PT2044117T

PT2044117T - Método para manipular imunoglobulinas

Info

Publication number: PT2044117T
Application number: PT77637411T
Authority: PT
Inventors: Himmler Gottfried; Redl Gerda; Rücker Florian; Wozniak-Knopp Gordana
Original assignee: F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entw M B H
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2017-12-07
Also published as: EP3293200A1; HUE037426T2; WO2008003116A2; CN101528775A; SI2044117T1; HK1251239A1; EP2044117B1; JP2009541361A; JP5508002B2; PL2044117T3; ES2968247T3; US20210388339A1; US9133274B2; EP2044117A2; US20170369868A1; CY1119641T1; EP3293200C0; WO2008003116A3; CN109777804A; EP3293200B1

Description

DESCRIÇÃO MÉTODO PARA MANIPULAR IMUNOGLOBULINAS Campo da invenção A presente invenção refere-se a um método para manipulação e fabrico de uma molécula que compreende um polipéptido de domínio variável de imunoglobulina modificada. 0 campo geral é a manipulação de proteínas com o objetivo de conferir propriedades de ligação específicas às mesmas. Mais especificamente, as proteínas manipuladas de relevância no presente documento são imunoglobulinas (anticorpos), e mais especificamente ainda, domínios variáveis únicos, pares ou combinações de domínios variáveis únicos de imunoglobulinas ou combinações com outros domínios de imunoglobulina. As propriedades de ligação específicas de imunoglobulinas são recursos importantes uma vez que controlam a interação com outras moléculas, como antigénios, e tornam as imunoglobulinas úteis para aplicações de diagnostico e terapêuticas. Antecedentes Estrutura de anticorpos A estrutura básica de anticorpos é similar para diversas classes de anticorpos e para diversas espécies e será explicada aqui com a utilização, como exemplo, de uma imunoglobulina IgGl intacta.

Duas cadeias pesadas idênticas (H) e duas cadeias leves idênticas (L) combinam-se para formar a molécula de anticorpo em formato de Y. As cadeias pesadas têm, cada uma, quatro domínios. Os domínios variáveis amino-terminais (VH) estão nas pontas do Y. Esses são seguidos de três domínios constantes: CHI, CH2 e o CH3 carbóxi - terminal, na base da haste do Y. Uma extensão curta, a comutação, liga as regiões constante e variável de cadeia pesada. A dobradiça liga CH2 e CH3 (o fragmento Fc) ao restante do anticorpo (os fragmentos Fab). Um fragmento Fc e dois fragmentos Fab idênticos podem ser produzidos por clivagem proteolítica da dobradiça numa molécula de anticorpo intacta. As cadeias leves são construídas por dois domínios, variável (VL) e constante (CL), separados por uma comutação.

As ligações de dissulfeto na região de dobradiça ligam as duas cadeias pesadas. As cadeias leves são acopladas as cadeias pesadas por ligações de dissulfeto adicionais.

As regiões variáveis tanto da cadeia pesada como leve (VH) e (VL) encontram-se nas "pontas" do Y, em que são posicionadas para reagir com o antigénio. Esta ponta da molécula é o lado em que as terminações N das sequências de aminoácidos estão situadas. A haste do Y projeta-se numa maneira para mediar de modo eficaz as funções efetoras, como a ativação de complemento e interação com recetores de Fc, ou ADCC e ADCP. Seus domínios CH2 e CH3 formam protuberância para facilitar a interação com proteínas efetoras. A terminação C da sequência de aminoácidos está situada no lado oposto da ponta, que pode ser chamado de "fundo" do Y.

Domínios variáveis de imunoglobulina (domínios V)

Cada domínio numa molécula de anticorpo tem uma estrutura similar de duas folhas beta embaladas firmemente uma contra a outra num barril beta antiparalelo comprimido. Esta estrutura conservada é chamada de dobra de imunoglobulina. Para referência, veja-se Bork et al. (1994) J. Mol. Biol. 242:309 a 320; Halaby et al. (1999) Protein Engineering 12: 563 a 571; Immunobiology. 5a edição. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. Nova Iorque e Londres: Garland Publishing; 2001. A dobra de domínios variáveis tem 9 filamentos beta dispostos em duas folhas de 4 e 5 filamentos. A folha de 5 filamentos é estruturalmente homóloga à folha de 3 filamentos de domínios constantes, mas contém os filamentos extra C' e C' ' . 0 restante dos filamentos (A, B, C, D, E, F, G) tem a mesma topologia e estrutura similar a suas contrapartes em dobras de imunoglobulina de domínio constante. Uma ligação de dissulfeto liga os filamentos B e F em folhas opostas, como em domínios constantes. Os domínios variáveis de cadeias de imunoglobulina tanto leves como pesadas contêm três alças hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). As três CDRs de um domínio V (CDR1, CDR2, CDR3) agrupam-se numa extremidade do barril beta. As CDRs são alças que ligam os filamentos beta B-C, C' -C' ' e F-G da dobra de imunoglobulina. Os resíduos nas CDRs variam de uma molécula de imunoglobulina para a próxima, conferindo especificidade de antigénio para cada anticorpo. Os domínios VL e VH nas pontas de moléculas de anticorpo são estreitamente embalados de modo que as 6 CDRs (3 em cada domínio) cooperem na construção de uma superfície (ou cavidade) para a ligação específica de antigénio. 0 sítio de ligação ao antigénio natural de um anticorpo é, desta forma, composto das alças que ligam os filamentos B-C, C'-C'' e F-G do domínio variável de cadeia leve e os filamentos B-C, C'-C'' e F-G do domínio variável de cadeia pesada.

Arcabouços para manipulação de proteína

Com a utilização da estrutura 3D de uma proteína como um auxílio para o projeto, os resíduos de aminoãcido situados sobre a superfície de muitas proteínas têm sido aleatorizados com a utilização da estrutura de núcleo da proteína como arcabouço. Os exemplos para esta estratégia são descritos ou analisados nas seguintes referências: Nygren PA, Uhlen M. , Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463 a 469; Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG, Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575 a 582; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191 a 199; US 6,562,617; Hufton et al. FEBS Letters (2000) 475: 225; Binz et al. Nat Biotechnol. (2005) 23:1.257 a 1.268; Hosse et al. Protein Sci. (2006) 15:14 a 27. 0 princípio básico desta técnica tem por base a observação que muitas proteínas têm um núcleo estável, formado por disposições específicas de elementos estruturais secundários, como folhas beta ou hélices alfa, que são interligados por estruturas como alças, giros ou espirais aleatórias. Tipicamente, estes últimos três elementos estruturais são menos cruciais para a estrutura geral da proteína e os resíduos de aminoácido nestes elementos estruturais podem ser permutados muitas vezes sem destruir a dobra geral da proteína. Os exemplos de ocorrência natural para este princípio do projeto são as CDRs de domínios semelhantes à imunoglobulina como pode ser encontrado em anticorpos, recetores das células T e outras moléculas da superfamília da imunoglobulina. Os exemplos artificiais incluem lipocalinas, anquirinas, inibidor de domínio de kunitz, knottin e outros arcabouços de proteína.

Manipulação das alças de CDR de domínios variáveis de imunoglobulina

Uma multiplicidade de documentos da técnica anterior mostra que o arcabouço semelhante à imunoglobulina tem sido empregado com o propósito de manipular o sítio de ligação ao antigénio ou ligando existente, introduzindo, assim, as propriedades de ligação inovadoras. Mais precisamente, principalmente as regiões CDR têm sido manipuladas para a ligação ao antigénio, em outras palavras, no caso da dobra de imunoglobulina, o sítio de ligação ao antigénio natural foi modificado para alterar sua especificidade ou afinidade de ligação. Existe um vasto conjunto de literaturas que descreve diferentes formatos de tais i munog1obu1ina s manipuladas, frequentemente expressas na forma de anticorpos completos, produtos de fusão e/ou fragmentos como fragmentos Fv de cadeia única (scFv), diacorpos, minicorpos, domínios únicos ou fragmentos Fab e similares, exibidos sobre a superfície de partículas de fago ou outros vírus e células ou expressos soluvelmente em diversos sistemas de expressão procariõticos ou eucarióticos. As técnicas são analisadas, por exemplo, em Holliger & Hudson, Nat. Biotechnol. (2005) 23:1.126 a 1.136 e Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005) 23:1.105 a 1.116.

Regiões framework ou não CDR de domínios variáveis de imunoglobulina

As alças de CDR de um domínio variável de imunoglobulina definem a especificidade de antigénio. O restante da molécula é chamado de framework (FR) . Estas regiões framework são, no entanto, compostas de estruturas de alça e filamento beta.

As alças que não são alças de CDR num domínio variável de imunoglobulina nativa não têm especificidade de ligação ao antigénio ou ligação ao epítopo, mas contribuem para o dobramento geral correto do domínio de imunoglobulina e consequentemente também para o posicionamento correto das CDRs e para interação entre os domínios. Estas alças são chamadas de alças estruturais de acordo com os propósitos desta invenção.

Os domínios variáveis de anticorpo, em geral, têm sido manipulados por muitas razões diferentes, como a construção de diversos formatos de anticorpo, enxertia de CDR (isto é, enxertia de especificidade de um anticorpo particular numa outra framework; por exemplo, Jones et al. Nature (1986) 321: 522 a 525; Kashmiri et al. Methods (2005) 36:25 a 34), alteração da superfície de domínios variáveis para tornar os mesmos mais solúveis e estáveis (por exemplo, Ewert et al. Methods (2004) 34:184 a 199; Conrath et al. J Mol Biol. (2005) 350:112 a 125), para torná-lo monomérico (por exemplo, Dottorini et al. Biochemistry (2004) 43:622 a 628))ou para estudar a interação entre domínios variáveis (por exemplo, Masuda et al. FEBS J. (2006) 273:2.184 a 2.194). Muitas das manipulações têm envolvido alterações na região framework da molécula; algumas mutações de aminoãcido dentro de alças estruturais do domínio variável foram realizadas. A influência de regiões framework remotas no posicionamento de alça de CDR é evidente a partir de resultados de enxertia de CDR que mostram que a mutação de aminoácidos de framework frequentemente é necessária para recuperar a ligação ao antigénio após a enxertia de CDRs de um framework a outro (por exemplo, Foote & Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487 a 499; Kettleborough et al. Protein Eng. (1991) 4:773 a 783; Wu et al. J. Mol. Biol. (1999) 294:151 a 162) .

Simon & Rajwesky (Protein Sci. (1992) 5:229 a 234) estudaram os efeitos de uma inserção de quatro resíduos na alça FR3 da região variável de cadeia pesada a partir do anticorpo anti-NP Bl-8. 0 mutante de inserção foi obtido como anticorpo secretado sem efeitos maiores na biossíntese, indicando que os domínios variáveis de anticorpo podem acomodar variação de comprimento não apenas em regiões determinantes de complementaridade (CDRs), mas também em alças de região framework (FR). Neste caso, o sítio de ligação ao antigénio original formado pelas alças de CDR não foi afetado pela modificação numa alça estrutural vizinha.

Enxertia de alças de CDR em regiões de alça estrutural 0 documento sob ο n° EP0640130B1 descreve análogos de proteína de superfamília da imunoglobulina (qui-proteínas) que têm mais de um sítio de ligação biológico (domínios V únicos ou Fvs) . Os sítios de ligação nestas proteínas são compreendidos de regiões hipervariáveis derivadas de moléculas relacionadas com a superfamília de moléculas da imunoglobulina, incluindo imunoglobulinas, antigénios de superfície celular (como antigénios de célula T) e recetores de célula (como recetor de Fc) . As regiões hipervariáveis são chamadas de "regiões semelhantes a CDR" e definem sítios de ligação de ligando. Adicionalmente, a qui-proteína tem pelo menos um segmento de sítio de ligação de ligando adicional, também uma região semelhante a CDR, submetida a splicing nas regiões semelhantes a FR do domínio de barril beta.

Cada sítio de ligação de ligando da qui-proteína, portanto, é compreendido de uma região semelhante a CDR derivada de moléculas da superfamília da imunoglobulina. Por exemplo, um sítio de ligação de ligando é compreendido das CDRs derivadas de uma molécula de imunoglobulina cujo ligando é um antigénio. 0 documento sob o n° EP0640130B1 mostra, desta forma, como submeter a splicing as regiões semelhantes a CDR com uma determinada especificidade a partir de uma molécula da superfamília da imunoglobulina nas alças estruturais de um domínio variável. Postulou-se que os anticorpos biespecíficos funcionais podem ser preparados por esta técnica. Hã um requisito para esta técnica que as orientações relativas das alças semelhantes a CDR (simetria de alça de CDR) para um domínio variável sejam reproduzidas a uma aproximação razoável na orientação relativa das alças estruturais. 0 documento sob o n° EP0640130B1 reivindica que tal aproximação da simetria de alça semelhante a CDR não existe para as alças estruturais. No entanto, é duvidoso que a orientação relativa das alças de CDR e das alças estruturais seja similar em resolução e detalhe suficiente; consequentemente não foi descrito até o momento que é realmente possível desenvolver moléculas biespecíficas por meio desta técnica. 0 documento sob o n° EP0640130B1 exemplifica que R19.9 (um anticorpo monoclonal murino específico para o p-azobenzeno arsonato) e 26-10 (anticorpo monoclonal murino específico para ouabaína) foram utilizados como o framework que fornece as alças de CDR primárias respetivamente, e as alças de CDR de anticorpo anti-lisozima murino Dl.3 foram enxertadas nas regiões de alça estrutural. No entanto, a especificação funcional após a enxertia não é descrita.

Um outro exemplo descreve que o anticorpo de cadeia única 26-10 específico para ouabaína poderia reter sua especificidade de ouabaína após a enxertia de duas CDRs a partir do anticorpo específico de lisozima nas alças estruturais do fragmento de anticorpo Fv de cadeia única específico de ouabaína. No entanto, não é descrito que o fragmento de anticorpo que foi produzido de acordo com este método também tinha especificidade de ligação a lisozima. Enxertia de péptidos na região de alça estrutural 0 documento sob o n° W000244215A2 descreve moléculas de ligação que compreendem um sítio de ligação alvo específico e um péptido efetor de Fc. 0 péptido efetor de Fc é um péptido de até 100 aminoácidos que interage com moléculas efetoras. 0 péptido efetor pode ser, por exemplo, inserido nas regiões de alça de um anticorpo desde que a capacidade para ligar um antigénio não seja afetada de maneira adversa. A inserção de um péptido efetor numa alça não CDR de um domínio CHI de um fragmento de imunog1obu1ina é exemplifiçada. A mesma inserção não é descrita para um domínio variável. Cada péptido enxertado numa alça não CDR de acordo com esta divulgação tem uma alta probabilidade de ser inativo devido ao ambiente estrutural diferente em que foi colocado. Além disso, pode ser difícil reter uma conformação de alça de CDR específica numa imunog1obu1ina parental se um péptido for enxertado numa alça estrutural de um domínio variável. Consequentemente, não é descrito que um péptido efetor pode ser enxertado num domínio variável sem perda de ligação ao antigénio ou ligação de molécula efetora. O documento sob o n° PCT/EP2006/050059 descreve um método para manipular uma imunoglobulina que compreende uma modificação numa região de alça estrutural para obter um novo sítio de ligação ao antigénio. Este método é amplamente aplicável a imunoglobulinas e pode ser utilizado para produzir uma série de imunoglobulinas que direcionam uma variedade de antigénios. 0 documento sob o n° US2005/266000A1 descreve polipéptidos que compreendem um domínio de framework variável de cadeia pesada variante (VFR). Um VFR é parte do sulco ou bolso de ligação ao que pode entrar em contacto com o antigénio. Os VFRs são partes da região de alça de CDR, no presente documento também chamada de região CDR, e situados num domínio variável no lado das alças de CDR para sustentar a ligação ao antigénio através da região de alça de CDR. As alças de framework além de VFR não foram submetidas à mutação com o propósito de manipular um sítio de ligação ao antigénio. É um objetivo da presente invenção fornecer imunoglobulinas e domínios variáveis de imunoglobulina com propriedades de ligação ao antigénio aperfeiçoadas e métodos para manipular e fabricar imunoglobulinas com os domínios variáveis aperfeiçoados.

Descrição da invenção 0 objetivo é alcançado pela matéria da presente invenção. A presente invenção refere-se a um método para manipular uma imunoglobulina que compreende um domínio variável e pelo menos uma modificação em pelo menos duas alças estruturais da referida imunoglobulina e determinar a ligação da referida imunoglobulina a um epítopo de um antigénio, em que a imunoglobulina não modificada não se liga significativamente ao referido epítopo, que compreende as etapas de: fornecer um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende pelo menos duas alças estruturais, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de cada uma das referidas alças estruturais, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, colocar a imunoglobulina modificada expressa em contacto com um epítopo, e determinar se a referida imunoglobulina modificada se liga ao referido epítopo.

As alças estruturais manipuladas de acordo com a invenção estão, de preferência, situadas dentro de uma ou mais regiões de alça estrutural, em alguns casos, as modificações são colocadas em até mais de 2 regiões de alça estrutural.

Com a finalidade de superar as desvantagens do estado da técnica, como descrito nos documentos sob os noS WO00244215A2 e EP0640130B1, na manipulação de um sítio de ligação numa região de alça estrutural de um domínio variável de anticorpo, a presente invenção fornece métodos para selecionar a ligação específica de um polipéptido (isto é, um péptido de domínio variável que compreende regiões de alça estrutural modificadas) em seu contexto natural (isto é, domínio variável de anticorpo). Com a finalidade de aumentar o número de estruturas potenciais de domínios de variantes que podem ser selecionadas para a ligação ao antigénio, pelo menos duas alças estruturais ou regiões de alça são modificadas de acordo com a invenção. Desta forma, é possível introduzir e selecionar muitas modificações diferentes com perturbação mínima da estrutura de domínio em geral. Uma outra vantagem da modificação de pelo menos duas alças ou regiões de alça é a área da superfície ampliada potencialmente com capacidade para interagir com um parceiro de ligação específico. Os domínios variáveis de imunoglobulina assim modificada são selecionados acerca da ligação ou funções específicas. A invenção possibilita manipular um domínio variável de imunoglobulina modificado e uma ligação de imunoglobulina modificada com seus alças estruturais ou regiões de alça modificados com alta afinidade e/ou alta especificidade com um parceiro de ligação. 0 método permite a seleção de moléculas de ligação específicas com modificações mínimas e sem destruição da estrutura geral do domínio variável de imunoglobulina,

Para superar a dificuldade para reter uma conformação de alça de CDR específica numa imunoglobulina parental, uma alça estrutural de um domínio variável é modificada de acordo com a invenção. Desta forma, pela primeira vez é possível adicionar as propriedades de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina sem a perda significativa de ligação ao antigénio ou até ligação de molécula efetora de um anticorpo parental. Surpreendentemente é possível manipular a imunoglobulina de acordo com a invenção sem interferir significativamente com as propriedades de ligação de uma conformação de alça de CDR específica, como afinidade de ligação, avidez e especificidade da imunoglobulina parental.

Uma conformação de alça de CDR específica fornece ligação ao antigénio por alças de CDR ou uma região de alça de CDR. Qualquer imunoglobulina relacionada com a ligação ao antigénio através de tal conformação de alça de CDR pode ser modificada de acordo com a invenção para obter um sítio de ligação adicional numa alça estrutural da imunoglobulina, de preferência, enquanto a conformação de alça de CDR específica e as propriedades de ligação ao antigénio originais da molécula parental podem ser retidas ou inalteradas. De preferência, as propriedades de ligação da conformação de alça de CDR podem ser mantidas até o ponto em que a afinidade de ligação da molécula parental não é significativamente reduzida, por exemplo, a constante de dissociação Kd não é significativamente aumentada, significando que a diferença em Kd é um fator, de preferência, menor que 104, mais preferencialmente, menor que 103, ainda mais preferencialmente, menor que 102 ou menor que 10.

De acordo com a presente invenção, um dos recursos principais da presente invenção é que a manipulação da imunoglobulina ou domínios variáveis de imunog1obu1ina ocorre em regiões que não estão normalmente envolvidas na ligação ao antigénio, em outras palavras, em regiões além das CDRs de um domínio variável de anticorpo. Foi observado que a dobra específica de domínios de imunoglobulina permite a introdução de mutações aleatórias em regiões que são estruturalmente análogas às CDRs, mas diferentes em posição na sequência e estrutura. As regiões identificadas para modificação de acordo com a presente invenção são, como CDRs, regiões de alça que ligam os filamentos beta da dobra de imunoglobulina. Estas alças estruturais ou regiões de alça podem ser mutadas como descrito na presente invenção, sem afetar a ligação dos domínios variáveis da imunoglobulina que é mediada através das alças de CDR. Mediante a mutação de referidas alças estruturais ou regiões de alça, é gerada uma nova superfície de ligação molecular ou bolso de ligação que é similar em tamanho e forma à superfície de ligação ou bolso de ligação formado pelas alças de CDR do sítio de ligação ao antigénio natural de um anticorpo. Uma vez que as alças estruturais também podem ser estendidas pela inserção de aminoácidos adicionais, a arquitetura do sítio de ligação recém-gerado pode ser voluntariamente ajustada ao alvo ao qual o mesmo deveria ligar-se. Por exemplo, os bolsos de ligação profundos que são especialmente adequados para a ligação de moléculas pequenas podem ser formados, de preferência, por alças longas, isto é, alças estruturais com aminoácidos adicionais inseridos em sua sequência, enquanto que, de preferência, as superfícies de ligação planas, que são bem adequadas a ligar-se a alvos com uma superfície molecular plana grande, são, de preferência, formadas quando os resíduos nas alças estruturais são mutados sem a inserção de resíduos adicionais. Mais especificamente, é descrito no presente documento que mediante a introdução de mutações aleatórias nas alças que ligam filamentos beta A-B, C'-D e E-F de um domínio variável de cadeia pesada humano ou humanizado, podem ser selecionados domínios mutantes que se ligam especificamente a albumina sérica humana ou ao recetor Fc gama III, que não são normalmente reconhecidos e ligados por domínios variáveis de imunoglobulina humanos ou humanizados. As mutações introduzidas incluem mutações em que os resíduos de aminoácido selecionados na sequência do tipo selvagem foram substituídos por resíduos escolhidos aleatoriamente e também podem incluir inserções de resíduos de aminoácido extra nas alças mencionados acima. Desta forma, de preferência, são fornecidas imunoglobulinas modificadas, de acordo com a invenção, que são obteníveis e produzidas de acordo com os métodos descritos acima, e têm um sítio de ligação específico para um antigénio, em particular, específico para uma albumina sérica, recetores de célula e fatores de complemento, mais especificamente, albumina sérica humana e recetores de Fc.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para manipular um domínio variável de imunog1obu1ina e uma imunoglobulina que contém tal domínio que se liga especificamente a um epítopo de um antigénio.

Especificamente, o método de acordo com a invenção compreende as etapas de: fornecer um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente a pelo menos um primeiro epítopo e que compreende pelo menos duas alças estruturais ou regiões de alça, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de cada uma das referidas alças estruturais ou regiões de alça codificadas pelo referido ácido nucleico, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, colocar o domínio variável de imunoglobulina modificada expresso em contacto com o referido pelo menos um segundo epítopo, e determinar se o referido domínio variável de imunoglobulina modificada liga-se especificamente ao segundo epítopo.

Este método aplica-se, de preferência, a péptidos de domínio variável de imunoglobulina. Mais preferencialmente, o método de acordo com esta forma de realização da invenção refere-se a imunog1obu1ina s que se ligam ao referido primeiro epítopo através de suas regiões CDR ou conformação de alça de CDR específica. 0 método de acordo com a invenção refere-se adicionalmente a pelo menos uma modificação em cada uma de pelo menos duas alças estruturais ou regiões de alça do referido domínio variável de imunoglobulina e determinação da ligação específica das referidas alças estruturais ou regiões de alça a pelo menos um antigénio, em que o domínio variável de imunoglobulina que contém uma região de alça ou alça estrutural não modificada não se liga especificamente a tal antigénio. 0 termo "imunoglobulina", como utilizado no presente documento, inclui imunog1obulinas ou partes, fragmentos ou derivados de imunog1obulinas. Desta forma, o mesmo inclui um "péptido de domínio variável de imunoglobulina" a ser modificado de acordo com a presente invenção (como utilizado no presente documento, os termos imunoglobulina e anticorpo são intercambiáveis), bem como os domínios variáveis de imunoglobulina ou partes dos mesmos que contêm uma alça estrutural, como um minidomínio, ou uma alça estrutural de tais domínios. As imunog1obulinas podem ser utilizadas como péptidos isolados ou como moléculas de combinação com outros péptidos. Em alguns casos, é preferencial utilizar uma alça estrutural modificada definida ou uma região de alça estrutural, ou partes da mesma, como moléculas isoladas para propósitos de ligação ou combinação. 0 "domínio variável de imunoglobulina", como definido no presente documento, contém tais péptidos ou polipéptidos de domínio variável de imunoglobulina que podem ter características de ligação específicas mediante modificação e manipulação. Os péptidos são homólogos a sequências de domínio variável de imunoglobulina, e têm, de preferência, pelo menos 5 aminoãcidos de comprimento, mais preferencialmente, pelo menos 10 ou até pelo menos 50 ou 100 aminoácidos de comprimento, e constituem pelo menos parcialmente a região de alça estrutural ou a região de alça não CDR do domínio variável. De preferência, os péptidos excluem aquelas inserções que são consideradas regiões semelhante a CDR ou regiões CDR quiméricas, híbridas ou de aminoácidos não funcionais e/ou estruturas canónicas de regiões CDR. As características de ligação referem-se a avidez, afinidade e ligação de epítopo específico.

