TR201807040T4 - Ox40 a bağlanan antikorlar ve bunların kullanımları. - Google Patents

Ox40 a bağlanan antikorlar ve bunların kullanımları. Download PDF

Info

Publication number
TR201807040T4
TR201807040T4 TR2018/07040T TR201807040T TR201807040T4 TR 201807040 T4 TR201807040 T4 TR 201807040T4 TR 2018/07040 T TR2018/07040 T TR 2018/07040T TR 201807040 T TR201807040 T TR 201807040T TR 201807040 T4 TR201807040 T4 TR 201807040T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
amino acid
fragment
human
seq
Prior art date
Application number
TR2018/07040T
Other languages
English (en)
Inventor
Attinger Antoine
Blein Stanislas
Albert Back Jonathan
Lissilaa Rami
Hou Samuel
Original Assignee
Glenmark Pharmaceuticals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46601863&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201807040(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glenmark Pharmaceuticals Sa filed Critical Glenmark Pharmaceuticals Sa
Publication of TR201807040T4 publication Critical patent/TR201807040T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/14—Ectoparasiticides, e.g. scabicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, insan OX40'a bağlanan antagonist antikorları veya bunların fragmanları ile ilgilidir. Daha belirgin olarak mevcut buluş, SEKANS TANIM NO: 1'in amino asit sekansını içeren bir ağır zincir CDR1'i ve/veya SEKANS TANIM NO: 2'nin amino asit sekansını içeren bir ağır zincir CDR2'yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansını içeren ağır zincir CDR3'ü ve SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansını içeren bir hafif zincir CDR3'ü ve SEKANS TANIM NO: 4'ün amino asit sekansını içeren bir hafif zincir CDR1'i ve/veya SEKANS TANIM NO: 6'nın amino asit sekansını içeren bir hafif zincir CDR3'ü içeren insan OX40'a bağlanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanı ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME OX40'A BAGLANAN ANTIKORLAR VE BUNLARIN KULLANIMLARI Ilgili Basvuru geçici patent basvurusundan rüçhan hakki talep etmektedir.
Bulusun Alani Mevcut bulus, insan OX40'a baglanan antagonist antikorlari veya bunlarin fragmanlari ile ilgilidir. Daha belirgin olarak mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 1'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR1'i ve/veya SEKANS TANIM NO: 2'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR2'yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDRS'ü ve/veya SEKANS TANIM NO: 4`ün amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR1”i ve/veya SEKANS TANIM NO: 5'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR2tyi ve/veya SEKANS TANIM NO: 6'nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR3”ü içeren, insan OX40*a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmani ile ilgilidir.
Bulusun Arka Plani OX40, reseptörlerin TNFR üst ailesinin bir üyesi olup, ilk kez 1987 yilinda siçanlardan alinan aktive CD4+ T hücrelerinde eksprese edilen 50 kDa glikoprotein 90). OX40'in ekstraselüler ligand baglama domeni 3 adet tam, sistein açisindan zengin domen (CRD'ler) ve bir kismi, dördüncü C terminal CRD,den olusur (Bodmer üzere trimerik Iiganda baglanir (Compaan DM & Hymowitz SG (2006) Structure, 14: CD28'in aksine OX40, naif T hücrelerinde konstitüf olarak ek8prese edilmeyip, T Hücre Reseptörünün (TCR) baglanmasindan sonra uyarilir. OX40, aktivasyonun ardindan 24 ila 72 saat sonra eksprese edilen bir sekonder kostimülatör molekül olup, bunun ligandi olan OX4OL de hareketsiz antijen sunan hücrelerde eksprese edilmeyip, bunlarin aktivasyonunun ardindan eksprese edilir. OX40 esas olarak aktive CD4+ T hücreleri tarafindan ve kisitli bir ölçüde aktive CD8+ T hücreleri tarafindan eksprese edilir (Salek-Ardakani S ve arkadaslari, (2006) Curr. Immunol. tarif edilmistir. Yaklasik olarak SOpMilik Kd sergileyen diger anti-OX40 antikorlari tarif sergileyen ve insan, al yanakli ve sinomolgus maymun hücrelerinin yüzeyinde OX40'i Bulusun Özeti Mevcut açiklama genel olarak insan OX40,a baglanan antagonist antikorlari veya bunlarin fragmanlari, OX40 aracili rahatsizliklarin tedavisi için yöntemler dahil olmak üzere bunlarin hazirlanma ve kullanim yöntemleri ile ilgilidir. Insan OX40'a baglanan mevcut bulusa ait antagonist antikorlari veya bunlarin fragmanlari antagonistik antikorlar olup, agonistik etkiler göstermezler ve/veya baglanma sonrasinda insan OX40”i aktive etmezler.
Bir yönünde mevcut açiklama, SEKANS TANIM NO: 1”in amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR1'i ve/veya SEKANS TANIM NO: 2'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR2'yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR3*ü ve/veya SEKANS TANIM NO: 4'ün amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDRl'i ve/veya SEKANS TANIM NO: 5'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR2'yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 6,nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR3'ü içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Bir baska yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 7'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölge sekansini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bir baska yönünde mevcut bulus, ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesini içeren, insan OX40”a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Bir baska yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 32'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansini içeren bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar ve burada agir zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun ilgili agir zincir degisken çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonunu içerir.
Bir baska yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 8'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölge sekansini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bir baska yönünde mevcut bulus, ve IGKV olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Bir baska yönünde mevcut bulus, lGHV insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesini içeren bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar ve burada hafif zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun hafif zincir degisken bölgesinin ilgili çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonunu içerir. 38'den olusan gruptan seçilen bir agir zincir sekansini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bir baska yönünde olusan gruptan seçilen bir hafif zincir sekansini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Bir baska yönünde mevcut bulus, asagidakileri içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar: (a) SEKANS TANIM NO: 37 veya 38'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansi ve (b) SEKANS TANIM NO: 47'nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekanSL Bir baska yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 58, 59, 79 ve 80'den olusan gruptan seçilen amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölgesini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bir baska yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 60, 86, 87 ve 89'dan olusan gruptan seçilen amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesini içeren, insan OX40,a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Bir baska yönünde mevcut bulus, asagidakileri içeren, insan OX40*a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar: (a) SEKANS TANIM NO: 58 veya 59”un amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve (b) SEKANS TANIM NO: 60'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi.
Bir baska yönünde mevcut bulus, insan OX40la baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglamakta olup, burada antikor bir insan IgG4 Fc bölgesi içermekte olup, burada antikorun Fc aracili sitotoksisite aktivitesi yoktur. Bir baska yönünde mevcut bulus, insan OX40,a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglamakta olup, burada antikor bir insan IGHG1 Fc bölgesi içermekte olup, burada antikor antikora bagimli hücresel sitotoksisite (ADCC) gibi sitotoksisite mekanizmalari için kompetandir. Tercih edilen bir yönde insan OX40'a baglanan antagonistik antikor veya bunun fragmani fukosile edilmemis bir IGHG1 Fc bölgesine sahip olup, ADCC gibi artirilmis Fc aracili sitotoksisite mekanizmalari sergiler.
Bir baska yönünde mevcut bulusun açiklamasi ayrica, ilgili kimerik antikor ile benzer bir afinite ile insan OX40'a baglanan, diger bir deyisle ilgili kimerik antikorun OX40 baglama afinitesinin (KD) en azindan %75'ini koruyan ya da ilgili kimerik antikorla kiyaslandiginda en azindan esdeger veya daha yüksek OX40 baglama afinitesine (KD) sahip olan antagonistik insanlastirilmis antikorlari veya bunlarin fragmanlarini tarif eder. Bir baska yönünde mevcut bulus, insan OX40 ekstraselüler bölgesinin ikinci domeni içerisindeki bir epitopa baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Mevcut bulusun açiklamasi ayrica, insan OX40'a baglanan antikorlari ve bunlarin fragmanlarini kodlayan izole nükleik asitleri, vektörleri ve bu nükleik asitleri veya vektörleri içeren konak hücreleri saglar. Antagonist antikoru veya bunun fragmanini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi ve bir terapötik ajana bagli antagonist antikoru veya bunun fragmanini içeren immünokonjugatlari içeren bilesimler de saglanir.
Mevcut açiklama ayrica OX40 aracili rahatsizliklarin tedavisi için yöntemleri saglar.
Bir yönde alloreaktif T hücre aktivasyonu ve proliferasyonuna iliskin (karisik Ienfosit reaksiyonu; MLR) bir in vitro modelde, bir antagonistik antikor veya bunun fragmani, yaklasik 100ng/mL olan E050 degeri ile iki farkli bireyde (yanit verenler) MLR'yi etkili bir biçimde inhibe eder. Ayrica, ksenojenik graft versus host reaksiyonunda, insan hastalarda kemik iligi naklinden sonra gözlemlenen allojenik graft versus host hastaligina yönelik bir modelde bir antagonistik antikor veya bunun fragmani GVHD reaksiyonunu güçlü bir biçimde bastirir.
Mevcut açiklama ayrica, antikoru veya bunun fragmanlarini içeren kitler ve imalat ürünlerini, OX40 aracili bir rahatsizligin tedavisi için bir bilesimi veya bir immünokonjugati saglar.
Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1: (A) Immobilize rekombinant insan OX40-his üzerinde direkt baglanan ELISA. Kimerik 2F8 ve 1D4 antikorlarinin insan OX40'a baglanmasi direkt ELISA ile ölçülmüstür. 1D4 (siyah histogramlar) ve 2F8'in (beyaz histogramlar) çesitli konsantrasyonlari (10 ila 0.01mg/ml araliginda) 96 gözlü bir plakada 4°C'de gece boyunca kaplanmis 2mg/ml rekombinant insan OX40- his etiketli protein ile inkübe edilmistir. Her antikorun OX40'a baglanmasi yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge anti insan antikoru ile saptanmistir. (B) Immobilize rekombinant insan OX40-FC üzerinde kompetitif ELISA. Kimerik 1D4 ve 2F8'in OX40/OX4OL etkilesimi üzerindeki inhibisyon etkileri bloke edici ELlSA ile degerlendirilmistir. 1D4 (siyah histogramlar) ve 2F8'in (beyaz histogramlar) çesitli konsantrasyonlari (10 ila 0.01mg/ml araliginda) 96 gözlü bir plakada 4°C'de gece boyunca kaplanmis 2mg/ml rekombinant insan OX40-FC etiketli protein ile inkübe edilmistir. 5 dakika sonra sabit bir biyotinillenmis rekombinant insan OX4OL konsantrasyonu (0.04mg/ml) her göze eklenerek oda sicakliginda 30 dakika süreyle inkübe edilmistir. OX40L'nin OX40'a baglanmasi Streptavidin-HRP kullanilarak saptanmistir.
Sekil 2: 3H timidin katilimi ile ölçülen tek yönlü karisik Iefosit reaksiyonu (MLR). Çubuklar, en azindan üç kopyanin ortalama 3H-timidin katilimini (sayimlar) ± ortalamadan standart sapmayi göstermektedir. Izotip kontrolü (trastuzumab) ve pozitif kontrol (efalizumab) gösterilmektedir. Efektör, sadece efektör hücrelerini simgeler. Efektör + hedef, antikorlarin atlandigi bir ölçümü temsil eder.
Sekil 3: Kimerik 1D4 antikorun akis sitometri analizi (A) Insan aktive periferal kan mononükleer hücreler (PBMC'Ier) ve HPB- ALL hücreler üzerinde boyama. Histogram çizimleri, floresan yogunlugunu (X ekseni) ve göreceli hücre sayisini (maks. olaylarin %”si - Y ekseni) gösterir.
Boyanan hücrelerin tipi belirtilmistir Insan PBMC'Ier, ölçümler öncesinde 48 saat süreyle PHA ve IL-2 ile aktive edilmistir.
(B) Aktive sinomologus faresi PBMC'Ieri üzerinde boyama. Kimerik 1D4 antikorunun sinomologus OX40,a baglanmasi akis sitometrisi ile degerlendirilmistir. Periferal kan mononükleer hücreler (PBMC'ler) bir sinomologus maymunundan alinan tam kandan izole edilmistir ve 10mg/ml PHA ve 1OOU/ml rhuIL-2 varliginda 50 saat süreyle 3x106 hücre kültüre edilmistir. Aktive PBMCiler ya kontrol antikorunun (üst profil (i)) ya da biyotillenmis koyun anti-insan OX40 antikorunun (orta profil (ii)) ya da biyotillenmis kimerik 1D4 antikorunun (alt profil (iii)) 25mg/ml'si ile inkübe edilmistir. Her antikorun sinomologus OX40'a baglanmasi streptavidin-APC ile saptanmistir.
Sekil 4: Anti-OX40 antikorlarin Yüzey Plazmon rezonans ölçümleri. Veriler, yanit sayisina (kisaltmasi: RU; Y ekseni) karsi süre (X ekseni) olarak ifade edilmistir.
SEKIL 4A - VH1/VL1 antikoruna karsi 1D4 kimera.
SEKIL 4B - VH1, VH2 ve VH3 bazli insanlastirilmis antikorlara (gösterildigi gibi) karsi 1D4 kimera.
SEKIL 4C - kötü baglayicilarin örnekleri: VH4/VL4, VH5/VL4, VH5/VL5 ve VH5/VL6.
FIG. 4D - zayif baglayicilarin (VH5/VL9 ve VH4/VL9) ve iyi baglayicilarin SEKIL 4E - VH7 bazli insanlastirilmis antikorlar.
SEKIL 4F - VH6/VL9, 1D4 kimera ve insanlastirilmis varyant VH7NL9 üzerinde en iyi baglanma özelliklerine sahiptir.
Sekil 5: Sekans Hizalama.1D4,ün agir zincir (SEKIL 5A) veya hafif zincir (SEKIL 5B) degisken bölgesinin IMGT kökenli seçilen germ hatti çatilari (IGHV ve IGHV3-11*01 (SEKANS TANIM NO: 24)) ve ters mutasyona ugramis degisken bölge varyantlari (VH1 (SEKANS TANIM NO: 29), VH2 (SEKANS TANIM NO: 77), VH3 (SEKANS TANIM NO: 78), VH4 (SEKANS TANIM NO: 79), VH5 (SEKANS TANIM NO: 80), VH6 (SEKANS TANIM NO: 58), VH7 (SEKANS TANIM NO: 59), (VL1 (SEKANS TANIM NO: 30), VL2 (SEKANS TANIM NO: 81), VL3 (SEKANS TANIM NO: 82), VL4 (SEKANS TANIM NO: 83), VL5 (SEKANS TANIM NO: 84), VL6 (SEKANS TANIM NO: 85), VL7 (SEKANS TANIM NO: 86), VL8 (SEKANS TANIM NO: 87), VL9 (SEKANS TANIM NO: 60) VL10 (SEKANS TANIM NO: 88), VL11 (SEKANS TANIM NO: 89) ile hizalanmasi.
Sekil 6: Diferansiyel taramali kalorimetri kullanilarak insanlastirilmis anti- 0X40 anti-antikor VH6NL9 FAB fragmaninin termostabilite ölçümleri. Veriler, molar isi kapasitesine (kisaltmasi Cp [kcaI/moI/°C]; Y ekseni) karsi sicaklik (X ekseni) olarak ifade edilmistir.
Sekil 7: Epitop Karakterizasyonu. Bu sekil, Örnek 7'de açiklandigi gibi ELISA test sonuçlari temelinde insanlastirilmis anti-OX40 anti-antikor VH6/VL9 epitopunu göstermektedir.
Sekil 8: 3H timidin katilimi ile ölçülen karisik Ienfosit reaksiyonu (MLR). SEKIL 8A ve 88, alakasiz iki dönorden karisik lenfosit reaksiyonunun sonuçlarini göstermektedir. Proliferasyon 3H-timidin katilimi ile ölçülmüstür.
Grafikler her kosul ± SEM için mutlak sayi degerlerini göstermektedir. Yanit veren hücreleri islem görmemis PBMCiler olup, stimülatör hücreler mitomisinle islem görmüs PBMC'lerdir. Test antikorlari ile tüm kosullar heterolog stimülatör PBMC'Ierle karistirilmis yanit veren hücreleri ile yapilmistir. Pozitif kontrol Efalizumab (anti LFA-1 antikoru) olmustur.
Sekil 9: Ksenojenik greft versus host reaksiyon modeli. Bu sekil, bahsedilen her kosul için sekiz hayvandan olusan grup içerisindeki sagkalim yüzdesini göstermektedir. Vehikül: sadece PBS. Dikey noktali çizgi tedavinin son gününü belirtir. PBMC almamis olan isinima tabi tutulmus iki kontrol hayvanindan olusan bir grupta mortalite ve semptom gözlemlenmemistir.
Bulusun Ayrintili Açiklamasi Mevcut açiklama, insan OX40'a baglanan antagonist antikorlari ve bunlarin fragmanlari ile ilgilidir.
Burada kullanildigi haliyle “insan OX40” terimi, insan OX40'in varyantlarini, izoformlarini ve tür homologlarini kapsar. Dolayisiyla, bu açiklamanin antikorlari belirli durumlarda insan disindaki türlere ait OX40 ile çapraz reaksiyona girebilir.
Belirli uygulamalarda antikorlar bir veya daha fazla insan OX40 proteini için tamamen spesifik olabilir ve türlerle veya diger insan olmayan tiplerle çapraz reaktivite sergilemeyebilir. Örnek bir insan OX40'in tam amino asit sekansi Swiss-Prot erisim numarasi P sahiptir. OX40 ayrica Gene tarafindan GenelD: 7293 olarak ve HGNC tarafindan HGNC: 11918 olarak TNFRSF4 /OX4O olarak belirtilen gen tarafindan kodlanabilir.
Burada “insan OX40” kullanimi, insan OX40`in bilinen veya henüz kesfedilmemis olan tüm allellerini ve polimorfik formlarini kapsar. Burada “insan OX40”, “OX40” veya “OX40 Reseptörü” terimleri esit bir biçimde kullanilmis olup, aksi özellikle belirtilmemisse “insan OX40" anlamina gelir.
Burada “OX40 Iigand” veya “OX40L” esit bir biçimde kullaanilmis olup, OX40 ligandi, spesifik olarak insan OX40 ligandi içerir. OX40L, TNF üst ailesinin bir üyesi olup, gp34 veya CD252 olarak da bilinmektedir. OX4OL ayni zamanda CD252 olarak da belirtilir (farklilasma kümesi 252) ve sekans veritabani erisim numarasi P23510'a (Swiss-Prot) veya Q6FGS4”e (Uniprot) sahiptir. OX40L, aktive B hücreleri, T hücreleri, dendritik hücreler ve endotelyal hücrelerin yüzeyinde eksprese edilir.
Burada kullanildigi haliyle “insan OX40'a baglanan antikor veya bunun fragmani“ terimi, insan OX40ia, örnegin izole formdaki insan OX40'a, 500 nM veya daha az, tercihen 200nM veya daha az, daha tercihen 150 nM veya daha az, daha tercihen ile baglanan antikorlari veya bunlarin bir fragmanini içerir. “Insan OX40,a baglanan antikor veya bunun fragmani” terimi antikorlari veya bunlarin antijenik baglama fragmanlarini içerir. kullanilmakta olup, örnegin OX40iin OX40 ligandina baglanmasini bloke ederek veya büyük ölçüde azaltarak ve dolayisiyla OX40 tarafindan tetiklenen sinyalizasyon yolagini inhibe ederek veya azaltarak ve/veya lenfosit proliferasyonu, sitokin ekspresyonu veya lenfosit sagkalimi gibi OX40 aracili hücre yanitini azaltarak OX40'in biyolojik sinyalleme aktivitesini inhibe edebilen ve/veya nötralize edebilen bir antikoru içerir.
Burada belirtildigi haliyle “antikor'i terimi tüm antikorlari ve bunlarin herhangi bir antijen baglayan fragmanini veya tek zincirini içerir. Bir “antikor", disülfit baglariyla birbirine baglanan en az iki agir (H) zincir ve iki hafif (L) zincir içeren bir glikoproteini veya bunun antijen baglayan bir fragmanini belirtir. Her agir zincir, bir agir zincir degisken bölgesi (burada VH olarak kisaltilmistir) ve bir agir zincir sabit bölgesinden olusur. Agir zincir sabit bölgesi CH1, CH2 ve CH3 olmak üzere üç domenden olusur.
Her hafif zincir, bir hafif zincir degisken bölgesi (burada VL olarak kisaltilmistir) ve bir hafif zincir sabit bölgesinden olusur. Hafif zincir sabit bölgesi CL olmak üzere bir domenden olusur. VH ve VL bölgeleri ayricai sekans açisindan hiperdegisken olan ve/veya antijen tanimaya katilan ve/veya genellikle çati bölgeleri (FR veya FW) olarak adlandirilan daha korunumlu bölgelerin aralarina serpistirildigi yapisal olarak tanimli halkalar olusturan tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR) olarak adlandirilan hiperdegiskenlik bölgelerine yeniden bölünebilir. Her VH ve VL, amino ucundan karboksi ucuna kadar asagidaki sirada düzenlenmis üç CDR ve dört FW'den olusur: FW1, CDRi, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. FW1, FW2, FW3 ve FW4iün amino asit sekanslari hep birlikte burada belirtildigi gibi VH veya VL'nin “non- CDR bölgesini” veya “uzatilmamis CDR bölgesini" meydana getirir.
Burada belirtildigi haliyle “agir zincir degisken çati bölgesi” terimi bir veya daha fazla (örn. bir, iki, üç ve/veya dört) agir zincir çati bölgesi sekansini (örn. çati 1 (FW1), çati 2 (FW2), çati 3 (FW3) ve/veya çati 4 (FW4)) içerebilir. Tercihen agir zincir degisken bölge çatisi FW1, FW2 ve/veya FW3'ü, daha tercihen FW1, FW2 ve FW3“ü içerir.
Burada belirtildigi haliyle “hafif zincir degisken çati bölgesi” terimi bir veya daha fazla (örn. bir, iki, üç ve/veya dört) hafif zincir çati bölgesi sekansini (örn. çati 1 (FW1), çati 2 (FW2), çati 3 (FW3) ve/veya çati 4 (FW4)) içerebilir. Tercihen hafif zincir degisken bölge çatisi FW1, FW2 ve/veya FW3'ü, daha tercihen FW1, FW2 ve FW3'ü içerir.
Agir ve hafif zincirlerin degisken bölgeleri bir antijenle etkilesime giren bir baglayici domen ihtiva eder. Antikorlarin sabit bölgeleri, immün sistemin çesitli hücreleri (örn. efektör hücreler) ve klasik kompleman sistemin Birinci bileseni (C1q) dahil olmak üzere, immünoglobulinin konak dokulara veya faktörlere baglanmasina aracilik Genetik olarak sabit bölge ile belirlendigi üzere antikorlar izotipler olarak da anilan siniflara ayrilir. Insan sabit hafif zincirleri kappa (CK) ve Iambda (CA) hafif zincirleri olarak siniflandirilir. Agir zincirler ise, mu (u), delta (ö), gama (v), alfa (oi) veya epsilon (5) olarak siniflandirilmakta olup, antikorun izotipini sirasiyla lgM, lgD, lgG, immünoglobulinlerin sabit bölgelerinin kimyasal ve antijenik özellikleri ile belirlenen siniflarinin ve/veya alt siniflarinin herhangi birini kast eder. Bilinen insan immünoglobulin izotipleri sunlardir: lgG1 (IGHG1), lgG2 (IGHG2), IgGS (IGHG3)i Insan immünoglobulin psodö-gamma IGHGP geni olarak anilan gen sekanslanmis olmakla birlikte degistirilmis geçis bölgesi yüzünden protein kodlamayan ek bir insan immünoglobulin agir sabit bölgeli geni temsil eder (Bensmana M ve arkadaslari, ragmen insan immünoglobulin psödo-gamma IGHGP geni tüm agir sabit domenler (CH1-CH3) ve mentese için açik okuma çatilarine sahiptir. Bunun agir sabit domenleri için açik okuma çatilarinin tümü, tahmin edilen yapisal özelliklerle tüm insan immünoglobulin sabit domenleri ile iyi hizalanan protein domenlerini kodlar. Bu ek psödo-gamma izotip burada IgGP veya IGHGP olarak anilir. Insan immünoglobulin agir sabit domenli epsilon P1 ve P2 psödo-genleri (lGHEP1 ve amaçlar için en yaygin olarak kullanilan siniftir. Insanlarda bu sinif lgG1, lgG2, lgG3 ve lgG4 alt siniflarini içerir. Farelerde bu sinif lgG1, lgG2a, IgGZb, lgG2c ve lgG3 alt siniflarini içerir.
Burada kullanildigi haliyle “kimerik antikor” terimi, degisken bölge sekanslarinin bir türden elde edildigi ve sabit bölge sekanslarinin bir diger türden elde edildigi antikorlari, mesela içerisindeki degisken bölge sekanslarinin bir fare antikorundan elde edildigi ve sabit bölge sekanslarinin bir insan antikorundan elde edildigi bir antikoru içerir.
Burada kullanildigi haliyle “insanlastirilmis antikor” veya “insanlastirilmis anti-OX4O antikoru” terimi, örnegin bir fare gibi bir diger memeli türünün germ hattindan elde edilen CDR sekanslarinin insan çati sekanslarina greftlenmis oldugu antikorlari içerir.
Insan çati sekanslarinin yani sira bir diger memeli türünün germ hattindan elde edilen CDR sekanslarinin içerisinde ek çati bölge modifikasyonlari yapilabilir.
Burada kullanildigi haliyle “Fab” veya “Fab bölgesi” terimi VH, CH1, VL ve CL immünoglobulin domenlerini içeren polipeptitleri içerir. Fab, bu bölgeyi izolasyon halinde ya da bu bölgeyi tam boy antikor veya antikor fragmani baglaminda ifade Burada kullanildigi haliyle “Fc” veya “FC bölgesi” terimi birinci sabit bölge immünoglobulin domeni hariç bir antikorun sabit bölgesini içeren polipeptiti içerir. Bu nedenle F0, lgA, IgD ve lgG'nin son iki sabit bölge immünoglobulin domenini ve IgE ve IgM'nin son üç sabit bölge immünoglobulin domenini ve bu domenlere esnek mentese N-terminalini belirtir. lgA ve IgM için, Fc J zincirini içerebilir. lgG için, Fc immünoglobulin domenleri C gamma 2 ve C gamma 3'ü (Cy2 ve Cy3) ve C gamma 1 (Cy1) ve C gamma 2 (Cv2) arasindaki menteseyi içerir. Fc bölgesinin sinirlari degisebilmesine ragmen insan lgG agir zincir FC bölgesi genellikle karboksil ucuna 0226 veya P23O kalintilarini içerdigi seklinde tanimlanir; buradaki numaralandirma AB numaralandirma sistemine göredir. Insan IgG1 için, Fc bölgesi burada karboksil ucuna P232 kalintisini içerdigi seklinde tanimlanir; buradaki numaralandirma AB numaralandirma sistemine göredir (Edelman GM ve arkadaslari, (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85). Fc, bu bölgeyi izolasyon halinde ya da bu bölgeyi bir PC polipeptit, örnegin bir antikor baglaminda ifade edebilir.
Burada “mentese" veya “mentese bölgesi” veya “antikor mentese bölgesi" terimi bir antikorun birinci ve ikinci sabit domenleri arasinda amino asitleri içeren esnek polipeptiti içerir. Burada anildigi haliyle “mentese bölgesi”, iki agir zinciri köprüleyen sistein kalintilarini kapsayan, yalnizca lgA, IgD ve lgG'de bulunan 6-62 amino asit uzunlugunda bir sekans bölgesidir. Yapisal olarak, lgG CH1 domeni AB pozisyonu 220`de sona erer ve lgG CH2 domeni, kalinti AB pozisyonu 237'de baslar. Bu (IgG1'de A231) içerdigi seklinde tanimlanir; buradaki numaralandirma AB numaralandirma sistemine göredir (Edelman GM ve arkadaslari, yukarida).
Burada kullanildigi haliyle “ana antikor" veya “ana immünoglobulin” terimi bir varyant üretmek üzere daha sonradan modifiye edilen modifiye edilmemis bir antikor içerir.
Söz konusu ana antikor dogal olusumlu bir antikor olabilecegi gibi dogal olusumlu bir antikorun bir varyanti veya mühendislikle tasarlanmis bir versiyonu olabilir. Ana antikor antikorun kendisini, ana antikoru içeren bilesimleri veya bunu kodlayan amino asit sekansini belirtebilir. Burada kullanildigi haliyle “ana anti-OX40 antikoru" ile insan OX40*a baglanan ve bir varyant üretmek üzere modifiye edilen bir antikor veya immünoglobulin kast edilir. Burada kullanildigi haliyle “ilgili murin antikoru” ile insan OX40'a baglanan ve bir varyant üretmek üzere modifiye edilebilen bir murin antikoru veya immünoglobulin, özellikle burada açiklandigi gibi murin antikoru 1D4 kast edilir.
Burada kullanildigi haliyle “varyant antikor” veya “antikor varyanti” terimi, ana antikorla kiyaslandiginda en az bir amino asit modifikasyonu nedeniyle ana antikordan farklilik gösteren bir antikor sekansini içerir. Burada varyant antikor sekansi tercihen ana antikor sekansi ile en az yaklasik %80, daha tercihen en az yaklasik %90, daha tercihen en az yaklasik %95 amino asit sekans özdesligine sahip olacaktir. Antikor varyanti antikorun kendisini, antikor varyantini içeren bilesimleri veya bunu kodlayan amino asit sekansini belirtebilir.
