ES2650437T3

ES2650437T3 - Método de manipulación de inmunoglobulinas

Info

Publication number: ES2650437T3
Application number: ES07763741.1T
Authority: ES
Inventors: Gottfried Himmler; Gerda Redl; Florian RÜCKER; Gordana Wozniak-Knopp
Original assignee: F Star Biotechnologische Forschungs und Entwicklungsges mbH
Current assignee: F Star Biotechnologische Forschungs und Entwicklungsges mbH
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2018-01-18
Anticipated expiration: 2027-07-05
Also published as: SI2044117T1; AT503902B1; US20150376603A1; LT2044117T; EP3293200B1; JP2009541361A; CN101528775A; PL2044117T3; JP5508002B2; EP2044117A2; CN109777804A; US20210388339A1; WO2008003116A3; US9133274B2; AT503902A1; CY1119641T1; EP3293200A1; WO2008003116A2; EP3293200C0; US20100029497A1

Abstract

Método de manipulación genética de una inmunoglobulina que comprende una región de bucle estructural modificada para proporcionar un sitio de unión no de CDR que se une a un epítope de un antígeno, en donde la región de bucle estructural no modificada no se une significativamente a dicho epítope, que comprende las etapas de: - proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina parental que comprende un dominio variable con una conformación de bucle de CDR específica, con propiedades de unión al antígeno originales, y una región de bucle estructural, - modificar al menos un resto de nucleótido de dicha región de bucle estructural, - transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión, - expresar dicha inmunoglobulina modificada, - poner en contacto con un epítope la inmunoglobulina modificada expresada, y - determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho epítope, en el que se modifica al menos un nucleótido en cada uno de al menos dos bucles estructurales, introduciendo dicha modificación al menos un aminoácido extraño al sitio de modificación, seleccionado del grupo que consiste en triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina y asparagina, y dicha modificación produce una modificación de hasta 30 aminoácidos dentro de una región de bucle estructural, y en donde se retienen dicha conformación de bucle de CDR específica y las propiedades de unión al antígeno originales de la inmunoglobulina parental.

Description

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DESCRIPCION

Método de manipulación de inmunoglobulinas Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de manipulación y fabricación de una molécula que comprende un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina modificada.

El campo general es la manipulación de proteínas con el objetivo de conferirles propiedades de unión específica. Más específicamente, las proteínas manipuladas de relevancia aquí son inmunoglobulinas (anticuerpos), e incluso más específicamente, dominios variables individuales o pares o combinaciones de dominios variables individuales de inmunoglobulinas o combinaciones con otros dominios de inmunoglobulina. Las propiedades de unión específica de las inmunoglobulinas son características importantes, ya que controlan la interacción con otras moléculas tales como antígenos, y hacen que las inmunoglobulinas sean útiles para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

Antecedentes

Estructura de anticuerpos

La estructura básica de los anticuerpos es similar para diversas clases de anticuerpos y para diversas especies y se explicará aquí usando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta.

Se combinan dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos ligeras (L) idénticas para formar la molécula de anticuerpo en forma de Y. Las cadenas pesadas tienen cada una cuatro dominios. Los dominios variables del extremo amino (VH) están en las puntas de la Y. Éstos van seguidos de tres dominios constantes: CH1, CH2, y CH3 del extremo carboxi, en la base del tallo de la Y. Un trecho corto, el cambio, conecta las regiones variables y constantes de las cadenas pesadas. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) con el resto del anticuerpo (los fragmentos Fab). Pueden producirse un Fc y dos fragmentos Fab idénticos por escisión proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo intacto. Las cadenas ligeras se construyen de dos dominios, variable (VL) y constante (CL), separados por un cambio.

Los enlaces disulfuro en la región bisagra conectan las dos cadenas pesadas. La cadena ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante enlaces disulfuro adicionales.

Las regiones variables de tanto las cadenas pesadas como ligeras (VH) y (VL) se encuentran en las "puntas" de la Y, donde están posicionadas para reaccionar con el antígeno. Esta punta de la molécula es el lado sobre el que se localiza el extremo N de la secuencia de aminoácidos.

El tallo de la Y sobresale de una forma para mediar eficientemente en funciones efectoras tales como la activación del complemento y la interacción con receptores de Fc, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con proteínas efectoras. El extremo C de la secuencia de aminoácidos se localiza en el lado opuesto de la punta, que puede llamarse la "parte inferior" de la Y.

Dominios variables de inmunoglobulina (dominios V)

Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos hojas beta apiladas estrechamente la una contra la otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se llama el pliegue de inmunoglobulina. Para referencia véase Bork et al. (1994) J. Mol. Biol. 242:309-320; Halaby et al. (1999) Protein Engineering 12: 563-571; Immunobiology. 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. New York and London: Garland Publishing; 2001.

El pliegue de dominios variables tiene 9 hebras beta dispuestas en dos hojas de 4 y 5 hebras. La hoja de 5 hebras es estructuralmente homóloga a la hoja de 3 hebras de dominios constantes, pero contiene las hebras C' y C'' adicionales. El resto de las hebras (A, B, C, D, E, F, G) tienen la misma topología y estructura similar como sus homólogos en los pliegues de inmunoglobulina de dominio constante. Un enlace disulfuro conecta las hebras B y F en hojas opuestas, como en dominios constantes. Los dominios variables de tanto las cadenas de inmunoglobulina pesadas como ligeras contienen tres bucles hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las tres CDR de un dominio V (CDR1, cDr2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan hebras beta B-C, C'-C" y F-G del pliegue de inmunoglobulina. Los restos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a la siguiente, confiriendo especificidad por antígeno a cada anticuerpo. Los dominios VL y VH en las puntas de las moléculas de anticuerpo están estrechamente apilados de forma que las 6 CDR (3 en cada dominio) cooperen en la construcción de una superficie (o cavidad) para la unión específica a antígeno. Así, el sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo está compuesto por los bucles que conectan las hebras B-C, C'-C'' y F-G del dominio variable de la cadena ligera y las hebras B-C, C'-C" y F-G del dominio variable de la cadena pesada.

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Armazones para la ingeniería de proteínas

Usando la estructura 3D de una proteína como ayuda para el diseño, se han aleatorizado restos de aminoácidos localizados sobre la superficie de muchas proteínas usando la estructura de núcleo de la proteína como armazón. Ejemplos de esta estrategia se describen o revisan en las siguientes referencias: Nygren Pa, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG, Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; documento US 6.562.617; Hufton et al. FEBS Letters (2000) 475: 225; Binz et al. Nat Biotechnol. (2005) 23:1257-68; Hosse et al. Protein Sci. (2006)15:14-27. El principio básico de esta técnica se basa en la observación de que muchas proteínas tienen un núcleo estable, formado por disposiciones específicas de elementos de estructura secundaria tales como hojas beta o hélices alfa, que están interconectados por estructuras tales como bucles, giros o espirales al azar. Normalmente, estos tres últimos elementos de estructura son menos cruciales para la estructura global de la proteína, y restos de aminoácidos en estos elementos de estructura pueden intercambiarse frecuentemente sin destruir el pliegue general de la proteína. Ejemplos que existen de forma natural de este principio de diseño son las CDR de dominios de tipo inmunoglobulina como pueden encontrarse en anticuerpos, receptores de linfocitos T y otras moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Ejemplos artificiales incluyen lipocalinas, ankirinas, inhibidor del dominio de kunitz, knottina y otros armazones de proteína.

Manipulación de los bucles de CDR dominios variables de inmunoglobulina

Una multitud de documentos del estado de la técnica muestran que el armazón de tipo inmunoglobulina ha sido empleado con el fin de manipular el sitio de unión al antígeno o ligando existente, introduciendo así novedosas propiedades de unión. Con más precisión, principalmente las regiones CDR han sido manipuladas para la unión al antígeno, en otras palabras, en el caso del pliegue de inmunoglobulina, el sitio de unión al antígeno natural se ha modificado con el fin de cambiar su afinidad de unión o especificidad. Existe un amplio conjunto de bibliografía que describe diferentes formatos de tales inmunoglobulinas manipuladas, frecuentemente expresadas en forma de anticuerpos completos, productos de fusión y/o fragmentos tales como fragmentos Fv monocatenarios (scFv), diacuerpos, minicuerpos, dominios individuales o fragmentos Fab y similares, ya sea presentadas sobre la superficie de partículas de fago u otros virus y células o solublemente expresadas en diversos sistemas de expresión procariotas o eucariotas. Las técnicas se revisan, por ejemplo, en Holliger & Hudson, Nat. Biotechnol. (2005) 23:1126-36 y Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005)23:1105-16.

Regiones estructurales o no CDR de dominios variables de inmunoglobulina

Los bucles de CDR de un dominio variable de inmunoglobulina definen la especificidad por antígenos. El resto de la molécula se llama región estructural (FR). Estas regiones estructurales, sin embargo, están compuestas de estructuras de hebra beta y de bucle.

Los bucles que no son bucles de CDR en un dominio variable de inmunoglobulina nativo no tienen unión al antígeno o especificidad de unión al epítope, pero contribuyen al correcto plegamiento global del dominio de inmunoglobulina y, por consiguiente, también al correcto posicionamiento de las CDR y a interacción entre dominios. Estos bucles se llaman bucles estructurales con el fin de la presente invención.

Los dominios variables de anticuerpo han sido en general manipulados por motivos muy diferentes, tales como la construcción de diversos formatos de anticuerpo, injerto de CDR (es decir, injerto de especificidad de un anticuerpo particular en otra región estructural; por ejemplo, Jones et al. Nature (1986) 321: 522-525; Kashmiri et al. Methods (2005) 36:25-34), cambio de la superficie de dominios variables con el fin de hacerla más soluble y estable (por ejemplo, Ewert et al. Methods (2004) 34:184-99; Conrath et al. J Mol Biol. (2005) 350:112-125), para hacerlos monoméricos (por ejemplo, Dottorini et al. Biochemistry (2004) 43:622-628)) o para estudiar la interacción entre dominios variables (por ejemplo, Masuda et al. FEBS J. (2006) 273:2184-94). Muchas de aquellas manipulaciones han implicado cambios en la región estructural de la molécula; se han realizado algunas mutaciones de aminoácido dentro de los bucles estructurales del dominio variable.

La influencia de regiones estructurales remotas sobre el posicionamiento del bucle de CDR es evidente de los resultados de injertos de CDR que muestran que la mutación de aminoácidos de la región estructural frecuentemente es necesaria para recuperar la unión al antígeno después del injerto de CDR de una región estructural a otra (por ejemplo, Foote & Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487-499; Kettleborough et al. Protein Eng. (1991) 4:773-783; Wu et al. J. Mol. Biol. (1999) 294:151-162).

Simon & Rajwesky (Protein Sci. (1992) 5:229-234) han estudiado los efectos de una inserción de cuatro restos en el bucle FR3 de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-NP B1-8. El mutante de inserción se obtuvo como anticuerpo secretado sin defectos importantes en la biosíntesis, que indica que los dominios variables de anticuerpo pueden acomodar variación de longitud no solo en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), sino también en los bucles de región estructural (FR). En este caso, el sitio de unión al antígeno original formado por los bucles de CDR no estuvo afectado por la modificación en un bucle estructural vecino.

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Injerto de bucles de CDR en regiones estructurales de bucle

El documento EP0640130B1 describe análogos de proteína de la superfamilia de la inmunoglobulina quimérica (proteínas chi) que tienen más de un sitio de unión biológico (dominios V individuales o Fvs). Los sitios de unión sobre estas proteínas comprenden regiones hipervariables derivadas de moléculas relacionadas con la superfamilia de moléculas de inmunoglobulina, que incluye inmunoglobulinas, antígenos de superficie celular (tales como antígenos de linfocitos T) y receptores celulares (tales como receptor de Fc). Las regiones hipervariables se llaman "regiones de tipo CDR" y definen sitios de unión al ligando. Adicionalmente, la proteína chi tiene al menos un segmento de sitio de unión al ligando más, también una región de tipo CDR, empalmada en las regiones de tipo FR del dominio de barril beta.

Cada sitio de unión al ligando de la proteína chi está comprendida de, por tanto, una región de tipo CDR derivada de moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Por ejemplo, un sitio de unión al ligando está comprendido de las CDR derivadas de una molécula de inmunoglobulina cuyo ligando es un antígeno.

El documento EP0640130B1 enseña así cómo empalmar regiones de tipo CDR con una especificidad dada de una molécula de la superfamilia de las inmunoglobulinas en los bucles estructurales de un dominio variable. Se postula que los anticuerpos biespecíficos funcionales pueden prepararse por esta técnica. Existe un requisito para esta técnica de que las orientaciones relativas de los bucles de tipo CDR (simetría de bucles de CDR) para un dominio variable sean reproducidas a una aproximación motivable en la orientación relativa de los bucles estructurales. El documento EP0640130B1 reivindica que una aproximación tal de la simetría de bucles de tipo CDR existe para los bucles estructurales. Sin embargo, es dudoso que la orientación relativa de los bucles de CDR y los bucles estructurales sea similar en detalle y resolución suficientes; por consiguiente, no se ha descrito hasta la fecha que sea en realidad posible desarrollar moléculas biespecíficas por esta técnica.

El documento EP0640130B1 ejemplifica que R19.9 (un anticuerpo murino específico monoclonal para el p- azobencenoarsonato) y 26-10 (anticuerpo murino específico monoclonal para ouabaína) se usaron como la región estructural que proporciona los bucles de CDR primarios respectivamente, y los bucles de CDR del anticuerpo anti- lisozima murino D1.3 se injertaron en las regiones de bucle estructurales. Sin embargo, no se describe la especificidad funcional después del injerto.

Otro ejemplo describe que el anticuerpo monocatenario 26-10 específico para ouabaína podría retener su especificidad por ouabaína después del injerto de dos CDR del anticuerpo para lisozima específico en los bucles estructurales del fragmento de anticuerpo Fv monocatenario específico de ouabaína. Sin embargo, no se describe que el fragmento de anticuerpo que se preparó según este método tuviera también especificidad de unión por lisozima.

Injerto de péptidos en la región estructural de bucle

El documento WO00244215A2 describe moléculas de unión que comprenden un sitio de unión a diana específico y un péptido efector de Fc. El péptido efector de Fc es un péptido de hasta 100 aminoácidos que interacciona con moléculas efectoras. El péptido efector puede, por ejemplo, insertarse en las regiones de bucle de un anticuerpo a condición de que la capacidad para unirse al antígeno no se afecte adversamente. Se ejemplifica la inserción de un péptido efector en un bucle no de CDR de un dominio CH1 de un fragmento de inmunoglobulina. La misma inserción no se describe para un dominio variable. Cada péptido injertado en un bucle no de CDR según la presente divulgación tiene una alta probabilidad de ser inactivo debido al entorno estructural diferente en el que se ha puesto. Además, puede ser difícil retener una conformación de bucle de CDR específica en una inmunoglobulina parental si un péptido se injerta en un bucle estructural de un dominio variable. Por consiguiente, no se describe que un péptido efector pueda ser injertado en un dominio variable sin pérdida de o bien la unión al antígeno o bien la unión a molécula efectora.

El documento PCT/EP2006/050059 describe un método de manipulación de una inmunoglobulina que comprende una modificación en una región de bucle estructural para obtener un nuevo sitio de unión al antígeno. Este método es ampliamente aplicable a inmunoglobulinas y puede usarse para producir una serie de inmunoglobulinas que se dirigen a varios antígenos.

El documento US2005/266000A1 describe polipéptidos que comprenden un dominio de región estructural variable de cadena pesada de variante (VFR). Un VFR es parte del sitio de unión al antígeno o ranura que puede ponerse en contacto con el antígeno. Las VFR son parte de la región de bucle del CDR, en el presente documento también llamada la región CDR, y localizadas en un dominio variable en el lado de los bucles de CDR para soportar la unión al antígeno mediante la región de bucle CDR. No se han mutado bucles de la región estructural distintos de VFR con el fin de manipular un sitio de unión al antígeno.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar inmunoglobulinas y dominios de inmunoglobulina variables con propiedades de unión al antígeno mejoradas y métodos de manipulación y fabricación de inmunoglobulinas con los dominios variables mejorados.

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Descripción de la invención

El objeto se logra mediante la materia de la presente invención.

La presente invención se refiere a un método de manipulación de una inmunoglobulina que comprende un dominio variable y al menos una modificación en al menos dos bucles estructurales de dicha inmunoglobulina y determinar la unión de dicha inmunoglobulina a un epítope de un antígeno, en el que la inmunoglobulina no modificada no se une significativamente a dicho epítope, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende al menos dos bucles estructurales,

- modificar al menos un resto de nucleótido de cada uno de dichos bucles estructurales,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión,

- expresar dicha inmunoglobulina modificada,

- poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con un epítope, y

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho epítope.

Los bucles estructurales manipulados según la invención se localizan preferentemente dentro de una o dos regiones de bucle estructural, en algunos casos las modificaciones están situadas en incluso más de 2 regiones de bucle estructural.

Con el fin de vencer las limitaciones del estado de la técnica como se describe en los documentos WO00244215A2 y EP0640130B1 en la manipulación de un sitio de unión en una región de bucle estructural de un dominio variable de anticuerpo, la presente invención proporciona métodos de selección de unión específica de un polipéptido (es decir, un péptido de dominio variable que comprende regiones de bucle estructural modificadas) en su contexto natural (es decir, dominio variable de anticuerpo). Con el fin de aumentar el número de posibles estructuras de dominios de inmunoglobulina de variante que pueden seleccionarse para la unión al antígeno, se modifican al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle según la invención. Así, es posible introducir y seleccionar muchas modificaciones diferentes con alteración mínima de la estructura de dominio global. Otra ventaja de modificar al menos dos bucles o regiones de bucle es el área superficial alargada posiblemente capaz de interaccionar con un componente de unión específica. Los dominios variables de inmunoglobulina así modificados están seleccionados para funciones específicas o unión. La invención permite manipular un dominio variable de inmunoglobulina modificada y una inmunoglobulina modificada que se une con sus bucles estructurales modificados o regiones de bucle con unión de alta afinidad y/o alta especificidad por un componente de unión. El método permite la selección de moléculas de unión específica con modificaciones mínimas y sin destrucción de la estructura global del dominio de inmunoglobulina variable.

Para vencer la dificultad de retener una conformación de bucle de CDR específica en una inmunoglobulina parental se modifica un bucle estructural de un dominio variable según la invención. Así, la primera vez es posible añadir al antígeno propiedades de unión de una inmunoglobulina sin pérdida significativa de unión al antígeno o incluso unión de molécula efectora de un anticuerpo parental. Es sorprendentemente posible manipular la inmunoglobulina según la invención sin interferir significativamente con las propiedades de unión de una conformación de bucle de CDR específica, tal como afinidad de unión, avidez y especificidad, de la inmunoglobulina parental.

Una conformación de bucle de CDR específica proporciona unión al antígeno por bucles de CDR o una región de bucle de CDR. Cualquier inmunoglobulina que está uniéndose al antígeno mediante una conformación de bucle de CDR tal puede modificarse según la invención para obtener un sitio de unión adicional en un bucle estructural de la inmunoglobulina, preferentemente mientras que la conformación de bucle de CDR específica y las propiedades de unión al antígeno original de la molécula parental pueden ser retenidas o son invariables. Preferentemente, las propiedades de unión de la conformación de bucle de CDR pueden mantenerse a tal grado que la afinidad de unión de la molécula parental no se reduzca significativamente, por ejemplo, la constante de disociación Kd no aumente significativamente, que significa que la diferencia en Kd es un factor preferentemente inferior a 104, más preferentemente inferior a 103, incluso más preferido inferior a 102, o inferior a 10.

Según la presente invención, una de las características clave de la presente invención es que la manipulación de la inmunoglobulina o dominios variables de inmunoglobulina tiene lugar en regiones que normalmente no están implicadas en la unión al antígeno, en otras palabras, en regiones distintas de las CDR de un dominio variable de anticuerpo. Se observó que el pliegue específico de los dominios de inmunoglobulina permite la introducción de mutaciones aleatorias en regiones que son estructuralmente análogas a las CDR, pero diferentes en posición en secuencia y estructura. Las regiones identificadas para modificación según la presente invención son, como las CDR, regiones de bucle que conectan las hebras beta del pliegue de inmunoglobulina. Estos bucles estructurales o regiones de bucle pueden mutarse como se describe en la presente invención sin afectar la unión de los dominios variables de la inmunoglobulina que está mediada por los bucles de CDR. Mutando dichos bucles estructurales o regiones de bucle, se genera una nueva superficie de unión molecular o sitio de unión que es similar en tamaño y forma a la superficie de unión o sitio de unión formado por los bucles de CDR del sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo. Como los bucles estructurales también pueden ser extendidos por la inserción de aminoácidos

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adicionales, la arquitectura del sitio de unión recién generado puede ser voluntariamente ajustada a la diana a la que debe unirse. Por ejemplo, sitios de unión profundos que son especialmente adecuados para la unión de moléculas pequeñas pueden estar preferencialmente formados por bucles largos, es decir, bucles estructurales con aminoácidos adicionales insertados en su secuencia, mientras que superficies de unión bastantes planas, que son muy adecuadas para unirse a dianas con una gran superficie molecular plana, se forman preferencialmente cuando los restos en los bucles estructurales se mutan sin la inserción de restos adicionales. Más específicamente, se describe en el presente documento que introduciendo mutaciones aleatorias en los bucles que conectan la hebras beta A-B, C'-D y E-F de un dominio variable de la cadena pesada humano o humanizado, pueden seleccionarse dominios mutados que se unen específicamente a ya sea albúmina de suero humano o a receptor III de Fcgamma, que normalmente no son reconocidos y unidos por dominios variables de inmunoglobulina humanos o humanizados. Las mutaciones introducidas incluyen mutaciones en las que restos de aminoácidos seleccionados en la secuencia no mutante se sustituyeron por restos elegidos aleatoriamente, y también incluyen inserciones de restos de aminoácidos adicionales en los bucles mencionados anteriormente. Así, preferentemente se proporcionan inmunoglobulinas modificadas según la invención que son obtenibles y producidas según los métodos anteriormente descritos, y tienen un sitio de unión específico para un antígeno, en particular específico para una albúmina de suero, receptores celulares y factores del complemento, más específicamente albúmina de suero humano y receptores de Fc.

En particular, la presente invención se refiere a un método de manipulación de un dominio variable de inmunoglobulina y una inmunoglobulina que contiene un dominio tal que está uniéndose específicamente a un epítope de un antígeno.

Específicamente, el método según la invención comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que se une específicamente a al menos un primer epítope y está comprendiendo al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle,

- modificar al menos un resto de nucleótido de cada uno de dichos bucles estructurales o regiones de bucle codificadas por dicho ácido nucleico,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión,

- expresar dicha inmunoglobulina modificada,

- poner en contacto el dominio variable de inmunoglobulina modificado expresado con dicho al menos un segundo epítope, y

- determinar si dicho dominio variable de inmunoglobulina modificado se une específicamente al segundo epítope.

Este método se aplica preferentemente a péptidos del dominio variable de inmunoglobulina. Más preferentemente, el método según esta realización de la invención se refiere a inmunoglobulinas que se unen a dicho primer epítope mediante sus regiones CDR o conformación de bucle de CDR específica.

El método según la invención se refiere además a al menos una modificación en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle de dicho dominio variable de inmunoglobulina y determinar la unión específica de dichos bucles estructurales o regiones de bucle a al menos un antígeno, en el que el dominio variable de inmunoglobulina que contiene un bucle estructural no modificado o región de bucle no se une específicamente a un antígeno tal.

