BR112019015900A2

BR112019015900A2 - polipeptídeo, métodos para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo, para aumentar a atividade de cdc de um polipeptídeo e de tratamento de um indivíduo tendo uma doença, composição, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou uma composição

Info

Publication number: BR112019015900A2
Application number: BR112019015900A
Authority: BR
Inventors: Beurskens Frank; Overdijk Marije; M. DIKS Annieck; De Jong Rob; Strumane Kristin; Schuurman Janine; Parren Paul
Original assignee: Genmab B.V.
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2020-04-07
Also published as: MX2019009346A; EP3580233A1; NZ756224A; JP2024105709A; CA3053222A1; MA47449A; CN110945021A; AU2018218345A1; KR20240101717A; KR20190115057A; WO2018146317A1; US20200181277A1; JP2020506208A; SG11201906961UA; IL268593A; EA201991879A1

Abstract

são descritos aqui polipeptídeos e anticorpos tendo uma região fc e uma região de ligação a antígeno em que a região fc tem uma mutação intensificando fc-fc e uma mutação intensificando ligação c1q, provendo polipeptídeos ou anticorpos com atividade cdc e/ou atividade agonista aumentadas.

Description

POLIPEPTÍDEO, MÉTODOS PARA AUMENTAR A ATIVIDADE AGONÍSTICA DE UM POLIPEPTÍDEO, PARA AUMENTAR A ATIVIDADE DE CDC DE UM POLIPEPTÍDEO E DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO TENDO UMA DOENÇA, COMPOSIÇÃO, KIT DE PARTES, E, USO DE UM POLIPEPTÍDEO OU UMA COMPOSIÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos contendo região

Fe compreendendo uma região de ligação, tal como anticorpos, que têm pelo menos duas substituições de aminoácidos na região Fe comparados com um polipeptídeo ou anticorpo parental.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] As funções efetoras mediadas por Fe de anticorpos monoclonais, tais como citotoxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) contribuem para a janela terapêutica definida por eficácia e toxicidade. CDC é iniciada por ligação a Clq às regiões Fe de anticorpos. Clq é uma proteína multimérica consistindo em seis cabeças globulares de ligação fixadas a uma haste.

[003] A hexamerização de IgG quando da ligação ao alvo sobre a superfície da célula demonstrou ser intensificada por mutações de pontos na região Fe. A hexamerização é mediada através de interações Fc-Fc não covalentes intermoleculares, e interações Fc-Fc podem ser intensificadas por mutações de pontos no domínio CH3, incluindo E345R e E430G.

[004] WO2013/004842 descreve anticorpos ou polipeptídeos compreendendo regiões Fe variantes tendo uma ou mais modificações de aminoácido resultando em funções efetoras modificadas tal como citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[005] W02014/108198 descreve polipeptídeos tal como anticorpos

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2/194 compreendendo regiões Fe variantes tendo uma ou mais modificações de aminoácido resultando em citotoxicidade dependente de complemento aumentada (CDC).

[006] WO2016/164480 descreve complexos de ligação a antígeno tendo atividade agonística.

[007] As interações Fc-Fc intensificadas entre anticorpos podem ser usadas para amplificar o efeito do anticorpo ligando a seu alvo em uma superfície de célula. No entanto somente intensificar as interações Fc-Fc entre regiões Fe nem sempre é suficiente para criar um sinal forte o suficiente para ativar uma via de sinalização por, por exemplo, ligando a um receptor.

[008] Consequentemente, é um objeto da presente invenção fornecer um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma IgG humana e uma região de ligação a antígeno cujo polipeptídeo tem aumentadas interações Fc-Fc e atividade agonística tal como ativação aumentada de um receptor alvo quando da ligação, quando comparados com um polipeptídeo parental, onde o polipeptídeo parental é uma IgG humana do mesmo isotipo e tendo a mesma região de ligação a antígeno, mas sem quaisquer mutações na região Fe, isto é, um polipeptídeo parental ou anticorpo parental.

[009] E outro objeto da presente invenção fornecer um polipeptídeo que ativa sinalização, opcionalmente induz sinalização intensificada, quando a região de ligação a antígeno do polipeptídeo, por exemplo anticorpo, é ligada ao antígeno correspondente comparado com um polipeptídeo parental, em que o polipeptídeo parental não tem quaisquer mutações no região Fe.

[0010] E ainda outro objeto da presente invenção fornecer um polipeptídeo com propriedades intensificadas de interação Fc-Fc e funções efetoras intensificadas tal como CDC. E um objeto adicional da presente invenção fornecer um polipeptídeo com interações Fc-Fc intensificadas e propriedades intensificadas de ligação a Clq, quando comparados com um polipeptídeo parental sem quaisquer mutações na região Fe.

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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0011] Como aqui descrito, a presente invenção refere-se a polipeptídeos ou anticorpos tendo uma região Fe e uma região de ligação a antígeno onde a região Fe tem uma mutação intensificando Fc-Fc e uma mutação de ligação a Clq fornecendo polipeptídeos ou anticorpos com atividade de CDC e/ou atividade agonística aumentadas.

[0012] Sem ser limitado a teoria, acredita-se que os polipeptídeos ou anticorpos da invenção são capazes de uma interação de ligação estável entre as regiões Fe de duas moléculas de polipeptídeos ou anticorpos quando ligados ao alvo sobre uma superfície celular, que leva a uma oligomerização intensificada, tal como formação de hexâmeros, assim fornecendo uma superfície ávida. Os polipeptídeos ou anticorpos da invenção têm adicionalmente uma resposta de efetor de Fe aumentada comparado com seu polipeptídeo parental ou anticorpo parental sem quaisquer mutações na região Fe, isto é, um polipeptídeo parental ou anticorpo do mesmo isotipo.

[0013] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou um anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende

a) pelo menos uma substituição intensificando Fc-Fc em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) pelo menos uma substituição de ligação a Clq, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE - União Européia (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1969 Maio; 63(l):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a. ed.. 1991 Publicação NIH No. 91-3242).

[0014] Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fc compreende, a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em:

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4/194 substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[0015] Uma substituição em uma posição correspondendo à substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W é considerada uma substituição intensificando Fc-Fc, de acordo com a presente invenção.

[0016] Uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, é considerada uma substituição de ligação a Clq, de acordo com a presente invenção.

[0017] Isto é, os inventores da presente invenção em um primeiro aspecto da invenção verificaram que introduzir uma primeira mutação que intensifica interação Fc-Fc junto com uma segunda mutação que intensifica ligação a Clq para fornecer um polipeptideo ou anticorpo com atividade agonística e/ou CDC intensificada.

[0018] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptideo ou um anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende

a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[0019] Isto é, os inventores verificaram que uma mutação intensificando Fc-Fc junto com uma ou mais substituição(ões) de ligação a Clq em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396 podem proporcionar atividade agonística.

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5/194 [0020] Os inventores verificaram adicionalmente que uma mutação intensificando Fc-Fc junto com uma ou mais substituição(ões) de ligação a Clq em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396 pode proporcionar funções efetoras mediadas por Fc intensificadas, tal como CDC intensificada.

[0021] A combinação de uma mutação intensificando Fc-Fc e a substituição de ligação a Clq em um polipeptídeo ou anticorpo tem adicionalmente o efeito surpreendente de gerar um polipeptídeo ou anticorpo com propriedades agonísticas, quando comparado com um polipeptídeo parental ou um anticorpo parental.

[0022] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W e S440Y.

[0023] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T.

[0024] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y.

[0025] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição E430G. Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição E345K. Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição S440Y.

[0026] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões)

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6/194 selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396.

[0027] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em uma ou mais posições, tal como duas ou três posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326A, K326W, E333S, E333A e P396L.

[0028] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em uma ou mais posições, tal como duas ou três posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326A, K326W, E333S, E333A, E333T e P396L.

[0029] Em uma modalidade da presente invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W e E333S.

[0030] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma IgG humana e uma região de ligação a antígeno, cujo método compreende a) introduzir uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) introduzir substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[0031] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma IgG humana e uma região de ligação a antígeno, cujo método compreende a) introduzir uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) introduzir substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

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7/194 [0032] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo pelo menos um polipeptídeo ou anticorpo como aqui descrito.

[0033] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo, anticorpo ou uma composição, como aqui descrito, para uso como um medicamento.

[0034] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo, anticorpo ou uma composição, como aqui descrito, para uso no tratamento de câncer, doença autoimune, doença inflamatória ou doença infecciosa.

[0035] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratar um indivíduo tendo uma doença compreendendo administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo, um anticorpo ou composição, como aqui descrito.

[0036] Estes e outros aspectos da invenção, particularmente vários usos e aplicações terapêuticas para o polipeptídeo ou anticorpo, são descritos em detalhes adicionais abaixo.

Breve Descrição dos Desenhos [0037] Figura 1 mostra o efeito de E430G, K326A/E333A/P396L e K326A/E333A/P396L/E430G sobre a eficácia de anticorpos anti-DR5 IgGlhDR5-01-G56T (A), IgGl-hDR-05 (B) e a combinação de anticorpo (C) sobre células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo). Exemplos representativos de duas experiências são mostrados.

[0038] Figura 2 mostra a eficácia de um anticorpo anti-DR5 monovalente com K326A/E333A/P396L/E430G em células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes (A) e de cólon COLO 205 como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo). Como um anticorpo anti-DR5 monovalente, um anticorpo biespecífico com um braço

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8/194 específico DR5 derivado de IgGl-hDR5-01-G56T e um braço não específico contra proteína HIV gpl20 derivado de IgGl-bl2 foi gerado por troca de Fabbraço controlada. Exemplos representativos destas experiências são mostrados.

[0039] Figura 3 mostra o efeito de E430G combinado com K326A/E333A/P396L ou duas dessas substituições E333A/P396L, K326A/E333A ou K326A /P396L, sobre a eficácia de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T em células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes (A) e câncer de cólon COLO 205 (B), como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo), e em ligação a Clq como determinado em um teste ELISA (C). Exemplos representativos destas experiências são mostrados.

[0040] Figura 4 mostra o efeito de E430G combinado com K326A/E333A ou K326W/E333S em Clq ligando a anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W como determinado em um teste ELISA (A) e sobre a eficácia de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T em células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes (B) e de câncer de cólon COLO 205 (C) como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo). Exemplos representativos destas experiências são mostrados.

[0041] Figura 5 mostra o efeito de E430G combinado com substituições de ligação a Clq S267E/H268F/S324T ou a variante 113F de IgGl de isotipo quimérico IgGl/IgG3 em Clq ligando a anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T como determinado em um teste ELISA (A) e sobre a eficácia de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T em células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes (B) e de cólon COLO 205 (C) como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo). Exemplos representativos destas experiências são mostrados.

[0042] Figura 6 mostra um sumário de testes de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo) sobre células de câncer pancreático BxPC-3 humanas

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9/194 aderentes com 10 pg/mL de variantes IgGl-hDR5-01-G56T contendo as mutações indicadas. O efeito é representado e classificado pelas células viáveis percentuais com relação a WT IgGl-hDR5-01-G56T, que foi definido a 100%. Os efeitos significantes sobre a viabilidade celular comparado com WT são indicados como *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 (ANOVA uma via com teste de comparações múltiplas de Dunnett).

[0043] Figura 7 mostra o efeito agonístico de anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W-K326A/E333A/P396L/E430G (A) e IgGl-hDR5-01G56T-K326W/E333S/E430G (B) em células em suspensão WIL2-S SF em meio isento de soro na presença ou ausência de 2,5 pg/mL Clq humana purificada como determinado em um teste de viabilidade de 24 horas. A porcentagem de células viáveis é representada pela porcentagem de células negativas para TO-PRO-3.

[0044] Figura 8 mostra o efeito agonístico de 2,5 pg/mL variantes de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T com E430G uma substituição intensificando Fc-Fc em combinação com substituições de ligação a Clq (A) e a combinação de anticorpos IgGl-hDR5-01-G56T-E430G + IgGl-hDR505-E430G (B) em células em suspensão em WIL2-S SF em meio isento de soro na presença ou ausência de uma série de concentrações de Clq humana purificada como determinado em um teste de viabilidade de 24 horas. As células viáveis percentuais são representadas pela porcentagem de células negativas para TO-PRO-3. Dados de quatro diferentes experiências são representados com barras de erro indicando o desvio padrão.

[0045] Figura 9 mostra a eficácia de 2,5 pg/mL de anti-DR5 IgGlhDR5-01-G56T-K326W/E333S/E430G (A) agonístico e a combinação de anticorpos IgGl-hDR5-01-G56T-E430G + IgGl-hDR5-05-E430G (B) em células em suspensão em WIL2-S SF em meio isento de soro com ou sem Clq humana purificada e anticorpo neutralizante anti-CIq como determinado em um teste de viabilidade de 24 horas. As células viáveis percentuais são

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10/194 representadas pela porcentagem de células negativas para TO-PRO-3.

[0046] Figura 10 mostra ativação de complemento em fase de solução como medido por quantificação de deposição de C4d quando amostras de anticorpos foram incubadas em NHS para variantes de anticorpos IgGlhDR5-01-G56T contendo as substituições 430G intensificando Fc-Fc em combinação com substituições de ligação a Clq K326W/E333S, K326A/E333A ou K326A/E333A/P396L. HAGG (gama globulina agregada com calor) e IgGl-CONA-RGY foram testados como controles positivos para ativação de complemento em fase de solução.

[0047] Figura 11 mostra o efeito de introduzir as substituições K326W, E333S, ou K326W/E333S em IgG-CONA-C49W e IgGl-CONAC49W-E430G em ligação a Clq, como determinado em um teste ELISA (A,B), Clq ligando aos anticorpos ligados a células WIL2-S SF positivas para DR5, como determinado por citometria de fluxo (C,D), e sobre a redução de viabilidade celular de células em suspensão WIL2-S SF como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo) (E,F,G). Desvios padrão foram calculados a partir de duas independentes experiências.

[0048] Figura 12 mostra o efeito de introduzir as substituições K326W, E333S, ou K326W/E333S em IgG-CONA-C49W e IgGl-CONAC49W-E430G (2,5 pg/mL) sobre a viabilidade de células em suspensão WIL2-S SF em meio isento de soro na presença de uma série de concentrações de Clq humana purificada, como determinado em teste de viabilidade de 24 horas. As células viáveis percentuais foram determinadas em um teste CellTiter-Glo.

[0049] Figura 13 mostra o efeito de adicionar um anticorpo anti-C Iq sobre a eficácia de variantes de anticorpos anti-DR5 IgGl-CONA-C49W com mutações intensificando a ligação a Clq e/ou intensificando a interação Fc-Fc em um teste de viabilidade de 24 horas em células em suspensão em WIL2-S SF em meio isento de soro suplementado com Clq humana purificada. As

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11/194 células viáveis percentuais foram determinadas em um teste CellTiter-Glo. [0050] Figura 14 mostra o efeito de adicionar um peptideo que inibe interações Fc-Fc entre variantes de anticorpos anti-DR5 IgGl-CONA-C49W opsonizados em células em suspensão WIL2-S SF, incubadas em meio isento de soro suplementado com Clq humana purificada, em teste de viabilidade de 24 horas. As células viáveis percentuais foram determinadas em um teste CellTiter-Glo. Peptideo embaralhado WCDLEGVTWHACL foi usado como um peptideo de controle não específico.

[0051] Figura 15 mostra o efeito de combinar as substituições de ligação a Clq K326W/E333S com as mutações intensificando Fc-Fc E345K, E345R, ou S440Y sobre a atividade agonista de anticorpo anti-DR5 IgGlCONA-C49W sobre células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes, como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiterGlo).

[0052] Figura 16 mostra o efeito de mutação E430G, combinado com mutações intensificando a ligação a Clq S267E/H268F/S324T ou uma variante 113F de IgGl isotipo quimérico IgGl/IgG3, introduzida em anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W, sobre a viabilidade de células de câncer pancreático BxPC-3 aderentes humanas, como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo).

[0053] Figura 17 mostra o efeito de anticorpo funcionalmente monovalente anti-DR5 com mutações K326W/E333S/E430G sobre a viabilidade de células em suspensão WIL2-S SF como determinado em um teste de viabilidade de um dia (CellTiter-Glo). O anticorpo funcionalmente monovalente anti-DR5 foi gerado como um anticorpo biespecífico, por troca de Fab-braço controlada de IgGl-CONA-C49W-F405LK326W/E333S/E430G (braço específico de DR5) e IgGl-bl2-K409RK326W/E333S/E430G (braço não específico, dirigido contra proteína HIV gpl20). RLU: unidades de luminescência relativa.

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12/194 [0054] Figura 18 mostra o efeito de introduzir as substituições K326W/E333S/E430G sobre a atividade agonista de variantes de isotipo IgGl e IgG3 de um anticorpo anti-DR5 (IgGl-CONA-C49W e IgG3-CONAC49W-R345H) como determinado em um teste de viabilidade de 1 dias sobre as células WIL2-S SF (A) e teste de viabilidades de 3 dias sobre as células BxPC-3 (B), HPAF-II (C) e HT-29 (D). Viabilidade foi determinada usando o kit CellTiter-Glo.

[0055] Figura 19 mostra o efeito de introduzir ambas a mutação intensificando a hexamerização de E430G e as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333T ou K326W/E333S em anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W em células em suspensão WIL2-S, como determinado em um teste de viabilidade de 24 horas (CellTiterGlo).

[0056] Figura 20 mostra a taxa de depuração de 450 pg de anticorpo administrado i.v. em camundongos SCID. (A) IgG humana total em amostras de soro foi determinada por ELISA e traçado em gráfico em uma curva de concentração versus tempo. Cada ponto de dados representa o desvio padrão médio +/- de amostras em triplicata. (B) Depuração após o dia 21 após administração do anticorpo foi determinada seguindo a fórmula D*l,000/AUC com D, dose injetada e AUC, área sob a curva da curva de concentração-tempo. Um exemplo representativo das duas experiências ELISA independentes é mostrado.

[0057] Figura 21 mostra o efeito da mutação intensificando Fc-Fc E430G em combinação com as mutações intensificando a ligação a Clq (K326A/E333A ou K326W/E333S) sobre a ligação de variantes de anticorpos IgGl-7D8 a FcRn humano, como determinado por um ELISA com FcRnECDHis-B2M-BIO revestido a pH 6,0 e 7,4. IgGl-7D8I235A/H310A/H435A foi usado como um controle negativo para ligação a FcRn a pH 6,0 (knockout FcRn); IgGl-7D8-M252Y/S254I7T256E foi usado como um controle para a ligação intensificada a FcRn a pH 7,4.

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13/194 [0058] Figura 22 mostra um teste ADCC de liberação de cromo usando WIL2-S SF como células alvo e PBMCs humanos (3 doadores) como células efetoras (razão E:T 100:1) em meio isento de soro com e sem a adição de Clq humana purificada. Na ausência e presença de Clq, células WIL2-S SF marcadas com cromo foram incubadas com série de concentração de anticorpo para comparar a atividade de ADCC de IgGl-7D8-F405LK326W/E333S/E430G com a de IgGl-7D8-E430G e WT IgGl-7D8. O anticorpo IgGl-bl2 não específico foi usado como controle negativo.

[0059] Figura 23 mostra o efeito de K326W/E333S/E430G sobre a atividade agonística dos anticorpos anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T e IgGlhDR5-05 em células em suspensão em WIL2-S SF como determinado em um teste de viabilidade de 24 horas (CellTiterGlo).

[0060] Figura 24 mostra o efeito do par de mutação Fe complementar K439E; S440K sobre a atividade agonística de um epítopo dual anti-DR5 alvejando a combinação de anticorpo IgGl-hDR5-01-G56TK326W/E333S/E430G + IgGl-hDR5-05-K326W/E333S/E430G em células em suspensão em WIL2-S SF como determinado em um teste de viabilidade de 24 horas (CellTiterGlo).

[0061] Figura 25 mostra os resultados de um teste CDC em células Wien 133 testando as variantes de anticorpos IgGl-Campath com as mutações intensificando a hexamerização E430G ou K248E/T437R, e as mutações intensificando a hexamerização K248E/T437R combinadas com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S. As células Wien 133 foram incubadas com séries de concentrações dos variantes de anticorpos na presença de soro humano normal reunido a 20% (NHS).

[0062] Figura 26 mostra o efeito de combinar a mutação intensificando a hexamerização E430G e as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S sobre a eficácia de anticorpo anti-DR4 IgGl-DR4chCTB007 sobre células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes

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14/194 como determinado em um teste de viabilidade de 3 dias (CellTiter-Glo).

[0063] Figura 27 mostra um teste CDC usando linfócitos B humanos WIL2S SF com variantes de anticorpos anti-FAS IgGl-FAS-E09 (A), IgGlCD95-APO1 (B) e IgGl-CD95-HFE7A (C) na presença de soro humano normal a 20%. As células WIL2-S SF foram incubadas durante 45 minutos com séries de concentrações dos variantes de anticorpos na presença de soro humano normal reunido a 20% (NHS). IgGl-bl2 foi usado como um anticorpo de controle de não ligação.

[0064] Figura 28 mostra a teste de viabilidade de 45 minutos (CellTiter-Glo) usando células WIL2-S SF incubadas com variantes de anticorpos anti-FAS IgGl-FAS-E09 (A), IgGl-CD95-AP01 (B) e IgGlCD95-HFE7A (C) em meio isento de soro sem Clq.

[0065] Figura 29 mostra teste de viabilidade de 24 horas (CellTiterGlo) usando células WIL2-S SF com variantes de anticorpos anti-FAS IgGlFAS-E09 (A), IgGl-CD95-AP01 (B) e IgGl-CD95-HFE7A (C) em meio isento de soro com Clq como reticulador.

[0066] Figura 30 mostra teste de viabilidade de 24 horas (CellTiterGlo) usando células WIL2-S SF incubadas com variantes de anticorpos antiFAS IgGl-FAS-E09 (A), IgGl-CD95-AP01 (B) e IgGl-CD95-HFE7A (C) em meio isento de soro sem Clq.

[0067] Figura 31 mostra a atividade de anticorpos de IgGl-CD134SF2 (WT), IgGl-CD134-SF2-E345R, IgGl-CD134-SF2-E430G e IgGlCD134-SF2-K326W/E333S/E430G em um teste repórter 0X40 Jurkat. Células tipo Thaw-and-Use GloResponse NFkB-1uc2/OX40 Jurkat foram incubadas durante 5 horas com uma faixa de concentração de anticorpo na presença de soro bovino fetal a 8%. Respostas de teste 0X40 foram registradas por detectada após estimulação de 0X40 por anticorpos anti0X40 que induzem a expressão de um gene repórter luciferase. RLU: Unidades de luminescência relativa.

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15/194 [0068] Figura 32 mostra o efeito de mutação intensificando Fc-Fc E430G combinado com mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S na resposta de CD40 de IgGl-CD40-SGN40 e IgGl-CD40CP870893. Células tipo Thaw-and-Use GloResponse NFkB-1uc2/CD40 Jurkat foram incubadas durante 5 horas com uma faixa de concentração de anticorpo na presença de soro bovino fetal a 8%. As respostas do teste CD40 foram registradas por luminescência detectada após estimulação de CD40 por anticorpos anti-CD40 ou ligando CD40, que induzem a expressão de um gene repórter luciferase. RLU: Unidades de luminescência relativa.

[0069] Figura 33 mostra o efeito de mutação intensificando Fc-Fc E430G combinado com mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S em resposta de 4-1BB de IgGl-CD137-MOR7480 e IgGlBMS-663513. Células tipo Thaw-and-Use GloResponseTM NFkB-1uc2/41BB Jurkat foram incubadas durante 5 horas com uma faixa de concentração de anticorpo na presença de 1% soro bovino fetal. As respostas do teste de 41BB foram registradas por luminescência detectada após estimulação de 41BB por anticorpos anti-4-ΙΒΒ ou ligando 4-1 BB com anticorpo anti-His, que induzem a expressão de um gene repórter luciferase. IgG-bl2K326W/E333S/E430G foi usado como controle negativo. RLU: Unidades de luminescência relativa.

[0070] Figura 34 mostra o efeito de mutação intensificando Fc-Fc E430G combinado com mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S sobre a resposta de GITR de IgGl-GITR-INCAGN01876. Células tipo Thaw-and-Use GloResponse NFkB-1uc2/GITR Jurkat foram incubadas durante 6 horas com uma faixa de concentração de anticorpos na presença de soro bovino fetal a 1%. As respostas do teste GITR foram registradas por luminescência detectada após estimulação de GITR por anticorpos anti-GITR, que induzem a expressão de um gene repórter luciferase. RLU: Unidades de luminescência relativa

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16/194 [0071] Figura 35 mostra o efeito de mutação intensificando Fc-Fc E430G combinado com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S sobre a resposta de GITR de anticorpo GITR-36E5 em subclasses IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Células tipo Thaw-and-Use GloResponse NFkB-1uc2/GITR Jurkat foram incubadas durante 6 horas com uma concentração final de 111 ng/mL de anticorpo na presença de soro bovino fetal a 1%. As respostas do teste GITR foram registradas por luminescência detectada após estimulação de GITR por anticorpos anti-GITR, que induzem a expressão de um gene repórter luciferase. Anticorpo de IgGlbl2 foi usado como um controle de não ligação. RLU: Unidades de luminescência relativa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0072] Ao descrever as modalidades da invenção, terminologia específica será apresentada por questões de clareza. No entanto, a invenção não é destinada a ser limitada pelos termos específicos assim selecionados, e deve ser entendido que cada termo específico inclui todos os equivalentes técnicos que operam em um modo similar para alcançar uma finalidade similar.

Definições [0073] O termo “polipeptídeo parental” ou “anticorpo parental”, deve ser entendido como um polipeptídeo ou anticorpo, que é idêntico a um polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a invenção, mas onde o polipeptídeo parental ou anticorpo parental não tem uma mutação intensificando Fc-Fc e uma mutação de ligação a Clq de acordo com a presente invenção.

[0074] O termo “polipeptídeo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação” refere-se, no contexto da presente invenção, a um polipeptídeo que compreende uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação que é uma capaz de se ligar a qualquer molécula, tal como um polipeptídeo, por exemplo presente em uma

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17/194 célula, bactéria, ou virion. A região Fe de uma imunoglobulina é definida como o fragmento de um anticorpo que seria tipicamente gerado após a digestão de um anticorpo com papaína (que é conhecidas por alguns especialistas na técnica) que inclui as duas regiões CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma região de conexão, por exemplo a região de dobradiça. O domínio constante de uma cadeia pesada de anticorpo define o isotipo de anticorpo, por exemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD, ou IgE. O região Fe media as funções efetoras de anticorpos com receptores de superfície celular chamados receptores Fe e proteínas do sistema de complementos. A O região de ligação pode ser uma sequência de polipeptídeos, tal como uma proteína, ligando de proteína, receptor, uma região de ligação a antígeno, ou um ligando-região de ligação capaz de ligar a uma célula, bactéria ou virion. Se a região de ligação é, por exemplo, um receptor, o “polipeptideo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação” pode ter sido preparado como uma proteína de fusão região Fe de uma imunoglobulina e dita região de ligação. Se a região de ligação é uma região de ligação a antígeno, o “polipeptideo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação” pode ser um anticorpo, como um anticorpo quimérico, humanizado ou humano ou um anticorpo somente de cadeia pesada ou uma fusão ScFv-Fc. O polipeptideo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação pode tipicamente compreender uma região de conexão, por exemplo uma região de dobradiça, e duas regiões CH2-CH3 da cadeia pesada de uma imunoglobulina, assim, o “polipeptideo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação” pode ser um “polipeptideo compreendendo pelo menos uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação”. O termo “região Fe de uma imunoglobulina” significa, no contexto da presente invenção, que uma região de conexão, por exemplo dobradiça dependendo do subtipo de anticorpo, e

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18/194 uma região CH2 e CH3 de uma imunoglobulina estão presentes, por exemplo, uma IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgAl, IgGA2, IgM, ou IgE humana. O polipeptídeo não é limitado a origem humana, mas pode ter qualquer origem, tal como, por exemplo, origem de camundongo ou cinomolgo. O termo “região Fc de tipo selvagem” significa, no contexto da presente invenção, uma região Fc de imunoglobulina com uma sequência de aminoácido como ela ocorre na natureza.

[0075] O termo “região de dobradiça” como usado aqui é destinado a fazer referência à região de dobradiça de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, por exemplo, a região de dobradiça de um anticorpo de IgGl humana corresponde a aminoácidos 216-230 de acordo com a numeração da UE.

[0076] O termo região CH2” ou “domínio CH2” como usado aqui é destinado a fazer referência à região CH2 de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, por exemplo, a região CH2 de um anticorpo de IgGl humana corresponde aos aminoácidos 231-340 de acordo com a numeração da UE. No entanto, a região CH2 também pode ser qualquer uma de outros subtipos, como aqui descrito.

[0077] O termo “região CH3” ou “domínio CH3” como usado aqui é destinado a fazer referência à região CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, por exemplo, a região CH3 de um anticorpo de IgGl humana corresponde aos aminoácidos 341-447 de acordo com a numeração da UE. No entanto, a região CH3 também pode ser qualquer uma de outros subtipos, como aqui descrito.

[0078] O termo “imunoglobulina” refere-se a uma classe de estruturalmente relacionadas consistindo em dois pares de cadeias de polipeptídeo de glicoproteínas, um par de cadeias leves (L) de baixo peso molecular e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro potencialmente interconectadas por ligações dissulfeto. A estrutura de imunoglobulinas foi

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19/194 bem caracterizado. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2^a. ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Brevemente, cada cadeia pesada tipicamente é constituída de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada tipicamente é constituída de três domínios, CHI, CH2, e CH3. As cadeias pesadas são interconectadas via ligações dissulfeto na assim chamada “região de dobradiça”. Cada cadeia leve tipicamente é constituída de uma região variável de cadeia leve (abreviado aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve tipicamente é constituída de um domínio, CL. As regiões de VH e VL podem ser subdivididas adicionalmente em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis em sequência e/ou formadas de alças estruturalmente definidas), também chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), interdispersas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de arcabouço (FRs). Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do aminotérmino para o carbóxi-térmico na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)). Salvo de outro modo especificado ou contradito pelo contexto, as sequências de CDR são aqui identificadas de acordo com as regras de IMGT usando DomínioGapAlign (Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212 e Ehrenmann F., Kaas Q. e Lefranc M.-P. Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010); ver também o endereço http na internet www.imgt.org/. Salvo de outro modo especificado ou contradito pelo contexto, referência a posições de aminoácido no domínio da região Fc/Fc na presente invenção está de acordo com a numeração da UE (Edelman et al., Proc Natl Acad Sei USA. 1969 May;63(l):78-85; Kabat et al., Sequences of proteínas of immunological interest. 5^a. ed. - 1991 NIH Publication No. 913242).

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20/194 [0079] O termo “anticorpo” (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, ou um derivado de um dos mesmos, que tem a capacidade de especificamente se ligar a um antígeno. O anticorpo da presente invenção compreende um domínio Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno. Um anticorpo geralmente contém duas regiões CH2-CH3 e uma região de conexão, por exemplo, a região de dobradiça, por exemplo, pelo menos um domínio Fe. Assim, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma região Fe e uma região de ligação a antígeno. As regiões variáveis de cadeias pesada e leve de uma molécula de imunoglobulina contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes ou “Fe” dos anticorpos pode mediar a ligação de uma imunoglobulina para hospedar tecidos ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (como células efetoras) e componentes do sistema de complemento, tal como Clq, o primeiro componente na via clássica de ativação de complemento. Um anticorpo também pode ser anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico ou molécula similar. O termo “anticorpo biespecífico” refere-se a um anticorpo tendo especificidades para pelo menos dois diferentes epítopos, tipicamente de não sobreposição. Tais epítopos podem estar no mesmo ou em diferentes alvos. Se os epítopos estão em diferentes alvos, tais alvos podem estar na mesma ou em diferentes células ou tipos de células. Como indicado acima, salvo de outra forma descrito ou claramente contradito pelo termo, o termo anticorpo aqui inclui fragmentos de um anticorpo que compreendem pelo menos uma porção de uma região Fe e que retém a capacidade para especificamente ligar ao antígeno. Tais fragmentos podem ser providos por qualquer técnica conhecida, tal como clivagem enzimática, síntese de peptídeo e técnicas de expressão recombinante. Foi demonstrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 27/257 / 194 comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo “Ab” ou “anticorpo” incluem, sem limitação, anticorpos monovalentes (descritos em W02007059782 por Genmab); anticorpos de cadeia pesada, consistindo somente de duas cadeias pesadas e naturalmente ocorrendo em, por exemplo, camelídeos (por exemplo, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), domínios engenheirados por troca de fita (SEED ou Seed-body) que são assimétricos e moléculas de tipo anticorpo biespecífico (Merck, W02007110205); Triomab (Pharma/Fresenius Biotech, Lindhofer et al. 1995 J Immunol 155:219; W02002020039); FcAAdp (Regeneron, W02010151792), andaime “Azymetric” (Zymeworks/Merck, WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011/028952), Xmab (Xencor), imunoglobulina de domínio variável dual (Abbott, DVD-Ig, Patente US No. 7,612,181); anticorpos de cabeça dupla domino duplo (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Di-diacorpo (ImClone/Eli Lilly), formatos de anticorpo nós-em-furos (Genentech, WO9850431); DuoCorpo (Genmab, WO 2011/131746); IgGl e IgG2 Biespecificas (Pfizer/ Rinat, WO11143545), DuetMab (Medlmmune, US2014/0348839), formatos de anticorpo de direção eletrostática (Amgen, EP1870459 e WO 2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, W02010129304A2); IgGl e IgG2 biespecificas (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAbs (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus, WO2013157953), anticorpos de domínio de alvejamento dual (GSK/Domantis), Anticorpos dois-em-um ou Fabs de ação dual reconhecendo dois alvos (Genentech, Novlmmune, Adimab), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), mAbs covalentmente fundidos (AIMM), CovX-body (CovX/Pfizer), FynomAbs (Covagen/Janssen ilag), DutaMab (Dutalys/Roche), iMab (Medlmmune), tipo IgG biespecífico (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 6574), TIG-corpo, DIG-corpo e PIG-corpo (Pharmabcine), moléculas de re

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22/194 alvejamento de afinidade dual (Fc-DART ou Ig-DART, por Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538), BEAT (Glenmark), Zybodies (Zyngenia), abordagens com cadeia leve comum (Crucell/ Merus, US7262028) ou cadeia pesada comum (KÀBodies por Novlmmune, WO2012023053), assim como proteínas de fusão compreendendo uma sequência de polipeptideo fusionada a um fragmento de anticorpo contendo uma região Fe como fusões scFv-, como BsAb por ZymoGenetics/BMS, HERCULES por Biogen Idee (US007951918), SCORPIONS por Emergent BioSolutions/Trubion e Zymogenetics/BMS, Ts2Ab (Medlmmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), fusão de scFv por Genetech/Roche, fusão de scFv por Novartis, fusão de scFv por Immunomedics, fusão de scFv por Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb por Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb²por f-Star (W02008/003116), e fusões duais de scFv. Também deve ser entendido que o termo anticorpo, salvo especificado ao contrário, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (tal como anticorpos monoclonais humanos), misturas de anticorpos (recombinantes policlonais) por exemplo, gerados por tecnologias exploradas por Symphogen e Merus (Oligoclonics), proteínas Fe multiméricas, como descrito em WO2015/158867, proteínas de fusão como descrito em WO2014/031646 e polipeptídeos tipo anticorpo, tal como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo como gerado pode potencialmente possuir qualquer isotipo.

