MX2014000479A - Anticuerpos que se unen a ox40 y sus usos. - Google Patents

Anticuerpos que se unen a ox40 y sus usos.

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Antoine Attinger
Jonathan Albert Back
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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a 0X40 de humano; más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a 0X40 de humano que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y/o que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Description

ANTICUERPOS QUE SE UNEN A OX40 Y SUS USOS REFERENCIA RECÍPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos No. 61/506,491 , presentada en Julio 1 1 de 2011 , la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano. Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y/o que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN OX40 es un miembro de la superfamilia de receptores del FNTR, y se identificó primero en 1987 como una glucoproteína de 50 kDa expresada en células T CD4+ activadas de la rata (Paterson DJ et al., (1987) Mol. Immunol. 24: 1281-90). El dominio de unión a ligando extracelular de OX40 está compuesto de 3 dominios ricos en cisteína (CRDs) completos y un cuarto CDR C-terminal parcial (Bodmer JL et al., (2002) Trends Biochem. Sci. 27: 19-26). El ligando para OX40 es OX40L (CD252), y 3 copias de OX40 se unen al ligando trimérico para formar el complejo OX40-OX40L (Compaan DM y Hymowitz SG (2006) Structure, 14: 1321-1330). OX40 es un receptor unido a la membrana; sin embargo, se ha detectado también una isoforma soluble (Taylor L y Schwarz H (2001) J. Immunol. Methods, 255: 67-72). A diferencia de CD28, OX40 no es expresado constitutivamente en células T no afectadas, sino es inducido después del engranaje del receptor de células T (TCR). OX40 es una molécula co-estimuladora secundaria, expresada después de 24 a 72 horas después de la activación; su ligando, OX40L, tampoco es expresado en células en reposo que presentan antígenos, pero es expresado después de su activación. OX40 es expresado principalmente por células T CD4+ activadas, y a un grado limitado, por células T CD8+ activadas (Salek-Ardakani S et al., (2006) Curr. Immunol. Rev. 2: 37-53).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere generalmente a anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano, métodos para su preparación y uso, incluyendo métodos para tratar trastornos mediados por OX40. Los anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos de la presente invención que se unen a OX40 de humano son anticuerpos antagonistas, y no muestran efectos agonistas y/o activan a OX40 de humano tras la unión.
En un aspecto, la presente descripción provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y/o que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región de estructura variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de: IGHV2-70*10 (SEQ ID NO: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID NO: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID NO: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID NO: 22) e IGHV2-70 1 (SEQ ID NO: 23).
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y en donde la región de estructura variable de cadena pesada comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura variable de cadena pesada correspondiente del anticuerpo de murino correspondiente.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de: IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24), IGKV1 -39*01 (SEQ ID NO: 25), IGKV1D-39*01 (SEQ ID NO: 26), IGKV3-1 *02 (SEQ ID NO: 27) e IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 28).
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que comprende una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado del gen de humano IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24), y en donde la región de estructura variable de cadena ligera comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura correspondiente de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de murino correspondiente.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 38. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, que comprende: (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 o 38; y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 58, 59, 79 y 80. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 60, 86, 87 y 89.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 o 59; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde el anticuerpo comprende una región Fe de lgG4 de humano, en donde el anticuerpo no tiene actividad de citotoxicidad mediada por Fe. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde el anticuerpo comprende una región Fe de IGHG1 de humano, en donde el anticuerpo es competente para mecanismos de citotoxicidad tales como citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). En un aspecto preferido, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano tiene una región Fe de IGHG1 no fucosilada y exhibe mecanismos mejorados de citotoxicidad mediada por Fe tales como ADCC.
En otro aspecto, la descripción de la presente invención describe también anticuerpos humanizados antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen con una afinidad similar a OX40 de humano, ya que el anticuerpo quimérico correspondiente retiene, por ejemplo, por lo menos 75% de la afinidad de unión (KD) a OX40 del anticuerpo quimérico correspondiente, o tiene afinidad de unión (KD) a OX40 por lo menos equivalente o mayor cuando se compara con el anticuerpo quimérico correspondiente. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a un epítope dentro del segundo dominio de la región extracelular de OX40 de humano.
La descripción de la presente invención provee también ácidos nucleicos aislados que codifican para anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano, vectores y células hospederas que comprenden el ácido nucleico o el vector. Se proveen también composiciones que comprenden el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable e inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo enlazado a un agente terapéutico.
La presente descripción provee también métodos para tratar trastornos mediados por OX40. En un aspecto, en un modelo in vitro de activación y proliferación de células T alorreactivas (reacción mixta de linfocitos; MLR), un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo inhibe eficientemente la MLR en dos diferentes individuos (respondedores), con un valor de EC5o de aproximadamente 100 ng/mL. Además, en una reacción de injerto xenogénico contra hospedero, un modelo para enfermedad de injerto alogénico contra hospedero (GVHD) observada después del trasplante de médula ósea en pacientes humanos, un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo suprimió potencialmente la reacción de GVHD.
La presente descripción provee también kits y artículos de fabricación que comprenden el anticuerpo o fragmentos del mismo, una composición o un inmunoconjugado para el tratamiento de un trastorno mediado por OX40.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A ELISA de unión directa en OX40-his recombinante inmovilizado de humano. La unión de los anticuerpos 2F8 y 1 D4 quiméricos en OX40 de humano se midió mediante ELISA directa. Varias concentraciones (variando de 10 a 0.01mg/ml) de 1 D4 (histogramas negros) y 2F8 (histogramas blancos) se incubaron con 2 mg/ml de proteína humana recombinante marcada con OX40-his recubierta durante la noche a 4°C en una placa de 96 cavidades. La unión de cada anticuerpo a OX40 se detectó mediante un anticuerpo anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Figura 1 B: ELISA competitiva en OX40-Fc recombinante inmovilizado de humano. Se evaluaron los efectos inhibidores de 1D4 y 2F8 quiméricos sobre la interacción OX40/OX40L mediante ELISA de bloqueo. Varias concentraciones (variando de 10 a 0.01 mg/ml) de 1D4 (histogramas negros) y 2F8 (histogramas blancos) se incubaron con 2 mg/ml de proteína humana recombinante marcada con OX40-Fc recubierta durante la noche a 4°C en una placa de 96 cavidades. Después de cinco minutos, una concentración fija de OX40L recombinante biotinilado de humano (0.04 mg/ml) se añadió a cada cavidad y se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. La unión de OX40L a OX40 se detectó usando estreptavidina-HRP.
Figura 2: Reacción mixta de linfocitos (MLR) unidireccional medida mediante incorporación de timidina tritiada. Las barras muestran la incorporación media de timidina tritiada (conteos) de por lo menos triplicados ± error estándar de la media. Se muestran el control de isotipos (trastuzumab) y el control positivo (efalizumab). El efector representa sólo células efectoras. El efector más objetivo representan una medición en donde los anticuerpos se han omitido.
Figuras 3A-3B: Análisis de citometría de flujo del anticuerpo 1D4 quimérico. Figura 3A: Tinción en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) activadas de humano y células HPB-ALL. Las gráficas del histograma muestran la intensidad de fluorescencia (eje X) y el número relativo de células (% de eventos máximos - eje Y). Se indica el tipo de células teñidas. PBMCs de humano fueron activadas con PHA e IL-2 por 48 horas antes de las mediciones. Figura 3B: Tinción en PBMCs activadas de monos Cynomolgus. La unión del anticuerpo 1 D4 quimérico a OX40 de monos Cynomolgus se evaluó mediante citometría de flujo. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de sangre entera colectada de un mono Cynomolgus, y 3x106 células se cultivaron por 50 horas en presencia de 10 mg/ml de PHA y 100 U/ml de rhulL-2. Se incubaron PBMCs activadas con 25 mg/ml de anticuerpo control (perfil superior (i)) o anticuerpo de OX40 anti-humano de oveja biotinilado (perfil medio (ii)) o anticuerpo 1D4 quimérico biotinilado (perfil inferior (iii)). La unión de cada anticuerpo a OX40 de los monos Cynomolgus se detectó con estreptavidina-APC.
Figuras 4A-4F: Mediciones de los anticuerpos anti-OX40 con resonancia de plasmones de superficie. Los datos se expresan como número de respuesta (abreviado RU; eje Y) contra tiempo (eje X).
Figura 4A - anticuerpo VH L1 contra quimera de 1D4.
Figura 4B - anticuerpos humanizados basados en VH1 , VH2 y VH3 (como se indica) contra quimera de 1D4.
Figura 4C - ejemplos de enlazadores deficientes: VH4A/L4, VH5 VL4, VH5 VL5 y VH5/VL6.
Figura 4D - ejemplos de enlazadores débiles (VH5/VL9 y VH4/VL9) y buenos enlazadores (VH6/VL9 y VH7/VL9).
Figura 4E - anticuerpos humanizados basados en VH7.
Figura 4F - VH6/VL9 tiene mejores propiedades de unión sobre la quimera de 1D4 y la variante humanizada VH7/VL9.
Figuras 5A-5B: Alineación de la secuencia. Alineación de la región variable de la cadena pesada (figura 5A) o cadena ligera (figura 5B) de 1 D4 con estructuras seleccionadas de la línea germinal (IGHV 2-70*10 (SEQ ID NO: 19) e IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24)) de IMGT y variantes de la región variable con mutación retrógrada VH1 (SEQ ID NO: 29), VH2 (SEQ ID NO: 77), VH3 (SEQ ID NO: 78), VH4 (SEQ ID NO: 79), VH5 (SEQ ID NO: 80), VH6 (SEQ ID NO: 58), VH7 (SEQ ID NO: 59), VL1 (SEQ ID NO: 30), VL2 (SEQ ID NO: 81), VL3 (SEQ ID NO: 82), VL4 (SEQ ID NO: 83), VL5 (SEQ ID NO: 84), VL6 (SEQ ID NO: 85), VL7 (SEQ ID NO: 86), VL8 (SEQ ID NO: 87), VL9 (SEQ ID NO: 60), VL10 (SEQ ID NO: 88) y VL11 (SEQ ID NO: 89).
Figura 6: Mediciones de termoestabilidad del fragmento FAB del anticuerpo VH6 VL9 anti-OX40 humanizado usando calorimetría de barrido diferencial. Los datos se expresan como el exceso de la capacidad térmica molar (abreviada como Cp [kcal/mol/°C]; eje Y) contra temperatura (eje X).
Figura 7: Caracterización de epítopes. Esta figura muestra el epítope del anticuerpo VH6/VL9 anti-OX40 humanizado basado en los resultados de la prueba de ELISA como se describe en el ejemplo 7.
Figuras 8A-8B: Reacción mixta de linfocitos (MLR) medida mediante la incorporación de timidina tritiada. Las figuras 8A y 8B muestran los resultados de la reacción mixta de linfocitos a partir de dos donadores no emparentados. Se midió la proliferación mediante la incorporación de timidina tritiada. La gráfica muestra los valores absolutos del conteo para cada condición ± SEM. Las células respondedoras fueron PBMCs no tratadas, y las células estimuladoras fueron PBMCs tratadas con mitomicina. Todas las condiciones con los anticuerpos de prueba se hicieron con células respondedoras mezcladas con PBMCs estimuladoras heterólogas. El control positivo fue Efalizumab (anticuerpo anti-LFA-1).
Figura 9: Modelo de la reacción de injerto xenogénico contra hospedero. Esta figura muestra el por ciento de supervivencia dentro de los grupos de ocho animales para cada condición mencionada. Vehículo: sólo PBS. La línea de puntos vertical indica el último día de tratamiento. No se observaron ni mortalidad ni síntomas en un grupo de dos animales control irradiados que no recibieron PBMCs (no mostrado).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a anticuerpos antagonistas y fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano.
El término ??40 de humano", como se usa en la presente, incluye variantes, isoformas y homólogos de especie de OX40 de humano. Por consiguiente, los anticuerpos de esta descripción pueden reaccionar en forma cruzada, en ciertos casos, con OX40 de especies diferentes de la especie humana. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para una o más proteínas OX40 de humano, y pueden no exhibir reactividad cruzada con especies u otros tipos de especies no humanas. La secuencia de aminoácidos completa de un ejemplo de OX40 de humano tiene el número de acceso de Swiss-Prot P43489 (TNR4_HUMANO; SEQ ID NO: 12). OX40 se conoce también como CD134, TNFRSF4, ACT35 o TXGP1 L. OX40 de humano se designa como GeneID: 7293 por Entrez Gene, y HGNC: 11918 por HGNC. OX40 se ha designado también como CD134 (grupo de diferenciación 134). OX40 puede ser codificada por el gen designado como TNFRSF4/OX40.
El uso del término ??40 de humano" abarca en la presente todos los alelos y formas polimórficas conocidos o aún no descubiertos de OX40 de humano. Los términos ??40 de humano", ??40" o "receptor de OX40" se usan equivalentemente en la presente, y significan ??40 de humano", si no se indica específicamente de otra manera.
Los términos "ligando de OX40" u "OX40L" se usan equivalentemente en la presente, e incluyen al ligando de OX40, específicamente el ligando de OX40 de humano. OX40L es un miembro de la superfamilia del FNT, y se conoce también como gp34 o CD252. OX40L se ha designado también como CD252 (grupo de diferenciación 252), y tiene el número de acceso de la base de datos de secuencia P23510 (Swiss-Prot) o Q6FGS4 (Uniprot). OX40L se expresa sobre la superficie de células B activadas, células T, células dendríticas y células endoteliales.
El término "anticuerpo o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano", como se usa en la presente, incluye anticuerpos o un fragmento de los mismos que se unen a OX40 de humano, por ejemplo, OX40 de humano en forma aislada, con una afinidad (KD) de 500 nM o menos, de preferencia 200 nM o menos, más preferiblemente 150 nM o menos, más preferiblemente 120 nM o menos, aún más preferiblemente 110 nM o menos. El término "anticuerpo o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano" incluye anticuerpos o fragmentos de unión antigénicos de los mismos.
Los términos "anticuerpo antagonístico" o "anticuerpo antagonista" se usan equivalentemente en la presente, e incluyen un anticuerpo que es capaz de inhibir y/o neutralizar la actividad de señalización biológica de OX40, por ejemplo, bloqueando la unión o sustancialmente reduciendo la unión de OX40 al ligando de OX40, y de esta manera inhibiendo o reduciendo la vía de señalización desencadenada por OX40 y/o inhibiendo o reduciendo una respuesta de las células mediada por OX40 tal como proliferación de linfocitos, expresión de citocinas o supervivencia de linfocitos.
El término "anticuerpo", como es referido en la presente, incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno o cadena sencilla de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), las cuales son hipervariables en secuencia y/o están implicadas en el reconocimiento del antígeno y/o forman usualmente bucles estructuralmente definidos, entremezcladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR o FW). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FWs, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FW1, CDR1 , FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Todas las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3, y FW4 constituyen un conjunto la "región no de CDR" o "región de CDR no extendida" de VH o VL, como es referido en la presente.
El término "región de estructura variable de cadena pesada", como es referido en la presente, puede comprender una o más (por ejemplo, una, dos, tres y/o cuatro) secuencias de la región de estructura de cadena pesada (por ejemplo, estructura 1 (FW1), estructura 2 (FW2), estructura 3 (FW3) y/o estructura 4 (FW4)). De preferencia, la región de estructura variable de cadena pesada comprende FW1 , FW2 y/o FW3, más preferiblemente FW1 , FW2 y FW3. El término "región de estructura variable de cadena ligera", como es referido en la presente, puede comprender una o más (por ejemplo, una, dos, tres y/o cuatro) secuencias de la región de estructura de cadena ligera (por ejemplo, estructura 1 (FW1), estructura 2 (FW2), estructura 3 (FW3) y/o estructura 4 (FW4)). De preferencia, la región de estructura variable de cadena ligera comprende FW1 , FW2 y/o FW3, más preferiblemente FW1 , FW2 y FW3.
Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedero, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema de complementos clásico.
Los anticuerpos se agrupan en clases, referidas también como isotipos, como es determinado genéticamente por la región constante. Las cadenas ligeras constantes de humano se clasifican como cadenas ligeras kappa (CK) y lambda (??). Las cadenas pesadas se clasifican como mu (µ), delta (d), gamma (?), alfa (a) o épsilon (e), y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. De esta manera, el término "isotipo", como se usa en la presente, significa cualquiera de las clases y/o subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulina conocidos de humano son lgG1 (IGHG1), lgG2 (IGHG2), lgG3 (IGHG3), lgG4 (IGHG4), lgA1 (IGHA1), lgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD) e IgE (IGHE). El denominado gen de pseudo-gamma IGHGP de inmunoglobulina de humano representa un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de humano adicional que ha sido secuenciado, pero no codifica para una proteína debido a una región de conmutación alterada (Bensmana M et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16(7): 3108). A pesar de que tiene una región de conmutación alterada, el gen de pseudo-gamma IGHGP de inmunoglobulina de humano tiene marcos de lectura abiertos para todos los dominios constantes de cadena pesada (CH1-CH3) y gozne. Todos los marcos de lectura abiertos para sus dominios constantes de cadena pesada codifican para dominios de proteína que se alinean bien con todos los dominios constantes de inmunoglobulina de humano con las características estructurales predichas. Este isotipo pseudo-gamma adicional es referido en la presente como IgGP o IGHGP. Se han reportado otros genes de pseudo-inmunoglobulina, tales como los pseudo-genes épsilon P1 y P2 del dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina de humano (IGHEP1 e IGHEP2). La clase de IgG es la usada más comúnmente para propósitos terapéuticos. En humanos, esta clase comprende las subclases lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4. En ratones, esta clase comprende las subclases lgG1 , lgG2a, lgG2b, lgG2c e lgG3.
El término "anticuerpo quimérico", como se usa en la presente, incluye anticuerpos en los cuales las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el cual las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo de humano.
El término "anticuerpo humanizado" o "anticuerpo anti-OX40 humanizado", como se usa en la presente, incluye anticuerpos en los cuales las secuencias de la CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias de estructura de humano. Pueden hacerse modificaciones adicionales a la región de estructura dentro de las secuencias de estructura de humano, así como dentro de las secuencias de la CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero.
El término "Fab" o "región Fab", como se usa en la presente, incluye los polipéptidos que comprenden los dominios de inmunoglobulina VH, CH1 , VL y CL. El término Fab puede referirse a esta región en aislamiento, o esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo.
El término "Fe" o "región Fe", como se usa en la presente, incluye el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante. De esta manera, la región Fe se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de IgA, IgD e IgG, y los tres últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de IgE e IgM, y el gozne flexible N-terminal para estos dominios. Para la IgA y la IgM, la región Fe puede incluir la cadena J. Para la IgG, la región Fe comprende los dominios de inmunoglobulina C gamma 2 y C gamma 3 (Cy2 y Cy3) y el gozne entre C gamma 1 (Gy1) y C gamma 2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fe pueden variar, se define usualmente que la región Fe de la cadena pesada de IgG de humano comprende los residuos C226 o P230 hacia su extremo carboxilo, en donde la numeración es de acuerdo con el sistema de numeración de EU. Para la lgG1 de humano, se define en la presente que la región Fe comprende el residuo P232 hacia su extremo carboxilo, en donde la numeración es de acuerdo con el sistema de numeración de EU (Edelman GM et al., (1969) Proc Nati Acad Sci USA, 63(1): 78-85). La región Fe puede referirse a esta región en aislamiento o esta región en el contexto de un polipéptido de Fe, por ejemplo, un anticuerpo.
El término "gozne" o "región de gozne" o "región de gozne del anticuerpo", incluye en la presente el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y segundo dominios constantes de un anticuerpo. La "región de gozne", como es referida en la presente, es una región de secuencia de 6 a 62 aminoácidos de longitud, sólo presentes en la IgA, la IgD y la IgG, la cual abarca los residuos de cisteína que unen con un puente las dos cadenas pesadas. Estructuralmente, el dominio CH1 de la IgG termina en la posición de EU 220, y el dominio CH2 de la IgG comienza en la posición de EU 237. De esta manera, para la IgG, se define en la presente que el gozne del anticuerpo incluye las posiciones 221 (D221 en la lgG1) a 231 (A231 en la lgG1), en donde la numeración es de acuerdo con el sistema de numeración de EU (Edelman GM et al., citado anteriormente).
El término "anticuerpo precursor" o "inmunoglobulina precursora", como se usa en la presente, incluye un anticuerpo no modificado que es modificado posteriormente para generar una variante. Dicho anticuerpo precursor puede ser un anticuerpo de ocurrencia natural, o una versión variante o diseñada de un anticuerpo de ocurrencia natural. El anticuerpo precursor puede referirse al anticuerpo mismo, composiciones que comprenden el anticuerpo precursor, o la secuencia de aminoácidos que codifica. Por el término "anticuerpo anti-OX40 precursor", como se usa en la presente, se entiende un anticuerpo o inmunoglobulina que se une a OX40 de humano y es modificado para generar una variante. Por el término "anticuerpo de murino correspondiente", como se usa en la presente, se entiende un anticuerpo o inmunoglobulina de murino que se une a OX40 de humano, y puede ser modificado para generar una variante, específicamente el anticuerpo 1D4 de murino como se describe en la presente.