El término "inmunoglobulina", como se usa en el presente documento, está incluyendo inmunoglobulinas o partes, fragmentos o derivados de inmunoglobulinas. Así, incluye un "péptido de dominio variable de inmunoglobulina" que va a modificarse según la presente invención (como se usa en el presente documento, los términos inmunoglobulina y anticuerpo son intercambiables), además de dominios variables de inmunoglobulina o partes de los mismos que contienen un bucle estructural, tal como un minidominio, o un bucle estructural de tales dominios. Las inmunoglobulinas pueden usarse como péptidos aislados o como moléculas de combinación con otros péptidos. En algunos casos es preferible usar un bucle estructural modificado definido o una región de bucle estructural, o partes de la misma, como moléculas aisladas para fines de unión o de combinación. El "dominio variable de inmunoglobulina", como se define en el presente documento, contiene tales péptidos o polipéptidos del dominio variable de inmunoglobulina que pueden tener características de unión específica tras la modificación y manipulación. Los péptidos son homólogos a las secuencias de dominio variable de inmunoglobulina, y tienen preferentemente al menos 5 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 10 o incluso al menos 50 o 100 aminoácidos de longitud, y constituyen al menos parcialmente la región de bucle estructural o la región de bucle no de CDR del dominio variable. Preferentemente, los péptidos excluyen aquellas inserciones que se consideran aminoácidos no funcionales, regiones de CDR híbridas o quiméricas, o regiones de tipo CDR y/o estructuras canónicas de regiones CDR. Las características de unión se refieren a unión a epítope específico, afinidad y avidez.

Un derivado de una inmunoglobulina según la invención es cualquier combinación de una o más inmunoglobulinas de la invención y o una proteína de fusión en la que cualquier dominio o minidominio de la inmunoglobulina de la invención puede fusionarse en cualquier posición de una o varias de otras proteínas (tales como otras inmunoglobulinas, ligandos, proteínas de armazón, enzimas, toxinas y similares). Un derivado de la inmunoglobulina

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de la invención también puede obtenerse por técnicas de recombinación o unión a otras sustancias por diversas técnicas químicas tales como acoplamiento covalente, interacción electrostática, enlace disulfuro, etc.

Las otras sustancias unidas a las inmunoglobulinas pueden ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas, o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, PEG, profármacos o fármacos). Un derivado también es una inmunoglobulina con la misma secuencia de aminoácidos, pero constituida completamente o parcialmente de aminoácidos no naturales o químicamente modificados.

Las moléculas manipuladas según la presente invención serán útiles como proteínas individuales, además de proteínas de fusión o derivados, lo más normalmente fusionadas de tal forma que sean parte de estructuras de anticuerpo más grandes o moléculas de anticuerpo completas, o partes de las mismas tales como fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv y otros. Será posible usar las proteínas manipuladas para producir moléculas que son biespecíficas, triespecíficas, y pueden incluso llevar más especificidades al mismo tiempo, y será posible al mismo tiempo controlar y preseleccionar la valencia de la unión al mismo tiempo según los requisitos del uso planeado de tales moléculas.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una inmunoglobulina con al menos una región de bucle, además de la conformación de bucle de CDR del dominio variable, caracterizada por que dicha al menos una región de bucle comprende al menos una modificación de aminoácidos que forma al menos una región de bucle modificada, en la que dicha al menos una región de bucle modificada se une específicamente a al menos un epítope de un antígeno.

Se prefiere combinar molecularmente al menos un dominio de anticuerpo modificado, que está uniéndose al componente específico mediante las secuencias no variables o un bucle estructural, con al menos otra molécula de unión, que puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando u otro dominio de anticuerpo modificado.

La molécula que actúa como una parte de un par de unión que es específicamente reconocido por la inmunoglobulina según la invención está seleccionada preferentemente del grupo que consiste en moléculas proteináceas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.

Los bucles modificados o regiones de bucle de las inmunoglobulinas según la invención pueden unirse específicamente a cualquier tipo de moléculas de unión o estructuras, en particular a antígenos, moléculas proteináceas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, moléculas orgánicas pequeñas, moléculas inorgánicas, o combinaciones o fusiones de los mismos. Por supuesto, las inmunoglobulinas modificadas pueden comprender al menos dos bucles o regiones de bucle, por lo que cada uno de los bucles o regiones de bucle pueden unirse específicamente a diferentes moléculas o epítopes.

Según la presente invención, regiones de unión a antígenos o sitios de unión al antígeno de todos los tipos de antígenos de superficie celular pueden introducirse en un bucle estructural de una estructura de anticuerpo dada.

La unión de las inmunoglobulinas según la invención es preferentemente, por una parte, mediante regiones CDR, si la inmunoglobulina contiene una región CDR tal, y por otra parte mediante un sitio de unión adicional que se forma modificando al menos dos bucles estructurales. Aquellos bucles estructurales están ya sea separados en uno o al menos dos dominios variables que tienen uno o más bucles estructurales modificados. Así, una inmunoglobulina según la invención contiene al menos dos modificaciones en los bucles estructurales de dominios variables bien mediante al menos una modificación de al menos dos dominios variables o bien al menos dos modificaciones de al menos un dominio variable. Preferentemente, la inmunoglobulina modificada presenta así un sitio de unión ya sea cambiando la estructura primaria de la proteína o cambiando la estructura terciaria para obtener un sitio de unión específico de conformación.

Por analogía, los dominios variables de inmunoglobulina de cualquier clase de inmunoglobulinas y de inmunoglobulinas de cualquier especie son susceptibles a este tipo de manipulación. Además, no solo los bucles específicos elegidos como diana en los ejemplos de la presente invención pueden manipularse, sino que cualquier bucle que conecte hebras beta en dominios variables de inmunoglobulina puede manipularse de la misma forma.

Las inmunoglobulinas manipuladas o dominios variables de inmunoglobulina de cualquier organismo y de cualquier clase de inmunoglobulina pueden usarse según la presente invención bien como tales (como dominios individuales), o bien como parte de una molécula mayor. Por ejemplo, pueden ser parte de una inmunoglobulina intacta, que por consiguiente tendría su región de unión al antígeno "normal" formada por al menos una de las 6 CDR y el nuevo sitio de unión al antígeno manipulado. Al igual que esto, podría generarse una inmunoglobulina multi-específica, por ejemplo biespecífica, o triespecífica. Los dominios de inmunoglobulina manipulados también pueden ser parte de cualquier proteína de fusión.

Las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención pueden ser moléculas de anticuerpo completas o parte de anticuerpos, tales como IgG, IgA, IgM, IgD, IgE y similares. Las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina de la invención también pueden contener o consistir en un fragmento

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funcional de anticuerpo tal como Fab, Fab2, scFv, Fv, o partes de los mismos, u otros derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas tales como minicuerpos, dominios de las cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como Fd, VL, que incluyen Vlambda y Vkappa, VH, VHH) además de mini-dominios que consisten en dos hebras beta de un dominio de inmunoglobulina conectadas por al menos dos bucles estructurales (véase, por ejemplo, Laffly et al (2005) Hum Antibodies. 2005;14:33-55), como dominios aislados o en el contexto de moléculas naturalmente asociadas.

La inmunoglobulina modificada según la invención se combina posiblemente además con una o más inmunoglobulinas modificadas o con inmunoglobulinas no modificadas, o partes de las mismas, para obtener una inmunoglobulina de combinación. Las combinaciones se obtienen preferentemente por técnicas de recombinación, pero también por asociación mediante adsorción, interacciones electrostáticas o similares, o incluso mediante unión química con o sin un conector. La secuencia conectora preferida es o bien una secuencia conectora natural o bien una secuencia artificial funcionalmente adecuada.

Se entiende que el término "inmunoglobulina", "péptido del dominio variable de inmunoglobulina" y "dominio variable de inmunoglobulina" incluye derivados también. Un derivado es cualquier parte o combinación de una o más inmunoglobulinas y/o una proteína de fusión en la que cualquier dominio o minidominio de la inmunoglobulina como se obtuvo según la invención puede combinarse o fusionarse en cualquier posición con uno o varios de otros péptidos o proteínas (que incluyen, pero no se limitan a, otras inmunoglobulinas, dominios de inmunoglobulina, partes de Fc, ligandos, proteínas de armazón, enzimas, toxinas, proteínas del suero y similares). Un derivado de la inmunoglobulina de la invención también puede obtenerse uniendo la inmunoglobulina no modificada o modificada o dominio variable de inmunoglobulina de la invención a otras sustancias por diversas técnicas químicas tales como acoplamiento covalente, interacción electrostática, enlace disulfuro, etc.

Las otras sustancias unidas a la inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina pueden ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas, o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, PEG, profármacos o fármacos). Un derivado también es una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina con la misma secuencia de aminoácidos, pero constituida completamente o parcialmente de aminoácidos no naturales, artificiales o químicamente modificados.

Las moléculas manipuladas según la presente invención serán útiles como proteínas individuales, además de proteínas de fusión o derivados, lo más normalmente fusionadas antes o después de la modificación de tal forma que sean parte de estructuras de anticuerpo más grandes o moléculas de anticuerpo completas, o partes de las mismas. Las inmunoglobulinas según la invención pueden así también consistir en o comprender fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios, en particular fragmentos Fv monocatenarios, scFv bi- o multiespecíficos, diacuerpos, multicuerpos, multivalentes o multímeros de dominios de inmunoglobulina, y otros. Será posible usar las proteínas manipuladas para producir moléculas que sean monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas, y moléculas que pueden incluso llevar más especificidades. Por la invención es posible controlar y preseleccionar la valencia de unión al mismo tiempo según los requisitos de uso planeados de tales moléculas.

Según la presente invención, uno o más sitios de unión a antígenos o sitios de unión al antígeno a uno o más antígenos pueden introducirse en un bucle estructural o región de bucle de una estructura de dominio variable de anticuerpo dada. Los antígenos pueden ser moléculas que existen de forma natural o moléculas químicamente sintetizadas o moléculas recombinantes, ya sea en solución o en suspensión, por ejemplo localizadas sobre o en partículas tales como fases sólidas, sobre o en células o sobre superficies virales. Fue sorprendente que la unión de una inmunoglobulina a un antígeno pudiera lograrse según la invención incluso cuando el antígeno estuviera todavía adherido o unido a moléculas y estructuras que previnieran su unión. Empleando el antígeno diana en su contexto seleccionado o natural y la estructura para seleccionar la inmunoglobulina modificada y diseñada, es posible identificar y obtener aquellas inmunoglobulinas modificadas que son las más adecuadas con el fin de uso de diagnóstico o terapéutico.

El término "antígeno", como se usa en el presente documento, debe comprender moléculas seleccionadas del grupo que consiste en alérgenos, antígenos asociados a tumor, auto-antígenos que incluyen albúmina, receptores de linfocitos T, FcRn, receptores de la superficie celular, enzimas, receptores de Fc, proteínas del sistema del complemento, moléculas de suero, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígeno de protozoo y antígenos virales, también moléculas responsables de la encefalitis espongiforme transmisible (EET), tales como priones, infectivos o no, y marcadores o moléculas que se refieren a enfermedad de Alzheimer. Los antígenos pueden ser dirigidos y unidos por las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina como se manipulan según la invención mediante al menos parte de un bucle estructural modificado.

En una realización preferida, la inmunoglobulina está uniéndose con sus bucles estructurales modificados específicamente a al menos dos de tales epítopes que son idénticos o se diferencian entre sí, bien del mismo antígeno o de antígenos diferentes.

Por ejemplo, el método según la invención se refiere a manipular una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina que está uniéndose específicamente a al menos un primer epítope y que comprende al menos una

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modificación en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle de dicha inmunoglobulina, y determinar la unión específica de dichos bucles o regiones de bucle a al menos un segundo epítope, siendo el epítope seleccionado del grupo de antígenos que se ha mencionado anteriormente, en el que el bucle estructural no modificado o región de bucle (región no de CDR) no se une específicamente a dicho al menos un segundo epítope.

El término antígeno, como se usa según la presente invención, debe en particular incluir todos los antígenos y moléculas diana capaces de ser reconocidos por un sitio de unión de una inmunoglobulina o una estructura de anticuerpo, en conjunto molécula diana o como un fragmento de tal molécula (especialmente subestructuras de dianas, generalmente denominadas "epítopes").

Antígenos preferidos como elegidos como diana por las inmunoglobulinas según la invención son aquellos antígenos o moléculas, que ya han demostrado ser o son capaces de ser inmunogénicos, unidos por factores de respuesta inmunitaria, o incluso inmunológica o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los que se ha probado una eficacia clínica.

El término "antígeno" según la presente invención debe significar moléculas o estructuras conocidas por interaccionar o capaces de interaccionar con la región de bucle de CDR de inmunoglobulinas. Las regiones de bucle estructural del estado de la técnica con referencia a anticuerpos nativos no interaccionan con antígenos, sino que contribuyen a la estructura global y/o a la unión a moléculas efectoras. Solo tras la manipulación según la invención, los bucles estructurales pueden formar sitios de unión al antígeno sin participación de bucles de CDR o la región CDR.

Según una realización preferida, el antígeno unido por la inmunoglobulina según la invención es un antígeno de superficie celular. El término "antígenos de superficie celular" debe incluir todos los antígenos o capaces de ser reconocidos por una estructura de anticuerpo sobre la superficie de una célula, y fragmentos de tales moléculas. "Antígenos de superficie celular" preferidos son aquellos antígenos, que ya han demostrado ser o que son capaces de ser inmunológica o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los que se ha probado una eficacia preclínica o clínica. Aquellas moléculas de la superficie celular son específicamente relevantes con el fin de la presente invención, que median en la actividad de destrucción celular. Tras la unión de la inmunoglobulina según la invención a al menos dos de aquellas moléculas de la superficie celular el sistema inmunitario proporciona citólisis o muerte celular, así puede proporcionarse un medio potente para atacar células humanas.

Preferentemente, el antígeno está seleccionado de antígenos de superficie celular, que incluyen receptores, en particular del grupo que consiste en tirosina cinasas de receptor de erbB (tales como eGfR, HER2, HER3 y HER4, pero no se limitan a éstos), moléculas de la superfamilia de receptores de TNF, tales como el receptor de Apo-1, TNFR1, TNFR2, receptor de factor de crecimiento nervioso ngFR, CD40, moléculas T de la superficie celular, receptores de linfocitos T, antígeno de linfocitos T OX40, receptor de TACI, BCMA, Apo-3, dR4, DR5, DR6, receptores de señuelo, tales como DcR1, DcR2, CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TnFl1, pero no se limitan a estas moléculas, antígenos de superficie de linfocitos B, tales como CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, antígenos o marcadores de tumores sólidos o células cancerosas hematológicas, células de linfoma o leucemia, otros glóbulos sanguíneos que incluyen plaquetas de la sangre, pero no se limitan a estas moléculas.

Según otra realización preferida de la presente invención, el antígeno diana o la molécula que se une al bucle estructural modificado o región de bucle se selecciona del grupo que consiste en antígenos asociados a tumor, en particular EpCAM, glucoproteína-72 asociada a tumor (TAG-72), antígeno CA 125 asociado a tumor, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno asociado a tumor que expresa el hidrato de carbono relacionado con Lewis Y, antígeno carcinoembrionario (CEA), CEACAM5, HMFG PeM, mucina MUC1, MUC18 y antígeno asociado a tumor de citoqueratina, antígenos bacterianos, antígenos virales, alérgenos, moléculas relacionadas con la alergia IgE, cKIT y Fc-épsilon-receptor I, IRp60, receptor de IL-5, CCR3, receptor de glóbulos rojos (CR1), albúmina de suero humano, albúmina de suero de ratón, albúmina de suero de rata, receptor de Fc-gamma neonatal FcRn, receptores de Fc-gamma Fc-gamma RI, Fc- gamma-RII, Fc-gamma RIII, receptores de Fc-alfa, receptores de Fc-épsilon, fluoresceína, lisozima, receptor 9 similar a Toll, eritropoyetina, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD64, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma; TNF-alfa, TNFbeta2, TNFalfa, TNFalfabeta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4- 1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, receptor-1 de TRAIL, receptor de adenosina A1, receptor beta de linfotoxina, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrina beta1, integrina beta2, integrina alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa5, integrina alfa6, integrina alfav, integrina alfaVbeta3, FGFR-3, factor de crecimiento de queratinocitos, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E- selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de linfocitos T, B7-1, B7-2, VNR integrina, TGFbeta1, TGFbeta2, eotaxina 1, BlyS (estimulador de linfocitos B), complementoC5, IgE, IgA, IgD, IgM, IgG, factor VII, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), factor tisular, VEGF, VEGFR, receptor de endotelina, VLA-4, hidratos de carbono tales como antígenos de grupo sanguíneo e hidratos de carbono relacionados, glucosilación de galili, gastrina, receptores de gastrina, hidratos de carbono asociados a tumor, hapteno NP-cap o NIP-cap, receptor alfa/beta de linfocitos T, E-selectina, P-glucoproteína, MRP3, MRP5, glutatión-

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S-transferasa pi (proteínas de multi-resistencia a fármaco), proteína de la membrana de gránulos alfa (GMP) 140, digoxina, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP) y fosfatasa alcalina similar a PLAP testicular, receptor de transferrina, heparanasa I, miosina cardíaca humana, glucoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), glucoproteína de la cubierta gH del citomegalovirus humano (HCMV), gp120 del VIH, HCMV, virus respiratorio sincitial RSV F, RSVF Fgp, VNR integrina, Hep B gp120, CMV, gpIIbIIIa, bucle V3 de gp120 de IIIB de VIH, Fgp del virus respiratorio sincitial (VRS), glucoproteína gD del virus del herpes simple (VHS), glucoproteína gB de VHS, glucoproteína de la cubierta gB de HCMV, toxina Clostridium perfringens y fragmentos de los mismos.

Preferentemente, el antígeno está seleccionado del grupo que consiste en antígeno patógeno, antígeno asociado a tumor, enzima, sustrato, auto-antígeno, molécula orgánica o alérgeno. Los antígenos más preferidos están seleccionados del grupo que consiste en antígenos virales, antígenos bacterianos o antígenos de patógenos de eucariotas o fagos. Antígenos virales preferidos incluyen virus VHA, VHB, VHC, VIH I, VIH II, parvovirus, de la gripe, VHS, virus de la hepatitis, flavivirus, virus del Nilo occidental, virus del Ébola, poxvirus, virus de la viruela, virus del sarampión, virus del herpes, adenovirus, virus del papiloma, virus del polioma, parvovirus, rinovirus, virus de Coxsackie, virus de la poliomielitis, ecovirus, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la fiebre amarilla, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus paragripal, virus de La Crosse, virus de Lassa, virus de la rabia, antígenos de rotavirus; antígenos bacterianos preferidos incluyen antígenos de Pseudomonas, Mycobacterium, Staphylococcus, Salmonella, meningocócicos, Borellia, Listeria, Neisseria, Clostridium, Escherichia, Legionella, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Moraxella, Brucella, Campylobacter, Cardiobacterium, Francisella, Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Vibrio, Chlamydia, Leptospira, Rickettsia, Mycobacterium, Treponema, Bartonella. Antígenos eucariotas preferidos de eucariotas patógenos incluyen antígenos de Giardia, Toxoplasma, Cyclospora, Cryptosporidium, Trichinella, levaduras, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides.

La inmunoglobulina modificada según la presente invención puede unirse preferentemente a una de las moléculas desveladas anteriormente. Estas moléculas comprenden también alérgenos y haptenos.

Subestructuras de antígenos se denominan generalmente "epítopes" (por ejemplo, epítopes de linfocitos B, epítopes de linfocitos T), en tanto que sean inmunológicamente relevantes, es decir, también son reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales. El término "epítope" según la presente invención debe significar una estructura molecular que puede constituir completamente un componente de unión específica o ser parte de un componente de unión específica al dominio de unión o la inmunoglobulina de la presente invención.

Químicamente, un epítope puede o bien estar compuesto de un hidrato de carbono, un péptido, un ácido graso, una sustancia inorgánica o derivados de la misma, y cualquier combinación de los mismos. Si un epítope es un péptido o polipéptido, normalmente tendrá al menos 3 aminoácidos, preferentemente 8 a 50 aminoácidos, y más preferentemente entre aproximadamente 10-20 aminoácidos incluidos en el péptido. No hay límite superior crítico a la longitud del péptido, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de polipéptidos. Los epítopes pueden ser o bien epítopes lineales o bien conformacionales. Un epítope lineal comprende un único segmento de una secuencia primaria de una cadena de polipéptidos. Los epítopes lineales pueden estar contiguos o solaparse. Los epítopes conformacionales están comprendidos de aminoácidos puestos juntos por plegamiento del polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no están necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia lineal.

Específicamente, los epítopes son al menos parte de moléculas diagnósticamente relevantes, es decir, la ausencia o presencia de un epítope en una muestra está cualitativa o cuantitativamente relacionada con tanto una enfermedad como con el estado de salud o con estado de proceso en la fabricación o con estado medioambiental o alimenticio. Los epítopes también pueden ser al menos parte de moléculas terapéuticamente relevantes, es decir, moléculas que pueden ser elegidas como diana por el dominio de unión específico que cambia el curso de la enfermedad.

Además de los sitios de unión al antígeno de la inmunoglobulina como se manipula según la invención, pueden introducirse capacidades de unión adicionales aparte de o en las regiones de bucle estructural de dominios variables, por ejemplo capacidades de unión para otros antígenos, moléculas pequeñas, para fármacos o enzimas, sitios catalíticos de enzimas o sustratos enzimáticos o la unión a un análogo de estado de transición de un sustrato enzimático.

Preferentemente, el nuevo sitio de unión al antígeno en los bucles estructurales es extraño al dominio variable de inmunoglobulina no modificada. Así, se prefieren dianas extrañas como moléculas efectoras, proteínas del suero o receptores de Fc o receptores de la superficie celular, que no están unidos por dominios variables por naturaleza, como antígenos o moléculas de unión unidas por los dominios variables de inmunoglobulina según la invención.

En este contexto, el término "extraño" significa que el antígeno no es reconocido por la región de unión CDR específica u otras regiones de unión de la inmunoglobulina naturales o intrínsecas. Un componente de unión extraño, pero no el componente de unión natural de una inmunoglobulina, puede así unirse por el sitio de unión al antígeno recién formado de un bucle estructural. Esto significa que un componente de unión natural, tal como un

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receptor de Fc o un efector del sistema inmunitario, no se considera que se una por el sitio de unión al antígeno extraño a la inmunoglobulina no modificada.

Como se usa en el presente documento, el término "se une específicamente a" o "unión específica" se refiere a una reacción de unión que es determinante del ligando de interés relacionado en una población heterogénea de moléculas. Así, bajo condiciones designadas (por ejemplo, condiciones de inmunoensayo), el dominio variable del anticuerpo especificado se une a su diana particular y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra. La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, afinidad de unión o avidez alta, media o baja, como se selecciona. La unión selectiva se logra normalmente si la constante de unión o dinámica de unión es al menos 10 veces diferente.

El término "sistema de expresión" se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control en enlace operativo, de manera que hospedadores transformados o transfectados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Con el fin de efectuar la transformación, el sistema de expresión puede incluirse en un vector; sin embargo, el ADN relevante también puede entonces integrarse en el cromosoma del hospedador. Alternativamente, puede usarse un sistema de expresión para la transcripción/traducción in vitro.

Un "bucle estructural" o "bucle no de CDR" según la presente invención debe entenderse del siguiente modo: las inmunoglobulinas están hechas de dominios con un llamado pliegue de inmunoglobulina. En esencia, hojas beta antiparalelas están conectadas por bucles para formar un barril beta antiparalelo comprimido. En la región variable, algunos de los bucles de los dominios contribuyen esencialmente a la especificidad del anticuerpo, es decir, la unión a un antígeno. Estos bucles se llaman bucles de CDR.

