BR112019018533A2 - anticorpo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, método para tratar uma doença, e, uso de um anticorpo - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a novos anticorpos e seu uso em medicina. em particular, a invenção refere-se a anticorpos biespecíficos capazes de se ligar à pd-l1 humana e capazes de se ligar a cd3 humano. também são providas novas classes de anticorpos capazes de se ligar à pd-l1 humana. a invenção refere-se adicionalmente a usos dos anticorpos da invenção e a métodos, construções de ácidos nucleicos e células hospedeiras para a produção de anticorpos da invenção.

Description

ANTICORPO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE
EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA, E, USO
DE UM ANTICORPO
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a novos anticorpos e seu uso em medicina. Em particular, a invenção refere-se a anticorpos biespecíficos capazes de se ligar à PD-L1 humana e capazes de se ligar a CD3 humano. Também são providas novas classes de anticorpos capazes de se ligar à PDL1 humana. A invenção refere-se adicionalmente a usos dos anticorpos da invenção e a métodos, construções de ácidos nucleicos e células hospedeiras para a produção de anticorpos da invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] O ligando de morte programada 1 (PD-L1, PDL1, CD274, B7H1, B7-H1) é uma proteína de membrana do tipo I de passagem única de 33 kDa. Três isoformas de PD-L1 foram descritas, com base em splicing alternativo. A PD-L1 pertence à superfamília da imunoglobulina (Ig) e contém um domínio do tipo C2 do tipo Ig e um domínio do tipo V do tipo Ig. As células T e B isoladas recentemente expressam quantidades desprezíveis de PD-L1 e uma fração (cerca de 16%) de monócitos CD 14+ expressa constitutivamente PD-L1 (Rietz e Chen, 2004 Am J Transplant 4: 8-14). Sabe-se que o interferon-γ (IFN-γ) regula positivamente a PD-L1 nas células tumorais (Abiko et al., 2015 Br J Cancer 112:1501-1509; Dong et al., 2002 Nature Medicine 8(8): 793-800).
[003] A PD-L1 obstrui a imunidade antitumoral por 1) tolerar as células T reativas ao tumor ligando-se ao seu receptor PD-1 (CD279) nas células T ativadas (Dong et al., supra; Latchman et al., 2004 Proc Natl Acad Sei USA 101, 10691-6); 2) tomar as células tumorais resistentes à célula T CD8+ e à lise mediada por ligando Fas por sinalização de PD-1 através de
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PD-L1 expressa em células tumorais (Azuma et al., 2008 Blood 111, 363543); 3) tolerar células T por sinalização reversa através do CD80 expresso em células T (B7.1) (Butte et al., 2007 Immunity 27, 111-22; Park et al., 2010 Blood 116, 1291-8); e 4) promover o desenvolvimento e manutenção de células T reguladoras induzidas (Francisco et al., 2009 J Exp Med 206, 301529). A PD-L1 é expressa em muitos cânceres humanos, incluindo melanoma, câncer de ovário, pulmão e cólon (Dong et al., supra).
[004] Os anticorpos bloqueadores de PD-L1 mostraram atividade clínica em vários cânceres que superexpressam PD-L1 (incluindo melanoma, CPCNP). Por exemplo, o atezolizumabe é um anticorpo monoclonal IgGl humanizado contra PD-L1. Atualmente, está em ensaios clínicos como imunoterapia para várias indicações, incluindo vários tipos de tumores sólidos (ver, por exemplo, Rittmeyer et al., 2017 Lancet 389:255-265). O avelumabe, um anticorpo PD-L1, (Kaufman et al. Lancet Oncol. 2016;17(10): 1374-1385) foi aprovado pela FDA para o tratamento de adultos e pacientes pediátricos com 12 anos de idade ou mais com carcinoma de células Merkel metastático e atualmente está em ensaios clínicos em várias indicações de câncer, incluindo câncer de bexiga, câncer de estômago, câncer de cabeça e pescoço, mesotelioma, CPCNP, câncer de ovário e câncer renal. O durvalumabe, um anticorpo PD-L1, é aprovado para indicações localmente avançadas ou metastáticas de carcinoma urotelial metastático e está em desenvolvimento clínico em vários tumores sólidos e cânceres sanguíneos (ver, por exemplo, Massard et al., 2016 J Clin Oncol. 34(26):3119-25). Outros anticorpos antiPD-L1 foram descritos em W02004004771, W02007005874, W02010036959, W02010077634, WO2013079174, WO2013164694, WO2013173223 e WO2014022758.
[005] Embora tenham sido feitos progressos significativos na erradicação do câncer, ainda é necessário melhorar ainda mais a terapia de câncer baseada em anticorpos.
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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Em um primeiro aspecto, a invenção provê novos anticorpos anti-PD-Ll compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana. Os anticorpos desse segundo aspecto da invenção podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos e, se multiespecíficos, os ditos anticorpos multiespecíficos podem ou não compreender uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano.
[007] A invenção provê adicionalmente anticorpos biespecíficos compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon). Esse anticorpo biespecífico tem um efeito duplo:
Em primeiro lugar, através da sua região de ligação à PD-L1, o anticorpo liga-se às células tumorais que expressam PD-L1, enquanto através da sua região de ligação ao CD3, o anticorpo liga-se às células Τ. O anticorpo aproxima as células T das células tumorais, facilitando assim a morte das células tumorais pelas células T. Além disso, sem se limitar a nenhuma teoria específica, é hipotético que aproximar células que expressam PD-L1 e células T efetoras umas das outras possa iniciar a liberação de interferon-γ que, por sua vez, poderia regular positivamente a PD-L1 nas células tumorais, facilitando assim o recrutamento de mais anticorpos para o tumor e intensificando ainda mais sua morte.
[008] Em segundo lugar, os anticorpos biespecíficos da invenção inibem a ligação da PD-L1 humana à PD-1 humana, impedindo assim que a PD-L1 obstrua a imunidade antitumoral através da PD-1.
[009] Os anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll são particularmente úteis em contextos terapêuticos nos quais é desejado o alvejamento específico e a morte mediada por células T que expressam PD-L1. Os anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll são altamente eficientes na mediação da morte de células que expressam PD-L1, incluindo, em algumas modalidades, células
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4/163 com baixo número de cópias de PD-L1.
[0010] Os anticorpos da invenção são capazes de se ligar a células que expressam PD-L1, tais como células MDA-MB-231, PC3 ou HELA. Além disso, os anticorpos da invenção inibem a interação entre PD-L1 e PD-1 e podem mediar a morte de células MDA-MB-231, PC3 e/ou HELA por PBMCs ou células T purificadas.
[0011] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso dos anticorpos da invenção em medicina, em particular para o tratamento de câncer.
[0012] Esses e outros aspectos da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0013] Figura 1: Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll e bl2xPD-Ll e seus equivalentes de PD-L1 monoespecíficos e bivalentes a células MDA-MB-231. (A) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338FEAR e IgGl-338-FEAR, (B) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547FEAR e IgG1-547-FEAR, (C) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511LC33S-FEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR, (D) Ligação de bs!gGl-bl2FEALx338-FEAR (E) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR, (F) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR. Os dados mostrados são a intensidade de fluorescência média (MFI), como determinado por citometria de fluxo, para um experimento representativo.
[0014] Figura 2: Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll e bl2xPD-Ll e seus equivalentes de PD-L1 monoespecíficos e bivalentes a células PC3. (A) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR e IgGl-338-FEAR, (B) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR e IgGl-547-FEAR, (C) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33SFEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR, (D) Ligação de bs!gGl-bl2-FEALx338FEAR (E) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR, (F) Ligação de
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5/163 bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR. Os dados mostrados são a intensidade de fluorescência média (MFI), como determinado por citometria de fluxo, para um experimento representativo.
[0015] Figura 3: Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll e bl2xPD-Ll e seus equivalentes de PD-L1 monoespecíficos e bivalentes a células HELA. (A) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR e IgGl-338-FEAR, (B) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR e IgG1-547-FEAR, (C) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33SFEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR, (D) Ligação de bsIgGl-b!2-FEALx338FEAR (E) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR, (F) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR. Os dados mostrados são a intensidade de fluorescência média (MFI), como determinado por citometria de fluxo, para um experimento representativo.
[0016] Figura 4: Ligação de anticorpos biespecíficos bl2xPD-Ll e seus equivalentes de PD-L1 monoespecíficos e bivalentes a células SKMES-1. (A) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx338-FEAR e IgGl-338-FEAR, (B) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR e IgGl-547-FEAR, (C) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR e IgGl-511-LC33SFEAR. Os dados mostrados são a intensidade de fluorescência média (MFI), como determinado por citometria de fluxo, para um experimento representativo.
[0017] Figura 5: Ligação de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll e bl2xPD-Ll e seus equivalentes de PD-L1 monoespecíficos e bivalentes a células CHO transfectadas com PD-L1 de macacos cinomolgos. (A) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR e IgGl-338-FEAR, (B) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR e IgGl-547-FEAR, (C) Ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR e IgGl-511LC33S-FEAR, (D) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx338-FEAR (E) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR, (F) Ligação de bsIgGl-bl2-FEALx511Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 12/222
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LC33S-FEAR. Os dados mostrados são a intensidade de fluorescência média (MFI), como determinado por citometria de fluxo, para um experimento representativo.
