KR20140043811A - Ox40에 결합하는 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

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라미 리시라
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    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95

Abstract

본 발명은 인간 OX40에 결합하는 길항제(antagonist) 항체 또는 이들의 단편에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) CDR1, 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) CDR1, 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편에 관한 것이다.

Description

OX40에 결합하는 항체 및 이들의 용도{Antibodies that bind to OX40 and their uses}
본 출원은 2011년 7월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 61/506,491의 이익을 주장하고; 이의 모두는 본 명세서에서 참조로서 통합된다.
기술분야
본 발명은 인간 OX40에 결합하는 길항제(antagonist) 항체 또는 이들의 단편에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) CDR1, 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) CDR1, 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제(antagonist) 항체 또는 이들의 단편에 관한 것이다.
OX40은 수용체의 TNFR-슈퍼패밀리 구성원이고 쥐로부터 활성화된 CD4+ T 세포에서 발현된 50 kDa 당단백질로서 1987년에 처음 확인되었다(Paterson DJ et al., (1987) Mol. Immunol. 24: 1281-90). OX40의 세포외 리간드 결합 도메인(extracellular ligand binding domain)은 3 전체 시스테인-리치 도메인(full cysteine-rich domains, CRDs) 및 부분적, 네 번째 C-말단 CRD로 구성된다(Bodmer JL et al ., (2002) Trends Biochem. Sci. 27: 19-26). OX40에 대한 리간드는 OX40L(CD252)이고 및 3 카피(copies)의 OX40은 OX40-OX40L 복합체를 형성하기 위하여 삼량체 리간드에 결합한다(Compaan DM & Hymowitz SG (2006) Structure, 14: 1321-1330). OX40은 막-결합(membrane-bound) 수용체이나; 그러나 용해성 이성체가 또한 검출되었다(Taylor L & Schwarz H (2001) J. Immunol. Methods, 255: 67-72). CD28과 달리, OX40은 미경험 T 세포(naive T cells)에서 지속적으로 발현되지 않지만 T-세포 수용체(TCR)의 진입 후 포함된다. OX40은 활성 다음 24 내지 72 시간 후 발현되는, 이차 부자극 분자이고; 이의 리간드; OX40L은, 또한 세포에 휴식 항원 제시 세포(esting antigen presenting cells)에서 발현되지 않지만, 그들의 활성을 따른다. OX40은 활성화된 CD4+ T 세포에 의해 및 한정된 범위에서, 활성화된 CD8+ T 세포에 의해 주로 발현된다(Salek-Ardakani S et al., (2006) Curr. Immunol. Rev. 2: 37-53).
본 발명은 일반적으로 인간 OX40에 결합하는 길항제(antagonist) 항체 또는 이들의 단편, OX40 매개된 장애를 치료하기 위한 방법을 포함하는, 이들의 제조 및 이용을 위한 방법에 관한 것이다. 인간 OX40에 결합하는 본 발명의 길항제 항체 또는 이들의 단편은 길항(antagonistic) 항체이고 및 효능(agonistic) 효과를 나타내거나 및/또는 결합에 있어서 인간 OX40을 활성화 시키지는 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) CDR1, 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) CDR1, 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
추가적인 측면에서 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(variable region) 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 추가적인 측면에서 본 발명은: IGHV2-70*10 (서열번호 19), IGHV2-70*01 (서열번호 20), IGHV2-70*13 (서열번호 21), IGHV2-5*09 (서열번호 22), 및 IGHV2-70*11 (서열번호 23)으로 구성된 군으로부터 선택된 인간 유전자의 산물이거나 또는 유래된 중쇄 가변구조형성영역(variable framework region)을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
추가적인 측면에서 본 발명은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공하고 및 여기서 중쇄 가변구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 중쇄 가변구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
추가적인 측면어세 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역(light chain variable region) 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 추가적인 측면에서 본 발명은: IGKV3-11*01 (서열번호 24), IGKV1-39*01 (서열번호 25), IGKV1D-39*01 (서열번호 26), IGKV3-11*02 (서열번호 27) 및 IGKV3-20*01 (서열번호 28)로 구성된 군으로부터 선택된 인간 유전자의 산물이거나 또는 유래된 경쇄 가변구조형성영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
추가적인 측면에서 본 발명은 인간 유전자 IGKV3-11*01 (서열번호 24)의 산물이거나 또는 유래된 경쇄 가변구조형성영역을 포함하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공하고 및 여기서 경쇄 가변구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 경쇄 가변구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
추가적인 측면에서 본 발명은 서열번호 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 추가적인 측면에서 본 발명은 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 49로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
추가적인 측면에서 본 발명은:
(a) 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열; 및
(b) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열
을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
추가적인 측면에서 본 발명은 서열번호 58, 59, 79 및 80으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 추가적인 측면에서 본 발명은 서열번호 60, 86, 87 및 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
추가적인 측면에서 본 발명은:
(a) 서열번호 58 또는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
(b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
추가적인 측면에서 본 발명은 OX40에 결합하는 길항 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 항체는 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하고, 여기서 항체는 Fc-매개된 세포독성 활성을 가지지 않는다. 추가적인 측면에서 본 발명은 인간 OX40에 결합하는 길항 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 항체는 인간 IGHG1 Fc 영역을를 포함하고, 여기서 항체는 항체 의존적 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)와 같은 세포독성 기전에 적합하다. 바람직한 측면에서, 인간 OX40에 결합하는 길항 항체 또는 이들의 단편은 비푸코실화된(non fucosylated) IGHG1 Fc 영역을 가지고 및 ADCC와 같은 증강된 Fc-매개된 세포독성 기전을 보인다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 명세서는 상응하는 키메라(chimeric) 항체로서 인간 OX40에 유사한 친화도를 가지고 결합하는 길항 인간화 항체 또는 이들의 단편을 또한 설명하고 즉 적어도 75%의 상응하는 키메라 항체의 OX40 결합친화도(KD)를 보유하거나 또는 상응하는 키메라 항체와 비교했을 때 적어도 동등한 또는 더 높은 OX40 결합친화도(KD)를 가진다. 추가적인 측면에서 본 발명은 인간 OX40 세포외(extracellular) 영역의 두 번째 도메인(domain) 내 항원결정기(epitope)에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
본 발명의 명세서는 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편을 암호화하는 분리된 핵산, 벡터 및 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주세포(host cells)을 또한 제공한다. 길항제 항체 또는 이들의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 조성물 및 치료제에 결합된 길항제 항체 또는 이들의 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugates)가 또한 제공된다.
본 발명은 OX40 매개된 장애를 치료하기 위한 방법을 또한 제공한다. 일 측면에서, 이질 반응성(alloreactive) T 세포 활성 및 증식(혼합림프구반응(mixed lymphocyte reaction); MLR)의 시험관 내(in vitro) 모델에서, 길항 항체 또는 이들의 단편은 대략 100 ng/mL의 EC50 값을 가지고, 두 다른 개별(반응자)에서 효과적으로 MLR을 억제한다. 뿐만 아니라, 외인성(xenogenic) 이식편대숙주반응(graft versus host reaction)에서, 동종(allogenic) 이식편대숙주반응에 대한 모델은 인간 환자에서 골수 이식 후 관찰하였고, 길항 항체 또는 이들의 단편은 강력하게 GVHD 반응이 억제하였다.
본 발명은 항체 또는 이들의 단편을 포함하는 제조의 키트 및 제품, OX40 매개된 장애의 치료를 위한 조성물 또는 면역접하체를 또한 제공한다.
도 1: (a) 고정화된 재조합 인간 OX40 - his 에 대한 직접-결합 ELISA. 인간 OX40에 대한 키메라(chimeric) 2F8 및 1D4 항체의 결합은 직접 ELISA에 의해 측정되었다. 다양한 농도(10 내지 0.01 mg/ml의 범위)의 1D4(검은색 히스토그램(histograms)) 및 2F8(흰색 히스토그램)은 96-웰 플레이트(plate)에 4℃에서 하루 동안 코팅된 2 mg/ml의 재조합 인간 OX40-his 태그된(tagged) 단백질과 함께 배양되었다. 각각의 항체의 OX40에의 결합은 호스라디시 페록시다제(horseradish peroxidise, HRP)-접합된 항 인간 항체에 의해 검출되었다. (b) 고정화된 재조합 인간 OX40-Fc에 대한 경쟁적 ELISA. OX40/OX40L 상호작용에 대한 키메라 1D4 및 2F8의 억제 효과는 ELISA를 차단(bloking)함에 의해 평가되었다. 다양한 농도(10 내지 0.01 mg/ml의 범위)의 1D4(검은색 히스토그램(histograms)) 및 2F8(흰색 히스토그램)은 96-웰 플레이트에 4℃에서 하루 동안 코팅된 2 mg/ml의 재조합 인간 OX40-Fc 태그된(tagged) 단백질과 함께 배양되었다. 5분 후, 고정된 농도의 비오틴화된(biotinylated) 재조합 인간 OX40L (0.04 mg/ml)는 각 웰에 첨가되었고 상온에서 30분 동안 배양되었다. OX40L의 OX40에의 결합은 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP를 이용하여 검출되었다.
도 2: 3 H 티미딘 ( thymidine ) 도입( incorporation )에 의해 측정된 일방향 혼합림프구반응( MLR ). 바(bars)는 적어도 3회의 평균 3H-티미딘 도입(수(counts) ± 평균의 표준오차를 나타낸다. 이소형(Isotype) 대조군(트라스투주맙(trastuzumab) 및 양성 대조군(에팔리주맙(efalizumab)이 나타내어진다. 효과기는 오직 효과기 세포를 나타낸다. 효과기 + 표적(target)은 항체가 생략된 곳에서 측정을 나타낸다.
도 3: 키메라 1D4 항체의 유동 세포측정 분석(Flow cytometry analysis)
(a) 인간 활성화된 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 및 HPB - ALL 세포에 대한 염색. 히스토그램 플롯(plots)은 형광 강도(X-축) 및 상대적 세포 수(최대 사건의 % - Y-축)를 나타낸다. 염색된 세포의 타입은 표시된다. 인간 PBMC는 측정 전에 48시간 동안 PHA 및 IL-2와 함께 활성화되었다.
(b) 활성화된 게먹이원숭이 ( cynomolgus monkey ) PBMCs 에 대한 염색. 키메라 1D4 항체의 게먹이원숭이 OX40에의 결합은 유동 세포측정에 의해 평가되었다. 말초혈액단핵구(PBMCs)는 게먹이원숭이로부터 수집된 전체 혈액으로부터 분리되었고 3x106 세포는 10 mg/ml의 PHA 및 100 U/ml의 rhuIL-2의 존재 하에 50시간 동안 배양되었다. 활성화된 PBMCs는 25 mg/ml의 대조군 항체(위 프로파일(i)) 또는 비오틴화된 양 항-인간 OX40 항체(가운데 프로파일(ii)) 또는 비오틴화된 키메라 1D4 항체(아래 프로파일(iii))과 함께 배양되었다. 각 항체의 게먹이원숭이 OX40에의 결합은 스트렙타비딘-APC를 가지고 검출되었다.
도4: 항-OX40 항체의 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon resonance) 측정. 데이터는 반응의 수(단축된 RU; Y 축) 대 시간(X 축)으로서 표현된다.
도 4a - VH1/VL1 항체 대 1D4 키메라.
도 4b - VH1, VH2, 및 VH3 기반된 인간화 항체(표시된 바와 같이) 대 1D4 키메라.
도 4c - 빈약한 결합자(binders)의 예: VH4/VL4, VH5/VL4, VH5/VL5, 및 VH5/VL6.
도 4d - 약한 결합자(VH5/VL9 및 VH4/VL9) 및 좋은 결합자(VH6/VL9 및 VH7/VL9)의 예.
도 4e - VH7 기반된 인간화 항체.
도 4f - VH6/VL9는 1D4 키메라 및 인간화 변이체 VH7/VL9에 대한 가장 좋은 결합 특성을 가진다.
도 5: 서열 정렬( Sequence Alignment ). IMGT로부터 선택된 생식(germline) 구조형성(frameworks)(IGHV 2-70*10 (서열번호 19) 및 IGKV3-11*01 (서열번호 24)) 및 뒤쪽-변형된(back-mutated) 가변영역 변이체 (VH1 (서열번호 29), VH2 (서열번호 77), VH3 (서열번호 78), VH4 (서열번호 79), VH5 (서열번호 80), VH6 (서열번호 58), VH7 (서열번호 59), (VL1 (서열번호 30), VL2 (서열번호 81), VL3 (서열번호 82), VL4 (서열번호 83), VL5 (서열번호 84), VL6 (서열번호 85), VL7 (서열번호 86), VL8 (서열번호 87), VL9 (서열번호 60) VL10 (서열번호 88), VL11 (서열번호 89)과 함께 중쇄(heavy chain)(도 5a) 또는 경쇄(light chain)(도 5b) 가변영역(variable region)의 정렬.
도 6: 시차 주사 열량계( differential scanning calorimetry )를 이용한 인간화된 항- OX40 항-항체 VH6 / VL9 FAB 단편의 열안정성 ( thermostability ) 측정. 데이터는 초과 몰 열용량(excess molar heat capacity)(단축된 Cp [kcal/mol/oC]; Y 축) 대 온도(X 축)으로서 표현된다.
도 7: 항원결정기 ( Epitope ) 정의( Characterisation ). 이 도는 실시예 7에서 설명된 바와 같이 ELISA 분석법 결과에 기반한 인간화 항-OX40 항-항체 VH6/VL9 항원결정기를 나타낸다.
도 8: 3 H 티미딘 도입에 의해 측정된 혼합림프구반응( MLR ). 도 8a 및 도 8b는 두 비관련된 공여자로부터 혼합림프구반응의 결과를 나타낸다. 증식은 3H-티미딘 도입에 의해 측정되었다. 그래프는 각 상태에 대한 절대적 계수값(counts values) ± SEM을 나타낸다. 반응기(responder) 세포는 무처리된 PBMCs였고, 자극기(stimulator) 세포는 미토마이신(mitomycin)-처리된 PBMCs였다. 시험 항체와 함께 모든 상태는 이종성(heterologous) 자극기 PBMCs와 혼합된 반응기 세포와 함께 수행되었다. 양성 대조군은 에팔리주맙(항 LFA-1 항체)이었다.
도 9: 외인성 이식편대숙주반응 모델. 이 도는 각 언급된 상태에 대한 8마리의 동물의 그룹 내 퍼센트 생존을 나타낸다. 운반체(Vehicle): 오직 PBS. 수직 점선은 처리의 마지막 날을 가리킨다. PBMCs를 받지 않은 두 조사된 대조군 동물의 그룹에서 사망률 및 증상이 관찰되지 않았다.
본 발명은 인간 OX40에 결합하는 길항제(antagonist) 항체 및 이들의 단편에 관한 것이다.
여기에서 사용된 용어 "인간 OX40(human OX40)"은 인간 OX40의 변이체(variants), 이성체(isoforms), 및 종 상동(species homologs)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는, 특정 경우에서, 인간보다 다른 종으로부터의 OX40과 함께 교차-반응할 수도 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 하나 또는 그 이상의 인간 OX40 단백질에 대해 완전히 특이적일 수도 있고 및 비-인간 교차-반응성의 종 또는 타입을 보이지 않을 수도 있다. 적절한 인간 OX40의 완전한 아미노산 서열은 Swiss-Prot 등록번호(accession number) P43489 (TNR4_HUMAN; 서열번호 12)를 가진다. OX40는 CD134, TNFRSF4, ACT35 또는 TXGP1 L로서 또한 알려져 있다. 인간 OX40는 Entrez Gene에 의한 GeneID: 7293, 및 HGNC에 의한 HGNC: 11918로 지정된다. OX40은 또한 CD134(분화 134(differentiation 134)의 무리(cluster))로 지정되었다. OX40은 TNFRSF4/OX40로 지정된 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
여기에서 "인간 OX40"의 사용은 모든 알려진 또는 아직 발견되지 않은 인간 OX40의 대립 유전자(alleles) 및 결정다형(polymorphic forms)를 포함한다. 용어 "인간 OX40(human OX40)", "OX40" 또는 "OX40 수용체(OX40 Receptor)"는 만약 특이적으로 표지되지 않는 한 여기에서 "인간 OX40(human OX40)"과 동등하게 사용되고 및 의미한다.
용어 "OX40 리간드(OX40 ligand)" 또는 "OX40L"은 여기에서 OX40 리간드, 특이적으로 인간 OX40 리간드로 여기에서 동등하게 사용되고 및 포함한다. OX40L은 TNF 슈퍼패밀리(superfamily)의 구성원이고 및 또한 gp34 또는 CD252로서 알려져 있다. OX40L은 또한 CD252(분화 252의 무리)로 지정되었고 및 서열 데이터베이스 등록번호 P23510 (Swiss-Prot) 또는 Q6FGS4 (Uniprot)를 가진다. OX40L은 활성화된 B 세포, T 세포, 수지상 세포(dendritic cells) 및 내피세포(endothelial cells)의 표면에서 발현된다.
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편"은 인간 OX40 즉 500 nM 또는 그 이하, 바람직하게 200 nM 또는 그 이하, 더 바람직하게 150 nM 또는 그 이하, 더 바람직하게 120 nM 또는 그 이하, 심지어 더 바람직하게 110 nM 또는 그 이하의 친화도 (KD)를 가지는, 분리된 형태로서 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편을 포함한다. 용어 "인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편"은 항체 또는 이들의 항원성(antigenic) 결합 단편을 포함한다.
용어 "길항 항체(antagonistic antibody)" 또는 "길항제 항체(antagonist antibody)"는, 예를 들어 OX40의 OX40 리간드에의 결합하는 것을 차단하거나 또는 결합을 상당히 완화하고 및 그 결과 OX40에 의해 촉진된 신화 경로를 억제하거나 또는 완하하고 및/또는 림프구(lymphocyte) 증식, 사이토카인(cytokine) 발현, 또는 림프구 생존(survival)과 같은 OX40-매개된 세포 반응을 억제하거나 또는 완화함에 의해 OX40의 생물학적 신호 활성을 억제하거나 및/또는 중화할 수 있는 항체로 여기에서 동등하게 사용되거나 포함한다.
여기에서 언급된 바와 같이 용어 "항체(antibody)"는 전체 항체 및 이들의 어느 항원 결합 단편 또는 단쇄(single chains)를 포함한다. "항체"는 이황(disulfide) 결합에 의해 상호-접촉된(inter-connected) 적어도 두 개의 중(hevay, H) 쇄(chain) 및 두 개의 경(light, L) 쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이들의 항원 결합 단편을 말한다. 각 중쇄는 중쇄 가변영역(variable region)(여기에서 VH로 단축된) 및 중쇄 불변영역(constant region)으로 구성된다. 중쇄 불변영역은 세 개의 도메인(domains), CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변영역(여기에서 VL로 단축된) 및 경쇄 불변영역으로 구성된다. 경쇄 불변영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 서열에 있어서 과가변(hypervariable)이고 및/또는 항원 인식에 포함되고 및/또는 구조형성영역(framework regions)(FR 또는 FW)로 일컬어지는, 더 보존된 영역으로 산재된, 구조적으로 정의된 루프(loops)를 형성하는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDR)으로 일컬어지는, 과가변성의 영역으로 추가적으로 다시 나눠질 수 있다. 각 VH 및 VL는 다음 순서: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4로 아미노-말단에서부터 카복실-말단으로 정렬된, 세 개의 CDRs 및 4 개의 FWs로 구성된다. FW1, FW2, FW3, 및 FW4의 아미노산 서열은 모두 함께 여기에서 언급된 바와 같이 VH 또는 VL의 "비-CDR 영역(non-CDR region)" 또는 "비-확장된 CDR 영역(non-extended CDR region)"으로 구성된다.
여기에서 언급된 바와 같이 용어 "중쇄 가변구조형성영역(heavy chain variable framework region)"은 하나 또는 그 이상의(즉, 하나, 둘 셋 및/또는 넷) 중쇄 구조형성영역 서열(즉, 구조형성 1(framework 1, FW1), 구조형성 2(framework 2, FW2), 구조형성 3(framework 3, FW3) 및/또는 구조형성 (framework 4, FW4))을 포함할 수도 있다. 바람직하게 중쇄 가변영역 구조형성은 FW1, FW2 및/또는 FW3, 더 바람직하게 FW1, FW2 및 FW3을 포함한다. 여기에서 언급된 바와 같이 용어 "경쇄 가변구조형성영역(light chain variable framework region)"은 하나 또는 그 이상의(즉, 하나, 둘 셋 및/또는 넷) 경쇄 구조형성영역 서열(즉, 구조형성 1(FW1), 구조형성 2(FW2), 구조형성 3(FW3) 및/또는 구조형성 (FW4))을 포함할 수도 있다. 바람직하게 경쇄 가변영역 구조형성은 FW1, FW2 및/또는 FW3, 더 바람직하게 FW1, FW2 및 FW3을 포함한다.
중 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변영역은 면역 시스템의 다양항 세포(즉, 효과기 세포(effector cells)) 및 고적적인 보체(complement) 시스템의 첫 번째 구성성분(C1q)를 포함하는, 면역글로블린(immunoglobulin)의 숙주(host) 조직 또는 인자로의 결합을 매개할 수도 있다.
항체는 유전적으로 불변영역에 의해 결정되어 진 바와 같이, 또한 이소형(isotypes)으로 언급된, 부류로 그룹화된다. 인간 불변 경쇄는 카파(kappa, CK) 및 람다(lambda, Cλ) 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤(mu, μ), 델타(delta, δ), 감마(gamma, γ), 알파(alpha, α), 또는 엡실론(epsilon, ε)으로서 분류되고, 항체의 이소형을 각각, IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 정의한다. 그러므로, 여기에서 사용된 바와 같이 "이소형(isotype)"은 이들의 불변영역의 화학적 및 항원적 특성에 의해 정의된 면역글로블린의 어느 부류 및/또는 서브부류(subclasses)로 의미되어진다. 알려진 인간 면역글로블린 이소형은 IgG1 (IGHG1), IgG2 (IGHG2), IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgA1 (IGHA1), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD), 및 IgE (IGHE)이다. 소위 인간 면역글로블린 슈도-감마(pseudo-gamma) IGHGP 유전자는 서열화되지만 변형된 스위치영역(switch region) 때문에 단백질을 암호화하지 않는 추가적인 인간 면역글로블린 중쇄 불변영역을 나타낸다(Bensmana M etal ., (1988) Nucleic Acids Res. 16(7): 3108). 변형된 스위치영역을 가졌음에도 불구하고, 인간 면역글로블린 슈도-감마 IGHGP 유전자는 모든 중쇄 불변 도메인(CH1-CH3) 및 힌지(hinge)에 대한 개방형 판독 프레임(open reading frames)을 가진다. 이의 중쇄 불변 도메인에 대한 모든 개방형 판독 프레임은 예상된 구조적 특성을 가지는 모든 인간 면역글로블린 불변 도메인과 잘 얼라인(align)하는 단백질 도메인을 암호화한다. 이 추가적인 슈도-감마 이소형은 여기에서 IgGP 또는 IGHGP로서 언급된다. 다른 슈도 면역글로블린 유전자는 인간 면역글로블린 중쇄 불변 도메인 엡실론 P1 및 P2 슈도-유전자(IGHEP1 및 IGHEP2)와 같이 보고된다. IgG 부류는 가장 일반적으로 치료 목적으로 사용된다. 인간에서 이 부류는 서브부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 마우스(mice)에서 이 부류는 서브부류 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 및 불변영역 서열이, 가변영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변영역이 인간 항체로부터 유래된 항체와 같은, 또 다른 종으로부터 유래된 항체를 포함한다.
여기에서 사용된 용어 "인간화 항체(humanized antibody)" 또는 "인간화 항-OX40 항체(humanized anti-OX40 antibody)"는 마우스와 같은, 또 다른 포유류 종의 생식세포(germline)로부터 유래된 CDR 서열이 인간 구조형성영역에 접목된 항체를 포함한다. 추가적인 구조형성영역 변형은 또 다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열 내에서뿐만 아니라 인간 구조형성 서열 내에서 만들어 질 수도 있다.
여기에서 사용된 용어 "Fab" 또는 "Fab 영역(Fab region)"은 VH, CH1, VL, 및 CL 면역글로블린 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. Fab는 분리에 있어서 이 영역, 또는 전장 항체 또는 항체 단편의 맥락에 있어서 이 영역을 말할 수도 있다.
여기에서 사용된 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역(Fab region)"은 첫 불변영역 면역글로블린 도메인을 제외한 항체의 불변영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로 Fc는 IgA, IgD, and IgG의 마지막 두 불변영역 면역글로블린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 세 불변영역 면역글로블린 도메인, 및 이들 도메인에서 유연한 힌지 N-말단을 말한다. IgA 및 IgM에 대하여, Fc는 J 쇄를 포함할 수도 있다. IgG에 대하여, Fc는 면역글로블린 도메인 C 감마 2 및 C 감마 3 (Cγ2 and Cγ3) 및 C 감마 1 (Cγl) 및 C 감마 2 (Cγ2) 사이의 힌지를 포함한다. 비록 Fc 영역의 경계가 변할 수도 있고, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 이의 카복실-말단에서 잔기 C226 또는 P230를 포함하는 것으로 보통 정의되고, 여기서 번호붙이기(numbering)은 EU 번호붙이기 시스템에 따른 것이다. 인간 IgG1에 대하여, Fc 영역은 여기에서 이의 카복실-말단에서 잔기 P232를 포함하는 것으로 정의되고, 여기서 번호붙이기는 EU 번호붙이기 시스템에 따른 것이다(Edelman GM etal., (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85). Fc는 분리에 있어서 이 영역 또는 Fc 폴리펩티드, 예를 들어 항체의 맥락에 있어서 이 영역을 말한다.
여기에서 용어 "힌지(hinge)" 또는 "힌지영역(hing region)" 또는 "항체 힌지영역(antibody hinge region)"은 항체의 첫 번째 및 두 번째 불변영역 사이의 아미노산을 포함하는 유연한 폴리펩티드를 포함한다. 여기에서 언급된 바와 같이 "힌지영역"은 두 중쇄를 연결하는 시스테인(cysteine) 잔기를 포함하는, 오직 IgA, IgD 및 IgG에서 나타나는, 길이에 있어서 6-62 아미노산의 서열 영역이다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 끝나고, 및 IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 2237에서 시작한다. 그러므로 IgG에 대하여 항체 힌지는 여기에서 위치 221(IgG1에서 D221) 내지 231(IgG1에서 A231)을 포함하는 것으로 정의되고, 여기에서 번호붙이기는 EU 번호붙이기 시스템에 따른 것이다( (Edelman GM etal ., supra).