Los bucles de CDR están localizados dentro de la región de bucle de CDR, que en algunos casos también pueden la región estructural variable (llamada "VFR") adyacente a los bucles de CDR. Se sabe que las VFR pueden contribuir al bolsillo de unión al antígeno de un anticuerpo, que generalmente se determina principalmente por los bucles de CDR. Así, aquellas VFR se consideran como parte de la región de bucle de CDR, y no se usarían apropiadamente para el fin de la invención. Al contrario de aquellas VFR dentro de la región de bucle de CDR o localizadas próximas a los bucles de CDR, otras VFR de dominios variables serían particularmente adecuadas para ser usadas según la invención. Aquellos son los bucles estructurales de las VFR localizadas opuestas a la región de bucle de CDR, o en lado del extremo C de un dominio de inmunoglobulina variable.

Todos los bucles de dominios variables de anticuerpo fuera de la región de bucle CDR están contribuyendo bastante a la estructura de la molécula. Estos bucles se definen en el presente documento como bucles estructurales o bucles no de CDR.

Toda la numeración de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas es según el esquema de numeración de IMGT (IMGT, international ImMunoGeneTics information
system@imgt.cines.fr;
http://imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29:185-203).

Según una realización preferida de la presente invención, el dominio variable de inmunoglobulina es de origen humano, camélido, conejo, pollo, rata, perro, caballo, oveja o murino.

Como la inmunoglobulina modificada puede emplearse para diversos fines, en particular en composiciones farmacéuticas, la inmunoglobulina es preferentemente de origen humano, camélido o murino. Por supuesto, la inmunoglobulina modificada también puede ser una inmunoglobulina humanizada o quimérica. En la realización más preferida de la invención, el dominio variable modificado es de origen humano o una versión humanizada de un dominio variable de cualquier especie.

Un dominio variable de inmunoglobulina humanizado tiene al menos aproximadamente el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente el 55 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina humana nativa.

Un dominio variable de inmunoglobulina humanizada tiene además al menos aproximadamente el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente el 55 % de identidad de secuencia de

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aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos cuando se comparan los aminoácidos accesibles de superficie con los aminoácidos accesibles de superficie de una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina humana nativa.

Homología preferida o identidades de secuencia se refiere específicamente a aquellas secuencias de la región estructural.

La inmunoglobulina preferida según la invención comprende un dominio que tiene al menos el 50 % de homología con el dominio no modificado.

El término "homología" indica que los polipéptidos tiene los mismos restos o restos conservados en una posición correspondiente en su estructura primaria, secundaria o terciaria. El término también se extiende a dos o más secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos homólogos.

"Dominio de inmunoglobulina homólogo" significa un dominio de inmunoglobulina según la invención que tiene al menos aproximadamente el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de dominio de inmunoglobulina de secuencia nativa de longitud completa o cualquier otro fragmento de una secuencia de dominio de inmunoglobulina de longitud completa como se desvela en el presente documento. Preferentemente, un dominio de inmunoglobulina homólogo tendrá al menos aproximadamente el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente el 55 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente el 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más

preferentemente al menos aproximadamente el 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de dominio de inmunoglobulina nativa, o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de dominio de inmunoglobulina de longitud completa como se desvela en el presente documento.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de dominio de inmunoglobulina identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas formas que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el alineamiento máximo con respecto a la longitud completa de las secuencias que se comparan.

Los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos pueden obtenerse como se describe más adelante usando el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se establecen a los valores por defecto. Aquellos no establecidos a los valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se establecen con los siguientes valores: distancia de superposición=1, fracción de superposición=0,125, umbral de la palabra (T) = 11 y matriz de puntuación=BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST-2, se determina un valor del % de identidad de la secuencia de aminoácidos dividiendo (a) el número de restos de aminoácidos idénticos correspondientes entre la secuencia de aminoácidos del dominio variable de inmunoglobulina de interés que tiene una secuencia derivada del dominio variable de inmunoglobulina nativa y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia contra que el dominio variable de inmunoglobulina de interés está siendo comparada que puede ser el dominio variable de inmunoglobulina no modificada) como se ha determinado por WU-BLAST-2 entre (b) el número total de restos de aminoácidos de las partes no aleatorizadas del dominio variable de inmunoglobulina de interés. Por ejemplo, en la afirmación "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos X que tiene o que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos Y", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del dominio variable de inmunoglobulina de interés.

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En una realización preferida, el polipéptido según la invención es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo monocatenario biespecífico o un Fab biespecífico o un sdAb biespecífico. Se prefiere además que el polipéptido comprenda un dominio biespecífico o una parte del mismo. Ejemplos específicos se refieren a moléculas de Fab o dAb con funcionalidad adicional a través del nuevo sitio de unión en el lado opuesto de la región CDR. La inmunoglobulina preferida según la invención, que es una molécula de Fab, puede, por ejemplo, contener uno o dos sitios de unión adicionales en el lado de bucle del extremo C de un dominio CH1 y/o Cl. La inmunoglobulina preferida según la invención, que es una molécula de dAb, puede, por ejemplo, contener un sitio de unión adicional en el lado de bucle del extremo C de un dominio Vh, Vhh o Vl. Por tales sitios de unión adicionales pueden añadirse funcionalidades adicionales como semivida prolongada (por ejemplo, mediante la unión a un FcRn o proteínas del suero, tales como albúmina o IgG), o función efectora (por ejemplo, mediante la unión a receptores de linfocitos T, C1q o CD64) a las moléculas. Según tales ejemplos, las bibliotecas de Fab o dAb dedicadas se prepararían con un tamaño apropiado para permitir la selección de los ligantes específicos para los componentes de unión específica.

El dominio variable preferido según la invención está seleccionado del grupo de VH, VL, que incluyen Vkappa y Vlambda, VHH y combinaciones de los mismos. Resultó que aquellas modificaciones son de ventaja específica cuando se introducen en bucles o regiones de bucle de un VH, un Vkappa, un Vlambda o un VHH, y los bucles modificados o regiones de bucle comprenden al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 o aminoácidos 106 a 117.

Los bucles estructurales o regiones de bucle de la inmunoglobulina o dominio variable de la inmunoglobulina de origen humano o humanizado como se modificaron según la invención están seleccionados preferentemente de los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 y aminoácidos 89 a 101, lo más preferentemente posiciones de aminoácidos 12 a 17, posiciones de aminoácidos 45 a 50, posiciones de aminoácidos 69 a 75 y posiciones de aminoácidos 93 a 98.

En otra realización preferida, una modificación en los bucles estructurales o regiones de bucle que comprenden aminoácidos 93 a 98 se combina con una modificación en los bucles estructurales o regiones de bucle que comprenden los aminoácidos 8 a 20.

Las regiones de aminoácidos anteriormente identificadas de las inmunoglobulinas respectivas son bucles o regiones de bucle especificados por ser adecuadas para fines de modificación según la invención. Preferentemente, las combinaciones de tales modificaciones, por ejemplo en al menos dos de los bucles o regiones de bucle especificados, se manipulan en la inmunoglobulina según la invención.

Preferentemente, una modificación en el bucle estructural o la región de bucle que comprende los aminoácidos 93 a 98 se combina con una modificación en uno o más de los otros bucles estructurales.

En una realización preferida, una modificación en el bucle estructural o región de bucle que comprende los aminoácidos 93 a 98 se combina con una modificación en la región de bucle estructural que comprende los aminoácidos 69 a 75.

Lo más preferentemente, cada uno de los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 93 a 98, aminoácidos 69 a 75 y aminoácidos 8 a 20 contienen al menos una modificación de aminoácidos.

En otra realización preferida, cada uno de los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 93 a 98, aminoácidos 69 a 75, aminoácidos 44 a 50 y aminoácidos 8 a 20 contienen al menos una modificación de aminoácidos.

Según una realización preferida de la presente invención, los bucles estructurales o regiones de bucle de una inmunoglobulina o el dominio variable de la inmunoglobulina de origen murino, por ejemplo un VH, comprenden los aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 y aminoácidos 92 a 101.

Según otra realización preferida de la presente invención, los bucles estructurales o regiones de bucle de una inmunoglobulina o el dominio variable de la inmunoglobulina de origen camélido, por ejemplo VHH, comprenden los aminoácidos 7 a 18, aminoácidos 43 a 55, aminoácidos 68 a 75 y aminoácidos 91 a 101.

Los dominios variables de origen camélido o variantes humanizadas de origen camélido tienen la ventaja que podrían combinarse fácilmente con otros dominios variables, por ejemplo con otros VHH de origen camélido, modificados o nativos. La posible combinación de VHH de origen camélido es la base para las inmunoglobulinas multivalentes. Así, según la invención, dominios variables modificados específicos de origen camélido son combinaciones multivalentes, preferentemente con al menos 3, más preferentemente con al menos 4 o 5 valencias o VHH.

Preferentemente, los nuevos sitios de unión al antígeno en los bucles estructurales se introducen en la inmunoglobulina codificada por el ácido nucleico seleccionado por sustitución, deleción y/o inserción de al menos un nucleótido.

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Según otra realización preferida de la presente invención, la modificación de al menos un nucleótido en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle produce una sustitución, deleción y/o inserción en la inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina codificado por dicho ácido nucleico.

La modificación de al menos dos bucles o regiones de bucle de una inmunoglobulina o dominio variable de anticuerpo puede producir una sustitución, deleción y/o inserción de 2 o más aminoácidos, preferentemente mutaciones puntuales, cambio de aminoácidos de bucles completos, más preferido el cambio de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, hasta 30 aminoácidos. Sin embargo, el máximo número de aminoácidos insertados en un bucle estructural o región de bucle de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina puede no superar en casos específicos el número de 30, preferentemente 25, más preferentemente 20 aminoácidos.

Así, la secuencia modificada comprende los aminoácidos no incluidos en las regiones conservadas de los bucles estructurales, siendo los aminoácidos recientemente introducidos existentes de forma natural, pero extraños al sitio de modificación, o sustitutos de aminoácidos que existen de forma natural. Cuando el aminoácido extraño está seleccionado de un grupo de aminoácidos específico, tales como aminoácidos con polaridad específica, o hidrofobia, puede obtenerse una biblioteca enriquecida en el grupo de aminoácidos específico en las posiciones aleatorizadas según la invención. Tales bibliotecas también se llaman bibliotecas "enfocadas".

Los al menos dos bucles o regiones de bucle son preferentemente mutadas o modificadas por métodos al azar, semi-al azar o, en particular, por mutagénesis al azar dirigida al sitio.

Un método preferido para introducir modificaciones es la mutación al azar dirigida al sitio. Con este método, dos o más restos de aminoácidos específicos de los bucles se intercambian o introducen usando inserciones aleatoriamente generadas en tales bucles estructurales. Alternativamente se prefiere el uso de enfoques combinatorios.

En otra realización preferida, al menos tres bucles estructurales o regiones de bucle de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina se mutan o modifican por métodos al azar, semi-al azar o, en particular, por mutagénesis al azar dirigida al sitio.

Estos métodos pueden usarse para hacer modificaciones de aminoácidos en las posiciones deseadas de las inmunoglobulinas o dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención. En estos casos, las posiciones se eligen al azar, o se hacen cambios de aminoácidos usando ciertas reglas. Por ejemplo, pueden mutarse ciertos restos a cualquier aminoácido, mientras que otros restos pueden mutarse a un conjunto limitado de aminoácidos. Esto puede lograrse de una forma escalonada alternando los ciclos de mutación y selección, o simultáneamente.

La molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada puede comprender las unidades de repetición identificadas en el presente documento, que codifican todos los aminoácidos conocidos que existen de forma natural o un subconjunto de los mismos. Aquellas bibliotecas que contienen secuencias modificadas en las que se usa un subconjunto específico de aminoácidos para fines de modificación se llaman bibliotecas "enfocadas". El miembro de tales bibliotecas tiene una elevada probabilidad de un aminoácido de un subconjunto tal en la posición modificada, que es al menos dos veces superior a la usual, preferentemente al menos 3 veces o incluso al menos 4 veces más alta. Tales bibliotecas también tienen un número limitado o más bajo de miembros de biblioteca, de manera que el número de miembros de biblioteca real alcance el número de miembros de biblioteca teóricos. En algunos casos, el número de miembros de biblioteca de una biblioteca enfocada no es inferior a 103 veces el número teórico, preferentemente no inferior a 102 veces, lo más preferentemente no inferior a 10 veces.

Una biblioteca según la invención puede diseñarse como una biblioteca que contiene o que consiste en miembros de biblioteca de un formato de inmunoglobulina específico. Aquellas bibliotecas que están consistiendo en formato molecular de inmunoglobulina específico se llaman biblioteca dedicada con el fin de la presente invención. Las bibliotecas dedicadas preferentemente contienen la mayoría de los formatos específicos, al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferido al menos el 70 %, más preferido al menos el 80 %, más preferido al menos el 90 %, o aquellas que esencialmente consisten en formatos de anticuerpo específicos. Se prefieren los formatos de anticuerpo específicos, de forma que la biblioteca preferida según la invención esté seleccionada del grupo que consiste en una biblioteca de VH, biblioteca de vHh, biblioteca de Vkappa, biblioteca de Vlambda, biblioteca de Fab, una biblioteca de CH1/CL y una biblioteca de CH3. Las bibliotecas caracterizadas por el contenido de moléculas compuestas que contienen más de un dominio de anticuerpo, tales como una biblioteca de IgG o biblioteca de Fc, son especialmente preferidas. Otras bibliotecas preferidas son aquellas que contienen receptores de linfocitos T, que forman bibliotecas de receptores de linfocitos T. Bibliotecas preferidas adicionales son bibliotecas de epítope, en las que la proteína de fusión comprende una molécula con una variante de un epítope, que también permite la selección de moléculas competitivas que tienen función de unión similar, pero funcionalidad diferente. A modo de ejemplo es una biblioteca de TNFalfa, en la que trímeros de la proteína de fusión de TNFalfa se presentan por un único paquete genético.

Sin embargo, el máximo número de aminoácidos insertado en un bucle o región de bucle de una inmunoglobulina preferentemente no puede superar el número 30, preferentemente 25, más preferentemente 20 aminoácidos como

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máximo. La sustitución y la inserción de los aminoácidos se producen preferentemente aleatoriamente o semi- aleatoriamente usando todos los aminoácidos posibles o una selección de aminoácidos preferidos para fines de aleatorización, por métodos conocidos en la técnica y como se desvela en la presente solicitud de patente.

El sitio de modificación puede estar en un bucle estructural individual específico o una región de bucle estructural. Una región de bucle normalmente está compuesta por al menos dos, preferentemente al menos 3 o al menos 4 bucles que son adyacentes entre sí, y que pueden contribuir a la unión de un antígeno mediante la formación de un sitio de unión al antígeno o bolsillo de unión al antígeno. Se prefiere que el uno o más sitios de modificación se localicen dentro del área de 10 aminoácidos, más preferentemente dentro de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 hasta 100 aminoácidos, en particular dentro de una región de bucle estructural para formar una superficie o bolsillo donde el antígeno pueden acceder estéricamente a las regiones de bucle.

El al menos un bucle o región de bucle está preferentemente mutado o modificado para producir bibliotecas, preferentemente por métodos al azar, semi-al azar o, en particular, por mutagénesis al azar dirigida al sitio, en particular para delecionar, intercambiar o introducir inserciones aleatoriamente generadas en bucles estructurales. Alternativamente, se prefiere el uso de enfoques combinatorios. Puede emplearse cualquiera de los métodos de mutagénesis conocidos, entre ellos la mutagénesis en casete. Estos métodos pueden usarse para hacer modificaciones de aminoácidos en las posiciones deseadas de la inmunoglobulina de la presente invención. En algunos casos, las posiciones se eligen aleatoriamente, por ejemplo con cualquiera de los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para aleatorizar secuencias de bucles, o se hacen cambios de aminoácidos usando reglas simplistas. Por ejemplo, todos los residuos pueden mutarse preferentemente a aminoácidos específicos, tales como alanina, denominado barrido de aminoácido o de alanina. Tales métodos pueden acoplarse con enfoques de ingeniería más sofisticados que emplean métodos de selección para cribar niveles más altos de diversidad de secuencia.

Un método preferido según la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada que codifica una inmunoglobulina, dominio de inmunoglobulina o una parte de la misma que comprende al menos una unidad de repetición de nucleótido dentro de una región codificante de bucle estructural que tiene la secuencia 5'- NNS-3', 5'-NNN-3', 5'-NNB-3' o 5'-NNK-3'. En algunas realizaciones, el ácido nucleico modificado comprende codones de nucleótido seleccionados del grupo de TMT, WMT, BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS o cualquier combinación de los mismos (la codificación es según IUPAC).

La molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada puede comprender las unidades de repetición anteriormente identificadas, que codifican todos los aminoácidos que existen de forma natural conocidos o un subconjunto de los mismos.

La modificación de la molécula de ácido nucleico puede realizarse introduciendo oligonucleótidos sintéticos en un segmento más grande de ácido nucleico o por síntesis de novo de una molécula de ácido nucleico completa. La síntesis de ácido nucleico puede realizarse con elementos estructurales de tri-nucleótido que reducirían el número de combinaciones de secuencia antisentido si un subconjunto de aminoácidos va a codificarse (por ejemplo, Yanez et al. Nucleic Acids Res. (2004) 32:e158; Virnekas et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607).

Preferentemente, las posiciones que van a modificarse son aminoácidos expuestos en la superficie. La exposición superficial de aminoácidos de bucles estructurales puede ser juzgada a partir de las estructuras de proteína conocidas de dominios variables de anticuerpo y por analogía u homología de tales secuencias de aminoácidos para las que no está disponible estructura experimentalmente determinada.

En una realización preferida de la invención, las modificaciones introducidas en los al menos dos bucles estructurales comprenden al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos extraños o aminoácidos que no existen de forma natural en el sitio respectivo del bucle estructural de la inmunoglobulina no modificada o dominio variable de inmunoglobulina.

La modificación de aminoácidos puede estar preferencialmente sesgada con el fin de introducir en bucles estructurales o regiones de bucle aminoácidos que son conocidos por estar frecuentemente implicados en las interacciones proteína-proteína (por ejemplo, Lea & Stewart (1995) FASEB J. 9:87-93; Fellhouse et al. (2006) J. Mol. Biol. 357:100-114; Adib-Conquuy et al. (1998) International Immunology 10:341-346; Lo Conte et al. (1999) J. Mol. Biol. 285:2177-2198; Zemlin et al. (2003) J. Mol. Biol. 334:733-749).

Según una realización de la invención, una inmunoglobulina obtenible por el método según la invención se usa para la preparación de una biblioteca con miembros de biblioteca que presentan o que codifican las inmunoglobulinas según la invención, específicamente una biblioteca de proteínas, proteínas de fusión, células, en particular células microbianas, como células bacterianas o de levadura, fagos, virus, ácidos nucleicos o ribosomas.

La siguiente memoria descriptiva no solo se refiere a bibliotecas de variantes de polipéptidos o de proteína, sino, por supuesto, también a las bibliotecas alternativas usadas para expresar las inmunoglobulinas según la invención, por ejemplo como se ha mencionado anteriormente.

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En una realización preferida, una biblioteca de variantes de polipéptidos que comprende inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina de la invención se usa como conjunto para la selección, en la que las modificaciones contienen o introducen al menos uno, más preferentemente al menos dos aminoácidos por bucle estructural modificado del grupo de los aminoácidos triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina y asparagina.

Resultó que según la invención, un polipéptido de dominio variable de variante puede proporcionarse con mutaciones específicas que son extrañas para los polipéptidos nativos. Cualquiera de los aminoácidos triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina y asparaginas no están presentes en los bucles estructurales de inmunoglobulinas nativas humanas, así se consideran "extraños". Un polipéptido de variante según la invención puede contener al menos dos de dichos aminoácidos extraños en los bucles estructurales, por modificación de al menos un bucle estructural y para constituir un sitio de unión.

Si la inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina es de origen humano o un dominio variable de inmunoglobulina humanizada, modificaciones preferidas son la incorporación de al menos una tirosina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 50, 69 a 75 y 93 a 98, y/o al menos un triptófano en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 50, 69, 71 a 75, 93 a 94 y 96 a 98, y/o al menos una histidina en una cualquiera de las

posiciones 12 a 17, 46, 47, 49, 50, 69 a 74 y 93 a 98, y/o al menos una asparagina en una cualquiera de las

posiciones 12 a 17, 45 a 47, 49, 50, 70 a 73, 75, 94 a 96 y 98, y/o al menos una metionina en una cualquiera de las

posiciones 12 a 17, 46 a 50, 69 a 71, 73 a 75, 93, 95, 96 y 98, y/o al menos una serina en una cualquiera de las

posiciones 13, 71, 75, 94, 95 y 98, y/o al menos una isoleucina en una cualquiera de las posiciones 12, 14 a 17, 45 a 50, 69, 70, 72 a 75, 93 y 96 a 98, y/o al menos una fenilalanina en una cualquiera de las posiciones 15, 46, 48, 70 a 73, 75, 93, 95 y 98.

Según otra realización preferida de la presente invención, se modifican al menos dos restos de aminoácidos en las posiciones 15 a 17, 29 a 34, 85,4 a 85,3, 92 a 94, 97 a 98 y/o 108 a 110 de un anticuerpo de un solo dominio humano o humanizado.

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina (y siempre incluidas en toda la memoria descriptiva entera: inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulina que comprenden un dominio variable de inmunoglobulina modificada) pueden clonarse en células hospedadoras, expresarse y ensayarse para sus especificidades de unión. Estas prácticas se llevan a cabo usando procedimientos muy conocidos, y varios métodos que pueden encontrar uso en la presente invención se describen en Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Los ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención pueden incorporarse en un vector de expresión con el fin de expresar dichas inmunoglobulinas. Los vectores de expresión normalmente comprenden una inmunoglobulina operativamente unida - que se pone en una relación funcional - con secuencias de control o reguladoras, marcadores de selección, cualquier componente de fusión, y/o elementos adicionales. Las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención pueden producirse cultivando una célula hospedadora transformada con ácido nucleico, preferentemente un vector de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica las inmunoglobulinas modificadas, en condiciones apropiadas para inducir o producir la expresión de las inmunoglobulinas modificadas. Los métodos de introducción de moléculas de ácidos nucleicos exógenas en un hospedador son muy conocidos en la técnica, y variarán con el hospedador usado. Por supuesto, también pueden emplearse sistemas de expresión no celulares o libres de células para la expresión de inmunoglobulinas modificadas.

En una realización preferida de la presente invención, las inmunoglobulinas modificadas se purifican o aíslan después de la expresión. Las inmunoglobulinas modificadas pueden aislarse o purificarse en varias formas conocidas para aquellos expertos en la materia. Métodos de purificación estándar incluyen técnicas cromatográficas, técnicas electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, diálisis, filtración, concentración y cromatoenfoque. La purificación puede ser frecuentemente permitida por un componente de fusión particular. Por ejemplo, pueden purificarse anticuerpos usando resina de glutatión si se emplea una fusión de GST, cromatografía de afinidad por Ni2+ si se emplea una marca de His o anticuerpo anti-flag inmovilizado si se usa una marca flag. Para orientación general en técnicas de purificación adecuadas véase, por ejemplo, Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 1994, 3a ed., Springer-Science and Business Media Inc., NY o Roe, "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", 2001, Oxford University Press. Por supuesto, también es posible expresar las inmunoglobulinas modificadas según la presente invención sobre la superficie de un hospedador, en particular sobre la superficie de una célula bacteriana, de insecto o de levadura, o sobre la superficie de fagos o virus.