Um derivado de uma imunoglobulina de acordo com a invenção é qualquer combinação de uma ou mais imunog1obu1inas da invenção e/ou uma proteína de fusão em que qualquer domínio ou minidomínio da imunoglobulina da invenção pode ser fundido em qualquer posição de uma ou mais outras proteínas (como outras imunog1obulinas, ligandos, proteínas de arcabouço, enzimas, toxinas e similares). Um derivado da imunoglobulina da invenção também pode ser obtido por técnicas de recombinação ou ligação a outras substâncias por meio de diversas técnicas químicas, como acoplamento covalente, interação eletrostática, ligação de dissulfeto etc.

As outras substâncias ligadas às imunoglobulinas podem ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e inorgânicas ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, PEG, pró-fármacos ou fármacos). Um derivado também é uma imunoglobulina com a mesma sequência de aminoácidos, mas produzida completa ou parcialmente a partir dos aminoácidos não naturais ou quimicamente modificados.

As moléculas manipuladas de acordo com a presente invenção serão úteis como proteínas independentes, bem como proteínas de fusão ou derivados, mais tipicamente, fundidas de tal maneira que façam parte de estruturas de anticorpo maiores ou moléculas de anticorpo completo, ou partes das mesmas, como fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv e outros. Será possível utilizar as proteínas manipuladas para produzir moléculas que são biespecíficas, triespecíficas e podem carregar até mais especificidades ao mesmo tempo, e será possível, ao mesmo tempo, controlar e pré-selecionar a valência de ligação de acordo com os requisitos da utilização planeada de tais moléculas.

Um outro aspeto da presente invenção refere-se a uma imunoglobulina com pelo menos uma região de alça além da conformação de alça de CDR do domínio variável, caracterizado por a referida pelo menos uma região de alça compreender pelo menos uma modificação de aminoácido que forma pelo menos uma região de alça modificada, em que a referida pelo menos uma região de alça modificada liga-se especificamente a pelo menos um epítopo de um antigénio. É preferencial combinar de maneira molecular pelo menos um domínio de anticorpo modificado, que se liga ao parceiro específico através das sequências não variáveis ou uma alça estrutural, com pelo menos uma outra molécula de ligação, que pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo, um recetor solúvel, um ligando ou outro domínio de anticorpo modificado. A molécula que funciona como uma parte de um par de ligação que é especificamente reconhecida pela imunoglobulina, de acordo com a invenção, é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em moléculas proteicas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.

As alças ou regiões de alça modificadas das imunoglobulinas de acordo com a invenção podem ligar-se especificamente a qualquer tipo de estruturas ou moléculas de ligação, em particular, a antigénios, moléculas proteicas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, moléculas orgânicas pequenas, moléculas inorgânicas ou combinações ou fusões dos mesmos. Certamente, as imunoglobulinas modificadas podem compreender pelo menos duas alças ou regiões de alça, de modo que cada uma das alças ou regiões de alça podem ligar-se especificamente a moléculas ou epítopos diferentes.

De acordo com a presente invenção, as regiões de ligação a antigénios ou sítios de ligação ao antigénio de todos os tipos de antigénios de superfície celular, podem ser introduzidas numa alça estrutural de uma determinada estrutura de anticorpo. A ligação das imunoglobulinas de acordo com a invenção é, de preferência, por um lado, através de regiões CDR, se a imunoglobulina conter tal região CDR, e por outro lado, através de um sítio de ligação adicional que é formado por meio da modificação de pelo menos duas alças estruturais. Aquelas alças estruturais são colocadas em um ou pelo menos dois domínios variáveis que têm uma ou mais alças estruturais modificadas. Desta forma, uma imunoglobulina de acordo com a invenção contém pelo menos duas modificações nas alças estruturais de domínios variáveis através de pelo menos uma modificação de pelo menos dois domínios variáveis ou pelo menos duas modificações de pelo menos um domínio variável. De preferência, a imunoglobulina modificada exibe, desta forma, um sítio de ligação mediante a alteração da estrutura primária da proteína ou mediante a alteração da estrutura terciária para obter um sítio de ligação específico de conformação.

Por analogia, os domínios variáveis de imunoglobulina a partir de qualquer classe de imunoglobulinas e a de imunoglobulinas a partir de qualquer espécie são suscetíveis a este tipo de manipulação. Adicionalmente, não apenas as alças específicas direcionadas nos exemplos da presente invenção podem ser manipuladas, mas qualquer alça que liga filamentos beta em domínios variáveis de imunoglobulina pode ser manipulada da mesma maneira.

As imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunog1obu1ina manipulados a partir de qualquer organismo e a partir de qualquer classe de imunoglobulina podem ser utilizados de acordo com a presente invenção como tal (como domínios únicos) ou como parte de uma molécula maior. Por exemplo, podem ser parte de uma imunog1obu1ina intacta, que consequentemente teria sua região de ligação ao antigénio "normal" formada por pelo menos uma das 6 CDRs e o novo sítio de ligação ao antigénio manipulado. Semelhante a isto, uma i munog1obu1i na multiespecífica, por exemplo, biespecífica ou triespecífica poderia ser gerada. Os domínios de i munog1obu1i na manipulados também podem ser parte de qualquer proteína de fusão.

As imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina de acordo com a invenção podem ser moléculas de anticorpo completo ou parte de anticorpos, como IgG, IgA, IgM, IgD, IgE e similares. As imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina da invenção também podem conter ou consistir num fragmento de anticorpo funcional, como Fab, Fab2, scFv, Fv ou partes do mesmo, ou outros derivados ou combinações das imunoglobulinas, como minicorpos, domínios das cadeias pesada e leve da região variável (como Fd, VL, incluindo Vlambda e Vcapa, VH, VHH), bem como minidomínios que consistem em dois filamentos beta de um domínio de imunoglobulina ligado por pelo menos duas alças estruturais (veja-se, por exemplo, Laffly et al (2005) Hum Antibodies. 2005; 14:33 a 55), como domínios isolados ou no contexto de moléculas associadas naturalmente. A imunoglobulina modificada de acordo com a invenção possivelmente é, ainda, combinada com uma ou mais imunoglobulinas modificadas ou com imunoglobulinas não modificadas, ou partes das mesmas, para obter uma imunoglobulina de combinação. As combinações são, de preferência, obtidas por técnicas de recombinação, mas também por associação através de adsorção, interações eletrostáticas ou similares, ou através de ligação química com ou sem um ligante. A sequência ligante preferencial é uma sequência ligante natural ou uma sequência artificial funcionalmente adequada.

Compreende-se que o termo "imunoglobulina", "péptido de domínio variável de imunoglobulina" e "domínio variável de imunoglobulina" inclui também derivados. Um derivado é qualquer parte ou combinação de uma ou mais imunoglobulinas e/ou uma proteína de fusão em que qualquer domínio ou minidomínio da imunoglobulina, como obtido de acordo com a invenção, pode ser combinado ou fundido em qualquer posição com um ou mais outros péptidos ou proteínas (incluindo, porém sem limitação, outras imunoglobulinas, domínios de imunoglobulina, partes de Fc, ligandos, proteínas de arcabouço, enzimas, toxinas, proteínas séricas e similares). Um derivado da imunoglobulina da invenção também pode ser obtido por meio da ligação do domínio variável de imunog1obu1ina ou imunog1obu1ina não modificada ou modificada da invenção a outras substâncias por meio de diversas técnicas químicas, como acoplamento covalente, interação eletrostática, ligação de dissulfeto etc.

As outras substâncias ligadas à i munog1obu1ina ou domínio variável de imunoglobulina podem ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e inorgânicas ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, PEG, pró-fármacos ou fármacos). Um derivado também é uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina com a mesma sequência de aminoácidos, mas produzido completa ou parcialmente a partir de aminoácidos não naturais, artificiais ou quimicamente modificados.

As moléculas manipuladas de acordo com a presente invenção serão úteis como proteínas independentes, bem como proteínas de fusão ou derivados, mais tipicamente, fundidas antes ou depois da modificação de tal maneira que façam parte de estruturas de anticorpo maiores ou moléculas de anticorpo completo, ou partes das mesmas. As imunoglobulinas de acordo com a invenção, desta forma, também podem consistir ou compreender fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv, anticorpos de cadeia única, em particular, fragmentos Fv de cadeia única, scFv bi- ou muitiespecífico, diacorpos, multicorpos, multivalentes ou multímeros de domínios de i munog1obu1ina e outros. Será possível utilizar as proteínas manipuladas para produzir moléculas que são monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas e moléculas que podem até carregar mais especificidades. Por meio da invenção, é possível controlar e pré-selecionar a valência de ligação ao mesmo tempo, de acordo com os requisitos da utilização planeada de tais moléculas.

De acordo com a presente invenção, um ou mais sítios de ligação a antigénios ou sítios de ligação ao antigénio a um ou mais antigénios podem ser introduzidos numa alça estrutural ou região de alça de uma determinada estrutura de domínio variável de anticorpo. Os antigénios podem ser moléculas de ocorrência natural, moléculas quimicamente sintetizadas ou moléculas recombinantes, em solução ou em suspensão, por exemplo, situadas sobre ou em partículas como fases sólidas, sobre ou em células ou sobre superfícies virais. Foi surpreendente que a ligação de uma imunog1obu1ina a um antigénio poderia ser obtida de acordo com a invenção, mesmo quando o antigénio ainda está aderido ou ligado a moléculas e estruturas que impediriam sua ligação. Empregando-se o antigénio alvo em seu contexto e estrutura selecionada ou natural para selecionar a imunog1obulina projetada e modificada, é possível identificar e obter aquelas imunoglobulinas modificadas que são mais bem adequadas ao propósito de utilização terapêutica ou de diagnóstico. 0 termo "antigénio", para utilização no presente documento, deve compreender moléculas selecionadas do grupo que consiste em alergénios, antigénios associados a tumor, auto-antigénios incluindo albumina, recetores de célula T, FcRn, recetores de superfície celular, enzimas, recetores de Fc, proteínas do sistema complementar, moléculas séricas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénio de protozoário e antigénios virais, também moléculas responsáveis por encefalopatia espongiforme transmissível (TSE), como priões, infeciosos ou não, e marcadores ou moléculas relacionadas com doença de Alzheimer. Os antigénios podem ser direcionados e ligados pelas imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunog1obulina como manipulado de acordo com a invenção através de pelo menos parte de uma alça estrutural modificada.

Numa forma de realização preferencial, a imunog1obulina liga-se com suas alças estruturais modificadas especificamente a pelo menos dois tais epítopos que são idênticos ou diferem-se um do outro, do mesmo antigénio ou de antigénios diferentes.

Por exemplo, o método de acordo com a invenção refere-se à manipulação de uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina que se liga especificamente a pelo menos um primeiro epítopo e que compreende pelo menos uma modificação em cada uma das pelo menos duas alças estruturais ou regiões de alça da referida imunog1obu1ina, e à determinação da ligação específica das referidas alças ou regiões de alça a pelo menos um segundo epítopo, sendo que o epítopo é selecionado do grupo de antigénios como mencionado acima, em que a alça estrutural não modificada ou região de alça (região não CDR) não se liga especificamente ao referido pelo menos um segundo epítopo. 0 termo antigénio, como utilizado de acordo com a presente invenção, deve incluir, em particular, todos os antigénios e moléculas-alvo com capacidade para serem reconhecidos por um sítio de ligação de uma imunog1obulina ou uma estrutura de anticorpo, como uma molécula-alvo inteira ou como um fragmento de tal molécula (especialmente subestruturas de alvos, em geral denominados "epítopos").

Os antigénios preferenciais como direcionados pelas imunoglobulinas de acordo com a invenção são aqueles antigénios ou moléculas que já foram comprovados como tendo ou que têm capacidade para serem imunogénicos, ligados por fatores de resposta imunológica ou imunológica ou terapeuticamente relevantes, especialmente aqueles em que uma eficácia clínica foi testada. 0 termo "antigénio", de acordo com a presente invenção, deve significar moléculas ou estruturas conhecidas por interagir ou com capacidade para interagir com a região de alça de CDR de imunoglobulinas. As regiões de alça estrutural da técnica anterior que se referem a anticorpos nativos não interagem com antigénios, mas, de preferência, contribuem para a estrutura geral e/ou para a ligação a moléculas efetoras. Apenas mediante a manipulação, de acordo com a invenção, as alças estruturais podem formar bolsos de ligação ao antigénio sem envolvimento de alças de CDR ou da região de CDR.

De acordo com uma forma de realização preferencial, o antigénio ligado pela imunog1obulina de acordo com a invenção é um antigénio de superfície celular. 0 termo "antigénios de superfície celular" deve incluir todos os antigénios ou com capacidade para serem reconhecidos por uma estrutura de anticorpo sobre a superfície de uma célula, e fragmentos de tais moléculas. Os "antigénios de superfície celular" preferenciais são aqueles antigénios que já foram comprovados como tendo ou que têm capacidade para serem imunológica ou terapeuticamente relevantes, especialmente aqueles em que uma eficácia clínica ou pré-clínica foi testada. Aquelas moléculas da superfície celular são especificamente relevantes para os propósitos da presente invenção, que mediam a atividade de extermínio de célula. Mediante a ligação da imunoglobulina de acordo com a invenção a pelo menos duas daquelas moléculas da superfície celular, o sistema imunológico fornece citólise ou morte celular, desta forma, um meio potente para atacar células humanas pode ser fornecido.

De preferência, o antigénio é selecionado a partir de antigénios de superfície celular, incluindo recetores, em particular, a partir do grupo que consiste em recetor erbB tirosina quinases (como EGFR, HER2, HER3 e HER4, porém sem limitação), moléculas da superfície de recetor TNF, como recetor Apo-1, TNFR1, TNFR2, recetor de fator de crescimento de nervo NGFR, CD40, moléculas de superfície de célula T, recetores de célula T, antigénio de célula T 0X4 0, recetor TACI, BCMA, Apo-3, DR4, DR5, DR6, recetores chamariz, como DcRl, DcR2, CARI, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, mas não se limitando a estas moléculas, antigénios de superfície de célula B, como CD10, CD19, CD2 0, CD21, CD22, antigénios ou marcadores de tumores sólidos ou células de cancro hematológico, células de linfoma ou leucemia, outras células sanguíneas incluindo plaquetas sanguíneas, mas não se limitando a estas moléculas.

De acordo com uma forma de realização preferencial adicional da presente invenção, o antigénio ou a molécula que se liga à alça estrutural ou região de alça modificada é selecionado do grupo que consiste em antigénios associados a tumor, em particular EpCAM, glicoproteína associada a tumor 72 (TAG-72), antigénio associado a tumor CA 125, antigénio de membrana específico de próstata (PSMA), antigénio associado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antigénio associado a tumor que expressa hidrato de carbono relacionado com Lewis Y, antigénio carcinoembrionário (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18 e antigénio associado a tumor de citoqueratina, antigénios bacterianos, antigénios virais, alergénios, moléculas relacionadas com alergia IgE, cKIT e recetor Fc-épsilon I, IRp60, recetor de IL-5, CCR3, recetor e eritrócito (CRI), albumina sérica humana, albumina sérica de ratinho, albumina sérica de rato, recetor Fc gama neonatal FcRn, recetores Fc-gama Fc-gama RI, Fc-gama- RII, Fc-gama RIII, recetores Fc-alfa, recetores Fc-épsilon, fluoresceína, lisozima, recetor do tipo Toll 9, eritropoietina, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CDlla, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD3 3 (proteína p67) , CD38, CD4 0, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD64, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL- 2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferão alfa, interferão beta, interferão gama,* TNF-alfa, TNFbeta2, TNFalfa, TNFalfabeta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, 0X4OL, recetor TRAIL 1, recetor de adenosina Al, recetor de linfotoxina Beta, TACI, BAFF- R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrina betal, integrina beta2, integrina alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa5, integrina alfa6, integrina alfav, alfaVbeta3 integrina, FGFR-3, fator de crescimento de queratinócito, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, recetor de célula T, B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFbetal, TGFbeta2, eotaxina-1, BLyS (estimulador de B-linfócito) , complemento C5, IgE, IgA, IgD, IgM, IgG, fator VII, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), fator de tecido, VEGF, VEGFR, recetor de endotelina, VLA-4, hidratos de carbono, como antigénios de grupo sanguíneo e hidratos de carbono relacionados, glicosilação Galili, Gastrina, recetores de Gastrina, hidratos de carbono associados a tumor, Hapteno NP-cap ou ΝΙΡ-cap, recetor de célula T alfa/beta, E- selectina, P-glicoproteína, MRP3, MRP5, glutationa-S-transferase pi (proteínas de resistência a múltiplos fãrmacos), proteína de membrana de grânulo alfa (GMP) 140, digoxina, fosfatase alcalina placentária (PLAP) e fosfatase alcalina semelhante a PLAP testicular, recetor de transferrina, Heparanase I, miosina cardíaca humana, glicoproteína Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa), citomegalovírus humano (HCMV) glicoproteína de envelope gH, gpl20 de VIH, HCMV, vírus sincicial respiratório RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gpl20, CMV, gpllbllla, ansa V3 IIIB gpl20 de VIH, vírus sincicial respiratório (RSV) Fgp, glicoproteína gD de vírus Herpes simplex (HSV), glicoproteína gB de HSV, glicoproteína envelope gB de HCMV, toxina de Clostridium perfringens e fragmentos dos mesmos.

De preferência, o antigénio é selecionado do grupo que consiste em antigénio de patogénico, antigénio associado a tumor, enzima, substrato, auto-antigénio, molécula orgânica ou alergénio. Os antigénios mais preferenciais são selecionados do grupo que consiste em antigénios virais, antigénios bacterianos ou antigénios a partir de patogénicos de eucariotas ou fagos. Os antigénios virais preferenciais incluem antigénios de HAV, HBV, HCV, HIV I, HIV II, Parvovirus, Influenza, HSV, vírus da hepatite, Flavivírus, vírus do Nilo Ocidental, vírus Ebola, Poxvirus, vírus da varíola, vírus do sarampo, vírus da Herpes, adenovirus, vírus do papiloma, vírus do polioma, Parvovirus, Rinovírus, vírus Coxsackie, vírus da pólio,

Echovirus, vírus da encefalite japonesa, virus da Dengue, virus da encefalite da carraça, vírus da febre amarela, Coronavírus, vírus sincicial respiratório, vírus parainfluenza, vírus La Crosse, vírus Lassa, vírus da raiva, rotavirus; antigénios bacterianos preferenciais incluem antigénios de Pseudomonas, Mycobacterium, Staphylococcus, Salmonella, Meningococcal, Borellia, Listeria, Neisseria, Clostridium, Escherichia, Legionella, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Moraxella, Brucella, Campylobacter, Cardiobacterium, Francisella, Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Vibrio, Chlamydia, Leptospira, Rickettsia, Mycobacterium, Treponema, Bartonella. Os antigénios eucarióticos preferenciais de eucariotas patogénicos incluem antigénios a partir de Giardia, Toxoplasma, Cyclospora, Cryptosporidium, Trichinella, leveduras, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides . A imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção pode ligar-se, de preferência, a uma das moléculas divulgadas acima. Estas moléculas também compreendem alergénios e haptenos.

As subestruturas de antigénios geralmente denominadas "epítopos" (por exemplo, epítopos de célula B, epítopos de célula T) , contanto que seja imunologicamente relevantes, isto é, também são reconhecíveis por anticorpos naturais ou monoclonais. 0 termo "epítopo" de acordo com a presente invenção deve significar uma estrutura molecular que pode constituir completamente um parceiro de ligação específico ou ser parte de um parceiro de ligação específico ao domínio de ligação ou à i munog1obu1ina da presente invenção.

Quimicamente, um epítopo pode ser composto de um hidrato de carbono, um péptido, um ácido gordo, uma substancia inorgânica ou derivados dos mesmos e quaisquer combinações dos mesmos. Se um epítopo for um péptido ou polipéptido, normalmente haverá pelo menos 3 aminoãcidos, de preferência, 8 a 50 aminoãcidos, e mais preferencialmente, entre cerca de 10 a 20 aminoãcidos incluídos no péptido. Não há limite superior crítico para o comprimento do péptido, que poderia compreender quase todo o comprimento da sequência de polipéptidos. Os epítopos podem ser epítopos lineares ou conformacionais. Um epítopo linear é compreendido de um único elemento de uma sequência primária de uma cadeia de polipéptido. Os epítopos lineares podem ser contíguos ou sobrepostos. Os epítopos conformacionais são compreendidos de aminoãcidos reunidos pela dobragem do polipéptido para formar uma estrutura terciária e os aminoácidos não são necessariamente adjacentes um ao outro na sequência linear.

Especificamente, os epítopos são pelo menos parte de moléculas diagnosticamente relevantes, isto é, a ausência ou presença de um epítopo numa amostra é qualitativa ou quantitativamente correlacionada com uma doença, com o estado de saúde, com um estado do processo no fabrico ou com o estado ambiental e alimentar. Os epítopos também podem ser pelo menos parte de moléculas terapeuticamente relevantes, isto é, moléculas que podem ser direcionadas pelo domínio de ligação específico que altera o curso da doença.

Além dos sítios de ligação ao antigénio da imunoglobulina, como manipulado de acordo com a invenção, podem ser introduzidas capacidades de ligação adicionais além de ou nas regiões de alça estrutural de domínios variáveis, por exemplo, capacidades de ligação para outros antigénios, moléculas pequenas, para fármacos ou enzimas, sítios catalíticos de enzimas ou substratos de enzima ou ligação a um análogo de estado de transição de um substrato de enzima.

De preferência, o novo sítio de ligação ao antigénio nas alças estruturais é estranho para o domínio variável de imunoglobulina não modificada. Desta forma, os alvos estranhos como moléculas efetoras, proteínas séricas, recetores Fc ou recetores de superfície celular, que não são ligados por domínios variáveis na natureza, são preferenciais como antigénios ou moléculas de ligação ligadas pelos domínios variáveis de imunoglobulina de acordo com a invenção.

Neste contexto, o termo "estranho" significa que o antigénio não é reconhecido pela região de ligação de CDR específica ou outras regiões de ligação intrínsecas ou naturais da imunoglobulina. Um parceiro de ligação estranho, mas não o parceiro de ligação natural de uma imunoglobulina, pode ser, desta forma, ligado pelo sítio de ligação ao antigénio recém-formado de uma alça estrutural. Isto significa que um parceiro de ligação natural, como um recetor Fc ou um efetor do sistema imunológico, não é considerado como ligado pelo sítio de ligação ao antigénio estranho para a imunoglobulina não modificada.

Como utilizado no presente documento, o termo "liga-se especificamente" ou "ligação específica" refere-se a uma reação de ligação que é determinante do ligando cognato de interesse numa população heterogénea de moléculas. Desta forma, sob as condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio), o domínio variável de anticorpo especificado liga-se a seu "alvo" particular e não se liga numa quantidade significativa a outras moléculas presentes numa amostra. A ligação específica significa que a ligação é seletiva em termos de identidade de alvo, alta, média ou baixa avidez ou afinidade de ligação, como selecionado. A ligação seletiva é normalmente alcançada se a constante de ligação ou dinâmica de ligação for pelo menos 10 vezes diferente. 0 termo "sistema de expressão" refere-se a moléculas de acido nucleico que contêm uma sequência de codificação desejada e sequências de controlo em ligação operável, de modo que os hospedeiros transformados ou transfetados com estas sequências tenham capacidade para produzir as proteínas codificadas. Com a finalidade de efetuar a transformação, o sistema de expressão pode estar incluído num vetor; no entanto, o ADN relevante pode ser, então, integrado também no cromossoma hospedeiro. Alternativamente, um sistema de expressão pode ser utilizado para a transcrição/tradução in vitro.

Uma "alça estrutural" ou "alça não CDR", de acordo com a presente invenção, deve ser compreendida da seguinte maneira: imunoglobulinas são produzidas a partir de domínios com uma chamada dobra de imunoglobulina. Em essência, as folhas beta antiparalelas são ligadas por alças para formar um barril beta antiparalelo compactado. Na região variável, algumas das alças dos domínios contribuem essencialmente para a especificidade do anticorpo, isto é, a ligação a um antigénio. Estas alças são chamadas de alças de CDR.

As alças de CDR estão situadas dentro da região de alça de CDR, que também pode ser, em alguns casos, a região framework variável (chamada "VFR") adjacente às alças de CDR. Sabe-se que as VFRs podem contribuir para o bolso de ligação ao antigénio de um anticorpo, que, em geral, é principalmente determinado pelas alças de CDR. Desta forma, aquelas VFRs são consideradas como parte da região de alça de CDR, e não seriam adequadamente utilizadas para o propósito da invenção. Ao contrário daquelas VFRs dentro da região de alça de CDR ou situadas próximo às alças de CDR, outras VFRs de domínios variáveis seriam particularmente adequadas para serem utilizadas de acordo com a invenção. Aquelas são as alças estruturais da VFRs situadas opostas à região de alça de CDR, ou no lado de terminação C de um domínio de imunoglobulina variável.

Todas as alças de domínios variáveis de anticorpo fora da região de alça de CDR estão, de preferência, contribuindo para a estrutura da molécula. Estas alças são definidas no presente documento como alças estruturais ou alças não CDR.

Toda a numeração das sequências de aminoãcidos das imunoglobulinas é de acordo com o esquema de numeração de IMGT (IMGT, as informações de ImMunoGeneTics internacional system@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209 a 212; Ruiz et al. , 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219 a 221; Lefranc et al. , 2001, Nucleic Acids Res. 29: 207 a 209; Lefranc et al. , 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307 a 310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29:185 a 203).

De acordo com uma forma de realização preferencial da presente invenção, o domínio variável de imunoglobulina é de origem humana, camelídea, de coelho, galinha, rato, cão, cavalo, ovelha ou murina.