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "모 항체(parent antibody)" 또는 "모 면역글로블린(parent immunoglobulin)"은 변이체를 발생하기 위해 그 뒤에 변형되는 비변형된 항체를 포함한다. 상기 모 항체는 자연적으로 발생하는 항체, 또는 자연적으로 발생하는 항체의 변이체 또는 조작된 버전(version)일 수도 있다. 모 항체는 항체 자체, 모 항체를 포함하는 조성물, 또는 이것을 암호화 하는 아미노산 서열을 말할 수도 있다. 여기에서 사용된 바와 같이 "모 항체-OX40 항체(parent anti-OX40 antibody)"에 의해 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 면역글로블린이 의미되고 및 변이체를 발생하기 위하여 변형된다. 여기에서 사용된 바와 같이 "상응하는 쥐 항체(corresponding murine antibody)"에 의해 인간 OX40에 결합하고 및 변이체, 특이적으로 여기에서 밝혀진 바와 같이 쥐 항체 1D4를 발생하기 위해 변형될 수 있는 쥐 항체 또는 면역글로블린이 의미된다.
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "변이체 항체(variant antibody)" 또는 "항체 변이체(antibody variant)"는 모체와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형의 장점(virtue)에 의해 모 항체 서열의 그것과 차이가 있는 항체 서열을 포함한다. 여기에서 변이체 항체 서열은 바람직하게 적어도 약 80%, 더 바람직하게 적어도 약 90%, 더 바람직하게 적어도 약 95% 모 항체 서열과 일치하는 아미노산 서열을 소유할 것이다. 항체 변이체는 항체 자체, 항체 변이체를 포함하는 조성물, 또는 이것을 암호화하는 아미노산 서열을 말할 수도 있다.
여기에서 용어 "아미노산 변형(amino acid modification)"은 폴리펩티드 서열에 있어서 아미노산 치환(substitution), 삽입(insertion), 및/또는 결실(deletion)을 포함한다. 여기에서 "아미노산 치환(amino acid substitution)" 또는 "치환(substitution)"에 의해 또 다른 아미노산과 함께 모 폴리펩티드 서열에 있어서 특정 위치에 아미노산의 대체로 의미된다. 예를 들어, 치환 R94K는 변이체 폴리펩타이드, 이 경우에 위치 94에서 아르기닌(arginine)이 라이신(lysine)으로 대체된, 중쇄 가변 구조형성영역 변이체를 말한다. 전술한 실시예에 대하여, 94K는 위치 94의 라이신으로 치환을 나타낸다. 여기에서 목적을 위하여, 다중 치환은 전형적으로 슬래시(slash)에 의해 분리된다. 예를 들어, R94K/L78V은 치환 R94K 및 L79V를 포함하는 이중 변이체를 말한다. 여기에서 사용된 바와 같이 "아미노산 삽입(amino acid insertion)" 또는 "삽입(insertion)"에 의해 모 폴리펩티드 서열에 있어서 특정 위치에서 아미노산의 추가로 의미된다. 예를 들어, 삽입 -94는 위치 94에서 삽입을 나타낸다. 여기에서 사용된 "아미노산 결실(amino acid deletion)" 또는 "결실(insertion)"은 모 폴리펩티드 서열에 있어서 특정 위치에서 아미노산의 제거로 의미된다. 예를 들어, R94-는 위치 94에서 아르기닌의 결실을 나타낸다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 변형(conservative modifications)" 또는 "보존적 서열 변형(conservative sequence modifications)"은 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 상당히 영향을 받지 않거나 또는 바뀌지 않는 아미노산 변형을 말하는 것으로 의도된다. 이런 보족적 변형은 아미노산 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이(PCR-mediated mutagenesis)와 같은, 당 업계에 잘 알려진 표준 기술에 의해 발명의 항체에 도입될 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 당 업계에서 정의되었다. 이들 패밀리는 아미노산 스위치 기초 측쇄(즉, 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine)), 산성 측쇄(즉, 아스파라트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)), 비하전된 극성(uncharged polar) 측쇄(즉, 글라이신(glycine, 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 트립토판(tryptophan)), 비극성 측쇄(즉, 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenyl alanine), 메티오닌(methionine)), 베타-분지된 측쇄(즉, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄(즉, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토한, 히스티딘)을 포함한다. 그러므로, CDR 내에 또는 본 발명의 항체의 구조형성영역 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 및 변형된 항체(변이체 항체)는 보유된 기능을 위해 시험될 수 있다.
모든 인간 면역 글로블린 중쇄 불변 도메인에 대하여 번호붙이기는 "EU 번호붙이기 시스템(EU numbering system)"에 따른 것이다(Edelman GM et al., (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85).
인간 카파 면역글로블린 경쇄 불변 도메인(IGKC)에 대하여, 번호붙이기는 "EU 번호붙이기 시스템(EU numbering system)"에 따른 것이다(Edelman GM et al., supra).
인간 람다 면역글로블린 경쇄 불변 도메인((IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6, 및 IGLC7)에 대하여, 번호붙이기는 Dariavach P et al., (1987) Proc Natl Acad Sci USA, 84(24): 9074-8 및 Frangione B et al., (1985) Proc Natl Acad Sci USA, 82(10): 3415-9에 의해 설명된 바와 같이 "케벳(Kabat) 번호붙이기 시스템(EU numbering system)"에 따른 것이다(Kabat EA etal., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition-US Department of Health and Human Services, NIH publication no 91-3242).
용어 "가변 도메인(variable domain)"은 항원-결합을 매개하고 및 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의하는 도메인을 말한다. 자연적으로 발생하는 항체에서, 항원-결합 부위(site)는 특이성: 중쇄에 위치한 하나(VH) 및 경쇄(VL)에 위치한 다른 하나로 정의하는 두 개의 가변 도메인으로 구성된다. 일부 경우에, 특이성은 카멜리드(camelids)에서 발견되는 중쇄 항체로부터 단일-도메인 항체와 같이 두 도메인 중 오직 하나에 배제적으로 존재할 수도 있다. V 영역은 보통 약 110 아미노산 길이이고, 및 9-12 아미노산 길이인 "과가변영역(hypervariable regions)"으로 불리는 극가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 아미노산의 구조형성영역(FRs)로 불리는 아미노산 서열의 상대적으로 불변 스트래치(stretches)로 구성된다. 선천적 중 및 경쇄의 가변 도메인은 루프를 형성하는, 세 개의 과가변 영역에 의해 연결된, 베타-시트(beat sheet) 배열을 거의 적용하는, 4 개의 FRs를 포함한다. 각 쇄에 있는 과가변영역은 서로 FRs에 의해 아주 근접하여 서로 붙잡히고, 및 다른 쇄로부터 과가변영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat EA etal., supra 참조). 여기에서 사용된 바와 같이 용어 "과가변영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변영역은 일반적으로 "상보적결정부위 (complementary determining region)" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성이고 및/또는 항원 인식이 포함된다. 모든 가변 도메인에 대하여 번호붙이기는 케벳에 따른 것이다(Kabat EA et al., supra).
많은 CDR 정의는 여기에서 쓰고 있고 및 포함된다. 케벳 정의는 서열 가변성에 기반하고 및 가장 일반적으로 사용된다(Kabat EA et al ., supra). 코티아(Chothia)는 대신에 구조적 루프의 위치를 말한다(Chothia C & Lesk AM (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). AbM 정의는 케벳 및 코티아 사이에서 포함되는 및 Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다(Martin ACR et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86: 9268-72; Martin ACR et al ., (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen JT et al., (1992) Immunomethods, 1: 126-136; Rees AR et al., (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.) Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172). 접촉 정의는 최근 소개되었고(MacCallum RM et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745) 및 Protein Databank에 사용할 수 있는 사용할 수 있는 복합체 구조의 분석에 기반한다. IMGT®, 국제적인 ImMunoGeneTics information system®(http://www.imgt.org)에 의한 CD의 정의는 모든 종의 모든 면역글로블린 및 T 세포 수용체 V-REGIONs를 위한 IMGT 번호붙이기에 기반한다(IMGT® the international ImMunoGeneTics information system® Lefranc MP et al ., (1991) Nucleic Acids Res. 27(1): 209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev. Comp. Immunol. 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64).
본 발명에서 논의된 모든 상보성 결정영역(Complementarity Determining Regions, CDRs)은, 바람직하게 IMGT® 따라 정의된다. 이들 CDRs의 각각에 대한 가변 도메인 잔기는 다음과 같다(Kabat EA, et al., supra에 따른 번호붙이기): LCDR1: 27-32, LCDR2: 50-52, LCDR3: 89-97, HCDR1: 26-35, HCDR2: 51-57 및 HCDR3: 93-102. 여기에서 사용된 VL 영역의 "비-CDR 영역(non-CDR region)"은 아미노산 서열: 1-26 (FR1), 33-49 (FR2), 53-88 (FR3), 및 98- 대략적으로 107 (FR4)를 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이 VH 영역의 "비-CDR 영역"은 아미노산 서열: 1-25 (FR1), 36-50 (FR2), 58-92 (FR3), 및 103- 대략적으로 113 (FR4)를 포함한다.
본 발명의 CDRs는 전술한 정의에 기반하고 다음과 같은: LCDR1: 24-36, LCDR2: 46-56, LCDR3:89-97, HCDR1: 26-36, HCDR2:47-65, HCDR3: 93-102 가변 도메인 잔기를 가지는 "확장된 CDRs"를 포함할 수도 있다. 이들 확장된 CDRs는 Kabat et al ., supra에 따라 잘 번호가 붙여진다. 여기에서 사용된 바와 같이 VL 영역의 "비-확장된 CDR 영역"은 아미노산 서열: 1-23 (FR1), 37-45 (FR2), 57-88 (FR3), 및 98- 대략적으로 107 (FR4)를 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이 VH 영역의 "비-확장된 CDR 영역"은 아미노산 서열: 1-25 (FR1), 37-46 (FR2), 66-92 (FR3), 및 103- 대략적으로 113 (FR4)를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "전장 항체(full length antibody)"는 가변 및 불변영역을 포함하는, 선천적 생물학적 형태의 항체를 구성하는 구조를 포함한다. 예를 들어, 인간 및 마우스를 포함한, 대부분 포유류에서, IgG 부류의 전장 항체는 사량체이고 두 개의 일치하는 쌍의 두 면역글로블린 쇄, 하나의 경 및 하나의 중쇄를 가지는 각 쌍, 면역글로블린 도멘인 VL 및 CL을 포함하는 각 경쇄, 및 면역글로블린 도메인 VH, CH1 (Cγ1), CH2 (Cγ2), 및 CH3 (Cγ3)을 포함하는 각 중쇄로 구성된다. 일부 포유류에서, 예를 들어 낙타 및 라마에서, IgG 항체는 오직 두 중쇄, Fc 영역에 접합된 가변 도메인을 포함하는 각 중쇄로 구성될 수도 있다.
항체 단편은, (i) Fab' 및 Fab'-SH를 포함하는, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) 단일 가변으로 구성된 dAB 단편(Ward ES et al ., (1989) Nature, 341: 544-546), (v) F(ab')2 단편, 두 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편 (vi) 여기서 VH 도메인 및 VL 도메인은 두 도메인이 항원 결합 부위와 관련이 있을 수 있는 펩티드 링커(linker)에 의해 연결된, 단쇄 Fv 분자(scFb) (Bird RE et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston JS et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83), (vii) 이특이적 단쇄 Fv 이량체((PCT/US92/09965), (viii) "디아체(diabodies)" 또는 "트리아체(triabodies)" 유전자 융합에 의해 만들어진 다중가 또는 다중특이적 단편(Tomlinson I & Hollinger P (2000) Methods Enzymol. 326: 461-79; WO94/13804; Holliger P et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-48) 및 (ix) 동일한 또는 다른 항체에 유전적으로 융합된 scFv (Coloma MJ & Morrison SL (1997) Nature Biotechnology, 15(2): 159-163)를 포함하나, 제한되지 않는다.
여기에서 사용된 바와 같이 용어 "효과기 기능(effector function)"은 Fc 수용체 또는 리간드와 항체 Fc 영역의 상호작용으로부터 야기하는 생화학적 사건을 포하한다. 효과기 기능은 ADCC(항체 의존적 세포-매개된 세포독성) 및 ADCP(항체 의존적 세포-매개된 식세포작용)와 같은 FcγR-매개된 효과기 기능, 및 CDC(상보적 의존적 세포독성)과 같은 상보적-매개된 효과기 기능을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 수용체 또는 상보적 구성성분과 같은 효과기 분자에 대한 항체의 친화도를 변화함, 즉 강화하거나 또는 완화하거나, 바람직하게 강화함에 의해 변화될 수도 있다. 결합친화도는 일반적으로 효과기 분자 결합 부위를 변형함에 의해 일반적으로 바뀔 것이고, 및 이 경우 흥미의 부위를 위치하고 적절한 방법으로 부뷔의 적어도 부분을 변형하는 것이 적절하다. 효과기 분자에 대한 항체에 있는 결합 부위에서 변경은 전체 결합 친화도를 상당히 바뀔 필요는 없으나 비-생산적 결합으로서 비효율적인 효과기 기전을 만드는 상호작용의 기하학을 바뀔 수도 있다고 또한 예상된다. 추가적으로 효과기 기능은 또한 효과기 분자 결합을 직접 포함하지 않는 부위를 변형함에 의해 바뀔 수도 있으나, 그렇지 않으면 효과기 기능의 수행에 포함될 수도 있다. 항체의 효과기 기능을 바꿈에 의해 면역 반응의 다양한 측면을 조절하는 것, 예를 들어 진단 및 치료에서 가능한 이득이 되는 효과와 함께, 면역 시스템의 다양한 반응을 강화하거나 또는 억제하는 것이 가능할 수도 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "OX40-매개된 장애"는 알러지, 천식, COPD. 류마티스성 관절염, 건선 및 자가면역 및 염증과 관련이 있는 질환과 같은 상태를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "개체"는 어느 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은, 포유류 및 비-포유류를 포함한다. 바람직하게 개체는 인간이다.
항- OX40 항체
첫 번째 측면에서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) CDR1, 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) CDR1, 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제(antagonist) 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
일부 실시형태에 있어서, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이의 단편은 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 중쇄 CDR1 및/또는 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 중쇄 CDR3을 포함하고; 및/또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 확장된 경쇄 CDR3을 포함한다.
바람직하게는, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 중쇄 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
CDR1 및/또는 CDR2 도메인으로부터 독립적으로, CDR3 도메인이 동종(cognate) 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 독단으로 결정할 수 있고, 다수의 항체가 일반적 CDR3 서열에 기반하여 동일한 결합 특이성을 갖도록 생성될 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 클림카외 다수(Klimka A et al., (2000) Br. J. Cancer, 83(2): 252-260) (단지, 쥐 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 변수 도메인을 사용하여 인간화 항-CD30 항체의 생성을 설명함); 베이보에르외 다수(Beiboer SH et al., (2000) J. Mol. Biol. 296: 833-849) (단지, 모 쥐 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열을 사용하여 재조합 상피 당단백질-2(EGP-2) 항체를 설명함); 레더외 다수( Rader C et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 8910-8915) (쥐 항-인테그린 ανβ3 항체 LM609의 중쇄 및 경쇄 변수 CDR3 도메인을 사용하여 인간화 항-인테그린 ανβ3 항체의 패널을 설명함, 여기서 각각의 항체 구성원은 CDR3 도메인 외부의 뚜렷한 서열을 구성하고, 높은 또는 모 쥐 항체보다 높은 친화도(affinity)를 갖는 모 쥐 항체(parental murine antibody)로서 동일한 항원결정기에 결합할 수 있음); 바르바스외 다수(Barbas C et al ., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-62)(CDR3 도메인은 항원 결합에 가장 현저한 기여를 제공함을 개시함)를 참조하시오.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인, 특히 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 및/또는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 항체 및 이들의 단편을 제공한다. 여기서, 항체는 인간 OX40에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비인간 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 상기 발명의 항체는 (a) 결합에 대해 경쟁할 수 있고; (b) 기능적 특성을 유지하고; (c) 동일한 항원결정기에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 모 비인간, 예를 들면, 쥐 항체로서 유사한 결합친화도를 갖는다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열 및 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편의 변이체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 중쇄이거나 경쇄, 예를 들면, 각각 서열번호: 7이거나 서열번호: 8로서 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열의 모 길항제 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 부위의 아미노산 서열에 적어도 80% 일치하는(적어도 80% 아미노산 서열 일치를 가짐) 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 부위의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 또한 중쇄이거나 경쇄의 모 길항제 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비확장된 CDR 부위의 아미노산 서열에 적어도 80% 일치하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 부위 서열의 비확장된 CDR 부위의 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 이들의 단편은 본 발명에 의해 제공된다. 바람직하게는, 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR부위 또는 비확정된 CDR 부위의 아미노산 서열 일치는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 특히 97%, 더욱 더 특히 98%, 가장 특히 99%, 실시예를 포함하여 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100% 이다. 아미노산 서열에 대한 일치 또는 상동(homology)은 가능하면, 서열 일치의 최대 퍼센트를 달성하기 위하여, 서열 및 도입간격(introducing gap)을 정렬한 후에 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편과 일치하는 후보 서열에 있는 아미노산 잔기의 퍼센트로서 본 명세서에서 정의된다. 따라서, 서열 일치는 두 개의 폴리펩티드(polypeptides) 아미노산의 위치에 있는 유사성을 비교하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 방법에 의해 결정된다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산의 최적의 매칭(matching)을 위해 정렬한다(하나 또는 두 개의 서열의 전장((full-length))을 따라서 또는 하나 또는 두 개 서열의 미리 결정된 일부를 따라서). 프로그램은 불이행 개방 페널티(default opening penalty) 및 불이행 간격 페널티(default gap penalty)를 제공하고, PAM250과 같은 스코오링 매트릭스(scoring matrix) (표준 스코오링 매트릭스; 데이호프외 다수(Dayhoff MO et al., (1978) in Atlas of Protein sequence and Structure, vol 5, supp. 3)를 참조하시오)는 컴퓨터 프로그램과 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 퍼센트 일치는 하기와 같이 계산될 수 있다: 총 일치 수를 100으로 곱한 후 매칭된 간격내 긴 서열의 길이와 두 개의 서열로 정렬하기 위해 긴 서열로 도입된 간격 수의 합계로 나눈다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 19, 20, 21, 22 또는 23의 구조형성영역 서열에 적어도 70% 일치하는 중쇄 가변구조형성영역 서열 및/또는 서열번호: 24, 25, 26, 27 및 28의 구조형성영역 서열에 적어도 60% 일치하는 경쇄 가변구조형성영역 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 19의 구조형성영역 서열에 적어도 74% 일치하는 중쇄 가변구조형성영역 서열 및/또는 서열번호: 24의 구조형성영역 서열에 적어도 65% 일치하는 경쇄 가변구조형성영역 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기에서 언급한 중쇄 및/또는 경쇄 CDRs를 포함하고 IGHV2-70*10(서열번호: 19), IGHV2-70*01(서열번호: 20), IGHV2-70*13(서열번호: 21), IGHV2-5*09(서열번호: 22), 및 IGHV2-70*11(서열번호: 23)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 산물이거나 또는 인간 유전자로부터 유래하는 중쇄 가변구조형성영역, 바람직하게는 인간 유전자 IGHV2-70*10(서열번호: 19)의 산물이거나 유래하는 중쇄 가변 구조형성영역을 추가적으로 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 중쇄 가변구조형성영역은 인간 유전자의 산물에 존재하거나 인간 유전자로부터 유래하는 하나 또는 그 이상(예를 들면, 1, 2, 3 및/또는 4) 중쇄 구조형성영역 서열(예를 들면, 구조형성 1(FW1), 구조형성 2(FW2), 구조형성 3(FW3) 및/또는 구조형성4(FW4)을 구성할 수 있다. 바람직하게는 중쇄 가변영역 구조형성은 FW1, FW2 및/또는 FW3를 포함하고, 더욱 바람직하게는 FW1, FW2 및 FW3은 IGHV2-70*10(서열번호: 19), IGHV2-70*01(서열번호: 20), IGHV2-70*13(서열번호: 21), IGHV2-5*09(서열번호: 22), 및 IGHV2-70*11(서열번호: 23)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 산물에 존재하거나 또는 인간 유전자로부터 유래한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이 중쇄 구조형성영역 서열은 FW1(위치 1 내지 위치 25), FW2(위치 36 내지 위치 49), FW3(위치 66 내지 위치 94) 및 FW 4(위치 103 내지 위치 113)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 케벳(Kabat)에서 설명된 번호 시스템을 활용하여 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 이들의 단편은 인간 유전자 IGHV2-70*10(서열번호: 19)의 산물이거나 또는 유래한 중쇄 가변 구조형성영역을 포함하고 여기서 중쇄 가변 구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 중쇄 가변 구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 중쇄 가변구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 제공한다.
바람직하게는 아미노산 변형은 23, 35b, 48, 50, 60, 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 위치, 더욱 바람직하게는 23, 35b, 50, 60, 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 위치, 가장 바람직하게는 35b 아미노산 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어진다. 특히, 아미노산 변형은 23S, 35bG, 48L, 50H, 60N, 및 62A로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환, 바람직하게는 T23S, S35bG, I48L, R50H, S60N 및 S62A 로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, 반면에 S35bG는 가장 바람직한 아미노산 치환이며, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어진다.
다른 측면에서, 본 발명은 IGKV3-11*01(서열번호: 24), IGKV1-39*01(서열번호: 25), IGKV1D-39*01(서열번호: 26), IGKV3-11*02(서열번호: 27) 및 IGKV3-20*01(서열번호: 28)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 산물이거나 또는 인간 유전자로부터 유래한 경쇄 가변구조형성영역, 바람직하게는 인간 유전자 IGKV3-11*01(서열번호: 24)의 산물이거나 또는 유래한 경쇄 가변 구조형성영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 경쇄 가변영역 구조형성영역은 상기 인간 유전자의 산물이거나 또는 인간 유전자로부터 유래한 하나 또는 그 이상(예를 들면, 1, 2, 3 및/또는 4)의 경쇄 구조형성영역 서열(예를 들면, 구조형성 1(FW1), 구조형성 2(FW2), 구조형성 3(FW3) 및/또는 구조형성 4(FW4))을 포함할 수 있다. 경쇄 가변영역 구조형성은 바람직하게는 FW1, FW2 및/또는 FW3, 더욱 바람직하게는 V3-11*01(서열번호: 24), IGKV1-39*01(서열번호: 25), IGKV1D-39*01(서열번호: 26), IGKV3-11*02(서열번호: 27) 및 IGKV3-20*01(서열번호: 28)로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 산물이거나 또는 유래한 FW1, FW2 및 FW3을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것처럼 경쇄 구조형성영역 서열은 FW1(위치 1 내지 위치 23), FW2(위치 35 내지 위치 49), FW3(위치 57 내지 위치 88) 및 FW 4(위치 98 내지 위치 108)을 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 케벳에서 설명된 번호 시스템을 활용하여 나타낸다.
일부 실시형태에서 본 개시는 인간 유전자 IGKV3-11*01(서열번호: 24)의 산물이거나 유래한 경쇄 가변구조형성영역을 포함하는 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 경쇄 가변구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 경쇄 가변영역의 상응하는 구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서 본 개시는 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 경쇄 서열의 경쇄 가변구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 경쇄 가변 구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
바람직하게는 아미노산 변형은 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56, 및 71 및/또는 아미노산 위치 31의 결실로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 33, 34, 46, 47, 54, 56, 및 71 및/또는 아미노산 위치 31의 결실로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 아미노산 치환, 가장 바람직하게는 46 및/또는 47의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어진다. 특히 아미노산 변형은 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S, 및 71Y, 및/또는 T31의 결실로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환, 바람직하게는 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S 및 71Y로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 33M, 34H, 46P, 47W 및 71Y로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하고, 반면에 46P, 47W은 특히 바람직하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어진다.
일부 실시형태에서, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 V2-70*10(서열번호: 19), V2-70*01(서열번호: 20), V2-70*13(서열번호: 21), V2-5*09(서열번호: 22), 및 V2-70*11(서열번호: 23)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 산물이거나 또는 인간 유전자로부터 유래된 중쇄 가변 구조형성영역과 V3-11*01(서열번호: 24), IGKV1-39*01(서열번호: 25), IGKV1D-39*01(서열번호: 26), IGKV3-11*02(서열번호: 27) 및 IGKV3-20*01(서열번호: 28)로 구성되는 군으로부터 선택되는 인간 유전자의 산물이거나 또는 인간 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 구조형성영역, 바람직하게는 인간 유전자 V2-70*10(서열번호:19)의 산물이거나 또는 유래된 중쇄 가변구조형성영역, 및 인간 유전자V3-11*01(서열번호: 24)의 산물이거나 또는 유래된 경쇄 가변구조형성영역을 포함한다. 또한, 상기에서 언급된 상이한 인간 유전자의 산물이거나 또는 유래된 중쇄 가변 구조형성영역 및/또는 상기에서 언급된 상이한 인간 유전자의 산물이거나 또는 유래된 경쇄 가변영역 구조형성영역의 조합은 본 발명에 의해 포함된다.
인간 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자를 위한 생식세포(Germline) DNA 서열은 상기 카벳외 다수(Kabat EA et al); 톰린슨외 다수(Tomlinson IM et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798) 및 콕스외 다수(Cox JPL et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827-836) 뿐만 아니라 “VBase”인간 생식세포 서열 데이타베이스(인터넷www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase상에서 활용가능함)에서 찾을 수 있다. 다른 실시예에서 인간 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자를 위한 생식세포 DNA 서열 유전자은행 데이타베이스(Genbank database)에서 찾을 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한고, 여기서 적어도 중쇄 CDRs의 하나 및/또는 적어도 경쇄 CDRs의 하나는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 특정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 또는 PCR-매개된 돌연변이 유발은 변형 및 항체 결합에 대한 효과를 도입하여 수행할 수 있거나, 또는 다른 관심대상의 기능적 속성은, 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 분석에서 평가될 수 있다. 바람직하게는 보존적변형이 도입된다. 변형은 아미노산 치환, 첨가 또는 결실일 수 있으나, 바람직하게는 치환이다. 통상적으로, 5개를 넘지 않은, 바람직하게는 4개를 넘지 않은, 더욱 바람직하게는 3개를 넘지 않은, 더욱 더 바람직하게는 2개를 넘지 않은, 가장 바람직하게는 1개를 넘지 않은 아미노산 변형이 CDR 영역에서 수행된다.