Las inmunoglobulinas modificadas de la invención pueden cribarse usando varios métodos, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos que usan ensayos in vitro, in vivo y ensayos basados en células, y tecnologías de selección. Pueden utilizarse automatización y tecnologías de cribado de alto rendimiento en los procedimientos de cribado. El cribado puede emplear el uso de un componente de fusión o marca, por ejemplo una enzima, una marca inmunitaria, marca isotópica, o marca de molécula pequeña tal como un colorante fluorescente o colorimétrico, o una molécula luminogénica.

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En una realización preferida, las propiedades funcionales y/o biofísicas de las inmunoglobulinas se criban en un ensayo in vitro. En una realización preferida, el anticuerpo se criba para funcionalidad, por ejemplo su capacidad para catalizar una reacción o su especificidad de unión, reactividad cruzada y/o afinidad por su diana.

En otra realización preferida, los dominios de inmunoglobulina modificados favorables pueden seleccionarse in vivo, por ejemplo introduciéndolo en una célula o un organismo. Las variantes de unión específicas pueden aislarse ya sea de un líquido corporal tal como sangre o líquido linfático o de órganos específicos, dependiendo de las propiedades requeridas de los dominios modificados.

Los ensayos pueden emplear varios métodos de detección que incluyen, pero no se limitan a, marcas cromogénicas, fluorescentes, luminiscentes o isotópicas.

Como es muy conocido en la técnica, hay varias tecnologías de selección que pueden usarse para la identificación y el aislamiento de proteínas con ciertas características de unión y afinidades, que incluyen, por ejemplo, tecnologías de presentación tales como presentación en fagos, presentación en ribosomas, presentación en superficie celular, y similares, como se describe más adelante. Métodos para la producción y cribado de variantes de anticuerpo son muy conocidos en la técnica. Métodos generales para la biología molecular, expresión, purificación y cribado de anticuerpos se describen en Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Como se conoce en la técnica, algunos métodos de cribado seleccionan miembros favorables de una biblioteca. Los métodos se denominan en el presente documento "métodos de selección", y estos métodos encuentran uso en la presente invención para cribar inmunoglobulinas modificadas. Cuando se criban bibliotecas de dominio variable de inmunoglobulina de variante usando un método de selección, solo aquellos miembros de una biblioteca que son favorables, es decir, que cumplen algunos criterios de selección, se propagan, aíslan y/u observan. Como se apreciará, debido a que solo se observan las variantes de idoneidad, tales métodos permiten el cribado de bibliotecas que son mayores que aquellas cribables por métodos que ensayan la idoneidad de miembros de biblioteca individualmente. La selección se permite por cualquier método, técnica o componente de fusión que enlace, covalentemente o no covalentemente, el fenotipo de inmunoglobulinas con su genotipo que es función de un anticuerpo con el ácido nucleico que lo codifica. Por ejemplo, el uso de presentación en fagos como método de selección se permite por la fusión de miembros de bibliotecas con una proteína de la cubierta del fago (el más frecuentemente usado es la proteína del gen III de bacteriófago filamentoso, sin embargo también pueden usarse otras proteínas de la cubierta tales como proteína VIII, proteína VII, proteína VI y proteína IX). De esta forma, la selección o aislamiento de inmunoglobulinas modificadas que cumplen algunos criterios, por ejemplo afinidad de unión por la diana de inmunoglobulina, también selecciona o aísla el ácido nucleico que lo codifica. Una vez aislado, el gen o genes que codifican inmunoglobulinas modificadas pueden entonces amplificarse. Este proceso de aislamiento y amplificación, denominado inmunopurificación, puede repetirse, permitiendo que se enriquezcan variantes de dominio variable de anticuerpo favorables en la biblioteca. La secuenciación de ácidos nucleicos del ácido nucleico unido por último lugar permite la identificación de genes.

Se conocen en la técnica varios métodos de selección que pueden encontrar uso en la presente invención para cribar bibliotecas de inmunoglobulina o de dominios variables de inmunoglobulina. Éstos incluyen, pero no se limitan a, presentación en fagos (Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315- 1317) y sus derivados tales como infección selectiva de fagos (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551), fagos selectivamente infecciosos (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630) e inmunopurificación de infectividad retardada (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904), presentación en superficie celular (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399) tal como presentación en células de bacteria (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29- 34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80), levadura (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557) y de mamífero (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), además de tecnologías de presentación in vitro (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405) tales como presentación en polisomas (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026), presentación en ribosomas (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942), presentación en ARNm (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405-408) y sistema de presentación por inactivación en ribosomas (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

Otros métodos de selección que pueden encontrar uso en la presente invención incluyen métodos que no se basan en presentación, tales como métodos in vivo que incluyen, pero no se limitan a, expresión periplásmica y cribado citométrico (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542), el ensayo de complementación de fragmentos de anticuerpo (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146) y el cribado de dos híbridos de levadura (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246) usado en el modo de selección (Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728). En una realización alternativa, la selección se permite por un componente de fusión que se une a una secuencia específica sobre el vector de expresión, enlazando así covalentemente o no covalentemente el componente de fusión y el miembro de

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biblioteca de inmunoglobulinas asociado con el ácido nucleico que los codifica. Por ejemplo, el documento WO9308278 describe un componente de fusión tal y técnica que puede encontrar uso en la presente invención. En una realización alternativa, puede producirse selección in vivo si la expresión del anticuerpo confiere alguna ventaja de crecimiento, reproducción o supervivencia a la célula.

Algunos métodos de selección se denominan métodos de "evolución dirigida". Aquellos métodos incluyen el apareamiento o cruce de secuencias favorables durante la selección, algunas veces con la incorporación de nuevas mutaciones. Como será apreciado por aquellos expertos en la materia, métodos de evolución dirigida pueden facilitar la identificación de las secuencias más favorables en una pluralidad de polipéptidos, y pueden aumentar la diversidad de secuencias que se criban. Se conocen en la técnica varios métodos de evolución dirigida que pueden encontrar uso en la presente invención para generar y cribar variantes de dominio variable de anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, barajado de ADN (documentos PCT WO00/42561; PCT WO 01/70947), barajado de exones (Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428), barajado de familias (Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291), aleatorización combinatoria selectiva (documentos WO03012100, WO04018674A1), quimeragénesis aleatoria en moldes transitorios (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354-359), evolución molecular por el proceso de extensión escalonado (StEP), recombinación in vitro (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683), ensamblaje de genes mediado por exonucleasas (patente de EE.UU. N.° 6.352.842; patente de EE.UU. N.° 6.361.974), mutagénesis de saturación de sitio génico (patente de EE.UU. N.° 6.358.709), reensamblaje de genes (patente de EE.UU. N.° 6.358.709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci Usa 98:11248-11253), métodos de fragmentación de ADN (Kikuchi et al., Gene 236:159-167), barajado de ADN monocatenario (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137), y tecnología de cribado de anticuerpos de evolución dirigida (Applied Molecular Evolution) (patente de EE.UU. N.° 5.824.514; patente de EE.UU. N.° 5.817.483; patente de EE.UU. N.° 5.814.476; patente de EE.UU. N.° 5.763.192; patente de EE.UU. N.° 5.723.323).

En una realización preferida, las inmunoglobulinas o variantes de dominio variable de anticuerpo se criban usando uno o más ensayos basados en células o in vivo. Para tales ensayos, se añaden exógenamente inmunoglobulinas modificadas purificadas o no purificadas o dominios variables de inmunoglobulina normalmente de forma que las células se expongan a inmunoglobulinas individuales o dominios variables de inmunoglobulina modificada o conjuntos de dominios variables de inmunoglobulina modificada que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos normalmente se basan, pero no siempre, en la función deseada de la inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina; es decir, la capacidad del anticuerpo o dominio variable de anticuerpo modificado según la invención para unirse a su diana y para mediar en algún evento bioquímico, por ejemplo función efectora, inhibición de la unión a ligando/receptor, apoptosis, y similares. Tales ensayos frecuentemente implican monitorizar la respuesta de células al dominio variable de anticuerpo, por ejemplo supervivencia celular, muerte celular, cambio en la morfología celular, o activación transcripcional tal como expresión celular de un gen natural o gen indicador. Por ejemplo, tales ensayos pueden medir la capacidad de variantes del dominio de inmunoglobulina variable para provocar ADCC, ADCP o CDC. Para algunos ensayos, puede necesitarse añadir células o componentes adicionales, es decir, además de las células diana, por ejemplo complemento del suero, o células efectoras tales como monocitos de sangre periférica (CMSP), células NK, macrófagos, y similares. Tales células adicionales pueden ser de cualquier organismo, preferentemente seres humanos, ratones, rata, conejo y mono. Las inmunoglobulinas pueden producir la apoptosis de ciertas líneas celulares que expresan la diana, o pueden mediar en el ataque en células diana por células inmunitarias que han sido añadidas al ensayo. Métodos de monitorización de la muerte o viabilidad celular se conocen en la técnica, e incluyen el uso de colorantes, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. Por ejemplo, los ensayos de tinción de caspasa pueden permitir medir la apoptosis, y la captación o liberación de sustratos radiactivos o colorantes fluorescentes puede permitir monitorizar el crecimiento celular o la activación.

Alternativamente, pueden monitorizarse células diana muertas o dañadas midiendo la liberación de uno o más componentes intracelulares naturales, por ejemplo lactato deshidrogenasa. La activación transcripcional puede también servir de método para ensayar la función en ensayos basados en célula. En este caso, la respuesta puede monitorizarse ensayando genes naturales que pueden regularse por incremento, por ejemplo puede medirse la liberación de ciertas interleucinas, o alternativamente la lectura puede ser mediante un sistema indicador. Los ensayos basados en célula pueden también implicar la medida de cambios morfológicos de células como una respuesta a la presencia de dominios variables de inmunoglobulina modificada. Tipos de células para tales ensayos pueden ser procariotas o eucariotas, y puede emplearse varias líneas celulares que se conocen en la técnica.

Alternativamente, pueden realizarse cribados basados en células usando células que han sido transformadas o transfectadas con ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de inmunoglobulina de variantes. En este caso, no se añaden exógenamente variantes de dominio variable de anticuerpo de la invención a las células (por ejemplo, Auf der Maur, 2004, Methods, 34:215-224). En otro método alternativo, el cribado basado en células utiliza presentación en la superficie celular. Puede emplearse un componente de fusión que permite la presentación de dominios variables de inmunoglobulina modificada sobre la superficie de células (Wittrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

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En una realización preferida, la inmunogenicidad de las inmunoglobulinas modificadas puede ser cambiada y determinada experimentalmente usando uno o más ensayos inmunológicos o basados en células (por ejemplo, Koren et al., 2002, Current Pharmaceutical Biotechnology 3:349-360; Chirino et al., 2004, Drug Discovery Today 9:82-90; Tangri et al., 2005, J. Immunol. 174:3187-3196; Hermeling et al., 2004, Pharm. Res. 21:897-903). En una realización preferida, se usan ensayos de activación de linfocitos T ex vivo para cuantificar experimentalmente la inmunogenicidad. En este método, se exponen células presentadoras de antígenos y linfocitos T intactos de donantes correspondientes a un péptido o anticuerpo completo o inmunoglobulina de interés. La activación de linfocitos T puede detectarse usando varios métodos, por ejemplo, monitorizando la liberación de citocinas o midiendo la captación de timidina tritiada. En realizaciones preferidas, se usa la tecnología LUMINEX para medir la liberación de citocinas (por ejemplo, de Jager et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2003, 10:133-139) o se monitoriza la producción de interferón gamma usando ensayos Elispot (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth, 24: 17-24).

Las propiedades biológicas o funcionales de las inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención pueden caracterizarse en experimentos de células, tejidos y de organismo completo. Como se conoce en la técnica, los fármacos se prueban frecuentemente en animales, que incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, con el fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad, o para medir una farmacocinética de fármaco, toxicidad, y otras propiedades. Los animales pueden denominarse modelos de enfermedad. Los terapéuticos se prueban frecuentemente en ratones, que incluyen, pero no se limitan a, ratones sin pelo, ratones SCID, ratones de xenoinjerto y ratones transgénicos (incluyendo mutantes activados e inactivados genéticos). Tal experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial de la variante de polipéptido que va a usarse como terapéutico. Cualquier organismo, preferentemente mamíferos, puede usarse para la prueba. Debido a su similitud genética con los seres humanos, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados, y así pueden usarse para probar la eficacia, toxicidad, farmacocinética, u otra propiedad de las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención. Las pruebas los candidatos a fármacos en seres humanos son principalmente requeridas para la autorización como agentes terapéuticos, y así por supuesto se contemplan estos experimentos. Así, las inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención pueden probarse en seres humanos para determinar su eficacia terapéutica, toxicidad, inmunogenicidad, farmacocinética, farmacodinámica y/u otras propiedades clínicas.

La inmunoglobulina según la presente invención puede usarse para cualquier fin conocido en la técnica para inmunoglobulinas, pero también permite aplicaciones que están dependiendo de la combinación de especificidades introducidas por la presente invención.

En una realización, la variante de anticuerpo de la presente invención se usa para terapia o profilaxis, para uso preparativo o analítico, como un diagnóstico, un compuesto industrial o un reactivo de investigación, preferentemente un agente terapéutico. La variante de anticuerpo puede encontrar uso en una composición de anticuerpo que es monoclonal, oligoclonal o policlonal. En una realización preferida, las inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención se usan para destruir células diana que llevan el antígeno diana, por ejemplo células cancerosas. En una realización alternativa, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar el antígeno diana, por ejemplo antagonizando una citocina o receptor de citocina. En una realización alternativamente preferida, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar el antígeno diana y destruir las células diana que llevan el antígeno diana.

En una realización alternativamente preferida, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento y destruir las células diana que llevan o necesitan el antígeno diana. En una realización alternativamente preferida, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar enzimas y sustrato de enzimas. En otra realización alternativamente preferida, los dominios variables de inmunoglobulina modificada de la presente invención se usan para neutralizar agentes infecciosos tales como virus, virus pequeños, priones, bacterias u hongos.

Las inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención pueden usarse para diversos fines terapéuticos. En una realización preferida, un anticuerpo que comprende la inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina se administra a un paciente para tratar un trastorno específico. Un "paciente" para los fines de la presente invención incluye tanto seres humanos como otros animales, preferentemente mamíferos y lo más preferentemente seres humanos. Por "trastornos específicos" en el presente documento se indica un trastorno que puede ser mejorado por la administración de una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención.

En una realización, una inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención es el único agente terapéuticamente activo administrado a un paciente. Alternativamente, la inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención se administra en combinación con uno o varios de otros agentes terapéuticos, que incluyen, pero no se limitan a, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de

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cinasas, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores, u otros agentes terapéuticos. La inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina puede administrarse concomitantemente con una o varias de otras pautas terapéuticas. Por ejemplo, una variante de anticuerpo de la presente invención puede formularse y administrarse al paciente junto con quimioterapia, radioterapia, o tanto quimioterapia como radioterapia. En una realización, la inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención puede administrarse conjuntamente con uno o más anticuerpos, que pueden o pueden no comprender una variante de anticuerpo de la presente invención. Según otra realización de la invención, la inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención y una o varias de otras terapias antineoplásicas se emplean para tratar células cancerosas ex vivo. Se contempla que tal tratamiento ex vivo puede ser útil en el trasplante de médula ósea y particularmente trasplante autólogo de médula ósea. Se contempla, por supuesto, que los anticuerpos de la invención pueden emplearse en combinación con todavía otras técnicas terapéuticas tales como cirugía.

Otros varios agentes terapéuticos pueden encontrar uso para administración con las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención. En una realización, la inmunoglobulina modificada se administra con un agente antiangiogénico, que es un compuesto que bloquea, o interfiere a cierto grado, con el desarrollo de los vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo un anticuerpo, fusión de Fc, o citocina, que se une a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento implicado en promover la angiogénesis. El factor antiangiogénico preferido en el presente documento es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En una realización alternativa, la inmunoglobulina modificada se administra con un agente terapéutico que induce o potencia la respuesta inmunitaria adaptativa, por ejemplo un anticuerpo que se dirige a CTLA-4. En una realización alternativa, la inmunoglobulina modificada se administra con un inhibidor de tirosina cinasas, que es una molécula que inhibe de algún modo la actividad de tirosina cinasas de una tirosina cinasa. En una realización alternativa, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se administran con una citocina. Por "citocina", como se usa en el presente documento, se indica un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares que incluyen quimiocinas.

Se contemplan composiciones farmacéuticas en las que se formulan las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención y uno o más agentes terapéuticamente activos. Se preparan formulaciones de las variantes de polipéptido de la presente invención para almacenamiento mezclando dicha inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, 16a edición, Osol, A. Ed.,), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Las formulaciones que van a usarse para administración in vivo son preferentemente estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril u otros métodos. Las inmunoglobulinas modificadas y otros agentes terapéuticamente activos desvelados en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas, y/o atraparse en microcápsulas.

La administración de la composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención, preferentemente en forma de una solución acuosa estéril, puede realizarse en varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, por vía oral, por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intranasal, por vía intraótica, por vía transdérmica, por vía tópica (por ejemplo, geles, bálsamos, lociones, cremas, etc.), por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, por vía intrapulmonar, por vía vaginal, por vía parenteral, por vía rectal o por vía intraocular.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de fabricación de una molécula que comprende una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina o una preparación farmacéutica de la misma que comprende al menos una modificación en cada uno de dos bucles estructurales o regiones de bucle de dicha inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina y determinar la unión de dicha molécula a un epítope de un antígeno, en el que la molécula no modificada no se une significativamente a dicho epítope, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina que comprende al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle,

- modificar al menos un resto de nucleótido en cada uno de dichos bucles estructurales o regiones de bucle,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión,

- expresar dicha inmunoglobulina modificada,

- poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con un epítope,

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho epítope, y

- proporcionar la inmunoglobulina modificada que se une a dicho epítope y opcionalmente acabarla una preparación farmacéutica.

En particular, la presente invención se refiere a un método de fabricación de una molécula multi-específica que se une específicamente a al menos una primera molécula o una preparación farmacéutica de la misma que comprende al menos una modificación en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina y determinar la unión específica de dichos al menos dos bucles o regiones de bucle a al menos una segunda molécula seleccionada de antígenos. La inmunoglobulina o

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dominio variable de inmunoglobulina que contiene bucles estructurales no modificados o regiones de bucle no se une específicamente a dicha al menos una segunda molécula.

El método comprende específicamente las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que se une específicamente a al menos una primera molécula que comprende al menos un bucle estructural o región de bucle,

- modificar al menos un resto de nucleótido de al menos uno de dichos bucles o regiones de bucle codificadas por dicho ácido nucleico,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión,

- expresar dicha inmunoglobulina modificada,

- poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con dicha al menos una segunda molécula, y

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une específicamente a la segunda molécula y

- proporcionar la inmunoglobulina modificada que se une específicamente a dicha al menos una segunda molécula y opcionalmente acabarla en una preparación farmacéutica.

Se prefiere la manipulación de más de un sitio de unión o al menos dos especificidades en un miembro de un par de unión específico (Kufer et al. (2004) Trends in Biotechnology vol. 22 páginas 238-244).

Se han hecho numerosos intentos para producir anticuerpos multi-específicos, por ejemplo biespecíficos, monoclonales o fragmentos de anticuerpos. Un problema en la producción de anticuerpos biespecíficos hechos de dos cadenas de polipéptidos diferentes (cadena pesada y ligera) es la necesidad de expresar cuatro cadenas diferentes (dos cadenas pesadas y dos ligeras) en una célula, produciendo varias combinaciones diversas de moléculas que tienen que separarse de la molécula biespecífica deseada en la mezcla. Debido a su similitud, la separación de estas moléculas es difícil y cara. Se han empleado varias técnicas para minimizar la aparición de tales emparejamientos no deseados (Carter (2001) Journal of Immunological Methods, vol 248, páginas 7-15)

Una solución al problema es la producción de una cadena de polipéptidos con dos especificidades, como, por ejemplo, dos scFvs unidos entre sí o la producción de los llamados diacuerpos. Se ha mostrado que tales moléculas están muy lejos del pliegue de una molécula natural y son notoriamente difíciles de producir (LeGall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol 17 páginas 357-366).

Según una realización preferida de la presente invención, el sistema de expresión comprende un vector. Puede usarse cualquier vector de expresión conocido en la técnica para este fin según convenga.

La inmunoglobulina modificada se expresa preferentemente en un hospedador, preferentemente en una bacteria, en levadura, en una célula de planta, en una célula de insecto, en una célula de animal o célula de mamífero o en un órgano de una planta o animal o en una planta completa o animal.

Puede usarse una amplia variedad de células hospedadoras apropiadas para expresar el polipéptido modificado de la invención, que incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero (células de animales), células vegetales, bacterias (por ejemplo, Bacillus subtilis, Escherichia coli), células de insecto y levadura (por ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Por ejemplo, varias líneas celulares que pueden encontrar uso en la presente invención se describe en el catálogo de líneas celulares de ATCC, disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Además, también pueden usarse plantas y animales como hospedadores para la expresión de la inmunoglobulina según la presente invención. La expresión, además de los vectores o casetes de transfección, puede seleccionarse según el hospedador usado.

Por supuesto, también pueden usarse sistemas de expresión en proteína no celulares o libres de células. La expresión de la transcripción/traducción in vitro de plataformas de proteínas, que producen cantidades suficientes de proteína, ofrecen muchas ventajas de una expresión de proteínas libres de células, eliminando la necesidad de laboriosas etapas aguas arriba y aguas bajo (por ejemplo, transformación de células hospedadoras, cultivo o lisis) normalmente asociadas a sistemas de expresión basados en células.

Otro problema del diseño actual de anticuerpos biespecíficos es el hecho de que aunque los anticuerpos originales estén uniéndose bivalentemente a su componente de unión respectivo (por ejemplo, IgG), el anticuerpo biespecífico resultante es monovalente para cada uno del componente de unión respectivo.

Las moléculas multi-específicas preferidas de la presente invención resuelven estos problemas:

Es posible la expresión de una molécula biespecífica como una cadena de polipéptidos (un dominio variable de inmunoglobulina modificado con dos especificidades de unión, véase la sección de ejemplos), que es más fácil de realizar que la expresión de dos cadenas de anticuerpo de polipéptidos (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984).

También puede producirse como una molécula de tipo anticuerpo (es decir, constituida de 2 cadenas de

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polipéptidos). Debido al hecho de que la segunda especificidad se localiza en la parte no CDR de los dominios variables, no hay necesidad de dos cadenas pesadas diferentes o cadenas ligeras diferentes. Así, no hay posibilidad de emparejamiento erróneo de las dos cadenas.

Un anticuerpo de la presente invención puede consistir en una cadena pesada y una cadena ligera, que forman juntas una región de bucle de CDR variable que se une a un componente de unión específica, es decir, una conformación de bucle de CDR específica, y la segunda especificidad puede formarse por bucles estructurales modificados o regiones de bucle contenidas en la molécula de inmunoglobulina, por ejemplo los bucles estructurales de o bien la cadena pesada o bien el dominio variable de la cadena ligera, mientras que se mantiene la conformación de bucle de CDR específica. El sitio de unión también puede formarse por al menos uno o más de un bucle no de CDR en dos dominios variables (por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que pueden ser estructuralmente vecinos).

El anticuerpo modificado puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab, scFv, Fv, minicuerpo, dAb) que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina y modificaciones en los bucles estructurales o regiones de bucle, o derivados de los mismos.

Puede unirse mono- o multivalentemente a componentes de unión o incluso con diferente valencia por los diferentes componentes de unión, dependiendo del diseño. Por ejemplo, un fragmento Fab o, equivalentemente un scFv, puede manipularse de tal forma que los bucles estructurales de los dominios VH y VL se manipulen por separado para unirse al mismo epítope que el sitio de unión formado por las CDR, produciendo un fragmento trivalente Fab o scFv, respectivamente. En otra realización, una inmunoglobulina completa que contiene los mismos dominios VH y VL manipulados se unirán hexavalentemente a su epítope diana. Si, por ejemplo, el sitio de unión natural formado por las CDR reconoce un epítope diana diferente al de los dominio Vh y Vl manipulados, entonces el fragmento Fab o scFv resultante se unirá monovalentemente a la primera diana, y bivalentemente a la segunda diana que se une independientemente por los bucles estructurales modificados del dominio VH y VL, respectivamente. Este principio de diseño modular puede aplicarse en numerosos formas diferentes como será obvio para aquellos expertos en la materia.

Como hay varios bucles estructurales diversos disponibles para la selección y diseño de un sitio de unión específica en las regiones no CDR de dominios pesados y ligeros, es posible diseñar derivados de anticuerpo con incluso más de dos especificidades. Por ejemplo, los dominios VH y VL que reconocen una primera diana por sus CDR pueden manipularse por separado para unirse específicamente a diferentes dianas (segunda y tercera) mediante interacciones mediadas por los bucles estructurales modificados. Así, puede generarse un fragmento triespecífico Fab o scFv, que se une monovalentemente a cada una de su diana. Si los dominios variables modificados de este Fab se manipulan en forma de una IgG de tamaño completo, se genera una IgG manipulada que es triespecífica y se une bivalentemente a cada una de sus tres especificidades.

Los dominios de unión específica dentro de una cadena de polipéptidos pueden conectarse con o sin un conector peptídico.

Algunas clases de anticuerpo pueden considerarse como multi-específicas, en particular biespecíficas, por naturaleza: Se unen a un antígeno (que normalmente es, por ejemplo, o bien una estructura extraña o bien una estructura asociada a cáncer) con la región variable y se unen a moléculas efectoras de Fc con la parte de Fc (por ejemplo, receptores de Fc en diversas células inmunitarias o proteína del complemento), permitiendo así efectos tales como aDcC, ADCP o CDC.

Las moléculas efectoras de Fc se unen por la parte de Fc de una molécula de inmunoglobulina (para IgG1 consiste en los dominios CH2 y CH3) y se han descrito varios métodos para optimizar la función efectora por mejora de la unión de la parte de Fc de una molécula de anticuerpo o bien por técnicas de glucomanipulación (documento US 6.602.684) o bien por ingeniería de proteínas, ya sea directamente en Fc (documento US 2005/0054832) o indirectamente por ingeniería fuera de Fc (documento US 2005/02444403). Ambos, la unión de la región Fc a receptor de Fc y/o la unión a proteínas del complemento tales como Cq1, han sido alteradas por tales técnicas. Normalmente, se intenta mejorar la afinidad de unión a tales moléculas efectoras de Fc, ya que esto se correlaciona con funciones efectoras mejoradas.

Con la actual invención es posible diseñar un anticuerpo que se une a moléculas efectoras de Fc fuera de la región de unión de Fc natural. Bucles modificados en dominios variables de anticuerpo distintos de los bucles implicados en la unión de la molécula efectora de Fc "natural" pueden seleccionarse de una biblioteca de estructuras de bucle modificado o diseñarse para unirse a una o más moléculas efectoras de Fc. Un anticuerpo con tales sitios de unión de molécula efectora de Fc adicionales tendría avidez más fuerte por una cierta molécula efectora de Fc o célula efectora que presenta una molécula efectora de Fc y, por tanto, puede tener un efecto incluso más fuerte que los anticuerpos glucomanipulados o regiones Fc de otro modo mejoradas.

Los fragmentos de anticuerpos tienen ciertas ventajas en comparación con los anticuerpos completos. Los fragmentos tienen normalmente buenas propiedades de biodistribución y pueden producirse más fácilmente. Sin

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embargo, la mayoría de los diseños de fragmentos de anticuerpo carecen de funciones efectoras y tienen corta semivida in vivo (Holliger P, et al. Nat Biotechnol (2005) 23:1126-36.). Ni los dominios CH1 ni Ck o CÁ son capaces de mediar en las funciones efectoras, que es el motivo por el que las moléculas Fab normalmente no muestran ADCC, ADCP o CDC.

El documento WO 02/44215 describe moléculas de unión que consisten en el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo y un péptido que se une a moléculas efectoras de Fc. De tal forma, puede construirse un fragmento de anticuerpo que presenta funciones efectoras. El péptido está siendo incorporado en la molécula de unión en una posición que ni destruye la unión al antígeno ni la capacidad del péptido para unirse a una molécula efectora de Fc.

Según la presente invención, sin embargo, la unión a moléculas efectoras de Fc puede realizarse con inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina que se han seleccionado para la unión de moléculas efectoras de Fc de bibliotecas de dos, tres o cuatro secuencias de bucle estructural aleatorizadas dentro de un armazón fijo de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina. Por tanto, es posible seleccionar secuencias de bucle específicas que no se unirían a moléculas efectoras de Fc si se aislaran del armazón de dominio de Ig. Los polipéptidos resultantes de la presente invención pueden, por tanto, consistir preferentemente en más de 100 aminoácidos y pueden comprender uno o más dominios variables de inmunoglobulina.

Con el fin de seleccionar la posible función efectora de tales dominios variables según la presente invención, pueden seleccionarse bibliotecas de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos que comprenden dominios variables mutantes para unirse a receptores de Fc y/o factores del complemento tales como C1q. Receptores de Fcgamma para la selección pueden proporcionarse o bien sobre la superficie de células que expresan naturalmente los receptores respectivos o bien por la expresión y purificación de la parte extracelular del receptor respectivo. Pueden usarse células U937 estimuladas con IFN-g (CRL-1503, Colección Americana de Cultivos Tipo) como células diana para el aislamiento de los dominios variables de inmunoglobulina modificada presentados en fago que se unen específicamente al receptor de IgG de alta afinidad, FcgammaRI (Berntzen et al., 2006, Protein Eng Des Sel. 19(3): 121-8). La unión al receptor de Fc puede probarse por FACS usando células U937 como diana, células que se tiñen específicamente con dominios variables de inmunoglobulina modificada seleccionados. Además, los dominios extracelulares de receptores de Fcgamma humana pueden clonarse y expresarse como proteínas solubles o proteínas de fusión y usarse para el análisis de la unión específica de posibles componentes de unión (por ejemplo, como en Berntzen et al., 2005, J Immunol Methods. 298(1-2):93-104). La identificación y caracterización de dominios variables de inmunoglobulina modificada que se unen específicamente al factor del complemento C1q pueden realizarse esencialmente similarmente (por ejemplo, como en Lauvrak et al. 1997 Biol Chem. 378(12):1509-19).

Con el fin de aumentar la semivida in vivo de una molécula que consiste en o que contiene un dominio variable tal que se une a FcRn, o puede seleccionarse albúmina de suero para bibliotecas de dominios variables mutantes según la presente invención. Pueden usarse aquellos bucles estructurales modificados responsables de prolongar la semivida de una molécula mediante su unión específica a proteínas del suero o proteínas del complemento como bucles estructurales aislados o en el contexto de una inmunoglobulina o partes de la misma, para la combinación con aquellas moléculas que van a diseñarse como moléculas con elevada semivida in vivo.

Los receptores FcRn u otros receptores celulares para la selección pueden proporcionarse o bien sobre la superficie de células que expresan naturalmente los receptores respectivos o bien por la expresión y purificación de la parte extracelular del receptor respectivo. Con el fin de la presente invención, un primer cribado en FcRn puede seleccionar dominios variables mutantes (o moléculas que comprenden tales dominios variables mutantes) que pueden además probarse in vitro e incluso caracterizarse además en experimentos de FACS uniéndose a células que expresan el receptor FcRn. El cribado y la selección también pueden considerar dependencias del pH en la unión a FcRn (como se describe en los documentos PCT WO02/060919; PCT WO97/34631). Pueden caracterizarse además por clasificación de afinidad de unión a diversos FcRn recombinantes, isoformas y alotipos, por ejemplo, con técnicas de resonancia de plasmones superficiales (por ejemplo, como en Dall' Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169: 5171-5180).

La inmunoglobulina modificada según la invención puede comprender una cadena pesada y/o ligera, o partes de las mismas, y al menos un dominio variable.

La inmunoglobulina según la presente invención comprende preferentemente al menos un dominio constante y/o al menos uno variable de la inmunoglobulina, o una parte de la misma.

Un dominio variable normalmente se considera una unidad de pliegue de inmunoglobulina de la parte variable de una inmunoglobulina, también denominado un dominio de la región variable (por ejemplo, VH, Vk, V1, Vd)

Otra inmunoglobulina preferida según la invención consiste en un dominio variable de una cadena pesada o ligera, o una parte de la misma, con al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle, y se caracteriza por que dichos al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle comprenden al menos dos modificaciones de aminoácidos que forman al menos dos bucles estructurales modificados o regiones de bucle, en la que dichos al menos dos bucles estructurales modificados o regiones de bucle se unen específicamente a al menos un epítope de un antígeno. En

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una inmunoglobulina preferida tal según la invención, las al menos dos modificaciones de aminoácidos pueden localizarse en uno o dos bucles estructurales o regiones de bucle o en uno o dos bucles estructurales para así constituir un sitio de unión para un antígeno.

Según una realización preferida de la presente invención, la unión específica del polipéptido modificado a una molécula se determina por un ensayo de unión seleccionado del grupo que consiste en ensayos inmunológicos, preferentemente enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayos de resonancia de plasmones superficiales, espectroscopía de resonancia magnética nuclear de diferencia de transferencia de saturación, espectroscopía de resonancia magnética nuclear de NOE de transferencia (trNOE), ensayos competitivos, ensayos de unión a tejido, ensayos de unión a células vivas y ensayos de extractos celulares.

Los ensayos de unión pueden llevarse a cabo usando varios métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, ensayos basados en FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) y BRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia), ensayo homogéneo de proximidad de luminiscencia amplificada, ensayo de proximidad de centelleo, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), SPR (resonancia de plasmones superficiales), calorimetría de valoración isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, electroforesis en gel y cromatografía que incluye filtración en gel.

El polipéptido modificado de la invención se conjuga preferentemente con una marca seleccionada del grupo que consiste en moléculas orgánicas, marcas enzimáticas, marcas radiactivas, marcas coloreadas, marcas fluorescentes, marcas cromogénicas, marcas luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complejos metálicos, metales, oro coloidal y mezclas de los mismos.

Pueden usarse polipéptidos modificados conjugados con marcas como se especificó anteriormente, por ejemplo, en métodos de diagnóstico.

La inmunoglobulina modificada puede conjugarse con otras moléculas que permiten la simple detección de dicho conjugado en, por ejemplo, ensayos de unión (por ejemplo, ELISA) y estudios de unión.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un dominio variable de una cadena ligera o pesada o combinaciones de las mismas, con al menos dos bucles o regiones de bucle, caracterizado por que dichos al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle comprenden cada uno al menos una modificación de aminoácidos que forman al menos dos bucles estructurales modificados o regiones de bucle, en el que dichos al menos dos bucles estructurales modificados o regiones de bucle se unen específicamente a al menos un epítope de un antígeno.

Se prefiere combinar molecularmente al menos un dominio variable de anticuerpo modificado (= unión al componente específico mediante las secuencias no variables o bucles estructurales) con al menos otra molécula de unión que puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando u otro dominio de anticuerpo modificado.

La otra molécula de unión combinada con el al menos un dominio variable de anticuerpo modificado de la invención se selecciona del grupo que consiste en moléculas proteináceas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.

Los bucles estructurales o regiones de bucle de la inmunoglobulina modificada según la invención pueden unirse específicamente a cualquier tipo de moléculas de unión, en particular a moléculas proteináceas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, pequeño y moléculas orgánicas grandes, moléculas inorgánicas. Por supuesto, la inmunoglobulina modificada según la invención puede comprender al menos dos bucles o regiones de bucle, por lo que cada uno de los bucles o regiones de bucle puede unirse específicamente a diferentes moléculas o epítopes.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención u obtenible por un método según la presente invención para la preparación de una vacuna para inmunización activa. Por este documento, la inmunoglobulina se usa o bien como principio activo antigénico para formular una vacuna o bien se usa para pescar o capturar estructuras antigénicas para su uso en una formulación de vacuna.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una inmunoglobulina según la presente invención u obtenible por un método según la presente invención para la preparación de una biblioteca de polipéptidos que comprenden dominios variables de inmunoglobulina modificada.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere a un método de unión específica y/o detección de una molécula diana que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula que comprende una inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención o una molécula que comprende un dominio variable de

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inmunoglobulina modificado obtenible por un método según la presente invención con una muestra de prueba que contiene o se sospecha que contiene dicha molécula diana, y opcionalmente

(b) detectar la posible formación de una inmunoglobulina/molécula específica o complejo de dominio variable de inmunoglobulina/molécula.

Un método preferido según la invención es para unir específicamente y/o detectar una molécula que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una biblioteca de inmunoglobulinas modificadas o una inmunoglobulina modificada según la presente invención con una muestra de prueba que contiene dicha molécula, y opcionalmente

(b) detectar la posible formación de un complejo de inmunoglobulina específica/molécula.

Muestras de prueba pueden ser muestra humana o animal, tal como muestras de sangre u otros líquidos corporales y suspensiones de células, muestra que posiblemente contiene una molécula diana para ser unida específicamente por inmunoglobulinas para fines de captura y/o detección.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para aislar específicamente una molécula diana que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula que comprende una inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención o una molécula que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificado obtenible por un método según la presente invención con una muestra que contiene dicha molécula diana,

(b) separar el complejo de dominio variable de inmunoglobulina específico/molécula diana formado, y

(c) opcionalmente aislar la molécula diana de dicho complejo.

Un método preferido según la invención es para aislar específicamente una inmunoglobulina modificada que se une a una molécula que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una biblioteca de inmunoglobulinas modificadas según la presente invención con una muestra que contiene dicha molécula,

(b) separar el complejo de inmunoglobulina modificada específica/molécula formado, y

(c) opcionalmente aislar la inmunoglobulina modificada de dicho complejo.

Aquellas muestras se consideran normalmente fuentes para el aislamiento preparativo de aquellas moléculas, por ejemplo fuentes naturales complejas, como fuentes animales, humanas o de planta, o fuentes derivadas de microbio o suspensiones de células y cultivos.

Las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina según la presente invención pueden usarse para aislar específicamente moléculas diana de una muestra. Si se usan inmunoglobulinas multi-específicas o dominios variables de inmunoglobulina, más de una molécula diana puede aislarse de una muestra. Es especialmente ventajoso usar inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina modificada en tales métodos debido a que permite, por ejemplo, generar una matriz que tiene una superficie homogénea con cantidades definidas de componentes de unión (es decir, dominios variables de inmunoglobulina modificada) inmovilizados encima que son capaces de unirse a las moléculas diana que van a aislarse. A diferencia de esto, si se usan componentes de unión mono-específica no puede generarse matriz homogénea debido a que los únicos componentes de unión no se unen con la misma eficiencia a la matriz.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de direccionamiento de un compuesto a una diana que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificada según la presente invención o una molécula que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificada obtenible por un método según la presente invención capaz de unirse específicamente a dicho compuesto,

(b) administrar la molécula que comprende un complejo de dominio variable de inmunoglobulina/compuesto a la diana.

Pueden usarse inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina según la presente invención para administrar al menos un compuesto unido a las CDR por una conformación de bucle de CDR específica a una diana que se une a la región de bucle estructural modificada. Tales inmunoglobulinas pueden usarse para dirigir sustancias terapéuticas a un sitio de acción preferido en el transcurso del tratamiento de una enfermedad.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una biblioteca de moléculas que comprende, que expresa o que codifica una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención u obtenible por el método según la presente invención.

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La biblioteca preferida de inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención comprende al menos 10 inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina, preferentemente 100, más preferentemente 1000, más preferentemente 10000, más preferentemente 100000, lo más preferentemente superior a 1000000 inmunoglobulinas de variante o dominios variables, con una modificación en al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle.

Normalmente, las bibliotecas según la invención comprenden al menos 10 proteínas de fusión o ligantes, preferentemente al menos 100, más preferido al menos 1000, más preferido al menos 104, más preferido al menos 105, más preferido al menos 106, más preferido al menos 107 más preferido al menos 108, más preferido al menos 109, más preferido al menos 1010, más preferido al menos 10, hasta 1012, en casos de presentación ribosómica son factibles números incluso más altos.

Resultó que los miembros más preferidos de una biblioteca tienen mutaciones de al menos 4, o incluso al menos 5 o 6 posiciones de aminoácidos en al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle. Así, las bibliotecas particularmente preferidas según la invención consisten en miembros que tienen mutaciones de al menos 2, 3 o 4 posiciones de aminoácidos en al menos dos bucles estructurales.

Una biblioteca según la invención puede también comprender o consistir en uno de o una mezcla de dominios variables de inmunoglobulina seleccionados del grupo de VH, Vkappa, Vlambda y VHH, como es adecuado con el fin de definir componentes de unión para motivos comerciales.

Métodos preferidos para construir dicha biblioteca pueden encontrarse anteriormente y en los ejemplos. La biblioteca según la presente invención puede usarse para identificar inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina que se unen a una molécula distinta.

En particular, la presente invención se refiere al uso de una biblioteca de proteínas de polipéptidos que comprende una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención u obtenible por el método según la presente invención para el diseño de derivados de inmunoglobulina. Una inmunoglobulina existente puede cambiarse para introducir sitios de unión al antígeno en una inmunoglobulina o un dominio variable usando una biblioteca de proteínas de la inmunoglobulina respectiva o dominio variable de al menos 10, preferentemente 100, más preferentemente 1000, más preferentemente 10000, más preferentemente 100000, lo más preferentemente superior a 1000000 inmunoglobulinas o dominios variables de variante cada uno con al menos dos bucles estructurales modificados. La biblioteca se criba entonces para unirse al antígeno específico. Después de la caracterización molecular para las propiedades deseadas, la inmunoglobulina seleccionada o dominio variable se clona en la inmunoglobulina original por técnicas de ingeniería genética de manera que sustituya la región no mutante. Alternativamente, solo el ADN que codifica los bucles modificados o que codifica los aminoácidos mutados puede intercambiarse para obtener una inmunoglobulina con el sitio de unión adicional para el antígeno específico. Alternativamente, la modificación en los bucles estructurales de los dominios variables puede realizarse con el dominio variable en su contexto natural, por ejemplo en forma de un Fab, scFv, o molécula de inmunoglobulina completa. Excepto cuando se producen inmunoglobulinas de un solo dominio, una cadena de dominios de inmunoglobulina individuales o inmunoglobulinas de una sola cadena, tales como scFv o unicuerpos (fragmentos de inmunoglobulina monovalentes), la inmunoglobulina según la invención se proporciona normalmente como un dímero, preferentemente como un heterodímero.

La elección del sitio para el bucle estructural específico de antígeno mutado depende de la estructura de la inmunoglobulina original y del fin del sitio de unión adicional. Si, por ejemplo, la inmunoglobulina original o parental es un Fab o scFv, es posible la modificación de al menos dos bucles estructurales en los dominios variables de la cadena ligera y/o la cadena pesada, pero también se prefiere la modificación de al menos dos bucles estructurales en CH1/CL para producir una inmunoglobulina según la invención. Así, la molécula de Fab según la invención puede contener el nuevo sitio de unión mediante una región de bucle modificada en el dominio CH1 y o CL. En este contexto, es normalmente de importancia primaria mantener la conformación de bucle de CDR específica y propiedades de unión naturales de la inmunoglobulina parental, scFv o Fab.

Para generar una biblioteca pueden prepararse bibliotecas de moléculas originales mutantes que tienen mutaciones en dos o más bucles estructurales de uno o más dominios variables. La selección con moléculas originales mutadas completas puede tener algunas ventajas, ya que la selección para unión al antígeno con un bucle estructural modificado proporcionará las modificaciones estéricamente ventajosas. Por ejemplo, si la molécula completa es un scFv, puede ser ventajoso cribar la biblioteca de scFv original mutado para unirse a un antígeno, seguido de cribado de los ligantes específicos para unirse al antígeno que es reconocido por los bucles de CDR (especificidad original). En un procedimiento de selección alternativa, el antígeno original - el primero - puede unirse a los bucles de CDR durante el cribado para unirse a un antígeno con los bucles estructurales modificados. Este cribado simultáneo puede permitir el rescate de clones que se perderían durante un procedimiento de selección secuencial si la unión al antígeno estuviera influida por la unión al primer antígeno.

Una realización preferida de la invención es una biblioteca de inmunoglobulinas de variante que contiene o que consiste en dominios variables con al menos una posición de aminoácido de variante en cada uno de al menos dos

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de los bucles estructurales. La biblioteca puede comprender dominios de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera o mezclas y combinaciones moleculares de las mismas.

Otra realización preferida es una biblioteca que contiene o que consiste en dominios VHH o formas humanizadas de tales dominios camélidos con al menos una posición de aminoácido de variante en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle.

Otra realización preferida de la invención es una biblioteca que contiene o que consiste en anticuerpos monocatenarios, tales como una biblioteca de scFv con al menos una posición de aminoácido de variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del anticuerpo monocatenario o scFv.

Otra realización preferida de la invención es una biblioteca de diacuerpos que contiene o que consiste en al menos una posición de aminoácido de variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del diacuerpo.

Otra realización preferida de la invención es una biblioteca de minicuerpos que contiene o que consiste en al menos una posición de aminoácido de variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del minicuerpo.

Otra realización preferida más de la invención es una biblioteca de Fab que contiene o que consiste en al menos una posición de aminoácido de variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del Fab.

Otra realización preferida más de la invención es una biblioteca de anticuerpos o de IgG, preferentemente una biblioteca de anticuerpos humanos, que contiene o que consiste en al menos una posición de aminoácido de variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del anticuerpo o dominios de IgG.

El requisito de tamaño (es decir, el número de variantes) de una biblioteca según la invención, que comprende inmunoglobulinas mutadas de forma diferente o dominios variables de inmunoglobulina o moléculas de fusión de dominios de anticuerpo variables mutados, depende de la tarea. En general, una biblioteca para generar un sitio de unión al antígeno de novo necesita ser más larga que una biblioteca usada para modificar adicionalmente un sitio de unión al antígeno manipulado ya existente formado por un bucle estructural modificado o región de bucle (por ejemplo, para potenciar la afinidad o cambiar la especificidad fina por el antígeno).

La presente invención también se refiere a una biblioteca de polipéptidos o una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina o al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle contenidas en un minidominio, o moléculas de ácidos nucleicos que codifican el mismo. La biblioteca contiene miembros con diferentes modificaciones, en la que la pluralidad se define por las modificaciones en los al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle. La biblioteca de ácidos nucleicos incluye preferentemente al menos 10 miembros diferentes (con al menos dos posibles modificaciones de aminoácidos) y más preferentemente incluye al menos 100, más preferentemente 1000 o 10000 miembros diferentes (por ejemplo, diseñados por estrategias de aleatorización o técnicas combinatorias). También se prefieren números de miembros individuales incluso más diversificados, tales como al menos 1000000 o al menos 10000000, más preferido al menos 108, más preferido al menos 109, más preferido al menos 1010, más preferido al menos 1011, hasta 1012, en casos de presentación ribosómica son factibles números incluso más altos.

Un aspecto adicional de la invención es la combinación de dos inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina diferentes seleccionados de al menos dos bibliotecas según la invención con el fin de generar inmunoglobulinas multi-específicas. Estos dominios variables de inmunoglobulina específicos seleccionados pueden combinarse entre sí y con otras moléculas, similar a elementos estructurales, para diseñar la disposición óptima de los dominios para conseguir las propiedades deseadas tales como combinaciones de especificidades y/o valencias.