[0080] O termo “anticorpo de comprimento completo” quando usado aqui, refere-se a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo parental) que contém todos os domínios variáveis e constantes de cadeia pesada e leve correspondendo aos que são normalmente encontrados em um anticorpo de tipo selvagem deste isotipo.

[0081] O termo “anticorpo humano”, como usado aqui, é destinado a

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 29/257 / 194 incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinal humana (por exemplo, mutações, inserções ou deleções introduzidas por mutagenese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo “anticorpo humano”, como usado aqui, não é destinado a incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linhagem germinal de outra espécie de mamífero, como um camundongo, foi enxertada sobre as sequências de arcabouço humanas.

[0082] O termo “anticorpo quimérico”, como usado aqui, refere-se a um anticorpo em que ambos os tipos de cadeia, isto é, cadeia pesada e cade3ia leve, são quiméricos como um resultado da engenharia do anticorpo. Uma cadeia quimérica é uma cadeia que contém um domínio variável estrangeiro (originado de uma espécie não humana, ou sintético ou modificado por engenharia genética de qualquer espécie, inclusive humana), ligado a uma região constante de origem humana.

[0083] O termo “anticorpo humanizado”, como aqui usado, refere-se a um anticorpo em que ambos os tipos de cadeia são humanizados como resultado da engenharia de anticorpos. Uma cadeia humanizada é tipicamente uma cadeia em que as regiões determinantes de complementaridade (CDR) dos domínios variáveis são estrangeiras (originárias de uma espécie diferente de humana, ou sintética) enquanto que o restante da cadeia é de origem humana. A avaliação da humanização baseia-se na sequência de aminoácidos resultante, e não na metodologia em si, que permite o uso de outros protocolos além do enxerto.

[0084] Os termos “anticorpo monoclonal”, “Ab monoclonal”, “composição de anticorpo monoclonal”, “mAb” ou semelhantes, como aqui usados, referem-se a uma preparação de moléculas de Ab de composição

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24/194 molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade e afinidade de ligação única para um epitopo particular. Por conseguinte, o termo “anticorpo monoclonal humano” refere-se a Abs apresentando uma especificidade de ligação única que possui regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os mAbs humanos podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgênico ou transcromossômico não humano, tal como um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um repertório de transgene de cadeia pesada humana e um repertório de transgene de cadeia leve, rearranjado para produzir um anticorpo humano funcional e fundido a uma célula imortalizada.

[0085] O termo “isotipo” como usado aqui, refere-se a uma classe de imunoglobulina (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgAl, IgGA2, IgE, ou IgM ou quaisquer alotipos derivados das mesmas, como como IgGlm(za) e IgGlm(f)) que é codificado pelos genes da região constante da cadeia pesada. Além disso, cada isotipo da cadeia pesada pode ser combinado com uma cadeia leve kappa (κ) ou lambda (λ). O termo “isotipo misto” aqui usado refere-se à região Fe de uma imunoglobulina gerada pela combinação de características estruturais de um isotipo com a região análoga de outro isotipo gerando assim um isotipo híbrido. Um isotipo misto pode compreender uma região Fe tendo uma sequência composta por dois ou mais isotipos selecionados dentre os seguintes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgAl, IgGA2, IgE, ou IgM, assim gerando combinações tal como, por exemplo, IgGl/IgG3, IgGl/IgG4, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4 ou IgGl/IgA.

[0086] O termo “região de ligação a antígeno”, “região de ligação a antígeno”, “região de ligação” ou domínio de ligação a antígeno, como usado aqui, refere-se a uma região de um anticorpo que é capaz de ligar ao antígeno. Esta região de ligação é tipicamente definida pelos domínios VH e VL do anticorpo que podem ser adicionalmente subdivididos em regiões de

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 31/257 / 194 hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis em sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas), também chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), interdispersas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de arcabouço (FRs). O antígeno pode ser qualquer molécula, tal como um polipeptideo, por exemplo presente em uma célula, bactéria ou vírion.

[0087] O termo “alvo”, como usado aqui, refere-se a uma molécula à qual a região de ligação a antígeno do anticorpo se liga. O alvo inclui qualquer antígeno para o qual o anticorpo criado é dirigido. O termo “antígeno” e “alvo” podem ser usados, em relação a um anticorpo, modo interpermutável e constituem o mesmo significado e finalidade com relação a qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção.

[0088] O termo “epítopo” significa um determinante de proteína capaz de ligação específica a um domino variável de anticorpo. Os epítopos geralmente consistem em agrupamentos de superfície de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar ou uma combinação dos mesmos, e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epitopos conformacionais e não conformacionais distinguem-se em que ligação ao primeiro mas não ao último pode ser perdida na presença de solventes desnaturantes. O epítopo pode compreender resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos na ligação (também denominado componente imunodominante do epítopo) e outros resíduos de aminoácidos, que não estão diretamente envolvidos na ligação.

[0089] Um “anticorpo” ou “variante de anticorpo” ou “variante de um anticorpo parental” da presente invenção é uma molécula de anticorpo que compreende uma ou mais mutações como comparado com um “anticorpo parental”. Os termos diferentes podem ser usados de modo interpermutável e constituem o mesmo significado e finalidade com relação a qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção. Os formatos exemplares de anticorpo

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26/194 parental incluem, sem limitação, um anticorpo tipo selvagem, um anticorpo de comprimento completo ou fragmento de anticorpo contendo Fe, um anticorpo biespecífico, um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico ou qualquer combinação dos mesmos. Similarmente, um “polipeptídeo” ou “uma variante de um polipeptídeo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação” ou “uma variante de um polipeptídeo parental compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação” da presente invenção é um “polipeptídeo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação”, que compreende uma ou mais mutações como comparadas com um “polipeptídeo parental compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação”. Os termos diferentes podem ser usados de modo interpermutável e constituem o mesmo significado e finalidade com relação a qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção. As substituições de aminoácidos podem trocar um aminoácido nativo por outro aminoácido de ocorrência natural, ou por um derivado de aminoácido não de ocorrência natural. A substituição de aminoácido pode ser conservativa ou não conservativa. No contexto da presente invenção, substituições conservativas podem ser definidas por substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas em uma ou mais das seguintes três tabelas: Classes de resíduos de aminoácidos para substituições conservativas

Resíduos ácidos	Asp (D) e Glu (E)
Resíduos básicos	Lys (K), Arg (R) e His (H)
Resíduos não carregados hidrofílicos	Ser (S), Thr (T), Asn (N) e Gin (Q)
Resíduos não carregados alifáticos	Gly (G), Ala (A), Vai (V), Leu (L) e He (I)
Resíduos não carregados não polares	Cys (C), Met (M) e Pro (P)
Resíduos aromáticos	Phe (F), Tyr (Y) e Trp (W)

Classes de substituição de resíduos de aminoácidos conservativas alternativas

1	A	s	T
2	D	E
3	N	Q
4	R	K
5	I	L	M
6	F	Y	W

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Classificações alternativas físicas e funcionais de resíduos de aminoácidos

Resíduos contendo grupo álcool	SeT
Resíduos alifáticos	I, L, V e M
Resíduos associados com cicloalquenila	F, H, W e Y
Resíduos hidrofóbicos	A, C, F, G, Η, I, L, M, R, T, V, W e Y
Resíduos negativamente carregados	DeE
Resíduos polares	C, D, E, Η, K, N, Q, R, S e T
Resíduos positivamente carregados	H, KeR
Resíduos pequenos	A, C, D, G, N, P, S, T e V
Resíduos muito pequenos	A, GeS
Resíduos envolvidos em formação de turnos	A, C, D, E, G, Η, K, N, Q, R, S, P e T
Resíduos flexíveis	Q, T, K, S, G, N, D, E e R

[0090] No contexto da presente invenção, uma substituição em uma variante é indicada como:

aminoácido original - posição - aminoácido substituído;

O código de três letras, ou um código de letra, são usados, incluindo os códigos Xaa e X para indicar o resíduo de aminoácido. Por conseguinte, a notação “E345R” ou “Glu345Arg” significa que a variante compreende uma substituição do ácido glutâmico por arginina na posição de aminoácido variante correspondente ao aminoácido na posição 345 no anticorpo parental.

[0091] Quando uma posição como tal não está presente em um anticorpo, mas a variante compreende uma inserção de um aminoácido, por exemplo:

Posição - aminoácido substituído; a notação, por exemplo, “448E” é usada.

[0092] Tal notação é particularmente relevante em conexão com modificação(ões) em uma série de polipeptídeos ou anticorpos homólogos.

[0093] Similarmente, quando a identidade do(s) resíduo(s) de aminoácidos de substituição é imaterial:

aminoácido original - posição; ou Έ345”.

[0094] Para uma modificação onde o(s) aminoácido(s) original(ais) e/ou aminoácido(s) substituído(s) pode(m) compreender mas do que um, mas não todos o(s) aminoácido(s), a substituição de ácido glutâmico por Arginina, Lisina ou Triptofano em posição 345:

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 34/257 / 194 “Glu345Arg, Lys,Trp” ou “E345R,K,W” ou “E345R/K/W” ou Έ345 a R, K ou W” podem ser usados de modo interpermutável no contexto da invenção.

[0095] Além do mais, o termo “uma substituição” engloga uma substituição em qualquer um dos outros dezenove aminoácidos naturais, ou em outros aminoácidos, tal como aminoácidos não naturais. Por exemplo, uma substituição de aminoácido E em posição 345 inclui cada uma das seguintes substituições: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 3451, 345K, 345L, 345M, 345N, 345P, 345Q, 345R, 345S, 345T, 345V, 345W, e 345Y. Isto é equivalente à designação 345X, em que ο X designa qualquer aminoácido. Estas substituições também podem ser designadas E345A, E345C, etc, ou E345A,C, etc, ou E345A/C/etc. O mesmo se aplica à analogia para cada e única posição mencionada aqui, para especificamente incluir qualquer uma de tais substituições.

[0096] Como aqui usado, o termo “célula efetora” refere-se a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, em oposição às fases de reconhecimento e ativação de uma resposta imune. Exemplos de células imunes incluem uma célula de origem mielóide ou linfóide, por exemplo linfócitos (tais como células B e células T incluindo células T citolíticas (CTLs)), células assassinas, células assassinas naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tais como neutrófilos, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células efetoras expressam receptores Fe (FcRs) ou receptores de complemento e realizam funções imunes específicas. Em algumas modalidades, uma célula efetora, tal como, por exemplo, uma célula assassina natural, é capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, e células de Kupffer que expressam FcR, estão envolvidos na morte específica de células alvo e apresentam antígenos a outros componentes do sistema imune, ou ligação a células que apresentam antígenos. Em algumas

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 35/257 / 194 modalidades, o ADCC pode ser ainda aumentado por ativação clássica do complemento dirigida por anticorpo, resultando na deposição de fragmentos C3 ativados na célula alvo. Produtos de clivagem C3 são ligandos para complementar receptores (CRs), como o CR3, expressos em células mieloides. O reconhecimento de fragmentos do complemento por CRs em células efetoras pode promover um ADCC intensificado mediado pelo receptor Fc. Em algumas modalidades, a ativação do complemento clássico dirigida por anticorpo conduz a fragmentos C3 na célula alvo. Estes produtos de clivagem C3 podem promover citotoxicidade celular dependente do complemento direto (CDCC). Em algumas modalidades, uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo, uma partícula alvo ou uma célula alvo. A expressão de um FcR particular ou receptor de complemento em uma célula efetora pode ser regulada por fatores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, a expressão de FcyRI foi verificada como sendo regulada positivamente pelo interferon γ (IFN γ) e/ou G-CSF. Esta expressão intensificada aumenta a atividade citotóxica de células portadoras de FcyRI contra alvos. Uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo ou fagocitar ou lisar uma célula alvo. Em algumas modalidades, a ativação do complemento clássico dirigida por anticorpo conduz a fragmentos C3 na célula alvo. Estes produtos de clivagem C3 podem promover a fagocitose direta por células efetoras ou indiretamente intensificando a fagocitose mediada por anticorpos.

[0097] O termo “funções efetoras de Fc,” como usado aqui, é destinado a fazer referência a funções que são uma consequência de ligação de polipeptídeo ou anticorpo ao seu alvo, tal como um antígeno, em uma membrana celular em que a função efetora de Fc é atribuível à região Fc do polipeptídeo ou anticorpo. Exemplos de funções efetoras de Fc incluem (i) ligação a Clq, (ii) ativação de complemento, (iii) citotoxicidade dependente de complemento (CDC), (iv) citotoxicidade mediada por célula dependente de

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30/194 anticorpo (ADCC), (v) ligação Fc-gama receptor, (vi) fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), (vii) citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC), (viii) citotoxicidade intensificada por complemento, (ix) ligação ao receptor complemento de um anticorpo opsonizado mediada pelo anticorpo, (x) opsonização, e (xi) uma combinação de qualquer um de (i) a(x).

[0098] O termo “funções dependentes de agrupamento “ como usado aqui, é destinado a fazer referência a funções que são uma consequência da formação de complexos de antígeno após a oligomerização de polipeptídeos ou anticorpos ligados a seus antígenos, opcionalmente em uma célula, uma membrana celular, sobre um virion, ou sobre outra partícula Exemplos de funções efetoras dependentes de agrupamento incluem (i) formação anticorpo oligômero, (ii) estabilidade anticorpo oligômero, (iii) formação antígeno oligômero, (iv) estabilidade antígeno oligômero,(v) indução de apoptose, (vi) modulação proliferação, tal como redução, inibição ou estimulação de proliferação e (vii) uma combinação de qualquer um de (i) a (vi).

[0099] O termo “agonístico”, como usado aqui, é entendido como estimulação ou ativação de um receptor em uma membrana celular, resultando em uma resposta biológica, como a sinalização intracelular. Tal efeito agonístico podería resultar em indução de apoptose (morte celular programada) ou ativação de células imunes, ou ativação de uma via intracelular.

[00100] Atividade agonística ou atividade aumentada agonística podem ser determinadas em um teste de viabilidade para anticorpos dirigidos a alvos expressando um domínio de morte intracelular, como descrito em Exemplo 2 usando as seguintes etapas de:

i) Semear uma linhagem celular expressando um alvo correspondendo a um anticorpo por exemplo DR5 em uma placa de fundo plano de 96 cavidades de poliestireno, durante a noite 37°C,

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31/194 ii) Adicionar uma diluição em série do anticorpo por exemplo um anticorpo anti-DR5 em uma faixa (0,0003 a 20,000 ng/mL) e incubar durante 3 dias a 37°C, iii) Determinar viabilidade celular por quantificação da presença de ATP, por exemplo por uso de teste de viabilidade celular luminescente CellTiler-Glo, iv) Calcular as células viáveis usando a seguinte fórmula: % células viáveis = [(luminescência na amostra anticorpo - luminescência na amostra estaurosporina)/(luminescência na amostra anticorpo - luminescência na amostra estaurosporina)]*100.

[00101] Atividade agonística ou atividade agonística aumentada podem ser determinadas em um teste repórter para anticorpos dirigidos a alvos ativando a via de sinalização intracelular, como descrito em Exemplo 29, 30, 31 e 32 usando as seguintes etapas de:

i) Semear células Jurkat estavelmente transfectadas com o alvo por exemplo 0X40, 4-1 BB, CD40 ou GITR e um gene repórter luciferase a jusante de um elemento de resposta a NFAT expressando, as células são incubadas em uma placa de fundo plano de 96 cavidades durante a noite 37°C, ii) Adicionar uma diluição em série do anticorpo, por exemplo um anticorpo anti-OX49, anti-4-ΙΒΒ, anti-CD40 ou anti-GITR em uma faixa de, por exemplo, 19,5 a 5.000 ng/mL e incubar durante 5 horas, iii) Adicionar um substrato de luciferase de vaga-lume (5’fluoroluciferina) às células e incubar durante 5-10 minutos, iv) Determinar a luminescência usando um leitor de placa Envision MultiLable Plate.

[00102] O termo “vetor”, como aqui usado, é destinado a fazer referência a uma molécula de ácido nucleico capaz de induzir a transcrição de um segmento de ácido nucleico ligado ao vetor. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que está na forma de uma alça circular de DNA de fita dupla.

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Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que o segmento de ácido nucleico pode ser ligado ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamíferos epissômicos). Outros vetores (tais como vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são aqui ditos como “vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente “vetores de expressão”). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados indistintamente como o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a presente invenção pretende incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (tais como retrovirus defeituosos na replicação, adenovirus e vírus adenoassociados), que servem a funções equivalentes.

[00103] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como aqui usado, é destinado a fazer referência a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão. Deve ser entendido que tais termos pretendem referir-se não apenas à célula em questão, mas também à descendência de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a ou mutação ou influências ambientais, essa progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula parental, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo “célula hospedeira” como aqui usado. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células HEK 293, PER.C6, células NSO e células linfócitos, e células procarióticas tais como E. coli e outros hospedeiros

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 39/257 / 194 eucarióticos, tais como células vegetais e fungos.

[00104] O termo “transfectoma”, como usado aqui, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes expressando o Ab ou um antígeno alvo, tais como células CHO, PER.C6, células NSO, células HEK 293, células vegetais ou fungos, incluindo células de levedura.

[00105] O termo “preparação” refere-se a preparações de variantes de anticorpos e misturas de diferentes variantes de anticorpos que podem ter uma capacidade aumentada de formar oligômeros ao interagir com o antígeno associado a uma célula (por exemplo, um antígeno expressado na superfície da célula), uma membrana celular, um virion ou outra estrutura, que pode resultar em sinalização e/ou ativação intensificadas pelo antígeno.

[00106] Como usado aqui, o termo “afinidade” é a força de ligação de uma molécula, por exemplo, um anticorpo para outro, por exemplo, um alvo ou antígeno, em um sítio único, tal como a ligação monovalente de um sítio de ligação ao antígeno individual de um anticorpo a um antígeno.

[00107] Como aqui usado, o termo “avidez” refere-se à força combinada de múltiplos sítios de ligação entre duas estruturas, tal como entre múltiplos sítios de ligação ao antígeno de anticorpos interagindo simultaneamente com um alvo ou, por exemplo, entre o anticorpo e Clq. Quando mais de uma interação de ligação está presente, as duas estruturas irão dissociar-se apenas quando todos os sítios de ligação se dissociarem e, assim, a taxa de dissociação será mais lenta do que para os sítios de ligação individuais e, assim, proporcionando uma maior força de ligação total eficaz (avidez) comparada para a força de ligação dos sítios de ligação individuais (afinidade).

[00108] Como aqui usado, o termo “oligômero” refere-se a uma molécula que consiste em mais de uma, mas em um número limitado, de unidades monoméricas (por exemplo anticorpos) em contraste com um polímero que, pelo menos em princípio, consiste de um número ilimitado de

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34/194 monómeros. Oligômeros exemplares são dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros e hexâmeros. Prefixos gregos são frequentemente usados para designar o número de unidades monoméricas no oligômero, por exemplo, um tetrâmero sendo composto de quatro unidades e um hexâmero de seis unidades.

[00109] O termo “oligomerização”, como aqui usado, é destinado a fazer referência a um processo que converte monómeros em um grau finito de polimerização. Aqui, observa-se que, polipeptídeos, anticorpos e/ou outras proteínas diméricas compreendendo regiões de ligação ao alvo de acordo com a invenção podem formar oligômeros, tais como hexâmeros, através de associação não covalente de regiões Fc após ligação ao alvo, por exemplo, a uma superfície celular.

[00110] O termo “agrupamento”, como aqui usado, é destinado a fazer referência à oligomerização de anticorpos, polipeptídeos, antígenos ou outras proteínas através de interações não covalentes.

[00111] O termo “intensificando Fc-Fc”, como usado aqui, é destinado a fazer referência a aumentar a força de ligação entre, ou estabilizar a interação entre, as regiões Fc de dois anticorpos contendo região Fc ou polipeptídeos de modo que os polipeptídeos formam oligômeros quando da ligação ao alvo [00112] Substituições intensificando Fc-Fc, como usadas aqui, referem-se às substituições nas seguintes posições correspondendo a IgGl humana de acordo com a numeração da UE E430, E345 ou S440 com a condição que as substituições em posição S440 são S440Y ou S440W. Assim, substituições intensificando Fc-Fc, como usado aqui, referem-se às seguintes substituições de aminoácidos E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W e S440Y. Em uma modalidade preferida, a substituição intensificando Fc-Fc é E430G ou E345K.

[00113] O termo “ligação a Clq”, como usado aqui, é destinado a fazer

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 41/257 / 194 referência à interação direta entre Clq e polipeptídeo ou anticorpo. A ligação direta a Clq pode ser avaliada, por exemplo, usando anticorpo imobilizado em superfície artificial (como descrito em Exemplos 4, 5 e 6). A interação multi valente resultando em ligação de alta avidez de Clq a um anticorpo oligômero pode ser avaliada quando ligada a um antígeno predeterminado em uma superfície celular ou virion.

[00114] Clq ligando a um polipeptídeo ou um anticorpo podem ser determinado em um teste ELISA usando as seguintes etapas i) revestir uma placa de 96 cavidades Microlon ELISA com 1 pg/mL de polipeptídeo ou anticorpo em 100 pl PBS a 4C durante a noite, ii) incubar a placa com 100 pL/cavidade de série de diluições em série de Clq, de faixa de concentração de Clq final 30-0,01 pg/mL em diluições de 3 vezes durante Ih a 37C, iii) incubar a placa com 100 pl/cavidade de Clq anti-humano de coelho durante Ih a RT, iv) incubar a placa com 100 pl/cavidade IgG-HRP anti-coelho de suíno durante Ih a RT, v) incubar a placa com 100 pL/cavidade de substrato com 1 mg/mL de ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) durante 15 min a RT, vi) a reação é parada por adição de 100 pL 2% ácido oxálico/cavidade. A absorbância é medida a 405 nm em um leitor de microplaca BioTek EL808.

[00115] O termo substituição de ligação a Clq, como usado aqui, é destinado a fazer referência a uma substituição em um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, que intensifica a interação direta com Clq. A ligação a Clq intensificada pode, por exemplo, resultar em um EC50 diminuído da interação entre Clq e o polipeptídeo compreendendo uma região Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, medidos de acordo com o método para determinar a ligação a Clq descrita acima.

[00116] Como usado aqui, o termo “ativação de complemento” referese à ativação da via do complemento clássica, que é iniciada por um grande

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36/194 complexo macromolecular denominado ligação a Cl para complexos anticorpo-antígeno em uma superfície. Cl é um complexo que consiste em 6 proteínas de reconhecimento de Clq e um hetero-tetrâmero de serina proteases, Clr2Cls2. Cl é o primeiro complexo de proteína nos primeiros eventos da cascata clássica do complemento que envolve uma série de reações de clivagem que começa com a clivagem de C4 em C4a e C4b e C2 em C2a e C2b. C4b é depositado e forma junto com C2a uma convertase ativa enzimática chamada C3 convertase, que cliva o componente de complemento C3 em C3b e C3a, que forma uma C5 convertase. Esta C5 convertase divide C5 em C5a e C5b e o último componente é depositado na membrana e que por sua vez desencadeia os eventos tardios de ativação do complemento em que componentes do complemento terminal C5b, C6, C7, C8 e C9 se agrupam no complexo de ataque à membrana (MAC). A cascata do complemento resulta na criação de poros na membrana celular que causam a lise da célula, também conhecida como citotoxicidade dependente do complemento (CDC). A ativação do complemento pode ser avaliada usando eficácia de Clq, cinética de CDC, testes de CDC (como descrito em WO2013/004842, W02014/108198) ou por métodos de deposição celular de C3b e C4b descritos em Beurskens et al I^o. de abril de 2012 vol. 188 no. 7 3532-3541.

[00117] O termo “citotoxicidade dependente de complemento” (“CDC”), como usado aqui, é destinado a fazer referência ao processo de ativação de complemento mediada por anticorpo levando à lise da célula ou virion quando o anticorpo é ligado a seu alvo em uma célula ou virion como um resultado de poros na membrana, que são criados pela montagem de MAC.

[00118] O termo “citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” (“ADCC”) como usado aqui, é destinado a fazer referência a um mecanismo de morte de células alvo ou virions revestidos com anticorpos por células que expressam receptores Fe que reconhecem a região constante do

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 43/257 / 194 anticorpo ligado. O termo “fagocitose celular dependente de anticorpo” (“ADCP”) como aqui usado é destinado a fazer referência a um mecanismo de eliminação de células alvo ou virions revestidos com anticorpos por intemalização por fagócitos. As células alvo ou virions revestidos com anticorpos internalizados estão contidos em uma vesícula chamada fagossoma, que então se funde com um ou mais lisossomas para formar um fagolisossomo. ADCP pode ser avaliado usando um teste de citotoxicidade in vitro com macrófagos como células efetoras e microscopia de vídeo, como descrito por van Bij et al. in Journal de Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, Páginas 677-685.

[00119] O termo “citotoxicidade celular dependente do complemento” (“CDCC”) como usado aqui é destinado a fazer referência ao mecanismo de morte de células alvo ou virions por células expressando receptores de complementos que reconhecem os produtos de clivagem de omplemento 3 (C3) que são covalentemente ligados às células alvo ou virions como um resultado da ativação de complemento mediada por anticorpo. CDCC podem ser avaliados por um modo similar como descrito para ADCC.

[00120] O termo “meia-vida plasmática”, como usado aqui, indica o tempo necessário para reduzir a concentração de polipeptideo no plasma sanguíneo para uma metade de sua concentração inicial durante a eliminação (após a fase de distribuição). Para anticorpos, a fase de distribuição será tipicamente de 1 a 3 dias, fase durante a qual ocorre uma diminuição de cerca de 50% na concentração plasmática do sangue, devido à redistribuição entre plasma e tecidos. A semi-vida plasmática pode ser medida por métodos bem conhecidos na técnica.

[00121] O termo “taxa de depuração plasmática”, como aqui usado, é uma medição quantitativa da taxa à qual um polipeptideo é removido do sangue após administração a um organismo vivo. A taxa de depuração plasmática pode ser calculada como a dose/AUC (mL/dia/kg), em que o valor

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38/194 de AUC (área sob a curva) é determinado a partir de uma curva concentraçãotempo.

[00122] O termo “conjugado anticorpo-fármaco”, como aqui usado, refere-se a um anticorpo ou polipeptídeo contendo Fe tendo especificidade para pelo menos um tipo de célula maligna, um fármaco e um ligante acoplando o fármaco a, por exemplo, anticorpo. O ligante é clivável ou não clivável na presença da célula maligna; em que o conjugado anticorpofármaco mata a célula maligna.

[00123] O termo “absorção de conjugado anticorpo-fármaco”, como aqui usado, refere-se ao processo em que conjugados anticorpo-fármaco estão ligados a um alvo em uma célula seguido por absorção/engolfamento pela membrana celular e são assim introduzidos na célula. A absorção de conjugado anticorpo-fármaco pode ser avaliada como “internalização mediada por anticorpo e morte celular por ADC anti-TF em um teste de morte in vitro” como descrito em WO 2011/157741.

[00124] O termo “apoptose”, como usado aqui, refere-se ao processo de morte celular programada (PCD) que pode ocorrer em uma célula. Eventos bioquímicos levam a mudanças celulares características (morfologia) e morte. Essas mudanças incluem a formação de bolhas, encolhimento das células, fragmentação nuclear, condensação da cromatina e fragmentação do DNA cromossômico. A ligação de um anticorpo a um certo receptor pode induzir apoptose.

[00125] O termo “morte celular programada” ou “PCD”, como aqui usado, refere-se à morte de uma célula em qualquer forma mediada por um programa intracelular. Diferentes formas de PCD existem, os vários tipos de PCD tendo em comum o fato de serem executados por processos celulares ativos que podem ser interceptados por interferência com sinalização intracelular. Em uma modalidade particular, a ocorrência de qualquer forma de PCD em uma célula ou tecido pode ser determinada por coloração da

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39/194 célula ou tecido com Anexina V conjugada, correlacionando com a exposição a fosfatidilserina.

[00126] O termo “Anexina V”, como usado aqui, refere-se a uma proteína do grupo anexina que liga fosfatidilserina (PS) sobre a superfície celular.

[00127] O termo “FcRn”, como usado aqui é destinado a fazer referência ao receptor Fe neonatal que é um receptor Fe. Ele foi primeiro descoberto em roedores como um único receptor capaz de transportar IgG do leite materno através do epitélio do intestino do roedor recém-nascido para a corrente sanguínea do recém-nascido. Outros estudos revelaram um receptor similar em humanos. Em humanos, no entanto, ele é encontrado na placenta para ajudar a facilitar o transporte de IgG da mãe para o feto em crescimento e também foi mostrado que desempenha um papel no monitoramento do turnover de IgG. FcRn liga-se a IgG em pH ácido de 6,0 a 6,5, mas não em pH neutro ou mais alto. Portanto, FcRn pode se ligar a IgG a partir do lúmen intestinal (o interior do intestino) a um pH levemente ácido e assegurar um transporte unidirecional eficiente para o lado basolateral (dentro do corpo), onde o pH é neutro a básico (pH 7,0-7,5). Este receptor também desempenha um papel no salvamento adulto de IgG através de sua ocorrência na via da endocitose em células endoteliais. Receptores FcRn nos endossomos acídicos se ligam à IgG internalizada por pinocitose, reciclando-a para a superfície celular, liberando-a no pH básico do sangue, assim evitando que a mesma sofra de degradação lisossômica. Esse mecanismo pode fornecer uma explicação para a maior meia-vida de IgG no sangue em comparação com outros isotipos.

[00128] O termo “Proteína A”, como usado aqui é destinado a fazer referência a uma proteína de superfície MSCRAMM de 56 kDa originalmente encontrada na parede celular da bactéria Staphylococcus aureus. Ela é codificada pelo gene spa e sua regulação é controlada pela topologia de DNA,

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40/194 osmolaridade celular e um sistema de dois componentes chamado ArlS-ArlR. Ela encontrou uso em pesquisas bioquímicas devido à sua capacidade de se ligar a imunoglobulinas. Ela é composta por cinco domínios de ligação a Ig homólogos que duplicam em um feixe de três hélices. Cada domínio é capaz de se ligar a proteínas de muitas espécies de mamíferos, o mais notavelmente IgGs. Ela se liga à região Fe da cadeia pesada da maioria das imunoglobulinas (sobrepondo o sítio de ligação conservado de receptores FcRn) e também interage com a região Fab da família VH3 humana. Através destas interações no soro, as moléculas de IgG ligam-se às bactérias via sua região Fe em vez de apenas via suas regiões Fab, através das quais a bactéria rompe a opsonização, ativação do complemento e fagocitose.

[00129] O termo “Proteína G”, como usado aqui é destinado a fazer referência a uma proteína de ligação a imunoglobulina expressa em bactérias Streptococcus do grupo C e G, muito semelhante à Proteína A, mas com especificidades diferentes. Ela é uma proteína de superfície celular de 65 kDa (G148 proteína G) e 58 kDa (proteína C40 G) que encontrou aplicação na purificação de anticorpos através de sua ligação à região Fe.

Modalidades específicas da invenção [00130] Como descrito aqui, de modo surpreendente, substituições de aminoácidos na região Fe de um polipeptídeo ou anticorpo fornecem polipeptídeos ou anticorpos com funções efetoras intensificadas, por exemplo, CDC e/ou atividade agonística. Os inventores verificaram que ao introduzir uma mutação que intensifica interações Fc-Fc, tal como uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 e S440 junto com a substituição de ligação a Clq, as funções efetoras de Fe do polipeptídeo ou anticorpo podem ser intensificadas. Além do mais, os inventores também verificaram que a combinação de uma mutação intensificando Fc-Fc e a substituição de ligação a Clq pode resultar em polipeptídeos, tal como anticorpos, com propriedades agonísticas ou

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[00131] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptideo ou um anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende

a) pelo menos uma substituição intensificando Fc-Fc em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 e S440, com a condição que a mutação em S440 é S440Y ou S440W, e b) pelo menos uma substituição de ligação a Clq, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE (Edelman et al., Proc Natl Acad Sei USA. 1969 May;63(l):78-85; Kabat et al., Sequences de Proteínas de Immunological Interest, 5^a. ed.. 1991 NIH Publication No. 91-3242) [00132] Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende, a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou uma S440Y ou S440W, e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00133] Uma substituição em uma posição correspondendo à substituição E430, E345 ou uma S440Y ou S440W é considerada uma substituição intensificando Fc-Fc de acordo com a presente invenção.