Uma vez que a imunoglobulina modificada pode ser empregada para diversos propósitos, em particular, em composições farmacêuticas, a imunoglobulina é, de preferência, de origem humana, camelídea ou murina. Certamente, a imunoglobulina modificada também pode ser uma imunoglobulina quimérica ou humanizada. Na forma de realização da máxima preferência da invenção, o domínio variável modificado é de origem humana ou uma versão humanizada de um domínio variável de qualquer espécie.

Um domínio variável de imunoglobulina humanizado tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, pelo menos cerca de 55% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de domínio variável de imunoglobulina humana nativa.

Um domínio variável de imunoglobulina humanizado tem, adicionalmente, pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, pelo menos cerca de 55% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, mediante a comparação de todos os aminoácidos acessíveis em superfície com os aminoácidos acessíveis em superfície de uma sequência de domínio variável de imunoglobulina humana nativa.

As identidades de sequência ou homologia preferenciais referem-se especificamente àquelas sequências da região framework. A imunoglobulina preferencial de acordo com a invenção compreende um domínio que tem pelo menos 50% de homo log ia com o domínio não modificado. 0 termo "homologia" indica que os polipéptidos têm os mesmos resíduos ou resíduos conservados numa posição correspondente em sua estrutura primária, secundária ou terciária. 0 termo também se estende a duas ou mais sequências de nucleótidos que codificam os polipéptidos homólogos. "Domínio de i munog1obu1ina homólogo" significa um domínio de imunog1obu1ina de acordo com a invenção que tem pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácidos em relação a uma sequência de domínio de imunoglobulina de sequência nativa de comprimento total ou qualquer outro fragmento de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total como divulgado no presente documento. De preferência, um domínio de imunoglobulina homólogo terá pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácidos, de preferência, pelo menos cerca de 55% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de domínio de imunoglobulina nativa, ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total, como divulgado no presente documento. A "percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências de domínio de imunoglobulina identificadas no presente documento é definida como a percentagem de resíduos de aminoácido numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência de domínio variável de imunoglobulina específica, após o alinhamento da sequência e introdução de lacunas, se for necessário, para alcançar a percentagem de identidade de sequência máxima, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. 0 alinhamento para propósitos da determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser obtido em diversas maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, com a utilização do software de computador disponível publicamente como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles peritos na especialidade podem determinar parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências que são comparadas.

Os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos podem ser obtidos como descrito a seguir com a utilização do programa de computador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460 a 480 (1996)). A maior parte dos parâmetros de pesquisa de WU-BLAST-2 é definida para os valores padrão. Aqueles não definidos para valores padrão, isto é, os parâmetros ajustáveis, são definidos com os seguintes valores: vão de sobreposição=l, fração de sobreposição=0,125, limiar de palavra (T)=11 e matriz de pontuação=BLOSUM62. Quando WU- BLAST-2 é empregado, um valor de % de identidade de sequência de aminoácidos é determinado mediante a divisão (a) do número de resíduos de aminoácido idênticos correlacionados entre a sequência de aminoácidos do domínio variável de imunoglobulina de interesse que tem uma sequência derivada do domínio variável de imunoglobulina nativo e a sequência de aminoácidos de comparação de interesse (isto é, a sequência com a qual o domínio variável de imunoglobulina de interesse está sendo comparado que pode ser o domínio variável de imunoglobulina não modificada) como determinado por WU-BLAST-2 pelo (b) número total de resíduos de aminoácido das partes não aleatorizadas do domínio variável de imunoglobulina de interesse. Por exemplo, na declaração "um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos X que tem ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos Y", a sequência de aminoácidos A é a sequência de aminoácidos de comparação de interesse e a sequência de aminoácidos B é a sequência de aminoácidos do domínio variável de imunoglobulina de interesse.

Numa forma de realização preferencial, o polipéptido de acordo com a invenção é um anticorpo biespecífico, um anticorpo de cadeia única biespecífico ou um Fab biespecífico ou um sdAb biespecífico. É adicionalmente preferencial o facto de que o polipéptido compreende um domínio biespecífico ou uma parte do mesmo. Os exemplos específicos referem-se a moléculas Fab ou dAb com funcionalidade adicional através do novo sítio de ligação no lado oposto da região CDR. A imunoglobulina preferencial de acordo com a invenção, que é uma molécula Fab, pode conter, por exemplo, um ou dois sítios de ligação adicionais no lado de alça C-terminal de um domínio CHI e/ou CL. A imunoglobulina preferencial de acordo com a invenção, que é uma molécula dAb, pode conter, por exemplo, um sítio de ligação adicional no lado de alça C-terminal de um domínio Vh, Vhh ou VI. Por meio de tais sítios de ligação adicionais, as funcionalidades adicionais, como meia-vida prolongada (por exemplo, através da ligação a um FcRn ou proteínas séricas, como albumina ou IgG), ou função efetora (por exemplo, através da ligação a recetores de célula T, Clq ou CD64) podem ser adicionadas às moléculas. De acordo com tais exemplos, as bibliotecas de Fab ou dAb dedicadas, seriam preparadas com um tamanho adequado para possibilitar a seleção dos aglutinantes específicos para os parceiros de ligação específicos. 0 domínio variável preferencial de acordo com a invenção é selecionado do grupo de VH, VL, incluindo Vcapa e Vlambda, VHH e combinações dos mesmos. Constatou-se que aquelas modificações são de vantagem específica quando introduzidas nas alças ou regiões de alça de um VH, um Vcapa, um Vlambda ou um VHH, e as alças ou regiões de alça modificadas compreendem pelo menos uma modificação dentro de aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 ou aminoácidos 106 a 117.

As alças estruturais ou regiões de alça da imunoglobulina ou domínio variável da i munog1obu1ina de origem humana ou humanizada como modificado de acordo com a invenção são selecionados, de preferência, a partir das alças estruturais que compreendem aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 89 a 101, com máxima preferência, posições de aminoácido 12 a 17, posições de aminoácido 45 a 50, posições de aminoácido 69 a 75 e posições de aminoácido 93 a 98.

Numa outra forma de realização preferencial, uma modificação nas alças estruturais ou regiões de alça que compreendem aminoácidos 93 a 98 é combinada com uma modificação nas alças estruturais ou regiões de alça que compreendem aminoácidos 8 a 20.

As regiões de aminoácido identificadas acima das respetivas i munog1obu1ina s são alças ou regiões de alça especificadas como adequadas para propósitos de modificação de acordo com a invenção. De preferência, as combinações de tais modificações, por exemplo, em pelo menos duas das alças ou regiões de alça especificadas, são manipuladas na imunoglobulina de acordo com a invenção.

De preferência, uma modificação na alça estrutural ou região de alça que compreende aminoácidos 93 a 98 é combinada com uma modificação em uma ou mais das outras alças estruturais.

Numa forma de realização preferencial, uma modificação na alça estrutural ou região de alça que compreendem aminoácidos 93 a 98 é combinada com uma modificação na região de alça estrutural que compreendem aminoácidos 69 a 75 .

Com a máxima preferência, cada uma das alças estruturais que compreende aminoácidos 93 a 98, aminoácidos 6 9 a 75 e aminoácidos 8 a 20 contém pelo menos uma modificação de aminoácido.

Numa outra forma de realização preferencial, cada uma das alças estruturais que compreende aminoácidos 93 a 98, aminoácidos 69 a 75, aminoácidos 44 a 50 e aminoácidos 8 a 20 contém pelo menos uma modificação de aminoácido.

De acordo com uma forma de realização preferencial da presente invenção, as alças estruturais ou regiões de alça de uma imunoglobulina ou o domínio variável da imunoglobulina de origem murina, por exemplo, um VH, compreendem aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 92 a 101.

De acordo com uma outra forma de realização preferencial da presente invenção, as alças estruturais ou regiões de alça de imunoglobulinas ou o domínio variável da imunoglobulina de origem camelídea, por exemplo, VHH, compreendem aminoácidos 7 a 18, aminoácidos 43 a 55, aminoácidos 68 a 75 e aminoácidos 91 a 101.

Os domínios variáveis de origem camelídea ou variantes humanizadas de origem camelídea, têm a vantagem que poderiam ser facilmente combinados com outros domínios variáveis, por exemplo, com outro VHH de origem camelídea, modificados ou nativos. A combinação possível de VHH de origem camelídea é a base para imunoglobulinas multivalentes. Desta forma, de acordo com a invenção, os domínios variáveis modificados específicos de origem camelídea são combinações multivalentes, de preferência, com pelo menos 3, mais preferencialmente, com pelo menos 4 ou 5 valências ou VHHs.

De preferência, os novos sítios de ligação ao antigénio nas alças estruturais são introduzidos na imunoglobulina codificada pelo ácido nucleico selecionado por meio de substituição, deleção e/ou inserção de pelo menos um nucleótido.

De acordo com uma outra forma de realização preferencial da presente invenção, a modificação de pelo menos um nucleótido em cada uma de pelo menos duas alças estruturais ou regiões de alça resulta numa substituição, deleção e/ou inserção na imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina codificado pelo referido ácido nucleico. A modificação das pelo menos duas alças ou regiões de alça de uma imunoglobulina ou domínio variável de anticorpo pode resultar numa substituição, deleção e/ou inserção de 2 ou mais aminoácidos, de preferência, mutações pontuais, alteração de aminoácidos de alças totais, mais preferencialmente, a alteração de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 até 30 aminoácidos. No entanto, o número máximo de aminoácidos inseridos em alças estruturais ou regiões de alça de uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina pode, em casos específicos, não exceder o número de 30, de preferência, 25, mais preferencialmente, 20 aminoácidos.

Assim, a sequência modificada compreende aminoácidos não incluídos nas regiões conservadas das alças estruturais, sendo que os aminoácidos recém-introduzidos são de ocorrência natural, mas estranhos para o sítio de modificação, ou substitutos de aminoácidos de ocorrência natural. Quando o aminoácido estranho é selecionado a partir de um grupo específico de aminoácidos, como aminoácidos com polaridade específica, ou hidrofobicidade, uma biblioteca enriquecida no grupo específico de aminoácidos nas posições aleatorizadas pode ser obtida de acordo com a invenção. Tais bibliotecas também são chamadas de bibliotecas "focalizadas".

As pelo menos duas alças ou regiões de alça são, de preferência, mutadas ou modificadas por métodos de mutagénese aleatória, semi-aleatória ou, em particular, aleatória sítio-dirigida.

Um método preferencial para introduzir modificações é a mutação aleatória sítio-dirigida. Com este método, dois ou mais resíduos de aminoácido específicos das alças são permutados ou introduzidos com a utilização de insertos gerados aleatoriamente em tais alças estruturais. É alternativamente preferencial a utilização de abordagens de combinação.

Numa outra forma de realização preferencial, pelo menos três alças estruturais ou regiões de alça de uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina são mutados ou modificados por métodos de mutagénese aleatória, semi-aleatória ou, em particular, aleatória sítio-dirigida.

Estes métodos podem ser utilizados para fazer modificações de aminoácido em posições desejadas das imunoglobulinas ou domínio variável de imunoglobulina da presente invenção. Nestes casos, as posições são escolhidas aleatoriamente ou são feitas alterações de aminoácido com a utilização de certas regras. Por exemplo, certos resíduos podem ser mutados para quaisquer aminoácidos, enquanto que outros resíduos podem ser mutados para um conjunto restrito de aminoácidos. Isto pode ser obtido de uma maneira por fases alternando-se os ciclos de mutação e seleção ou simultaneamente. A molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada pode compreender as unidades de repetição identificadas no presente documento, que codificam todos os aminoãcidos de ocorrência natural conhecidos ou um conjunto dos mesmos. Aquelas bibliotecas que contêm sequências modificadas em que um subconjunto específico de aminoãcidos é utilizado para propósitos de modificação são chamadas de bibliotecas "focalizadas". 0 membro de tais bibliotecas tem uma probabilidade aumentada de um aminoãcido de tal subconjunto na posição modificada, que é pelo menos duas vezes maior que o habitual, de preferência, pelo menos 3 vezes ou até pelo menos 4 vezes maior. Tais bibliotecas também têm um número limitado ou menor de membros de biblioteca, de modo que o número de membros de biblioteca reais alcance o número dos membros de biblioteca teóricos. Em alguns casos, o número de membros de biblioteca de uma biblioteca focalizada é não menor que 103 vezes o número teórico, de preferência, não menor que 102 vezes, com a máxima preferência, não menor que 10 vezes.

Uma biblioteca de acordo com a invenção pode ser projetada como uma biblioteca que contém ou consiste em membros de biblioteca de um formato de imunoglobulina específico. Aquelas bibliotecas que consistem em formato molecular de imunoglobulina específico são chamadas de biblioteca dedicada para o propósito desta invenção. As bibliotecas dedicadas contêm, de preferência, uma maior parte dos formatos específicos, pelo menos 50%, de preferência, pelo menos 60%, mais preferencialmente, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, ou aqueles que consistem essencialmente em formatos de anticorpo específicos. Os formatos de anticorpo específicos são preferenciais, de modo que a biblioteca preferencial de acordo com a invenção seja selecionada do grupo que consiste numa biblioteca de VH, biblioteca de VHH, biblioteca de Vcapa, biblioteca de Vlambda, biblioteca de Fab, uma biblioteca de CH1/CL e uma biblioteca de CH3. As bibliotecas caracterizadas pelo conteúdo de moléculas compósitas que contêm mais de um domínio de anticorpo, como uma biblioteca de IgG ou biblioteca de Fc, são especialmente preferenciais. Outras bibliotecas preferenciais são aquelas que contêm recetores de célula T, que formam bibliotecas de recetores de célula T. As bibliotecas preferenciais adicionais são bibliotecas de epítopo, em que a proteína de fusão compreende uma molécula com uma variante de um epítopo, possibilitando, também, a seleção de moléculas competitivas que têm função de ligação similar, mas funcionalidade diferente. 0 exemplo é uma biblioteca de TNF-alfa, em que os trímeros da proteína de fusão de TNF-alf a são exibidos por um único pacote genético.

No entanto, o número máximo de aminoáeidos inseridos numa alça ou região de alça de uma imunoglobulina pode, de preferência, não exceder o número de 30, de preferência, 25, mais preferencialmente, 20 aminoácidos no máximo. A substituição e a inserção dos aminoácidos ocorrem, de preferência, de maneira aleatória ou semi-aleatória com a utilização de todos os aminoácidos possíveis ou uma seleção de aminoácidos preferenciais para propósitos de aleatorização, por métodos conhecidos na técnica e como divulgado no presente pedido de patente. 0 sítio de modificação pode ser numa única alça estrutural específica ou uma região de alça estrutural. Uma região de alça é normalmente composta de pelo menos dois, de preferência, pelo menos 3 ou pelo menos 4 alças que são adjacentes um ao outro, e que podem contribuir para a ligação de um antigénio através da formação de um sítio de ligação ao antigénio ou bolso de ligação ao antigénio. É preferencial que o um ou mais sítios de modificação estejam situados dentro da área de 10 aminoácidos, mais preferencialmente, dentro de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 até 100 aminoácidos, em particular, dentro de uma região de alça estrutural para formar uma superfície ou bolso em que o antigénio pode aceder de maneira estérica as regiões de alça. A pelo menos uma alça ou região de alça é, de preferência, mutada ou modificada para produzir bibliotecas, de preferência, por métodos de mutagénese aleatória, semi-aleatória ou, em particular, aleatória sítio-dirigida, em particular, para deletar, permutar ou introduzir insertos aleatoriamente gerados em alças estruturais. É alternativamente preferencial a utilização de abordagens de combinação. Qualquer um dos métodos de mutagénese conhecidos pode ser empregado, entre os mesmos a mutagénese de cassete. Estes métodos podem ser utilizados para fazer modificações de aminoãcido em posições desejadas da imunoglobulina da presente invenção. Em alguns casos, as posições são escolhidas aleatoriamente, por exemplo, com qualquer um dos possíveis aminoácidos ou uma seleção de aminoácidos preferenciais para aleatorizar sequências de alças, ou são feitas alterações de aminoácido com a utilização de regras simplistas. Por exemplo, todos os resíduos podem ser mutados, de preferência, para aminoácidos específicos, como alanina, denominado varrimento de aminoácido ou alanina. Tais métodos podem ser acoplados com abordagens de manipulação mais sofisticadas que empregam métodos de seleção para a triagem de níveis maiores de diversidade de sequência.

Um método preferencial, de acordo com a invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada que codifica uma imunoglobulina, domínio de imunoglobulina ou uma parte do mesmo que compreende pelo menos uma unidade de repetição de nucleótido dentro de uma região de codificação de alça estrutural que tem a sequência 5'-NNS-3', 5'-NNN-3', 5' - NNB-3' OU 5' - NNK-3' . Em algumas formas de realização, o ácido nucleico modificado compreende codões de nucleótido selecionados do grupo de TMT, WMT, BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS ou qualquer combinação dos mesmos (a codificação é de acordo com IUPAC). A molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada pode compreender as unidades de repetição identificadas acima, que codificam todos os aminoácidos de ocorrência natural conhecidos ou um conjunto dos mesmos. A modificação da molécula de ácido nucleico pode ser realizada por meio da introdução de oligonucleõtidos sintéticos num segmento maior de ácido nucleico ou por síntese de novo de uma molécula de ácido nucleico completa. A síntese de ácido nucleico pode ser realizada com blocos de construção de tri-nucleótido que reduziriam o número de combinações de sequência sem sentido se um subconjunto de aminoácidos deve ser codificado (por exemplo, Yanez et al. Nucleic Acids Res. (2004) 32 : el58; Virnekas et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22:5.600 a 5.607).

De preferência, as posições a serem modificadas são aminoácidos expostos em superfície. A exposição de superfície de aminoácidos de alças estruturais pode ser julgada a partir de estruturas de proteína conhecidas de domínios variáveis de anticorpo e por analogia ou homologia para tais sequências de aminoácidos nas quais nenhuma estrutura experimentalmente determinada está disponível.

Numa forma de realização preferencial da invenção, as modificações introduzidas nos pelo menos duas alças estruturais compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos estranhos ou aminoácidos de ocorrência não natural no respetivo sítio da alça estrutural do domínio variável de imunoglobulina ou imunoglobulina não modificada. A modificação de aminoácidos pode ser, de preferência, inclinada para introduzir em alças estruturais ou regiões de alça aminoácidos que são conhecidos como estando frequentemente envolvidos em interações proteína-proteína (por exemplo, Lea & Stewart (1995) FAS EB J. 9:87 a 93; Fellhouse et al. (2006) J. Mol. Biol. 357:100 a 114; Adib-Conquuy et al. (1998) International Immunology 10:341 a 346; Lo Conte et al. (1999) J. Mol. Biol. 285:2.177 a 2.198; Zemlin et al. (2003) J. Mol. Biol. 334:733 a 749).

De acordo com uma forma de realização da invenção, uma imunoglobulina obtenível pelo método de acordo com a invenção é utilizada para a preparação de uma biblioteca com membros de biblioteca que exibem ou que codificam as imunoglobulinas de acordo com a invenção, especificamente uma biblioteca de proteínas, proteínas de fusão, células, em particular células microbianas, como células bacterianas ou de levedura, fagos, vírus, ácidos nucleicos ou ribossomas. 0 relatório descritivo a seguir não apenas refere-se a bibliotecas de variantes de proteína ou polipéptido, mas, certamente, também às bibliotecas alternativas utilizadas para expressar as imunoglobulinas de acordo com a invenção, por exemplo, como mencionado acima.

Em uma forma de realização preferencial, uma biblioteca de variantes de polipéptido que compreende imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina da invenção é utilizada como um agrupamento para seleção, em que as modificações contêm ou introduzem pelo menos um, mais preferencialmente, pelo menos dois aminoácidos por alça estrutural modificada do grupo de aminoácidos triptofano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina e asparagina.

Constatou-se que, de acordo com a invenção, um polipéptido de domínio variável de variante pode ser dotado de mutações específicas que são estranhas para os polipéptidos nativos. Qualquer um dos aminoácidos triptofano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina e asparaginas não está presente nas alças estruturais de imunoglobulinas nativas humanas, desta forma, são considerados como "estranhos". Um polipéptido variante de acordo com a invenção pode conter pelo menos dois dos referidos aminoácidos estranhos nas alças estruturais, por meio de modificação de pelo menos uma alça estrutural e para compor um sítio de ligação.

Se o domínio variável de imunoglobulina ou imunoglobulina modificada for de origem humana ou um domínio variável de imunoglobulina humanizado, as modificações preferenciais são a incorporação de pelo menos uma tirosina em qualquer uma das posições 12 a 17, 45 a 50, 69 a 75 e 93 a 98 e/ou pelo menos um triptofano em qualquer uma das posições 12 a 17, 45 a 50, 69, 71 a 75, 93 a 94 e 96 a 98 e/ou pelo menos uma histidina em qualquer uma das posições 12 a 17, 46, 47, 49, 50, 69 a 74 e 93 a 98 e/ou pelo menos uma asparagina em qualquer uma das posições 12 a 17, 45 a 47, 49, 50, 70 a 73, 75, 94 a 96 e 98 e/ou pelo menos uma metionina em qualquer uma das posições 12 a 17, 46 a 50, 69 a 71, 73 a 75, 93, 95, 96 e 98 e/ou pelo menos uma serina em qualquer uma das posições 13, 71, 75, 94, 95 e 98 e/ou pelo menos uma isoleucina em qualquer uma das posições 12, 14 a 17, 45 a 50, 69, 70, 72 a 75, 93 e 96 a 98 e/ou pelo menos uma fenilalanina em qualquer uma das posições 15, 46, 48, 70 a 73, 75, 93, 95 e 98.

De acordo com uma outra forma de realização preferencial da presente invenção, pelo menos dois resíduos de aminoãcido nas posições 15 a 17, 29 a 34, 85,4 a 85,3, 92 a 94, 97 a 98 e/ou 108 a 110 de um anticorpo de domínio único humano ou humanizado são modificados.

As moléculas de ácido nucleico que codificam as imunoglobulinas modificadas ou domínios variáveis de imunoglobulina (e sempre incluídas ao longo de todo relatório descritivo: imunoglobulinas e fragmentos de imunoglobulina que compreendem um domínio variável de imunoglobulina modificada) podem ser clonadas em células hospedeiras, expressadas e analisadas acerca de suas especificidades de ligação. Essas práticas são realizadas com a utilização de procedimentos bem conhecidos, e uma variedade de métodos que podem encontrar utilização na presente invenção é descrita em Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3a edição (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, 2001) e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Os ácidos nucleicos que codificam as imunoglobulinas modificadas ou domínios variáveis de imunoglobulina da presente invenção podem ser incorporados num vetor de expressão para expressar as referidas imunoglobulinas. Os vetores de expressão tipicamente compreendem uma imunoglobulina operacionalmente ligada - que é colocada numa relação funcional - com sequências reguladoras ou de controlo, marcadores selecionáveis, quaisquer parceiros de fusão e/ou elementos adicionais. As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser produzidas por meio da cultura de uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, de preferência, um vetor de expressão, que contêm ácido nucleico que codifica as imunoglobulinas modificadas, sob as condições adequadas para induzir ou causar a expressão das imunoglobulinas modificadas. Os métodos para introduzir moléculas de ácido nucleico exógenas num hospedeiro são bem conhecidos na técnica, e irão variar com o hospedeiro utilizado. Certamente, os sistemas de expressão não celulares ou isentos de célula para a expressão de imunoglobulinas modificadas podem ser empregados.

Numa forma de realização preferencial da presente invenção, as imunoglobulinas modificadas são purificadas ou isoladas após a expressão. As imunoglobulinas modificadas podem ser isoladas ou purificadas numa variedade de maneiras conhecidas pelos peritos na especialidade. Os métodos de purificação padrão incluem técnicas cromatográficas, eletroforéticas, imunológicas, precipitação, diálise, filtração, concentração e técnicas de cromatofocalização. A purificação pode ser muitas vezes possibilitada por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados com a utilização de resina de glutationa se uma fusão GST for empregada, cromatografia de afinidade de Ni2+ se uma His-tag for empregada ou anticorpo anti-Flag imobilizado se uma flag-tag for utilizada. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, veja-se, por exemplo, Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 1994, 3a edição, Springer- Science and Business Media Inc., NY ou Roe, "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", 2001, Oxford University Press. Certamente, também é possível expressar as imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção sobre a superfície de um hospedeiro, em particular, sobre a superfície de uma célula bacteriana, de inseto ou levedura ou sobre a superfície de fagos ou vírus.

As imunoglobulinas modificadas da invenção podem ser submetidas à triagem com a utilização de uma variedade de métodos incluindo, porém sem limitação, aqueles que utilizam ensaios in vitro, ensaios à base de célula e in vivo e tecnologias de seleção. A automação e tecnologias de triagem com alto rendimento podem ser utilizadas nos procedimentos de triagem. A triagem pode empregar a utilização de uma identificação ou parceiro de fusão, por exemplo, uma enzima, uma identificação imunológica, identificação isotópica ou identificação de molécula pequena, como um corante fluorescente ou colorimétrico, ou uma molécula luminogénica.

Numa forma de realização preferencial, as propriedades funcionais e/ou biofísicas das imunoglobulinas são submetidas à triagem num ensaio in vitro. Numa forma de realização preferencial, o anticorpo é submetido à triagem acerca de funcionalidade, por exemplo, sua capacidade para catalisar uma reação ou sua especificidade de ligação, reatividade cruzada e/ou afinidade com seu alvo.

Numa outra forma de realização preferencial, os domínios de imunoglobulina modificada favoráveis podem ser selecionados in vivo, por exemplo, mediante a introdução dos mesmos numa célula ou num organismo. As variantes especificamente ligadas podem ser isoladas a partir do fluido corporal, como sangue ou líquido linfático, ou a partir de órgãos específicos, dependendo das propriedades necessárias dos domínios modificados.