[0018] Figura 6: Bloqueio cruzado de anticorpos. A determinação do bloqueio cruzado de anticorpos foi realizada usando interferometria de biocamada. Todos os anticorpos foram produzidos em uma cadeia principal de FEAR IgGl. Na tabela, respostas >0,1 nm foram consideradas pares de anticorpos não bloqueadores (resultados indicados como números simples na tabela), respostas abaixo de 0,1 foram consideradas pares de anticorpos bloqueadores (resultados indicados como números em negrito na tabela), enquanto algumas respostas nem bloqueadores nem não bloqueadores foram indicadas como anticorpos mostrando comportamento de deslocamento (resultados indicados em asterisco (*) na tabela). MEDI = MEDI4736; MPDL = MPDL3280A. Figuras representativas são mostradas para (A) deslocamento, (B) pares de anticorpos bloqueadores e (C) não bloqueadores.
[0019] Figura 7: Efeito de anticorpos biespecíficos bl2xPD-Ll e seus equivalentes de PD-L1 monoespecíficos e bivalentes na interação PD-1/PD-L1. O efeito de (A) bs!gGl-bl2-FEALx338-FEAR e IgGl-338FEAR, (B) bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR e IgGl-547-FEAR, (C) bsIgGlbl2-FEALx511-LC33S-FEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR foi determinado em um bioensaio de bloqueio PD-1/PD-L1. Os dados mostrados são fator de indução em relação ao controle (sem adição de anticorpo), para um experimento representativo.
[0020] Figura 8: Indução de citotoxicidade in vitro de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll em células MDA-MB-231. As células MDA-MB231 eram bs!gGl-huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR, bs!gGl-huCD3-HlLlFEALx547-FEAR e bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR incubadas. As células T purificadas (A) ou PBMCs (B) foram usadas como células efetoras. Os dados mostrados são % de células viáveis, para um
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7/163 experimento representativo.
[0021] Figura 9: Indução de citotoxicidade in vitro de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll em células PC-3. As células PC-3 eram bsIgGlhuCD3-HlLl-FEALx338-FEAR, bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR e bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR incubadas. As células T purificadas (A) ou PBMCs (B) foram usadas como células efetoras. Os dados mostrados são % de células viáveis, para um experimento representativo.
[0022] Figura 10: Indução de citotoxicidade in vitro de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll em células HELA. As células HELA eram bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR, bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547FEAR e bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR incubadas. As células T purificadas (A) ou PBMCs (B) foram usadas como células efetoras. Os dados mostrados são % de células viáveis, para um experimento representativo.
[0023] Figura 11: Proliferação e ativação de células T por anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll.
[0024] Os anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll foram testados em um ensaio in vitro para medir a ativação e proliferação de células T, usando células MDA-MB-231 como células alvo e células T purificadas como células efetoras. (A) Contagem total de células T, (B) Contagem de células T CD69pos, (C) Contagem de células T CD25pos.
[0025] Figura 12: Variação de expressão gênica na ligação de anticorpos PD-L1 a variantes de PD-L1 com mutações de alanina nas posições 42 a 131. A variação de expressão gênica foi definida como Logio(gMFI normalizada^ mutante]/gMFI normalizada^t])· Os resíduos em que a variação de expressão gênica na ligação foi menor que a variação de expressão gênica média - 1,5 x SD (indicada pela linha pontilhada) foram considerados ‘perda de mutantes de ligação’. Os resíduos com uma variação de expressão gênica positiva na ligação são a perda de resíduos de ligação
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8/163 para o anticorpo de controle IgGl-625-FEAR-A488 (resíduos 75 e 86). O número acima do eixo x refere-se às posições de aminoácidos.
[0026] Figura 12: Variação de expressão gênica na ligação de anticorpos PD-L1 a variantes de PD-L1 com mutações de alanina nas posições 42 a 131. A variação de expressão gênica foi definida como Logio(gMFI normalizada^ mutante]/gMFI normalizada^t])· Os resíduos em que a variação de expressão gênica na ligação foi menor que a variação de expressão gênica média - 1,5 x SD (indicada pela linha pontilhada) foram considerados ‘perda de mutantes de ligação’. Os resíduos com uma variação de expressão gênica positiva na ligação são a perda de resíduos de ligação para o anticorpo de controle IgGl-625-FEAR-A488 (resíduos 75 e 86). O número acima do eixo x refere-se às posições de aminoácidos.
[0027] Figura 13: Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos de células MDA-MB-231 por anticorpos PD-L1, como determinado em um ensaio de liberação de 51Cr.
[0028] A ADCC de células MDA-MB-231 foi determinada em um ensaio de liberação de 51Cr in vitro com PBMC recém-isolada de um doador humano saudável na razão E:T de 100:1. Para cada ponto de dados, é apresentada a média e o desvio padrão de 3 amostras replicadas. E mostrado um exemplo representativo com PBMC de um doador.
[0029] Figura 14: Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos de células MDA-MB-231 por anticorpos PD-L1, como determinado em um Bioensaio Repórter de ADCC Luminescente.
[0030] A ADCC de células MDA-MB-231 por anticorpos PD-L1 foi quantificado usando células repórter Jurkat que expressam FcyRIIIa que expressam luciferase após a ligação a FcyRIIIa. A produção de luciferase é apresentada por unidades de luminescência relativa (URL). Para cada ponto de dados, é apresentada a média e o desvio padrão de duplicatas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
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Definições [0031] O termo “imunoglobulina” refere-se a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas que consiste em dois pares de cadeias polipeptídicas, um par de cadeias leves (L) de baixo peso molecular e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro interconectadas por ligações dissulfeto. A estrutura das imunoglobulinas foi bem distinguida. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Em resumo, cada cadeia pesada é tipicamente constituída por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como VH ou VH) e uma região constante da cadeia pesada (aqui abreviada como CH ou CH). A região constante da cadeia pesada é tipicamente composta por três domínios, CHI, CH2 e CH3. A região de dobradiça é a região entre os domínios CHI e CH2 da cadeia pesada e é altamente flexível. As ligações dissulfeto na região de dobradiça fazem parte das interações entre duas cadeias pesadas em uma molécula de IgG. Cada cadeia leve é tipicamente constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL ou VL) e uma região constante da cadeia leve (aqui abreviada como CL ou CL). A região constante da cadeia leve é tipicamente composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis em sequência e/ou forma de alças estruturalmente definidas), também denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas de aminoterminal a carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Salvo indicação em contrário ou contradito pelo contexto, as sequências de CDR neste documento são identificadas de acordo com as regras do IMGT usando DomainGapAlign Versão 4.9.2 (2016-09-26)
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10/163 (Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212 e Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.-P. Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010); ver também endereço http da internet http://www.imgt.org/). Salvo indicação em contrário ou contradito pelo contexto, a referência às posições de aminoácidos nas regiões constantes da presente invenção está de acordo com a numeração da UE (Edelman et al., Proc Natl Acad Sei USA. 1969 May;63(l):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242). Por exemplo, a SEQ ID NO:93 aqui apresenta as posições de aminoácidos 118-447 de acordo com a numeração da UE, da região constante da cadeia pesada de IgGlm(f).
[0032] O termo “aminoácido correspondente à posição...”, como usado aqui, refere-se a um número de posição de aminoácido em uma cadeia pesada de IgGl humana. As posições correspondentes de aminoácidos em outras imunoglobulinas podem ser encontradas pelo alinhamento com a IgGl humana. Assim, um aminoácido ou segmento em uma sequência que “corresponde a” um aminoácido ou segmento em outra sequência é aquele que se alinha ao outro aminoácido ou segmento usando um programa de alinhamento de sequência padrão, como ALIGN, ClustalW ou similar, tipicamente em configurações padrão e possui pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com uma cadeia pesada de IgGl humana. E considerado bem conhecido na técnica como alinhar uma sequência ou segmento em uma sequência e, assim, determinar a posição correspondente em uma sequência para uma posição de aminoácido de acordo com a presente invenção.
[0033] O termo “anticorpo” (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina ou um derivado de qualquer um deles, que tem a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno em condições fisiológicas típicas com meia-vida de períodos significativos de tempo, como
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11/163 pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias etc., ou qualquer outro período relevante funcionalmente definido (como um tempo suficiente para induzir, promover, intensificar e/ou modular uma resposta fisiológica associada à ligação do anticorpo ao antígeno e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar uma atividade do efetor). As regiões variáveis das cadeias pesada e leve da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. O termo “região de ligação ao anticorpo”, onde usado aqui, refere-se à região que interage com o antígeno e compreende as regiões VH e VL. O termo anticorpo, quando usado aqui, compreende não apenas anticorpos monoespecíficos, mas também anticorpos multiespecíficos que compreendem múltiplos, como dois ou mais, por exemplo, três ou mais regiões diferentes de ligação ao antígeno. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (como células efetoras) e componentes do sistema complemento, como Clq, o primeiro componente da via clássica de ativação do complemento. Como indicado acima, o termo anticorpo aqui, a menos que indicado de outra forma ou claramente contradito pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que são fragmentos de ligação ao antígeno, isto é, retêm a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno. Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno abrangidos pelo termo “anticorpo” incluem (i) um fragmento Fab’ ou Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI ou um anticorpo monovalente como descrito em W02007059782 (Genmab); (ii) fragmentos
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F(ab’)2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste essencialmente nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo essencialmente nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente em um domínio VH e também chamado de anticorpos de domínio (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(l 1):48490); (vi) camelídeos ou nanocorpos (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(l):lll-24) e (vii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam produzidos como uma única cadeia proteica em que as regiões VL e VH emparelham-se para formar moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (scFv), ver, por exemplo, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única são abrangidos pelo termo anticorpo, a menos que indicado de outra forma ou claramente indicado pelo contexto. Embora esses fragmentos sejam geralmente incluídos no significado de anticorpo, eles coletivamente e cada um independentemente são características únicas da presente invenção, apresentando diferentes propriedades e utilidades biológicas. Estes e outros fragmentos de anticorpo úteis no contexto da presente invenção, bem como formatos biespecíficos de tais fragmentos, são discutidos mais adiante. Também deve ser entendido que o termo anticorpo, a menos que especificado de outra forma, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), polipeptídeos semelhantes a anticorpos, como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, e fragmentos de anticorpos que retêm a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno (fragmentos de ligação ao antígeno) providos por
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13/163 qualquer técnica conhecida, como clivagem enzimática, síntese de peptídeos e técnicas recombinantes. Um anticorpo como gerado pode possuir qualquer isótipo. Como usado aqui, o termo “isótipo” refere-se à classe de imunoglobulina (por exemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM) que é codificada pelos genes da região constante da cadeia pesada. Quando um isótipo específico, por exemplo, IgGl é mencionado aqui, o termo não está limitado a uma sequência de isótipos específica, por exemplo, uma sequência de IgGl específica, mas é usada para indicar que o anticorpo está mais próximo em sequência desse isótipo, por exemplo, IgGl, do que de outros isótipos. Assim, por exemplo, um anticorpo IgGl da invenção pode ser uma variante de sequência de um anticorpo IgGl de ocorrência natural, incluindo variações nas regiões constantes.