[00134] Uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, é considerada uma substituição de ligação a Clq de acordo com a presente invenção.

[00135] Uma mutação em uma das seguintes posições E430, E345 ou S440 com a condição que a mutação em S440 é S440Y ou S440W introduz o efeito de interações Fc-Fc intensificadas e oligomerização no polipeptideo ou

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42/194 anticorpo. A oligomerização intensificada ocorre quando a região de ligação a antígeno do polipeptideo ou anticorpo é ligada ao antígeno alvo correspondente. A oligomerização intensificada gera oligômeros tal como, por exemplo, hexâmeros. A geração de estruturas oligoméricas, tal como hexâmeros, tem o efeito aumentar as funções efetoras de Fe por exemplo CDC por aumento da avidez da ligação a Clq do polipeptideo. A combinação da mutação intensificando Fc-Fc com uma substituição de ligação a Clq tal como uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, gera um polipeptideo ou anticorpo com funções efetoras intensificadas. A combinação de uma substituição intensificando Fc-Fc e a substituição de ligação a Clq tem adicionalmente o efeito de gerar um polipeptideo ou anticorpo com atividade agonística. Em uma modalidade, o polipeptideo ou anticorpo pode ter atividade agonística aumentada quando comparado com um polipeptideo parental ou a anticorpo parental.

[00136] Polipeptídeos ou anticorpos de acordo com a presente invenção são de interesse particular quando ativando uma via de sinalização intracelular através de ligando para a superfície celular receptor.

[00137] Em uma modalidade, de acordo com a invenção, um uma função ou atividade efetora de Fe aumentada ou intensificada de um polipeptideo ou anticorpo tendo uma substituição intensificando Fc-Fc e a substituição de ligação a Clq deve ser entendido para quando o polipeptideo ou anticorpo é comparado com um polipeptideo parental ou anticorpo parental, que é o polipeptideo parental ou anticorpo parental sem as substituições, de acordo com a invenção, mas de outra forma idênticos.

[00138] A presente invenção permite novas terapêuticas com base em polipeptideo ou anticorpo com propriedades aumentadas, tal como uma atividade agonística de CDC. Isto é, os polipeptídeos ou anticorpos de acordo com a invenção tem propriedades aumentadas dependendo da região Fe tal

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 49/257 / 194 como CDC e eles também podem ter propriedades aumentadas dependendo da região de ligação a antígeno, tal como atividade agonística.

[00139] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo ou um anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende

a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição(s) em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00140] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em duas ou três posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396.

[00141] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições de ligação a Clq selecionadas a partir de um dos grupos consistindo em;

i) duas substituições de ligação a Clq em posições K326, E333 ii) três substituições de ligação a Clq em posições f: K326, E333 e P396, e iii) três substituições de ligação a Clq em posições S267, H268 e S324.

[00142] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais

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44/194 substituição(ões) de ligação a Clq são em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição G236 não é G236F, G236R, G236Y.

[00143] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituição(ões) de ligação a Clq são em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição S267 não é S267H, S267I, S267K, S267G.

[00144] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituição(ões) de ligação a Clq são em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição H268 não é H268K, H268D, H268E.

[00145] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição intensificando Fc-Fc é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W e S440Y.

[00146] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição intensificando Fc-Fc é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T.

[00147] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição intensificando Fc-Fc é selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y.

[00148] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E430G. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E345K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E345R. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 51/257 / 194 anticorpo tem pelo menos uma substituição S440Y.

[00149] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00150] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T e uma substituição em uma ou mais a posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: K326, E333 e P396. [00151] Em uma modalidade da invenção, a região Fc compreende uma substituição E430G e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00152] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y, e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00153] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y, e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: K326, E333 e P396.

[00154] Em uma modalidade da invenção, a região Fc compreende uma substituição E345K e uma substituição em uma ou mais posições selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.

[00155] Em uma modalidade da invenção, a região Fc compreende a E345R substituição e uma substituição em uma ou mais posição(ões)

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 52/257 / 194 selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326, 1332, E333 e P396.

[00156] Em uma modalidade da invenção, a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: S440Y ou S440W e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326, 1332, E333 e P396.

[00157] Em uma modalidade da invenção, a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: S440Y ou S440W e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: K326, E333 e P396.

[00158] Em uma modalidade da invenção, a região Fe compreende uma substituição S440Y e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326, 1332, E333 e P396.

[00159] Assim são aqui providas modalidades quer permitem uma ligação a Clq e/ou propriedades agonísticas intensificadas dos polipeptídeos ou anticorpos sobre a ligação a antígeno na superfície celular. Em uma modalidade, os polipeptídeos ou anticorpos compreendem propriedades agonísticas intensificadas. Em uma modalidade, os polipeptídeos ou anticorpos compreendem uma região Fe compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma segunda cadeia pesada, em que umas das substituições acima mencionadas pode estar presente na primeira e/ou na segunda cadeia pesada.

[00160] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição, tal como duas ou três substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 53/257 / 194 invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições em posições K326 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições em posições K326 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições em posições P396 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições em posições K326, E333 e P396.

[00161] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e uma substituição em uma ou mais posições, tal como duas ou três posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições K326 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições K326 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições K326, E333 e P396.

[00162] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e uma substituição em uma ou mais posições, tal como duas ou três posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 54/257 / 194 posição E345 e substituições nas posições K326 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições nas posições K326 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições nas posições E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições nas posições K326, E333 e P396.

[00163] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em S440Y ou S440W e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e uma substituição em um ou mais posições, tal como duas ou três posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em S440Y ou S440W e substituições nas posições K326 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em S440Y ou S440W e substituições nas posições K326 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em S440Y ou S440W substituições nas posições E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em S440Y ou substituições S440W nas posições K326, E333 e P396.

[00164] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição K326 selecionada a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, K326D, K326N, K326G, K326F, K326E, K326F, K326Y, K326H, e K326M.

[00165] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E333 selecionada a partir do grupo

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 55/257 / 194 consistindo em: E333S, E333A, E333T e E333G.

[00166] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E396 selecionada a partir do grupo consistindo em: E396L, E396I, E396V, E396Q, E396N, e E396A.

[00167] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, E333S, e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, E333T e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326A, E333S, e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326A, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição K326A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição K326W. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição.E333A Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E333T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W e E333T. Em uma modalidade da

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50/194 invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326A e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326A e E333T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições E333S e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326A, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326S, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W, E333S e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições K326W, E333T e P396L.

[00168] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais substituições de ligação a Clq em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais substituições, tal como duas ou três substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267 e H268. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267 e

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S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267, H268 e S324.

[00169] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições S267 e H268. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições S267 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e substituições nas posições S267, H268 e S324.

[00170] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições nas posições S267 e H268. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições nas posições

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S267 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e substituições nas posições H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E E345 e substituições nas posições S267, H268 e S324.

[00171] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e uma substituição em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e uma substituição em uma ou mais posições, como duas ou três posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e substituições nas posições S267 e H268. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e substituições nas posições S267 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e substituições nas posições H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e substituições nas posições S267, H268 e S324.

[00172] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: S267E, H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende um ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: S267E, H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S267E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição H268F. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S324T. Em uma modalidade da

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 59/257 / 194 invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de S267E e H268F. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições S267E e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições S267E, H268F e S324T.

[00173] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende, a) pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W de, b) pelo menos uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A, ii. E333A, iii. E333T iv. P396L,

v. E333S, vi. K326W, E333S vii. K326W, E333T viii. K326A, E333A, ix. K326A, K333A, P396L

x. S267E, H268F, xi. S267E, S324T, xii. H268F, S324T, xiii. S267E, H268F, S324T, e xiv. S324,1332.

[00174] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e pelo menos uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A,

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54/194 ii. E333A, iii. E333T iv. P396L,

x. S267E, H268F, xi. S267E, S324T, xii. H268F, S324T xiii. S267E, H268F, S324T, e xiv. S324,1332.

[00175] Assim, modalidades são fornecidas em que uma substituição está em posição E430. Em uma modalidade, a substituição em posição E430 é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F, E430T.

[00176] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G e uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A, ii. E333A, iii. E333T iv. P396L,

x. S267E, H268F,

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 61/257 / 194 xi. S267E, S324T, xii. H268F, S324T, xiii. S267E, H268F, S324T, e xiv. S324,1332.

[00177] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326A, E333A e P396L.

[00178] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430S, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430S, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430S, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430S, K326A, E333A e P396L.

[00179] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430F, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430F, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430F, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430F, K326A, E333A e P396L.

[00180] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430T, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430T, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou

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56/194 anticorpo compreende uma substituição E430T, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430T, K326A, E333A e P396L.

[00181] Em uma modalidade da invenção, polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e pelo menos uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A, ii. E333A, iii. E333T iv. P396L,

[00182] Assim, modalidades são fornecidas em que uma substituição está em posição E345. Em uma modalidade, a substituição em posição E345 é selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R, E345Y.

[00183] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K e pelo menos uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A, ii. E333A,

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 63/257 / 194 iii. E333T iv. P396L,

[00184] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326A, E333A e P396L.

[00185] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R e pelo menos uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A, ii. E333A, iii. E333T iv. P396L,

v. E333S, vi. K326W, E333S vii. K326W, E333T

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58/194 viii. K326A, E333A, ix. K326A, K333A, P396L

[00186] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326A, E333A e P396L.

[00187] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Q, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Q, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Q, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Q, K326A, E333A e P396L.

[00188] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Y, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Y, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Y, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345Y, K326A, E333A e P396L.

[00189] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo

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59/194 compreende uma substituição S440Y ou S440W e pelo menos uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A, ii. E333A, iii. E333T iv. P396L,

[00190] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y e pelo menos uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326A, ii. E333A, iii. E333T iv. P396L,

x. S267E, H268F,

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60/194 xi. S267E, S324T, xii. H268F, S324T, xiii. S267E, H268F, S324T, e xiv. S324,1332.

[00191] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K326A, E333A e P396L.

[00192] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440W, K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440W, K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440W, K333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440W, K326A, E333A e P396L.

[00193] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende adicionalmente uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: G236A, I332E, S239D e I332E.

[00194] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende adicionalmente pelo menos duas substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em:

i. G236A, I332E, e ii. S239D, I332E.

[00195] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende a) pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou

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S440W e b) substituições selecionadas a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. H268F, S324T, G236A, I332E, ii. H268F, S324T, S239D, I332E iii. S267E, H268F, S324T, G236A, I332E, e iv. S267E, H268F, S324T, S239D, I332E.

[00196] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E430 e as substituições selecionadas a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

[00197] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G e as substituições selecionadas a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

[00198] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição em posição E345 e as substituições selecionadas a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

[00199] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K e as substituições selecionadas a partir

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62/194 de um dos seguintes grupos consistindo em:

[00200] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R e as substituições selecionadas a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

[00201] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y ou S440W e as substituições selecionadas a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

[00202] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y e as substituições selecionadas a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. H268F, S324T, G236A, I332E, ii. H268F, S324T, S239D, I332E, iii. S267E, H268F, S324T, G236A, I332E, e iv. S267E, H268F, S324T, S239D, I332E.

[00203] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais substituições adicionais. Isto é, em uma modalidade da invenção o polipeptídeo ou anticorpo de acordo com qualquer aspecto ou

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 69/257 / 194 modalidade descrito aqui compreende uma ou mais substituições adicionais na região Fc.

[00204] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição adicional correspondendo à posição K439 ou onde a região Fc não compreende uma substituição em posição S440, a substituição adicional pode estar na posição S440.

[00205] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição adicional no polipeptídeo ou anticorpo correspondendo à posição K439 ou S440, com a condição que a substituição em S440 não é S440Y ou S440W.

[00206] Polipeptídeos ou anticorpos compreendendo uma substituição intensificando Fc-Fc e uma substituição de ligação a Clq de acordo com a presente invenção e uma substituição adicional em posição S440, tal como S440K, não formam oligômeros com polipeptídeos ou anticorpos compreendendo uma substituição em posição S440, tal como S440K. Polipeptídeos ou anticorpos compreendendo uma substituição intensificando Fc-Fc e uma substituição de ligação a Clq de acordo com a presente invenção e uma substituição adicional em posição K439, tal como K439, não formam oligômeros com polipeptídeos ou anticorpos compreendendo a mutação em posição K439, tal como K439E. Em uma modalidade da invenção, a substituição adicional é selecionada dentre S440K ou K439E.

[00207] Em uma modalidade da presente invenção, a região Fc compreende uma substituição adicional que é uma substituição inibindo hexamerização correspondendo a K439E ou S440K em numeração da UE de IgGl humana. Isto é, em uma modalidade da presente invenção, a região Fc compreende uma substituição intensificando Fc-Fc tal como E430G e a substituição inibindo hexamerização K439E. Em uma modalidade da presente invenção, a região Fc compreende uma substituição intensificando Fc-Fc tal como E345K e uma substituição inibindo hexamerização K439E. Em outra

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64/194 modalidade da presente invenção, a região Fe compreende uma substituição intensificando Fc-Fc tal como E430G e uma substituição inibindo hexamerização S440K. Em uma modalidade da presente invenção, a região Fe compreende uma substituição intensificando Fc-Fc tal como E345K e uma substituição inibindo hexamerização S440K. Aqui são fornecidas modalidades que permitem a hexamerização exclusiva entre combinações de anticorpos compreendendo uma substituição K439E e anticorpos compreendendo uma substituição S440. Isto é, as substituições inibindo K439E e S440K podem ser vistas como substituições complementares. Combinações de anticorpos com duas diferentes substituições de inibição de hexamerização complementar podem ser de particular interesse em composições tendo pelo menos dois anticorpos com diferentes especificidades.

[00208] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 e S440, com a condição que a substituição em S440 não é S440Y ou S440W e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396 e c) uma substituição K439E.

[00209] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430 e E345 e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396 e c) uma substituição S440K.

[00210] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326W, E333S e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326A, E333A e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G,

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K333A, P396L e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326A, E333A, P396L e K439E.

[00211] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326W, E333S e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326A, E333A e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K333A, P396L e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326A, E333A, P396L e K439E.

[00212] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326W, E333S e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326A, E333A e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K333A, P396L e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326A, E333A, P396L e K439E.

[00213] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K326W, E333S e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K326A, E333A e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K333A, P396L e K439E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440Y, K326A, E333A, P396L e K439E.

[00214] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do

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66/194 grupo consistindo em: E430 e E345, e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396 e c) uma substituição S440K.

[00215] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326W, E333S e S440K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326A, E333A e S440S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K333A, P396L e S440S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E430G, K326A, E333A, P396L e S440K.

[00216] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326W, E333S e S440K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326A, E333A e S440K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K333A, P396L e S440K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345K, K326A, E333A, P396L e S440K.

[00217] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326W, E333S e S440K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326A, E333A e S440S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K333A, P396L e S440K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E345R, K326A, E333A, P396L e S440K.

[00218] O polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a invenção tem pelo menos uma substituição intensificando Fc-Fc e uma ou mais

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 73/257 / 194 substituições de ligação a Clq, mas como descrito acima também pode ter substituições adicionais para introduzir funções adicionais no polipeptideo ou anticorpo. Em uma modalidade, o polipeptideo ou anticorpo compreende no máximo de substituições, tal como nove substituições, tal como oito substituições, tal como sete substituições, tal como seis substituições, tal como cinco substituições, tal como quatro substituições, tal como três substituições ou tal como duas substituições.

[00219] Aqui são fornecidas modalidades que permitem que os polipeptídeos ou anticorpos da invenção tenham substituições adicionais, que introduzem características adicionais no polipeptideo ou anticorpo. Adicionalmente, as substituições adicionais também permitem uma variação na região Fe em posições que não estão envolvidas em interação Fc-Fc, assim como em posições não envolvidas em funções efetoras de Fe. Adicionalmente, substituições adicionais também podem ser devido a variações alélicas.

[00220] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem uma Função efetora de Fe aumentada por pelo menos 20% comparados com um polipeptideo parental ou anticorpo parental, que é idêntico ao anticorpo, exceto que ele não compreende uma substituição intensificando FcFc e uma substituição de ligação a Clq na região Fe.

[00221] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem um função efetora de Fe aumentada por pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% comparado com um polipeptideo parental ou anticorpo parental, que é idêntico ao anticorpo, exceto que ele não compreende uma substituição intensificando Fc-Fc e uma substituição de ligação a Clq na região Fe.

[00222] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma função efetora de Fe aumentada.

[00223] Em uma modalidade da invenção, a função efetora de Fe é

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 74/257 / 194 selecionada a partir do seguinte grupo; citotoxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade dependente de complemento mediada por célula, ativação de complemento, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo, ligação a Clq e ligação a FcyR. Em uma modalidade, a função efetora de Fe é sinalização de FcyRIIIa. Isto é, a segunda mutação de acordo com a invenção é capaz de diminuir pelo menos uma função efetora de Fe. [00224] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende atividade agonística. Isto é, o polipeptídeo ou anticorpo compreende atividade agonística quando comparado com um polipeptídeo parental ou anticorpo parental.

[00225] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende atividade agonística intensificada. Isto é, o polipeptídeo ou anticorpo compreende atividade agonística intensificada quando comparado com um polipeptídeo parental ou anticorpo parental. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende atividade agonística intensificada, quando comparado com um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo a mesma mutação intensificando Fc-Fc, mas sem mutação ligando a Clq.

[00226] Atividade agonística de receptores do TNFR-SF requer reticulação exógena para alcançar atividade agonística. Isto pode ser medido em testes substitutivos usando, por exemplo, células HEK293 contendo gene repórter secretado dirigido por NF-kB (por exemplo, gene repórter pMetLucexpressando luciferase, Clontech) que são estavelmente transfectados com o receptor de interesse TNFR-SF. A reticulação do receptor leva à ativação do promotor e secreção de, por exemplo, proteína luciferase no meio. Em testes de pontos de tempo desejados, a atividade de luciferase pode ser medida, por transferência da amostra de meio e adicionando substrato. A atividade de luciferase pode ser medida em um luminômeto, que é uma medida para a

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69/194 atividade agonística. Para exemplos de 0X40, ver Zhang et al. J Biol Chem. 30 de dezembro de 2016, 291(53):27134-27146 [00227] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende atividade agonística aumentada. Isto é, o polipeptideo ou anticorpo compreende atividade agonística aumentada quando comparado com um polipeptideo parental ou anticorpo parental.

[00228] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo é um anticorpo, anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico. Em uma modalidade, o polipeptideo é um polipeptideo monoespecífico, um polipeptideo biespecífico ou um polipeptideo multiespecífico.

[00229] O polipeptideo da invenção não é limitado a anticorpos que tem um domínio natural, por exemplo um Fe humano, mas também pode ser um anticorpo tendo outas mutações diferentes das da presente invenção, tal como, por exemplo, mutações que afetam a glicosilação ou permite que o anticorpo seja um anticorpo biespecífico. Pelo termo “anticorpo natural” é entendido qualquer anticorpo que não compreende quaisquer mutações geneticamente introduzidas. Um anticorpo que compreende modificações naturalmente ocorrendo, por exemplo diferentes alotipos, deve ser assim entendido como sendo um “anticorpo natural” no sentido da presente invenção, e pode ser assim entendido como um anticorpo parental. Tais anticorpos podem servir como um gabarito para, pelo menos, duas substituições de acordo com a presente invenção e, assim, fornecer os anticorpos da invenção. Um exemplo de um anticorpo parental compreendendo outras substituições diferentes das da presente invenção é o anticorpo biespecífico, como descrito em WO2011/131746 (Genmab), utilizando condições redutoras para promover a troca meia-molécula de dois anticorpos compreendendo regiões CH3 de tipo IgG4, assim formando anticorpos biespecíficos sem formação concomitante de agregados. Outros

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70/194 exemplos de anticorpos parentais incluem, mas não são limitados a, anticorpos biespecíficos, tal como biespecíficos heterodiméricos: Triomabs (Fresenius); IgGl e IgG2 biespecíficos (Rinat neurosciences Corporation); FcAAdp (Regeneron); nós-em-furo (Genentech); direção eletrostática (Amgen, Chugai, Oncomed); SEEDbodies (Merck); andaime ‘Azymetric’ (Zymeworks); mAb-Fv (Xencor); e LUZ-Y (Genentech). Outros formatos exemplares de anticorpos parentais incluem, sem limitação, um anticorpo tipo selvagem, um anticorpo de comprimento completo ou fragmento de anticorpo contendo Fe, um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico ou qualquer combinação dos mesmos.

[00230] Em uma modalidade, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma região Fe compreendendo uma substituição R435H.

[00231] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polipeptideo ou um anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, e c) uma substituição R435H, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00232] O polipeptideo ou anticorpo pode ser qualquer anticorpo humano de qualquer isotipo, por exemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, ou IgA, opcionalmente um anticorpo de comprimento completo humano, tal como um anticorpo de IgGl de comprimento completo humano. [00233] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo é um anticorpo de IgGl humana, por exemplo o alotipo IgGlm(za) ou IgGlm(f).

[00234] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 77/257 / 194 tem uma região Fc que é um isotipo humano de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, IgA ou um isotipo misto. Isto é, a região Fc de um polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a invenção tem pelo menos uma primeira e uma segunda mutação introduzidas na região Fc correspondendo a um isotipo humano de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, IgA ou um isotipo misto. Em uma modalidade da invenção, a região Fc é um isotipo misto selecionado a partir do seguinte grupo: IgGl/IgG2, IgGl/IgG3, IgGl/IgG4, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4 e IgG3/IgG4. Em um isotipo misto, a região Fc é constituída de uma sequência de aminoácidos de mais do que um isotipo.

[00235] Em uma modalidade da invenção, a região Fc é um isotipo humano de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 ou um isotipo humano.

[00236] Em uma modalidade da invenção, a região Fc é uma IgG humana.

[00237] Em uma modalidade preferida da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo tem uma região Fc que é um isotipo humano de IgG.

[00238] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo tem uma região Fc que é um alotipo de IgGlm(f), IgGlm(a), IgGlm(z), IgGlm(x) ou alotipo misto.

[00239] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma região Fc como especificada em SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 89, 168, 169 ou 170, em que a região Fc compreende uma substituição na posição selecionada a partir do grupo correspondendo a E430, E345 e S440, com a condição que a substituição em S440 é S440Y ou S440W, e uma substituição em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00240] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma região Fc como especificada em SEQ ID NO :77, 78 ou 90

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72/194 em que a região Fe compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em G236, S239, S267, H268, S324, K326, 1332, E333 e P396, em que as posições correspondem a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00241] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma região Fe como especificada em SEQ ID NO: 80, 82, 83, 84, 87 ou 88.

[00242] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo é a anticorpo humano, anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico.

Anticorpos multiespecíficos [00243] O polipeptídeo ou anticorpo da invenção não é limitado a anticorpos que têm um domínio natural, por exemplo, um domínio Fe humano, mas também pode ser um anticorpo tendo outras mutações diferentes das da presente invenção, tal como, por exemplo, mutações que afetam a glicosilação ou permitem que o anticorpo seja um anticorpo multiespecífico ou um anticorpo biespecífico. Pelo termo “anticorpo natural” significa qualquer anticorpo que não compreende quaisquer mutações geneticamente introduzidas. Um anticorpo que compreende modificações naturalmente ocorrendo, por exemplo diferentes alotipos, deve ser assim entendido como um “anticorpo natural” no sentido da presente invenção, e pode ser assim entendido como um anticorpo parental. Tais anticorpos podem servir como um gabarito para pelo menos duas substituições de acordo com a presente invenção, e assim fornecer os anticorpos da invenção. Um exemplo de um anticorpo parental compreendendo outras substituições que as da presente invenção é o anticorpo biespecífico, como descrito em WO2011/131746 (Genmab), utilizando condições de redução para promover a troca de meia molécula de dois anticorpos compreendendo regiões CH3 de tipo IgG4, assim formando anticorpos biespecíficos sem formação concomitante de agregados. Outros exemplos de anticorpos parentais incluem, mas não são limitados a,

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 79/257 / 194 anticorpos biespecíficos, tal como biespecíficos heterodiméricos: Triomabs (Fresenius); IgGl e IgG2 biespecíficos (Rinat neurosciences Corporation); FcAAdp (Regeneron); nós-em-furos (Genentech); direção eletrostática (Amgen, Chugai, Oncomed); SEEDbodies (Merck); andaime ‘Azymetric’ (Zymeworks); mAb-Fv (Xencor); e LUZ-Y (Genentech). Outros formatos exemplares anticorpo parental incluem, sem limitação, um anticorpo tipo selvagem, um anticorpo de comprimento completo ou fragmento de anticorpo contendo Fe, um anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico ou qualquer combinação dos mesmos.

[00244] Deve ser entendido que qualquer modalidade da presente invenção aqui descrita pode ser usada em anticorpo multiespecífico em um aspecto descrito abaixo.

[00245] Assim, em uma modalidade, a variante da presente invenção é um anticorpo selecionado dentre um anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico.

[00246] Em uma particular modalidade, o anticorpo biespecífico tem o formato descrito em WO 2011/131746.

[00247] O anticorpo biespecífico da presente invenção não é limitado ao formato particular e pode ser qualquer um dos descritos aqui.

[00248] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao polipeptídeo ou anticorpo que é um polipeptídeo biespecífico ou anticorpo compreendendo uma primeira cadeia pesada de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação a antígeno, e um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma segunda cadeia pesada de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação a antígeno, em que a primeira e a segunda regiões de ligação a antígeno ligam diferentes epítopos no mesmo ou em diferentes antígenos, e em que a primeira e/ou a segunda cadeia pesada compreendem

a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo correspondendo a E430, E345 e S440, com a condição que a

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74/194 substituição em S440 é S440Y ou S440W,

b) um ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396, e

c) em que a primeira cadeia pesada compreende uma substituição adicional na posição selecionada a partir do grupo consistindo em: K409, T366, L368, K370, D399, F405, e Y407; e a segunda cadeia pesada compreende uma substituição adicional na posição selecionada a partir do grupo consistindo em: F405, T366, L368, K370, D399, Y407 e K409, e em que a mutação adicional no primeiro polipeptideo é diferente da mutação adicional no segundo polipeptideo.

[00249] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma IgG humana compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma primeira região de ligação a antígeno, uma segunda cadeia pesada de uma segunda região de ligação a antígeno, em que dita primeira e segunda cadeia pesada compreende a) uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 e S440, com a condição que a substituição em S440 é S440Y ou S440W e b) uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo consistindo em: G236, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396 e c) uma substituição adicional em posição F405 ou K409; em que a substituição adicional é diferente da da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada de modo que, se a primeira cadeia pesada tem substituição em posição F405, então, a segunda cadeia pesada tem uma substituição em K409 e vice versa.

[00250] Assim, modalidades são fornecidas em que a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada não são idênticas devido à (c) mutação adicional não estar localizada na mesma posição na primeira e segunda cadeia

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 81/257 / 194 pesada.

[00251] Deve ser entendido que qualquer modalidade da presente invenção aqui descrita pode ser usada em um aspecto de anticorpo multiespecífico descrito abaixo.

[00252] Assim, em uma modalidade, a variante da presente invenção é um anticorpo selecionado dentre o anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico.

[00253] Em uma modalidade particular, o anticorpo biespecífico tem o formato descrito em WO 2011/131746.

[00254] Em uma modalidade particular da presente invenção, a primeira cadeia pesada compreende uma substituição adicional correspondendo a K409, tal como K409R; a segunda cadeia pesada compreende uma substituição adicional correspondendo a F405, tal como F405L.

[00255] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo à posição_E430,

b) uma substituição em um ou mais posição(ões) selecionadas a partir do grupo consistindo em: G236, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396, e

c) em que a primeira cadeia pesada compreende uma substituição adicional correspondendo a K409R; e a segunda cadeia pesada compreende uma substituição adicional correspondendo a F405L.

[00256] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou a segunda cadeia pesada compreendem

a) uma substituição correspondendo à posição E345,

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76/194

[00257] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou a segunda cadeia pesada Fe compreendem

a) uma substituição correspondendo a S440Y ou S440W,

[00258] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeia pesada Fe compreendem

a) uma substituição correspondendo a E430G,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333S, e

c) em que a primeira cadeia pesada compreende uma substituição adicional correspondendo a K409R, e a segunda cadeia pesada compreende uma substituição adicional correspondendo a F405L.

[00259] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas Fe compreendem

a) uma substituição correspondendo a E430G,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333T, e

[00260] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda região Fe compreendem

a) uma substituição correspondendo a E430G,

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b) duas substituições correspondendo a K326A, E333A, e

[00261] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E430G,

b) duas substituições correspondendo a K333A, P396L, e

[00262] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E430G,

b) três substituições correspondendo a K326A, E333A, P396L, e

[00263] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E430G,

b) três substituições correspondendo a K326A, E333T, P396L, e

[00264] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

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a) uma substituição correspondendo a E345K,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333S, e

[00265] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345K,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333T, e

[00266] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345K,

b) duas substituições correspondendo a K326A, E333A, e

[00267] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345K,

b) duas substituições correspondendo a K333A, P396L, e

[00268] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345K,

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b) três substituições correspondendo a K326A, E333A, P396L, e

[00269] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345K,

b) três substituições correspondendo a K326A, E333T, P396L, e

[00270] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345R,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333S, e

[00271] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345R,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333T, e

[00272] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

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80/194

a) uma substituição correspondendo a E345R,

b) duas substituições correspondendo a K326A, E333A, e

[00273] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345R,

b) duas substituições correspondendo a K333A, P396L, e

[00274] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a E345R,

b) três substituições correspondendo a K326A, E333A, P396L, e

[00275] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a S440Y,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333S, e

[00276] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

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81/194

a) uma substituição correspondendo a S440Y,

b) duas substituições correspondendo a K326W, E333T, e

[00277] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a S440Y,

b) duas substituições correspondendo a K326A, E333A, e

[00278] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a S440Y,

b) duas substituições correspondendo a K333A, P396L, e

[00279] Em uma modalidade da presente invenção, a primeira e/ou segunda cadeias pesadas compreendem

a) uma substituição correspondendo a S440Y,

b) três substituições correspondendo a K326A, E333A, P396L, e

Alvos e método de uso [00280] O polipeptideo ou anticorpo de acordo com a presente

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82/194 invenção pode se ligar a um alvo que ativa uma via de transdução de sinal. Em uma modalidade, o alvo é um alvo que ativa, inibe, modula e ou regula a via de transdução de sinal. Exemplos de alvos que podem ser particularmente apropriados como alvos de acordo com a presente invenção são receptores e ligandos de superfície celular.

[00281] Os receptores de superfície celular incluem, por exemplo, receptores que pertencem a famílias de receptores tal como a família do receptor de fator hematopoietico, a família receptor de citocina, a família receptor de tirosina quinase, a família de receptor de serina/treonina quinase, a família de receptor de TNF, a família de receptor acoplado a proteína G„ a família de receptor ancorado a GPI, a família do receptor de tirosina fosfatase receptor, a família de fator de adesão, a família de receptor de hormônio. Várias referências que se refere aos receptores pertencendo a estas famílias de receptor e suas características são disponíveis e incluem, por exemplo, Cooke B A., King R J B., van der Molen H J. ed. New Comprehensive Biochemistry Vol. 18B “Hormones and their Actions Part Π” pp. 1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., New York, USA; Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14; Ullrich A., et al. (1990) Cell, 61: 203-212; Massagul J. (1992) Cell, 69: 10671070; Miyajima A., et al. (1992)Annu. Rev. Immunol., 10: 295-331; Taga T. e Kishimoto T. (1992) FASEB J., 7: 3387-3396; Fantl W I., et al. (1993) Annu. Rev. Biochem., 62: 453-481; Smith C A., et al. (1994) Cell, 76: 959962; Flower D R. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207-234; e M. Miyasaka ed., Cell Technology, supplementary volume, Handbook series, “Handbook for Adhesion Fators” (1994) (Shujunsha, Tokyo, Japan).

[00282] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno em que a região de ligação a antígeno se liga a um membro da super-família do receptor de fator de necrose de tumor (TNFR-SF) ou super-família do receptor acoplado a proteína G (GPCR).

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 89/257 / 194 [00283] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo se liga ao receptor de superfície celular incluindo, por exemplo, receptores de hormônio e receptores de citocinas. Os receptores de citocinas exemplares incluem, por exemplo, receptor de fator hematopoietico, receptor de linfocina, receptor de fator de crescimento, receptor de fator de controle de diferenciação e similares. Exemplos de receptores de citocinas são receptor de eritropoietina (EPO), receptor de trombopoietina (TPO), receptor de fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), receptor de fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF), receptor de fator estimulante de colônia de macrófagos granulares (GM-CSF), receptor de fator de necrose de tumor (TNF), receptor de interleucina-1 (IL-1), receptor de interleucina-2 (IL-2), receptor de interleucina-3 (IL-3), receptor de interleucina-4 (IL- 4), receptor de interleucina-5 (IL-5), receptor de interleucina-6 (IL-6), receptor de interleucina-7 (IL-7), receptor de interleucina-9 (IL-9), receptor de interleucina-10 (IL-10), receptor de interleucina-11 (IL-11), receptor de interleucina-12 (IL-12), receptor de interleucina-13 (IL-13), receptor de interleucina-15 (IL- 15), receptor de interferon- alfa (IFN-alfa), receptor de interferon-beta (IFN-beta), receptor de interferon-gama (IFN-gama), receptor de hormônio do crescimento (GH), receptor de insulina, receptor de fator de proliferação de células-tronco do sangue (SCF), receptor de fator de crescimento epidérmico vascular (VEGF), receptor de fator de crescimento de células epidérmicas (EGF), receptor de fator de crescimento dos nervos (NGF), receptor de fator de crescimento de fibroblastos (FGF), receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), receptor de fator de crescimento transformante-beta (TGF-beta), receptor de fator inibitório da migração de leucócitos (LIF), receptor de fator neurotrófico ciliar (CNTF), receptor de oncostatina M (OSM), e receptor de família Notch.