Os ensaios podem empregar uma variedade de métodos de deteção que incluem, porém sem limitação, identificações cromogénicas, fluorescentes, luminescentes ou isotópicas.

Conforme é bem conhecido na técnica, existe uma variedade de tecnologias de seleção que podem ser utilizadas para a identificação e isolamento de proteínas com certas características de ligação e afinidades, incluindo, por exemplo, tecnologias de exibição como exibição em fago, exibição em ribossoma, exibição em superfície celular e similares, como descrito abaixo. Os métodos para produção e triagem de variantes de anticorpo são bem conhecidos na técnica. Os métodos gerais para biologia molecular, expressão, purificação e triagem de anticorpo são descritos em Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; e Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683 a 689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339 a 376 .

Como é conhecido na técnica, alguns métodos de triagem selecionam membros favoráveis de uma biblioteca. Os métodos são denominados, no presente documento, "métodos de seleção", e esses métodos encontram utilização na presente invenção para triagem de imunoglobulinas modificadas.

Quando as bibliotecas de domínio variável de imunog1obu1ina de variante são submetidas à triagem com a utilização de um método de seleção, apenas aqueles membros de uma biblioteca que são favoráveis, a saber que atendem alguns critérios de seleção, são propagados, isolados e/ou observados. Conforme será observado, devido ao facto de que apenas as variantes mais aptas são observadas, tais métodos possibilitam a triagem de bibliotecas que são maiores que aquelas passíveis de triagem por métodos que analisam a aptidão de membros de biblioteca individualmente. A seleção é possibilitada por qualquer método, técnica ou parceiro de fusão que liga, de maneira covalente ou não covalente, o fenótipo de imunog1obulinas com seu genótipo que é a função de um anticorpo com o ácido nucleico que codifica o mesmo. Por exemplo, a utilização de exibição em fago como um método de seleção é possibilitada pela fusão de membros de biblioteca com uma proteína de revestimento de fago (é mais frequentemente utilizada a proteína de gene de bacteriófago filamentoso III, no entanto, podem ser utilizadas também outras proteínas de revestimento, como proteína VIII, proteína VII, proteína VI e proteína IX). Desta maneira, a seleção ou isolamento de imunoglobulinas modificadas que atendem alguns critérios, por exemplo, afinidade de ligação com o alvo da imunog1obulina, também seleciona ou isola o ácido nucleico que codifica as mesmas. Uma vez isolado, o gene ou genes que codificam imunoglobulinas modificadas podem ser, então, amplificados. Este processo de isolamento e amplificação, denominado panning, pode ser repetido, permitindo que variantes de domínio variável de anticorpo favoráveis na biblioteca sejam enriquecidas. A sequenciação de ácido nucleico do ácido nucleico fixado finalmente permite a identificação de gene. É conhecida na técnica uma variedade de métodos de seleção que pode encontrar utilização na presente invenção para triagem de bibliotecas de imunog1obulina ou domínio variável de imunoglobulina. Estes incluem, porém sem limitação, exibição em fago (Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10.832 a 10.838; Smith, 1985, Science 228:1.315 a 1.317) e seus derivados, como infeção de fago seletivo (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544 a 551), fago seletivamente infecioso (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619 a 630) e panning de infetividade retardada (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893 a 904), exibição em superfície celular (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395 a 399) como exibição em bactérias (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29 a 34; Georgiou et al. , 1993, Trends Biotechnol 11:6 a 10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645 a 648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576 a 580), células de levedura (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430 a 444; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553 a 557) e de mamífero (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1.215 a 1.219), bem como tecnologias de exibição in vitro (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400 a 405) como exibição em polissoma (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:9.022 a 9.026), exibição em ribossoma (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:4.937 a 4.942), exibição em mARN (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:12.297 a 12.302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405 a 408) e sistema de exibição de inativação em ribossoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538 a 543).

Outros métodos de seleção que podem encontrar utilização na presente invenção incluem métodos que não dependem da exibição, como métodos in vivo que incluem, porém sem limitação, triagem citométrica e expressão periplásmica (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537 a 542) , o ensaio de complementação de fragmento de anticorpo (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:10.340 a 10.344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12.141 a 12.146) e a triagem de dois híbridos de levedura (Fields & Song, 1989, Nature 340:245 a 246) utilizada no modo de seleção (Visintin et al. , 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11.723 a 11.728) . Numa forma de realização alternativa, a seleção é possibilitada por um parceiro de fusão que se liga a uma sequência específica no vetor de expressão, ligando, assim, de maneira covalente ou não covalente o parceiro de fusão e membro de biblioteca de imunoglobulina associado com o ácido nucleico que codifica os mesmos. Por exemplo, o documento sob o n° WO9308278 descreve tal técnica e parceiro de fusão que podem encontrar utilização na presente invenção. Numa forma de realização alternativa, a seleção in vivo pode ocorrer se a expressão do anticorpo conferir alguma vantagem de crescimento, reprodução ou sobrevivência para a célula.

Alguns métodos de seleção são denominados métodos de "evolução dirigida". Aqueles métodos incluem o cruzamento ou melhoramento de sequências favoráveis durante a seleção, às vezes com a incorporação de novas mutações. Como será observado por aqueles peritos na especialidade, os métodos de evolução dirigida podem facilitar a identificação das sequências mais favoráveis numa pluralidade de polipéptidos, e podem aumentar a diversidade de sequências que são submetidas à triagem. É conhecida na técnica uma variedade de métodos de evolução dirigida que pode encontrar utilização na presente invenção para a geração e triagem de variantes de domínio variável de anticorpo, incluindo, porém sem limitação, embaralhamento de ADN (documentos sob os nos PCT WOOO/42561; PCT WO 01/70947), embaralhamento de exão (Kolkman & Stemmer, 2001, Mat Biotechnol 19:423 a 428), embaralhamento de família (Crameri et al., 1998, Nature 391:288 a 291), aleatorização combinatória seletiva (documentos sob os nos W003012100, W004018674A1), quimeragénese aleatória em modelos transitórios (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354 a 359), evolução molecular por recombinação in vivo por processo de extensão escalonada (StEP) (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258 a 261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681 a 683), montagem de gene mediada por exonuclease (patente n° U.S. 6,352,842,- patente n° U.S. 6,361,974), mutagénese de saturação de sítio de gene (patente n° U.S. 6,358,709), remontagem de gene (patente n° U.S. 6,358,709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11.248 a 11.253), métodos de fragmentação de ADN (Kikuchi et al., Gene 236:159 a 167), embaralhamento de ADN de filamento simples (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133 a 137) e tecnologia de manipulação de anticorpo de evolução dirigida (Applied Molecular Evolution) (patente n° U.S. 5,824,514; patente n° U.S. 5,817,483; patente n° U.S. 5,814,476; patente n° U.S. 5,763,192; patente n° U.S. 5,723,323).

Numa forma de realização preferencial, variantes de domínio variável de anticorpo ou i munoglobulinas são submetidas à triagem com a utilização de um ou mais ensaios in vivo ou à base de célula. Para tais ensaios, os domínios variáveis de imunog1obu1ina ou imunoglobulinas modificadas purificadas ou nâo purificadas são tipicamente adicionadas de maneira exógena, de modo que as células sejam expostas a domínios variáveis de imunoglobulina modificada ou imunoglobulinas individuais ou agrupamentos de domínios variáveis de imunoglobulina modificada que pertencem a uma biblioteca. Estes ensaios são tipicamente, mas nem sempre, baseados na função desejada da imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina; a saber, a capacidade do anticorpo ou domínio variável de anticorpo modificado de acordo com a invenção para ligar-se a seu alvo e para mediar algum evento bioquímico, por exemplo, função efetora, inibição de ligação de ligando/recetor, apoptose e similares. Tais ensaios muitas vezes envolvem a monitorização da resposta de células ao domínio variável de anticorpo, por exemplo, sobrevivência celular, morte celular, alteração em morfologia celular ou ativação transcricional, como expressão celular de um gene natural ou gene repórter. Por exemplo, tais ensaios podem medir a capacidade de variantes de domínio de imunoglobulina variável para suscitar ADCC, ADCP ou CDC. Por algumas razões, as células ou componentes adicionais, isto é, adicionalmente às células-alvo, podem precisar ser adicionados, por exemplo, complemento sérico, ou células efetoras como monócitos de sangue periférico (PBMCs), células NK, macrófagos e similares. Tais células adicionais podem ser a partir de qualquer organismo, de preferência, seres humanos, ratinhos, rato, coelho e macaco. As imunoglobulinas podem causar apoptose de certas linhagens de células que expressam o alvo, ou podem mediar o ataque em células-alvo por células imunes que foram adicionadas ao ensaio. Os métodos para a monitorização de viabilidade ou morte celular são conhecidos na técnica e incluem a utilização de corantes, reagentes imunoquímicos, citoquímicos e radioativos. Por exemplo, os ensaios de manchamento de caspase podem possibilitar a medição de apoptose, e a absorção ou libertação de substratos radioativos ou corantes fluorescentes pode possibilitar que a ativação ou crescimento celular seja monitorizado.

Alternativamente, as células-alvo danificadas ou mortas podem ser monitorizadas mediante a medição da libertação de um ou mais componentes intracelulares naturais, por exemplo, lactato desidrogenase. A ativação transcricional também pode servir como um método para avaliar a função em ensaios à base de célula. Neste caso, a resposta pode ser monitorizada por meio da avaliação de genes naturais que podem ser regulados de forma ascendente, por exemplo, a libertação de certas interleucinas pode ser medida ou, alternativamente, a leitura pode ser através de um sistema repórter. Os ensaios à base de célula também podem envolver a medição de alterações morfológicas de células como resposta à presença de domínios variáveis de imunoglobulina modificada. Os tipos de célula para tais ensaios podem ser procarióticas ou eucarióticas, e pode ser empregada uma variedade de linhagens de células que é conhecida na técnica.

Alternativamente, as triagens à base de célula podem ser realizadas com a utilização de células que foram transformadas ou transfetadas com ácidos nucleicos que codificam os domínios variáveis de imunoglobulina de variante. Neste caso, as variantes de domínio variável de anticorpo da invenção não são adicionadas de maneira exógena às células (por exemplo, Auf der Maur, 2004, Methods, 34:215 a 224) . Num outro método alternativo, a triagem à base de célula utiliza exibição em superfície celular. Pode ser empregado um parceiro de fusão que possibilita a exibição de domínios variáveis de imunoglobulina modificada sobre a superfície de células (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395 a 399).

Numa forma de realização preferencial, a imunogenicidade das imunoglobulinas modificadas pode ser alterada e determinada experimentalmente com a utilização de um ou mais ensaios à base de célula ou imunológicos (por exemplo, Koren et al. , 2002, Current Pharmaceutical Biotechnology 3:349 a 360; Chirino et al. , 2004, Drug Discovery Today 9:82 a 90; Tangri et al., 2005, J. Immunol. 174:3.187 a 3.196; Hermeling et al., 2004, Pharm. Res. 21:897 a 903). Numa forma de realização preferencial, os ensaios de ativação de células T ex vivo são utilizados para quantificar experimentalmente a imunogenicidade. Neste método, as células apresentadoras de antigénio e células T naifes a partir de doadores correlacionados são provocadas com um péptido, imunoglobulina ou anticorpo total de interesse uma ou mais vezes. A ativação de células T pode ser detetada com a utilização de vários métodos, por exemplo, por meio da monitorização de libertação de citocina ou medição da absorção de timidina tritiada. Em formas de realização preferenciais, a tecnologia LUMINEX ê utilizada para medir a libertação de citocina (por exemplo, de Jager et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2003, 10:133 a 13 9) ou a produção de interferon é monitorizada com a utilização de ensaios Elispot (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17 a 24) .

As propriedades biológicas ou funcionais das imunoglobulinas modificadas ou domínios variáveis de imunoglobulina da presente invenção podem ser caracterizadas em experiências de célula, tecido e organismo inteiro. Como é conhecido na técnica, os fármacos são muitas vezes testados em animais, incluindo, porém sem limitação, ratinhos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e macacos, para medir uma eficácia do fármaco para o tratamento contra uma doença ou modelo de doença, ou para medir a farmacocinética, toxicidade e outras propriedades de um fármaco. Os animais podem ser denominados modelos de doença. Os produtos terapêuticos são muitas vezes testados em ratinhos, incluindo, porém sem limitação, ratinhos sem pelos, ratinhos SCID, ratinhos de xenoenxerto e ratinhos transgénicos (incluindo mutantes genéticos modificados {knockin) e inativados (knockout)). Tal experiência pode fornecer dados significativos para a determinação do potencial da variante de polipéptido a ser utilizada como um produto terapêutico. Qualquer organismo, de preferência, mamíferos, pode ser utilizado para teste. Devido à sua similaridade genética com seres humanos, os macacos podem ser modelos terapêuticos adequados e, desta forma, podem ser utilizados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinética ou outra propriedade das i munog1obu1ina s modificadas da presente invenção. O teste de candidatos de fármaco em seres humanos é predominantemente exigido para a aprovação como produtos terapêuticos e, desta forma, certamente essas experiências são contempladas. Desta forma, as imunoglobulinas modificadas ou domínios variáveis de imunoglobulina da presente invenção podem ser testados em seres humanos para determinar sua eficácia terapêutica, toxicidade, imunogenicidade, farmacocinética, farmacodinâmica e/ou outras propriedades clínicas. A imunoglobulina de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para qualquer propósito conhecido na técnica para imunoglobulinas, mas também possibilita aplicações que são dependentes da combinação de especificidades introduzidas pela presente invenção.

Em uma forma de realização, a variante de anticorpo da presente invenção é utilizada para terapia ou profilaxia, para utilização analítica ou preparatória, como um composto de diagnóstico, industrial ou um reagente de pesquisa, de preferência, um produto terapêutico. A variante de anticorpo pode encontrar utilização numa composição de anticorpo que é monoclonal, oligoclonal ou policlonal. Numa forma de realização preferencial, as imunoglobulinas modificadas ou domínios variáveis de imunoglobulina da presente invenção são utilizados para exterminar células-alvo que contêm o antigénio alvo, por exemplo, células cancerosas. Numa forma de realização alternativa, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar ou agonizar o antigénio alvo, por exemplo, antagonizar uma citocina ou recetor de citocina. Numa forma de realização alternativamente preferencial, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar ou agonizar o antigénio alvo e exterminar as células-alvo que contêm o antigénio alvo.

Numa forma de realização alternativamente preferencial, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar ou agonizar fatores de crescimento ou recetores de fator de crescimento e exterminar células-alvo que contêm ou precisam do antigénio alvo. Numa forma de realização alternativamente preferencial, as imunog1obu1ina s modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar ou agonizar enzimas e substrato de enzimas. Numa outra forma de realização alternativamente preferencial, os domínios variáveis de imunog1obulina modificada da presente invenção são utilizados para neutralizar agentes infeciosos como vírus, vírus pequenos, priões, bactérias ou fungos.

As imunog1obu1inas modificadas ou domínios variáveis de imunog1obulinas da presente invenção podem ser utilizados para propósitos terapêuticos. Numa forma de realização preferencial, um anticorpo que compreende a imunoglobulina modificada ou domínio variável de imunoglobulina é administrado a um paciente para tratar um distúrbio específico. Um "paciente" para os propósitos da presente invenção inclui tanto seres humanos como outros animais, de preferência, mamíferos e, com a máxima preferência, seres humanos. 0 termo "distúrbio específico" no presente documento significa um distúrbio que pode ser melhorado pela administração de uma composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina modificada ou domínio variável de imunoglobulina da presente invenção.

Em uma forma de realização, uma imunoglobulina modificada ou domínio variável de imunog1obu1ina de acordo com a presente invenção é o único agente terapeuticamente ativo administrado a um paciente. Alternativamente, a imunoglobulina modificada ou domínio variável de imunoglobulina de acordo com a presente invenção é administrada em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, incluindo, porém sem limitação, agentes citotõxicos, agentes quimioterápicos, citocinas, agentes inibitórios de crescimento, agentes anti-hormonais, inibidores de quinase, agentes anti-angiogénicos, cardioprotetores ou outros agentes terapêuticos. A imunoglobulina modificada ou domínio variável de imunoglobulina pode ser administrada concomitantemente com um ou mais regimes terapêuticos. Por exemplo, uma variante de anticorpo da presente invenção pode ser formulada e administrada ao paciente juntamente com quimioterapia, radioterapia ou tanto quimioterapia como radioterapia. Em uma forma de realização, a i munog1obu1ina modificada ou domínio variável de imunoglobulina da presente invenção pode ser administrada em conjunto com um ou mais anticorpos, que pode ou não compreender uma variante de anticorpo da presente invenção. De acordo com uma outra forma de realização da invenção, a imunoglobulina modificada ou domínio variável de imunoglobulina da presente invenção e uma ou mais outras terapias anticancro são empregadas para tratar células cancerosas ex vivo. É contemplado que tal tratamento ex vivo pode ser útil no transplante de medula óssea e, particularmente, transplante de medula óssea autóloga. Certamente, é contemplado que os anticorpos da invenção podem ser empregados em combinação com mais outras técnicas terapêuticas como cirurgia.

Uma variedade de outros agentes terapêuticos pode encontrar utilização para administração com as imunoglobulinas modificadas da presente invenção. Em uma forma de realização, a i munog1obu1ina modificada é administrada com um agente antiangiogénico, que é um composto que bloqueia ou interfere até certo ponto com o desenvolvimento de vasos sanguíneos. 0 fator antiangiogénico pode ser, por exemplo, uma molécula pequena ou uma proteína, por exemplo, um anticorpo, fusão Fc ou citocina que se liga a um fator de crescimento ou recetor de fator de crescimento envolvido na promoção de angiogénese. 0 fator antiangiogénico preferencial no presente documento é um anticorpo que se liga ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Numa forma de realização alternativa, a i munog1obu1ina modificada é administrada com um agente terapêutico que induz ou otimiza a resposta imunológica adaptativa, por exemplo, um anticorpo que direciona CTLA-4. Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina modificada é administrada com um inibidor de tirosina quinase, que é uma molécula que inibe até certo ponto a atividade de tirosina quinase de uma tirosina quinase. Numa forma de realização alternativa, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são administradas com uma citocina. 0 termo "citocina", para utilização no presente documento, significa um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de células que age numa outra célula como mediadores intercelulares incluindo quimiocinas. São contempladas composições farmacêuticas em que as imunoglobulinas modificadas da presente invenção e um ou mais agentes terapeuticamente ativos são formulados. As formulações das variantes de polipéptido da presente invenção são preparadas para o armazenamento por meio da mistura da referida imunoglobulina modificada ou domínio variável de imunoglobulina que tem o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, 16a edição, Osol, A. Ed.,), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As formulações a serem utilizadas para a administração in vivo são, de preferência, estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis ou outros métodos. As imunog1obu1inas modificadas e outros agentes terapeuticamente ativos divulgados no presente documento também podem ser formuladas como imunolipossomas e/ou capturadas em microcápsulas. A administração da composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina modificada ou domínio variável de i munog1obu1ina da presente invenção, de preferência, na forma de uma solução aquosa estéril, pode ser realizada numa variedade de maneiras, incluindo, porém sem limitação, de maneira oral, subcutânea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, tópica (por exemplo, géis, unguentos, loções, cremes, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parentérica, retal ou intraocular.

Um outro aspeto da presente invenção refere-se a um método para fabricar uma molécula compreendida de uma imunoglobulina ou domínio variável de imunog1obulina ou uma preparação farmacêutica da mesma que compreende pelo menos uma modificação em cada uma das duas alças estruturais ou regiões de alça da referida imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina e determinar a ligação da referida molécula a um epítopo de um antigénio, em que a molécula não modificada não se liga significativamente ao referido epítopo, que compreende as etapas de: fornecer um ácido nucleico que codifica um domínio variável de imunoglobulina que compreende pelo menos duas alças estruturais ou regiões de alça, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido em cada uma das referidas alças estruturais ou regiões de alça, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, colocar a imunoglobulina modificada expressa em contacto com um epítopo, determinar se a referida imunoglobulina modificada liga-se ao referido epítopo, e fornecer a imunoglobulina modificada que se liga ao referido epítopo e opcionalmente terminar a mesma numa preparação farmacêutica.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para fabricar uma molécula multiespecífica que se liga especificamente a pelo menos uma primeira molécula ou uma preparação farmacêutica da mesma que compreende pelo menos uma modificação em cada uma de pelo menos duas alças estruturais ou regiões de alça de uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina e determinar a ligação específica das referidas pelo menos duas alças ou regiões de alça a pelo menos uma segunda molécula selecionada a partir de antigénios. A imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina que contém alças estruturais ou regiões de alça não modificadas não se liga especif icamente a referida pelo menos uma segunda molécula. 0 método compreende especificamente as etapas de: fornecer um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente a pelo menos uma primeira molécula que compreende pelo menos uma alça estrutural ou regiões de alça, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de pelo menos uma das referidas alças ou regiões de alça codificadas pelo referido ácido nucleico, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, colocar a imunoglobulina modificada expressa em contacto com a referida pelo menos uma segunda molécula, e determinar se a referida imunoglobulina modificada liga-se especificamente à segunda molécula e fornecer a imunoglobulina modificada que se liga especificamente a referida pelo menos uma segunda molécula e opcionalmente terminar a mesma numa preparação farmacêutica. A manipulação de mais de um sítio de ligação ou pelo menos duas especificidades num membro de um par de ligação específico é preferencial (Kufer et al. (2004) Trends in

Biotechnology vol. 22 páginas 238 a 244).

Inúmeras tentativas têm sido feitas para produzir anticorpos multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, monoclonais ou fragmentos de anticorpo. Um problema na produção de anticorpos biespecíficos compostos de duas cadeias de polipéptido diferentes (cadeia pesada e leve) é a necessidade de expressar quatro cadeias diferentes (duas cadeias pesadas e duas leves) numa célula, resultando em várias combinações de moléculas que têm que ser separadas da molécula biespecífica desejada na mistura. Devido a sua similaridade, a separação destas moléculas é difícil e dispendiosa. Várias técnicas foram empregadas para minimizar a ocorrência de tais emparelhamentos indesejados (Carter (2001) Journal of Immunological Methods, vol. 248, páginas 7 a 15)

Uma solução para o problema é a produção de uma cadeia de polipéptido com duas especificidades, como, por exemplo, dois scFvs ligados um ao outro ou a produção dos chamados diacorpos. Tais moléculas têm sido mostradas como sendo afastadas da dobra de uma molécula natural e são notoriamente difíceis de produzir (LeGall et al. (2004)

Protein Engineering, Design & Selection vol. 17 páginas 357 a 366) .

De acordo com uma forma de realização preferencial da presente invenção, o sistema de expressão compreende um vetor. Qualquer vetor de expressão conhecido na técnica pode ser utilizado para este propósito, conforme for adequado. A imunoglobulina modificada é, de preferência, expressa num hospedeiro, de preferência, numa bactéria, em levedura, numa célula vegetal, numa célula de inseto, numa célula animal ou célula de mamífero ou num órgão de uma planta ou animal, ou num animal ou planta completa.

Uma ampla variedade de células hospedeiras adequadas pode ser utilizada para expressar o polipéptido modificado da invenção, incluindo, porém sem limitação, células de mamífero (células de animal), células vegetais, bactérias (por exemplo, Bacillus subtilis, Escherichia coli), células de inseto e levedura (por exemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Por exemplo, uma variedade de linhagens de células que pode encontrar utilização na presente invenção é descrita no catálogo de linhagem de células ATCC, disponível junto à Coleção de Culturas do

Tipo Americana. Adicionalmente, as plantas e animais também podem ser utilizados como hospedeiros para a expressão da imunoglobulina de acordo com a presente invenção. A expressão, bem como os vetores de transfeção ou cassetes podem ser selecionados de acordo com o hospedeiro utilizado.

Certamente, os sistemas de expressão de proteína isento de célula ou não celular também podem ser utilizados. As plataformas de expressão de proteína de transcrição/tradução in vitro, que produzem quantidades suficientes de proteína oferecem muitas vantagens de uma expressão de proteína isenta de célula, eliminando a necessidade por etapas a jusante e a montante trabalhosas (por exemplo, transformação de célula hospedeira, cultura ou lise) tipicamente associadas a sistemas de expressão à base de célula.

Um outro problema do presente projeto de anticorpos biespecíficos é o facto de que mesmo se os anticorpos parentais se ligarem de maneira bivalente a seu respetivo parceiro de ligação (por exemplo, IgG), o anticorpo biespecífico resultante é monovalente para cada respetivo parceiro de ligação.

As moléculas multiespecíficas preferenciais da presente invenção solucionam estes problemas: A expressão de uma molécula biespecífica como uma cadeia de polipolipéptido é possível (um domínio variável de imunoglobulina modificada com duas especificidades de ligação, veja-se a secção de exemplo), que é mais fácil para realizar que a expressão de duas cadeias de polipéptido de anticorpo (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3.273 a 3.277 (1984) .

Também pode ser produzido como uma molécula semelhante a anticorpo (isto é, composta de 2 cadeias de polipéptido). Devido ao facto de que a segunda especificidade está situada na parte não CDR dos domínios variáveis, não há necessidade para as duas cadeias pesadas diferentes ou cadeias leves diferentes. Dessa forma, não há possibilidade de emparelhamento errado das duas cadeias.