Burada “amino asit modifikasyonu” terimi bir polipeptit sekansinda bir amino asit sübstitüsyonunu, insersiyonunu ve/veya delesyonunu içerir. Burada “amino asit sübstitüsyonu” veya “sübstitüsyon" ile ana polipeptit sekansindaki belirli bir pozisyondaki bir amino asidin bir baska amino asitle degistirilmesi kast edilir. Örnegin, sübstitüsyon R94K, 94. pozisyondaki arjininin Iizinle degistirildigi bir varyant polipeptiti, bu durumda bir agir zincir degisken çati bölgeli varyanti belirtir. Önceki örnek için 94K, 94. pozisyonda Iizinle sübstitüsyonu belirtir. Buradaki amaçlar dogrultusunda çoklu sübstitüsyonlar genellikle bir taksim isareti ile ayrilir. Örnegin R94K/L78V, R94K ve L78V sübstitüsyonlarini içeren bir çift varyanti belirtir. Burada kullanildigi haliyle “amino asit insersiyonu” veya “insersiyon” ile ana polipeptit sekansindaki belirli bir pozisyonda bir amino asidin eklenmesi kast edilir. Örnegin insers -94, 94. pozisyonda bir insersiyonu belirtir. Burada kullanildigi haliyle “amino asit delesyonu” veya “delesyon” ile ana polipeptit sekansindaki belirli bir pozisyonda bir amino asidin çikarilmasi kast edilir. Örnegin R94-, 94. pozisyonda arjininin delesyonunu belirtir.
Burada kullanildigi haliyle “konservatif modifikasyonlar” veya “konservatif sekans modifikasyonlari" teriminin, amino asit sekansini içermeyen antikorun baglama özelliklerini önemli ölçüde etkilemeyen veya degistirmeyen amino asit modifikasyonlarini belirtmesi amaçlanir. Bu konservatif modifikasyonlar amino asit sübstitüsyonlarini, insersiyonlarini ve delesyonlarini içerir. Bulusa ait bir antikorda alanda bilinen standart tekniklerle, mesela bölgeye yönlendirilmis mutajenez ve PCR aracili mutajenezle modifikasyonlar yapilabilir. Konservatif amino asit sübstitüsyonlari, amino asit kalintisinin benzer bir yan zinciri olan bir amino asit kalintisi ile degistirildigi sübstitüsyonlardir. Benzer yan zincirleri olan amino asit kalintilarinin aileleri alanda tanimlanmistir. Bu aileler, bazik yan zincirleri (örn. Iizin, arjinin, histidin), asidik yan zincirleri (örn. aspartik asit, glutamik asit), yüksüz polar yan zincirleri (örn. glisin, asparajin, glutamin, serin, treonin, tirozin, sistein, triptofan), nonpolar yan zincirleri (örn. alanin, valin, lösin, izolösin, prolin, fenilalanin, metiyonin), beta-dallanmis yan zincirleri (örn. treonin, valin, izolösin) ve aromatik yari zincirleri (örn. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin) olan amino asitleri içerir. Bu nedenle, CDR bölgeleri içerisindeki veya bulusun antikorunun çati bölgeleri içerisindeki bir veya daha fazla amino asit kalintisi ayni yan zincir ailesinden diger amino asit kalintilari ile degistirilebilir ve degistirilen antikor (varyant antikor) korunan fonksiyon açisindan test edilebilir.
Insan immünoglobulin agir zincir sabit bölgelerinin tamami için numaralandirma “AB numaralandirma sistemi”ne göredir (Edelman GM ve arkadaslari, (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85). Insan kappa immünoglobulin hafif zincir sabit domeni (IGKC) için numaralandirma “AB numaralandirma sistemi”ne göredir (Edelman GM ve arkadaslari, yukarida).
Insan lambda immünoglobulin hafif zincir sabit domenleri için (IGLC1, lGLCZ, IGLC3, Sci USA, 82(10): 3415-9 tarafindan açiklandigi gibi "Kabat numaralandirma sistemi"ne göredir (Kabat EA ve arkadaslari, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242). belirli bir antikorun spesifitesini tanimlayan domenleri belirtir. Dogal olusumlu antikorlarda antijen baglayici bölge biri agir zincirde (VH) ve digeri hafif zincirde (VL) yer alan, spesifiteyi tanimlayan iki degisken domenden olusur. Bazi durumlarda spesifite sadece, devegillerde bulunan agir zincir antikorlarindan tek domenli antikorlarda oldugu gibi iki domenden yalnizca birinde bulunabilir. V bölgeleri genellikle yaklasik 110 amino asit uzunlugunda olup, 9-12 amino asit uzunlugunda olan “hiperdegisken bölgeleri” olarak adlandirilan son derece degisken olan kisa bölgelerle ayrilan 15-30 amino asidin çati bölgeleri (FR'Ier) olarak adlandirilan amino asit sekanslarinin göreceli olarak degismez kisimlarindan meydana gelir. Natif agir ve hafif zincirlerin degisken domenleri halkalar olusturan, üç hiperdegisken bölge ile baglanan, ekseriyetle bir beat-sheet konfigürasyonunu benimseyen dört FR içerir.
Her zincirdeki hiperdegisken bölgeler FR'Ier ile oldukça yakin olarak bir arada tutulur ve diger zincirdeki hiperdegisken bölgelerle beraber antikorlarin antijen baglayici bölgesinin olusumuna katkida bulunur (bkz. Kabat EA ve arkadaslari, yukarida).
Burada kullanildigi haliyle “hiperdegisken bölge” terimi antikorun antijen baglamasindan sorumlu olan amino asit kalintilarini belirtir. Hiperdegisken bölge genellikle bir “tamamlayicilik belirleyen bölge" veya “CDR” kökenli amino asit kalintilarini içerir; “tamamlayicilik belirleyen bölge" veya “CDR” en yüksek sekans degiskenligine sahiptir ve/veya antijen tanimaya katilir. Tüm degisken domenler için numaralandirma Kabat'a göredir (Kabat EA ve arkadaslari, yukarida).
Bir dizi CDR tanimi kullanilmakta olup, burada kapsanmaktadir. Kabat tanimi sekans degiskenligine dayali olup, en yaygin kullanilandir (Kabat EA ve arkadaslari, yukarida). Chothia ise buna karsilik yapisal halkalarin konumuna atifta bulunur Chothia tanimlari arasinda bir uzlasma saglar ve Oxford Molecular'e ait AbM antikor modelleme yazilimi tarafindan kullanilir (Martin ACR ve arkadaslari, (1989) Proc.
Natl Acad. Sci. USA, 86: Methods Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172). Portör tanimi son zamanlarda Protein Veritabaninda bulunan mevcut kompleks yapilarinin analizine dayalidir.
CDR'nin lMGT®, International ImMunoGeneTics information system® (http://www.imgt.org) tarafindan tanimlamasi tüm türlere ait tüm immünoglobulin ve T hücre reseptör V-BÖLGELERI için IMGT numaralandirmasina dayalidir (lMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®;Lefranc MP ve arkadaslari, Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64).
Mevcut bulusta ele alinan tüm Tamamlayicilik Belirleyen Bölgeler (CDR”Ier) tercihen kalintilari asagidaki gibidir (numaralandirma suna göredir: Kabat EA, ve arkadaslari, 57 ve HCDR3: 93-102. Burada kullanildigi haliyle VL bölgesinin “non-CDR bölgesi” su amino asit sekanslarini içerir: ve 98- yaklasik olarak . Burada kullanildigi haliyle VH bölgesinin “non-CDR bölgesi" su amino asit sekanslarini içerir: ve 103- yaklasik olarak .
Mevcut bulusa ait CDR'ler yukarida bahsedilen tanimlara dayali olan ve asagidaki gibi degisken domen kalintilarina sahip olan “uzatilmis CDRileri” içerebilir: CDR1: 24- Bu uzatilmis CDR'Ier de Kabat ve arkadaslar/,na (yukarida) göre numaralanmistir.
Burada kullanildigi haliyle VL bölgesinin “uzatilmamis CDR bölgesi” su amino asit sekanslarini içerir: ve 98- yaklasik olarak . Burada kullanildigi haliyle VH bölgesinin “uzatilmamis CDR bölgesi” su amino asit sekanslarini içerir: ve 103- yaklasik Burada kullanildigi haliyle “tam boy antikor” terimi degisken ve sabit bölgeler dahil olmak üzere bir antikorun dogal biyolojik formunu meydana getiren yapiyi içerir. Örnegin insanlar ve fareler dahil olmak üzere çogu memelide, IgG sinifina ait tam boy antikor bir tetramer olup, iki immünoglobulin zincirinin iki özdes çiftinden olusmakta olup, her çift bir hafif ve bir agir zincire sahip olup, her hafif zincir immünoglobulin domenleri VL ve CLiyi içerir ve her agir zincir immünoglobulin domenleri VH, CH1 (Cy1), CH2 (Cy2) ve CH3,ü (Cy3) içerir. Bazi memelilerde, örnegin develerde ve Iamalarda, lgG antikorlari yalnizca iki agir zincirden olusabilmekte olup, her agir zincir Fc bölgesine bagli bir degisken domen içerir.
Antikor fragmanlari bunlarla sinirli olmamak üzere sunlari içerir: (i) Fab' ve Fab'-SH dahil olmak üzere VH, CL ve CH1 domenlerini içeren Fab fragmani, (ii) VH ve CH1 domenlerini içeren Fd fragmani, (iii) tek bir antikorun VL ve VH domenlerini içeren Fv fragmani; (iv) tek bir degiskenden olusan dAb fragmani (Ward ES ve arkadaslari, fragman olan F(ab')2 fragmanlari, (vi) tek zincirli Fv molekülleri (scFv), burada bir VH domeni ve bir VL domeni, bir antijen baglayici bölge olusturmak üzere iki domenin birlesmesine olanak veren bir peptit baglayici ile baglanir (Bird RE ve ardakaslari, gen füzyonu ile olusturulan multivalan veya multispesifik fragmanlar olan USA, 90: 6444-48) ve (ix) ayni veya farkli bir antikora genetik olarak kaynastirilan Burada kullanildigi haliyle “efektör fonksiyonu" terimi bir antikor Fc bölgesinin bir Fc reseptörü veya Iigandi ile etkilesiminden kaynaklanan bir biyokimyasal olayi içerir.
Efektör fonksiyonlari ADCC (antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite) ve ADCP (antikora bagimli hücre aracili fagositoz) gibi FcyR aracili efektör fonksiyonlarini ve CDC (kompleman bagimli sitotoksisite) gibi kompleman aracili efektör fonksiyonlarini içerir. Bir antikorun efektör fonksiyonu, antikorun bir PC reseptörü veya bir kompleman bilesen gibi bir efektör molekül için afinitesini degistirme, yani artirma veya azaltma, tercihen artirma yoluyla degistirilebilir. Baglama afinitesi genellikle efektör molekül baglama bölgesini modifiye ederek degistirilecektir ve bu durumda ilgili bölgeyi saptamak ve bu bölgenin en azindan bir kismini uygun bir biçimde modifiye etmek uygun olur. Efektör molekül için antikordaki baglama bölgesindeki bir degisikligin genel baglama afinitesini önemli ölçüde degistirmesinin zorunlu olmadigi, ancak üretken olmayan baglamada oldugu gibi efektör mekanizmasini etkisiz hale getirecek sekilde etkilesimin geometrisini degistirebilecegi de öngörülmüstür. Ayrica bir efektörfonksiyonunun dogrudan efektör molekül baglanmasina katilmayip, efektör fonksiyonunun performansina baska bir sekilde katilan bir bölgenin modifiye edilmesi ile degistirilebilecegi de öngörülmüstür. Bir antikorun efektör fonksiyonunun degistirilmesi ile immün yanitinin çesitli yönlerini kontrol etmek, yani immün sisteminin çesitli reaksiyonlarini artirmak veya bastirmak mümkün olabilmekte olup, tani ve tedavide olasi faydali etkileri vardir.
Burada kullanildigi haliyle “OX4O aracili rahatsizlik” terimi alerji, astim, KOAH, römatoid artrit, psoriazis ve otoimmünite ve inflamasyonla iliskili hastaliklar gibi durumlari içerir.
Burada kullanildigi haliyle “denek” terimi herhangi bir insani veya insan disi hayvani içerir. “Insan disi hayvan” terimi tüm omurgalilari, örnegin memelileri ve memeli olmayanlari, mesela insan olmayan primatlari, koyunlari, köpekleri, kedileri, atlari, inekleri, tavuklari, amfibi hayvanlari, sürüngenleri vb. içerir. Tercihen denek insandir.
Anti-OX40 antikorlari Birinci yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 1'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR1'i ve/veya SEKANS TANIM NO: 2”nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR2'yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR3`ü ve/veya SEKANS TANIM NO: 4'ün amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR1”i ve/veya SEKANS TANIM NO: 5”in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR2`yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 6”nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR3'ü içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Bazi uygulamalarda insan OX40'a baglanan antagonist antikoru veya bunun fragmani, SEKANS TANIM NO: 13'ün amino asit sekansini içeren bir uzatilmis agir zincir CDR1'i ve/veya SEKANS TANIM NO: 14'ün amino asit sekansini içeren bir uzatilmis agir zincir CDR2'yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 15iin amino asit sekansini içeren bir uzatilmis agir zincir CDR3'ü ve/veya SEKANS TANIM NO: 16lnin amino asit sekansini içeren bir uzatilmis hafif zincir CDR1”i ve/veya SEKANS TANIM NO: 17'nin amino asit sekansini içeren bir uzatilmis hafif zincir CDR2'yi ve/veya SEKANS TANIM NO: 18'in amino asit sekansini içeren bir uzatilmis hafif zincir CDR3'ü içerir.
Tercihen insan OX40'a baglanan antagonist antikoru veya bunun fragmani, SEKANS TANIM NO: 1'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDRlii, SEKANS TANIM NO: 2'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR2'yi ve SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR3iü ve/veya SEKANS TANIM NO: 4'ün amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR1'i, SEKANS TANIM NO: 5iin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR2'yi ve SEKANS TANIM NO: 6'nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR3'ü içerir. Daha tercihen insan OX40'a baglanan antagonist antikoru veya bunun fragmani, SEKANS TANIM NO: 17in amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDRlii, SEKANS TANIM NO: 2inin amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR2lyi ve SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDRS'ü ve SEKANS TANIM NO: 4'ün amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR1'i, SEKANS TANIM NO: 5'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR2'yi ve SEKANS TANIM NO: 6'nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR3'ü içerir.
Alanda CDR1 ve/veya CDR2 domenlerinden bagimsiz olarak CDR3 domeninin tek basina bir soydas antijen için bir antikorun baglama spesifitesini belirleyebilecegi ve ortak CDRS sekansina dayali olarak ayni baglama spesifitesine sahip çok sayida antikorun tahmini olarak üretilebilecegi iyi bilinmektedir. Bkz. örnegin Klimka A ve Ki-4'ün agir zincir degisken domeni kullanilarak bir insanlastirilmis anti-CD30 antikorunun üretimi açiklanmaktadir); Beiboer SH ve arkadaslari, (2000) J. Mol. Biol.
CDR3 sekansi kullanilarak rekombinant epitelyum glikoprotein-Z (EGP-2) antikorlarini açiklamaktadir); Rader C ve arkadaslari, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci zincir degisken CDR3 domeni kullanilarak insanlastirilmis anti-integrin dvß3 antikorlarinin bir grubunu açiklamaktadir, burada her üye antikor CDR3 domeni disinda ayri bir sekansi içerir ve parental murin antikoru ile ayni epitopu parental murin antikoru kadar yüksek afiniteyle veya bundan daha yüksek afiniteyle 62 (CDR3 domeninin antijen baglanmasina en önemli katkiyi sagladigini açiklamaktadir).
Dolayisiyla, mevcut bulus bir veya daha fazla agir ve/veya hafif zincir CDR3 domenini, özellikle SEKANS TANIM NO: 3'ün amino asit sekansini içeren agir zincir CDR3'ü ve/veya SEKANS TANIM NO: 6'nin amino asit sekansini içeren hafif zincir CDR3'ü içeren, insan OX40'a baglanan antikorlari ve bunlarin fragmanlarini saglamakta olup, burada antikor insan OX40'a baglanabilir. Bazi uygulamalarda bir insan olmayan antikor kökenli bir veya daha fazla agir ve/veya hafif zincir CDR3 domeni içeren bulus konusu bu antikorlar, (a) baglanma açisindan rekabet edebilir; (b) fonksiyonel karakteristikleri koruyabilir; (c) ayni epitopa baglanabilir; ve/veya (d) ilgili parental insan olmayan, örn. murin antikoru ile benzer bir baglama afinitesine sahip olabilir.
Bir baska yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 7'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölge sekansini içeren, insan OX40”a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bir baska yönünde mevcut bulus, SEKANS TANIM NO: 8'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölge sekansini içeren, insan OX40*a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bazi uygulamalarda insan OX40,a baglanan antagonist antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 77nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölge sekansini ve SEKANS TANIM NO: 8'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölge sekansi içerir.
Bir baska yönünde mevcut bulus, insan OX40`a baglanan bir antagonist antikorun veya bunun fragmaninin varyantlarini saglar. Dolayisiyla mevcut bulus, agir veya hafif Zincirli, yani sirasiyla SEKANS TANIM NO: 7 veya SEKANS TANIM NO: 8'de oldugu gibi agir ve hafif degisken bölge sekanslarina sahip ana antagonist antikorunun agir ve/veya hafif zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgelerinin amino asit sekansina en az %80 özdes olan (en az %80 amino asit sekans özdesligi olan) agir ve/veya hafif zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgelerinin amino asit sekansina sahip antikorlari veya bunlarin fragmanlarini saglar. Ayni zamanda agir veya hafif zincirli ana antagonist antikorunun agir ve/veya hafif zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgelerinin amino asit sekansina en az %80 özdes olan agir ve/veya hafif zincir degisken bölge sekansinin uzatilmamis CDR bölgelerinin amino asit sekansina sahip anitkorlar veya bunlarin fragmanlari da mevcut bulusla saglanir. Tercihen agir ve/veya hafif zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgeleri veya uzatilmamis CDR bölgelerinin amino asit sekans özdesligi en az %85, daha etrcihen en az %90% ve en çok tercih edilen haliyle en az %95, özellikle %96, daha özel olarak %97, daha da özel olarak %98, en özel haliyle %99 olup, örnegin özdeslik veya homoloji burada maksimum sekans özdesligi yüzdesini elde etmek amaci ile gerekmesi halinde sekanslarin hizalanmasindan ve bosluklarin eklenmesinden sonra, insan OX40`a baglanan antagonist antikor veya bunun fragmani ile özdes olan, aday sekanstaki amino asit kalintilarinin yüzdesi olarak tanimlanir. Dolayisiyla sekans özdesligi iki polipeptidin amino asitlerinin pozisyonlarindaki benzerligi karsilastirmak için yaygin olarak kullanilan standart yöntemlerle belirlenebilir. BLAST veya FASTA gibi bir bilgisayar programi kullanilarak iki polipeptit ilgili amino asitlerinin optimum eslesmesi için hizalanir (ya bir veya iki sekansin tam boyu boyunca ya da bir veya daha fazla sekansin önceden belirlenen bir kismi boyunca). Bu programlar bir varsayilan bosluk açma cezasi ve bir varsayilan bosluk cezasi sunar ve PAM250 gibi bir skorlama matrisi (standart skorlama matrisi; bkz. Dayhoff MC ve arkadaslari, (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3) bilgisayar programi ile baglantili olarak kullanilabilir. Örnegin özdeslik yüzdesi su sekilde hesaplanabilir: özdeslik eslesmelerinin toplam sayisi 100 ile çarpilip eslesen aralik içerisindeki daha uzun sekansin uzunlugu ile iki sekansi hizalamak için daha uzun sekansa eklenen bosluk sayisinin toplamina bölünür.
Dolayisiyla bazi uygulamalarda mevcut açiklama insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikor veya bunun fragmanini saglar, burada antikor veya bunun az %70 özdes olan bir agir zincir degisken çati bölge sekansini ve/veya SEKANS hafif zincir degisken çati bölge sekansini içerir. Bazi uygulamalarda mevcut açiklama insan OX40,a baglanan bir antagonistik antikor veya bunun fragmanini saglar, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANlM NO: 19'un çati bölge sekansina en az %74 özdes olan bir agir zincir degisken çati bölge sekansini ve/veya SEKANS TANIM NO: 24'ün çati bölge sekansina en az %65 özdes olan bir hafif zincir degisken çati bölge sekansini içerir.
Bir baska yönünde mevcut bulus, yukarida açiklandigi gibi agir ve/veya hafif zincir CDR'leri içeren ve ayrica IGHV, IGHV2-70*O1 (SEKANS TANIM NO: 20), IGHV, IGHV2- olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesini, tercihen IGHV insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Agir zincir degisken çati bölgesi, bu insan genlerinin ürününde bulunan veya bunlardan elde edilen bir veya daha fazla (örn. bir, iki, üç ve/veya dört) agir zincir çati bölgesi sekansini (örn. çati 1 (FW1), çati 2 (FW2), çati 3 (FW3) ve/veya çati 4 (FW4)) içerebilir. Tercihen agir zincir degisken bölge çatisi IGHV2-70*10 (SEKANS TANIM NO: 19), lGHV, lGHV2-70*13 (SEKANS TANIM NO: 21), IGHV ve IGHV2-70*11'den (SEKANS TANIM NO: 23) olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürününde bulunan veya bundan elde edilen FW1, FW2 ve/veya FW3, daha tercihen FW1, FW2 ve FW3'ü içerir. Burada kullanildigi haliyle agir zincir çati bölge sekanslari FW1 (pozisyon 1 ila ve FW 4'ü (pozisyon 103 ila pozisyon 113) içermekte olup, burada amino asit pozisyonu Kabafta verilen numaralandirma sistemi kullanilarak gösterilir.
Bazi uygulamalarda mevcut açiklama bir antikor veya bunun fragmanini saglamakta olup, burada antikor veya bunun fragmani lGHV insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesi içerir ve burada agir zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun ilgili agir zincir degisken çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonunu içerir.
Bazi uygulamalarda mevcut açiklama, SEKANS TANIM NO: 32'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansini içeren bir antikoru veya bunun fragmanini saglar ve burada agir zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun ilgili agir zincir degisken çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonunu içerir. amino asit pozisyonlarinda, en çok tercih edilen haliyle 35b amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu içermekte olup, burada her grup üyesinin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir. Spesifik olarak amino asit olusan gruptan seçilen bir amino asit sübstitüsyonu içerirken, 835bG en çok tercih edilen amino asit sübstitüsyonu olup, burada her grup üyesinin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir.
Bir baska yönünde mevcut bulus, IGHV, IGKV1- olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesini, tercihen IGKV insan geninin ürünü olan veya bundan olusan bir hafif zincir degisken çati bölgesini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Hafif zincir degisken bölge çati bölgesi, bu insan genlerinin ürününde bulunan veya bunlardan elde edilen bir veya daha fazla (örn. bir, iki, üç ve/veya dört) hafif zincir çati bölgesi sekansini (örn. çati 1 (FWI), çati 2 (FW2), çati 3 (FW3) ve/veya çati 4 (FW4)) içerebilir. Tercihen hafif zincir degisken bölge çatisi V3-11*01 (SEKANS TANIM NO: 24), IGKV, IGKV1D-39*01 (SEKANS TANIM NO: 26), lGKV ve IGKV3-20*O1'den (SEKANS TANIM NO: 28) olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürününde bulunan veya bundan elde edilen FW1, FW2 ve/veya FW3, daha tercihen FW1, FW2 ve FW3'ü içerir. Burada kullanildigi haliyle hafif zincir çati bölge sekanslari FW1 ila pozisyon 88) ve FW 4'ü (pozisyon 98 ila pozisyon 108) içermekte olup, burada amino asit pozisyonu Kabat`ta verilen numaralandirma sistemi kullanilarak gösterilir.
Bazi uygulamalarda mevcut açiklama, lGHV insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesini içeren bir antikoru veya bunun fragmanini saglar ve burada hafif zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun hafif zincir degisken bölgesinin ilgili çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonunu içerir.
Bazi uygulamalarda mevcut açiklama, SEKANS TANIM NO: 39'un amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansini içeren bir antikoru veya bunun fragmanini saglar ve burada hafif zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun ilgili agir zincir degisken çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonunu içerir. seçilen amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu ve/veya 31. amino asit gruptan seçilen amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu ve/veya 31. amino asit pozisyonunda bir delesyon, en çok tercih edilen haliyle 46 ve/veya 47. amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu içerir, burada her grup üyesinin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir. Spesifik olarak gruptan seçilen bir amino asit sübstitüsyonu ve/veya T311de bir delesyon, tercihen seçilen bir amino asit sübstitüsyonu içermekle birlikte 46P, 47W özellikle tercih edilmektedir, burada her grup elemaninin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir.
Bazi uygulamalarda insan OX40'a baglanan antagonistik antikor veya bunun fragmani, V, olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesini ve V3-11*O1 (SEKANS TANIM NO: 24), lGKV, IGKV1D-39*O1 (SEKANS TANIM NO: 26), IGKV ve IGKV3- olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesini, tercihen V2- insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesini ve V insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesini içerir. Ayni zamanda yukarida bahsedilen farkli insan genlerinin ürününde bulunan veya bundan elde edilen agir zincir degisken çati bölgelerinin ve/veya yukarida bahsedilen farkli insan genlerinin ürününde bulunan veya bundan elde edilen hafif zincir degisken çati bölgelerinin kombinasyonlari da mevcut bulusta kapsanir.
Insan agir ve hafif zincir degisken bölge genleri için germ hatti DNA sekanslari adresinden Internet'te bulunabilir) ve ayrica Kabat EA ve arkadaslari, baska örnek olarak, insan agir ve hafif zincir degisken bölge genleri için germ hatti DNA sekanslari Genbank veritabaninda bulunabilir.
Bir baska yönünde mevcut açiklama ayrica, içerisindeki agir zincir CDR'Ierin en az birinin ve/veya hafif zincir CDR'lerin en az birinin en az bir amino asit modifikasyonu içerigi, insan OX40ta baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Modifikasyonlari uygulamak için alana yönlendirilmis mutajenez veya PCR aracili mutajenez gerçeklestirilebilir ve antikor baglanmasi üzerine etkisi veya bir diger ilgili fonksiyonel özelligi in vitro veya in vivo testlerde degerlendirilebilir. Tercihen konservatif modifikasyonlar yapilabilir. Bu modifikasyonlar amino asit sübstitüsyonlari, adisyonlari veya delesyonlari olabilmekle birlikte tercihen sübstitüsyonlardir. Tipik olarak bir CDR bölgesi içerisinde besten fazla, tercihen dörtten fazla, daha etrcihen üçten fazla, daha da tercihen ikiden fazla, en çok tercih edilen haliyle birden fazla amino asit modifikasyonu gerçeklestirilmez.
Belirli uygulamalarda çati sekanslari varyant antikorlar üretmek üzere degisken bölgeleri mühendislikle tasarlamak için kullanilabilir. Bulusun varyant antikorlari, örnegin antikorun özelliklerini gelistirmek üzere VH ve/veya VK içerisindeki çati kalintilarda modifikasyon yapilanlari içerir. Tipik olarak bu çati modifikasyonlari antikorun immünojenesitesini azaltmak için yapilir. Örnegin, bir yaklasim ilgili murin sekansinda bir veya daha fazla çati kalintisinin “ters mutasyona ugratilmasi” veya ilgili germ hatti sekansinda bir veya daha fazla çati kalintisinin “ters mutasyona ugratilmasidir”.
Dolayisiyla bir baska yönünde mevcut açiklama, içerisindeki insanlastirilmis antikorun veya bunun fragmaninin agir zincir degisken bölgesinin çati bölge sekanslarindan en az birinin ilgili murin antikorunun agir zincir degisken bölgesinin ilgili çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonu içerdigi, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Tercihen amino asit modifikasyonu bir amino asit sübstitüsyonudur. Tipik olarak bir çati bölgesi içerisinde altidan fazla, tercihen besten fazla, tercihen dörtten fazla, daha etrcihen üçten fazla, daha da tercihen ikiden fazla, en çok tercih edilen haliyle birden fazla amino asit modifikasyonu gerçeklestirilmez. Bazi uygulamalarda mevcut açiklama, içerisindeki agir zincir degisken bölgesinin çati bölgelerinin amino asit modifikasyonunun 23, 35b, 48, 50, 60 ve 62'den olusan gruptan seçilen amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu içerdigi, insan OX40ia baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglamakta olup, burada her grup üyesinin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir. Agir zincir degisken bölgesinin çati bölgelerinin seçilen amino asit pozisyonlarindadir. Agir zincir degisken bölgesinin çati bölgelerinin olusan gruptan seçilirken, 35bG, agir zincir degisken bölgesinin çati bölgelerinin en çok tercih edilen amino asit sübstitüsyonudur.
Mevcut açiklama ayrica, içerisindeki insanlastirilmis antikorun veya bunun fragmaninin hafif zincir degisken bölgesinin çati bölge sekanslarindan en az birinin, ilgili murin antikorunun hafif zincir degisken bölgesinin ilgili çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonu içerdigi, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Tercihen amino asit modifikasyonu bir amino asit sübstitüsyonudur ve/veya bir amino asit delesyonudur. Tipik olarak bir çati bölgesi içerisinde altidan fazla, tercihen besten fazla, tercihen dörtten fazla, daha etrcihen üçten fazla, daha da tercihen ikiden fazla, en çok tercih edilen haliyle birden fazla amino asit modifikasyonu gerçeklestirilmez. Bazi uygulamalarda mevcut açiklama bir insanlastirilmis antikor veya bunun fragmanini saglamakta olup, burada hafif zincir degisken bölge sekansinin çati bölgelerinin amino asit modifikasyonu 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56 ve 71'den olusan gruptan seçilen amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu ve/veya 31. amino asit pozisyonunda bir delesyonu içerir. Hafif zincir degisken bölge sekansinin çati bölgelerinin daha tercih edilen amino asit ve 71Y'den olusan gruptan seçilen bir sübstitüsyonu içermekte olup, burada her grup üyesinin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir. Hafif zincir degisken bölge sekansinin çati bölgelerinin en çok tercih edilen amino asit olusan gruptan seçilen bir sübstitüsyonu içermekle birlikte 46P ve/veya L47W özellikle tercih edilir. Bazi uygulamalarda mevcut bulusun insanlastirilmis antikoru veya bunun fragmani yukarida verildigi gibi agir zincir degisken bölge sekansinin çati bölgelerinin amino asit modifikasyonlarini ve yukarida verildigi gibi hafif zincir degisken bölge sekansinin çati bölgelerinin amino asit modifikasyonlarini içerir. olusan gruptan seçilen, tercihen SEKANS TANIM NO: 58, 59, 79 ve 80'den olusan gruptan seçilen ve daha tercihen SEKANS TANIM NO: 58 ve 59'dan olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Mevcut açiklama ayrica, seçilen, tercihen SEKANS TANIM NO: 60, 86, 87 ve 89”dan olusan gruptan seçilen, daha tercihen SEKANS TANIM NO: 60ldan olusan gruptan seçilen bir hafif zincir degisken bölgesini içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bazi uygulamalarda insan OX40'a baglanan antagonistik olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS TANIM NO: 30, degisken bölgesi içerir. Bu agir ve hafif zincir degisken bölge sekanslarinin her birinin insan OX40'a baglanabildigi dikkate alindiginda, agir ve hafif zincir degisken bölge sekanslari bulusa ait anti-OX40 baglama moleküllerini olusturmak üzere “karisik ve eslesmis” olabilir. Bu “karisik ve eslesmis” antikorlarin OX40 baglanmasi örnegin Örneklerde açiklanan baglanma testleri ile test edilebilir.