[0034] O termo “anticorpo monoclonal” como usado aqui refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação única para um epítopo particular. Consequentemente, o termo “anticorpo monoclonal humano” refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico ou transcromossômico, como um camundongo transgênico, com um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve, fundido a um célula imortalizada.
[0035] O termo “anticorpo biespecífico” ou “bs” no contexto da presente invenção refere-se a um anticorpo com duas regiões diferentes de ligação ao antígeno definidas por diferentes sequências de anticorpos. Em algumas modalidades, as ditas regiões diferentes de ligação ao antígeno ligam diferentes epítopos no mesmo antígeno. No entanto, em modalidades
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14/163 preferidas, as ditas regiões diferentes de ligação a antígeno ligam antigenos alvo diferentes. Um anticorpo biespecífico pode ter qualquer formato, incluindo qualquer um dos formatos de anticorpos biespecíficos descritos abaixo.
[0036] Quando usados aqui, os termos “meia molécula”, “braço fab” e “braço” se referem a um par de cadeia pesada-cadeia leve.
[0037] Quando um anticorpo biespecífico é descrito como compreendendo um anticorpo de meia molécula “derivado de” um primeiro anticorpo e um anticorpo de meia molécula “derivado de” um segundo anticorpo, o termo “derivado de” indica que o anticorpo biespecífico foi gerado por recombinação, por qualquer método conhecido, das ditas meias moléculas de cada um dos ditos primeiro e segundo anticorpos no anticorpo biespecífico resultante. Nesse contexto, “recombinar” não pretende ser limitado por nenhum método específico de recombinação e, portanto, inclui todos os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos descritos abaixo, incluindo, por exemplo, a recombinação por troca de meias moléculas, bem como a recombinação em nível de ácido nucleico e/ou através da coexpressão de duas meias moléculas nas mesmas células.
[0038] O termo “anticorpo monovalente” significa, no contexto da presente invenção, que uma molécula de anticorpo é capaz de se ligar a uma única molécula de um antígeno e, portanto, não é capaz de reticular antigenos ou células.
[0039] O termo “comprimento total” quando usado no contexto de um anticorpo indica que o anticorpo não é um fragmento, mas contém todos os domínios do isótipo particular normalmente encontrado para esse isótipo na natureza, por exemplo, os domínios VH, CHI, CH2, CH3, dobradiça, VL e CL para um anticorpo IgGl.
[0040] Quando usado aqui, a menos que seja contradito pelo contexto, o termo “região Fe” refere-se a uma região de anticorpo que consiste nas duas
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15/163 sequências Fc das cadeias pesadas de uma imunoglobulina, em que as ditas sequências Fc compreendem pelo menos uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3.
[0041] Quando usado aqui, o termo “interação heterodimérica entre a primeira e a segunda regiões CH3” refere-se à interação entre a primeira região CH3 e a segunda região CH3 em uma primeira/segunda proteína heterodimérica CH3.
[0042] Quando usado aqui, o termo “interações homodiméricas da primeira e da segunda regiões CH3” refere-se à interação entre uma primeira região CH3 e outra primeira região CH3 em uma primeira/primeira proteína heterodimérica CH3 e a interação entre uma segunda região CH3 e outra segunda região CH3 em uma segunda/segunda proteína homodimérica CH3.
[0043] Como usados aqui, os termos “capaz de se ligar” ou “ligação” no contexto da ligação de um anticorpo a um antígeno ou epítopo predeterminado são tipicamente uma ligação com uma afinidade correspondente a uma de cerca de IO'6 M ou menos , como cerca de IO'7 M ou menos, como cerca de 10'8 M ou menos, como cerca de IO'9 M ou menos, cerca de IO'10 M ou menos, ou cerca de 10'11 M ou menos, quando determinado usando a Interferometria de Biocamada (BLI), por exemplo, como descrito no Exemplo 8, ou, por exemplo, quando determinado usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como ligando e o anticorpo como analito. O anticorpo se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade correspondente a uma que é pelo menos dez vezes menor, como pelo menos 100 vezes menor, por exemplo, pelo menos 1.000 vezes menor, como pelo menos 10.000 vezes menor, por exemplo, pelo menos 100.000 vezes menor que sua afinidade para a ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) que não seja o antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. A quantidade com a qual a afinidade é
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16/163 menor depende da Kd do anticorpo, de modo que, quando a Kd do anticorpo é muito baixa (ou seja, o anticorpo é altamente específico), o grau em que a afinidade para o antígeno é menor que a afinidade para um antígeno não específico pode ser pelo menos 10.000 vezes.
[0044] O termo “kd” (see-1), como usado aqui, refere-se à constante da taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. O dito valor é também chamado de valor kOff ou [0045] O termo “TCd” (M), como usado aqui, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. E obtida pela divisão de kd por ka.
[0046] O termo “ka” (M_1 x see'1), como usado aqui, refere-se à constante da taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular. O dito valor é também chamado de valor kon ou taxa de associação. [0047] Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção é isolado. Um “anticorpo isolado” como usado aqui pretende referir-se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas. Em uma modalidade preferida, um anticorpo biespecífico isolado que se liga especificamente à PD-L1 e um segundo alvo, como CD3, está substancialmente livre de anticorpos monoespecíficos que se ligam especificamente à PD-L1 ou ao segundo alvo, por exemplo, CD3. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo, está substancialmente livre de anticorpos de origem natural que não são capazes de se ligar à PD-L1. Em uma outra modalidade preferida, o anticorpo da invenção possui uma alteração estrutural em sua sequência de aminoácidos, em relação à estrutura de um anticorpo anti-PD-Ll de ocorrência natural, em que a dita alteração estrutural faz com que o dito anticorpo apresente uma funcionalidade alterada em relação à funcionalidade apresentada pelo dito anticorpo anti-PD-Ll de ocorrência natural, a dita funcionalidade sendo selecionada do grupo que
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17/163 consiste em: (i) afinidade de ligação à PD-L1, (ii) capacidade de inibir a ligação de PD-L1 à PD-1 e (iii) capacidade de induzir funções efetoras mediadas por Fc.
[0048] O termo “PD-L1”, quando usado aqui, refere-se à proteína ligando de morte programada 1. A PD-L1 é encontrada em humanos e outras espécies e, portanto, o termo “PD-L1” não se limita à PD-L1 humana, a menos que seja contradito pelo contexto. As sequências de PD-L1 de humanos, macacos e camundongos podem ser encontradas através do n° de acesso no banco de genes NP_054862.1, XP_005581836 e NP_068693, respectivamente.
[0049] O termo “PD-L2”, quando usado aqui, refere-se à proteína 2 ligando de morte programada humana 1 (n° de acesso no banco de genes NP.079515).
[0050] O termo “PD-1”, quando usado aqui, refere-se à proteína de morte programada humana 1, também conhecida como CD279.
[0051] O termo “CD3”, como usado aqui, refere-se à proteína Grupamento de diferenciação 3 humana que faz parte do complexo proteico de correceptores de células T e é composta por quatro cadeias distintas. O CD3 também é encontrado em outras espécies e, portanto, o termo “CD3” não se limita ao CD3 humano, a menos que seja contradito pelo contexto. Em mamíferos, o complexo contém uma cadeia de CD3y (gama) (cadeia de CD3y humano UniProtKB/Swiss-Prot n° P09693, ou CD3y de macacos cinomolgos UniProtKB/Swiss-Prot n° Q95LI7), uma cadeia de CD35 (delta) (CD35 humano UniProtKB/Swiss-Prot n° P04234, ou CD35 de macacos cinomolgos UniProtKB/Swiss-Prot n° Q95LI8), duas cadeias de CD3e (epsilon) (CD3e humano UniProtKB/Swiss-Prot n° P07766 (SEQ ID NO:95); CD3e de macacos cinomolgos UniProtKB/Swiss-Prot n° Q95LI5; ou CD3e de macacos rhesus UniProtKB/Swiss-Prot n° G7NCB9), e uma cadeia de Cd3ζ (zeta) (Οϋ3ζ humano UniProtKB/Swiss-Prot n° P20963, Οϋ3ζ de macacos
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18/163 cinomolgos UniProtKB/Swiss-Prot n° Q09TK0). Essas cadeias se associam a uma molécula conhecida como receptor de células T (TCR) e geram um sinal de ativação nos linfócitos T. As moléculas de TCR e CD3 juntas compreendem o complexo TCR.