Um anticorpo da presente invenção pode consistir numa cadeia pesada e uma cadeia leve, que formam em conjunto uma região de alça de CDR variável que se liga a um parceiro de ligação específico, isto é, uma conformação de alça de CDR específica, e a segunda especificidade pode ser formada por alças estruturais ou regiões de alça modificadas contidas na molécula de imunoglobulina, por exemplo, as alças estruturais do domínio variável de cadeia pesada ou cadeia leve, enquanto que mantém a conformação de alça de CDR específica. 0 sítio de ligação também pode ser formado por pelo menos uma ou mais de uma alça não CDR em dois domínios variáveis (por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve que pode ser estruturalmente vizinho). 0 anticorpo modificado pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, Fab, scFv, Fv, minicorpo, dAb) que compreende pelo menos um domínio variável de imunoglobulina e modificações nas alças estruturais ou regiões de alça, ou derivados dos mesmos.

Podem ligar-se de maneira mono ou multivalente a parceiros de ligação ou mesmo com valência diferente para os diferentes parceiros de ligação, dependendo do projeto. Por exemplo, um fragmento Fab ou, de modo equivalente um scFv pode ser manipulado de tal maneira que as alças estruturais dos domínios VH e VL sejam separadamente manipuladas para ligar-se ao mesmo epítopo que o sítio de ligação formado pelas CDRs, resultando num fragmento Fab trivalente ou scFv respetivamente. Numa outra forma de realização, uma imunoglobulina completa que contém os mesmos domínios VH e VL manipulados irã ligar-se de maneira hexavalente a seu epítopo alvo. Se, por exemplo, o sítio de ligação natural formado pelas CDRs reconhecer um epítopo alvo diferente dos domínios Vh e VI manipulados, então, o fragmento Fab ou scFv resultante irá ligar-se de maneira monovalente ao primeiro alvo, e bivalente ao segundo alvo que é ligado independentemente pelas alças estruturais modificadas do domínio VH e VL respetivamente. Este princípio de projeto modular pode ser aplicado em inúmeras formas diferentes, como será óbvio para aqueles peritos na especialidade. À medida que existem várias alças estruturais disponíveis para a seleção e projeto de um sítio de ligação específico nas regiões não CDR de domínios pesados e leves, é possível projetar derivados de anticorpo com até mais de duas especificidades. Por exemplo, os domínios VH e VL que reconhecem um primeiro alvo por suas CDRs podem ser manipulados separadamente para ligar-se especificamente a diferentes (segundo e terceiro) alvos através de interações mediadas pelas alças estruturais modificadas. Desta forma, um scFv ou fragmento Fab triespecí f ico, que se liga de maneira monovalente a seu alvo, pode ser gerado. Se os domínios variáveis modificados deste Fab forem manipulados sob a forma de uma IgG de tamanho completo, é gerada uma IgG manipulada que é triespecífica e, para cada uma de suas três especificidades, liga-se de maneira bivalente.

Os domínios de ligação específicos dentro de uma cadeia de polipéptido podem ser ligados com ou sem um ligante de péptido.

Algumas classes de anticorpo podem ser consideradas como multiespecíficas, em particular biespecíficas, por natureza: Ligam-se a um antigénio (que é tipicamente, por exemplo, uma estrutura estranha ou um a estrutura associada a cancro) com a região variável e ligam-se a moléculas efetoras Fc com a parte Fc (por exemplo, recetores Fc em diversas células imunes ou proteínas complementares) , possibilitando, assim, efeitos como ADCC, ADCP ou CDC.

As moléculas efetoras de Fc são ligadas pela parte de Fc de uma molécula de imunoglobulina (para IgGl, a mesma consiste nos domínios CH2 e CH3), e vários métodos foram descritos para otimizar a função efetora pela melhora da ligação da parte de Fc de uma molécula de anticorpo ou por técnicas de glicoengenharia (US 6,602,684) ou por engenharia de proteína ou diretamente no Fc (US 2005/0054832) ou indiretamente por engenharia fora do Fc (US 2005/02444403). Tanto a ligação da região Fc ao recetor de Fc quanto a ligação a proteínas de complemento tal como Cql foram alteradas por tais técnicas. Usualmente, tenta-se melhorar a afinidade de ligação a tais moléculas efetoras de Fc na medida que isso se correlacionada a funções efetoras melhoradas.

Com a presente invenção, é possível projetar um anticorpo que se liga às moléculas efetoras de Fc fora da região de ligação Fc natural. As alças modificadas em domínios variáveis de anticorpo diferentes das alças envolvidas na ligação de molécula efetora de Fc "natural" podem ser selecionadas a partir de uma biblioteca de estruturas de alça modificadas ou projetados para se ligar a uma ou mais moléculas efetoras de Fc. Um anticorpo com tais sítios de ligação de molécula efetora de Fc adicionais teria ou avidez mais forte a uma determinada molécula efetora de Fc ou célula efetora que exibe uma molécula efetora de Fc e, portanto, pode ter um efeito ainda mais forte do que anticorpos glicomanipulados ou regiões Fc melhoradas de outro modo.

Os fragmentos de anticorpo têm determinadas vantagens em comparação aos anticorpos inteiros. Os fragmentos têm usualmente boas propriedades de biodistribuição e podem ser mais facilmente produzidos. No entanto, a maioria dos projetos de fragmento de anticorpo não têm funções efetoras e têm meia-vida in vivo curta (Holliger P, et al. Nat

Biotechnol (2005) 23:1.126 a 1.136.). Nem CHI nem os domínios Ck ou CÀ têm a capacidade de mediar funções efetoras, o que é a razão pela qual as moléculas Fab usualmente não mostram ADCC, ADCP ou CDC. 0 documento WO 02/44215 descreve moléculas de ligação que consistem no sítio de ligação ao antigénio de um anticorpo e um péptido que se liga a moléculas efetoras de Fc. De tal modo, um fragmento de anticorpo que exibe funções efetoras pode ser construído. 0 péptido está sendo incorporado na molécula de ligação numa posição que não destrói nem a ligação ao antigénio nem a capacidade do péptido de se ligar a uma molécula efetora de Fc.

De acordo com a presente invenção, no entanto, a ligação a moléculas efetoras de Fc pode ser realizada com imunoglobulinas ou domínios variáveis de i munog1obu1ina modificados que foram selecionados para ligação de molécula efetora de Fc a partir de bibliotecas de duas, três ou quatro sequências de alça estruturais aleatorizadas dentro de um arcabouço fixo de uma i munog 1 obu li na ou domínio variável de imunog1obu1ina. Portanto, é possível selecionar sequências de alça específicas que não se ligariam a moléculas efetoras de Fc se forem isoladas do arcabouço de domínio de Ig. Os polipéptidos resultantes da presente invenção podem, portanto, consistir, de preferência, mais do que 100 aminoácidos e podem compreender um ou mais domínios variáveis de imunog1obulina. A fim de selecionar a função efetora potencial de tais domínios variáveis de acordo com a presente invenção, bibliotecas de anticorpos ou fragmentos de anticorpo que compreendem domínios variáveis mutantes podem ser selecionadas para ligação a recetores de Fc e/ou fatores complementares tal como Clq. Recetores Fc gama para seleção podem ser fornecidos ou na superfície de células que expressam naturalmente os respetivos recetores ou pela expressão e purificação da parte extracelular do respetivo recetor. Células U937 estimuladas com IFN-g (CRL-1503, Coleção de Culturas do Tipo Americana) podem ser utilizadas como células-alvo para o isolamento de domínios variáveis de imunoglobulina modificados exibidos em fago que se ligam especificamente ao recetor de IgG de alta afinidade, Fc gama RI (Berntzen et al., 2006, Protein Eng Des Sei. 19(3) :121 a 128) . A ligação ao recetor Fc pode ser testada por FACS utilizando células U937 como alvo, tais células são manchadas especificamente com domínios variáveis de imunoglobulina modificados selecionados. Ademais, os domínios extracelulares de recetores Fc gama humanos podem ser clonados e expressos como proteínas solúveis ou proteínas de fusão e utilizados para análise da ligação específica de parceiros de ligação potenciais (por exemplo, como em Berntzen et al., 2005, J Immunol Methods. 298 (1-2):93 a 104). A identificação e a caracterização de domínios variáveis de imunoglobulina modificados que se ligam especificamente ao fator complementar Clq podem ser realizadas de modo essencialmente similar (por exemplo, como em Lauvrak et al. 1997 Biol Chem. 378 (12) : 1.509 a 1.519) . A fim de aumentar a meia-vida in vivo de uma molécula que consiste em ou que contém tal domínio variável que se liga a FcRn, ou a albumina sérica pode ser selecionada com bibliotecas de domínios variáveis mutantes de acordo com a presente invenção. Aquelas alças estruturais modificadas responsáveis pela extensão da meia-vida de uma molécula através de sua ligação específica a proteínas séricas ou proteínas complementares podem ser utilizadas como alças estruturais isoladas ou no contexto de uma imunoglobulina ou partes da mesma, para combinação com aquelas moléculas que devem ser projetadas como moléculas com meia-vida aumentada in vivo.

Recetores FcRn ou outros recetores de células para seleção podem ser fornecidos ou na superfície de células que expressam naturalmente os respetivos recetores ou pela expressão e purificação da parte extracelular do respetivo recetor. Para o propósito desta invenção, uma primeira triagem em FcRn pode selecionar domínios variáveis mutantes (ou moléculas que compreendem tais domínios variáveis mutantes) que podem ser adicionalmente testados in vitro e mais adicionalmente caracterizados em experiências FACS pela ligação a células que expressam recetor FcRn. A triagem e a seleção podem também considerar dependências de pH na ligação a FcRn (conforme descrito nos documentos PCT W002/060919; PCT W097/34631). A mesma pode ser adicionalmente caracterizada pela classificação de afinidade da ligação a vários FcRn recombinantes, isoformas e alótipos, por exemplo, com técnicas de ressonância de plasmão de superfície (por exemplo, como em Dali' Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169: 5.171 a 5.180). A imunoglobulina modificada de acordo com a invenção pode compreender uma cadeia pesada e/ou leve, ou partes da mesma, e pelo menos um domínio variável. A imunoglobulina de acordo com a presente invenção compreende, de preferência, pelo menos um domínio constante e/ou pelo menos uma variável da imunoglobul ina, ou uma parte da mesma.

Um domínio variável usualmente é considerado uma unidade de dobra de imunoglobulina da parte variável de uma imunoglobulina, também denominada um domínio da região variável (por exemplo, VH, Vk, VI, Vd)

Outra imunoglobulina preferencial de acordo com a invenção consiste num domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, ou uma parte da mesma, com pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais e é caracterizada pelo facto de que as referidas pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais compreendem pelo menos duas modificações de aminoácido que formam pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais modificadas, em que as referidas pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais modificadas ligam-se especificamente a pelo menos um epítopo de um antigénio. Em tal imunoglobulina preferencial de acordo com a invenção, as pelo menos duas modificações de aminoácido podem estar situadas em uma ou duas regiões de alça ou alças estruturais ou em uma ou duas alças estruturais de modo a constituírem um sítio de ligação para um antigénio.

De acordo com uma forma de realização preferencial da presente invenção, a ligação específica do polipéptido modificado a uma molécula é determinada por um ensaio de ligação selecionado a partir do grupo que consiste em ensaios imunológicos, de preferência, ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA), ensaios de ressonância de plasmão de superfície, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de diferença de transferência de saturação, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de NOE de transferência (trNOE), ensaios competitivos, ensaios de ligação a tecido, ensaios de ligação à célula viva e ensaios de extrato celular.

Os ensaios de ligação podem ser executados utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, porém, sem limitação, ensaios com base em FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) e BRET (Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência), Ensaio Homogéneo de Proximidade Luminescente Amplificado, Ensaio de Proximidade de Cintilação, ELISA (Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima), SPR (Ressonância de Plasmão de Superfície), calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria de varrimento diferencial, eletroforese em gel e cromatografia incluindo filtração em gel. 0 polipéptido modificado da invenção é, de preferência, conjugado com uma identificação selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas orgânicas, identificações de enzima, identificações radioativas, identificações coloridas, identificações fluorescentes, identificações cromogénicas, identificações luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos de metal, metais, ouro coloidal e misturas dos mesmos.

Polipéptidos modificados conjugados com identificações conforme especificado acima podem ser utilizados, por exemplo, em métodos diagnósticos. A imunoglobulina modificada pode ser conjugada com outras moléculas que permitem a deteção simples do referido conjugado em, por exemplo, ensaios de ligação (por exemplo, ELISA) e estudos de ligação.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a um polipéptido que compreende um domínio variável de uma cadeia leve ou pesada ou combinações dos mesmos, com pelo menos duas alças ou regiões de alça, caracterizado por as referidas pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais compreenderem, cada uma, pelo menos uma modificação de aminoácido que forma pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais modificadas, em que as referidas pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais modificadas ligam-se especificamente a pelo menos um epítopo de um antigénio. É preferencial combinar de maneira molecular pelo menos um domínio variável de anticorpo modificado (= que se liga ao parceiro específico através das sequências não variáveis ou alças estruturais) com pelo menos uma outra molécula de ligação que pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo, um recetor solúvel, um ligando ou outro domínio de anticorpo modificado. A outra molécula de ligação combinada com o pelo menos um domínio variável de anticorpo modificado da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em moléculas proteicas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.

As regiões de alça ou alças estruturais da imunoglobulina modificada de acordo com a invenção podem se ligar especificamente a qualquer tipo de moléculas de ligação, particularmente a moléculas proteicas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, moléculas orgânicas pequenas e grandes, moléculas inorgânicas. Certamente, a imunoglobulina modificada de acordo com a invenção pode compreender pelo menos duas alças ou regiões de alça, de modo que cada uma das alças ou regiões de alça possa ligar-se especificamente a moléculas ou epítopos diferentes.

Outro aspeto da presente invenção refere-se à utilização de uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtenível por um método de acordo com a presente invenção para a preparação de uma vacina para imunização ativa. Por meio disso, a imunoglobulina é ou utilizada como uma substância farmacêutica antigénica para formular uma vacina ou utilizada para pescar ou capturar estruturas antigénicas para utilização numa formulação de vacina.

Outro aspeto da presente invenção refere-se à utilização de uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtenível por um método de acordo com a presente invenção para a preparação de uma biblioteca de polipéptidos que compreendem domínios variáveis de imunoglobulina modificados.

Ainda outro aspeto da presente invenção refere-se a um método para se ligar especificamente a e/ou detetar uma molécula-alvo que compreende as etapas de: (a) colocar uma molécula que compreende uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina modificado de acordo com a presente invenção ou uma molécula que compreende um domínio variável de imunoglobulina modificado obtenível por um método de acordo com a presente invenção em contacto com uma amostra de teste contendo ou suspeita de conter a referida molécula-alvo e, opcionalmente, (b) detetar a formação potencial de um complexo de imunoglobulina/molécula específico ou domínio variável de imunoglobulina/ molécula.

Um método preferencial de acordo com a invenção é para ligar especificamente e/ou detetar uma molécula que compreende as etapas de: (a) colocar uma biblioteca de imunoglobulinas modificadas ou uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção em contacto com uma amostra de teste contendo a referida molécula e, opcionalmente, (b) detetar a formação potencial de um complexo de imunoglobulina/molécula específico.

As amostras de teste podem ser uma amostra de ser humano ou animal, tais como amostras de sangue ou outros fluidos corporais e suspensões de células, tal amostra possivelmente contém uma molécula-alvo para ser especificamente ligada por imunoglobulinas para propósitos de captura e/ou deteção.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a um método para isolar especificamente uma molécula-alvo que compreende as etapas de: (a) colocar uma molécula que compreende uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina modificado de acordo com a presente invenção ou uma molécula que compreende um domínio variável de imunoglobulina modificado obtenível por um método de acordo com a presente invenção em contacto com uma amostra contendo a referida molécula-alvo, (b) separar o complexo de domínio variável de imunoglobulina/molécula-alvo específico formado e (c) isolar opcionalmente a molécula-alvo do referido complexo.

Um método preferencial de acordo com a invenção é para isolar especificamente uma imunoglobulina modificada que se liga a uma molécula que compreende as etapas de: (a) colocar uma biblioteca de imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção em contacto com uma amostra contendo a referida molécula, (b) separar o complexo de imunoglobulina modificada/molécula específico formado, e (c) isolar opcionalmente a imunoglobulina modificada do referido complexo.

Essas amostras são usualmente consideradas fontes para o isolamento preparatório dessas moléculas, por exemplo, fontes naturais complexas, como fontes animais, humanas ou vegetais ou fontes derivadas de micróbios ou culturas e suspensões de células.

As imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para isolar especificamente as moléculas-alvo de uma amostra. Se imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina multiespecíficos forem utilizados, mais do que uma molécula-alvo pode ser isolada de uma amostra. É especialmente vantajoso utilizar i munog1obu1ina s ou domínios variáveis de imunoglobulina modificados em tais métodos devido ao facto de que isso permite, por exemplo, gerar uma matriz que tem uma superfície homogénea com quantidades definidas de parceiros de ligação (isto é, domínios variáveis de imunoglobulina modificados) imobilizados na mesma que têm a capacidade de se ligar às moléculas-alvo a serem isoladas. Em contraste a isso, se parceiros de ligação monoespecíficos forem utilizados, nenhuma matriz homogénea pode ser gerada devido ao facto de que os parceiros de ligação única não se ligam com a mesma eficácia à matriz.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a um método para direcionar um composto a um alvo que compreende as etapas de: (a) contactar uma molécula que compreende um domínio variável de imunoglobulina modificado de acordo com a presente invenção ou uma molécula que compreende um domínio variável de imunoglobulina modificado obtenível por um método de acordo com a presente invenção com a capacidade de se ligar especificamente ao referido composto, (b) entregar a molécula que compreende um complexo de domínio variável de imunoglobulina/composto ao alvo.

As imunog1obu1inas modificadas ou domínios variáveis de imunoglobulina de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para entregar pelo menos um composto ligado às CDRs por uma conformação de alça de CDR específica a um alvo pela ligação à região de alça estrutural modificada. Tais imunoglobulinas podem ser utilizadas para direcionar substâncias terapêuticas a um sítio preferencial de ação no curso do tratamento de uma doença.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a uma biblioteca de moléculas que compreende, que expressa ou que codifica uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtenível pelo método de acordo com a presente invenção. A biblioteca preferencial de imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina de acordo com a invenção compreende pelo menos 10 imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina, de preferência, 100, mais preferencialmente, 1000, mais preferencialmente, 10.000, mais preferencialmente 100.000, com máxima preferência, 1.000.000 imunoglobulinas variantes ou domínios variáveis, com uma modificação em pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais.

Usualmente, as bibliotecas de acordo com a invenção compreendem pelo menos 10 proteínas de fusão ou agentes de ligação, de preferência, pelo menos 100, mais preferencialmente, pelo menos 1.000, mais preferencialmente, pelo menos 104, mais preferencialmente, pelo menos 10b, mais preferencialmente, pelo menos 105, mais preferencialmente, pelo menos 107, mais preferencialmente, pelo menos 108, mais preferencialmente, pelo menos 109, mais preferencialmente, pelo menos 1010, mais preferencialmente, pelo menos 1011, até 1012, em casos de exibição ribossómica, números ainda mais altos são exequíveis.

Constatou-se que os membros mais preferenciais de uma biblioteca têm mutações de pelo menos 4 ou até mesmo pelo menos 5 ou 6 posições de aminoácido em pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais. Assim, as bibliotecas particularmente preferenciais de acordo com a invenção consistem em membros que têm mutações de pelo menos 2, 3 ou 4 posições de aminoãcidos em pelo menos duas alças estruturais.

Uma biblioteca de acordo com a invenção pode também compreender ou consistir num de entre ou uma mistura de domínios variáveis de imunog1obu1ina selecionados a partir do grupo de VH, Vcapa, Vlambda e VHH, como adequados para o propósito de definir parceiros de ligação por razões comerciais.

Os métodos preferenciais para construir a referida biblioteca podem ser encontrados acima e nos exemplos. A biblioteca de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para identificar imunog1obulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina que se ligam a uma molécula distinta.

Particularmente, a presente invenção refere-se à utilização de uma biblioteca de proteína de polipéptidos que compreendem uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtenível pelo método de acordo com a presente invenção para o projeto de derivados de imunoglobulina. Uma imunoglobulina existente pode ser alterada para introduzir sítios de ligação ao antigénio numa imunoglobulina ou num domínio variável utilizando-se uma biblioteca de proteína da respetiva imunoglobulina ou domínio variável de pelo menos 10, de preferência, 100, mais preferencialmente, 1.000, mais preferencialmente, 10.000, mais preferencialmente, 100.000, com máxima preferência, mais do que 1.000.000 imunoglobulinas ou domínios variáveis variantes, cada um com pelo menos duas alças estruturais modificadas. A biblioteca é, então, triada para ligação ao antigénio específico. Após a caracterização molecular para as propriedades desejadas, a imunoglobulina ou domínio variável selecionado é clonado na imunoglobulina original por técnicas de engenharia genética de modo que o mesmo substitua a região do tipo selvagem. Alternativamente, apenas a codificação de ADN para as alças modificadas ou a codificação para aminoácidos mutados pode ser permutada para obter uma imunoglobulina com o sítio de ligação adicional para o antigénio específico. Alternativamente, a modificação nas alças estruturais dos domínios variáveis pode ser realizada com o domínio variável em seu contexto natural, por exemplo, na forma de um Fab, scFv ou molécula de imunoglobulina completa. Exceto quando imunoglobulinas de domínio único, uma cadeia de domínios de imunoglobulina únicos ou imunoglobulinas de cadeia única, tal como scFv ou unicorpos (fragmentos de imunoglobulina monovalentes), são produzidas, usualmente, a imunoglobulina de acordo com a invenção é fornecida como um dímero, de preferência, como um heterodímero. A escolha do sítio para a alça estrutural específica para antigénio mutado é dependente da estrutura da imunoglobulina original e no propósito do sítio de ligação adicional. Se, por exemplo, a imunoglobulina original ou progenitora for um Fab ou scFv, a modificação de pelo menos duas alças estruturais nos domínios variáveis da cadeia leve e/ou da cadeia pesada é possível, mas também, a modificação de pelo menos duas alças estruturais no CH1/CL é preferencial para produzir uma imunoglobulina de acordo com a invenção. Assim, a molécula de Fab de acordo com a invenção pode conter o novo sítio de ligação através de uma região de alça modificada no domínio CHI e/ou CL. Nesse contexto, é usualmente de importância primária manter a conformação de alça de CDR específica e as propriedades de ligação natural da imunoglobulina progenitora, scFv ou Fab.

Para gerar uma biblioteca, pode-se preparar bibliotecas de moléculas originais mutantes que têm mutações em duas ou mais alças estruturais de um ou mais domínios variáveis. A seleção com moléculas originais com mutação completas pode ter algumas vantagens na medida em que a seleção para ligação ao antigénio com uma alça estrutural modificada entregará as modificações estericamente vantajosas. Por exemplo, se a molécula completa for um scFv, pode ser vantajoso triar a biblioteca de scFv original mutada para a ligação a um antigénio, seguido pela triagem de aglutinantes específicos para ligação ao antigénio que é reconhecido pelas alças de CDR (especificidade original). Num procedimento de seleção alternativo, o antigénio original - o primeiro - pode ser ligado às alças de CDR durante a triagem para ligação a um antigénio com as alças estruturais modificadas. Essa triagem simultânea pode permitir o resgate de clones que seriam perdidos durante um processo de seleção sequencial se a ligação ao antigénio for influenciada pela ligação ao primeiro antigénio.

Uma forma de realização preferencial da invenção é uma biblioteca de i munog1obu1i na s variantes que contém ou consiste em domínios variáveis com pelo menos uma posição de aminoácido variante em cada uma das pelo menos duas alças estruturais. A biblioteca pode compreender domínios de imunoglobulina da cadeia pesada e leve ou misturas e combinações moleculares dos mesmos.

Outra forma de realização preferencial é uma biblioteca que contém ou que consiste em domínios VHH ou formas humanizadas de tais domínios camelídeos com pelo menos uma posição de aminoácido variante em cada uma das pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais.

Outra forma de realização preferencial da invenção é uma biblioteca que contém ou que consiste em anticorpos de cadeia única, tal como uma biblioteca de scFv com pelo menos uma posição de aminoácido variante em cada uma das pelo menos duas das regiões de alça ou alças estruturais de qualquer um dos domínios variáveis do anticorpo de cadeia única ou scFv.

Outra forma de realização preferencial da invenção é uma biblioteca de diacorpo que contém ou que consiste em pelo menos uma posição de aminoácido variante em cada uma das pelo menos duas das regiões de alça ou alças estruturais de qualquer um dos domínios variáveis do diacorpo.

Outra forma de realização preferencial da invenção é uma biblioteca de minicorpo que contém ou que consiste em pelo menos uma posição de aminoácido variante em cada uma das pelo menos duas das regiões de alça ou alças estruturais de qualquer um dos domínios variáveis do minicorpo.

Ainda outra forma de realização preferencial da invenção é uma biblioteca de Fab que contém ou que consiste em pelo menos uma posição de aminoácido variante em cada uma das pelo menos duas das regiões de alça ou alças estruturais de qualquer um dos domínios variáveis do Fab.