Bazi uygulamalarda insan OX40'a baglanan antagonistik antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 58 ve 59'dan olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS TANIM NO: 60 ve 89'dan olusan gruptan seçilen bir hafif zincir degisken bölgesi içerir. Daha fazla tercih edilen uygulamalarda insan OX40'a baglanan antagonist antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 58'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS TANIM NO: 60'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi, SEKANS TANIM NO: 58”in amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS TANIM NO: 89'un amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi, SEKANS TANIM NO: 59'un amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS TANIM NO: 60'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi veya SEKANS TANIM NO: 59'un amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS TANIM NO: 89lun amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi içerir. En çok tercih edilen SEKANS TANIM NO: 58 ve 59'dan olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken bölgesi ve SEKANS TANIM NO: 60,in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölgesi içeren, insan OX40ya baglanan bir antagonistik antikor veya bunun fragmanidir. olusan gruptan seçilen, tercihen SEKANS TANIM NO: 35, 36, 37 ve 38'den olusan gruptan seçilen ve daha tercihen SEKANS TANIM NO: 37 ve 38'den olusan gruptan seçilen bir agir zincir degisken sekansi içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Mevcut açiklama ayrica, seçilen, tercihen SEKANS TANIM NO: 45, 46, 47 ve 49'dan olusan gruptan seçilen, daha tercihen SEKANS TANIM NO: 47'den olusan gruptan seçilen bir hafif zincir sekansi içeren, insan OX40,a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Bazi uygulamalarda insan OX40'a baglanan antagonistik antikor ve hafif zincir degisken bölge sekanslarinin her birinin insan OX40'a baglanabildigi dikkate alindiginda, agir ve hafif zincir degisken bölge sekanslari bulusa ait anti- OX40 baglama moleküllerini olusturmak üzere “karisik ve eslesmis" olabilir. Bu baglanma testleri ile test edilebilir.
Bazi uygulamalarda insan OX40'a baglanan antagonistik antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 37 ve 38'den olusan gruptan seçilen bir agir zincir sekansi ve SEKANS TANIM NO: 47 ve 49,dan olusan gruptan seçilen bir hafif zincir sekansi içerir. Daha fazla tercih edilen uygulamalarda insan OX40*a baglanan antagonistik antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 37,nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansi ve SEKANS TANIM NO: 47fnin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi, SEKANS TANIM NO: 37'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansi ve SEKANS TANIM NO: 49”un amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi, SEKANS TANIM NO: 38'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansi ve SEKANS TANIM NO: 47”nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi veya SEKANS TANIM NO: 38”in amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansi ve SEKANS TANIM NO: 49'un amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi içerir. En çok tercih edilen SEKANS TANIM NO: 37 ve 38'den olusan gruptan seçilen bir agir zincir sekansi ve SEKANS TANIM NO: 47fnin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikor veya bunun fragmanidir.
Mevcut açiklamanin bir uygulamasinda antagonistik antikor veya bunun fragmani bir murin antikoru, kimerik antikor veya insanlastirilmis antikor, tercihen bir insanlastirilmis antikor, daha tercihen bir monoklonal murin antikoru, bir monoklonal kimerik antikor veya bir monoklonal insanlastirilmis antikordur.
Mevcut açiklama ayrica insan OX40'a baglanan bir monovalan antikor veya bunun fragmanini, yani tek bir antijan baglayici koldan olusan bir antikoru saglar. Mevcut açiklama ayrica Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, bispesifik tek zincir Fv dimerler, diabodyler, triabody'ler ve ayni veya farkli bir antikora genetik olarak kaynastirilmis scFv'den olusan gruptan seçilen insan OX40,a baglanan bir antikorun bir fragmanini saglar. Tercih edilen fragmanlar scFv, bispesifik tek zincir Fv dimerler ve diabody'lerdir. Mevcut açiklama ayrica insan OX40la baglanan bir tam boy antikor Mevcut açiklama ayrica insan OX40'a baglanan bir antikor veya bunun fragmanini saglamakta olup, bu ayrica bir agir ve/veya hafif sabit bölge, özellikle bir insan agir ve/veya bir insan hafif sabit bölge içerir. Insan agir sabit bölgeleri IgG1 (IGHG1), (IGHM), lgD (lGHD) veya IgE (lGHE)'den olusan insan immünoglobulinlerin grubundan seçilebilirken, insan agir zincir sabit bölgesi IgG, özellikle IgG1 (lGHGi) tercih edilir. Insan hafif sabit bölgesi kappa veya Iambda sabit bölgelerinden olusan insan immünoglobulinlerin grubundan seçilebilirken, insan kappa sabit bölgesi tercih edilir. Tercih edilen bir uygulamada insan OX40'a baglanan antagonistik antikor veya bunun fragmani insan IgG1 (lGHGf) agir sabit domenini ve insan hafif kappa sabit domenini içerir. Çati bölgeleri veya CDR bölgeleri içerisinde yapilan modifikasyonlara ek olarak veya alternatif olarak, bulusun antikorlari FC bölgesi içerisindeki modifikasyonlari kapsamak, tipik olarak antikorun bir veya daha fazla fonksiyonel özelligini, mesela serum yari ömrünü, kompleman fiksasyonunu, Fc reseptör baglanmasini ve/veya antijene bagimli hücresel sitotoksisitesini degistirmek üzere mühendislikle tasarlanabilir. Ayrica, bulusun antikoru kimyasal olarak modifiye edilebilecegi gibi (örn. bir veya daha fazla kimyasal parça antikora baglanabilir) glikosilasyonunu degistirmek amaci ile de modifiye edilebilir. Bu uygulamalarin her biri asagida daha detayli olarak tarif edilmektedir. Asagida ana hatlariyla belirtildigi gibi Fc bölgesi içerisindeki modifikasyonlar Fc bölgesindeki kalintilarin AB numaralandirmasina göredir. Bir uygulamada CH1'in mentese bölgesi, mentese bölgesindeki sistein kalintilarinin sayisinin degistirilecegi sekilde, bir diger deyisle artirilacagi veya azaltilacagi sekilde modifiye edilir. Bu yaklasim ayrica Bodmer ve arkadaslarina ait ,677,425 sayili ABD patent belgesinde açiklanmaktadir. CH1'in mentese bölgesindeki sistein kalintilarinin sayisi örnegin hafif ve agir zincirlerin birlestirilmesini kolaylastirmak veya antikorun stabilitesini artirmak veya azaltmak için degistirilir. Bir baska uygulamada bir antikorun Fc mentese bölgesi antikorun biyolojik yari ömrünü azaltmak için mutasyona ugratilir. Daha belirgin olarak, Fc mentese fragmaninin CH2-CH3 domeni arayüz bölgesine, antikorun natif Fc mentese domeni SpA baglanmasina göre bozulmus Stafilokokal protein A (SpA) baglanmasina sahip olacagi sekilde bir veya daha fazla amino asit mutasyonu uygulanir. Bu yaklasim Ward ve arkadaslarina ait 6,165,745 sayili ABD patentinde daha detayli açiklanmaktadir. Bir baska uygulamada antikor biyolojik yari ömrünü artirmak için modifiye edilmektedir. Muhtelif yaklasimlar mümkündür. Örnegin, asagidaki mutasyonlardan biri veya daha fazlasi uygulanabilir: Ward adina duran 6,277,375 biyolojik yari ömrü artirmak amaci ile antikor CH1 veya CL bölgesi içerisinde patent belgelerinde açiklandigi gibi bir IgG'nin Fc bölgesinin CH2 domeninin iki halkasindan alinan bir kurtarma reseptörü baglayici epitopu içerir. Bir baska uygulamada FC bölgesi, antikorun efektör fonksiyonlarini degistirmek üzere en az bir amino asit kalintisinin farkli bir amino asit kalintisi ile ikame edilmesi yoluyla 322iden seçilen bir veya daha fazla amino asit, antikorun bir efektör ligandi için degistirilmis afiniteye sahip olacagi ancak ana antikorun antijen baglama kabiliyetini koruyacagi sekilde farkli bir amino asit kalintisi ile ikame edilebilir. Kendisine yönelik afinitenin degistirildigi efektör ligandi örnegin bir FC reseptörü veya C1 kompleman bileseni olabilir. Bu yaklasim her ikisi de Winter ve arkadaslarina ait olan açiklanmaktadir. Bir baska örnekte, amino asit kalintilari 329, 331 ve 322'den seçilen bir veya daha fazla amino asit, antikorun degistirilmis C1q baglanmasi olacagi ve/veya azaltilmis veya kaldirilmis komplemana bagimli sitotoksisiteye (CDC) sahip olacagi sekilde farkli bir amino asit kalintisi ile ikame edilebilir. Bu yaklasim Idusogie ve arkadaslarina ait 6,194,551 sayili ABD patentinde daha ayrintili olarak açiklanmaktadir. Bir baska örnekte, CH2 domeninin N-terminal bölgesindeki amino asit pozisyonlari 231 ila 238 içerisindeki bir veya daha fazla amino asit kalintisi, antikorun komplemani fiske etme kalibiyetini degistirmek üzere degistirilir. Bu yaklasim Bodmer ve arkadaslarina ait WO94/29351 sayili PCT yayininda daha fazla açiklanmaktadir. Yine bir baska örnekte Fc bölgesi, asagidaki pozisyonlardaki bir veya daha fazla amino asidi modifiye ederek antikorun antikora bagimli hücresel sitotoksisiteye (ADCC) aracilik etme ve/veya bir Fcy reseptörü için antikorun ayrica Presta adina olan WOOO/42072 sayili PCT yayinda açiklanmaktadir.
Mevcut açiklama ayrica, insan agir ve/veya hafif sabit bölgelerini içeren insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglamakta olup, burada insan agir sabit bölgesi CH1 bölgesini, mentese bölgesini, CH2 bölgesini ve insan IgG4'ten (IGHG4) CH3 bölgesini içeren bir izotipik varyanti içerir ve burada mentese bölgesi 228. pozisyonda serin prolinle sübstitüsyonunu içerir. Tercihen izotipik varyanti içeren insanlastirilmis antikor bir tam boy antikordur. Insan IgG4'ten (IGHG4) CH1`i, menteseyi ve insan lgG4'ten (lGHG4) CH2 ve CH3”ü içeren bir izotipik varyanti içeren, insan OX40'a baglanan özellikle tercih edilen insanlastirilmis antikor veya bunun fragmani, SEKANS TANIM NO: 57'nin amino asit sekansini Içeren bir agir zincir sekansi ve SEKANS TANIM NO: 47'nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi içerir.
Izotipik varyantin, insan IgGi'den (IGHG1) bir insan agir sabit bölgesi (genellikle bir natif insan lgG1'dir) içeren insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikor veya bunun fragmani ile kiyaslandiginda, yani izotipik varyanttan yalnizca modifiye edilmis agir sabit bölge bakimindan farklilik gösteren insan OX40ia baglanan bir antagonistik antikor veya bunun fragmani ile kiyaslandiginda ADCC gibi FC aracili sitotoksisite mekanizmalari sergilemedigi bulunmustur.
Mevcut açiklama ayrica, bir insan lgG Fc bölgesi içeren insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglamakta olup, burada insan lgG FC bölgesine baglanan matür çekirdek karbonhidrat yapisinda fukoz bulunmaz (burada alternatif olarak “fukosile edilmemis” olarak anilir). Tercihen, antikor bir insan lgGi (IGHG1) FC bölgesi içermekte olup, burada insan IgGi (IGHG1) Fc bölgesine bagli matür çekirdek karbonhidrat yapisinda fukoz bulunmaz. Bir insan IgGi (lGHGi) Fc bölgesi içeren tam boy antikor daha fazla tercih edilmekte olup, burada insan IgGi (IGHG1) Fc bölgesine bagli matür çekirdek karbonhidrat yapisinda fukoz bulunmaz.
WOO3/035835 sayili belgeden insan lgG Fc bölgesine bagli matür çekirdek karbonhidrat yapisinda fukoz bulunmamasinin ADCC'yi artirabildigi bilinmektedir. Bu nedenle bir baska uygulamada mevcut açiklamanin antagonist antikoru veya bunun fragmani bir insan lgGi (IGHG1) Fc bölgesini içermekte olup, burada insan IgGi (IGHG1) Fc bölgesine bagli matür çekirdek karbonhidrat yapisinda fukoz bulunmazken, fukoz bulunmayan antikor ana insanlastirilmis antikora veya bunun fukoz bulunmayan fragmanina kiyasla artirilmis ADCC sergiler. Fukoz bulunmayan antikorlari üretmek için yöntemler örnegin sunlardir: (a) içerisinde eksprese edilen proteinleri fukosilleme açisindan düsük kabiliyeti olacagi sekilde (veya olmayacagi sekilde) fukoz metabolizmasi bakimindan eksik olan islenmis veya mutant konak hücrenin kullanilmasi; (b) hücreleri fukosilasyonu önleyen veya azaltan kosullar altinda kültürleme; (c) fukozun post-translasyonel uzaklastirilmasi (örn. bir fukosidaz enzimi ile); (d) örnegin glikosillenmemis bir glikoproteinin rekombinant ekspresyonundan sonra istenen karbonhidratin post-translational ilavesi; veya (e) fukosile edilmemis ürünü seçmek için glikoproteinin saflastirilmasi. Tercihen örnegin Longmore ve arkadaslari, (1982) Carbohydr. Res. 365-92 veya Imai-Nishiya ve arkadaslari, (2007), BMC Biotechnol. 7: 84 içerisinde açiklanan yöntemlerdir.
Mevcut bulusla ayrica, insan OX40'a baglanan ve SEKANS TANIM NO. 7'nin amino asit sekansini içeren agir zincir degisken sekansi ve/veya SEKANS TANIM NO. 8'in amino asit sekansini içeren hafif zincir degisken sekansi içeren antikor ile ayni epitopa baglanan bir antagonist antikor veya bunun fragmani saglanir. Mevcut bulusla ayrica, mevcut bulusla saglanan bir antikorun, özellikle SEKANS TANIM NO. 7”nin amino asit sekansini içeren agir zincir degisken sekansini ve/veya SEKANS TANIM NO. 8'in amino asit sekansini içeren hafif zincir degisken sekansini içeren bir antikorun baglandigi, insan OX40'in, özellikle insan OX40 reseptör ekstrasellüler domeninin spesifik bir bölgesi veya epitopu saglanir. Insan OX40 polipeptidinin bu spesifik bölgesi veya epitopu, mevcut bulusla saglanan antikorlarin herhangi biri ile kombinasyon halinde alanda bilinen herhangi bir uygun haritalama yöntemi ile tanimlanabilir. Bu yöntemlerin örnekleri arasinda, antikorun tanidigi epitopun sekansini içeren antikora spesifik olarak baglanabilen en küçük fragmanla birlikte, mevcut bulusun antikoruna baglanmak için OX40*tan elde edilen degisen boylarda peptitlerin taranmasi yer alir. OX40 peptitleri yapay olarak üretilebilecegi gibi OX40 polipeptidinin proteolitik parçalanmasi ile de üretilebilir. Antikora baglanan peptitler örnegin kütle spektrometrik analizi ile tanimlanabilir. Bir baska örnekte NMR spektroskopisi veya X-isini kristallografisi mevcut bulusun antikorunun baglandigi epitopu tanimlamak için kullanilabilir. Tanimlandiktan sonra mevcut bulusun antikoruna baglanan epitopik fragman gerekirse ayni epitopa baglanan ek antagonistik antikorlari elde etmek için immünojen olarak kullanilabilir.
Anti-OX40 antikor özellikleri Örnegin ELlSAs, BIAcore®, Western blot, RIA ve akis sitometrisi analizi dâhil olmak üzere, antikorlarin örnegin insan OX40,a yönelik baglanma kabiliyetini degerlendirmek üzere standart testler alanda bilinir. Uygun testler Örneklerde ayrintili olarak açiklanmistir. Antikorlarin baglanma kinetikleri (örn. KD gibi baglama afinitesi) Scatchard veya BIAcore® sistem analizi gibi alanda bilinen standart testlerle de degerlendirilebilir. Göreceli baglama afinitesi Ki alanda bilinen standart kompetisyon testleriyle degerlendirilebilir.
Mevcut bulus bir baska yönünde insan OX40'a baglanan ve rekombinant insanlastirilmis antikor efalizumaba göre doza bagli olarak daha yüksek derecede Insan Karisik Lenfosit Tepkimesini (MLR) bloke eden antagonistik antikorlari veya bunlarin fragmanlarini saglar. Rekombinant insanlastirilmis antikor efalizumab, lenfosit fonksiyonu ile iliskili antijen 1'in bir alt birimi olan CD11'e baglanir. MLR, Örnek 3'e göre yürütülebilir ve ölçülebilir.
Mevcut bulus bir baska yönünde insan OX40'a baglanan ve ayrica sinomolgus maymunu OX40iini taniyabilen antagonistik antikorlari veya bunlarin fragmanlarini saglar. Bir antagonistik anti-OX40 antikorunun hem insan hem de sinomolgus maymunu periferik kan mononükleer hücrelerine (PBMC) baglanmasi, Örnek 4'e göre ve Sekil 3'te gösterildigi gibi yürütülebilir ve ölçülebilir. Antikorun insan ve sinomolgus maymunu aktive Ienfositlerinin yüzeyinde eksprese edilen OX40`i tanidigi görülmüstür, bu da bu antikorun çapraz reaktif özellikleri olduguna isaret eder.
Mevcut bulus bir baska yönünde, örnegin bir BIAcore® cihazinda (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) Yüzey Plazmon Rezonansi (SPR) teknigiyle antikorun bir protein-A bagli CM5 arastirma sinifi sensör çipinde (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre; BR-1000-14) Örnek 5'te ve 6'de ayrintilari verildigi ve Sekil 4'te gösterildigi gibi analit olarak kullanilan bir rekombinant monovalan insan OX40 reseptörü ekstrasellüler domeniyle (SEKANS TANIM NO:11) birlikte yakalanmasi yoluyla ölçülecek sekilde 500 nM veya daha az, tercihen 200 nM veya daha az, daha çok tercihen 150 nM veya daha az, daha çok tercihen 120 nM veya daha az, hatta daha çok tercihen insan OX40'a, özellikle izole formda insan OX40'a baglanan antagonistik antikorlari veya bunun fragmanlarini saglar. Burada OX40 reseptörü kullanilarak afinite ölçümleriyle ilgili olarak kullanildigi haliyle “monovalan" ifadesi, örnegin domen bir immonoglobulin FC bölümüne amino terminal olarak kaynatilmissa olacagi gibi suni olarak dimerize veya multimerize olmayan, ekstrasellüler domen gibi bir insan OX40 reseptör domenine atifta bulunur. Mevcut bulus tercih edilen bir yönünde ilgili kimerik antikorun OX40 baglama afinitesinin (KD) en az %75'ini koruyan bir insanlastirilmis antikoru veya bunun fragmanini saglar. Tercihen insanlastirilmis antikor veya bunun fragmani, ilgili kimerik antikora esdeger afiniteyle insan OX40'a baglanir. “Esdeger afiniteyle” ilgili kimerik antikorun OX40 baglama afinitesinin ±%10 araliginda olan bir afinite degeri kastedilmektedir. Daha çok tercihen mevcut bulus, insan OX40'a ilgili kimerik antikordan daha yüksek bir afiniteyle baglanan bir insanlastirilmis antikoru veya bunun fragmanini saglar. Mevcut bulusun tercih edilen bir yönünde, örnegin bir BIAcore® cihazinda (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) Yüzey Plazmon Rezonansi (SPR) teknigiyle antikorun bir protein-A bagli CM5 arastirma sinifi sensör çipinde (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre; BR-1000-14) Örnek 5'te ve 6'de ayrintilari verildigi ve Sekil 4'te gösterildigi gibi analit olarak kullanilan bir rekombinant monovalan insan OX40 reseptörü ekstrasellüler domeniyle (SEKANS TANIM NO:11) birlikte yakalanmasi yoluyla ölçülecek sekilde 110 nM veya daha az, tercihen 100 nM veya daha az, daha çok tercihen 90 nM veya daha az, daha çok tercihen 80 nM veya daha az, hatta daha çok tercihen 70 nM veya daha az afiniteyle (Ko) insan OX40,a baglanan antagonistik antikorlari veya bunun fragmanlarini saglar.
Mevcut bulusun farkli bir yönü, insan OX40”a baglanan ve iyi termal kararliligi olan antagonistik antikorlari veya bunlarin fragmanlarini saglar. Tercih edilen bir uygulamada insan OX40,a baglanan bir antegonistik insanlastirilmis antikorun veya bunun fragmaninin, 70°Ciden büyük, tercihen 75°C'den büyük, daha çok tercihen 80°Ciden büyük ve hatta daha çok tercihen 85°C'den büyük bir FAB fragmani termostabilite sicakligi vardir. FAB fragmaninin termostabilite analizi için diferansiyel tarama kalorimetre ölçümleri kullanilirken FAB fragmaninin tem boy lgG baglaminda bir orta nokta erime sicakligi belirlenir. Bu tür kalorimetrik ölçümler, alanda uzman kisiler tarafindan bilinirler ve Örnek 6'de açiklandigi ve Sekil 6'de gösterildigi gibi yürütülebilirler.
Mevcut bulus bir baska yönünde insan OX40 ekstrasellüler bölgesindeki bir epitopa baglanan antagonistik antikorlari veya bunlarin fragmanlarini açiklar. Örnek Tde açiklandigi ve Sekil 7'de gösterildigi gibi, OX40 ekstrasellüler bölgesinin dört domeninden biri veya daha fazlasi, insan ve siçan sekanslari ve üretilen Fc füzyon proteinleri arasinda takas edilir. Ardindan bir antagonistik insanlastirilmis antikorun, insan OX40 ekstrasellüler bölgesindeki, siçan OX40 ekstrasellüler bölgesindeki ve dört insan-siçan kimerik proteinindeki reaktivitesini test etmek için bir baglayici ELISA yürütülmüstür. Bu nedenle mevcut bulus, insan OX40 ekstrasellüler bölgesinin ikinci domeni içinde eslesen bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Mevcut bulus ayrica immün reaksiyonlarini baskilamak için kullanilabilecek antagonistik antikorlari veya bunlarin fragmanlarini saglar. Bir antagonistik insanlastirilmis anti-OX40 antikorun etkisi, alloreaktif T hücre aktivasyonu ve proliferasyonunun in vitro modeli olarak kullanilan bir MLRide (bkz. Örnek 8) test edilen PBMC karistirilmis, bu T hücrelerin aktivasyonuna ve T lenfositlerin proliferasyonuna yol açmistir. Ek olarak, ADCC gibi sitotoksik mekanizmalarin MLR inhibisyonuna katkisini belirlemek için antagonistik insanlastirilmis anti-OX40 antikorunun üç farkli formati bu testte test edilmistir: bir IgG1 (IGHG1) formati, bir fukosile edilmemis lgG1 (IGHG1) formati ve bir IgG4 (IGHG4) formati. Antagonistik insanlastirilmis anti-OX40 antikoru, yaklasik 100 ng/mL EC50 degerleriyle iki farkli bireyde (yanit veren) MLR'yi etkili sekilde inhibe etmistir. Öte yandan sonuçlar kullanilan antikorun formatina bagli olan bir farki göstermistir. Birinci bireyde (yanit veren 1), T hücre reaktivitesi IgG1 (IGHG1) ve lgG4 (IGHG4) antikor formatlariyla etkili sekilde inhibe edilmistir, bu da sitotoksik mekanizmalarin bu birey için kritik olmadigini gösterir. Ikinci birey (yanit veren 2) için lgG1 (IGHG1) formati %60'tan fazla inhibisyon saglamisken IgG4 (IGHG4) formati MLR'yi yalnizca yetersiz sekilde bloke etmistir. Her iki bireyde de fukosile edilmemis IgG1 (IGHG1) formati MLRiyi inhibe etmede çok etkili olmustur. Bu sonuçlar, OX40 aktivasyonunun bloke edilmesinin bazi bireylerde MLR'yi inhibe etmede yeterli olabilecegini ancak bu etkinin ek sitotoksik mekanizmalarla büyük ölçüde artirilabilecegini gösterir. Bu nedenle OX40 aracili rahatsizliklardan muzdarip olan hastalarin tedavisi için ve bozuklugun hastalarin OX40 kostimülatör durumundan bagimsiz göründügü yerlerde, örnegin düsük OX40 ekspresyon seviyeleri, insan OX40'a baglanan ve artirilmis sitotoksik mekanizmalari olan bir antagonistik antikorun veya bunun fragmaninin uygulanmasi özellikle etkili olabilir. Mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasi, bir OX40 aracili rahatsizliktan muzdarip olan bir hastanin tedavisi için insan OX40'a baglanan bir antagonistik insanlastirilmis antikor saglar. Ayrica hastanin düsük OX40 ekspresyon seviyeleri olabilir. Tercihen insan OX40ia baglanan antagonistik insanlastirilmis antikor, bir lgG1 (lGHG1) bölgesi içerir. Daha çok tercihen insan OX40'a baglanan antagonistik insanlastirilmis antikor, bir fukosile edilmemis lgG1 bölgesi içerir.
Mevcut bulusun bir baska yönünde, bir antagonistik antikorun veya bunun fragmaninin etkisi, SClD farelerinin insan PBMC'Ierier yeniden yapilandirildigi bir ksenojenik graft versus konak reaksiyonunda gösterilmistir. Bu reaksiyon, insan hastalarda kemik iligi nakli sonrasinda allojenik graft versus konak hastaligi (GVHD) için bir model saglar. Bu modelde insan PBMCileri ve özellikle T lenfositler, siddetli inflamatuvar semptomlarina yol açan fare konak hücrelerine karsi güçlü bir yanit baslatir. Örnek 9'de açiklandigi ve Sekil 9'da ve Tablo 10ida gösterildigi gibi, insan OX40'a baglanan bir antagonistik insanlastirilmis antikor 1 mg/kg dozda GVHD reaksiyonunu etkili sekilde baskilamistir. Sasirtici bir sekilde bu antikor, GVHD için kabul görmüs bir tedavi olan Enbrel®'den daha iyi bir etkililik göstermistir Xhaard A Pharmacother. 2(7): 1109-17). Dolayisiyla tercih edilen bir uygulamada mevcut bulus, insan OX40ta baglanan ve GVHD tedavisinde etkili olan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Tercihen antikorun bir denege uygulanmasi, vehikülün uygulanmasina kiyasla sagkalim medyaninda (gün) dört kat iyilesmeye yol açar. Daha çok tercihen antikorun bir denege uygulanmasi, Enbrel®'in uygulanmasina kiyasla sagkalim medyaninda (gün) iki kat iyilesmeye yol açar.
Dolayisiyla mevcut bulus, Enbrel®iin GVHDili hastayi tedavi etmede ve/veya GVHD'yi baskilamada daha etkili oldugu insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini saglar. Buna ek olarak, agonistik anti-OX40 baglayici antikorlarinin allojenik fare GVHD modellerinde (Valzasina B ve 101(9): 3741-8) GVHDtyi kötülestirdigi bildirilmistir, bu nedenle modelde GVHD kötülesmesi gözlemlenmediginden mevcut bulusun antagonistik antikorlarinin ve bunlarin fragmanlarinin baglayici insan OX40li üzerinde agonistik etkiler göstermedigi Örnek 9'dan çikarilabilir. Dolayisiyla mevcut bulus, baglama üzerinde agonistik aktivite göstermeyen, insan OX40'a baglanan bir insanlastirilmis antikoru veya bunun fragmanini saglar.
Nükleik asitler, Vektörler ve Konak Hücreler Mevcut açiklama ayrica insan OX40`a baglanan antikorlari ve bunlarin fragmanlarini kodlayan izole edilmis nükleik asitleri, vektörleri ve nükleik asiti veya vektörü içeren konak hücreleri saglar. Nükleik asitler tüm hücrelerde, bir hücre lizatinda veya kismen saflastirilmis veya büyük ölçüde saf formda bulunabilirler. Bir nükleik asit, diger sellüler bilesenlerden veya diger kirleticilerden, örnegin diger sellüler nükleik asitler veya proteinlerden, Alkalin/SDS islemi, CsCl bantlama, kolon kromatografisi, agaroz jel elektroforezi ve alanda iyi bilinen diger yöntemler dâhil olmak üzere standart tekniklerle saflastirildiginda "izole edilmis" veya "büyük ölçüde saflastirilmis" olur, bkz. örnegin F. Ausubel, ve arkadaslari, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley lnterscience, New York. Bulusun bir nükleik asiti örnegin DNA veya RNA olabilir ve intron sekanslarini içerebilir veya içermeyebilir. Tercih edilen bir uygulamada nükleik asit bir cDNA molekülüdür.