[00284] A superfamília do fator de necrose de tumor receptor (TNFRSF) é um grupo de receptores caracterizado pela capacidade de ligar

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84/194 ligandos da superfamilia do fator de necrose de tumor TNFSF) via um domínio rico em cisteína extracelular. Os receptores de TNF formam complexos triméricos na membrana do plasma. O TNFRSF inclui a seguinte lista de 29 proteínas; TNFR1 (Uniprot P19438), FAS (Uniprot P25445), DR3 (Uniprot Q93038), DR4(Uniprot 000220), DR5 (Uniprot 014763), DR6 (Uniprot 075509), NGFR (Uniprot P08138), EDAR (Uniprot Q9UNE0), DcRl (Uniprot 014798), DcR2(Uniprot Q9UBN6), DcR3 (Uniprot 095407), OPG (Uniprot 000300), TROY (Uniprot Q9NS68), XEDAR (Uniprot Q9HAV5), LTbR (Uniprot P36941), HVEM (Uniprot Q92956), TWEAKR (Uniprot Q9NP84), CD120b (Uniprot P20333), 0X40 (Uniprot P43489), CD40 (Uniprot P25942), CD27 (Uniprot P26842), CD30 (Uniprot P28908), 4-1BB (Uniprot Q07011), RANK (Uniprot Q9Y6Q6), TACI (Uniprot 014836), BLySR (Uniprot Q96RJ3), BCMA(Uniprot Q02223), GITR (Uniprot Q9Y5U5), RELT (Uniprot Q969Z4).

[00285] Algumas TNFRSF estão envolvidas em apoptose e contém um domínio de morte intracelular, tal como FAS, DR4, DR5, TNFR1, DR6, DR3, EDAR e NGFR. Outras TNFRSF estão envolvidas em outras vias de transdução de sinal, tal como proliferação, sobrevivência, e diferenciação tal como DcRl, DcR2, DcR3, OPG, TROY, XEDAR, LTbR, HVEM, TWEAKR, CD120b, 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR, RELT. Os receptores TNF são expressados em uma ampla variedade de tecidos em mamíferos, especialmente em leucócitos.

[00286] Em uma modalidade da invenção, a região de ligação a antígeno se liga a um membro do TNFR-SF selecionado a partir do grupo consistindo em: FAS, DR4, DR5, TNFR1, DR6, DR3, EDAR, NGFR, 0X40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT e GITR.

[00287] Em uma modalidade da invenção, a região de ligação a antígeno se liga a um membro do TNFR-SF. Em uma modalidade da invenção, a região de ligação a antígeno se liga a um membro do TNFR-SF

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 91/257 / 194 que não compreende um domínio de morte intracelular. Em uma modalidade da invenção, a TNFR-SF é selecionada a partir do grupo de: 0X40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT e GITR. Em uma modalidade da invenção, a TNFR-SF é selecionada a partir do grupo de: FAS, DR4, DR4, TNFR1, DR6, DR3, EDAR, e NGFR.

[00288] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a 0X40, em que a região Fe de IgGl compreende:

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00289] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a CD40, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00290] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a CD 137, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00291] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a GITR, em que a região Fe de IgG compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00292] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a GITR, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

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b. uma substituição K326W e E333S.

[00293] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a GITR, em que a região Fe de IgG2 compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00294] O polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a invenção pode se ligar a qualquer alvo, exemplos de tais alvos ou antígenos de acordo com a invenção podem ser, dirigidos contra: TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, NGFR, EDAR, DcRl, DcR2, DcR3, OPG, TROY, XEDAR, LTbR, HVEM, TWEAKR, CD120b, 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR, RELT.

[00295] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a FAS, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00296] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a DR5, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326A e E333A.

[00297] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a DR5, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326A e E333T.

[00298] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a DR5, em que a região Fe de IgGl

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 93/257 / 194 compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326A.

[00299] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a DR5, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição E333A.

[00300] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a DR5, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00301] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma região de ligação a antígeno ligando a CD20, em que a região Fe de IgGl compreende,

a. uma substituição E430G, e

b. uma substituição K326W e E333S.

[00302] Em uma modalidade da invenção, a região de ligação a antígeno se liga a um membro da superfamília de fator de necrose de tumor (TNF-SF).

[00303] Em uma modalidade da invenção, a região de ligação a antígeno se liga a um membro da TNF-SF selecionada a partir do grupo consistindo em: linfotoxina beta (TNF-C), OX40L, CD 154, FasL, CD70, CD153, RANKL, APRIL e BAFF.

[00304] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo se ligando a um receptor de superfície celular inclui, por exemplo, receptores de hormônio e receptores de citocina. Os receptores de citocina exemplares incluem, por exemplo, receptor de fator hematopoietico, receptor de linfocina,

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 94/257 / 194 receptor de fator de crescimento, receptor de fator de controle de diferenciação e similares. Exemplos de receptores de citocina são receptor de eritropoietina (EPO), receptor de trombopoietina (TPO), receptor de fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), receptor de fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF), receptor de fator estimulante de colônia de macrófagos granulares (GM-CSF), receptor de fator de necrose de tumor (TNF), receptor de interleucina-1 (IL-1), receptor de interleucina-2 (IL-2), receptor de interleucina-3 (IL-3), receptor de interleucina-4 (IL- 4), receptor de interleucina-5 (IL-5), receptor de interleucina-6 (IL-6), receptor de interleucina-7 (IL-7), receptor de interleucina-9 (IL-9), receptor de interleucina-10 (IL-10), receptor de interleucina-11 (IL-11), receptor de interleucina-12 (IL-12), receptor de interleucina-13 (IL-13), receptor de interleucina-15 (IL- 15), receptor de interferon- alfa (IFN-alfa), receptor de interferon-beta (IFN-beta), receptor de interferon-gama (IFN-gama), receptor de hormônio do crescimento (GH), receptor de insulina, receptor de fator de proliferação de células-tronco do sangue (SCF), receptor de fator de crescimento epidérmico vascular (VEGF), receptor de fator de crescimento de células epidérmicas (EGF), receptor de fator de crescimento de nervos (NGF), receptor de fator de crescimento de fibroblastos (FGF), receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), receptor de fator de crescimento transformante-beta (TGF-beta), receptor de fator inibitório da migração de leucócitos (LIF), receptor de fator neurotrófico ciliar (CNTF), receptor de oncostatina M (OSM), receptor de família Notch.

[00305] Em uma modalidade da invenção, a região de ligação a antígeno se liga a um receptor de superfície celular selecionado a partir do grupo consistindo em: CTLA-4, PD1, TIM-3, LAG-3, ICOS, CD28 e PDL-1. [00306] O polipeptideo ou anticorpo de acordo com a invenção pode se ligar a qualquer alvo, exemplos de tais alvos ou antígenos de acordo são descritos acima.

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Métodos para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo [00307] Deve ser entendido que as modalidades descritas abaixo com referência a um polipeptídeo ou anticorpo referem-se a um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, um polipeptídeo ou anticorpo também pode ser um polipeptídeo multiespecífico ou anticorpo tendo uma primeira região Fe de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação a antígeno, e um segundo polipeptídeo ou anticorpo tendo uma segunda região Fe de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação a antígeno.

[00308] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo por introdução de uma substituição intensificando Fc-Fc e uma substituição de ligação a Clq.

[00309] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, cujo método compreende a) introduzir pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) introduzir uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00310] Introduzindo a) pelo menos uma substituição de acordo com a invenção que está em uma das seguintes posições E430, E345 ou S440 introduz o efeito de interações Fc-Fc intensificadas do polipeptídeo ou anticorpo. Introduzindo b) uma ou mais substituições de acordo com a invenção, que está em uma das seguintes posições G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, introduz o efeito de atividade agonística

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90/194 aumentada no polipeptídeo ou anticorpo.

[00311] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fc de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fc compreende a) pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e cujo método compreende b) introduzir uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00312] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fc de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fc compreende a) pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e cujo método compreende b) introduzir pelo menos duas substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00313] Aumentando a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a presente invenção deve ser entendido como aumentando a atividade agonística do polipeptídeo ou anticorpo comparada com um polipeptídeo ou anticorpo parental, altemativamente aumentando a atividade agonística do polipeptídeo ou anticorpo também pode se referir a quando o polipeptídeo ou anticorpo é comparado com um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma mutação intensificando Fc-Fc mas não uma mutação de ligação a Clq. Assim, deve ser entendido que o polipeptídeo ou

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 97/257 / 194 anticorpo pode ser comparado com um polipeptideo parental ou anticorpo parental tendo a região de ligação a antígeno idêntica e uma região Fe sem uma substituição intensificando Fc-Fc e sem uma substituição de ligação a Clq, altemativamente, o polipeptideo ou anticorpo pode ser comparado com um polipeptideo ou anticorpo tendo a região de ligação a antígeno idêntica e uma região Fe com um substituição intensificando Fc-Fc, mas sem a substituição de ligação a Clq.

[00314] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição G236 não é G236F, G236R, G236Y.

[00315] Em uma modalidade da invenção, um ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição S267 não é S267H, S267I, S267K, S267G.

[00316] Em uma modalidade da invenção, um ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição H268 não é H268K, H268D, H268E.

[00317] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W e S440Y. Aqui modalidades são fornecidas em que a substituição intensifica as interações Fc-Fc.

[00318] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F, E430T.

[00319] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q,

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E345R, E345Y.

[00320] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E430G. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E345K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E345R. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição S440Y.

[00321] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00322] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00323] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E430G, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.

[00324] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E430G, cujo método

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 99/257 / 194 compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00325] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E430G, cujo método compreende introduzir as substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00326] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00327] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00328] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E345K, cujo método

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94/194 compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00329] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende uma substituição E345K, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00330] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende uma substituição E345K, cujo método compreende introduzir as substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00331] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende um substituição E345R, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00332] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende uma substituição E345R, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 101/257 / 194 do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00333] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E345R, cujo método compreende introduzir as substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00334] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: S440Y e S440W, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00335] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: S440W e S440W, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00336] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição S440Y, cujo método compreende um ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 102/257

96/194 [00337] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição S440Y, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00338] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende um substituição S440Y, cujo método compreende introduzir as substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00339] Aqui são fornecidas modalidades que permitem propriedades agonísticas aumentadas de polipeptídeos ou anticorpos quando da ligação de antígeno na superfície celular. Em uma modalidade, os polipeptídeos ou anticorpos compreendem propriedades agonísticas aumentadas. Em uma modalidade, os polipeptídeos ou anticorpos compreendem uma região Fe compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma segunda cadeia pesada, em que uma das substituições acima mencionadas pode estar presente na primeira e/ou a segunda cadeia pesada.

[00340] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições, tal como duas ou três substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 103/257 / 194 polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições K326 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições K326 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições P396 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições K326, E333 e P396.

[00341] Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326A, K326W, E333S, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição K326A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição K326W. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326W e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326W e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326A e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de E333S e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de

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K326A, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326S, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326W, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326W, E333S e P396L.

[00342] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições, tal como duas ou três substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267 e H268. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267, H268 e S324.

[00343] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267E, H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: S267E, H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S267E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição H268F. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de S267E e H268F. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de S267E e S324T.

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99/194

Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de: S267E, H268F e S324T.

[00344] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método em que a região Fe compreende uma ou mais substituições adicionais. [00345] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método em que a região Fe compreende uma substituição adicional nas seguintes posições em IgGl humana de acordo com a numeração da UE: S440 ou K439. Em uma modalidade da invenção, a região Fe compreende uma substituição adicional correspondendo a uma das seguintes posições S440 ou K439, com a condição que uma substituição adicional não é em posição S440 se a substituição intensificando Fc-Fc é em S440. Polipeptideos ou anticorpos, compreendendo a substituição intensificando Fc-Fc e a substituição de ligação a Clq de acordo com a presente invenção e uma substituição adicional em posição S440 tal como S440K, não formam oligômeros com polipeptideos ou anticorpos compreendendo a mutação na posição S440 tal como S440K. Polipeptideos ou anticorpos, compreendendo a substituição intensificando Fc-Fc e a substituição de ligação a Clq de acordo com a presente invenção e uma substituição adicional em posição K439 tal como K439E, não formam oligômeros com polipeptideos ou anticorpos compreendendo a mutação em posição K439 tal como K439E. Aqui, um método é fornecido que permite a formação de oligômeros entre polipeptideos ou anticorpos em que um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição K439E e um segundo polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S440K. Deste modo, oligômeros tal como, por exemplo, hexâmeros podem ser forçados a serem formados em alguns padrões do primeiro e segundo polipeptideos. Isto pode ser de interesse em métodos onde os polipeptideos se ligam a diferentes alvos ou epítopos e oligômeros devem

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100/194 ser formados em combinações destes diferentes alvos ou epítopos.

[00346] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método em que a substituição adicional é selecionada dentre S440K ou K439E.

[00347] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade agonística em que a atividade agonística é aumentada por pelo menos 20% comparado com um polipeptídeo parental ou anticorpo parental que é idêntico ao polipeptídeo ou anticorpo ou altemativamente ao polipeptídeo ou anticorpo com uma substituição idêntica intensificando Fc-Fc, mas sem a substituição de ligação a Clq. Em outra modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo tem uma atividade agonística aumentada de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60 %, pelo menos 70% pelo menos 80 %, pelo menos 90%, pelo menos 95% comparado com um polipeptídeo parental ou anticorpo parental ou altemativamente com o polipeptídeo ou anticorpo com uma substituição idêntica intensificando Fc-Fc, mas sem a substituição de ligação a Clq. Métodos para aumentar a atividade de CDC [00348] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo introduzindo uma substituição intensificando Fc-Fc e uma substituição de ligação a Clq.

[00349] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, cujo método compreende a) introduzir pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e b) introduzir uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

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101/194 [00350] Introduzir a) pelo menos uma substituição de acordo com a invenção que está em uma das seguintes posições E430, E345 ou S440 introduz o efeito de interações Fc-Fc intensificadas do polipeptídeo ou anticorpo. Introduzir b) uma ou mais substituições de acordo com a invenção que está em uma das seguintes posições G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396 introduz o efeito de atividade aumentada de CDC no polipeptídeo ou anticorpo.

[00351] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende a) pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e cujo método compreende b) introduzir uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00352] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende a) pelo menos uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e cujo método compreende b) introduzir pelo menos duas substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, em que a posição corresponde a IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00353] Aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a presente invenção deve ser entendido como

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102/194 aumentar a atividade de CDC do polipeptídeo ou anticorpo comparado com um polipeptídeo ou anticorpo parental, altemativamente aumentando a atividade agonística do polipeptídeo ou anticorpo também pode fazer referência a quando o polipeptídeo ou anticorpo é comparado com um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma mutação intensificando Fc-Fc, mas não uma mutação de ligação a Clq. Assim, deve ser entendido que o polipeptídeo ou anticorpo pode ser comparado com um polipeptídeo parental ou anticorpo parental tendo a região de ligação a antígeno idêntica e uma região Fe sem uma substituição intensificando Fc-Fc e sem uma substituição de ligação a Clq, altemativamente o polipeptídeo ou anticorpo pode ser comparado com um polipeptídeo ou anticorpo tendo uma região de ligação a antígeno idêntica e uma região Fe com uma substituição intensificando Fc-Fc, mas sem a substituição de ligação a Clq.

[00354] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição G236 não é G236F, G236R, G236Y.

[00355] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição S267 não é S267H, S267I, S267K, S267G.

[00356] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, com a condição que a substituição em posição H268 não é H268K, H268D, H268E.

[00357] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W e S440Y. Pelo presente, modalidades são fornecidas em que a substituição intensifica

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103 / 194 interações Fc-Fc.

[00358] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S,

E430F, E430T.

[00359] Em uma modalidade da invenção, pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q,

E345R, E345Y.

[00360] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E430G. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E345K. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição E345R. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo tem pelo menos uma substituição S440Y.

[00361] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00362] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F e E430T, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00363] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E430G, cujo método

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104 / 194 compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.

[00364] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E430G, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00365] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E430G, cujo método compreende introduzir a substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00366] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00367] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir

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105 / 194 do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R e E345Y, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00368] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E345K, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00369] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E345K, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00370] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E345K, cujo método compreende introduzir a substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00371] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptideo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição E345R, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição

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106 / 194 selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00372] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende uma substituição E345R, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00373] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende uma substituição E345R, cujo método compreende introduzir a substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00374] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: S440Y e S440W, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00375] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fc compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: S440W e S440W, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de:

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107 / 194

K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00376] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição S440Y, cujo método compreende um ou mais substituição(ões) em uma posição selecionada a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396.

[00377] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição S440Y, cujo método compreende introduzir uma ou mais substituição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: K326A, K326W, E333A, E333S, E333T, e P396L.

[00378] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para aumentar atividade CDC de um polipeptídeo ou anticorpo em que a região Fe compreende uma substituição S440Y, cujo método compreende introduzir a substituição(ões) de um dos grupos consistindo em:

i) K326WeE333S, ii) K326WeE333T, iii) K326A e E333A, iv) K326A, E333A e P396L,

v) K326W, vi) E333S, e vii) E333T.

[00379] Pelo presente são fornecidas modalidades que permitem a atividade CDC aumentada de polipeptídeos ou anticorpos por ligação a antígeno na superfície celular. Em uma modalidade, os polipeptídeos ou anticorpos compreendem atividade aumentada de CDC. Em uma modalidade, os polipeptídeos ou anticorpos compreendem uma região Fe compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma segunda cadeia pesada, em que uma das substituições acima mencionadas pode estar presente na primeira e/ou

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108 / 194 segunda cadeia pesada.

[00380] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições, tal como duas ou três substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições K326 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições K326 e P396. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições P396 e E333. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende substituições nas posições K326, E333 e P396.

[00381] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326A, K326W, E333S, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição K326A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma K326W substituição. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende uma substituição P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326W e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326W e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326W e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326A e E333A. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo ou anticorpo compreende as substituições de K326A

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109 / 194 e E333S. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de E333S e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326A, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326S, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326W, E333A e P396L. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de K326W, E333S e P396L.

[00382] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições, tal como duas ou três substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267 e H268. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições H268 e S324. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende substituições nas posições S267, H268 e S324.

[00383] Em uma modalidade da invenção, uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267E, H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: S267E, H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição

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S267E. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição H268F. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende uma substituição S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de S267E e H268F. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de S267E e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de H268F e S324T. Em uma modalidade da invenção, o polipeptideo ou anticorpo compreende as substituições de: S267E, H268F e S324T.

Composições [00384] Deve ser entendido que as modalidades descritas abaixo com referência a um polipeptideo ou anticorpo referem-se a um polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, um polipeptideo ou anticorpo também pode ser um polipeptideo ou anticorpo multiespecífico tendo uma primeira região Fe de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação a antígeno, e um segundo polipeptideo ou anticorpo tendo uma segunda região Fe de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação a antígeno.

[00385] A invenção também refere-se a composições compreendendo polipeptídeos ou anticorpos descritos aqui e variações dos mesmos. Os aspectos e modalidades específicos serão descritos abaixo. Além do mais, tal polipeptideo ou anticorpo pode ser obtido de acordo com qualquer método descrito aqui.

[00386] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo pelo menos um polipeptideo ou anticorpo descrito aqui.

[00387] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um ou mais polipeptídeos ou anticorpos de acordo com qualquer

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Ill / 194 aspecto ou modalidade descritos aqui.

[00388] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo e um segundo polipeptídeo ou anticorpo como descrito em qualquer aspecto ou modalidade aqui.

[00389] Em um aspecto da invenção, a composição compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo ou anticorpo, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos ou anticorpos compreende uma região Fc compreendendo, (i) pelo menos uma substituição, que é uma mutação intensificando Fc-Fc; e (ii) uma ou mais substituições, que são substituições de ligação a Clq; e (iii) uma mutação adicional, que evita a oligomerização entre regiões Fc tendo a mutação idêntica adicional, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos ou anticorpos não compreendem a mesma mutação adicional. [00390] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo e um segundo polipeptídeo ou anticorpo em que o primeiro e segundo polipeptídeos ou anticorpos compreendem i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou S440Y ou S440W, e ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333, e P396 e iii) uma mutação adicional em que o primeiro e o segundo polipeptídeos ou anticorpos não compreendem a mesma mutação adicional. Assim, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região Fc e um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma segunda região Fc.

[00391] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende

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112/194 um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

(i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W; e (ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333,eP396;e (iii) uma substituição adicional em posição K439 ou S440, com a condição que se a substituição adicional é em S440, então a substituição de acordo com (i) não é em S440, com a condição que a primeira e segunda regiões Fe não compreendem uma substituição adicional de acordo com (iii) na mesma posição de aminoácido, (iv) em que as substituições correspondem às posições de aminoácido em IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00392] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem (i) uma primeira mutação, (ii) uma segunda mutação, (iii) uma mutação adicional, em que as mutações correspondem às seguintes posições de aminoácidos em IgGl humana, de acordo com a numeração da UE:

(i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: E430, E345 ou uma substituição S440Y ou S440W; e;

(ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332,

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E333,eP396;e (iii) uma substituição adicional em posição K439 na primeira região Fe e uma substituição adicional em posição S440 na segunda região Fe, ou vice versa, com a condição que se a substituição adicional é em posição S440, então a substituição não é em S440;

(iv) em que as substituições correspondem às posições de aminoácido em IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00393] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

(i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: E430, E345 ou uma substituição S440Y ou S440W; e (ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333,eP396;e (iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, e (iv) em que as substituições correspondem ás posições de aminoácido em IgGl humana, de acordo com a numeração da UE.

[00394] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

(i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W; e

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114/194 (ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333,eP396;e (iii) uma substituição S440K adicional na primeira região Fc e uma substituição K439E adicional na segunda região Fc;

[00395] Assim, modalidades são fornecidas em que um ou ambos primeiro e o segundo polipeptídeos ou anticorpo têm atividade aumentada agonística e/ou atividade de CDC, ou somente o primeiro ou o segundo polipeptídeo tem a atividade agonística e/ou atividade de CDC aumentadas.

[00396] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fc, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fc, em que a primeira e segunda regiões Fc compreendem:

(i) uma substituição no aminoácido posição correspondendo a E430, e (ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333,eP396;e (iii) substituição K439E adicional na primeira região Fc e uma substituição S440K adicional na segunda região Fc, ou vice versa.

[00397] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fc, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fc, em que a primeira e segunda regiões Fc compreendem:

i) uma substituição na posição de aminoácido correspondendo

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115/194 a E345, e ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333,eP396;e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00398] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E430G, e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A, P396L, S267E, H268F, S324T, G263A, S324E, I332E e S239D; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00399] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E430G, e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L; e (iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00400] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região

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116/194 de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E430G, e ii) pelo menos duas substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00401] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma substituição E430G, e ii) uma substituição K326W e E333S ; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00402] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E345K, e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A, P396L, S267E, H268F, S324T, G263A, S324E, I332E e S239D; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00403] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende

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117/194 um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E345K, e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00404] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E345K, e ii) pelo menos duas substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00405] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma substituição E345K, e ii) uma substituição K326W e E333S ; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00406] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende

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118/194 um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E345R, e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A, P396L, S267E, H268F, S324T, G263A, S324E, I332E e S239D; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00407] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E345R, e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00408] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma E345R, e ii) pelo menos duas substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e

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119/194 uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00409] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreendem:

i) uma substituição E345R, e ii) uma substituição K326W e E333S ; e iii) uma substituição K439E adicional na primeira região Fe e uma substituição S440K adicional na segunda região Fe, ou vice versa. [00410] Em outra modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo ou anticorpo, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos ou anticorpos compreende uma região Fe compreendendo,

i) pelo menos uma substituição, que é uma mutação intensificando Fc-Fc;

ii) uma mutação adicional, que evita a oligomerização entre regiões Fe tendo a mutação idêntica adicional, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos ou anticorpos não compreendem a mesma mutação adicional, iii) e ou a primeira ou a segunda região Fe compreende uma ou mais substituições, que são substituições de ligação a Clq. Assim, em algumas modalidades, somente o primeiro ou o segundo polipeptídeo ou anticorpo compreende uma segunda mutação que diminui as funções efetoras de Fe.

[00411] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira e segunda regiões Fe compreende

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i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, ii) uma mutação K439E ou S440K adicional, em que a primeira e segunda regiões Fe não compreendem a mesma substituição adicional, e em que se pelo menos uma substituição é S440Y ou S440W, então a mutação adicional não é S440K;

iii) e ou a primeira ou a segunda região Fe compreende uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333, e P396.

[00412] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira região Fe compreende (i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333, e P396, e uma iii) K439E mutação adicional; e a segunda região Fe compreende i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: substituição E430, E345 ou a S440Y ou S440W, e uma mutação S440K adicional. Pelo presente, modalidades são fornecidas em que somente o primeiro polipeptideo ou anticorpo tem atividade aumentada agonística e/ou atividade aumentada de CDC.

[00413] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira região Fe compreende (i) pelo menos

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121/194 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: E430, E345, e ii) uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333, e P396, e a iii) mutação S440K adicional; e a segunda região Fe compreende i) pelo menos uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: E430, E345 ou uma substituição S440Y ou S440W, e uma mutação K439E adicional. Pelo presente, modalidades são fornecidas em que somente o primeiro polipeptideo ou anticorpo tem atividade aumentada agonística e/ou atividade aumentada de CDC.

[00414] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira região Fe compreende (i) uma substituição E430G e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L e iii) uma substituição K439E adicional; e a segunda região Fe compreende i) uma substituição E430G, e uma substituição S440K adicional.

[00415] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptideo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira região Fe compreende (i) uma substituição E430G e ii) uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333A e P396L e iii) uma substituição S440K adicional; e a segunda região Fe compreende i) uma substituição E430G, e uma substituição K439E adicional.

[00416] Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma primeira região

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122/194 de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira região Fe compreende (i) a E430G substituição e ii) uma substituição K326W e E333S, e iii) uma substituição S440K adicional; e a segunda região Fe compreende i) uma substituição E430G, e uma substituição K439E adicional. Em uma modalidade da invenção, a composição compreende um primeiro polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma primeira região de ligação a antígeno e uma primeira região Fe, um segundo polipeptídeo ou anticorpo compreendendo segunda região de ligação a antígeno e uma segunda região Fe, em que a primeira região Fe compreende (i) uma substituição E430G e ii) uma substituição K326W e E333S, e iii) uma substituição K439E adicional; e a segunda região Fe compreende i) uma substituição E430G e uma substituição S440K adicional.

[00417] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um polipeptídeo ou anticorpo capaz de ligar ao membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFR-SF) ou superfamília de receptor acoplado a proteína G (GPCR) [00418] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um polipeptídeo ou anticorpo capaz de se ligar a um membro de TNFR-SF selecionado a partir do grupo consistindo em: TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, NGFR, EDAR DcRl, DcR2, DcR3, OPG, TROY, XEDAR, LTbR, HVEM, TWEAKR, CD120b, 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR e RELT.

[00419] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um polipeptídeo ou anticorpo capaz de se ligar a um membro de TNFR-SF com um domínio de morte intracelular selecionado a partir do seguinte grupo consistindo em: TNFR1, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6, NGFR e EDAR.

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123 / 194 [00420] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um polipeptídeo ou anticorpo capaz de se ligar a um membro de TNFR-SF sem um domínio de morte intracelular selecionado a partir do seguinte grupo consistindo em: DcRl, DcR2, DcR3, OPG, TROY, XEDAR, LTbR, HVEM, TWEAKR, CD120b, 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR, RELT.

[00421] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um polipeptídeo ou anticorpo capaz de se ligar a um membro de TNFR-SF pertencendo ao grupo de ativadores imunes consistindo em: 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR e RELT.

[00422] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um polipeptídeo ou anticorpo em que um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo se ligam a diferentes epítopos em um ou mais membros de TNFR-SF sem um domínio de morte intracelular, selecionado a partir do seguinte grupo consistindo em: 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR e RELT.

[00423] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreende um polipeptídeo ou anticorpo em que um primeiro polipeptídeo ligando a um membro de TNFR-SF sem um domínio de morte intracelular selecionado a partir do seguinte grupo consistindo em: 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR e RELT não bloqueiam a ligação de dito segundo anticorpo se ligando a um membro de TNFR-SF sem um domínio de morte intracelular selecionado a partir do seguinte grupo consistindo em: 0X40, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, GITR e RELT.

[00424] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreendendo um primeiro polipeptídeo ou anticorpo e um segundo polipeptídeo ou anticorpo estão presentes na composição em uma razão molar de 1:49 a 49:1, tal como uma razão molar de 1:1, uma razão molar de 1:2,

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124/194 uma razão molar de 1:3, uma razão molar de 1:4, uma razão molar de 1:5, uma razão molar de 1:6, uma razão molar de 1:7, uma razão molar de 1:8, uma razão molar de 1:9, uma razão molar de 1:10, uma razão molar de 1:15, uma razão molar de 1:20, uma razão molar de 1:25, uma razão molar de 1:30, uma razão molar de 1:35, uma razão molar de 1:40, uma razão molar de 1:45, uma razão molar de 1:50, uma razão molar de 50:1, uma razão molar de 45:1, uma razão molar de 40:1, uma razão molar de 35:1, uma razão molar de 30:1, uma razão molar de 25:1, uma razão molar de 20:1, uma razão molar de 15:1, uma razão molar de 10:1, uma razão molar de 9:1, uma razão molar de 8:1, uma razão molar de 7:1, uma razão molar de 6:1, uma razão molar de 5:1, uma razão molar de 4:1, uma razão molar de 3:1, uma razão molar de 2:1.

[00425] Em uma modalidade da presente invenção, a composição compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo e/ou qualquer polipeptídeo adicional estão presentes na composição em uma razão equimolar.

[00426] Em uma modalidade da presente invenção, a composição de acordo com qualquer aspecto ou modalidade é uma composição farmacêutica. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS [00427] Os polipeptídeos, anticorpos, anticorpos biespecífico ou composições de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção podem ser usados como um medicamento, isto é, para aplicações terapêuticas.

[00428] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo, anticorpo ou uma composição de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descritos aqui para uso como um medicamento.

[00429] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo, anticorpo ou uma composição de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descritos aqui para uso no tratamento de câncer, doença autoimune, doença inflamatória ou doença infecciosa.

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125 / 194 [00430] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratar um indivíduo tendo uma doença compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo, anticorpo ou composição de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descritos aqui.

[00431] Em uma modalidade da invenção, a doença é selecionada a partir do grupo de: câncer, doença autoimune, doença inflamatória e doença infecciosa.

[00432] Em uma modalidade da invenção, o método de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descritos aqui refere-se à administração adicional de um agente terapêutico adicional.

[00433] Em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico adicional é um ou mais agente(s) anticâncer selecionado(s) a partir do grupo consistindo em quimioterapêuticos (incluindo mas não limitados a paclitaxel, temozolomida, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, irinotecano, doxorubicina, gemcitabina, 5-fluorouracil, pemetrexed), inibidores de quinase (incluindo mas não limitados a sorafenib, sunitinib ou everolimus), agentes moduladores de apoptose (incluindo mas não limitados a TRAIL humano recombinante ou birinapant), inibidores de RAS, inibidores de proteassoma (incluindo mas não limitados a bortezomib), inibidores de histona deacetilase (incluindo mas não limitados a vorinostat), nutracêuticos, citocinas (incluindo mas não limitadas a IFN-γ), anticorpos ou miméticos de anticorpos (incluindo mas não limitados a anticorpos anti-EGFR, anti-IGF-lR, anti-VEGF, antiCD20, anti-CD38, anti-HER2, anti-PD-1, anti-PD-Ll, anti-CTLA4, antiCD40, anti-CD137, anti-GITR e miméticos de anticorpo), conjugados de anticorpo-fármaco.

KIT DE PARTES [00434] Deve ser entendido que as modalidades descritas abaixo com referência a um polipeptídeo ou anticorpo referem-se a um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma

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126/194 região de ligação a antígeno, um polipeptídeo ou anticorpo também pode ser um polipeptídeo ou anticorpo multiespecífico tendo uma primeira região Fc de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação a antígeno, e um segundo polipeptídeo ou anticorpo tendo uma segunda região Fc de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação a antígeno.

[00435] A invenção também refere-se a kits de partes para o uso simultâneo, separado ou sequencial em terapia compreendendo polipeptídeos ou anticorpos descritos aqui. Além do mais, tais variantes podem ser obtidas de acordo com qualquer método descrito aqui.

[00436] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um kit de partes compreendendo um polipeptídeo, anticorpo ou composição de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descrito aqui, em que dito polipeptídeo, anticorpo ou composição está em um ou mais recipientes, tais como frascos pequenos.

[00437] Em uma modalidade da presente invenção, o kit de partes compreende um polipeptídeo, anticorpo ou uma composição de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descrito aqui, para uso simultâneo, separado ou sequencial em terapia. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um polipeptídeo, um anticorpo, uma composição ou kit de partes de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para uso em um método diagnóstico.

[00438] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método diagnóstico compreendendo a administração de um polipeptídeo, anticorpo, uma composição ou um kit de partes de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas a pelo menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero.

[00439] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um polipeptídeo, um anticorpo, uma composição ou kit de partes de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas na formação de imagem de pelo

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127 / 194 menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero.

[00440] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a formação de imagem de pelo menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero, compreendendo a administração de uma variante, uma composição ou um kit de partes de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas.

USOS ADICIONAIS [00441] Deve ser entendido que as modalidades descritas abaixo com referência a um polipeptideo ou anticorpo referem-se a um polipeptideo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, um polipeptideo ou anticorpo também pode ser um polipeptideo ou anticorpo multiespecífico tendo uma primeira região Fe de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação a antígeno, e um segundo polipeptideo ou anticorpo tendo uma segunda região Fe de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação a antígeno.