[0052] Um “anticorpo PD-L1” ou “anticorpo anti-PD-Ll” é um anticorpo como descrito acima, que se liga especificamente ao antígeno PDLl, em particular a PD-L1 humana.
[0053] Um “anticorpo CD3” ou “anticorpo anti-CD3” é um anticorpo como descrito acima, que se liga especificamente ao antígeno CD3, em particular o CD3e humano (epsilon).
[0054] Um “anticorpo CD3xPD-Ll”, “anticorpo anti-CD3xPD-Ll”, “anticorpo PD-LlxCD3” ou “anticorpo anti-PD-Ll xCD3” é um anticorpo biespecífico, que compreende duas regiões diferentes de ligação ao antígeno, uma das quais se liga especificamente ao antígeno PD-L1 e uma das quais se liga especificamente ao CD3.
[0055] A presente invenção também provê anticorpos compreendendo variantes funcionais das regiões VL, regiões VH ou uma ou mais CDRs dos anticorpos dos exemplos. Uma variante funcional de uma VL, VH ou CDR usada no contexto de um anticorpo ainda permite que o anticorpo retenha pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) da afinidade e/ou especificidade/seletividade do anticorpo de “referência” ou “parental” e, em alguns casos, esse anticorpo pode estar associado a uma maior afinidade, seletividade e/ou especificidade do que o anticorpo parental.
[0056] Tais variantes funcionais retêm tipicamente uma identidade de sequência significativa com o anticorpo parental. A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % de homologia = número de posições idênticas/número total de posições x 100), levando em
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19/163 consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzida para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos pode, por exemplo, ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM 120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).
[0057] Variantes exemplificativas incluem aquelas que diferem das regiões VH e/ou VL e/ou CDR das sequências de anticorpos parentais principalmente por substituições conservativas; por exemplo, 10, como 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 das substituições na variante são substituições conservativas de resíduos de aminoácidos.
[0058] No contexto da presente invenção, substituições conservativas podem ser definidas por substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas na tabela a seguir:
Classes de resíduos de aminoácidos para substituições conservativas
Resíduos ácidos Asp (D) e Glu (E)
Resíduos básicos Lys (K), Arg (R), e His (H)
Resíduos não carregados hidrofílicos Ser (S), Thr (T), Asn (N), e Gin (Q)
Resíduos não carregados alifáticos Gly (G), Ala (A), Vai (V), Leu (L), e He (I)
Resíduos não carregados não polares Cys (C), Met (M), e Pro (P)
Resíduos aromáticos Phe (F), Tyr (Y), e Trp (W)
[0059] No contexto da presente invenção, as seguintes notações são, a menos que indicado de outra forma, usadas para descrever uma mutação; i) a substituição de um aminoácido em uma determinada posição é escrita como, por exemplo, K409R que significa uma substituição de uma Lisina na posição 409 por uma Arginina; e ii) para variantes específicas, são usados os códigos específicos de três ou uma letra, incluindo os códigos Xaa e X para indicar qualquer resíduo de aminoácido. Assim, a substituição de Lisina por Arginina
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20/163 na posição 409 é designada como: K409R, e a substituição de Lisina por qualquer resíduo de aminoácido na posição 409 é designada como K409X.
Em caso de deleção de Lisina na posição 409, é indicado por K409*.
[0060] No contexto da presente invenção, “competição” refere-se a uma redução significativa na propensão para uma molécula em particular se ligar a um parceiro de ligação particular na presença de outra molécula que se liga ao parceiro de ligação. “Competição” pode se referir a “bloqueio” ou “deslocamento”, isto é, uma molécula competidora pode ser uma molécula bloqueadora ou deslocadora. “Deslocamento” refere-se a uma condição em que um segundo anticorpo pode deslocar um antígeno de um complexo antígeno-anticorpo (formado anteriormente) resultando na troca do antígeno (Abdiche et al., 2017 Pios One 12(1): e0169535). A competição pela ligação à PD-L1 por dois ou mais anticorpos anti-PD-Ll pode ser determinada por qualquer técnica adequada. Em uma modalidade, a competição é determinada como descrito no Exemplo 9 deste documento.
[0061] Da mesma forma, no contexto da presente invenção, “inibição da ligação de PD-L1 à PD-1” refere-se a qualquer redução detectável significativa na ligação de PD-L1 à PD-1 na presença de um anticorpo capaz de se ligar à PD- Ll. Tipicamente, inibição significa uma redução de pelo menos cerca de 10%, tal como pelo menos cerca de 15%, por exemplo, pelo menos cerca de 20%, tal como uma redução de pelo menos 40% na ligação entre PD-L1 e PD-1, causada pela presença de um anticorpo anti-PD-Ll. A inibição da ligação de PD-L1 à PD-1 pode ser determinada por qualquer técnica adequada. Em uma modalidade, a inibição é determinada como descrito no Exemplo 10 deste documento.
[0062] O termo “epítopo” significa um determinante da proteína capaz de ligação específica a um anticorpo. Epítopos consistem geralmente em grupamentos de moléculas de superfície, como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e geralmente têm características estruturais tridimensionais,
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21/163 e também características de carga específicas. Epítopos conformacionais e não conformacionais são diferenciados pelo fato de que a ligação aos primeiros, mas não aos últimos, é perdida na presença de solventes desnaturantes. O epítopo pode compreender resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos na ligação e outros resíduos de aminoácidos, que não estão diretamente envolvidos na ligação, como resíduos de aminoácidos efetivamente bloqueados ou cobertos pelo peptídeo de ligação ao antígeno especificamente (em outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da pegada do peptídeo de ligação ao antígeno específico).
[0063] O termo “anticorpo quimérico”, como usado aqui, refere-se a um anticorpo em que a região variável é derivada de uma espécie não humana (por exemplo, derivada de roedores) e a região constante é derivada de uma espécie diferente, como a humana. Os anticorpos monoclonais quiméricos para aplicações terapêuticas são desenvolvidos para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Os termos “região variável” ou “domínio variável”, como usados no contexto de anticorpos quiméricos, referem-se a uma região que compreende as CDRs e as regiões estruturais das cadeias pesada e leve da imunoglobulina. Os anticorpos quiméricos podem ser gerados usando técnicas de DNA padrão, como descrito em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15. O anticorpo quimérico pode ser um anticorpo recombinante geneticamente ou enzimaticamente engenheirado. Está dentro do conhecimento do versado na técnica gerar um anticorpo quimérico e, portanto, a geração do anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser realizada por outros métodos além dos aqui descritos.
[0064] O termo “anticorpo humanizado”, como usado aqui, refere-se a um anticorpo não humano geneticamente engenheirado, que contém domínios constantes de anticorpos humanos e domínios variáveis não
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22/163 humanos modificados para conter um alto nível de homologia de sequência com domínios variáveis humanos. Isso pode ser conseguido enxertando as seis regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de anticorpos não humanos, que juntas formam o local de ligação ao antígeno, em uma região estrutural aceitadora humana homóloga (FR) (ver WO92/22653 e EP0629240). A fim de reconstituir completamente a afinidade e especificidade de ligação do anticorpo parental, pode ser necessária a substituição de resíduos estruturais do anticorpo parental (isto é, o anticorpo não humano) nas regiões estruturais humanas (mutações reversas). A modelagem de homologia estrutural pode ajudar a identificar os resíduos de aminoácidos nas regiões estruturais que são importantes para as propriedades de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo humanizado pode compreender sequências de CDR não humanas, principalmente regiões estruturais humanas, opcionalmente compreendendo uma ou mais mutações reversas de aminoácidos na sequência de aminoácidos não humanos e regiões constantes totalmente humanas. Opcionalmente, modificações adicionais de aminoácidos, que não são necessariamente mutações reversas, podem ser aplicadas para obter um anticorpo humanizado com características preferidas, como afinidade e propriedades bioquímicas.
[0065] O termo “anticorpo humano”, como usado aqui, refere-se a anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, não pretende incluir anticorpos nos quais sequências CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos, como um camundongo, foram enxertadas nas sequências estruturais humanas. Os
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 29/222 / 163 anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia convencional de anticorpos monoclonais, por exemplo, a técnica de hibridização de células somáticas padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora os procedimentos de hibridização de células somáticas sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser utilizadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnicas de exibição de fagos usando bibliotecas de genes de anticorpos humanos. Um sistema animal adequado para a preparação de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos. Os anticorpos monoclonais humanos podem assim, por exemplo, ser gerado usando camundongos ou ratos transgênicos ou transcromossômicos que transportam partes do sistema imunológico humano em vez do sistema de camundongo ou rato. Consequentemente, em uma modalidade, um anticorpo humano é obtido a partir de um animal transgênico, como um camundongo ou um rato, carregando sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em vez de sequências de imunoglobulina animal. Em tais modalidades, o anticorpo se origina de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana introduzidas no animal, mas a sequência final de anticorpo é o resultado das ditas sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana sendo adicionalmente modificadas por hipermutações somáticas e maturação por afinidade pelo mecanismo de anticorpos animais endógenos, ver, por exemplo, Mendez et al. 1997 Nat Genet. 15(2):146-56. O termo “condições de redução” ou “ambiente de redução” refere-se a uma condição ou ambiente em que um substrato, aqui um
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24/163 resíduo de cisteína na região de dobradiça de um anticorpo, é mais provável que seja reduzido do que oxidado.