특정 실시 형태에서, 구조형성 서열은 변이항체(variant antibodies)를 생성하기 위해서 가변영역을 조작하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 변이항체는, 예를 들면, 항체의 속성을 향상시키기 위해, VH 및/또는 VK내의 구조형성 잔기로 만들어진다. 통상적으로 상기 구조형성 변형은 항체의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위해 만들어진다. 예를 들면, 한가지 접근방법은 하나 또는 그 이상의 구조형성 잔기를 상응하는 쥐 서열에 “복귀돌연변이(backmutate)”시키거나 또는 하나 또는 그 이상의 구조형성 잔기를 상응하는 생식세포 서열에 “복귀돌연변이”시키는 것이다.
따라서, 추가적인 측면에서 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는이들의 단편을 제공한다. 여기서 인간화 항체 또는 이들의 단편의 중쇄 가변영역의 구조형성영역 서열의 적어도 하나는 상응하는 쥐 항체의 중쇄 가변영역의 상응하는 구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는 아미노산 변형은 아미노산 치환이다. 통상적으로, 6개를 넘지 않은, 바람직하게는 5개를 넘지 않은, 바람직하게는 4개를 넘지 않은, 더욱 바람직하게는 3개를 넘지 않은, 더욱 더 바람직하게는 2개를 넘지 않은, 가장 바람직하게는 1개를 넘지 않은 아미노산 변형은 구조형성영역내에서 수행된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 여기서 중쇄 가변영역의 구조형성영역의 아미노산 변형은 23, 35b, 48, 50, 60 및 62로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 아미노산 치환을 포함하고 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어진다. 바람직하게는 중쇄 가변영역의 구조형성영역의 아미노산 치환은 23, 35b, 50, 60 및 62로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 있다. 더욱 바람직하게는 중쇄 가변영역의 구조형성영역의 아미노산 치환은 23S, 35bG, 48L, 50H, 60N 및 62A로 구성되는 군으로부터 선택되고, 여기서 35bG는 가장 바람직하게는 중쇄 가변영역의 구조형성영역의 아미노산 치환이다.
또한 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 인간화 항체 또는 이들의 단편의 경쇄 가변영역의 적어도 하나의 구조형성영역 서열은 상응하는 쥐 항체의 경쇄 가변영역의 상응하는 구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 변형은 아미노산 치환 및/또는 아미노산 결실이다. 통상적으로, 6개를 넘지 않은, 바람직하게는 5개를 넘지 않은, 바람직하게는 4개를 넘지 않은, 더욱 바람직하게는 3개를 넘지 않은, 더욱 더 바람직하게는 2개를 넘지 않은, 가장 바람직하게는 1개를 넘지 않은 아미노산 변형은 구조형성영역내에서 수행된다. 일부 실시형태에서 본 개시는 인간화 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 경쇄 가변영역 서열의 구조형성영역의 아미노산 변형은 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56 및 71 및/또는 아미노산 위치 31의 결실로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치의 아미노산 치환을 포함한다 . 더욱 바람직하게는 경쇄 가변영역 서열의 구조형성영역의 아미노산 변형은 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S 및 71Y로 구성되는 군으로부터 선택되는 Y31의 결실 및/또는 치환을 포함하고 여기서 각 군의 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어진다. 가장 바람직하게는 경쇄 가변영역 서열의 구조형성영역의 아미노산 변형은 33M, 34H, 46P, 47W 및 71Y로 구성되는 군으로부터 선택되는 T31의 결실 및/또는 치환을 하고, 반면에 46P, 및/또는 L47W가 특히 바람직하다. 일부 실시형태에서 본 발명의 인간화 항체 또는 이들의 단편은 상기에서 나타낸 바와 같이 중쇄 가변영역 서열의 구조형성영역의 아미노산 변형 및 상기에서 나타낸 바와 같이 경쇄 가변영역 서열의 구조형성영역의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
또한 본 개시는 서열번호: 29, 58, 59, 77, 78, 79 및 80으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 서열번호: 58, 59, 79 및 80으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 더욱 바람직하게는 서열번호: 58 및 59로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 또한 본 개시는 서열번호: 30, 60, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 및 89로 구성되는 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 서열번호: 60, 86, 87 및 89로 구성되는 군으로부터 선택되는, 더욱 바람직하게는 서열번호: 60의 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 29, 58, 59, 77, 78, 79 및 80으로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역과 서열번호: 30, 60, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 및 89로 구성되는 경쇄 가변영역을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열의 각각이 인간 OX40에 결합할 수 있음을 고려할 때, 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 “혼합 및 매칭(mixed and matched)”하여 본 발명의 항-OX40 결합 분자를 만들 수 있다. 상기 “혼합 및 매칭”항체의 OX40 결합을 실시예에서 설명된 결합분석(binding assay)을 사용하여 테스트할 수 있다.
일부 실시형태에서 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 58 및 59로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역과 서열번호: 60 및 89로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 서열번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다. 가장 바람직한 것은 서열번호: 58 및 59로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 및 서열번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편이다.
또한 본 개시는 서열번호: 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 바람직하게는 서열번호: 35, 36, 37 및 38로 구성되는 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 서열번호: 37 및 38로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 또한 본 개시는 서열번호: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 서열번호: 45, 46, 47 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는, 더욱 바람직하게는 서열번호: 47의 경쇄 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열 및 서열번호: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열이 인간 OX40에 결합할 수 있음을 고려할 때, 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을“혼합 및 매칭”하여 본 발명의 항-OX40 결합 분자를 만들 수 있다. 상기 “혼합 및 매칭”항체의 OX40 결합을 실시예에서 설명된 결합분석을 사용하여 테스트할 수 있다.
일부 실시형태에서 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 37 및 38로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 및 서열번호: 47 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열, 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열, 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열, 또는 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 가장 바람직한 것은 서열번호: 37 및 38로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열, 및 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편이다.
본 개시의 일실시형태에서, 길항제 항체 또는 이들의 단편은 쥐 항체, 키메라(chimeric) 항체 또는 인간화 항체, 바람직하게는 인간화 항체, 더욱 바람직하게는 단클론 쥐 항체, 단클론 키메라 항체 또는 단클론 인간화 항체이다.
또한 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 예를 들면, 단일 항원 결합 가지(binding arm)로 구성된 1가(monovalent) 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 또한 본 개시는 Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb , F(ab')2, scFv, 이특이성(bispecific) 단쇄( single chain) Fv 이량체, 디아체(diabodies), 트리아체(triabodies) 및 동일한 또한 다른 항체에 유전적으로 융합된 scFv로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 OX40에 결합하는 항체의 단편을 제공한다. 바람직한 단편은 scFv, 이특이성 단쇄 Fv 이량체, 디아체이다. 또한 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 전장 항체를 제공한다.
또한 본 개시는 중쇄 및/또는 경쇄 불변부위 특히 인간 중쇄 및/또는 인간 경쇄 불변영역을 추가적으로 포함하는 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 인간 중쇄 불변영역은 IgG1(IGHG1), IgG2(IGHG2), IgG3(IGHG3), IgG4(IGHG4), IgA1(IGHA1), IgA2(IGHA2), IgM(IGHM), IgD(IGHD), 또는 IgE(IGHE)로 구성된 인간 면역글로불린의 군으로부터 선택될 수 있고, 반면에 인간 중쇄 불변부위 IgG, 특히 IgG1(IGHG1)이 바람직하다. 인간 경쇄 불변영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 불변영역으로 구성된 인간 면역글로불린의 군으로부터 선택되고, 반면에 인간 카파 불변영역이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 인간 IgG1(IGHG1) 중쇄 불변 도메인 및 인간 경쇄 카파 불변 도메인을 포함한다.
구조형성영역 또는 CDR 영역내에 만들어진 변형에 대한 추가 또는 대안에서, 본발명의 항체는 통상적으로 혈장 반감기(serum half-life), 보체결합(complement fixation), Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존적 세포내 독성과 같은 항체의 하나 또는 그 이상의 기능적 속성을 변형시키는 Fc 영역내의 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형(modified)될 수 있거나(예: 하나 또는 그 이상의 화학적 부위(moieties)는 항체에 부착될 수 있음) 또는 자체의 글라이코실화(glycosylation)를 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 상기 실시형태의 각각은 하기에 추가적으로 상세히 설명된다. 하기에 요약한 바와 같이 Fc 영역내의 변형(modifications)은 Fc 영역에 있는 잔기의 EU 수에 따른다. 일실시형태에서, CH1의 경첩 영역(hinge region)을 경첩 영역의 시스테인(cysteine) 잔기의 수를 변경, 예를 들면, 증가 또는 감소로 변형시킨다. 상기 방법은 보드머외 다수(Bodmer et al.)에 의한 미국특허등록 제 5,677,425호에서 추가적으로 설명되고 있다. CH1의 경첩 영역에 있는 시스테인 잔기의 수는 예를 들면, 경쇄 또는 중쇄의 집합을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소로 변경시킨다. 다른 실시예에서, 항체의 Fc 경첩 영역을 항체의 샐물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이시킨다. 더욱 특정적으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-경첩 단편의 CH2-CH3 도메인 접촉면 영역으로 도입시켜 항체가 고유의 Fc-경첩 도메인 SpA 결합에 비해 포도상 구균(Staphylococcal) 단백질 A(SpA) 결합에 약하다. 상기 접근 방법은 와드외 다수(Ward et al .)에 의한 미국특허등록 제6,165,745호에서 추가적으로 상세히 설명하고 있다. 다른 실시예에서, 항체는 자체의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근방법이 가능하다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 하기의 돌연변이가 도입될 수 있다: 와드에 의한 미국특허등록 제6,277,375호에서 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 프레스타외 다수(Presta et al.)에 의한 미국특허등록 제5,869,046호 및 제6,121,022호에서 설명된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프(loops)로부터 수용된 항원결정기에 결합하는 구조 수용체를 포함하는 CH1 또는 CL 영역내에서 변경될 수 있다. 추가 실시형태에서, 항체의 효과 기능을 변경시키기 위해, Fc 영역은 적어도 하나 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하여 변경된다. 예를 들면, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 상기 항체는 효과 리간드(effector ligand)를 위한 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합능력은 유지한다. 변경된 친화도에 효과 리간드는, 예를 들면, Fc 수용체 또는 보완물의 C1 구성요소일 수 있다. 상기 접근방법은 윈터외 다수(Winter et al .)에 의한 미국특허등록 제5,624,821호 및 제5,648,260호에서 추가적으로 상세히 설명되고 있다. 다른 실시예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 대체되어 항체는 C1q 결합을 변경하고 및/또는 세포독성(CDC)의존적 보완물을 감소하거나 폐지한다. 상기 접근방법은 이두소기에외 다수(Idusogie et al.)에 의한 미국특허등록 제6,194,551호에서 추가적으로 상세히 설명되고 있다. 다른 실시예에서, CH2 도메인의 N-말단 영역의 아미노산 위치 231 내지 238내의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 항체의 능력을 변경시키고 보완물을 고정시킨다. 상기 접근방법은 보드머외 다수(Bodmer et al.)에 의한 PCT 공개 WO94/29351에서 추가적으로 설명되고 있다. 또 다른 실시예에서, 하기의 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변형시켜 Fc 영역이 변경되어 세포독성 의존적 항체를 매개하는 및/또는 Fcγ 수용체를 위한 항체의 친화도를 증가시키는 항체의 능력을 증가시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 상기 접근방법은 프레스타(Presta)에 의한 PCT 공개 WO00/42072에서 추가적으로 설명되고 있다.
또한 본 개시는 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서 인간 중쇄 불변영역은 인간 IgG4(IGHG4)로부터의 CH1 영역, 경첩 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 동형변이체(isotypic variant)를 포함하고 여기서 경첩영역은 위치 228의 세린(serine)을 프롤리(proline)으로의 치환을 포함한다. 바람직하게는 동형변이체를 포함하는 인간화 항체는 전장의 항체이다. 특히 바람직하게는 인간 IgG4(IGHG4)로부터 CH1, S228P 치환을 갖는 인간 IgG4(IGHG4)으로부터 경첩, 및 인간 IgG4(IGHG4)로부터 CH2 및 CH3를 포함하는 동형변이체를 포함하는 인간 OX40에 결합하는 인간화 항체 또는 이들의 단편은 서열번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 상기 동형변이체는 인간 IgG1(IGHG1)로부터 인간 중쇄 불변영역(항상 고유의 인간 IgG1임)을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편과 비교하여, 즉, 변형된 중쇄 불변영역에 관련하여 단지 동형변이체로부터 상이한 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편과 비교하여, ADCC와 같은 Fc-매개된 독성 기전이 없음이 발견되었다.
또한 본 개시는 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공하고, 여기서, 인간 IgG Fc 영역에 부착된 성숙 핵심 탄수화물(mature core carbohydrate)구조는 푸코오스(fucose)(본 명세서에서 대안적으로 비푸코오스화(non-fucosylated))가 부족하다. 바람직하게는 상기 항체는 인간 IgG1(IGHG1) Fc 영역을 포함하고, 여기서 인간 IgG1(IGHG1) Fc 영역에 부착된 성숙 핵심 탄수화물 구조는 푸코오스가 부족하다. 더욱 바람직한 것은 인간 IgG1(IGHG1) Fc 영역을 포함하는 전장 항체이고, 여기서 인간 IgG1(IGHG1) Fc 영역에 부착된 성숙 핵심 탄수화물 구조는 푸코오스가 부족하다. 인간 IgG Fc 영역에 부착된 성숙 핵심 탄수화물 구조에서 푸코오스의 부족은 ADCC를 강화할 수 있다는 것이 ADCC로부터 알려져 있다. 따라서, 추가 실시형태에서 본 개시의 길항제 항체 또는 이들의 단편은 인간 IgG1(IGHG1) Fc 영역을 포함하고, 여기서 인간 IgG1(IGHG1) Fc 영역에 부착된 성숙 핵심 탄수화물 구조는 푸코오스가 부족하고, 반면에 푸코오스가 부족한 항체는 푸코오스가 부족하지 않은 모 인간화 항체 또는 이들의 단편과 비교하여 강화된 ADCC를 나타낸다. 푸코오스가 부족한 항체를 생성하는 방법은, 예를 들면 (a) 감소된 능력(또는 할 수 없는)의 푸코오실화 단백질을 갖는 푸코오스 대사에서 결핍이 있는 조작되거나 돌연변이 숙주세포의 사용; (b) 푸코오실화(fucosylation)를 방지 또는 감소하는 조건하에서 배양하는 세포; (c) 번역후(post-translation) 푸코오스의 제거(예: 푸코시다제(fucosidase)효소와 함께); (d) 번역후 원하는 탄수화물의 첨가, 예: 비당화 당단백질(non-glycosylated glycoprotein)의 재조합 발현; 또는 (e) 푸코실화 되지않은 산물을 선별하기 위해서 당단백질을 정제하는 것이다. 바람직하게 사용된 것은 WO10/095031의 실시예 14, 예를 들면, 롱모어외 다수(Longmore et al., (1982) Carbohydr. Res. 365-92) 또는 이마이외 다수(Imai-Nishiya et al., (2007), BMC Biotechnol. 7: 84)에서 설명된 방법이다.
또한 본 발명에 의해 제공된 것은 인간 OX40에 결합하고 서열번호. 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 서열 및/또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체로서 동일한 항원결정기에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편이다. 또한 본 발명에 의해 제공된 것은 본 발명에 의해 제공된 항체, 특히 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 서열 및/또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체에 의하여 결합된, 특히 인간 OX40 수용체 세포외 도메인으로 된 인간 OX40의 특정 영역 또는 항원결정기이다. 상기 인간 OX40 폴리펩티드의 특정 영역 또는 항원결정기는 본 발명에 의해 제공된 항체의 임의 하나와 결합하여 당업계에 알려진 임의 적합한 항원결정기 맵핑 방법(mapping method)에 의해 식별된다. 상기 방법의 실시예는 상기 항체에 의해 인식되는 항원결정기의 서열을 포함하는 항체에 특정적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 갖는 본 발명의 항체에 결합을 위한 OX40으로부터 유래한 다양한 길이의 펩티드의 스크리닝을 포함한다. OX40 펩티드는 OX40 폴리펩티드의 합성적 또는 단백질 분해 소화(proteolytic digestion)에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩티드는 예를 들면, 질량 분광 분석(mass spectrometric analysis)에 의해 식별될 수 있다. 다른 실시예에서, 핵자기공명분광법(NMR spectroscopy) 또는 엑스-선 결정 분석법(X-ray crystallography)은 본 발명의 항체에 의해 결합된 항원결정기를 식별하는데 사용될 수 있다. 일단 식별되면, 본 발명의 항체와 결합하는 항원결정 단편은, 요구되는 경우에, 면역원(immunogen)으로서 사용되어 동일한 항원결정기와 결합하는 추가 길항제 항체를 얻을 수 있다.
항- OX40 항체 속성
인간 OX40에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한, 예를 들면, ELISAs, 비아코어(BIAcore®), 웨스턴블롯, RIAs, 및 유세포 분석기(flow cytometry analysis)를 포함하는 표준 분석(standard assays)은 당업계에 알려져 있다. 적합한 분석은 실시예에서 상세히 설명되어있다. 항체의 결합역동(binding kinetics)(예: KD와 같은 결합친화도)은 당업계에서 알려진 스캐차드(Scatchard) 또는 비아코어®시스템 분석과 같은 표준분석에 의해 평가될 수 있다. 상대적인 결합친화도 Ki는 당업계에서 알려진 표준 경쟁분석에 의해 평가될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 인간 OX40에 결합하고 재조합 인간화 항체 에팔리주맙(efalizumab)보다 더 높은 정도로 농도의존적 방식으로 인간 혼합 림프구 반응(Mixed Lymphocyte Reaction(MLR))을 차단하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 림프구 기능과 연관된 항원 1의 CD11a 아단위(subunit)에 결합하는 재조합 인간화 항체 에팔리주맙은 실시예 3에 따라서 수행되고 측정될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 인간 OX40에 결합하고 시노몰구스 원숭이(cynomologus monkey) OX40을 인식할 수 있는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 인간 및 시노몰구스 말초혈액 단핵세포(PBMC) 모두에 길항제 항-OX40 항체의 결합은 실시예 4 및 도 3에 따라서 수행되고 측정될 수 있다. 림포구가 활성화된 인간 및 시노몰구스 원숭이의 표면에 발현되는 OX40을 인식하는 항체가 발견되었고 상기 항체가 교차반응 속성(cross-reactive properties)을 가지고 있음을 나타낸다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 예를 들면, 실시예 5 및 6과 도 4에서 상세히 설명된 분석체로서 사용된 재조합 1가 인간 OX40 수용체 세포외 도메인(서열번호: 11)이 있는 단백질-A 결합된 CM5 연구용 센서 칩(research grade sensor chip (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland; BR-1000-14)) 상의 항체를 포착하여 비아코어® 기구(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland) 상의 표면 프라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance(SPR))에 의해 측정되는, 특히 500 nM 이하의 친화도(KD)를 갖는 분리된 형태의 인간 OX40, 바람직하게는 200 nM 이하, 더욱 바람직하게는 150 nM 이하, 더욱 바람직하게는 120 nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 110 nM 이하의 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. OX40 수용체를 사용하여 친화도 측정에 관련하여 본 명세서에서 사용된 1가(monovalent)는 도메인이 면역글로불린 Fc부위에 아미노-말단 융합된 경우인 것과 같은 인공적 이량화 또는 다량화가 아닌, 세포외 도메인과 같은 인간 OX40 수용체 도메인을 의미한다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 상응하는 키메라 항체의 OX40 결합친화도(KD)의 적어도 75%를 유지하는 인간화 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 바람직하게는, 인간화 항체 또는 이들의 단편은 상응하는 키메라 항체에 동등한 친화도(equivalent affinity)를 갖는 인간 OX40에 결합한다. “동등한 친화도”는 상응하는 키메라 항체의 OX40 결합친화도의 ±10% 범위내에 있는 친화도 값을 의미한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 상응하는 키메라 항체보다 더 높은 친화도를 갖는 인간 OX40에 결합하는 인간화 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편은 예를 들면, 실시예 5 및 6과 도 4에서 상세히 설명된 분석체로서 사용된 재조합 1가 인간 OX40 수용체 세포외 도메인(서열번호: 11)이 있는 단백질-A 결합된 CM5 연구용 센서 칩(research grade sensor chip (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland; BR-1000-14))상의 항체를 포착하여 비아코어® 기구(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)상의 표면 프라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance(SPR))에 의해 측정되는, 110 nM 이하의 결합친화도(KD), 바람직하게는 100 nM 이하, 더욱 바람직하게는 90 nM 이하, 더욱 바람직하게는 80 nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 70 nM 이하로 제공된다.
본 발명의 추가적인 측면은 인간 OX40에 결합하고 좋은 열 안정도를 갖는 길항제 항체 또는 단편을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 인간 OX40에 결합하는 길항제 인간화 항체 또는 이들의 단편은 70℃보다 높은, 바람직하게는 75℃보다 높은, 더욱 바람직하게는 80℃보다 높고 더욱 더 바람직하게는 85℃보다 높은 FAB 단편 열안정도 온도를 갖는다. FAB 단편 열안정도 분석을 위해서, 차 주사열량측정(differential scanning calorimetry)이 사용되었고, 반면에 전장 IgG의 조건에서 FAB 단편의 중간 지점 녹는점이 확인되었다. 상기 종루의 열량측정은 당업자에게 알려져 있고, 추가적으로 실시예 6에서 설명되고, 도 6에서 나타낸 바와 같이, 예를 들면, 가버 및 데마레스트(Garber & Demarest (2007), BBRC, 355: 751-7)에 따라서 수행될 수 있다.
추가적인 측면에서 본 발명은 인간 OX40 세포외 영역상의 항원결정기에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 설명한다. 실시예 7에서 설명되고 도 7에서 나타낸 바와 같이, OX40 세포외 영역의 하나 또는 그 이상의 4개 도메인은 인간 및 래트(rat) 서열과 생성된 Fc 융합단백질 사이에서 교환될 수 있다. ELISA 결합은 인간 OX40 세포외 영역, 래트 OX40 세포외 영역 및 4개 인간-래트 키메라 단백질상의 길항제 인간화 항체의 반응성을 테스트하기 위해서 수행되었다. 따라서, 본 발명은 인간 OX40 세포외 영역의 두 번째 도메인내에 맵(map)하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 면역 반응을 억제하는데 사용될 수 있는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 길항제 인간화 항-OX40 항체의 효과를 동종반응성 T 세포 활성화 및 증식의 시험관내 모델로서 사용된 MLR(실시예 8을 참조하시오)에서 테스트하였다(O’Flaherty E et al., (2000) Immunology, 100(3): 289-99; DuPont B & Hansen JA (1976) Adv. Immunol. 23: 107-202). 2개의 관련되지 않은 기증체로부터의 PBMCs를 혼합하여, T 세포 활성 및 T 림포구 증식의 결과를 얻었다. 추가적으로, MLR의 억제에 대한 ADCC와 같은 독성 기전의 기여를 결정하기 위하여, 길항제 인간화 항-OX40 항체의 3개의 다른 형식(formats)을 상기 분석에서 테스트하였다: IgG1(IGHG1)형식, 비 푸코실화 IgG1(IGHG1) 형식 및 IgG4(IGHG4) 형식. 길항제 인간화 항-OX40 항체는 약 100 ng/mL의 EC50 값을 갖는 2개의 다른 개체(대응체(responders))에서 효과적으로 MLR을 억제하였다. 그러나 상기 결과는 사용된 항체의 형식의 의존도에서 차이를 나타냈다. 첫 번째 개체(대응체 1)에서, T 세포 반응성은 IgG1(IGHG1) 및 IgG4(IGHG4) 항체 형식에 의해 효과적으로 억제되고, 결과적으로 독성 기전은 상기 개체에 대해 결정적이 아님을 나타냈다. 두 번째 개체(대응체 2)에서, IgG1(IGHG1) 형식은 60% 이상의 억제를 달성하였고, 반면에 IgG4(IGHG4) 형식은 MLR을 단지 약하게 차단하였다. 모든 개체에서, 비푸코실화된 IgG1(IGHG1) 형식은 MLR 억제에서 매우 효과적이다. 상기 결과는 OX40 활성 차단이 MLR 억제하는데 일부 개체에서는 충분하지만 상기 효과는 추가 독성 기전에 의해 크게 강화될 수 있음을 나타낸다. 따라서, OX40 매개된 장애로부터 고통받는 환자의 치료에 있어서, 장애가 환자의 OX40 공동자극 상태, 예를 들면, 낮은 OX40 발현 수준을 갖는 환자에 비의존적으로 나타나는 경우에, 인간 OX40과 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편의 투여 및 세포독성 기전이 강화된 것이 특히 효과적일 수 있다. 본 발명의 바람지한 실시예는 OX40 매개된 장애로부터 고통받는 화자의 치료를 위한 인간 OX40에 결합하는 길항제 인간화 항체를 제공한다. 추가적으로, 상기 환자는 OX40의 저발현 수준을 가질 수 있다. 바람직하게는, 인간 OX40에 결합하는 길항제 인간화 항체는 IgG1(IGHG1) 영역을 포함한다. 더욱 바람직하게는 인간 OX40에 결합하는 길항제 인간화 항체는 비푸코실화 IgG1 영역을 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 길항제 항체 또는 이들의 단편의 효과는 SCID 쥐가 인간 PBMCs와 재구성된, 이종(xenogeneic) 이식편대숙주반응(graft versus host reaction)에서 나타났다. 상기 반응은 인간 환자에서 골수이식(bone marrow transplant) 후에 관찰되는 동종(allogenic) 이식편대숙주병(graft versus host disease(GVHD))위한 모델을 제공한다. 상기 모델에서, 특히 인간 PBMCs 및 T 림포구는 심각한 염증 증상을 일으키는 쥐 숙주세포에 대하여 강한 반응을 개시한다. 실시예 9에서 설명하고 도 1 및 표 10에서 나타낸 바와 같이, 인간 OX40에 결합하는 길항제 인간화 항체는 1 mg/kg의 양에서 GVHD 반응을 강력하게 억제한다. 놀랍게도, 상기 항체는 엔브렐®(Enbre®), GVHD를 위한 인식된 치료(recognised therapy)보다 더 나은 효험(efficacy)을 나타냈다(Xhaard A et al., (2011) Bull. Cancer, 98(8): 889-99; Simpson D (2001) Expert Opin. Pharmacother. 2(7): 1109-17). 따라서, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 인간 OX40에 결합하고 GVHD의 치료에 효과적인 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 바람직하게는, 개체에게 항체의 투여는 비히클(vehicle)투여와 비교하여 생존 배지(survival medium)(days)에서 4배 향상의 결과를 나타냈다. 더욱 바람직하게는, 개체에게 항체의 투여는 엔브렐®투여와 비교하여 생존 배지(days)에서 2배 향상의 결과를 나타냈다. 따라서, 본 발명은 GVHD를 갖는 및/또는 GVHD를 억제하는 환자를 치료하는데 있어서 엔브렐®보다 더욱 효과적인 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 또한, 항체에 결합하는 길항제 항-OX40은 동종 쥐 GVHD 모델에서 GVHD를 더욱 나쁘게 한다는 것이 알려져 있고(Valzasina B et al., (2005) Blood, 105(7): 2845-51; Blazar BR et al., (2003) Blood, 101(9): 3741-8), 따라서 상기 모델에서 GVHD가 더 이상 나빠지지 않았기 때문에, 본 발명의 길항제 항체 및 이들의 단편은 인간 OX40의 결합상의 효능제 효과를 나타내지 않음을 실시예 9로부터 결론지을 수 있다. 따라서, 본 발명은 결합상에 효능제 효과를 나타내지 않는 인간 OX40에 결합하는 인간화 항체 이들의 단편을 제공한다.
핵산, 벡터 및 숙주세포
또한 본 개시는 인간 OX40에 결합하는 항체 및 이들의 단편을 암호화하는 분리된 핵산, 벡터 및 핵산 또는 벡터를 포함한 숙주세포를 제공한다. 상기 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분 정제 또는 충분한 순수형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에서 잘 알려진 다른 것을 포함하는 표준 기술에 의해, 다른 세포 구성요소 또는 다른 오염물질, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 떨어져 정제될 때 “분리된”또는 “제공된 충분한 순수(rendered substantially pure)”이고, 아우수벨외 다수의 책을 참조하면 된다(F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York). 예를 들면, 본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론(intron)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준분자생물기술(standard molecular biology techniques)을 사용하여 얻을 수 있는데, 예를 들면, 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하거나 VH 및 VL 부분을 암호화하는 cDNAs는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린유전자 라이브러리로부터 얻어진 항체에 대하여(예: 파지 디스플레이 기술(phage display techniques)을 이용하여), 상기 항체를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 핵산은 라이브러리로부터 회수(recovered)될 수 있다. 숙주세포로 외인성 핵산을 도입하는 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 사용되는 숙주세포와 같이 다양할 것이다. 기술은 덱스트란-매개된 형질주입, 칼슘포스페이트 침전, 칼슘클로라이드 처리, 폴리에틸렌이민 매개된 형질주입, 폴리브렌(polybrene) 매개된 형질주입, 원형질체(protoplast) 융합, 전기천공(electroporation), 바이러스 또는 파지 감염, 리포솜(liposomes)에서 폴리뉴클레오티드의 캡슐화(encapsulation), 및 핵으로 DNA의 직접 미세주사(microinjection)을 포함한다. 포유동물 세포의 경우에서, 형질주입은 일시적 또는 안정적일 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 서열 및/또는 서열번호: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 49로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 암호화하는 상기이다. 본 발명의 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 29, 58, 59, 77, 78, 79 및 80으로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 30, 60, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 및 89로 구성되는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 암호화하는 상기이다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 8의 경쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 7의 중쇄 가변영역을 암호화하는 상기, 예를 들면, 서열번호: 9의 핵산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 및/또는 서열번호: 10의 핵산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA이다. 본 발명의 더욱 바람직한 핵산 분자는 서열번호: 58 또는 59의 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호: 60의 경쇄 가변영역을 암호화하는 상기, 예를 들면, 서열번호: 61 또는 62의 핵산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA 및/또는 가장 바람직한, 서열번호: 63의 핵산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA이다.
일단, VH 및 VL 부분을 암호화하는 DNA 단편이 얻어지면, 상기 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들면, 가변영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, 또는 Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자와 같은 상기에서 설명된 단편에 상응하는 단편 유전자로 전환시키는 기술에 의해 추가적으로 조작할 수 있다. 상기 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변영역 또는 유연한 링커(flexible linker)와 같은 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편과 작동적으로 링크된다. 상기 조건에서 사용된 것처럼, 상기 용어 “작동적으로 링크(operatively linked)”는 2개의 DNA 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 프레임내(in-frame)에 남아있는 것과 같이 2개의 DNA 단편이 합쳐지는 의미를 의도한다. VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)를 암호화하는 다른 DNA로 작동적으로 링크하여 전장 중쇄유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변영역 유전자의 서열은 당업계에서 알려져 있고(예를 들면, 케벳외 다수(Kabat EA et al.), 상기를 참조하시오), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변영역은 IgG1(IGHG1), IgG2(IGHG2), IgG3(IGHG3), IgG4(IGHG4), IgA1(IGHA1), IgA2(IGHA2), IgM(IGHM), IgD(IGHD) 또는 IgE(IGHE) 불변영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1(IGHG1) 불변영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대하여, VH-암호화 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변영역을 암호화하는 다른 DNA 분자로 작동적으로 링크될 수 있다. VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변영역, CL로 암호화하는 다른 DNA 분자로 작동적으로 링크하여 전장 경쇄유전자(Fab 경쇄 유전자 뿐만아니라)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변영역 유전자의 서열은 당업계에서 알려져 있고(예를 들면, 케벳외 다수(Kabat EA et al.), 상기를 참조하시오) 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 불변영역, 바람직하게는 카파 불변영역일 수 있다. scFv 유전자를 만들기 위해서, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편을 유연한 링커를 암호화하는, 예를 들면, 아미노산 서열(Gly4 -Ser3)를 암호화하는 다른 단편으로 작동적으로 링크하여, VH 및 VL 서열이 유연한 링커에 의해 결합된 VL 및 VH 영역을 갖는 인접한 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들면, Bird RE et al., (1988) Science, 242: 423-426; Huston JS et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83; McCafferty J et al., (1990) Nature, 348: 552-554를 참조하시오). 다양한 기술이 항체의 항체 단편을 생성을 위해 발달하여 왔다. 통상적으로, 상기 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 경유하여 유래하였다(예를 들면, Morimoto K et al., (1992) J. Biochem. & Biophysical Methods, 24: 107-117 및 Brennan M et al., (1985) Science, 229: 81-3를 참조하시오). 그러나, 상기 단편은 재조합 숙주세포에 의해 직접적으로 현재 생성될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상기에서 언급된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균(E. coli)으로부터 직접적으로 회수될 수 있고 F(ab')2 단편을 형성하기 위해 화학적으로 커플될 수 있다(Carter P et al., (1992) Bio/Technology, 10: 163-167). 다른 접근방법에 따라서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주세포 배양으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 다른 기술은 숙련된 기술자에게 분명하게 될 것이다. 다른 실시형태에서, 선택한 항체는 단일-사슬 Fv 단편(scFv)이고, 예를 들면, WO 1993/16185; 미국특허등록 제 5,571,894호 및 미국특허등록 제5,587,458호를 참조하시오. 항체 단편은, 예를 들면, 미국특허등록 제5,641,870호에서 설명한 바와 같이 또한 “직선 항체(linear antibody)”일 수 있다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산은 단백질을 발현시키기 위해서 벡터로, 바람직하게는 발현벡터로 통합(incorporate)될 수 있다. 다양한 발현벡터는 단백질 발현을 위해서 활용될 수 있다. 발현벡터는 자가-복제 염색체외(self-replicating extra- chromosomal) 벡터 또는 숙주 유전체로 통합하는 벡터를 포함할 수 있다. 발현벡터는 숙주세포 유형과 호환성이 되도록 구성된다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 벡터, 바람직하게 발현벡터는 포유동물 세포, 박테리아, 곤충세포, 효모 및 시험관내 시스템에서 단백질 발현을 가능하게 하는 것을 포함하나 제한적이지 않다. 당업계에서 알려진 바와 같이, 상업적으로 또는 그 이외에, 항체 발현을 위해서 본 발명에서 사용을 발견할 수 있는 다양한 발현벡터를 활용할 수 있다.
통상적으로 발현벡터는 제어(control) 또는 조절서열, 선택마커(selectable markers), 임의 융합 파트너, 및/또는 첨가 요소와 사용가능하게 링크(operably linked)된 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 “사용가능하게 링크”는 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 수 있음을 의미한다. 용어 “조절서열(regulatory sequence)”은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터(promoters), 증강자(enhancers) 및 다른 발현 제어요소(예: 아데닐중합체형성(polyadenylation) 신호)를 포함하도록 의도된다. 상기 조절서열은 예를 들면, 고에델(Goeddel)에서 설명된다(Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). 일반적으로, 상기 발현벡터는 항체를 암호화하는 핵산에 사용가능하게 링크된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함하고, 통상적으로 단백질을 발현하기 위해서 사용된 숙주세포에 적합하다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 위치, 전사 시작 및 정지 서열, 번역 시작 및 정지 서열, 증강자(enhancer) 또는 활성체(activator) 서열을 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 통상적으로 발현벡터는 발현벡터를 포함하는 변형된 숙주세포를 선택하도록 선택유전자(selection gene) 또는 마커를 포함한다. 선택유전자는 당업계에 잘 알려져 있고 사용된 숙주세포와 같이 다양할 것이다. 예를 들면, 통상적으로 선택마커유전자는 벡터가 도입된 숙주세포상에서 G418, 하이그로마이신(hygromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 약물에 저항을 부여한다. 바람직한 선택마커유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase (DHFR))유전자(메토트렉세이트 선별/증폭을 갖는 dhfr- 숙주세포에서 사용하기 위해) 및 네오(neo)유전자(G418 선별을 위해서)을 포함한다.
본 명세서에서 벡터에 있는 DNA를 클로닝 또는 발현하기 위한 적합한 숙주세포는 원핵, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 상기 목적을 위한 적합한 원핵은 그람음성(gram-negative)- 또는 그람양성(gram-positive) 생물, 예를 들면, 고초균(B. subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis)와 같은 바실리( Bacilli), 녹농균(P. aeruginosa)과 같은 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스( Streptomyces) 뿐만 아니라 대장균(Escherichia), 예를 들면, E. coli, 엔테레로박터(Enterobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스( Proteus)와 같은 장내세균(Enterobacteriaceae), 살모넬라(Salmonella), 예를 들면, 살모넬라티피무륨( Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들면, 세라티아마르세센스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella)를 포함하는 유박테리아(eubacteria)를 포함한다. 적합한 E. coli 클로닝 숙주는 E. coli 294(ATCC 31,446), E. coli B, E. coli X1776(ATCC 31,537), 및 E. coli W3110(ATCC 27,325)을 포함한다. 원핵 뿐만 아니라, 실모양 곰팡이(filamentous fungi) 또는 효모와 같은 진핵 미생물(eukaryotic microbes)은 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반 빵의 효모를 저등 진핵숙주 미생물 사이에서 가장 많이 사용한다. 그러나, 다른 속(genera), 종(species) 및 주(strains)의 수는 예를 들어, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharoriyces pombe); 락티스(K. lactis), 프레길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 불가리스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 위케라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 왈스(K. WaItH)(AJCC 56,500), 드로소프마룸(K. drosopmarum)(ATCC 36,906), 터모톨레란스(K. thermotolerans), 또는 K. 마르시아누시아로위아(marxianusyarrowia)(EP402226)을 포함하는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP183070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia)(EP244234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 슈와니오마이세스(Schwanniomyces); 및 붉은빵 곰팡이(Neurospora ), 페니실리움( Penicillium), 톨리포클라디움 ( Tolypocladium) 또는 니둘란스(A. nidulans) 또는 아스퍼질러스 나이거(A. niger)와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주를 포함하는 실모양 곰팡이(filamentous fungi)가 일반적으로 활용되고 유용하다.
본 발명의 항체의 발현을 위한 적합한 숙주세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추 동물 세포의 실시예는 플라릴(plaril) 및 곤충세포를 포함한다. 다수의 배큐로바이러스(baculoviral) 균주 및 변이체 및 나비목해충(Spodoptera frugiperda)(모충(caterpillar)), 숲모기(Aedes aegypti) (모기(mosquito)), 흰줄숲모기(Aedes albopictus)(모기), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)(초파리(fruitfly)) 및 누에나방(Bombyx mori)과 같은 숙주로부터 상응하는 허가된 곤충 숙주세포가 발견되었다. 형질주입을 위한 다수의 바이러스 균주가 공개적으로 활용되는데, 예를 들면, 오토그라파 캘리포르니카(Autographa californica) NVP의 L-1 변이체 및 누에나방(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주 및 상기 바이러스가 특히 나비목해충 세포의 형질주입을 위해 사용될 수 있다. 또한 목화, 옥수수, 감자, 콩, 피튜니아(petunia), 토마토 및 담배의 식물세포가 숙주로서 활용될 수 있다.
본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 숙주세포는 바람직하게는 중국햄스터 난소세포(Chinese Hamster Ovary (CHO cells)) (dhfr- CHO 세포를 포함하여, Urlaub G & Chasin LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77: 4216-4220에서 설명됨, 예를 들면, Kaufman RJ & Sharp PA (1982) J. Mol. Biol, 159: 601-621에서 설명한 것처럼 DHFR 선별마커와 같이 사용됨), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함하는 포유동물 세포이다. 특히 NSO 골수종 세포를 위하여, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462(윌슨(Wilson)에게), WO 89/01036(베빙톤(Bebbington)에게) 및 EP338841(베빙톤에게)에서 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 재조합 항체 유전자를 포유동물 숙주세포에 도입시킬 때, 항체를 숙주세포에서 항체의 발현이 되도록, 또는 더욱 바람직하게는 숙주세포가 자라는 배양으로 항체의 분비가 되도록 충분한 시간 동안 숙주세포를 배양하여 생성시킨다. 인간 OX40에 결합하는 항체를 생성시키기 위한 유용한 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland), 최소기본배지(Minimal Essential Medium (MEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH)), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Basel, Switzerland), 및 둘베코스 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH))와 같은 상업적으로 활용가능한 배지가 숙주세포 배양을 위해 적합하다. 항체는 표준 단백질 정제방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
항체는 발현되는 단백질, 정제, 스크리닝, 디스플레이 등의 표적이 가능하도록 융합 파트너와 사용가능하게 링크될 수 있다. 융합 파트너는 링커서열을 경유하여 항체서열로 링크될 수 있다. 긴 링커가 사용될 수도 있지만, 링커서열은 일반적으로 소수의 아미노산, 통상적으로 10 미만을 포함한다. 통상적으로 링커서열은 유연하고 분해로부터 저항되도록 선택된다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 임의 넓은 다양한 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 일반적 링커서열은 아미노산 서열 GGGGS를 포함한다. 융합 파트너는 항체 및 원하는 세포 위치 또는 여분의 세포 배지에 임의 연결된 융합 파트너에 직접적인 표적 또는 신호서열일 수 있다. 당업계에서 알려진 바와 같이, 확실한 신호서열은 성장배지로 또는 세포막 내부와 외부 사이에 위치하는 세포질 공간(periplasmic space)으로 분비되는 단백질을 표적할 수 있다. 또한 융합 파트너는 전제 및/또는 스크리닝을 가능하게 하는 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 서열일 수 있다. 상기 융합 파트너는 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tags(His-tags)) (예를 들면, 고정화 금속 친화 크로마토그래피(Immobilized Metal Affinity Chromatography(IMAC))시스템(예: Ni+2 친화 컬럼(affinity columns))으로 사용을 위한 H6 및 H10 또는 다른 태그), GST 융합, MBP 융합, 스트랩-태그(Strep-tag), 박테리아 효소 BirA의 BSP 바이오틴화된 표적서열, 및 항체에 의해 표적되는 항원결정기 태그(예를 들면, c-myc 태그, 플래그-태그 등)을 포함하나 제한적은 아니다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 상기 태그는 정제를 위해서, 스크리닝을 위해서 또는 모두에게 유용할 수 있다.
항체의 제조 및 생성
OX40 폴리펩티드에 대하여 생성된 항체는 동물의 접종, 예를 들면, 잘 알려진 일상적 절차에 의해 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비인간 동물에 투여하여
얻을 수 있는데, 실험면역학의 실험안내서(Handbook of Experimental Immunology Weir DM (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)를 참조할 수 있다. 토끼, 쥐, 래트,양, 소, 낙타 또는 돼지와 같은 많은 온혈동물이 접종될 수 있다. 그러나 주, 토끼, 돼지 및 래트, 특히 쥐가 일반적으로 가장 적합하다. 항체는 당업자에게 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 추가적으로 항체는 자연적으로 발생한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 인간화 항체는 비인간 동물(예: 쥐)로부터 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 CDRs 또는 이들의 부분을 인간 VH 및/또는 VL 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 구조형성영역으로 전달하여 생성될 수 있다. 선택적으로, 항체의 면역원성(immunogenicity) 감소 및/또는 결합친화도를 유지하기 위해 필요하거나 원할 때, VH 및/또는 VL 영역에 존재하는 인간 구조형성 잔기는 상응하는 비인간(예: 쥐) 잔기를 대체하여 생성될 수 있다. 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기에서 설명한 바와 같이 비인간 단클론 항체의 서열상에 기반하여 제조될 수 있다. DNA 암호화 중쇄 및 경쇄 면역글로불린은 관심대상의 비인간 하이브리도마로부터 얻을 수 있고 표준분자생물 기술(standard molecular biology techniques)을 사용하여 비-쥐(non-murine) (예: 인간) 면역글로불린 서열을 포함하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 만들기 위해, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 쥐 가변영역을 인간 불변영역과 링크할 수 있다(예: 미국특허등록 제4,816,567호, 카빌리외 다수(Cabilly et al .)를 참조하시오). 인간화 항체를 만들기 위해, 쥐 CDR 영역을 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 구조형성으로 삽입시킬 수 있다(예: 미국특허등록 제5,225,539호, 윈터(Winter), 및 미국특허등록 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호, 퀸외 다수(Queen et al .)를 참조하시오).
본 발명의 인간화 항체는 중쇄 가변영역을 위한 인간 수용분자가 쥐 항체의 잠재적 수용 분자 가변영역과 중쇄 가변영역 사이에 상동 고려에 기반하여 선택된다. 생식세포 후보 인간 수용 분자는 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 바람직하다. 생식세포 데이타베이스는 중쇄 FW3 영역의 말단을 통하여 부분적으로 CDR3 서열로 읽는 항체 서열로 만들어져 있다. FW4 영역의 선택을 위해서, 선택된 생식세포 분자로부터 유래한 성숙 항체 서열의 데이타베이스를 조사할 수 있거나 또는 인간 기증으로부터 선택된 데이타베이스 분자로부터 유래하는 항체 서열을 사용할 수 있다. 인간 수용 분자는 바람직하게는 쥐 기증 분자로서 쥐 기증 분자의 가변영역의 동일한 정규구조 클래스의 동일한 중쇄 클래스(class)로부터 선택된다. 중쇄 가변영역을 위한 인간 수용 분자의 선별을 위한 두 번째 고려는 쥐 기증 분자와 인간 수용 분자 사이에 CDR 길이에 있는 상동을 피하는 것이다. 비록 케벳과 같은 다른 데이타베이스와 공동 NCBI 데이타베이스가 또한 사용될 수 있지만, 인간 수용 항체 분자는 바람직하게는 V-BASE 데이타베이스에 상동 조사에 의해 선택된다.
본 발명의 인간화 항체는 경쇄 가변영역을 위한 인간 수용분자가 쥐 항체의 잠재적 수용 분자 가변영역과 경쇄 가변영역 사이에 상동 고려에 기반하여 선택된다. 생식세포 후보 인간 수용 분자는 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 바람직하다. 생식세포 데이타베이스는 중쇄 FW3 영역의 말단을 통하고 부분적으로 CDR3 서열로 읽는 항체 서열로 만들어져 있다. FW4 영역의 선별을 위해서, 선택된 생식세포 분자로부터 유래한 성숙 항체 서열의 데이타베이스를 조사할 수 있거나 또는 인간 기증으로부터 선택된 데이타베이스 분자로부터 유래하는 항체 서열을 사용할 수 있다. 인간 수용 분자는 바람직하게는 쥐 기증 분자로서 쥐 기증 분자의 가변영역의 동일한 정규구조 클래스의 동일한 경쇄 클래스로부터 선택된다. 경쇄 가변영역을 위한 인간 수용 분자의 선택을 위한 두 번째 고려는 쥐 기증 분자와 인간 수용 분자 사이에 CDR 길이에 있는 상동을 포함하는 것이다. 인간 수용 항체 분자는 바람직하게는 V-BASE 데이타베이스에 상동 조사에 의해 선택되고, 케벳과 같은 다른 데이타베이스와 공동 NCBI 데이타베이스가 또한 사용될 수 있다. 비인간 항체를 인간화하는 방법은 하기의 실시예 6을 포함하여 본 명세서에서 설명되어 있다.
본 발명은 핵산이 발현되고 항체가 생성하도록 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주세포 배양을 포함하거나 또는 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 생성하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 항체는 분리된다. 숙주세포, 핵산 및 벡터를 위하여, 상기에서 설명된 것이 사용될 수 있다. 핵산의 발현은 예를 들면, 당업계에서 잘 알려지고 상기에서 추가적으로 개요된 바와 같이 재조합 DNA 기술의 조합 및 유전자형질주입 방법(예: 모리슨(Morrison S (1985) Science 229: 1202))에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이들의 항체 단편을 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄의 부분 또는 전장을 암호화하는 DNAs를 표준 분자생물 기술(예: 관심대상의 항체를 발현하는 하이브리도마를 이용하여 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻을 수 있고 DNAs를 발현벡터와 같은 벡터에 삽입시킬 수 있다. 발현벡터 및 발현 제어서열은 사용되는 발현 숙주세포와 호환이 되도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 각각의 벡터로 삽입될 수 있거나, 또는 더욱 통상적으로, 두 개의 유전자 모두 동일한 발현벡터로 삽입된다. 항체 유전자는 표준방법에 의해 발현벡터로 삽입된다(예: 항체유전자단편 및 벡터상의 상보적 제한부위(complementary restriction sites) 연결(ligation), 또는 제한부위가 존재하지 않는 경우에 둔단연결(blunt end ligation)). 본 명세서에서 설명된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역을 임의 항체 동형의 전장 항체 유전자를 만들기 위해서, VH 부분이 벡터내의 CH1 부분으로 작동적으로 링크되고 VK 부분이 벡터내의 CK 부분으로 작동적으로 링크되는 것과 같이 상기를 이미 원하는 동형의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역을 암호화하는 발현벡터로 삽입시켜 사용할 수 있다.
항- OX40 항체의 특성 및 정제
항체를 위한 스크리닝을 인간 OX40에 결합을 측정하기 위한 분석 및/또는 자체의 리간드, OX40L에 OX40의 결합을 차단하는 능력을 측정하기 위한 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 결합분석의 실시예는 특히, 인간 OX40 및 인간 Fc의 융합단백질을 사용하고, 융합단백질에 결합된 항-OX40 항체를 검출하기 위해서 접합된(conjugated) 2차 항체를 사용한 플레이트상에 고정된 ELISA이다. 차단분석(blocking assay)의 실시예는 인간 CD4 세포상에서 OX40에 결합하는 OX40 리간드 융합단백질의 차단을 측정하는 유세포(flow cytometry)에 기반하는 분석이다. 형광으로 표시된 2차 항체를 세포에 결합하는 OX40 리간드 융합단백질의 양을 검출하기 위해 사용하였다. 상기 분석은 상층액에 있는 항체가 OX40에 리간드 융합단백질의 결합을 차단함으로써 신호에서 감소를 기대한다. 차단분석의 추가 실시예는 플레이트에 코팅된 OX40 리간드 융합단백질에 의해 매개된 고유 인간 T 세포의 공동자극의 차단이 티미딘 혼합(thymidine incorporation)을 측정하여 측정되는 분석이다. 항-OX40 항체의 기능적 활성, 예를 들면, T 세포 활성의 감소를 평가하기 위한 분석으로서, 실시예 3 및 8에서 설명된 인간 혼합 림포구 반응이 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 분리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제방법은 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화도, 가호 또는 겔 여과(sizing or gel filtration) 및 역상(reversed-phase)를 포함하여 대기압 또는 FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 사용하는 고압에서 수행되는 크로마토그래픽 기술을 포함한다. 정제방법은 또한 전기영동, 면역(immunological), 침전, 투석, 및 크로마토포커싱(chromatofocusing) 기술을 포함한다. 단백질 농도와 함께 초미세여과 및 여과작용 기술은 또한 유용하다. OX40 항체를 정제하기 위해, 선별된 숙주세포는 단클론 항체 정제를 위한 교반-플라스크에서 자라게 할 수 있다. 상층액은 단백질 A-세파로오스(Pharmacia, Piscataway, NJ)가 있는 친화 크로마토그래피 전에 여과되고 농축될 수 있다. 순도를 확실하게 하기 위해서 용리된 항체를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 점검할 수 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 항체는 분리 및/또는 정제된 인간 OX40에 결합하는 항체이다.
면역접합체( Immunoconjugates )
다른 측면에서, 본 발명은 세포독성, 약물(예: 면역억제제) 또는 방사선독소와 같은 치료제와 링크되어 있는 인간 OX40에 결합하는 길항제 OX40 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 상기 접합체는 본 명세서에서 “면역접합체”로 언급한다. 하나 또는 그 이상의 세포독성을 포함하는 면역접합체는 “면역독소”로 언급한다. 세포독성 또는 세포독성제는 세포에 유해한(예: 사멸) 임의 제제를 포함한다. 실시예는 탁솔(taxol), 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 에티디움 브로마이드, 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 콜키신(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이의 유사체 및 동종을 포함한다. 예를 들면, 치료제는 항대사물질(antimetabolites) (예: 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머갑토퓨린(6-mercaptopurine), 티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로유라실데카르바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(alkylating agents)(예: 메클로르에타민 (mechlorethamine), 티오에파클로람뷰실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine (BSNU)) 및 로무스틴(lomustine (CCNU)), 사이클로포스파미드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모마니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C), 및 시스-디클로로디아민플래티늄(II) (DDP)시스플라틴(cis-dichlorodiamine platinum (II) (DDP) cisplatin)), 안트라사이클린(anthracyclines) (예: 다우노루비신(daunorubicin) (이전에 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제(예: 닥티노마이신(dactinomycin) (이전에 악티노마이신), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 및 안트라미이신(anthramycin (AMC))), 및 항유사분열제(anti-mitotic agents)(예: 빈크리스틴 (vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))을 포함한다. 본 발명의 항체와 링크될 수 있는 치료 세포독성의 다른 실시예는 듀오카르마이신(duocarmycins), 칼리케아미신(calicheamicins), 메이탄시네스(maytansines) 및 아우리스타틴스(auristatins), 및 이의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 접합체의 실시예는 상업적으로 이용가능하다(마일로타그(Mylotarg(R)); American Home Products). 세포독성은 당업계에서 이용가능한 링커기술을 사용하여 본 발명의 항체와 링크될 수 있다. 항체에 세포독성을 접합시켜 사용된 링커 유형의 실시예는 하이드라존(hydrazones), 티오에테르(thioethers), 에스테르(esters), 디설피드(disulfides) 및 펩티드-포함 링커를 포함하지만 제한적은 아니다. 링커는 예를 들면, 리소좀 구획내의 낮은 pH에 의한 절단에 민감하거나 또는 카텝신(cathepsins)(예: 카텝신 B,C,D)과 같은 종양조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제에 의한 절단에 민감하게 선택될 수 있다. 세포독성 유형의 추가 논의에서, 항체에 치료제를 접합시키기 위한 링커 및 방법은 사이토외 다수(Saito G et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215); 트레일외 다수(Trail PA et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337); 페인(Payne G (2003) Cancer Cell, 3: 207-212); 알렌(Allen TM (2002) Nat. Rev. Cancer, 2: 750-763); 파스탄외 다수(Pastan I & Kreitman RJ (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs, 3: 1089-1091); 센터외 다수(Senter PD & Springer CJ, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264)를 참조하면 된다. 또한, 본 발명의 항체는, 방사능면역접합체라고도 언급되는 세포독성 방사능제약을 생산하기 위해서 방사능 동위원소와 링크될 수 있다. 진단적 또는 치료적 사용을 위해 항체에 접합될 수 있는 방사능 동위원소의 실시예는 요요드131 (iodine131), 인듐111(indium111), 이트륨90(yttrium90) 및 루테튬177(lutetium177)을 포함하지만 제한적은 아니다. 방사능면역접합체 제조를 위한 방법은 당업계에서 정착되었다. 방사능면역접합체의 실시예는 제발린®(Zevalin®)(EDEC Pharmaceuticals) 및 벡사르®(Bexxar®)(Corixa Pharmaceuticals)을 포함하여 상업적으로 이용가능하고 유사한 방법은 본 발명의 항체를 사용하여 방사능면역접합체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 면역접합체는 주어진 생물적 반응을 변형시키는데 사용될 수 있고, 약물 부분은 기존의 화학적 치료제로서 제한적으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질은 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 녹농균 외독소(pseudomonas exotoxin), 또는 디프테리아 독소(diphtheria toxin)와 같은 효소적으로 활성 독소, 또는 활성적 이들의 단편; 종양괴사인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질 또는 림포카인(lymphokines), 인터루킨-1(interleukin-1 (“IL-1")), 인터루킨-2(interleukin-2 (“IL-2")), 인터루킨-6(interleukin-6 (“IL-6")), 과립구 대식세포 집락 촉진인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor (“GM-CSF")), 과립구 집락 촉진인자(granulocyte colony stimulating factor (“G-CSF")), 또는 다른 성장인자와 같은 생물학적 반응 변경자를 포함할 수 있다.
항체에 상기 치료제를 링크하는 기술은 잘 알려져 있고, 아논외 다수(Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, 레이스펠드외 다수(Reisfeld et al., (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)); 헬스트롬외 다수(Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.)), 로빈슨외 다수(Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)); 토르페(Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications), 핀체라외 다수(Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985)); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled 항체 In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, 발드윈외 다수(Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 토로페외 다수(Thorpe PE & Ross WC (1982) Immunol. Rev. 62: 119-58)를 참조하면 된다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포독성, 약물(예: 면역억제제) 또는 방사선독소와 같은 치료제와 함께 투여되는 인간 OX40에 결합하는 길항제 OX40 항체 또는 이들의 단편을 제공한다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 길항제 항체 또는 이들의 단편과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 항체, 및/또는 본 발명의 면역접합체 및/또는 상기에서 설명된 세포독성, 약물(예: 면역억제제) 또는 방사선독소와 같은 치료제의 하나 또는 조합(예: 2개 또는 그 이상 다른)을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 표적항원상에 또는 보완적 활성을 갖는 다른 항원결정기에 결합하는 항체(또는 면역접합체)의 조합을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 조합치료(combination therapy), 즉,다른 치료제와 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 조합치료는 적어도 하나의 다른 항-염증제 또는 면역억제제와 함께 조합된 본 발명의 길항제 OX40 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용한 바와 같이, “약학적으로 허용가능한 담체”는 생리적으로 호환되는 임의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아제 및 항곰팡이제, 등장(isotonic)제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥내투여(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 비경구(parenteral), 척수(spinal) 또는 표피(epidermal) 투여(예: 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여경로에 따라서, 활성화합물, 즉, 항체 또는 면역접합체는 화합물이 비활성화될 수 있는 산의 작용과 다른 고유의 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질로 코팅될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 주사용액 또는 분산액의 임시제조를 위한 멸균된 수용액 또는 멸균 분말을 포함한다. 상기 배지의 사용 및 약학적으로 활성물질의 제제는 당업계에서 알려져 있다. 종래의 배지 또는 제제의 범위내에서 활성화합물과의 모순을 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물에서 이들의 사용은 심사숙고된다. 보충 활성화합물은 또한 조성물로 혼합될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료제 및 약학적으로 허용가능한 담체에 링크된 인간 OX40에 결합하는 길항제 항체 또는 이들의 단편을 포함하는 면역접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 사용될 수 있는 면역접합체 및 치료제는 상기에서 설명되었다.
다른 측면에서, 본 발명은 추가적으로 다른 약학적 활성제를 포함하는 본 발명의 길항제 항체 또는 이들의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는 다른 약학적 활성제는 하나 또는 그 이상의: a)인간 OX40에 다른 길항제, b)진통제 및 c)면역억제제, 예를 들면, 프레드니손(prednisone)과 같은 글루코코르티코이드이다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 실시예는 (1) 아스코르빈산, 시스테인하이드로클로라이드, 소듐비설페이트, 소듐메타비설피트, 소듐설피트 등과 같은 물 용해 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸화된 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole (BHA)), 부틸화된 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene (BHT)), 레시틴(lecithin), 프로필갈레이트(propyl gallate), 알파-토코페롤(alpha-tocopherol) 등과 같은 오일-용해 항산화제; (3) 시트르산(citric acid), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic-acid (EDTA)), 소르비톨(sorbitol), 타르타르산(tartaric acid), 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수용성 및 비수용성 담체의 실시예는 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 채소오일, 및 에틸오레이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 적당한 유동성은 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산의 경우에서 요구되는 입자크기의 유지에에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 상기 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보강제를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기의 멸균절차에 의해, 및 다양한 항박테리아 및 항곰팡이제 함유물, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올 등에 의해 보장될 수 있다. 설탕, 소금 등과 같은 등장제(isotonic agent)를 조성물로 포함하는 것은 바람직하다. 추가적으로 주사용 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연하는 제제의 함유물에 의해 초래될 수 있다.
치료 및 다른 용도
본 발명의 길항제 항체는 OX40 매개된 장애의 진단 및 치료를 포함하는 많은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 진단적 및 치료적 유용성을 갖는다. 예를 들면, 상기 분자는 배양하는 세포, 시험관내 또는 생체외(ex vivo), 또는 인간개체, 예를 들면, 생체내, 치료, 예방 및 다양한 OX40-매개된 장애의 진단에 투여될 수 있다. 바람직한 개체는 인간이고 OX40 활성(OX40 매개된 장애)에 의해 매개된 장애를 갖는 환자를 포함한다. 본 발명의 길항제 항체는 자체의 OX40 공동자극 상태의 비의존적으로 환자를 치료하는데 효과적일 수 있다. 더욱 바람직한 개체는 인간이고 OX40의 저발현 수준을 가지는 환자를 포함한다.
본 발명의 목적을 위한 “목적”은 인간 및 다른 동물 모두, 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 따라서 본 발명의 항체는 인간 치료 및 수의학 적용 모두를 갖는다. 본 발명에서 용어 “치료(treatment)” 또는 “처리(treating)”는 예방뿐만 아니라 치료(therapeutic treatment), 또는 질환 또는 장애를 위한 억제측정을 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 질환이 오기전에 항체의 성공적인 투여는 질환의 치료결과를 가져온다. 다른 실시예로서, 질환 증상과 싸우기 위해 질환의 임상소견 후에 성공적인 항체의 투여는 질환의 치료를 포함한다. “치료” 또는 “처리”는 질환을 근절하기 위하여 질환이 나타난 후에 항체의 투여를 포함한다. 가능한 임상증상의 감퇴 및 질환의 향상과 함께 발달한 시작 후 및 임상증상 후에 항체의 성공적인 투여는 질환의 치료를 포함한다. “치료의 필요성”은 질환 또는 장애가 예방되는 포유동물을 포함하여, 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 포유동물뿐만 아니라, 이미 질환 또는 장애가 있는 포유동물을 포함한다.
특정 실시형태에서, 길항제 항체는 다양한 OX40-매개된 장애를 치료, 방지 또는 진단하기 위해서 생체내에서 사용된다. 따라서, 본 발명은 개체에서 OX40 매개된 장애를 치료하는 방법, 즉, 길항제 항체 또는 이들의 단편의 치료적으로 효과적인 양을 개체에게 투여를 포함하는 방법을 제공한다. 길항제 항체 또는 이들의 단편의 실시예는 감염(바이러스에 의한, 박테리아에 의한, 균류에 의한 및 기생충에 의한), 감염과 연관된 내독소성 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, 만성폐쇄폐질환(chronic obstructive pulmonary disease (COPD)), 골반염증질환(pelvic inflammatory disease), 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 염증성장질환(inflammatory bowel disease), 크론병(Crohn's disease), 궤양성대장염(ulcerative colitis), 페로니병(Peyronie's Disease), 코이헥 질환(coeliac disease), 담낭 질환(gallbladder disease), 모소 질환(Pilonidal disease), 복막염(peritonitis), 건선(psoriasis), 혈관염(vasculitis), 수술 유착(surgical adhesions), 뇌졸중(stroke), 제1형 당뇨병(Type I Diabetes), 라임병(lyme disease), 관절염(arthritis), 수막뇌염(meningoencephalitis), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 루푸스(lupus) (전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus)과 같은) 및 길랑-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome)과 같은 중추 및 말초신경계의 면역이 매개된 염증성 장애, 아토피성 피부염(Atopic dermatitis), 자가면역성 감염(autoimmune hepatitis), 섬유성 폐렴(fibrosing alveolitis), 기능항진증(Grave's disease), IgA 신장변(IgA nephropathy), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 메니에르병(Meniere's disease), 천포창(pemphigus), 원발담즙성간경변(primary biliary cirrhosis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis, pancreatitis), 외상(trauma (수술)), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease (GVHD)), 이식거부(transplant rejection), 죽상동맥경화증(atherosclerosis)뿐만 아니라 심근경색증(myocardial infarction)과 같은 허혈성 질환(ischaemic diseases)을 포함하는 심혈계 질환(cardiovascular disease), 혈관내 응고(intravascular coagulation), 골흡수(bone resorption), 골다공증(teoporosis), 골관절염(osteoarthritis), 치주염(periodontitis), 저염산증(hypochlorhydia) 및 시신경척수염(neuromyelitis optica)을 포함한다.
OX40 매개된 장애의 다른 실시예는 감염(infections)(바이러스에 의한, 박테리아에 의한, 균류에 의한 및 기생충에 의한), 감염과 연관이 있는 내독소성 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, 기관지염(bronchitis), 인플루엔자(influenza), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 폐렴(pneumonia), COPD, 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 잠재 섬유성 폐포염(cryptogenic fibrosing alveolitis, CFA), 특발성 섬유성 간질성 폐렴(idiopathic fibrosing interstitial pneumonia), 폐기종(emphysema), 골반 염증성 질환, 알츠하이머 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병, 코이헥 질환, 담낭 질환, 모소 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, 제 1형 당뇨병, 라임병, 관절염, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 루푸스(전신홍반성낭창과 같은) 및 길랑-바레 증후군과 같은 중추 및 말초 신경계의 면역 매개된 염증성 장애, 아토피성 피부염, 자가면역성 감염, 섬유성 폐렴, 기능항진증, IgA 신장병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 메니에르병, 천포창, 원발담즙성간경변, 유육종증, 경피증, 베게너육아종증, 췌장염, 트라우마(수술), 이식편대숙주병(GVHD), 이식거부, 죽상동맥경화증뿐만 아니라 심근경색증과 같은 허혈성 질환을 포함하는 심혈관계 질환, 혈관내 응고, 골흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 저염산증 및 시신경척수염을 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 항체로 치료되는 OX40 매개된 장애는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 대장염, 건선, 천식, COPD, IPF, 이식편대숙주병(GVHD), 죽상동맥경화증 및 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특히 바람직하게, 본 발명의 항체로 치료되는 OX40 매개된 장애는 이식편대숙주병(GVHD)이다.
본 발명은 또한 통증, 특히 염증과 연관된 통증의 치료에서 사용을 위한 항체를 제공한다.
일실시형태에서, 본 발명의 항체는 특정 질환 증상과 링크될 수 있는 OX40의 수준 또는 자체의 멤브린 표면상의 OX40을 포함하는 세포 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 OX40 기능을 억제 또는 차단하기 위해 사용될 수 있고, 차례로 특정 질환 증상의 방지 또는 향상하기 위해 링크될 수 있으므로, 질환의 매개체로서 OX40이 관련되었음을 나타낸다. 상기는 항체와 OX40 사이에서 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에서 OX40 항체를 갖는 시료 및 대조군 시료를 접촉하여 얻을 수 있다. 항체와 OX40 사이에서 형성된 임의 복합체는 시료및 대조군에서 검출되고 비교된다. OX40을 위한 본 발명의 항체의 특정 결합의 관점에서, 본 발명의 항체는 세포의 표면상에 OX40 발현을 특정적으로 검출하기 위해, 예를 들면, OX40의 저발현 수준을 가지는 환자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 면역친화 정제를 경유하여 OX40을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 OX40의 저발현 수준을 가지는 환자를 검출하기 위한 시험관내 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 환자의 혈액 시료로부터 말초혈액단핵세포(PBMCs)를 정제;
(b) 개체ing the PBMCs를 유세포 분석을 받게함; 및
(c) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에서 OX40 양성세포의 수를 결정하고 대조군 수준과 상기 수를 비교.
바람직한 실시형태에서, OX40의 저발현 수준은 대조군 수준과 비교하였을 때 10%까지, 더욱 바람직하게는 20%까지, 더욱 더 바람직하게는 30%까지, OX40 양성세포의 발현 수준에서 증가를 나타낸다. OX40 발현을 결정하는 접근 방법은 추가적으로 코타니외 다수(Kotani A et al ., (2001) Blood, 98: 3162-4 and Xiaoyan Z et al ., (2005) Clin. Exp. Immunol. 143: 110-6)에서 상세히 설명되어 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 항체는 시험관내 치료적 또는 임상적 사용과 연관되어 있는 결합 활성을 위해 초기에 테스트 될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 유세포 분석을 사용하여 테스트될 수 있다.
본 개시는 의약으로서 길항제 항체 또는 이들의 단편의 사용과 OX40 매개된 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서 길항제 항체 또는 이들의 단편의 사용을 추가적으로 제공한다. 본 개시의 추가 실시형태에서, 의약으로서 사용을 위한 길항제 항체 또는 이들의 단편을 제공한다. 또한 본 개시에 의해 제공되는 것은 OX40 매개된 장애를 치료하기 위한 방법에서 사용을 위한 길항제 항체 또는 이들의 단편이다. OX40 매개된 장애는 상기에서 설명된 것이다. 본 발명의 길항제 항체는 환자의 OX40 공동자극 상태의 비의존적인 OX40 매개된 장애를 치료하는데 특히 유용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 길항제 항체 또는 이들의 단편은 환자가 OX40의 저발현 수준을 나타내는 OX40 매개된 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
이전에 설명된 바와 같이, 본 발명의 길항제 OX40 항체는 하나 또는 그 이상의 치료제, 예를 들면, 세포독성제, 방사선독성 또는 면역억제제로 공투여될 수 있다. 상기 항체는 제제(상기에 언급된 바와 같이 면역억제제로서) 또는 제제로부터 개별적으로 투여될 수 있다. 상기 후자의 경우에서(개별적 투여), 상기 항체는 제제와 함께 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있거나 또는 다른 알려진 치료(therapy), 예를 들면, 항암치료, 방사선과 함께 공투여될 수 있다.
상기 항체의 투여를 위해서, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 더욱 항상 0.01 내지 10 mg/kg범위이다. 치료 체제의 실시예는 1주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회, 4주당 1회, 1개월당 1회, 매 3개월당 1회 또는 매 3 내지 6개월당 1회 투여를 필요로 한다. 항체는 다수의 경우에서 항상 투여될 수 있다. 예를 들면, 단일 투여 사이에서 간격은 매주, 매달, 매 3개월 또는 매년일 수 있다. 간격은 환자의 표적 항원에 항체의 혈액 수준을 측정하여 비정기적으로 또한 나타낼 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 ㎕/㎖의 혈장 항체 농도, 일부 방법에서는 약 25-300 ㎕/㎖를 얻기 위해서 조정된다. 대안적으로 상기 항체는, 덜 빈번한 투여가 요구되는 경우에서 지연되는 방출 제제로서 투여될 수 있다. 투여량과 빈번도는 환자에게서 항체의 반감기에 따라 다양하다. 투여의 투여량과 빈번도는 치료(treatment)가 예방이거나 또는 치료(therapeutic)인가에 따라 다양할 수 있다. 예방의 적용에서, 상대적으로 낮은 투여량이 장기간동안 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 자신의 일생의 나머지 동안 치료받는 것을 계속한다. 치료(therapeutic)의 적용에서 질환의 진행이 감소하거나 제거될 때까지 상대적으로 단기간동안 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다.
유효성분, 즉 본 발명의 약학적 조성물에서 항체의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식을 위한 원하는 치료 반응을 얻기 위한 효과적인 유효성분의 양을 얻기 위해서 다양할 수 있다. 선별된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되고자 하는 특정 항체의 분비 속도, 치료기간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 화합물 및 물질, 연령, 성별, 체중, 상태, 치료되는 하는 환자의 일반적 건강 및 이전의 의학적 치료의 개인력, 의료업계에 잘 알려진 요인을 포함하는 약동학 요인의 다양성에 의존될 것이다.
본 발명의 OX40 항체의 “치료적으로 유효한 양”은 바람직하게 질환의 증상의 심각도에서 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈번도 및 지속기간의 증가, 및/또는 질환의 고통에 기인한 손상 또는 무력의 방지를 초래한다. OX40 매개된 장애의 치료를 위한 화합물의 능력은 인간에서 효험의 전조가 되는 동물 모델 시스템에서 평거될 수 있다. 대안적으로 조성물의 상기 속성은 세포성장을 억제하는 화합물의 능력을 조사하여 평가할 수 있고, 상기 억제는 당업자에게 알려진 분석에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 당업계에서 보통 기술의 하나는 개체의 크기, 개체의 증상의 심각도, 및 특정 조성물 또는 선별된 투여경로로서 상기 요인에 기반한 상기 양을 결정할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 조성물은 당업계에서 알려진 다양한 방법의 하나 또는 그 이상을 사용하고 하나 또는 그 이상의 투여경로를 경유하여 투여될 수 있다. 당업자에 의해 알 수 있는 바와 같이, 투여경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 다양할 것이다. 바람직한 투여경로는 정맥내, 근육내, 진피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 피하조직(subcutaneous), 척수 또는 주사 또는 주입에 의한 투여의 비경구 경로를 포함한다. 더욱 바람직한 투여경로는 정맥내 또는 피하조직이다. 본 명세서에서 사용된 문구 “비경구 투여”는 장 및 국소투여보다 항상 주사에 의한 다른 투여 방식을 의미하고, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내(intraarterial), 경막내(intrathecal), 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 진피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 경기관내(transtracheal), 피하조직(subcutaneous), 표피밑(subcuticular), 관절내(intraarticula), 피막밑(subcapsular), 거미막밑(subarachnoid), 척수강내(intraspinal), 경막외(epidural) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로 본 발명의 항체는 투여의 국소, 표피 또는 점막 경로와 같은 비경구가 아닌 경로, 예를 들면, 비강내로(intranasally), 경구로, 질내로(vaginally), 직장으로(rectally), 혀밑으로(sublingually), 구소적으로(topically) 투여될 수 있다.
제조물품 및 키트
본 발명의 다른 실시형태에서, 길항제 항체 또는 이들의 단편, 조성물 또는 OX40 매개된 장애의 치료를 위한 발명의 면역접합체를 포함하는 제조물품이 제공된다. 상기 제조물품은 용기(container) 및 용기와 연결된 라벨 또는 패키지 삽입부(package insert) 또는 용기와 연결(label or package insert on or associated with the container)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 용기는 병, 바이알 또는 주사기를 포함한다. 용기는 유리 또는 프라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 상태를 치료하는데 효과적일 수 있는 조성물을 지탱하고, 멸균 접속포트(access port)(예: 상기 용기는 파하주사 바늘에 의해 접합할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 투여 용액 백 또는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다. 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에서 설명된 길항제 항체일 수 있다. 상기 라벨 또는 패키지 삽입부는 상기 조성물이 암과 같은 선택의 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일실시형태에서, 라벨 또는 패키지 삽입부는 길항제 항체를 포함하는 조성물이 OX40-매개된 장애를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
나아가, 제조물품은 하기를 포함할 수 있다: (a) 조성물이 들어있는 첫 번째 용기, 여기서 상기 조성물은 본 명세서의 길항제 항체를 포함하고, (b) 조성물이 들어있는 두 번째 용기, 여기서 상기 조성물은 본 명세서의 길항제 항체보다 치료제를 포함한다. 본 명세서의 상기 실시형태의 제조물품은 패키지 삽입부를 추가적으로 포함할 수 있고, 첫 번째와 두 번째 조성물은 OX40 매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 조합하여 사용될 수 있음을 나타낸다. 상기 치료제는 이전 섹션에서 설명된 임의 부속물 치료제일 수 있다(예: 혈전 용해약(thrombolytic agent), 항혈소판제(anti-platelet agent), 화학요법제(chemotherapeutic agent), 항혈관형제(anti-angiogenic agent), 항호르몬 화합물(anti-hormonal compound), 심장보호제(cardioprotectant), 및/또는 사이토카인을 포함하여 포유동물에 있는 면역기능 조절인자). 대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 제조물품은 주사용 정균 물(bacteriostatic water for injection (BWFI)), 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline), 링거용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 버퍼를 포함하는 두 번째(또는 세 번째) 용기를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기는 다른 버퍼, 희석액, 여과기, 바늘, 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자의 관점으로부터 원하는 다른 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 범위내에서, 키트는 항체, 본 발명의 조성물 또는 면역접합체 및 사용 안내서를 포함한다. 상기 키트는 면역억제제, 세포독성제 또는 방사선독성제, 또는 하나 이상의 본 발명의 추가 길항제 항체(예: 첫 번째 길항제 항체로부터 구별되는 OX40 항원에 있는 항원결정기에 결합된 보완되는 활성을 갖는 길항제 항체)와 같은 하나 이상의 추가 시약을 포함할 수 있다.
추가적인 설명 없이, 당업계의 보통기술의 하나는, 선행 설명 및 하기의 분명한 실시예를 사용하여, 본 개시의 제제를 만들고 활용하고 청구된 방법을 실행할 수 있음을 확신하게 한다. 하기의 실용적 실시예는 본 발명의 실행을 용이하게 하는 것을 제공하고, 본 개시의 나머지를 임의 방식으로 제한하여 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1:
마우스 항-인간 OX40 항체의 생산 및 스크리닝
재조합 인간 OX40-Fc 단백질을 생산하기 위하여, 인간 TNFRSF4를 위한 cDNA는 이매진[imaGenes, 베를린, 독일, 클론(clone) 번호: RZPDB737H0329D]으로부터 구입하였다. 상기 cDNA는 인간 TNFRSF4 세포외 도메인(extracellular domain)(서열번호 11)의 PCR-증폭 DNA 암호화 부위(coding region)에 대한 주형(template)으로 사용되었다. 분리된 PCR 반응에 있어서, 인간 IgG1[EU 위치(position) 223-451]의 Fc 부위는 5' GSGGG 링커(linker) 및 3'SA-6xHis 링커 및 복제(cloning)를 위한 제한위치(restriction site)를 추가한 PCR로 증폭되었다. 두 결과물은 측면 프라이머(flanking primers)와 함께 겹친 연장 PCR(overlap extension PCR)을 사용하고, 인비트로젠(Invitrogen AG, 바젤, 스위스, Cat. No. V795-20)의 pcDNA3.1(-) 플라스미드(plasmid)를 기초로 변형된 포유동물 발현 벡터안으로 이어지는 복제를 위하여 제한위치가 추가되어 융합되었으며, 여기에는 미국 출원번호 5924939에 서술된 Ig 기증자(donor) 수용체(acceptor) 단편[첫번째 인트론(intron)]과 함께 인간 CMV 프로모터, OriP 서열(Koons MD et al., (2001) J Virol. 75(22): 10582-92), SV40 개선제(enhancer), 및 Kim D, et al., (2003) Biotechnol. Prog. 19(5): 1620-2에 서술된 바와 같이 가스트린 말단(gastrin terminator)에 결합된 SV40 폴리A를 포함한다. 상기 재조합 플라스미드는 인간 TNFRSF4 단백질의 기본 신호 펩티드(native signal peptide)에 의해 유발되는 세포 배양 배지안에서의 분비와 함께 포유동물 세포에 있어서 인간 TNFRSF4 세포외 도메인-Fc 융합 단백질의 발현을 허용한다. 재조합 단백질의 생산을 위하여, 상기 언급된 재조합 벡터는 jetPEITM 형질감염(transfection) 시약(reagent)[폴리플러스-형질감염 S.A.(polyplus-transfection S.A.), 스트라스부르, 프랑스, 유통회사: 브런슈윅(brunschwig), 바젤, 스위스]을 사용하여 현탁액-적응된(suspension-adapted) HEK293 세포(ATCC 번호 CRL 1573)안으로 형질감염되었다. 세포 배양 상청액(supernatant)은 5일 후에 모아졌고, AKTA FPLC 시스템[GE 헬스케어(Healthcare) 유럽 GmbH, 글라트부르그(Glattbrugg), 스위스]으로 작동되는 단백질 A 친화성 정제 컬럼(affinity purification column)[HiTrap 단백질 A 세파로스(separose) 컬럼; GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스]을 사용하여 추가적으로 정제되었다.
재조합 인간 OX40-his 단백질을 생산하기 위하여, 인간 TNFRSF4(서열번호 11)의 세포외 부위는 3'GSG-6xHis 링커 및 복제를 위한 제한위치를 추가한 PCR에 의해 증폭되었다. 상기 PCR 산물은 이어서 상기 서술된 변형된 pcDNA3.1(-) 플라스미드안으로 복제되었다. 상기 재조합 플라스미드는 인간 TNFRSF4 단백질의 기본 신호 펩티드에 의해 유발되는 세포 배양 배지안에서의 분비와 함께 포유동물 세포에 있어서 인간 OX-40-his 단백질의 발현을 허용한다. 재조합 단백질의 생산을 위하여, 상기 언급된 재조합 벡터는 jetPEITM 형질감염 시약(폴리플러스-형질감염 S.A., 스트라스부르, 프랑스, 유통회사: 브런슈윅, 바젤, 스위스)을 사용하여 현탁액-적응된 HEK293 세포(ATCC 번호 CRL 1573)안으로 형질감염되었다. 세포 배양 상청액은 5일 후에 모아졌고, AKTA FPLC 시스템(GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스)으로 작동되는 Ni2 +-NTA 친화성 정제 컬럼(HiTrap Ni2 +-NTA 세파로스 컬럼; GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스]을 사용하여 추가적으로 정제되었다. 재조합 인간 OX40-Fc 및 OX40-his 단백질은 SDS-PAGE에 의해 판단된 바와 같이 95% 순수한 것으로 확인되었고, 사용하기 전에 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 바뀌어 추가적으로 완충되었다.
PBS에 용해된 재조합 인간 OX40-Fc 단백질은 스티뮴 애주번트(Stimune adjuvant)[프리오닉스(Prionics), 스위스, ref: 7925000]의 동량과 혼합되었고, 에멀전(emulsion)으로 제조되었다. 에멀전은 0.5 ㎖ 인슐린(insulin) 주사기로 이동되었고, BALB/c 동물[할란(Harlan), 네덜란드]에 에멀전화 된 단백질의 50 ㎍을 꼬리 및 목의 가장 아래 부분에 등 풋패드(back footpad)에 있어서 피하에(sub-cutaneously) 면역주사되었다. 면역화(immunization)는 동일한 양의 항원 및 동일한 루트(route)의 주사로 2주 후에 반복되었다.
면역화된 마우스 혈청(sera)에 있어서 순환하는 항-인간 OX40 항체의 존재는 재조합 인간 OX40-his 단백질이 코팅된 플레이트(plate)를 이용한 직접적인 ELISA에 의해 평가된다. 다른 마우스 혈청을 단계 희석(serial dilution)(1:100 내지 1:109)하여 플레이트에 추가하고, 결합된 항체는 염소(goat) 항-마우스 H+L 전체(whole) 분자-HRP[시그마-알드리치 케미(Sigma-Aldrich Chemie) GmbH, 북스(Buchs), 스위스]를 사용하여 탐지하였다. 애주번트 없이 50 ㎍의 항원으로 최종 피하의 부스트(boost)가 희생되기 3일 전 최고의 항-인간 OX40 IgG 혈청 역가(titer)를 나타내는 동물에 수행되었다.
*동물은 안락사되었고, 서혜부(inguninal), 겨드랑이(axillary), 팔(brachial), 슬와(popliteal) 및 림프절(lymph nodes)은 DNAse[로슈 진단(Roche Diagnostics)(슈바이츠(Schweiz)) AG, 록크뤠즈(Rotkreuz), 스위스] 및 콜라겐 분해효소(collagenase)[로슈 진단(슈바이츠) AG, 록크뤠즈, 스위스] 용액에 있어서, 두개의 25G 바늘로 흐트러진 림프절의 구성에 의해 단일 세포 현택액으로 준비하기 위하여 수집되었다. 단일 세포 현탁액은 골수종 세포주(myeloma cell line) X63AG8.653[마우스 BALB/c 골수종 세포주; ATCC 수납 번호(accession number): CRL 1580; Kearney JF et al., (1979) J. Immunol. 123(4): 1548-1550]와 7:1(융합 파트너 대 수집된 림프절 세포)의 비율로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 1500[로슈 진단(슈바이츠) AG, 록크뤠즈, 스위스]과 함께 융합되었다. 융합된 세포는 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)[PAA 라보레터리(Laboratories), 파싱(Pasching), 오스트리아], 2 mM L-글루타민(L-glutamine), 100 U/㎖[바이오크롬 AG(Biochrom AG), 독일] 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토바이신(streptomycin)(바이오크롬 AG, 독일), 10 mM HEPES(인비트로젠 AG, 바젤, 스위스), 50 μM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스), HAT(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스) 및 1% 성장인자(growth factor)[하이브리도카인(hybridokine), 인터침(interchim)/업티마(uptima), 몽뤼송(Montlucon), 프랑스]가 첨가된 DMEM-10 배지(인비트로젠 AG, 바젤, 스위스)에 있어서, 마우스 대식세포(macrophage)가 포함된 96 웰(well) 평평한 바닥(falt bottom) 플레이트 안으로 분주하였다.
융합으로부터 약 800 웰이 인식된 인간 OX40 마우스 IgG의 존재를 위한 ELISA에 의해 스크리닝 되었고, 인간 OX40와 이의 수용체의 결합은 차단되었다. 양성 웰은 확장되었고, 서브복제(subcloning)의 2회가 수행되었다. 세포는 수집되었고, 중쇄 및 경쇄는 복제되고 서열분석되었다.
실시예 2:
융합 세포(hybridoma cell)로부터 항-OX40 항체의 VH 및 VL의 복제 및 서열분석
각각의 양성으로 선택된 융합세포(hybridoma)를 위하여, 전체 RNA가 준비되었고, cDNA로 역전사(reverse-transcribed)되었으며, VH 및 VL 유전자는 PCR에 의해 각각 증폭되었다. 이들 PCR 생산물은 구조-벡터(rescue-vector)[pDrive 벡터; 퀴아젠 AG(QIAGEN AG), 홈브레츠티콘(hombrechtikon), 스위스; Cat. 번호. 231124] 안으로 결찰되었고, 이는 각각의 PCR 산물의 서열분석 및 선택된 융합세포의 모노(mono)- 또는 폴리(poly)-클론형성능(clonality)의 결정을 허용한다. 상기 벡터는 IPTG 및 X-gal(LaZ α-펩타이드에 의해 X-gal의 분해로 인해 삽입되지 않은 벡터는 파란 콜로니)을 포함하는 LB-아가(agar) 플레이트에서 파란/흰 선별을 허용한다. 양성(흰) 박테리아 클론(clone)으로부터의 재조합 플라스미드가 제조되었고, 벡터의 골격(backbone)(M13rev, M13fwd, T7 또는 SP6)에 특이적인 표준 DNA 서열분석 프라이머를 사용하여 서열분석되었다. DNA 서열은 포유동물 세포에서 관심있는 항체의 재조합 발현을 위한 발현 벡터안으로 최종적으로 서브복제되었다.
RNA 분리
전체 RNA는 퀴아젠의 알앤이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(퀴아젠 AG, 홈브레츠티콘, 스위스; Cat. 번호. 74106)를 사용하여 제조사의 프로토콜(protocol)을 따라 2 - 10 x 106 세포로부터 분리되었다; 샘플은 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 분광광도계(spectrophotometer)[위텍(WITEC) AG, 리토(Littau), 스위스]를 사용하여 정량하였다.
한단계 ( one step ) RT - PCR
상기 서술된 전체 RNA 준비는 cDNA로 추가적으로 역전사되었고, VH 및 VL 단편은 퇴보한(degenerated) 프라이머의 두 다른 혼합물(mixture)을 사용한 PCR에 의해 증폭되었으며, 여기서 각각은 마우스 면역글로불린(immunoglobulin) 중쇄 가변 단편 및 가변 중쇄 접합(junction) 부위의 모든 다른 아족들(subfamilies)의 회복 또는 모든 마우스 면역글로불린 경쇄 카파(kappa) 가변 단편 및 가변 경쇄 카파 접합 부위의 회복을 허용한다. 역전사 및 증폭을 위해 사용된 프라이머는 마이크로신스(Microsynth)[발가(Balgach), 스위스]에서 합성되었고, HPLC로 정제되었다(표 1 내지 4). 역전사 및 PCR 증폭 모두 퀴아젠 한단계 RT-PCR 키트(퀴아젠 AG, 홈브레츠티콘, 스위스; Cat. 번호. 210212)를 사용하여 동시에 수행되었다. 기술에 특이적인 프라이머가 사용된 이후, 각각의 mRNA 샘플은 각각의 역전사 및 VH 또는 VL 단편 모두의 증폭을 위해 허용하는 이중(duplicate)으로 취급되었다. 최종 부피가 30 ㎕이 되도록 RNase-자유 물(RNase-free water)에 용해된 2 ㎍ 전체 RNA는 하기와 혼합되었다: 퀴아젠 한단계 RT-PCR 완충액(buffer)의 5x 저장액(stock solution) 10 ㎕, 10 mM의 농도인 dNTP 믹스(mix) 2 ㎕, 10 μM의 농도인 프라이머 믹스 3 ㎕ 및 퀴아젠 한단계 RT-PCR 효소(enzyme) 2 ㎕. 최종 혼합물은 PCR 튜브(tube)에 두었고, 하기의 단계를 사용하여 PCR 서모사이클러(themocycler)[바이오래드(BioRad) 아이사이클러(iCycler) 버전 4.006, 바이오래드 라보레터리 AG, 라이나흐(Reinach), 스위스]로 순환되었다:
50℃에서 30분
95℃에서 15분
40회: 94℃에서 30초
55℃에서 30초
72℃에서 1분
72℃에서 10분
4℃로 고정
pDrive 복제
PCR 산물은 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 달렸다. DNA 전기영동(electrophoresis)에 이어서, 관심의 단편(~ 450 bp)은 아가로스 겔로부터 잘려졌고, 마처레이-나겔 누클로스핀 익스트렉트 II 킷트 250(Macherey-Nagel NucloSpin Extract II kit 250)[마처레이-나겔, 올텐(Oensingen), 스위스: Cat. 번호 740609.250]을 사용하여 추가적으로 추출되었다. DNA 서열분석을 위하여, 추출된 PCR 산물은 상기 서술된 구조-벡터(pDrive 벡터, 퀴아젠 AG, 홈브레츠티콘, 스위스, Cat. 번호 231124)안으로 복제되었고, 대장균 TOP10 균주(인비트로젠 AG, 바젤, 스위스; Cat. 번호 C404006)안으로 형질전환(transformed)되었다.
미니프렙 ( miniprep ) 추출
양성 클론들은 마처레이-나겔 사각-웰 전처리(bloking) 플레이트(마처레이-나겔, 올텐, 스위스: Cat. 번호 740488.24)에 접종되어 100 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)이 첨가된 1.5 ㎖ 루리아 버타니(Luria Bertani, LB) 배지에서 37℃[250 RPM으로 진탕(shaking)]에서 하룻밤 배양되었다. 다음날, DNA 미니프렙 추출이 뉴클레오스핀 멀티-8 플라스미드 키트(NucleoSpin Multi-8 Plasmid kit)(마처레이-나겔, 올텐, 스위스: Cat. 번호 740620.5)를 사용하여 수행되었다.
서열분석( sequencing ) 및 서열의 분석( sequence analysis )
샘플은 DNA 서열분석을 위해 DNA 서열분석 회사 파스테리스(Fasteris)[플랑-레-와트(Plan-les-Ouates), 스위스]로 보내졌다. 표준 프라이머: M13rev, M13fwd, T7, SP6가 사용되었다(표 5). DNA 서열을 분석하기 위하여, 클론 매니저 9 전문가 에디션(Clone Manager 9 Professional Edition)[사이언티픽 & 에듀케이셔날 소프트웨어(Scientific & Edicational Software), NC, 미국] 및 바이오에딧 시퀀스 얼라인먼드 에디터(BioEdit Sequence Alignment Editor)(Hall, TA (1999) Nucl. Acids. Symp. Ser. 41: 95-98)가 사용되었다.
재조합 키메라 ( chimeric ) 항체 발현을 위한 발현 벡터의 복제
포유동물 세포에서 재조합 발현을 위하여, 분리된 쥐(murine) VH 및 VL 단편이 조립-기초(assembly-based) PCR 방법을 사용하여 키메라 면역글로불린으로서 형식화되었다. 이들 키메라 항체는 쥐 중쇄 가변 도메인이 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인[γ1, 경첩(hinge), γ2, and γ3 부위]에 융합된 중쇄 및 쥐 경쇄 가변 도메인이 인간 카파 불변 도메인(Cκ)에 융합된 경쇄로 구성된다. PCR-조립된 쥐 가변 및 인간 불변 부분은 이어서 단백질 분비를 촉발하기 위해 사용된 인간 면역글로불린 경쇄 카파 리더(leader)와 차이(difference)와 함께 실시예 1에서 언급된 인비트로젠의 변형된 pcDNA3.1(-)에 기초한 변형된 포유동물 발현 벡터안으로 복제되었다. 면역글로불린 후보들(candidates)의 단백질 생산을 위하여, 중쇄 및 경쇄 벡터 DNA의 동량이 현탁액-적응된 HEK-293(ATCC 번호: CRL-1573)안으로 공-형질감염되었다(co-transfected). 세포 배양 상청액은 5일 후에 수집되었고, AKTA FPLC 시스템(GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스)으로 작동되는 단백질 A 친화성 정제 컬럼(HiTrap 단백질 A 세파로스 컬럼; GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스)을 사용하여 정제되었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
서열분석 프라이머
M13-Fwd GTAAAACGACGGCCAGT
M13-Rev AACAGCTATGACCATG
T7 TAATACGACTCACTATAGG
SP6 GATTTAGGTGACACTATAG
실시예 3:
항-인간 OX40 항체의 생물학적 특징
OX40 -특이적 항체 탐지 ELISA :
융합세포에 의한 항체 역가, 특이성(specificity) 및 생산 및 재조합 항체 후보는 직접 ELISA에 의해 결정된다. 간단하게, 96 웰-마이크로역가(microtiter) 플레이트[코아스타(Coastar), 미국, 유통회사 VWRAG, 니용(Nyon), 스위스]에 PBS에 있는 2 ㎍/㎖의 재조합 인간 OX40-his 100 ㎕를 코팅하였다(OX40-his 단백질의 생산은 실시예 1을 참조). 플레이트는 4℃에 하룻밤동안 배양하였고, 그리고나서 PBS 2% BSA[소혈청 알부민(Bovine Serum Albumine), PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아]와 함께 상온(room temperature, RT)에서 1시간 동안 전처리되었다. 전처리 용액은 제거되고, 융합세포 상청액 또는 정제된 항체가 추가되었다. 플레이트는 30분 동안 RT에서 배양되고, 그리고나서 PBS 0.01% 트윈-20(Tween-20)(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)으로 9번 세척하였으며, 겨자무과산화효소(Horseradish Peroxidase, HRP) 표지된-염소 항-마우스 H+L 탐지 항체(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)가 1:1000으로 희석되어 추가되었다. 인간 Fc를 갖는 재조합 키메라 항체(실시예 2 참조)를 탐지하기 위하여, HRP-표지된 토끼 항 인간 IgG 항체(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)가 1:1000의 희석으로 항체의 탐지(detection)로서 사용되었다. 플레이트는 상온(RT)에서 30분간 배양되었고, PBS 0.1% 트윈-20으로 9번 세척되었으며, TMB 기질(substrate)(바이오래드 라보레터리 AG, 라이나흐, 스위스)이 플레이트에 추가되었고, 상기 반응은 H2SO4의 추가에 의하여 6분 후에 정지되었다. 그리고나서, 흡광도(absorbance)는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)[바이오테크(Biotek), 미국; 유통회사: WITTEC AG, 리토, 스위스]에 의해 450 nm에서 읽혀졌다. 도 1a는 키메라 1D4 항체 및 키메라 2F8 항체가 OX40-his 코팅된 단백질을 인식함을 나타낸다.
OX40L 전처리 ELISA :
재조합 인간 OX40 리간드(ligand) 단백질(OX40L)은 하기와 같이 생산되었다: 인간 TNFSF4(클론 이름: IOH46203)의 cDNA는 이매진(베를린, 독일)에서 구입되었고, 인간 TNFSF4 리간드(의 세포외 부분(extracellular portion)(아미노산 51 - 183)[유니프롯(Uniprot) Q6FGS4 서열에 따른 번호]은 측면 제한위치와 함께 증폭되었다. 5' 말단(end)에 ASA 링커 및 8-His 표지(tag)를 포함하는 결과 PCR 산물은 이어서 CMV 프로모터, 소 성장 호르몬(Bovine Growth Hormone) 폴리-아데닐화(poly-adenylation), 및 재조합 단백질의 분비를 촉발하기 위한 쥐 VJ2C 리더 펩타이드를 갖는 인비트로젠의 pREP4 벡터(인비트로젠 AG, 바젤, 스위스)의 변형된 버전(version)안으로 복제되었다. 재조합 단백질의 생산을 위하여, 재조합 벡터는 jetPEITM 형질감염 시약(폴리플러스-형질감염 S.A., 스트라스부르, 프랑스, 유통회사: 브런슈윅, 바젤, 스위스)을 사용하여 현탁액-적응된 HEK293 세포(ATCC 번호 CRL 1573)안으로 형질감염되었다. 세포 배양 상청액은 5일 후에 모아졌고, AKTA FPLC 시스템(GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스)으로 작동되는 단백질 A 친화성 정제 컬럼(HiTrap 단백질 A 세파로스 컬럼; GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스)을 사용하여 정제되었다.
만약, 생성된 항-OX40 항체가 OX40L이 OX40 수용체에 결합하는 것을 방해할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 전처리 ELISA가 개발되었다. 96 웰-마이크로역가 플레이트(코아스타, 미국; 유통회사: VWR AG, 니용, 스위스)는 PBS에 있는 2 ㎍/㎖의 재조합 인간 OX40-Fc(실시예 1 참조) 100 ㎕로 코팅하였다. 플레이트는 4℃에 하룻밤동안 배양하였고, 그리고나서 PBS 2% BSA로 한시간동안 RT에서 전처리되었다. 처리 용액은 제거되고, 융합세포 상청액 또는 정제된 항체가 추가되었다. 5분 후, 0.04 ㎎/㎖인 바이오티닐화된(biotinylated)-재조합 인간 OX40L 50 ㎕를 각 웰에 추가하였다. 플레이트는 60분 동안 RT에서 배양되고, 그리고나서 PBS 0.01% 트윈-20(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)으로 9번 세척하였으며, HRP-스트렙타비딘(streptavidin)(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)가 1:2000으로 희석되어 추가되었다. 플레이트는 RT에서 30분간 배양되었고, PBS 0.1% 트윈-20으로 9번 세척되었으며, TMB 기질(바이오래드 라보레터리 AG, 라이나흐, 스위스)이 플레이트에 추가되었고, 상기 반응은 H2SO4의 추가에 의하여 6분 후에 정지되었다. 그리고나서, 흡광도는 마이크로플레이트 리더(바이오테크, 미국; 유통회사: WITTEC AG, 리토, 스위스]에 의해 450 nm에서 읽혀졌다. 도 1b는 키메라 1D4 항체가 농도의존적으로 OX40 및 OX40L 사이의 상호작용을 차단할 수 있으나, 키메라 2F8 항체는 OX40 및 OX40L 사이의 상호작용을 차단하지 못함을 나타낸다.
인간 혼합된 림프구 반응( Mixed Lymphocyte Reaction , MLR )
두 다른 기증자로부터의 혈액(blood)이 항-응고제(anti-coagulant)[자르슈테트(Sarstedt), 넘브레흐(Numbrecht), 독일]로서 구연산염(citrate)과 함께 세개의 10 ㎖ S-모노베떼(S-Monovette)에 수집되었다. 1번 기증자로부터의 세포는 작동인자 세포(effector cell)로서 사용되었으나, 2번 기증자로부터의 세포는 표적 세포(target cell)로서 사용되었다. 2번 기증자로부터의 PBMC는 제조사의 설명에 따라 50 ㎖ 블러드-셉-필터 튜브(Blood-Sep-Filter Tube)를 사용하여 정제되었다. 세포는 FBS 없이 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute, RPMI)(PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아) 배지로 두번 세척되었다. 표적 세포는 50 ㎍/㎖ 마이토마이신 C(mitomycin C)(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)와 함께 37℃에서 30분간 배양되었다. 그리고나서 세포는 FBS 없는 RPMI로 3회 세척되었고, 10% FBS(PAA 라보레터리, 파싱 오스트리아), 2 mM L-글루타민(L-glutamine)[론자(Lonza), 루뱅(Leuven), 벨기에], 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(바이오크롬 AG, 베를린, 독일)이 포함된 RPMI에 1 x 106 cell/㎖로 재현탁되었다. 96웰 U 바닥 마이크로-플레이트[TPP, 트라사디겐(Trasadingen), 스위스]에 있어서, 50'000 표적 세포 및 80'000 작동인자 세포는 각각의 웰에 최종 부피가 100 ㎕로 분배되었다. 항체 희석의 100 ㎕가 웰에 추가되었다. 플레이트는 7일 동안 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 배양되었다. MLR의 시작 7일 후, 세포는 0.5 μCi 3H 티미딘(thymidine)[펄킨 엘머(Perkin Elmer)]과 함께 펄스(pulsed)되었다. 펄싱(pulsing) 18시간 후, 세포는 모아지고, 삽입된 방사성(radioactivity)는 왈락 베타 카운터(Wallac beta counter)로 정량화되었다. 도 2는 키메라 1D4 항체가 농도의존적으로 양성대조군보다 높게 MLR을 차단시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4:
유동 세포분석법( flow cytometry )에 의한 인간 및 다른동물에서 활성화된 말초혈액단핵구( PBMC)의 항-인간 OX40 항체의 결합
인간 세포
인간 백혈구를 포함하는 필터는 라쇼드퐁(La Chaux-de-Fonds), 스위스[수혈센터 및 혈청학연구소(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologie), 소피-메레 길(rue Sophie-Mairet) 29, CH-2300]로부터 수집되었다. 세포는 10 U/㎖ 리퀘민(liquemin)[드로사팜(Drossapharm) AG, 루체른(Lucern), 스위스]을 포함하는 60 ㎖ PBS로 백플러싱(backflushing)에 의한 필터로 제거되었다. 그리고나서, PBMC는 제조사의 설명에 따라 50 ㎖ 블러드-셉-필터 튜브(유통회사: 브런슈윅, 바젤, 스위스)로 정제되었다. 세포는 FBS 있는 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아) 배지로 세번 세척되었다. 세포는 24웰 플레이트(TPP, 트라사디겐, 스위스)에 10% FBS(PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아), 2 mM 울트라글루타민(ultraglutamine)(론자, 루뱅, 벨기에), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(바이오크롬 AG, 베를린, 독일), 10 ㎍/㎖ 식물성적혈구응집소(Phytohemagglutinin, PHA)(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스) + 100 U/㎖ rHu IL-2[프로류킨(Proleukin), 노바티스(Novartis), 바젤, 스위스]가 포함된 RPMI로 3 x 106 세포/㎖로 재현탁되었다. 48시간 후, 세포는 수집되고, 하기 서술된 바와 같이 유동 세포분석법으로 분석되었다.
HPB-ALL 세포[T 급성 림프구성 백혈병(T acute lymphoid leukemia) 세포주, 미생물 및 세포 배양 GmbH의 독일 컬렉션(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 브라운슈바이크(Braunschweig), 독일로부터 받음]는 10% FBS가 첨가된 RPMI에서 배양되었다. 2 x 105 세포가 96웰 V 바닥 플레이트(TPP, 트라사디겐, 스위스]에 분주되었고, 13000 rpm에서 3분동안 원심분리되었으며; 상청액은 버려지고, 세포는 수집되고, 하기에 서술된 바와 같이 유동 세포 분석법으로 분석되었다.
상기 서술된 바와 같이 준비된 PBMCs 및 HPB-ALL 세포는 5 ㎍/㎖ 키메라 1D4 항체 또는 5 ㎍/㎖ 또는 적당량의 동종(isotype) 대조군 또는 20 ㎕ PE-표지된 상용화된 항-인간 OX40 항체[클론 L106, BD 바이오사이언스(BD Biosciences), 알슈빌(Allschwil), 스위스]가 포함된 50 ㎕ FACS 완충액[PBS, 2% FBS, 10% 벌세네(versene)(인비트로젠, 미국)]에 재현탁하였다. 세포는 얼음위에서 30분 동안 배양되었고, 3번 세척하였으며, 50 ㎕ FACS 완충액에 재현탁하였다. 1/200으로 희석된 항-인간 IgG-피코에리스린(phycoerithrin)-PE(BD 바이오사이언스, 알슈빌, 스위스)가 키메라 1D4 항체 및 동종 대조군 항체를 탐지하기 위해 사용되었다. 세포는 얼음위에서 15분 동안 배양되었고, 1번 세척한뒤, 400 ㎕ FACS 완충액에 재현탁하였으며, FACS 계기(instrument)[시안(Cyan), 벡맨 코울터 인터네셔널 S.A.(Beckman Coulter International S.A.), 니용, 스위스]로 분석되었다.