[00442] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um polipeptideo, anticorpo da invenção como descrito acima para uso como um medicamento, em particular para uso como um medicamento para o tratamento de doenças ou distúrbios. Exemplos de tais doenças e distúrbios incluem, sem limitação, câncer, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, doenças infecciosas, infecções bacterianas, virais ou fúngicas.

[00443] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao polipeptideo, anticorpo, anticorpos biespecíficos, composições e kit de partes descritos aqui, para o tratamento de uma doença, tal como câncer.

[00444] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratamento de uma doença humana, compreendendo administração de uma variante, uma composição ou um kit de partes descritos aqui.

[00445] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer em um humano compreendendo administração de

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128 / 194 uma variante, uma composição ou um kit de partes.

[00446] “Tratamento” refere-se à administração de uma quantidade eficaz de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção com o objetivo de facilitar, melhorar, parar ou erradicar (curar) os sintomas ou estados doentios.

[00447] Uma “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo pode variar de acordo com fatores tal como o estado doentio, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo para elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também um em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção do anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

DOSAGENS [00448] Deve ser entendido que as modalidades descritas abaixo com referência a um polipeptídeo ou anticorpo referem-se a um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, um polipeptídeo ou anticorpo também pode ser um polipeptídeo ou anticorpo multiespecífico tendo uma primeira região Fe de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação a antígeno, e um segundo polipeptídeo ou anticorpo tendo uma segunda região Fe de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação a antígeno.

[00449] Dosagens eficientes e os regimes de dosagem para o anticorpo dependem da doença ou patologia a ser tratada e podem ser determinados pelos versados. Uma faixa exemplar e não limitativa para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da presente invenção é cerca de 0,1 a 100 mg/kg, tal como cerca de 0,1 a 50 mg/kg, por exemplo cerca de 0,1 a 20 mg/kg, tal como cerca de 0,1 a 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,5, cerca de

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129/194 tal como 0.3, cerca de 1, cerca de 3, cerca de 5, ou cerca de 8 mg/kg.

[00450] Polipeptídeos ou anticorpos da presente invenção também podem ser administrados em uma terapia de combinação, isto é, combinados com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Consequentemente, em uma modalidade, o medicamento contendo anticorpo é para combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como agentes citotóxicos, quimioterapêuticos ou anti-angiogênicos. Tal administração combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial [00451] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir doenças, tal como câncer, cujo método compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante ou composição farmacêutica da presente invenção, em combinação com radioterapia e/ou cirurgia.

Método de preparação [00452] Deve ser entendido que as modalidades descritas abaixo com referência a um polipeptídeo ou anticorpo referem-se a um polipeptídeo ou anticorpo compreendendo uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, um polipeptídeo ou anticorpo também pode ser um polipeptídeo ou anticorpo multiespecífico tendo uma primeira região Fe de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação a antígeno, e um segundo polipeptídeo ou anticorpo tendo uma segunda região Fe de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação a antígeno.

[00453] A invenção também fornece ácidos nucleicos isolados e vetores que codificam uma variante de acordo com qualquer um dos aspectos descritos acima, bem como vetores e sistemas de expressão codificando as variantes. Construções de ácido nucleico, vetores e sistemas de expressão adequados para anticorpos e variantes dos mesmos são conhecidos na técnica e estão descritos nos Exemplos. Em modalidades em que a variante

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130/194 compreende não apenas uma cadeia pesada (ou um fragmento contendo Fe da mesma) mas também uma cadeia leve, as sequências de nucleotídeos que codificam as porções de cadeia pesada e leve podem estar presentes nos mesmos ou em diferentes ácidos nucleicos ou vetores.

[00454] A invenção também fornece um método para produzir, em uma célula hospedeira, um polipeptídeo ou anticorpo de acordo com qualquer um dos aspectos descritos acima, em que o dito polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos a região Fe de uma cadeia pesada, compreendendo o dito método as seguintes etapas:

a) fornecer uma construção de nucleotideo codificando a dita região Fe da dita variante,

b) expressar a dita construção de nucleotideo em uma célula hospedeira e

c) recuperar a dita variante de anticorpo a partir de uma cultura celular da dita célula hospedeira.

[00455] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de cadeia pesada. Na maioria das modalidades, no entanto, o anticorpo também conterá uma cadeia leve e, assim, a dita célula hospedeira expressa ainda uma construção codificando a cadeia leve, no mesmo vetor ou em um vetor diferente.

[00456] As células hospedeiras apropriadas para a expressão recombinante de anticorpos são bem conhecidas na técnica e incluem células CHO, HEK-293, Expi293, PER-C6, NS/0 e Sp2/0. Em uma modalidade, a dita célula hospedeira é uma célula que é capaz de glicosilação de proteínas ligada a Asn, e. uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula humana. Em uma modalidade adicional, a dita célula hospedeira é uma célula não humana que é geneticamente modificada para produzir glicoproteínas tendo glicosilação de tipo humana ou humana. Exemplos de tais células são de Pichia pastoris geneticamente modificadas

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131/194 (Hamilton et al., Science 301 (2003) 1244-1246; Potgieter et al., J. Biotechnology 139 (2009) 318-325) e de Lemna minor geneticamente modificadas (Cox et al., Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597).

[00457] Em uma modalidade, a dita célula hospedeira é uma célula hospedeira que não é capaz de remover eficientemente os resíduos K447 da lisina C-terminal das cadeias pesadas dos anticorpos. Por exemplo, a Tabela 2 em Liu et al. (2008) J Pharm Sei 97: 2426 (aqui incorporado por referência) lista alguns desses sistemas de produção de anticorpos, por exemplo, Sp2/0, NS/0 ou glândula mamária transgênica (cabra), em que é obtida apenas remoção parcial de lisinas C-terminais. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterada. Tais células foram descritas na arte e podem ser usadas como células hospedeiras em que se podem expressar variantes da invenção para, assim, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, assim como EP1176195; WO03/035835; e WO99/54342. Os métodos adicionais para gerar glicoformas engenheiradas são conhecidos na técnicas, e incluem, mas não são limitados aos descritos em Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), US6602684, WOOO/61739A1; WO01/292246A1; W002/311140A1; WO 02/30954A1; tecnologia Potelligent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnologia de engenharia de glicosilação GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiça); US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

[00458] A invenção também se refere a um anticorpo obtido ou obtenível pelo método da invenção descrito acima.

[00459] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma célula hospedeira capaz de produzir um polipeptideo ou anticorpo da invenção. Em

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132/194 uma modalidade, a célula hospedeira foi transformada ou transfectada com uma construção de nucleotídeo da invenção.

[00460] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como ainda limitativos.

TABELA 1

SEQ ID NO:	Nome	Sequência	Clone
SEQ ID NO: 1	VH hDR5-01- G56T CDR1	GFNIKDTF	hDR5- 01-G56T
SEQ ID NO: 2	VH hDR5-01- G56T CDR2	IDPANTNT
SEQ ID NO: 3	VH hDR5-01- G56T CDR3	VRGLYTYYFDY
SEQ ID NO: 4	VH hDR5-01- G56T	EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDTFIH WVKQAPGQGLEWIGRIDPANTNTKYDPKFQGKATI TTDTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGLYTYYF DYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 5	HChDR5-01- G56T	EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDTFIH WVKQAPGQGLEWIGRIDPANTNTKYDPKFQGKATI TTDTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGLYTYYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 6	VLhDR5-01 CDR1	QSISNN
	VLhDR5-01 CDR2	FAS
SEQ ID NO: 7	VLhDR5-01 CDR3	QQGNSWPYT
SEQ ID NO: 8	VLhDR5-01	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISNNLHWY QQKPGQAPRLLIKFASQSITGIPARFSGSGSGTEFTLT ISSLQSEDFAVYYCQOGNSWPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 9	LC hDR5-01	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISNNLHWY QQKPGQAPRLLIKFASQSITGIPARFSGSGSGTEFTLT ISSLQSEDFAVYYCQQGNSWPYTFGQGTKLEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 10	VH hDR5-05 CDR1	GFNIKDTH	hDR5-05
SEQ ID NO: 11	VH hDR5-05 CDR2	IDPANGNT
SEQ ID NO: 12	VH hDR5-05 CDR3	ARWGTNVYFAY
SEQ ID NO: 13	VH hDR5-05	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTHM HWVRQAPGQRLEWIGRIDPANGNTEYDQKFQGRV TITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGTNV YFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:	HC hDR5-05	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTHM

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133/194

14		HWVRQAPGQRLEWIGRIDPANGNTEYDQKFQGRV TITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGTNV YFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 15	VL hDR5-05 CDR1	SSVSY
	VL hDR5-05 CDR2	RTS
SEQ ID NO: 16	VL hDR5-05 CDR3	QQYHSYPPT
SEQ ID NO: 17	VL hDR5-05	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMYWYQ QKPGKAPKPWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCOOYHSYPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 18	LC hDR5-05	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMYWYQ QKPGKAPKPWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQYHSYPPTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 19	VH CONAC49W-CDR1	GGSISSGDYF	IgGlCONA- C49W
SEQ ID NO: 20	VH CONAC49W-CDR2	IHNSGTT
SEQ ID NO: 21	VH CONAC49W-CDR3	ARDRGGDYYYGMDV
SEQ ID NO: 22	VH CONAC49W-C49W	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYFW SWIRQLPGKGLEWIGHIHNSGTTYYNPSLKSRVTISV DTSKKQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRGGDYYY GMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 23	HC CONA- C49W	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYFW SWIRQLPGKGLEWIGHIHNSGTTYYNPSLKSRVTISV DTSKKQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRGGDYYY GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 24	VL CONAC49W-CDR1	QGISRSY
	VL CONAC49W-CDR2	GAS
SEQ ID NO: 25	VL CONAC49W-CDR3	QQFGSSPWT
SEQ ID NO: 26	VL CONA- C49W	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGISRSYLAWY QQKPGQAPSLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCOOFGSSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID	LC CONA-	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGISRSYLAWY

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 140/257

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NO:27	C49W	QQKPGQAPSLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCOQFGSSPWTFGOGTKVEIK EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGISRSYLAWY QQKPGQAPSLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQFGSSPWTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 28	VH 7D8 CDR1	GFTFHDYA	7D8
SEQ ID NO: 29	VH 7D8 CDR2	ISWNSGTI
SEQ ID NO: 30	VH 7D8 CDR3	AKDIQYGNYYYGMDV
SEQ ID NO: 31	VH 7D8	EVQLVESGGGLVQPDRSLRLSCAASGFTFHDYAMH WVRQAPGKGLEWVSTISWNSGTIGYADSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGN YYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 32	HC7D8	EVQLVESGGGLVQPDRSLRLSCAASGFTFHDYAMH WVRQAPGKGLEWVSTISWNSGTIGYADSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGN YYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 33	VL 7D8 CDR1	QSVSSY
	VL 7D8 CDR2	DAS
SEQ ID NO: 34	VL 7D8 CDR3	QQRSNWPIT
SEQ ID NO: 35	VL 7D8	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO: 36	LC 7D8	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 37	VH 11B8 CDR1	GFTFSYHA	11B8
SEQ ID NO: 38	VH 11B8CDR2	IGTGGVT
SEQ ID NO: 39	VH 11B8CDR3	ARDYYGAGSFYDGLYGMDV
SEQ ID NO: 40	VH 11B8	EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCTGSGFTFSYHAMH WVRQAPGKGLEWVSIIGTGGVTYYADSVKGRFTIS RDNVKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARDYYGAG SFYDGLYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 41	HC 11B8	EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCTGSGFTFSYHAMH WVRQAPGKGLEWVSIIGTGGVTYYADSVKGRFTIS RDNVKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARDYYGAG SFYDGLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 141/257

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		NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 42	VL 11B8CDR1	QSVSSY
	VL 11B8 CDR2	DAS
SEQ ID NO: 43	VL 11B8 CDR3	QQRSDWPLT
SEQ ID NO: 44	VL 11B8	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 45	LC 11B8	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPLTFGGGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 46	VH ALEM CDR1	GFTFTDFY	alemtuzu mab
SEQ ID NO: 47	VH ALEM CDR2	IRDKAKGYTT
SEQ ID NO: 48	VH ALEM CDR3	AREGHTAAPFDY
SEQ ID NO: 49	VH ALEM	QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTFTDFYMN WVRQPPGRGLEWIGFIRDKAKGYTTEYNPSVKGRV TMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREGHTA APFDYWGQGSLVTVSS
SEQ ID NO: 50	HC ALEM	QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTFTDFYMN WVRQPPGRGLEWIGFIRDKAKGYTTEYNPSVKGRV TMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREGHTA APFDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 51	VL ALEM CDR1	QNIDKY
	VL ALEM CDR2	NTN
SEQ ID NO: 52	VL ALEM CDR3	LQHISRPRT
SEQ ID NO: 53	VL ALEM	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDKYLNWY QQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFT FTISSLQPEDIATYYCLQHISRPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:54	LC ALEM	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIDKYLNWY QQKPGKAPKLLIYNTNNLQTGVPSRFSGSGSGTDFT FTISSLQPEDIATYYCLQHISRPRTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 55	VH 2F8 CDR1	GFTFSTYG	2F8

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 142/257

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SEQ ID NO: 56	VH 2F8 CDR2	IWDDGSYK
SEQ ID NO: 57	VH 2F8 CDR3	ARDGITMVRGVMKDYFDY
SEQ ID NO: 58	VH 2F8	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMH WVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITM VRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 59	HC 2F8	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMH WVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGDSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITM VRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 60	VL 2F8 CDR1	QDISSA
	VL 2F8 CDR2	DAS
SEQ ID NO: 61	VL 2F8 CDR3	QQFNSYPLT
SEQ ID NO: 62	VL 2F8	AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:63	LC2F8	AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQ QKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSESGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 64	VHbl2CDRl	GYRFSNFV	b!2
SEQ ID NO: 65	VHbl2CDR2	INPYNGNK
SEQ ID NO:66	VHbl2CDR3	ARVGPYSWDDSPQDNYYMDV
SEQ ID NO: 67	VHbl2	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIH WVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEFSAKFQDRVT FTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYS WDDSPQDNYYMDVWGKGTTVIVSS
SEQ ID NO:68	HCbl2	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIH WVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEFSAKFQDRVT FTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYS WDDSPQDNYYMDVWGKGTTVIVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD lAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
SEQ ID NO:69	VLbl2CDRl	HSIRSRR

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 143/257

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	VLbl2CDR2	GVS
SEQ ID NO: 70	VLbl2CDR3	QVYGASSYT
SEQ ID NO: 71	VLbl2	EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWY QHKPGQAPRLVIHGVSNRASGISDRFSGSGSGTDFT LTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERK
SEQ ID NO:72	LCbl2	EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWY QHKPGQAPRLVIHGVSNRASGISDRFSGSGSGTDFT LTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:73	Fc IgGlm(f)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO:74	Fc IgGlm(z)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 75	Fc IgGlm(a)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKPVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 76	Fc IgGlm(x)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKPVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 77	Fc IgGlm(f)E430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 144/257

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		FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHGALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 78	Fc IgGlm(f)E345K	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPRKPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 79	Fc IgGlm(f)- K326A/E333A/ P396L	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPA PIAKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 80	Fc IgGlm(f)- K326A/E333A/ P396L/E430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPA PIAKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHGALHNH YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:81	Fc IgGlm(f)- K326A/E333A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPA PIAKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:82	Fc IgGlm(f)- K326A/E333A/ E430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPA PIAKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHGALHNH YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 83	Fc IgGlm(f)- K326A/P396L/ E430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHGALHNHYT

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 145/257

139/194

		QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 84	Fc IgGlm(f)- E333A/P396L/E 430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIAKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHGALHNH YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 85	Fc IgGlm(f)- I253D/K322A	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMDSRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 86	Fc IgGlm(f)- K326W/E333S	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNWALPA PISKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO:87	Fc IgGlm(f)- K326W/E333S/ E430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNWALPA PISKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHGALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 88	Fc IgGlm(f)- S267E/H268F/S 324T/E430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVEFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHGALHNHYT QKSLSLSPGK


SEQ ID NO:89	FcIgG113F [FcIgGl(f)m- K274Q/N276K/ Y300F/A339T/ N384S/K392N/ V397M/V422I]	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSF

Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 146/257

140 / 194

		FLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
SEQ ID NO: 90	FcIgG113F- E430G	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHGALHNHYTQK SLSLSPGK
SEQ ID NO: 91	VH BMS- 663513 CDR1	GGSFSGYY	BMS- 663513
SEQ ID NO: 92	VH BMS- 663513 CDR2	INHGGYV
SEQ ID NO: 93	VH BMS- 663513 CDR3	ARDYGPGNYDWYFDL
SEQ ID NO: 94	VH BMS- 663513	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWS WIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVD TSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDW YFDLWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO:95	VL BMS663513 CDR1	QSVSSY
	VL BMS663513 CDR2	DAS
SEQ ID NO: 96	VL BMS663513 CDR3	QQRSNWPPALT
SEQ ID NO: 97	VL BMS- 663513	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEI K
SEQ ID NO: 98	VH CD134-SF2 CDR1	GYTFKDYT	CD 134- SF2
SEQ ID NO: 99	VH CD134-SF2 CDR2	IYPNNGGS
SEQ ID NO: 100	VH CD134-SF2 CDR3	ARMGYHGPHLDFDV
SEQ ID NO: 101	VH CD134-SF2	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTM HWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRV TLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHG PHLDFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 102	VL CD134-SF2 CDR1	QDVGAA
	VL CD134-SF2 CDR2	WAS
SEQ ID NO: 103	VL CD134-SF2 CDR3	QQYINYPLT
SEQ ID NO: 104	VL CD134-SF2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAW YQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQOYINYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 105	VH CD 137MOR7480 CDR1	GYSFSTYW	CD137MOR748 0
SEQ ID NO: 106	VH CD 137MOR7480 CDR2	IYPGDSYT
SEQ ID NO: 107	VH CD 137MOR7480 CDR3	ARGYGIFDY
SEQ ID NO:	VH CD 137-	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISW

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108	MOR7480	VRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTIS ADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 109	VL CD 137- MOR7480 CDR1	NIGDQY
	VL CD 137- MOR7480 CDR2	QDK
SEQ ID NO: 110	VL CD 137- MOR7480 CDR3	ATYTGFGSLAV
SEQ ID NO:111	VL CD 137- MOR7480	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQ QKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLT ISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 112	VH CD40- CP870893 CDR1	GYTFTGYY	CD40- CP87089 3
SEQ ID NO: 113	VH CD40- CP870893 CDR2	INPDSGGT
SEQ ID NO: 114	VH CD40- CP870893 CDR3	ARDQPLGYCTNGVCSYFDY
SEQ ID NO: 115	VH CD40- CP870893	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYM HWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGR VTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPL GYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 116	VL CD40- CP870893 CDR1	QGIYSW
	VL CD40- CP870893 CDR2	TAS
SEQ ID NO: 117	VL CD40- CP870893 CDR3	QQANIFPLT
SEQ ID NO: 118	VL CD40- CP870893	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWY QQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQOANIFPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 119	VH CD40SGN40 CDR1	GYSFTGYY	CD40- SGN40
SEQ ID NO: 120	VH CD40SGN40 CDR2	VIPNAGGT
SEQ ID NO: 121	VH CD40SGN40 CDR3	AREGIYW
SEQ ID NO: 122	VH CD40- SGN40	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIH WVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFT LSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYW WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 123	VL CD40SGN40 CDR1	QSLVHSNGNTF
	VL CD40SGN40 CDR2	TVS
SEQ ID NO: 124	VL CD40SGN40 CDR3	SQTTHVPWT
SEQ ID NO: 125	VL CD40- SGN40	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTF LHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKV EIK
SEQ ID NO:	VH CD95-	GFTFNTNA	CD95-

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126	APO1 CDR1		APO1
SEQ ID NO: 127	VH CD95APO1 CDR2	IRSKSNNYAT
SEQ ID NO: 128	VH CD95APO1 CDR3	VTDGYY
SEQ ID NO: 129	VH CD95APO1	EVOLVETGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNAMN WVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYAESVKDR FTISRDDSOSMLYLQMNNLKAEDTAMYYCVTDGY YWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 130	VL CD95APO1 CDR1	ESVEYYGTSL
	VL CD95APO1 CDR2	VAS
SEQ ID NO: 131	VL CD95APO1 CDR3	QQSTKVPWT
SEQ ID NO: 132	VL CD95- APO1	DIVLTQSPASLAVSLGORATISCRASESVEYYGTSL MQWYQQKPGQPPKLLIYYASNVESGVPARFSGSGS GTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCOQSTKVPWTFGGGTK LEIK
SEQ ID NO: 133	VH CD95HFE7A CDR1	GYTFTSYW	CD95- HFE7A
SEQ ID NO: 134	VH CD95HFE7A CDR2	IDPSDSYT
SEQ ID NO: 135	VH CD95HFE7A CDR3	ARNRDYSNNWYFDV
SEQ ID NO: 136	VH CD95- HFE7A	OVOLOOPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWM QWVKORPGOGLEWIGEIDPSDSYTNYNQKFKGKAT LTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARNRDYSN NWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID NO: 137	VL CD95HFE7A CDR1	QSVDYDGDSY
	VL CD95HFE7A CDR2	AAS
SEQ ID NO: 138	VL CD95HFE7A CDR3	QQSNEDPRT
SEQ ID NO: 139	VL CD95- HFE7A	DIVLTQSPASLAVSLGORATISCKASOSVDYDGDSY MNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSG TDFTLNIHPVEEEDAATYYCOOSNEDPRTFGGGTKL EIK
SEQ ID NO: 140	VH DR4chCTB007 CDR1	GFNIKDTY	DR4chCTBO 07
SEQ ID NO: 141	VH DR4chCTB007 CDR2	IDPANGNT
SEQ ID NO: 142	VH DR4chCTB007 CDR3	AYYYVSNAWFTY
SEQ ID NO: 143	VH DR4chCTB007	EVQLOQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMH WVKORPEOGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATI TADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAYYYVSNAW FTYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO: 144	VL DR4chCTB007 CDR1	ENIYSN
	VL DR4chCTB007 CDR2	AAT
SEQ ID NO: 145	VL DR4chCTB007 CDR3	QHFWGTWT

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SEQ ID NO: 146	VL DR4chCTB007	DIOMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLEWY OQKOGKSPOLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTOY SLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGTWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 147	VH FAS-E09 CDR1	GASISANSYY	FAS-E09
SEQ ID NO: 148	VH FAS-E09 CDR2	IAYRGNSNSGST
SEQ ID NO: 149	VH FAS-E09 CDR3	ARRQLLDDGTGYQWAAFDV
SEQ ID NO: 150	VH FAS-E09	OLOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISANSYYG VWVRQSPGKGLEWVGSIAYRGNSNSGSTYYNPSLK SRATVSVDTSKNQVSLRLTSVTAADTALYYCARRO LLDDGTGYOWAAFDVWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 151	VL FAS-E09 CDR1	SFNIGRYP
	VL FAS-E09 CDR2	YNN
SEQ ID NO: 152	VL FAS-E09 CDR3	STWDDTLKGWV
SEQ ID NO: 153	VL FAS-E09	QSVLTOPPSVSEAPRQTVTISCSGNSFNIGRYPVNW YQQLPGKAPKLLIYYNNLRFSGVSDRFSGSKSGTSA SLAIRDLLSEDEADYYCSTWDDTLKGWVFGGGTKV TVL
SEQ ID NO: 154	VH GITR-36E5 CDR1	GFTFSSYA	GITR- 36E5
SEQ ID NO: 155	VH GITR-36E5 CDR2	ISSGGTT
SEQ ID NO: 156	VH GITR-36E5 CDR3	ARVGGYYDSMDY
SEQ ID NO: 157	VH GITR-36E5	EVNLVESGGGLVKPGGSLKVSCAASGFTFSSYAMS WVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDSVKGRFTISR DNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARVGGYYDSM DYWGQGISVTDSS
SEQ ID NO: 158	VL GITR-36E5 CDR1	ESVDNYGVSF
	VL GITR-36E5 CDR2	AAS
SEQ ID NO: 159	VL GITR-36E5 CDR3	QQTKEVTWT
SEQ ID NO: 160	VL GITR-36E5	DIVLTQSPASLAVSLGORATISCRASESVDNYGVSF MNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGS GTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCOQTKEVTWTFGGGT KLEIK
SEQ ID NO: 161	VH GITR- INCAGNO1876 CDR1	GYTFTDYA	GITRINCAG NO 1876
SEQ ID NO: 162	VH GITR- INCAGNO1876 CDR2	IRTYSGDV
SEQ ID NO: 163	VH GITR- INCAGNO1876 CDR3	AKSGTVRGFAY
SEQ ID NO: 164	VH GITR- INCAGNO1876	OVOLLQSGTELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAMY WVKOSHAKSLEWIGVIRTYSGDVTYNQKFKDKAT MTVDKSSSIAYMELARLSSEDSAIYYCAKSGTVRGF AYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 165	VL GITR- INCAGN01876 CDR1	QSLLNSGNQKNY
	VL GITR- INCAGN01876	WAS

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	CDR2
SEQ ID NO: 166	VL GITR- INCAGN01876 CDR3	QNDYSYPYT
SEQ ID NO: 167	VL GITR- INCAGN01876	DIVMTQSPSSLTVTAGEKVIMSCKSSQSLLNSGNQK NYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGS GSGTDFTLTISSVQAEDLAVYHCQNDYSYPYTFGGG TKLEIK
SEQ ID NO: 168	Fc IgG2	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT ISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK	IgG2 humano
SEQ ID NO: 169	Fc IgG3	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDT THTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP EPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTI PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMH EALHNRFTQKSLSLSPGK	IgG3 Humano
SEQ ID NO: 170	Fc IgG4	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPS CPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK	IgG4 humano
SEQ ID NO: 171	FcRnECDHisB AP	AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQY LSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLR IKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSV PTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQR WQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLE WKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRF LRNGLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDE HHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSSPGSSSHHHH HHPGGGLNDIFEAQKIEWHE	FcRn Humano
SEQ ID NO: 172	B2M	IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEV DLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPT EKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM	B2M

EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração, produção e purificação de anticorpo.

Construtos de expressão para anticorpos [00461] Para expressão de anticorpo, sequências de cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável (VL) foram preparadas por síntese de

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145 / 194 genes (GeneArt Gene Synthesis; ThermoFisher Scientific, Alemanha) e clonadas em vetores de expressão pcDNA3.3 (ThermoFisher Scientific, US) contendo regiões constantes de cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) IgGl. Mutações desejadas foram introduzidas ou por síntese de gene ou mutagenese dirigida ao sítio. Anticorpos mencionados neste pedido têm sequências VH e VL derivadas de anticorpos DR5 previamente descritos hDR5-01, hDR5-05 (W02014/009358) e conatumumab (US7521048 B2 e WO2010/138725), anticorpo DR4 chCTB007 (US 2009/0136503), FAS anticorpos E09 (Chodorge Cell Death Differ. 2012 Jul; 19(7): 1187-1195), APO1 (WO 2014/076292) e HFE7A (US6972323), anticorpo 0X40 SF2 (US2014/0377284), anticorpos CD40 SGN 40 (US6838261) e CP870893 (US7338660), anticorpos 4-1BB MOR7480 (WO 2012/032433) e BMS663513 (US8475790), anticorpos CD20 HuMab-7D8 e 11B8 (W02004/035607), anticorpo CD52 alemtuzumab (Crowe et al., Clin Exp Immunol. 1992;87(1): 105-10), e anticorpo EGFR 2F8 (W02002/100348). Em alguns dos exemplos o anticorpo de IgGl humana bl2, um anticorpo específico gpl20 foi usado como um controle negativo (Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23).

Expressão transiente [00462] Anticorpos foram expressados como misturas de DNA de plasmídeo IgGl,K. codificando tanto cadeias pesadas como leves de anticorpos que foram transientemente transfectados em células Expi293 (Life/Thermo Scientific, USA) usando Expifectamina (Invitrogen, US) essencialmente como descrito pelo fabricante.

Purificação e análise de proteínas [00463] Anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade de proteína A. Sobrenadantes da cultura foram filtrados sobre um filtro sem saída de 0,20 μΜ e carregados em colunas de 5 mL MabSelect SuRe (GE Healthcare), lavados e eluídos com 0,02 M de citrato de sódio-NaOH, pH 3.

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Os eluatos foram carregados em uma coluna de dessalinização HiPrep (GE Healthcare) imediatamente após a purificação e o tampão dos anticorpos foi trocado para tampão 12,6 rnM NaHzPCU, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun ou Thermo Fisher). Após a troca de tampão, amostras foram filtradas estéreis através de filtros sem saída de 0,2 pm. Proteínas purificadas foram analisadas por diversos ensaios bioanalíticos incluindo eletroforese capilar em géis de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (CE-SDS) e cromatografia por exclusão de tamanho de alto desempenho (ΗΡ-SEC). Concentração foi medida por absorvência a 280 nm. Anticorpos purificados foram armazenados a 2-8°C.

Geração de anticorpos biespecíficos [00464] Anticorpos IgGl biespecíficos foram gerados por troca de Fab-braço sob condições de redução controlada. A base para este método é o uso de domínios CH3 complementares, que promovem a formação de heterodímeros sob condições de teste específicas como descrito em WO2011/131746. As mutações F405L e K409R (numeração da UE) foram introduzidas em anticorpos IgGl anti-DR5 para criar pares de anticorpos com domínios CH3 complementares. A mutação F405L foi introduzida em IgGlbl2-K326A/E333A/P396L/E430G e IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S/ E430G; a mutação K409R mutação foi introduzida em IgGl-b 12K326W/E333S/E430G e IgGl-hDR5-01-G56T-K326A/E333A/P396L/ E430G. Para gerar anticorpos biespecíficos, dois anticorpos complementares parentais, cada anticorpo a uma concentração final de 0,5 mg/mL, foram incubadas com 75 mM 2-mercaptoetilamina-HCl (2-MEA) em um volume total de 100 pL PBS a 31 °C durante 5 horas. A reação de redução foi parada removendo o agente redutor 2-MEA usando colunas de centrífuga (filtros centrífugos Microcon, 30k, Millipore) de acordo com o protocolo do fabricante. O tampão dos anticorpos foi trocado para 12,6 mM NaHzPCU, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun ou Thermo). Deste modo os anticorpos

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147 / 194 biespecíficos IgGl-hDR5-01-G56T-K326A/E333A/P396L/K409R/E430G x IgGl-bl2-K326A/E333A/P396L/F405L/E430G ditos como BsAb (hDR5-01G56T-K409Rxbl2-F405L)-K326A/E333A/P396L/E430G e IgGl-CONAC49W-F405L-K326W/E333S/E430G x IgGl-bl2-K409RK326W/E333S/E430G, ditos como BsAb (IgGl-CONA-C49W-F405L x IgGl-bl2-K409R)-K326W/E333S/E430G, foram gerados.

Exemplo 2: Efeito de combinação de E430G e K326A/E333A/P396L sobre a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos.

[00465] Um teste de viabilidade foi realizado para avaliar o efeito da combinação de substituição intensificando Fc-Fc de E430G (WO2013/004842; W02014/108198; WO2014/006217; de Jong et al., 2016) e K326A/E333A/P396L (WO2016/116635) na atividade agonística de anticorpos anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR-05 nas células BxPC3 DR5-positivas (ATCC, CRL-1687). Células foram coletadas por tripsinização e passadas através de um filtro de células. Células foram granuladas por centrifugação durante 5 minutos a 1,200 rpm e recolocadas em suspensão em meio de cultura (RPMI 1640 com 25mM Hepes e L-Glutamina (Lonza número de catálogo BE12-115F) + soro bovino de doador termoinativado a 10% com ferro (DBSI; Life Technologies número de catálogo 10371-029) + 50 U/mL Penicillina/Estreptomicina (Pen/Strep; Lonza; número de catálogo DE17-603E) a uma concentração de 0,5x10⁵células/mL. 100 pL das únicas suspensões de células (5.000 células por cavidade) foram cultivadas em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades (Greiner Bio-One, número de catálogo 655182) e deixadas aderir durante a noite a 37°C. Em seguida, 50 pL de uma série de preparação de anticorpos de diluição em série (faixa de concentrações finais de 0,0003 a 20,000 ng/mL em diluições de 4 vezes) foram adicionados e incubados durante 3 dias a 37°C. Como um controle negativo e positivo, células foram incubadas sem anticorpo ou com 5 pM de estaurosporina (Sigma Aldrich,

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148 / 194 número de catálogo S6942), respectivamente. A viabilidade das culturas de células foi determinada em um teste de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo (Promega, número de catálogo G7571) que quantifica o ATP presente, que é um indicador de células ativas metabolicamente. Do kit, 20 pL de reagente de solução de luciferina foram adicionados por cavidade e misturados agitando a placa durante 2 minutos a 500 rpm. Em seguida, as placas foram incubadas durante 1,5 horas a 37°C. 100 pL de sobrenadante foram transferidos para um OptiPlate-96 branco (Perkin Elmer, número de catálogo 6005299) e luminescência foi medida em um EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 1 mostra a porcentagem de células viáveis, como calculado usando a seguinte fórmula: % células viáveis = [luminescência na amostra de anticorpo - luminescência na amostra de estaurosporina )/(sem luminescência na amostra de anticorpo - luminescência na amostra de estaurosporina )]* 100.