El término "anticuerpo variante" o "variante de anticuerpo", como se usa en la presente, incluye una secuencia de anticuerpo que difiere de aquella de una secuencia de anticuerpo precursor en virtud de por lo menos una modificación de aminoácido en comparación con el precursor. La secuencia de anticuerpo variante poseerá de preferencia en la presente por lo menos aproximadamente 80%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de anticuerpo precursor. La variante de anticuerpo puede referirse al anticuerpo mismo, composiciones que comprenden la variante de anticuerpo, o la secuencia de aminoácidos que codifica.
El término "modificación de aminoácido" incluye en la presente una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácido en una secuencia de polipéptidos. Por el término "sustitución de aminoácido" o "sustitución", se entiende en la presente el reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptido precursor con otro aminoácido. Por ejemplo, la sustitución R94K se refiere a un polipéptido variante, en este caso una variante de la región de estructura variable de cadena pesada, en la cual la arginina en la posición 94 es reemplazada con una lisina. Para el ejemplo anterior, 94K indica la sustitución en la posición 94 con una lisina. Para los propósitos en la presente, las sustituciones múltiples se separan típicamente mediante una diagonal. Por ejemplo, R94K/L78V se refiere a una variante doble que comprende las sustituciones R94K y L78V. Por el término "inserción de aminoácido" o "inserción", como se usa en la presente, se entiende la adición de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptidos precursora. Por ejemplo, la inserción -94 designa una inserción en la posición 94. Por el término "deleción de aminoácido" o "deleción", como se usa en la presente, se entiende la remoción de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptidos precursora. Por ejemplo, R94- designa la deleción de arginina en la posición 94.
Como se usa en la presente, se pretende que el término "modificaciones conservativas" o "modificaciones conservativas de secuencia" se refiera a modificaciones de aminoácidos que no afecten o alteren significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene a la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, inserciones y deleciones de aminoácido. Pueden introducirse modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácido son aquellas en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, uno o más residuos de aminoácido dentro de las regiones CDR o dentro de las regiones de estructura de un anticuerpo de la invención pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoácido de la misma familia de la cadena lateral, y el anticuerpo alterado (anticuerpo variante) puede ser puesto a prueba para función retenida.
Para todos los dominios constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina de humano la numeración es de acuerdo con el "sistema de numeración de EU" (Edelman GM et al., (1969) Proc Nati Acad Sci USA, 63(1): 78-85). Para el dominio constante de cadena ligera de inmunogiobulina kappa de humano (IGKC), la numeración es de acuerdo con el "sistema de numeración de EU" (Edelman GM etal., citado anteriormente).
Para los dominios constantes de la cadena ligera de inmunogiobulina lambda de humano (IGLC1 , IGLC2, IGLC3, IGLC6 e IGLC7), la numeración es de acuerdo con el "sistema de numeración de Kabat" (Kabat EA et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 5a. edición -US Department of Health and Human Services, NIH, publicación No. 91-3242), como es descrito por Dariavach P ef al., (1987) Proc Nati Acad Sci USA, 84(24): 9074-8 y Frangione B et al., (1985) Proc Nati Acad Sci USA, 82(10): 3415-9.
El término "dominio variable" se refiere a los dominios que median la unión al antígeno y definen la especificidad de un anticuerpo particular por un antígeno particular. En anticuerpos de ocurrencia natural, el sitio de unión al antígeno consiste de dos dominios variables que definen la especificidad: uno localizado en la cadena pesada (VH) y el otro localizado en la cadena ligera (VL). En algunos casos, la especificidad puede residir exclusivamente en sólo uno de los dos dominios como en los anticuerpos de dominio sencillo de los anticuerpos de cadena pesada encontrados en los camélidos. Las regiones V son usualmente de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, y consisten de tramos relativamente invariantes de secuencia de aminoácidos denominados regiones de estructura (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" que son de 9 a 12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cuatro FRs, adoptando principalmente una configuración de lámina beta, unidas por tres regiones hipervariables, las cuales forman bucles. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas juntas en estrecha proximidad por las FRs, y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat EA et al., citado anteriormente). El término "región hipervariable", como se usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR", la última siendo de más alta variabilidad de secuencia y/o implicada en el reconocimiento del antígeno. Para todos los dominios variables, la numeración es de acuerdo con Kabat (Kabat EA et al., citado anteriormente).
Muchas definiciones de la CDR están en uso y son abarcadas en la presente. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de la secuencia y es la usada más comúnmente (Kabat EA et al., citado anteriormente). Chothia se refiere más bien a la localización de los bucles estructurales (Chothia C y Lesk AM (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). La definición de AbM es un compromiso entre las definiciones de Kabat y Chothia, y es usada por el software de modelación de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (Martin ACR er a/., (1989) Proc. Nati Acad. Sci. USA, 86: 9268-72; Martin ACR et al., (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen JT et al., (1992) Immunomethods, 1 : 126-136; Rees AR et al., (1996) en Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172). La definición del contacto se ha introducido recientemente (MacCallum RM et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745), y se basa en un análisis de las estructuras complejas disponibles en el Banco de Datos de Proteínas. La definición de la CDR por IMGT®, sistema de información internacional ImMunoGeneTics® (http://www.imgt.org), se basa en la numeración de IMGT para todas las regiones V de los receptores de células T y de inmunoglobulina de todas las especies (IMGT®, sistema de información internacional ImMunoGeneTics®; Lefranc MP et al., (1991) Nucleic Acids Res. 27(1): 209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 219-21 ; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev. Comp. Immunol. 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64).
Todas las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) discutidas en la presente invención se definen de preferencia de acuerdo con IMGT®. Los residuos del dominio variable para cada una de estas CDRs, son los siguientes (numeración de acuerdo con Kabat EA, et al., citado anteriormente): LCDR1 : 27-32, LCDR2: 50-52, LCDR3: 89-97, HCDR1 : 26-35, HCDR2: 51-57 y HCDR3: 93-102. La "región no de CDR" de la región VL, como se usa en la presente, comprende las secuencias de aminoácidos: 1-26 (FR1), 33-49 (FR2), 53-88 (FR3) y 98- aproximadamente 107 (FR4). La "región no de CDR" de la región VH, como se usa en la presente, comprende las secuencias de aminoácidos: 1-25 (FR1), 36-50 (FR2), 58-92 (FR3) y 103-aproximadamente 113 (FR4).
Las CDRs de la presente invención pueden comprender "CDRs extendidas", las cuales se basan en las definiciones mencionadas anteriormente, y tienen residuos del dominio variable siguientes: LCDR1 : 24-36, LCDR2: 46-56, LCDR3: 89-97, HCDR1 : 26-36, HCDR2: 47-65, HCDR3: 93-102. Estas CDRs extendidas se enumeran también de acuerdo con Kabat et al., citado anteriormente. La "región de CDR no extendida" de la región VL, como se usa en la presente, comprende las secuencias de aminoácidos: 1-23 (FR1), 37-45 (FR2), 57-88 (FR3) y 98- aproximadamente 107 (FR4). La "región de CDR no extendida" de la región VH, como se usa en la presente, comprende las secuencias de aminoácidos: 1-25 (FR1), 37-46 (FR2), 66-92 (FR3) y 103- aproximadamente 113 (FR4).
El término "anticuerpo de longitud completa", como se usa en la presente, incluye la estructura que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, incluyendo las regiones variables y constantes. Por ejemplo, en la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos y ratones, el anticuerpo de longitud completa de la clase de IgG es un tetrámero y consiste de dos pares idénticos de dos cadenas de inmunoglobulina, cada par teniendo una cadena ligera y una cadena pesada, cada cadena ligera comprendiendo los dominios de inmunoglobulina VL y CL, y cada cadena pesada comprendiendo los dominios de inmunoglobulina VH, CH1 (Cy1), CH2 (Cy2) y CH3 (Cy3). En algunos mamíferos, por ejemplo, en camellos y llamas, los anticuerpos de IgG pueden consistir de sólo dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprendiendo un dominio variable unido a la región Fe.
Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, (i) el fragmento Fab que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 , incluyendo Fab' y Fab'-SH, (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1 , (iii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un anticuerpo sencillo, (iv) el fragmento dAb (Ward ES et al., (1989) Nature, 341 : 544-546) que consiste de un dominio sencillo variable, (v) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados, (vi) moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un enlazador de péptidos que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Bird RE et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston JS et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83), (vii) dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos (documento PCT/US92/09965), (viii) "cuerpos bivalentes" o "cuerpos trivalentes", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante la fusión de genes (Tomlinson I y Hollinger P (2000) Methods Enzymol. 326: 461-79; documento WO94/13804; Hollinger P et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-48) y (ix) scFv fusionado genéticamente con el mismo anticuerpo o un anticuerpo diferente (Coloma MJ y Morrison SL (1997) Nature Biotechnology, 15(2): 159-163).
El término "función efectora", como se usa en la presente, incluye un evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fe del anticuerpo con un receptor o ligando de la región Fe. Las funciones efectoras incluyen funciones efectoras mediadas por FcyR, tales como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo) y ADCP (fagocitosis mediada por células dependiente del anticuerpo) y funciones efectoras mediadas por el complemento, tales como CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). Una función efectora de un anticuerpo puede ser alterada alterando, es decir, aumentando o reduciendo, de preferencia aumentando, la afinidad del anticuerpo por una molécula efectora tal como un receptor de Fe o un componente del complemento. La afinidad de unión se hará variar generalmente modificando el sitio de unión de la molécula efectora, y en este caso es apropiado localizar el sitio de interés y modificar por lo menos parte del sitio en una manera adecuada. Se contempla también que una alteración en el sitio de unión en el anticuerpo para la molécula efectora no necesita alterar significativamente la afinidad de unión general, sino puede alterar la geometría de la interacción, haciendo que el mecanismo efector sea ineficaz como en la unión no productiva. Se contempla además que una función efectora pueda ser alterada también modificando un sitio no directamente implicado en la unión a la molécula efectora, sino de otra manera implicado en el desempeño de la función efectora. Mediante la alteración de una función efectora de un anticuerpo, puede ser posible controlar varios aspectos de la respuesta inmune, por ejemplo, aumentando o suprimiendo varias reacciones del sistema inmune, con efectos benéficos posibles en diagnóstico y terapia.
Como se usa en la presente, el término "trastorno mediado por OX40" incluye condiciones tales como alergia, asma, EPOC, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedades asociadas con autoinmunidad e inflamación.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye a todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. De preferencia, el sujeto es humano.
Anticuerpos anti-OX40 En un primer aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y/o que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una CDR1 de cadena pesada extendida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, y/o una CDR2 de cadena pesada extendida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y/o una CDR3 de cadena pesada extendida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y/o comprende una CDR1 de cadena ligera extendida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y/o una CDR2 de cadena ligera extendida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y/o una CDR3 de cadena ligera extendida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
De preferencia, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Más preferiblemente, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
Es bien sabido en la técnica que el dominio de la CDR3 solo, independientemente de los dominios de la CDR1 y/o la CDR2, puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo por un antígeno cognado, y que pueden generarse predeciblemente anticuerpos múltiples que tienen la misma especificidad de unión con base en una secuencia común de la CDR3. Véase, por ejemplo, Klimka A et al., (2000) Br. J. Cáncer, 83(2): 252-260 (que describe la producción de un anticuerpo anti-CD30 humanizado usando sólo la CDR3 del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD30 de murino, Ki-4); Beiboer SH et al., (2000) J. Mol. Biol. 296: 833-849 (que describe anticuerpos de la glucoproteína-2 epitelial recombinante (EGP-2) usando sólo la secuencia de la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo anti-EGP-2 MOC-31 precursor de murino); Rader C et al., (1998) Proc. Nati. Acad. Sci USA, 95: 8910-8915 (que describe un panel de anticuerpos anti-integrina a?ß3 humanizados usando un dominio de la CDR3 variable de cadena ligera y pesada de un anticuerpo anti-integrina a?ß3 de murino, LM609, en donde cada anticuerpo miembro comprende una secuencia distinta fuera del dominio de la CDR3 y capaz de unirse al mismo epítope que el anticuerpo de murino precursor con afinidades tan altas o mayores que el anticuerpo de murino precursor); y Barbas C et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-62 (que describe que el dominio de la CDR3 provee la contribución más significativa a la unión al antígeno).
Por consiguiente, la presente invención provee anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano que comprenden uno o más dominios de la CDR3 de cadena ligera y/o pesada, en particular que comprenden la CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o la CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, en donde el anticuerpo es capaz de unirse a OX40 de humano. Dentro de algunas modalidades, dichos anticuerpos inventivos que comprenden uno o más dominios de la CDR3 de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo no de humano, (a) son capaces de competir por la unión con OX40; (b) retienen las características funcionales; (c) se unen al mismo epítope; y/o (d) tienen una afinidad de unión similar que el anticuerpo no de humano precursor correspondiente, por ejemplo, anticuerpo de murino.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En otro aspecto, la presente invención provee variantes de un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano. De esta manera, la presente invención provee anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen una secuencia de aminoácidos de las regiones no de CDR de la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o ligera que es por lo menos 80% idéntica (teniendo por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos) a la secuencia de aminoácidos de las regiones no de CDR de la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo antagonista precursor de la cadena pesada o la cadena ligera, por ejemplo, de las secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada como en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, respectivamente. También anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen una secuencia de aminoácidos de las regiones de CDR no extendidas de la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o ligera que es por io menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las regiones de CDR no extendidas de la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo antagonista precursor de la cadena pesada o la cadena ligera, son provistos por la presente invención. De preferencia, la identidad de la secuencia de aminoácidos de las regiones no de CDR o de las regiones de CDR no extendidas de la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o ligera es de por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, y muy preferiblemente por lo menos 95%, en particular 96%, más en particular 97%, aun más en particular 98%, muy en particular 99%, incluyendo por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y 100%. La identidad u homología con respecto a una secuencia de aminoácidos se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos con el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, después de la alineación de las secuencias e introduciendo espacios intermedios, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia. De esta manera, la identidad de secuencia puede determinarse mediante métodos estándar que se usan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Mediante el uso de un programa de cómputo tal como BLAST o FASTA, dos polipéptidos son alineados para coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (ya sea a lo largo de la longitud completa de una secuencia o ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una secuencia o ambas secuencias). Los programas proveen una penalización por apertura predeterminada y una penalización por espacios intermedios predeterminada, y una matriz de puntuación tal como PAM250 (una matriz de puntuación estándar; véase Dayhoff MO et al., (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supl. 3) puede usarse en conjunto con el programa de cómputo. Por ejemplo, el por ciento de identidad puede calcularse como: el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100, y dividido entonces entre la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del tramo comparado y el número de espacios intermedios introducidos en las secuencias más largas para alinear las dos secuencias.
En algunas modalidades, la presente descripción provee de esta manera un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de región de estructura variable de cadena pesada que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de la región de estructura de SEQ ID NOS: 19, 20, 21 , 22 o 23 y/o una secuencia de región de estructura variable de cadena ligera que es por lo menos 60% idéntica a la secuencia de la región de estructura de SEQ ID NOS: 24, 25, 26, 27 y 28. En algunas modalidades, la presente descripción provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de región de estructura variable de cadena pesada que es por lo menos 74% idéntica a la secuencia de la región de estructura de SEQ ID NO: 19 y/o una secuencia de región de estructura variable de cadena ligera que es por lo menos 65% idéntica a la secuencia de la región de estructura de SEQ ID NO: 24.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende las CDRs de cadena pesada y/o ligera como se describió anteriormente y que comprende además una región de estructura variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de IGHV2-70*10 (SEQ ID NO: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID NO: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID NO: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID NO: 22) e IGHV2-70 1 (SEQ ID NO: 23), de preferencia una región de estructura variable de cadena pesada que es el producto de o derivado del gen de humano IGHV2-70 0 (SEQ ID NO: 19). La región de estructura variable de cadena pesada puede comprender una o más (por ejemplo, una, dos, tres y/o cuatro) secuencias de la región de estructura de cadena pesada (por ejemplo, estructura 1 (FW1), estructura 2 (FW2), estructura 3 (FW3) y/o estructura 4 (FW4)) presentes en el producto de o derivado de aquellos genes de humano. De preferencia, la región de estructura variable de cadena pesada comprende FW1, FW2 y/o FW3, más preferiblemente FW1, FW2 y FW3 presentes en el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de IGHV2-70*10 (SEQ ID NO: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID NO: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID NO: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID NO: 22) e IGHV2-70*11 (SEQ ID NO: 23). Las secuencias de la región de estructura de cadena pesada, como se usan en la presente, incluyen FW1 (posición 1 a posición 25), FW2 (posición 36 a posición 49), FW3 (posición 66 a posición 94) y FW4 (posición 103 a posición 113), en donde la posición de aminoácido se indica usando el sistema de numeración expuesto en Kabat.
En algunas modalidades, la presente descripción provee un anticuerpo o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región de estructura variable de cadena pesada que es el producto de o derivado del gen de humano IGHV2-70 0 (SEQ ID NO: 19), y en donde la región de estructura variable de cadena pesada comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura variable de cadena pesada correspondiente del anticuerpo de murino correspondiente.
En algunas modalidades, la presente descripción provee un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y en donde la región de estructura variable de cadena pesada comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura variable de cadena pesada correspondiente del anticuerpo de murino correspondiente.
De preferencia, la modificación de aminoácido comprende una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 23, 35b, 48, 50, 60 y 62, más preferiblemente en las posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de 23, 35b, 50, 60 y 62, muy preferiblemente en la posición de aminoácido 35b, en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat. Específicamente, la modificación de aminoácido comprende una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 23S, 35bG, 48L, 50H, 60N y 62A, de preferencia una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de T23S, S35bG, I48L, R50H, S60N y S62A, mientras que S35bG es la sustitución de aminoácido más preferida, en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de IGKV3-1 T01 (SEQ ID NO: 24), IGKV1 -39*01 (SEQ ID NO: 25), IGKV1D-39*01 (SEQ ID NO: 26), IGKV3-11*02 (SEQ ID NO: 27) e IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 28), de preferencia una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado del gen de humano IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24). La región de estructura variable de cadena ligera puede comprender una o más (por ejemplo, una, dos, tres y/o cuatro) secuencias de la región de estructura de cadena ligera (por ejemplo, estructura 1 (FW1), estructura 2 (FW2), estructura 3 (FW3) y/o estructura 4 (FW4)) presentes en el producto de o derivado de aquellos genes de humano. De preferencia, la región de estructura variable de cadena ligera comprende FW1, FW2 y/o FW3, más preferiblemente FW1 , FW2 y FW3, presente en el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de V3-1 1*01 (SEQ ID NO: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID NO: 25), IGKV1 D-39*01 (SEQ ID NO: 26), IGKV3-11*02 (SEQ ID NO: 27) e IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 28). Las secuencias de la región de estructura de cadena ligera, como se usan en la presente, incluyen FW1 (posición 1 a posición 23), FW2 (posición 35 a posición 49), FW3 (posición 57 a posición 88) y FW4 (posición 98 a posición 108), en donde la posición de aminoácido se indica usando el sistema de numeración expuesto en Kabat.
En algunas modalidades, la presente descripción provee un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado del gen de humano IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24), y en donde la región de estructura variable de cadena ligera comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura correspondiente de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de murino correspondiente.
En algunas modalidades, la presente descripción provee un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, y en donde la región de estructura variable de cadena ligera de la secuencia de la cadena ligera comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura variable de cadena ligera correspondiente del anticuerpo de murino correspondiente.
De preferencia, la modificación de aminoácido comprende una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 1 , 33, 34, 46, 47, 54, 56 y 71 y/o una deleción en la posición de aminoácido 31 , más preferiblemente una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 33, 34, 46, 47, 54, 56 y 71 y/o una deleción en la posición de aminoácido 31 , más preferiblemente una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 46 y/o 47, en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat. Específicamente, la modificación de aminoácido comprende una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S y 71 Y, y/o una deleción en T31 , de preferencia una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S y 71 Y, más preferiblemente una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 33M, 34H, 46P, 47W y 71Y, mientras que 46P, 47W se prefieren particularmente, en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una región de estructura variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de V2-70*10 (SEQ ID NO: 19), V2-70*01 (SEQ ID NO: 20), V2-70*13 (SEQ ID NO: 21), V2-5*09 (SEQ ID NO: 22) y V2-70*11 (SEQ ID NO: 23), y una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de V3-11*01 (SEQ ID NO: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID NO: 25), IGKV1 D-39*01 (SEQ ID NO: 26), IGKV3-11*02 (SEQ ID NO: 27) e IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 28), de preferencia una región de estructura variable de cadena pesada que es el producto de o derivado del gen de humano V2-70*10 (SEQ ID NO: 19) y una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado del gen de humano V3-11*01 (SEQ ID NO: 24). También combinaciones de las regiones de estructura variable de cadena pesada que están presentes en el producto de o derivado de diferentes genes de humano mencionados anteriormente y/o de regiones de estructura de región variable de cadena ligera que están presentes en el producto de o derivado de diferentes genes de humano mencionados anteriormente, son abarcadas por la presente invención.
Secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de cadena ligera y pesada de humano pueden encontrarse en la base de datos de secuencias de la línea germinal de humano "VBase" (disponible en la Internet en www.mrccpe. cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat EA et al., citado anteriormente; Tomlinson IM et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798 y Cox JPL et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827-836. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de cadena pesada y ligera de humano pueden encontrarse en la base de datos del Genbank.
En otro aspecto, la presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde por lo menos una de las CDRs de cadena pesada y/o por lo menos una de las CDRs de cadena ligera comprende por lo menos una modificación de aminoácido. Puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir las modificaciones, y el efecto sobre la unión al anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse en pruebas in vitro o in vivo. De preferencia, se introducen modificaciones conservativas. Las modificaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácido, pero son de preferencia sustituciones. Típicamente, no más de cinco, de preferencia no más de cuatro, más preferiblemente no más de tres, aún más preferiblemente no más de dos, muy preferiblemente no más de una modificación de aminoácido se lleva a cabo dentro de una región de CDR.
En ciertas modalidades, pueden usarse secuencias de estructura para diseñar regiones variables para producir anticuerpos variantes. Los anticuerpos variantes de la invención incluyen aquellos en los cuales se han hecho modificaciones a los residuos de estructura dentro de la VH y/o VK, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, dichas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un procedimiento de "mutar en forma retrógrada" uno o más residuos de estructura a la secuencia de murino correspondiente, o "mutar en forma retrógrada" uno o más residuos de estructura a una secuencia de la línea germinal correspondiente.
De esta manera, en otro aspecto, la presente descripción provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde por lo menos una de las secuencias de la región de estructura de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura correspondiente de la región variable de cadena pesada del anticuerpo de murino correspondiente. De preferencia, la modificación de aminoácido es una sustitución de aminoácido. Típicamente, no más de seis, de preferencia no más de cinco, de preferencia no más de cuatro, más preferiblemente no más de tres, aún más preferiblemente no más de dos, muy preferiblemente no más de una modificación de aminoácido se realizan dentro de una región de estructura. En algunas modalidades, la presente descripción provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde la modificación de aminoácido de las regiones de estructura de la región variable de cadena pesada comprende una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 23, 35b, 48, 50, 60 y 62, y en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat. Las sustituciones de aminoácido preferidas de las regiones de estructura de la región variable de cadena pesada son en las posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de 23, 35b, 50, 60 y 62. Sustituciones de aminoácido más preferidas de las regiones de estructura de la región variable de cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste de 23S, 35bG, 48L, 50H, 60N y 62A, mientras que 35bG es la sustitución de aminoácido más preferida de las regiones de estructura de la región variable de cadena pesada.
La presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, en donde por lo menos una de las secuencias de la región de estructura de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura correspondiente de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de murino correspondiente. De preferencia, la modificación de aminoácido es una sustitución de aminoácido y/o una deleción de aminoácido. Típicamente, no más de seis, de preferencia no más de cinco, de preferencia no más de cuatro, más preferiblemente no más de tres, aún más preferiblemente no más de dos, muy preferiblemente no más de una modificación de aminoácido se realizan dentro de una región de estructura. En algunas modalidades, la presente descripción provee un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, en donde la modificación de aminoácido de las regiones de estructura de la secuencia de la región variable de cadena ligera comprende una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56 y 71 y/o una deleción en la posición de aminoácido 31. Modificaciones de aminoácido más preferidas de las regiones de estructura de la secuencia de la región variable de cadena ligera comprenden una deleción en Y31 y/o una sustitución seleccionada del grupo que consiste de 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S y 71 Y, y en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat. Modificaciones de aminoácido más preferidas de las regiones de estructura de la secuencia de la región variable de cadena ligera comprenden una deleción en T31 y/o una sustitución seleccionada del grupo que consiste de 33M, 34H, 46P, 47W y 71Y, mientras que 46P y/o L47W se prefieren particularmente. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de la presente invención puede comprender modificaciones de aminoácido de las regiones de estructura de la secuencia de la región variable de cadena pesada como se expuso anteriormente y modificaciones de aminoácido de las regiones de estructura de la secuencia de la región variable de cadena ligera como se expuso anteriormente.
La presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 29, 58, 59, 77, 78, 79 y 80, de preferencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 58, 59, 79 y 80, y más preferiblemente del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 58 y 59. La presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 30, 60, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 y 89, de preferencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 60, 86, 87 y 89, más preferiblemente SEQ ID NO: 60. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 29, 58, 59, 77, 78, 79 y 80, y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 30, 60, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 y 89. Dado que cada una de estas secuencias de la región variable de cadena ligera y pesada puede unirse a OX40 de humano, las secuencias de la región variable de cadena ligera y pesada pueden ser "mezcladas y apareadas" para crear las moléculas de unión anti-OX40 de la invención. La unión a OX40 de dichos anticuerpos "mezclados y apareados" puede ponerse a prueba usando las pruebas de unión descritas, por ejemplo, en los ejemplos.
En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 58 y 59, y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 60 y 89. En modalidades más preferidas, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89. Más preferido es un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 58 y 59, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.
La presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 38, de preferencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 35, 36, 37 y 38, y más preferiblemente del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 37 y 38. La presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49, de preferencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 45, 46, 47 y 49, más preferiblemente SEQ ID NO: 47. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 38, y una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49. Dado que cada una de estas secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera puede unirse a OX40 de humano, las secuencias de la región variable de cadena ligera y pesada pueden ser "mezcladas y apareadas" para crear las moléculas de unión anti-OX40 de la invención. La unión a OX40 de dichos anticuerpos "mezclados y apareados" pueda ponerse a prueba usando las pruebas de unión descritas, por ejemplo, en los ejemplos.
En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 37 y 38, y una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 47 y 49. En modalidades más preferidas, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, o una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. Más preferido es un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 37 y 38, y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.
En una modalidad de la presente descripción, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo es un anticuerpo de murino, anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, de preferencia un anticuerpo humanizado, más preferiblemente un anticuerpo de murino monoclonal, un anticuerpo quimérico monoclonal o un anticuerpo humanizado monoclonal.
La presente descripción provee también un anticuerpo monovalente o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, es decir, un anticuerpo que consiste de un brazo individual de unión al antígeno. La presente descripción provee también un fragmento de un anticuerpo que se une a OX40 de humano seleccionado del grupo que consiste de Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos, cuerpos bivalentes, cuerpos trivalentes y scFv fusionado genéticamente con el mismo anticuerpo o un anticuerpo diferente. Fragmentos preferidos son scFv, dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos y cuerpos bivalentes. La presente descripción provee también un anticuerpo de longitud completa que se une a OX40 de humano.
La presente descripción provee también un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende además una región constante de cadena pesada y/o ligera, en particular una región constante de cadena pesada de humano y/o una región constante de cadena ligera de humano. Las regiones constantes de cadena pesada de humano pueden seleccionarse del grupo de inmunoglobulinas de humano que consisten de lgG1 (IGHG1), lgG2 (IGHG2), lgG3 (IGHG3), lgG4 (IGHG4), lgA1 (IGHA1), lgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD) o IgE (IGHE), mientras que se prefiere la región constante de cadena pesada de humano IgG, en particular lgG1 (IGHG1). La región constante de cadena ligera de humano puede seleccionarse del grupo de inmunoglobulinas de humano que consisten de las regiones constantes kappa o lambda, mientras que se prefiere la región constante kappa de humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano comprende un dominio constante de cadena pesada de lgG1 (IGHG1) de humano y un dominio constante kappa de cadena ligera de humano.
Además o en forma alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones de estructura o regiones de CDR, los anticuerpos de la invención pueden ser diseñados para que incluyan modificaciones dentro de la región Fe, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media en suero, fijación del complemento, unión al receptor de Fe y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede ser químicamente modificado (por ejemplo, una o más porciones químicas pueden ser unidas al anticuerpo) o puede ser modificado para alterar su glucosilación. Cada una de estas modalidades se describe en más detalle a continuación. Las modificaciones dentro de la región Fe como se esbozan a continuación, son de acuerdo con la numeración de EU de los residuos en la región Fe. En una modalidad, la región de gozne de CH1 es modificada de modo que el número de residuos de cisteína en la región de gozne es alterado, por ejemplo, incrementado o disminuido. Este procedimiento se describe además en la patente de los Estados Unidos No. 5,677,425 por Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región de gozne de CH1 es alterado para, por ejemplo, facilitar el ensamble de las cadenas pesada y ligera, o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad, la región de gozne de la región Fe de un anticuerpo es mutada para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácido son introducidas en la región de la zona interfacial del dominio CH2-CH3 del fragmento de gozne de la región Fe, de modo que el anticuerpo tenga unión deteriorada a la proteína A estafilocócica (SpA) respecto a la unión a la SpA del dominio de gozne de la región Fe nativa. Este procedimiento se describe en más detalle en la patente de los Estados Unidos No. 6,165,745 por Ward et al. En otra modalidad, el anticuerpo es modificado para incrementar su vida media biológica. Varios procedimientos son posibles. Por ejemplo, una o más de las siguientes mutaciones pueden ser introducidas: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,277,375 a Ward. En forma alternativa, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítope silvestre de unión al receptor tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fe de una IgG, como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,869,046 y 6,121 ,022 por Presta et al. En otra modalidad, la región Fe es alterada reemplazando por lo menos un residuo de aminoácido con un diferente residuo de aminoácido para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden ser reemplazados con un diferente residuo de aminoácido, de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando del efector, pero retenga la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo precursor. El ligando del efector para el cual la afinidad es alterada puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe o el componente C1 del complemento. Este procedimiento se describe en más detalle en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter et al. En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 329, 331 y 322 pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de modo que el anticuerpo tenga unión a C1q alterada y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o suprimida. Este procedimiento se describe en más detalle en la patente de los Estados Unidos No. 6,194,551 por Idusogie et al. En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácido 231 a 238 en la región N-terminal del dominio CH2 son alterados para alterar de esta manera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este procedimiento se describe adicionalmente en la publicación del PCT W094/29351 por Bodmer et al. En otro ejemplo más, la región Fe es modificada para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301 , 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331 , 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este procedimiento se describe adicionalmente en la publicación del PCT WO00/42072 por Presta.
La presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende regiones constantes de cadena pesada y/o ligera de humano, en donde la región constante de cadena pesada de humano comprende una variante isotípica que comprende la región CH1 , la región de gozne, la región CH2 y la región CH3 de lgG4 de humano (IGHG4), y en donde la región de gozne comprende una sustitución de serina en la posición 228 por prolina. De preferencia, el anticuerpo humanizado que comprende la variante isotípica es un anticuerpo de longitud completa. Un anticuerpo humanizado preferido particular o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una variante isotípica que comprende la región CH1 de lgG4 de humano (IGHG4), la región de gozne de lgG4 de humano (IGHG4), que tiene la sustitución S228P y las regiones CH2 y CH3 de lgG4 de humano (IGHG4), comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. Se ha encontrado que la variante isotípica no exhibe mecanismos de citotoxicidad mediada por Fe tal como ADCC, en comparación con un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región constante de cadena pesada de humano de lgG1 de humano (IGHG1) (la cual es usualmente una lgG1 nativa de humano), es decir, en comparación con un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que difiere sólo de la variante isotípica con respecto a la región constante de cadena pesada modificada.
La presente descripción provee también un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una región Fe de IgG de humano, en donde la estructura de carbohidratos del núcleo maduro unida a la región Fe de IgG de humano carece de fucosa (referida en la presente en forma alternativa como "no fucosilada"). De preferencia, el anticuerpo comprende una región Fe de lgG1 de humano (IGHG1), en donde la estructura de carbohidratos del núcleo maduro unida a la región Fe de lgG1 de humano (IGHG1) carece de fucosa. Más preferido es un anticuerpo de longitud completa que comprende una región Fe de lgG1 de humano (IGHG1), en donde la estructura de carbohidratos del núcleo maduro unida a la región Fe de lgG1 de humano (IGHG1) carece de fucosa. Se sabe del documento WO03/035835 que la falta de fucosa en la estructura de carbohidratos del núcleo maduro unida a la región Fe de IgG de humano puede aumentar la ADCC. De esta manera, en otra modalidad, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo de la presente descripción comprende una región Fe de lgG1 de humano (IGHG1), en donde la estructura de carbohidratos del núcleo maduro unida a la región Fe de lgG1 de humano (IGHG1) carece de fucosa, mientras que el anticuerpo que carece de fucosa exhibe ADCC aumentada en comparación con el anticuerpo humanizado precursor o fragmento del mismo que no carece de fucosa. Métodos para generar anticuerpos que carecen de fucosa son, por ejemplo, (a) el uso de una célula hospedera diseñada o muíante que sea deficiente en el metabolismo de la fucosa, de modo que tenga una capacidad reducida (o sea incapaz de) fucosilar las proteínas expresadas en la misma; (b) el cultivo de células bajo condiciones que prevengan o reduzcan la fucosilación; (c) la remoción post-traducción de la fucosa (por ejemplo, con una enzima fucosidasa); (d) la adición post-traducción del carbohidrato deseado, por ejemplo, después de la expresión recombinante de una glucoproteína no glucosilada; o (e) la purificación de la glucoproteína para seleccionar para el producto que no es fucosilado. Usados de preferencia son los métodos descritos en el ejemplo 14 del documento W0107095031 , por ejemplo, los métodos descritos en Longmore et al., (1982) Carbohydr. Res. 365-92 o en Imai-Nishiya et al., (2007), BMC Biotechnol. 7: 84.
Provisto también por la presente invención es un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano y el cual se une al mismo epítope que el anticuerpo que comprende la secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7 y/o la secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8. Provisto también por la presente invención es una región o epítope específico de OX40 de humano, en particular del dominio extracelular del receptor de OX40 de humano, el cual es unido por un anticuerpo provisto por la presente invención, en particular por un anticuerpo que comprende la secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7 y/o la secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8. Esta región o epítope específico del polipéptido OX40 de humano puede identificarse mediante cualquier método adecuado de mapeo de epítopes conocido en la técnica, en combinación con cualquiera de los anticuerpos provistos por la presente invención. Ejemplos de dichos métodos incluyen la selección de péptidos de longitudes variables derivados de OX40 por la unión al anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que puede unirse específicamente al anticuerpo que contiene la secuencia del epítope reconocido por el anticuerpo. Los péptidos OX40 pueden producirse sintéticamente o mediante la digestión proteolítica del polipéptido OX40. Los péptidos que se unen al anticuerpo pueden identificarse, por ejemplo, mediante análisis espectrométrico de masa. En otro ejemplo, puede usarse espectroscopia de RMN o cristalografía de rayos X para identificar el epítope unido por un anticuerpo de la presente invención. Una vez identificado, el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención puede usarse, si es requerido, como un inmunógeno para obtener anticuerpos antagonistas adicionales que se unen al mismo epítope.
Propiedades de los anticuerpos anti-OX40 Se conocen en la técnica pruebas estándar para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia, por ejemplo, OX40 de humano, e incluyen, por ejemplo, ELISAs, BIAcore®, Western blots, RIAs y análisis de citometría de flujo. Pruebas adecuadas se describen en detalle en los ejemplos. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión como KD) de los anticuerpos puede evaluarse también mediante pruebas estándar conocidas en la técnica, tales como mediante Scatchard o análisis con el sistema BIAcore®. La afinidad de unión relativa K¡ puede evaluarse mediante pruebas de competencia estándar conocidas en la técnica.
En otro aspecto, la presente invención provee anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano y que bloquean una reacción mixta de linfocitos (MLR) de humano en una manera dependiente de la dosis a un mayor grado que el anticuerpo humanizado recombinante efalizumab. El anticuerpo humanizado recombinante efalizumab se une a la subunidad CD11a del antígeno 1 asociado con la función de los linfocitos. Puede llevarse a cabo la MLR y puede medirse de acuerdo con el ejemplo 3.
En otro aspecto, la presente invención provee anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano y los cuales son también capaces de reconocer a OX40 de monos Cynomolgus. La unión de un anticuerpo anti-OX40 antagonista a células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de humano y de monos Cynomolgus puede llevarse a cabo y puede medirse de acuerdo con el ejemplo 4 y como se muestra en las figuras 3A-3B. Se encontró que el anticuerpo reconoce a OX40 que se expresa sobre la superficie de linfocitos activados de humano y de monos Cynomolgus, indicando que este anticuerpo tiene propiedades de reactividad cruzada.
En otro aspecto, la presente invención provee anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano, en particular OX40 de humano en forma aislada, con una afinidad (KD) de 500 nM o menos, de preferencia 200 nM o menos, más preferiblemente 150 nM o menos, más preferiblemente 120 nM o menos, aún más preferiblemente 110 nM o menos, por ejemplo, medida mediante resonancia de plasmones de superficie (SPR) en un instrumento BIAcore® (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza), capturando el anticuerpo sobre un chip sensor de grado investigación CM5 acoplado a proteína A (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza; BR-1000-14) con un dominio extracelular del receptor de OX40 monovalente recombinante de humano (SEQ ID NO: 11) usado como analito como se describe en los ejemplos 5 y 6 y como se ilustra en las figuras 4A-4F. El término "monovalente", como se usa en la presente con relación a mediciones de afinidad usando el receptor de OX40, se refiere a un dominio del receptor de OX40 de humano, tal como el dominio extracelular, no dimerizado o multimerizado artificialmente como sería, por ejemplo, si el dominio fuese fusionado amino-terminalmente con una porción de Fe de ¡nmunoglobulina. En un aspecto preferido, la presente invención provee un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que retiene por lo menos 75% de la afinidad de unión (KD) a OX40 del anticuerpo quimérico correspondiente. De preferencia, el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo se une a OX40 de humano con una afinidad equivalente al anticuerpo quimérico correspondiente. Por el término "afinidad equivalente" se entiende un valor de afinidad que está dentro de una escala de ±10% de la afinidad de unión a OX40 del anticuerpo quimérico correspondiente. Más preferiblemente, la presente invención provee un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano con una afinidad mayor que el anticuerpo quimérico correspondiente. En un aspecto preferido de la presente invención, se proveen anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano que tienen una afinidad de unión (KD) de 1 0 nM o menos, de preferencia 100 nM o menos, más preferiblemente 90 nM o menos, más preferiblemente 80 nM o menos, aún más preferiblemente 70 nM o menos, por ejemplo, medida mediante la técnica de resonancia de plasmones de superficie (SPR) en un instrumento BIAcore® (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza) capturando el anticuerpo sobre un chip sensor de grado investigación CM5 acoplado a proteína A (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza; BR-1000-14) con un dominio extracelular del receptor de OX40 monovalente recombinante de humano (SEQ ID NO: 11) usado como analito como se detalla en los ejemplos 5 y 6 y como se ilustra en las figuras 4A-4F.
Otro aspecto de la presente invención provee anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano y que tienen buena estabilidad térmica. En una modalidad preferida, un anticuerpo humanizado antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano tiene un fragmento FAB cuya temperatura de termoestabilidad es mayor de 70°C, de preferencia mayor de 75°C, más preferiblemente mayor de 80°C, y aún más preferiblemente mayor de 85°C. Para el análisis de la termoestabilidad del fragmento FAB se usan mediciones de calorimetría de barrido diferencial, en vista de que se identifica una temperatura de fusión de punto medio del fragmento FAB en el contexto de una IgG de longitud completa. Estos tipos de mediciones calorimétricas son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden llevarse a cabo de acuerdo con, por ejemplo, Garber y Demarest (2007), BBRC, 355: 751-7, como se describe adicionalmente en el ejemplo 6 y se muestra en la figura 6.
En otro aspecto, la presente invención describe anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que se unen a un epítope en la región extracelular de OX40 de humano. Como se describe en el ejemplo 7 y como se muestra en la figura 7, uno o más de los cuatro dominios de la región extracelular de OX40 fueron intercambiados entre secuencias de humano y de rata y proteínas de fusión de Fe generadas. Una ELISA de unión se llevó a cabo entonces para poner a prueba la reactividad de un anticuerpo humanizado antagonista en la región extracelular de OX40 de humano, la región extracelular de OX40 de rata y cuatro proteínas quiméricas de humano-rata. De esta manera, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que mapea dentro del segundo dominio de la región extracelular de OX40 de humano.