Ainda outra forma de realização preferencial da invenção é uma biblioteca de anticorpo ou IgG, de preferência, uma biblioteca de anticorpo humano que contém ou que consiste em pelo menos uma posição de aminoácido variante em cada uma das pelo menos duas das regiões de alça ou alças estruturais de qualquer um dos domínios variáveis dos domínios de anticorpo ou IgG. A exigência de tamanho (isto é, o número de variantes) de uma biblioteca de acordo com a invenção que compreende imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina ou moléculas de fusão com diferentes mutações de domínios de anticorpo variáveis com mutação é dependente da tarefa. Em geral, uma biblioteca para gerar um sítio de ligação ao antigénio de novo precisa ser maior do que uma biblioteca utilizada para modificar adicionalmente um sítio de ligação ao antigénio manipulado já existente formado por uma região de alça ou alça estrutural modificada (por exemplo, para acentuar a afinidade ou alterar a especificidade fina ao antigénio). A presente invenção também se refere a um polipéptido biblioteca ou uma biblioteca de ácidos nucleicos que compreende uma pluralidade de polipéptidos que compreendem imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina ou pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais contidas num minidomínio ou moléculas de ácido nucleico que codificam o mesmo. A biblioteca contém membros com diferentes modificações, em que a pluralidade é definida pelas modificações nas pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais. A biblioteca de ácido nucleico de preferência inclui pelo menos 10 diferentes membros (com pelo menos duas modificações de aminoácido potenciais) e inclui mais preferencialmente pelo menos 100, mais preferencialmente, 1.000 ou 10.000 diferentes membros (por exemplo, projetados por estratégias de aleatorização ou técnicas combinatórias). Números de membro individual ainda mais diversificados, tal como pelo menos 1.000.000 ou pelo menos 10.000.000, são também preferenciais, mais preferencialmente, pelo menos 108, mais preferencialmente, pelo menos 109, mais preferencialmente, pelo menos 1010, mais preferencialmente, pelo menos 1011, até 1012, em casos de exibição ribossõmica, números ainda mais altos são exequíveis.

Um aspeto adicional da invenção é a combinação de duas imunoglobulinas ou domínios variáveis de i munog1obu1i na diferentes selecionados a partir de pelo menos duas bibliotecas de acordo com a invenção a fim de gerar imunoglobulinas multiespecíficas. Esses domínios variáveis de imunog1obulina específicos selecionados podem ser combinados uns com os outros e com outras moléculas, similares a blocos de construção, para projetar a disposição ideal dos domínios para obter as propriedades desejadas tais como combinações de especificidades e/ou valências.

Ademais, uma ou mais imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunog1obulina modificados de acordo com a invenção podem ser introduzidos em vários ou todos os diferentes sítios de uma proteína sem a destruição da estrutura da proteína. Por tal técnica de "embaralhamento de domínio", novas bibliotecas são criadas que podem ser novamente selecionadas para as propriedades desejadas. A biblioteca preferencial contém imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunog1obulina de acordo com a invenção ou derivados dos mesmos.

Uma forma de realização preferencial da presente invenção é uma molécula de ligação para um antigénio (molécula de ligação ao antigénio) que compreende pelo menos uma imunog1obulina ou domínio variável de imunoglobulina e pelo menos duas regiões de alça ou alças estruturais sendo modificadas de acordo com a presente invenção para se ligarem ao antigénio, em que a referida molécula de ligação não tem nenhuma atividade de ligação relevante e/ou específica com seus alças de CDR. A mesma pode compreender outras partes utilizáveis para atividades de anticorpo (por exemplo, tais como regiões (sequências) efetoras naturais ou modificadas; no entanto, a mesma não tem a região de ligação "natural" dos anticorpos, isto é, as alças de CDR ativas em sua posição de ocorrência natural. Essas moléculas de ligação ao antigénio de acordo com a presente invenção têm as vantagens descritas acima para as presentes moléculas, mas sem a atividade de ligação específica dos anticorpos; no entanto, com uma atividade de ligação específica recentemente introduzida na alça ou região de alça estrutural.

Também para as moléculas de ligação ao antigénio de acordo com a presente invenção, é preferencial que os novos sítios de ligação ao antigénio nas alças estruturais sejam introduzidos por tecnologias de aleatorização, isto é, modificando-se um ou mais resíduos de aminoácido de pelo menos duas alças estruturais por técnicas de aleatorização ou introduzindo-se insertos gerados aleatoriamente em tais alças estruturais. É alternativamente preferencial a utilização de abordagens de combinação.

De acordo com outro aspeto, a presente invenção refere-se a uma imunoglobulina modificada que tem um sítio de ligação ao antigénio entranho à imunoglobulina não modificada e incorporado em uma, duas, três ou mais alças estruturais da imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina. Nesse contexto, o termo "estranho" significa que o sítio de ligação ao antigénio não é naturalmente formado pela alça ou região de alça estrutural específica do domínio de imunoglobulina variável.

De acordo com ainda outro aspeto, a presente invenção refere-se a uma imunoglobulina modificada que tem um sítio de ligação ao antigénio estranho à imunoglobulina não modificada e incorporado em uma, duas, três ou mais alças estruturais do domínio variável, em que a referida imunoglobulina modificada liga-se ao referido antigénio com uma afinidade de pelo menos 103 mol'1, pelo menos 104 mol"1, pelo menos 105 mol"1, pelo menos 106 mol"1, pelo menos 107 mol"1, pelo menos 108 mol"1 ou pelo menos 109 mol"1.

Usualmente, aglutinantes com afinidade média ou alta são fornecidos de acordo com a invenção. Aqueles com afinidade média exercem, de preferência, uma taxa de dissociação Kd na faixa de 10-5 a 10~7, aqueles com afinidade alta têm uma Kd comprovada na faixa de 10'8 a 10“ 10, sendo que aqueles que têm uma Kd menor do que 10“9 são mais preferenciais como um aglutinante de afinidade alta. Em alguns casos, será apropriado selecionar aglutinantes com Kd ainda menor, por exemplo, menor do que 10"11, usualmente tão baixa quanto 10'12.

As imunoglobulinas ou domínios variáveis de imunoglobulina preferenciais de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos dois sítios de ligação ao antigénio, o primeiro sítio que se liga a um primeiro epítopo e o segundo sítio que se liga a um segundo epítopo.

De acordo com uma forma de realização preferencial, a presente imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina compreende pelo menos três alças ou regiões de alça, a primeira alça ou região de alça que se liga a um primeiro epítopo e a segunda e a terceira alças ou regiões de alça que se ligam a um segundo epítopo. Pelo menos a primeira ou pelo menos a segunda e a terceira alças ou regiões de alça ou todos podem conter uma alça estrutural. A imunoglobulina ou os domínios variáveis de imunoglobulina de acordo com as presentes invenções incluem os fragmentos dos mesmos conhecidos na técnica por serem funcionais que contêm os elementos essenciais de acordo com a presente invenção: as regiões de alça ou alças estruturais modificadas de acordo com a presente invenção.

De preferência, a imunoglobulina de acordo com a presente invenção é composta de pelo menos dois domínios de imunoglobulina, ou uma parte dos mesmos incluindo um minidomínio, e cada domínio contém pelo menos um sítio de ligação ao antigénio. Um dos pares preferenciais de domínios de imunoglobulina é um par de CL/CH1 que pode ser manipulado na região de alça estrutural que é localizada na terminação C do par de CL/CH1. Assim, um ou dois novos sítios de ligação são manipulados. Mediante a seleção do par de domínios de ligação CL/CH1 específico, o mesmo pode ser recombinado com os domínios variáveis VL e VH para obter uma molécula Fab, de acordo com a invenção com um sítio de ligação "natural" na região CDR e um ou dois sítios de ligação adicionais opostos ao mesmo, isto é, na região de alça estrutural C-terminal dos domínios CHI/CL.

Assim, a imunog1obu1ina de acordo com a invenção pode ser obtida modificando-se uma molécula progenitora de imunoglobulina que contém o domínio variável. Alternativamente, um domínio de imunoglobulina constante pode ser manipulado para obter um sítio de ligação na região de alça estrutural, tal domínio pode, então, ser utilizado como um bloco de construção para produzir combinações com domínios de imunoglobulina variáveis e, opcionalmente, com outros domínios constantes, resultando numa imunoglobulina de acordo com a invenção que contém tanto um domínio variável quanto um novo sítio de ligação formado por alças estruturais ou regiões de alça estruturais.

De acordo com tal forma de realização preferencial da invenção, é fornecida uma imunoglobulina que compreende pelo menos um domínio da região variável de uma imunoglobulina e pelo menos um domínio da região constante de uma imunoglobulina; por exemplo, um domínio variável que é modificado em pelo menos duas alças estruturais ligadas a um domínio CHI.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a um kit de parceiros de ligação que contém (a) um polipéptido que compreende um domínio variável de imunoglobulina modificado que tem um sítio de ligação ao antigénio incorporado em duas ou mais alças estruturais e (b) uma molécula de ligação que contém um epítopo do referido antigénio.

De preferência, um kit de parceiros de ligação de acordo com a invenção contém (a) uma biblioteca de imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção e (b) uma molécula de ligação que contém um epítopo de um antigénio.

Tal molécula de ligação desse kit de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para selecionar e distinguir uma imunoglobulina nativa ou modificada de acordo com a presente invenção numa amostra ou a partir de uma biblioteca. A mesma pode ser adicionalmente utilizada para identificar a especificidade de ligação de polipéptidos que compreendem uma imunoglobulina ou domínio variável de imunoglobulina modificado de acordo com a presente invenção. Utilizando-se a molécula de ligação desse kit de acordo com a presente invenção, a potência do polipéptido modificado de acordo com a presente invenção pode ser determinada.

Potência, conforme definido aqui, é a propriedade de ligação da molécula modificada da invenção a seu antigénio. A ligação pode ser determinada quantitativa e/ou qualitativamente em termos de especificidade e/ou afinidade e/ou avidez por métodos de ensaio conforme conhecido na técnica para propósitos de controlo de qualidade.

Além disso, a molécula de ligação de um kit de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para selecionar o polipéptido que compreende um domínio variável de imunoglobulina ou imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção de uma biblioteca conforme especificado acima, de preferência, que consiste em pelo menos 10, de preferência, pelo menos 100, mais preferencialmente, pelo menos 1.000, mais preferencialmente, pelo menos 10.000, especialmente pelo menos 100.000 polipéptidos com diferentes modificações nas alças estruturais. A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos a seguir.

Exemplo 1: Projeto da biblioteca de VHH A estrutura de cristal do domínio de VHH de camelo D2-L24 em complexo com Lisozima da Clara do Ovo de Galinha, que está publicada no Banco de dados Brookhaven como a entrada lZVH.pdb, foi utilizada para auxiliar no projeto do domínio de VHH com mutação. A sequência da cadeia A do arquivo de estrutura lZVH.pdb é dada na SEQ ID No. 1. SEQ ID No.l PREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPFVLBSDGSFFI, A sequência, que foi utilizada como a base para a construção da biblioteca de VHH, é a sequência do domínio de VHH anti-TNF-alfa da patente WO04041862A21, clone 3E e é dada na SEQ ID No. 2. SEQ ID No.2 ccatggcccc cqgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagetcnnsn nsrniscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agfcgggagag -caatgggcagccggagaaca acrt&eaagac cacgcetccc gtgctgga cggctc ottcttcctc tacagcaagc ifaccgtgnn snnsrmgagg tggrmsnnsg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctGcgggt aaagcggccg ca

Após análise detalhada da estrutura de lZVH.pdb e por inspeção visual dos resíduos que formam as alças que ligam os filamentos beta, pode-se decidir randomizer os resíduos 13, 15, (isto é, na alça entre os filamentos beta A e B) 89, 90, 92 e 93 (isto é, na alça entre os filamentos beta E e F) da SEQ ID No. 2 para a geração da biblioteca.

Adicionalmente, decidiu-se inserir três posições randomizadas entre os resíduos 14 e 15, e decidiu-se inserir três posições randomizadas entre os resíduos 92 e 93 da SEQ ID No. 2.

Exemplo 2: Construção da biblioteca de VHH 0 gene manipulado que codifica a sequência de VHH é produzido na forma de um gene sintético por montagem de PCR. A sequência e sua tradução são mostradas na Figura 2. Os resíduos de aminoácidos a serem aleatorizados para a construção da biblioteca estão sublinhados. Os sítios de restrição para clonagem estão incluídos conforme segue e estão sublinhados na sequência de nucleõtidos, conforme mostrado na Figura 2: Ncol, BglII e NotI. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene sintético é dada na SEQ ID. No.3. SEQ ID No.3

MAPREPQVYTLPPSRDSLKXK.QVSLTCLVKGFYPSDIAVSWESNGQPENNYKTTPFVLDSBGSF FLYSKLTVXXXRWXXGNVFSCSVHHEALRNHYTQKSLSLSP6KAAA

Os primeiros dois resíduos e os últimos dois resíduos são causados pelos sítios de restrição utilizados para clonagem. A sequência de nucleõtidos que codifica a SEQ ID No. 3 é dada na SEQ ID No. 4. SEQ ID No.4: cttgccatgg ccccccgaga accacaggtg tac

Os primeiros dois codões e os últimos dois codões são causados pelos sítios de restrição utilizados para clonagem.

Os oligonucleótidos para montagem de PCR do gene sintético são projetados pela utilização da ferramenta de software publicamente disponível DNAWorks 3.1 (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) e são montados por PCR seguindo os protocolos padrão dos 18 oligos apresentados na Tabela 1 e como SEQ ID No. 5 a SEQ ID No. 22 (Hoover DM, Lubkowski J., DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis, Nucleic Acids Res. 15 de maio de 2002,-30 (10) :e43) . X. CCATGGClUySTCAGCTGCAGGAAAGCGGTGGeGGCCTG (SEQ ID Ho. 5·) 2. acacgcaggctgccgccaggctggaccasgccgccaccgc {SSQ id Ho. S) 3. CGGCAGCCTGCGTCTGAGC?GTGCGGCCAGCGGCCGTACC {SSQ ID No. ?} 4. AGGTGTAGCCGGT A!GGTCGCTA&AGGT&CGGGCGCTGGC (SEQ ID Ho. 8) 5. ACCATAGC GGCTACACCTAT AGCATTGGCTGGTTTCGTCA (SEQ ID No. 9) 6. TCACGTTCTTTTCCTGGCSCCTGACG&AACCAGCCAATGG (SEQ ID No. 10) 7. CGCCAGGAASAGAACGTSAATTTGTGGCGCGTATTOACTG {SEQ ID No. 11) 3. ATAGGTATTGCCGCT5CTCCAGTAAATACGCGCCACAAAT (SEQ ID No. 12} 9. GAGCAGCGGC&ATACCTAT7ATGCGGATAGCGTGAAAGGC (SEQ ID No. 13) 10. TGTCGCGGCTA&TCGCGAAACGQCCTTTCACGCTATCCGC (SEQ ID No. 14) 11. GCGATTAGCCGCG&CATTGCCAAGAACACGGTAGATCTTA (SSQ ID No. 15) 12,. 'GGCTCCAGGTTGTTCATCGTAAGATCTACCGTGTTCTTGGC {SEQ ID No. 16} 13. CGATGAACAACCTGGAGCCCGAAGACACAGCCGTSTATTA {SEQ ID NO. J.7) 14. GCOATCCCG&GCCGCGCAAT&A?ACACGGOTGTGICTTCG (SEQ ID No. 13) 15. GCGGCTCGGGATGGCATTCCGACCAGCCGTAGCGTGGAAA (SEQ ID No. 19) 16. CCCTGGCCCCAGTAATTGTAGCTTTCCACGCTACGGCTGG (SEQ ID No. 20} 17. CAATTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTCAGCTCT (SEQ ID No. 21) IS, GCGSCCGCAGASCTGACGGTCACCTG (SEQ ID No. 22}

Tabela 1: Oligonucleótidos utilizados para montagem do gene sintético que codifica o gene de VHH manipulado.

Em resumo, volumes iguais de soluções de oligonucleótido (cada uma a uma concentração de ~1 mg/ml) são misturados um ao outro e diluídos com água até uma concentração final de ~1 ng/μΐ para cada oligonucleótido. A mistura de oligonucleótidos é diluída 5 vezes com a solução de PCR. As concentrações finais dos componentes são 0,2 ng/μΐ para cada oligonucleótido, 20 mM para Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM para KC1, 10 mM para (NH4)2S04, 6 mM para MgS04, 0,1% (v/v) para Triton X-100, 0,1 mg/ml para albumina sérica bovina, 0,2 mM para cada dNTP e 2,5 U para Pfu polimerase. O protocolo de PCR para montagem de gene começa com uma etapa de desnaturação de 5 min de 95 °C, durante a qual a polimerase é adicionada para evitar qualquer erro de iniciação possível (PCR de "início quente"). Essa etapa é seguida por 25 ciclos de uma temperatura de desnaturação de 95 °C por 30 s, uma temperatura de têmpera de 55 °C por 30 s e uma temperatura de extensão de 72 °C por 1,5 min. A última etapa nesse protocolo é um ciclo de incubação a 72 °C por 10 min. Para amplificação de gene, 1 μΐ da mistura resultante da reação de montagem de gene é utilizado como o molde, com os oligonucleótidos mais externos (SEQ ID No. 5 e SEQ ID No. 22) utilizado como iniciadores. 0 protocolo de PCR para amplificação de gene é essencialmente o mesmo que aquele para montagem de gene. 0 gene de VHH sintético montado é subsequentemente clonado por meio dos sítios de restrição Ncol e Notl no vetor pET27b (Novagen, http: //www.merck-_biosciences . co .uk/product/69863 ; http://www.novagen.com) e a sequência é verificada por sequenciação de ADN. PCR é, então, utilizada para construir a biblioteca randomizada. O molde para as primeiras 2 reações de PCR é o gene de VHH sintético conforme descrito acima. Os pares de iniciadores utilizados para as primeiras duas reações de PCR são conforme segue: 3esynmul (gactccatgg caagtgcaac tgcaggaaag cggaggcggt ctggttnnsc cannsnnsnn snnsggcagc ctgcgtctga get (SEQ ID No. 23)) e 3esynmu2 (catgagatct acggtgttct tggcg (SEQ ID No. 24)); 3esynmu3 (catgagatct tacgatgnns nnsttgnnsn nsnnsnnsnn sgaagatacg gcggtgtatt attg (SEQ ID No. 25)) e 3esyn2 (aatagcggcc geagagetea cggtcacc (SEQ ID No. 26)) . Os produtos de PCR resultantes são digeridos com BglII, ligados, e o produto de ligação é utilizado como molde para uma reação de PCR com os iniciadores 3esynl (acgtccatgg caagtgcaac tgcag (SEQ ID No. 27)) e 3esyn2 (aatagcggcc geagagetea cggtcacc (SEQ ID No. 26)). Os codões NNS nos iniciadores 3esynmul (SEQ ID No. 23) e 3esynmu3 (SEQ ID No. 25) introduzem as posições randomizadas na sequência. É escolhido o codão NNS (código IUPAC, em que S significa C ou G) que codifica todos os 20 aminoácidos de ocorrência natural, mas evita 2 de 3 codões de parada. A Figura 3 mostra o esquema das reações de PCR e procedimento de ligação. As setas horizontais indicam as posições e as direções dos iniciadores de PCR, as linhas verticais indicam as posições dos sítios Ncol, BglII e Notl, respetivamente (da esquerda para a direita).

Esse produto de PCR randomizado é subsequentemente clonado no vetor de clonagem de fagomídeo pHENl (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi - subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 11 de agosto de 1991,-19(15):4.133 a 4.137) em sintonia com o sinal de secreção pelB por meio do sítio de restrição Ncol. 0 sítio de restrição Notl na extremidade 3' do gene insere a biblioteca de VHH em sintonia com o gene que codifica a proteína de revestimento menor (proteína III) de fago filamentoso fd contido no vetor pHENl. A sequência manipulada do inserto de biblioteca de VHH randomizado é dada como uma a sequência de nucleótidos na SEQ ID No. 28 e traduzida como uma sequência de aminoãcidos na SEQ ID No. 29. A Letra X na SEQ ID No. 2 9 denota os resíduos de aminoácido aleatorizados. SEQ ID No. 28: í ccatggçaag tgca&çfcgca ggaaagogga fgcggtctgg ftsmsccana srmannsrms 61 ggc&gcctgc gtctgagctg cgcggcgfcce ggccgtacct fctagcgacca tfcegggcfcat 121 acctatacca ttggctggtt ccgtcaggcg ccagggaaag aacgtgaatt tgtggcgcgt 181 atfcfcactgga gcagcggcaa tacotactat gcggafcagcg tga&aggccg tttfcgcgatt 241 agcogcgaca tcgccaagaa caccgtagat cttacgatgn rjsnnsfctgnn snnsnnsn'u; 301 nnsgaagata cggcggtgta ttattgcgca gcgcgtgacg gcattccgac ctcccgtagc 361 gtggaaagct acaattactg gggccagggc acccaggtgs acgtgagctc tgcggccgc SEQ ID No. 29: PWQVQl>QSSiSG6LYXPXXXXGSkRLSCÃÃSGR?FãDHSGYTreiGfêFBQà£GKERErMMVWSS§HT^alÍJSVK6S.

F&ISRDÃAKN^X.TSXKI-XX>ÍXXSDTAVYYCA?iRDGXPTSRSVESyrr^SQGT'QVTySSAA 0 produto de ligação é, então, transformado em TG1 de Escherichia coli, o número de colónias obtidas é determinado, e diversos clones selecionados são controlados por análise de restrição e por sequenciação de ADN. Para as etapas a seguir da preparação de fago de biblioteca de exibição de superfície, os protocolos padrão são seguidos. Em resumo, a mistura de ligação é transformada em células TGI de E. coli por eletroporação. Subsequentemente, partículas de fago são resgatadas de células TGI de E. coli com fago auxiliar M13-K07. As partículas de fago são, então, precipitadas do sobrenadante de cultura com PEG/NaCl em 2 etapas, dissolvidas em água e utilizadas para seleção por panning ou, alternativamente, armazenadas a menos 80 °C.

Exemplo 3: Panning da biblioteca de VHH - fago em Albumina Sérica Humana (HSA) 3 rodadas de panning são realizadas de acordo com protocolos padrão, (por exemplo, Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996,

Academic Press, San Diego, Calif.). Em resumo, o método a seguir é aplicado. Placas de 96 poços Maxisorp (Nunc) são revestidas com HSA. 200 ml da solução a seguir são adicionados por poço: 0,1 M de tampão carbonato de Na, pH 9,6, com as seguintes concentrações de HSA: Ia rodada de panning: 2 mg/ml de HSA; 2a rodada de panning: 1 mg/ml de HSA; 3a rodada de panning: 1 mg/ml de HSA A incubação ocorre por 1 hora a 37 °C, seguida por bloqueio com leite seco a 2% (M-PBS) com 200 yl por poço por 1 hora à temperatura ambiente. A biblioteca de fago de exibição em superfície é, então, deixada reagir com o HSA ligado adicionando-se 100 μΐ de suspensão de fago e 100 μΐ de leite seco a 4% (M-PBS) , seguido por incubação por 45 minutos com agitação e por 90 minutos sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fago não ligadas são lavadas conforme segue. Após a Ia rodada de panning: 10 x 300 μΐ de T-PBS, 5 x 300 μΐ de PBS; após a 2a rodada de panning: 15 x 300 μΐ de T-PBS, 10 x 300 μΐ de PBS; após a 3a rodada de panning: 20 x 300 μΐ de T-PBS, 20 x 300 μΐ de PBS. A eluição das partículas de fago ligadas é realizada adicionando-se 200 μΐ por poço de glicina a 0,1 M, pH 2,2, e incubação com agitação por 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago é neutralizada por adição de 60 μΐ de Tris-Base a 2 M, seguida por infeção em células TGI de E. coli misturando-se 10 ml de cultura exponencialmente em crescimento com 0,5 ml de fago eluído e incubação por 30 minutos a 37 °C.

Finalmente, as bactérias infetadas são colocadas em placas em meio TYE com 1% de glicose e 100 pg/ml de ampicilina e incubadas a 30 °C de um dia para o outro.

Exemplo 4: Clonagem de clones selecionados de mutantes de VHH selecionados contra HSA para expressão solúvel ADN fagomídeo do fago selecionado através das 3 rodadas de panning ê isolado com um midi-prep. 0 ADN que codifica domínios de VHH com mutação é amplificado em lote por PCR e Ncol-Notl clonado no vetor pNOTBAD/Myc-His, que é o vetor de expressão de E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) com um sítio de restrição Notl inserido para facilitar a clonagem. Os construtos ligados são transformados em células LMG194 de E. coli (Invitrogen) com eletroporação e cultivados a 30 °C em meio TYE com 1% de glicose e ampicilina de um dia para o outro. Os clones selecionados são inoculados em 200 μΐ de meio 2xYT com ampicilina, cultivados de um dia para o outro a 30 °C e induzidos adicionando-se L-arabinose a uma concentração final de 0,1%. Após expressão a 16 °C de um dia para o outro, as células são colhidas por centrifugação e tratadas com 100 μΐ de tampão borato de Na, pH 8,0, a 4 °C de um dia para o outro para preparação de extratos periplásmicos. 50 μΐ dos extratos periplásmicos são utilizados em ELISA (veja-se abaixo).

Exemplo 5: ELISA de mutantes de VHH selecionados contra HSA Os extratos periplásmicos dos mutantes de VHH selecionados para ligação a albumina sérica humana são testados num ELISA com o seguinte protocolo:

Revestimento: Placa de microtitulação (NUNC,

Maxisorp) , 100 μΐ por poço, 100 ug de HSA/ml em PBS, de um dia para o outro a 4 °C.