[00466] Figura 1 mostra que a combinação da substituição intensificando Fc-Fc E430G e as três substituições K326A/E333A/P396L resultaram em indução de eficácia de morte para os anticorpos anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T (Figura IA) e IgGl-hDR5-05 (Figura 1B) quando testado como um único agente em um teste de viabilidade in vitro em células de câncer pancreático BxPC-3 humanas aderentes. Em contraste, estes anticorpos não mostraram eficácia de morte nestas células BxPC-3 não aderidas quando apenas E430G ou K326A/E333A/P396L estavam presentes. Também para a combinação de anticorpos de não bloqueio cruzado IgGlhDR5-01-G56T + IgGl-hDR5-05, a introdução das substituições combinadas K326A/E333A/P396L/E430G resultou na morte mais eficaz de células BxPC3 não aderidas (Figura 1C).

[00467] Estes dados mostram que as substituições

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K326A/E333A/P396L/E430G induziram atividade agonística forte para anticorpos anti-DR5 nas células BxPC-3 aderentes.

Exemplo 3: Eficácia de anticorpo anti-DR5 monovalente contendo K326A/E333A/P396L/E430G.

[00468] Um teste de viabilidade foi realizado em células de câncer de cólon COLO 205 e pancreático BxPC-3 humanas para estudar a eficácia de anticorpo anti-DR5 monovalente contendo K326A/E333A/P396L/E430G. O anticorpo anti-DR5 monovalente foi gerado por troca de Fab-braço controlada entre IgGl-hDR5-01-G56T-K326A/E333A/P396L/K409R/E430G e IgGlbl2-K326A/E333A/P396L/F405L/E430G como descrito em Exemplo 1. O anticorpo biespecífico gerado, dito como BsAb (hDR5-01-G56TK409Rxbl2-F405L)-K326A/E333A/P396L/E430G, contém um braço específico para DR5 e um braço não específico contra glicoproteína do HIV gpl20, resultando em ligação monovalente de DR5 nas células de câncer humano positivas para DR5. Células BxPC-3 foram coletadas como descrito no Exemplo 2. Células COLO 205 (ATCC, CCL-222) foram coletadas por pooling da cultura de sobrenadante contendo células não aderentes e células COLO 205 aderentes tripinizadas. Células foram granuladas por centrifugação durante 5 minutos a 1,200 rpm e recolocadas em suspensão em meio de cultura (RPMI 1640 com 25mM Hepes e L-Glutamina + 10% DBSI inativado por calor + 50 U/mL Pen/Strep a uma concentração de 0,5xl0⁵células/mL. 100 pL das únicas suspensões de células (5.000 células por cavidade) foram cultivadas em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades e deixadas aderir durante a noite a 37°C. Em seguida, 50 pL de uma série de preparação de anticorpos de diluição em série (faixa de concentrações finais de 0,0024 a 10,000 ng/mL em diluições de 4 vezes) foram adicionados e incubados durante 3 dias a 37°C. Como um controle negativo e positivo, células foram incubadas sem anticorpo ou com 5 pM de estaurosporina, respectivamente. A viabilidade das células cultivada foi determinada em um

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150/194 teste de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2.

[00469] Figura 2 mostra que na presença das mutações K326A/E333A/P396L/E430G, a variante monovalente de IgGl-hDR5-01G56T poderia induzir ainda morte de células de câncer de cólon COLO 205 e pancreático BxPC-3 humano.

Exemplo 4: Efeito de combinação E430G e K326A/E333A, K326A/P396L ou E333A/P396L na ligação a Clq e a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos.

[00470] Um teste de viabilidade foi realizado para estudar o efeito da combinação de substituição por intensificação de Fc-Fc E430G com duas das três substituições em K326A/E333A/P396L na atividade agonística de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T em células BxPC-3 e COLO 205 positivas para DR5. Como uma referência, a combinação de E430G com todas as três substituições K326A/E333A/P396L como descrito em Exemplo 2 foi incluída na experiência. O teste de viabilidade foi realizado como descrito em Exemplo 3. A viabilidade das células cultivadas foi determinada em um teste de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo, como descrito em Exemplo 2.

[00471] Figura 3 mostra que a combinação da substituição intensificando Fc-Fc E430G e duas substituições de K326A/E333A/P396L (E333A/P396L, K326A/E333A ou K326A/P396L) resultou na indução de eficácia de morte para o anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T quando testado como único agente em um teste de viabilidade in vitro em células de pâncreas BxPC-3 (Figura 3A) e cólon COLO 205 (Figura 3B) humano aderente. Em contraste, nenhuma morte nestas células de câncer pré-aderidas foi observada quando apenas E430G estava presente. Morte mais eficiente foi observada quando E430G foi combinado com todas as três mutações K326A/E333A/P396L.

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151/194 [00472] Um ELISA de ligação foi realizado para avaliar o efeito de diferentes substituições em ligação a Clq. Amostras de anticorpos purificadas de variantes IgG-hDR5-01-G56T contendo a substituição E430G em combinação com as substituições K326A/E333A, K326A/P396L, E333A/P396L ou K326A/E333A/P396L foram testadas e comparadas com WT IgG-hDR5-01-G56T e IgG-hDR5-01-G56T-E430G. IgG-2F8I253D/K322A foi usado como a controle negativo para ligação a Clq. Revestimento das placas Microlon ELISA de 96 cavidades (Greiner número de catálogo 655092) foi realizado por incubação durante a noite a 4°C com 1 pg/mL de amostras de anticorpos em 100 pL PBS. As placas foram lavadas e bloqueadas durante 1 hora a RT com 200 pL/cavidade 0,5x PBS suplementado com 0,025% Tween 20 e 0,1% de gelatina enquanto agitando. Com lavagens entre incubações, as placas foram incubadas em sequência com 100 pL por cavidade de uma série de diluições em série de Clq purificada (Quidel número de catálogo A400; faixa de concentração final de Clq 30 0,010 pg/mL em diluições de 3 vezes) durante lha 37°C, 100 pL Clq antihumano de coelho por cavidade (DAKO, # de produto A0136, 1/4,000) durante lha RT, e com 100 pL/cavidade IgG-HRP anti-coelho de suíno (DAKO, P0399, 1:10,000) como anticorpo de detecção durante lha RT, e finalmente 100 pL/cavidade de substrato com 1 mg/mL de ácido 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS; Roche número de catálogo 11112 597001) durante cerca de 15 min a RT. A reação foi parada pela adição de 100 pL de ácido oxálico a 2%. Absorvência foi medida a 405 nm em um BioTek EL808 Microplate Reader (BioSPX). Dados transformados em logaritmos foram analisados configurando as curvas dose-resposta sigmoidais com inclinação variável usando o software GraphPad Prism.

[00473] Figura 3C mostra que a introdução da substituição intensificando Fc-Fc E430G não afetou a afinidade de ligação a Clq aparente para 1 pg/mL de anticorpo IgGl-hDR5-01-G56T revestido, enquanto as

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152/194 variantes de anticorpos contendo a combinação da substituição E430G e das substituições K326A/E333A, K326A/P396L, E333A/P396L ou

K326A/E333A/P396L mostraram ligação a Clq intensificada comparado com IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR5-01-G56T-E430G (Tabela 2).

Tabela 2: Valores EC50 de ligação a Clq para variantes de anticorpos IgGlhDR5-01-G56T (ELISA)_______________________________________

Variante de anticorpo IgGl-hDR5-01-G56T (1 jrg/mL)	EC50 de ligação a Clq (pg/mL)	SD	n	Variante de anticorpo versus WT¹	Variante de anticorpo versus E430G¹
WT	18,8	9,9	6	Não aplicável	Não significativa
E430G	20,7	12,6	6	Não significativa	Não aplicável
K326A/E333A/P396L/E4 30G	1,3	0,2	3	p<0,05	p<0,05
K326A/E333A/E430G	0,8	0,1	3	p<0,05	p<0,05
K326A/P396L/E430G	0,6	0,1	3	p<0,05	p<0,05
E333A/P396L/E430G	1,9	0,8	3	p<0,05	p<0,05

¹ valor p de ANO VA unidirecional = 0,0022; teste post hoc de Bonferroni Ab versus WT: p < 0,05 como indicado.

[00474] Juntos, estes dados mostraram que a combinação da substituição intensificando Fc-Fc E430G com as substituições K326A/E333A, K326A/P396L, E333A/P396L ou K326A/E333A/P396L resultou em ligação aumentada a Clq e atividade agonística aumentada do anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T-E430G apenas com a mutação intensificando Fc-Fc E430G.

Exemplo 5: Efeito de combinação E430G e K326W/E333S na ligação a Clq e a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos.

[00475] Um ELISA de ligação foi realizado para avaliar o efeito de K326A/E333A e K326W/E333S na ligação a Clq a um anticorpo contendo a mutação intensificando Fc-Fc E430G. Amostras de anticorpos purificadas de variantes IgGl-CONA-C49W contendo a substituição E430G em combinação com as mutações K326A/E333A ou K326W/E333S mutações foram testadas e comparadas com WT IgGl-CONA-C49W e IgGl-CONA-C49W-E430G. Também IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S sem a substituição E430G foi testada. IgGl-2F8-I253D/K322A foi usada como o controle negativo para ligação a Clq. O ELISA de ligação a Clq foi realizado em placas ELISA

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153/194 revestidas com 1 pg/mL de anticorpo como descrito em Exemplo 4.

[00476] Intensificação forte de ligação a Clq pela introdução da substituição K326W/E333S foi confirmada quando comparado com o anticorpo WT (Figura 4A). Em contraste, a introdução da mutação intensificando Fc-Fc E430G não afetou a afinidade de ligação a Clq aparente para 1 pg/mL de anticorpo IgGl-CONA-C49W revestido. As variantes de anticorpos contendo a combinação da substituição E430G e da substituição K326A/E333A ou K326W/E333S mostraram ligação a Clq fortemente intensificada comparado com IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR5-01-G56TE430G (Tabela 3).

Tabela 3: Valores de EC50 de ligação a Clq para variantes de anticorpos

IgGl-CONA-C49W (ELISA)_______________________

Variante de anticorpo IgGl-CONA-C49W (1 jig/mL)	EC50 de ligação a Clq (pg/mL)	SD	n	Variante de anticorpo versus WT¹	Variante de anticorpo versus E430G¹
WT	15,2	12,2	3	Não aplicável	Não significativa
E430G	15,4	6,1	3	Não significativa	Não aplicável
K326W/E333S	0,3	0,1	3	p<0,05	p<0,05
K326A/E333A/E430G	0,8	0,3	3	p<0,05	p<0,05
K326W/E333S/E430G	0,5	0,1	3	p<0,05	p<0,05

'valor p de ANO VA unidirecional = 0,0013; teste post hoc de Bonferroni Ab versus WT: p < 0,05 como indicado.

[00477] Um teste de viabilidade foi realizado para estudar o efeito da combinação de mutação intensificando Fc-Fc E430G com substituições de ligação a Clq K326A/E333A ou K326W/E333S na atividade agonística de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T nas células positivas para DR5 BxPC-3 e COLO 205. O teste de viabilidade foi realizado como descrito em Exemplo 3. A viabilidade das células cultivadas foi determinada em um teste de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo como descrito em Exemplo

2.

[00478] Figura 4B/C mostra que combinação de substituição intensificando Fc-Fc E430G e as duas mutações K326W/E333S resultou na indução de eficácia de morte forte para o anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01G56T quando testada como único agente em um teste de viabilidade in vitro

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154/194 em células de câncer pancreático BxPC-3 humano aderentes (Figura 4B) e de cólon COLO 205 (Figura 4C). Em contraste, o anticorpo WT e IgGl-hDR501-G56T-E430G não mostraram eficácia. A eficácia de morte de IgGl-hDR501-G56T-K326W/E333S/E430G foi melhor do que para IgGl-hDR5-01G56T-K326A/E333A/E430G em ambas as células de câncer BxPC-3 e COLO 205.

[00479] Juntos, estes dados mostraram que a combinação da substituição intensificando Fc-Fc E430G com as substituições K326A/E333A ou K326W/E333S resultou em ligação aumentada a Clq e atividade agonística aumentada de anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W-E430G apenas com a mutação intensificando hexamerização de E430G.

Exemplo 6: Efeito de combinação de E430G com outras variantes Fe na ligação a Clq e a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos.

[00480] Um ELISA de ligação a Clq foi realizado para estudar o efeito substituições de ligação a Clq S267E/H268F/S324T ou a variante 113F de IgGl do isotipo quimérico IgGl/IgG3 sobre a ligação a Clq a um anticorpo contendo a substituição intensificando Fc-Fc E430G (Tammen et al., J Immunol. 2017). Amostras de anticorpos purificadas de variantes IgGlhDR5-01-G56T com e sem estas substituições foram testadas e comparadas com WT IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR5-01-G56T-E430G. IgGl-2F8I253D/K322A foi usado como um controle negativo para ligação a Clq. O ELISA de ligação a Clq foi realizado em placas ELISA revestidas com 1 pg/mL de anticorpo como descrito em Exemplo 4.

[00481] Figura 5 A mostra que a introdução da substituição intensificando Fc-Fc E430G não afetou a afinidade de ligação a Clq aparente para 1 pg/mL de anticorpo IgGl-hDR5-01-G56T revestido. Em contraste, a variante de anticorpo contendo a combinação da substituição E430G e as substituições S267E/H268F/S324T mostrou ligação a Clq fortemente intensificada comparado com IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR5-01-G56T

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E430G, enquanto a introdução da substituição E430G na variante de formato IgG113F-hDR5-01-G56T resultou em uma ligação a Clq levemente intensificada comparado com IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR5-01-G56TE430G (Tabela 4).

Tabela 4: Valores de EC50 de ligação a Clq para variantes de anticorpos

IgGl-hDR5-01-G56T (ELISA)_________________________________

Variante de anticorpo IgGl-hDR501-G56T (1 pg/rnL)	EC50 ligação a Clq (pg/mL)	SD	n	Variante de anticorpo versus WT¹	Variante de anticorpo versus E430G¹
WT	15,2	12,2	3	Não aplicável	Não significativa
E430G	15,4	6,1	3	Não significativa	Não aplicável
S267E/H268F/S324T/E430G	0,5	0,1	3	p<0,05	p<0,05
IgG113F-E430G	11,4	3,9	3	Não significativa	Não significativa

'valor p de ANOVA unidirecional = 0,0013; teste post hoc de Bonferroni Ab versus. WT: p < 0,05 como indicado.

[00482] Um teste de viabilidade foi realizado para estudar o efeito da combinação de substituição intensificando Fc-Fc E430G com substituições de ligação a Clq S267E/H268F/S324T (Moore et al., MAbs 2010) ou a variante de isotipo quimérico IgGl/IgG3113F (Natsume et al., Cancer Res. 2008) na atividade agonística de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T em células BxPC-3 e COLO 205 positivas para DR5. O teste de viabilidade foi realizado como descrito em Exemplo 3. A viabilidade das células cultivadas foi determinada em um teste de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2.

[00483] Figura 5B/C mostra que a combinação da substituição intensificando Fc-Fc E430G com as substituições de ligação a Clq S267E/H268F/S324T resultou na indução de eficácia de morte para um anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T quando testada como um único agente em um teste de viabilidade in vitro em células de câncer pancreático BxPC-3 (Figura 5B) e cólon COLO 205 humanas aderentes (Figura 5C). Quando E430G foi incorporada na variante 113F de IgGl de isotipo quimérico IgGl/IgG3 de IgGl-hDR5-01-G56T, indução de eficácia de morte foi observada em COLO 205 (Figura 5C) e levemente em BxPC-3 onde a

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156/194 atividade agonística foi observada apenas a concentração mais alta de anticorpo testada (Figura 5B). No entanto, a eficácia destas variantes IgGlhDR5-01-G56T-S267E/H268F/S324T/E430G e IgG113F-hDR5-01-G56TE430G foi significativamente menor do que para IgGl-hDR5-01-G56TK326W/E333S/E430G e IgGl-hDR5-01-G56T-K326A/E333A/P396L/ E430G em ambas as linhagens de células. Como nos exemplos prévios, o anticorpo WT e IgGl-hDR5-01-G56T-E430G não mostraram eficácia.

[00484] Juntos, estes dados mostraram que combinação da substituição intensificando Fc-Fc E430G com as substituições S267E/H268F/S324T resultou em ligação a Clq fortemente aumentada e atividade agonística de IgGl-hDR5-01-G56T-E430G anticorpo anti-DR5 apenas com a substituição intensificando Fc-Fc E430G. A introdução de uma substituição E430G na variante de formato IgG113F-hDR5-01-G56T resultou em ligação a Clq levemente intensificada e atividade agonística do anticorpo.

Exemplo 7: Sumário do efeito de combinação de E430G com outras mutações Fe e variantes sobre a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos.

[00485] Nos exemplos prévios, teste de viabilidades foram descritos em que o efeito na atividade agonística de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR501-G56T foi testado quando a substituição intensificando Fc-Fc E430G foi combinada com outra substituição da região Fe ou variantes que foram escritas por afetar agonismo de DR5 ou ligação a Clq. Neste exemplo, um resumo é apresentado de todos os teste de viabilidades em células de câncer BxPC-3 pancreático humano aderente por representação e classificação da porcentagem de células viáveis após incubação durante três dias com 10 pg/mL dos anticorpos indicados relativos a WT IgGl-hDR5-01-G56T, que foi mostrado por não ter efeitos nos Exemplos 2, 4, 5 e 6. Detalhes dos teste de viabilidades em células BxPC-3 aderentes e do teste luminescente CellTiterGlo são descritos em Exemplo 2.

[00486] Figura 6 mostra que a combinação da substituição

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157/194 intensificando Fc-Fc E430G com a substituição dupla de ligação a Clq K326W/E333S mostrou o efeito mais significativo quando comparado com o anticorpo WT IgGl-hDR5-01-G56T após um período de incubação de três dias das células de câncer pancreático BxPC-3 humano aderentes com 10 pg/mL de anticorpo em um meio de cultura completo contendo soro de bezerro fetal inativado por calor. Também as combinações de E430G com K326A/E333A/P396L, E333A/P396L e K326A/E333A resultaram em porcentagens significativamente inferiores de células viáveis do que o anticorpo WT. Outras variantes Fc que foram mostradas como intensificando a ligação a Clq, tal como IgG-113F quimérico S267E/H268F/S324T e IgGl/IgG3, não mostraram indução significativa de eficácia de morte quando combinadas com E430G em IgGl-hDR5-01-G56T na configuração experimental aqui com 10 pg/mL de anticorpo nas células BxPC-3 aderentes, em que também IgGl-hDR5-01-G56T-E430G não resultou na indução de eficácia de morte quando testadas como um único agente.

Exemplo 8: Efeito de Clq na atividade in vitro de anticorpos anti-DR5 agonísticos com uma substituição intensificando Fc-Fc em combinação com substituições de ligação a Clq.

[00487] Os exemplos prévios sugeriram que ligação intensificada a Clq contribui para atividade agonística melhor dos anticorpos anti-DR5 testados contendo a mutação intensificando Fc-Fc E430G. Para testar o efeito de Clq, um teste de viabilidade foi realizado com IgGl-CONAK326A/E333A/P396L/E430G e IgGl-hDR5-01-G56T-K326W/E333S/ E430G em células WIL2-S SF em meio isento de soro na presença ou ausência de Clq humana purificada. Células WIL2-S SF foram derivadas de linfoblastos B WIL2-S (ATCC, CRL-8885) e adaptadas para crescer sob condições isentas de soro em meio de cultura formulado por HyQ-ADCFMab (Perbio, número de catálogo SH30349) contendo 50 U/mL Pen/Strep e 1 rnM de piruvirato de sódio. Células WIL2-S SF em suspensão foram passadas

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158/194 através de um filtro de células, granuladas por centrifugação durante 5 minutos a 300xg, e recolocadas em suspensão no meio de cultura isento de soro a uma concentração de 0,5xl0⁶ células/mL. 100 pL das únicas suspensões de células (50.000 células por cavidade) foram cultivadas em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades (Greiner Bio-One, número de catálogo 655182). 25 pL de uma série de preparação de anticorpos de diluição em série (faixa de concentrações finais de 0,0003 a 20,000 ng/mL em diluições de 4 vezes) e 25 pL de Clq purificada (Quidel, número de catálogo A400; concentração final 2,5 pg/mL) foram adicionados e incubados durante 1 dia a 37°C. Como um controle negativo e positivo, células foram incubadas no meio sem anticorpo ou com 5 pM de estaurosporina (Sigma Aldrich, número de catálogo S6942), respectivamente. Viabilidade da célula foi determinada por coloração TO-PRO-3. TO-PRO-3 é um corante de monômero de carbocianina impermeante de célula que se liga ao DNA de filamento duplo. Como tal, TO-PRO-3 pode ser usado como um indicador de morte de células. Todas as amostras foram transferidas para placas de poliestireno com fundo tipo U de 96 cavidades (Greiner Bio-One, número de catálogo 650261) e centrifugadas durante 3 minutos a 300 x g antes de remover 70 pL do sobrenadante. Uma mistura delO pL TO-PRO-3 (Invitrogen, número de catálogo T3605) 20 pL TO-PRO-3 + 1980 pL PBS) foi adicionada antes de recolocar as células em suspensão por pipetagem. A quantidade de células positivas para TO-PRO-3 foi determinada por citometria de fluxo em um analisador de células BD LSRFortessa X-20 (BD Biosciences).

[00488] Figura 7 mostra que a adição de Clq purificada ao meio isento de soro intensificou muito a potência tanto de IgGl-CONAK326A/E333A/P396L/E430G (Figura 7A) como IgGl-hDR5-01-G56TK326W/E333S/E430G (Figura 7B) nas células WIL2-S SF. Estes dados indicam que a ligação a Clq contribui para atividade agonística melhor de

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159/194 anticorpos anti-DR5 agonísticos contendo a substituição intensificando Fc-Fc E430G em combinação com as substituições K326A/E333A/P396L ou K326W/E333S de ligação a Clq.

Exemplo 9: Efeito de Clq na atividade agonística in vitro de anticorpos antiDR5 agonísticos com uma substituição intensificando Fc-Fc em combinação com substituições de ligação a Clq.

[00489] No Exemplo 8 o efeito de Clq sobre a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos foi testado em um teste de viabilidade em células WIL2S SF em meio isento de soro com uma série de concentração de anticorpos e uma concentração fixa de Clq. Neste exemplo, o efeito de uma série de concentrações de Clq foi testado sobre a eficácia de variantes de anticorpos agonísticos IgGl-hDR5-01-G56T com a substituição intensificando Fc-Fc (E430G) em combinação com substituições de ligação a Clq (K326A/E333S/P396L, K326W/E333S ou K326A/E333A) em um teste de viabilidade em células WIL2-S SF em meio isento de soro. A viabilidade foi realizada, essencialmente como descrito em Exemplo 8, com uma concentração de anticorpo fixa de 2,5 pg/mL e uma série de concentrações de Clq purificada na faixa de concentrações finais de 0,0002 a 2,5 pg/mL em diluições de 4 vezes.

[00490] Figura 8 mostra que a adição de Clq purificada ao meio isento de soro intensificou a potência de anticorpos anti-DR5 contendo a substituição intensificando Fc-Fc E430G. Todas as variantes testadas de anticorpos IgGl-hDR5-01-G56T-E430G contendo substituições intensificando a ligação a Clq (K326A/E333S/P396L, K326W/E333S ou K326A/E333A) mostraram eficácia nas células WIL2-S SF de modo dependente da dose de Clq (Figura 8A). IgGl-hDR5-01-G56TK326W/E333S/E430G mostrou maior eficácia de todos os anticorpos testados e alcançou morte máxima a uma faixa de concentração de Clq partindo de 0,16 pg/mL. Estes dados indicam que a ligação a Clq contribui para atividade

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160/194 melhor de anticorpos anti-DR5 agonísticos contendo a substituição intensificando Fc-Fc E430G em combinação com as substituições de ligação a Clq K326A/E333A/P396L, K326W/E333S ou K326A/E333A. Também a combinação de anticorpo alvejando epítopo duplo IgGl-hDR5-01-G56TE430G + IgGl-hDR5-05-E430G mostrou um aumento dependente da dose de Clq na eficácia para matar células WIL2S-SF em meio isento de soro, alcançando morte máxima em tomo de 0,16 pg/mL Clq (Figura 8B).

Exemplo 10: Efeito de neutralização de Clq na atividade agonística in vitro de anticorpos anti-DR5 agonísticos com a substituição intensificando Fc-Fc em combinação com substituições de ligação a Clq.

[00491] A exigência de Clq para a eficácia de anti-DR5 agonístico IgGl-hDR5-01-G56T-K326W/E333S/E430G contendo a substituição intensificando Fc-Fc E430G em combinação com a substituição K326W/E333S para ligação a Clq foi testada usando um anticorpo neutralizante anti-CIq dirigido contra a região de cabeça globular Clq, em um teste de viabilidade nas células WIL2-S SF em meio isento de soro contendo Clq purificada. Similarmente, o efeito de neutralização de Clq também foi testado nas mesmas configurações para a combinação de anticorpo guiado ao alvo de epítopo duplo IgGl-hDR5-01-G56T-E430G + IgGl-hDR5-05-E430G. O teste de viabilidade foi realizado, essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, células WIL2-S SF foram recolocadas em suspensão em meio de cultura isento de soro a uma concentração de 0,67xl0⁶ células/mL. 75 pL das únicas suspensões de células (50.000 células por cavidade) foram cultivadas em meio de cultura isento de soro em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades. Em seguida, 25 pL de amostra de anticorpo anti-DR5 (concentração final de 2,5 pg/mL), 25 pL de Clq purificada (concentração final de 0,01 pg/mL) e 25 pL de amostra anticorpo anti-Clq (Sanquin, CLB/Clq-85 CAT # MW1828; concentração final de 10 pg/mL) foram adicionados e incubadas durante 1 dia

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161/194 a 37°C. Viabilidade da célula foi determinada por corante T0-PR0-3 como descrito em Exemplo 8.

[00492] O efeito da adição de Clq purificada ao meio isento de soro para intensificar a potência de anticorpo anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56TK326W/E333S/E430G como descrito em Exemplo 9 foi confirmado neste experimento (Figura 9A). Além disso, esta potência foi diminuída quando a ligação a Clq suplementado ao anticorpo anti-DR5 foi neutralizada pela presença de um excesso de anticorpo anti-CIq (Figura 9A). Estes dados ilustram que a ligação a Clq é exigida para atividade ideal de anticorpos antiDR5 agonísticos contendo substituição intensificando Fc-Fc E430G em combinação com substituição K326W/E333S de ligação a Clq. Eficácia dependente de Clq para matar células WIL2S-SF também foi confirmada para a combinação de anticorpo guiando ao alvo epítopo duplo IgGl-hDR501-G56T-E430G + IgGl-hDR5-05-E430G mostrando eficácia intensificada quando da adição de Clq ao meio isento de soro, e neutralização deste efeito pela presença de um excesso de anticorpo anti-CIq (Figura 9B).

Exemplo 11: Teste de ativação de complemento em fase de solução para anticorpos com uma substituição intensificando Fc-Fc em combinação com substituições de ligação a Clq.

[00493] Ativação de complemento de ligação ao alvo por variantes de anticorpos foi determinada por quantificação de C4d, um marcador para ativação de via de complemento clássica, após anticorpos serem incubados em soro humano normal (NHS). Um procedimento ELISA de três etapas foi realizado usando o teste MicroVue C4d Enzyme Immuno Assay (Quidel, número de catálogo A0008) contendo (1) uma placa de microteste revestida com um anticorpo monoclonal de camundongo que se liga especificamente a fragmentos de ativação contendo C4d de C4 humano, (2) um anticorpo C4d anti-humano de cabra conjugado com HRP, e (3) um substrato cromogênico. Controles e padrões internos foram suplementados com o kit e usados como

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162/194 descrito pelas instruções do fabricante. Como um controle positivo, gama globulina agregada com calor foi preparada como se segue. Alíquotas de 1 mL em frascos de 1,5 ml de solução IVIG (60 mg/mL; Sanquin, número de catálogo 04H04H443A) foram aquecidas durante 20 min a 63°C. Os frascos foram reunidos em pools e diluídos a 20 mg/mL com PBS e filtrados através de filtros de seringa com membrana de acetato de celulose (SFCA) isento de tensoativo de poros de 0,22 pm (Coming, número de catálogo 431219). Alíquotas de ~0,2 mL foram armazenadas a 4°C. Para as amostras de anticorpos, amostras de 50 pL de preparação de anticorpo de 100 pg/mL em 90% de soro humano normal (NHS, Sanquin M0008AC) foram incubadas em placas de polipropileno com fundo tipo U de 96 cavidades (Greiner Bio-One; número de catálogo 650261) durante 1 hora a 37°C. Em seguida, 5 pL estas amostras foram diluídos 90x com diluente de Amostra e 100 pL das amostras diluídas foram incubados por cavidade durante 30 minutos em temperatura ambiente enquanto agitando nas tiras revestidas que foram pré-lavadas três vezes com 250 pL de solução de lavagem. Em seguida, as cavidades foram lavadas cinco vezes com 250 pL de solução de lavagem antes da incubação de 50 pL de conjugado C4d por cavidade durante 30 minutos a RT enquanto agitando. As cavidades foram lavadas cinco vezes com 250 pL de solução de lavagem antes da incubação de 100 pL de substrato por cavidade durante 30 minutos a RT enquanto agitando. As reações foram paradas pela adição de 50 pL de solução de parada por cavidade e a intensidade da cor foi medida espectrofotometricmente a 405 nm em um leitor de microplaca BioTek EL808 Microplate Reader (BioSPX).

[00494] Amostras de controle positivo mostraram níveis de C4d claramente intensificados comparado com amostras de controle negativo (Figura 10). Em contraste, nenhuma intensificação clara de níveis de C4d foi observada para todas as variantes de anticorpos IgGl-hDR5-01-G56T testadas contendo a substituição intensificando Fc-Fc E430G em combinação com

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163 / 194 substituições de ligação a Clq K326W/E333S, K326A/E333A ou K326A/E333A/P396L quando incubadas em NHS na ausência de células alvo (Figura 10), enquanto C4d foi produzido quando os controles positivos HAGG, representando complexos imunes aleatórios, e IgGl-CONA-RGY, representando hexâmeros de IgGl de fase fluida, foram incubados em NHS. Estes dados indicam que variantes de anticorpos IgGl-hDR5-01-G56T contendo a substituição intensificando Fc-Fc E430Gs em combinação com substituições de ligação a Clq K326W/E333S, K326A/E333A ou K326A/E333A/P396L não mostram hexamerização e ativação de complemento independente de alvo na fase em solução.

Exemplo 12: Efeito de combinação de E430G e K326W, E333S ou K326W/E333S sobre a ligação a Clq e eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos.

[00495] ELISA de ligação a Clq foi realizado para avaliar o efeito de introduzir as substituições K326W, E333S, ou K326W/E333S na ligação a Clq a variantes IgG-CONA-C49W com ou sem a substituição E430G. IgG2F8-I253D/K322A foi usado como a controle negativo para ligação a Clq. O experimento ELISA foi realizado em placas de 96 cavidades revestidas com 1 pg/mL anticorpo que foram testados para ligação de diferentes concentrações de Clq purificada (faixa 0,010 - 30 pg/mL em diluições de 3 vezes) como descrito em Exemplo 4. Absorvência foi medida a 405 nm e dados transformados em logaritmos foram analisados por configuração curvas sigmoidais de dose-resposta com inclinação variável usando software GraphPad Prism. Figura 11A,B mostra que introdução das substituições K326W, E333S, ou K326W/E333S resultaram, todas, em aumentada ligação a Clq a um anticorpo aleatoriamente imobilizado para ambos o anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W e sua variante IgGl-CONA-C49W-E430G com a interação intensificando Fc-Fc E430G e mutação intensificando hexamerização. IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S/E430G mostrou a maior

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164/194 afinidade de ligação a Clq aparente de todas as variantes de anticorpos testadas.

[00496] Ligação de variantes de anticorpos purificadas para células em suspensão WIL2-S SF foi analisada por citometria de fluxo. As células foram coletadas, contadas, lavadas em PBS e recolocadas em suspensão em 3,33xl0⁶ células/mL em meio de cultura. 30 pL células (IxlO⁵ células por cavidade) foram pipetados em placas de 96 cavidades. Amostras de 50 pL de série de titulação de anticorpos (faixa 0,001 - 2,5 pg/mL de concentrações de anticorpo finais em diluições de 3 vezes) foram adicionadas e incubadas durante 15 minutos a 37°C. Subsequentemente, 20 pL de Clq purificada (2,5 pg/mL concentração final ) foram adicionados e incubados durante 45 minutos a 4°C. Em seguida, 100 pL de tampão FACS (PBS + 0,1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) + 0,02% (p/v) sódio azida) foram adicionados antes de lavar as células duas vezes com 150 pL de tampão FACS. As células lavadas foram incubadas durante 30 minutos a 4°C com 50 pL de Clq anti-humano de coelho anticorpo marcado com FITC (20 pg/mL de concentração final; DAKO Número de catálogo F0254). 100 pL de tampão FACS foram adicionados e células foram lavadas duas vezes com tampão FACS. Células foram recolocadas em suspensão em 30 pL de tampão FACS e fluorescência foi medida por citometria de fluxo usando iQue Screener (IntelliCyt). Curvas de ligação com um eixo de concentração de Clq transformado por logaritmo foram analisadas usando análise de regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 11C,D mostra que introdução de somente a substituição E333S ou E430G em anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W não teve efeito sobre a ligação a Clq a o anticorpo ligou a células WIL2-S SF positivas para DR5 (Figura 11C). Introdução da mutação K326W em anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W ou IgGl-CONA-C49W-E430G resultou em aumentada ligação a Clq a células WIL2-S SF opsonizadas com

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165 / 194 anticorpo anti-DR5, consistente com a ligação aumentada a Clq observada para células opsonizadas com IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S/E430G (Figura 11C, D). Introdução de E333S em anticorpo anti-DR5 IgGl-CONAC49W-E430G resultou em um aumento modesto em Clq ligando a células WIL2-S SF opsonizadas com anticorpo (Figura 11D). Estes dados de citometria de fluxo que IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S/E430G ligado à célula mostrou a ligação a Clq a mais ávida.