Bulusun nükleik asitleri, standart moleküler biyoloji teknikleri kullanilarak elde edilebilir, örnegin antikorun hafif ve agir Zincirlerini kodlayan veya VH ve VL segmentlerini kodlayan cDNA'Iar standart PCR amplifikasyonuyla veya cDNA klonlama teknikleriyle elde edilebilirler. Bir immünoglobulin gen kitapligindan (örn. faj görüntüleme teknikleri kullanilarak) elde edilen antikorlar için antikoru kodlayan bir veya birden fazla nükleik asit kitapliktan geri kazanilabilir. Konak hücrelere eksojen nükleik asitin saglanmasi yöntemleri alanda iyi bilinir ve kullanilan konak hücreye göre farklilik gösterecektir. Teknikler dekstran aracili transfeksiyonu, kalsiyum fosfat çökeltmeyi, kalsiyum klorürle islemeyi, polietilenimin aracili transfeksiyonu, polibren aracili transfeksiyonu, protoplast füzyonu, elektroporasyonu, viral veya faj enfeksiyonunu, lipozomlardaki polinükleotidlerin enkapsülasyonu ve DNA'nin çekirdeklere dogrudan mikro enjeksiyonunu kapsamakla bilikte bunlarla sinirli degildir. Memeli hücreleri durumunda transenfeksiyon geçici veya kalici olabilir.
Bulusun tercih edilen nükleik asit molekülleri, SEKANS TANIM NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37 ve 38”den olusan gruptan seçilen agir zincir sekansini kodlayanlar ve/veya seçilen hafif zincir sekansini kodlayanlardir. Bulusun tercih edilen nükleik asit seçilen agir zincir degisken bölgesini kodlayanlar ve/veya SEKANS TANIM NO: 30, degisken bölgesini kodlayanlardir.
Bulusun tercih edilen nükleik asit molekülleri, SEKANS TANIM NO: 8'in hafif zincir degisken bölgesini ve/veya SEKANS TANIM NO: 7'nin agir zincir degisken bölgesini kodlayanlardir, örnegin SEKANS TANIM NO:9'un nükleik asit sekansini içeren agir zincir degisken bölgesini kodlayan DNA ve/veya SEKANS TANIM NO: 10”un nükleik asit sekansini içeren hafif zincir degisken bölgesini kodlayan DNA. Bulusun daha çok tercih edilen nükleik asit molekülleri, SEKANS TANIM NO: 58 veya 59'un agir zincir degisken bölgesini ve/veya SEKANS TANIM NO: 60'in hafif zincir degisken bölgesini kodlayanlardir, örnegin SEKANS TANIM NO:61'in veya 62'nin nükleik asit sekansini içeren agir zincir degisken bölgesini kodlayan DNA ve/veya SEKANS TANIM NO: 63'ün nükleik asit sekansini içeren hafif zincir degisken bölgesini kodlayan DNA en çok tercih edilir.
VH ve VL segmentlerini kodlayan DNA fragmanlari elde edildiginde, bu DNA fragmanlari örnegin degisken bölge genlerinin tam boy antikor zincir genlerine dönüstürülmesi veya Fab fragman genleri gibi yukarida açiklanan fragmanlara karsilik gelen fragman genlerine veya bir scFV genine dönüstürülmesi için standart rekombinant DNA teknikleri tarafindan manipüle edilebilir. Bu manipülasyonlarda bir VL- veya VH-kodlayan DNA fragmani bir antikor sabit bölgesi veya bir esnek baglayici gibi farkli bir proteini kodlayan farkli bir DNA fragmanina islevsel sekilde baglanir. Bu baglamda kullanilan sekliyle “islevsel sekilde bagli” teriminin, iki DNA fragmaninin, iki DNA fragmani tarafindan kodlanan amino asit sekanslarinin çerçevede kalacagi sekilde birlestirilmesi anlamina gelmesi amaçlanir. VH bölgesini kodlayan izole edilmis DNA, VH-kodlayan DNA'nin agir zincir sabit bölgelerini (CH1, CH2 ve CH3) kodlayan farkli bir DNA molekülüne islevsel sekilde baglanmasiyla bir tam boy agir zincir genine dönüstürülebilir. Insan agir zincir sabit bölge genlerinin sekanslari alanda bilinir (bkz. örn. Kabat EA ve arkadaslari, yukarida) ve bu bölgeleri içeren DNA fragmanlari standart PCR amplifikasyonuyla elde edilebilir. Agir zincir sabit bölgesi bir lgG1 (lGHG1), IgG2 (lGHG2), IgG3 (lGHG3), IgG4 (IGHG4), lgA1 (IGHA1), lgA2 (lGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD) veya IgE (IGHE) sabit bölgesi olabilir ancak en çok tercihen bir lgG1 (lGHG1) sabit bölgesidir. Bir Fab fragmani agir zincir geni için VH-kodlayan DNA, yalnizca agir zincir CH1 sabit bölgesini kodlayan farkli bir DNA molekülüne islevsel sekilde baglanabilir. VL bölgesini kodlayan izole edilmis DNA, VL-kodlayan DNA'yi hafif zincir sabit bölgesini, CL, kodlayan farkli bir DNA molekülüne islevsel sekilde baglayarak bir tam boy hafif zincir genine (bir Fab hafif zincir geni) dönüstürülebilir. Insan hafif zincir sabit bölge genlerinin sekanslari alanda bilinir (bkz. örn. Kabat EA ve arkadaslari, yukarida) ve bu bölgeleri kapsayan DNA fragmanlari standart PCR amplifikasyonuyla elde edebilir. Tercih edilen uygulamalarda hafif zincir sabit bölgesi, bir kappa veya lambda sabit bölgesi, tercihen bir kappa sabit bölgesi olabilir. Bir scFv geni yaratmak için, VH- ve VL-kodlayan DNA fragmanlari, VH ve VL sekanslarinin bitisik tek zincir proteini olarak eksprese edilebilecegi ve VL ve VH bölgelerinin esnek baglayiciyla birlestirilecegi sekilde bir esnek baglayiciyi, örnegin amino asit sekansini (Gly4-Ser)3 kodlayan farkli bir fragmana islevsel sekilde baglanir (bkz. örnegin Bird RE ve arkadaslari, (1988) antikor fragmanlarinin üretimi için muhtelif teknikler gelistirilmistir. Geleneksel olarak bu fragmanlar intakt antikorlarin proteolitik parçalamasi ile elde edilmistir (bkz. örnegin Morimoto K ve arkadaslari, (1992) J. Biochem. & Biophysical Methods, 24: fragmanlar artik dogrudan rekombinant konak hücreleriyle üretilebilirler. Örnegin antikor fragmanlari, yukarida ele alinan antikor faj kitapliklarindan izole edilebilirler.
Alternatif olarak Fab'-SH fragmanlari dogrudan E. coli'den geri kazanilabilir ve F(ab')2 fragmanlarini olusturmak için kimyasal olarak baglanabilir (Carter P ve fragmanlari dogrudan rekombinant konak hücre kültüründen izole edilebilir. Antikor fragmanlarinin üretimine yönelik diger teknikler, uzmanlar için asikar olacaktir. Diger uygulamalarda seçilen antikor, tek zincirli Fv fragmanidir (scFv), bkz. örnegin WO sayili ABD Patenti. Antikor fragmani örnegin 5,641,870 sayili ABD Patentinde açiklandigi gibi bir “lineer antikor” da olabilir.
Mevcut bulusun antikorlarini kodlayan nükleik asitler, protein ekspresyonu için bir vektöre, tercihen bir ekspresyon vektörüne dâhil edilebilir. Protein ekspresyonu için çesitli ekspresyon vektörleri kullanilabilir. Ekspresyon vektörleri, kendi kendini yenileyen ekstrakromozomal vektörleri veya bir konak genomuna entegre olan vektörleri içerebilir. Ekspresyon vektörleri konak hücre tipiyle uyumlu olacak sekilde yapilandirilir. Bu nedenle mevcut bulusta kullanilan vektörler, tercihen ekspresyon vektörleri, memeli hücrelerinde, bakterilerde, böcek hücrelerinde, maya ve in vitro sistemlerde protein ekspresyonunu saglayanlari kapsarlar ancak bunlarla sinirli degildirler. Alanda bilindigi gibi, antikor ekspresyonu için mevcut bulusta kullanilabilecek çesitli ekspresyon vektörleri ticari olarak veya farkli sekillerde temin edilebilir.
Ekspresyon vektörleri genellikle kontrol veya regülatör sekanslari, seçilebilir markörler, füzyon ortaklari ve/veya ek elemanlari ile islevsel sekilde baglantili bir protein içerir. Burada “islevsel sekilde baglantili” ifadesiyle nükleik asitin farkli bir nükleik asit sekansiyla bir fonksiyonel iliski içine getirildigi kastedilir. "Regülatör sekans" teriminin, promotörleri, hizlandiricilari ve antikor zinciri genlerinin transkripsiyonunu veya translasyonunu kontrol eden diger ekspresyon kontrol elemanlarini (örn. poliadenilasyon sinyalleri) kapsamasi amaçlanir. Bu tür regülatör sekanslari örnegin Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)) kaynaginda açiklanirlar. Genel olarak bu ekspresyon vektörleri, antikoru kodlayan nükleik aside islevsel sekilde baglanmis olan transkripsiyonel ve translasyonel regülatör nükleik asiti kapsarlar ve genellikle proteini eksprese etmek için kullanilan konak hücreye uygun olurlar. Genel olarak transkripsiyonel ve translasyonel regülatör sekanslari, promotör sekanslarini, ribozomal baglama bölgelerini, transkripsiyonel baslangiç ve bitis sekanslarini, translasyonel baslangiç ve bitis sekanslarini ve hizlandirici veya aktivatör sekanslari kapsar. Yine alanda bilindigi gibi ekspresyon vektörleri genellikle ekspresyon vektörünü içeren transforme edilmis konak hücrelerinin seleksiyonuna imkân vermek için bir seleksiyon geni veya markörü içerirler. Seleksiyon genleri alanda iyi biiinirler ve kullanilan konak hücreye göre degisirler. Örnegin genellikle seçilebilir markör geni, vektörün saglandigi bir konak hücresinde G418, higromisin veya metotreksat gibi ilaçlara direnç saglar. Tercih edilen seçilebilir markör genleri, (metotreksat seleksiyonu/amplifikasyonuyla dhfr-konak hücrelerinde kullanim için) dihidrofolat redüktaz (DHFR) genini ve (G418 seleksiyonu için) neo genini kapsar.
Burada vektörlerdeki DNA'yi klonlamaya veya eksprese etmeye yönelik uygun konak hücreleri prokaryot, maya veya daha yüksek ökaryot hücrelerdir. Bu amaçla uygun prokaryotlar, örnegin Enterobacteriaceae, örnegin Escherichi'a, örnegin E. coli, Enterobacter, Klebsie//a, Proteus, Salmonella, örnegin, Salmonella typhimuri'um, Serratia, örnegin Serratia marcescans ve Shigella ve Bacilli, örnegin 8. subtilis ve B.
Iicheniformis, Pseudomonas, örnegin P. aeruginosa ve Streptomyces gibi gram negatif veya gram pozitif organizmalari kapsayan öbakterileri kapsarlar. Uygun E. coli klonlama konaklari, E. co/i, E. coli B, E. coli X1776 (ATCC kapsar. Prokaryotlara ek olarak filamentöz mantarlar veya maya gibi ökaryotik mikroplar uygun klonlama veya ekspresyon konaklaridir. Saccharomyces cerew'siae veya ortak ekmek mayasi, düsük ökaryotik konak mikro organizmalari arasinda en yaygin olarak kullanilan mayadir. Öte yandan Schizosaccharoriyces pombe; K. Iactis, K. frag/!is (ATCC WaItH (AJCC , K. thermotolerans veya K. marxianusyarrowia (EP402226) dâhil olmak üzere Kluyveromyces konaklari; Pichi'a Schwanniomyces occidenta/is gibi Schwanniomyces ve Neurospora, Penici//i'um, Tolypoc/adium veya A. nidu/ans veya A. niger gibi Aspergi/lus konaklar dâhil olmak üzere filamentöz mantarlar gibi bir dizi farkli cins, tür ve sus yaygin olarak mevcut ve yararlidir.
Bulusun antikorlarinin ekspresyonu için uygun olan konak hücreler, multisellüler organizmalardan elde edilirler. Omurgasiz hücrelerin örnekleri, plaril ve böcek hücrelerini kapsar. Spodoptera frugiperda (tirtil), Aedes augypti (sivrisinek), Aedes albopictus (sivrisinek), Drosophila melanogaster (meyve sinegi) ve Bombyx mori (ipek böcegi) gibi konaklardan muhtelif bakuloviral suslar ve varyantlar ve ilgili permisif böcek konak hücreleri belirlenmistir. Örnegin Autographa californica NPV'nin L-1 varyanti ve Bombyx mori NPV,nin Bm-5 susu gibi transenfeksiyonun çesitli viral suslari piyasadan temin edilebilir ve bu tür virüsler özellikle Spodoptera frugiperda hücrelerinin transenfeksiyonu için kullanilabilir. Pamuk, misir, patates, soya fasulyesi, petunya, domates ve tütünün bitki hücre kültürleri de konak olarak kullanilabilir.
Bulusun rekombinant antikorlarini eksprese etmeye yönelik konak hücreler tercihen memeli konak hücreleridir ve Çin Hamsteri Yumurtaligini (CHO hücreleri) (örnegin DHFR seçilebilir markörle birlikte kullanilan Urlaub G & Chasin LA (1980) Proc. Natl.
Acad. Sci, USA, 77: , NSO miyelom hücrelerini, COS hücrelerini ve SP2 hücrelerini kapsarlar. Özellikle NSO miyelom hücreleriyle kullanilmak üzere tercih edilen farkli bir ekspresyon sistemi, WO ve EP patentlerinde açiklanan GS gen ekspresyon sistemidir. Rekombinant antikor genleri, memeli konak hücrelerine saglandiginda, antikorlar konak hücrelerin, antikorun konak hücrelerinde ekspresyonuna veya daha çok tercihen antikorun konak hücrelerinin içinde büyüdügü kültür besiyerine sekresyonuna imkân tanimaya yeterli bir süreyle kültürlenmesiyle üretilirler. Insan OX407ina baglanan antikorlarin üretilmesi için yararli olan konak hücreler, çesitli besiyerlerde kültürlenebilirler. Ham's F10 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre), Asgari Temel Besiyer (MEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Basel, Isviçre) ve Dulbecco'nun Modifiye Edilmis Eagle Besiyeri ((DMEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH) gibi piyasada satilan besiyerler konak hücrelerin kültürlenmesine uygundur. Antikorlar, kültür besiyerinden standart protein saflastirma yöntemleri kullanilarak elde edilebilirler.
Antikorlar, eKSprese edilen proteinin hedeflenmesini, saflastirilmasini, taranmasini, görüntülenmesini ve benzerini saglamak için bir füzyon ortagina islevsel sekilde baglanabilir. Füzyon ortaklari, baglayici sekanslari araciligiyla antikor sekansina baglanabilir. Baglayici sekansi genellikle az sayida, genellikle ondan az amino asit içerecektir, bununla birlikte daha uzun baglayicilar da kullanilabilir. Genellikle baglayici sekanslari esnek ve bozunmaya dirençli olacak sekilde seçilirler. Alanda uzman olanlarin takdir edecegi gibi, çok çesitli sekanslar baglayici olarak kullanilabilir. Örnegin yaygin bir baglayici sekansi, amino asit sekansi GGGGS'yi içerir. Bir füzyon ortagi, antikoru ve iliskili füzyon ortaklarini istenen bir sellüler lokasyona veya ekstrasellüler besiyere yönlendiren bir hedefleme veya sinyal sekansi olabilir. Alanda bilindigi gibi, belirli sinyal sekanslari, büyüme besiyerine veya hücrenin iç ve dis zari arasinda yer alan periplazmik alana salgilanmasi için bir proteini hedef alabilir. Bir füzyon ortagi, saflastirmayi ve/veya taramayi saglayan bir peptidi veya proteini kodlayan bir sekans da olabilir. Bu tür füzyon ortaklarina, polihistidin etiketleri (His-etiketleri) (örnegin H6 ve H10 veya Immobilize Metal Afinitesi Kromatografi (IMAC) sistemleriyle (örn. Ni**2 afinite kolonlari) kullanilan diger etiketler), GST füzyonlari, MBP füzyonlari, Strep-tag, bakteriyel enzim BirA'nin BSP biyotinilasyon hedef sekansi ve antikorlar tarafindan hedeflenen epitop etiketleri (örn. c-myc etiketleri, bayrak etiketleri ve benzeri) dâhildir ancak bunlarla sinirli degildir.
Alanda uzmanlarin takdir edecegi gibi bu tür etiketler saflastirma, tarama veya her ikisi için yararli olabilirler.
Antikorlarin Yapisi ve Üretilmesi OX40 polipeptidine karsi üretilen antikorlar, bir hayvanin immünizasyonu, yani polipeptidlerin bir hayvana, tercihen insan disi bir hayvana, iyi bilinen ve rutin protokoller kullanilarak uygulanmasiyla elde edilebilirler, bkz. örnegin Handbook of Experimental lmmunology (Weir DM (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986) kitabi. Tavsanlar, fareler, siçanlar, koyunlar, inekler, develer veya domuzlar gibi pek çok sicak kanli hayvana bagisiklik kazandirilabilir. Öte yandan genellikle en çok uygun olanlar fareler, tavsanlar, domuzlar ve siçanlardir ve özellikle farelerdir. Antikorlar, uzman kisilerin bildigi rekombinant DNA teknikleriyle de üretilebilirler. Ayrica antikorlar, dogal olusumlu antikorlarin enzimatik veya kimyasal klivaji ile üretilebilirler. Mevcut bulusun insanlastirilmis antikorlari, insan disi bir hayvandan (örn. fare) VH ve/veya VL bölgelerinden bir veya birden fazla CDR'nin veya bölümlerinin insan VH ve/veya VL bölgelerinden bir veya birden fazla çati bölgesine aktarilmasiyla yapilandirilabilirler. Istege göre VH ve/veya VL bölgelerinde bulunan insan çati kalintilari, antikorun immünojenisitesini azaltma ve/veya baglama afinitesini koruma amaciyla ihtiyaç duyuldugunda veya istendiginde ilgili insan disi (örn. fare) kalintilariyla yer degistirilebilir. Istege göre CDRilerde bulunan insan disi amino asit kalintilari, insan kalintilariyla yer degistirilebilir. Mevcut bulusun kimerik veya insanlastirilmis antikorlari, yukarida açiklandigi gibi hazirlanan insan disi bir monoklonal antikorun sekansi temel alinarak hazirlanabilir. Agir ve hafif zincir immünoglobulinleri kodlayan DNA, ilgili insan disi hibridomadan elde edilerek standart moleküler biyoloji teknikleri kullanilarak murin disi (örn. insan) immünoglobulin sekanslarini içerecek sekilde tasarlanabilir. Örnegin bir kimerik antikor olusturulmasi için murin degisken bölgeleri, alanda bilinen yöntemler kullanilarak insan sabit bölgelerine baglanabilirler (bkz. örnegin Cabilly et al'a ait . Bir insanlastirilmis antikor olusturulmasi için murin CDR bölgeleri, alanda bilinen yöntemler kullanilarak insan çatisina inserte edilebilirler (bkz. örnegin Winter'e ait 5,225,539 sayili ABD Patenti, Queen et al'a Mevcut bulusun insanlastirilmis antikorlari, agir zincir degisken bölgesi için insan akseptör molekülünün, potansiyel akseptör molekül degisken bölgeleri ve murin antikorun agir zincir degisken bölgesi arasindaki homoloji düsünceleri temelinde seçilecegi sekilde yapilandirilabilirler. Potansiyel immünojenisiteyi azaltmak için germ hatti aday insan akseptör molekülleri tercih edilir. Germ hatti veritabanlari, agir zincir FW3 bölgesinin ucundan ve kismen CDR3 sekansina okunan antikor sekanslarindan olusur. Bir FW4 bölgesinin seçilmesi için seçilen germ hatti molekülünden elde edilmis olan matür antikor sekanslarinin veritabanlari arastirilabilir veya bir insan donöründen seçilen germ hatti molekülünden elde edilen antikor sekanslari kullanilabilir. Insan akseptör molekülleri tercihen murin donör molekülü ile ayni agir zincir sinifindan ve murin donör molekülünün degisken bölgesinin ayni kanonikal yapisal sinifindan seçilirler. Agir zincir degisken bölge için insan akseptör molekülünün seçimine yönelik ikincil düsünceler, murin donör molekülü ve insan akseptör molekülü arasindaki CDR uzunlugu homolojisinden siyrilir. Insan akseptör antikor molekülleri tercihen V-BASE veritabaninda homoloji aramasiyla seçilir, bununla birlikte Kabat ve halka açik NCBI veritabanlari gibi diger veritabanlari da kullanilabilir.
Mevcut bulusun insanlastirilmis antikorlari, hafif zincir degisken bölgesi için insan akseptör molekülünün, potansiyel akseptör molekül degisken bölgeleri ve murin antikorun hafif zincir degisken bölgesi arasindaki homoloji düsünceleri temelinde seçilecegi sekilde yapilandirilabilirler. Potansiyel immünojenisiteyi azaltmak için germ hatti aday insan akseptör molekülleri tercih edilir. Germ hatti veritabanlari, agir zincir FW3 bölgesinin ucundan ve kismen CDR3 sekansina okunan antikor sekanslarindan olusur. Bir FW4 bölgesinin seçilmesi için seçilen germ hatti molekülünden elde edilmis olan matür antikor sekanslarinin veritabanlari arastirilabilir veya bir insan donöründen seçilen germ hatti molekülünden elde edilen antikor sekanslari kullanilabilir. Insan akseptör molekülleri tercihen murin donör molekülü ile ayni hafif zincir sinifindan ve murin donör molekülünün degisken bölgesinin ayni kanonikal yapisal sinifindan seçilirler. Hafif zincir degisken bölge için insan akseptör molekülünün seçimine yönelik ikincil düsünceler, murin donör molekülü ve insan akseptör molekülü arasindaki CDR uzunlugu homolojisini kapsar. Insan akseptör antikor molekülleri tercihen V-BASE veritabaninda homoloji aramasiyla seçilir ve Kabat ve halka açik NCBI veritabanlari gibi diger veritabanlari da kullanilabilir. Bir insan disi antikoru insansilastirma yöntemleri, asagida Örnek 6 dâhil burada açiklanirlar.
Mevcut bulus, insan OX40'a baglanan antagonistik antikoru veya bunun fragmanini kodlayan bir izole edilmis nükleik asiti içeren bir konak hücresini veya insan OX40`a baglanan antagonistik antikoru veya bunun fragmanini kodlayan bir izole edilmis nükleik asiti içeren bir vektörü kültürlemeyi, böylece nükleik asitin eksprese edilmesini ve antikor üretilmesini içeren insan OX40'a baglanan bir antagonistik antikoru veya bunun fragmanini üretme yöntemini saglar. Tercihen antikor izole edilmistir. Konak hücreler, nükleik asitler ve vektörler için yukarida açiklananlar kullanilabilirler. Nükleik asitlerin ekspresyonu, alanda iyi bilindigi gibi rekombinant DNA tekniklerinin ve gen transfeksiyon yöntemlerinin bir kombinasyonuyla ve Örnegin antikorlarin veya bunlarin antikor fragmanlarinin eksprese edilmesi için parsiyel veya tam boy hafif ve agir zincirleri kodlayan DNA'lar standart moleküler biyoloji teknikleriyle (örn. PCR amplifikasyonu veya ilgili antikoru eksprese eden bir hibridomayi kullanan CDNA) elde edilebilir ve DNA`lar, ekspresyon vektörleri gibi vektörlere inserte edilebilir. Ekspresyon vektörü ve ekspresyon kontrol sekanslari, kullanilan ekspresyon konak hücresiyle uyumlu olacak sekilde seçilir. Antikor hafif zincir geni ve antikor agir zincir geni, ayri vektöre inserte edilebilir veya daha genellikle her iki gen ayni ekspresyon vektörüne inserte edilir. Antikor genleri ekspresyon vektörüne standart yöntemlerle (örn. antikor gen fragmani ve vektör üzerindeki komplementer restriksiyon bölgelerinin Iigasyonu veya restriksiyon bölgesi mevcut degilse küt uçlu ligasyon) inserte edilir. Burada açiklanan antikorlarin hafif ve agir zincir degisken bölgeleri, herhangi bir antikor izotipin tam boy antikor genlerini, bunlarin Istenen izotipin agir zincir sabit ve hafif zincir sabit bölgelerini kodlayan ekspresyon vektörlerine, VH segmentinin vektör bünyesindeki CH1 segmentine/segmentlerine islevsel sekilde baglandigi ve VK segmentinin vektör bünyesindeki CK segmentine islevsel sekilde baglandigi sekilde inserte edilmesiyle olusturmak için kullanilabilir.
Anti-OX40 antikorlarinin Karakterizasyonu ve Saflastirilmasi Antikorlara yönelik tarama, insan OX40'a baglanmayi ölçen testlerin ve/veya OX40'in ligandi olan OX40L'ye baglanmasini bloke etme kabiliyetini ölçen testlerin kullanilmasiyla gerçeklestirilebilir. Bir baglama testi örnegi, özellikle insan OX40'in ve insan Fc'sinin, plakalarda immobilize edilen bir füzyon proteininin kullanildigi ve füzyon proteinine baglanan anti-OX40 antikorunu saptamak için bir konjuge sekonder antikoru kullanan ELISA testidir. Bir bloklama testi örnegi, insan CD4 hücrelerinde OX40'a baglanan OX40 ligand füzyon proteininin bloklanmasini ölçen bir akis sitometri bazli testtir. Hücreye baglanan OX40 ligand füzyon protein miktarini saptamak için bir floresan etiketli sekonder antikor kullanilir. Bu test, süpernatanttaki antikor, ligand füzyon proteininin OX40'a baglanmasini bloke ettiginden sinyalde azalmayi arar. Bir bloklama testinin bir diger örnegi, bir plakaya kaplanan OX40 ligand füzyon proteini tarafindan aracilik edilen naif insan T hücrelerinin kostimülasyonunun bloke edilmesinin, timidinin katiliminin ölçülmesiyle ölçüldügü bir testtir. Anti-OX40 antikorlarinin fonksiyonel aktivitesini, örnegin T hücre aktivasyonunun azaltilmasini, degerlendirme testi olarak, Örnek 3 ve 8'de açiklanan insan Karisik Lenfosit Tepkimesini (MLR) kullanabilir. Mevcut bulusun antikorlari, alandaki uzmanlarin bildigi çesitli yollarla izole edilebilirler veya saflastirilabilirler.
Standart saflastirma yöntemleri, atmosfer basincinda veya yüksek basinçta FPLC ve HPLC gibi sistemlerin kullanilmasiyla, iyon degisimi, hidrofobik etkilesim, afinite, boyutlandirma veya jel filtrasyonu dâhil kromatografik teknikleri kapsar. Saflastirma yöntemleri ayrica elektroforetik, immünolojik, çöktürme, diyaliz ve kromatoodaklama tekniklerini kapsar. Protein konsantrasyonuyla birlikte ultrafiltrasyon ve diafiltrasyon teknikleri de yararli olur. OX40 antikorlarinin saflastirilmasi için seçilen konak hücreleri örnegin monoklonal antikor saflastirma için döner kaplarda büyütülebilir.
Süpernatantlar, protein A-sefarozla afinite kromatografisi öncesinde filtrelenebilir ve yogunlastirilabilir (Pharmacia, Piscataway, NJ). Seyreltilen antikorlar, safligin saglanmasi için jel elektroforezle ve yüksek performansli sivi kromatografiyle kontrol edilebilir. Mevcut bulusun tercih edilen bir antikoru bu nedenle insan OX40`a baglanan bir izole edilmis ve/veya saflastirilmis antikordur.
Immünokonjugatlar Mevcut bulus bir baska yönünde bir sitotoksin, bir ilaç (örn. bir immünosüpresan) veya bir radyotoksin gibi bir terapötik maddeye bagli olan, insan OX40'a baglanan bir antagonist OX40 antikorunu veya fragmanini saglar. Bu tür konjugatlar burada immünooknjugatlar “immünotoksinler” olarak anilir. Bir sitotoksin veya sitotoksik ajan, hücrelere zararli olan (örn. öldüren) herhangi bir ajani içerir. Örnekler arasinda taksol, sitokalasin B, gramisidin D, etidyum bromür, emetin, mitomisin, etoposid, tenoposit, vinkristin, vinblastin, kolsisin, doksorubisin, daunorubisin, dihidroksi antrasin dion, mitoksantron, mitramisin, aktinomisin D, 1-dehidr0testosteron, glukokortikoidler, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol ve puromisin ve bunlarin analoglari veya benzerleri yer alir. Terapötik ajanlar arasinda ayrica örnegin antimetabolitler (örn. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiyouanin, sitarabin, 5- florourasil dekarbazin), alkilleyici ajanlar (örn. mekloretamin, tiyotepa klorambusil, melfalan, karmustin (BSNU) ve lomustin (CCNU), siklotosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotosin, mitomisin C ve cis-diklorodiamin platin (ll) (DDP) sisplatin), antrasiklinler (örn. daunorubisin (önceden daunomisin) ve doksorubisin), antibiyotikler (örn. daktinomisin (önceden aktinomisin), bleomisin, mitramisin ve antramisin (AMC)) ve anti-mitotik ajanlar (örn. vinkristin ve vinblastin) yer alir.
Bulusun bir antikoruna baglanabilen terapötik sitotoksinlerin diger örnekleri arasinda duokarmisinler, kaliseamisinler, maytansinler ve auristatinler ve bunlarin türevleri yer alir. Bir kaliseamisin antikoru konjugatinin örnegi piyasadan temin edilebilir (Mylotarg(R); American Home Products). Sitotoksinler, bulusun antikorlarina alanda kullanilan baglayici teknolojisiyle baglanabilirler. Bir sitotoksini bir antikora konjuge etmek için kullanilan baglayici tipleri örnekeri arasinda hidrazonlar, tiyoeterler, esterler, disülfitler ve peptit içeren baglayicilar yer alir ancak bunlarla sinirli degildir. Örnegin Iizozomal kompartman bünyesinde düsük pH ile klivaja duyarli veya katepsinler gibi tercihen tümör dokusunda eksprese edilen proteazlar gibi proteazlar tarafindan klivaja duyarli olan (örn. katepsinler B, C, D) bir baglayici seçilebilir.