Además, pueden introducirse una o más inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención en diversos o todos los sitios diferentes de una proteína sin destrucción de la estructura de la proteína. Por una técnica de "barajado de dominios" tal se crean nuevas bibliotecas que pueden otra vez seleccionarse para las propiedades deseadas.

La biblioteca preferida contiene inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención o derivados de los mismos.

Una realización preferida de la presente invención es una molécula de unión por un antígeno (molécula de unión al antígeno) que comprende al menos una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina y al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle que se modifican según la presente invención para unirse al antígeno, en la que dicha molécula de unión no tiene actividad de unión relevante y/o específica con sus bucles de CDR. Puede

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comprender otras partes útiles para actividades de anticuerpo (por ejemplo, tales como regiones efectoras naturales o modificadas (secuencias); sin embargo, carece de la región de unión "natural" de anticuerpos, es decir, bucles de CDR activos en su posición que existen de forma natural. Estas moléculas de unión al antígeno según la presente invención tienen las ventajas que se han descrito anteriormente para las presentes moléculas, pero sin la actividad de unión específica de anticuerpos; sin embargo, con una actividad de unión específica recién introducida en el bucle estructural o región de bucle.

También se prefiere para las moléculas de unión al antígeno según la presente invención que los nuevos sitios de unión al antígeno en los bucles estructurales se introduzcan por tecnologías de aleatorización, es decir, modificando uno o más restos de aminoácidos de al menos dos bucles estructurales por técnicas de aleatorización o introduciendo inserciones aleatoriamente generadas en tales bucles estructurales. Alternativamente, se prefiere el uso de enfoques combinatorios.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a una inmunoglobulina modificada que tiene un sitio de unión al antígeno extraño a la inmunoglobulina no modificada e incorporada en uno, dos, tres o más bucles estructurales de la inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina. A este respecto, el término "extraño" significa que el sitio de unión al antígeno no se forma naturalmente por el bucle estructural específico o región de bucle del dominio de inmunoglobulina variable.

Según otro aspecto más, la presente invención se refiere a una inmunoglobulina modificada que tiene un sitio de unión al antígeno extraño a la inmunoglobulina no modificada e incorporado en uno, dos, tres o más bucles estructurales del dominio variable, en el que dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho antígeno con una

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afinidad de al menos 10 moles , al menos 10 moles , al menos 10 moles , al menos 10 moles , al menos

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10 mor , al menos 10 moles , o al menos 10 moles .

Normalmente, se proporcionan ligantes con afinidad media o alta según la invención. Aquellos con afinidad media ejercen preferentemente una velocidad de disociación Kd en el intervalo de 10-5 a 10-7, aquellos con alta afinidad tienen una Kd demostrada en el intervalo de 10-8 a 10-10, siendo aquellos que tiene una Kd inferior a 10-9 los más preferidos como un ligante de alta afinidad. En algunos casos será apropiado seleccionar ligantes con Kd incluso más baja, por ejemplo inferior a 10-11, normalmente de tan solo 10-12.

Inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina preferidos según la presente invención comprenden al menos dos sitios de unión al antígeno, el primer sitio que se une a un primer epítope y el segundo sitio que se une a un segundo epítope.

Según una realización preferida, la presente inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina comprende al menos tres bucles o regiones de bucle, el primer bucle o región de bucle que se une a un primer epítope y el segundo y tercer bucle o región de bucle que se une a un segundo epítope. Cualquiera del al menos primer o al menos segundo y tercer bucle o región de bucle, o ambos, puede contener un bucle estructural. La inmunoglobulina o dominios variables de inmunoglobulina según la presente invención incluye los fragmentos de la misma conocidos en la técnica por ser funcionales que contienen los elementos esenciales según la presente invención: los bucles estructurales o regiones de bucle modificados según la presente invención.

Preferentemente, la inmunoglobulina según la presente invención está compuesta por al menos dos dominios de inmunoglobulina, o una parte de los mismos que incluye un minidominio, y cada dominio contiene al menos un sitio de unión al antígeno. Uno de los pares preferidos de los dominios de inmunoglobulina es un par CL/CH1, que puede manipularse en la región de bucle estructural que se localiza en el extremo C del par CL/CH1. Así, se manipulan uno o dos sitios de unión nuevos. Tras la selección del par de dominios de unión CL/CH1 específicos, puede recombinarse con los dominios variables VL y VH para obtener una molécula de Fab, según la invención con un sitio de unión "natural" en la región CDR y uno o dos sitios de unión adicionales opuestos al mismo, es decir, en la región de bucle estructural del extremo C de los dominios CH1/CL.

Así, la inmunoglobulina según la invención puede obtenerse modificando una molécula parental de inmunoglobulina que contiene el dominio variable. Alternativamente, puede manipularse un dominio de inmunoglobulina constante para obtener un sitio de unión en la región de bucle estructural, dominio que puede entonces usarse como elemento estructural para producir combinaciones con dominios de inmunoglobulina variables y opcionalmente con otros dominios constantes, produciendo una inmunoglobulina según la invención que contiene tanto un dominio variable como un nuevo sitio de unión formado por bucles estructurales o regiones de bucle estructural.

Según tal realización preferida de la invención se proporciona una inmunoglobulina, que comprende al menos un dominio de la región variable de una inmunoglobulina y al menos un dominio de la región constante de una inmunoglobulina; por ejemplo, un dominio variable, que se modifica en al menos dos bucles estructurales unidos a un dominio CH1.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit de componentes de unión que contiene

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10

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45

50

(a) un polipéptido que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificado que tiene un sitio de unión al antígeno incorporado en dos o más bucles estructurales, y

(b) una molécula de unión que contiene un epítope de dicho antígeno.

Preferentemente, un kit de componentes de unión según la invención está conteniendo

(a) una biblioteca de inmunoglobulinas modificadas según la presente invención, y

(b) una molécula de unión que contiene un epítope de un antígeno.

Una molécula de unión tal de este kit según la presente invención puede usarse para seleccionar y distinguir una inmunoglobulina nativa o modificada según la presente invención en una muestra o de una biblioteca. Puede usarse además para identificar la especificidad de unión de polipéptidos que comprenden una inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención. Usando la molécula de unión de este kit según la presente invención, puede determinarse la potencia del polipéptido modificado según la presente invención.

La potencia como se define aquí es la propiedad de unión de la molécula modificada de la invención a su antígeno. La unión puede determinarse cuantitativamente y/o cualitativamente en términos de especificidad y/o afinidad y/o avidez por métodos de ensayo como se conoce en la técnica para fines de control de calidad.

Además, la molécula de unión de un kit según la presente invención puede usarse para seleccionar el polipéptido que comprende una inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención de una biblioteca como se especifica anteriormente, preferentemente que consiste en al menos 10, preferentemente al menos 100, más preferentemente al menos 1000, más preferido al menos 10000, especialmente al menos 100000 polipéptidos con diferentes modificaciones en los bucles estructurales.

La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Diseño de la biblioteca de VHH

Se usó la estructura cristalina del dominio VHH de camello D2-L24 en complejo con lisozima de clara de huevo de gallina, que se publica en la base de datos Brookhaven como la entrada 1ZVH.pdb para ayudar en el diseño del dominio VHH mutado. La secuencia de la cadena A del archivo de estructura 1ZVH.pdb se da en SEQ ID No. 1.

SEQ ID No. 1

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA

La secuencia que se usó como base para la construcción de la biblioteca de VHH es la secuencia del dominio de VHH anti-TNF-alfa de la patente WO04041862A21, clon 3E y se da en SEQ ID No. 2.

SEQ ID No. 2

ccatggcccc

gagctcnnsn

tcccagcgac

actacaagac

tacagcaagc

ctcatgctcc

gcctctccct

ccgagaacca

nsnnscaagt

atcgccgtgg

cacgcctccc

ttaccgtgnn

gtgatgcatg

gtctccgggt

caggtgtaca

cagcctgacc

agtgggagag

gtgctggact

snnsnnsagg

aggctctgca

aaagcggccg

ccctgccccc atcccgtgac tgcctggtca aaggcttcta caatgggcagccggagaaca ccgacggctc cttcttcctc tggnnsnnsg ggaacgtctt caaccactac acacagaaga ca

Después del análisis detallado de la estructura de 1ZVH.pdb y por inspección visual de los restos que forman los bucles que conectan las hebras beta, se decidió aleatorizar los restos 13, 15, (es decir, en el bucle entre las hebras beta A y B) 89, 90, 92 y 93 (es decir, en el bucle entre las hebras beta E y F) de SEQ ID No. 2 para la generación de la biblioteca. Además, se decidieron tres posiciones aleatorizadas que iban a insertarse entre los restos 14 y 15, y se decidieron tres posiciones aleatorizadas que iban a insertarse entre los restos 92 y 93 de SEQ ID No. 2.

5

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40

Ejemplo 2: Construcción de la biblioteca de VHH

El gen manipulado que codifica la secuencia de VHH se produce en forma de un gen sintético por ensamblaje por PCR. La secuencia y su traducción se muestran en la Figura 2. Restos de aminoácidos que van a aleatorizarse para la construcción de bibliotecas están subrayados. Sitios de restricción para la clonación están incluidos del siguiente modo, y se subrayan en la secuencia de nucleótidos como se muestra en la Figura 2: NcoI, BglII y NotI.

La secuencia de aminoácidos codificada por el gen sintético se da en SEQ ID. No. 3.

SEQ ID No. 3

MAPREPQVYTLPPSRDELXXXQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSKLTVXXXRWXXGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA

Los dos primeros restos y los dos últimos restos se producen por los sitios de restricción usados para la clonación. La secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID No. 3 se da en SEQ ID No. 4.

SEQ ID No. 4: cttgccatgg ccccccgaga accacaggtg tac

Los dos primeros codones y los dos últimos codones se producen por los sitios de restricción usados para la clonación.

Los oligonucleótidos para el ensamblaje por PCR del gen sintético se diseñan usando la herramienta de software públicamente disponible DNAWorks 3.1 (
http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) y se ensamblan por PCR siguiendo los protocolos convencionales de los 18 oligonucleótidos presentados en la Tabla 1 y como SEQ ID No. 5 a SEQ ID No. 22 (Hoover DM, Lubkowski J., DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis, Nucleic Acids Res. 2002 May 15;30(10):e43).

1.: CCATGGCAAGTTCAGCTGCAGGAAAGCGGTGGCGGCCTG (SEQ ID No. 5.)

2 .: AGACGCAGGCTGCCGCCAGGCTGGACCAGGCCGCCACCGC (SEQ ID No. 6)

3.: CGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCGGCCAGCGGCCGTACC (SEQ ID No. 7)

4 .: AGGTGTAGCCGCTATGGTCGCTAAAGGTACGGCCGCTGGC (SEQ ID No, 8}

5 .: ACCATAGCGGCTACACCTATACCATTGGCTGGTTTCGTCA (SEQ ID No. 9)

6.: TCACGTTCTTTTCCTGGCGCCTGACGAAACCAGCCAATGG (SEQ ID No. 10)

7 .: CGCCAGGAAAAGAACGTGAATTTGTGGCGCGTATTTACTG (SEQ ID No. 11)

8 .: ATAGGTATTGCCGCTGCTCCAGTAAATACGCGCCACAAAT (SEQ ID No. 12)

9.: GAGCAGCGGCAATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGC (SEQ ID No. 13)

10 .: TGTCGCGGCTAATCGCGAAACGGCCTTTCACGCTATCCGC (SEQ ID No. 14)

11.: GCGATTAGCCGCGACATTGCCAAGAACACGGTAGATCTTA (SEQ ID No. 15)

12 .: GGCTCCAGGTTGTTCATCGTAAGATCTACCGTGTTCTTGGC (SEQ ID No ■ - 16)

13.: CGATGAACAACCTGGAGCCCGAAGACACAGCCGTGTATTA (SEQ ID No. 17)

14 .: GCCATCCCGAGCCGCGCAATAATACACGGCTGTGTCTTCG (SEQ ID No. 18)

15 .: GCGGCTCGGGATGGCATTCCGACCAGCCGTAGCGTGGAAA (SEQ ID No . 19)

16.: CCCTGGCCCCAGTAATTGTAGCTTTCCACGCTACGGCTGG (SEQ ID No . 20)

17. 18 .: CAATTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTCAGCTCT (SEQ GCGGCCGCAGAGCTGACGGTCACCTG (SEQ ID No. 22} ID No • 21)

Tabla 1: Oligonucleótidos usados para el ensamblaje del gen sintético que codifica el gen VHH manipulado.

Brevemente, se mezclan juntos volúmenes iguales de soluciones de oligonucleótido (cada una a una concentración de ~1 mg/ml) y se diluyen con agua a una concentración final de ~1 ng/pl para cada oligonucleótido. La mezcla de oligonucleótidos se diluye 5 veces con la solución de PCR. Las concentraciones finales de componentes son 0,2 ng/pl para cada oligonucleótido, 20 mM para Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM para KCl, 10 mM para (NH4)2SÜ4, 6 mM para MgSÜ4, 0,1 % (v/v) para Triton X-100, 0,1 mg/ml para albúmina de suero bovino, 0,2 mM para cada dNTP y 2,5 U para Pfu polimerasa. El protocolo de PCR para el ensamblaje de genes empieza con un etapa de desnaturalización de 5 min de 95 °C, durante la cual la polimerasa se añade para evitar cualquier posible cebado erróneo (PCR de 'inicio caliente'). Esta etapa va seguida de 25 ciclos de una temperatura de desnaturalización de

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40

45

50

55

95 °C durante 30 s, una temperatura de hibridación de 55 °C durante 30 s y una temperatura de extensión de 72 °C durante 1,5 min. La última etapa en este protocolo es un ciclo de incubación a 72 °C durante 10 min. Para la amplificación génica, se usa 1 pl de la mezcla resultante de la reacción de ensamblaje génica como molde, con los oligonucleótidos exteriores (SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 22) usados como cebadores. El protocolo de PCR para la amplificación génica es esencialmente el mismo que aquél para el ensamblaje génico. El gen VHH sintético ensamblado se clona posteriormente mediante los sitios de restricción Ncol y Notl en el vector pET27b (Novagen,
http://www.merckbiosciences.co.uk/product/69863;
http://www.novagen.com) y la secuencia se verifica por secuenciación de ADN.

Entonces se usa PCR para construir la biblioteca aleatorizada. El molde para las 2 primeras reacciones de PCR es el gen VHH sintético clonado como se ha descrito anteriormente. Los pares de cebadores usados para estas dos primeras reacciones de PCR son los siguientes: 3esynmu1 (gactccatgg caagtgcaac tgcaggaaag cggaggcggt ctggttnnsc cannsnnsnn snnsggcagc ctgcgtctga gct (SEQ ID No. 23)) aynd 3esynmu2 (catgagatct acggtgttct tggcg (SEQ ID No. 24)); 3esynmu3 (catgagatct tacgatgnns nnsttgnnsn nsnnsnnsnn sgaagatacg gcggtgtatt attg (SEQ ID No.

25) ) y 3esyn2 (aatagcggcc gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No. 26)). Los productos de PCR resultantes se digieren con BglII, se ligan, y el producto de ligación se usa como molde para una reacción de PCR con los cebadores 3esyn1 (acgtccatgg caagtgcaac tgcag (SEQ ID No. 27)) y 3esyn2 (aatagcggcc gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No.

26) ). Los codones NNS en los cebadores 3esynmu1 (sEQ ID No. 23) y 3esynmu3 (SEQ ID No. 25) introducen las posiciones aleatorizadas en la secuencia. Se elige el codón NNS (código de la IUPAC, donde S significa C o G) que codifica los 20 aminoácidos que existen de forma natural, pero evita 2 de los 3 codones de terminación. La Figura 3 muestra el esquema de las reacciones de PCR y el procedimiento de ligación. Las flechas horizontales indican las posiciones y direcciones de los cebadores de PCR, líneas verticales indican las posiciones de los sitios NcoI, BglII y NotI, respectivamente (de izquierda a derecha).

Este producto de PCR aleatorizado se clona posteriormente en el vector de clonación de fagémido pHEN1 (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19(15):4133-7) en marco con la señal de secreción pelB mediante el sitio de restricción NcoI. El sitio de restricción NotI en el extremo 3' del gen inserta la biblioteca VHH en marco con el gen que codifica la proteína de la cubierta menor (proteína III) del fago filamentoso fd contenido en el vector pHEN1. La secuencia manipulada de la inserción de biblioteca de VHH aleatorizada se da como una secuencia de nucleótidos en SEQ ID No. 28 y se traduce como una secuencia de aminoácidos en SEQ ID No. 29. La letra X en SEQ ID No. 29 indica los restos de aminoácidos aleatorizados.

SEQ ID No. 28:

1 ccatggcaag 61 ggcagcctgc 121 acctatacca 181 atttactgga 241 agccgcgaca 301 nnsgaagata 361 gtggaaagct

SEQ ID No. 29:

tgcaactgca

gtctgagctg

ttggctggtt

gcagcggcaa

tcgccaagaa

cggcggtgta

acaattactg

ggaaagcgga

cgcggcgtcc

ccgtcaggcg

tacctactat

caccgtagat

ttattgcgca

gggccagggc

ggcggtctgg

ggccgtacct

ccagggaaag

gcggatagcg

cttacgatgn

gcgcgtgacg

acccaggtga

ttnnsccann

ttagcgacca

aacgtgaatt

tgaaaggccg

nsnnsttgnn

gcattccgac

ccgtgagctc

snnsnnsnns

ttcgggctat

tgtggcgcgt

ttttgcgatt

snnsnnsnns

ctcccgtagc

tgcggccgc

PWQVQLQESGGGLVXPXXXXGSLRLSCflASGRTFSDHSGYTYTIGWí'RQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGR FAISROIAKNTVDLTMXXLXXXXXEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA

El producto de ligación se transforma entonces en TG1 de Escherichia coli, se determina el número de colonias obtenidas y se controlan varios clones seleccionados por análisis de restricción y por secuenciación de ADN. Para las siguientes etapas de la preparación de fago de bibliotecas de presentación en superficie, se siguen protocolos convencionales. Brevemente, la mezcla de ligación se transforma en células TG1 de E. coli por electroporación. Posteriormente, se rescatan partículas de fago de células TG1 de E. coli con el fago auxiliar M13-KO7. Las partículas de fago se precipitan entonces del sobrenadante de cultivo con PEG/NaCl en 2 etapas, se disuelven en agua y se usan para la selección por inmunopurificación o, alternativamente, se almacenan a menos 80 °C.

Ejemplo 3: Inmunopurificación de la biblioteca de fagos de VHH sobre albúmina de suero humano (HSA)

Se realizan 3 rondas de inmunopurificación según protocolos convencionales (por ejemplo, Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif ). Brevemente, se aplica el siguiente método. Se recubren placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc) con HSA. Se añaden 200 pl de la siguiente solución por pocillo: tampón carbonato de Na 0,1 M, pH 9,6, con las siguientes concentraciones de HSA: 1a

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ronda de inmunopurificación: 2 mg/ml de HSA; 2a ronda de inmunopurificación: 1 mg/ml de HSA; 3a ronda de inmunopurificación: 1 mg/ml de HSA. La incubación es durante 1 hora a 37 °C, seguido de bloqueo con 2 % de leche en polvo (M-PBS) con 200 pl por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. La biblioteca de fagos de presentación en superficie se dejó entonces reaccionar con la HSA unida añadiendo 100 pl de suspensión de fago y 100 pl de 4 % de leche en polvo (M-PBS), seguido de incubación durante 45 minutos con agitación y durante 90 minutos sin agitación a temperatura ambiente.

Se lavan partículas de fago no unido del siguiente modo. Después de la 1a ronda de inmunopurificación: 10 x 300 pl de T-PBS, 5x 300 pl de PBS; después de la 2a ronda de inmunopurificación: 15 x 300 pl de T-PBS, 10 x 300 pl de PBS; después de la 3a ronda de inmunopurificación: 20 x 300 pl de T-PBS, 20 x 300 pl de PBS.

La elución de partículas de fago no unidas se realiza añadiendo 200 pl por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2, e incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, la suspensión de fagos se neutraliza mediante la adición de 60 pl de Tris-Base 2 M, seguido de infección en células TG1 de E. coli mezclando 10 ml de cultivo de crecimiento exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se siembran bacterias infectadas sobre medio TYE con 1 % de glucosa y 100 pg/ml de ampicilina, y se incuban a 30 °C durante la noche.

Ejemplo 4: Clonación de clones seleccionados de mutantes de VHH seleccionados contra HSA para expresión soluble

Se aísla ADN de fagémido del fago seleccionado mediante las 3 rondas de inmunopurificación con un midi-prep. El ADN que codifica regiones de dominios de VHH mutados se amplifica en lotes por PCR y se clona Ncol-Notl en el vector pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de expresión de E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) con un sitio de restricción Notl insertado para facilitar la clonación. Las construcciones ligadas se transforman en células LMG194 de E. coli (Invitrogen) con electroporación, y se cultivan a 30 °C en medio TYE con 1 % de glucosa y ampicilina durante la noche. Los clones seleccionados se inoculan en 200 pl de 2x medio YT con ampicilina, se cultivan durante la noche a 30 °C y se inducen añadiendo L-arabinosa a una concentración final del 0,1 %. Después de la expresión a 16 °C durante la noche, las células se recogen por centrifugación y se tratan con 100 pl de tampón borato de Na, pH 8,0, a 4 °C durante la noche para la preparación de extractos periplásmicos. Se usan 50 pl de los extractos periplásmicos en ELISA (véase más adelante).

Ejemplo 5: ELISA de mutantes de VHH seleccionados contra HSA

Se prueban los extractos periplasmáticos de los mutantes de VHH seleccionados para unión a albúmina de suero humano en un ELISA con el siguiente protocolo:

Recubrimiento: Placa de microtitulación (NUNC, Maxisorp), 100 pl por pocillo, 100 pg de HSA/ml en PBS, durante la noche a 4 °C.

Lavado: 3x 200 pl de PBS

Bloqueo: 1 % de caseína bloqueante en PBS (Pierce), 1 h a TA Lavado: 3x 200 pl de PBS

Unión de extracto periplásmico: 50 pl de extracto periplásmico (Ejemplo 4), 50 pl de PBS 0,05 % de Tween 20, a temperatura ambiente durante la noche Lavado: 3x 200 pl de PBS

1° anticuerpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 en PBS 0,05 % de Tween 20, 90 min a TA, 100 pl por pocillo Lavado: 3x 200 pl de PBS

2° anticuerpo: cabra anti-ratón*HRP (SIGMA), 1:1000 en PBS 0,05 % de Tween 20, 90 min a TA (temperatura ambiente), 100 pl por pocillo Lavado: 3x 200 pl de PbS

Detección: 3 mg/ml de OPD en tampón citrato de Na/fosfato, pH 4,5, 0,4 pl de 30 % de H2O2 Para antes de que el ruido de fondo sea demasiado alto: 100 ml de H2SO4 3 M Lectura de absorbancia: 492/620 nm

Ejemplo 6: Ejemplo de una biblioteca en la que solo un bucle se aleatoriza: el bucle C' 'D

El gen sintético que codifica el gen de VHH manipulado descrito anteriormente en el Ejemplo 2 se usa como molde para dos reacciones de PCR en las que se usan los siguientes pares de cebadores: SEQ ID No. 30 (actgctcgag agacatcgcc aagaacac; esynmu4) junto con SEQ ID No. 26 (3esyn2) y SEQ ID No. 31 (cacactcgag atcgcaaasn nsnnsnncac snnsnncgca tagtaggtat tgcc; 3esynmu5) junto con SEQ ID No. 27 (3esyn1). Los productos de PCR resultantes se digieren con XhoI, se ligan y el producto de ligación se usa como molde para una reacción de PCR con los cebadores 3esyn1 (SEQ ID No. 27) y 3esyn2 (SEQ ID No. 26). Los codones NNS en los cebadores 3esynmu4 (SEQ ID No. 30) y 3esynmu5 (SEQ ID No. 31) introducen las posiciones aleatorizadas en la secuencia similarmente como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 4 muestra el esquema de las reacciones de PCR y el procedimiento de ligación. Las flechas horizontales indican las posiciones y direcciones de los cebadores de PCR, las líneas verticales indican las posiciones de los sitios NcoI, XhoI y NotI, respectivamente (de izquierda a derecha).