[00497] Um teste de viabilidade foi realizado para avaliar o efeito de introduzir K326W, E333S, ou K326W/E333S em variantes anti-DR5 IgGlCONA-C49W com ou sem a substituição E430G na atividade agonista de DR5 em células WIL2-S SF. Um teste de viabilidade de um dia foi realizado, essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 100 pL de células em meio isento de soro (50.000 células/cavidade) foram pipetados em placas de 96 cavidades. 25 pL de Clq purificada (de concentração final 2,5 pg/mL) e 25 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) foram adicionadas e incubadas a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiterGlo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor tipo EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Os dados de concentração de Clq transformados em logaritmos foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 11E-G mostra que introduzir apenas a mutação K326W, E333S ou E430G em anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W não resultou em indução de atividade agonista DR5 em células WIL2-S SF, enquanto que a mutação dupla K326W/E333S em IgGl-CONA-C49W resultou na indução de atividade agonista de DR5 e morte parcial de células WIL2-S SF (Figura HE). A combinação de mutação K326W, mutação E333S, ou mutação dupla K362W/E333S com a mutação intensificando Fc

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Fc E430G no anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W resultou na indução de atividade agonista DR5, com K362W/E333S/E430G resultando na morte máxima maior em células WIL2-S SF (Figura 11F).

Exemplo 13: Efeito de combinação de E430G e K326W, E333S ou K326W/E333S sobre a eficácia dependente de Clq de anticorpos anti-DR5 agonísticos.

[00498] O efeito de introduzir as substituições K326W, E333S, ou K326W/E333S em variantes de anticorpos anti-DR5 IgG-CONA-C49W, com ou sem mutação E430G, sobre a atividade agonística dependente de Clq foi testado. Um teste de viabilidade de um dia foi realizado in vitro usando células WIL2-S SF em meio isento de soro com uma série de diluição de concentração de Clq, essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 100 pL de células em meio isento de soro (50.000 células/cavidade) foram pipetados em placas de 96 cavidades. 25 pL de amostras de anticorpos (2,5 pg/mL de concentração final) e 25 pL de uma série de diluição de concentração de Clq purificada (faixa de concentrações finais de 42 pg/mL - 2,5 pg/mL em diluições de 3 vezes) foram adicionados e incubados a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Os dados transformados em logaritmos da concentração de Clq foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 12 mostra que introduzir a substituição intensificando Fc-Fc E430G ou as substituições intensificando a ligação a Clq K326W ou E333S como uma mutação única em anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W resultou na indução de morte dependente da dose de Clq de células WIL2-S SF, e comparado com isto, introdução da mutação dupla K326W/E333S resultou em indução mais eficiente de morte dependente da dose de Clq de células WIL2-S SF.

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Combinando a substituição intensificando Fc-Fc E430G e as substituições de ligação a Clq testadas resultou em morte mais eficaz, com IgG-CONAC49W-K326W/E333S/E430G induzindo a mais eficiente morte dependente da dose de Clq de células WIL2-S SF (Figura 12).

Exemplo 14: Efeito de neutralização de Clq na atividade agonística in vitro de anticorpos anti-DR5 com uma mutação E430G em combinação com mutações K326W, E333S ou K326W/E333S.

[00499] Para testar a contribuição de Clq para a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonistas contendo a mutação intensificando Fc-Fc E430G, um anticorpo neutralizante de Clq foi adicionado em um teste de viabilidade com células WIL2-S SF opsonizadas com variantes IgGl-CONA-C49W em meio isento de soro contendo Clq humana purificada. A experiência foi realizada essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 75 pL de suspensões celulares foram semeados em meio isento de soro em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades (50.000 células por cavidade). 25 pL de variantes de anticorpos IgGl-CONA-C49W (2,5 pg/mL de concentração final), 25 pL de Clq purificada (em concentrações finais de Clq aproximando a concentração EC90 para cada diferente anticorpo de acordo com Tabela 5) e 25 pL de (10 pg/mL de concentração final) anticorpo neutralizante de Clq (CLB-Clq-85; Sanquin, Artigo No. MW1828) ou anticorpo de controle de isotipo (IgGl purificado de camundongo, κ Clone MOPC-21; BD Biosciences Número de catálogo 555746) foram adicionados a células WIL2-S SF e incubados a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados foram analisados e traçados em gráfico usando software GraphPad Prism. Figura 13 mostra que na presença do anticorpo neutralizando Clq, a atividade agonista DR5 das variantes IgGl-CONAC49W com as substituições K326W/E430G, E333S/E430G ou

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K326W/E333S foi completamente inibida. Para IgGl-CONA-C49WK326W/E333S/E430G, neutralização de Clq resultou em inibição parcial de atividade agonista DR5.

Tabela 5: Valores EC90 de Clq para 2,5 pg/mL dos anticorpos indicados em um teste de viabilidade em células WIL2-S SF em meio isento de soro suplementado com séries de concentrações purificadas de Clq como descrito em Exemplo 13 (dados não mostrados).____________________________

Anticorpo	Clq EC90 (qg/mL)	concentração Clq em Figura 13 (qg/mL)
IgGl-bl2	>2,5	2,5
IgGl-CONA-C49W	>2,5	2,5
IgG 1-CONA-C49 W-K326W/E430G	1,0	1,0
IgGl-CONA-C49W-E333S/E430G	>2,5	2,5
IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S	0.3	0.3
IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S/E430G	0,1	0,1

Exemplo 15: Efeito de inibição da interação Fc-Fc sobre a atividade agonística in vitro de anticorpos anti-DR5 com uma mutação E430G em combinação com K326W, E333S ou K326W/E333S.

[00500] Para testar o envolvimento de hexamerização de anticorpos mediada por Fc-Fc na indução de morte celular por variantes de anticorpos IgGl-CONA, os requerentes usaram o peptídeo de 13 resíduos DCAWHLGELVWCT (DeLano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):127983) que se liga a Fc em uma região contendo os aminoácidos de núcleo na área do nó hidrofóbico envolvida em interações Fc-Fc (Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176): 1260-3). A viabilidade de células WIL2-S SF foi determinada na presença ou ausência do peptídeo DCAWHLGELVWCT, essencialmente como descrito em Exemplo 14. Brevemente, 75 pL de suspensões celulares WIL2-S SF foram semeados em meio isento de soro em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades (50.000 células por cavidade). 25 pL de anticorpo (2,5 pg/mL de concentração final) foram adicionados e incubados durante 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, 25 pL de peptídeo inibindo Fc-FcDCAWHLGELVWCT ou peptídeo de controle embaralhado

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WCDLEGVTWHACL (80 pg/mL) foram adicionados e incubados durante 10 minutos em temperatura ambiente. Então, 25 pL de Clq purificada (em concentrações finais de Clq se aproximando do EC90 para cada diferente anticorpo, como listado em Exemplo 14, Tabela 1) foram adicionados e as misturas de reação foram incubadas a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados foram analisados e traçados em gráfico usando software GraphPad Prism. Figura 14 mostra que na presença de peptídeo inibindo Fc-Fc DCAWHLGELVWCT, a atividade agonista DR5 das variantes IgGl-CONA-C49W com as substituições K326W/E430G, E333S/E430G, K326W/E333S, ou K326W/E333S/E430G foi parcialmente inibida. O peptídeo inibindo Fc-Fc inibiu a atividade agonística de IgGlCONA-C49W-K326W/E333S/E430G com a mutação intensificando Fc-Fc E430G mais fortemente do que IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S sem mutação E430G.

Exemplo 16: Efeito de combinação de K326W/E333S com mutação intensificando Fc-Fc E345K, E345R, ou S440Y sobre a atividade agonista de um anticorpo anti-DR5 [00501] Um teste de viabilidade foi realizado para estudar o efeito de combinação das substituições de ligação a Clq K326W/E333S com as mutações intensificando Fc-Fc E345K, E345R, ou S440Y sobre a atividade agonista de anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W opsonizado para células BxPC-3. O teste de viabilidade foi realizado essencialmente como descrito em Exemplo 2. Brevemente, 100 pL de suspensões celulares únicas de BxPC-3 foram cultivados em meio de cultura completo (RPMI contendo 10% DBSI) em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades (5.000 células por cavidade) e deixados aderir durante a noite a 37°C. Em seguida, 50 pL de uma série de preparação de anticorpos de diluição em série (faixa de concentrações

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170/194 finais de 0,0003 a 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) foram adicionados e incubados durante 3 dias a 37°C. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiter-Glo. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados com eixos de concentração transformados em logaritmos foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 15A mostra que a morte de células BxPC-3 por IgGl-CONA-C49W foi fortemente induzida por introdução da mutação E345R, levemente induzida pela mutação E430G ou E345K, enquanto S440Y não apresentou efeito. Figura 15B mostra que a morte de células BxPC-3 por variantes IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S foi aumentada por introdução da mutação E430G, E345K ou E345R, enquanto não foi adicionalmente intensificada por introdução da mutação S440Y. Juntos, estes dados indicam que a mutação K326W/E333S intensificando a ligação a Clq pode intensificar eficácia de anticorpos IgGl agonista anti-DR5 com diferentes mutações intensificando Fc-Fc, tal como E430G, E345K ou E345R.

Exemplo 17: Efeito de combinação de E430G com outras modificações Fe sobre a eficácia de anticorpos anti-DR5 agonísticos [00502] Um teste de viabilidade foi realizado para estudar o efeito de combinação de substituição intensificando Fc-Fc E430G com substituições de ligação a Clq S267E/H268F/S324T ou a variante de isotipo quimérico IgGl/IgG3113F na atividade agonística de anticorpo anti-DR5 IgGl-CONAC49W opsonizado a células BxPC-3 DR5-positivas. O teste de viabilidade foi realizado essencialmente como descrito em Exemplo 3. Brevemente, 100 pL de suspensões celulares únicas BxPC-3 foram cultivados em meio de cultura (RPMI contendo 10% DBSI inativado com calor) em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades (5.000 células por cavidade) e deixados aderir durante a noite a 37°C. 25 pL de Clq purificada (2,5 pg/mL de

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171 / 194 concentração final) e 25 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) foram adicionados e incubados a 37°C durante 3 dias. A viabilidade das células cultivadas foi determinada em um teste CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados com eixos de concentração transformados em logaritmos foram analisados usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) e traçados em gráfico usando software GraphPad Prism. Figura 16 mostra que combinação da substituição intensificando Fc-Fc E430G com os formatos intensificando a ligação a Clq S267E/H268F/S324T (Figura 16A) ou IgG113F (Figura 16B) resultou na indução de atividade agonista de anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W em células BXPC-3 humanas aderentes de câncer pancreático. Combinando a substituição E430G com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S resultou em atividade agonística de DR5 mais forte por IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S/E430G comparado com IgGl-CONA-C49W-S267E/H268F/S324T/E430G e IgGl 13F-CONA-C49W-E430G.

Exemplo 18: Eficácia de anticorpo anti-DR5 monovalente contendo as substituições K326W/E333S/E430G [00503] Um teste de viabilidade foi realizado para estudar o efeito sobre a atividade agonista de anticorpo anti-DR5 monovalente contendo as substituições K326W/E333S/E430G opsonizado em células BxPC-3 de câncer pancreático. O anticorpo anti-DR5 monovalente foi gerado por troca de Fab-braço controlada entre IgGl-CONA-C49W-F405LK326W/E333S/E430G e IgGl-bl2-K409R-K326W/E333S/E430G como descrito em Exemplo 1. O anticorpo biespecífico gerado, dito como BsAb (IgGl-CONA-C49W-F405L x IgGl-bl2-K409R)-K326W/E333S/ E430G, contém um braço específico para DR5 e um braço não específico contra

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172/194 glicoproteina do HIV gpl2, resultando em ligação de DR5 monovalente em células humanas positivas para DR5. Um teste de viabilidade de um dia foi realizado em células WIL2-S SF, essencialmente como descrito em Exemplo

8. Brevemente, 100 pL de células WIL2-S SF em meio isento de soro foram pipetados em placas de 96 cavidades (50.000 células/cavidade). 25 pL de Clq purificada (2,5 pg/mL de concentração final) e 25 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) foram adicionados às células e incubados a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados com eixos de concentração transformados em logaritmos foram analisados usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) e traçados em gráfico usando software GraphPad Prism. Figura 17 mostra que na presença das mutações K326W/E333S/E430G, a variante monovalente de IgGl-CONA-C49W ainda poderia induzir a morte de células WIL2-S SF.

Exemplo 19: Efeito de combinação de E430G e K326W/E333S sobre a atividade agonista de diferentes variantes de isotipos de um anticorpo antiDR5.

[00504] Para testar se a introdução das substituições K326W/E333S/E430G pode induzir atividade agonista de anticorpos antiDR5 em uma espinha dorsal não anticorpo IgGl, variantes isotípicas IgG3 de IgGl-CONA-C49W com domínios constantes de IgG3 humana, foram geradas por métodos conhecidos na técnica, dando IgG3-CONA-C49W. A espinha dorsal de IgG3 também continha a mutação R345H para ligação intensificada FcRn (Stapleton et al., 2011 Nat Commun). As substituições K326W/E333S/E430G foram introduzidas em ambas as variantes de isotipos IgGl e IgG3 e atividade agonista dos diferentes anticorpos foi testada nos

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173 / 194 testes de viabilidade in vitro usando diferentes linhagens celulares: células linfoblastos humanos WIL2-S SF B, BxPC-3 e HPAF-II (ATCC, CRL-1997) células de câncer pancreático e HT-29 (ATCC, HTB-38) células de câncer de cólon. O teste de viabilidades usando células WIL2-S SF em suspensão foi realizado, essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 100 pL de células WIL2-S SF foram pipetados em meio isento de soro em placas de 96 cavidades (50.000 células/cavidade). Em seguida, 25 pL de amostras de Clq purificada (2,5 pg/mL de concentração final) e 25 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) foram adicionados às células e incubados a 37°C durante 1 dia. Para as células aderentes BxPC-3, HPAF-II e HT-29, um teste de viabilidade de 3 dias foi realizado, essencialmente como descrito em Exemplo 3. Brevemente, 100 pL de células em meio de cultura (RPMI 1640 com 25mM Hepes e L-Glutamina + 10% + DBSI inativado com calor + 50 U/mL Pen/Strep) foram pipetados em placas de 96 cavidades (5.000 células/cavidade) e deixados aderir por incubação durante a noite a 37°C. Em seguida, 25 pL de amostras de Clq purificada (2,5 pg/mL de concentração final) e 25 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) foram adicionados às células e incubados a 37°C durante 3 dias. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados com eixos de concentração transformados em logaritmos foram analisados usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) e traçados em gráfico usando software GraphPad Prism. Figura 18 mostra que introdução das substituições K326W/E333S/E430G na variante de IgG3 do anticorpo anti-DR5 (IgG3-DR5-CONA-C49W-R435HK326W/E333S/E430G) resultou na indução de atividade agonista em todas as

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174/194 linhagens celulares testadas: WIL2S-SF (Figura 18A), BxPC-3 (Figura 18B), HPAF-II (Figura 18C) e HT29 (Figura 18D). A variante de IgGl IgGl-DR5CONA-C49W-K326W/E333S/E430G foi mais potente do que a variante de IgG3 IgG3-DR5-CONA-C49W-R435H-K326W/E333S/E430G em todas as linhagens celulares testadas.

Exemplo 20: Efeito de combinação de E430G com K326W/E333T sobre a atividade agonista de anticorpos anti-DR5 [00505] Um teste de viabilidade foi realizado para avaliar o efeito da combinação de substituição intensificando Fc-Fc E430G e K326W/E333T comparado com K326W/E333S na atividade agonística de anticorpo anti-DR5 IgGl-CONA-C49W em células WIL2-S positivas para DR5. Um teste de viabilidade in vitro foi realizado, essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 100 pL de células WIL2-S foram pipetados em meio de cultura (RPMI 1640 com 25mM Hepes e L-Glutamina (Lonza, número de catálogo BE12-115F) + 10% DBSI inativado com calor + 1 mM piruvato de sódio (Lonza, número de catálogo BE13-115E) + 50 U/mL Pen/Strep) em placas de 96 cavidades (50.000 células/cavidade). Em seguida, 50 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,001 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) e 10 pL de amostras de Clq purificada (2,5 pg/mL de concentração final) foram adicionados às células e incubados a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste cellTiterGlo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 19 mostra que introdução de K326W/E333I7E430G em IgGl-CONA-C49W resultou na indução de atividade agonista DR5 do agente único com uma eficácia similar de morte em um teste de viabilidade in vitro em células WIL2-S como por introdução

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175 / 194 de K326W/E333S/E430G.

Exemplo 21: Análise farmacocinética (PK) de variantes de anticorpos IgGlCONA-C49W contendo mutação(ões) intensificando Fc-Fc(s) e/ou mutações Fc que afetam a ligação a Clq.

[00506] O efeito de mutações intensificando Fc-Fc E430G e mutações intensificando a ligação a Clq sobre a taxa de depuração de IgGl-CONAC49W foi estudado em uma experiência PK com camundongos SCID. Todas as variantes de anticorpos testadas são listadas na Tabela 6. As experiências com animal foram realizadas de acordo com a lei de proteção aos animais na Holanda (WoD) traduzidas das diretrizes da União Européia (2010/63AUE) e se aplicável o Código da Prática para “experiências com animais para pesquisa de câncer” (Inspection V&W, Zutphen, Holanda, 1999) e foram aprovados pelo comitê de ética de Utrecht. Os animais foram alojados e tratados de acordo com boa prática animal como definida por FELASA, em uma instalação para animais certificada por AAALAC e ISO 9001:2000 (GDL). Camundongos SCID fêmeas com 11-12 semanas de idade (camundongos SCID C.B-17/IcrHan®Hsd-PrkóZc^íCK/; Envigo) foram injetados intravenosamente com 450 mg de anticorpo (22,5 mg/kg) em um volume de injeção de 200 pL (3 camundongos por grupo). Amostras de sangue de 50 pL foram coletadas da veia safena a 10 minutos, 4 horas, 1 dia, 2 dias, 7 dias, 14 dias e 20 dias após a administração do anticorpo. O sangue foi coletado em frascos contendo heparina e centrifugado por 10 minutos a 14.000 g. As amostras de plasma de 20 pL foram diluídas com 380 pL de PBS (1:20) e armazenadas a -20°C até determinação das concentrações de anticorpo. As concentrações totais de IgG humana foram determinadas usando um ensaio ELISA sanduíche. O clone IgG-kappa mAb anti-humano de camundongo MH16 (CLB Sanquin, número de catálogo M1268) foi usado como um anticorpo de captura e revestido em 100 pL durante a noite a 4°C em placas Microlon ELISA de 96 cavidades (Greiner, Alemanha) em uma concentração

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176/194 de 2 pg/mL em PBS. As placas foram bloqueadas por incubação em um agitador de placas durante 1 h em temperatura ambiente com PBS suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino (BSA). Após a lavagem, 100 pL das amostras diluídas de plasma foram adicionados e incubados em um agitador de placas por Ih em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 pL de PB ST (PBS suplementado com Tween 20 a 0,05%) e subsequentemente incubadas em um agitador de placas por Ih em temperatura ambiente com 100 pL de imunoglobulina IgG anti-humana de cabra marcada com peroxidase (# 109-035-098, Jackson, West Grace, PA; 1: 10.000 em PBST suplementado com 0,2% de BSA). As placas foram lavadas novamente três vezes com 300 pL de PBST antes da incubação por 15 minutos em temperatura ambiente com 100 pL de substrato ácido 2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) [ABTS; Roche, número de catálogo 11112 422001; 1 comprimido em 50 mL de tampão ABTS (Roche, número de catálogo 11112 597001) protegido da luz. A reação foi interrompida pela adição de 100 pL de ácido oxálico a 2% e incubação por 10 minutos em temperatura ambiente. A absorvância foi medida em um leitor de microplacas (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm. A concentração foi calculada usando o material injetado como uma curva de referência. Como placa de controle, proteína de mieloma humano de controle contendo IgG (The binding site, número de catálogo BP078) foi incluída. Concentrações de IgG humana (em pg/mL) foram traçadas em gráfico (Figura 20A) e a área sob a curva (AUC) foi calculada usando prisma de Graphpad. As taxas de depuração até o último dia da coleta de sangue (dia 21) foram determinadas pela fórmula D* 1.000/AUC, em que D é a dose de injeção de 22,5 mg/kg (Figura 20B). Todas as variantes de IgGl-CONA-C-49W testadas contendo a mutação intensificando Fc-Fc E430G e/ou mutações intensificando a ligação a Clq mostraram uma taxa de depuração comparável como IgGl WT (Figura 20A, B). Em conclusão, a introdução de mutações intensificando a ligação a Clq,

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177 / 194 tais como K326W/E333S ou K326A/E333A, não afetam significativamente a taxa de depuração de um anticorpo IgGl contendo uma mutação intensificando Fc-Fc E430G, tal como em IgGl-CONA-C49WK326W/E333S/E430G e IgGl-CONA-C49W-K326A/E333A/E430G.

Tabela 6: Variantes de anticorpos IgGl-CONA-C49W testadas em análise PK em camundongos Scid_____________________________________

Variante de anticorpo	Mutação intensificando FcFc	mutação intensificando a ligação a Clq
IgGl-CONA-C49W	-	-
IgGl-CONA-C49W-K326W/E333S	-	K326W/E333S
IgG 1 -CON A-C49 W-K326W/E430G	E430G	K326W
IgGl-CONA-C49W-E333S/E430G	E430G	E333S
IgGl-CONA-C49W- K326W/E333S/E430G	E430G	K326W/E333S
IgGl-CONA-C49W- K326A/E333A/E430G	E430G	K326A/E333A

Exemplo 22: Efeito de combinação da mutação intensificando Fc-Fc E430G e mutações intensificando a ligação a Clq K326A/E333A ou K326W/E333S em ligação FcRn de um anticorpo IgGl.

[00507] O receptor Fc neonatal (FcRn) é responsável pela longa meiavida plasmática da IgG, protegendo a IgG da degradação. Após intemalização do anticorpo, FcRn liga-se às regiões Fc do anticorpo nos endossomos, onde a interação é estável no ambiente levemente ácido (pH 6,0). Após reciclo para a membrana plasmática, onde o ambiente é neutro (pH 7,4), a interação é perdida e o anticorpo é liberado de volta na circulação. Isso influencia a meiavida plasmática de IgG.

[00508] Um ELISA de ligação a FcRn foi realizado para avaliar o efeito da introdução de uma combinação de uma mutação intensificando FcFc e mutações intensificando ligação a Clq K326A/E333A ou K326W/E333S na ligação de FcRn humano às variantes do anticorpo IgGl-7D8. IgGl-7D8I235A/H310A/H435A foi usado como um controle negativo (knockout de FcRn; Shields et al., J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591) para ligação a FcRn; IgGl-7D8-M252Y/S254T/T256E foi usado como controle para ligação intensificada a FcRn (DallAcqua et al., J Biol Chem. 2006 Ago 18; 281 (33):

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23514-24). Todas as incubações foram feitas em temperatura ambiente. Placas streptawell 96 (Roche, número de catálogo 1734776001) foram revestidas durante 1 hora com 5 pg/mL de (100 pg/cavidade) de domínio extracelular biotinilado produzido recombinantemente de FcRn humano (FcRnECDHis-B2M-BIO, isto é, o domínio extracelular de FcRn humano com um His C-terminal e marcador BAP como dímero com beta2microglobulina), diluído em PBST mais 0,2% de BSA. As placas foram lavadas três vezes com PBST. Amostras de anticorpos diluídas em série (faixa de concentrações finas de 0,003 10 pg/mL em diluições de 3 vezes em PBST/0,2% de BSA, pH 6,0) foram adicionadas e incubadas durante 1 hora. As placas foram lavadas com PBST/0,2% BSA, pH 6,0. IgG de cabra antihumana policlonal conjugada com peroxidase de raiz forte (HRP) (1: 10.000; Jackson ImmunoResearch, número de catálogo 109-035-097) diluída em PBST/BSA a 0,2%, pH 6,0 ou 7,4 e as placas foram incubadas por 1 hora. Após lavagem, 100 pL de ABTS (1 mg/mL) foram adicionados como substrato e as placas foram incubadas durante 30 minutos protegidas da luz. A reação foi parada usando 100 pL de ácido oxálico a 2% e a absorbância medida a 405 nm usando um leitor de microplaca de absorbância ELx808 (BioTek). Os dados transformados em logaritmos foram analisados por ajuste de curvas dose-resposta sigmoidais com inclinação variável usando software GraphPad Prism. O controle negativo (IgGl-7D8-I235A/H310A/H435A) mostrou perda completa da ligação de FcRn humano a pH 6,0 (Figura 21 A), enquanto que o controle positivo (IgGl-7D8-M252Y/S254T/T256E) apresentou ligação aumentada a FcRn humano em comparação com WT IgGl-7D8 a pH 6,0 e perda de ligação a pH 7,4 (Figura 21B). Todas as variantes de IgGl-7D8 testadas com uma mutação intensificando Fc-Fc com ou sem mutações intensificando a ligação a Clq mostraram uma ligação eficiente a FcRn humano a pH 6,0 e perda de ligação a pH 7,4. No entanto, em comparação com WT IgGl-7D8, a introdução da mutação intensificando

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Fc-Fc E430G sozinha resultou em uma leve diminuição da ligação a FcRn humano a pH 6,0, que foi um pouco mais diminuída quando combinada com as mutações intensificando ligação a Clq K326A/E333A ou K326W/E333S. Exemplo 23: Efeito de Clq em atividade ADCC por variantes de anticorpos anti-CD20 IgGl-7D8 contendo as substituições K326W/E333S/E430G.

[00509] O efeito de Clq sobre a atividade de ADCC de variantes de anticorpos anti-CD20 IgGl-7D8 contendo tanto a mutação intensificando FcFc E430G como as substituições intensificando a ligação a Clq K326W/E333S foi testado em um teste de liberação de cromo usando células WIL2-S SF em meio isento de soro. Células WIL2-S SF foram coletadas (5xl0⁶ células/mL), lavadas (duas vezes em PBS, 1,200 rpm, 5 min) e coletadas em 1 mL de meio isento de soro (meio HyQ ADCF-Mab suplementado com 10% piruvato de sódio). 200 pCi ⁵¹Cr (cromo-51; Amersham Biosciences Europe GmbH) foram adicionados e incubados em um banho de água agitada durante 1 hora a 37°C. Após lavar as células (duas vezes em PBS, 1,200 rpm, 5 min), as células foram recolocadas em suspensão em meio isento de soro. As células marcadas com cromo foram contadas por exclusão de azul tripano e diluídas em uma concentração de IxlO⁵células/mL. Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) foram isoladas de buffy coats frescas de doadores saudáveis (Sanquin) usando centrifugação padrão de densidade Ficoll de acordo com as instruções dos fabricantes (meio de separação de linfócitos; Lonza). Após recolocação em suspensão de PBMCs em meio isento de soro, os PBMCs foram contados por exclusão de azul tripano e concentrados a IxlO⁷ células/mL. Para a experiência ADCC, 50 pL de células marcadas com cromo WIL2-S SF foram pipetados em placas de 96 cavidades (5.000 células/cavidade). 25 pL de amostras de anticorpos da série de diluição (faixa de concentrações finais de 0,003 - 10 pg/mL em diluições de 3 vezes) e 25 pL Clq humana purificada (2,5 pg/mL de concentração final) ou meio foram adicionados e pre

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180/194 incubados durante 10 minutos a RT. Em seguida, 50 pL de PBMCs (500.000 células/cavidade) foram adicionados, resultando em uma razão de efetor para alvo de 100:1, e incubados durante 4 horas a 37°C. Lise máxima de células foi determinada por incubação de 50 pL de células rotuladas como cromo WIL2-S SF (5.000 células/cavidade) com 100 pL 5% Triton-X100 (SigmaAldrich). Lise espontânea foi determinada por incubação de células rotuladas como cromo WIL2-S SF (5.000 células/cavidade) em meio de 150 pL sem anticorpo e células efetoras. A lise celular independente de anticorpo foi determinada por incubação de células rotuladas com cromo WIL2-S SF (5.000 células/cavidade) com PBMCs (500.000 células/cavidade) em um volume total de 150 pL em ausência de anticorpo. A quantidade de lise celular foi determinada usando um contador de cintilação. S células foram centrifugadas (1,200 rpm; 3 min) e 25 pL de sobrenadante foram transferidos para Optiplates de fundo F branca, de 96 cavidades, cheias com 100 pL de solução microscint-40. O ⁵¹Cr liberado nos sobrenadantes foi contado usando um contador de cintilação. As contagens medidas por minuto (cpm) foram usadas para calcular a porcentagem de lise mediada por anticorpo de acordo com a seguinte fórmula: (cpm amostra - cpm lise independente de anticorpo)/(cpm lise máxima - cpm lise espontânea) x 100%. Como controles negativos, um anticorpo IgGl-bl2 não específico e uma variante IgGl-7D8 com as substituições L234A/L235A/P329G, que são conhecidas como eliminando a ligação de complemento e ativação, assim como ligação de FcyR e indução de ADCC (Lo et al. JBC 2017) foram testados. Como esperado, nenhuma atividade de ADCC foi observada para o anticorpo IgGlbl2 não específico, nem nenhuma presença ou ausência de Clq (Figura 22). Para o anticorpo IgGl-7D8-F405L-K326W/E333S/E430G, adição de 2,5 pg/mL de Clq humana purificada resultou em inibição da atividade de ADCC em células WIL2-S SF em meio isento de soro. Em contraste, Clq não afetou a atividade ADCC de WT IgGl-7D8 e IgGl-7D8-E430G.

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Exemplo 24: Efeito de K326W/E333S/E430G sobre a atividade agonista dos anticorpos anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR5-05.

[00510] O efeito de introduzir a combinação da mutação intensificando Fc-Fc E430G e das mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S sobre a atividade agonista de anticorpos anti-DR5 IgGl-hDR5-01-G56T e IgGl-hDR5-05 foi testado em um /este de viabilidade in vitro usando células WIL2-S SF. O teste de viabilidade de um dia foi realizado, essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 100 pL de células em meio isento de soro foram pipetados em placas de 96 cavidades (50.000 células/cavidade). 25 pL amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) e 25 pL Clq purificada (2,5 pg/mL de concentração final) foram adicionadas e incubadas a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiterGlo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor de placa EnVision Multilabel (PerkinElmer). Dados foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism.

[00511] Introdução de ambas as mutações intensificando Fc-Fc E430G e intensificando a ligação a Clq K326W/E333S resultou na indução de atividade agonista de DR5 para ambos os anticorpos testados IgGl-hDR5-01G56T e IgGl-hDR5-05, enquanto estes anticorpos não induziram a morte celular quando somente a mutação intensificando Fc-Fc E430G foi introduzida (Figura 23).

Exemplo 25: Compatibilidade de K326W/E333S/E430G com o par de mutação Fc complementar K439E; S440K em combinação de agonista e um anticorpo anti-DR5.

[00512] Compatibilidade das mutações K326W/E333S/E430G com outras mutações de engenharia F, tal como o par de mutações Fc complementares K439E: S440K que podem controlar as interações

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182/194 intermoleculares Fc-Fc entre diferentes anticorpos ligados a célula-superfíciealvo, foi testada usando a combinação de anticorpo anti-DR5 agonista IgGlhDR5-01-K326W/E333S/E430G + IgGl-hDR5-05-K326W/E333S/E430G em um teste de viabilidade in vitro em células WIL2-S SF. Um teste de viabilidade de um dia foi realizado, essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 100 pL de células em meio isento de soro foram pipetados em placas de 96 cavidades (50.000 células/cavidade). 25 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) e 25 pL de Clq purificada (2,5 pg/mL de concentração final) foram adicionados e incubados a 37°C durante 1 dia. Viabilidade da célula foi determinada usando o teste CellTiterGlo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor de placa EnVision Multilabel (PerkinElmer). Dados foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 24 mostra que o único anticorpo IgGl-hDR5-01-K326W/E333S/E430GK439E, contendo a mutação inibindo Fc-Fc K439E, dificilmente induziu qualquer mote celular. IgGl-hDR5-05-K326W/E333S/E430G-S440K, contendo a mutação de inibição de Fc-Fc S440K, induziu alguma morte celular, embora morte máxima não tenha sido de 100%. Em contraste, a combinação de ambas IgGl-hDR5-01-K326W/E333S/E430G-K439E + IgGlhDR5-05-K326W/E333S/E430G-S440K, combinando as duas mutações de controle de Fc-Fc complementares K439E e S440K mostrou eficiente morte celular, que foi similar cimo a combinação sem as mutações de controle de Fc-Fc complementares K439E e S440K. Morte celular por uma combinação de anticorpos contendo as mutações K326W/E333S/E430G (com e sem as mutações complementares K439E; S440K) foi muito mais eficiente do que a combinação de anticorpos contendo somente a mutação intensificando Fc-Fc E430G (IgGl-hDR5-01-K326W/E333S/E430G-K439E + IgGl-hDR5-05Petição 870190088279, de 06/09/2019, pág. 189/257

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K326W/E333S/E430G-S440K).