Sitotoksin tiplerinin, baglayicilarin ve terapötik ajanlarin antikorlara konjuge edilmesine yönelik yöntemlerin daha ayrintili bir tartismasi için bkz. ayrica Saito G ve Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264. Mevcut bulusun antikorlari ayrica radyoimmünokonjugatlar olarak da anilan sitotoksik radyofarmasötikleri olusturmak için bir radyoaktif izotopa da baglanabilirler. Tanilama ve terapötik amaçli olarak kullanilmak üzere antikorlara konjuge edilebilen radyoaktif izotoplarinin örnekleri arasinda iyodinm, indiyumm, Itriyumg0 ve lutetiyum177 yer alir ancak bunlarla sinirli degildir. Radyoimmünkonjugatlari hazirlama yöntemleri alanda yerlesiktir.
Radyoimmünkonjugatlarin örnekleri, Zevalin® (EDEC Pharmaceuticals) ve Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals) dâhil olmak üzere, piyasadan temin edilebilir ve bulusun antikorlari kullanilarak radyoimmünkonjugatlari hazirlamak için benzer yöntemler kullanilabilir. Bulusun antikor immünokonjugatlari, belirli bir biyolojik yanitin modifiye edilmesi için kullanilabilir ve ilaç parçacigi klasik kimyasal terapötik ajanlarla sinirli olarak yorumlanmayacaktir. Örnegin ilaç parçacigi, istenen biyolojik aktiviteye sahip bir protein veya polipeptid olabilir. Bu tür proteinler örnegin abrin, risin A, pseudomonas eksotoksin veya difteri toksin gibi bir enzimatik olarak aktif toksin veya aktif fragmani; tümör nekroz faktörü veya interferon-y gibi bir protein veya örnegin lenfokinler, interlökin-1 ("lL-1"), interlökin-2 ("lL-2"), interlökin-B ("lL-6"), granülosit makrofaj koloni uyarici faktör ("GM-CSF"), granülosit koloni uyarici faktör ("G-CSF") veya diger büyüme faktörleri gibi biyolojik yanit modifiye edicilerini içerebilir.
Bu tür terapötik ajanlarin antikorlara baglanmasi teknikleri iyi bilinmektedir, bkz. örnegin, Arnon ve arkadaslari, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld ve arkadaslari, (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, lnc. 1985); Hellstrom ve arkadaslari, arkadaslari, (eds.), pp. ; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", iri Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera ve arkadaslari, (eds.), Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin ve arkadaslari, (eds.), pp. Immunol. Rev. 62: 119- Mevcut bulus bir baska yönünde bir sitotoksin, bir ilaç (örn. bir immünosüpresan) veya bir radyotoksin gibi bir terapötik ajanla birlikte verilen, insan OX40'a baglanan bir antagonist OX40 antikorunu veya bunun fragmanini saglar.
Farmasötik Bilesimler Mevcut bulus bir baska yönünde mevcut bulusun antagonist antikoru veya bunun fragmanini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içeren örnegin bir farmasötik bilesim gibi bir bilesimi saglar. Bu tür bilesimler, bulusun antikorlarindan ve/veya immünokonjugatlarindan ve/veya yukarida açiklandigi gibi sitotoksin, ilaç (örn. immünosüpresan) veya bir radyotoksin gibi bir terapötik ajandan birini veya bir kombinasyonunu (örn. iki veya daha fazla) içerebilir. Örnegin bulusun bir farmasötik bilesimi, hedef antijendeki farkli epitoplara baglanan veya tamamlayici aktiviteleri olan antikorlarin (veya immünokonjugatlarinin) bir kombinasyonunu içerebilir.
Bulusun farmasötik bilesimleri ayrica kombinasyon terapisinde, yani diger ajanlarla birlikte de verilebilir. Örnegin kombinasyon terapisi, en az bir diger anti-inflamatuvar veya immünosüpresan ajanla birlestirilen mevcut bulusun bir antagonist OX40 antikorunu içerebilir.
Burada kullanilan sekliyle "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici" her tür solventi, dispersiyon besiyerini, kaplamayi, antibakteriyel ve antifungal ajani, izotonik ve absorpsiyon geciktirici ajani ve fizyolojik olarak uyumlu digerlerini kapsar. Tercihen tasiyici, intravenöz, intramüsküler, subkutan, parenteral, spinal veya epidermal uygulama (örn. enjeksiyon veya infüzyon) için uygundur. Uygulama yoluna bagli olarak aktif bilesik, yani antikor veya immünokonjugat, bilesigi asitlerin etkisinden ve bilesigi inaktif kilabilecek diger dogal kosullardan koruyacak bir malzemeyle kaplanabilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, steril sulu çözeltileri veya dispersiyonlari ve steril enjekte edilebilir çözeltilerin veya dispersiyonun ekstemporane preparati için steril tozlari kapsar. Farmasötik olarak kabul edilebilir maddeler için bu ortam ve ajanlarin kullanilmasi alanda bilinir. Herhangi bir konvansiyonel ortamin veya ajanin etken bilesikle uyumlu olmadigi durumlar hariç, bunlarin bulusun farmasötik bilesimlerinde kullanilmasi öngörülür. Bilesimlere ayrica tamamlayici etkin bilesikler de dâhil edilebilir.
Mevcut bulus bir baska yönünde bir terapötik ajana veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciya bagli olan, insan OX40'a baglanan antagonist antikoru veya bunun fragmanini içeren bir immünokonjugati içeren bir bilesim saglar.
Kullanilabilecek immünokonjugatlar ve terapötik ajanlar yukarida açiklanmistir.
Mevcut bulus bir baska yönünde ayrica farkli bir farmasötik olarak aktif maddeyi içeren mevcut bulusun antagonist antikoru veya bunun fragmanini içeren bir bilesim saglar. Tercihen farkli bir farmasötik olarak kabul edilebilir aktif madde asagidakilerden biri veya birden fazlasidir: a) insan OX40'a farkli bir antagonist, b) bir analjezik ajan c) örn. prednizon gibi bir glukokortikoid gibi bir immün süpresif ajan.
Bulusun bir farmasötik bilesimi ayrica farmasötik olarak kabul edilebilir bir antioksidan içerebilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir antioksidanlarin örnekleri arasinda sunlar yer alir: (1) askorbik asit, sistein hidroklorür, sodyum bisülfat, sodyum metabisülfit, sodyum sülfit ve benzeri gibi suda çözünür antioksidanlar; (2) askorbil palmitat, butil hidroksianizol (BHA), butil hidroksitoluen (BHT), Iesitin, propil gallat, alfa-tokoferol ve benzerleri gibi yagda çözünür antioksidanlar ve (3) sitrik asit, etilendiamin tetraasetik- asit (EDTA), sorbitol, tartarik asit, fosforik asit ve benzeri gibi metal selatlastirici ajanlar. Bulusun farmasötik bilesimlerinde kullanilabilecek uygun sulu ve susuz tasiyici örnekleri arasinda su, etanol, polioller (gliserol, propilen glikol, polietilen glikol ve benzeri) ve bunlarin uygun karisimlari, zeytinyagi gibi bitkisel yaglar ve etil oleat gibi enjekte edilebilir organik esterler yer alir. Uygun akiskanlik örnegin Iesitin gibi kaplama malzemelerinin kullanilmasiyla, dispersiyonlar durumunda gereken parçacik büyüklügünün korunmasiyla ve yüzey etken maddelerin kullanilmasiyla saglanabilir.
Bu bilesimler ayrica koruyucu maddeler, islatma ajanlari, emülsifiye edici ajanlar ve dagitici ajanlar gibi adjuvanlari da ihtiva edebilir. Mikro organizmalarin varliginin önlenmesi hem yukarida açiklanan sterilizasyon prosedürleriyle, hem de örnegin paraben, klorobutanol, fenol sorbik asit ve benzeri gibi muhtelif antibakteriyel ve antifungal ajanlarin dâhil edilmesiyle saglanabilir. Seker, sodyum klorür ve benzeri gibi izotonik ajanlarin bilesimlere dâhil edilmesi de istenebilir. Ayrica enjekte edilebilir farmasötik formun uzatilmis absorpsiyonu, alüminyum monostearat ve jelatin gibi absorpsiyonu geciktiren ajanlarin dâhil edilmesiyle saglanabilir.
Mevcut bulusun antagonist antikorlarinin, OX40 aracili rahatsizliklarin tanilanmasini ve tedavisini içeren çok sayida in vitro ve in vivo tanilayici ve terapötik faydasi vardir. Örnegin bu moleküller, çesitli OX40 aracili rahatsizliklari tedavi etmek, önlemek ve tanilamak için kültürde, in vitro veya ex vi'vo olarak hücrelere veya örnegin i'ri vivo olarak insan deneklerine uygulanabilir. Tercih edilen denekler insandir ve OX40 aktivitesi aracili rahatsizliklari (OX40 aracili rahatsizliklar) olan hastalari kapsar.
Mevcut bulusun antagonist antikorlari, OX40 kostimülatör durumlarindan bagimsiz olarak hastalari tedavi etmede etkili olabilir. Daha çok tercih edilen denekler insanlardir ve düsük bir OX40 seviyesi eksprese eden hastalari kapsar.
Mevcut bulusun amaçlari dogrultusunda "hasta" hem insanlari hem de diger hayvanlari, tercihen memelileri ve en çok tercihen insanlari kapsar. Bu nedenle mevcut bulusun antikorlarinin hem insanlari tedavi etme hem de veterinerlik uygulamalari vardir. Mevcut bulusta "tedavi" veya "tedavi edici" teriminin, terapötik tedaviyi ve bir hastaligin veya bozuklugun profilaktik veya süpresif tedbirlerini kapsadigi kastedilir. Bu nedenle örnegin bir antikorun hastalik baslamadan önce basariyla uygulanmasi, hastaligin tedavi edilmesini saglar. Farkli bir örnek olarak bir antikorun, hastaligin klinik görünümünden sonra hastaligin belirtileriyle savasmak için basariyla uygulanmasi, hastaligin tedavisini içerir. "Tedavi" veya "tedavi edici" ayrica hastalik ortaya çiktiktan sonra hastaligin ortadan kaldirilmasi için bir antikorun uygulanmasini da kapsar. Klinik belirtilerin görülmesinden sonra veya klinik belirtilerin gelismesinden sonra ve muhtemelen hafifletilmesiyle birlikte ve belki de hastaligin iyilestirilmesiyle birlikte bir antikorun basariyla uygulanmasi, hastaligin tedavisini kapsar. "Tedaviye ihtiyaci olanlar" hastaliga veya bozukluga sahip olan memelileri ve hastaligi veya bozuklugu önlenecek olanlar dâhil hastaliga veya bozukluga yakalanma egilimi olanlari kapsar. Özel bir uygulamada antagonist antikorlar, çesitli OX40 aracili rahatsizliklari tedavi etmek, önlemek veya tanilamak için in vivo olarak kullanilirlar. Bu nedenle bulus, bir OX40 aracili bozuklugun bir denekte tedavi edilmesi yöntemini saglar, yöntem denege antagonist antikorun veya fragmaninin terapötik olarak etkili bir miktarinin denege uygulanmasini içerir. Örnek OX40 aracili rahatsizliklar arasinda enfeksiyonlar (viral, bakteriyal, fungal ve parazitik), enfeksiyonla iliskili endotoksik sok, artrit, romatoid artrit, astim, kronik obstrüktif akciger hastaligi (KOAH), pelvik inflamatuvar hastalik, Alzheimer hastaligi, inflamatuvar bagirsak hastaligi, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, Peyronie hastaligi, çölyak hastaligi, safra kesesi hastaligi, Pilonidal hastalik, peritonit, psöriyazis (sedef hastaligi), vaskülit, cerrahi adezyonlar, inme, Tip I Diyabet, lyme hastaligi, artrit, meningoensefalit, otoimmün üveit, multipl skleroz, Iupus (sistemik Iupus eritematozus) gibi santral ve periferik sinir sisteminin immün aracili inflamatuvar rahatsizliklari ve Guillain-Barr sendromu, Atopik dermatit, otoimmün hepatit, fibrozan alveolit, Grave hastaligi, lgA nefropati, idiyopatik trombositopenik purpura, Meniere hastaligi, pemfigus, primer biliyer siroz, sarkoidoz, skleroderma, Wegener granülomatozu, pankreatit, travma (cerrahi), graft-versus-host hastaligi (GVHD), transplant reddi, miyokart enfarktüsü gibi iskemik hastaliklar ve ateroskleroz, intravasküler koagülasyon, kemik rezorpsiyonu, osteoporoz, osteoartrit, periodontitis, hipoklorid ve nöromiyelitis optika dâhil kardiyovasküler hastaliklar yer Diger örnek OX40 aracili rahatsizliklar arasinda enfeksiyonlar (viral, bakteriyal, fungal ve parazitik), enfeksiyonla iliskili endotoksik sok, artrit, romatoid artrit, astim, bronsit, influenza, respiratuvar sinsityal virüsü, pnömoni, kronik obstrüktif akciger hastaligi (KOAH), idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF), kriptojenik fibrozan alveolit (CFA), idiyopatik fibrozis interstisyel pnömoni, amfizem, pelvik inflamatuvar hastalik, Alzheimer hastaligi, inflamatuvar bagirsak hastaligi, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, Peyronie hastaligi, çölyak hastaligi, safra kesesi hastaligi, Pilonidal hastalik, peritonit, psöriyazis (sedef hastaligi), vaskülit, cerrahi adezyonlar, inme, Tip l Diyabet, Iyme hastaligi, artrit, meningoensefalit, otoimmün üveit, multipl skleroz, lupus (sistemik Iupus eritematozus) gibi santral ve periferik sinir sisteminin immün aracili inflamatuvar rahatsizliklari ve Guillain-Barr sendromu, Atopik dermatit, otoimmün hepatit, fibrozan alveolit, Grave hastaligi, IgA nefropati, idiyopatik trombositopenik purpura, Meniere hastaligi, pemfigus, primer biliyer siroz, sarkoidoz, skleroderma, Wegener granülomatozu, pankreatit, travma (cerrahi), graft-versus-host hastaligi (GVHD), transplant reddi, miyokart enfarktüsü gibi iskemik hastaliklar ve ateroskleroz, intravasküler koagülasyon, kemik rezorpsiyonu, osteoporoz, osteoartrit, periodontitis, hipoklorid ve nöromiyelitis optika dâhil kardiyovasküler hastaliklar yer Bulusun antikoruyla tedavi edilecek tercih edilen OX40 aracili rahatsizliklar, multipl skleroz, romatoid artrit, kolit, psoriazis, astim, KOAH, IPF, graft-versus-host hastaligi (GVHD), ateroskleroz ve diyabeti kapsayan gruptan seçilir. Bulusun antikoruyla tedavi edilecek özellikle tercih edilen OX40 aracili rahatsizliklar, graft-versus-host hastaligidir (GVHD).
Mevcut bulus ayrica agrinin, özellikle inflamasyonla iliskilendirilen agrinin tedavisinde kullanilmak üzere bir antikor saglar.
Bir uygulamada bulusun antikorlari, OX40 seviyelerini veya membran yüzeylerinde OX40 içeren hücre seviyelerini saptamak için kullanilabilir, ardindan bu seviyeler belirli hastalik semptomlarina baglanabilir. Alternatif olarak antikorlar, belirli hastalik belirtilerinin önlenmesiyle veya iyilestirilmesiyle baglantilandirilabilecek, böylece OX40'i hastaligin aracisi olarak isaret eden OX40 fonksiyonunu inhibe veya bloke etmek için kullanilabilir. Bu durum antikor ve OX40 arasinda bir kompleks olusumuna imkân veren kosullar altinda bir numunenin ve bir kontrol numunesinin OX40 antikoruyla temas ettirilmesi yoluyla saglanabilir. Antikor ve OX40 arasinda olusturulan kompleksler saptanarak numune ve kontrolde karsilastirilir. Bulusun antikorlarinin OX40'a spesifik baglanmasi isiginda bulusun antikorlari özellikle hücre yüzeylerindeki OX40 ekspresyonunu saptamak için kullanilabilir, örnegin düsük OX40 ekspresyon seviyesi olan bir hastayi saptamak için kullanilabilir. Bulusun antikorlari ayrica OX40ii immünoafinite saflastirmasi vasitasiyla saflastirmak için de kullanilabilir.
Bu nedenle mevcut bulus ayrica düsük OX40 ekspresyon seviyesi olan bir hastayi saptamak için bir in vitro tarama yöntemi saglar ve asagidaki adimlari içerir: (a) bir hastanin kan örneginden periferik kari mononükleer hücrelerin (PBMC) saflastirilmasi; (b) PBMC'Ierin akis sitometrik analizine tabi tutulmasi ve (c) CD4*ve/veya CD8+T hücrelerindeki OX40 pozitif hücre sayisinin belirlenmesi ve bu rakamin kontrol seviyeleriyle karsilastirilmasi.
Tercih edilen bir uygulamada düsük OX40 ekspresyon seviyesi, %10'a kadar, daha çok tercihen %20'ye kadar ve hatta daha çok tercihen %30'a kadar kontrol seviyeleriyle karsilastirildiginda OX40 pozitif hücrelerin ekspresyon seviyesindeki bir artisla gösterilir. OX40 ekspresyonunu belirleme yaklasimi ayrica Kotani A ve Farkli bir uygulamada bulusun antikorlari öncelikle in vitro terapötik veya tanilayici kullanimla iliskilendirilen baglama aktivitesi için test edilebilir. Örnegin bulusun bilesimleri akis sitometrik testleri kullanilarak test edilebilir.
Mevcut açiklama ayrica bir OX40 aracili bozuklugun tedavisi için bir antagonist antikorun veya bunun fragmaninin bir ilaç olarak kullanilmasini ve bir antagonist antikorun veya fragmaninin tedavi için bir ilacin hazirlanmasinda kullanilmasini saglar. Farkli bir uygulamada mevcut açiklama, antagonist antikorun veya bunun fragmaninin bir ilaç olarak kullanilmasini saglar. Mevcut açiklama ayrica antagonist antikorun veya bunun fragmaninin bir OX40 aracili bozuklugun tedavi edilmesi yönteminde kullanilmasini saglar. OX40 aracili rahatsizliklar yukarida açiklananlardir. Mevcut bulusun antagonist antikoru, bir hastanin OX40 kostimülatör durumundan bagimsiz olarak OX40 aracili rahatsizliklarin tedavisi için özellikle yararli olabilir. Tercih edilen bir uygulamada antagonist antikor veya bunun fragmani, bir OX40 aracili bozuklugun tedavisi için kullanilabilir, burada bir hasta düsük OX40 seviyesi eksprese eder. Önceden açiklandigi gibi bulusun antagonist OX40 antikorlari, örnegin bir sitotoksik ajan, bir radyotoksik ajan veya bir immünosüpresif ajan gibi bir veya birden fazla terapötik ajanla birlikte uygulanabilir. Antikor ajana (yukarida açiklandigi gibi bir immünokonjugat olarak) baglanabilir veya ajandan ayri olarak uygulanabilir. Ikinci durumda (ayri uygulama) antikor, ajandan önce, sonra veya es zamanli olarak uygulanabilir veya örnegin anti-kanser tedavisi, örnegin radyasyon gibi bilinen diger terapilerle birlikte uygulanabilir.
Antikorun uygulanmasi için dozajlar konagin kilosunun yaklasik 0,0001 - 100 mg/kg ve daha çok, genellikle 0,01 - 10 mg/kg araliginda yer alir. Örnek bir tedavi rejimi, haftada bir, iki haftada bir, üç haftada bir, dört haftada bir, ayda bir, 3 ayda bir veya her 3-6 ayda bir uygulamayi beraberinde getirir. Antikor genellikle birkaç kez uygulanir. Tekli dozajlar arasindaki aralik örnegin haftalik, aylik, her üç ayda bir veya yillik olabilir. Araliklar, antikorun hastadaki hedef antijene kan seviyelerinin ölçülmesiyle gösterildigi gibi düzensiz de olabilir. Bazi yöntemlerde dozaj, yaklasik 1- 1000 ug/ml ve bazi yöntemlerde yaklasik 25-300 ug/ml plazma antikor konsantrasyonu elde edilecek sekilde ayarlanir. Alternatif olarak antikor, sürekli salinimli formülasyon olarak uygulanabilir, bu durumda uygulama daha az siklikta gerekli olur. Dozaj ve siklik, hastadaki antikorun yari ömrüne göre farklilik gösterir.
Uygulama dozaji ve sikligi, tedavinin profilaktik veya terapötik olmasina göre farklilik gösterebilir. Profilaktik uygulamalarda oldukça az bir dozaj, görece sik olmayan araliklarla, daha uzun bir sürede uygulanir. Bazi hastalar ömürlerinin geri kalani boyunca tedavi görmeye devam ederler. Terapötik uygulamalarda bazen, hastaligin ilerlemesi azalana veya sona erene kadar görece yüksek bir dozajin görece kisa araliklarda uygulanmasi gerekir.
Etken maddelerin gerçek dozaj seviyeleri, yani mevcut bulusun farmasötik bilesimlerindeki antikor, belirli bir hasta, bilesim ve uygulama modu için, hasta açisindan toksik olmadan, istenen terapötik yaniti saglamaya etkili olan bir etken madde miktarini elde etmek için degistirilebilir. Seçilen dozaj seviyesi, kullanilan mevcut bulusun özel bilesimlerinin aktivitesi, uygulama yolu, uygulama zamani, kullanilan özel antikorun eksresyon orani, tedavi süresi, kullanilan özel bilesimlerle birlikte kullanilan diger ilaçlar, bilesikler ve/veya malzemeler, tedavi edilen hastanin yasi, cinsiyeti, kilosu, durumu, genel sagligi ve önceki tibbi öyküsü ve tibbi alanlarda iyi bilinen benzer faktörleri içeren çesitli farmakokinetik faktörlere bagli olacaktir.
Bulusun bir OX40 antikorunun bir “terapötik olarak etkili miktari” tercihen hastalik belirtilerinin siddetinde bir azalmaya, hastaligin belirtilerinin görülmedigi dönemlerin sikliginda ve süresinde artisa ve/veya hastalik agrisi nedeniyle özürlülügün veya sakatligin önlenmesine yol açar. Bir OX40 aracili bozuklugun tedavisine yönelik bir bilesigin kabiliyeti, insandaki etkinligini tahmin eden bir hayvan model sisteminde degerlendirilebilir. Alternatif olarak bir bilesimin bu özelligi, bilesigin hücre büyümesini inhibe etme kabiliyetinin incelenmesiyle degerlendirilebilir, bu inhibisyon uzman pratisyenin bildigi testlerle in vitro olarak ölçülebilir. Alanda uzman olanlar, bu miktarlari denegin büyüklügü, denegin belirtilerinin siddeti ve seçilen özel bilesim veya uygulama yolu gibi faktörlere göre belirleyebilir.
Mevcut bulusun antikoru veya bilesimi, alanda bilinen çesitli yöntemlerden biri veya birden fazlasi kullanilarak bir veya birden fazla uygulama yoluyla uygulanabilir.
Alanda uzman olanlar tarafindan takdir edilecegi gibi, uygulama yolu ve/veya sekli istenen sonuçlara bagli olarak farklilik gösterecektir. Tercih edilen uygulama yollari arasinda intravenöz, intramüsküler, intradermal, intraperitoneal, subkutan, spinal veya diger parenteral uygulama yollari, örnegin enjeksiyon veya infüzyon yer alir.
Daha çok tercih edilen uygulama yollari intravenöz veya subkutan uygulamadir.
Burada kullanilan sekliyle "parenteral uygulama" ifadesi, enteral ve topikal uygulama disinda, genellikle enjeksiyon yoluyla uygulama yollari anlamina gelir ve intravenöz, intramüsküler, intraarteriyel, intratekal, intrakapsüler, intraorbital, intrakardiyak, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkutan, subkutiküler, intraartiküler, subkapsüler, subaraknoid, intraspinal, epidural ve intrasternal enjeksiyonu ve infüzyonu kapsar ancak bunlarla sinirli degildir. Alternatif olarak bulusun bir antikoru, topikal, epidermal veya mukozal uygulama yolu gibi bir parenteral olmayan yoldan, örnegin, intranazal, oral, vajinal, rektal, sublingual veya topikal yoldan uygulanabilir. Üretilen ürün ve kit Açiklamanin farkli bir uygulamasinda, bir OX40 aracili bozuklugun tedavisi için bulusun antagonist antikoru veya bunun fragmanini, bilesimini veya immünokonjugatini içeren bir ürün saglanir. Ürün, bir kap ve kap üzerinde veya kapla iliskili bir etiket veya prospektüs içerebilir. Uygun kaplar örnegin siseleri, viyalleri veya siringalari kapsar. Kaplar, cam veya plastik gibi çesitli malzemelerden olusturulabilirler. Kap, durumu tedavi etmede etkili olabilecek bir bilesim ihtiva eder ve bir steril erisim agzi olabilir (örn. kap, bir intravenöz solüsyon torbasi veya bir hipodermik enjeksiyon ignesiyle delinebilir bir durducusu olan viyal olabilir).
Bilesimdeki en az bir etken madde, burada açiklanan antagonist antikor olabilir.
Etiket veya prospektüs, bilesimin kanser gibi seçilen durumun tedavisi için kullanilabilecegini gösterebilir. Bir uygulamada etiket veya prospektüs, antagonist antikoru içeren bilesimin, bir OX4O aracili bozuklugun tedavi edilmesi için kullanilabilecegini gösterebilir.
Ayrica ürün (a) içinde bilesimin oldugu birinci kabi içerebilir, burada bilesim antagonist antikoru içerir ve (b) içinde bilesimin oldugu ikinci kabi içerebilir, burada bilesim antagonist antikorun disinda bir terapötik ajani içerir. Açiklamanin bu uygulamasindaki ürün ayrica birinci ve ikinci bilesimlerin bir OX4O aracili hastaligin veya bozuklugun tedavi edilmesi için birlikte kullanilabilecegini gösteren bir prospektüs de içerebilir. Bu terapötik ajan, önceki bölümde açiklanan tamamlayici terapilerden biri olabilir (örn. trombolitik ajan, anti-platelet ajani, kemoterapötik ajan, anti-anjiojenik ajan, anti-hormonal bilesik, kardiyoprotektan ve bir sitokin dâhil olmak üzere bir memelideki immün fonksiyonun regülatörü). Alternatif veya ek olarak ürün ayrica enjeksiyonluk bakteriostatik su (BWFI), fosfat tamponlu salin, Ringer solüsyonu ve dekstroz solüsyonu gibi bir farmasötik olarak kabul edilebilir tamponu içeren bir ikinci (veya üçüncü) kabi içerebilir. Ayrica diger tamponlar, seyrelticiler, filtreler, igneler ve siringalar dâhil olmak üzere ticari açidan ve kullanici açisindan istenen diger malzemeleri de içerebilir.
Ayrica bulusun antikorunu, bilesimlerini veya immünokonjugatlarini ve kullanim talimatlarini içeren kitler, mevcut bulusun kapsaminda yer alirlar. Kit ayrica immünosüpresif reaktif, sitotoksik ajan veya radyotoksik ajan gibi bir veya birden fazla ek reaktif veya bulusun bir veya birden fazla ek antagonist antikorunu (örn. birinci antagonist antikordan ayri olan OX4O antijenindeki bir epitopa baglanan bir komplementer aktivitesi olan bir antagonist antikoru) içerebilir.
Baska açiklama olmadan alanda uzman olanlarin, önceki açiklamayi ve asagidaki açiklayici örnekleri kullanarak mevcut açiklamanin ajanlarini yapabilecegine ve kullanabilecegine ve hak talep edilen yöntemleri uygulayabilecegine inanilir.
Asagidaki çalisma örnekleri, mevcut açiklamanin uygulamasini kolaylastirmak üzere saglanirlar ve açiklamanin geriye kalanini hiçbir sekilde sinirlandiracak sekilde yorumlanmazlar. Örnekler Fare anti-insan OX4O antikorlarinin olusturulmasi ve taranmasi Rekombinant insan OX40-Fc proteininin üretilmesi için insan TNFRSF4'ü için bir cDNA, imaGenessten (klon numarasi: RZPDB?37HO329D; Berlin, Almanya) satin alinmistir. Bu cDNA, insan TNFRSF4 ekstrasellüler domeninin (SEKANS TANIM NO: 11) DNA kodlama bölgesini PCR-çogaltmak için bir sablon olarak kullanilmistir. Ayri bir PCR reaksiyonunda bir insan lgG1'inin Fc bölgesi (EU pozisyonlarin 223-451) klonlama için bir 5' GSGGG baglayici ve bir 3' SA-6xHis baglayici ve restriksiyon bölgelerinin eklenmesiyle PCR yoluyla çogaltilmistir. Elde edilen iki ürün, 5924939 sayili ABD Patentinde açiklanan lg donör akseptör fragmaniyla (birinci intron) insan CMV promotörünü, OriP sekansini (Koons MD ve arkadaslari, (2001) J Virol. 75(22): 1620-2 kaynaginda açiklandigi gibi gastrin terminatörüne kaynastirilan SV40 polyAiyi içeren, Invitrogen'den (Invitrogen AG, Basel, Switzerland, Cat. No. V795-20) temin edilen cDNA3.1(-) plazmidini temel alan bir modifiye edilmis memeli ekspresyon vektörüne müteakip klonlama için restriksiyon bölgelerinin eklenmesi ile örtüsme- uzatma PCR kullanilarak komsu primerlerle kaynastirilmistir. Bu rekombinant plazmid, insan TNFRSF4 proteininin natif sinyal peptidiyle yürütülen hücre kültür besiyerine sekresyonla, memeli hücrelerinde insan TNFRSF4 ekstrasellüler domeni - Fc füzyonunun ekspresyonuna imkân vermistir. Rekombinant protein üretimi için yukarida anilan rekombinant vektörü, jetPEITM transfeksiyon reaktifi kullanilarak (Polyplus-transfection S.A., Strasbourg, France; distributor: Brunschwig, Basel, Isviçre) süspansiyonla uyarlanmis HEK transfekte edilmistir. Hücre kültürü süpernatanti, bes gün sonra alinmis ve ÄKTA FPLC sisteminde (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) çalistirilan bir Protein A afinite saflastirma kolonu (HiTrap Protein A sefaroz kolonu; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) kullanilarak saflastirilmistir.