Lavagem: 3 x 200 μΐ de PBS

Bloqueamento: 1% de Caseína Bloqueadora em PBS

(Pierce), 1 h à TA Lavagem: 3 x 200 μΐ de PBS

Ligação de extrato periplásmico: 50 μΐ de extrato periplásmico (Exemplo 4), 50 μΐ de PBS 0,05% Tween 20, à temperatura ambiente de um dia para o outro Lavagem: 3 x 200 μΐ de PBS 1- anticorpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1.000 em PBS 0,05% Tween 20, 90 min à TA, 100 μΐ por poço

Lavagem: 3 x 200 μΐ de PBS 2- anticorpo: HRP anti-ratinho de cabra (SIGMA), 1:1.000 em PBS 0,05% de Tween 20, 90 min à TA (temperatura ambiente), 100 μΐ por poço

Lavagem: 3 x 200 μΐ de PBS

Deteção: 3 mg/ml de OPD em tampão citrato/fosfato de Na, pH 4,5, 0,4 μΐ de H202 a 30%

Interrupção antes que o fundo se torne muito alto: 100 ml de H2S04 a 3 M

Leitura de absorbância: 492/620 nm Exemplo 6: Exemplo de uma biblioteca em que apenas uma alça é randomizada: a alça C' 'D 0 gene sintético que codifica o gene de VHH manipulado descrito acima no exemplo 2 é utilizado como um molde para duas reações de PCR em que os seguintes pares de iniciadores são utilizados: SEQ ID No. 30 (actgctcgag agacatcgcc aagaacac; esynmu4) juntamente com SEQ ID No. 26 (3esyn2) e SEQ ID No. 31 (cacactcgag atcgcaaasn nsnnsnncac snnsnncgca tagtaggtat. tgcc; 3esynmu5) juntamente com SEQ ID No. 27 (3esynl). Os produtos de PCR resultantes são digeridos com Xhol, ligados, e o produto de ligação é utilizado como molde para uma reação de PCR com os iniciadores 3esynl (SEQ ID No. 27) e 3esyn2 (SEQ ID No. 25). Os codões NNS nos iniciadores 3esynmu4 (SEQ ID No. 30) e 3esynmu5 (SEQ ID No. 31) introduzem as posições randomizadas na sequência, similarmente conforme descrito no exemplo 2. A Figura 4 mostra o esquema das reações de PCR e procedimento de ligação. As setas horizontais indicam as posições e as direções dos iniciadores de PCR, as linhas verticais indicam as posições dos sítios Ncol, Xhol e Notl, respetivamente (da esquerda para a direita).

Esse produto de PCR randomizado é subsequentemente clonado no vetor de clonagem de fagomídeo pHENl (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi - subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 11 de agosto de 1991,-19(15) :4.133 a 4.137) em sintonia com o sinal de secreção pelB e a proteína de revestimento menor (proteína III) de fago filamentoso fd contido no vetor pHENl conforme descrito no exemplo 2. A sequência manipulada do inserto de biblioteca de VHH randomizado é dada como uma a sequência de nucleó tidos na SEQ ID No. 32 e traduzida como uma sequência de aminoácidos na SEQ ID No. 33. A Letra X na SEQ ID No. 33 denota os resíduos de aminoácido aleatorizados. SEQ ID No. 32 1 ccatggcaag fcfccagctgca ggaaagcggb ggcggcctgg fc.ccagect.gg cggcagccbg 61 cgfcefcgagei gfcgsggccag cggecgtacc fettagçgacc afcagcggcfca cacctataec 121 atfcggcfcggt ttcgfccaggc gccaggaaaa gaacçigaat ttgtggcgcg tatttacfegg 181 agcagcggca atacctatta tgegnnsims gtgaasftnsn nsttcgcgafc etegagagac 241 attgccaaga acacggtaga tcfctacgatg aacaaectgg agcccg&aga cacagccgtg 301 t&ttattgcg cggcfecggga tggcattceg aecagccgba gcgtggaa&g ctacaattaa 361 tggggceagg gcacccaggt gaccgtaagc tetgcggçcg c SEQ ID No. 33

^QVQLQESGGG LVQ1· 3G31«R1S CMvSGRT F B D Jí S G ΪΤ ϊ II-3W FRQAPGKSREF VARIYW S SGNT YYSXXVXXX 0 produto de ligação é, então, transformado em TG1 de Escherichia coli, o número de colónias obtidas é determinado, e diversos clones selecionados são controlados por análise de restrição e por sequenciação de ADN. Para as etapas a seguir da preparação de fago de biblioteca de exibição de superfície, os protocolos padrão são seguidos, conforme descrito no exemplo 2. As etapas de panning, seleção e caracterização de clones de ligação específica são realizadas essencialmente conforme descrito nos exemplos 3, 4 e 5.

Exemplo 7: Exemplo de uma biblioteca em que três alças são randomizadas: a alça AB, EF e C' 'D A biblioteca com resíduos aleatorizados na alça AB e na alça EF, conforme descrito no exemplo 2, é utilizada como um molde para uma PCR em que os mesmos pares de iniciadores que no exemplo 6 são utilizados: SEQ ID No. 30 (esynmu4) juntamente com SEQ ID No. 26 (3esyn2) e SEQ ID No. 31 (3esynmu5) juntamente com SEQ ID No. 27 (3esynl). As etapas a seguir para construção de biblioteca, panning, seleção e caracterização de clones de ligação específica são essencialmente conforme descrito nos exemplos 2, 3, 4 e 5.

Exemplo 8: Comparação de bibliotecas de domínio variável com posições de aminoácido randomizadas em uma, duas e três alças estruturais

As bibliotecas são utilizadas no panning de vários antigénios. lisozima de ovo de galinha como antigénio: 3 rodadas de panning são realizadas. Placas de 96 poços Maxisorp (Nunc) são revestidas com lisozima de ovo de galinha adicionando-se 200 μΐ da seguinte solução por poço: PBS, com as seguintes concentrações de lisozima de ovo de galinha dissolvida (HEL):

1- rodada de panning: 2 mg/ml de HEL

2- rodada de panning: 1 mg/ml de HEL 3- rodada de panning: 1 mg/ml de HEL A incubação ocorre por 1 hora a 3 7 °C, seguida por bloqueio com leite seco a 2% (M-PBS) com 200 μΐ por poço por 1 hora à temperatura ambiente. A biblioteca de exibição em fago é, então, deixada reagir com a lisozima de ovo de galinha ligado adicionando-se 100 μΐ de suspensão de fago e 100 μΐ de leite seco a 4% (M- PBS) , seguido por incubação por 4 5 minutos com agitação e por 90 minutos sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fago não ligadas foram lavadas conforme segue.

1~ rodada de panning·. 10 x 300 μΐ de T-PBS, 5 x 3 00 μΐ de PBS

2- rodada de panning: 15 x 3 00 μΐ de T-PBS, 10 x 300 μΐ de PBS

3- rodada de panning: 2 0 x 3 00 μΐ de T-PBS, 2 0 x 300 μΐ de PBS A eluição das partículas de fago ligadas é realizada adicionando-se 200 μΐ por poço de glicina a 0,1 M, pH 2,2, e incubação com agitação por 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago é neutralizada por adição de 60 μΐ de Tris-Base a 2 M, seguida por infeção em células TGI de E. coli por mistura de 10 ml de cultura exponencialmente em crescimento com 0,5 ml de fago eluído e incubação por 30 minutos a 37 °C. Finalmente, as bactérias infetadas são colocadas em placas em meio TYE com 1% de glicose e 100 pg/ml de ampicilina e incubadas a 30 °C de um dia para o outro.

Albumina sérica humana como antigénio:

As bibliotecas dos exemplos 2, 6 e 7 são utilizadas nas rodadas de panning conforme descrito acima. Especificamente, as bibliotecas de fago são suspensas em tampão de ligação (PBS, 1% de ovalbumina, 0,005% de Tween 20) e submetidas a panning contra albumina sérica humana imobilizada diretamente em placas maxisorp (10 microgramas/ml em PBS, de um dia para o outro a 4 °C; as placas são bloqueadas com Caseína Bloqueadora (Pierce). Após 2 horas, os fagos não ligados são removidos por lavagem repetitiva (PBS, 0,05% de Tween 20) e os fagos ligados são eluídos com 500 mM de KC1, 10 mM de HC1, pH 2. Após cada rodada de panning específico para HSA, os clones resultantes são selecionados ou testados quanto à ligação a TNF alfa. A seleção e teste quanto à especificidade para TNF-alfa é realizada conforme descrito no exemplo 1 do documento W02004/041862.

FcRn como antigénio: 0 panning é realizado conforme descrito no documento W002060919, Exemplo 6.2. Em resumo, as bibliotecas de fago são ressuspensas em 5 ml de MES a 20 mM, pH 6,0/leite desnatado a 5%/Tween 20 a 0,05% e adicionadas (100 microlitros de 5 x 1012 PFU/ml/poço) a 20 poços de uma imunoplaca Maxisorp (Nunc) antes de serem revestidas com 1 micrograma de FcRn murino e bloqueadas com leite desnatado a 5%. Após a incubação por 2 h a 3 7 °C, os poços são lavados 10 a 30 vezes com 20 mM de MES, pH 6,0/0,2% de Tween 20/0,3 M de NaCl e fago eluído por incubação em 100 microlitros de PBS, pH 7,4/poço por 30 min a 37 °C. os fagos são utilizados para reinfetar TGI de E. coli exponencialmente em crescimento, conforme descrito no exemplo 3.

Após cada rodada de panning em FcRn, os clones resultantes são selecionados ou testados quanto à ligação a TNF alfa, conforme descrito acima.

Recetores de Fc-gama como antigénios:

Panning contra proteínas de fusão recombinantes de Fc-gamaRI, Fc-gamaRIIA e Fc-gamaRIIA são realizados conforme descrito em Berntzen et al (2006) Protein Eng Des Sei 19:121 a 128. Após cada rodada de panning num recetor de Fc, os clones resultantes são selecionados ou testados quanto à ligação a TNF alfa, conforme descrito acima.

Exemplo 9:

Esse exemplo demonstra a possibilidade de introduzir novas funções ou especificidades de ligação adicionais num fragmento de anticorpo. A molécula utilizada como um ponto de partida para modificação é o fragmento de anticorpo de cadeia única murino sFv 26-10 (Huston et al. (1988) Proc

Natl Acad Sei USA. 85:5.879 a 5.883). Cinco bibliotecas diferentes são construídas para modificar diferentes sequências de alça estrutural por sequências de aminoácidos aleatórias:

Biblioteca 26-10-1: (SEQ ID NO. 34) S VQIjQQSGPEL· VKPGAS VRMS CKS SGYI FT DFYMKWVRQSHGKS1DYIGYIS P YS GVT6YNQKF KGKÃ.TLT VDKS S STAYMELRSLT SEDS&VYYCAGS SGNK»AMDY»GHGASVTVSS GGGGSGGSG SGGGGS DWMTQT PLS L PVSLS DQAS1SCRS SQS X« VHSNGNTY LNSÍYI^QXftGQS PKLLIYKVSN RFSGXXXXFSGSGS GT DFTLKISXXmXXQXYFC SQTTHVP PT FGGGTKLSI KR Biblioteca 26-10-2: (SEQ ID NO. 35)

EVQLQQSGPÈLVKPGASVRMS CKS SGY l ÍTT DF YMNHVRQS KGKSLDYIGYI SP YSGVTG ΥΝ0ΚΙΓ KGKATLWDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYKGHSASVTVSSGGSGSGGGG SGGGG S DWMTQT PLSLPXXXXXQASISCRS S QSLVHSNGNTYLNWYLGKASQS PKLLIYKVSN R F S GXXXX FS GS G S G1DFTLK1SXXXXXXXGIYFC SQTTHVFFT FGGGTKLEI KR Biblioteca 26-10-3: (SEQ ID NO. 36)

EVQLQQS GPELVKPGAS'VRMSC KS SGYI FT DFYMNWVRQSHGKSliDYlGYI S P YS GVTG YNQKF KGKÃTLT VDKS S STAYM E LRSLISE DSAV Y YCAGS S GfíKK AMDYWGHGAS VTVS S GGGGSGGGG SGGGGS DVVMTQTPLS LPXX.XXXQAS I SCRS SQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQS PKLLI YKVSN RFSGXVPDRFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLBIKR

Biblioteca 26-10-4: (SEQ ID NO. 37)

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKS SGYÍPTDFYMNWVRQSHGKSLDYI GY IS PYSGVTGYNQKF

KGKATLTVDKS S STAYMELRSLTS EDSAVYYCAGS SGNKWAMDYSíGRGAS VTVSSGGGGSGGGG SGGGGS DWMTQT !?L5 LPV5LGDQA8I SCRS SQS LVHSNGKTYLIUWYIQKAGQS PKLLI YKVSN RFSGXXXXXXXFSGSGSGT DFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Biblioteca 26-10-5: (SEQ ID NO. 38)

EVQLQQSGPSLVKPGASVRMSCKSSGYIgTDriM^WVRQXXXXXXDYIGYISPYSGWGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNK»M«DY»GHGâSVTYSSÔGGGS6GGG SGGGGSDmiTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGHTYLNWYLQXXXXXXKLLIYKVSN RFSGVPDR FSG SGSGTDFTLKISRVEASDL6IYFC SQTTHVP PTFGGGTKLEIKR

As bibliotecas são produzidas por tradução re\^ersa das sequências, em que as posições de aminoácidos randomizadas são codificadas pelo tripleto de nucleótido NNK.

Gene de biblioteca 26-10-1: (SEQ ID NO. 39) GAAGTTC&GCTGCÃGC&GTCTGGTCCGGAACTSGTTAAACCSGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCmC&TGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA atctctggactacatcggttacatctctccgtactctggtgttaccggttacãaccagaaattc aaaggtaaagctaccctgaccgttgacamtcttcttctaccgcttacatgsmctgcçttçtc

T GAC CT C T GA&GACT CT GCT GTTΪ ACTÃCTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGG-CCT A.TGGA CTACT GGG GT CACGGTGCT T CTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT tctggtggtggtggttctgacgttgttatgacccagaccccgctgtctctgccgstttotctgg GT Q AC CAGGCTT CTATCT CTT GCCGTTCTT C TC AGTCT CT G G T T C ACT CTAAC GGTftA CACC TA CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTC^GTCTCCGAMCTGCTGATCTACMAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTNNKNNKNNKNSKTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA tctctksknnkksknsknnknnknnkggtatctacttctgctctcagaccacccacgttccgcc GAC C T TCGG T GGT GGTACCAAACTGG&&ATCAAACGT Gene de biblioteca 26-10-2: (SEQ ID NO. 40)

GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCGGGAACTGGTTA.AACCGGGTGCTTCTGTTCGTÃTGTCTT

GCAAATCTTCTGGTTACATCTTC^CCGACTTCTftCATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA

ATCTCrGCACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGSTCTTACCGGTTACâACCAGAMTTC aaaggtaaagctaccctgaccgttgacaaatcttcttctaccgcttacatgg&actgcgttctc

TSACCTCTGAASACTCTGCTGTTTACTACTGCSCTGGTTCTTCTGGTAAC&AATGGGCTATGGA ctactggggtcacggtscttctgttaccgtttcttctggtggtggtggttctgôtggtggtggt TCTGGTSGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCACACCCCSCTCTCTCTCCCGNNKNNIOÍIÍK»

NKNSKCAG6CTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA

CCTGAACTGGTACCTSCAGAAAGCTGGTCAfiTCTCCSAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC

c GT T T CTÇT GGT MN KH M KÈJ S KHN KTT CTCT G GTT C T GG TTCT GG TAG C GACTT C AC C CT GAAAA

TCTCT3SIMIÍSíNK?!NKNNKÍÍNKNl3KNÍíKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC

GACCTTCGGTGGTGGTACCAAaCTGGAAATCAAACGT

Gene de biblioteca 26-10-3: (SEQ ID NO. 41) gaagttcagctgcaçcíustciggtccggaactggstaaaccggnstgcttctgttcgtatgtctt G C&A&T CT T C T GGΐTACATCT7 C ACCG AC TTCTACMGAACTGGGTTCGTC AG7GTCACGGT AA ATCTCTGGACTACATCGGTT&CATCTCTCCGTaCTCTGGTeTTACCQGTTACÃACCASAaATTC AAAGGT&AAGCTACCCTSACCGTTGACAAAtCTTCfTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTfCTC TSÃCCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGÍSGGTCACGQTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGT^CTGGTGGTGGTGeT tctgstggtggtggttctgacgttgttatgacccagaccccgctgtctctgccgsnkknknnkn

NKNNKCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTGACTCTAACGGTAACACCTA

CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTC/íGTCTCCGAAACTGCTGATCTACMAGTTTCTAAO

CGTTTCTCTGGTGTTCCGGACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA

TCTCTNNKNSKNNKNSKKÍÍKNíítKNÍÍKGGTATCTAClTCTGCTCTCAGACCACCCACGTICCGCC gaccttcggtggtggtaccaaactggaaatcaaacgt

Gene de biblioteca 26-10-4: (SEQ ID NO. 42)

G&AGTT C AGC T G C KG C AG T CT GGT € C G GAACT GG TT.AAAC C GGGT GCT T CT GT T CGT AT GTGTT GCAAAT CTTCTGGT TAC AT C TT CACC GACTTCTACATGAAC T GGGTT CGT CAGT C T CAC GGTAA

ATCTCTGGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACA&CCAGMATTC

AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTftCCGCTTACATGGAACTGCÍ^TCTC

T G AC CT C Ϊ SAAG AC T C TGCTGTTTACTACTGCSCTGGTTCTTCTGGTAACAAATG6GCT&TGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTtCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCrGTCTCTGCCGGTTTCTCTGG GTGACCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCtA CCTCEAACTGGTACCSSCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTMMKNNKHNKMNKNt3KNMSNNKTTCTCTGGTTCTGGTTC?GGTACCGACTTCA CCCTGAAARTCTCTMNK^NKW3>iKNNKNKKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCA. CGTTCCGCCGACCTTGGSfGGTGGTACCAMCTGGAAATCMACGT

Gene de biblioteca 26-10-5: (SEQ ID NO. 43)

GAAGTTCÃGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCSGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTãCATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGNNKNKK^^KIÍN KNNKNNKGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTAGAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACA?GGAACTGCGTTCTC TGAGCTÇTGAAGACTCTGCrGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT tctggtggtggtggttctgacgttgttatgaccgagaccccgctgtctctgccggtttctctgg GTGÃCCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCA(3MNKMMKMtíKKÍÍKN»K^NKAAACTGCTGATCTACAAAGTT'TCTAAC CGTTTCTCTGGTGTTCCGGACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA TCTCTCGTGTTGÃAGCTGAAGACCTGGGTATCTACTTCTGCTCTCASACGÂCCCACGTTGCGGC GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCâAACGT

Os respetivos genes são montados com oligonucleótidos quimicamente sintetizados e clonados num vetor de exibição de fago para exibição superficial de fago conforme descrito acima com todas as adaptações necessárias para atingir tradução em estrutura de um péptido líder, a variante sFv e a proteína de revestimento III do fago.

As bibliotecas de exibição de fago são selecionadas para ligação a albumina sérica humana, lisozima, FcRn e recetores de Fc gama conforme descrito no exemplo 8. Alternativamente, os genes são ligados ao vetor pRDV analogamente ao método descrito em Binz et al. (2005) Nat

Biotechnol. 22:575 a 582 e submetidos a panning para albumina sérica humana, recetores de Fc e lisozima de acordo com a metodologia descrita em Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231:119 a 135.

Exemplo 10:

Um anticorpo humano, 2F5, específico para o péptido de HIV ELDKWA é utilizado como um arcabouço para aleatorização de alças estruturais e expresso como scFv. A construção de vetor de expressão e exibição de fago é realizada conforme descrito no exemplo 9. A seleção de fago é realizada de modo correspondente. A sequência de scFv do tipo selvagem e as respetivas bibliotecas são mostradas nas Figuras 5 a 8.

Exemplo 11: Biblioteca de Fab, em que alças estruturais de um domínio constante são randomizadas

Para a seleção de moléculas de ligação específica das bibliotecas de domínios de imunoglobulina, em que os resíduos que estão localizados em alças estruturais foram aleatorizados, vários formatos podem ser aplicados. Domínios únicos, tal como os domínios de VL, VH, CHI, CH2, CH3, CH4 ou CL, podem ser utilizados, fragmentos Fc que consistem nos domínios de CH2 e CH3 (incluindo ou não incluindo a região de dobradiça ou partes da mesma) podem ser utilizados, fragmentos Fv ou Fv de cadeia única podem ser utilizados, anticorpos inteiros podem ser utilizados ou combinações de domínios de imunoglobulina podem ser utilizados. Um formato que é de interesse particular para a seleção de moléculas de ligação específica é o fragmento Fab, que é um heterodímero de duas cadeias, a saber, a parte VL-CL e a parte VH-CH1 do anticorpo. Os fragmentos Fab são conhecidos hã muito tempo e podem ser produzidos por clivagem proteolítica de uma IgG com a protease papaína e podem ser também produzidos recombinante numa ampla gama de diferentes sistemas de expressão, tal como, por exemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, células de inseto ou células de mamífero. É bem conhecido na técnica que sistemas de exibição de superfície, tal como exibição de fago, exibição de levedura, e outros sistemas tal como exibição de ribossoma, etc. podem ser utilizados para o enriquecimento e a seleção de moléculas de ligação específica, tal como fragmentos Fab, de bibliotecas grandes (Veja-se, por exemplo, Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.

Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 11 de agosto de 1991,-19(15):4.133 a 4.137.,- Kang AS, Barbas CF, Janda KD, Benkovic SJ, Lerner RA. Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 15 de maio de 1991,-88(10).:4.363 a 4.366.,- Kang X, Yang BA, Hu Y, Zhao H, Xiong W, Yang Y, Si B, Zhu Q. Human neutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage display. Clin Vaccine Immunol. Agosto de 2006,-13(8):953 a 957.,- Weaver-Feldhaus JM, Lou J, Coleman JR, Siegel RW, Marks JD, Feldhaus MJ. Yeast mating for combinatorial Fab library generation and surface display. FEBS Lett. 23 de abril de 2004;564(1-2):24 a 34,).

Como um exemplo, se o sistema de exibição de fago for aplicado para a exibição de fragmentos Fab (por exemplo, bibliotecas de fragmentos Fab), uma cadeia do fragmento Fab, por exemplo, a cadeia de VH-CH1, pode ser expressa como uma proteína de fusão com, por exemplo, proteína III de fago M13, levando, assim, à exibição dessa cadeia na superfície do fago, enquanto a outra cadeia, VL-CL, é expressa na forma solúvel e forma o heterodímero natural com a cadeia VH-CH1 ancorada em superfície. Numa biblioteca de exibição de superfície de Fab típica, diferentes sequências de VH e VL estão presentes, que podem originar-se de um doador, tipicamente um ratinho ou um ser humano, mas diversidade pode ser também gerada por métodos in vitro, tal como mutagénese sítio-dirigida. Diferentes sítios de ligação são, assim, gerados, e com a utilização de uma exibição adequada ou outro método de enriquecimento ou seleção, clones podem ser isolados de tais bibliotecas que se ligam a seu parceiro de ligação por meio do sítio de ligação que é formado por VH e VL.

Podem ser gerados fragmentos Fab que se ligam a um alvo por meio de seu sítio de ligação natural formado por VH e VL e a outro (ou uma segunda vez ao mesmo) alvo por meio de sítios de ligação formados por suas alças estruturais. A fim de obter tais fragmentos Fab manipulados, são primeiramente geradas as bibliotecas de Fabs em que os resíduos nas alças estruturais são substituídos por sequências randomizadas. Inserções de resíduos adicionais podem ser também realizadas. As alças estruturais que podem ser manipuladas por essa abordagem podem ser alças C-terminais (as alças de "fundo") de VH ou VL, ou N-terminal (alças de "topo") ou C-terminal (alças de "fundo") do CHI ou dos domínios de CL. Diferentes combinações de domínios com alças estruturais manipuladas em qualquer uma das posições são também possíveis. Um formato que pode ser utilizado para selecionar domínios de ligação específicos é como domínios únicos, como fragmentos Fv ou Fv de cadeia única, ou, conforme descrito em detalhes abaixo, como fragmentos Fab.

Os genes que codificam VH-CH1 e VL-CL, respetivamente, do anticorpo 4D5 (Cho HS, Mason K, Ramyar KX, Stanley AM, Gabelli SB, Denney DW Jr, Leahy DJ. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 13 de fevereiro de 2003,-421(6924):756 a 760.), que se liga a Her2 humano são utilizados para esse exemplo. É construído um gene sintético que consiste na parte de codificação de VL-CL 4D5 do gene, flanqueado em sua extremidade 5' por um sítio Ncol para inserção em estrutura na sequência de sinalização pelB contida no vetor de fagomídeo pHENl (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 11 de agosto de 1991,-19(15):4.133 a 4.137) seguido por um codão de parada. No trânsito da sequência de VL para CL, um sítio de restrição BsiWI exclusivo está incluído, que é utilizado posteriormente para substituição da sequência de CL do tipo selvagem contra insertos de biblioteca contendo alças estruturais aleatorizadas em combinação com um sítio de restrição Asei exclusivo que está localizado a jusante do codão de parada do gene que codifica VL-CL. O mesmo segue uma sequência que contém um sítio de ligação de ribossoma (Shine-Dalgarno sequência) tomado de Carter et al. (Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan MD, Wong WL, Rowland AM, Kotts CE, Carver ME, et al. High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment: Biotechnology (N Y) . Fevereiro de 1992 ,-10 (2) :163 a 167) , seguido por um segmento de gene que codifica a sequência de sinalização de enterotoxina estável em calor II (stll) fundida em estrutura à parte de codificação de VH-CH1 do anticorpo 4D5 seguida por um sítio Notl para inserção em estrutura do vetor pHENl. Esse construto dicistrónico leva à expressão de VL-CL (a sequência proteica do qual é dada na SEQ ID No. 44) por um lado e por outro lado de VH-CH1 fundido à proteína III do fago M13 (a sequência proteica do qual é dada na SEQ ID No. 45), que é codificado por pHENl. A sequência completa do vetor de exibição 4D5 Fab conforme descrito aqui é dada como uma sequência de nucleõtidos na SEQ ID No. 46.