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Este producto de PCR aleatorizado se clona posteriormente en el vector de clonación de fagémido pHENI (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19(15):4133-7) en marco con la señal de secreción pelB y la proteína de la cubierta menor (proteína III) del fago filamentoso fd contenido en el vector pHEN1 como se describe en el Ejemplo 2. La secuencia manipulada de la inserción de biblioteca de VHH aleatorizada se da como una secuencia de nucleótidos en SEQ ID No. 32 y se traduce como una secuencia de aminoácidos en SEQ ID No. 33. La letra X en SEQ ID No. 33 indica los restos de aminoácidos aleatorizados.

SEQ ID No. 32

1 ccatggcaag 61 cgtctgagct 121 attggctggt 181 agcagcggca 241 attgccaaga 301 tattattgcg 361 tggggccagg

ttcagctgca

gtgcggccag

ttcgtcaggc

atacctatta

acacggtaga

cggctcggga

gcacccaggt

ggaaagcggt

cggccgtacc

gccaggaaaa

tgcgnnsnns

tcttacgatg

tggcattccg

gaccgtcagc

ggcggcctgg

tttagcgacc

gaacgtgaat

gtgnnsnnsn

aacaacctgg

accagccgta

tctgcggccg

tccagcctgg

atagcggcta

ttgtggcgcg

nsttcgcgat

agcccgaaga

gcgtggaaag

c

cggcagcctg

cacctatacc

tatttactgg

ctcgagagac

cacagccgtg

ctacaattac

SEQ ID No. 33

PKQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYAXXVXXX FAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA .

El producto de ligación se transforma entonces en TG1 de Escherichia coli, se determina el número de colonias obtenidas y se controlan varios clones seleccionados por análisis de restricción y por secuenciación de ADN. Para las siguientes etapas de la preparación de fago de bibliotecas de presentación en superficie, se siguen protocolos convencionales como se describe en el Ejemplo 2. Las etapas de inmunopurificación, selección y caracterización de clones que se unen específicamente se realizan esencialmente como se describe en los Ejemplos 3, 4 y 5.

Ejemplo 7: Ejemplo de una biblioteca en la que tres bucles se aleatorizan: el bucle AB, EF y C' 'D

Se usa la biblioteca con restos aleatorizados en el bucle AB y en el bucle EF como se describe en el Ejemplo 2 como molde para una PCR en la que se usan los mismos pares de cebadores que en el Ejemplo 6: SEQ ID No. 30 (esynmu4) junto con SEQ ID No. 26 (3esyn2) y SEQ ID No. 31 (3esynmu5) junto con SEQ ID No. 27 (3esyn1). Las siguientes etapas para la construcción de bibliotecas, clonación, inmunopurificación, selección y caracterización de clones que se unen específicamente son esencialmente como se describen en los Ejemplos 2, 3, 4 y 5.

Ejemplo 8: Comparación de bibliotecas de dominio variable con posiciones de aminoácidos aleatorizadas en uno, dos y tres bucles estructurales

Las bibliotecas se usan en inmunopurificación con diversos antígenos.

Lisozima de huevo de gallina como antígeno:

Se realizan 3 rondas de inmunopurificación. Se recubren placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc) con lisozima de huevo de gallina añadiendo 200 pl de la siguiente solución por pocillo:

PBS, con las siguientes concentraciones de lisozima de huevo de gallina disuelta (HEL):

1a ronda de inmunopurificación: 2 mg/ml de HEL 2a ronda de inmunopurificación: 1 mg/ml de HEL 3a ronda de inmunopurificación: 1 mg/ml de HEL

La incubación es durante 1 hora a 37 °C, seguido de bloqueo con 2 % de leche en polvo (M-PBS) con 200 pl por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente.

La biblioteca de fagos de presentación en superficie se dejó reaccionar entonces con la lisozima de huevo de gallina unida añadiendo 100 pl de suspensión de fagos y 100 pl de 4 % de leche en polvo (M-PBS), seguido de incubación durante 45 minutos con agitación y durante 90 minutos sin agitación a temperatura ambiente.

Se lavaron las partículas de fago no unidas del siguiente modo:

1a ronda de inmunopurificación: 10 x 300 pl de T-PBS, 5x 300 pl de PBS

2a ronda de inmunopurificación: 15 x 300 pl de T-PBS, 10x 300 pl de PBS

3a ronda de inmunopurificación: 20 x 300 pl de T-PBS, 20 x 300 pl de PBS

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50

55

Se realiza elución de partículas de fago unidas añadiendo 200 pl por pocilio de glicina 0,1 M, pH 2,2, e incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, la suspensión de fagos se neutraliza mediante adición de 60 pl de Tris-Base 2 M, seguido de infección en células TG1 de E. coli por mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento exponencial con 0,5 ml de fago eluido e incubación durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, se siembran bacterias infectadas en medio TYE con 1 % de glucosa y 100 pg/ml de ampicilina, y se incuban a 30 °C durante la noche.

Albúmina de suero humano como antígeno:

Se usan las bibliotecas de los Ejemplos 2, 6 y 7 en rondas de inmunopurificación como se ha descrito anteriormente. Específicamente, las bibliotecas de fagos se suspenden en tampón de unión (PBS, 1 % de ovoalbúmina, 0,005 % de Tween 20) y se inmunopurifican contra albúmina de suero humano inmovilizada directamente sobre placas Maxisorp (10 microgramos/ml en PBS, durante la noche a 4 °C; las placas se bloquean con caseína bloqueante (Pierce). Después de 2 horas, los fagos no unidos se eliminan por lavado repetitivo (PBS, 0,05 % de Tween 20) y el fago no unido se eluye con KCl 500 mM, HCl 10 mM, pH 2.

Después de cada ronda de inmunopurificación específica de HSA, los clones resultantes se seleccionan o prueban para unirse a TNF alfa. La selección y prueba para la especificidad de TNF-alfa se realiza como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2004/041862.

FcRn como antígeno:

La inmunopurificación se realiza como se describe en el documento WO02060919, Ejemplo 6.2. En resumen, se resuspenden bibliotecas de fagos en 5 ml de MES 20 mM, pH 6,0/5 % de leche desnatada/0,05 % de Tween 20 y se añaden (100 microlitros de 5 x 1012 UFP/ml/pocillo) a 20 pocillos de una inmunoplaca Maxisorp (Nunc) previamente recubierta con 1 microgramo de FcRn murino y se bloquean con 5 % de leche desnatada. Después de la incubación durante 2 h a 37 °C, los pocillos se lavan 10-30 veces con MES 20 mM, pH 6,0/0,2 % de Tween 20/NaCl 0,3 M y el fago se eluye por incubación en 100 microlitros de PBS, pH 7,4/pocillo durante 30 min a 37 °C. Los fagos se usan para reinfectar TG1 de E. coli que crecen exponencialmente, como se describe en el Ejemplo 3.

Después de cada ronda de inmunopurificación en FcRn, se seleccionan los clones resultantes o se prueban para unirse a TNF alfa como se ha descrito anteriormente.

Receptores de Fc-gamma como antígenos:

Se realiza inmunopurificación contra proteínas de fusión recombinantes de Fc-gammaRI, Fc-gammaRIIA y Fc- gammaRIIA como se describe en Berntzen et al (2006) Protein Eng Des Sel 19:121-128. Después de cada ronda de inmunopurificación en un receptor de Fc, se seleccionan los clones resultantes o se prueban para unirse a TNF alfa como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 9:

Este ejemplo demuestra la posibilidad de introducir nuevas funciones o especificidades de unión adicionales en un fragmento de anticuerpo. La molécula usada como punto de partida para la modificación es el fragmento murino de anticuerpo monocatenario sFv 26-10 (Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci U S A. 85:5879-5883). Se construyen cinco bibliotecas diferentes para modificar diferentes secuencias de bucle estructural por secuencias de aminoácidos aleatorias:

Biblioteca 26-10-1: (SEQ ID NO. 34)

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF

KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG

sggggsdvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylnwylqkagqspklliykvsn

RFSGXXXXFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR Biblioteca 26-10-2: (SEQ ID NO. 35)

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF

kgkatltvdkssstaymelrsltsedsavyycagssgnkwamdywghgasvtvssggggsgggg

SGGGGSDVVMTQTPLSLPXXXXXQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQSPKLLIYKVSN

RFSGXXXXFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Biblioteca 26-10-3: (SEQ ID NO. 36)

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDVVMTQTPLSLPXXXXXQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQSPKLLIYKVSN RFSGXVPDRFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

5 Biblioteca 26-10-4: (SEQ ID NO. 37)

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQSPKLLIYKVSN RFSGXXXXXXXFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Biblioteca 26-10-5: (SEQ ID NO. 38)

10

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQXXXXXXDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQXXXXXXKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR ■

Las bibliotecas se producen por traducción inversa de las secuencias, en las que las posiciones de aminoácidos aleatorizadas están codificadas por el triplete de nucleótidos NNK.

15

Gen de la biblioteca 26-10-1: (SEQ ID NO. 39)

GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT

GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA

ATCTCTGGACTACATCGGTIACATCCCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC

AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC

TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA

CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT

TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGGTTTCTCTGG

GTGACCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA

CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC

cgtttctctggtnnknnknnknnkttctctggttctggttctggtaccgacttcaccctgaaaa

TCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC

GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

20

Gen de la biblioteca 26-10-2: (SEQ ID NO. 40)

GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT

GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA

ATCTCTGGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC

AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC

TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA

CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT

TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGNNKNNKNNKN

NKNNKCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA

CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC

CGTTTCTCTGGTNNKNNKNNKNNKTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA

TCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC

GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

Gen de la biblioteca 26-10-3: (SEQ ID NO. 41)

GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA ATCTCTGGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGNNKNNKNNKN NKNNKCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTGTTCCGGACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA TCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC 5 GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT ■

Gen de la biblioteca 26-10-4: (SEQ ID NO. 42)

GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCñCCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA ATCTCTGGACGACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGñCCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTÁTGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGGTTTCTCTGG GTGACCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCA CCCTGAAAATCTCTNNKNNKNNKNNKNKKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCA. 10 CGTTCCGCCGACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

Gen de la biblioteca 26-10-5: (SEQ ID NO. 43)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT

GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGNNKNNKNNKNN

KNNKNNKGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC

AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC

TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA

CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT

TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGGTTTCTCTGG

GTGACCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA

CCTGAACTGGTACCTGCAGNWKNNKNNKNNKNNKNNKAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC

CGTTTCTCTGGTGTTCCGGACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA

TCTCTCGTGTTGAAGCTGAAGACCTGGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC

GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

Los genes respectivos se ensamblan con oligonucleótidos químicamente sintetizados y se clonan en un vector de presentación en fagos para la presentación en superficie de fago como se ha descrito anteriormente con todas las adopciones necesarias para lograr la traducción en marco de un péptido conductor, la variante de sFv y la proteína de la cubierta III del fago.

Se seleccionan bibliotecas presentadas en fago para unirse a albúmina de suero humano, lisozima, FcRn y receptores de Fc gamma como se describe en el Ejemplo 8.

Alternativamente, los genes se ligan con el vector pRDV análogo al método descrito en Binz et al. (2005) Nat Biotechnol. 22:575-582 y se inmunopurifican para albúmina de suero humano, receptores de Fc y lisozima según la metodología descrita en Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231:119-135.

Ejemplo 10:

Se usa un anticuerpo humano, 2F5, específico para el péptido del VIH ELDKWA como armazón para la aleatorización de bucles estructurales y se expresa como scFv. La construcción del vector de expresión y de presentación en fagos se realiza como se describe en el Ejemplo 9. La selección de fagos se realiza por consiguiente.

La secuencia de scFv no mutante y las bibliotecas respectivas se muestran en las Figuras 5 a 8.

Ejemplo 11: Biblioteca de Fab, en la que se aleatorizan bucles estructurales de un dominio constante

Para la selección de moléculas que se unen específicamente de bibliotecas de dominios de inmunoglobulina, en las que restos que se localizan en bucles estructurales han sido aleatorizados, pueden aplicarse diversos formatos. Pueden usarse dominios individuales, tales como dominios VL, VH, CH1, cH2, CH3, CH4 o CL, pueden usarse fragmentos Fc que consisten en dominios CH2 y CH3 (que incluyen o que no incluyen la región bisagra o partes de la misma), pueden usarse fragmentos Fv o Fv monocatenarios, pueden usarse anticuerpos completos o pueden usarse otras combinaciones de dominios de inmunoglobulina. Un formato que es de particular interés para la selección de moléculas que se unen específicamente es el fragmento Fab, que es un heterodímero de dos cadenas, concretamente la parte VL-CL y la parte VH-CH1 del anticuerpo. Los fragmentos Fab se conocen desde hace tiempo, y pueden producirse por escisión proteolítica de una IgG con la proteasa papaína, y también pueden producirse recombinantemente en una amplia variedad de sistemas de expresión diferentes, tales como, por ejemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, células de insecto o células de mamífero.

Es muy conocido en la técnica que los sistemas de presentación en superficie, tales como presentación en fagos, presentación en levadura, y otros sistemas tales como presentación en ribosoma, etc., pueden usarse para el enriquecimiento y la selección de moléculas que se unen específicamente tales como fragmentos Fab de grandes bibliotecas (véase, por ejemplo, Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.

Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19(15):4133-7.; Kang AS, Barbas cF, Janda KD, Benkovic SJ, Lerner RA. Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 May 15;88(10).:4363-6.; Kang X, Yang BA, Hu Y, Zhao H, Xiong W, Yang Y, Si B, Zhu Q. Human neutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage display. Clin Vaccine Immunol. 2006 Aug;13(8):953-7.; Weaver-Feldhaus Jm, Lou J, Coleman JR, Siegel RW, Marks JD, Feldhaus MJ. Yeast mating for combinatorial Fab library generation and surface display. FEBS Lett. 2004 Apr 23;564(1-2):24-34.).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Como un ejemplo, si el sistema de presentación en fagos se aplica para la presentación de fragmentos Fab (por ejemplo, bibliotecas de fragmentos Fab), una cadena del fragmento Fab, por ejemplo la cadena VH-CH1, puede expresarse como una proteína de fusión con, por ejemplo, la proteína III del fago M13, conduciendo así a la presentación de esta cadena sobre la superficie del fago, mientras que la otra cadena, VL-CL, se expresa en forma soluble y forma el heterodímero natural con la cadena VH-CH1 anclada en superficie. En una biblioteca de presentación en superficie de Fab típico, se presentan diferentes secuencias de VH y VL, que pueden originarse de un donante, normalmente un ratón o un ser humano, pero también puede generarse diversidad por métodos in vitro tales como mutagénesis dirigida al sitio. Así se generan diferentes sitios de unión, y por el uso de una presentación adecuada u otro método de enriquecimiento o de selección pueden aislarse clones que se unen específicamente de tales bibliotecas que se unen a su componente de unión mediante el sitio de unión que se forma por VH y VL.

Pueden generarse fragmentos Fab que se unen a una diana mediante su sitio de unión natural formado por VH y VL, y a otra diana (o una segunda vez a la misma) mediante sitios de unión formados por sus bucles estructurales. Con el fin de obtener tales fragmentos Fab manipulados, primero se generan bibliotecas de Fab en las que restos en los bucles estructurales están sustituidos por secuencias aleatorizadas. También pueden hacerse inserciones de restos adicionales. Bucles estructurales que pueden ser manipulados por este enfoque puede ser o bien bucles del extremo C (los bucles "inferiores") de VH o VL, o extremo N (bucles "superiores") o bien extremo C (bucles "inferiores") de los dominios CH1 o CL. También son posibles diferentes combinaciones de dominios con bucles estructurales manipulados en cualquiera de estas posiciones. Un formato que puede usarse para seleccionar específicamente dominios de unión es dominios individuales, como fragmentos Fv o Fv monocatenarios, o, como se describe en detalle más adelante, como fragmentos Fab.

Se usan genes que codifican VH-CH1 y VL-CL, respectivamente, del anticuerpo 4D5 (Cho HS, Mason K, Ramyar KX, Stanley AM, Gabelli SB, Denney DW Jr, Leahy DJ. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 2003 Feb 13;421(6924):756-60), que se une a Her2 humano para este ejemplo. Se construye un gen sintético que consiste en VL-CL de 4D5 que codifica parte del gen, flanqueado en su extremo 5' por un sitio NcoI para la inserción en marco en la secuencia señal pelB contenida en el vector de fagémido pHEN1 (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19(15):4133-7) seguido de un codón de terminación. En el tránsito de la secuencia de VL en CL, se incluye un único sitio de restricción BsiWI, que se usa después para la sustitución de la secuencia de CL no mutante contra inserciones de biblioteca que contienen bucles estructurales aleatorizados en combinación con un sitio de restricción AscI único que se localiza en la dirección 3' del codón de terminación del gen que codifica VL-CL. De esto resulta una secuencia que contiene un sitio de unión al ribosoma (secuencia de Shine-Dalgarno) tomada de Carter et al. (Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan MD, Wong WL, Rowland AM, Kotts CE, Carver ME, et al. High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment: Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):163-7), seguido de un segmento de gen que codifica la secuencia señal de enterotoxina II (stII) estable al calor fusionada en marco con VH-CH1 que codifica parte del anticuerpo 4D5, seguido de un sitio NotI para la inserción en marco en el vector pHEN1. Esta construcción dicistrónica conduce a la expresión de VL-CL (la secuencia de proteínas que se da en SEQ ID No. 44), por una parte, y, por otra parte, de VH-CH1 fusionada con la proteína III del fago M13 (cuya secuencia de proteínas se da en SEQ ID No. 45), que está codificada por pHEN1. La secuencia completa del vector de presentación de Fab 4D5 como se describe aquí se da como una secuencia de nucleótidos en SEQ ID No. 46.

Para la construcción de una biblioteca de dominios CL en la que restos en los bucles estructurales se aleatorizan, se prepara un gen sintético que codifica un dominio constante kappa humano (CL) en el que ciertos codones están sustituidos por un codón degenerado tal como, por ejemplo, NNB (código de la IUPAC, donde N representa C,G, T y A; B representa T, C y G). También es posible insertar restos adicionales en la secuencia. En este ejemplo, 3, 4 o 5 restos se insertan respectivamente entre los restos 127 y 128, y los restos 182-185 y 187-189 se aleatorizan (numeración de Kabat). Las secuencias de los genes resultantes se dan como secuencias de nucleótidos en SEQ ID No. 47, 48 y 49 (3, 4 o 5 inserciones respectivamente entre los restos 127 y 128) y como secuencias de aminoácidos en SEQ ID No. 50, 51 y 52 (la letra X representa cualquiera de los 20 aminoácidos naturalmente codificados). Las secuencias de nucleótidos incluyen el sitio BsiWI en el extremo 5' y el sitio AscI en el extremo 3' para clonar en SEQ ID No. 46.

Para construir la biblioteca de presentación en fagos, el vector de presentación de Fab 4D5 (SEQ ID No. 46) se escinde con las enzimas de restricción BsiWI y AscI, y el fragmento grande se prepara por electroforesis preparativa en gel de agarosa. El fragmento pequeño, correspondiente al gen que codifica CL no mutante, se elimina. La mezcla de inserciones de biblioteca se describió anteriormente (SEQ ID Nos. 47-49) y asimismo se escindió con BsiWI y AscI y se ligó al fragmento de vector purificado. La mezcla de ligación se transforma en una cepa de E. coli adecuada tal como TG1 por, por ejemplo, electroporación, y se generan un gran número de colonias independientes (por ejemplo, 10exp8, 10exp9 o más). Las bacterias transformadas se reúnen y se infectan con fago auxiliar (tal como, por ejemplo, M13K07) para el rescate de partículas de fago. Las partículas de fago se producen mediante procedimientos convencionales y se usa para la inmunopurificación de la biblioteca.

La inmunopurificación de la biblioteca contra una diana dada da fragmentos Fab que no solo se unen a Her2 (debido

al sitio de unión formado por VH y VL del anticuerpo 4D5), sino también a la diana contra la que se seleccionaron.

En este ejemplo, se describe el diseño, preparación y uso de una biblioteca de presentación de Fab, en la que bucles estructurales del dominio CL se modifican. De forma análoga, pueden prepararse y usarse bibliotecas con 5 aleatorización en los bucles estructurales de otros dominios, tales como el dominio CH1, VH o VL.