Rekombinant insan OX40-his proteinini üretmek için insan TNFRSF4yün ekstrasellüler bölgesi (SEKANS TANIM NO: 11) klonlama için bir 3' GSG-GxHis baglayicisinin ve restriksiyon bölgelerinin eklenmesiyle PCR yoluyla çogaltilmistir.
PCR ürünü daha sonra yukarida açiklanan modifiye edilmis cDNA3.1(-) plasmide klonlanmistir. Bu rekombinant plazmid, insan TNFRSF4'ün natif sinyal peptidiyle yürütülen hücre kültür besiyerine sekresyonla, memeli hücrelerinde insan OX40-his proteininin ekspresyonuna imkân vermistir. Rekombinant protein üretimi için yukarida anilan rekombinant vektörü, jetPEIT'`Il transfeksiyon reaktifi kullanilarak (Polyplus- transfection S.A., Strasbourg, France; distributor: Brunschwig, Basel, Isviçre) süspansiyonla uyarlanmis HEK transfekte edilmistir. Hücre kültürü süpernatanti, transfeksiyondan bes gün sonra alinmis ve ÄKTA FPLC sisteminde (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) çalistirilan bir Ni2+-NTA afinite saflastirma kolonu (HiTrap Ni2+-NTA sepharose column; GE Healthcare Eur0pe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) kullanilarak saflastirilmistir. Rekombinant insan OX40-FC ve OX40-his proteinlerinin, SDS-PAGE ile belirlendigi gibi %95 saf oldugu görülmüstür ve kullanimdan önce fosfat tampon saline (PBS) tampon degisimi yapilmistir.
PBS'de çözünen rekombinant insan OX40-FC proteini, esit hacimli Stimune adjuvanla (Prionics, Isviçre, ref: 7925000) karistirilarak bir emülsiyon hazirlanmistir. Bu emülsiyon aktarilmistir ve BALB/c hayvanlari (Harlan, Hollanda) arka patilerin yumusak yerlerinden, kuyruk ucundan ve boyundan 50 ug emülsifiye edilmis protein subkutan olarak immünize edilmistir. Immünizasyon ayni miktarda antijenle ve ayni enjeksiyon yoluyla iki hafta sonra tekrarlanmistir. immünize edilmis fare serumundaki dolasan anti-insan OX40 antikorlarinin varligi, rekombinant insan OX40-his proteiniyle kapli plakalar kullanilarak dogrudan ELISA ile degerlendirilmistir. Farkli fare serumlarinin seri dilüsyonu (1:100 - 1:109) plakalara katilmistir ve bagli antikorlar, bir keçi anti-fare H+L tam molekül-HRP (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) kullanilarak saptanmistir. Adjuvan içermeyen 50 ug antijenli nihai subkutan pekistirme hayvanlara uygulanmis ve hayvanlar sakrifiye edilmeden üç gün önce en iyi anti-insan OX40 lgG serum titresini sergilemistir.
Hayvanlar ötenazi edilmis ve DNAse (Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Isviçre) ve kollajenaz (Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Isviçre) solüsyonunda iki 25G igneyle lenf dügümü mimarisinin dagitilmasi yoluyla tek hücre süspansiyonunun hazirlanmasi için inguinal, aksiller, brakiyal, popliteal ve skiyatik lenf dügümleri alinmistir. Tek hücre süspansiyonlari, bir miyeloma hücre hatti X63AG8.653,e (fare BALB/c miyeloma hücre hatti; ATCC katilim numarasi: CRL glikol 1500 ile (Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Isviçre) 7:1 oraninda (füzyon ortagi-toplanan lenf dügümü hücreleri) kaynastirilmistir. Kaynasik hücreler, glutamin, 100U/ml (Biochrom AG, Almanya) penisilin, 100 ug/ml streptomisin (Biochrom AG, Almanya), 10mM HEPES (lnvitrogen AG, Basel, Isviçre), 50 (M B- merkaptoetanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre), HAT (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) ve %1 Büyüme faktörüyle (Hybridokine, (lnvitrogen AG, Basel, Isviçre) fare makrofajlari içeren 96 gözlü düz dipli plakaya kaplanmistir.
Füzyonlardan yaklasik 800 göz, insan OX40'ini taniyan ve insan OX40Llsinin reseptörüne baglanmasini bloke eden fare IgG'sinin varligi açisindan ELISA ile taranmistir. Pozitif gözler genisletilmis ve iki tur alt klonlamaya tabi tutulmustur.
Hücreler toplanmis ve agir ve hafif zincirler klonlanip sekanslanmistir.
Hibridoma hücrelerinden anti-OX40 antikorlarinin VH ve VL zincirlerinin klonlanmasi ve sekanslanmasi Her pozitif olarak seçilmis hibridoma için total RNA hazirlanmis, cDNA'ya ters transkibe edilmistir ve VH ve VL genleri sirasiyla PCR ile çogaltilmistir. Bu PCR ürünleri, bagimsiz PCR ürünlerinin DNA sekanslamasina ve seçilen hibridomalarin mono ve poli-klonalitesinin belirlenmesine imkân verecek sekilde bir kurtarma vektörüne (pDrive vektörü; QIAGEN AG, Hombrechtikon, Isviçre; Kat. No. 231124) baglanmistir. Bu vektör, lPTG ve X-gal içeren LB-agar plakalarinda mavi/beyaz seleksiyona imkân vermistir (LacZ oi -peptidiyle X-galiin degredasyonu nedeniyle ara parçasi olmayan koloniler mavi olmustur). Pozitif (beyaz) bakteri klonlarindan rekombinant plazmidler, vektör belkemigi (M13rev, M13fwdi T7 veya SP6) için spesifik olan standart DNA sekanslama primerleri kullanilarak hazirlanmis ve sekanslanmistir. DNA sekanslari nihai olarak memeli hücrelerindeki ilgili antikorun rekombinant ekspresyonu için bir ekspresyon vektörüne alt klonlanmistir.
RNA izolasyonu Total RNA, imalatçi protokolüne göre QIAGENlden (QlAGEN AG, Hombrechtikon, edilmistir; numunelerin miktari NanoDrop ND-1000 spektrofotometre (WlTEC AG, Littau, Isviçre) kullanilarak belirlenmistir.
Tek adim/i RT-PCR Yukarida açiklanan total RNA preparatlari yine cDNAiya ters transkribe edilmistir ve VH ve VL fragmanlari dejenere primerlerin iki farkli karisimi kullanilarak PCR ile çogaltilmistir, her biri fare immünoglobulin agir zincir degisken fragmanlarinin ve degisken agir zincir kesisim bölgelerinin tüm farkli alt ailelerinin geri kazanilmasina veya tüm fare immünoglobulin hafif zincir kappa degisken fragmanlarinin ve degisken hafif zincir kappa kesisim bölgelerinin geri kazanilmasina imkân vermistir. Ters transkripsiyon ve amplifikasyon için kullanilan primerler, Microsynth (Balgach, Isviçre) ile sentezlenmistir ve HPLC ile saflastirilmistir (Tablo 1-4). Hem ters-transkripsiyon hem de PCR amplifikasyonu, QlAGEN one step RT-PCR kit (QlAGEN AG, Hombrechtikon, Isviçre; Kat. No. 210212) kullanilarak es zamanli olarak gerçeklestirilmistir. Teknik spesifik primerleri kullandigindan her bir mRNA numunesi çift olarak islemden geçirilerek VH veya VL fragmanlarinin bagimsiz ters- transkripsiyonuna ve amplifikasyonuna imkân vermistir. Nihai 30pl hacmine ulasacak sekilde RNase içermeyen suda çözünmüs olan 2pg total RNA sunlarla karistirilmistir: QIAGEN OneStep RT-PCR Tamponu 10pl 5x stok çözeltisi, 10mM konsantrasyonlu 2pl dNTPs karisimi, 10pM konsantrasyonlu 3pl primer karisim ve 2pl QIAGEN OneStep RT-PCR Enzim Karisimi. Nihai karisim daha sonra bir PCR tüpüne yerlestirilmistir ve asagidaki ayarlar kullanilarak bir PCR isil döngülleyicide (BioRad iCycler version 4.006, Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Isviçre) döngüden geçirilmistir: 50 °C'de 30 dk 95 °C,de 15 dk 40 çevrim: 94 °C*de 30 sn 55 °C'de 30 sn 72 °C'de 1 dk 72 °C'de 10 dk 4 °C”de tutun gDrive klonlama PCR ürünleri, %2 agaroz jelden geçirilmistir. DNA elektroforezini takiben ilgili fragmanlar (~450bp) agarozjellerden kesilmis ve Macherey-Nagel NucloSpin Extract ll kit kullanilarak ekstrakte edilmistir. DNA sekanslamasi için ekstrakte edilen PCR ürünleri, yukarida açiklanan kurtarma vektörüne (pDrive vector, QlAGEN AG, Hombrechtikon, Isviçre; Kat. No. 231124) klonlamistir ve E. coIiTOP10 susuna (lnvitrogen AG, Basel, Isviçre; Kat. No. 0404006) transforme edilmistir.
Miniprep ekstraksiyonu Pozitif koloniler, Macherey-Nagel Kare gözlü Blok plakalarda (Macherey-Nagel, edilmis bir gece kültürlenmistir. Sonraki gün NucleoSpin Multi-8 Plazmid kit (Macherey-Nagel, Oensingen, Isviçre; Kat. No. 7406205) kullanilarak Dna miniprep ekstraksiyonlari gerçeklestirilmistir.
Sekanslama ve Sekans analizi Numuneler, DNA sekanslama hizmeti sirketi Fasteris'e (PIan-les-Ouates, Isviçre) DNA sekanslamasi Için gönderilmistir. Standart primerler: M13rev, M13fwd, T7, SP6 kullanilmistir (Tablo 5). DNA sekanslarinin analiz edilmesi için Clone Manager 9 Professional Edition (Scientific & Educational Software, NC, ABD) ve BioEdit kullanilmistir.
Rekombinant kimerik antikor ekSpresyonu için ekspresyon vektörünün klonlanmasi Memeli hücrelerinde rekombinant ekspresyon için izole edilmis murin VH ve VL fragmanlari, düzenek bazli PCR yöntemleri kullanilarak kimerik immünoglobulinler olarak formatlanmistir. Bu kimerik antikorlar, murin agir zincir degisken domeni insan lgG1 agir zincir sabit domenlerine (v1, mentese, y2 ve v3 bölgeler) kaynastirildiginda bir agir zincirden ve murin hafif zincir degisken domeni bir insan kappa sabit domenine (CK) kaynastirildiginda bir hafif zincirden olusur. PCR ile birlestilmis murin degiskeni ve insan sabit parçalari daha sonra protein sekresyonunu desteklemek için insan immünoglobulin hafif zincir kappa lider peptidinin kullanilmasi farkiyla Örnek 1'de bahsedilen lnvitrogen7den modifiye edilmis cDNA3.1(-) vektörünü temel alan bir modifiye edilmis memeli ekspresyon vektörüne klonlanmistir. immünoglobulin adaylarinin protein üretimi için esit agir ve hafif zincir vektör DNA miktarlari, süspansiyonla uyarlanmis HEK- birlikte transfekte edilmistir. Hücre kültürü süpernatanti, bes gün sonra alinmis ve ÄKTA FPLC sisteminde (her ikisi de GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) çalistirilan bir Protein A afinite saflastirma kolonu (HiTrap Protein A sefaroz kolonu) kullanilarak saflastiri Imistir.
Tablo2 : primer Mix V H - forward Tabioar : primer Mix V L - back M13-Fwd GTAAAACGACGGCCAGT M 1 3-Rev AACAG CTATGACCATG T7 TAATACGACTCACTATAGG SP6 GATTTAG GTGACACTATAG Anti-insan 0X40 antikorlarinin biyolojik karakterizasyonu OX40-spesifik Antjkor Saptgmasi &ISA; Antikor titreleri, spesifisite ve hibridomalarla üretim ve rekombinant antikor adaylari dogrudan ELISA ile belirlenmistir. Özetle 96 gözlü mikro titre plakalar (Costar USA, distributor VWR AG, Nyon, Isviçre) PBS'de 2 ug/ml olarak 100 ul rekombinant insan Ox40-his ile kaplanmistir (bkz. OX40-his proteini üretimi için Örnek 1). Plakalar 4°Cide bir gece inkübe edilmis ve ardindan PBS %2 BSA (Bovin Serum Albumin, PAA Laboratories, Pasching, Avusturya) ile bir saat süreyle oda sicakliginda (RT) bloke edilmistir. Bloklama çözeltisi uzaklastirilmis ve hibridoma süpernatantlari veya saflastirilmis antikorlar katilmistir. Plakalar 30 dk süreyle RTide inkübe edilmis, ardindan PBS %0.01 Tween-20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) ile dokuz kez yikanmistir ve bir Horseradish Peroksidaz (HRP) etiketli-Keçi anti-fare H+L-deteksiy0n antikoru (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) 121000 seyrelti oraninda katilmistir. Bir insan Fc'si olan rekombinant kimerik antikorlari saptamak için (bkz. Örnek 2) 1:1000 seyrelti oraninda bir HRP etiketli tavsan anti- insan IgG antikoru (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) deteksiyon antikoru olarak kullanilmistir. Plakalar 30 dk süreyle RTide inkübe edilmis, PBS Laboratories AG, Reinach, Isviçre) katilmis ve reaksiyon H2804 katilarak 6 dakika sonra durdurulmustur. Absorbans bir mikro plaka okuyucuyla 450 nmide okunmustur (Biotek, ABD; distribütör: WITTEC AG, Littau, Isviçre). Sekil 1A, kimerik 1D4 antikorun ve kimerik 2F8 antikorun, OX40-his kapli proteini tanidigini gösterir.
OX40L bloklayici ELISA: Rekombinant insan OX40 Iigand proteini (OX4OL) asagidaki gibi üretilmistir: insan TNFSF4'ten cDNA (klon adi: IOH46203) imaGenesiten (Berlin, Almanya) satin alinmistir ve insan TNFSF4 Iigandin ekstrasellüler bölümü (amino asitler 51-183) (Uniprot QGFGS4 sekansa göre numaralandirma) komsu restriksiyon bölgeleriyle çogaltilmistir. Bir ASA baglayici ve 5' ucunda bir 8-His etiket sekansi içeren elde edilen PCR ürünü daha sonra rekombinant proteininin sekresyonunu desteklemek için bir CMV promotörü, bir Bovin Büyüme Hormonu poIi-adenilasyon ve murin VJ2C lider peptidi tasiyan lnvitrogen'den (Invitrogen AG, Basel, Isviçre) pREP4 vektörünün bir modifiye edilmis versiyonuna klonlanmistir. Rekombinant protein üretimi için rekombinant vektörü, jetPEITM transfeksiyon reaktifi kullanilarak (Polyplus- transfection S.A., Strasbourg, France; distributor: Brunschwig, Basel, Isviçre) süspansiyonla uyarlanmis HEK transfekte edilmistir. Hücre kültürü süpernatanti, bes gün sonra alinmis ve ÄKTA FPLC sisteminde (GE Healthcare Eur0pe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) çalistirilan bir Protein A afinite saflastirma kolonu (HiTrap Protein A sefaroz kolonu; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) kullanilarak saflastirilmistir. Üretilen anti-OX40 antikorlarinin OX4OL'nin OX40 reseptörüne baglanmasini bloke edebilip edemedigini belirlemek için bir bloklayici ELlSA gelistirilmistir. Doksan alti gözlü mikro titre plakalari (Costar, ABD; distribütör VWR AG, Nyon, Isviçre) PBSide 2 ug/ml miktarinda 100 ul rekombinant insan OX40-F0 ile kaplanmistir (bkz. Örnek 1).
Plakalar 4°C'de bir gece inkübe edilmis ve ardindan bir saat süreyle RT'de PBS %2 BSA ile bloke edilmistir. Bloklama çözeltisi uzaklastirilmis ve hibridoma süpernatantlari veya saflastirilmis antikorlar plakaya katilmistir. Bes dakika sonra her bir göze 0.04 mg/ml miktarinda 50 ul biyotinlenmis-rekombinant insan OX40L katilmistir. Plakalar 60 dk süreyle RT'de inkübe edilmis, ardindan PBS %0.01 Tween-20 ile dokuz kez yikanmistir ve HRP-streptavidin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) 122000 seyrelti oraninda katilmistir. Plakalar 30 dk süreyle RTide inkübe edilmis, PBS %0.01 Tween-20 ile dokuz kez yikanmistir ve TMB substrati (Bio-rad Laboratories AG, Reinach, Isviçre) plakalara katilmis ve reaksiyon H2804 eklemesi ile 6 dakika sonra durdurulmustur. Absorbans bir mikro plaka okuyucuyla 450 nm'de okunmustur (Biotek, ABD; distribütör: WlTTEC AG, Littau, Isviçre). Sekil 18, kimerik 1D4 antikorun doza bagli sekilde OX40 ile OX4OL arasindaki etkilesimi bloke edebildigini gösterir; diger yandan kimerik 2F8 antikoru, OX40 ile OX40L arasindaki etkilesimi bloke edememektedir.
Insan Karisik Lenfosit Reaksiyonu (MLR) Iki farkli donörden alinan kan, anti-koagülent olarak (Sarstedt, Nümbrecht, Almanya) sitratla üç 10 mL S-Monovettetde toplanmistir. Donör No:1'den alinan hücreler, efektör hücreler olarak kullanilmistir, diger yandan donör No:2`den alinan hücreler hedef hücreler olarak kullanilmistir. 2 donörden alinan PBMC'Ier (periferik kan mononükleer hücreler) imalatçi talimatlarina göre 50 mL Kan-Sep-Filtre Tüpleri (distribütör: Brunschwig, Basel, Isviçre) kullanilarak saflastirilmistir. Hücreler FBS olmadan Roswell Park Memorial Institute (RPMl, PAA Laboratories, Pasching, Avusturya) besiyeriyle 2 kez yikanmistir. Hedef hücreler 37°C'de 30 dk için 50 pg/ml mitomisin C (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) ile inkübe edilmistir.
Ardindan hücreler FBS olmadan RPMI ile 3 kez yikanmistir ve %10 FBS (PAA Laboratories, Pasching, Avusturya), 2mM L-glutamin (Lonza, Leuven, Belçika), 100U/ml penisilin, 100 pg/ml streptomisin (Biochrom AG, Berlin, Almanya) ile RPMI'de 1x106 hücre/mL'de yeniden süspansiyon haline getirilmistir. 96 gözlü U dipli hücre, her bir göze nihai 100 ul hacimle dagitilmistir. Yüz pl antikor seyreltisi gözlere katilmistir. Plakalar %5 C02 inkübatörde 37°Clde 7 gün süreyle inkübe edilmistir.
MLR'nin baslamasindan yedi gün sonra hücreler ile pulse edilmistir. Pulse etmeden 18 saat sonra hücreler toplanmis ve dâhil edilen radyoaktivitenin miktari bir Wallac beta tezgâhta belirlenmistir. Sekil 2, kimerik 1D4 antikorun doza bagli sekilde pozitif kontrolden daha yüksek derecede MLR'yi bloke edebildigini gösterir.
Akis sitometrisiyle periferik kan mononükleer hücrelerle (PBMC) aktive edilmis insan ve diger hayvan türlerinde anti-insan 0X40 antikorlarinin baglanmasi Insan hücreleri Insan Iökositlerini içeren filtreler, La Chaux-de-Fonds, Isviçreideki Kan Merkezinden (Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Sérologie, rue Sophie-Mairet 29, CH-2300) temin edilmistir. Hücreler, 10U/mL Iikuemin (Drossapharm AG, Lucern, Isviçre) içeren 60 mL PBS ile filtrelerden geri yikama ile uzaklastirilmistir. Ardindan PBMCiler imalatçi talimatlarina göre 50mL Kan-Sep-Filtre Tüpler (distribütör: Brunschwig, Basel, Isviçre) kullanilarak saflastirilmistir. Hücreler FBS içeren (PAA Laboratories, Pasching, Avusturya) Roswell Park Memorial Institute (RPMI, PAA Laboratories, Pasching, Avusturya) besiyeriyle 3 kez yikanmistir. Hücreler %10 FBS (PAA Laboratories, Pasching, Avusturya), 2mM Ultraglutamin (Lonza, Leuven, Belçika), 100U/ml penisilin, 100 ug/ml streptomisin (Biochrom AG, Berlin, Almanya), ug/ml Fitohemagglutinin (PHA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) + 100 U/mL rHu IL-2 (Proleukin, Novartis, Basel, Isviçre) ile RPMI”de 13x106 hücre/ml'de bir 24 gözlü plakada (TPP, Trasadingen, Isviçre) yeniden süspansiyon haline getirilmistir. Kirk sekiz saat sonra hücreler toplanmis ve asagida açiklandigi gibi akis sitometrisiyle analiz edilmistir.
HPB-ALL hücreler (T akut Iinfoid lösemi hücre hatti, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Almanya) %10 FBS içeren RPMI'de kültürlenmistir. 2x105 hücre bir 96 gözlü V dipli plakaya (TPP, Trasadingen, Isviçre) dagitilmis ve üç dakika süreyle 1300 dev/dk'da santrifüje tabi tutulmustur; süpernatantlar atilmis, hücreler toplanmis ve asagida açiklandigi gibi akis sitometrisiyle analiz edilmistir.
Yukarida açiklandigi gibi hazirlanan PBMC'Ier ve HPB-ALL hücreler, 5ug/mL kimerik 1D4 antikor veya 5iJg/mL veya uygun bir izotip kontrolle veya 20 ul PE etiketli ticari anti-insan OX4O antikor (klon L106, BD Biosciences, Allschwil, Isviçre) ile 50 pl FACS tamponda (PBS, %2 FBS, %10 Versene (Invitrogen, ABD) yeniden süspansiyon haline getirilmistir. Hücreler, 30 dakika süreyle buzda inkübe edilmistir, iki kez yikanmistir ve 50 pl FACS tamponda yeniden süspansiyon haline getirilmistir. 1/200 oraninda seyreltilmis olan bir anti-insan IgG-Fikoeritrin-PE (BD Biosciences, Allschwil, Isviçre) kimerik 1D4 antikoru ve izotip kontrol antikoru saptamak için kullanilmistir. Hücreler, 15 dakika süreyle buzda inkübe edilmistir, bir kez yikanmistir ve 400 pl FACS tamponda yeniden süspansiyon haline getirilmistir ve FACS cihazinda (Cyan, Beckman Coulter international S.A., Nyon, Isviçre) analiz edilmistir.
Sinomolqus maymunu primer hücreleri (Profesör Eric Rouiller, Nörofizyoloji Laboratuvari, Fribourg Üniversitesi, Fribourg, Isviçrelden temin edilen) sinomolgus maymunlarindan alinan tam kan sitratli tüplere (BD Biosciences, Allschwil, Isviçre) alinmistir. Iki mL PBS, 3 mL kanla karistirilmistir ve karisim 10 ml 85:15 Ficoll: PBS karisimi (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) üzerine katmanlandirilmistir. Numuneler 20 dakika süreyle oda sicakliginda araliksiz olarak santrifüjlenmistir. PBMC katmani alinmis ve PBS ile üç kez yikanmistir. Hücreler, Dulbecco'nun Modifiye Edilmis Eagle Besiyerinde (DMEM, PAA Laboratories, Pasching, Avusturya) 3x106 hücre/mL, %10 FBS (PAA Laboratories, Pasching, Avusturya), esansiyel olmayan amino asitler (PAA Laboratories, Pasching, Avusturya), 1mM Sodyum Piruvat (PAA Laboratories, Pasching, Avusturya)l 2mM Ultraglutamin (Lonza, Belçika), 100U/ml penisilin (Biochrom AG, Almanya), 100 pg/ml streptomisinde (Biochrom AG, Almanya) yeniden SÜSpansiyon haline getirilmistir. Bir mL hücre SÜSpansiyonu, 24 gözlü plakaya (TPP, Trasadingen, Isviçre) dagitilmis ve 10ug/ml PHA (PHA/M, Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) 100 U/mL rHu IL-2 (Proleukin, Novartis, Basel, Isviçre) katilmistir. Hücreler %5 002 inkübatörde 37 °C'de 50 saat süreyle inkübe edilmistir. Aktive edilmis PBMC toplanmis ve FBS/%25 FBS'de (FACS tampon) yeniden süspansiyon haline getirilmistir. 50 pl FACS tampondaki elli bin hücre, 96 gözlü V dipli bir plakaya dagitilmis ve koyunlarda (BD Biosciences, Allschwil, Isviçre) büyütülmüs biyotinlenmis anti-insan OX40-kimerik 1D4 antikor veya biyotinlenmis izotip kontrol antikoru veya biyotinlenmis ticari anti-insan OX40, 25 ug/mltde gözlere katilmistir. Numuneler 20 dakika süreyle buzda inkübe edilmistir, ardindan hücreler soguk FACS tamponla iki kez yikanmistir, ardindan 15 dakika süreyle buzda 1:20 seyrelti oraninda Streptavidin-PE (BD Biosciences, Allschwil, Isviçre) ile inkübe edilmistir. Hücreler FACS tamponuyla bir kez yikanmistir, ardindan 300 pl FACS tamponda yeniden süspansiyon haline getirilmistir. 2 ul hacim propidyum iyodür (PI; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) ölü hücrelerin çikarilmasi için her bir numuneye katilmistir. Hücreler akis sitometresiyle (Cyan, Beckman Coulter international S.A., Nyon, Isviçre) analiz edilmistir.
Sekil 3A ve SB, kimerik 1D4 antikorun sirasiyla insan ve sinomologus maymunu aktiveli lenfositlerin yüzeyinde eksprese edilen OX40'i taniyabildiklerini, böylece ilaç gelistirilmesi için son derece istenen çapraz reaktivite özelliklerini sagladiklarini gösterir.
Yüzey plazmon rezonansi (SPR) ile insan OX40 reseptör ekstrasellüler domeni için kimerik 1D4 antikorun kinetik baglama afinitesi sabitleri Kinetik baglama afinitesi sabitleri (KD) analit olarak Örnek 1'de açiklandigi gibi rekombinant histidin etiketli insan OX40 reseptör ekstrasellüler domeni kullanilarak protein A yakalamali antikorda ölçülmüstür. Ölçümler, oda sicakliginda BlAcore üzerinde yürütülmüstür ve BiaEvaluation yazilimiyla (BlAcore: v4.1) analiz edilmistir. pl / 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid Hidroklorür (EDC) çözeltisi (hacim/hacim, akis yolu 1 ve 2'de 5 pI/dk akis hizi) enjekte edilerek bir CMS arastirma sinifi sensör çipi (GE Healthcare Europe GmbH, Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) asetat tampon pH 4.5'te (GE, BR-1003-50; pl'nin bir pH birimi alti) nihai 50 pg/ml konsantrasyona seyreltilmistir ve ardindan hem akis yolu 1'e hem de akis yolu 2'ye (5 uI/dk) 35 pl enjekte edilerek önceden aktiflestirilmis CM5 sensör çipinde immobilize edilmistir; bu da yaklasik 1500 yanit birimine (RU) karsilik gelir. Ardindan protein-A-CM5 sensör çipi, 35 pl etanolamin çözeltisi (5|JI/dk) enjekte edilerek deaktive edilmistir. Son olarak çapraz baglanmis olmayan protein-A moleküllerinin serbest kalmasi için 10 pl glisin çözeltisinin (GE, Afinite ölçümlerinden önce sabit analit konsantrasyonunun farkli akis hizlarinda (2 dakika süreyle 5, 15, 30, 50, 75 ul/dk) sabit protein-A ile yakalanmis antikor miktarina enjekte edilmesiyle bir kütle transfer sinirlandirma testi gerçeklestirilmistir. Farkli akis hizlarinda oran egimleri analizi, kütle transferini göstermistir.
Afinite ölçümleri için 1 x PBS tamponda saklanmis kimerik 1D4 antikor, HBS-Ep Ardindan bu seyreltilmis stokun 10 |JI miktari, 200-250 RU'ya ulasmak için protein-A CMS çipinin (30 ul/dk) akis yolu 2'sine enjekte edilmistir. Bu yakalama adimini takiben rekombinant histidin etiketli insan OX40 reseptör ekstrasellüler domeni, farkli konsantrasyonlarda (50 nM - akis yolu 1 ve 2'ye (akis yolu 1 referans olarak kullanilmistir) 30 uI/dk akis hizinda enjekte edilmistir. Her bir baglama olayindan sonra yüzey 1 dk süreyle (min (10 uI/dk) enjekte edilen glisin tampon pH 1.5 ile yeniden olusturulmustur. Ölçümler (sensorgram: f02-fc1) kütle transferi olan 221 bivalent analit modeliyle en iyi uyuma getirilmistir. Her ölçümün basinda protein-A ile yakalanmis antikordaki deneysel degisiklikleri açiklamak için Rmax degeri tüm uyumlarda yerele ayarlanmistir. Dissosiyasyon süreleri en az 300-600 saniye olmustur. Ölçümler çift olarak yapilmis ve referans olmasi için sifir konsantrasyonlu örnekleri kapsamistir.