[0066] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como usado aqui, pretende se referir a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido, por exemplo, um vetor de expressão que codifica um anticorpo da invenção. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 ou NSO e células linfocíticas.
[0067] O termo “tratamento” refere-se à administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo terapeuticamente ativo da presente invenção com o objetivo de aliviar, melhorar, interromper ou erradicar (curar) sintomas ou estados de doença.
[0068] O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[0069] O termo “anticorpo anti-idiotípico” refere-se a um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associados ao local de ligação ao antígeno de um anticorpo.
Aspectos e modalidades adicionais da invenção [0070] Como descrito acima, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma região de ligação ao
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[0071] Em uma modalidade, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:21.
[0072] Em uma modalidade adicional, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente, ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia
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26/163 leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:24, respectivamente.
[0073] Em uma outra modalidade, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VH selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 18.
[0074] Em uma outra modalidade, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:22.
[0075] Em uma modalidade adicional, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15, ou
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[0076] Dessa forma, por exemplo, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
uma sequência VH que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5, ou uma sequência VH que tem pelo menos 97 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5, ou uma sequência VH que tem pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5, ou uma sequência VH que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15, ou uma sequência VH que tem pelo menos 97 % de identidade de
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NO :8 e uma sequência VL que tem pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID
NO: 15, ou uma sequência VH que tem pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15, ou uma sequência VH que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22, ou uma sequência VH que tem pelo menos 97 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22, ou uma sequência VH que tem pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22.
[0077] Em uma modalidade adicional, as ditas sequências VH e VL compreendem, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente, e as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VH têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%
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29/163 ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas. No contexto desta modalidade, a % de identidade refere-se à porcentagem de identidade obtida quando as sequências estruturais são tomadas em conjunto como uma sequência consecutiva sem as sequências intermediárias de CDR.
[0078] Em uma modalidade preferida do anticorpo da invenção, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
[0079] Diferentes anticorpos capazes de se ligar ao mesmo antígeno, como PD-L1, podem se ligar a diferentes regiões do dito antígeno. Em alguns casos, a ligação de um anticorpo PD-L1 à PD-L1 ainda pode permitir a ligação de um anticorpo PD-L1 diferente à PD-L1. Em outros casos, no entanto, a ligação de um anticorpo PD-L1 à PD-L1 pode competir com (bloquear ou deslocar) a ligação de um anticorpo PD-L1 diferente à PD-L1. Assim, experimentos de competição fornecem informações sobre onde no antígeno alvo um anticorpo se liga, o que pode impactar os efeitos funcionais da ligação ao anticorpo.
[0080] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da invenção:
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30/163 (i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :22, ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15.
[0081] Em uma modalidade adicional do mesmo, o dito anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5.
[0082] Os anticorpos que competem pela ligação ao antígeno alvo podem se ligar a diferentes epítopos no antígeno, em que os epítopos estão tão próximos um do outro que um primeiro anticorpo que se liga a um epítopo impede a ligação de um segundo anticorpo ao outro epítopo. Em outras situações, no entanto, dois anticorpos diferentes podem ligar o mesmo epítopo ao antígeno.
[0083] Dessa forma, em uma modalidade, o anticorpo da invenção:
(i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou
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31/163 (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22. [0084] Em uma modalidade adicional, a ligação do anticorpo biespecífico à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57.
[0085] Em uma modalidade adicional, a ligação do anticorpo biespecífico à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22. “Bloqueada” aqui indica que um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 compete com o anticorpo biespecífico, mas não o desloca.
[0086] Como descrito acima, os anticorpos biespecíficos mencionados acima do primeiro aspecto da invenção compreendem uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano.
[0087] Em uma modalidade, a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
[0088] As seis sequências de CDR como definidas acima são derivadas de um anticorpo de rato indicado como SP34. Versões humanizadas desse anticorpo foram geradas e os anticorpos humanizados são aqui indicados como huCD3 e são ainda descritos em W02015001085 (Genmab).
[0089] Em uma modalidade preferida do anticorpo biespecífico da
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32/163 invenção, o dito anticorpo biespecífico compreende:
(i) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (ii) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na
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SEQ ID N0:31, respectivamente, ou (iii) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:23, a sequência DDN e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:24, respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
[0090] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH), em que a dita sequência VH tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO:25.
[0091] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano que compreende uma região variável da cadeia leve (VL), em que a dita sequência VL tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO:29.
[0092] Em uma modalidade preferida, a região de ligação ao antígeno
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34/163 capaz de se ligar ao CD3e humano compreende uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:25 e uma sequência VL como estabelecida na
SEQ ID NO:29.
[0093] Em um aspecto, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser modificados para reduzir a afinidade dos anticorpos. Isso pode ser vantajoso em algumas situações e levar à maior eficácia. Em particular, a baixa afinidade de ligação ao CD3e humano pode ter um impacto na motilidade das células T em circulação e no local do tumor, levando assim a um melhor envolvimento das células T com as células tumorais, cf. Mplhpj et al., Molecular Immunology 44 (2007).
[0094] Consequentemente, em uma modalidade diferente do anticorpo biespecífico da invenção compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano, o dito anticorpo biespecífico:
(i) tem uma afinidade menor para a ligação ao CD3e humano em comparação com um anticorpo que tem uma região de ligação ao antígeno capaz de compreender uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:25 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, preferivelmente em que a dita afinidade é pelo menos 2 vezes menor, por exemplo pelo menos 5 vezes menor, como pelo menos 10 vezes menor, por exemplo pelo menos 25 vezes menor, tal como pelo menos 50 vezes menor, e (ii) é capaz de mediar a citotoxicidade dependente da concentração de células MDA-MB-231, células PC-3 e/ou células HELA ao usar PBMCs ou células T purificadas como células efetoras.
[0095] De modo similar, em uma modalidade, o anticorpo da invenção compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano:
(i) tem uma afinidade menor para a ligação ao CD3e humano
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35/163 em comparação com um anticorpo que tem uma região de ligação ao antígeno capaz de compreender uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:25 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, preferivelmente em que a dita afinidade é pelo menos 2 vezes menor, por exemplo pelo menos 5 vezes menor, como pelo menos 10 vezes menor, por exemplo pelo menos 25 vezes menor, tal como pelo menos 50 vezes menor, e (ii) é capaz de mediar a citotoxicidade dependente da concentração de células MDA-MB-231, células PC-3 e/ou células HELA ao usar PBMCs ou células T purificadas como células efetoras.
[0096] A afinidade para CD3e humano pode, por exemplo, ser medida usando a determinação de afinidade de ligação ao octeto como descrito no Exemplo 7 do documento WO2017009442.
[0097] A capacidade de um anticorpo para mediar a citotoxicidade por PBMCs ou células T purificadas pode, por exemplo, ser determinada como descrito no Exemplo 11 deste documento, isto é, células MDA-MB231, PC-3 ou células HELA são semeadas e cultivadas em poços. São adicionadas células tumorais, PBMCs e diluições seriadas de anticorpo e, após a incubação, as células tumorais são coradas para viabilidade.
[0098] Aqui, huCD3-HlLl refere-se a um anticorpo anti-CD3 com sequências VH e VL como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 25 e 29. IgGlhuCD3-FEAL refere-se a uma variante do mesmo compreendendo as substituições L234F, L235E, D265A e F405L (ver também em outra parte neste documento).
[0099] Exemplos de variantes de IgGl-huCD3-FEAL com afinidade reduzida para CD3e humano foram descritos em WO2017009442 (Genmab). O Exemplo 7 (Tabela 6) do documento WO2017009442 descreve afinidades de IgGl-huCD3-FEAL e sete variantes do mesmo, medidas usando a determinação de afinidade de ligação ao octeto:
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Anticorpo <KD> (nM) SDEV SEM CV
IgGl-huCD3-FEAL 15 6 3 37
IgGl-huCD3-Yl 14V-FEAL 29 8 4 26
IgGl-huCD3-T31P- FEAL 42 9 4 21
IgG 1 -huCD3-Y 1 14M-FEAL 42 14 8 33
IgG 1 -huCD3-Y 1 14R-FEAL 46 10 6 22
IgG 1 -huCD3 -S110A-FEAL 72 15 6 21
IgG 1 -huCD3 -T31M-FEAL 99 23 13 23
IgG 1 -huCD3 -Η 101G-FEAL 683 169 97 25
[00100] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico da invenção, a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 99, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 100, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 101, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (iv) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 102, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a
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37/163 sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (v) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 103, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (vi) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 104, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (vii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 105, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
[00101] Em uma outra modalidade, a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:39 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:40 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:41 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (iv) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:42 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou
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38/163 (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:43 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (vi) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:44 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (vii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:45 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29.
[00102] Em modalidades preferidas adicionais do anticorpo biespecífico da invenção, cada uma das regiões de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região variável da cadeia leve (VL), e em que as ditas regiões variáveis compreendem três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente.
[00103] Em modalidades adicionais preferidas do anticorpo biespecífico da invenção, o anticorpo compreende duas regiões constantes da cadeia pesada (CH) e duas regiões constantes da cadeia (CL).
[00104] Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira e segunda cadeia pesada, em que cada uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas compreende pelo menos uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma CH3, em que na dita primeira cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, F405, Y407 e K409 (de acordo com a numeração da UE) foi substituído e, na dita segunda cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, F405, Y407 e K409 (de acordo com a numeração da UE) foi substituído, e em que a dita primeira e a dita segunda cadeias pesadas não são substituídas nas mesmas posições.