Para construção de uma biblioteca de domínios de CL em que resíduos nas alças estruturais são aleatorizadas, é produzido um gene sintético que codifica um domínio constante capa humano (CL) em que certos codões são substituídos por um codão degenerado, tal como, por exemplo, NNB (código 1UPAC, em que filamentos N para C, G, T e A; filamentos B para T, C e G) . É também possível inserir resíduos adicionais na sequência. Nesse exemplo, 3, 4 ou 5 resíduos, respetivamente, são inseridos entre os resíduos 127 e 128, e os resíduos 182 a 185 e 187 a 189 são aleatorizados (numeração de Rabat). As sequências dos genes resultantes são dadas como as sequências de nucleótido nas SEQ ID No. 47, 48 e 49 (3, 4 ou 5 inserções, respetivamente, entre os resíduos 127 e 128) e como as sequências de aminoácidos nas SEQ ID No. 50, 51 e 52 (a letra X significa qualquer um dos 20 aminoácidos naturalmente codificados). As sequências de nucleótidos incluem o sítio BsiWI na extremidade 5' e o sítio Asei na extremidade 3' para clonagem na SEQ ID No. 46.

Para construir a biblioteca de exibição em fago, o vetor de exibição Fab 4D5 (SEQ ID No. 46) é clivado com as enzimas de restrição BsiWI e Asei, o fragmento grande é preparado por eletroforese preparativa em gel de agarose. 0 fragmento pequeno, correspondente ao gene que codifica o CL do tipo selvagem, é removido. A mistura de insertos de biblioteca, conforme descrito acima (SEQ ID Nos. 47 a 49), e similarmente clivadas com BsiWI e Asei e ligadas ao fragmento de vetor purificado. A mistura de ligação é transformada numa estirpe de E. coli adequada, tal como TG1, por exemplo, por eletroporação, e um grande número de colónias independentes é gerado (por exemplo, 10exp8, 10exp9 ou mais). As bactérias transformadas são agrupadas e infetadas com fago auxiliar (tal como, por exemplo, M13K07) para resgate de partículas de fago. As partículas de fago são produzidas por procedimentos padrão e utilizadas para panning da biblioteca. 0 panning da biblioteca contra um dado alvo produz fragmentos Fab que não apenas se ligam a Her2 (devido ao sítio de ligação formado por VH e VL do anticorpo 4D5), mas também ao alvo contra o qual foram selecionados.

Nesse exemplo, o projeto, a preparação e a utilização, em que alças estruturais do domínio de CL são modificadas, são descritos. De uma forma análoga, as bibliotecas com aleatorização nas alças estruturais de outros domínios, tal como o domínio de CHI, VH ou VL, podem ser preparados e utilizados.

Sequências: SEQ ID No. 44 5 10 15 20 25 S0

1 Η K Y h X» P T A A A G I* 1< h h AA0?AHiD10«íaS? 31 S S L S & B V G S> A V T I T C R & S Q Ú V H t A V A8ÍQ Q fil K P Cl K A P K L Ϊ, I Y S Ά B F L Y S G V P S B F S G S R S 3

SI T D F T L T I S S L Q P E 0 F A T Y Y C Q Q Η Y T T P P T F

121 GOST K V £ I K R T V A A 9 S V V 1 ψ PFSDEQ L K S G

151 T A S V V C L L N S ? ϊ P R E & K V 8 Η V D 8 J 1 Q S 8 N 181 S Q E S V T E Q D S K D S Π S L S S U U 8 K A SYS K 211 HKVYACEVÍKQGLSSPVTKSFKRGSC /// SEQ ID No. 45 5 10 15 20 25 30

1 Μ Κ Κ Κ 1 A F L LAS Μ F V F S ϊ A Τ Μ A Υ A Ε V Q L, V S S

31 5 ε 5 1 V Q 2 G G 3 L Β. LSCSISGFSIOTYI Η W V

SI R Q A i? G S S L δ S V A Ε I Υ Β Ί Ν (3 Υ f Ε ¥ Ά 0 S ¥ Κ S R 91 F Τ I S A 0 Τ 8 Κ Μ Τ Α Υ i Q Μ Η U R A g D Τ A V Υ Υ C $

121 RSGSDSFYàlDYISgGTLVTVSSASTEGPS 151 VFPLÃPSSHTSSfifft A h G C Xs V K D Y F P E Ψ ¥ 181 Τ V S W U $CA1 T 3 G V β Ϊ F P A ¥ I Q S S <3 L Y 3 L 3 S

211 V V Τ V F SSSXiSíQin C Ν V Si β X B S Ή Τ Κ V D Κ K

241 ¥ S P X S C A A A E Q KLISEEDL β G A ASTVESCL

211 A Κ P Η Τ E N S T f IVfXDDKYHFYlSTSGC 1, W 3D1 N A T Q V V V CTGDETQCYGIBVPIG L A I P 8 8 g 331 SSSSEGSSSESSSSEG G G Τ X F p g γ Q D Y F I g

361 G Y TYIKPLDGT Y F P G Ί E Q N F A X I? H p S L E £ S

391. 0 P L K £ F M F Q N N A F R Ν B Q G A 1 Τ V Y f Q Τ. V ? 0 G

421 T D P ¥ Κ Τ Y Y Q Υ Τ P ¥ 3 S K A Μ Y D A Y W K G K F R D C

451 APSSGF.NEBPF ¥ C S Y ÍSQSSDUQPP V ® A Q 4SI G S S β G (3 S G Q G Ξ E G G G S E G G G S E G G G S S 6 G G

SKI S G G G S G S G D F D Y E R M A H A 13 SC G A Μ Τ E M Ã D S S

541 A L Q S D A K <3 K L B S ¥ A T l> Y G A A I D G F I G 0 V S G

511 L A Ν G N G A £ G B S’ A G S 19 S Q M A Q V Q D G D M g?L M 6Ô1 Μ N F R Q Y L P S L F Q S V E C R P Y ¥ f G A G K F Y E F S 631 I B C Β Κ l Ν Ϊ, F R G V F A F L L ϊ V A f F Η Υ V F S T h

661 Ν X L Η K S S SEQ ID No. 46 _! gacgaaaggg ectcgtçata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt ^61 cttagaagtc a.ggtggcsc-t fcttoggggas âtgtgçgggg aaoccctatt tgtttatttt 221 tctaaataca ttcaaatstg tafcccgctca tgagacsata acccfcgataa atgcttcaat 181 aatattgaaa aagga&gagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt atfcecctttt 24i fcLgcggcatt ttgccfctcct gcccttgctc acocagasas gcfcggfcgaaa gtasaagato 301 ctgaagafcda gtfcgggtgca cg&gtgggtt acatcgaacfc ggatcfccaac agcggtaaça 361 tocttçagsg ttfcfcegcccc g&ageacgtt: tfcecaatgat gsgcactttt aaagfciotgc 4X1 tatgtggcgc ggtattatcc egtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt egccgc&tac 401 actaetctca gaafcgacttg gtsgagtact caccagtcac agaaaageat ctt&eçgatg 541 gcatgscagi ssgagaatts tgcagtgotg eeataacaat gagtgataaç aefcgcggçca 601 acttacttct gacaaegate ggaggaccga aggsgetaac cgcsbtttttg C&Caacatgg 661 gggatcstgt aactcgc«tt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaaeç 721 aogagcgtga caccaegatg <jctgtagesa tggeaseaae gttgegcaaa ct&bfeaactg 181 gcgaactact tactet&gct tcccggc&ac aatfcaataga ctggatggag gcggstsaag 641 ttgcagçacc acttctgc-gc tdggccctts cggctggctg gtttattgct gstsaafeetg 901 gagcoggtga gogtgggtct cgoggtatca ttgcageact ggggeeagst ggtaagcoot 981 cccgtatcgt agttatctac .acgacgggga gtcaggcsac tatggatgaa cgaaat&gac 1021 agatcgctga gataggtgcc taacfcgatta agcattggta sctçtcsgac saagttfeact 1031 cafcístatact ttagattgai tfcasaaette atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1141 tcotttctgs taatotcatg accaaaatcc ctt&acgtga gttttcgttc cactgagcgt 1201 cagaccccgt ag&aaagabc aaaggafcctfc cttgsg&tce tttttttctg cgcgtaatcc 1261 gctgefctgca aaeaaaaaaa eeaecgatac cagcggfcggt ttgtttgoog gatcaagagc 1321 tsdcaactct ttttccgaag g-fcaactggct ccagcagagc çcagat&cca aataofcgcec 1381 fctctagtgta gccgtegtta ggcoaccact tc&agaaotc igtagcaccg cctacatacc 14 4.1 tcgotctgct satcotgtfca casgfcggctg ct.gcc»gtgf cg&taagtcg tgtcttaccg 1S01 ggttggactc aagacgafeag tfeaccggata sggcgçageg gtcgggctgã acggggçgtt 1S61 cgtgcae&es gcccagcttg g&gegaac-ga cctacaccga acfcgagatac ctacagcgtg 1621. agcattgaga aagcgccacg cfct.ecagaag ggagaaaggc ggacaggfcat ccggtsagcg 1.681 gcagggtcgg aaoaggagag cgcacgaggg agct.tccs.gg gggaaacgcc tggtatcttt 17 41 at.agtcíií-gt cçggtiiçgc naftctatgac ttgagcgtcg atttfctgtga tgetegtcag 1801 gçgggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1851 gstggccttt. tgctcacatg tt.ctttr.ctg' egttatcccc tg&fctctgfcg gata&eegta 1021 btsecgectt tg&gtgsgct gatactígate gecgcsçjcccj aaeg&cegag egcagcgagi 1981 csgtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa taagaaaaae gecfcetceoo gcccgttggo 2041 cgafcfceatta·atgcsgctgg c&cgacaggt tbeccgaefcg g&aagcgggc agtgâgcgca 21ÔI âsgaaattaa tgfcgagtt&g cteaetcatt aggcacccoa ggctfctaaaa ttfcatgctte 21Ê1 cggctcgtat gttgtgtgga afctgtgagcg gat&acaatt tcacacagga aacagctatg 2221 accetgatta cgccaagctt gcetgcaaafc tctatfctcaa ggagacagtc ataatgaaat 22B1 acctattgcc tacggcagcc gotggattgt tattactcgc ggoccagccg gccstggccg 2341 atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tftccgcctc tgtgggcgat agggtcacea 2401. taacctgcag tgccagtaag gst«tg;aata «tgctgtagc ctgçt&tesa cagaaaocag 2461 gaaaagctcc gaaactactg aftttacfccgg catccfcfcccfc cfcacfcetgga gtccettctc 252.1 gcttctctçg atccagatct ggg&cggatt tcactctgac catcagcagt ctçcagccgg 2581 aagactbcgc aaettattse tgtcagcaac attatsotac fecctcccacg ttsggacagg 2641 gtacaaaggt ggagatcaaa cgtaoggtgg oggcgocat-c tgtcttcsatc ttoccgccat 2701. ctgatgagca gcttaagtct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aaçttctatc 2761 soag&gagge c&aagtacag £.ggaag>gtgg ataacgccct ccaatcgggb a&ctcccagg 2821 agagtgtcac agagesggac ageaaggada gcacct&cag'ôctcagcagd acôdtgaogc 2881 tgagcaasgc agsctacgaç aaacacaaag tatacgc.ctg ogaagtcacc catcagggec 2341 tgagctcgcc agtcaeaaag agcttcssaca ggggagagtg ttaataaggc gcgccgctga 3001 fcccfectacgrc cggacgcatc gtggccctag tsc>gcaagtt s&dgtaa&aa gggtatctag 3061 aggttgaggt gattttatga aaaagaatàt «gcafcttctt s:ttgcatcfcã t.gtfccgtttt 3121 ttctattgct acaastgcat acgctgaggt tgaactagtg gagtctggcg gfcggcctggt 3261 gcagftcaggg ggctcactco gtttgtcotg tgsagcttct ggcfetcaaoa ttaaagecac 3241 ctetctacac igggtgcçtc aggccccggg taagggoctg gaafcgggttg caâggattta 3301 tcotacgaat ggttafcacta gstatgfi&ga. fcagcgtciaag gg&cgtttcfi ctat«ag<jgQ 1361 agacacatcc aaaaacaeag cctaectgca gatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc 3421 cgtctsttat tgttotagat ggggagggga cggcsttctat gctatggact actggggtea 3431 aggaacootg gtc&ccgtct cctcggogtc gecoaagggc ccatcggtcfe tecc.cctggc 3S41 accctccfecc aag&gcacct ctgggggcsc agcggccctg ggctgcetgg tcaaggacta 3601 ottcocegaa ccggtgacgg tgtagtggaa Cteagçtgcc ctgaccagcg gcgtgcacac 3661 cttcQcggct gtccta<jagt cctaaggact ofcactoocbc agcagcgtgg tgaccgtgce 3721 ctccagc&gc ttgggcaccs agaoctacat ctgca&cgtg aatcacaagc ccagcaacae 378.1 oaagçtggac aagaaagttg agccoaaatc ttgtgcggco gcagaaoaaa aactcatctc 3841 agaagaggat ctgaabgggg ççgaatagad tgttgaaagfc tgtttagcaa aacctcatac 3301 agaaaattca fetiactascg tctggaaaga cgaoaaaact. ttagatcgtt scgcvsact® 3961 tgagggctgt ctgtggaatg cfcacaggcgt tgtggtttgt actggtgacg aaaotaagtg 4021 ttacggtaca tgggttecta ttgggcttgc tatccctgaa astgagggtg gtggctctga 4081 gggtggcggt tctgagggtg gcggfcfcctga gggtggcggfc actaaacctc ctgagtacgg 4141 tgafcacâcct afctecgggct. atac.fctatst caacectcfcc gacggeactt atccgcctgg 4201 tactgagcaa aaccccgcta atcotaatcc ttctctfcgag gagfcctcaga ctctfcaatac 4261 iiicatgttt cagaataata ggttccgaaa taggcagggt gcattaactg ttfcatacggg 4321 cacfcgttacfc caaggcactg accccgttaa aacttattac cagtacacto ctgtatcafcc 4381 a&aagccatg tatgacgctt actggaacgg taaattcaga gactgcgctfc tccattctgg 4441 cttfcaatgag gatceahicg tttgtgaata fccaaggeeaa tcgtctgacc tgcctcascc 4501 tcctgtcaat gctggcggcg gctctggtgg tggtfcctggt ggcggctctg agggtggcgg 4561 atctgagggt ggcggttctg agggtggcgg atctgagggt ggcggttcog gtggcggctc 4621 aggttccggt gafctttgatt atgaaaaaafc ggcsââcgct a&taaggggg ctatgaccga 4681 aaafcgccgat gaaaacgogc tacagtctga cgctaaaggc aaacfctgatt ctgtcgctac 4741 tgattacggt gctgctateg atggtitcat tggtgacgtt tccggecfctg ctaatggfcaa 4801 tggtgctact ggtgattttg ctggctctaa tteccaaatg gotcaagtcg gtgecggtga 4361 taattcacct ttaatgasta atttcogtca afcatttacct tctttgcotc agteggttga 4921 atgtcgcccfc tatgtctfctg gcgctggbaa accatatgaa ttttcfcattg attgtgacaa 4981 aataaactta fctccgfcggtg tefcttgcgtfc icttttatai gttgceacct ttatgtatgt 5041 attttsgaeg tttgctaaca tactgcaftaa ggagtcttaa taagaattcsa ctggccgtcg 5101 tlfctacaacg tcgtgaçtgg çaaa&çectg gcgfctaccca aettaatcgc cxtgcagcac 5161 atcccccttt cgccagctgg cgtaafcagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcocaac 5221 agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgafcgcggts ttttctcctt acgcatctgt 5281 gcggtatttc acaccgcacg tesasgcaac catagtacgc gcoctgtagc ggegcattaa 5341 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgcfcac acitgccagc gccctagcgc 5401 ccgctccfctt cgctttcttc ccttcetttc fccgccacgtfc egccggcttt ccccgtcaag 5461 ctctaaatcg ggggctccct tfeagggttec gatttagtgc fcttaeggcac ctcgacccca 5521 aaaaacttga tttgggfcgat ggttcacgfca gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 3381 gccctttgac gtfcggagtco aagttcttta atagtggacfc ottgttecaa acfcggaacaà 5641 cacfceaaccc tatctcgggc tattcfctttg atttataagg gattttgccg atttcggcci 5701 attggttaaa aaatgsgctg atttaacaas aatttsacgc g&attttaac aa&atattaa 5761 cgfcttacaat tttatggtgc actctcagfca castotgctc tgatgccgca tagttaagcc 5821 agccccgaea cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg cfccecsggcat 5881 ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttfctcaccgt 5341 catcaccgaa acgcgcge SEQ ID No. 47 1 cgtacggtgg cggcgccatc tgtctteate tfceccgceat etgatgagea gctfeaagtct $i nnbnnbnnbg gaactgcetc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 121 aaagtaeagt ggaaggtgga taaegecctc caatcgggta actcccagga gagtgtoaca 181 gagcaggaca gcsaggacag e&cctaesgc efccagcagca ccctgacgct gnnbnnbmib 241 «abtacnrsba ssbnnbaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 301 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt taataaggcg cgcc SEQ ID No. 48 1 cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gcttaagtct 61 safonnbnnbn nbggaastgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccag&gag 121 gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 18.1 scagagcagg aaagcaagga cagc&cctac agcctcagca gcaaectgac gctgnnbxmb 241 nnbnabtacn nbnnbncbaa agtetacgcc tgegaagtea cccatcaggg cctgagctcg 301 cQcgtcacaa agagettoaa saggggagag tgttaataag gagegee SEQ ID NO. 49 1 cgtacggtgg eggcgeeatc tgtcttcatc tfccesgccat ctgatgagca gctt&agtet SI rmbnnbnrsbn nbnnbggaac tgcctatgtt gfcgtgcctgc tgaatsacfct ctatcccaga 12X gaggccaaag tasagtggaa ggtgg&taac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 181 gtcacagago aggaoagcaa ggaoagcacc tacagcetca gcsgaaacot gacgctgnnb 241 nnbnnbanbt acrmbnribnn baaagtctac gcctgcgaag tcacccatoa gggcotgagc 301 tsgoccgto®. esasagagctt caacagggga gagtgttaat aaggcgogcc SEQ ID No. 50 5 10 15 20 25’ 30

1 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSXXXGTAS V V C

31 t h N 8 1’ ¥ P R E A K V Q W K V D 8 A L Q $ G H S Q E S V T

61 SQDSKDST'YSL S B T L T L X X X X. Y X X X K V ¥ A C

91 EVTBQGLSSP V ϊ K B F H R G E C SEQ ID No. 51 5 10 15 20 25 30

1 RIVAAPS VFI FPPSORQLKSnnGTA S V V 31 C L h SHF? B R E A K V Q W K V D N A 10SSKSH 3 V 61 TSQDSKDSTYSLSSTL T LXKXXnnK V Y A 91 C E V T H Q G L S E P ¥ T K S F K R G E 0 SEQ ID No. 52 5 IQ 15 20 25 30

X RTVAAPS?n FFPSDEQLKSXXXXXGTASV 31 V C L L N M F ϊ P R E AKVQWKVDMALQ30ISS Q B $ 61 YYEQDSKDSTYSLSSTLTLXXXXYXXXKYY 91 ACRVTHQGLSSPVTXAFSRGEC

Descrição das figuras

Figura 1: Alinhamento de sequências das sequências de aminoácidos da SEQ ID No. 1 e da SEQ ID No. 2.

Figura 2: Sequência de nucleótidos que codifica o gene sintético que codifica o domínio de VHH de camelo anti-TNF-alfa, assim como a tradução em código de uma letra de aminoácido. Os sítios de restrição utilizados para clonagem estão sublinhados na sequência de nucleótidos. Os resíduos de aminoácido a serem aleatorizados na biblioteca estão sublinhados na sequência de aminoácidos. (Os aminoácidos inseridos não são dados nessa sequência.) A Figura 3 mostra o esquema das reações de PCR e procedimento de ligação. As setas horizontais indicam as posições e as direções dos iniciadores de PCR, as linhas verticais indicam as posições dos sítios Ncol,

Bglll e NotI, respetivamente (da esquerda para a direita).

Figura 4: Esquema das reações de PCR utilizadas para construir a biblioteca conforme descrito no exemplo 6. Figura 5: biblioteca 1 de gene sintético scFv 2F5 wt (VH-Ligante-VL) e tradução, com duas alças estruturais aleatorizadas

Figura 6: biblioteca 2 de gene sintético scFv 2F5 wt (VH-Ligante-VL) e tradução, com duas alças estruturais aleatorizadas

Figura 7: biblioteca 3 de gene sintético scFv 2F5 wt (VH-Ligante-VL) e tradução, com três alças estruturais aleatorizadas

Figura 8: gene sintético do tipo selvagem scFv 2F5 com tradução (VH-Ligante-VL)

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6562617 B [0010] • EP 0640130 BI [0017] [0019] [0020] [0029] • WO 00244215 A2 [0022] [0029] • EP 2006050059 W [0023] • US 2005266000 AI [0024] • WO 9308278 A [0134] • WO 0042561 A [0135] • WO 0170947 A [0135] • WO 03012100 A [0135] • WO 04018674 AI [0135] • US 6352842 B [0135] • US 6361974 B [0135] • US 6358709 B [0135] • US 5824514 A [0135] • US 5817483 A [0135] • US 5814476 A [0135] • US 5763192 A [0135] • US 5723323 A [0135] ® US 6602684 B [0168] • US 20050054832 A [0168] • US 200502444403 A [0168] • WO 0244215 A [0171] • WO 02060919 A [0175] [0262] • WO 9734631 A [0175] • WO 04041862 A2 [0238] • WO 2004041862 A [0261]

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para manipular uma imunoglobulina que compreende uma região de alça estrutural modificada para fornecer um sítio de ligação não CDR que se liga a um epítopo de um antigénio, em que a região de alça estrutural não modificada não se liga significativamente ao referido epítopo, que compreende as etapas de: fornecer um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina parental que compreende um domínio variável com uma conformação de alça de CDR específica com propriedades de ligação ao antigénio originais, e uma região de alça estrutural, - modificar pelo menos um resíduo de nucleótido da referida região de alça estrutural, - transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - expressar a referida imunoglobulina modificada, colocar a imunoglobulina modificada expressa em contacto com um epítopo, e - determinar se a referida imunoglobulina modificada se liga ao referido epítopo, em que pelo menos um nucleótido em cada uma das pelo menos duas alças estruturais é modificado, sendo que a referida modificação introduz pelo menos um aminoácido estranho ao sítio de modificação, selecionado do grupo que consiste em triptofano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina e asparagina, e a referida modificação resulta numa modificação de até 30 aminoácidos dentro de uma região de alça estrutural, e em que a referida conformação de alça de CDR específica e propriedades de ligação ao antigénio originais da imunoglobulina parental são retidas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a referida imunoglobulina é biespecífica e se liga especificamente a dois epítopos.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por a imunog1obu1ina ser de origem humana, camelídea ou murina.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o domínio variável ser selecionado do grupo de VH, Vcapa, Vlambda e VHH.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por as pelo menos duas regiões de alça estrutural modificadas de um VH, um Vcapa, um Vlambda ou um VHH compreenderem pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 41 a 81 ou aminoácidos 89 a 103, em que a numeração é de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT).

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a região de alça estrutural modificada de VH ou Vcapa ou Vlambda de origem humana compreender pelo menos uma modificação dentro dos aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 89 a 101, posições de aminoácido 12 a 17, posições de aminoácido 45 a 50, posições de aminoácido 69 a 75 e posições de aminoácido 93 a 98, em que a numeração é de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a região de alça estrutural modificada de VH de origem murina compreender pelo menos uma modificação dentro de aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 92 a 101, em que a numeração é de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT).

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a região de alça estrutural modificada de um VHH de origem camelídea compreender pelo menos uma modificação dentro de aminoácidos 7 a 18, aminoãcidos 43 a 55, aminoácidos 68 a 75 e aminoácidos 91 a 101, em que a numeração é de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por pelo menos um aminoácido das referidas pelo menos duas alças estruturais ser modificado por meio de mutação aleatória sítio-dirigida.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada compreender pelo menos uma unidade de repetição de nucleótido que tem a sequência 5'-NNS-3', 5'-NNN-3' ou 5'-NNK-3' , em que a codificação é de acordo com a União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC).

11. Polipéptido de domínio variável de imunog1obu1ina variante que compreende pelo menos duas alças estruturais modificadas, sendo que cada uma contém pelo menos um aminoácido selecionado do grupo que consiste em triptofano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina e asparagina, em que as alças estruturais modificadas formam um sítio de ligação ao antigénio não CDR, em que o polipéptido de domínio variável de i munog1obu1ina variante é de origem humana ou um polipéptido de domínio variável de variante humanizado e compreende pelo menos uma tirosina em qualquer uma das posições 12 a 17, 45 a 50, 69 a 75 e 93 a 98, e/ou pelo menos um triptofano em qualquer uma das posições 12 a 17, 45 a 50, 69, 71 a 75, 93 a 94 e 96 a 98, e/ou pelo menos uma histidina em qualquer uma das posições 12 a 17, 46, 47, 49, 50, 69 a 74 e 93 a 98, e/ou pelo menos uma asparagina em qualquer uma das posições 12 a 17, 45 a 47, 49, 50, 70 a 73, 75, 94 a 96 e 98, e/ou pelo menos uma metionina em qualquer uma das posições 12 a 17, 46 a 50, 69 a 71, 73 a 75, 93, 95, 96 e 98, e/ou pelo menos uma serina em qualquer uma das posições 13, 71, 75, 94, 95 e 98, e/ou pelo menos uma isoleucina em qualquer uma das posições 12, 14 a 17, 45 a 50, 69, 70, 72 a 75, 93 e 96 a 98, e/ou pelo menos uma fenilalanina em qualquer uma das posições 15, 46, 48, 70 a 73, 75, 93, 95 e 98, em que a numeração é de acordo com ο sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT).