KR20210069058A - 항-ox40 항체, 이의 항원-결합 단편 및 약학적 용도 - Google Patents

항-ox40 항체, 이의 항원-결합 단편 및 약학적 용도 Download PDF

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청 랴오
주펑 수
자화 장
신 예
리안샨 장
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지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 항-OX40 항체, 이의 항원-결합 단편 및 약학적 용도를 제공한다. 추가로, 본 발명은 항-OX40 항체 및 이의 항원-결합 단편의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체 및 인간화된 항체를 제공하고, 또한 상기 항-OX40 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 암 치료용 약물로서의 이의 용도도 제공한다.

Description

항-OX40 항체, 이의 항원-결합 단편 및 약학적 용도
본원은 2018년 9월 26일에 출원된 제201811128669.3호 및 2018년 11월 26일에 출원된 제201811417666.1호의 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 생물의약의 분야에 속하고 항-OX40 항체, 이의 항원-결합 단편, 키메라(chimera) 항체, 항-OX40 항체의 CDR 영역을 포함하는 인간화된 항체, 및 항-OX40 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물, 및 항암제로서 이들의 용도에 관한 것이다.
암은 장기간 동안 인간 사회가 직면하는 심각한 건강 도전과제이다. 퍼진 고형 종양의 경우, 전통적인 수술, 화학요법 및 방사선요법은 통상적으로 제한된 효과를 나타낸다.
종양 면역요법은 종양 요법의 분야에서 꾸준히 뜨거운 쟁점이다. 최근 연구는 항-종양 T 세포의 기능의 향상이 암을 무력화시키는 데 이용될 수 있음을 입증하였다. 종양 세포는 주로 조절 T 림프구에 의해 매개된 능동 면역 관용을 유도함으로써 면역 시스템으로부터 "탈출"한다는 것을 보여주는 많은 증거들이 있다(Treg; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241:104-118). 따라서, 이펙터 T 림프구(Teff)와 관용유발성 Treg 사이의 균형은 효과적인 항-종양 면역요법에 필수적이다. 그러므로, 효과적인 항-종양 면역 반응은 종양 특이적 Teff의 이펙터 기능을 향상시키고, 및/또는 종양 특이적 Treg의 억제 기능을 감소시킴으로써 수득될 수 있다.
CD134(OX40) 수용체는 이 반응을 매개하는 핵심 수용체인 것으로 밝혀졌다(Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4:420-431).
OX40은 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리의 구성원이고 세포 표면 상에서 발현된 약 50 kDa의 분자량을 갖는 당단백질이다. OX40의 세포외 리간드 결합 도메인은 4개의 시스테인 풍부 도메인(CRD)으로 구성된다. OX40의 천연 리간드는 OX40L(CD252)이고, OX40과 OX40L은 OX40-OX40L 복합체를 형성한다.
OX40은 주로 활성화된 T 세포 상에서 발현되고, OX40은 활성화 후 24시간 내지 72시간 이내에 발현되는 이차 보조자극 분자이다. OX40의 리간드인 OX40L은 주로 활성화된 항원 제시 세포 상에서 발현된다. OX40을 발현하는 T 림프구는 다양한 인간 악성 종양들 및 암들을 갖는 환자들의 배액 림프절에 존재하는 것으로 확인되었다. 중증 복합 면역결핍(SCID)의 마우스 모델에서, OX40 결합 도메인과 OX40L 결합 도메인의 상호작용은 항-종양 면역을 향상시킴으로써, 다양한 인간 악성 종양 세포주들, 예컨대, 림프종, 전립선암, 결장암 및 유방암의 종양 성장 억제를 야기할 수 있다.
현재, 많은 국제적인 제약회사들은 OX40에 대한 단일클론 항체를 개발하고 있다. OX40 항체는 특정 자극을 통해 면역을 활성화시키고, 종양에 대한 환자 자신의 면역 시스템을 개선하고, 종양 세포의 사멸이라는 목적을 달성한다. 관련 특허는 예컨대, 국제 특허출원 공개 제WO2013038191호, 국제 특허출원 공개 제WO2015153513호, 국제 특허출원 공개 제WO2016179517호, 국제 특허출원 공개 제WO2017096182호, 중국 특허출원 제CN110078825A호, 국제 특허출원 공개 제WO2016196228호 등이다. 지금까지, 아스트라제네카(AstraZeneca) 및 BMS와 같은 회사들에 의해 개발된 항-OX40 항체들은 II 상 임상시험 중이고, 제넨텍(Genentech) 및 GSK와 같은 회사들의 관련 제품도 임상시험 중이다.
그러나, 여전히 치료 효과의 관점에서 상기 의약들을 개선할 필요성이 있다. 따라서, 높은 선택성, 높은 친화성 및 유리한 효능을 갖는 항-OX40 항체를 더 개발할 필요가 있다.
본 발명은 인간 OX40에 특이적으로 결합하고 하기 표시된 CDR들을 포함하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다:
(ⅰ) 각각 서열번호 3, 4 및 5로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 3, 4 및 5로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체; 및/또는
각각 서열번호 6, 7 및 8로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 6, 7 및 8로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 LCDR 변이체;
특히, 각각 서열번호 3, 4 및 5로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
(ⅱ) 각각 서열번호 11, 12 및 13으로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 11, 12 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체; 및/또는
각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 LCDR 변이체;
특히, 각각 서열번호 11, 12 및 13으로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
(ⅲ) 각각 서열번호 11, 33 및 13으로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 11, 33 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체; 및/또는
각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 LCDR 변이체;
특히, 각각 서열번호 11, 33 및 13으로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
(ⅳ) 각각 서열번호 11, 34 및 13으로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 11, 34 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체; 및/또는
각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 LCDR 변이체;
특히, 각각 서열번호 11, 34 및 13으로 표시된 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3.
일부 실시양태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린(murine) 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 또는 이의 단편; 특히, 인간화된 항체이다.
일부 실시양태에서, 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편의 CDR들(3개의 중쇄 CDR들 및 3개의 경쇄 CDR들을 포함함)은 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 포함하도록 허용된다(즉, CDR 변이체). CDR 변이체는 친화성 성숙 방법에 의해 수득된다.
일부 실시양태에서, OX40에 대한 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편의 친화성(KD)은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만이다.
일부 실시양태에서, 뮤린 항체는 하기 표시된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(ⅰ) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되거나; 서열번호 1에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖고; 및/또는
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되거나; 서열번호 2에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖거나;
(ⅱ) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시되거나; 서열번호 9에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖고; 및/또는
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시되거나; 서열번호 10에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간화된 항체는 인간 생식세포주 또는 이의 돌연변이체 서열(들)로부터 유래되는 FR 영역(들)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간화된 항체는
(ⅰ) 서열번호 17, 18, 31 또는 32 중 어느 한 서열번호로 표시되거나; 서열번호 17, 18, 31 또는 32에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 또는
(ⅱ) 서열번호 26, 27, 28, 29 또는 30 중 어느 한 서열번호로 표시되거나; 서열번호 26, 27, 28, 29 또는 30에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역;을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(ⅰ) 서열번호 19 또는 20으로 표시되거나; 서열번호 19 또는 20에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
(ⅱ) 서열번호 21, 22, 23, 24 또는 25 중 어느 한 서열번호로 표시되거나; 서열번호 21, 22, 23, 24 또는 25에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역;을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(ⅰ) 서열번호 17, 18, 31 및 32 중 어느 한 서열번호로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19 또는 20으로 표시된 경쇄 가변 영역; 또는
(ⅱ) 서열번호 26, 27, 28, 29 및 30 중 어느 한 서열번호로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21, 22, 23, 24 및 25 중 어느 한 서열번호로 표시된 경쇄 가변 영역;을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 표시된 가변 영역을 포함한다:
(1) 서열번호 17로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19로 표시된 경쇄 가변 영역;
(2) 서열번호 18로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19로 표시된 경쇄 가변 영역;
(3) 서열번호 31로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19로 표시된 경쇄 가변 영역;
(4) 서열번호 32로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19로 표시된 경쇄 가변 영역;
(5) 서열번호 17로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시된 경쇄 가변 영역;
(6) 서열번호 18로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시된 경쇄 가변 영역;
(7) 서열번호 31로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시된 경쇄 가변 영역; 또는
(8) 서열번호 32로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시된 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 표시된 가변 영역을 포함한다:
(1) 서열번호 26으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21로 표시된 경쇄 가변 영역;
(2) 서열번호 26으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22로 표시된 경쇄 가변 영역;
(3) 서열번호 26으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23으로 표시된 경쇄 가변 영역;
(4) 서열번호 26으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24로 표시된 경쇄 가변 영역;
(5) 서열번호 26으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25로 표시된 경쇄 가변 영역;
(6) 서열번호 27로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21로 표시된 경쇄 가변 영역;
(7) 서열번호 27로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22로 표시된 경쇄 가변 영역;
(8) 서열번호 27로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23으로 표시된 경쇄 가변 영역;
(9) 서열번호 27로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24로 표시된 경쇄 가변 영역;
(10) 서열번호 27로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25로 표시된 경쇄 가변 영역;
(11) 서열번호 28로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21로 표시된 경쇄 가변 영역;
(12) 서열번호 28로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22로 표시된 경쇄 가변 영역;
(13) 서열번호 28로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23으로 표시된 경쇄 가변 영역;
(14) 서열번호 28로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24로 표시된 경쇄 가변 영역;
(15) 서열번호 28로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25로 표시된 경쇄 가변 영역;
(16) 서열번호 29로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21로 표시된 경쇄 가변 영역;
(17) 서열번호 28로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22로 표시된 경쇄 가변 영역;
(18) 서열번호 29로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23으로 표시된 경쇄 가변 영역;
(19) 서열번호 29로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24로 표시된 경쇄 가변 영역;
(20) 서열번호 29로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25로 표시된 경쇄 가변 영역;
(21) 서열번호 30으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21로 표시된 경쇄 가변 영역;
(22) 서열번호 30으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 22로 표시된 경쇄 가변 영역;
(23) 서열번호 30으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 23으로 표시된 경쇄 가변 영역;
(24) 서열번호 30으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24로 표시된 경쇄 가변 영역; 및
(25) 서열번호 30으로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 25로 표시된 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 항-OX40 항체는 불변 영역을 포함하고; 일부 특정 실시양태에서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체이고, 상기 항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 돌연변이체 서열(들)로부터 유래되고, 경쇄 불변 영역은 인간 카파, 람다 사슬 또는 이의 돌연변이체 서열(들)로부터 유래되고; 다른 특정 실시양태에서, 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 35로 표시되거나 서열번호 35에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖고; 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 36으로 표시되거나, 서열번호 36에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-OX40 항체의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 39 또는 37로 표시되거나 서열번호 39 또는 37에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖고, 및/또는, 항-OX40의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 40 또는 38로 표시되거나 서열번호 40 또는 38에 대한 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 항-OX40 항체는
(ⅰ) 서열번호 37로 표시되거나 서열번호 37에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 38로 표시되거나 서열번호 38에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 또는
(ⅱ) 서열번호 39로 표시되거나 서열번호 39에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호 40으로 표시되거나 서열번호 40에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄;를 포함한다.
본 발명은 인간 OX40에 대한 결합을 위해 전술된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하거나, 동일한 OX40 에피토프에 대한 결합을 위해 전술된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편도 제공한다.
본 발명은 치료/예방 유효량의 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물도 제공한다.
일부 특정 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 유닛 용량 형태로 제조될 수 있고, 상기 유닛 용량은 0.01 내지 99 중량%의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있거나; 상기 약학적 조성물에 포함되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양은 0.1 내지 2000 mg/유닛 용량이다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양은 1 내지 1000 mg이다.
일부 특정 실시양태에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 조성물에 포함되는 하나의 유일한 활성 성분일 수 있고; 다른 특정 실시양태에서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다른 활성 성분과 병용된다.
본 발명은 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자도 제공한다. 본원의 문맥에서, 상기 핵산 분자의 상보적 서열도 본원의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 전술된 핵산 분자를 포함하는 벡터도 제공한다. 상기 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명은 전술된 벡터로 형질전환된 숙주 세포도 제공하고, 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이고, 이때 포유류 세포는 CHO, HEK293 및 NSO를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 숙주 세포는 인간으로 발생할 수 있는 임의의 세포를 포함하지 않음을 이해해야 한다.
본 발명은 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 전술된 숙주 세포를 배양하는 단계; 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계; 및 임의적으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
본 발명은 인간 OX40을 검출하거나 측정하는 방법으로서, 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 (예를 들면, 인간으로부터 채취된) 샘플과 접촉시키는 단계; 및 임의적으로, 상기 샘플에서 OX40의 양을 측정하거나, OX40이 존재하는지 아니면 존재하지 않는지를 확인하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
본 발명은 인간 OX40을 검출하거나 측정하는 시약으로서, 전술된 항-OX40 항체들 또는 이들의 항원-결합 단편들 중 어느 한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 시약도 제공한다.
본 발명은 인간 OX40과 관련된 질환에 대한 진단제로서, 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 진단제도 제공한다.
본 발명은 인간 OX40과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서, 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 인간 OX40 또는 OX40 양성 세포를 검출하거나 측정하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 OX40과 관련된 질환에 대한 진단제의 제조에 있어서 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 상기 OX40 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암 또는 세포 증식성 질환일 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 암은 폐암, 전립선암, 유방암, 두경부암, 식도암, 위 암종, 결장암, 대장암, 방광암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 간암, 흑색종, 신장암, 편평 세포 암종, 혈액암, 또는 비제어된 세포 생장을 특징으로 하는 임의의 다른 질환 또는 장애이다.
일부 특정 실시양태에서, 혈액암은 급성 및 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수 조직 증식성 질환, 다발성 골수종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 여포성 중심 세포 림프종 및 만성 골수성 백혈병을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 인간 대상체에서 면역 반응을 향상시키기 위한 의약의 제조에 있어서 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 전술된 OX40 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 암의 치료/예방용 의약의 제조에 있어서 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 전술된 OX40 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물의 용도도 제공한다.
본 발명은 키트의 제조에 있어서 전술된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 전술된 OX40 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물의 용도 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 향상된 면역 반응은 T 이펙터 세포의 면역자극/이펙터 기능의 증가, 및/또는 T 조절 세포의 면역억제 기능의 하향조절을 포함한다. 이때, 상기 증가는 세포 증식의 결과일 수 있고, 상기 하향조절은 세포 수의 증가의 부재(또는 세포 수의 감소)의 결과일 수 있다.
본 발명은 하기 용도들 중 하나 이상의 용도에 사용하기 위한 항-인간 OX40 항체 또는 이의 단편을 제공한다: Treg 기능의 억제(예를 들면, Treg의 억제 기능의 억제), OX40 발현 세포(예를 들면, 고수준의 OX40을 발현하는 세포)의 사멸, 이펙터 T 세포 기능의 개선 및/또는 메모리 T 세포 기능의 개선, 종양 면역의 감소, T 세포 기능의 향상 및/또는 OX40 발현 세포의 감소.
본 발명은 암을 치료하고, 대상체에서 면역 반응을 자극하고, 항원 특이적 T 세포 반응을 자극하고, T 세포를 활성화시키거나 보조자극하고, T 세포에서 사이토카인(예컨대, IL-2 및/또는 IFN-γ) 생성을 증가시키고, 및/또는 T 세포 증식을 증가시키고, 종양에서 T 조절 세포 수를 감소시키거나 고갈시키고, 및/또는 종양 세포의 생장을 억제하기 위한 항-OX40 항체 또는 이의 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극하고, 항원 특이적 T 세포 반응을 자극하고, T 세포를 활성화시키거나 보조자극하고, T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생성 및/또는 T 세포 증식을 증가시키고, 종양에서 T 조절 세포 수를 감소시키거나 고갈시키고, 및/또는 종양 세포의 생장을 억제하는 데 사용되는 작용제의 제조에 있어서 항-OX40 항체의 용도도 제공한다.
도 1a 및 도 1b: 인간 OX40에 대한 뮤린 항체 및 키메라 항체의 친화성을 보여주는 ELISA 시험 결과. 도 1a는 음성 대조군으로서 m2G3-NC 및 ch2G3-NC를 사용함으로써, 뮤린 항체 m2G3 및 키메라 항체 ch2G3의 친화성의 결과를 보여주고; 도 1b는 음성 대조군으로서 m4B5-NC 및 ch4B5-NC를 사용함으로써, 뮤린 항체 m4B5 및 키메라 항체 ch4B5의 친화성의 결과를 보여준다.
도 2: 항-OX40 항체에 의해 자극된 T 세포에서 분비된 IFN-γ를 보여주는 시험. 결과는 시험 OX40 항체가 10 ng/㎖의 농도에서 최대 자극 효과를 달성함을 보여준다.
도 3a 및 도 3b: 마우스에서의 항-OX40 항체의 항-종양 효과. 도 3a는 투여 후 상이한 마우스에서 종양 부피의 변화를 보여주고; 도 3b는 투여 후 마우스에서 종양 중량에 대한 상이한 항-OX40 항체들의 효과를 보여준다. 결과는 치료 투약 후 20일째 날, 용량이 3 mg/kg일 때, 2G3 항체의 종양 억제율이 최대 97%임을 보여준다.
용어
본 발명이 더 용이하게 이해되도록, 일부 기술 용어들 및 과학 용어들은 이하에 구체적으로 정의되어 있다. 본원의 다른 곳에서 구체적으로 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술 용어들 및 과학 용어들은 본원이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
용어 "T 세포 기능의 향상"은 이펙터 또는 메모리 T 세포가 재생된, 지속된 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 이 T 세포를 유도하거나, 야기하거나 자극하는 것을 의미한다. 향상된 T 세포 기능의 예로는 치료 전 수준과 비교될 때 CD8+ 이펙터 T 세포로부터의 γ-인터페론의 증가된 분비, CD4+ 메모리 및/또는 이펙터 T 세포로부터의 γ-인터페론의 증가된 분비, CD4+ 이펙터 및/또는 메모리 T 세포의 증가된 증식, CD8+ 이펙터 T 세포의 증가된 증식, 및 항원에 대한 증가된 반응(예를 들면, 제거)이 있다.
용어 "면역 반응의 향상"은 포유류에서 면역 시스템의 반응을 자극하거나, 민감하게 만들거나, 증가시키거나, 개선하거나 향상시키는 것을 의미한다. 면역 반응은 세포성 반응(즉, 세포 매개, 예컨대, 세포독성 T 림프구 매개) 또는 체액성 반응(즉, 항체 매개 반응)일 수 있고, 일차 또는 이차 면역 반응일 수 있다. 향상된 면역 반응의 예로는 CD4+ 헬퍼 T 세포의 증가된 활성 및 세포독성 T 세포의 생성이 있다. 향상된 면역 반응은 세포독성 T 림프구 어세이, 사이토카인 방출(예컨대, IL-2 생성), 종양의 퇴행, 및 종양 보유 동물의 생존, 항체 생성, 면역 세포의 증식, 세포 표면 마커의 발현 및 세포독성을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 당분야서 숙련된 자에게 주지된 일부 시험관내 또는 생체내 측정에 의해 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, 방법은 세포성 면역 반응, 특히 세포독성 T 세포 반응을 향상시킨다.
"종양 면역"은 종양이 면역 인식 및 제거로부터 탈출하는 과정을 지칭한다. 치료 개념으로서, 종양 면역이 면역 인식 및 제거로부터 탈출하는 종양의 능력 면에서 약화될 때, 종양은 면역 시스템에 의해 인식되고 공격받을 것이고, 결과적으로 환자는 치료될 것이다. 종양 인식의 예로는 종양에 대한 결합, 종양의 수축 및 종양의 제거가 있다.
"T 이펙터 세포"("Teff")는 세포용해 활성을 갖는 T 세포(예를 들면, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포) 및 T 헬퍼(Th) 세포를 지칭한다. Teff는 사이토카인을 분비하고 조절 T 세포(Treg 세포) 이외의 면역 세포를 활성화시키고 안내한다. 본 발명에 기재된 항-OX40 항체는 Teff 세포, 예컨대, CD4+ Teff 세포 및 CD8+ Teff 세포를 활성화시킬 수 있다.
"조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 다른 T 세포의 반응을 억제할 수 있는 전문화된 유형의 CD4+ T 세포를 의미한다. Treg 세포는 CD4, IL-2 수용체의 α 서브유닛(CD25), 및 전사 인자 포크헤드 박스(forkhead box) P3(FOXP3)을 발현함을 특징으로 하고(Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)), 말초 자가 관용의 유도 및 유지에 있어서 중추적인 역할을 한다. 상기 관용은 종양에 의해 발현된 항원을 표적으로 삼는다.
"OX40"은 OX40 리간드(OX40-L)에 결합하는 수용체를 지칭하고, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. OX40은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4), ACT35, IMD16, TXGP1L 및 CD134로서도 주지되어 있다. 용어 "OX40"은 세포에 의해 천연적으로 발현되는 OX40의 임의의 변이체 또는 이소타입을 포함한다. 따라서, 본 발명에 기재된 OX40 항체 또는 이의 단편은 인간을 제외한 종의 OX40(예를 들면, 사이노몰구스 원숭이 OX40)과 교차반응할 수 있다. 대안적으로, OX40 항체 또는 이의 단편은 인간 OX40에 특이적일 수 있고, 다른 종의 OX40과 교차반응성을 나타내지 않는다.
OX40 또는 이의 변이체 및 동형체(isoform)는 당분야 및/또는 본 발명에서 잘 주지된 기법을 이용함으로써, 그를 천연적으로 발현하거나 재조합적으로 생성하는 세포 또는 조직으로부터 단리된다. 달리 특정되어 있지 않은 한, "OX40"은 포유류, 예컨대, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래되는 천연 OX40일 수 있다. 상기 용어는 프로세싱되지 않은 "전체 길이" OX40 및 세포 내에서 일어난 프로세싱으로 인한 임의의 형태의 OX40을 커버한다. 상기 용어는 OX40의 천연 생성 변이체, 예컨대, 스플라이싱 변이체 또는 대립유전자 변이체도 커버한다.
"OX40 활성화"는 OX40 수용체의 활성화를 지칭한다. 일반적으로, OX40 활성화는 신호전달을 유발한다.
"항-OX40 항체" 또는 "OX40에 결합하는 항체"는 항체가 OX40을 표적화하기 위한 진단제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있도록 충분한 친화성으로 OX40에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
용어 "OX40 발현 세포의 감소"는 항-OX40 항체 또는 이의 단편이 OX40 발현 세포를 사멸시키거나 제거함을 의미한다. OX40 발현 세포의 감소는 다양한 기작들, 예컨대, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 식세포작용을 통해 달성될 수 있다.
용어 "사이토카인"은 세포 집단에 의해 방출되는 단백질의 한 유형에 대한 일반 용어이고, 사이토카인은 또 다른 세포에 영향을 미치는 세포내 매개자로서 작용한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 단핵구; 인터류킨(IL), 예컨대, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; 종양 괴사 인자, 예컨대, TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드(KL) 및 γ-인터페론을 비롯한 다른 폴리펩타이드 인자이다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 사이토카인은 인위적 합성에 의해 생성된 소분자 물질, 및 이의 약학적으로 허용가능한 유도체 및 염을 포함하는, 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양으로부터의 단백질 및 이의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 아미노산에 대한 3-문자 코드 및 1-문자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)]에 기재되어 있다.
용어 "항체"는 항체를 생성하는 임의의 특정 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들면, 이 용어는 재조합 항체, 단일클론 항체 및 다중클론 항체를 포함한다. 항체는 상이한 이소타입의 항체, 예를 들면, IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단 근처에서, 가변 영역(V 영역)으로서 주지된 약 110개 아미노산의 서열이 크게 달라지고; C-말단 근처에서 상기 아미노산 서열의 나머지는 상대적으로 안정하고 불변 영역(C 영역)으로서 주지되어 있다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역들(HVR들) 및 상대적으로 보존된 서열을 갖는 4개의 골격 영역(FR)을 포함한다. 상보성 결정 영역들(CDR들)로서도 주지된 3개의 초가변 영역들은 항체의 특이성을 결정한다. 각각의 경쇄 가변 영역(VL) 및 각각의 중쇄 가변 영역(VH)은 아미노 말단부터 카르복실 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 3개의 CDR들 및 4개의 FR들로 구성된다. 3개의 경쇄 CDR들은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고; 3개의 중쇄 CDR들은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다.
본 발명에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 LCVR 영역 및 HCVR 영역에서 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 (LCDR1-3, HCDR1-3에 대한) 주지된 카바트(Kabat) 넘버링 기준에 따른다.
용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 제조되었거나, 발현되었거나, 생성되었거나 단리된 인간 항체, 예컨대, 하기 항체들을 포함하고, 이용되는 기법 및 방법은 당분야에서 잘 주지되어 있다:
(1) 인간 면역글로불린 유전자 형질전환 동물 또는 트랜스-염색체 동물(예를 들면, 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체;
(2) 항체를 발현하는 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 형질감염종으로부터 단리된 항체;
(3) 재조합 인간 항체의 조합 라이브러리로부터 단리된 항체; 및
(4) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 또 다른 DNA 서열 등으로 스플라이싱함으로써 제조되었거나, 발현되었거나, 생성되었거나 단리된 항체. 이러한 재조합 인간 항체는 생식세포주 유전자에 의해 암호화된 특정 인간 생식세포주 면역글로불린 서열을 포함할 뿐만 아니라, 후속 재배열 및 돌연변이, 예컨대, 항체 성숙 동안 일어난 재배열 및 돌연변이도 포함하는 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체이다.
본원에서 용어 "뮤린 항체"는 당분야의 지식 및 기술에 따라 제조된, 인간 OX40에 대한 단일클론 항체를 지칭한다. 제조 동안, OX40 항원을 피험체에게 주사한 후, 원하는 서열 또는 기능적 특성을 갖는 항체를 발현하는 비장세포(B 림프구)를 분리하고, 이어서 상기 B 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 상응하는 하이브리도마 세포를 수득한다.
일부 특정 실시양태에서, 뮤린 OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체(들)의 경쇄 불변 영역(들)을 추가로 포함하거나, 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체(들)의 중쇄 불변 영역(들)을 추가로 포함한다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역(들) 및 불변 영역(들)을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "인간 항체"는 다른 포유류 종(예컨대, 마우스) 생식세포주로부터 유래되는 CDR 서열이 인간 골격 서열 상에 이식된 항체(즉, "인간화된 항체")를 지칭한지 않는다.
용어 "인간화된 항체"는 비-인간 종 CDR 서열을 인간 항체의 가변 영역 골격 상에 이식함으로써 생성된 항체; 즉, 상이한 유형의 인간 생식세포주 항체 골격 서열로부터 생성된 항체를 지칭한다. 인간화된 항체는 다량의 이종 단백질 성분을 보유하는 키메라 항체에 의해 유도된 이종 반응을 극복한다. 이러한 골격 서열은 생식세포주 항체 유전자 서열을 포함하는 공용 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌을 통해 수득될 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식세포주 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포주 서열 데이터베이스(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)뿐만 아니라 문헌[Kabat, E.A, et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition]으로부터도 수득될 수 있다. 면역원성의 감소와 함께 활성의 감소를 피하기 위해, 인간 항체의 가변 영역 내의 FR 서열을 최소한으로 역 돌연변이시키거나 복귀 돌연변이시켜, 활성을 유지할 것이다. 본 발명의 인간화된 항체는 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이에 의한 CDR의 추가 친화성 성숙 후 수득된 인간화된 항체도 포함한다.
CDR 이식의 경우, 항원에 대한 생성된 OX40 항체(또는 이의 항원-결합 단편)의 감소된 친화성은 항원과의 접촉을 담당하는 골격 잔기에서 일어난 변화에 기인한다. 이러한 상호작용은 체세포에서의 과다돌연변이의 결과일 수 있다. 따라서, 이러한 기증자 골격 아미노산을 인간화된 항체의 골격 상으로 이식할 필요가 여전히 있다. 항원-결합에 관여하는 비-인간 OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 잔기는 비-인간 단일클론 항체의 가변 영역의 서열 및 구조를 검출함으로써 확인될 수 있다. 생식세포주의 잔기와 상이한 CDR 기증자 골격의 잔기가 관련되어 있는 것으로 간주될 수 있다. 가장 가까운 생식세포주가 확인될 수 없는 경우, 서브타입의 컨센서스 서열 또는 높은 퍼센트의 유사성을 갖는 뮤린 서열의 컨센서스 서열에 대해 서열을 정렬할 수 있다. 희귀 골격 잔기는 체세포에서의 과다돌연변이의 결과이므로, 결합에 있어서 중요한 역할을 수행한다고 생각된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, OX40 인간화된 항체의 항체 경쇄는 인간 카파, 람다 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. OX40 인간화된 항체의 항체 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역, 특히 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
용어 "역 돌연변이"는 인간 항체의 FR 영역 내의 아미노산 돌연변이(들)가 원래의 항체 공급원의 상응하는 위치(들)에 있는 아미노산 잔기(들)로 복귀되는 것을 의미한다. 통상적으로, 활성의 감소를 유발하는, 인간화된 항체에 의해 야기된 면역원성의 감소를 피하기 위해, 인간화된 항체의 가변 영역을 최소한으로 역 돌연변이시켜 항체의 활성을 유지할 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 비-인간 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합시킴으로써 형성된 항체이고, 상기 키메라 항체는 비-인간 항체에 의해 유도된 면역 반응을 경감시킬 수 있다. 일례로서, 키메라 항체를 확립하기 위해, 특정 뮤린 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 먼저 확립한 후, 마우스 하이브리도마로부터 가변 영역 유전자를 클로닝한 다음, 원하는 경우 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하고, 마우스 가변 영역 유전자를 인간 불변 영역 유전자에 라이게이션시켜, 인간 벡터 내로 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성하고, 최종적으로 키메라 항체 분자를 진핵생물 또는 원핵생물 산업용 시스템에서 발현시킨다. 인간 항체의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체(들)의 중쇄 불변 영역(들)으로부터 선택된다. 특히, 키메라 항체는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(들)을 포함한다.
용어 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "기능적 단편"은 항원(예를 들면, OX40)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 전체 길이 항체의 단편을 사용하여 항원-결합이라는 기능을 달성할 수 있음이 확인되었다. 용어 항체의 "항원-결합 단편"에 포함된 결합 단편의 예로는
(ⅰ) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편;
(ⅱ) 힌지 영역에서 디설파이드 가교(들)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들에 의해 형성된 2가 단편인 F(ab')2 단편;
(ⅲ) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편;
(ⅳ) 항체의 한 아암(arm)의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편;
(ⅴ) VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 또는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature, 341:544-546); 및
(ⅵ) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 또는
(ⅶ) 임의적으로, 합성 링커에 의해 연결된 2개 이상의 단리된 CDR들의 조합물.
추가로, Fv 단편의 VL 도메인 및 VH 도메인은 2개의 별개의 유전자들에 의해 암호화되나, 재조합 방법을 이용하여 합성 링커로 이들을 연결하여, 1가 분자가 VL 도메인과 VH 도메인의 페어링에 의해 형성되어 있는 단일 단백질 사슬을 생성할 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)로서 지칭됨; 예를 들면, 문헌[Bird et al. (1988): Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 사슬 항체도 용어 항체의 "항원 결합 단편"에 포함된다. 이러한 항체 단편은 당분야에서 숙련된 자에 의해 주지된 통상적인 기법을 이용함으로써 수득되고, 온전한 항체에 대해 이용되는 방법과 동일한 방법을 이용함으로써 기능적 단편을 스크리닝할 수 있다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술, 또는 온전한 면역글로불린의 효소 또는 화학 분해에 의해 생성될 수 있다. 항체는 상이한 이소타입, 예를 들면, IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 형태로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, "항원-결합 단편"은 항원-결합 활성을 갖는 Fab, Fv, sFv, F(ab')2, 선형 항체, 단일 사슬 항체, scFv, sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody), 펩티바디(peptibody), 도메인 항체 및 다중특이적 항체(이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv)를 지칭한다.
Fab는 (H 사슬에서 위치 224의 아미노산 잔기를 절단하는) 파파인으로 IgG 항체 분자를 처리함으로써 수득된 항체 단편이다. 수득된 단편은 약 50,000의 분자량 및 항원-결합 활성을 갖고, 이때 N-말단 쪽으로 H 사슬의 거의 절반과 전체 L 사슬은 디설파이드 결합을 통해 함께 결합된다. 본 발명에서 Fab는 파파인으로 (인간 OX40을 특이적으로 인식하고 세포외 도메인의 아미노산 서열 또는 이의 3D 구조에 결합하는) 본 발명의 단일클론 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다. 추가로, Fab는 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하고 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
"F(ab')2"는 펩신으로 IgG의 힌지 영역에서 2개의 디설파이드 결합의 다운스트림 부분을 분해함으로써 수득된, 약 100,000의 분자량 및 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편을 지칭한다. F(ab')2는 힌지 영역에서 연결된 2개의 Fab들을 함유한다.
본 발명의 F(ab')2는 펩신으로 본 발명의 단일클론 항체를 처리함으로써 생성될 수 있다. 또한, F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 디설파이드 결합을 통해 이하에 기재된 Fab'를 연결함으로써 생성될 수 있다.
Fab'는 상기 언급된 F(ab')2의 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 절단함으로써 수득된, 약 50,000의 분자량 및 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab'는 본 발명의 F(ab')2를 디티오트레이톨과 같은 환원제로 처리함으로써 생성될 수 있다.
추가로, Fab'는 항체의 Fab'를 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하고 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
용어 "단일 사슬 항체", "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)에 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반 구조를 갖는다. 종래기술에서 적합한 링커는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 예를 들면, 1개 내지 4개의 반복부를 갖는 변이체로 구성된다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌[Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731], 문헌[Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106], 문헌[Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061], 문헌[Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56] 및 문헌[Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.]에 기재되어 있다.
본 발명의 scFv는 하기 단계들에 의해 생성될 수 있다: 본 발명의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계; scFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계; 상기 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 및 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 scFv를 발현시키는 단계.
"디아바디"는 scFv가 이량체화되어 있는 항체 단편이고, 2가 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가 항원-결합 활성에서, 2개의 항원들은 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
본 발명의 디아바디는 하기 단계들에 의해 생성될 수 있다: 본 발명의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계; scFv를 암호화하는 DNA를 구축하여, 링커 펩타이드의 길이가 8개 이하의 아미노산 잔기가 되도록 만드는 단계; 상기 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 및 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 디아바디를 발현시키는 단계.
"dsFv"는 VH 및 VL 각각에서 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체한 후 2개의 시스테인 잔기들 사이의 디설파이드 결합을 통해 치환된 폴리펩타이드를 연결함으로써 수득된다. 시스테인 잔기로 대체되는 아미노산 잔기는 주지된 방법(Protein Engineering, 7, 697 (1994))에 따라 항체의 3차원 구조 예측에 근거하여 선택될 수 있다.
본 발명의 dsFv는 하기 단계들에 의해 생성될 수 있다: 본 발명의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계; dsFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계; 상기 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 및 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 dsFv를 발현시키는 단계.
"CDR 함유 펩타이드"는 하나 이상의 영역을 VH 또는 VL의 CDR 내에 혼입함으로써 구축된다. 다수의 CDR들을 함유하는 펩타이드는 직접 연결될 수 있거나 적합한 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 CDR 함유 펩타이드는 하기 단계들에 의해 생성될 수 있다: 본 발명에서 단일클론 항체의 VH 및 VL의 CDR들을 암호화하는 DNA를 구축하는 단계; 상기 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 이어서 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입하여 상기 펩타이드를 발현시키는 단계. CDR 함유 펩타이드는 화학 합성 방법, 예컨대, Fmoc 방법 또는 tBoc 방법에 의해서도 생성될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "골격(FR)"은 VL 또는 VH 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)를 위한 스카폴드로서 사용되는, 이 가변 도메인의 부분을 지칭한다. 본질적으로, 이것은 CDR을 갖지 않은 가변 도메인이다.
용어 "아미노산 차이"는 폴리펩타이드 단편 상의 특정 아미노산 위치(들)에서 폴리펩타이드와 이의 변이체(들) 사이의 차이(들)를 의미하고, 이때 상기 변이체(들)는 폴리펩타이드 상의 특정 위치(들)에서 아미노산(들)을 치환시키거나, 삽입하거나 결실시킴으로써 수득될 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체에 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산들에 의해 형성될 수 있거나, 단백질의 3차 폴딩으로 인해 더 가까워진 비-인접 아미노산들에 의해 형성될 수 있다. 인접 아미노산들에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출 시 보유되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매를 사용한 처리 후 부재한다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간적 입체구조에서 적어도 3개 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 면역블롯팅 및 면역침전 어세이 등을 포함하는, 에피토프를 확인하는 방법은 당분야에서 잘 주지되어 있다. 에피토프의 공간적 입체구조를 확인하는 방법은 당분야에서 주지된 기법 및 본원에 기재된 기법, 예컨대, X-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명 등을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "에 특이적으로 결합한다"는 항체와, 소정의 항원 상의 에피토프의 결합을 의미한다. 전형적으로, 항체는 대략 10-7 M 미만 또는 심지어 더 낮은 평형 해리 상수(KD)로 소정의 항원에 결합하고, 소정의 항원에 대한 결합을 위한 항체의 친화성은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기법을 통해 기계에서 측정되었을 때 소정의 항원 이외의 비-특이적 항원(예컨대, BSA) 또는 밀접히 관련된 항원에 대한 결합을 위한 친화성보다 적어도 2배 더 높고, 이때 재조합 인간 OX40은 피분석물로서 사용되는 반면, 항체는 리간드로서 사용된다. 용어 "항원을 인식하는 항체"는 본원에서 용어 "에 특이적으로 결합하는 항체"와 교환 가능하게 사용될 수 있다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 비아코어(Biacore) 기계에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 측정되었을 때 약 10-7 M 미만, 예를 들면, 약 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 또는 심지어 더 낮은 해리 평형 상수(KD)로 인간 OX40에 결합한다.
용어 "경쟁"이 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원-결합 단백질(예를 들면, 중화 항원-결합 단백질 또는 중화 항체)의 문맥에서 사용될 때, 이것은 항원-결합 단백질들 사이에 경쟁이 일어남을 의미하고, 이 경쟁은 시험되는 항원 결합 단백질(예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 기준 항원 결합 단백질(예를 들면, 리간드 또는 기준 항체)와 공통 항원(예를 들면, OX40 항원 또는 이의 단편)의 특이적 결합을 방해하거나 억제하는(예를 들면, 감소시키는) 어세이에 의해 확인된다. 항원-결합 단백질이 서로 경쟁하는지를 확인하기 위해 다양한 유형의 경쟁 결합 어세이들이 이용될 수 있다. 이 어세이들은 예를 들면, 고체상 직접 또는 간접 방사면역어세이(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역어세이(EIA), 샌드위치 경쟁 어세이(예를 들면, 문헌[Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253] 참조), 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들면, 문헌[Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619] 참조), 고체상 직접 표지부착 어세이, 고체상 직접 표지부착 샌드위치 어세이(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지부착 RIA(예를 들면, 문헌[Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15] 참조), 및 직접 표지부착 RIA(Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82)이다. 전형적으로, 상기 어세이는 표지부착되지 않은 시험 항원 결합 단백질 및 표지부착된 기준 항원 결합 단백질 둘 다에 결합할 수 있는 정제된 항원(항원은 고체 표면 또는 세포 표면 상에 로딩됨)의 사용을 수반한다. 경쟁 억제는 시험 항원-결합 단백질의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포 표면에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 확인된다. 통상적으로, 시험 항원-결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 어세이에 의해 확인되는 항원-결합 단백질(경쟁 항원-결합 단백질)은 기준 항원-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원-결합 단백질; 및 기준 항원-결합 단백질이 결합하는 에피토프에 충분히 가까운 에피토프에 결합하는 항원-결합 단백질을 포함하고, 이때 상기 두 에피토프들은 결합을 방해할 정도로 서로 공간적으로 간섭한다. 경쟁 결합을 측정하는 방법에 대한 추가 상세한 내용은 본원의 실시예에서 제공된다. 전형적으로, 경쟁 항원-결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 이 단백질은 기준 항원-결합 단백질과 공통 항원의 특이적 결합을 적어도 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%까지, 또는 심지어 더 많이 억제할(예를 들면, 감소시킬) 것이다. 일부 경우, 결합은 적어도 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 97%까지, 또는 심지어 더 많이 억제된다.
용어 "교차반응"은 상이한 종들의 OX40에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 의미한다. 예를 들면, 인간 OX40에 결합하는 본 발명의 항체는 또 다른 종의 OX40에도 결합할 수 있다. 교차반응성은 결합 어세이(예를 들면, SPR 및 ELISA)에서 정제된 항원으로 특이적 반응성을 검출함으로써 측정되거나, OX40을 생리학적으로 발현하는 세포와의 결합 또는 기능적 상호작용을 검출함으로써 측정된다. 교차반응성을 측정하는 방법은 본원에 기재된 표준 결합 어세이, 예컨대, 표면 플라즈몬 공명 분석(SPR), 또는 유세포분석을 포함한다.
용어 "억제" 또는 "차단"은 교환 가능하게 사용되고, 부분적 억제/차단 및 완전한 억제/차단 둘 다를 커버한다.
(예를 들면, 세포에 적용될 때) 용어 "생장의 억제"는 세포 생장의 임의의 측정 가능한 감소를 지칭하기 위한 것이다.
용어 "면역 반응의 유도" 및 "면역 반응의 향상"은 교환 가능하게 사용되고, 특정 항원의 자극에 대한 면역 반응(즉, 수동 또는 적응 면역 반응)을 의미한다. CDC 또는 ADCC의 유도와 관련하여 용어 "유도"는 특이적 직접 세포 사멸 기작의 자극을 지칭한다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 일부 세포독성 세포들(예컨대, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 분비 면역글로불린이 이 세포독성 이펙터 세포들로 하여금 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후 세포독소로 표적 세포를 사멸시키게 만드는 형태의 세포독성을 의미한다. ADCC를 매개하는 주요 세포(NK 세포)는 FcyRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcyRI, FcyRII 및 FcyRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 제464면에 있는 표 3에 요약되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 어세이, 예컨대, 미국 특허 제5,500,362호, 미국 특허 제5,821,337호 또는 미국 특허 제6,737,056호(Presta)에 기재된 어세이를 수행할 수 있다. 이러한 어세이에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다. 추가로, IgG의 Fc 분절은 항체의 ADCC 효과를 감소시키거나 제거하도록 변형될 수 있다. 변형은 항체의 중쇄 불변 영역 내의 돌연변이, 예컨대, IgG1의 N297A, L234A, L235A; IgG2/4 키메라, IgG4의 F235E, 및 L234A/E235A 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 지칭한다.
용어 "보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 의미한다. 보체 활성화의 고전적인 경로는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)과 그의 동족 항원에 결합된 (적절한 서브클래스의) 항체의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같이 CDC 어세이를 수행할 수 있다. 변형된 Fc 영역 아미노산 서열(들)을 갖는 폴리펩타이드 변이체(변이체 Fc 영역(들)을 갖는 폴리펩타이드)뿐만 아니라 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩타이드 변이체도 예를 들면, 미국 특허 제6,194,551B1호 및 국제 특허출원 공개 제WO 1999/51642호에 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌[Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 특히 이중 가닥 DNA일 수 있다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주된다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미칠 때 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다.
용어 "벡터"는 그 자신에 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 벡터는 추가 DNA 분절(들)이 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 이때 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 본원에 개시된 벡터는 그 자신이 도입되는 숙주 세포에서 자가-복제할 수 있거나(예를 들면, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀성 포유류 벡터), 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으므로, 숙주의 게놈과 함께 복제된다(예를 들면, 비-에피좀성 포유류 벡터).
항체 및 이의 항원-결합 단편을 생성하고 정제하는 방법은 당분야에서 잘 주지되어 있다(예를 들면, 문헌[A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15]). 예를 들면, 마우스를 인간 OX40 또는 이의 단편으로 면역화시킬 수 있고, 그 후 당분야에서 잘 주지되어 있는 통상적인 방법을 이용함으로써 생성된 항체를 재생시키고 정제하고 아미노산 서열에 대해 시퀀싱할 수 있다. 항원-결합 단편도 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 인간 FR 영역을 비-인간 CDR 영역 상에 삽입하도록 조작된다. 인간 FR 생식세포주 서열은 MOE 소프트웨어를 사용하여 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics)(IMGT) 인간 항체 가변 생식세포주 유전자 데이터베이스에 대해 정렬함으로써, IMGT 웹사이트(http://imgt.cines.fr) 또는 문헌[The Immunoglobulin Facts Book, 2001 ISBN012441351]으로부터 입수될 수 있다.
본 발명에서 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적인 방법을 이용함으로써 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들면, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열을 GS 발현 벡터 내로 클로닝하고 재조합할 수 있다. 이어서, 재조합 면역글로불린 발현 벡터를 CHO 세포 내로 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 당분야에서 더 권장된 방법으로서, 포유류 발현 시스템은 전형적으로 Fc 영역 내의 고도로 보존된 N-말단에서 항체의 글리코실화를 야기할 수 있다. 안정한 클론은 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 발현을 통해 수득될 수 있다. 양성 클론은 생물반응기 내에서의 항체 생성을 위해 무혈청 배양 배지에서 증폭될 수 있다. 항체가 분비되어 있는 배양 배지는 통상적인 기법에 의해 정제되고 수거될 수 있다. 통상적인 기법을 이용하여 항체를 여과하고 농축할 수 있다. 가용성 혼합물 및 다량체는 통상적인 기법, 예컨대, 분자 체 또는 이온 교환에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 수득된 생성물은 예를 들면, -70℃에서 즉시 냉동될 수 있거나, 동결건조될 수 있다.경숙
단일클론 항체(mAb)는 진핵생물, 원핵생물, 또는 세포 균주의 파지 클론이나 이들로 제한되지 않는 세포 균주의 단일 클론으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 단일클론 항체 및 이의 항원-결합 단편은 예를 들면, 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술(예를 들면, CDR 이식) 또는 당분야에서 주지된 다른 기술에 의해 수득될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 미생물(예컨대, 세균), 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환되기 쉬운 세균은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella); 바실라세애(Bacillaceae), 예컨대, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코쿠스(Pneumococcus); 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)의 구성원들을 포함한다. 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(중국 햄스터 난소 세포주), NS0 및 293 세포를 포함한다.
"보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"은 변형이 단백질의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 빈번히 수행될 수 있도록 단백질에서 아미노산을, 유사한 특성(예컨대, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 주쇄 입체구조 및 강성 등)을 보이는 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 당분야에서 숙련된 자는 일반적으로 폴리펩타이드의 비-필수 영역 내에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않음을 알고 있다(예를 들면, 문헌[Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224 (4th edition)] 참조). 또한, 유사한 구조 또는 기능을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성의 손실을 야기할 가능성이 거의 없다.
"유효량"은 의학적 증상 또는 상태의 증상 또는 징후를 완화시키거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 진단을 가능하게 하거나 용이하게 하기에 충분한 양도 의미한다. 특정 환자 또는 수의학 대상체를 위한 유효량은 치료되는 상태, 환자의 일반적인 건강, 투여 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 유의미한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투약 프로토콜일 수 있다.
"외생성"은 문맥에 따라 유기체, 세포 또는 인체의 외부에서 생성된 물질을 의미한다.
"내생성"은 문맥에 따라 유기체, 세포 또는 인체의 내부에서 생성된 물질을 의미한다.
본 발명에서 언급된 "돌연변이된 서열"은 적절한 치환, 삽입 또는 결실로 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 변형시킨 후 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열에 대한 다양한 퍼센트 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 지칭한다. 서열 동일성은 적어도 85%, 90% 또는 95%일 수 있고, 비제한적 예로는 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%가 있다. 2개의 서열들 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 측정은 디폴트 설정으로 국립생명공학 연구 센터 웹사이트 상에서 입수될 수 있는 BLASTN/BLASTP 알고리즘을 이용함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열들 또는 2개의 폴리펩타이드 서열들 사이의 서열 유사성을 의미한다. 비교되는 2개의 서열들 둘 다에서 한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들면, 2개의 DNA 분자들 각각에서 한 위치가 아데닌에 의해 점유될 때, 상기 분자들은 그 위치에서 상동하다. 2개의 서열들 사이의 상동성의 퍼센트는 2개의 서열들에 의해 공유된 일치하거나 상동한 위치의 수를 비교되는 모든 위치의 수로 나눈 후 100을 곱한 함수이다. 예를 들면, 2개의 서열들이 최적으로 정렬될 때, 2개의 서열들에서 10개의 위치들 중 6개의 위치들이 일치하거나 상동한 경우, 상기 2개의 서열들은 60% 상동한 것으로서 주지되고, 2개의 서열들에서 100개의 위치들 중 95개의 위치들이 일치하거나 상동한 경우, 상기 2개의 서열들은 95% 상동한 것으로서 주지된다. 일반적으로, 2개의 서열들은 정렬이 최대 상동성 퍼센트를 제공할 때 비교된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 교환 가능하게 사용되고, 모든 이러한 표기들은 그의 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 계대배양 수와 관계없이 일차 대상체 세포 및 이로부터 유래되는 배양물을 포함한다. 모든 자손들은 의도되거나 의도되지 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량의 관점에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝될 때 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 나타내는 돌연변이체 자손이 포함된다. 상이한 표기가 언급되어 있는 경우, 이것은 문맥에 따라 명확히 이해될 것이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 극소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 부분이 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바와 같이 증폭되는 절차 또는 기법을 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 디자인될 수 있도록, 관심 있는 영역의 말단 또는 이 영역을 넘는 부분에 대한 서열 정보를 입수할 필요가 있고; 이 프라이머들의 서열은 증폭되는 주형의 상보적 가닥과 동일 또는 유사할 것이다. 상기 2개의 프라이머들의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭되는 물질의 말단과 동일할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 게놈의 특정 DNA 서열 및 총 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로 문헌[Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263]; 및 문헌[Erlich editor, (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY)]을 참조한다. 본 발명에서 이용된 PCR은 시험될 핵산 샘플을 증폭하는 중합효소 반응 방법들의 일례인 것으로 간주된다(그러나, 유일한 방법은 아님). 상기 방법은 핵산의 특정 부분을 증폭하거나 생성하기 위해 프라이머로서 주지된 핵산 서열과 핵산 중합효소를 병용하는 단계를 포함한다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는 후속되는 사건 또는 환경이 일어날 수 있음(그러나 반드시 일어나는 것은 아님)을 의미하고, 설명은 상기 사건 또는 환경이 일어난 경우 및 일어나지 않은 경우를 포함한다. 예를 들면, "임의적으로 1개 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역(들)을 함유한다"는 특정 서열을 갖는 항체 중쇄 가변 영역(들)이 존재할 수 있으나, 존재할 필요는 없음을 의미한다.
"약학적 조성물"은 본 발명에 따른 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 다른 화학 성분, 예컨대, 생리학적으로/약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 혼합물을 지칭한다. 약학적 조성물은 유기체에게의 투여를 촉진하여, 활성 성분의 흡수를 용이하게 함으로써 생물학적 효과를 나타내는 것을 목적으로 한다.
용어 "암"은 조절되지 않은 세포 생장을 특징으로 하는, 포유류의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프 악성 종양이 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더 구체적인 예로는 편평 세포 암종(예를 들면, 상피 편평 세포 암종), 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 선암종 및 폐의 편평 세포 암종을 포함함), 복막암, 간세포 암종, 위 암종(위장암 및 위장간질암을 포함함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요도암, 간 종양, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 항문암, 음경암, 흑색종, 표재 확산 흑색종, 악성 주근깨 기태 흑색종, 선단 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 B 세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 모발 세포 백혈병, 만성 골수모구성 백혈병 및 이식 후 림프증식성 장애(PTLD)뿐만 아니라, 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 관련된 부종) 및 메이그스(Meigs) 증후군, 뇌 종양 및 뇌암, 및 두경부암 및 이들의 관련된 전이가 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 OX40 항체 또는 이의 단편에 의해 치료되기에 적합한 암은 유방암, 대장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 교모세포종, 비-호지킨 림프 종양(NHL), 신장 세포 암종, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암, 교모세포종, 신경모세포종, 흑색종, 유방암(예를 들면, 삼중 음성 유방암), 위 암종, 대장암(CRC) 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 일부 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암, 대장암, 교모세포종 및 유방암(예를 들면, 삼중 음성 유방암)(이 암들의 전이를 포함함)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암을 지칭한다.
용어 "종양"은 악성이든 아니면 양성이든 관계없이 모든 신생물성 세포 생장 및 증식, 모든 전구암성 세포 및 조직, 및 모든 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본 발명에서 언급될 때 서로 배타적이지 않다.
동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체에 적용될 때 "투여", "투여하는" 및 "치료"는 외생성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체와 접촉시키는 것을 의미한다. "투여", "투여하는" 및 "치료"는 예를 들면, 치료 방법, 약물동력학적 방법, 진단 방법, 연구 방법 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약을 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라, 유체가 세포와 접촉되어 있을 때 시약을 상기 유체와 접촉시키는 것도 포함한다. "투여", "투여하는" 및 "치료"는 시약, 진단제 또는 결합 조성물의 사용 또는 또 다른 세포의 사용에 의한, 예를 들면, 세포의 시험관내 및 생체외 치료도 의미한다. 인간, 동물 또는 연구 대상체에 적용될 때 "치료"는 치료적 치료, 예방적 또는 방지적 조치, 연구 및 진단 적용을 의미한다.
"치료하는 것"은 치료제(예컨대, 본 발명의 항체들 또는 이들의 항원-결합 단편들 중 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물; 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자)를, 상기 치료제가 치료 활성을 보이는 것으로 주지된 하나 이상의 질환 또는 증상을 갖는 환자에게 내부적 또는 외부적으로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 치료제는 이러한 증상(들)의 퇴행을 유도하거나 이러한 증상(들)의 진행을 임의의 임상적으로 측정될 수 있는 정도까지 억제함으로써, 치료받는 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질환 또는 증상을 완화시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 또는 증상을 완화시키기에 효과적인 치료제의 양("치료 유효량"으로서도 지칭됨)은 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 환자에서 원하는 효과를 이끌어내는 의약의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지는 그 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 숙련된 건강관리 제공자에 의해 전형적으로 이용되는 임의의 임상 측정에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 실시양태(예를 들면, 치료 방법 또는 제품)이 관심 있는 각각의 질환 증상을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 당분야에서 주지된 임의의 통계적 검정, 예컨대, 스튜던트 t-검정, 카이제곱 검정, 만(Mann)과 휘트니(Whitney)에 따른 U-검정, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정(H-검정), 용크헤이러-테르프스트라(Jonckheere-Terpstra) 검정 및 윌콕손(Wilcoxon) 검정에 의해 확인될 때 통계적으로 유의미한 수의 대상체에서 관심 있는 표적 질환 증상(들)을 완화시킬 것이다.
용어 "암의 예방"은 포유류에서 암의 발병을 지연시키거나, 억제하거나 예방하는 것을 의미하고; 암 또는 종양의 발생의 시작은 포유류에서 확인되지 않았으나, 상기 포유류는 예를 들면, 유전학적 스크리닝 또는 다른 방법에 의해 암에 민감한 것으로 확인되어 있다. 상기 용어는 전구암성 상태가 악성 종양 쪽으로 진행하는 것을 예방하거나 심지어 퇴행을 달성하기 위해 전구암성 상태를 앓고 있는 포유류를 치료하는 것도 포함한다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명은 실시예와 관련하여 더 기재된다. 그러나, 본 발명의 범위는 이로 제한되지 않는다. 실시예에서, 구체적인 조건이 기재되어 있지 않은 경우, 실험은 일반적으로 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual and Molecular Cloning Manual, by Cold Spring Harbor]에 기재된 통상적인 조건 하에서, 또는 재료 또는 제품의 제조사에 의해 제안된 조건 하에서 수행된다. 시약의 공급원이 구체적으로 제공되어 있지 않은 경우, 시약은 시판된다.
실시예 1: 항체의 제조
마우스를 면역화시킴으로써 항-인간 OX40 단일클론 항체의 라이브러리를 생성하였다. BalB/C 및 A/J 품종의 실험용 마우스(비교 의약 센터, 양저우 대학교, 동물 생산 라이센스 번호; SCXK(Jiangsu)2017-007), 암컷, 10주령.
면역 항원은 HEK293에서 발현된 후 통상적인 방법에 따라 정제된, Fc 태그를 갖는 인간 OX40 재조합 단백질(OX40-Fc: Fc와 융합된 OX40 Leu29-Ala216(수탁 #NP_003318))이었고 카탈로그 번호 #OX40-H5255 하에서 아크로 바이오시스템스(Acro Biosystems)로부터 구입되었다.
OX40-Fc를 프로인트 아쥬번트(Freund's adjuvant)로 유화시켰다: 1차 면역화를 위해 프로인트 완전 아쥬번트(시그마-알드리치(sigma-aldrich), F5881-10ML)를 사용하였고, 부스터 면역화의 재설정을 위해 프로인트 불완전 아쥬번트(시그마-알드리치, F5506-10ML)를 사용하였다. 항원 대 아쥬번트의 비는 1:1이었고, 각각의 면역화를 위해 25 ㎍ 단백질/200 ㎕/마우스를 주사하였다. 구체적으로,
1일째 날 완전 프로인트 아쥬번트를 사용한 1차 면역화
21일째 날 불완전 프로인트 아쥬번트를 사용한 2차 면역화
35일째 날 불완전 프로인트 아쥬번트를 사용한 3차 면역화
42일째 날 혈액 샘플링 및 혈청 역가 시험
49일째 날 불완전 프로인트 아쥬번트를 사용한 4차 면역화
56일째 날 혈액 샘플링 및 혈청 역가 시험.
실시예 2에 기재된 ELISA 방법으로 마우스 혈청을 사용하여 마우스 혈청 중의 항체 역가 및 OX40/OX40L의 결합을 차단하는 중화 활성을 측정하였다. 최종 면역화를 위해 강한 혈청 역가, 친화성 및 리간드 결합을 차단하는 능력을 갖는 마우스를 선택한 후 희생시켰다. 비장 세포를 SP2/0 골수종 세포(ATCC® CRL-1581™)와 융합시키고 플레이트 상에 접종하여 하이브리도마를 수득하였다. 실시예 2에 제시된 간접 ELISA, 포획 ELISA 및 세포 기반 기능적 스크리닝으로 표적 하이브리도마를 선택하였고, 제한 희석 방법으로 단일클론 항체 품종을 확립하였다.
무혈청 발현으로 OX40 마우스 단일클론 항체의 확립된 19개 품종들을 생성하였고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제된 마우스 단일클론 항체들을 수득하였다. 간접 ELISA, 포획 ELISA 및 세포 기능적 활성 스크리닝으로 활성화된 항-OX40 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 선택하였다. 기능적 스크리닝의 간단한 절차는 다음과 같았다: GS-H2/OX40 안정한 세포주를 배양하였다(진스크립트(Genscript)로부터 구입됨, 카탈로그 #M00608). 시험될 희석된 항체 및 OX40L(시노 바이올로지칼(Sino Biological), 13127-H04H) 용액을 준비하였고 대수 생장기에 있는 GS-H2/OX40 세포에 첨가하였다. 배양을 완료한 후, 세포 상청액을 수거하였고 상기 상청액에서 IL-8의 함량을 측정하였다(인간 IL-8 키트의 사용, 시스바이오(Cisbio), 카탈로그 #62IL8PEB). 항체 GPX4(국제 특허출원 공개 제WO2015153513호의 1A7.gr.1을 참조함으로써 제조됨)를 시험에서 양성 대조군으로서 사용하였고, hIgG(실험실에서 제조됨)를 음성 대조군으로서 사용하였다.
세포 기능적 활성에 따라, 유전자 클로닝 및 시퀀싱을 위해 고활성을 갖는 10개의 품종들을 선택하였다. 통상적인 RNA 추출 기술로 세포로부터 총 RNA를 추출한 후, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)으로 단일클론 항체의 가변 영역의 PCR 생성물을 수득하였다. 상기 PCR 생성물을 아가로스 겔로 해상하고 회수한 후, 유전자 벡터 내로 클로닝한 다음, 이 벡터를 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 여러 형질전환된 콜로니들을 무작위로 선택하였고, 유전자 시퀀싱을 위해 단일클론 항체의 가변 영역을 PCR로 증폭시켰다. 수득된 예시적 뮤린 단일클론 항체의 상응하는 서열은 이하에 표시되어 있다.
뮤린 단일클론 항체 m4B5의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
뮤린 단일클론 항체 m4B5의 CDR 영역의 서열은 표 1에 제시되어 있다:
Figure pct00002
뮤린 단일클론 항체 m2G3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:
Figure pct00003
뮤린 단일클론 항체 m2G3의 CDR 영역의 서열은 표 2에 제시되어 있다:
Figure pct00004
실시예 2: ELISA에 의한 항체의 확인 및 스크리닝
간접 ELISA 방법:
탈이온수를 사용하여 20배 코팅 완충제를 1배까지 희석하였다. 1배 코팅 완충제(탄산염 완충제)를 사용함으로써 2 ㎍/㎖의 최종 농도까지 제조된 100 ㎕의 인간 OX40-His 항원(아크로 바이오시스템스, OXL-H52Q8)을 각각의 웰에 첨가하고 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였거나 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 1회 세척하였고, 200 ㎕의 차단 용액(5% 탈지유를 함유하는 PBST)을 각각의 웰에 첨가하고 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 100 ㎕의 희석된 일차 항체를 각각의 웰에 첨가하고(시험되는 항체를 10000 ng/㎖의 농도부터 5배 희석하여, 7개의 구배, 즉 10000 ng/㎖, 2000 ng/㎖, 400 ng/㎖, 80 ng/㎖, 16 ng/㎖, 3.2 ng/㎖ 및 0.64 ng/㎖를 야기하였고, 블랭크 웰은 희석 용액, 즉 PBST 중의 2.5% 탈지유만을 함유하였음) 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였고, 효소-표지부착된 이차 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)로부터 구입된 HRP-표지부착된 염소 항-마우스 IgG(카탈로그 #115036071), 잭슨 이뮤노리서치로부터 구입된 HRP-표지부착된 염소 항-인간 IgG(카탈로그 #109036098))를 PBST 완충제로 희석하였고; 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였고, 100 ㎕ TMB 현상 용액을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 어두운 곳에서 3분 내지 15분 동안 인큐베이션하였고, 50 ㎕ 중단 용액(1 M 황산)을 각각의 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기에 대해 파라미터를 설정하였고, OD 값을 450 내지 630 nm에서 판독하였고, 시험 데이터를 저장하였다.
포획 ELISA:
탈이온수로 20배 PBS 완충제를 1배까지 희석하였다. 1배 PBS를 사용함으로써 2 ㎍/㎖의 최종 농도까지 제조된 100 ㎕의 GAM 이차 항체(잭슨 이뮤노리서치, 115-006-071)를 각각의 웰에 첨가하고 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였거나 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였고; 플레이트를 PBST로 1회 세척하였고, 200 ㎕의 차단 용액(5% 탈지유를 함유하는 PBST)을 각각의 웰에 첨가하고 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 100 ㎕의 희석된 일차 항체를 각각의 웰에 첨가하고(시험되는 항체를 10000 ng/㎖의 농도부터 5배 희석하여, 7개의 구배, 즉 10000 ng/㎖, 2000 ng/㎖, 400 ng/㎖, 80 ng/㎖, 16 ng/㎖, 3.2 ng/㎖ 및 0.64 ng/㎖를 야기하였고, 블랭크 웰은 희석 용액, 즉 PBST 중의 2.5% 탈지유만을 함유하였음) 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였고, 인간 OX40-FC-바이오틴(아크로 바이오시스템, OX0-H5255, 표지부착된 바이오틴)을 PBST 중의 2.5% 탈지유로 희석하였고, 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 100 ㎕의 TMB 현상 용액을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 어두운 곳에서 3분 내지 15분 동안 인큐베이션하였고, 50 ㎕의 중단 용액(1 M 황산)을 각각의 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기에 대해 파라미터를 설정하였고, OD 값을 450 내지 630 nm에서 판독하였고, 시험 데이터를 저장하였다.
리간드 결합의 차단 ELISA:
탈이온수를 사용하여 20배 코팅 완충제를 1배까지 희석하였고, 1배 코팅 완충제(탄산염 완충제)를 사용함으로써 2 ㎍/㎖의 최종 농도까지 제조된 100 ㎕의 OX40L-His 항원(아크로 바이오시스템스, OXL-H52Q8)을 각각의 웰에 첨가하고 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였거나 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 1회 세척하였고, 200 ㎕의 차단 용액(5% 탈지유를 함유하는 PBST)을 각각의 웰에 첨가하고 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였고; 마우스 혈청/항체를 미리 제조된 200 ng/㎖ 인간 OX40-Fc 용액(2.5% 탈지유로 제조됨)으로 구배 희석한 후, 40분 동안 실온에서 예비인큐베이션한 다음, 차단된 OX40L 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 첨가하고 40분 동안 인큐베이션하였고; 플레이트를 PBST로 4회 세척하였고; HRP-표지부착된 염소 항-인간 이차 항체(GAH-HRP, 잭슨 이뮤노리서치, 109-035-006)를 PBST 완충제로 희석하였고; 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 40분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였고, 100 ㎕의 TMB 현상 용액을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 어두운 곳에서 3분 내지 15분 동안 인큐베이션하였고, 50 ㎕의 중단 용액(1 M 황산)을 각각의 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기에 대해 파라미터를 설정하였고, OD 값을 450 내지 630 nm에서 판독하였고, 시험 데이터를 저장하였다.
실시예 3: 항-OX40 재조합 키메라 항체의 구축 및 발현
인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역과 조합된 뮤린 항체 m2G3 및 m4B5 중쇄 가변 영역(VH), 및 인간 면역글로불린 카파 경쇄 불변 영역과 조합된 경쇄 가변 영역(VL)을 진핵생물 발현 벡터 내로 따로 클로닝한 후, 이 발현 벡터를 세포 내로 형질감염시켜 마우스-인간 키메라 항체를 생성하였다.
중쇄 벡터를 다음과 같이 디자인하였다: 신호 펩타이드 + 중쇄 가변 영역 서열 + 인간 IgG1 불변 영역 서열.
경쇄 벡터를 다음과 같이 디자인하였다: 신호 펩타이드 + 경쇄 가변 영역 서열 + 인간 카파 불변 영역 서열.
상기 서열들을 pCEP4 벡터(써모피셔(Thermofisher), V04450) 내로 삽입하였다. 벡터 플라스미드를 수득한 후, 상기 플라스미드를 추출하였고 검증을 위해 시퀀싱으로 전달하였다. PEI를 사용하여 적격 플라스미드를 인간 293F 세포 내로 형질감염시키고 연속적으로 배양하였고, 세포 형질감염을 위해 상기 293F 세포를 대수생장기에 도달하도록 무혈청 배지(상하이 오피엠 바이오사이언시스(Shanghai OPM biosciences), OPM-293 CD03)에서 배양하였다. 21.4 ㎍의 키메라 항체 경쇄 플라스미드 및 23.6 ㎍의 키메라 항체 중쇄 플라스미드를 10 ㎖ Opti-MEM®I 환원 혈청 배지(깁코(GIBCO), 31985-070)에 용해시키고 웰을 혼합한 후, 200 ㎍의 PEI를 첨가하고 웰을 혼합하고 15분 동안 실온에서 인큐베이션하고 50 ㎖ 세포에 첨가하였다. 세포 배양 조건: 5% CO2, 37℃, 125 rpm/분. 배양 기간 동안 세포 생존율이 70% 미만일 때까지 1일째 날 및 3일째 날에 배지 보충제를 첨가하였고, 세포 상청액을 수거하고 원심분리하였다. 원심분리 및 여과 후, 항체 정제를 위해 세포 배양 용액을 친화성 컬럼 상에 로딩하였고, 컬럼을 인삼염 완충제로 세척하고 글리신-염산 완충제(pH 2.7, 0.1 M Gly-HCl)로 용출하고 1 M 트리스 염산(pH 9.0)으로 중화시키고 인산염 완충제에 대해 투석하였고, 정제된 키메라 항체 Ch2G3 및 Ch4B5를 최종적으로 수득하였다.
실시예 4: 시험관내 결합 친화성 및 동력학 시험
인간 OX40에 대한 뮤린 항체 및 키메라 항체의 친화성을 검출하였고(방법 단계는 실시예 2에 기재된 방법 단계와 동일하였음), 결과는 도 1a 및 도 1b에 제시되어 있다. m2G3-NC(-NC는 음성 대조군을 표시함), Ch2G3-NC, m4B5-NC 및 Ch4B5-NC는 각각 m2G3, Ch2G3, m4B5 및 Ch4B5에서 사용된 불변 영역과 동일한 불변 영역을 공유하는 음성 대조군이었으나, 이들의 가변 영역은 OX40을 인식하지 못한다.
결과는 키메라 항체 Ch2G3 및 Ch4B5가 인간 OX40에 대한 고친화성을 가짐을 보여준다.
실시예 5: 항-OX40 항체에 대한 레포터 유전자의 시험관내 세포 시험
웰 플레이트를 항-CD3 항체(켐파트너(Chempartner), A05-001)로 코팅하고 하룻밤 동안 4℃에서 놓아두고 PBS로 3회 세척하였고; Jurkat-NF-Kb luc-hOX40 세포(ATCC, 상하이 켐파트너에 의해 구축된 TIB-152 안정한 세포주) 및 Raji 세포(ATCC, CCL-86)를 수거하고 재현탁하고 혼합하였다. 50 ㎕/웰의 시험될 희석된 항체 및 50 ㎕/웰의 혼합된 두 유형의 세포들을 플레이트에 첨가하였고, 상기 플레이트를 5시간 동안 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 100 ㎕의 원-글로(ONE-Glo)™ 루시퍼라제 시약(프로메가(Promega), 카탈로그 #E6120)을 각각의 웰에 첨가하고 3분 이상 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 기계 상에서 발광 신호를 측정하였고, RLU 판독을 기록하였다. 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다.
Figure pct00005
결과는 키메라 항체 Ch2G3 및 Ch4B5가 레포터 유전자를 효과적으로 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 6: 뮤린 항체의 인간화 시험
가능한 면역원성을 감소시키기 위해, 뮤린 항체를 인간화하였다. 키메라 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 각각에 대해 FR 영역(골격 영역)에서 부위-지정된 아미노산 돌연변이를 유발하였다. 아미노산 돌연변이의 상이한 조합에 따라, 상이한 인간화된 항체 중쇄 및 경쇄를 디자인하였고, 상이한 경쇄/중쇄 조합을 암호화하는 플라스미드를 세포 내로 형질감염시켜 인간화된 항체를 생성하였다. 요약하면, 다음과 같다:
먼저, 발현 벡터를 디자인하였다:
중쇄 벡터를 다음과 같이 디자인하였다: 신호 펩타이드 + 돌연변이된 중쇄 가변 영역 서열 + 인간 IgG1 불변 영역 서열.
경쇄 벡터를 다음과 같이 디자인하였다: 신호 펩타이드 + 돌연변이된 경쇄 가변 영역 서열 + 인간 카파 불변 영역 서열.
상기 서열들을 pCEP4 벡터(써모피셔, V04450) 내로 따로 삽입하였다. 발현 벡터는 상기 디자인에 따라 제3자 유전자 합성 회사에 의해 합성되었다. 벡터 플라스미드를 수득한 후, 플라스미드를 추출하였고 검증을 위해 시퀀싱에 보냈다. PEI를 사용하여 적격 플라스미드를 인간 293F 세포 내로 형질감염시키고 연속적으로 배양하였고, 세포 형질감염을 위해 상기 293F 세포를 대수생장기에 도달하도록 무혈청 배지(상하이 오피엠 바이오사이언시스, OPM-293 CD03)에서 배양하였다. 21.4 ㎍의 인간화된 항체 경쇄를 암호화하는 플라스미드 및 23.6 ㎕의 인간화된 항체 중쇄를 암호화하는 플라스미드를 10 ㎖ Opti-MEM®I 환원 혈청 배지(깁코, 31985-070)에 용해시키고 웰을 혼합한 후, 200 ㎍의 PEI를 첨가하고 웰을 혼합하고 15분 동안 실온에서 인큐베이션하고 50 ㎖ 세포에 첨가하였다.
세포 배양 조건: 5% CO2, 37℃, 125 rpm/분. 배양 기간 동안, 세포 생존율이 70% 미만일 때까지 1일째 날 및 3일째 날에 배지 보충제를 첨가하였고, 세포 상청액을 수거하고 원심분리하였다. 원심분리 및 여과 후, 항체 정제를 위해 세포 배양 용액을 친화성 컬럼 상에 로딩하였고, 컬럼을 인삼염 완충제로 세척하고 글리신-염산 완충제(pH 2.7, 0.1 M Gly-HCl)로 용출하고 1 M 트리스 염산(pH 9.0)으로 중화시키고 인산염 완충제에 대해 투석하였고, 정제된 인간화된 항체를 최종적으로 수득하였다.
인간화된 가변 영역의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00006
Figure pct00007
인간화된 항체의 디자인된 가변 영역들을 다음과 같이 상이한 항체로 조합하였다:
Figure pct00008
m4B5의 인간화된 가변 영역의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
인간화된 항체의 디자인된 가변 영역들을 다음과 같이 상이한 항체로 조합하였다:
Figure pct00012
더 우수한 인간화된 변형된 m2G3 항체를 수득하기 위해, hu2G3 VH1의 아미노산 서열을 돌연변이시켰다. 돌연변이 후 중쇄 가변 영역의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00013
돌연변이 후 수득된 HCDR2 서열은 다음과 같다:
Figure pct00014
중쇄 가변 영역 hu2G3 VH1.1 및 hu2G3 VH1.2를 경쇄 가변 영역 hu2G3 VL과 조합하여 신규 최적화된 인간화된 항체를 형성하였다(표 7 참조).
Figure pct00015
전술된 인간화된 항체들을 친화성에 대해 시험하였고(실시예 2의 포획 ELISA 참조), 시험 결과는 인간화된 분자들이 OX40에 결합할 수 있음을 보여주었다.
예시적 2G3 및 이의 인간화된 항체에 대한 친화성 평가(포획 ELISA) 결과는 하기 표 8에 제시되어 있다:
Figure pct00016
예시적 m4B5 및 이의 변형된 항체에 대한 포획 ELISA 시험 결과는 하기 표 9에 제시되어 있다:
Figure pct00017
전술된 경쇄 가변 영역 서열을 경쇄 불변 영역 서열과 조합하여 최종 경쇄 서열을 형성하였고, 전술된 중쇄 가변 영역 서열을 중쇄 불변 영역과 조합하여 최종 중쇄 서열을 형성하였다. 구체적인 경쇄 및 중쇄 불변 영역들은 본원에 개시된 항체 불변 영역들로 제한되지 않는다. 당분야에서 주지된 다른 경쇄 및 중쇄 불변 영역들 및 이들의 돌연변이체들도 항체의 성능을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
예시적 불변 영역은 다음과 같다:
Figure pct00018
예시적 전체 길이 2G3 및 hu4B5-V7(4B5로서도 주지되어 있음) 항체의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
국제 특허출원 공개 제WO2015153513호에 교시된 1A7.gr.1을 참조함으로써 양성 대조군 GPX4를 제조하였고, 이의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 7: 인간화된 항체에 대한 시험관내 결합 친화성 및 동력학의 시험
비아코어(Biacore) 방법은 단백질들 사이의 친화성 및 동력학을 객관적으로 검출하는 잘 인식된 방법이다. 본 발명자들은 친화성 및 결합 동력학을 특징규명하기 위해 비아코어 T200(GE)을 이용하여 본 발명의 시험될 OX40 항체를 분석하였다.
비아코어에 의해 제공된 키트를 사용하여, NHS 표준 아미노산 커플링 방법으로 본 발명의 시험될 재조합 항-OX40 항체를 CM5(GE) 칩에 공유연결하였다. 그 다음, 동일한 완충제로 희석한 일련의 농도 구배의 인간 OX40-His 단백질(시노바이올로지칼 #10481-H08H)을 30 ㎕/분의 유속으로 각각의 주기 내로 로딩하였다. 로딩 후, 상기 키트에 제공된 재생 시약을 사용하여 상기 칩을 재생시켰다. 항원-항체 결합 동력학을 3분 동안 추적하였고, 해리 동력학을 10분 동안 추적하였다. 1:1(Langmuir) 결합 모델로 비아에발루션(BIAevaluation) 소프트웨어(GE)를 이용함으로써, 수득된 데이터를 분석하였다. 이 방법에 의해 측정된, 키메라 항체의 ka(kon), kd(koff) 및 KD 값은 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00025
결과는 2G3 및 4B5 둘 다가 OX40에 효과적으로 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 8: 항체에 의한 OX40-OX40L 결합 차단의 ELISA 시험
웰 플레이트를 OX40 리간드(아크로바이오시스템, OXL-H52Q8)로 코팅하고 차단하였고, 시험될 구배 희석된 항체를 첨가하고(인간 Bio-OX40-FC(아크로바이오시스템, OX40-H5255, 바이오틴으로 표지부착됨)를 포함하는 용액으로 항체를 희석하고 40분 동안 예비인큐베이션한 후 플레이트에 첨가함) 40분 동안 인큐베이션하고 세척하였다. 이어서, SA-HRP(잭슨 이뮤노리서치, 016-030-084)를 첨가하고 40분 동안 인큐베이션하였다. 현상 용액 및 중단 용액을 첨가하였고, OD 값을 측정하였다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00026
결과는 2G3 및 4B5 둘 다가 OX40과 OX40L의 결합을 차단할 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 인간화된 항체의 활성 데이터
웰 플레이트를 항-CD3 항체(켐파트너, A05-001)로 코팅하고 하룻밤 동안 4℃에서 놓아두고 PBS로 3회 세척하였고; Jurkat-NF-Kb luc-hOX40 세포(ATCC, TIB-152, 상하이 켐파트너에 의해 구축된 안정한 세포주) 및 Raji 세포(ATCC, CCL-86)를 수거하였다. 상기 2종의 세포들을 재현탁하고 혼합하였다. 50 ㎕/웰의 시험될 희석된 항체 및 50 ㎕/웰의 상기 혼합된 2종의 세포들을 플레이트에 첨가하였고, 상기 플레이트를 5시간 동안 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 원-글로™ 루시퍼라제 시약(프로메가, 카탈로그 #E6120)을 각각의 웰에 첨가하고 3분 이상 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 기계 상에서 발광 신호를 측정하였고, RLU 판독을 기록하였다. 결과는 표 12에 제시되어 있다. 결과는 2G3 및 4B5 둘 다가 레포터 유전자를 효과적으로 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
Figure pct00027
실시예 10: 시험관내 세포 기능 시험
CD4+ 메모리 T 세포를 단리하고 항-CD3 항체로 코팅된 96웰 플레이트(켐파트너, A05-001)에 시험될 항체와 함께 첨가하고 72시간 동안 37℃에서 함께 인큐베이션하였고, 상청액을 수거하여 IFN-γ를 검출하였다. 결과는 도 2 및 표 13에 제시되어 있다. 결과는 GPX4, 4B5 및 2G3이 IFN-γ의 방출을 유의미하게 향상시킬 수 있고, 2G3이 10 ng/㎖에서 최대 자극 효과를 달성할 수 있음을 보여준다.
Figure pct00028
실시예 11: 항-OX40 항체에 의한 종양 세포 생장의 억제
B-hTNFRSF4(OX40) 인간화된 마우스(B-hTNFRSF4(OX40) 인간화된 마우스, 바이오사이토겐 장쑤 진 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드(Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co., Ltd.)로부터 입수됨), 암컷, 17 내지 20 g, 6주령 내지 7주령.
대수생장기에 있는 MC38 종양 세포 7(난징 인헤 바이오메디슨 컴퍼니 리미티드(Nanjing Yinhe Biomedicine Co., Ltd.)로부터 구입됨)을 수거하였고, 세포 농도를 PBS 완충제로 5×106/㎖까지 조절하였고, 0.1 ㎖의 세포 현탁액을 OX40 마우스의 옆구리에 접종하였다. 접종 후 상기 마우스를 종양의 성장에 대해 모니터링하였다. 접종 후 7일째 날, 종양 보유 마우스의 옆구리에서 평균 종양 부피는 102.5 mm3에 도달하였다. 종양 크기에 따라 마우스들을 군으로 나누고 투여하고 모니터링하였다. 군 배정 정보는 표 14에 표시되어 있다.
Figure pct00029
마우스에서 MC38 결장암 세포 이종이식편의 성장에 대한 OX40 인간화된 항체의 억제 효과를 시험하였다.
종양 보유 마우스의 종양 부피 및 중량의 측정: 칼리퍼를 이용하여 종양을 매주 2회 측정하였다. 식 V = 0.5 a×b2에 따라 종양 부피를 계산하였는데, 이때 a 및 b는 각각 종양의 길이 직경 및 폭 직경을 표시한다; 종양 성장 이종이식편 TGI(%) = [1-T/C]×100. 모든 종양 보유 마우스들의 체중을 매주 2회 측정하였다.
투여 후 20일째 날, IgG1 대조군의 평균 종양 부피는 1732.593 mm3에 도달하였고; 시험 화합물 2G3 저용량 투여 군(0.3 mg/kg), 중간 용량 투여 군(2G3, 1 mg/kg) 및 고용량 투여 군(2G, 3 mg/kg)의 평균 종양 부피는 각각 930.37 mm3, 303.49 mm3 및 155.79 mm3에 도달하였다. 중간 용량 군 및 고용량 군은 대조군에 비해 종양 성장을 유의미하게 억제하였고(**P<0.01), 각각 최대 49%, 88% 및 97.0%의 종양 성장 억제율과 함께 예비 용량 의존적 관계가 관찰되었다. 3 mg/kg GPX4 군에서 평균 종양 부피는 대조군의 평균 종양 부피와 유의미하게 상이한 362.47 mm3이었고, 3 mg/kg GPX4 군은 최대 84%의 종양 성장 억제율로 유의미한 종양 성장 억제도 보였다(*P<0.05).
투여 후 20일째 날에 시험을 종결하였다. 결과는 표 15, 도 3a 및 도 3b에 제시되어 있다. 모든 치료받은 마우스들을 안락사시켰고, 종양 보유 마우스로부터 피하 이종이식편 덩어리를 제거하였고 이의 중량을 측정하였다. 대조군에서 종양 덩어리의 평균 중량은 1.568 g이었고; 저용량 군(0.3 mg/kg), 중간 용량 군(1 mg/kg) 및 고용량 군(3 mg/kg)에서 시험 화합물 2G3의 경우 평균 종양 중량은 각각 0.926 g, 0.251 g 및 0.181 g에 도달하였고; 중간 용량 군 및 고용량 군은 대조군에 비해 종양 성장을 유의미하게 억제하였다(**P<0.01). 한편, GPX4(3 mg/kg) 투여 군에서, 평균 종양 중량은 대조군의 평균 종양 중량과 유의미하게 상이한 0.372 g이었고, GPX4(3 mg/kg) 투여 군은 MC38 종양 세포의 생장에 대한 유의미한 억제 효과도 보였다(**P<0.01).
시험 동안, 모든 치료받은 종양 보유 마우스들의 체중에 있어서 분명한 비정상은 없었다. 동시에, 의약 치료 동안 분명한 비정상적인 행동 및 다른 징후는 없었다.
Figure pct00030
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD. <120> AN ANTI-OX40 ANTIBODY, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF AND THE PHARMACEUTICAL USE <130> 2021-FPA-0643 <160> 42 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of Murine monoclonal antibody m4B5 <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(113) <223> Heavy chain variable region of Murine monoclonal antibody m4B5 <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Leu His Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial 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Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kappa light chain constant region <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <223> kappa light chain constant region <400> 36 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 37 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Antibody 2G3 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(449) <223> Heavy chain of Antibody 2G3 <400> 37 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Trp Asp Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Pro Leu Tyr Phe Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 38 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of antibody 2G3 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(214) <223> Light chain of antibody 2G3 <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ile Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asn Thr Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 39 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of antibody 4B5 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(443) <223> Heavy chain of antibody 4B5 <400> 39 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Leu His Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Glu Asp Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of antibody 4B5 <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(214) <223> Light chain of antibody 4B5 <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 41 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of control antibody GPX4 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(447) <223> Heavy chain of control antibody GPX4 <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 42 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of control antibody GPX4 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(214) <223> Light chain of control antibody GPX4 <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (18)

  1. 중쇄 가변 영역이
    Ⅰ) 각각 서열번호 3, 4 및 5로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 3, 4 및 5로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체;
    Ⅱ) 각각 서열번호 11, 12 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 11, 12 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체;
    Ⅲ) 각각 서열번호 11, 33 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 11, 33 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체; 또는
    Ⅳ) 각각 서열번호 11, 34 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 또는 각각 서열번호 11, 34 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 HCDR 변이체;를 포함하고/하거나
    경쇄 가변 영역이
    Ⅰ) 각각 서열번호 6, 7 및 8로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 6, 7 및 8로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 LCDR 변이체; 또는
    Ⅱ) 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 비교될 때 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 LCDR 변이체;를 포함하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    바람직하게는 상기 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    ⅰ) 각각 서열번호 3, 4 및 5로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 6, 7 및 8로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    ⅱ) 각각 서열번호 11, 12 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;
    ⅲ) 각각 서열번호 11, 33 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3; 또는
    ⅳ) 각각 서열번호 11, 34 및 13으로 표시된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 14, 15 및 16으로 표시된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;을 포함하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    뮤린 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 이의 단편인 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 항원-결합 단편은 Fab, Fab', Fv, scFv, F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 변이체(들)로부터 유래되는 중쇄 골격 영역을 추가로 포함하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 항체는 불변 영역을 포함하고;
    바람직하게는 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이의 돌연변이체 서열(들)로부터 유래되고;
    바람직하게는 경쇄 불변 영역은 인간 카파, 람다 사슬 또는 이의 돌연변이체 서열(들)로부터 유래되고;
    보다 바람직하게는 상기 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 35로 표시되거나 서열번호 35에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 갖고;
    보다 바람직하게는 상기 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 36으로 표시되거나 서열번호 36에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은
    Ⅰ) 서열번호 1로 표시되거나 서열번호 1에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    Ⅱ) 서열번호 9로 표시되거나 서열번호 9에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    Ⅲ) 서열번호 17, 18, 31 및 32 중 어느 한 서열번호로 표시되거나 서열번호 17, 18, 31 또는 32에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    Ⅳ) 서열번호 26, 27, 28, 29 및 30 중 어느 한 서열번호로 표시되거나 서열번호 26, 27, 28, 29 또는 30에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;을 포함하고/하거나
    상기 경쇄 가변 영역은
    Ⅰ) 서열번호 2로 표시되거나 서열번호 2에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    Ⅱ) 서열번호 10으로 표시되거나 서열번호 10에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    Ⅲ) 서열번호 19 및 20 중 어느 한 서열번호로 표시되거나 서열번호 19 또는 20에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    Ⅳ) 서열번호 21, 22, 23, 24 및 25 중 어느 한 서열번호로 표시되거나 서열번호 21, 22, 23, 24 또는 25에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;을 포함하고,
    바람직하게는
    ⅰ) 서열번호 1로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 2로 표시된 경쇄 가변 영역;
    ⅱ) 서열번호 9로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 10으로 표시된 경쇄 가변 영역;
    ⅲ) 서열번호 17 또는 18로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 19로 표시된 경쇄 가변 영역;
    ⅳ) 서열번호 17 또는 18로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20으로 표시된 경쇄 가변 영역; 또는
    ⅴ) 서열번호 26, 27, 28, 29 및 30 중 어느 한 서열번호로 표시된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 21, 22, 23, 24 및 25 중 어느 한 서열번호로 표시된 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    ⅰ) 서열번호 37로 표시되거나 서열번호 37에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는
    서열번호 38로 표시되거나 서열번호 38에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄; 또는
    ⅱ) 서열번호 39로 표시되거나 서열번호 39에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는
    서열번호 40으로 표시되거나 서열번호 40에 대한 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄;를 포함하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 인간 OX40에 대한 결합을 위해 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 청구항 8의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서,
    바람직하게는 상기 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터 또는 바이러스 벡터인 벡터.
  10. 청구항 9의 벡터를 포함하는 숙주 세포로서,
    바람직하게는 상기 숙주 세포는 세균, 효모 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포이고;
    보다 바람직하게는 상기 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이, 피키아 파스토리스, 중국 햄스터 난소 세포 및 인간 배아 신장 293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  11. 청구항 10의 숙주 세포를 배양하는 단계;
    항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계;
    임의적으로, 상기 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 단계;를 포함하는 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는 OX40을 검출 또는 측정하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 시약.
  14. 치료 또는 예방 유효량의 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
    하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제;를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 치료 또는 예방 유효량의 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 청구항 14의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    바람직하게는 상기 질환 또는 장애는 암이고;
    보다 바람직하게는 상기 암은 폐암, 전립선암, 유방암, 두경부암, 식도암, 위 암종, 결장암, 대장암, 방광암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 간암, 흑색종, 신장암, 편평 세포 암종 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 치료 또는 예방 유효량의 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 청구항 14의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 인간 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법으로서,
    바람직하게는 향상된 면역 반응은 T 이펙터 세포의 증가된 면역자극/이펙터 기능 및/또는 T 조절 세포의 하향조절된 면역억제 기능을 포함하는 방법.
  17. - 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편;
    - 청구항 8의 폴리뉴클레오티드;
    - 청구항 9의 벡터;
    - 청구항 14의 약학적 조성물;로부터 선택되는 어느 하나의 의약의 제조에 있어서의 용도로서,
    상기 의약은 암을 치료 또는 예방하거나, 인간 대상체에서 면역 반응을 향상시키기 위해 사용되고;
    바람직하게는 상기 암은 폐암, 전립선암, 유방암, 두경부암, 식도암, 위 암종, 결장암, 대장암, 방광암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 간암, 흑색종, 신장암, 편평 세포 암종 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  18. OX40 발현과 관련된 질환 또는 장애를 검출 또는 진단하기 위한 키트의 제조에 있어서의 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도로서,
    바람직하게는 상기 질환 또는 장애는 암이고;
    보다 바람직하게는 상기 암은 폐암, 전립선암, 유방암, 두경부암, 식도암, 위 암종, 결장암, 대장암, 방광암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 간암, 흑색종, 신장암, 편평 세포 암종 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
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