Ki2 degeri, her bir noktada deneysel veriler ve referans verileri arasindaki kareli farklarin toplamini temsil eder; kalintilarin alanlari, uyumdaki her nokta için deneysel ve referans verileri arasindaki farki gösterir. Hem ki2 hem de kalinti degerler, deneysel veriler ve bagimsiz baglama modelleri arasindaki uyumun kalitesini degerlendirmek için kullanilmistir. Ölçümler, protein-A sensör çipinde immobilize edilmis yakalanmis kimerik 1D4 anti- insan OX40 antikoruyla ve analit olarak rekombinant histidin etiketli insan OX40 reseptör ekstrasellüler domenle çift olarak gerçeklestirilmistir. KD degeri, Ki2 degerleri < 1.25 olacak sekilde 91 - 116 nM arasinda olmustur.
Fare monoklonal antikor 1D4'ün insanlastirilmasi Insan akseptör çatilarinin, ters mutasyonlarin ve insan CDR-graftli akseptör çatilarinin baglama özelliklerini büyük ölçüde koruyan ve/veya iyilestiren mutasyonlarin seçilmesi dâhil anti-insan OX40 fare antikor 1D4'ün insanlastirilmasi burada açiklanir.
Yeniden biçimlendirilmis degisken bölqelerin tasarimi Homoloji eslesmesi, 1D4 CDR'Ieri graftlamak üzere insan akseptör çatilarini seçmek için kullanilmistir. Veritabanlari, örnegin insan ve fareden immünoglobulin lokilerinden germ hatti degisken genlerinin veri tabani (the IMGT database (the international ImMunoGeneTics information system®;Lefranc MP ve arkadaslari, Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64) veya VBASE2 (Retter l ve yayinlar (örn. Kabat EA ve arkadaslari, yukarida) murin agir ve hafif zincir V bölgelerinin ait oldugu insan alt ailelerini belirlemek ve akseptör molekülü olarak kullanilacak en iyi uyan insan germ hatti çatisini belirlemek için kullanilabilir.
Akseptör olarak kullanilacak bu alt ailelerin bünyesindeki agir ve hafif zincir degisken sekanslarinin (VH ve VL) seçilmesi, sekans homolojisini ve/veya greftlemeden sonra alti CDRlnin uygun göreceli sunumunu korumaya yardimci olmak için CDR1 ve CDR2 bölgelerinin yapisinin bir eslesmesini temel alabilir. Örnegin IMGT veritabaninin kullanimi, 1D4 agir zincir degisken domeni çatisi ve insan agir zincir degisken domeni alt ailesi 2inin üyeleri arasinda iyi homoloji gösterir.
Hem CDRilerin hem de çati sekanslarinin en yüksek homolojileri ve tanimlari germ hatti sekanslari için gözlemlenmistir: IGHV , ve bunlarin tamami CDRS'e kadar tüm sekans Için %73 üzeri sekans tanimi vardir. 1D4 hafif zincir degisken domen sekansi, ayni yaklasim kullanilarak insan hafif zincir degisken domeni kappa alt ailesi 3'ün üyelerine iyi homoloji göstermistir. Hem CDR'lerin hem de çati sekanslarinin en yüksek homolojileri ve tanimlamalari su germ hatti sekanslari için gözlemlenmistir: IGHV (%653 tanim), lGKV, IGKV1D-39*O1 (SEKANS TANIM NO: 26) (% Insanlastirma prosesinin baslangiç noktasi olarak insan IGHV 2-70*10 (SEKANS TANIM NO: 19) ve IGHV degisken domenleri 1D4 CDR'lere akseptörler olarak seçilmistir. IGHV 2-70*10, diger insan agir zincir degisken domenleri arasindan çati bir bölgesindeki 1D4 ile üstün homolojisi nedeniyle seçilmistir.
Insan gamma bir izotipinin birinci insanlastirilmis antikoru hazirlanmistir (bkz. asagi).
Antikor, bir insan-fare hibrit agir zincir degisken domeninin ve bir insan-fare hibrit hafif zincir degisken domenini kapsamistir. Hibrit agir zincir degisken domeni, insan agir zincir degisken domeni IGHV 2-70*10'u temel almistir, burada germ hatti CDR1 ve 2 sirasiyla 1D4 agir zincir CDR1 ve 2 ile yer degistirmistir. Insan akseptör çatisiyle en iyi eslesen JH segment sekansi, yukarida bahsedilen IMGT aramalarindan belirlenmistir. Insan IGHV 2-70*10 çati bölgelerine, 1D4 fare CDR'lerine ve insan akseptörüne en iyi eslesen JH'ye sahip olan elde edilen insan-fare hibrit agir zincir degisken sekansi burada SEKANS TANIM NO: 29 ile agir zincir degisken domeni VH1 olarak anilir. Benzer sekilde bu birinci insanlastirilmis antikor adayi için kullanilan insan-fare hibrit hafif zincir degisken domeninin, insan IGKV3-11*O1 çati bölgeleri, 1D4 fare CDR`Ieri ve insan akseptörüne en iyi eslesen JK'si vardi ve burada SEKANS TANIM NO: 30 ile hafif zincir degisken domeni VL1 olarak anilir.
VH1 ve VL1'i içeren birinci insanlastirilmis antikor burada VH1NL1 antikoru olarak kisaltilmistir.
Birinci insanlastirilmis antikor prototipinin üretilmesi VH1 ve VL1 için kodlayan DNA sekanslari (cDNA'Iar) GENEART AG (Regensburg, Almanya) tarafindan bir scFV formatinda sentezlenerek tek bir DNA sekansinin her iki degisken domeni (SEKANS TANIM NO: 31) kapsamasina imkân vermistir.
Bagimsiz degisken domen cDNA'Iari, PCR yoluyla bu scFv yapisindan elde edilmis ve PCR düzenleme teknikleri kullanilarak ilgili sabit domen cDNA sekanslarinin yukari tarafina (upstream) birlestirilmistir. Son olarak tam agir ve hafif zincir cDNA'lar, CMV promotörünü ve bir Bovin Büyüme Hormonu poIi-adenilasyon sinyalini tasiyan bir modifiye edilmis pcDNA temel alan bagimsiz vektörlerde baglanmistir. Hafif zincir spesifik vektör, BamHl ve BsiWl restriksiyon enzim bölgeleri kullanilarak kappa hafif zincir sabit domen cDNA'sinin önünde ilgili hafif zincir degisken domeni cDNA'sinin Iigasyonuyla insan kappa izotip hafif zincirlerinin ekspresyonuna imkân vermistir; diger yandan agir zincir spesifik vektör, BamHI ve Sall restriksiyon enzim bölgeleri kullanilarak insan IGHG1 CH1, IGHG1 mentese bölgesi, IGHG1 CH2 ve lGHG1 CH3 sabit domenlerini kodlayan cDNA sekansinin önünde ilgili agir zincir degisken domeni cDNA'sinin ligasyonuna imkân vermek üzere tasarlanmistir. Hem agir hem de hafif zincir ekspresyon vektörlerinde, sekresyon BamHl bölgesini içeren fare VJ2C lider peptidiyle desteklenmistir. BsiWl restriksiyon enzim bölgesi, kappa sabit domeninde yer alirken, Sali restriksiyon enzim bölgesi IGHG1 CH1 domeninde bulunur.
VH1NL1 antikoru, esit miktarda agir ve hafif zincir vektörlerinin, polietilenimin (PEI, Sigma, Buchs, Isviçre) kullanilarak süspansiyonla uyarlanmis HEK293-EBNA1 hücrelerine (ATCC® katalog numarasi: CRL-10852) ko-transfeksiyonuyla geçici olarak üretilmistir. Genellikle süspansiyondaki 100 ml hücreler ml basina 08-12 milyon hücre yogunlukta agir zinciri kodlayan 50 ug ekspresyon vektörünü ve hafif zinciri kodlayan 50 ug ekspresyon vektörünü içeren bir DNA-PEI karisimiyla transfekte edilir. Antikor genlerini kodlayan rekombinant ekspresyon vektörleri konak hücrelere saglandiginda, antikorlar %0.1 pluronik asitle, 4 mM glutaminle ve 0.25 ug/ml genetisinle takviye edilmis, kültür besiyerine (EX-CELL 293, HEK293-serum- free medium; Sigma, Buchs, Isviçre) sekresyona imkân vermek için 4-5 günlük süreyle hücrelerin kültürlenmesiyle üretilirler.
VH1/VL1 antikoru, rekombinant protein-A akis besiyeri (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Isviçre) kullanilarak hücresiz süpernatanttan saflastirilmis ve testler öncesinde fosfat tampon saline tampon degisimi yapilmistir. Insan OX40'ina baglanma, Örnek 5'te açiklandigi gibi SPR ile ölçülmüstür.
Graftli insan catilarinin ters mutasyonu 1D4 fare antikorundan CDR'lerin düz graftlamasi, insan OX40'a baglanmayan bir adaya yol açtigindan (Tablo 6 ve SEKIL 4), insan kalintilarinin fare kalintilariyla sübstitüe edildigi mutagenez baslatilmistir. Bu proses ters mutasyon olarak anilir ve monoklonal antikorlarin insansilastirilmasinda en tahmin edilemeyen prosedürdür.
Afiniteyi muhafaza etmek için korunmasi gereken fare antikorundan kritik çati kalintilarinin belirlenmesini ve seçilmesini ve ayni zamanda insanlastirilmis antikorda potansiyel immünojenisitenin en aza indirilmesini gerektirir. Tablo 7, Tablo 8 ve SEKIL 5, fare ve insan antikor çatilari arasinda farklilik gösteren kalintilari (Kabat numaralandirmasi) gösterir. CDR`lerin konformasyonlarini veya birbiriyle degistirilebilir domen paketini etkileyebilecek kalintilara özel ilgi duyulur çünkü bunlar antikor afinitesindeki en büyük etkiye sahip olabilirler. Çogu CDR konformasyonunu ve/veya birbiriyle degistirilebilir domen paketini etkileyebilecek kalintilari belirlemek için degisken domenlerin VH1-VL1 çifti için bir 38 model, otomatik moda ayarlanmis yapi homolojisi-modelleme sunucusu SWISS- httpz//swissmodel.expasy.org) kullanilarak hesaplanmistir. Model analizi, CDR bölgelerindeki varsayimsal etkiye ve/veya agir zincir-hafif zincir degisken domen paketine göre bir alt pozisyonlar kümesinin seçimine imkân vermistir. Bu pozisyonlar numaralandirmasi) olusmustur. Bu ters mutasyonlara ek olarak VH1/VL1 antikorunda bulunan hafif zincir pozisyonu Y31 bazi adaylarda silinmistir.
Agir ve hafif zincir sübstitüsyonlarinin çesitli kombinasyonlarini temel alan insanlastirilmis adaylar, yukarida açiklanan standart mutagenez ve yöntemleri kullanilarak VH1/VL1 antikor sekansi baglaminda hazirlanmistir. insanlastirilmis antikor adaylari, Örnek 5'te açiklandigi gibi SPR ile baglama afinitesi bakimindan test edilmistir.
Bu tekli sübstitüsyonlari veya sübstitüsyonlarin kombinasyonunu temel alan bazi insanlastirilmis antikorlarin üretim verimleri ve baglama özellikleri Tablo 6'da gösterilir. Gösterilen 28 antikordan dokuz aday, insan OX40'a baglanma göstermemistir ve diger dokuzluk grup yetersiz-zayif baglanma göstermistir. VL9 bazli insanlastirilmis antikorlar, SPR ile insan OX40'ini zayif sekilde baglayanlar en tutarli antikorlari göstermistir. Yalnizca iki antikor - VH6/VL9 ve VH7/VL9 - insan OX40'a iyi baglanma göstermistir. Her iki insanlastirilmis antikorlarin degisken agiz 34, 46, 47 ve ?1'de (Kabat numaralandirmasi) ters mutasyonlari vardi. Bu ters mutasyonlara ek olarak hem VH6NL9 hem de VH7/VL9 hafif zincir pozisyonu 31'in uzaklastirilmasindan yararlanmistir. Sasirtici sekilde VH7/\/L9,un, 1D4 kimerik antikoru ve VH6NL9 varyantina göre iyilestirilmis insan OX40 afinitesi vardi. Bu insanlastirilmis antikorlarin baglama afinitesi Tablo 9ida özetlenir.
Diferansiyel taramali kalorimetreyle seçilen insanlastirilmis anti-OX40 antikorlarinin termostabilitesi insanlastirilmis antikorlarin termal stabiliteleri, diferansiyel taramali kalorimetre (DSC) kullanilarak ölçülmüstür. Monoklonal antikorlarin erime profilleri, izotiplerinin karakteristigidir (Garber E & Demarest SJ (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355: 751-7), bununla birlikte FAB fragmaninin orta nokta erime sicakligi tam boy IgG baglaminda bile kolaylikla tanimlanabilir. FAB bölümünün bu orta nokta erimesi, insanlastirilmis adaylarin monoklonak stabilitesini izlemek için kullanilmistir.
Kalorimetrik ölçümler, bir VP-DSC diferansiyel taramali mikro kalorimetrede yürütülmüstür (MicroCal, Northampton, BK). Hücre hacmi 0.128 ml; isitma orani 200°C/sa olmustur ve asiri basinç 65 p.s.i,de tutulmustur. Tüm antikorlar PBS'de (pH 7.4) 1 mg/ml konsantrasyonda kullanilmistir. Antikorun molar isi kapasitesi, antikorun çikarilmis oldugu benzer bir tamponu içeren çift örneklerle karsilastirmayla tahmin edilmistir. Kismi molar isi kapasiteleri ve erime egrileri, standart prosedürler kullanilarak analiz edilmistir. Termogramlar, Origin v7.0 yaziliminda Non-Two State modeli kullanilarak analiz edilmeden önce referans degerine göre düzeltilmis ve konsantrasyonlari normallestirilmistir.
Insanlastirilmis varyant VH6/VL9 FAB fragmani, genel olarak kompakt olarak katlanmis FAB fragmanlari için gözlemlenen bir isbirligine dayali yayilmayla tutarli olan bir biçim ve genlesmeyle 76.3°C'de tek bir geçis göstermistir, bu da mühendislik prosesinin FAB stabilitesini korumada basarili oldugunu gösterir. Genel olarak insanlastirilmis varyant, iyi bir termal stabilite göstermistir.
Tablo 6: Insanlastirilmis anti-insan 0X40 antikorlari Insanlastirilmis SEKANS Mutasyonl Geçici Insan antikor varyanti TAN. NO: ar VH/VL ekspres OX40'i (IGHG1) yon na (mg/I) baglan Insanlastirilmis VH2NL3 VH3/VL1 VH3/VL2 VH3/VL3 VH4/VL4 VH4/VL9 SEKANS Mutasyonl Geçici antikor varyanti TAN. NO: ar VH/VL ekspres 33, 41 34, 39 34, 40 34, 41 , 42 , 47 T23S/F71 14 R50H/N.A 23 R5OH 22 /L33M R50H/F71 18 T233- 15 R50H/L33 T238- 3 R50H/ Y31deles L33 M- A34 H- L46 P- L47W- OX40'i Yetersi Insanlastirilmis SEKANS Mutasyonl Geçici Insan antikor varyanti TAN. NO: arVH/VL ekspres OX40'i (IGHG1) yon na (mg/I) baglan R50H- Z 860 N- 862A/L33 R50H- Z 862A/ L33 M- L46 P- L47W- R50H- z $62A/ L33M- L46P- L47W- R50H- Insanlastirilmis antikor VH6/VL5 SEKANS Mutasyonl Geçici varyanti TAN. NO: ar VH/VL ekspres 860 N- 862A/ Y31deles L33 M- A34 H- L46 P- L47W- 37, 43 T238- 0 S35bG- 860 N- 862A/ L33 M- L46 P- L47W- T238- 0.5 S35bG- R5OH- 860 N- 862A/ L33 M- 37, 44 OX40'i Insanlastirilmis antikor VH6/VL7 VH6NL8 VH6NL9 varyanti TAN. NO: 37, 45 37, 46 37, 47 OX40ii Mutasyonl Geçici ar VH/VL ekspres (mg/I) baglan L46P- L47W- T23S- N.D.
S35bG- R50H- 860 N- 862A/ Y31deles L33 M- T238- 7 S35bG- R50H- Y31deles L33M- A34H- T238- S35bG- 3.5 Iyi Insanlastirilmis antikor VH6/VL10 SEKANS Mutasyonl Geçici varyanti TAN. NO: ar VH/VL ekspres R50H- 860 N- 862A/ Y31deles L33 M- A34 H- L46 P- L47W- 37, 48 T23S- 0.5 835bG- R50H- 862A/ delesyon- L33M - R54L- T568- 37, 49 T238- 5.5 R50H- OX40'i Insanlastirilmis antikor VH7NL5 VH7/VL6 varyanti TAN. NO: 38, 43 38, 44 Mutasyonl Geçici Insan ar VH/VL ekspres OX40'i (mg/I) baglan Y31ddes L33M- A34H- R54L- T568- T23S- 1 N.D. 835bG- l48L- 860 N- 862A/ L33 M- L46 P- L47W- T238- 1 N.D.
S35bG- l48L- 860 N- 862A/ Insanlastirilmis antikor VH7/VL7 VH7/VL8 varyanti TAN. NO: 38, 45 38, 46 OX40ii Mutasyonl Geçici ar VH/VL ekspres Üngh) bagmn L33M- L46P- L47W- T238- l48L- R50H- 860 N- 862A/ Y31deles L33 M- 1.5 Zayif T238- 835bG- l48L- R50H- Y31ddes L33M- A34H- Zayif Insanlastirilmis anükor VH7NL9 VH7/VL1 'I SEKANS Mutasyonl Geçici varyanti TAN. NO: ar VH/VL ekspres 38, 47 38, 49 OX40'i (mg/I) baglan T238- 3 Iy S35bG- l48L- R50H- Y31ddes L33M- A34H- L46P- L47VV- T238- 115 Zawü 835bG- Iw l48L- R50H- Y31ddes L33M- A34H- R54L- Insanlastirilmis SEKANS Mutasyonl Geçici Insan antikor varyanti TAN. NO: arVH/VL ekspres OX40'i (IGHG1) yon na (mg/I) baglan T568- Tablo 7: 104 ve insan akseptör agir zincir degiskeni IGHV 2-70*1O çatilarinin karsilastirilmasi Kabat 1D4 CDR graftli lGHV 2- pozisyonu 70*10 35b G 8 pozßyonu CBR gmühlGHV Z 70*10 Tablo 8: 1D4 ve insan akseptör hafif zincir degiskeni IGKV 3-11*01 çatilarinin karsilastirilmasi Kabat 1D4 CDR graftli IGKV 3- pozisyonu 11*01 Kabat 1D4 CDR graftli IGKV 3- pozisyonu 11*01 Tablo 9: Seçilen insanlastirilmis ve kimerik anti-OX40 antikorlarinin baglama özellikleri Insanlastirilmis SEKANS kon (11 koff(1I Kn(n varyantlar TAN. NO: MS) 5) M) O4 10'3 04 10'3 Insanlastirilmis anti-OX40 antikorlarinin epit0p karakterizasyonu.
Insanlastirilmis anti-OX40 antikorlarinin epitopunun karakterize edilmesi için VH6/VL9 antikoru, çesitli insan-Siçan OX40 kimerik proteinlerinin kullanilmasiyla insan OX40 ektrasellüler bölgesinin domenini tanimlamak üzere haritalandirilmistir.
Insan-Siçan OX40 kimerik proteinlerinin hazirlanmasi ve ELISA Siçan ve insan-Siçan OX40 proteinleri, Örnek 1'de açiklanan yönteme göre Fc füzyon proteinleri olarak formatlanmistir. ELISA için OX40 proteinleri, yüksek baglamali 96 gözlü plakalarda (Coastar) 4°C'de bir gece süreyle PBSide 2ug/mL'de kaplanmistir. Plakalar, VH6/VL9 antikoruyla veya izotip kontrol antikoruyla inkübasyondan önce PBS %2 Bovin Serum Albumin (BSA) ile bloke edilmistir.
Ardindan plakalar keçi anti-insan lg F(ab')2 fragman Spesifik-HRP (Jackson yikama isleminden sonra antikor baglamasini ortaya koymak için TMB substratla (Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Isviçre) inkübe edilmistir. Reaksiyon 2M H2804 katilarak durdurulmustur ve optik yogunluk Synergy HT2 spektrofotometrede (Biotek, ABD; distribütör: WlTTEC AG, Littau, Isviçre) okunmustur.
Kökeninden bagimsiz olarak OX40 ektrasellüler bölgesi, domen 1, 2, 3 ve 4 olarak anilan dört yapisal modüle bölünmüstür (Compaan DM & Hymowitz SG (2006) kimerik OX40 proteinleri (insan TNFRSF41ün amino asitleri 29-214, numaralandirma Uniprot P43489 sekansina göredir) dört domenden birinin veya birden fazlasinin insan ve siçan sekanslari arasinda degistirilmesiyle yapilandirilmistir. Örnegin kimerik RHRR OX40 proteini, siçan OX40 ekstrasellüler bölgesine karsilik gelir, burada ikinci domen ilgili insan domen sekansiyla degistirilmistir.
Bir baglayici ELISA, VH6/VL9 antikorunun insan OX40 ekstrasellüler bölgesi (SEKANS TANIM NO: 11 ile HHHH olarak kisaltilmistir), siçan OX40 ekstrasellüler bölgesi (SEKANS TANIM NO: 52 ile RRRR olarak kisaltilmistir) ve dört insan-siçan kimerik proteini: RHRR (SEKANS TANIM NO: 53), HRRR (SEKANS TANIM NO: 54), HHRR (SEKANS TANIM NO: 55) ve RRHH (SEKANS TANIM NO: 56) üzerindeki reaktivitesini test etmek için gerçeklestirilmistir. Bu ELISA'nin sonucu SEKIL 77de gösterilir. Bu epitop haritalamasi deneyinin bir ön kosulu olarak VH6/VL9 antikorunun insan OX40 proteinine baglandigi ancak siçan OX40 proteinine baglanmadigi gösterilmistir, bu da siçan OX40'ina çapraz reaktivite olmagini gösterir. VH6NL9 antikorunun, RHRR ve HHRR'yi bagladigi ancak HRRR veya RRHH'yi baglamadigi görülmüstür, bu da VH6/VL9 epitopunun insan OX40 ekstrasellüler bölgesinin ikinci domeni bünyesinde haritalandigini gösterir.
VH6NL9 antikoru mekanizmalari öldürüp bloke ederek insan karisik lenfosit reaksiyonunu bloke eder.
VH6/VL9 antikorunun in vitro immün reaksiyonlari baskilama etkisi, tek yollu allojeneik karisik lenfosit reaksiyonunda (MLR) test edilmistir. MLR, alloreaktif T hücre aktivasyonunun ve çogalmasinin bir in vitro modelidir (O'Flaherty E ve (PBMC'ler) karistirildiginda T hücreler allojeneik majör histouyumluluk (MHC) moleküllerinin taninmasiyla aktiflestirilir. Bu aktivasyon, T lenfositlerin çogalmasina yol açar. MLR reaksiyonu, T hücre hedefleme immünosüpresif ilaçlarinin etkisini göstermek için yaygin olarak kullanmistir (Bromelow KV ve arkadaslari, (2001) J. hücre aktivasyonunu inhibe ederek çalisirlar. VH6NL9 antikorunun bloklama etkisini test etmenin yani sira antikor bagimli sellüler sitotoksisite (ADCC) gibi sitotoksik mekanizmalarin MLR inhibisyonuna katkisi da incelenmistir. VH6NL9 antikorunun üç farkli antikor formati bu testte test edilmistir: bir lGHG1 formati (burada VH6NL9 olarak anilir), bir fukosile edilmemis IGHG1 (lgG1)formati (burada fukosile edilmemis olarak anilir). lGHG1 (lgG1) antikorlarinin, ADCC gibi bir sitotoksisite mekanizmasi için kompetan oldugu bilinir. Fukosile edilmemis lGHG1 Antikorlarin, dogal öldürücü hücreler (NK hücreler) gibi sitotoksik hücrelerde ekSprese edilen FcyRIIIa için daha yüksek bir afinite nedeniyle iyilestirilmis ADCC aktivitesi sergiledigi bilinir (Mizushima T ve arkadaslari, ( antikorlarinin ADCC gibi bu tür Fc aracili sitotoksisite mekanizmalari olmadigi bilinir.
VH6NL9 antikorunun formatlanmasi Sübstitüsyon 8228P`ye sahip olan IGHG4 immünoglobulin formatlamasi, IGHG1 CH1, IGHG1 mentese bölgesi, IGHG1 CH2 ve IGHG1 CH3'ü kodlayan cDNA sekansinin Örnek 61da açiklanan agir zincir spesifik vektöründe IGHG4 CH2 ve mentese bölgesini kodlayan bir cDNA sekansla degistirilmesiyle elde edilmistir.
Sübstitüsyon 8228P, standart PCR mutagenez teknikleriyle bir insan IGHG4 agir zincir cDNA sablonuna saglanmistir. Elde edilen agir zincir SEKANS TANlM NO: 57”ye sahiptir. Fukosile edilmemis VH6/VL9 lGHG1 antikorun üretimi, Karisik Ienfosit reaksiyonu Iki farkli insan donörden alinan kari, anti-koagülent olarak (Sarstedt, Nümbrecht, Almanya) sitratla üç 10 mL S-Monovette`de toplanmistir. Iki insan donörden alinan periferik kan mononükleer hücreler (PBMC'ler) imalatçi talimatlarina göre 50 ML Kan- Sep-Filtre Tüpleri (distribütör: Brunschwig, Basel, Isviçre) kullanilarak saflastirilmistir.
Hücreler FBS olmadan Roswell Park Memorial Institute (RPMI, PAA Laboratories, Pasching, Avusturya) besiyeriyle iki kez yikanmistir. Iki donörden alinan stimülatör hücreler 37°C'de 30 dk için 50 ug/ml mitomisin C (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Isviçre) ile inkübasyonla hazirlanmistir. Ardindan hücreler FBS olmadan RPMI ile üç kez yikanmistir ve %10 FBS (PAA Laboratories, Pasching, Avusturya), 2mM L-glutamin (Lonza, Leuven, Belçika), 100U/ml penisilin, 100 ug/ml streptomisin (Biochrom AG, Berlin, Almanya) ile RPMI'de 1x106 hücre/mL'de yeniden süspansiyon haline getirilmistir. Yanit veren hücreler, 96 gözlü U dipli mikro plakalarda (TPP, Trasadingen, Isviçre) %10 FBS, L-glutamin, 100U/ml penisilin, 100 pg/ml streptomisin ile RPMI'de yeniden süspansiyon haline getirilmistir. 50'000 stimülatör hücre ve 80'000 yanit veren hücre, her bir göze nihai 100 pl hacimle dagitilmistir.
Gözlere 100 pl antikor seyreltileri (veya yalnizca besiyer) katilmistir. Plakalar %5 CO2inkübatörde 37°C'de 7 gün süreyle inkübe edilmistir. Hücreler son 18 saat boyunca pulse edilmistir. Hücreler bir filtermat filtre (Perkin Elmer) üzerinde toplanmistir ve dâhil edilen radyoaktivitenin miktari bir Wallac beta tezgâhta (Perkin Elmer) belirlenmistir.
Sonuçlar SEKIL 8'de gösterilen sonuçlar, VH6/VL9 antikorunun 100 ng/mL civari E050 degerleriyle iki farkli birey (yanit veren) için MLR'yi etkili sekilde inhibe edebildigini gösterir. Sonuçlar ayrica kullanilan antikor formatina bagli olarak farkli bir yaniti gösterir ve farkli bireylerden MLR”de, bloklama ve sitotoksik mekanizmalarin katkisinda bir fark gözlemlenir.
Yanit veren 1'den T hücre reaktivitesi (SEKIL8A) IGHG1 ve IGHG4 formatlariyla etkili sekilde inhibe edilmistir, bu da sitotoksik mekanizmalarin yanit veren 1 için kritik olmadigini gösterir. Diger yandan IGHG4 formati yanit veren 2'den MLR'yi (SEKIL 88) yüksek konsantrasyonda yalnizca yetersiz sekilde bloke edebilmistir ve daha düsük konsantrasyonlarda etkisini hizla kaybetmistir, diger yandan IGHG1 formati mekanizmalarin, inhibitör etkisinin çogundan sorumlu olduklarina isaret eder.
Etki yolundaki bu fark, bir MLR reaksiyonundaki T hücrelerin aktivasyonunun, çogalmasinin ve sagkaliminin, allerjenik reaktivitenin ölçüsüne ve muhtemelen diger kostimülatör sinyallere bagli olarak muhtemelen bireyler arasindaki OX40 kostimülatör sinyallerine degisken olarak bagli olmasindan kaynaklanir. OX40 türevli kostimülatör sinyallerine yetersiz sekilde bagli olan bireyler için ADCC mekanizmasiyla etkinlestirilmis T hücrelerin eliminasyonu, VH6NL9'un temel etki mekanizmasidir.
Sasirtici sekilde fukosile edilmemis lGHG1 formati, her iki yanit veren için MLR'yI inhibe etme konusunda çok etkili bir kabiliyet sergilemistir. Bu gözlem, bir bloklayici mekanizma MLR inhibisyonunu saglamada yeterli olabilse de öldürücü mekanizmalarin adisyonunun veya artirilmasinin anti-OX40 antikorlarinin inhibitör etkisini iyilestirdigi gerçegini vurgular. Bu artirma, hastalarin OX40 kostimülatör durumundan bagimsiz olarak OX40 aracili rahatsizliklarini tedavi etmede, örnegin hastalar düsük OX40 ekspresyon seviyelerine sahip oldugunda özellikle yararlidir.
VH6NL9 antikoru ksenojenik graft-versus-konak hastaligini bloke eder.
Ksenojenik graft versus konak (GVH) reaksiyonu, insan hastalarda kemik iligi naklinden sonra gözlemlenen allojeneik graft versus konak hastaligi (GVHD) modelidir. GVH reaksiyonu, bir allojeneik veya ksenojenik MHC tanimasinin sonucu olarak konak ortamina saldiran graftli immün hücrelerin aracilik ettigi bir akut immün lenfositler, GVH reaksiyonlarinin temel efektör hücreleridir. VH6/VL9 antikorunun immünosüpresif etkisi, insan PBMC'leriyle SClD farelerinin yeniden konstitüsyonuna bagli olarak bir ksenojenik GVHD modelinde test edilmistir. Bu modelde insan PBMC7Ieri ve esasen T lenfositler, fare konak hücrelerine karsi güçlü bir yanit baslatirlar. Reaksiyon özellikle agir cilt ve intestinal inflamasyona ve kilo kaybina yol açar. Bu modelin en önemli sonucu, hayvanlarin sag kalmasidir.
Hayvanlar (SCID fareleri) 30 milyon insan PBMC'Ieriyle intraperitoneal olarak yeniden konstitüte edilmeden önce subletal olarak isina tabi tutulmustur. Fareler haftada iki kez TMbeta 1 antikoru enjeksiyonlariyla fare NK hücrelerinden yoksun birakilmistir. VH6/VL9 antikoru, Enbrel® veya vehikülle tedavi, art arda bes doz ve haftalik olarak i.v. yolla verilmistir ve PBMC enjeksiyonundan iki gün önce baslamistir. Hayvanlar vehikül (PBS) veya VH6/VL9 antikoruyla 10 mg/kg veya 1 mg/kg miktarinda veya Enbrel® (insan IgG1'inin Fc bilesenine kaynastirilan insan çözünür TNF reseptörü 2'nin bir füzyon proteini, Amgen-Pfizer) ile 8 mg/kg miktarinda tedavi edilmistir. Hayvanlar kilo kaybi, diyare, kürk bakimindan ve genel davranislar dahil GVHD belirtileri için haftada üç kez kontrol edilmis ve puanlanmistir.
Belirtilerin çok siddetli oldugu düsünüldügünde hayvanlar etik olarak sakrifiye edilmistir.
SEKIL 9, VH6/VL9 antikorunun düsük 1 mg/kg dozunda bile GVHD reaksiyonunu çok etkili olarak baskilamis oldugunu gösterir. Sasirtici sekilde VH6/VL9 antikoru, insanlarda GVHD'nin kabul görmüs bir tedavisi olan Enbrel®`e göre iyilestirilmis antikoruyla 1 veya 10 mg/kg miktariyla tedavi edilen hayvanlarin medyan sagkalim süresi, vehikülle tedavi edilmis grupla (Tablo 10) karsilastirildiginda dört kat daha uzun ve Enbrel® ile karsilastirildiginda iki kat daha uzun olmustur. Ayrica bu sonuç, VH6/VL9 antikorunun agonistik aktivitesi olmadigini vurgular çünkü mevcut çalismada gözlemlenmemis olan bir olay olan, bir agonistik anti-OX40 antikorunun allojeneik fare GVHD modellerinde GVHD'yi kötülestirdigi bildirilmistir (Valzasina B ve 101(9): 3741-8).
Tablo 10: Gösterilen tedavi gruplarinda medyan sagkalim süresi (gün olarak) (1mg/kg) (10mg/kg ortalamasi Vehikül: Sadece PBS. 1D4: GBR 830-1D4 antikoru; Enbrel® klinik ürün olmustur.
SEKANS LISTESI <110> Glenmark Pharmaceutical SA <120> Antibodies that bind to OX4O and their uses <130>17741/U8 <160> 89 <170> Patentln version 3.5 <210>1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 2 <210> 3 <21 1> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 3 Ala Arg Ile Asp Trp Asp Giy Phe Ala Ty:: <210>4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 4 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 6 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> heavy chain variable region sequence of 1D4 <400> 7 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> light chain variable region sequence of 1D4 <400> 8 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu <210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> DNA sequence of heavy chain variable region sequence of 1D4 <400> 9 <210> 10 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> DNA sequence of light chain variable region sequenoe of 1D4 <400> 10 <210> 11 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <400> 11 Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His 1 5 10 15 Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Vai Cys Arg Pro Cys Giy Pro Giy Phe Tyr Asn Asp Vai Vai 40 45 Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg 65 70 75 80 Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp 85 90 95 Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Giy Asp Asn Gin Ala 100 105 110 Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala 115 120 Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys 130 135 Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro 145 150 Vai Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr 165 170 Arg Pro Val Glu Vai Pro Gly Gly Arg Ala 180 185 <210> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human OX4O receptor (P43489) <400> 12 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended heavy chain CDR 1 of 1D4 <400> 13 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended heavy chain CDR 2 of 1D4 <400> 14 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended heavy chain CDR 3 of 104 <400> 15 Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Ty: <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended light chain CDR 1 of 1D4 <400> 16 Arg Ala Ser Ser Ser val Ser Tyr Met His Trp Tyr <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended light chain CDR 2 of 1D4 <400> 17 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended light chain CDR 3 of 104 <400> 18 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr <210> 19 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGHV2-70*10 <400> 19 <210> 20 <211>115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGHV2-70*01 <400> 20 Vai Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Vai Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 Va1 Ser Ser <210> 21 <211>115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGHV2-70*13 <400> 21 Gln Vai Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Cys Ala Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 <210> 22 <211>115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGHV2-5*09 <400> 22 <210> 23 <211>115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGHV2-70*11 <400> 23 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGKV3-11*O1 <400> 24 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGKV1-39*01 <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGKV1D-39*O1 <400> 26 <210> 27 <211>107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IGKV3-11*02 <400> 27 <210> 28 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human lGKV3-20*01 <400> 28 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH1 heavy chain variable domain <400> 29 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL1 light chain variable domain <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Giu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr <210> 31 <211> 720 <212> DNA <213> Artif <220> <223> VH1-VL1 SCFV CDNA <400> 31 <210> 32 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH1 heavy chain lGHG1 <400> 32 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 Ser Val Leu Thr Vai Leu Bis Gln 305 310 Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 <210> 33 <21 1> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH2 heavy chain lGHG1 <400> 33 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln l 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Ile Ala Arg Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 8D Vai Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Ty: 85 90 95 Cys Ala Arg Iie Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Giy Gln Giy Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Ram Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Giy Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Giu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Val 290 295 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 Leu Val Lys Giy Phe Tyr Pro Ser 370 375 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Leu His Asn His Ty: Thr Gln Lys 435 440 <210> 34 <21 1> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3 heavy chain lGHG1 <400> 34 <210> 35 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH4 heavy chain lGHG1 <400> 35 A511. 355 360 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 Ser Asp Giy Ser ?he ?he Leu Tyr Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 <210> 36 <21 1> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH5 heavy chain lGHG1 <400> 36 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser <210> 37 <21 1> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH6 heavy chain IGHG1 <400> 37 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175 Ser Ser Giy Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Giy Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Giu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arq 245 250 255 Thr Pro Giu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Giu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Giu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Giu Giu Gln Ty: Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Giy Lys Giu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Giu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Vai Lys Giy ?he Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Giu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gin Pro Giu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Giy Lys 435 440 445 <210> 38 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH7 heavy chain lGHG1 <400> 38 Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala 100 105 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 Ser Ser Gly Leu Ty: Ser Leu Ser Ser Val 180 185 <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL1 light Chain <400> 39 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL2 light Chain <400> 40 <210> 41 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL3 light Chain <400> 41 <210> 42 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL4 light Chain <400> 42 <210> 43 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL5 light chain <400> 43 Glu Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Ser Gly Ser Giy Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Phe Giy Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 Thr Ala Ser Vai Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Giy Leu Ser 195 200 <210> 44 <21 1> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL6 light chain <400> 44 Gin Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Met Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gln Ty: Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 Lys Val Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu 145 150 Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 <210> 45 <21 1> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL7 light chain <400> 45 <210> 46 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial A159` <220> <223> VL8 light Chain <400> 46 <210> 47 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL9 light chain <400> 47 Glu Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Trp Ty: Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 <210> 48 <211>213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL1O light chain <400> 48 Glu Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Gly Ser Giy Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Giu Ile Lys 100 105 Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 Ala Ser Val Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 <210> 49 <21 1> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL11 light Chain <400> 49 <210> 50 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain of 1D4 chimera <400> 50 <210> 51 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain of 1D4 chimera <400> 51 <210> 52 <211> 191 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <223> rat OX40 extracellular domain <400> 52 <210>53 <211>191 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human-rat OX40 extracellular domain chimera RHRR <400> 53 <210> 54 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human-rat OX40 extracellular domain chimera RHHH <400> 54 <210> 55 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human-rat OX40 extracellular domain chimera HHRR <400> 55 <210> 56 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human-ret OX40 extracellular domain chimera RRHH <400> 56 Val Thr Vai Lys Leu Asn Cys Val Lys Asp Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Asp His Thr Arg Asp Thr Val Cys His Pro Asn Glu Ala Vai Asn Tyr Asp Thr Cys Lys His Arg Ser Giy Ser Glu Leu Lys Gln Asn Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro 100 105 Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn 115 120 Bis Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser 130 135 Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu 145 150 Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala 165 170 Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Giu Val Pro 180 185 <210> 57 <21 1> 445 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH6 heavy chain lGHG4 8228P A311. <400> 57 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH6 heavy chain variable domain <400> 58 <210> 59 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH7 heavy chain variable domain <400> 59 <210> 60 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL9 light chain variable domain <400> 60 Giu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Giy Ser Giy Thr Asp Tyr Thr Leu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Giu <210> 61 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH6 heavy chain variable domain DNA coding sequence <400> 61 <210> 62 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH7 heavy chain variable domain DNA coding sequence <400> 62 <210> 63 <211>318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL9 light chain variable domain DNA coding sequence <400> 63 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 64 Giy Phe Ser Leu Ser Thr Ser Giy Met Giy <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 65 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 66 Ala Arq Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 67 <210> 68 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 68 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <400> 69 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended heavy chain CDR 1 of VH6 <400> 70 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp <210> 71 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> extended heavy chain CDR 2 of VH6 <400> 71 Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala 1 5 10 15 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended heavy chain CDR 3 of VH6 <400> 72 Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended light chain CDR 1 of VL9 <400> 73 Arg Ala Ser Ser Ser val Ser Tyr Met His Trp Tyr <210> 74 <21 1> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> extended light chain CDR 2 of VL9 <400> 74 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Arq Ala Thr <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> extended light chain CDR 3 of VL9 <400> 75 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr <210> 76 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> module 2 of human OX40 extracellular domain <400> 76 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 25 30 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg <210> 77 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH2 heavy chain variable domain <400> 77 <210> 78 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH3 heavy chain variable domain <400> 78 <210> 79 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH4 heavy chain variable domain <400> 79 Asn Gln Val10 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr <210> 80 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH5 heavy chain variable domain <400> 80 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL2 light chain variable domain <400> 81 <210> 82 <211>107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL3 light chain variable domain <400> 82 <210> 83 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL4 light chain variable domain <400> 83 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL5 light chain variable domain <400> 84 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <21 1> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL6 light chain variable domain <400> 85 Gln Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ty: 25 30 Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Giy Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Giy Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 86 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL7 light chain variable domain <400> 86 <210> 87 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL8 light chain variable domain <400> 87 <210> 88 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL1O light Chain variable domain <400> 88 <210> 89 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL11 light Chain variable domain <400> 89 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (1)

  1. ISTEMLER 1. SEKANS TANIM NO: 1'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR1'i ve SEKANS TANIM NO: 2'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir CDR2'yi ve SEKANS TANIM NO: 3,ün amino asit sekansini içeren agir zincir CDR3'ü ve SEKANS TANIM NO: 4“ün amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR1'i ve SEKANS TANIM NO: 5'in amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR2'yi ve SEKANS TANIM NO: 6'nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir CDR37Ü içeren, insan OX40'a baglanan bir antagonist antikoru veya bunun fragmani. . istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani bir murin antikoru, kimerik antikor veya bir insanlastirilmis antikordur. . istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 7, 58, 59, 79 ve 80'den olusan gruptan seçilen amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölge sekansini içerir veya SEKANS TANIM NO: 7, 58, 59, 79 veya 80'den olusan gruptan seçilen agir zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgesine en az %80 özdes olan bir agir zincir degisken bölge sekansinin bir non-CDR bölgesini içerir. . istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 35, 36, 37 ve 38'den olusan gruptan seçilen amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansini içerir veya SEKANS TANIM NO: 35, 36, 37 veya 38'den olusan gruptan seçilen agir zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgesine en az %80 özdes olan bir agir zincir degisken bölge sekansinin bir non-CDR bölgesini içerir. . Istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 19iun amino asit sekansina sahip olan IGHV2- 70*10, SEKANS TANIM NO: 20'nin amino asit sekansina sahip olan IGHV2- SEKANS TANIM NO: 22'nin amino asit sekansina sahip olan IGHV2-5*09 ve SEKANS TANIM NO: 23'ün amino asit sekansina sahip olan IGHV2-70*11'den olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesi içerir. Istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 19,un amino asit sekansina sahip olan IGHV2- 70*10 insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir agir zincir degisken çati bölgesi içerir ve burada agir zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun ilgili agir zincir degisken çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonu içerir. Istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 32'nin amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansi içerir ve burada agir zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun ilgili agir zincir degisken çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonu Istem 6 veya 7'ye göre insanlastirilmis antikor veya bunun fragmani olup, burada amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu içerir, burada her bir grup üyesinin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir. Istem 1Ie göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 8, 60, 86, 87 ve 89idan olusan gruptan seçilen amino asit sekansini içeren bir hafif zincir degisken bölge sekansini içerir veya SEKANS TANIM NO: 8, 60, 86, 87 ve 89idan olusan gruptan seçilen agir zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgesine en az %80 özdes olan bir hafif zincir degisken bölge sekansinin bir non-CDR bölgesini içerir. 10.Istem 1Ie göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 45, 46, 47 ve 49idan olusan gruptan seçilen amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansini içerir veya SEKANS TANIM NO: 45, 46, 47 veya 49`dan olusan gruptan seçilen hafif zincir sekansinin hafif zincir degisken bölge sekansinin non-CDR bölgesine en az %80 özdes olan bir non-CDR bölgesi içerir. .Istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 24'ün amino asit sekansina sahip olan IGKV3- SEKANS TANIM NO: 26'nin amino asit sekansina sahip olan IGKV1D-39*O1, SEKANS TANIM NO: 26'nin amino asit sekansina sahip olan IGKV1D-39*01, SEKANS TANIM NO: 27,nin amino asit sekansina sahip olan IGKV3-11*02 ve SEKANS TANIM NO: 28,in amino asit sekansina sahip olan lGKV3-20*O1'den olusan gruptan seçilen bir insan geninin ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesi içerir. 12.Istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani insan geni IGHV ürünü olan veya bundan elde edilen bir hafif zincir degisken çati bölgesi içerir ve burada hafif zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun hafif zincir degisken bölgesinin ilgili çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonu içerir. 13.Istem Ile göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani SEKANS TANIM NO: 39,un amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi içerir ve burada hafif zincir degisken çati bölgesi ilgili murin antikorunun ilgili hafif zincir degisken çati bölgesinden en az bir amino asit modifikasyonu 14.Istem 12 veya 13'e göre insanlastirilmis antikor veya bunun fragmani olup, gruptan seçilen amino asit pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu içerir, burada her bir grup üyesinin amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir. 15.Istem 12 veya 13,e göre insanlastirilmis antikor veya bunun fragmani olup, burada amino asit modifikasyonu amino asit pozisyonu 31'de bir amino asit delesyonunu içerir, burada amino asit pozisyonu Kabat numaralandirmasina göre gösterilir. 16.Istem 1Ie göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani (a) SEKANS TANIM NO: 37 veya SEKANS TANIM NO: 38'in amino asit sekansini içeren bir agir zincir sekansi ve (b) SEKANS TANIM NO: 47'nin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir sekansi içerir. 17.Istem 1'e göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani (a) SEKANS TANIM NO: 58 veya SEKANS TANIM NO: 59'un amino asit sekansini içeren bir agir zincir degisken bölge sekansi ve (b) SEKANS TANIM NO: 60lin amino asit sekansini içeren bir hafif zincir 18.Istem 1-17'ye göre antikor veya bunun fragmani olup, ayrica agir ve/veya hafif sabit bölgeler içermekte olup, burada insan agir sabit bölgesi IGHG1, fukosile edilmemis IGHG1 ve IGHG4lten olusan insan immünoglobulinleri grubundan seçilir. 19.Istem 1-18lden herhangi birine göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor bir monovalent antikor, bir tam boy antikor, Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, F(ab')2, scFv, bispesifik tek zincir Fv dimerleri, diyabody'ler, triyabody'ler ve ayni veya farkli bir antikora genetik olarak kaynastirilmis scFVtden olusan gruptan seçilen bir antikor fragmaninda olusan gruptan seçilir. 20.Istem 1-18tden herhangi birine göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor ana antikorun Fc bölgesine göre en az bir amino asit modifikasyonu içeren bir varyant Fc bölgesi içerirken, antikor ana antikorla karsilastirildiginda degistirilmis efektör fonksiyonu sergileyen varyant Fc bölgesi içerir. 21.Istem 1-20'den herhangi birine göre antikor veya bunun fragmani olup, burada antikor veya bunun fragmani 110 nM veya daha az olan bir afiniteyle insan OX40'a baglanir. 22.Istem 1-21'den herhangi birine göre antikoru veya bunun fragmanini kodlayan bir izole edilmis nükleik asit. 23. istem 22'ye göre izole edilmis nükleik asiti içeren bir vektör. 24.Istem 22'ye göre izole edilmis nükleik asiti veya istem 23'e göre vektörü içeren bir konak hücre. 25.Istem 24'e göre konak hücresinin kültürlenmesini, böylece nükleik asitin eksprese edilmesini ve antikorun üretilmesini içeren, insan OX40'a baglanan bir antikorun veya bunun fragmaninin üretilmesi yöntemi. 26.Istem 1-21'den herhangi birine göre antikoru veya bunun fragmanini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içeren bir bilesim. 27.Bir terapötik ajana bagli olan istem 1-21'den herhangi birine göre antikoru veya fragmanini içeren bir immünokonjugat. 28.Istem 26'ya göre bilesim olup, ayrica bir baska farmasötik olarak aktif madde 29.Bir ilaç olarak kullanilmak üzere istem 1-21'den herhangi birine göre antikor veya bunun fragmani. 30.R0mat0id artrit, otoimmün üveit, multipl skleroz, lupus (sistemik lupus eritematozus gibi) ve graft-versus-konak hastaligini (GVHD) tedavi etmeye yönelik bir yöntemde kullanilmak üzere istem 1-21'den herhangi birine göre antikor veya bunun fragmani. 31.Bir OX4O aracili bozuklugun tedavisine yönelik olarak istem 1-21'den herhangi birine göre antikoru veya bunun fragmanini, istem 26'ya veya istem 28'e göre bilesimi veya istem 27lye göre immünokonjugatu içeren bir kit.
TR2018/07040T 2011-07-11 2012-07-09 Ox40 a bağlanan antikorlar ve bunların kullanımları. TR201807040T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161506491P 2011-07-11 2011-07-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201807040T4 true TR201807040T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=46601863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/07040T TR201807040T4 (tr) 2011-07-11 2012-07-09 Ox40 a bağlanan antikorlar ve bunların kullanımları.

Country Status (29)

Country Link
US (5) US8748585B2 (tr)
EP (1) EP2731677B1 (tr)
JP (3) JP6261499B2 (tr)
KR (2) KR102119840B1 (tr)
CN (2) CN103717263B (tr)
AP (1) AP2014007415A0 (tr)
AU (2) AU2012282116B2 (tr)
BR (1) BR112014000630A2 (tr)
CA (2) CA2840460C (tr)
CL (1) CL2013003728A1 (tr)
CO (1) CO7020848A2 (tr)
CY (1) CY1120414T1 (tr)
DK (1) DK2731677T3 (tr)
EA (1) EA036047B1 (tr)
ES (1) ES2670621T3 (tr)
HK (1) HK1253936A1 (tr)
HR (1) HRP20180858T1 (tr)
HU (1) HUE037700T2 (tr)
IL (1) IL259979A (tr)
LT (1) LT2731677T (tr)
MX (1) MX353931B (tr)
PE (1) PE20142243A1 (tr)
PL (1) PL2731677T3 (tr)
PT (1) PT2731677T (tr)
SI (1) SI2731677T1 (tr)
TR (1) TR201807040T4 (tr)
UA (1) UA116873C2 (tr)
WO (1) WO2013008171A1 (tr)
ZA (1) ZA201400254B (tr)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102741287B (zh) 2009-02-17 2015-02-18 Ucb制药公司 对人ox40具有特异性的抗体分子
TWI449710B (zh) 2010-08-20 2014-08-21 Josai University Corp A monoclonal antibody having an immunosuppressive activity or an antigen-binding fragment thereof
CN103221427B (zh) 2010-08-23 2016-08-24 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
CA2840460C (en) * 2011-07-11 2022-08-16 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Antibodies that bind to ox40 and their uses
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
CN104968364A (zh) 2012-12-03 2015-10-07 百时美施贵宝公司 强化免疫调变性Fc融合蛋白的抗癌活性
US9708404B2 (en) 2012-12-21 2017-07-18 Seattle Genetics, Inc. Anti-NTB-A antibodies and related compositions and methods
SG10201708048XA (en) * 2013-03-18 2017-10-30 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
BR112016009919A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma e método para produzir in vitro uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
HUE048782T2 (hu) * 2014-03-10 2020-08-28 Richter Gedeon Nyrt Immunoglobulin tisztítása elõtisztítási lépések alkalmazásával
US10144778B2 (en) * 2014-03-12 2018-12-04 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
SG11201608106PA (en) 2014-03-31 2016-10-28 Genentech Inc Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
CN108064242B (zh) 2014-05-28 2022-10-21 阿吉纳斯公司 抗gitr抗体和其使用方法
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
SG11201704597WA (en) 2015-01-08 2017-07-28 Biontech Ag Agonistic tnf receptor binding agents
FI3265123T3 (fi) 2015-03-03 2023-01-31 Vasta-aineita, käyttöjä & menetelmiä
US9434785B1 (en) 2015-04-30 2016-09-06 Kymab Limited Anti-human OX40L antibodies and methods of treating graft versus host disease with the same
US9512229B2 (en) 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
US9139653B1 (en) 2015-04-30 2015-09-22 Kymab Limited Anti-human OX40L antibodies and methods of treatment
US20180044429A1 (en) 2015-03-09 2018-02-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
MY189692A (en) 2015-05-07 2022-02-26 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
TW201709932A (zh) * 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
AU2016329120B2 (en) * 2015-10-02 2023-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory TNF receptor
EP3363816A4 (en) * 2015-10-15 2019-10-09 Dingfu Biotarget Co., Ltd. ANTI-OX40 ANTIBODIES AND USES THEREOF
MX2018006477A (es) 2015-12-02 2018-09-03 Agenus Inc Anticuerpos y metodos de uso de estos.
WO2017134292A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-ox40 antagonistic antibodies for the treatment of atopic dermatitis
DE102016105069A1 (de) 2016-03-18 2017-09-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Antivirale Immuntherapie durch Membranrezeptorligation
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
JP6730466B2 (ja) * 2016-06-13 2020-07-29 アイ−エムエービー バイオファーマ ユーエス リミテッド 抗ｐｄ−ｌ１抗体およびその使用
RU2756236C2 (ru) 2016-06-20 2021-09-28 Кимаб Лимитед PD-L1 специфические антитела
US11046776B2 (en) 2016-08-05 2021-06-29 Genentech, Inc. Multivalent and multiepitopic antibodies having agonistic activity and methods of use
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
AU2017359467A1 (en) 2016-11-09 2019-05-02 Agenus Inc. Anti-OX40 antibodies, anti-GITR antibodies, and methods of use thereof
US11242398B2 (en) * 2017-08-01 2022-02-08 Remd Biotherapeutics, Inc. Anti-OX40 antibodies and methods of activating OX40
US11142579B2 (en) 2017-12-06 2021-10-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Variant antibodies that bind OX40
CN108218990B (zh) 2017-12-29 2021-03-02 南京优迈生物科技有限公司 分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用
SG11202011201QA (en) * 2018-05-11 2020-12-30 Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd Fully human antibodies against ox40, method for preparing same, and use thereof
WO2019219978A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-ox40 antagonistic antibodies for the treatment of autoimmune diseases
EP3802600A1 (en) * 2018-05-31 2021-04-14 Ichnos Sciences S.A. Anti-ox40 antagonistic antibodies and dosage for the treatment of ox40-mediated disorders
CA3103629A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
KR20210069058A (ko) * 2018-09-26 2021-06-10 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 항-ox40 항체, 이의 항원-결합 단편 및 약학적 용도
US20220017632A1 (en) * 2018-12-25 2022-01-20 Hanx Biopharmaceutics, Inc Anti-ox40 monoclonal antibody and application thereof
US10442866B1 (en) * 2019-01-23 2019-10-15 Beijing Mabworks Biotech Co. Ltd Antibodies binding OX40 and uses thereof
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
EP4004051A4 (en) 2019-07-19 2023-08-23 Oncoresponse, Inc. IMMUNOMODULATING ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
KR20220114595A (ko) 2019-12-17 2022-08-17 암젠 인크 치료에서의 사용을 위한 이중 인터류킨-2/tnf 수용체 효현제
CN113045655A (zh) * 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CA3184366A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Darby Rye Schmidt Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
GB202012331D0 (en) 2020-08-07 2020-09-23 Petmedix Ltd Therapeutic antibodies
US20230365709A1 (en) 2020-10-08 2023-11-16 Affimed Gmbh Trispecific binders
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
CN114685658A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 百力司康生物医药(杭州)有限公司 Ox40的靶向抗体及其制备方法和应用
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
EP4376958A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Affimed GmbH Duplexbodies
WO2023152486A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Petmedix Ltd Therapeutic antibodies
WO2024056861A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for stimulating nk cells and use thereof
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5924939A (en) 1996-09-10 1999-07-20 Cobra Golf Incorporated Golf club head with a strike face having a first insert within a second insert
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US7365167B2 (en) * 2001-11-26 2008-04-29 Cell Matrix, Inc. Humanized collagen antibodies and related methods
GB0210783D0 (en) * 2002-05-10 2002-06-19 Polonelli Luciano Anti-microbial polypeptides
US6875433B2 (en) * 2002-08-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Monoclonal antibodies and complementarity-determining regions binding to Ebola glycoprotein
EP1565493B1 (en) * 2002-11-29 2011-09-21 Rsr Limited Antibody for the thyrotropin receptor and uses thereof
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
PL2769992T3 (pl) * 2006-10-02 2021-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Przeciwciała ludzkie o wysokim powinowactwie względem ludzkiego receptora IL-4
AU2008219666A1 (en) * 2007-02-27 2008-09-04 Genentech, Inc. Antagonist OX40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
EP3239178A1 (en) * 2007-12-14 2017-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Binding molecules to the human ox40 receptor
CN102741287B (zh) 2009-02-17 2015-02-18 Ucb制药公司 对人ox40具有特异性的抗体分子
CA2753158A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Humanized antibodies that bind to cd19 and their uses
TWI449710B (zh) 2010-08-20 2014-08-21 Josai University Corp A monoclonal antibody having an immunosuppressive activity or an antigen-binding fragment thereof
CN103221427B (zh) * 2010-08-23 2016-08-24 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
US8825023B2 (en) * 2011-01-12 2014-09-02 Call Gate Co., Ltd. System and method for providing a screen switching service during call counseling and device applied thereto
CA2840460C (en) 2011-07-11 2022-08-16 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Antibodies that bind to ox40 and their uses
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

Also Published As

Publication number Publication date
CA2840460C (en) 2022-08-16
ES2670621T3 (es) 2018-05-31
DK2731677T3 (en) 2018-06-18
EP2731677A1 (en) 2014-05-21
US20140294824A1 (en) 2014-10-02
KR20200067220A (ko) 2020-06-11
CO7020848A2 (es) 2014-08-11
PT2731677T (pt) 2018-07-27
AU2012282116A1 (en) 2014-02-13
EP2731677B1 (en) 2018-04-18
US11407839B2 (en) 2022-08-09
WO2013008171A1 (en) 2013-01-17
NZ619849A (en) 2016-01-29
HK1253936A1 (zh) 2019-07-05
CA3158257A1 (en) 2013-01-17
US8748585B2 (en) 2014-06-10
EA036047B1 (ru) 2020-09-18
AU2012282116A2 (en) 2014-04-10
KR20140043811A (ko) 2014-04-10
HUE037700T2 (hu) 2018-09-28
US20130183315A1 (en) 2013-07-18
CN103717263B (zh) 2018-01-12
JP2019213520A (ja) 2019-12-19
KR102119840B1 (ko) 2020-06-09
CA2840460A1 (en) 2013-01-17
IL259979A (en) 2018-07-31
US20220411526A1 (en) 2022-12-29
AU2016204274A1 (en) 2016-07-14
PL2731677T3 (pl) 2018-08-31
CL2013003728A1 (es) 2014-10-17
CN107915775B (zh) 2022-07-12
CN107915775A (zh) 2018-04-17
AU2016204274B2 (en) 2017-12-07
BR112014000630A2 (pt) 2017-02-14
JP2018093869A (ja) 2018-06-21
JP2014523248A (ja) 2014-09-11
US20200071409A1 (en) 2020-03-05
UA116873C2 (uk) 2018-05-25
AU2012282116B2 (en) 2016-07-07
ZA201400254B (en) 2015-05-27
SI2731677T1 (sl) 2018-09-28
HRP20180858T1 (hr) 2018-09-21
EA201490053A1 (ru) 2014-08-29
CN103717263A (zh) 2014-04-09
MX2014000479A (es) 2014-02-17
CY1120414T1 (el) 2019-07-10
PE20142243A1 (es) 2015-01-11
AP2014007415A0 (en) 2014-02-28
US20170260280A1 (en) 2017-09-14
LT2731677T (lt) 2018-07-10
MX353931B (es) 2018-02-02
JP6261499B2 (ja) 2018-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11407839B2 (en) Antibodies that bind to OX40 and their uses
US20200079863A1 (en) Antibodies that bind to tl1a and their uses
JP2017536101A (ja) Ｃｃｒ６と結合する抗体およびその使用
NZ619849B2 (en) Antibodies that bind to ox40 and their uses
OA17440A (en) Antibodies that bind to TL1a and their uses.