[00105] Mais preferivelmente, (i) o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita
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39/163 primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita segunda cadeia pesada, ou (ii) o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita segunda cadeia pesada.
[00106] Em uma modalidade particularmente preferida adicional, o anticorpo é um anticorpo biespecífico CD3xPD-Ll compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada em que as posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F e E, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda cadeia pesada é R, ou (ii) a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é R, e a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda pesada cadeia é L.
[00107] Em uma modalidade particularmente preferida adicional, o anticorpo é um anticorpo biespecífico CD3xPD-Ll compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada em que as posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F, E, e A, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração
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40/163 da UE da segunda cadeia pesada é R, ou (ii) a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é R, e a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda pesada cadeia é L.
Novas classes de anticorpos PD-L1 [00108] Em um aspecto adicional, a invenção provê novos anticorpos anti-PD-Ll que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana. Os anticorpos desse aspecto da invenção podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos e, se multiespecíficos, os ditos anticorpos multiespecíficos podem ou não compreender uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano.
[00109] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana tem as características definidas aqui acima.
[00110] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 113 (R113), 123 (Y123) e 125 (R125) na SEQ ID NO: 94 foram substituídos por alaninas é reduzida em comparação com a ligação à PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - 1,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13.
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41/163 [00111] O dito anticorpo pode se ligar a um epítopo na PD-L1 (SEQ
ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos na posição 113 (RI 13), o resíduo de aminoácido na posição 123 (Y123) e/ou o resíduo de aminoácido na posição 125 (RI25) da SEQ ID NO: 94.
[00112] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 19 (F19), 42 (F42), 45 (E45), 46 (K46), 94 (L94) e 116 (1116) na SEQ ID NO: 94 foi/foram substituído(s) por alaninas é reduzida em comparação com a PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - l,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13. [00113] O anticorpo pode se ligar a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: os resíduos de aminoácidos na posição 45 (E45), o resíduo de aminoácido na posição 46 (K46); e/ou o resíduo de aminoácido na posição 94 (L94) da SEQ ID NO: 94.
[00114] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 58 (E58) e 113 (RI 13) na SEQ ID NO: 94 foi/foram substituído(s) por alaninas é reduzida em comparação com a PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a
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42/163 ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - l,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13.
[00115] O anticorpo pode se ligar a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo o resíduo de aminoácido na posição 58 (E58) e/ou o resíduo de aminoácido na posição 113 (RI 13) da SEQ ID NO: 94.
[00116] Em modalidades adicionais, o anticorpo de acordo com a invenção é capaz de induzir a lise dependente da dose de células epiteliais de um adenocarcinoma, como MDA-MB-231 através de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).
[00117] Em modalidades adicionais, o anticorpo de acordo com a invenção é capaz de reduzir o número de células em uma cultura das ditas células epiteliais em pelo menos 5%, como pelo menos 6%, 7%, 8%, 9% ou pelo menos 10% como resultado da lise celular.
[00118] A ADCC pode ser determinada in vitro em um ensaio de liberação de 51Cr, como o ensaio descrito no exemplo 14. Em particular, a ADCC é determinada in vitro, incubando as ditas células epiteliais com uma composição compreendendo o anticorpo e células efetoras, como células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), por 4 horas a 37°C, 5% CO2, a quantidade de anticorpo na dita composição estando dentro da faixa de 0,1 a 1 qg/mL e a razão de células efetoras para células epiteliais sendo de 100:1.
[00119] A lise de células epiteliais pode ser determinada in vitro em um ensaio repórter de luciferase como substituto da ADCC, como o bioensaio repórter luminescente de ADCC descrito no exemplo 14.
[00120] A ADCC pode, em particular, ser determinada in vitro, por
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i) contato de uma cultura das ditas células epiteliais com uma composição compreendendo o anticorpo e as células T humanas Jurkat que expressam estavelmente FcyRIIIa (CD 16) e luciferase de vagalume (células efetoras), em uma razão de célula efetora:célula epitelial de 1:1, ii) ajuste da cultura das células epiteliais e células efetoras à temperatura ambiente por 15 minutos, iii) incubação da cultura das células epiteliais e células efetoras com um substrato de luciferase, e iv) determinação da produção de luciferase na dita cultura celular;
a quantidade de anticorpo na dita composição estando dentro da faixa de 0,5 a 250 ng/mL e a razão de células efetoras para células epiteliais sendo de 1:1.
[00121] A ADCC das ditas células epiteliais pode ser determinada em um ensaio repórter de luciferase, tal como um ensaio repórter definido na reivindicação 23 ou 24, então a ADCC observada após a incubação de uma cultura das células epiteliais com uma composição de teste compreendendo o dito anticorpo é de pelo menos 1,5 vezes a ADCC observada após a incubação de uma cultura das células epiteliais com uma composição compreendendo anticorpo de referência; a ADCC sendo determinada como unidades de luminescência relativa (RLU), a concentração de anticorpo na dita composição de teste e na dita composição compreendendo um anticorpo de referência sendo a mesma e dentro da faixa de 20 a 250 ng/ml, e o anticorpo de referência sendo selecionado de:
a) um anticorpo compreendendo a sequência VH estabelecida na SEQ ID NO: 74 e a sequência VL estabelecida na SEQ ID NO: 78; e
b) um anticorpo compreendendo a sequência VH estabelecida na SEQ ID NO: 81 e a sequência VL estabelecida na SEQ ID NO: 85.
[00122] Em uma modalidade, é provido um anticorpo compreendendo
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44/163 uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:21.
[00123] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente, ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:24.
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 51/222 / 163 [00124] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VH selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 18.
[00125] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:22.
[00126] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende:
(i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma
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46/163 sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15, ou (iii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22.
[00127] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende sequências VH e VL compreendendo, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente, e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VH têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas.
[00128] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana:
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 53/222 / 163 (i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
[00129] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que o dito anticorpo:
(i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :22, ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15.
[00130] Preferivelmente, o dito anticorpo compete pela ligação à PDL1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5.
[00131] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na
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SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57. [00132] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é bloqueada pela ligação de um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 110.
[00133] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57 e em que o dito anticorpo inibe a ligação da PD-L1 humana à PD-1 humana.
[00134] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57, e em que o dito anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
[00135] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57 e em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
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49/163 “Bloqueada” aqui indica que um anticorpo compreendendo uma sequência
VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 compete com o anticorpo biespecífico, mas não o desloca.
[00136] Em uma modalidade adicional, é provido um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que o dito anticorpo:
(i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22. [00137] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que o dito anticorpo compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 33, 34 e 35, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:37, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:38, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 47, 48 e 49, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as
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50/163 sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:51, a sequência DVI, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:52, respectivamente, ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:58, a sequência RDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:59, respectivamente, ou (iv) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 61, 62 e 63, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:65, a sequência DDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:66, respectivamente, ou (v) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 107, 108 e 109, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:111, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 113, respectivamente.
(vi) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 68, 69 e 70, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:72, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:73, respectivamente.
[00138] Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:32 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:36, ou
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51/163 (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:46 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:50, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57, ou (iv) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:60 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :64, ou (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 110, ou (vi) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:67 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:71.
[00139] Em uma modalidade, o anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é monovalente.
[00140] Em uma outra modalidade, o anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é um anticorpo monoespecífico compreendendo duas ou mais regiões de ligação ao antígeno idênticas.
[00141] Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é um anticorpo bivalente com duas regiões de ligação ao antígeno capazes de se ligar à PD-L1 humana e em que as ditas duas regiões de ligação ao antígeno têm sequências de região variável idênticas.
[00142] Em uma modalidade diferente, o anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é um anticorpo biespecífico bivalente que, além da dita (primeira) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, compreende uma (segunda) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno, em que o dito segundo antígeno é CD3e humano.
[00143] Em uma modalidade diferente, o anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é um
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52/163 anticorpo biespecífico bivalente que, além da dita (primeira) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, compreende uma (segunda) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno não é CD3e humano.
[00144] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico compreendendo uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno opcionalmente não é CD3e humano, e em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:70. “Epítopo diferente” neste documento significa que o epítopo ao qual a segunda região de ligação ao antígeno se liga é diferente do epítopo ao qual a primeira região de ligação ao antígeno se liga.
[00145] Em uma modalidade do dito anticorpo multiespecífico, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH)
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53/163 compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas
SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente, ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO :24, respectivamente, (iv) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 33, 34 e 35, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:37, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:38, respectivamente, ou (v) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 47, 48 e 49, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:51, a sequência DVI, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:52, respectivamente, ou (vi) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:58, a sequência RDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:59, respectivamente, ou
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54/163 (vii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 61, 62 e 63, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:65, a sequência DDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:66, respectivamente, ou (viii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 68, 69 e 70, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:72, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:73, respectivamente.
[00146] Em uma outra modalidade do dito anticorpo multiespecífico, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VH selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 18.
[00147] Em uma outra modalidade do dito anticorpo multiespecífico, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:22.
[00148] Em uma outra modalidade do dito anticorpo multiespecífico, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos
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95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15, ou (iii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22.
[00149] Em uma outra modalidade do dito anticorpo multiespecífico, as ditas sequências VH e VL compreendem, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente, e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VH têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4
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56/163 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas.
[00150] Em uma outra modalidade do dito anticorpo multiespecífico, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :22, ou (iv) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:32 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:36, ou (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:46 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:50, ou (vi) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57, ou (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 110, ou (vii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:60 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:64, ou (viii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:67 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:71.
[00151] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno opcionalmente não é CD3e humano, em que o dito anticorpo:
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57/163 (i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :22, ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15.
[00152] Em uma modalidade do dito anticorpo multiespecífico, o dito anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5.
[00153] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57.
[00154] Em uma modalidade do mesmo, o anticorpo inibe a ligação de PD-L1 humana à PD-1 humana.
[00155] Em uma modalidade adicional, o anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como
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58/163 estabelecida na SEQ ID NO:22.
[00156] Em uma modalidade adicional, a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22. “Bloqueada” aqui indica que um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 compete com o anticorpo biespecífico, mas não o desloca.
[00157] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno opcionalmente não é CD3e humano, e em que a dita primeira região de ligação ao antígeno:
(i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22. [00158] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo biespecífico bivalente compreendendo uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno opcionalmente não é CD3e humano, e em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de
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59/163 se ligar à PD-L1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:21.
[00159] Em uma modalidade do dito anticorpo biespecífico bivalente, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente, ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:24, respectivamente.
[00160] Em uma outra modalidade do dito anticorpo biespecífico bivalente, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1
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60/163 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VH selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8 e
SEQ ID NO: 18.
[00161] Em uma outra modalidade do dito anticorpo biespecífico bivalente, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:22.
[00162] Em uma outra modalidade do dito anticorpo biespecífico bivalente, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15, ou (iii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência
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61/163 de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22.
[00163] Em uma outra modalidade do dito anticorpo biespecífico bivalente, as ditas sequências VH e VL compreendem, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente, e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VH têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas.
[00164] Em uma outra modalidade do dito anticorpo biespecífico bivalente, a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
[00165] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo biespecífico bivalente que compreende uma primeira região de ligação ao
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62/163 antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno opcionalmente não é CD3e humano, em que o dito anticorpo:
(i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :22, ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15.
[00166] Em uma modalidade do dito anticorpo biespecífico bivalente, o dito anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5.
[00167] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo biespecífico bivalente que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57.
[00168] Em uma modalidade do mesmo, o anticorpo inibe a ligação de
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PD-L1 humana à PD-1 humana.
[00169] Em uma modalidade adicional, o anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência
VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
[00170] Em uma modalidade adicional, a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22. “Bloqueada” aqui indica que um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 compete com o anticorpo biespecífico, mas não o desloca.
[00171] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo biespecífico bivalente que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno opcionalmente não é CD3e humano, e em que a dita primeira região de ligação ao antígeno:
(i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5, ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, ou (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22. Modalidades adicionais dos anticorpos da invenção [00172] Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção
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64/163 liga a PD-L1 humana com uma KD de cerca de IO'8 M ou menos, tal como cerca de IO'9 M ou menos, por exemplo, cerca de IO'10 M ou menos, quando determinado como descrito no Exemplo 8 aqui.
[00173] Em uma modalidade adicional, o anticorpo da invenção medeia a citotoxicidade dependente da concentração de células MDA-MB231, células PC-3 e/ou células HELA ao usar células T purificadas como células efetoras, quando testado como descrito no Exemplo 11 aqui.
[00174] Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção não se liga à PD-L2 humana.
Formatos de anticorpos [00175] Como descrito acima, vários formatos de anticorpos foram descritos na técnica. O anticorpo da invenção pode, em princípio, ser de qualquer isótipo. A escolha do isótipo normalmente será guiada pelas funções efetoras mediadas por Fc desejadas, como a indução de ADCC, ou pela exigência de um anticorpo desprovido da função efetora mediada por Fc (anticorpo “inerte”). Isótipos exemplificativos são IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Qualquer uma das regiões constantes da cadeia leve humana, capa ou lambda, pode ser usada. A função efetora dos anticorpos da presente invenção pode ser alterada por troca de isótipo para, por exemplo, um anticorpo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos terapêuticos. Em uma modalidade, ambas as cadeias pesadas de um anticorpo da presente invenção são do isótipo IgGl, por exemplo, um IgGl,K. Opcionalmente, a cadeia pesada pode ser modificada na região de dobradiça e/ou CH3, como descrito em outro lugar aqui.
[00176] Preferivelmente, cada uma das regiões de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região variável da cadeia leve (VL), e em que as ditas regiões variáveis compreendem três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente. Além disso,
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 71/222 / 163 preferivelmente, o anticorpo compreende duas regiões constantes da cadeia pesada (CH) e duas regiões constantes da cadeia leve (CL).
[00177] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, como um anticorpo IgGl de comprimento total. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4 de comprimento total, preferivelmente com uma região de dobradiça estabilizada. Modificações que estabilizam a região de dobradiça IgG4, como a mutação S228P na dobradiça central, foram descritas na técnica, ver, por exemplo, Labrijn et al., 2009 Nat Biotechnol. 27(8):767-71.
[00178] Em outras modalidades, o anticorpo da invenção é um fragmento de anticorpo, como um fragmento Fab’ ou Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI, um anticorpo monovalente como descrito em W02007059782 (Genmab), um Fragmento F(ab’)2, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento dAb, camelídeo ou nanocorpos ou uma região determinante de complementaridade isolada (CDR).
[00179] Os anticorpos da invenção são preferivelmente humanos, humanizados ou quiméricos. Nas modalidades em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico, ambas as meias moléculas podem ser humanas, humanizadas ou quiméricas, ou as meias moléculas podem diferir em caráter em relação à origem da sequência.
[00180] Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende duas meias moléculas, cada uma compreendendo uma região de ligação ao antígeno, em que (i) a(s) meia(s) molécula(s) que compreende(m) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é/são quimérica(s), e/ou (ii) a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é
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66/163 quimérica.
[00181] Por exemplo, em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende duas meias moléculas, cada uma compreendendo uma região de ligação ao antígeno, em que (i) a(s) meia(s) molécula(s) que compreende(m) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é/são humanizada(s), e/ou (ii) a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humanizada.
[00182] Por exemplo, em uma modalidade adicional, o anticorpo biespecífico compreende duas meias moléculas, cada uma compreendendo uma região de ligação ao antígeno, em que (i) a(s) meia(s) molécula(s) que compreende(m) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é/são humana(s), e/ou (ii) a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humana. [00183] Assim, por exemplo, em uma modalidade, a(s) região(ões) de ligação ao antígeno capaz(es) de se ligar à PD-L1 humana é/são humanizada(s) e a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humanizada.
[00184] Em uma modalidade diferente, a(s) região(ões) de ligação ao antígeno capaz(es) de se ligar à PD-L1 humana é/são humana(s) e a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humana.
[00185] Em uma modalidade adicional, o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), em que a meia molécula que compreende a região
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 73/222 / 163 de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é humana, humanizada ou quimérica, e a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon) é humanizada.
[00186] Preferivelmente, a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é humana e a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon) é humanizada.
Formatos de anticorpos biespecíficos [00187] Muitos formatos e usos diferentes de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica e foram revisados por Kontermann; Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47 and; MAbs, 2012 Mar-Apr;4(2):182-97.
[00188] Um anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção não está limitado a qualquer formato ou método biespecífico específico para produzi-lo.
[00189] Exemplos de moléculas de anticorpos biespecíficos que podem ser usadas na presente invenção compreendem (i) um único anticorpo que tem dois braços compreendendo regiões diferentes de ligação ao antígeno; (ii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade para dois epítopos diferentes, por exemplo, através de dois scFvs ligados em tandem por um ligante peptídico extra; (iii) um anticorpo de domínio variável duplo (DVDIg), em que cada cadeia leve e cadeia pesada contém dois domínios variáveis em tandem por meio de uma ligação peptídica curta (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVDIg™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) um fragmento (Fab’)2 biespecífico quimicamente ligado; (v) um Tandab, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia única, resultando em um anticorpo biespecífico tetravalente que tem dois locais de ligação para cada um dos antigenos alvo; (vi) um flexicorpo, que é uma combinação de scFvs
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68/163 com um diacorpo, resultando em uma molécula multivalente; (vii) uma molécula chamada “dock and lock”, com base no “domínio de dimerização e acoplamento” na Proteína Quinase A, que, quando aplicada a Fabs, pode render uma proteína de ligação biespecífica trivalente consistindo em dois fragmentos Fab idênticos ligados a um fragmento Fab diferente; (viii) uma molécula chamada Scorpion, compreendendo, por exemplo, dois scFvs fundidos aos dois terminais de um braço Fab humano; e (ix) um diacorpo.
[00190] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo, um corpo cruzado ou um anticorpo biespecífico obtido por meio de uma troca de braço Fab controlada (como descrito em WO2011131746 (Genmab)).
[00191] Exemplos de classes diferentes de anticorpos biespecíficos incluem, mas não se limitam a (i) moléculas do tipo IgG com domínios CH3 complementares para forçar a heterodimerização; (ii) moléculas de alvejamento duplo do tipo IgG recombinante, em que os dois lados da molécula contêm, cada um, o fragmento Fab ou parte do fragmento Fab de pelo menos dois anticorpos diferentes; (iii) moléculas de fusão IgG, em que anticorpos IgG de comprimento total são fundidos com fragmento Fab extra ou partes do fragmento Fab; (iv) moléculas de fusão Fc, em que moléculas de Fv de cadeia única ou diacorpos estabilizados são fundidos a domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; (v) moléculas de fusão Fab, em que diferentes fragmentos Fab são fundidos, fundidos a domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; e (vi) anticorpos baseados em ScFv e em diacorpo e de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) em que diferentes moléculas de Fv de cadeia única ou diferentes diacorpos ou anticorpos diferentes de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) são fundidos entre si ou com outra proteína ou molécula transportadora fundida a domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas.