Exemplo 26: Efeito de combinação das substituições intensificando a ligação a Clq K326W/E333S com K248E/T437R em eficácia de CDC de um anticorpo anti-CD52 [00513] O efeito de combinar as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S com as substituições K248E/T437R que facilitam a multimerização de anticorpos sobre a superfície celular (Zhang et al., 2017 MAbs (9)7:1129-42) em eficácia de CDC foi testado usando as variante antiCD52 IgGl-Campath (à base de alemtuzumab) em células de linfoma positivas para CD52 células B Wien 133. Células Wien 133 (gentilmente fornecidas pelo Dr. Geoff Hale, BioAnaLab Limited, Oxford, UK) foram coletadas e recolocadas em suspensão em meio [RPMI (Lonza, número de catálogo BE12-115F) com 0,2% albumina de soro bovino (BSA; Roche número de catálogo 10735086001)]. 40 pL de células foram pipetados em placas de fundo redondo de 96 cavidades (Ο,ΙχΙΟ⁶ células/cavidade). 40 pL de amostras de anticorpos diluídas em série (faixa de concentrações finais de 0,002 - 40 pg/mL em diluições de 4 vezes) foram adicionadas e incubadas durante 15 minutos a RT enquanto agitando. Em seguida, 20 pL de NHS (20% de concentração final) foram adicionados como uma fonte de complemento humano e incubadas durante 45 minutos a 37°C. A reação foi parada por colocação das amostras em gelo. As células resfriadas foram granuladas e recolocadas em suspensão em 30 pL 2 pg/mL de iodeto de propídio (PI; Sigma Aldrich). As amostras foram analisadas por citometria de fluxo em um Intellicyt iQue Screener PLUS e a lise percentual foi determinada de acordo com a seguinte fórmula: % lise = (número de células positivas para PI/número total de células) x 100%. Figura 25 mostra que introdução da mutação única intensificando hexamerização E430G ou a mutação dupla intensificando multimerização K248E/T437R em WT IgGlCampath resultou em aumentada eficácia de CDC em células Wien 133. A

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184/194 eficácia de CDC foi adicionalmente intensificada por combinação das mutações K248E/T437R que facilitam a multimerização sobre a superfície celular e as mutações K326W/E333S que intensificam a ligação a Clq em IgGl-Campath-K248E/K326W/E333S/T437R.

Exemplo 27: Efeito de combinação de E430G e K326W/E333S sobre a eficácia de anticorpos anti-DR4 agonísticos na presença de Clq.

[00514] Um teste de viabilidade foi realizado para estudar o efeito da combinação da mutações intensificando hexamerização E430G e K326W/E333S na atividade agonística de anticorpo anti-DR4 chCTB007 em células BxPC-3 DR4-positivas. A viabilidade foi realizada, essencialmente como descrito em Exemplo 2. Brevemente, 100 pL de suspensões celulares únicas de BxPC-3 foram cultivados em meio de cultura (RPMI contendo 10% DBSI inativado com calor) em placas de poliestireno com fundo plano de 96 cavidades (5.000 células por cavidade) e deixadas aderir durante a noite a 37°C. 25 pL de amostras de Clq purificadas (2,5 pg/mL de concentração final) e 25 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,00001 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) foram adicionados e incubados a 37°C durante 3 dias. A viabilidade das células cultivadas foi determinada em um teste de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor de placa EnVision Multilabel (PerkinElmer) e os dados foram analisadas e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 26 mostra que a combinação da mutação intensificando hexamerização E430G e as duas mutações K326W/E333S resultou na indução de uma forte eficácia de morta para o anticorpo anti-DR4 IgGl-DR4-chCTB007 similar como o mutante triplo E345R/E430G/S440Y quando testado como um único agente em um teste de viabilidade in vitro em células de câncer pancreático BxPC-3 humanas

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185 / 194 aderentes na presença de soro bovino fetal termoinativado suplementado com 2,5 pg/mL de Clq purificada. Em contraste, estes anticorpos não mostraram eficácia de morte sobre estas células BxPC-3 não aderidas quando testados como anticorpo tipo selvagem IgGl-DR4-chCTB007 ou quando somente mutação E430G estava presente. Estes dados mostram que as mutações K326W/E333S/E430G induziram atividade agonística forte para anticorpos anti-DR4 em células BxPC-3 aderentes suplementadas com Clq.

Exemplo 28: Introdução de mutação intensificando hexamerização E430G combinado com mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S melhora a eficácia de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e indução de morte celular por anticorpos FAS.

[00515] O receptor FAS é um receptor de morte sobre a superfície de células que leva a morte celular programada (apoptose) por reticulação do receptor por ligando Fas (Wajant et al., 2002 Science 296 (5573): 1635-6). FAS, também conhecido como membro da superfamília 6 de receptor de antígeno 1 de apoptose (APO-1 ou APT), agrupamento de diferenciação 95 (CD95) ou fator de necrose de tumor (TNFRSF6). CDC por anticorpos antiFAS contendo a mutação tripla K326W/E333S/E430G, foi analisado em teste de CDC in vitro em linfócitos B WIL2-S FAS-positivos. A introdução da mutação intensificando hexamerização E430G em combinação com mutações intensificando a ligação a Clq K326W E333S em diferentes anticorpos FAS IgGl-FAS-E09, IgGl-CD95-AP01 e IgGl-CD95-HFE7A foi estudada em um teste CDC usando células WIL2-S SF essencialmente como descrito em Exemplo 26. Brevemente, 30 pL de células WIL2-S SF em meio RPMI-1640 (3,33 χ 10⁶ células/mL) foram pre-incubados em placas de fundo redondo de 96 cavidades (0,1 χ 10⁶ células/cavidade) com 50 pL de séries de concentrações de anticorpos (0,003-10,0 pg/mL concentrações finais em diluições de 3 vezes) durante 15 min em um agitador em RT. Em seguida, 20 pL soro normal humano foram adicionados como uma fonte de complemento

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186/194 (20% de concentração final) e incubados em um incubador a 37°C durante 45 min. A reação foi parada colocando as placas em gelo. A lise celular foi determinada por coloração com iodeto de propídeo. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo usando um iQue Screener. Dados transformados em logaritmos com eixos de concentração foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Todos os três anticorpos anti-FAS de tipo selvagem IgGl-FAS-E09 (Figura 27A), IgGlCD95-APO1 (Figura 27B) e IgGl-CD95-HFE7A (Figura 27C) não induziram CDC similar ao anticorpo de controle negativo IgGl-bl2. IgGl-FAS-E09 com mutação intensificando Fc-Fc (E430G) ou mutações intensificando a ligação a Clq (K326W/E333S) induzem CDC. A combinação de E430G com K326W/E333S em IgGl-FAS-E09 resultou em CDC máximo similar, como IgGl-FAS-E09-E345R/E430G/S440Y. Padrão similar foi visto com IgGlCD95-APO1 em que IgGl-CD95-APOl-E430G induz CDC e IgGl-FASE09-K326W/E333S/E430G pode potenciar adicionalmente CDC. Para anticorpo IgGl-CD95-HFE7A, a adição de mutação E430G não teve efeito sobre CDC, no entanto IgGl-CD95-HFE7A com as mutações triplas K326W/E333S/E430G completamente resgatou recuperou CDC para lise máxima.

[00516] Para confirmar que a morte celular observada no teste CDC descrito acima foi devido a lise mediada por complemento, um teste de viabilidade foi realizado usando WIL2-S SF em meio isento de soro ao qual Clq purificada (Quidel) foi adicionada como reticulador. O teste de viabilidade foi realizado essencialmente como descrito em Exemplo 8. Brevemente, 100 pL de células WIL2-S SF foram pipetados em meio isento de soro em placas de 96 cavidades (50.000 células/cavidade). Em seguida, 50 pL de amostras de anticorpos de uma série de diluição de concentração (faixa de concentrações finais de 0,0003 - 20 pg/mL em diluições de 5 vezes) e 10

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187/194 pL Clq purificada (2,5 pg/mL de concentração final) foram adicionados às células e incubados a 37°C durante 45 minutos ou 24 horas. A viabilidade das células cultivadas foi determinada usando o teste CellTiterGlo como descrito em Exemplo 2. Luminescência foi medida em um leitor EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). Dados transformados em logaritmos com eixos de concentração foram analisados e traçados em gráfico usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando software GraphPad Prism. Figura 28 mostra os RLU (dados brutos) das células após 45 min de incubação com os anticorpos na presença de 2,5 pg/mL Clq. Nenhum dos anticorpos afetou a viabilidade das células após este curto período de incubação.

[00517] Figura 29A mostra que no teste de viabilidade de 24 horas, introdução das mutações únicas intensificando a hexamerização E430G, assim como as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S permitiram que o anticorpo FAS IgGl-FAS-E09 induzisse uma morte dependente da dose de células WIL2-S SF na presença de Clq, enquanto o anticorpo tipo selvagem foi incapaz de induzir a morte nas concentrações testadas de anticorpos. Quando a mutação intensificando Fc-Fc E430G foi combinada com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S em IgGl-FAS-E09, o anticorpo se torna tão potente como com E345R/E430G/S440Y no teste de viabilidade de 24 horas na presença de Clq. Figura 29B mostra que também com o anticorpo IgGl-CD95-AP01, introdução de E430G ou K326W/E333S/E430G resultou em morte dependente da dose de WIL2-S SF na presença de Clq, com o mutante triplo K326W/E333S/E430G sendo o mais potente. Figura 29C mostra para IgGlCD95-HFA7E que a combinação de intensificação da ligação a Clq e intensificação de Fc-Fc foram requeridas (K326W/E333S/E430G) para induzir a inibição da proliferação na presença de Clq.

[00518] Como uma experiência de controle, outro teste de viabilidade

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188/194 de 24 horas foi realizado usando células WIL2-S SF sem Clq. Figura 30A mostra que a introdução das mutações intensificando a hexamerização E345R/E430G/S440Y permitiram que o anticorpo FAS IgGl-FAS-E09 induzisse a morte dependente de dose de células WIL2-S SF independentes de Clq, enquanto que o anticorpo de tipo selvagem e as variantes de anticorpos com somente a mutação intensificando Fc-Fc E430G ou as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S foram incapazes de induzir a morte nas concentrações testadas de anticorpos em ausência de Clq. No entanto, introdução de ambas as mutações intensificando Fc-Fc e intensificando a ligação a Clq (IgGl-FAS-E09-K326W/E333S/E430G) resultaram em uma perda de até 25% de viabilidade celular em ausência de Clq. Em ausência de Clq, introdução de K326W/E333S/E430G tem um efeito similar para IgGl-CD95-AP01 (Figura 30B), mas sem efeito sobre IgGl-CD95-HFA7E (Figura 30C).

[00519] Em conclusão, a combinação da mutação intensificando Fc-Fc E430G com mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S em anticorpos anti-FAS poderia induzir CDC de células WIL2-S SF após 45 minutos. Este processo foi completamente dependente de soro porque Clq sozinho não induziu a morte das células após 45 minutos. No entanto, após 24 horas, incubação de anticorpos anti-FAS com mutação K326W/E333S/E430G na presença de Clq de fato induziu a morte e superou a potência de morte dos mutantes E430G e K326W/E333S.

Exemplo 29: O efeito de combinar a mutação intensificando Fc-Fc E430G com as mutações K326W/E333S sobre a ativação de 0X40 em células Jurkat por anticorpos anti-OX40.

[00520] A reticulação de receptor de ligando 0X40 (CD 134) por ligando 0X40 (OX40L) pode induzir a proliferação de células T expressando 0X40 (Gramaglia et al., 1998 J. Immunol. 161, 6510-6517). O efeito de mutações K326W/E333S em sinalização de 0X40 foi testado usando

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189/194 diferentes variantes do anticorpo anti-OX40 IgGl-SF2 usando o kit de bioteste 0X40 (Promega, número de catálogo CS 197704), essencialmente de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Células Jurkat tipo Thaw-and-Use GloResponse NFkB-1uc2/OX40 (Promega, número de catálogo CS 197704), que expressam estavelmente 0X40 humano e um gene repórter luciferase a jusante de um elemento de resposta a NFAT, expressam luciferase quando de ativação 0X40. 25 pL de células recentemente descongeladas foram incubados durante a noite in Optiplates de fundo F brancas de 96 cavidades (Perkin Elmer, número de catálogo 6005299) em 25 pL de meio RPMI 1640 (Promega, número de catálogo G708A) na presença de 8% de soro bovino fetal (FBS, Promega Ref. J121A). No dia seguinte, uma diluição em série de anticorpos (concentrações finais de 19,5 - 5.000 ng/mL em diluições de 4 vezes) foi adicionada às células em meio para um volume final de 80 pL. Células foram incubadas durante mais 5 horas antes da adição do reagente Bio-Glo (Promega, número de catálogo CS 197704). Após 5-10 min de incubação em temperatura ambiente, luminescência foi registrada usando um leitor de placa Envision MultiLabel. Figura 31 mostra que anticorpo anti-OX40de tipo selvagem IgGl-CD134-SF2 não induziu uma resposta de 0X40. Introdução de uma mutação intensificando Fc-Fc resultou com E345R em uma indução forte, e com E430G em uma indução suave em resposta de 0X40. Combinação da mutação intensificando Fc-Fc E430G com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S resultou em uma forte atividade agonista de IgGl-SF2.

Exemplo 30: O efeito de mutações K326W/E333S/E430G sobre a ativação de CD40 em células U20S por anticorpos anti-CD40 na presença de soro de bezerro fetal.

[00521] A reticulação de receptores de CD40 encontrados em células apresentando antígeno, por ligando CD40 em células TH pode induzir uma variedade de efeitos a jusante (Chatzigeorgiou et al., 2009 BioFators (Oxford,

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Inglaterra) 35 (6): 474-83). O efeito de mutações K326W/E333S/E430G em sinalização de CD40 foi testado usando diferentes variantes dos anticorpos anti-CD40, SGN40 e CP870893 usando o kit de bioteste CD40 (Promega, número de catálogo CS1979A06) essencialmente de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Células Thaw-and-Use GloResponse NFkBluc2P/U20S que expressam estavelmente CD40 humano e um gene repórter luciferase a jusante de um elemento de resposta a NFAT, expressam luciferase quando da ativação de CD40. 25 pL de células recentemente descongeladas foram incubados durante a noite em Optiplates de fundo F brancas de 96 cavidades (Perkin Elmer, número de catálogo 6005299) em 25 pL de meio RPMI 1640 (Promega, número de catálogo G708A) na presença de 8% soro bovino fetal (J1211). No dia seguinte, uma diluição em série de anticorpos ou ligando CD40 recombinante purificado (R&D systems, número de catálogo 6420-CL-025/CF) foram adicionados às células em meio a um volume final de 80 pL. Células foram incubadas durante mais 5 horas antes da adição do reagente Bio-Glo (Promega, número de catálogo CS 197704). Após 5-10 min de incubação em temperatura ambiente, luminescência foi registrada usando um leitor de placa Envision MultiLabel. Soro bovino fetal (FBS, Promega Ref. J121A) foi usado como a fonte de soro. Anticorpos foram testados em uma diluição em série na faixa de 0,1 a 25.000 ng/mL. Ligando CD40 recombinante (diluição em série na faixa de 0,04 a 10,000 ng/mL), que foi usado como um controle positivo no teste de resposta a CD40, induziu sinais de resposta claros relativos ao anticorpo de controle d negativo de não ligação IgGl-bl2 (Figura 32). Anticorpo tipo selvagem antiCD40 IgGl-SGN40 induziu níveis de resposta a CD40 essencialmente similares ao anticorpo de controle negativo IgGl-b 12. Em contraste, variante IgGl-CD40-SGN40 que continha somente a mutação E430G, que induz interações Fc-Fc entre anticorpos após ligação na superfície celular, induziu a resposta a CD40 (EC50 336.4 ± 15.3 SD ng/mL). Variante IgGl-CD40

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SGN40 com a mutação intensificando Fc-Fc E430G combinada com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S adicionalmente intensificou a potência de IgGl-SGN40 (EC50 18,0 ± 1,1 SD ng/mL). Anticorpo tipo selvagem IgGl-CD40-CP870893 já é capaz de induzir uma resposta d eCD40 (EC50 187.4 ± 9,2 SD ng/mL), que pode ser adicionalmente potenciada por K326W/E333S/E430G (EC50 45,9 ± 3,3 SD ng/mL) a um nível similar como ligando CD40.

[00522] Em conclusão, mutações K326W/E333S/E430G potenciaram a ativação de CD40 em células U20S por anticorpos anti-CD40 na presença de soro de bezerro fetal.

Tabela 7: EC50 e SD de ligando CD40 e IgGl- CD40 anticorpos e variantes

	EC50 médio (ng/mL)	SD (ng/mL)
ligando CD40	112,5	48,0
IgGl-CD40-SGN40	3356,0	0,0
IgG 1-CD40-SGN40-E430G	336.4	15.3
IgG 1-CD40-SGN40-WSG	18,0	1.1
IgGl-CD40-CP870893	187.4	9.2
IgGl-CD40-CP870893-WSG	45.9	3.3

Exemplo 31:0 efeito de mutações K326W/E333S/E430G sobre a ativação de 4-IBB (CD 137) em células Jurkat por anticorpos anti-4-IBB na presença de soro de bezerro fetal.

[00523] Membro 9 da superfamília de receptor 4-1 BB ou CD 137 ou fator de necrose de tumor (TNFRSF9), é um membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFR) e induzido por ativação de linfócitos (ILA) (Schwarz et al., 1993, Gene. 134 (2): 295-8). Reticulação de 4-1BB intensifica a proliferação de células T, secreção de IL-2, sobrevivência e atividade citolítica (Sica et al., 2000 Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 47 (5): 275-9). O efeito de mutações K326W/E333S/E430G em sinalização de 4-IBB foi testado usando diferentes variantes dos anticorpos anti-4-ΙΒΒ, MOR7480 e BMS-663513 usando o kit de bioteste 4-1BB (Promega, número de catálogo CS 196005) essencialmente de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Células Jurkat Thaw-and-Use GloResponseTM NFkB-1uc2/4-1BB que expressam estavelmente 4-1BB humano e um gene

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192/194 repórter luciferase a jusante de um elemento de resposta a NF AT expressam luciferase quando da ativação de CD40. 25 pL de células recentemente descongeladas foram incubados durante a noite Optiplates de fundo F branca, de 96 cavidades (Perkin Elmer, número de catálogo 6005299) em 25 pL de meio RPMI 1640 (Promega, número de catálogo G708A) na presença de 1% soro bovino fetal (J121A). No seguinte dia, uma diluição em série de anticorpos ou ligando 4-1 BB recombinante purificado com marcador His (R&D systems, 2295-4L-025/CF) anticorpo anti-His-marcador (Clone J099B12) foram adicionados às células em meio a um volume final de 80 pL. Células foram incubadas durante mais 5 horas antes da adição do reagente Bio-Glo (Promega, número de catálogo CS 197704). Após 5-10 min de incubação em temperatura ambiente, luminescência foi registrada usando um leitor de placa Envision MultiLabel. Soro bovino fetal (FBS, Promega Ref. J121A) foi usado como uma fonte de soro. Ligando 4-1BB recombinante e mistura anti-His Ab, que foi usada como um controle positivo no teste de resposta a 4-1BB, induziram sinais de resposta claros relativos ao anticorpo de controle de não ligação e negativo IgGl-bl2-WSG (Figura 33). Os anticorpos testados contendo a mutação intensificando Fc-Fc E430G combinado com mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S induziram ativação dependente de dose de sinalização a 4-1 BB em células Jurkat na presença de soro de bezerro fetal (EC50 16,9 ng/mL para IgGlCD137-MOR7480-K326W/E333S/E430G e EC50 32.9 ng/mL para IgGlBMS-663513-K326W/E333S/E430G).

Exemplo 32: O efeito de mutações K326W/E333S/E430G sobre a ativação de GITR em células Jurkat por anticorpos anti-GITR na presença de soro de bezerro fetal.

[00524] Membro da superfamília de receptor de 18 GITR (proteína relacionada com TNFR induzida por glucocorticóide) ou fator de necrose de tumor (TNFRSF18), é um membro da superfamília de TNFR. GITR é ativada

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193 / 194 por ligando GITR (GITRL), que é principalmente expressado em APC. O engate de GITR em células T com anticorpos agonistas, GITRL recombinante ou transfectantes de GITRL, após estimulação subótima de TCR, intensifica a ativação de células T por regulação positiva de CD25, induzindo a expressão de IL-2 e IFNy e aumentando a proliferação (revisto por Knee et al. em Eur J Cancer. 2016 Nov; 67:1-10).

[00525] O efeito de mutações K326W/E333S/E430G em sinalização GITR foi testado usando diferentes variantes do anticorpo anti-GITR, INCAGN01876 usando o kit de bioteste GITR (Promega, número de catálogo CS 184006) essencialmente de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Células Jurkat Thaw-and-Use GloResponse NFkB-1uc2P/GITR que expressam estavelmente GITR humana e um gene repórter luciferase a jusante de um elemento de resposta a NFAT, expressam luciferase quando da ativação de GITR. 25 pL de células recentemente descongeladas foram incubados durante a noite em Optiplates de fundo F branca, de 96 cavidades (Perkin Elmer, número de catálogo 6005299) em 25 pL de meio RPMI 1640 (Promega, número de catálogo G708A) na presença de 8% soro bovino fetal (J1211). No dia seguinte, uma diluição em série de anticorpos foram adicionadas às células em meio a um volume final de 80 pL. Células foram incubadas durante a adicionalmente 5 horas antes da adição do reagente BioGlo (Promega, número de catálogo CS 197704). Após 5-10 min de incubação em temperatura ambiente, luminescência foi registrada usando um leitor de placa Envision MultiLabel. Soro bovino fetal (FBS, Promega Ref. J121A) foi usado como fonte de soro. O anticorpo de controle negativo de não ligação IgGl-bl2 define o sinal de fundo. Anticorpo de tipo selvagem anti-GITR IgGl-GITR-INCAGN01876 induziu níveis de resposta de GITR logo acima do anticorpo de controle negativo IgGl-bl2 (Figura 34). Em contraste, variante IgGl-GITR-INCAGN01876 que continha somente a mutação intensificando Fc-Fc E430G induziu uma resposta de GITR mais forte. IgGl

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GITR-INCAGN01876 com a mutação intensificando Fc-Fc E430G combinado com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S intensificou adicionalmente a potência de IgGl-GITR-INCAGN01876.

[00526] Em conclusão, as mutações K326W/E333S/E430G potenciam a ativação de GITR em células Jurkat por anticorpo anti-GITR na presença de soro de bezerro fetal.

Exemplo 33: O efeito de mutações K326W/E333S/E430G sobre a ativação de GITR em células Jurkat por anticorpos anti-GITR em diferentes subclasses IgG na presença de soro de bezerro fetal.

[00527] O efeito de mutações K326W/E333S/E430G em sinalização GITR foi testado usando variantes de subclasses IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 de anticorpo anti-GITR 36E5 usando o kit de bioteste GITR como descrito em Exemplo 32 na presença de soro bovino fetal. Os anticorpos foram testados a uma concentração final de 111 ng/mL. O anticorpo tipo selvagem de IgGl anti-GITR IgGl-GITR-36E5 induziu uma baixa resposta agonista de GITR em comparação com o controle de não ligação IgGl-bl2 (Figura 35). Introdução da mutação intensificando Fc-Fc E430G resultou em um aumento modesto da resposta agonista de GITR. A variante IgGl-GITR-36E5 com a mutação intensificando Fc-Fc E430G combinada com as mutações intensificando a ligação a Clq K326W/E333S adicionalmente intensificou a potência do anticorpo para uma resposta máxima. Introdução de K326W/E333S/E430G em subclasses de IgG2 IgG2-GITR-36E5 resultou em uma resposta agonista modesta de GITR. Em IgG3-GITR-36E5 e IgG4GITR-36E5, introdução das mutações K326W/E333S/E430G resultou em baixas respostas agonistas de GITR, similar aos níveis de anticorpo WT IgGl.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptideo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fe de uma imunoglobulina e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende,

a. uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 ou uma substituição de S440Y ou S440W, e

b. uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326,1332, E333 e P396, em que as posições correspondem a IgGl humana, em conformidade com a numeração EU.
2. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.
3. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo compreende:

i) uma substituição em duas ou três posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396, ou ii) substituições nas três posições S267, H268 e S324.
4. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser com a condição de que a substituição em posição G236 não é G236F, G236R, G236Y.
5. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser com a condição de que a substituição em posição S267 não é S267H, S267I, S267K, S267G.
6. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

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2/15 caracterizado pelo fato de ser com a condição de que a substituição em posição H268 não é H268K, H268D, H268E.
7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W.
8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F, E430T.
9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R, E345Y.
10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição E430G.
11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, 7 ou 9, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição E345K.
12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição S440Y.
13. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 8 ou 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F, E430T e o polipeptídeo compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.
14. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das

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3/15 reivindicações 1 a 7, 9 ou 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R, E345Y e o polipeptídeo compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.
15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em: S440Y ou S440W e o polipeptídeo compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.
16. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396.
17. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações Ia3oul3al6, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição em uma ou mais posição(ções), como duas ou três posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396.
18. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende substituições nas posições K326 e E333.
19. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende substituições nas posições K326, E333 e P396.
20. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações Ia3oul3al9, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo

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4/15 consistindo em: K326W, K326A, E333S, E333T, E333A e P396L.
21. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende as substituições K326W e E333S.
22. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende as substituições K326W e E333T.
23. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende as substituições K326A e E333A.
24. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende as substituições K326A, E333A e P396L.
25. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende as substituições K326W, E333S e P396L.
26. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 13 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende as substituições K326W, E333T e P396L.
27. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 5, 6 ou 13 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324.
28. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 5, 6, 13 a 15 ou 27, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais, como duas ou três substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: S267E, H268F e S324T.
29. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 5, 6, 13 a 1, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que

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5/15 compreende as substituições de: S267E, H268F e S324T.
30. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fe de uma imunoglobulina humana e uma região de ligação a antígeno, em que a região Fe compreende,

a. uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 ou uma substituição S440Y ou S440W e,

b. uma substituição selecionada a partir de um dos seguintes grupos consistindo em:

i. K326W, ii. K326A, iii. E333S, iv. E333T,

v. E333A, vi. P396L, vii. K326W, E333S viii. K326W, E333T ix. K326W, E333S, P396L,

x. K326A, E333A, xi. K326A, K333A, P396L, xii. K326A, K333T, P396L xiii. S267E, H268F, xiv. S267E, S324T, xv. H268F, S324T, xvi. S267E, H268F, S324T, xvii. G236A, S267E, H268F, S324T, xviii. S324,1332.
31. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais

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6/15 substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em: G236A, S239D e I332E.
32. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos duas substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em:

a. G236A, I332E,

b. S239D, I332E.
33. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais substituições adicionais na região Fc.
34. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição adicional na região Fc correspondente à posição K439 ou S440, com a condição de que a mutação em S440 não é S440Y ou S440W.
35. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a substituição adicional é selecionada dentre K439E ou S440K.
36. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição adicional na região Fc correspondente à posição F405 ou K409.
37. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que a substituição adicional é selecionada dentre F405L ou K409R.
38. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo, anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico.
39. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo biespecífico

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7/15 compreendendo uma região Fc compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma primeira região de ligação a antígeno, uma segunda cadeia pesada e uma segunda região de ligação a antígeno, em que

a. a dita primeira cadeia pesada compreende uma substituição adicional em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em K409, F405, T366, L368, K370, D399, Y407

b. a dita segunda cadeia pesada de Fc compreende uma substituição adicional em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em K409, F405, T366, L368, K370, D399, Y407

c. em que a substituição adicional na dita primeira cadeia pesada e na dita segunda cadeia pesada não está na mesma posição.
40. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que uma primeira cadeia pesada compreende uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo dentre: K409 e F405, e uma segunda cadeia pesada compreende uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo dentre: K409 e F405, em que a substituição na dita primeira cadeia pesada e na dita segunda cadeia pesada não está na mesma posição.
41. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizado pelo fato de que uma primeira cadeia pesada compreende uma substituição K409R ou F405L, uma segunda cadeia pesada compreende uma substituição K409R ou F405L, em que a substituição na dita primeira região Fc e dita segunda região Fc não são iguais.
42. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região Fc é um isotipo de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, IgA humana ou um isotipo misto.
43. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região Fc é um

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8/15 isotipo de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou um isotipo misto.
44. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região Fe é um isotipo de IgGl humana.
45. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é um anticorpo humano, anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico.
46. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região de ligação a antígeno se liga a um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR-SF) ou superfamília do Receptor Acoplado à proteína G (GPCR).
47. Polipeptideo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região de ligação a antígeno se liga a um membro do TNFR-SF selecionado a partir do grupo consistindo em: FAS, DR4, DR5, TNFR1, DR6, DR3, EDAR, NGFR, 0X40, CD40, CD30, CD27, 4-1BB, RANK, TACI, BLySR, BCMA, RELT e GITR.
48. Método para aumentar a atividade agonística de um polipeptideo compreendendo uma região Fe de uma IgG humana e uma região de ligação a antígeno, o método caracterizado pelo fato de que compreende

a. introduzir uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 ou uma substituição S440Y ou S440W, e

b. introduzir uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, em que a posição corresponde à IgGl humana, de acordo com a numeração EU.
49. Método para aumentar a atividade de CDC de um

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9/15 polipeptídeo compreendendo uma região Fc de uma IgG humana e uma região de ligação a antígeno, o método caracterizado pelo fato de que compreende

a. introduzir uma substituição em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430, E345 ou uma substituição S440Y ou S440W, e

b. introduzir uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: G236, S239, S267, H268, S324 K326, 1332, E333 e P396, em que a(s) posição(ões) corresponde(m) a IgGl humana, em conformidade com a numeração EU.
50. Método de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de ser com a condição de que a substituição em posição G236 não é G236F, G236R, G236Y.
51. Método de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de ser com a condição de que a substituição em posição S267 não é S267H, S267I, S267K, S267G.
52. Método de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de ser com a condição de que a substituição em posição H268 não é H268K, H268D, H268E.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a introdução de uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W e S440Y.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 53, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a introdução de uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F, E430T.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

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48 a 53, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a introdução de uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R, E345Y.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende uma substituição E430G.
57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 53 ou 55, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição E345K.
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende uma substituição S440Y.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54 ou 56, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E430G, E430S, E430F, E430T e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo de: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 53, 55 ou 57, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: E345K, E345Q, E345R, E345Y e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo dentre: G236, S239, S267, H268, S324, K326,1332, E333 e P396.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52 ou 58, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição selecionada a partir do grupo consistindo em: S440Y, S440W e uma substituição em uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo dentre: G236, S239, S267, H268, S324,

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K326,1332, E333 e P396.
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 61, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição de uma ou mais posição(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396.
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 62, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição em duas ou três posições(ões) selecionada(s) a partir do grupo consistindo em: K326, E333 e P396.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 63, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição em posições K326 e E333.
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 64, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição em posições K326, E333 e P396.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 65, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma ou mais, como duas ou três substituições são selecionadas a partir do grupo consistindo em: K326A, K326W, E333S, E333T, E333A e P396L.
67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 66, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir as substituições K326W e E333S.
68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 66, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir as substituições K326W e E333T.
69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 66, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir as substituições K326A e E333A.
70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

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48 a 66, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir as substituições K326A, E333A e P396L.
71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 66, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir as substituições K326W, E333S e P396L ou K326W, E333T e P39L.
72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 61, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma ou mais substituições em uma posição selecionada a partir do grupo consistindo em: S267, H268 e S324.
73. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 61 ou 72, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo consistindo em S267E, H268F e S324T.
74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48a61 ou72a73, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir as substituições S267E, H268F e S324T.
75. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 74, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma ou mais substituições adicionais na região Fc.
76. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 75, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição adicional na região Fc que é K439E ou S440K.
77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 76, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma substituição adicional na região Fc correspondente à posição F405 ou K409.
78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 77, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende introduzir uma outra substituição na região Fc que é F405L ou K409R.

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79. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 78.
80. Composição de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais anticorpos, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 45.
81. Composição de acordo com a reivindicação 79 ou 80, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.
82. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 81, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se ligam a diferentes epítopos.
83. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 82, caracterizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo se ligam a diferentes antígenos.
84. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 83, caracterizada pelo fato de que um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo estão presentes na composição em razão molar de cerca de 1:50 a 50:1, razão molar de cerca de 1:1, razão molar de cerca de 1:2, razão molar de cerca de 1:3, razão molar de cerca de 1:4, razão molar de cerca de 1:5, razão molar de cerca de 1:6, razão molar de cerca de 1:7, razão molar de cerca de 1:8, razão molar de cerca de 1:9, razão molar de cerca de 1:10, razão molar de cerca de 1:15, razão molar de cerca de 1:20, razão molar de cerca de 1:25, razão molar de cerca de 1:30, razão molar de cerca de 1:35, razão molar de cerca de 1:40, razão molar de cerca de 1:45, razão molar de cerca de 1:50, razão molar de cerca de 50:1, razão molar de cerca de 45:1, razão molar de cerca de 40:1, razão molar de cerca de 35:1, razão molar de cerca de 30:1, razão molar de cerca de 25:1, razão molar de

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14/15 cerca de 20:1, razão molar de cerca de 15:1, razão molar de cerca de 10:1, razão molar de cerca de 9:1, razão molar de cerca de 8:1, razão molar de cerca de 7:1, razão molar de cerca de 6:1, razão molar de cerca de 5:1, razão molar de cerca de 4:1, razão molar de cerca de 3:1, razão molar de cerca de 2:1.
85. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 84, caracterizada pelo fato de que um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo e/ou qualquer polipeptídeo adicional estão presentes na composição em uma razão equimolar.
86. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 85, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica.
87. Polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 79 a 86, caracterizados pelo fato de serem para uso como um medicamento.
88. Polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 79 a 86, caracterizados pelo fato de serem para uso no tratamento de câncer, doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou doenças infecciosas.
89. Método de tratamento de um indivíduo tendo uma doença, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou composição como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores.
90. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 78, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada a partir do grupo de: câncer, doença autoimune, doença inflamatória e doença infecciosa.
91. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

48 a 78, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a

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15/15 administração de um agente terapêutico adicional.
92. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo ou composição como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito polipeptídeo ou composição está em um ou mais recipientes, tais como frascos pequenos.
93. Kit de partes de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou composição como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores, é para uso simultâneo, separado ou sequencial em terapia.
94. Uso de um polipeptídeo ou uma composição como definidos em qualquer das reivindicações anteriores 1 a 47 ou 79 a 86, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença.
95. Uso de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer, doença autoimune, doença inflamatória ou doença infecciosa.