Secuencias:

10

15

SEQ ID No. 44

///

1: M K Y 3 L L P T A 1C A 1 A G L L 15 L L A A Q 20 P A M A D 23 I Q M T Q 30 S i P

31: S S L S A S V G D R V T I T C R A 3 Q D V N T A V A W Y Q Q

61: K P G K ñ P K L L X Y S A S F L Y S G V P S R F S G S R S G

91: T D F T L T I S 5 L Q P E D F A T Y Y C Q Q H Y T T P P T F

121: G Q G T K V E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G

151: T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N

181: S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K

211: H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C

SEQ ID No. 45

1: M K K 5 N I A F L 1C L A S M F

31: G G G L V Q P G G S L R L

61: R Q A P G K G L E W V A R

91: F T I S A D T S K N T A Y

121: R W G G D G F Y A M D Y W

151: V F P L A P S S K S T S G

181: T V S W N S G A L T S G V

211: V V T V P s S S L G T Q T

241: V E P K S c A A A E Q K L

271: A K P H T E N s F T N V W

301: N A T G V V V c T G D E T

331: G G G S E G G G 3 E G G G

361: G Y T Y I P L D G T Y P

391: Q P L N T F M F Q N N R F

421: T D P V K T Y Y Q Y T P V

451: A F H S G F, . N E D P F V C

481: G G S G G G S G G G S E G

511: S G G G S G S G D F D Y E

541: A L Q S D A K G K L D S V

571: L A N G N G A T G D F A G

601: N N F R Q Y L P S L P Q S

631: I D C D K I N L F R G V F

661: N I L H K E S

15 V: F S I A 20 T N A Y A 25 E V Q L V 30 E S

s: C A A S G F N I K D T Y I H w V

I: Y P T N G Y T R Y A D S V K G R

L: Q M N S L R A E D T A V Y Y C S

G: Q G T L V T V S S A S T K G P S

G: T A A L G C L V K D Y F P E P V

H: T F P A V L Q s S G L Y S L s s

Y: I C N V N H K P s N T K V D K K

I: S E E D L N G A A 0 T V E S C L

K: D D K T L D R Y A N Y E G c L W

Q: C Y G T W V P I G L A I P E N E

S: E G G G T K P P E Y G D T P I P

P: G T E Q N P A N P N P 3 L E E S

R: N R Q G A L T V Y T G T V T Q G

S
S: K A M Y D A Y W N G K F R D C

E: Y Q G Q 3 S D L P Q P P V N A G

G
G: s E G G G S E G G G S E
G
G
G

K: M A N A N K G A M T E N A D E N

A: T D Y G A A I D G F I G D V S G

S: N S Q M A Q V G D G D N S P L M

V: E C R P Y V F G A G K P Y E F S

A: F L L Y V A T F M Y V F S T F
A

SEQ ID No. 46

1 gacgaaaggg cctcgtgata 61 ottagacgtc aggtggcact 121 tctaaataca ttcaaatatg 181 aatattgaaa aaggaagagt 241 ttgcggcatt ttgccttcct

cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tatccgctca tgagacaata accctgataa atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa

ataatggttt

tgtttatttt

atgcttcaat

attccctttt

gtaaaagatg

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Método de manipulación genética de una inmunoglobulina que comprende una región de bucle estructural modificada para proporcionar un sitio de unión no de CDR que se une a un epítope de un antígeno, en donde la región de bucle estructural no modificada no se une significativamente a dicho epítope, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina parental que comprende un dominio variable con una conformación de bucle de CDR específica, con propiedades de unión al antígeno originales, y una región de bucle estructural,

- modificar al menos un resto de nucleótido de dicha región de bucle estructural,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión,

- expresar dicha inmunoglobulina modificada,

- poner en contacto con un epítope la inmunoglobulina modificada expresada, y

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho epítope,

en el que se modifica al menos un nucleótido en cada uno de al menos dos bucles estructurales, introduciendo dicha modificación al menos un aminoácido extraño al sitio de modificación, seleccionado del grupo que consiste en triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina y asparagina, y dicha modificación produce una modificación de hasta 30 aminoácidos dentro de una región de bucle estructural, y en donde se retienen dicha conformación de bucle de CDR específica y las propiedades de unión al antígeno originales de la inmunoglobulina parental.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha inmunoglobulina es biespecífica y se une específicamente a dos epítopes.
3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que la inmunoglobulina es de origen humano, camélido o murino.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la reivindicación 3, caracterizado por que el dominio variable está seleccionado del grupo de VH, Vkappa, Vlambda y VHH.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la reivindicación 4, caracterizado por que las al menos dos regiones de bucle estructural modificadas de un VH, Vkappa, Vlambda o VHH comprenden al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 41 a 81 o aminoácidos 89 a 103, en donde la numeración es según el sistema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT).
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la reivindicación 4, caracterizado por que la región de bucle estructural modificada de VH o Vkappa o Vlambda de origen humano comprende al menos una modificación dentro de los aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 y aminoácidos 89 a 101, posiciones de aminoácidos 12 a 17, posiciones de aminoácidos 45 a 50, posiciones de aminoácidos 69 a 75 y posiciones de aminoácidos 93 a 98, en donde la numeración es según el sistema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT).
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la reivindicación 4, caracterizado por que la región de bucle estructural modificada de VH de origen murino comprende al menos una modificación dentro de los aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 y aminoácidos 92 a 101, en donde la numeración es según el sistema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT).
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la reivindicación 4, caracterizado por que la región de bucle estructural modificada de VHH de origen camélido comprende al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 18, aminoácidos 43 a 55, aminoácidos 68 a 75 y aminoácidos 91 a 101, en donde la numeración es según el sistema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT).
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que al menos un aminoácido de dichos al menos dos bucles estructurales se modifica por mutación aleatoria dirigida al sitio.
10. Método según la reivindicación 9, caracterizado por que la molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada comprende al menos una unidad de repetición de nucleótido que tiene la secuencia 5'-NNS-3', 5'-NNN-3' o 5'-NNK- 3', donde la codificación es según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC).
11. Un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina variante que comprende al menos dos bucles estructurales modificados, conteniendo cada uno al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina y asparagina, en donde los bucles estructurales modificados forman un sitio de unión al antígeno no de CDR, en donde el polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina variante es de origen humano o un polipéptido variante humanizado de dominio variable y comprende al menos una tirosina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 50, 69 a 75 y 93 a 98, y/o al

menos un triptófano en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 50, 69, 71 a 75, 93 a 94 y 96 a 98, y/o al menos una histidina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 46, 47, 49, 50, 69 a 74 y 93 a 98, y/o al menos una asparagina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 47, 49, 50, 70 a 73, 75, 94 a 96 y 98, y/o al menos una metionina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 46 a 50, 69 a 71, 73 a 75, 93, 95, 96 y 98, y/o al menos una 5 serina en una cualquiera de las posiciones 13, 71, 75, 94, 95 y 98, y/o al menos una isoleucina en una cualquiera de las posiciones 12, 14 a 17, 45 a 50, 69, 70, 72 a 75, 93 y 96 a 98, y/o al menos una fenilalanina en una cualquiera de las posiciones 15, 46, 48, 70 a 73, 75, 93, 95 y 98, en donde la numeración es según el sistema de numeración ImMunoGeneTics (IMGT).

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2 VQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSG VQL ESGGG VQ GGSLRLSCAASG S + +GWFRQAPGKERE VA + + G 61

Sujeto

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121 QGTQVTVSS 129 QGTQVTVSS

Sujeto

117 QGTQVTVSS 125

+ 3

P Ví Q V Q L Q E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G R T F S D

1

CCATGGCAAG TTCAGCTGCA GGAAAGCGGT GGCGGCCTGG TCCAGCCTGG CGGCAGCCTG CGTCTGAGCT GTGCGGCCAG CGGCCGTACC TTTAGCGACC

GGTACCGTTC AAGTCGACGT CCmCGCCA CCGCCGGACC AGGTCGGACC GCCGTCGGAC GCAGACTCGA CACGCCGGTC GCCGGCATGG AAATCGCTGG

+3

H S G Y T Y T r g » F R Q A P G K ERE F V A R I Y W S S G N T Y Y

101

ATAGCGGCTA CACCTATACC ATTGGCTGGT TTCGTCAGGC GCCAGGAAAA GAACGTGAAT TTGTGGCGCG TATTTACTGG AGCAGCGGCA ATACCTATTA

TATCGCCGAT GTGGATATGG TAACCGACCA AAGCAGTCCG CGGTCCTTTT CTTGCACTTA AACACCGCGC ATAAATGACC TCGTCGCCGT TATGGATAAT

+3

A D S V K G R F A I S R D I A K N T V D L T M N K L E P E D T A V

201

TGCGGATAGC GTGAAAGGCC GTTTCGCGAT TAGCCGCGAC ATTGCCAAGA ACACGGTAGA TCTTACGATG AACAACCTGG AGCCCGAAGA CACAGCCGTG

ACGCCTATCG CACTTTCCGG CAAAGCGCTA ATCGGCGCTG TAACGGTTCT TGTGCCATCT AGAATGCTAC TTGTTGGACC TCGGGCTTCT GTGTCGGCAC

+3

Y Y C A A R D G I P T S R S V E S Y N Y W G Q G T Q V T V 5 S A A

301 TATTATTGCG CGGCTCGGGA TGGCATICCG ACCAGCCGTA GCGTGGAAAG CTACAATTAC TGGGGCCAGG GCACCCAGGT GACCGTCAGC TCTGCGGCCG ATAATAACGC GCCGAGCCCT ACCGTAAGGC TGGTCGGCAT CGCACCTTTC GATGTTAATG ACCCCGGTCC CGTGGGTCCA CTGGCAGTCG AGACGCCGGC

+3

401 C

G

Figura 2

imagen1

imagen2

+3FWR X T L K ESG PPL V K P T QTL TI. T CSB’S G F S LSD

1 CCATGGCGGA TCACCCTGAA AGAGAGTGGA CCCCCCCTGG TGAAACCTAC CCAGACCCTG ACTCTGACTT GCTCATTTAG CGGCTTTAGC CTGAGCGATT

GGTñCCGCCT AGTGGGACTT TCTCTCACCT GGGGGGGACC ACTTTGGATG GGTCTGGGAC TGAGACTGAA CGAGTAAATC GCCGAAATCG GACTCGCTAA

+3FGVG VES? IRQ PFGK ALE W L ñ 1 1 Y S DDD KRÜ S P X X

101 TTGGCGTCGG CGTTGGTTGG ATTCGCCAGC CTCCCGGCAA AGCCCTGGAA TGGCTGGCCA TCATCTACTC CGATGATGAC AAGCGTTATA GCCCCMHSHN

AACCGCAGCC GCAACCAACC TAAGCGGTCG GAGGGCCGTT TCGGGACCTT ACCGACCGGT AGTñGATGAG GCTACTACTG TTCGCAATAT CGGGGAGCGA

+ 3 XXX LTI T K D T SKN Q V V LVfíX X V S P V D T A T Y FCA 201 SHHSHHSmiS CTGACCATCA CCAAAGATAC GAGCRAGAAC CAGGTGGTTT TGGTAATGMEÍ StWSGTGAGC CCCGTCGACA CCGCGACTTA TTTCTGTGCC

CTTATGGGCA GACTGGTAGT GGTTTCTATG CTCGTTCTTG GTCCACCAAA ACCATTACTG GGCACACTCG GGGCAGCTGT GGCGCTGAAT AAAGACACGG

+3HRR GPTT LFG VPI AEGF V N A M D V WGQG ITV TIS

301 CATCGTCGTG GTCCGACCAC CCTGTTTGGT GTGCCGATTG CACGCGGTCC CGTGAATGCG ATGGATGTGT GGGGGCAGGG GATTACCGTG ACCATTTCAT

GTAGCAGCAC CAGGCTGGTG GGACAAACCA CACGGCTAAC GTGCGCCAGG GCACTTACGC TACCTACACA CCCCCGTCCC CTAATGGCAC TGGTAAAGTA

+3SGGG GSG GGG SGGG GSA LQL TQSP SSL SAS VGDR

401 CCGGTGGAGG TGGTAGTGGfl. GGGGGTGGGT CAGGCGGTGG CGGCTCCGCC TTACAACTGA CGCAGAGCCC GTCTAGTTTG AGCGCAAGCG TGGGCGATCG

GGCCACCTCC ACCATCACCT CCCCCACCCñ GTCCGCCACC GCCGAGGCGG AATGTTGACT GCGTCTCGGG CAGATCAAAC TCGCGTTCGC ACCCGCTAGC

£ +3 ÍTI TCR ASQG VTS ALA WYEQ KPG SPP Q L L I YDA

501 TATTACAATT ACCTGTCGGG CGAGCCAAGG TGTTACCTCC GCCCTGGCCT GGTATCGTCA GAAACCCGGG AGCCCGCCAC AGTTGTTGAT CTACGATGCG

ATAATGTTAA TGGACAGCCC GCTCGGTTCC ACAATGGAGG CGGGACCGGA CCATAGCAGT CTTTGGGCCC TCGGGCGGTG TCAACAACTA GATGCTACGC

+3 SSL E S G V PSR F S G SGSG T E F TLT ISTL RPE DEA

SOL TCCTCACTGG AATCAGGGGT CCCTAGCCGC TTTTCCGGGT CCGGCAGCGG CACGGAATIT ACATTGACCA TAAGCACCCT GCGTCCGGAA GATTTTGCCA

RGGAGTGACC ttagtcccca gggatcggcg aaaaggccca ggccgtcgcc gtgccttaaa tgtaactggt attcgtggga cgcaggcctt CTAAAACGGT

+3TYYC QQL HFY PHTF GGG TRV DVRR TVA ASA

701 CCTATTATTG CCAACAGCTG CACTTTTATC CCCATACCTT CGGTGGGGGG ACGCGGGTTG ACGTGCGTCG TACCGTAGCT GCTGCGGCCG C

GGATAATAAC GGTTGTCGAC GTGAAAATAG GGGTATGGAA GCCACCCCCC TGCGCCCAAC TGCACGCAGC ATGGCATCGA CGACGCCGGC G

Figura 5

+3

P W P, I T L K a s g P P X X X P X XXL T L T C S F S G F S LSD

1

CCATGGCGGA TCACCCTGAA AGAGAGTGGA CCCCCCNNSN NSNNSCCTNN SítNSNNSCTG ACTCTGACTT GCTCATTTAG CGGCTTTAGC CTGAGCGATT

GGTACCGCCT AGTGGGACTT TCTCTCACCT GGGGGGGACC ACTTTGGATG GGTCTGGGAC TGAGACTGAA CGAGTAAATC GCCGAAATCG GACTCGCTAA

+3

F G V G V G W IRQ P P G K ALE «LA I I Y S 0 D D K R Y S P S L

101

TTGGCGTCGG CGTTGGTTGG ATTCGCCAGC CTCCCGGCAñ AGCCCTGGAA TGGCTGGCCA TCATCTACTC CGATGATGAC AAGCGTTATA GCCCCTCGCT

AACCGCAGCC GCAACCAACC TAAGCGGTCG GAGGGCCGTT TCGGGACCTT ACCGACCGGT AGTAGATGAG GCTACTACTG TTCGCAATAT CGGGGAGCGA

+3

N T R L T I T K D T S K N Q V V L V M X X V S P V D T A I Y F C A

201

GAATACCCGT CTGACCATCA CCAAAGATAC GAGCAAGAAC CAGGTGGTTT tggtaatgnw SNNSGTGAGC CCCGTCGACA CCGCGACTTA TTTCTGTGCC

CTTATGGGCA GACTGGTAGT GGTTTCTATG CTCGTTCTTG GTCCACCAAA ACCATTACTG GGCACACTCG GGGCAGCTGT GGCGCTGAAT AAAGACACGG

+3

H R R G P . T T L F G V P I A R G P V H A M D V W G Q G LTV T I S

301

CATCGTCGTG GTCCGACCAC CCTGTTTGGT GTGCCGATTG CACGCGGTCC CGTGAATGCG ATGGATGTGT GGGGGCAGGG GATTACCGTG ACCATTTCAT

GTAGCAGCAC CAGGCTGGTG GGACAAACCA CACGGCTAAC GIGCGCCAGG GCACTTACGC TACCTACACA CCCCCGTCCC CTAATGGCAC TGGTAAAGTA

+3

S G G G G S G G G G S G G G G S A L Q L T Q S P SSL S A S V G D R

401

CCGGTGGAGG TGGTAGTGGA GGGGGTGGGT CAGGCGGTGG CGGCTCCGCC TTACAACTGA CGCAGAGCCC GTCTAGTTTG AGCGCAAGCG TGGGCGATCG

GGCCACCTCC ACCATCACCT CCCCCACCCA GTCCGCCACC GCCGAGGCGG AATGTTGACT GCGTCTCGGG CAGATCAftfiC TCGCGTTCGC ACCCGCTAGC

+3

I T 1 T C R A S Q G V T S ALA W Y R Q K P G S P P Q L L I Y D A

sol

TATTACAATT ACCTGTCGGG CGAGCCAAGG TGTTACCTCC GCCCTGGCCT GGTATCGTCA GAAACCCGGG AGCCCGCCAC AGTTGTTGAT CTACGATGCG

ATAATGTTAA TGGACAGCCC GCTCGGTTCC ACAATGGAGG CGGGACCGGA CCATAGCAGT CTTTGGGCCC TCGGGCGGTG TCAACAACTA GATGCTACGC

+3

SSL E S G V P S R F S G S G S G T E E T L T I S T L R P E D F A

601

TCCTCACTGG fiATCAGGGGT CCCTAGCCGC TTTTCCGGGT CCGGCAGCGG CACGGAATTT ACATTGACCA TAAGCACCCT GCGTCCGGAA GATTTTGCCA

AGGAGTGACC TTAGTCCCCA GGGATCGGCG AAAAGGCCCA GGCCGTCGCC GTGCCTTAAA TGTAACTGGT ATTCGTGGGA CGCAGGCCTT CTAAAACGGT

+3

T Y Y C Q Q L H F Y í H I F G G G T R V D V R R T V A A A A

701

CCTATTATTG CCAACAGCTG CACTTTTATC CCCATACCTT CGGTGGGGGG ACGCGGGTTG ACGTGCGTCG TACCGTAGCT GCTGCGGCCG C

GGATAATAAC GGTTGTCGAC GTGAAAATAG GGGTATGGAA GCCACCCCCC TGCGCCCAAC TGCACGCAGC ATGGCATCGA CGACGCCGGC G

+3 P W R I T L K ESG P P X X X P X

1 CCATGGCGGA TCACCCTGAA AGAGAGTGGA CCCCCCNNSN NSNNSCCTNH

GGTACCGCCT AGTGGGACTT TCTCTCACCT GGGGGGGACC ACTTTGGATG

+3FGVG VGW IRQ PPGK ALE

101 TTGGCGTCGG CGTTGGTTGG ATTCGCCAGC CTCCCGGCAA AGCCCTGGAA

AACCGCAGCC GCAACCAACC TAAGCGGTCG GAGGGCCGTT TCGGGACCTT

+3 XXX L T I TKDT SKN QVV

201 SMiTSXHSNNS CTGACCATCA CCAAAGATAC GAGCAAGAAC CAGGTGGTTT

CTTATGGGCA GACTGGTAGT GGTTTCTATG CTCGTTCIXG GTCCACCAAA

+3 H R R GPTT LFG V P I ARGP

301 CATCGTCGTG GTCCGACCAC CCTGTTTGGT GTGCCGAITG CACGCGGTCC

GTAGCAGCAC CAGGCTGGTG GGACAAACCA CACGGCTAAC GTGCGCCAGG

+3SGGG GSG GGG SGGG GSñ

401 CCGGTGGAGG TGGTAGTGGA GGGGGTGGGr CAGGCGGTGG CGGCTCCGCC

GGCCACCTCC ACCATCACCT CCCCCACCCA GTCCGCCACC GCCGAGGCGG

+3 I T I TCR ASQG VTS ALA

SOI TATTACAATT’ACCTGTCGGG CGAGCCAAGG TGTTACCTCC GCCCTGGCCT

ATAATGTTAA TGGACAGCCC GCTCGGTTCC ACAATGGAGG CGGGACCGGA

+3 SSL E S G V PSR FSG SGSG

601 TCCTCACTGG AATCAGGGGT CCCTAGCCGC TTTTCCGGGT CCGGCAGCGG

AGGAGTGACC TTAGTCCCCA GGGATCGGCG AAAAGGCCCA GGCCGTCGCC

+3TYYC QQL H F Y PHTF GGG

701 CCTATTATTG CCAACAGCTG CACTTTTATC CCCATACCTT CGGTGGGGGG

GGATAATAfiC GGTTGTCGAC GTGAAAATAG GGGTATGGAA GCCACCCCCC

XXL TLT CSFS GFS LSD

SNNStlNSCTG ACTCTGACTT GCTCATTTAG CGGCTTTAGC CTGAGCGATI GGTCTGGGAC TGAGACTGAA CGAGTAAATC GCCGAAATCG GACTCGCTAA

SLA I I Y S DDD K R Y SPXX

TGGCTGGCCA TCATCTACTC CGATGATGAC AAGCGTTATA GCCCCKN3SÍH ACCGACCGGT AGTAGATGAG GCTACTACTG TTCGCAATAT CGGGGAGCGA

L V M X XVS PVD T A T Y FCA

TGGTAATGMH SHHSGTGAGC CCCGTCGACA CCGCGACTTA TTTCTGTGCC

accattactg ggcacactcg gggcagctgt ggcgctgaax aaagacacgg VNA MDV WGQG I T V TIS

cgtgaatgcg atggatgtgt gggggcaggg gattaccgtg accatttcat

GCACTTACGC TACCTACACA CCCCCGTCCC CTAATGGCAC TGGTAAAGTA

LQL TQSP SSL SAS VGDR

TTACAACTGA CGCAGAGCCC GTCTAGTTTG AGCGCAAGCG TGGGCGATCG AATGTTGACT GCGTCTCGGG CAGATCAAAC TCGCGTTCGC ACCCGCTAGC

WYRQ KEG SPP QLLI YDA

GGTATCGTCA GAAACCCGGG AGCCCGCCAC AGTTGTTGAT CTACGATGCG CCATAGCAGT CTTTGGGCCC TCGGGCGGTG TCAACAACTA GATGCTACGC

TEF TLT ISTL R P E DFA

CñCGGAATTT ACATTGACCA TAAGCACCCT GCGTCCGGAA GATTTTGCCA GTGCCTTAÁA TGTAACTGGT ATTCGTGGGA CGCAGGCCTT CTAAAACGGT

TRV D V R R T V A A A A

ACGCGGGTTG ACGTGCGTCG TACCGTAGCT GCTGCGGCCG C TGCGCCCAAC TGCACGCAGC ATGGCATCGA CGACGCCGGC G

+3

P W R I T L K E S G PPL V K P T Q T L T L T C S F 3 G F S LSD

1

CCATGGCGGA TCACCCTGAA AGAGAGTGGA CCCCCCC2GG TGAAACCTAC CCAGACCCTG ACTCTGACTT GCTCATTTAG CGGCTTTAGC CTGAGCGATT

GGTACCGCCT AGLGGGACTT TCTCTCACCT GGGGGGGACC ACTTTGGATG GGTCTGGGAC TGAGACTGAA CGAGTAAATC GCCGAAATCG GACTCGCTAA

+3

F G ' V G V G W IRQ P P G K ALE W L A I Z Y S D D D K R Y S P S L

101

TTGGCGTCGG CGTTGGTTGG ATTCGCCAGC CTCCCGGCAA AGCCCTGGAA TGGCTGGCCA TCATCTACTC CGATGATGAC AAGCGTTATA GCCcCTcera

AACCGCAGCC GCAACCAACC TAAGCGGTCG GñGGGCCGTT .TCGGGACCTT ACCGACCGGT AGIAGATGAG GCTACTACTG TTCGCAATAT CGGGGAGCGA

+3

N E E L T I T K D T S K N Q V V L V M T F. V s P V D T A T Y F C A

201

GftA^í-CCCGT CTGACCATCA CCAAAGATAC GAGCAAGAAC CAGGTGGTTT tggtaatgac CCGTGTGAGC CCCGTCGACA CCGCGACTTA TTTCTGTGCC

CTTATGGGCA GACTGGTAGT GGITTCTATG CTCGTTCTTG' GTCCACCAAA ACCATTACTG GGCACACTCG GGGCAGCTGT GGCGCTGAAT AAAGACACGG

+3

H R R G P T T L F G V P I A R G P V N A M D V W G Q G I T V T I S

301

CATCGTCGTG GTCCGACCAC CCTGTTTGGT GTGCCGATTG CACGCGGTCC CGTGAATGCG ATGGATCTGT GGGGGCAGGG GATTACCGTG ACCATTTCAT

GTAGCAGCAC CAGGCTGGTG GGACAAACCA CACGGCTAAC GTGCGCCAGG GCACTTACGC TACCTACACA CCCCCGTCCC CTAATGGCAC TGGTAAAGTA

+3

S G G G G S G G G G S G G G G S A L Q L r q s p SSL S A S V G D R

401

CCGGTGGAGG TGGTAGTGGA GGGGGTGGGT CAGGCGGTGG CGGCÍCCGCC TTACAACTGA CGCAGAGCCC GTCTAGTTTG AGCGCAAGCG tgggcgatcg

GGCCñCCTCC ACCATCACCT CCCCCACCCA GTCCGCCACC gccgaggcgg AATGTTGACT GCGTCTCGGG CAGATCAAAC TCGCGTTCGC ACCCGCrAGC

+3

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ATAATGTTAA TGGACAGCCC GCTCGGTTCC ACAATGGAGG CGGGACCGGA CCATAGCAGT CTTTGGGCCC TCGGGCGGTG TCAACAACTA GATGCTACGC

+3

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601

TCCTCñCTGG AATCAGGGGT CCCTAGCCGC TTTTCCGGGT CCGGCAGCGG CACGGAATTT ACATTGACCA TAAGCACCCT GCGTCCGGAA GATTTTGCCA

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+3

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701

CCTATTATTG CCAACAGCTG CACTTTTATC CCCATACCTT CGGTGGGGGG ACGCGGGTTG ACGTGCGTCG TACCGTAGCT GCTGCGGCCG C

GGATAATAAC GGTTGTCGAC GTGAAAATAG GGGTATGGAA GCCACCCCCC TGCGCCCAAC TGCACGCAGC ATGGCATCGA CGACGCCGGC G