게먹이원숭이 ( Cynomolgus monkey ) 일차배양 세포
게먹이원숭이[스위스, 프리부르(Fribourg), 프리부르 대학교, 신경생리학 실험실, 에릭 로우일러(Eric Rouiller) 교수로부터 얻음]의 전체 혈액은 구연산염 튜브(BD 바이오사이언스, 알슈빌, 스위스)에 모아졌다. 2 ㎖ PBS가 3 ㎖ 혈액에 섞였고, 상기 혼합물은 10 ㎖의 85:15로 피콜(Ficoll): PBS 혼합물(GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스)에 최상층에 층을 형성하였다. 샘플은 상온에서 쉬지않고 20분 동안 원심분리되었다. PBMC 층(layer)은 수집되었고, PBS로 세번 세척하였다. 세포는 3 x 106 세포/㎖로 10% FBS(PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아), 비-필수적 아미노산(non-essential amino acid)(PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아), 1 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)(PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아), 2 mM 울트라글루타민(론자, 벨기에), 100 U/㎖ 페니실린(바이오크롬 AG, 독일), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(바이오크롬 AG, 베를린, 독일)이 포함된 둘베코스 모디파이드 이글 메디엄(Dullbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아)에 재현탁되었다. 1 ㎖ 세포 현탁액은 24웰 플레이트(TPP, 트라사디겐, 스위스)에 분주되고, 10 ㎍/㎖ PHA(PHA/M, 시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스), 100 U/㎖ rHuIL-2[프로류킨(Proleukin), 노바티스, 바젤, 스위스]가 첨가되었다. 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 50시간 동안 배양되었다. 활성화된 PBMC는 수집되었고, PBS/2.5% FBS(FACS 완충액)에 재현탁되었다. 50 ㎕ FACS 완충액에 5만개 세포가 되도록 96웰 V 바닥 플레이트에 분주하였고, 바이오티닐화된 항-인간 OX40-키메라 1D4 항체 또는 바이오티닐화된 동종 대조군 항체 또는 바이오티닐화된 양으로부터 생산되 상용화된 항-인간 OX-40(BD 바이오사이언스, 알슈빌, 스위스)가 25 ㎍/㎖로 웰에 첨가되었다. 샘플은 얼음위에서 20분 동안 배양되었고, 그리고나서 차가운 FACS 완충액으로 2번 세척되었으며, 1:20으로 희석된 스트렙타비딘-PE(Streptavidin-PE)(BD 바이오사이언스, 알슈빌, 스위스)과 함께 얼음위에서 15분 동안 배양되었다. 세포는 FACS 완충액으로 한번 세척되었고, 300 ㎕ FACS 완충액에 재현탁되었다. 2 ㎕ 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide, PI)(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)가 죽은 세포를 제외한 각 샘플에 첨가되었다. 세포는 유동 세포 분석법(시안, 벡맨 코울터 인터네셔널 S.A., 니용, 스위스)에 의해 분석되었다.
도 3a 및 3b는 키메라 1D4 항체가 각각 인간 및 게먹이원숭이의 활성화된 림프구 표면에 발현된 OX40을 인식할 수 있음을 나타내고, 따라서 약물 개발(drug development)을 위해 매우 바라던 교차-반응(cross-reactivity) 특성을 제공한다.
실시예 5:
표면 플라스몬 공명( surface plasmon resonance , SPR )에 의한 인간 OX40 수용체 세포외 도메인을 위한 키메라 1 D4 항체의 운동 결합력 상수( kinetic binding affinity constant )
운동 결합력 상수(KD)는 분해물질로서 실시예 1에 서술된 바와 같이 히스티딘(histidine) 표지된 재조합 인간 OX40 수용체 세포외 도메인을 사용하여 포획된 단백질-A로 측정되었다. 측정은 실온에서 비아코어 2000(BIAcore)[GE 헬스케어, 비아코어, 웁살라(Uppsala), 스웨덴]로 수행되었고, 비아이밸류에이션 소프트웨어(BiaEvaluation software)(비아코어; v4.1)로 분석되었다.
CM5 시험등급 센서칩(research grade sensor chip)(GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스, BR-1000-14)은 35 ㎕ 1:1 N-하이드록시설포숙시니마이드(N-hydroxysulfosuccinimide, NHS)/1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디마이드 하이드로클로라이드{1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride, EDC) 용액[v/v, 5 ㎕/㎖ 유동률(flow-rate); 1 및 2 유로(flow path)]의 주입에 의해 활성화되었다. 단백질-A(참조. P7837; 시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)가 pH4.5 아세테이트(acetate) 완충액[GE, BR-1003-50; pI 아래 한 pH 단위(unit)]에 최종 농도가 50 ㎍/㎖가 되도록 희석되었고, 이어서 1 및 2 양쪽 유로에 35 ㎕의 주입(5 ㎕/분)에 의해서 이전에 활성화된 CM5 센서칩에 고정화되었다; 이는 약 1500 반응 단위(response unit, RU)에 상응한다. 그리고나서, 단백질-A-CM5 센서칩은 35 ㎕ 에탄올아민 용액(5 ㎕/분)을 주입함으로써 비활성화되었다. 최종적으로, 10 ㎕ 글라이신(glycine) 용액(GE, 참조. BR-1003-54; 10 mM; pH 1.5)의 두번 주입이 비-교차결합된(non-crosslinked) 단백질-A 분자의 방출을 위해 수행되었다.
결합력 측정 전에, 물질전달 제한시험(mass transfer limitation test)가 다른 유속(2분 동안 5, 15, 30, 50, 75 ㎕/분)에서 단백질-A 포획된 항체의 고정된 양에 분석물질의 고정된 농도의 주입에 의해 수행되었다. 다른 유속에서 비율 기울기(on-rate slope)의 분석을 물질전달을 나타낸다.
결합력 측정을 위하여, 1x PBS 완충액에 보관된 키메라 1D4 항체가 HBS-EP 완충액[GE, 참조. BR-1001-88; 0.01 M 허피스(Hepes), 0.15 M NaCl, EDTA 3 mM, 0.005% 계면활성제(Surfactant) P20, pH 7.4]에 최종 농도가 15 nM이 되도록 희석되었다. 상기 희석된 스톡(stock) 10 ㎕이 이어서 200-250 RUs에 도달하도록 단백질-A CM5 칩(30 ㎕/분)의 2 유로에 주입되었다. 상기 포획단계에 이어서, 히스티딘 표지된 재조합 인간 OX40 수용체 세포외 도메인이 30 ㎕/분 유속으로 1 및 2 유로(1 유로는 참조로서 사용됨)에 다른 농도(50 nM 내지 0.4 μM)로 주입되었다. 각각의 결합 이벤트 후, 표면은 1분동안 주입된 pH 1.5 글라이신 완충액(10 ㎕/분)과 함께 재생성되었다.
측정[센서그램(sensorgram): fc2-fc1]은 물질전달과 함께 2:1 이가(divalent)의 분석물질 모델(model)이 가장 적합하였다. 각각의 측정의 시작에서 단백질-A 포획된 항체에 있어서 실험적 변이를 해명하기 위하여, Rmax 값이 모든 맞춤(fit)에 있어서 일부(local)에 설정되었다. 해리시간(dissociation time)은 적어도 300 - 600초였다. 측정은 두번 수행되었고, 참조를 위해 농도 0 샘플을 포함하였다. Chi2 값은 실험 데이터 및 참조 데이터 각각의 포인트 사이의 차이의 제곱의 합을 나타낸다; 그동안 잔기의 구성(plot)은 맞춤에 있어서 각 포인트를 위한 실험 및 참조 데이타 사이의 차이를 나타낸다. Chi2 및 잔기의 값 모두는 실험 데이타 및 개인의 결합 모델 사이의 맞춤의 양을 측정하기 위해 사용되었다.
측정은 분석물질로서 단백질-A 센서칩 위에 고정된 포획된 키메라 1D4 항-인간 OX40 항체 및 히스티딘 표지된 재조합 인간 OX40 수용체 세포외 도메인으로 두번 수행되었다. Chi2 값이 1.25 이하와 함께 KD 값은 91 및 116 nM 사이이다.
실시예 6:
마우스 단클론 ( monoclonal ) 항체 1 D4 의 인간화( humanization )
인간 CDR-접합된(grafted) 수용체 구조형성(framework)의 결합 특성을 주로 지속 및/또는 개선시키는 인간 수용체 구조형성, 복귀 돌연변이(back mutation), 및 돌연변이의 선택을 포함하는 인간 수용체 인간화 항-인간 OX40 마우스 항체 1D4는 여기에 서술되었다.
개조된( resharped ) 가변영역( variable region )의 디자인
상동성(homology) 맞춤(matching)은 1D4 CDRs을 접합시키기 위한 인간 수용체 구조형성을 선택하기 위해 사용되었다. 데이타베이스, 예를 들어 인간 및 마우스의 면역글로불린 자리(loci)로부터 생식계열(germline) 가변 유전자의 데이타베이트[IMGT 데이타베이스(the international ImMunoGeneTics information system®; Lefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27(1): 209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev. Comp. Immunol. 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64) 또는 the VBASE2 (Retter I et al., (2005) Nucleic Acids Res. 33, Database issue D671-D674) 또는 케벳(Kabat) 데이타베이스(Johnson G et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28: 214-218)] 또는 출판물(예를 들어, Kabat EA et al., supra)이 수용체 분자로서 사용되기 위해 인간 생식계열 구조형성에 가장 잘 맞게 포함 또는 결정된 쥐 중쇄 및 경쇄 V 부위와 인간 아족을 동정하기 위해 사용될 것이다. 수용체로서 사용된 상기 아족내에서 중쇄 및 경쇄 가변 서열(VH 및 VL)의 선택은 접합 후 6개 CDRs의 적절한 상대 제시(presentation)을 유지하기 위해 CDR1 및 CDR2 부위의 서열 상동성 및/또는 구조의 맞춤에 기초하였다.
예를 들어, IMGT 데이타베이스의 용도는 1D4 중쇄 가변 도메인 구조형성 및 인간 중쇄 가변 도메인 아족 2의 구성원 사이의 좋은 상동성을 나타낸다. CDRs 및 구조형성 서열 모두의 높은 상동성 및 일치성은 생식계열 서열에서 관찰되었고: IGHV 2-70*10(서열번호 19), IGHV2-70*01(서열번호 20), IGHV2-70*13(서열번호 21), IGHV2-5*09(서열번호 22), 및 IGHV2-70*11(서열번호 23), 이들 모두는 CDR3까지 전체 서열의 73% 이상 서열 상동성을 갖는다. IGHV 2-70*10, IGHV2-70*01 및 IGHV2-70*13는 74%의 서열 상동성을 갖고, IGHV2-5*09 및 IGHV2-70*11는 각각 73.5% 및 73%의 서열 상동성을 갖는다.
동일한 접근법을 사용하여, 1D4 경쇄 가변 도메인 서열은 인간 경쇄 가변 도메인 카파 아족 3의 구성원과 좋은 상동성을 나타낸다. CDRs 및 구조형성 서열 모두의 높은 상동성 및 일치성은 생식계열 서열에서 관찰되었다: IGKV3-11*01(서열번호 24)(65.3% 상동성), IGKV1-39*01(서열번호 25)(64.9% 상동성), IGKV1D-39*01(서열번호 26)(64.9% 상동성), IGKV3-11*02(서열번호 27)(64.2% 상동성), 및 IGKV3-20*01(서열번호 28)(62.5% 상동성).
인간화 과정을 위한 시작점(starting point)으로서, 인간 IGHV 2-70*10(서열번호 19), 및 IGKV3-11*01(서열번호 24) 가변 도메인은 1D4 CDRs의 수용체로서 선택되었다. IGHV 2-70*10은 구조형성 한 부위에 있어서 1D4의 우수한 상동성을 위해 다른 인간 중쇄 가변 도메인 이상이 선택되었다.
인간 감마 한 동종의 첫번째 인간화 항체가 준비되었다(아래 참조). 항체는 인간-마우스 혼성(hybrid) 중쇄 가변 도메인 및 인간-마우스 혼성 경쇄 가변 도메인을 고려한다. 혼성 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인 IGHV 2-70*10에 기초하였고, 여기서 생식계열 CDR1 및 CDR2는 각각 1D4 중쇄 CDR1 및 CDR2대신 교체되었다. 인간 수용체 구조형성에 대한 최적 맞춤 JH 부분(segment) 서열은 상기 언급된 IMGT 찾기로 동정되었다. 1D4 마우스 CDRs인 인간 IGHV 2-70*10 구조형성 부위를 갖는 인간-마우스 혼성 중쇄 가변 서열 결과 및 인간 수용체에 대한 최적 맞춤 JH는 서열번호 29인 중쇄 가변 도메인 VH1으로서 본 명세서에 참조되었다. 유사하게, 첫번째 인간화 항체 후보를 위해 사용된 인간-마우스 혼성 경쇄 가변 도메인은 1D4 마우스 CDRs인 인간 IGKV3-11*01 구조형성 부위를 갖고, 인간 수용체에 대한 최적 맞춤은 서열번호 30인 경쇄 가변 도메인 VL1으로 본 명세서에 참조되었다.
첫번째 인간화 항체 원형( prototype )의 생산
VH1 및 VL1을 위한 암호화 DNA 서열(cDNAs)는 GENEART AG[레겐스부르크(regensburg), 독일]에 의해 scFv 형태로 합성되었고, 이는 두 가변 도메인(서열번호 31)을 포함하기 위해 단일 DNA 서열로 허용되었다. 개인의 가변 도메인 cDNA는 PCR에 의해 상기 scFv로부터 회수되었고, 추가적으로 PCR 조립 기술을 사용하여 그들 각각의 불변 도메인 cDNA 서열의 업스트림(upstream)에 조립되었다. 최종적으로, 완전한 중쇄 및 경쇄 cDNA는 CMV 프로모터 및 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호를 운반하는 변형된 pcDNA3.1 벡터(인비트로젠, CA, 미국)에 기초한 독립적인 벡터에 결찰되었다. 경쇄 특이적 벡터는 BamHI 및 BsiWI 제한효소(restriction enzyme) 위치를 사용하여 카파 경쇄 불변 도메인 cDNA의 앞의 관심의 경쇄 가변 도메인 cDNA의 결찰에 의해 인간 카파 동종의 발현을 허용하고, 중쇄 특이적 벡터는 BamHI 및 SalI 제한효소 부위를 사용하여 인간 IGHG1 CH1, IGHG1 경첩 부위, IGHG1 CH2, 및 IGHG1 CH3 불변 도메인을 암호화하는 cDNA 서열 앞의 관심의 중쇄 가변 도메인 cDNA의 결찰을 허용하기 위해 조작되었다. 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 모두에 있어서, 분비는 BamHI 위치를 포함하는 마우스 VJ2C 리더 펩티드에 의해 촉발된다. BsiWI 제한효소 위치는 카파 불변 도메인에 위치하고; 반면에 SalI 제한효소 부위는 IGHG1 CH1 도메인에서 찾을 수 있다.
VH1/VL1 항체는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)(시그마, 북스, 스위스)를 사용하여 현탁액-적응된 HEK293-EBNA1 세포주(ATCC® 카탈로그 번호: CRL-10852)안으로 중쇄 및 경쇄 벡터의 동일한 양이 공-형질감염(co-transfecting)되어 일시적으로(transiently) 생산되었다. 일반적으로, 1 ㎖당 0.8 내지 1.2 백만 세포의 밀도의 현탁액에서 100 ㎖ 세포가 중쇄를 암호화하는 50 ㎍ 발현벡터 및 경쇄를 암호화하는 50 ㎍ 발현벡터를 포함하는 DNA-PEI 혼합물과 형질감염되었다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 숙주세포(host cell) 안으로 도입될 때, 항체는 0.1% 플루론산(pluronic acid), 4 mM 글루타민(glutamine), 및 0.25 ㎍/㎖ 게네티신(geneticin)을 포함하는 배양 배지[EX-CELL 293, HEK293-무혈청배지(serum free medium); 시그마, 북스, 스위스]에 분비되기 위해 4 내지 5일 동안의 추가적인 세포 배양에 의해 생산된다.
VH1/VL1 항체는 재조합 단백질-A 간소화 배지(streamline media)(GE 헬스케어 유럽 GmbH, 글라트부르그, 스위스)를 사용하여 무혈청 상청액으로부터 정제되었고, 분석(assay) 이전에 인산완충식염수로 바뀌어 완충되었다. 인간 OX40에의 결합은 실시예 5에 서술된 바와 같이 SPR로 측정되었다.
접합된 인간 구조형성의 복귀 돌연변이
1D4 마우스 항체로부터 CDRs의 바로 접합(straight grafting)이 인간 OX40에 결합하지 않는 후보를 초래한 이후(표 6 및 도 4), 사람 잔기(residues)가 마우스 잔기로 치환되는(substituted) 돌연변이 유발(mutagenesis)이 시작되었다. 상기 과정은 복귀-돌연변이라고 불리었고, 단클론 항체의 인간화에 있어서 가장 예측불가능한 절차였다. 이는 인간화 항체에 있어서 동시에 최소화된 잠재적 면역원성에 대한 결합력을 보존하기 위하여 얻어질 필요가 있는 마우스 항체로부터 중요한(critical) 구조형성 잔기의 동정 및 선택을 필요하게 하였다. 표 7, 표 8, 및 도 5는 마우스 및 인간 항체 구조형성 사이의 차이인 잔기(케벳 번호)를 나타낸다. CDRs의 형성에 영향을 줄 것인 잔기 또는 가변 도메인간(inter-variable domain) 포장이 특별한 관심이고, 이는 항체 결합력에 가장 영향을 줄 것이다.
CDR 형성 및/또는 가변 도메인간 포장에 가장 영향을 줄 것인 잔기를 동정하기 위하여, 가변 도메인의 VH1-VL1 쌍(pair)을 위한 3D 모델이 자동화된 모드로 설정된 구조 상동성-모델링(modelling) 서버(server) SWISS-MODEL(Arnold K et al., (2006) Bioinformatics, 22(2): 195-201; http://swissmodel.expasy.org)을 사용하여 계산되었다. 모델 분석은 CDR 부위에 대한 그들의 추정되는 영향 및/또는 중쇄-경쇄 가변 도메인 포장에 근거하여 위치의 부분집합(subset)의 선택을 허용한다. 상기 위치의 부분집합은 가변 경쇄 위치: 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56, 및 71뿐만 아니라 가변 중쇄 위치: 23, 35b, 48, 50, 60, 및 62(케벳 번호)로 구성된다. 상기 복귀 돌연변이에 더하여, VH1/VL1 항체에서 발견된 경쇄 위치 Y31은 어떤 후보에 있어서 결실되었다(deleted).
중쇄 또는 경쇄 치환(substitution)의 다양한 조합에 기초한 추가적인 인간화 후보는 상기 서술된 표준 돌연변이 유발 및 방법을 사용하여 VH1/VL1 항체 서열의 맥락에 있어서 준비되었다. 인간화 항체 후보는 실시예 5에 서술된 바와 같이 SPR로 그들의 결합력을 위해 분석되었다.
하나 또는 치환의 조합에 기초한 인간화 항체의 어떤 생산율(production yield) 및 결합 특성(binding properties)는 표 6에 나타난다. 28개의 항체 중, 9개 후보는 인간 OX40에 어떠한 결합을 나타내지 않았고, 9개의 다른 군(group)은 약하고 좋지 못한 결합을 갖는다. 인간화 항체에 근거한 VL9은 SPR에 의해 인간 OX40에 일관적으로 가장 약한 결합을 나타내었다. 오직 2개의 항체, VH6/VL9 및 VH7/VL9이 인간 OX40에 좋은 결합을 나타내었다. 두 인간화 항체는 가변 중쇄 위치: 23, 35b, 50, 60, 및 62 및 가변 경쇄 위치: 33, 34, 46, 47 및 71(케벳 번호)에 복귀 돌연변이를 갖는다. 상기 복귀 돌연변이에 더하여, VH6/VL9 및 VH7/VL9 모두 경쇄 위치 31의 제거로부터 이득을 보았다. 놀랍게도, VH7/VL9은 1D4 키메라 항체 및 VH6/VL9 변이체(variant)를 능가하는 인간 OX40에 대한 발전된 결합력을 나타냈다. 이들 인간화 항체의 결합력은 표 9에 요약되었다.
시차주사 열량측정법( differential scanning calorimetry )에 의한 선택된 인간화 항- OX40 항체의 열안정성( thermostability )
인간화 항체의 열안정성은 시차주사 열량측정법(DSC)을 사용하여 측정되었다. 단일클론 항체 녹는점 프로필(profile)은 그들 동종(Garber E & Demarest SJ (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355: 751-7)의 특징을 나타내나, FAB 단편의 중간-지점(mid-point) 녹는점 온도는 전장(full-length) IgG의 맥락에 있어서도 쉽게 동정될 수 있다. 상기 FAB 위치의 중간-지점 녹는점은 인간화 후보의 단클론 안정성을 모니터하기 위해 사용되었다.
열량 측정(calorimetric measurement)은 VP-DSC 시차주사 초소형 열량계(differential scanning microcalorimeter)[마이크로칼(MicroCal), 노샘프턴(Northampton), 영국]로 수행되었다. 세포 부피는 0.128 ㎖이고, 가열 속도는 200℃/h이었으며, 초과압(excess pressure)은 65 p.s.i로 유지하였다. 모든 항체는 PBS(pH 7.4)에 1 ㎎/㎖의 농도로 사용되었다. 항체의 몰 열용량(molar heat capacity)는 항체가 제외된 동일한 완충액을 포함하는 이중(duplicate) 샘플과의 비교에 의해 추정되었다. 부분 몰 열용량 및 녹는 곡선(melting curve)은 표준 절차를 사용하여 분석되었다. 온도기록도(thermogram)는 기준선으로 수정되었고, 농도는 소프트웨어 오리진(origin) v7.0에 있어서 비-두 상태 모델(Non-Two State model)을 사용하여 추가적으로 분석되기 전에 평균화되었다(normalized).
인간화 변이체 VH6/VL9 FAB 단편은 조작 과정을 나타내는 소형으로(compactly) 접힌 FAB 단편으로 일반적으로 관찰되는 한결같은 협력적 전개(cooperative unfolding)와 함께 모양(shape) 및 전개(amplitude)가 일치하는 76.3 ℃에서 단일 변천(single transition)을 보여주고, 이는 FAB 안정성을 유지하기 위한 조작 과정이 성공적이었음을 나타낸다. 전반적인 인간화 변이체는 좋은 열 안정성을 나타낸다.
인간화 항 인간 OX40 항체
인간화 항체
변이체(IGHG1)		 서열번호 돌연변이 VH/VL 일시적 발현
(㎎/ℓ)		 인간 OX40에
대한 결합
VH1/VL1 32, 39 N.A/N.A 40 안함
VH1/VL2 32, 40 N.A/L33M 21 안함
VH1/VL3 32, 41 N.A/F71Y 17 안함
VH2/VL1 33, 39 T23S/N.A 13 안함
VH2/VL2 33, 40 T23S/L33M 17 안함
VH2/VL3 33, 41 T23S/F71Y 14 안함
VH3/VL1 34, 39 R50H/N.A 23 안함
VH3/VL2 34, 40 R50H/L33M 22 안함
VH3/VL3 34, 41 R50H/F71Y 18 안함
VH4/VL4 35, 42 T23S-R50H/L33M-F71Y 15 거의 안함
VH4/VL9 35, 47 T23S-R50H/Y31결실-L33M-A34H-L46P-L47W-F71Y 3 약함
VH5/VL4 36, 42 T23S-R50H-S60N/L33M-F71Y 15 거의 안함
VH5/VL5 36, 43 T23S-R50H-S60N-S62A/L33M-L46P-L47W-F71Y 2 거의 안함
VH5/VL6 36, 44 T23S-R50H-S60N-S62A/E1Q-L33M-L46P-L47W-E71Y 2 거의 안함
VH5/VL9 36, 47 T23S-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-A34H-L46P-L47W-F71Y 6 약함
VH6/VL5 37, 43 T23S-S35bG-R50H-S60N-S62A/L33M-L46P-L47W-F71Y 0 N.D.
VH6/VL6 37, 44 T23S-S35bG-R50H-S60N-S62A/E1Q-L33M-L46P-L47W-E71Y 0.5 N.D.
VH6/VL7 37, 45 T23S-S35bG-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-F71Y 14 N.D.
VH6/VL8 37, 46 T23S-S35bG-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-A34H-F71Y 7 N.D.
VH6/VL9 37, 47 T23S-S35bG-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-A34H-L46P-L47W-F71Y 3.5 잘함
VH6/VL10 37, 48 T23S-S35bG-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-R54L-T56S-F71Y 0.5 N.D.
VH6/VL11 37, 49 T23S-S35bG-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-A34H-R54L-T56S-F71Y 5.5 N.D.
VH7/VL5 38, 43 T23S-S35bG-I48L-R50H-S60N-S62A/L33M-L46P-L47W-F71Y 1 N.D.
VH7/VL6 38, 44 T23S-S35bG-I48L-R50H-S60N-S62A/E1Q-L33M-L46P-L47W-E71Y 1 N.D.
VH7/VL7 38, 45 T23S-S35bG-I48L-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-F71Y 1.5 약함
VH7/VL8 38, 46 T23S-S35bG-I48L-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-A34H-F71Y 10 약함
VH7/VL9 38, 47 T23S-S35bG-I48L-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-A34H-L46P-L47W-F71Y 3 잘함
VH7/VL11 38, 49 T23S-S35bG-I48L-R50H-S60N-S62A/Y31결실-L33M-A34H-R54L-T56S-F71Y 11.5 약함/잘함
1 D4 및 인간 수용체 중쇄 가변 IGHV 2-70*10 구조형성의 비교
케벳 위치 1D4 CDR 접합된 IGHV 2-70*10
10 G A
11 I L
12 L V
13 Q K
15 S T
19 S T
23 S T
35b G S
41 S P
44 G A
48 L I
50 H R
60 N S
62 A S
65 S T
66 G R
79 F V
81 K T
82 I M
82a A T
82b S N
82c Y M
84 T P
85 T V
1 D4 및 인간 수용체 경쇄 가변 IGKV 3-11*01 구조형성의 비교
케벳 위치 1D4 CDR 접합된 IGKV 3-11*01
1 Q E
10 I T
13 A L
18 K R
19 V A
21 M L
22 T S
33 M L
34 H A
42 S Q
43 S A
45 K R
46 P L
47 W L
54 L R
56 S T
58 V I
70 S D
71 Y F
72 S T
76 N S
77 R S
78 V L
80 A P
83 A F
85 T V
선택된 인간화 및 키메라 항- OX40 항체의 결합 특징
인간화 변이체 서열번호 kon(I/Ms) koff(I/s) KD(nM)
1D4 키메라 50, 51 3.4 x 104 3.08 x 10-3 91
VH6/VL9 37, 47 3.54 x 104 3.56 x 10-3 101
VH7/VL9 38, 48 4.45 x 104 3.12 x 10-3 70
실시예 7:
인간화 항- OX40 항체의 항원결정기 특징
인간화 항-OX40 항체의 항원결정기를 특징짓기 위하여, VH6/VL9 항체는 다양한 인간-랫트(rat) OX40 키메라 단백질을 사용하여 인간 OX40 세포외 부위의 도메인을 결정하기 위하여 지도화되었다(mapped).