La presente invención provee también anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos que pueden usarse para suprimir reacciones inmunes. El efecto de un anticuerpo anti-OX40 humanizado antagonista se puso a prueba en una MLR (véase el ejemplo 8) usada como un modelo in vitro de activación y proliferación de células T alorreactivas (O'Flaherty E et ai, (2000) Immunology, 100(3): 289-99; DuPont B y Hansen JA (1976) Adv. Immunol. 23: 107-202). Se mezclaron PBMCs de dos donadores no emparentados, resultando en la activación de células T y una proliferación de linfocítos T. Además, tres diferentes formatos del anticuerpo anti-OX40 humanizado antagonista se pusieron a prueba en esta prueba: un formato de lgG1 (IGHG1), un formato de lgG1 no fucosilada (IGHG1) y un formato de lgG4 (IGHG4), para determinar adicionalmente la contribución de mecanismos citotóxicos tales como la ADCC sobre la inhibición de la MLR. El anticuerpo anti-OX40 humanizado antagonista inhibió eficientemente la MLR en dos diferentes individuos (respondedores) con valores de EC50 de aproximadamente 100 ng/mL. Sin embargo, los resultados mostraron una diferencia dependiendo del formato del anticuerpo usado. En el primer individuo (respondedor 1), la reactividad de las células T fue inhibida eficientemente por los formatos de los anticuerpos de lgG1 (IGHG1) e lgG4 (IGHG4), indicando que los mecanismos citotóxicos no son críticos para este individuo. Para el segundo individuo (respondedor 2), el formato de lgG1 (IGHG1) logró más de 60% de inhibición, mientras que el formato de lgG4 (IGHG4) sólo bloqueó deficientemente la MLR. En ambos individuos, el formato de lgG1 no fucosilada (IGHG1) fue muy eficaz para inhibir la MLR. Estos resultados indican que el bloqueo de la activación de OX40 puede ser suficiente en algunos individuos para inhibir la MLR, pero este efecto puede ser aumentado ampliamente por mecanismos citotóxicos adicionales. Por lo tanto, para el tratamiento de pacientes que sufren de trastornos mediados por OX40, en donde el trastorno parece ser independiente del estado co-estimulador de OX40 de los pacientes, por ejemplo, pacientes con bajos niveles de expresión de OX40, la administración de un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano y el cual tiene mecanismos citotóxicos aumentados, puede ser particularmente efectiva. Una modalidad preferida de la presente invención provee un anticuerpo humanizado antagonista que se une a OX40 de humano para el tratamiento de un paciente que sufre de un trastorno mediado por OX40. Además, el paciente puede tener bajos niveles de expresión de OX40. De preferencia, el anticuerpo humanizado antagonista que se une a OX40 de humano comprende una región de lgG1 (IGHG1). Más preferiblemente, el anticuerpo humanizado antagonista que se une a OX40 de humano comprende una región de lgG1 no fucosilada.
En otro aspecto de la presente invención, el efecto de un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo se demostró en una reacción de injerto xenogénico contra hospedero, en la cual ratones SCID fueron reconstituidos con PBMCs de humano. Esta reacción provee un modelo para la enfermedad de injerto alogénico contra hospedero (GVHD) observada después del trasplante de médula ósea en pacientes humanos. En este modelo, PBMCs y linfocitos T de humano en particular, lanzan una fuerte respuesta contra las células hospederas de ratón que da lugar a síntomas inflamatorios severos. Como se describe en el ejemplo 9 y como se muestra en la figura 9 y el cuadro 10, un anticuerpo humanizado antagonista que se une a OX40 de humano suprimió potentemente la reacción de la GVHD a una dosis de 1 mg/kg. En forma sorprendente, este anticuerpo demostró una mejor eficacia que Enbrel®, una terapia reconocida para la GVHD (Xhaard A et al., (201 1) Bull. Cáncer, 98(8): 889-99; Simpson D (2001) Expert Opin. Pharmacother. 2(7): 1109-17). Por lo tanto, en una modalidad preferida, la presente invención provee un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano y el cual es efectivo en el tratamiento de la GVHD. De preferencia, la administración del anticuerpo a un sujeto resulta en una mejora de cuatro veces en el valor medio de supervivencia (días) en comparación con la administración de vehículo. Más preferiblemente, la administración del anticuerpo a un sujeto resulta en una mejora de dos veces en el valor medio de supervivencia (días) en comparación con la administración de Enbrel®. La presente invención provee por lo tanto un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que es más efectivo que Enbrel® en el tratamiento de un paciente con GVHD y/o en la supresión de la GVHD. Además, se ha reportado que los anticuerpos de unión anti-OX40 agonistas empeoran la GVHD en modelos de GVHD en el ratón alogénico (Valzasina B et al., (2005) Blood, 105(7): 2845-51 ; Blazar BR et al., (2003) Blood, 101 (9): 3741-8); por lo tanto, puede concluirse del ejemplo 9, que los anticuerpos antagonistas y fragmentos de los mismos de la presente invención no muestran efectos agonistas sobre la unión a OX40 de humano, ya que ningún empeoramiento de la GVHD se observó en el modelo. Por lo tanto, la presente invención provee un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano y que no muestra actividad agonista sobre la unión. Ácidos nucleicos, vectores y células hospederas La presente descripción provee también ácidos nucleicos aislados que codifican para los anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen a OX40 de humano, vectores y células hospederas que comprenden el ácido nucleico o el vector. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado de células, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se hace que sea sustancialmente puro", cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, que incluyen tratamiento alcalino/con SDS, efecto de banda de CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, y puede o no contener secuencias de intrones. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse usando técnicas estándar de biología molecular, por ejemplo, moléculas de ADNc que codifiquen para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo o que codifiquen para los segmentos VH y VL, y pueden obtenerse mediante técnicas de clonación de ADNc o de amplificación por PCR estándar. Para anticuerpos obtenidos de una colección de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, usando técnicas de exhibición de fagos), uno o más ácidos nucleicos que codifiquen para el anticuerpo pueden recuperarse de la colección. Los métodos para introducir ácido nucleico exógeno en células hospederas son bien conocidos en la técnica, y variarían con la célula hospedera usada. Las técnicas incluyen, pero no están limitadas a, transfección mediada por dextrán, precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con cloruro de calcio, transfección mediada por polietilenimina, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, infección por virus o fagos, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en núcleos. En el caso de células de mamífero, la transfección puede ser transitoria o estable.
Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son aquellas que codifican para la secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 38 y/o la secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49. Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son aquellas que codifican para la región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 29, 58, 59, 77, 78, 79 y 80 y/o la región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 30, 60, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 y 89.
Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son aquellas que codifican para la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8 y/o la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 7, por ejemplo, ADN que codifica para la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 y/o ADN que codifica para la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10. Las moléculas de ácido nucleico más preferidas de la invención son aquellas que codifican para la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58 o 59 y/o la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 60, por ejemplo, ADN que codifica para la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOS: 61 o 62 y/o ADN que codifica para la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 63, las cuales son más preferidas.
Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican para los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden ser manipulados adicionalmente mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de la cadena de anticuerpo de longitud completa, o en fragmentos de genes que correspondan a los fragmentos descritos anteriormente, tales como los genes del fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica para VH o VL es enlazado operativamente a otro fragmento de ADN que codifica para otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. Se pretende que el término "enlazado operativamente", como se usa en este contexto, signifique que los dos fragmentos de ADN son unidos de modo que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en el marco de lectura. El ADN aislado que codifica para la región VH puede ser convertido en un gen de cadena pesada de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica para VH con otra molécula de ADN que codifica para las regiones constantes de cadena pesada (CH1 , CH2 y CH3). Las secuencias de genes de la región constante de cadena pesada de humano se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat EA et al., citado anteriormente), y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG1 (IGHG1 ), lgG2 (IGHG2), lgG3 (IGHG3), lgG4 (IGHG4), lgA1 (IGHA1), lgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD) o IgE (IGHE), pero más preferiblemente es una región constante de lgG1 (IGHG1). Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica para VH puede ser enlazado operativamente con otra molécula de ADN que codifica para sólo la región constante CH1 de cadena pesada. El ADN aislado que codifica para la región VL puede ser convertido en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) enlazando operativamente el ADN que codifica para VL con otra molécula de ADN que codifica para la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de la región constante de cadena ligera de humano se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat EA et al., citado anteriormente.), y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. En modalidades preferidas, la región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, de preferencia una región constante kappa. Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican para VH y VL son enlazados operativamente con otro fragmento que codifica para un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica para la secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser3), de modo que las secuencias de VH y VL puedan ser expresadas como una proteína contigua de cadena sencilla, con las regiones VH y VL unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird RE et al., (1988) Science, 242: 423-426; Huston JS et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83; McCafferty J et al., (1990) Nature, 348: 552-554). Varias técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto K et ai, (1992) J. Biochem. and Biophysical Methods, 24: 107-117, y Brennan M et al., (1985) Science, 229: 81-3). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por medio de células hospederas recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las colecciones de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. En forma alternativa, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli, y pueden ser acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter P et al., (1992) Bio/Technology, 10: 163-167). De acuerdo con otro procedimiento, pueden aislarse directamente fragmentos F(ab')2 del cultivo de células hospederas recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para los expertos en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, el documento WO 1993/16185; la patente de los Estados Unidos No. 5,571 ,894 y la patente de los Estados Unidos No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,641 ,870, por ejemplo.
Los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos de la presente invención pueden ser incorporados en un vector, de preferencia un vector de expresión para expresar la proteína. Una variedad de vectores de expresión puede usarse para la expresión de proteínas. Los vectores de expresión pueden comprender vectores extracromosómicos auto-replicables o vectores que se integran en el genoma de un hospedero. Se construyen vectores de expresión que sean compatibles con el tipo de célula hospedera. De esta manera los vectores, de preferencia los vectores de expresión que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos que permiten la expresión de proteínas en células de mamífero, bacterias, células de insecto, levaduras, y en sistemas in vitro. Como se sabe en la técnica, está disponible una variedad de vectores de expresión, comercialmente o de otro modo, que pueden encontrar uso en la presente invención para la expresión de anticuerpos.
Los vectores de expresión comprenden típicamente una proteína enlazada operablemente con secuencias de control o reguladoras, marcadores seleccionabas, cualquier miembro de fusión, y/o elementos adicionales. Por el término "enlazado operablemente", se entiende en la presente que el ácido nucleico es puesto en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). En general, estos vectores de expresión incluyen un ácido nucleico regulador de la transcripción y traducción enlazado operablemente con el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, y son típicamente apropiados para la célula hospedera usada que expresa la proteína. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y traducción pueden incluir secuencias de promotor, sitios de unión del ribosoma, secuencias de inicio y detención de la transcripción, secuencias de inicio y detención de la traducción, y secuencias de intensificador o activador. Como se sabe también en la técnica, los vectores de expresión contienen típicamente un gen o marcador de selección que permite la selección de las células hospederas transformadas que contienen al vector de expresión. Los genes de selección son bien conocidos en la técnica, y variarán con la célula hospedera usada. Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la cual el vector ha sido introducido. Genes marcadores seleccionares preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospederas dhfr- con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para selección por G418).
Células hospederas adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente son células procarióticas, de levadura o células eucarióticas superiores. Procariontes adecuados para este propósito incluyen eubacterias, que incluyen organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escheríchia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimuríum, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Hospederos de clonación de E. coli adecuados incluyen E. coli 294 (ATCC 31 ,446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 ,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Además de procariontes, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son hospederos de clonación o expresión adecuados. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común del pan, es el usado más comúnmente entre los microorganismos hospederos eucarióticos inferiores. Sin embargo, muchos otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y son útiles, tales como los hospederos Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, que incluyen a K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. walth (ATCC 56,500), K. drosopmarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans o K. marxianusyarrowia (documento EP402226); Pichia pastorís (documento EP183070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos que incluyen a los hospederos Neurospora, Penicillium, Tolypocladium o Aspergillus, tales como A nidulans o A. niger.
Células hospederas adecuadas para la expresión de los anticuerpos de la invención se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plaril y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y que corresponden a células hospederas de insecto permisivas de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y dichos virus pueden usarse, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate y tabaco pueden usarse también como hospederos.
Las células hospederas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención son de preferencia células hospederas de mamífero que incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo las células CHO dhfr", descritas en Urlaub G y Chasin LA (1980) Proc. Nati. Acad. Sci, USA, 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman RJ y Sharp PA (1982) J. Mol. Biol, 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión de genes GS descrito en los documentos WO 87/04462 (a Wilson), WO 89/01036 (a Bebbington) y EP338841 (a Bebbington). Cuando se introducen genes de anticuerpos recombinantes en células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas por un período suficiente que permita la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, más preferiblemente, para la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las células hospederas se cultivan. Células hospederas útiles para la producción de anticuerpos que se unen a OX40 de humano pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios disponibles comercialmente tales como medio F10 de Ham (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza), medio mínimo esencial (MEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH), medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Basel, Suiza), y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH), son adecuados para el cultivo de las células hospederas. Pueden recuperarse los anticuerpos del medio de cultivo usando métodos estándar de purificación de proteínas.
Los anticuerpos pueden ser enlazados operablemente a un miembro de fusión que permita el direccionamiento de la proteína expresada, así como los pasos de purificación, selección, exhibición, y similares. Los miembros de fusión pueden ser enlazados a la secuencia del anticuerpo por medio de las secuencias de un enlazador. La secuencia del enlazador comprenderá en general un pequeño número de aminoácidos, típicamente menos de 10, aunque pueden usarse también enlazadores más largos. Típicamente, se seleccionan secuencias de un enlazador que sean flexibles y resistentes a la degradación. Como los expertos en la técnica apreciarán, cualquiera de una amplia variedad de secuencias puede usarse como enlazadores. Por ejemplo, una secuencia de enlazador común comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS. Un miembro de fusión puede ser una secuencia de direccionamiento o de señal que dirija al anticuerpo y cualquier miembro de fusión asociado, hacia un sitio celular deseado o hacia el medio extracelular. Como se sabe en la técnica, ciertas secuencias de señalización pueden elegir como objetivo una proteína para que sea secretada en el medio de crecimiento, o en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interior y exterior de la célula. Un miembro de fusión puede ser también una secuencia que codifique para un péptido o proteína que permita la purificación y/o selección. Dichos miembros de fusión incluyen, pero no están limitados a, marcadores de polihistidina (marcadores His) (por ejemplo, H6 y H10 u otros marcadores para su uso con sistemas de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) (por ejemplo, columnas de afinidad por Nf2)), fusiones de GST, fusiones de MBP, marcadores de estreptavidina, la secuencia objetivo de biotinilación BSP de la enzima bacteriana BirA, y marcadores de epítopes que son elegidos como objetivo por anticuerpos (por ejemplo, marcadores c-myc, marcadores flag, y similares). Como los expertos en la técnica apreciarán, dichos marcadores pueden ser útiles para purificación, para selección, o ambas.
Construcción v producción de anticuerpos Los anticuerpos generados contra el polipéptido OX40 pueden obtenerse mediante la inmunización de un animal, es decir, administrando los polipéptidos a un animal, de preferencia un animal no humano, usando protocolos de rutina y bien conocidos; véase, por ejemplo, Handbook of Experimental Immunology (Weir DM (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos pueden ser inmunizados. Sin embargo, ratones, conejos, cerdos y ratas, en particular ratones, son generalmente más adecuados. Pueden producirse anticuerpos también mediante técnicas de ADN recombinante conocidas por los expertos en la técnica. Además, pueden producirse anticuerpos mediante la digestión enzimática o química de anticuerpos de ocurrencia natural. Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden construirse transfiriendo una o más CDRs o porciones de las mismas de las regiones VH y/o VL de un animal no humano (por ejemplo, ratón) a una o más regiones de estructura de las regiones VH y/o VL de humano. Opcionalmente, los residuos de estructura de humano presentes de esta manera en las regiones VH y/o VL pueden ser reemplazados por residuos no de humano (por ejemplo, ratón) correspondientes cuando sea necesario o se desee para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o para mantener la afinidad de unión. Opcionalmente, los residuos de aminoácido no de humano presentes en las CDRs pueden ser reemplazados con residuos de humano. Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención pueden prepararse con base en la secuencia de un anticuerpo monoclonal no de humano preparado como se describió anteriormente. ADN que codifica para las ¡nmunoglobulinas de cadena ligera y pesada puede obtenerse del hibridoma no de humano de interés, y puede ser diseñado para que contenga secuencias de inmunoglobulina no de murino (por ejemplo, humano) usando técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, regiones variables de murino pueden ser enlazadas a regiones constantes de humano usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,816,567 a Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de murino pueden ser insertadas en una región de estructura de humano usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,225,539 a Winter, y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,530,101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 a Queen et al.).
Pueden construirse los anticuerpos humanizados de la presente invención, en donde la molécula aceptora de humano para la región variable de cadena pesada se selecciona con base en consideraciones de homología entre las regiones variables de la molécula aceptora potencial y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de murino. Moléculas aceptoras candidatas de la línea germinal de humano se prefieren para reducir la inmunogenicidad potencial. Se compilan bases de datos de la línea germinal de secuencias de anticuerpo que leen a través del extremo de la región FW3 de cadena pesada y parcialmente en la secuencia de la CDR3. Para la selección de una región FW4, pueden buscarse bases de datos de secuencias de anticuerpo maduras que se hayan derivado de la molécula de la línea germinal seleccionada, o pueden usarse secuencias de anticuerpo que se hayan derivado de la molécula de la línea germinal seleccionada de un donador humano. Las moléculas aceptoras de humano se seleccionan de preferencia de la misma clase de cadena pesada que la molécula donadora de murino, y de la misma clase estructural canónica de la región variable de la molécula donadora de murino. Consideraciones secundarias para la selección de la molécula aceptora de humano para la región variable de cadena pesada eluden la homología en la longitud de la CDR entre la molécula donadora de murino y la molécula aceptora de humano. Las moléculas de anticuerpo aceptoras de humano se seleccionan de preferencia mediante la búsqueda de homología con la base de datos V-BASE, aunque pueden usarse también otras bases de datos tales como la base de datos de Kabat y la base de datos pública del NCBI.
Pueden construirse los anticuerpos humanizados de la presente invención, en donde la molécula aceptora de humano para la región variable de cadena ligera se selecciona con base en consideraciones de homología entre las regiones variables de la molécula aceptora potencial y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de murino. Moléculas aceptoras candidatas de la línea germinal de humano se prefieren para reducir la inmunogenicidad potencial. Se compilan bases de datos de la línea germinal de secuencias de anticuerpo que leen a través del extremo de la región FW3 de cadena pesada y parcialmente en la secuencia de la CDR3. Para la selección de una región FW4, pueden buscarse bases de datos de secuencias de anticuerpo maduras que se hayan derivado de la molécula de la línea germinal seleccionada, o pueden usarse secuencias de anticuerpo que se hayan derivado de la molécula de la línea germinal seleccionada de un donador humano. Las moléculas aceptoras de humano se seleccionan de preferencia de la misma clase de cadena ligera que la molécula donadora de murino, y de la misma clase estructural canónica de la región variable de la molécula donadora de murino. Consideraciones secundarias para la selección de la molécula aceptora de humano para la región variable de cadena ligera eluden la homología en la longitud de la CDR entre la molécula donadora de murino y la molécula aceptora de humano. Las moléculas de anticuerpo aceptoras de humano se seleccionan de preferencia mediante la búsqueda de homología con la base de datos V-BASE, aunque pueden usarse también otras bases de datos tales como la base de datos de Kabat y la base de datos pública del NCBI. Métodos para humanizar un anticuerpo no humano se describen en la presente, que se incluyen el ejemplo 6, más adelante.
La presente invención provee un método para producir un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, que comprende cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano o un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, de modo que el ácido nucleico es expresado y el anticuerpo producido. De preferencia, el anticuerpo es aislado. Para células hospederas, ácidos nucleicos y vectores, pueden usarse los descritos anteriormente. La expresión de los ácidos nucleicos puede lograrse, por ejemplo, mediante una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como es bien sabido en la técnica (véase, por ejemplo, Morrison S (1985) Science 229: 1202), y como adicionalmente se esbozó anteriormente. Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, moléculas de ADN que codifican para las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, pueden obtenerse mediante técnicas estándar de biología molecular (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que exprese el anticuerpo de interés), y las moléculas de ADN pueden ser insertadas en vectores tales como vectores de expresión. Se eligen el vector de expresión y las secuencias de control de la expresión que sean compatibles con la célula hospedera de expresión usada. El gen de la cadena ligera de anticuerpo y el gen de la cadena pesada de anticuerpo pueden ser insertados en un vector separado o, más típicamente, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo son insertados en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento y vector del gen del anticuerpo, o ligación del extremo rasurado si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos descritos en la presente pueden usarse para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo, insertándolos en vectores de expresión que ya codifican para las regiones constantes de cadena ligera y las regiones constantes de cadena pesada del isotipo deseado, de modo que el segmento VH sea enlazado operativamente a los segmentos CH1 dentro del vector, y el segmento VK sea enlazado operativamente al segmento CK dentro del vector.
Caracterización y purificación de los anticuerpos anti-OX40 La selección de los anticuerpos puede llevarse a cabo usando pruebas que miden la unión a OX40 de humano y/o pruebas que miden la capacidad para bloquear la unión de OX40 a su ligando, OX40L. Un ejemplo de una prueba de unión es una ELISA, en particular, usando una proteína de fusión de OX40 de humano y una región Fe de humano, la cual es inmovilizada en placas, y usando un anticuerpo secundario conjugado que detecte el anticuerpo anti-OX40 unido a la proteína de fusión. Un ejemplo de una prueba de bloqueo es una prueba basada en citometría de flujo que mide el bloqueo de la unión de la proteína de fusión del ligando de OX40 a OX40 en células CD4 de humano. Un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia se usa para detectar la cantidad de la proteína de fusión del ligando de OX40 que se une a la célula. Esta prueba busca una reducción en la señal conforme el anticuerpo en el sobrenadante bloquea la unión de la proteína de fusión del ligando a OX40. Otro ejemplo de una prueba de bloqueo es una prueba en donde el bloqueo de la co-estimulación de células T no afectadas de humano mediada por la proteína de fusión del ligando de OX40 recubierta a una placa se mide midiendo la incorporación de timidina. Como una prueba para evaluar la actividad funcional de los anticuerpos anti-OX40, por ejemplo, la reducción de la activación de células T, puede usarse la reacción mixta de linfocitos (MLR) de humano como se describe en los ejemplos 3 y 8.