인간- 랫트 OX40 키메라 단백질의 준비 및 ELISA
랫트 및 인간-랫트 OX40 단백질은 실시예 1에 서술된 방법을 따라 Fc 융합 단백질로서 구성되었다. ELISA를 위하여 OX40 단백질은 PBS에 높은(high) 결합 96-웰 플레이트(코아스타)에 2 ㎍/㎖로 4℃에서 하룻밤동안 코팅되었다. 플레이트는 2% 소혈청 알부민(BSA)가 포함된 PBS로 VH6/VL7 항체 또는 동종 대조군 항체와 배양하기 전에 전처리되었다. 그리고나서, 플레이트는 세척되었고, 염소-항 인간 IgF(ab')2 단편 특이적-HRP[잭슨 이뮤노리서치 유럽 Ltd(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd), 뉴마켓(Newmarket), 영국]과 함께 배양되었다. 세척 후, 플레이트는 항체 결합을 나타내기 TMB 기질(바이오래드 라보레터리 AG, 라이나흐, 스위스)과 함께 배양되었다. 반응은 2M H2SO4를 첨가하여 정지되었고, 흡광도(optical density)는 시너지 HT2 분광광도계(Synergy HT2 spectrophotometer)(바이오테크, 미국; 유통회사: WITTEC AG, 리토, 스위스)로 450 nM에서 읽혔다.
결과
이의 기원(origin)에 관계 없이, OX40 세포외 부위는 도메인 1, 2, 3 및 4(Compaan DM & Hymowitz SG (2006) Structure, 14(8): 1321-30)로서 나타내지는 네개의 구조적 모듈(module)로 나뉘었다. 인간 OX40의 세포외 부위에 상응하는(인간 TNFRSF4의 29 내지 214 아미노산, 유니프롯 P43489 서열에 따른 번호) 키메라 OX40 단백질은 인간 및 랫트 서열 사이의 네 도메인의 하나 또는 그 이상의 교환에 의해 구성되었다. 예를 들어, 키메라 RHRR OX40 단백질은 랫트 OX40 세포외 부위에 상응하고, 여기서 두번째 도메인은 상응하는 인간 도메인 서열로 교체되었다.
결합 ELISA는 인간 OX40 세포외 부위(서열번호 11의 HHHH로 축약), 랫트 OX40 세포외 부위(서열번호 52의 RRRR로 축약), 네개의 인간-랫트 키메라 단백질: RHRR(서열번호 53), HRRR(서열번호 54), HHRR(서열번호 55), 및 RRHH(서열번호 56)에서 VL6/VL9의 반응성(reactivity)을 시험하기 위하여 수행되었다. 상기 ELISA의 결과는 도 7에 나타난다. 상기 항원결정기 지도화 실험의 전제조건으로서, VH6/VL9 항체는 랫트 OX40 단백질이 아닌 인간 OX40 단백질에 결합하는 것을 나타냈고, 이는 랫트 OX40과 교차반응성(cross-reactivity)가 없음을 나타낸다. 이는 VH6/VL9 항체가 HRRR 또는 RRHH가 아닌 RHRR 및 HHRR에서 경계를 이룸을 나타내고, 이는 VH6/VL9 항원결정기가 인간 OX40 세포외 부위의 두번째 도메인 내에 지도화됨을 나타낸다.
실시예 8:
VH6 / VL9 항체가 죽임( killing ) 및 차단 매커니즘(mechanism)에 의해 인간 혼합 림프구 반응을 차단한다.
시험관 내에서(in vitro) 면역 반응을 억제하기 위한 VH6/VL9의 능력(potency)이 편도(oneway) 동종의(allogeneic) 혼합된 림프구 반응(MLR)에 있어서 시험되었다. MLR은 동종의 T 세포 활성 및 분열(proliferation)의 시험관 내 모델이다(O'Flaherty E et al., (2000) Immunology, 100(3): 289-99; DuPont B & Hansen JA (1976) Adv. Immunol. 23: 107-202). 관련되지 않은 두 기증자의 말초혈액단핵구(PBMCs)가 혼합될 때, T 세포는 동종의 주조직적합성(major histocompatibility, HMC) 분자의 인식을 통해 활성화된다. 상기 활성은 T 림프구의 분열을 가져온다. MLR 반응은 T 세포를 표적으로 하는 면역억제제(immunosuppressive drugs)의 영향을 증명하기 위하여 광범위하게 사용된다(Bromelow KV et al., (2001) J. Immunol. Methods, 247(1-2): 1-8). 사이클로스포린(cyclosporine)과 같은 면역억제제는 주로 T 세포 활성을 억제함으로써 작용한다. VH6/VL9 항체에 의한 차단 효과외에, MLR의 억제에 있어서 항체 의존적인 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)과 같은 세포독성 기전(cytotoxic mechanism)의 분배 또한 연구되었다. VH6/VL9 항체의 세 다른 항체 포맷(format)이 본 분석에서 수행되었다: IGHG1 포맷(VH6/VL9으로 본 명세서에 참조됨), 비푸코실화된 IGHG1(IgG1) 포맷(비푸코실화된 VH6/VL9으로 본 명세서에 참조됨), 및 IGHG4(IgG4) 포맷(VH6/VL9 IGHG4 S228P로서 본 명세서에 참조됨). IGHG1(IgG1) 항체는 ADCC와 같이 세포독성 기전을 위한 능력이 없음이 알려져 있다. 비푸코실화된 IGHG1 항체는 자연살해 세포(natural killer cell, NK cell)과 같은 세포독성 세포에 발현되는 FcγRIIIa를 위한 높은 결합력때문에 증가된 ADCC 활성이 존재하는 것이 알려져 있다(Mizushima T et al., (2011) Genes Cells, 16(11): 1071-80). 반면에, IGHG4(IgG4) 항체는 ADCC와 같이 Fc-매개된 세포독성 기전을 갖지 않음이 알려져 있다.
VH6 / VL9 항체의 포맷화( formatting )
S228P 치환을 갖는 IGHG4 면역글로불린 포맷화는 IGHG1 CH1, IGHG1 경첩부위, IGHG1 CH2, 및 IGHG1 CH3 불변 도메인을 암호화하는 cDNA 서열이 S228P 치환을 갖는 IGHG4 CH1, IGHG4 경첩부위를 암호화하는 cDNA 서열로 교체됨으로써 달성되었고, 중쇄 특이적 벡터에 있어서 IGHG4 CH2 및 IGHG4 CH3 불변 도메인은 실시예 6에 서술되었다. S228P 치환은 표준 PCR 돌연변이 유발 기술에 의해 인간 IGHG4 중쇄 cDNA 주형(template)으로 도입되었다. 상기 결과의 중쇄는 서열번호 57을 갖는다. 비푸코실화된 VH6/VL9 IGHG1 항체의 생산은 출원번호 WO2010/095031의 실시예 14에 서술된 프로토콜(protocol)을 따랐다.
혼합 림프구 반응
두 다른 기증자로부터의 혈액이 항-응고제(자르슈테트, 넘브레흐, 독일)로서 구연산염과 함께 세개의 10 ㎖ S-모노베떼에 수집되었다. 두 기증자의 말초혈액단핵구(PBMCs)는 50 ㎖ 블러드-셉-필터 튜브(유통회사: 브런슈윅, 바젤, 스위스)fmf 사용하여 제조사의 설명에 따라 정제되었다. 세포는 FBS 없이 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI, PAA 라보레터리, 파싱, 오스트리아) 배지로 두번 세척되었다. 두 기증자의 자극세포(stimulator cell)는 50 ㎍/㎖ 마이토마이신 C(mitomycin C)(시그마-알드리치 케미 GmbH, 북스, 스위스)과 함께 37℃에서 30분간 배양되어 제조되었다. 그리고나서 세포는 FBS 없는 RPMI로 3회 세척되었고, 10% FBS(PAA 라보레터리, 파싱 오스트리아), 2 mM L-글루타민(론자, 루뱅, 벨기에), 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(바이오크롬 AG, 베를린, 독일)이 포함된 RPMI에 1 x 106 cell/㎖로 재현탁되었다. 반응세포(responder cell)는 96웰 U 바닥 마이크로플레이트(TPP, 트라사디겐, 스위스)에 10% FBS, L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 RPMI에 재현탁되었다. 50'000 자극세포 및 80'000 반응세포가 각 웰에 100 ㎕의 최종 부피로 분배되었다. 100 ㎕ 항체 희석액(또는 배지만)이 웰에 추가되었다. 플레이트는 7일 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 마지막 18시간 동안, 세포는 0.5 μCi 3H 티미딘(펄킨 엘머, 바젤, 스위스)과 함께 펄스되었다. 세포는 필터맷 필터(filtermat filter)(펄킨 엘머)에 모아졌고, 삽입된 방사성은 왈락 베타 카운터로 정량화되었다.
결과
도 8에 나타난 결과는 VH6/VL9 항체가 EC50 값이 100 ng/㎖ 주위에서 두 다른 개인(반응자)을 위해 효율적으로 MLR을 억제할 수 있음을 증명한다. 상기 결과는 또한 사용된 항체 포맷 의존적인 다른 반응 및 차단 및 세포독성 기전의 분배에 있어서 차이점이 다른 개인의 MLR에 있어서 관찰되었다.
반응자 1의 T 세포의 반응성은 IGHG1 및 IGHG4 포맷에 의해 유의적으로 억제되었고, 이는 세포독성 기전이 반응자 1에게 위협적이지 않음을 나타낸다(도 8a). 반면에, IGHG4 포맷은 높은 농도에서 반응자 2로부터의 MLR을 오직 매우 약하게 차단할 수 있고, 낮은 농도에서는 이의 효과가 매우 빠르게 사라지며, 반면에 IGHG1 포맷은 60% 이상의 억제를 달성할 수 있고, 이를 통하여, 반응자 2에서는, 살해 기전(killing mechamism)이 대부분의 억제효과를 위한 이유임을 확인하였다(도 8b).
MLR 반응에 있어서 T 세포의 활성, 분열 및 생존(survival)의 사실로부터 발생할 수 있는 작용기작(mode of action)에 있어서 상기 차이는 개인 사이의 OX40 공자극(costimulatory) 신호 의존적으로 변하기 쉽고, 이는 동종 반응성의 확장 및 가능한 다른 공자극 신호에 의존적이다. OX40-유래한 공자극 신호에 매우 약하게 의존적인 개인을 위하여, ADCC 기전에 의한 활성화된 T 세포의 제거(elimination)가 VH6/VL9의 활성의 주요 기전이다.
놀랍게도, 비푸코실화된 IGHG1 포맷은 두 반응자에서 MLR을 억제하기 위한 매우 잠재적인 능력을 나타내었다. 상기 관찰은 차단 기전이 MLR의 억제를 달성하기에 충분함에도 불구하고 사실로 강조되었고, 살해 기전의 추가 또는 증대(enhancement)는 환자의 OX40 공자극 상태(status)에 관계 없이, 예를 들어 환자가 낮은 OX40 발현 수준을 가질때, OX40 매개된 장애의 치료에 있어서 부분적으로 유용하다.
실시예 9:
VH6 / VL9 항체가 대숙주성 이종이식편병( xenogeneic graft - versus - host - disease )
이종이식편 숙주반응(xenogeneic versus host reaction, GVH reaction)은 인간 환자에 있어서 골수이식(bone marrow transplant) 후에 관찰되는 대숙주성 동종이식편병(allogeneic graft versus host disease, GVHD)의 모델이다. GVH 반응은 동종 또는 이종 MHC 인식의 결과로서 숙주 환경을 공격하는 이식된 면역 세포에 의해 매개되는 급성 면역 반응(acute immune response)이다(Murphy WJ et al., (1996) Semin. Immunol. 8(4): 233-41). T 림프구는 GVH 반응의 주요 작동인자 세포이다. VH6/VL9 항체의 면역억제 효능은 인간 PBMCs로 재구성된(reconstitution) SCID 마우스에 기초한 이종 GVHD 모델로 시험되었다. 상기 모델에 있어서, 인간 PBMCs 및 단일(primarily) 림프구는 마우스 숙주세포에 대하여 강한 반응을 시작했다. 반응은 체중 감소와 함께 피부 및 창자의 심각한 염증을 특히 유발시켰다. 상기 모델과 가장 관련있는 해독(readout)은 동물의 생존이다.
방법
동물(SCID 마우스)는 3,000만 인간 PBMCs로 재구성되기 전에 복강내(intraperitoneally)에 거의 치사량으로(sub-lethally) 방사선 조사되었다. 마우스는 또한 TM베탈(TMbetal) 항체를 일주일에 두번 주사하여 마우스 NK를 격감시켰다. VH6/VL9 항체, Enbrel® 또는 운송수단(vehicle)의 처리는 5개의 연속된 투여량(five consecutive doses)으로 주 1회 정맥내로 주사되었고, 이는 PBMC 주입 2일 전에 시작되었다. 동물은 운송수단(PBS) 또는 VH6/VL9 항체 각각 10 ㎎/㎏ 또는 1 ㎎/㎏, 또는 Enbrel®(인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 인간 가용성 TNF 수용체 2인 융합 단백질) 8 ㎎/㎏로 모두 처리되었다. 동물은 체중감소, 설사, 털의 양상(fur aspect) 및 일반적인 행동을 포함하는 GVHD 증상이 일주일에 세번 확인되고 점수를 매겨졌다. 동물은 만약 증상이 너무 심각해졌다고 고려되면 윤리적으로 희생되었다.
결과
도 9는 VH6/VL9 항체가 낮은 1 ㎎/㎏ 투여량에도 불구하고 GVHD 반응을 매우 강하게 억제하는 것을 나타낸다. 놀랍게도, VH6/VL9 항체는 인간의 GVHD 치료로 알려진 Enbrel®의 효과를 넘어선 것을 증명하였다(Xhaard A et al., (2011) Bull. Cancer, 98(8): 889-99; Simpson D (2001) Expert Opin. Pharmacother. 2(7): 1109-17). VH6/VL9 항체가 1 또는 10 ㎎/㎏으로 처리된 동물의 평균 생존시간은 운송수단을 처리한 군과 비교하여 4배 길었고, Enbrel®과 비교하여 2배 길었다(표 10). 또한, 상기 결과는 반대의(agonistic) 항-OX40 항체가 동종 마우스 GVHD 모델에 있어서 GVHD를 악화시킨다는 보고 이후에, VH6/VL9 항체가 반대 활성(agonistic activity)를 갖지 않음을 강조하고, 상기 이벤트는 본 연구에서 관찰되지 않았다(Valzasina B et al., (2005) Blood, 105(7): 2845-51; Blazar BR et al., (2003) Blood, 101(9): 3741-8).
지정된 치료군의 평균 생존 시간(일)
처리 운송수단 Enbrel® 1D4(1 ㎎/㎏) 1D4(10 ㎎/㎏)
평균 생존(일) 11.5 20.5 42 47.5
운송수단: 오직 PBS. 1D4: GBR 830-1D4 항체; Enbrel®은 임상제품이다.
<110> Glenmark Pharmaceutical SA <120> Antibodies that bind to OX40 and their uses <130> 17741/US <150> US 61/506,491 <151> 2011-07-11 <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ala Thr Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp 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acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180 tataacacag ccctgaagag cgggctcaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggtc 240 ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactaca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300 gactgggacg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 10 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 cagattgtac tgactcagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcaacagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg agataaaa 318 <210> 11 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His 1 5 10 15 Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln 20 25 30 Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp 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Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <400> 82 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <400> 83 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <400> 84 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 85 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <400> 85 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr 20 25 30 Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 86 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <400> 86 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 87 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <400> 87 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <400> 88 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 89 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <400> 89 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (67)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) CDR1, 및/또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) CDR1, 및/또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 길항제(antagonist) 항체 또는 이들의 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하고; 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 쥐(murine) 항체, 키메라(chimeric) 항체 또는 인간화(humanized) 항체인 항체 또는 이들의 단편.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 인간화 항체인 항체 또는 이들의 단편.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역(variable region) 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 7의 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 35, 36, 37 및 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 중쇄 서열은 서열번호 35, 36, 37 또는 38로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 서열의 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 비-CDR 영역을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 58, 59, 79 및 80으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 58, 59, 79 및 80으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 IGHV2-70*10 (서열번호 19), IGHV2-70*01 (서열번호 20), IGHV2-70*13 (서열번호 21), IGHV2-5*09 (서열번호 22), 및 IGHV2-70*11 (서열번호 23)로 구성된 군으로부터 선택된 인간 유전자의 산물이거나 또는 인간 유전자로부터 유래한 중쇄 가변구조형성영역(variable framework region)을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 인간 유전자 IGHV2-70*10 (서열번호 19)의 산물이거나 또는 유래된 중쇄 가변구조형성영역을 포함하고 및 여기서 중쇄 가변구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 중쇄 가변구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하고 및 여기서 중쇄 가변 구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 중쇄 가변구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 아미노산 변형은 23, 35b, 48, 50, 60, 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원(member)의 아미노산 위치는 케벳 번호(Kabat numbering)에 따라 나타내어지는 인간화 항체 또는 이들의 단편.
  15. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 아미노산 변형은 23S, 35bG, 48L, 50H, 60N, 및 62A로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화 항체 또는 이들의 단편.
  16. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  17. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 8의 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  18. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 45, 46, 47 및 49로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 경쇄 서열은 서열번호 45, 46, 47 또는 49로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 서열의 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR에 적어도 80% 일치하는 비-CDR 영역을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  20. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 60, 86, 87 및 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  21. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 60, 86, 87 및 89로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역에 적어도 80% 일치하는 경쇄 가변영역 서열의 비-CDR 영역을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  22. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 IGKV3-11*01 (서열번호 24), IGKV1-39*01 (서열번호 25), IGKV1D-39*01 (서열번호 26), IGKV3-11*02 (서열번호 27) 및 IGKV3-20*01 (서열번호 28)로 구성된 군으로부터 선택된 인간 유전자의 산물이거나 또는 인간 유전자로부터 유래된 경쇄 가변구조형성영역을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  23. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 인간 유전자 IGKV3-11*01 (서열번호 24)의 산물이거나 또는 유래된 경쇄 가변구조형성영역을 포함하고 및 여기서 경쇄 가변구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 경쇄 가변영역의 상응하는 구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  24. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고 및 여기서 경쇄 가변구조형성영역은 상응하는 쥐 항체의 상응하는 경쇄 가변구조형성영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 아미노산 변형은 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56, 및 71로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화 항체 또는 이들의 단편.
  26. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 아미노산 변형은 1Q, 33M, 34H, 46P, 47W, 54L, 56S, 및 71Y로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 각 군 구성원의 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화 항체 또는 이들의 단편.
  27. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 아미노산 변형은 아미노산 위치 31에 아미노산 결실(deletion)을 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 케벳 번호에 따라 나타내어지는 인간화 항체 또는 이들의 단편.
  28. 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은:
    (a) 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열; 및
    (b) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열
    을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  29. 제 2항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은:
    (a) 서열번호 58 또는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 서열; 및
    (b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 서열
    을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 중쇄 CDRs 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDRs는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄 불변영역(constant regions)을 추가적으로 포함하는 항체 또는 이들의 단편.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 인간 중쇄 불변영역은 IGHG1, 비푸코실화된(non fucosylated) IGHG1 및 IGHG4로 구성된 인간 면역글로블린(immunoglobulins)의 군으로부터 선택된 항체 또는 이들의 단편.
  33. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 1가(monovalent) 항체인 항체 또는 이들의 단편.
  34. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 전장 항체인 항체 또는 이들의 단편.
  35. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, 이특이성(bispecific) 단쇄(single chain) Fv 이량체, 디아체(diabodies), 트리아체(triabodies) 및 동일한 또는 다른 항체에 유전적으로 융합된 scFv로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편인 항체 또는 이들의 단편.
  36. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 모 항체(parent antibody)의 Fc 영역에 관련이 있는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 반면, 변이체 Fc 영역을 포함한 항체는 모 항체와 비교하여 변화된 효과기 기능을 보이는 항체 또는 이들의 단편.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 110 nM 또는 그 이하의 친화도(KD)를 가지는 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편.
  38. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 적어도 75%의 상응하는 키메라 항체의 OX40 결합친화도(KD)를 보유하는 항체 또는 이들의 단편.
  39. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 단편은 상응하는 키메라 항체와 비교했을 때 동일한 또는 더 높은 OX40 결합친화도(KD)를 가지는 항체 또는 이들의 단편.
  40. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 75℃보다 높은 FAB 단편 열안정성 온도를 가지는 항체 또는 이들의 단편.
  41. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 항체로서 인간 OX40에 결합하고 및 동일한 항원결정기(epitope)에 결합하는 항체 또는 이들의 단편.
  42. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 항체에 의해 결합되는 인간 OX40 세포외 도메인(extracellular domain)에 있는 항원결정기.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 인간 OX40 세포외 도메인은 도메인 2(서열번호 76)인 항원결정기.
  44. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편을 암호화 하는 분리된 핵산.
  45. 서열번호 61 또는 62의 뉴클레오티드산(nucleotide acid) 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 암호화하는 DNA; 및/또는 서열번호 63의 뉴클레오티드산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 제 44항에 따른 분리된 핵산.
  46. 제 44항 또는 제 45항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  47. 제 44항 또는 45항에 따른 분리된 핵산 또는 제 46항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포(host cell).
  48. 제 47항에 따른 숙주세포를 배양하여 핵산이 발현되고, 항체가 생산되는 것을 포함하는 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편을 생산하는 방법.
  49. 제 44항 또는 제 45항에 따른 분리된 핵산에 의해 암호화된 인간 OX40에 결합하는 항체 또는 이들의 단편.
  50. 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier)를 포함하는 조성물.
  51. 치료제에 결합된 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).
  52. 제 51항에 따른 면역접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  53. 제 50항 또는 제 52항에 있어서 다른 약학적 활성제를 추가적으로 포함하는 조성물.
  54. 치료학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 OX40 매개된 장애를 치료하기 위한 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 OX40 매개된 장애는 감염(infections)(바이러스에 의한, 박테리아에 의한, 균류에 의한 및 기생충에 의한), 감염과 연관이 있는 내독소성 쇼크(endotoxic shock), 관절염(arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 천식(asthma), COPD, 골반 염증성 질환(pelvic inflammatory disease), 알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 페이로니병(Peyronie's Disease), 코이헥 질환(coehac disease), 담낭 질환(gallbladder disease), 모소 질환(Pilonidal disease), 복막염(peritonitis), 건선(psoriasis), 혈관염(vasculitis), 수술 유착(surgical adhesions), 뇌졸중(stroke), 제 1형 당뇨병(Type I Diabetes), 라임병(lyme disease), 관절염(arthritis), 수막뇌염(meningoencephalitis), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 루푸스(lupus) (전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus)과 같은) 및 길랑-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome)과 같은 중추 및 말초 신경계의 면역 매개된 염증성 장애, 아토피성 피부염(Atopic dermatitis), 자가면역성 감염(autoimmune hepatitis), 섬유성 폐렴(fibrosing alveolitis), 기능항진증(Grave's disease), IgA 신장병(IgA nephropathy), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura), 메니에르병(Meniere's disease), 천포창(pemphigus), 원발담즙성간경변(primary biliary cirrhosis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 다른 자가면역 장애, 췌장염(pancreatitis), 트라우마(trauma) (수술), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD), 이식거부(transplant rejection), 죽상동맥경화증(atherosclerosis)뿐만 아니라 심근경색증(myocardial infarction)과 같은 허혈성 질환(ischaemic diseases)을 포함하는 심혈관계 질환(cardiovascular disease), 혈관내 응고(intravascular coagulation), 골흡수(bone resorption), 골다공증(osteoporosis), 골관절염(osteoarthritis), 치주염(periodontitis), 저염산증(hypochlorhydia) 및 시신경척수염(neuromyelitis optica)으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  56. 제 54항에 있어서, 상기 OX40 매개된 장애는 감염(infections)(바이러스에 의한, 박테리아에 의한, 균류에 의한 및 기생충에 의한), 감염과 연관이 있는 내독소성 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, 기관지염(bronchitis), 인플루엔자(influenza), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 폐렴(pneumonia), COPD, 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 잠재 섬유성 폐포염(cryptogenic fibrosing alveolitis, CFA), 특발성 섬유성 간질성 폐렴(idiopathic fibrosing interstitial pneumonia), 폐기종(emphysema), 골반 염증성 질환, 알츠하이머 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병, 코이헥 질환, 담낭 질환, 모소 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, 제 1형 당뇨병, 라임병, 관절염, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 루푸스 (전신홍반성낭창과 같은) 및 길랑-바레 증후군과 같은 중추 및 말초 신경계의 면역 매개된 염증성 장애, 아토피성 피부염, 자가면역성 감염, 섬유성 폐렴, 기능항진증, IgA 신장병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 메니에르병, 천포창, 원발담즙성간경변, 유육종증, 경피증, 베게너육아종증, 다른 자가변역 장애, 췌장염, 트라우마 (수술), 이식편대숙주병(GVHD), 이식거부, 죽상동맥경화증뿐만 아니라 심근경색증과 같은 허혈성 질환을 포함하는 심혈관계 질환, 혈관내 응고, 골흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 저염산증 및 시신경척수염으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  57. 제 54 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 OX40의 낮은 발현 수준을 가지는 방법.
  58. 제 54 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 중쇄 불변영역 IGHG1을 가지는 항체와 비교하여 증강된 세포독성을 가지는 방법.
  59. 약제로서 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편의 용도.
  60. OX40 매개된 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편의 용도.
  61. 제 60항에 있어서, 상기 OX40 매개된 장애는 GVHD이고 및 여기서 항체 또는 이들의 단편은 Enbrel®보다 GVHD를 억제하는데 더 효과적인 항체 또는 이들의 단편의 용도.
  62. 약제로서 이용을 위한 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편.
  63. OX40 매개된 장애를 치료하기 위한 방법에 있어서 이용을 위한 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편.
  64. OX40 매개된 장애는 GVHD이고 및 여기서 항체 또는 이들의 단편은 Enbrel®보다 GVHD를 억제하는데 더 효과적인, OX40 매개된 장애를 치료하기 위한 방법에 있어서 이용을 위한 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편.
  65. OX40 매개된 장애의 치료를 위한 제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편, 제 50항, 제 52항 또는 제 53항에 따른 조성물 또는 제 51항에 따른 면역접합체를 포함하는 제조물품.
  66. OX40 매개된 장애의 치료를 위한 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 단편, 제 50항, 제 52항 또는 제 53항에 따른 조성물 또는 제 51항에 따른 면역접합체를 포함하는 키트.
  67. 하기 단계를 포함하는, OX40의 저발현 수준을 가지는 환자를 검출하기 위한 시험관 내(in vitro) 스크리닝 방법:
    (a) 환자 혈액 샘플로부터 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)를 정제하고;
    (b) PBMCs가 유동 세포측정 분석(flow cytometric analysis)이 되며; 및
    (c) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에서 OX40 양성 세포의 수를 검증하고 및 대조 수준과 이 수를 비교하는 단계.
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