Los anticuerpos de la presente invención pueden aislarse o purificarse en una variedad de modos conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos de purificación estándar incluyen técnicas cromatográficas, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, de interacción hidrofóbica, de afinidad, de dimensionamiento o filtración en gel, y de fase invertida, llevadas a cabo a presión atmosférica o a alta presión usando sistemas tales como FPLC y HPLC (CLAR). Los métodos de purificación incluyen también técnicas electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, de diálisis y de cromatoenfoque. Son también útiles las técnicas de ultrafiltración y diafiltración en conjunto con la concentración de proteínas. Para purificar los anticuerpos de OX40, pueden cultivarse células hospederas seleccionadas, por ejemplo, en matraces rotatorios para la purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden ser filtrados y concentrados antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sepharose (sefarosa) (Pharmacia, Piscataway, NJ). Pueden verificarse los anticuerpos eluidos mediante electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alto rendimiento para garantizar la pureza. Un anticuerpo preferido de la presente invención es de esta manera un anticuerpo aislado y/o purificado que se une a OX40 de humano.
Inmunoconjugados En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo de OX40 antagonista o un fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, enlazado a un agente terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados son referidos en la presente como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas son referidos como "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, destruir) las células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen también, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracilo, dacarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) y cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Otros ejemplos de citotoxinas terapéuticas que pueden ser enlazadas a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maytansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo y caliqueamicina está disponible comercialmente ( ylotarg(R); American Home Products). Las citotoxinas pueden ser enlazadas a los anticuerpos de la invención usando las tecnologías de enlazadores disponibles en la técnica. Ejemplos de tipos de enlazadores que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, enlazadores que contienen hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y péptidos. Puede seleccionarse un enlazador que sea susceptible, por ejemplo, a la escisión por un pH bajo dentro del compartimiento lisosómico o susceptible a la digestión por proteasas, tales como las proteasas expresadas preferiblemente en un tejido tumoral, tales como las catepsinas (por ejemplo, las catepsinas B, C, D). Para más discusión de los tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos, véase también Saito G et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail PA er a/., (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne G (2003) Cáncer Cell, 3: 207-212; Alien TM (2002) Nat. Rev. Cáncer, 2: 750-763; Pastan I y Kreitman RJ (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs, 3: 1089-1091 ; y Senter PD y Springer CJ, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser enlazados también a un isótopo radiactivo para generar radiofarmacéuticos citotóxicos, referidos también como radioinmunoconjugados. Ejemplos de isótopos radiactivos que pueden ser conjugados con anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no están limitados a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Métodos para preparar radioinmunoconjugados están establecidos en la técnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados están disponibles comercialmente, incluyendo Zevalin® (EDEC Pharmaceuticals) y Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), y pueden usarse métodos similares para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invención. Los inmunoconjugados de anticuerpos de la invención pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada, y no se considerará que la porción de fármaco se limita a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tales como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral o interferón-?; o modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL- 1 "), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.
Técnicas para enlazar dichos agentes terapéuticos a anticuerpos son bien conocidos; véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al., (eds ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a. ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe PE y Ross WC (1982) Immunol. Rev. 62: 119-58.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo de OX40 antagonista o un fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, administrado en conjunto con un agente terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina.
Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención provee una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo, de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, y/o inmunoconjugados de la invención y/o un agente terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina como se describió anteriormente. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados) que se unen a diferentes epítopes en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse también en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo de OX40 antagonista de la presente invención combinado con por lo menos algún otro agente antiinflamatorio o inmunosupresor.
Como se usa en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y que retardan la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. De preferencia, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo o inmunoconjugado, puede ser recubierto en un material para proteger al compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar al compuesto.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o una dispersión. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Salvo hasta donde algún medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. Compuestos activos complementarios pueden incorporarse también en las composiciones.
En otro aspecto, la presente invención provee una composición que comprende un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, enlazado a un agente terapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los inmunoconjugados y agentes terapéuticos que pueden usarse son como se describieron anteriormente.
En otro aspecto, la presente invención provee una composición que comprende el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo de la presente invención, el cual comprende además otro agente farmacéuticamente activo. De preferencia, el otro agente farmacéuticamente activo es uno o más de: a) otro antagonista de OX40 de humano, b) un agente analgésico, y c) un agente inmunosupresor, por ejemplo, un glucocortlcoide tal como prednisona.
Una composición farmacéutica de la invención puede incluir también un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de agentes tensoactivos. Estas composiciones pueden contener también adyuvantes tales como conservadores, agentes mojantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización, como se mencionó anteriormente, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. Puede ser deseable también incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Usos terapéuticos v de otro tipo Los anticuerpos antagonistas de la presente invención tienen numerosas utilidades terapéuticas y de diagnóstico in vitro e in vivo que incluyen el diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados por OX40. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar una variedad de trastornos mediados por OX40. Los sujetos preferidos son humanos e incluyen pacientes que tienen trastornos mediados por la actividad de OX40 (trastornos mediados por OX40). Los anticuerpos antagonistas de la presente invención pueden ser efectivos en el tratamiento de pacientes independientemente de su estado co-estimulador de OX40. Los sujetos más preferidos son humanos, e incluyen pacientes que expresan un bajo nivel de OX40.
Un "paciente" para los propósitos de la presente invención, incluye tanto humanos como otros animales, de preferencia mamíferos y más preferiblemente humanos. De esta manera, los anticuerpos de la presente invención tienen aplicaciones en veterinaria y en terapia humana. Se entiende que el término "tratamiento" o "tratar" en la presente invención incluye el tratamiento terapéutico, así como medidas profilácticas o supresoras de una enfermedad o trastorno. De esta manera, por ejemplo, la administración exitosa de un anticuerpo antes del inicio de la enfermedad resulta en el tratamiento de la enfermedad. Como otro ejemplo, la administración exitosa de un anticuerpo después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad comprende el tratamiento de la enfermedad. Los términos "tratamiento" y "tratar" abarcan también la administración de un anticuerpo después de la aparición de la enfermedad para erradicar la enfermedad. La administración exitosa de un anticuerpo después del inicio y después de que los síntomas clínicos se han desarrollado, con abatimiento posible de los síntomas clínicos y quizá la mejora de la enfermedad, comprende el tratamiento de la enfermedad. Aquellos "en necesidad de tratamiento" incluyen mamíferos que tienen ya la enfermedad o trastorno, así como aquellos propensos a que tengan la enfermedad o trastorno, incluyendo aquellos en los cuales la enfermedad o trastorno se va a prevenir.
En una modalidad particular, los anticuerpos antagonistas se usan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos mediados por OX40. De esta manera, la invención provee un método para tratar un trastorno mediado por OX40 en un sujeto, el método comprendiendo administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antagonista o fragmento del mismo. Ejemplos de trastornos mediados por OX40 incluyen infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, artritis, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central y periférico mediados por el sistema inmune, tales como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barré, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, pancreatitis, trauma (quirúrgico), enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), rechazo de trasplante, enfermedad cardiovascular que incluye enfermedades isquémicas tales como infarto al miocardio así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis, hipoclorhidria y neuromielitis óptica.
Otros ejemplos de trastornos mediados por OX40 incluyen infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, asma, bronquitis, influenza, virus sincicial respiratorio, neumonía, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar idiopática (IPF), alveolitis Abrasante criptogénica (CFA), neumonía intersticial fibrosante idiopática, enfisema, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, artritis, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central y periférico mediados por el sistema inmune, tales como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barré, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, pancreatitis, trauma (quirúrgico), enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), rechazo de trasplante, enfermedad cardiovascular que incluye enfermedades isquémicas tales como infarto al miocardio así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis, hipoclorhidria y neuromielitis óptica.
Los trastornos mediados por OX40 preferidos que se van a tratar con el anticuerpo de la invención se seleccionan del grupo que consiste de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, colitis, psoriasis, asma, EPOC, IPF, enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), aterosclerosis y diabetes. Un trastorno mediado por OX40 preferido particular que se va a tratar con el anticuerpo de la invención, es la enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD).
La presente invención provee también un anticuerpo para su uso en el tratamiento del dolor, en particular el dolor asociado con inflamación.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención pueden usarse para detectar niveles de OX40, o niveles de células que contienen a OX40 sobre la superficie de su membrana, cuyos niveles pueden ser vinculados entonces con ciertos síntomas de enfermedad. En forma alternativa, los anticuerpos pueden usarse para inhibir o bloquear la función de OX40 la cual, a su vez, puede ser vinculada con la prevención o mejora de ciertos síntomas de enfermedad, implicando de esta manera a OX40 como un mediador de la enfermedad. Esto puede lograrse poniendo en contacto una muestra y una muestra control con el anticuerpo de OX40 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y OX40. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y OX40 se detecta y se compara en la muestra y el control. A la luz de la unión específica de los anticuerpos de la invención a OX40, los anticuerpos de la invención pueden usarse para detectar específicamente la expresión de OX40 sobre la superficie de las células, por ejemplo, pueden usarse para detectar a un paciente que tiene bajo nivel de expresión de OX40. Los anticuerpos de la invención pueden usarse también para purificar a OX40 por medio de purificación por inmunoafinidad.
De esta manera, la presente invención provee también un método de selección in vitro para detectar a un paciente que tiene un bajo nivel de expresión de OX40, que comprende los pasos de: (a) purificar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de una muestra de sangre de un paciente; (b) someter las PBMCs a análisis citométrico de flujo; y (c) determinar el número de células positivas para OX40 en células T CD4+ y/o CD8+, y comparar este número con niveles control.
En una modalidad preferida, un bajo nivel de expresión de OX40 se indica mediante un incremento en el nivel de expresión de células positivas para OX40 cuando se compara con niveles control de hasta 10%, más preferiblemente de hasta 20%, y aún más preferiblemente de hasta 30%. El procedimiento para determinar la expresión de OX40 se describe adicionalmente en detalle en Kotani A et al., (2001) Blood, 98: 3162-4, y en Xiaoyan Z et al., (2005) Clin. Exp. Immunol. 143: 110-6.
En otra modalidad, los anticuerpos de la invención pueden ponerse a prueba inicialmente para la actividad de unión asociada con su uso terapéutico o de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, pueden ponerse a prueba las composiciones de la invención usando análisis citométrico de flujo.
La presente descripción provee además el uso de un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo como un medicamento y el uso de un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno mediado por OX40. En otra modalidad, la presente descripción provee el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo para su uso como un medicamento. Provisto también por la presente descripción, es el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo para su uso en un método para tratar un trastorno mediado por OX40. Los trastornos mediados por OX40 son los descritos anteriormente. El anticuerpo antagonista de la presente invención puede ser particularmente útil para tratar trastornos mediados por OX40, independientemente del estado co-estimulador de OX40 de un paciente. En una modalidad preferida, el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo puede usarse para tratar un trastorno mediado por OX40, en donde un paciente expresa un bajo nivel de OX40.
Como se describió anteriormente, los anticuerpos de OX40 antagonistas de la invención pueden ser co-administrados con uno o más de otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente ¡nmunosupresor. El anticuerpo puede ser enlazado al agente (como un inmunoconjugado como se describió anteriormente), o puede administrarse por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después o concurrentemente con el agente, o puede ser co-administrado con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anti-cáncer, por ejemplo, radiación.
Para la administración del anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0.01 a 10 mg/kg, del peso corporal del hospedero. Un ejemplo de régimen de tratamiento causa la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez por mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. El anticuerpo se administra usualmente en ocasiones múltiples. Intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos pueden ser también irregulares, según se indica midiendo los niveles del anticuerpo en sangre con el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración del anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 g/ml, y en algunos métodos aproximadamente 25-300 g/ml. En forma alternativa, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían, dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. La dosificación y la frecuencia de la administración pueden variar, dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, una dosificación relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes durante un período largo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento por el resto de su vida. En aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos se requiere a veces hasta que la progresión de la enfermedad sea reducida o terminada.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos, es decir, el anticuerpo en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden hacerse variar hasta que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención usadas, la vía de administración, la hora de administración, la velocidad de excreción del anticuerpo particular que está siendo usado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares usadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las áreas médicas.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo de OX40 de la invención, resulta de preferencia en una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y la duración de los períodos libres de los síntomas de la enfermedad, y/o una prevención de deterioro o incapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para el tratamiento de un trastorno mediado por OX40 puede evaluarse en un sistema de modelo animal profético de eficacia en humanos. En forma alternativa, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, y dicha inhibición puede medirse in vitro mediante pruebas conocidas por el profesional médico experto. El experto en la técnica sería capaz de determinar dichas cantidades con base en factores tales como la estatura del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición o vía de administración particular seleccionada.
El anticuerpo o la composición de la presente invención pueden administrarse por medio de una o más vías de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como el experto en la técnica apreciará, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Vías de administración preferidas incluyen las vías de administración intravenosa, intramuscular, ¡ntradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. Vías de administración más preferidas son las vías intravenosa o subcutánea. La frase "administración parenteral", como se usa en la presente, significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, la administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, ¡ntradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal y por infusión. En forma alternativa, un anticuerpo de la invención puede administrarse por medio de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o por mucosas, por ejemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente o tópicamente.
Artículo de fabricación v kit En otra modalidad de la descripción, se provee un artículo de fabricación que comprende el anticuerpo antagonista o fragmento del mismo, la composición o el inmunoconjugado de la invención, para el tratamiento de un trastorno mediado por OX40. El artículo de fabricación puede comprender un contenedor y una etiqueta o inserción del empaque sobre o asociado con el contenedor. Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, matraces, viales o jeringas. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor contiene una composición que puede ser efectiva para tratar la condición, y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón horadable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición puede ser el anticuerpo antagonista descrito en la presente. La etiqueta o la inserción del empaque pueden indicar que la composición puede usarse para tratar la condición de elección, tal como cáncer. En una modalidad, la etiqueta o inserción del empaque puede indicar que la composición que comprende el anticuerpo antagonista puede usarse para tratar un trastorno mediado por OX40.
Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer contenedor con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende el anticuerpo antagonista en el mismo, y (b) un segundo contenedor con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente terapéutico diferente del anticuerpo antagonista. El artículo de fabricación en esta modalidad de la descripción puede comprender además una inserción del empaque que indica que la primera y segunda composiciones pueden usarse en combinación para tratar una enfermedad o trastorno mediado por OX40. Dicho agente terapéutico puede ser cualquiera de las terapias auxiliares descritas en la sección anterior (por ejemplo, un agente trombolítico, un agente anti-plaquetario, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico, un compuesto anti-hormonal, un cardioprotector y/o un regulador de la función inmune en un mamífero, incluyendo una citocina). En forma alternativa, o además, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) contenedor que comprende un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina regulada en su pH con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
También dentro del alcance de la presente invención están kits que comprenden el anticuerpo, las composiciones o los inmunoconjugados de la invención, e instrucciones para su uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, y uno o más anticuerpos antagonistas adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo antagonista que tenga una actividad complementaria y que se una a un epítope en el antígeno de OX40 distinto del primer anticuerpo antagonista).
Sin más descripción, se cree que el experto en la técnica puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, producir y usar los agentes de la presente descripción y practicar los métodos reclamados. Los siguientes ejemplos de trabajo se proveen para facilitar la práctica de la presente descripción, y de ninguna manera se considerará que limitan el resto de la descripción.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación v selección de anticuerpos de OX40 antí-humano de ratón Para producir la proteína OX40-Fc recombinante de humano, un ADNc para TNFRSF4 de humano se adquirió de imaGenes (clon número: RZPDB737H0329D; Berlín, Alemania). Este ADNc se usó como molde para amplificar por PCR la región codificante de ADN del dominio extracelular TNFRSF4 de humano (SEQ ID NO: 11). En una reacción de PCR separada, la región Fe de una lgG1 de humano (posiciones de EU 223-451) se amplificó mediante PCR añadiendo un enlazador 5' GSGGG y un enlazador 3' SA-6xHis y sitios de restricción para la clonación. Los dos productos resultantes se fusionaron entonces usando PCR de extensión por traslape con los iniciadores de flanqueo, añadiendo sitios de restricción para la clonación subsiguiente en un vector de expresión modificado de mamífero basado en el plásmido pcDNA3.1 (-) de Invitrogen (Invitrogen AG, Basel, Suiza, No. de catálogo V795-20), que contiene al promotor del CMV de humano con el fragmento aceptor donador de Ig (primer intrón) descrito en la patente de los Estados Unidos 5924939, la secuencia OriP (Koons MD et al., (2001) J Virol. 75(22): 10582-92), el intensificador de SV40 y la poliA del SV40 fusionada al terminador de gastrina como es descrito por Kim D. et al., (2003) Biotechnol. Prog. 19(5): 1620-2. Este plásmido recombinante permitió la expresión de la proteína de fusión de Fe - dominio extracelular TNFRSF4 de humano en células de mamífero con secreción en el medio de cultivo de células dirigida por el péptido de señal nativo de la proteína TNFRSF4 de humano. Para la producción de la proteína recombinante, el vector recombinante mencionado anteriormente fue transfectado en células HEK 293 adaptadas a la suspensión (No. de la ATCC CRL 1573) usando el reactivo de transfección jetPEI™ (Polyplus-transfection S. A., Estrasburgo, Francia; distribuidor: Brunschwig, Basel, Suiza). El sobrenadante del cultivo de células se colectó después de cinco días y se purificó adicionalmente usando una columna de purificación por afinidad de proteína A (columna HiTrap de proteína A sepharose; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza) operada en un sistema ÁKTA FPLC (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza).
Para producir la proteína OX40-his recombinante de humano, la región extracelular de TNFRSF4 de humano (SEQ ID NO: 11) fue amplificada mediante PCR añadiendo un enlazador 3' GSG-6xHis y sitios de restricción para la clonación. El producto de PCR fue clonado subsiguientemente en el plásmido pcDNA3.1 (-) modificado descrito anteriormente. Este plásmido recombinante permitió la expresión de la proteína OX40-his de humano en células de mamífero con secreción en el medio de cultivo de células dirigida por el péptido de señal nativo de TNFRSF4 de humano. Para la producción de la proteína, el vector recombinante fue transfectado en células HEK 293 adaptadas de la suspensión (No. de la ATCC CRL 1573) usando el reactivo de transfección jetPEI™ (Polyplus-transfection S. A., Estrasburgo, Francia; distribuidor: Brunschwig, Basel, Suiza). El sobrenadante del cultivo de células se colectó cinco días después de la transfección y se purificó usando una columna de purificación por afinidad de Ni2+-NTA (columna HiTrap de Ni2+-NTA sepharose; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza) operada en un sistema AKTA FPLC (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza). Se encontró que las proteínas OX40-Fc y OX40-his recombinantes de humano son 95% puras según se juzgó mediante SDS-PAGE, y adicionalmente reguladas en su pH intercambiadas en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) antes de su uso.
La proteína OX40-Fc recombinante de humano disuelta en PBS se mezcló con un volumen igual de adyuvante Stimune (Prionics, Suiza, ref: 7925000), y se preparó una emulsión. La emulsión se transfirió a jeringas de insulina de 0.5 mL (BD Pharmingen, Allschwil, Suiza), y se inmunizó subcutáneamente a animales BALB/c (Harían, Los Países Bajos) en los cojinetes de las patas traseras, la base de la cola y el cuello con 50 pg de la proteína emulsificada. Se repitió la inmunización dos semanas después con la misma cantidad de antígeno y la misma vía de inyección.
La presencia de anticuerpos de OX40 anti-humano circulantes en el suero de los ratones inmunizados se evaluó mediante ELISA directa usando placas recubiertas con la proteína OX40-his recombinante de humano. Una dilución en serie (de 1 :10° a 1 :109) de los diferentes sueros de los ratones se añadió a las placas, y se detectaron los anticuerpos unidos usando una molécula entera H+L anti-ratón de cabra-HRP (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza). Un refuerzo subcutáneo final con 50 pg de antígeno sin adyuvante se llevó a cabo en los animales que exhibieron el mejor título del suero de IgG de OX40 anti-humano tres días antes del sacrificio.
Se sometió a los animales a eutanasia, y los nodulos linfáticos inguinales, axilares, braquiales, poplíteos y ciáticos se colectaron para preparar una suspensión de células individuales perturbando la arquitectura de los nodulos linfáticos con dos agujas 25G en una solución de desoxirribonucleasa (Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Suiza) y colagenasa (Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Suiza). Suspensiones de células individuales fueron fusionadas con una línea de células de mieloma X63AG8.653 (línea de células de mieloma de ratones BALB/c; número de acceso de la ATCC: CRL 1580; Kearney JF et al., (1979) J. Immunol. 123(4): 1548-1550) a una relación de 7:1 (miembro de fusión a células cosechadas de los nódulos linfáticos) con polietilenglicol 1500 (Roche Diagnostics (Schweiz) AG, Rotkreuz, Suiza). Las células fusionadas se sembraron en placas de fondo plano de 96 cavidades que contenían macrófagos de ratón en medio DMEM-10 (Invitrogen AG, Basel, Suiza) complementado con suero de bovino fetal (FBS, PAA Laboratories, Pasching, Austria) a 10%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml (Biochrom AG, Alemania) de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Biochrom AG, Alemania), HEPES 10 mM (Invitrogen AG, Basel, Suiza), ß-mercaptoetanol 50 µ? (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza), HAT (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) y factor de crecimiento a 1 % (Hybridokine, Interchim/Uptima, Montlucon, Francia).
Aproximadamente 800 cavidades de las fusiones se seleccionaron mediante ELISA para la presencia de IgG de ratón que reconoció a OX40 de humano y bloqueó la unión del OX40L de humano en su receptor. Las células positivas se expandieron y se sometieron a dos rondas de subclonación. Las células se colectaron y las cadenas pesada y ligera fueron clonadas y secuenciadas.
EJEMPLO 2 Clonación v secuenciación de las cadenas VH y VL de los anticuerpos anti-OX40 de células de hibridoma Por cada hibridoma positivamente seleccionado, se preparó ARN total, el cual fue transcrito en forma inversa en ADNc, y los genes de VH y VL fueron amplificados respectivamente mediante PCR. Estos productos de PCR fueron ligados en un vector de rescate (vector pDrive; QIAGEN AG, Hombrechtikon, Suiza; No. de catálogo 231124), permitiendo la secuenciación del ADN de los productos de PCR individuales y la determinación de mono-clonalidad o poli-clonalidad de los hibridomas seleccionados. Este vector permitió la selección de azul/blanco en placas de agar de LB que contenían IPTG y X-gal (las colonias sin inserción eran azules debido a la degradación de la X-gal por la combinación LacZ a-péptido). Se prepararon plásmidos recombinantes de los clones bacterianos positivos (blancos), y se secuenciaron usando iniciadores de secuenciación de ADN estándar para la estructura de base del vector (M13 inverso, M13 delantero, T7 o SP6). Las secuencias de ADN fueron finalmente subclonadas en un vector de expresión para la expresión recombinante del anticuerpo de interés en células de mamífero.
Aislamiento de ARN Se aisló ARN total de 2-10x106 células usando el mini kit RNeasy de QIAGEN (QIAGEN AG, Hombrechtikon, Suiza; No. de catálogo 74106), de acuerdo con el protocolo del fabricante; las muestras se cuantificaron usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (WITEC AG, Littau, Suiza).
RT-PCR de un paso Las preparaciones de ARN total descritas anteriormente fueron adicionalmente transcritas en forma inversa en ADNc, y los fragmentos de VH y VL fueron amplificados mediante PCR usando dos mezclas diferentes de iniciadores degenerados, cada una permitiendo la recuperación de todas las diferentes subfamilias de los fragmentos variables de la cadena pesada de inmunoglobulina y las regiones de la unión variables de la cadena pesada de ratón o la recuperación de todos los fragmentos variables kappa de la cadena ligera de inmunoglobulina y las regiones de la unión kappa de la cadena ligera variable de ratón. Los iniciadores usados para la transcripción inversa y la amplificación fueron sintetizados por Microsynth (Balgach, Suiza), y fueron purificados mediante CLAR (cuadros 1-4). Tanto la transcripción inversa como la amplificación por PCR se llevaron a cabo simultáneamente usando el kit de RT-PCR de un paso de QIAGEN (QIAGEN AG, Hombrechtikon, Suiza; No. de catálogo 210212). Puesto que la técnica usó iniciadores específicos, cada muestra de ARNm se trató entonces por duplicado permitiendo la transcripción inversa individual y la amplificación de los fragmentos de VH o VL. 2 pg de ARN total disueltos en agua libre de ribonucleasa hasta un volumen final de 30 µ? se mezclaron con: 10 µ? de una solución de repuesto 5x de regulador de pH para RT-PCR de un paso de QIAGEN, 2 µ? de una mezcla de dNTPs a una concentración de 10 mM, y 3 µ? de mezcla de iniciadores a una concentración de 10 µ? y 2 µ? de mezcla de enzimas para RT-PCR de un paso de QIAGEN. La mezcla final se puso entonces en un tubo de PCR, y se ciclizó en un termociclizador de PCR (BioRad iCycler versión 4.006, Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Suiza) usando los siguientes valores: 30 minutos a 50°C 15 minutos a 95°C 40 ciclos: 30 segundos a 94°C 30 segundos a 55°C 1 minuto a 72°C 10 minutos a 72°C Mantener a 4°C Clonación en pDrive Se hicieron correr productos de PCR en geles de agarosa a 2%. Después de la electroforesis del ADN, los fragmentos interés (~450 pb) se separaron de los geles de agarosa, y se extrajeron adicionalmente usando el kit NucleoSpin Extract II 250 de Macherey-Nagel (Macherey-Nagel, Oensingen, Suiza; No. de catálogo 740609.250). Para la secuenciación del ADN, los productos de PCR extraídos fueron clonados en el vector de rescate descrito anteriormente (vector pDrive, QIAGEN AG, Hombrechtikon, Suiza; No. de catálogo 231124) y transformados en la cepa TOP10 de E. coli (Invitrogen AG, Basel, Suiza; No. de catálogo C404006).
Extracción miniprep Se cultivaron colonias positivas durante la noche a 37°C (agitación, 250 RPM) en 1.5 mi de medio de Luria Bertani (LB) complementado con 100 µg/ml de ampicilina, sembradas en placas de bloqueo de cavidades cuadradas de Macherey-Nagel (Macherey-Nagel, Oensingen, Suiza; No. de catálogo 740488.24). Al día siguiente, se hicieron extracciones miniprep de ADN usando el kit de plásmidos NucleoSpin Multi-8 (Macherey-Nagel, Oensingen, Suiza; No. de catálogo 740620.5).
Secuenciación y análisis de la secuencia Las muestras se enviaron para la secuenciación del ADN a la compañía de servicios de secuenciación de ADN Fasteris (Plan-les-Ouates, Suiza). Se usaron los iniciadores estándar: M13 inverso, M13 delantero, T7, SP6 (cuadro 5). Para analizar las secuencias de ADN, se usaron el administrador 9 de clones edición profesional (Scientific & Educational Software, NC, USA) y el editor de la alineación de secuencias BioEdit (Hall, TA (1999) Nucí. Acids. Symp. Ser. 41 : 95-98).
Clonación del vector de expresión para la expresión de anticuerpos quiméricos recombinantes Para la expresión recombinante en células de mamífero, los fragmentos de VH y VL aislados de murino fueron formateados como inmunoglobulinas quiméricas usando métodos de PCR basados en el ensamble. Estos anticuerpos quiméricos consisten de una cadena pesada en donde el dominio variable de cadena pesada de murino es fusionado con los dominios constantes de cadena pesada de lgG1 de humano (regiones ?1 , gozne, ?2 y ?3) y una cadena ligera en donde el dominio variable de la cadena ligera de murino es fusionado con un dominio constante kappa de humano (CK). Las regiones constante de humano y variable de murino ensambladas mediante PCR fueron clonadas posteriormente en un vector de expresión modificado de mamífero basado en el vector pcDNA3.1(-) modificado de Invitrogen mencionado en el ejemplo 1 , con la diferencia de que se usó un péptido guía kappa de cadena ligera de inmunoglobulina de humano para dirigir la secreción de proteínas. Para la producción de proteínas de los candidatos de inmunoglobulina, cantidades iguales de ADN del vector de cadena ligera y pesada fueron co-transfectadas en células HEK-293 (No. de la ATCC: CRL-1573) adaptadas a la suspensión. El sobrenadante del cultivo de células se colectó después de cinco días y se purificó usando una columna de purificación por afinidad de proteína A (columna HiTrap de proteína A sepharose) operada en un sistema ÁKTA FPLC (ambos de GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza).
CUADRO 1 Mezcla de iniciadores inversos para la región VH GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAK GTR MAG CTT CAG GAG TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTG CAG CTG AAG SAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTY CAG CTB CAG CAR TC GTGATC GCC A l G GCG TCG ACC CAG GTY CAR CTG CAG CAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTC CAC GTG AAG CAR TC GTGATC GCC A TG GCG TCG ACC GAG GTG AAS STG GTG GAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAV GTG AWG STG GTG GAG TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG CAG STG GTG GAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAK GTG CAM CTG GTG GAR TC GTGATC GCC A TG GCG TCG ACC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG CAR CTT GTT GAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAR GTR AAG CTT CTC GAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAA GTG AAR STT GAG GAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTT ACT CTR ??? SAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC CAG GTC CAA CTV CAG CAR CC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAT GTG AAC TTG GAA SAR TC GTGATC GCC ATG GCG TCG ACC GAG GTG AAG GTC ATC GAR TC CUADRO 2 Mezcla de iniciadores delanteros para la región VH CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA AAC GGT GAC CGT GGT CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT CCTCCACCACTCGAGCC CGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT CUADRO 3 Mezcla de iniciadores inversos para la región VL GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC GGCGGTGGC GCT AGC CAA ATT GTT CTC ACC CAG TC GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG YTR ACA CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTR ATG ACM CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT CAG ATG AYD CAG TC GGCGGTGGCGCT AGC GAY ??? CAG ATG ACA CAG AC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTT CTC A WC CAG TC GGCGGTGGCGC T AGC GAY ATT GWG CTS ACC CAA TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT STR ATG ACC CAR TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY RTT KTG ATG ACC CAR AC GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT GTG ATG ACB CAG KC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATA ACY CAG GA GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACA CAA CC GGCGGTGGCGCT AGC GAY ATT TTG CTG ACT CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAA ACA ACT GTG ACC CAG TC GGCGGTGGCGCT AGC GAA AAT GTK CTS ACC CAG TC GGCGGTGGCGCT AGC CAG GCT GTT GTG ACT CAG GAA TC CUADRO 4 Mezcla de iniciadores delanteros para la región VL ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT TAT TTC CAA CTT TG ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT CAG CTC CAG CTT GG ATGCTGAC GC GGC CGC ACC TAG GAC AGT CAG TTT GG CUADRO 5 Iniciadores de secuenciación M13 delantero GTAAAACGACGGCCAGT M13 inverso AACAGCTATGACCATG T7 TAATACGACTCACTATAGG SP6 GATTTAGGTGACACTATAG EJEMPLO 3 Caracterización biológica de los anticuerpos de OX40 anti-humano ELISA de detección de anticuerpos específicos de OX40 Los títulos de los anticuerpos, la especificidad y producción de hibridomas y los candidatos de anticuerpos recombinantes, se determinaron mediante una ELISA directa. En resumen, se recubrieron placas de microtítulo de 96 cavidades (Costar USA, distribuidor VWR AG, Nyon, Suiza) con 100 µ? de OX40-his recombinante de humano a 2 pg/ml en PBS (véase el ejemplo 1 para la generación de la proteína OX40-his). Las placas se incubaron durante la noche a 4°C, y entonces fueron bloqueadas con PBS, usando BSA (albúmina de suero de bovino) a 2% (PAA Laboratories, Pasching, Austria) a temperatura ambiente (RT) por una hora. La solución de bloqueo se removió, y se añadieron los sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos purificados. Las placas se incubaron a RT por 30 minutos, entonces se lavaron nueve veces con PBS, usando Tween-20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) a 0.01%, y se añadió un anticuerpo de detección H+L anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) a una dilución de 1 :1000. Para detectar los anticuerpos quiméricos recombinantes (véase el ejemplo 2) que poseen un Fe de humano, se usó un anticuerpo de IgG anti-humano de conejo marcado con HRP (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) a una dilución de 1 :1000 como el anticuerpo de detección. Las placas se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente (RT), se lavaron nueve veces con PBS usando Tween-20 a 0.01%, y el substrato de TMB (Bio-rad Laboratories AG, Reinach, Suiza) se añadió a las placas, y la reacción se interrumpió después de seis minutos añadiendo H2SO4. Entonces se leyó la absorbancia a 450 nm mediante un lector de microplacas (Biotek, USA; distribuidor: WITTEC AG, Littau, Suiza). La figura 1A muestra que el anticuerpo 1D4 quimérico y el anticuerpo 2F8 quimérico reconocen a la proteína recubierta con OX40-his.
ELISA de bloqueo de OX40L Se generó la proteína del ligando de OX40 recombinante de humano (OX40L), como sigue: el ADNc para TNFSF4 de humano (número de clon: IOH46203) se adquirió de ¡maGenes (Berlín, Alemania), y la porción extracelular (aminoácidos 51-183) del ligando TNFSF4 de humano (numeración de acuerdo con la secuencia de Uniprot Q6FGS4) se amplificó con sitios de restricción de flanqueo. El producto de PCR resultante que abarca un enlazador de ASA y una secuencia de marcador 8-His en su extremo 5' fue clonado posteriormente en una versión modificada del vector pREP4 de Invitrogen (Invitrogen AG, Basel, Suiza) que posee un promotor del CMV, una poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino y el péptido guía VJ2C de murino que dirige la secreción de la proteína recombinante. Para la producción de la proteína recombinante, el vector recombinante fue transfectado en células HEK 293 adaptadas a la suspensión (No. de la ATCC CRL 1573) usando el reactivo de transfección jetPEI™ (Polyplus-transfection S. A., Estrasburgo, Francia; distribuidor: Brunschwig, Basel, Suiza). El sobrenadante del cultivo de células se colectó después de cinco días y se purificó usando una columna de purificación por afinidad de proteína A (columna HiTrap de proteína A sepharose; GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza) operada en un sistema ÁKTA FPLC (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza).
Para determinar si los anticuerpos anti-OX40 generados pueden bloquear la unión de OX40L al receptor de OX40, se desarrolló una ELISA de bloqueo. Se recubrieron placas de microtítulo de noventa y seis cavidades (Costar, USA; distribuidor VWR AG, Nyon, Suiza) con 100 µ? de OX40-Fc recombinante de humano (véase el ejemplo 1) a 2 Mg/ml en PBS. Las placas se incubaron durante la noche a 4°C, y entonces fueron bloqueadas con PBS, usando BSA a 2% a RT por una hora. La solución de bloqueo se removió, y los sobrenadantes de hibridomas o los anticuerpos purificados se añadieron a la placa. Cinco minutos después, se añadieron a cada cavidad 50 µ? de OX40L recombinante biotinilado de humano a 0.04 mg/ml. Las placas se incubaron a RT por 60 minutos, entonces se lavaron nueve veces con PBS, usando Tween-20 a 0.01%, y se añadió HRP-estreptavidina (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) a una dilución de 1 :2000. Las placas se incubaron por 30 minutos a RT, se lavaron 9 veces con PBS, usando Tween-20 a 0.01 %, y se añadió el substrato de TMB (Bio-rad Laboratories AG, Reinach, Suiza) a las placas y la reacción se interrumpió después de 6 minutos añadiendo H2SO4. Se leyó entonces la absorbancia a 450 nm mediante un lector de microplacas (Biotek, USA; distribuidor: WITTEC AG, Littau, Suiza). La figura 1 B muestra que el anticuerpo 1D4 quimérico es capaz de bloquear la interacción entre OX40 y OX40L en una manera dependiente de la dosis, mientras que el anticuerpo 2F8 quimérico no es capaz de bloquear la interacción entre OX40 y OX40L.
Reacción mixta de linfocitos (MLR) de humano Se colectó sangre de dos diferentes donadores en tres S-Monovette de 10 ml_ con citrato como un anticoagulante (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Las células del donador número 1 se usaron como células efectoras, mientras que las células del donador número 2 se usaron como células objetivo. Las PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) de los 2 donadores se purificaron usando tubos Blood-Sep-Filter de 50 mL (distribuidor: Brunschwig, Basel, Suiza), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron 2 veces con medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI, PAA Laboratories, Pasching, Austria) sin FBS. Las células objetivo se incubaron con 50 pg/ml de mitomicina C (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) por 30 minutos a 37°C. Las células se lavaron entonces 3 veces con RPMI sin FBS y se resuspendieron a 1x106 células/mL en RPMI, FBS a 10% (PAA Laboratories, Pasching, Austria), L-glutamina 2 mM (Lonza, Leuven, Bélgica), 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina (Biochrom AG, Berlín, Alemania). En microplacas de fondo en U de 96 cavidades (TPP, Trasadingen, Suiza), 50,000 células objetivo y 80,000 células efectoras se distribuyeron en un volumen final de 100 µ? por cada cavidad. Cien µ? de diluciones del anticuerpo se añadieron a las cavidades. Las placas se incubaron por 7 días a 37°C en una incubadora de CO2 a 5%. Siete días después del inicio de la MLR, las células fueron pulsadas con 0.5 µ?? de timidina tritiada (Perkin Elmer). 18 horas después de la pulsación, las células se cosecharon y se cuantificó la radiactividad incorporada en un contador Wallac beta. La figura 2 muestra que el anticuerpo 1 D4 quimérico es capaz de bloquear la MLR en una manera dependiente de la dosis a un mayor grado que el control positivo.
EJEMPLO 4 Unión de los anticuerpos de OX40 anti-humano en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) activadas de humano v otra especie animal mediante citometría de flujo Células humanas Se colectaron filtros que contenían leucocitos humanos del Blood Collection Center de La Chaux-de-Fonds, Suiza (Centre de Transfusión Sanguine et Laboratoire de Sérologie, rué Sophie-Mairet 29, CH-2300). Las células se removieron de los filtros mediante contraflujo con 60 mL de PBS que contenía 10 U/mL de liquemin (Drossapharm AG, Lucern, Suiza). Entonces las PBMCs se purificaron con tubos Blood-Sep-Filter de 50 mL (distribuidor: Brunschwig, Basel, Suiza), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron 3 veces con medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI, PAA Laboratories, Pasching, Austria) con FBS (PAA Laboratories, Pasching, Austria). Las células se resuspendieron a 3x106 células/ml en RPMI, FBS a 10% (PAA Laboratories, Pasching, Austria), ultraglutamina 2 mM (Lonza, Leuven, Bélgica), 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Biochrom AG, Berlín, Alemania), 10 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) + 100 U/mL de IL-2 rHu (Proleukin, Novartis, Basel, Suiza) en una placa de 24 cavidades (TPP, Trasadingen, Suiza). Cuarenta y ocho horas después, las células se colectaron y se analizaron mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.
Células HPB-ALL (línea de células T de leucemia linfoide aguda, de Deumsche Sammlung von ikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania) se cultivaron en RPMI, FBS a 10%. Se distribuyeron 2x105 células en una placa de fondo en V de 96 cavidades (TPP, Trasadingen, Suiza), y se centrifugaron por tres minutos a 1300 rpm; los sobrenadantes se desecharon, las células se colectaron y se analizaron mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.
Las PBMCs y las células HPB-ALL preparadas como se describió anteriormente se resuspendieron en 50 µ? de regulador de pH para FACS (PBS, FBS a 2%, Versene a 10% (Invitrogen, USA) con 5 pg/mL de anticuerpo 1 D4 quimérico o 5 pg/mL de un control de isotipos apropiado o 20 µ? de un anticuerpo de OX40 anti-humano comercial marcado con PE (clon L106, BD Biosciences, Allschwil, Suiza). Las células se incubaron por 30 minutos sobre hielo, se lavaron dos veces y se resuspendieron en 50 µ? de regulador de pH para FACS. Se usó una IgG anti-humano-ficoeritrina-PE (BD Biosciences, Allschwil, Suiza) diluida 1/200 para detectar el anticuerpo 1 D4 quimérico y el anticuerpo control de isotipos. Las células se incubaron por 15 minutos sobre hielo, se lavaron una vez, se resuspendieron en 400 µ? de regulador de pH para FACS y se analizaron en el instrumento para FACS (Cyan, Beckman Coulter International S. A., Nyon, Suiza).
Células primarias de monos Cvnomolqus Sangre entera de monos Cynomolgus (obtenida del Profesor Eric Rouiller, Laboratory of Neurophysiology, University of Fribourg, Fribourg, Suiza), se colectó en tubos de citrato (BD Biosciences, Allschwil, Suiza). Dos ml_ de PBS se mezclaron con 3 ml_ de sangre, y la mezcla se estratificó en la parte de arriba de 10 mi de una mezcla 85:15 de Ficoll: PBS (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza). Las muestras se centrifugaron por 20 minutos a temperatura ambiente sin interrupción. La capa de PBMCs se colectó y se lavó tres veces con PBS. Las células se resuspendieron a 3x106 células/mL en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, PAA Laboratories, Pasching, Austria), FBS a 10% (PAA Laboratories, Pasching, Austria), aminoácidos no esenciales (PAA Laboratories, Pasching, Austria) piruvato de sodio 1 mM (PAA Laboratories, Pasching, Austria), ultraglutamina 2 mM (Lonza, Bélgica), 100 U/ml de penicilina (Biochrom AG, Alemania) y 100 pg/ml de estreptomicina (Biochrom AG, Alemania). Un mL de la suspensión de células se distribuyó en una placa de 24 cavidades (TPP, Trasadingen, Suiza), y se añadieron 10 pg/ml de PHA (PHA/M, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) 100 U/mL de IL-2 rHu (Proleukin, Novartis, Basel, Suiza). Las células se incubaron por 50 horas a 37°C en una incubadora de C02 a 5%. Las PBMCs activadas se colectaron y se resuspendieron en PBS/FBS a 2.5% (regulador de pH para FACS). Cincuenta mil células en 50 µ? de regulador de pH para FACS se distribuyeron en una placa de fondo en V de 96 cavidades, y se añadieron anticuerpo 1 D4 quimérico-OX40 anti-humano biotinilado o anticuerpo control de isotipos biotinilado u OX40 anti-humano comercial biotinilado producido en ovejas (BD Biosciences, Allschwil, Suiza) a las cavidades a 25 pg/ml. Las muestras se incubaron por 20 minutos sobre hielo y entonces las células se lavaron dos veces con regulador de pH para FACS, y entonces se incubaron con estreptavidina-PE (BD Biosciences, Allschwil, Suiza) a una dilución 1 :20 por 15 minutos sobre hielo. Las células se lavaron una vez con regulador de pH para FACS, y entonces se resuspendieron en 300 µ? de regulador de pH para FACS. Se añadió yoduro de propidio a un volumen de 2 µ? (Pl; Sigma-Aldhch Chemie GmbH, Buchs, Suiza) en cada muestra para excluir las células muertas. Las células se analizaron mediante citometría de flujo (Cyan, Beckman Coulter International S.A., Nyon, Suiza).
Las figuras 3A y 3B muestran que el anticuerpo 1 D4 quimérico es capaz de reconocer a OX40 expresada sobre la superficie de linfocitos activados de humano y de mono Cynomolgus, respectivamente; de esta manera, provee propiedades de reactividad cruzada altamente deseadas para el desarrollo de fármacos.
EJEMPLO 5 Constantes de cinética de la afinidad de unión del anticuerpo 1D4 quimérico por el dominio extracelular del receptor de OX40 de humano mediante resonancia de plasmones de superficie (SPR) Se midieron las constantes de cinética ( D) de la afinidad de unión en el anticuerpo capturado por proteína-A usando el dominio extracelular recombinante del receptor de OX40 de humano marcado con histidina como se describió en el ejemplo 1 como analito. Se hicieron mediciones en un BIAcore 2000 (GE Healthcare-BIAcore, Uppsala, Suecia) a temperatura ambiente, y se analizaron con el software BiaEvaluation (BIAcore; v4.1).
Un chip sensor de grado investigación CM5 (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza; BR-1000-14) fue activado inyectando 35 µ? de una solución 1 :1 de N-hidroxisulfosuccinimida (NHS)/clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) (v/v; magnitud de flujo de 5 µ?/min; en las trayectorias de flujo 1 y 2). Se diluyó proteína A (ref. P7837; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) hasta una concentración final de 50 pg/ml en regulador de pH de acetato pH 4.5 (GE, BR-1003-50; una unidad de pH abajo del pl), y posteriormente se inmovilizó sobre el chip sensor CM5 previamente activado inyectando 35 µ? en ambas trayectorias de flujo 1 y 2 (5 µ?/min); esto correspondió a aproximadamente 1500 unidades de respuesta (RUs). El chip sensor de proteína A-CM5 se desactivó entonces inyectando 35 µ? de solución de etanolamina (5 µ?/min). Por último, se llevaron a cabo dos inyecciones de 10 µ? de solución de glicina (GE, ref. BR-1003-54; 10 mM; pH 1.5) para liberar las moléculas de proteína A no entrelazadas.
Antes de las mediciones de la afinidad, una prueba de limitación de transferencia de masa se llevó a cabo inyectando una concentración fija de analito sobre una cantidad fija de anticuerpo capturado con proteína-A a diferentes magnitudes de flujo (5, 15, 30, 50, 75 µ?/min por 2 minutos). El análisis de las pendientes de la constante de velocidad de asociación a diferentes magnitudes de flujo, indicó la transferencia de masa.
Para las mediciones de la afinidad, el anticuerpo 1 D4 quimérico almacenado en 1x regulador de pH de PBS se diluyó hasta una concentración final de 15 nM en regulador de pH de HBS-EP (GE, ref. BR-1001-88; Hepes 0.01 M, NaCI 0. 5 M, EDTA 3 mM, agente tensoactivo P20 a 0.005%, pH 7.4). 10 µ? de este repuesto diluido se inyectaron posteriormente en la trayectoria de flujo 2 del chip de proteína A CM5 (30 µ?/min) hasta alcanzar las 200-250 RUs. Después de este paso de captura, el dominio extracelular recombinante del receptor de OX40 de humano marcado con histidina se inyectó a diferentes concentraciones (50 nM a 0.4 µ?) en las trayectorias de flujo 1 y 2 (la trayectoria de flujo 1 siendo usada como referencia) a una magnitud de flujo de 30 µ?/min. Después de cada evento de unión, se regeneró la superficie con regulador de pH de glicina pH 1.5 inyectado por 1 minuto (10 µ?/min).
Las mediciones (sensorgrama: fc2-fc1) se ajustaron mejor con un modelo de analito bivalente 2:1 con transferencia de masa. Para dar razón de las variaciones experimentales en el anticuerpo capturado con proteína A al inicio de cada medición, el valor de Rmáx se ajustó a local en todos los valores. Los tiempos de disociación fueron de por lo menos 300 a 600 segundos. Se hicieron mediciones por duplicado e incluyeron muestras de concentración cero como referencia. El valor Chi2 representa la suma de las diferencias al cuadrado entre los datos experimentales y los datos de referencia en cada punto; mientras que las gráficas de los residuales indican la diferencia entre los datos experimentales y de referencia para punto en el ajuste. Tanto Chi2 como los valores residuales se usaron para evaluar la calidad de un ajuste entre los datos experimentales y los modelos de unión individuales.
Se hicieron mediciones por duplicado con el anticuerpo de OX40 anti-humano 1 D4 quimérico capturado inmovilizado sobre el chip sensor de proteína A y el dominio extracelular recombinante del receptor de OX40 de humano marcado con histidina como analito. El valor de la KD estuvo entre 91 y 116 nM con valores de Chi2 < 1.25.
EJEMPLO 6 Humanización del anticuerpo monoclonal de ratón 1D4 Se describe en la presente la humanización del anticuerpo 1 D4 de ratón de OX40 anti-humano, incluyendo la selección de las estructuras aceptaras de humano, las mutaciones retrógradas y las mutaciones que retienen y/o mejoran sustancialmente las propiedades de unión de las estructuras aceptoras insertadas con CDR de humano.
Diseño de las regiones variables reformadas Se usó acoplamiento de homología para elegir las estructuras aceptoras de humano para injertar CDRs de 1 D4. Pueden usarse bases de datos, por ejemplo, una base de datos de los genes variables de la línea germinal de los loci de inmunoglobulina de la base de datos de humano y de ratón (base de datos IMGT (sistema de información internacional ImMunoGeneTics®; Lefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27(1 ): 209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 219-21 ; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31 (1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev. Comp. Immunol. 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64) o la base de datos VBASE2 (Retter I et al., (2005) Nucleic Acids Res. 33, emisión de la base de datos D671-D674) o la base de datos de Kabat (Johnson G et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28: 214-218)) o publicaciones (véase, por ejemplo, Kabat EA et al., citado anteriormente), para identificar las subfamilias de humano a las cuales las regiones V de cadena ligera y pesada de murino pertenecen, y determinar la estructura de la línea germinal de humano de mejor ajuste para su uso como la molécula aceptora. La selección de las secuencias variables de cadena pesada y ligera (VH y VL) dentro de estas subfamilias que se usarán como el aceptor puede basarse en la homología de secuencia y/o un acoplamiento de la estructura de las regiones CDR1 y CDR2 para ayudar a preservar la presentación relativa apropiada de las seis CDRs después del injerto.
Por ejemplo, el uso de la base de datos IMGT indica buena homología entre la estructura del dominio variable de cadena pesada de 1 D4 y los miembros de la subfamilia 2 del dominio variable de cadena pesada de humano. Se observaron las más altas homologías e identidades de ambas CDRs y secuencias de estructura para las secuencias de la línea germinal: IGHV 2-70*10 (SEQ ID NO: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID NO: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID NO: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID NO: 22) e IGHV2-70*11 (SEQ ID NO: 23), todas las cuales tienen identidad de secuencia arriba de 73% para la secuencia entera hasta CDR3. IGHV 2-70*10, IGHV2-70*01 e IGHV2-70*13 tienen una identidad de secuencia de 74%; mientras que IGHV2-5*09 e IGHV2-70 1 tienen una identidad de secuencia de 73.5% y 73%, respectivamente.
Mediante el uso del mismo procedimiento, la secuencia del dominio variable de cadena ligera de 1 D4 mostró buena homología con los miembros de la subfamilia 3 kappa del dominio variable de cadena ligera de humano. Se observaron las más altas homologías e identidades de ambas CDRs y secuencias de estructura para las secuencias de la línea germinal: IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24) (65.3% de identidad), IGKV1-39*01 (SEQ ID NO: 25) (64.9% de identidad), IGKV1D-39*01 (SEQ ID NO: 26) (64.9% de identidad), IGKV3-11*02 (SEQ ID NO: 27) (64.2% de identidad) e IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 28) (62.5% de identidad).
Como punto de partida para el procedimiento de humanización, se seleccionaron los dominios variables IGHV 2-70*10 (SEQ ID NO: 19) e IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24) de humano como aceptores para las CDRs de 1 D4. Se seleccionó a IGHV 2-70*10 sobre otros dominios variables de cadena pesada de humano por su homología superior con 1 D4 en una región de su estructura.
Se preparó un primer anticuerpo humanizado de un isotipo gamma de humano (véase más adelante). El anticuerpo abarcó un dominio variable de cadena pesada híbrido de humano-ratón y un dominio variable de cadena ligera híbndo de humano-ratón. El dominio variable de cadena pesada híbrido se basó en el dominio variable de cadena pesada de humano IGHV 2-70*10, en donde las CDRs 1 y 2 de la línea germinal fueron reemplazadas respectivamente por las CDRs 1 y 2 de la cadena pesada de 1 D4. Se identificó la secuencia del segmento JH de mejor coincidencia con la estructura aceptora de humano de las búsquedas de IMGT mencionadas anteriormente. La secuencia variable de cadena pesada híbrida de humano-ratón resultante que tiene las regiones de estructura IGHV 2-70*10 de humano, CDRs de 1 D4 de ratón, y JH de mejor coincidencia con el aceptor de humano, es referida en la presente como el dominio variable de cadena pesada VH1 con SEQ ID NO: 29. De igual manera, el dominio variable de cadena ligera híbrido de humano-ratón usado para este primer anticuerpo humanizado candidato tuvo las regiones de estructura IGKV3-11*01 de humano, CDRs de 1 D4 de ratón y JK de mejor coincidencia con el aceptor de humano, y es referido en la presente como el dominio variable de cadena ligera VL1 con SEQ ID NO: 30. El primer anticuerpo humanizado que abarca a VH1 y VL1 se abrevia en la presente como anticuerpo VH1/VL1.
Producción del primer prototipo de anticuerpo humanizado Secuencias de ADN codificantes (moléculas de ADNc) para VH1 y VL1 fueron sintetizadas en un formato de scFv por GENEART AG (Regensburg, Alemania), permitiendo de esta manera que una secuencia de ADN individual abarque ambos dominios variables (SEQ ID NO: 31). Moléculas de ADNc individuales del dominio variable se recuperaron de esta construcción de scFv mediante PCR, y se ensamblaron adicionalmente hacia el extremo 5' de sus secuencias de ADNc del dominio constante respectivas usando técnicas de ensamble por PCR. Por último, las moléculas de ADNc de la cadena ligera y pesada completas fueron ligadas en vectores independientes que se basan en un vector pcDNA3.1 modificado (Invitrogen, CA, USA) que posee al promotor del CMV y una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino. El vector específico de la cadena ligera permitió la expresión de las cadenas ligeras de isotipo kappa de humano mediante la ligación del ADNc del dominio variable de cadena ligera de interés enfrente del ADNc del dominio constante de cadena ligera kappa usando los sitios de enzimas de restricción BamHI y BsiWI; mientras que se diseñó el vector específico de la cadena pesada que permite la ligación del ADNc del dominio variable de cadena pesada de interés enfrente de la secuencia de ADNc que codifica para los dominios constantes CH1 IGHG1 , región de gozne IGHG1 , CH2 IGHG1 y CH3 IGHG1 usando los sitios de enzimas de restricción BamHI y Salí. En ambos vectores de expresión de cadena pesada y ligera, la secreción fue dirigida por el péptido guía VJ2C de ratón que contiene al sitio BamHI. El sitio de la enzima de restricción BsiWI se localiza en el dominio constante kappa; mientras que el sitio de la enzima de restricción Salí se encuentra en el dominio CH1 IGHG1.
El anticuerpo VH1/VL1 fue producido transitoriamente co-transfectando cantidades iguales de vectores de cadena ligera y pesada en células HEK293-EBNA1 adaptadas a la suspensión (No. de catálogo de la ATCC®: CRL-10852) usando polietilenimina (PEI, Sigma, Buchs, Suiza). Típicamente, 100 mi de células en suspensión a una densidad de 0.8-1.2 millones de células por mi son transfectadas con una mezcla de ADN-PEI que contiene 50 \ig del vector de expresión que codifica para la cadena pesada y 50 µg del vector de expresión que codifica para la cadena ligera. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican para los genes de anticuerpo se introducen en las células hospederas, se producen anticuerpos cultivando adicionalmente las células por un período de 4 a 5 días para permitir la secreción en el medio de cultivo (EX-CELL 293, medio de células HEK293 libre de suero; Sigma, Buchs, Suiza) complementado con ácido plurónico a 0.1%, glutamina 4 mM y 0.25 pg/ml de geneticina).
El anticuerpo VH1/VL1 se purificó del sobrenadante libre de células usando medio streamline de proteína A recombinante (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Suiza), y regulado en su pH se intercambió en solución salina de regulador de pH de fosfato antes de las pruebas. La unión a OX40 de humano se midió mediante SPR como se describió en el ejemplo 5.
Mutaciones retrógradas de estructuras injertadas de humano Puesto que el injerto directo de CDRs del anticuerpo 1 D4 de ratón llevó a un candidato que no tiene unión con OX40 de humano (cuadro 6 y figuras 4A-4F), se inició la mutagénesis en donde residuos de humano son sustituidos por residuos de ratón. Este procedimiento se denomina mutación retrógrada, y es el procedimiento más impredecible en la humanización de los anticuerpos monoclonales. Necesita la identificación y la selección de residuos de estructura críticos del anticuerpo de ratón que necesitan ser retenidos para preservar la afinidad, mientras que al mismo tiempo reduce al mínimo la inmunogenicidad potencial en el anticuerpo humanizado. El cuadro 7, el cuadro 8 y las figuras 5A-5B muestran residuos (numeración de Kabat) que difieren entre las estructuras de anticuerpo de ratón y de humano. Los residuos que pueden afectar las conformaciones de las CDRs o el empaque del dominio intervariable son de particular interés, puesto que pueden tener el más alto impacto sobre la afinidad del anticuerpo.
Para identificar los residuos que pueden engastar la mayor parte de la conformación de la CDR y/o el empaque del dominio ¡ntervariable, se calculó un modelo tridimensional para el par VH1-VL1 de los dominios variables usando el servidor de modelación de homología estructura SWISS-MODEL (Arnold K et al., (2006) Bioinformatics, 22(2): 195-201 ; http://swissmodel.expasy.org) puesto en modo automatizado. El análisis del modelo permitió la selección de un subgrupo de posiciones con base en su influencia putativa sobre las regiones de CDR y/o el empaque del dominio variable de cadena ligera y cadena pesada. Este subgrupo de posiciones consistió de las posiciones de la cadena pesada variable: 23, 35b, 48, 50, 60 y 62, así como las posiciones de la cadena ligera variable: 1 , 33, 34, 46, 47, 54, 56 y 71 (numeración de Kabat). Además de estas mutaciones retrógradas, la posición Y31 de la cadena ligera encontrada en el anticuerpo VH1A L1 fue deletada en algunos candidatos.
Se prepararon más candidatos humanizados con base en varias combinaciones de sustituciones de la cadena ligera y pesada en el contexto de la secuencia del anticuerpo VH1 VL1 usando mutagénesis estándar y los métodos descritos anteriormente. Se pusieron a prueba candidatos de anticuerpo humanizados por su capacidad de unión mediante la SPR como se describió en el ejemplo 5.
Los rendimientos de producción y las propiedades de unión de algunos de los anticuerpos humanizados con base en estas sustituciones individuales o combinación de sustituciones, se muestran en el cuadro 6. De los 28 anticuerpos mostrados, nueve candidatos no mostraron unión alguna con OX40 de humano, y otro grupo de nueve tuvo unión débil a deficiente. Los anticuerpos humanizados basados en VL9 mostraron la unión más consistentemente a débilmente a OX40 de humano mediante SPR. Sólo dos anticuerpos, VH6/VL9 y VH7/VL9, mostraron buena unión a OX40 de humano. Ambos anticuerpos humanizados tuvieron mutaciones retrógradas en las posiciones de la cadena pesada variable: 23, 35b, 50, 60 y 62 y las posiciones de la cadena ligera variable: 33, 34, 46, 47 y 71 (numeración de Kabat). Además de estas mutaciones retrógradas, VH6A L9 y VH7 VL9 se beneficiaron de la remoción de la posición 31 de la cadena ligera. En forma sorprendente, VH7/VL9 tuvo afinidad mejorada por OX40 de humano sobre el anticuerpo quimérico 1 D4 y la variante VH6A L9. Las afinidades de unión de estos anticuerpos humanizados se resumen en el cuadro 9.
Termoestabilidad de anticuerpos anti-OX40 humanizados seleccionados mediante calorimetría de barrido diferencial Las estabilidades térmicas de los anticuerpos humanizados se midieron usando calorimetría de barrido diferencial (DSC). Los perfiles de fusión de los anticuerpos monoclonales son característicos de sus isotipos (Garber E y Demarest SJ (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355: 751-7); sin embargo, la temperatura de fusión de punto medio del fragmento FAB puede identificarse fácilmente incluso en el contexto de una IgG de longitud completa. Dicha fusión de punto medio de la porción FAB se usó para monitorear la estabilidad monoclonal de los anticuerpos humanizados.
Se llevaron a cabo mediciones calorimétricas en un microcalorímetro de barrido diferencial VP-DSC (MicroCal, Northampton, Reino Unido). El volumen de células fue de 0.128 mi, el régimen de calentamiento fue de 200°C/h, y el exceso de presión se mantuvo a 4.5695 kg/cm2. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración de 1 mg/ml en PBS (pH 7.4). Se estimó la capacidad térmica molar del anticuerpo por comparación con muestras duplicadas que contenían regulador de pH idéntico de las cuales se había omitido el anticuerpo. Las capacidades térmicas molares parciales y las curvas de fusión se analizaron usando procedimientos estándar. Los termogramas fueron corregidos en la línea base y la concentración normalizada antes de ser analizados adicionalmente usando un modelo Non-Two State en el software Origin v7.0.
El fragmento FAB de VH6/VL9 variante humanizado exhibió una transición individual a 76.3°C con una amplitud y forma consistentes con un despliegue cooperativo el cual se observa generalmente para un fragmento FAB compactamente plegado, indicando que el procedimiento de diseño fue exitoso en la retención de la estabilidad del fragmento FAB. En general, la variante humanizada mostró una buena estabilidad térmica.
CUADRO 6 Anticuerpos de OX40 anti-humano humanizados CUADRO 6 (CONTINUACIÓN) CUADRO 7 Comparación de 1D4 y estructuras de IGHV 2-70*10 variables de cadena pesada de aceptor de humano CUADRO 8 Comparación de 1 D4 y estructuras de IGKV 3-11*01 variables de cadena ligera de aceptor de humano CUADRO 9 Características de la unión de anticuerpos anti OX40 quiméricos v humanizados seleccionados EJEMPLO 7 Caracterización del epítope de los anticuerpos anti-OX40 humanizados Para caracterizar el epítope de los anticuerpos anti-OX40 humanizados, el anticuerpo VH6/VL9 fue mapeado hacia un dominio definido de la región extracelular de OX40 de humano usando varias proteínas quiméricas OX40 de humano-rata.
Preparación de las proteínas quiméricas OX40 de humano-rata y ELISA Proteínas OX40 de rata y de humano-rata fueron formateadas como proteínas de fusión de Fe de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1. Para la ELISA, se recubrieron proteínas OX40 a 2 pg/mL, en PBS, durante la noche a 4°C en placas de 96 cavidades de alta unión (Costar). Las placas fueron bloqueadas con PBS, albúmina de suero de bovino (BSA) a 2%, antes de la incubación con el anticuerpo VH6A/L9 o el anticuerpo control de isotipos. Las placas se lavaron entonces y se incubaron con HRP específica del fragmento F(ab')2 de Ig anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Newmarket, Reino Unido). Después del lavado, las placas se incubaron con substrato TMB (Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Suiza) para revelar la unión del anticuerpo. La reacción se interrumpió añadiendo H2S04 2M, y se leyó la densidad óptica a 450 nM (DO 450 nM) en un espectrofotómetro Synergy HT2 (Biotek, USA; distribuidor: WITTEC AG, Littau, Suiza).
Resultados Sin tener en cuenta su origen, la región extracelular de OX40 se ha dividido en cuatro módulos estructurales referidos como dominios 1 , 2, 3 y 4 (Compaan DM y Hymowitz SG (2006) Structure, 14(8): 1321-30). Se construyeron proteínas OX40 quiméricas que corresponden a la región extracelular de OX40 de humano (aminoácidos 29-214 de TNFRSF4 de humano, numeración de acuerdo con la secuencia Uniprot P43489), intercambiando uno o más de los cuatro dominios entre las secuencias de humano y de rata. Por ejemplo, la proteína OX40 RHRR quimérica corresponde a la región extracelular de OX40 de rata, en donde el segundo dominio ha sido reemplazado por la secuencia correspondiente del dominio de humano.
Se llevó a cabo una ELISA de unión para poner a prueba la reactividad del anticuerpo VH6/VL9 en la región extracelular de OX40 de humano (abreviada como HHHH con SEQ ID NO: 1 1), la región extracelular de OX40 de rata (abreviada como RRRR con SEQ ID NO: 52), y en cuatro proteínas quiméricas- de humano-rata: RHRR (SEQ ID NO: 53), HRRR (SEQ ID NO: 54), HHRR (SEQ ID NO: 55) y RRHH (SEQ ID NO: 56). El resultado de esta ELISA se muestra en la figura 7. Como un prerrequisito a este experimento de mapeo de epítopes, se mostró que el anticuerpo VH6/VL9 se une a la proteína OX40 de humano, pero no a la proteína OX40 de rata, indicando que no hubo reactividad cruzada con OX40 de rata. Se encontró que el anticuerpo VH6A/L9 se unió a RHRR y HHRR, pero no a HRRR o RRHH, indicando que el epítope de VH6 VL9 mapea dentro del segundo dominio de la región extracelular de OX40 de humano.
EJEMPLO 8 El anticuerpo VH6/VL9 bloquea la reacción mixta de linfocitos de humano mediante mecanismos de bloqueo y destrucción La potencia del anticuerpo VH6 VL9 para suprimir reacciones inmunes in vitro se puso a prueba en una reacción mixta de linfocitos (MLR) alogénica unidireccional. La MLR es un modelo in vitro de activación y proliferación de células T alorreactivas (O'Flaherty E et al., (2000) Immunology, 100(3): 289-99; DuPont B y Hansen JA (1976) Adv. Immunol. 23: 107-202). Cuando se mezclan células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de dos donadores no emparentados, las células T llegan a ser activadas a través del reconocimiento de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) alogénicas. Esta activación resulta en la proliferación de linfocitos T. La reacción de MLR se ha usado ampliamente para demostrar el efecto de los fármacos inmunosupresores que eligen como objetivo a las células T (Bromelow KV et al., (2001) J. Immunol. Methods, 247(1-2): 1-8). Fármacos inmunosupresores tales como la ciclosporina funcionan principalmente a través de la inhibición de la activación de las células T. Además de la prueba del efecto de bloqueo por el anticuerpo VH6/VL9, se investigó también la contribución de mecanismos citotóxicos tales como la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) sobre la inhibición de la MLR. Tres diferentes formatos de anticuerpo del anticuerpo VH6/VL9 se pusieron a prueba en esta prueba: un formato de IGHG1 (referido en la presente como VH6A L9), un formato de IGHG1 no fucosilada (lgG1) (referido en la presente como VH6A L9 no fucosilado), y un formato de IGHG4 (lgG4) (referido en la presente como VH6A/L9 IGHG4 S228P). Se sabe que los anticuerpos de IGHG1 (lgG1) son competentes por mecanismos de citotoxicidad tales como la ADCC. Se sabe que los anticuerpos de IGHG1 no fucosilada exhiben actividad de ADCC aumentada debido a una mayor afinidad por el FcyRIIIa expresado en células citotóxicas tales como las células asesinas naturales (células NK) (Mizushima T et al., (2011) Genes Cells, 16(11): 1071-80). En contraste, se sabe que los anticuerpos de IGHG4 (lgG4) no tienen dichos mecanismos de citotoxicidad mediada por Fe tales como la ADCC.
Formateo del anticuerpo VH6/VL9 El formateo de la inmunoglobulina IGHG4 que tiene la sustitución S228P se logró reemplazando la secuencia de ADNc que codifica para los dominios constantes CH1 IGHG1 , región de gozne IGHG1 , CH2 IGHG1 y CH3 IGHG1 con una secuencia de ADNc que codifica para los dominios constantes CH1 IGHG4, región de gozne IGHG4 que tiene la sustitución S228P, CH2 IGHG4 y CH3 IGHG4 en el vector específico de la cadena pesada descrito en el ejemplo 6. Se introdujo la sustitución S228P en un molde de ADNc de cadena pesada de IGHG4 de humano mediante técnicas estándar de mutagénesis por PCR. La cadena pesada resultante tiene a SEQ ID NO: 57. La producción del anticuerpo VH6A L9 de IGHG1 no fucosilada siguió el protocolo descrito en el ejemplo 14 de la publicación WO2010/095031.
Reacción mixta de linfocitos Sangre de dos diferentes donadores humanos se colectó en tres S-Monovette de 10 mL con citrato como anticoagulante (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de los dos donadores humanos se purificaron usando tubos Blood-Sep-Filter de 50 mL (distribuidor: Brunschwig, Basel, Suiza), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron dos veces con medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI, PAA Laboratories, Pasching, Austria) sin FBS. Células estimuladoras de los dos donadores se prepararon mediante incubación con 50 pg/ml de mitomicina C (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza) por 30 minutos a 37°C. Las células se lavaron entonces tres veces con RPMI sin FBS y se resuspendieron a 1x106 células/mL en RPMI, FBS a 10% (PAA Laboratories, Pasching, Austria), L-glutamina 2 mM (Lonza, Leuven, Bélgica), 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Biochrom AG, Berlín, Alemania). Las células respondedoras se resuspendieron en RPMI, FBS a 10%, L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina en microplacas de fondo en U de 96 cavidades (TPP, Trasadingen, Suiza). 50,000 células estimuladoras y 80,000 células respondedoras se distribuyeron en un volumen final de 10 pl para cada cavidad. 100 µ? de las diluciones del anticuerpo (o medio solo) se añadieron a las cavidades. Las placas se incubaron por 7 días a 37°C en una incubadora de CO2 a 5%. Las células fueron pulsadas con 0.5 pCi de timidina tritiada (Perkin Elmer, Basel Suiza) durante las últimas 18 horas. Las células se cosecharon en un filtro filtermat (Perkin Elmer), y la radiactividad incorporada se cuantificó en un contador Wallac beta (Perkin Elmer).
Resultados Los resultados mostrados en las figuras 8A-8B demuestran que el anticuerpo VH6/VL9 es capaz de inhibir eficientemente la MLR para dos diferentes individuos (respondedores), con valores de EC50 de alrededor de 100 ng/mL. Los resultados muestran también una diferente respuesta que depende del formato del anticuerpo usado, y se observa una diferencia en la contribución de los mecanismos de bloqueo y citotóxicos en la MLR de los diferentes individuos.
La reactividad de las células T del respondedor 1 (figura 8A) fue inhibida eficientemente por los formatos de IGHG1 e IGHG4, indicando que los mecanismos citotóxicos no son críticos para el respondedor 1. En contraste, el formato de IGHG4 fue sólo deficientemente capaz de bloquear la MLR del respondedor 2 (figura 8B) a alta concentración, y perdió muy rápidamente su efecto a bajas concentraciones, mientras que el formato de IGHG1 pudo lograr más de 60% de inhibición implicando que, para el respondedor 2, los mecanismos de destrucción dan razón de la mayor parte del efecto inhibidor.
Esta diferencia en el modo de acción surge probablemente del hecho de que la activación, proliferación y supervivencia de las células T en una reacción de MLR dependen variablemente de señales co-estimuladoras de OX40 entre los individuos, dependiendo del grado de reactividad alergénica y posiblemente otras señales co-estimuladoras. Para individuos deficientemente dependientes de las señales co-estimuladoras derivadas de OX40, la eliminación de las células T activadas por el mecanismo de la ADCC es el mecanismo de acción principal de VH6/VL9.
En forma sorprendente, el formato de IGHG1 no fucosilada exhibió una capacidad muy potente para inhibir la MLR para ambos respondedores. Esta observación resalta el hecho de que incluso si un mecanismo de bloqueo puede ser suficiente para lograr la inhibición de la MLR, la adición o el realce de los mecanismos de destrucción mejora el efecto inhibidor de los anticuerpos anti-OX40. Dicho realce es particularmente útil cuando se tratan trastornos mediados por OX40 sin tener en cuenta el estado co-estimulador de OX40 de los pacientes, por ejemplo, cuando los pacientes tienen bajos niveles de expresión de OX40.
EJEMPLO 9 El anticuerpo VH6/VL9 bloquea la enfermedad de injerto xenogénico contra hospedero La reacción de injerto xenogénico contra hospedero (GVH) es un modelo para la enfermedad de injerto alogénico contra hospedero (GVHD) observada después del trasplante de médula ósea en pacientes humanos. La reacción de GVH es una respuesta inmune aguda mediada por las células inmunes injertadas que atacan al ambiente del hospedero como una consecuencia del reconocimiento alogénico o xenogénico del MHC (Murphy WJ et al., (1996) Semin. Immunol. 8(4): 233-41). Los linfocitos T son las células efectoras principales de las reacciones de GVH. La potencia inmunosupresora del anticuerpo VH6/VL9 se puso a prueba en un modelo de enfermedad de injerto xenogénico contra hospedero basado en la reconstitución de ratones SCID con PBMCs de humano. En este modelo, las PBMCs de humano y principalmente los linfocitos T lanzan una fuerte respuesta contra las células hospederas de ratón. La reacción lleva notablemente a inflamación severa intestinal y de la piel acompañada por pérdida de peso. La lectura de salida más relevante de este modelo, es la supervivencia de los animales.
Método Se irradió sub-letalmente a animales (ratones SCID) antes de ser reconstituidos con 30 millones de PBMCs de humano intraperitonealmente. Los ratones fueron agotados también de células NK de ratón mediante inyecciones dobles semanalmente con el anticuerpo TMbetal . El tratamiento con el anticuerpo VH6/VL9, Enbrel® o vehículo se dio i.v. semanalmente como cinco dosis consecutivas, y comenzaron dos días antes de la inyección de las PBMCs. Los animales se trataron con vehículo (PBS) o con el anticuerpo VH6/VL9 a 10 mg/kg o 1 mg/kg, o Enbrel® (una proteína de fusión del receptor 2 del FNT soluble de humano fusionada con el componente Fe de lgG1 de humano, Amgen-Pfizer) a 8 mg/kg. Los animales fueron verificados y calificados tres veces por semana para síntomas de GVHD, incluyendo pérdida de peso, diarrea, aspecto del pelaje y comportamiento general. Los animales eran éticamente sacrificados, si se consideraba que los síntomas eran demasiado severos.
Resultados La figura 9 muestra que el anticuerpo VH6/VL9 suprimió muy potentemente la reacción de la GVHD, incluso a la dosis menor de 1 mg/kg.
En forma sorprendente, el anticuerpo VH6/VL9 demostró eficacia mejorada sobre Enbrel®, que es una terapia reconocida para la GVHD en humanos (Xhaard A et al., (201 1) Bull. Cáncer, 98(8): 889-99; Simpson D (2001 ) Expert Opin. Pharmacother. 2(7): 1 109-17). El tiempo de supervivencia medio de los animales tratados con el anticuerpo VH6A L9 a 1 o 10 mg/kg, fue cuatro veces más largo en comparación con el grupo tratado con vehículo (cuadro 10), y dos veces más largo en comparación con Enbrel®. Además, este resultado resalta que el anticuerpo VH6A L9 no posee actividad agonista, ya que se ha reportado que un anticuerpo anti-OX40 agonista empeora la GVHD en modelos de GVHD en el ratón alogénico (Valzasina B et al., (2005) Blood, 105(7): 2845-51 ; Blazar BR et al., (2003) Blood, 101 (9): 3741-8), un evento que no se observó en el presente estudio.
CUADRO 10 Tiempo de supervivencia medio (en días) de los grupos de tratamiento indicados Vehículo: sólo PBS.1D4: anticuerpo GBR 830-1 D4; Enbrel fue el producto clínico.

Claims (49)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un anticuerpo antagonista o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
2.- El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo de murino, anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
3. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo humanizado.
4. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende: i. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; o ii. la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 58, 59, 79 y 80.
5.- El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región no de CDR de la secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos 80% idéntica a: i. la región no de CDR de la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 7; o ii. la región no de CDR de la secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 58, 59, 79 y 80.
6. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 35, 36, 37 y 38.
7. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la secuencia de cadena pesada comprende una región no de CDR que es por lo menos 80% idéntica a la región no de CDR de la secuencia de región variable de cadena pesada de la secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 35, 36, 37 o 38.
8. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región de estructura variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de: i. un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de IGHV2-70*10 (SEQ ID NO: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID NO: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID NO: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID NO: 22) e IGHV2-70*11 (SEQ ID NO: 23); o ii. gen humano IGHV2-70*10 (SEQ ID NO: 19) y en donde la región de estructura variable de cadena pesada comprende al menos una modificación de aminoácido de la región de estructura variable de cadena pesada correspondiente del anticuerpo de murino correspondiente.
9. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, y en donde la región de estructura variable de cadena pesada comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura variable de cadena pesada correspondiente del anticuerpo de murino correspondiente.
10. - El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado además porque la modificación de aminoácido comprende: i. una sustitución de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 23, 35b, 48, 50, 60 y 62, en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat; o ii. una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 23S, 35bG, 48L, 50H, 60N y 62A, en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat.
11.- El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende: i. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o ii. la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 60, 86, 87 y 89.
12.- El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región no de CDR de una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos 80% idéntica a: i. la región no de CDR de la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8: o ii. la región no de CDR de la secuencia de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 60, 86, 87 y 89.
13 - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 45, 46, 47 y 49.
14. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la secuencia de cadena ligera comprende una región no de CDR que es por lo menos 80% idéntica a la región no de CDR de la secuencia de la región variable de cadena ligera de la secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 45, 46, 47 o 49.
15. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región de estructura variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de: i. un gen de humano seleccionado del grupo que consiste de IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID NO: 25), IGKV1 D-39*01 (SEQ ID NO: 26), IGKV3-11*02 (SEQ ID NO: 27) e IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 28); o ii. gen de humano IGKV3-11*01 (SEQ ID NO: 24) y en donde la región de estructura variable de cadena ligera comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura correspondiente de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de murino correspondiente.
16. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, y en donde la región de estructura variable de cadena ligera comprende por lo menos una modificación de aminoácido de la región de estructura variable de cadena ligera correspondiente del anticuerpo de murino correspondiente.
17. - El anticuerpo humanizado o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 15 o 16, caracterizado además porque la modificación de aminoácido comprende: i. una sustitución de aminoácido en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 1 , 33, 34, 46, 47, 54, 56 y 71 , en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat; ii. una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S y 71 Y, en donde la posición de aminoácido de cada miembro de grupo se indica de acuerdo con la numeración de Kabat; o iii. una deleción de aminoácido en la posición de aminoácido 31 , en donde la posición de aminoácido se indica de acuerdo con la numeración de Kabat.
18. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende: (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38; y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.
19.- El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende: (a) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 59; y (b) una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.
20. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque por lo menos una de las CDRs de cadena pesada y/o por lo menos una de las CDRs de cadena ligera comprende por lo menos una modificación de aminoácido.
21. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado además porque comprende adicionalmente regiones constantes de cadena pesada y/o ligera; y en donde la región constante de cadena pesada de humano se selecciona del grupo de inmunoglobulinas de humano que consisten de IGHG1 , IGHG1 no fucosilada e IGHG4.
22. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
23. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , caracterizado además porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos, cuerpos bivalentes, cuerpos trivalentes y scFv fusionado genéticamente con el mismo anticuerpo o un anticuerpo diferente.
24. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , caracterizado además porque el anticuerpo comprende una región Fe variante que comprende por lo menos una modificación de aminoácido respecto a la región Fe del anticuerpo precursor, mientras que el anticuerpo que comprende la región Fe variante exhibe función efectora alterada en comparación con el anticuerpo precursor.
25.- El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento del mismo: i. se une a OX40 de humano con una afinidad (KD) de 110 nM o menos; ii. retiene por lo menos 75% de la afinidad de unión (KD) a OX40 del anticuerpo quimérico correspondiente; o iii. tiene afinidad de unión (KD) a OX40 equivalente o mayor cuando se compara con el anticuerpo quimérico correspondiente.
26. - El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado además porque el anticuerpo tiene un fragmento FAB cuya temperatura de termoestabilidad es mayor de 75°C.
27. - Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano y el cual se une al mismo epítope que el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
28. - Un epítope en el dominio extracelular de OX40 de humano que es unido por el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el dominio extracelular de OX40 de humano es el dominio 2 (SEQ ID NO: 76).
29.- Un ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
30 - El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende ADN que codifica para la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 61 o 62; y/o ADN que codifica para la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 63.
31. - Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 29 o 30.
32. - Una célula hospedera que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 29 o 30 o el vector de la reivindicación 31.
33. - Un método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano, que comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 32 de modo que el ácido nucleico sea expresado y el anticuerpo producido.
34. - Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a OX40 de humano codificado por el ácido nucleico aislado de la reivindicación 29 o 30.
35. - Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
36. - Un ¡nmunoconjugado que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 enlazado a un agente terapéutico.
37. - El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para usarse como un medicamento.
38. - El anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para usarse en un método para tratar un trastorno mediado por OX40 en un sujeto.
39. - El anticuerpo o fragmento del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el trastorno mediado por OX40 se selecciona del grupo que consiste de infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, asma, bronquitis, influenza, virus sincicial respiratorio, neumonía, EPOC, fibrosis pulmonar idiopática (IPF), alveolitis fibrosante criptogénica (CFA), neumonía intersticial fibrosante idiopática, enfisema, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, artritis, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central y periférico mediados por el sistema inmune, tales como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barré, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, trauma (quirúrgico), enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), rechazo de trasplante, enfermedad cardiovascular que incluye enfermedades isquémicas tales como infarto al miocardio así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis, hipoclorhidria y neuromielitis óptica.
40.- El anticuerpo o fragmento del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 37 o reivindicación 38, en donde el sujeto tiene un bajo nivel de expresión de OX40, indicado por un incremento en el nivel de expresión de células positivas de OX40 en comparación con los niveles de control de hasta 10%.
41.- El anticuerpo o fragmento del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicación 37 o reivindicación 38, en donde el anticuerpo tiene citotoxicidad mejorada en comparación con el anticuerpo que tiene región constante de cadena pesada de humano IGHG1 determinada en una reacción mixta alogénica de linfocitos (MLR) unidireccional.
42.- El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para usarse en el tratamiento de un trastorno mediado por OX40, en donde el trastorno mediado por OX40 es GVHD, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo es más efectivo que Enbrel® (proteína de fusión del receptor 2 del FNT soluble de humano fusionada con el componente Fe de lgG1 de humano) en la supresión de la GVHD.
43.- Un kit para el tratamiento de un trastorno mediado por OX40 que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, la composición de la reivindicación 35 o el inmunoconjugado de la reivindicación 36.
44. - Un método de selección ¡n vitro para detectar a un paciente que tiene un bajo nivel de expresión de OX40, que comprende los pasos de: (a) purificar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de una muestra de sangre de un paciente; (b) someter las PBMCs a análisis citométrico de flujo; y (c) determinar el número de células positivas para OX40 en células T CD4+ y/o CD8+, y comparar este número con niveles control, en donde un bajo nivel de expresión de OX40 es indicado por un incremento en el nivel de expresión de células positivas de OX40 en comparación con niveles de control de hasta 10%.
45. - El uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 en la producción de un medicamento para tratar un trastorno mediado por OX40 en un sujeto.
46. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde el trastorno mediado por OX40 se selecciona del grupo que consiste en infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, asma, bronquitis, influenza, virus sincicial respiratorio, neumonía, EPOC, fibrosis pulmonar idiopática (IPF), alveolitis fibrosante criptogénica (CFA), neumonía intersticial fibrosante idiopática, enfisema, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, artritis, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central y periférico mediados por el sistema inmune, tales como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barré, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, trauma (quirúrgico), enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), rechazo de trasplante, enfermedad cardiovascular que incluye enfermedades isquémicas tales como infarto al miocardio así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis, hipoclorhidria y neuromielitis óptica.
47.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde el sujeto tiene un bajo nivel de expresión de OX40, indicado por un incremento en el nivel de expresión de células positivas de OX40 en comparación con los niveles de control de hasta 10%.
48. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde el anticuerpo tiene citotoxicidad mejorada en comparación con el anticuerpo que tiene región constante de cadena pesada de humano IGHG1 determinada en una reacción mixta alogénica de linfocitos (MLR) unidireccional.
49. El uso de un anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno mediado por OX40, en donde el trastorno mediado por OX40 GVHD, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo es más efectivo que Enbrel® (proteína de fusión del receptor 2 del FNT soluble de humano fusionada con el componente Fe de lgG1 de humano) en la supresión de la GVHD.
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