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69/163 [00192] Exemplos de moléculas do tipo IgG com moléculas de domínio CH3 complementares incluem, entre outras, as moléculas de Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech; Roche, WO2011069104), as chamadas moléculas Knobs-into-Holes (Genentech, WO9850431), CrossMAbs (Roche, WO2011117329) e as moléculas eletrostaticamente correspondentes (Amgen, EP1870459 e W02009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, W02010129304), as moléculas LUZY (Genentech, Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.Ml 12.397869. Epub 2012 Nov 1), moléculas do corpo DIG e do corpo PIG (Pharmabcine, WO2010134666, WO2014081202), as moléculas do corpo do Domínio Engenheirado por Troca de Cadeia (SEEDbody) (EMD Serono, W02007110205), as moléculas Biclonics (Merus, WO2013157953), moléculas FcAAdp (Regeneron, W0201015792), moléculas biespecíficas de IgGl e IgG2 (Pfizer/Rinat, WO11143545), moléculas de ancoragem azimétricas (Zymeworks/Merck, WO2012058768), moléculas mAb-Fv (Xencor, WO2011028952), anticorpos biespecíficos bivalentes (W02009080254) e as moléculas DuoBody® (Genmab, WO2011131746).
[00193] Exemplos de moléculas de alvejamento duplo do tipo IgG recombinante incluem, mas não estão limitados a moléculas de Ig de alvejamento duplo (DT) (W02009058383), Anticorpo Dois em Um (Genentech; Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614.), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star, W02008003116), moléculas Zybody (Zyngenia; LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):20818), abordagens com cadeia leve comum (Crucell/Merus, US7,262,028), KÀBodies (Novlmmune, W02012023053) e CovX-body (CovX/Pfizer; Doppalapudi, V.R., et al. 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.).
[00194] Exemplos de moléculas de fusão IgG incluem, mas não se limitam a moléculas de Ig de Domínio Variável Duplo (DVD) (Abbott,
US7,612,181), anticorpos de cabeça dupla de domínio duplo (Unilever;
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Sanofi Aventis, W020100226923), moléculas biespecíficas tipo IgG (ImClone/Eli Lilly, Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2): 191-8), Ts2Ab (Medlmmune/AZ; Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):67292) e moléculas BsAb (Zymogenetics, WO2010111625), moléculas HERCULES (Biogen Idee, US007951918), moléculas de fusão scFv (Novartis), moléculas de fusão scFv (Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246) e moléculas TvAb (Roche, WO2012025525, W02012025530). [00195] Exemplos de moléculas de fusão Fe incluem, mas não estão limitados a fusões ScFv/Fc (Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6): 1179-88), moléculas SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465); Zymogenetics/BMS, WO2010111625), moléculas de tecnologia de realvejamento de dupla afinidade (Fc-DART) (MacroGenics, W02008157379, W02010080538) e moléculas Dual(ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine - China).
[00196] Exemplos de anticorpos biespecíficos de fusão Fab incluem, mas não estão limitados a moléculas F(ab)2 (Medarex/AMGEN; Deo et al. J Immunol. 1998 Feb 15;160(4): 1677-86.), moléculas de ação dupla ou Bis-Fab (Genentech, Bostrom, et al. 2009. Science 323, 1610-1614.), moléculas Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics, W02003074569, W02005004809), moléculas biespecíficas bivalentes (Biotecnol, Schoonjans, J Immunol. 2000 Dec 15; 165(12):7050-7.) e moléculas Fab-Fv (UCB-Celltech, WO 2009040562 Al).
[00197] Exemplos de anticorpos ScFv, baseados em diacorpos e de domínio incluem, mas não estão limitados a moléculas de engate de células Τ biespecíficas (BiTE) (Micromet, W02005061547), moléculas de diacorpo em tandem (TandAb) (Affimed) Le Gall et al., Protein Eng Des Sei. 2004 Apr;17(4):357-66.), moléculas de tecnologia de realvejamento de dupla afinidade (DART) (MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538),
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71/163 moléculas de diacorpo de cadeia única (Lawrence, FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84), anticorpos tipo TCR (AIT, ReceptorLogics), moléculas de fusão de albumina sérica humana ScFv (Merrimack, W02010059315) e COMBODY (Epigen Biotech, Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75.), nanocorpos de alvejamento duplo (Ablynx, Hmila et al., FASEB J. 2010) e anticorpos de domínio único de cadeia pesada de alvejamento duplo.
[00198] Em um aspecto, o anticorpo biespecífico da invenção compreende uma primeira sequência Fc compreendendo uma primeira região CH3, e uma segunda sequência Fc compreendendo uma segunda região CH3, em que as sequências da primeira e da segunda regiões CH3 são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3. Mais detalhes sobre essas interações e como elas podem ser alcançadas são providas nos documentos WO2011131746 e W02013060867 (Genmab), que são aqui incorporados por referência.
[00199] Como aqui descrito mais adiante, um anticorpo biespecífico estável, como um anticorpo biespecífico CD3xPD-Ll, pode ser obtido com alto rendimento usando um método específico com base em um anticorpo PDL1 inicial homodimérico e um anticorpo inicial homodimérico capaz de se ligar a um epítopo diferente de PD-L1 ou antígeno diferente (como um anticorpo CD3 inicial homodimérico) contendo apenas algumas mutações conservativas e assimétricas nas regiões CH3. Mutações assimétricas significam que as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 contêm substituições de aminoácidos em posições não idênticas.
[00200] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que
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72/163 consiste em: 366, 368, 370, 399, 405, 407 e 409, e a segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 399, 405, 407 e 409, e em que a primeira e a segunda regiões CH3 não são substituídas nas mesmas posições.
[00201] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos na posição 366 e a dita segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 368, 370, 399, 405, 407 e 409. Em uma modalidade, o aminoácido na posição 366 é selecionado de Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val ou Gin.
[00202] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos na posição 368 e a dita segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 370, 399, 405, 407 e 409.
[00203] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos na posição 370 e a dita segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 399, 405, 407 e 409.
[00204] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos na posição 399 e a dita segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 405, 407 e 409.
[00205] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos na posição 405 e a dita segunda região CH3
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73/163 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 399, 407 e 409.
[00206] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos na posição 407 e a dita segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 399, 405, e 409.
[00207] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem uma substituição de aminoácidos na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácidos em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 399, 405, e 407.
[00208] Consequentemente, em uma modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 contêm mutações assimétricas, isto é, mutações em posições diferentes nas duas regiões CH3, por exemplo, uma mutação na posição 405 em uma das regiões CH3 e uma mutação na posição 409 na outra região CH3.
[00209] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 399, 405 e 407. Em uma dessas modalidades, a dita primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido diferente de Phe, por exemplo Gly, Ala, Vai, lie, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr, Cys,
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Lys ou Leu, na posição 405. Em uma modalidade adicional do mesmo, a dita primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, He, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido diferente de Phe, Arg ou Gly, por exemplo Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 405.
[00210] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um aminoácido diferente de Phe, por exemplo Gly, Ala, Val, lie, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr, Leu, Met, ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma modalidade adicional do mesmo, a dita primeira região CH3 compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, lie, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um aminoácido diferente de Phe, Arg ou Gly, por exemplo Leu, Ala, Val, lie, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409.
[00211] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma modalidade adicional do mesmo, a dita primeira região CH3
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 81/222 / 163 compreende um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um aminoácido diferente de Phe, Arg ou Gly, por exemplo Leu, Ala, Vai, He, Ser, Thr, Lys, Met, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma outra modalidade, a dita primeira região CH3 compreende Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409.
[00212] Em uma modalidade adicional do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, He, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405. Em uma modalidade adicional, a dita primeira região CH3 compreende um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.
[00213] Em uma modalidade mais adicional do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.
[00214] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, He, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou
b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.
[00215] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como
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76/163 definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.
[00216] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um Thr na posição 350, um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.
[00217] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 compreende um Thr na posição 350, um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 compreende um Ile na posição 350, um Thr na posição 370, um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409.
[00218] Em uma modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido diferente de Phe na posição 405, tal como diferente de Phe, Arg ou Gly na posição; ou a dita primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gin, Arg, Ser ou Thr na posição 407.
[00219] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui compreende uma primeira região CH3 com um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e uma segunda região CH3 com um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gin, Arg, Ser ou Thr na posição 407.
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 83/222 / 163 [00220] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui compreende uma primeira região CH3 com um Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e uma segunda região CH3 com um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gin, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00221] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui compreende uma primeira região CH3 com um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e uma segunda região CH3 com um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gin, Arg, Ser ou Thr na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00222] Em uma outra modalidade, a dita primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gin, Arg, Ser ou Thr, por exemplo, Leu, Met, Gly, Ala, Vai, Ile, His, Asn, Pro, Trp, ou Cys, na posição 407. Em uma outra modalidade, a dita primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, lie, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um Ala, Gly, His, lie, Leu, Met, Asn, Vai ou Trp na posição 407.
[00223] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, lie, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407.
[00224] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira
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78/163 região CH3 tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, He, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gin, Arg, Ser ou Thr, por exemplo, Leu, Met, Gly, Ala, Vai, He, His, Asn, Pro, Trp, ou Cys, na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00225] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um Ala, Gly, His, He, Leu, Met, Asn, Vai ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00226] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Vai, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00227] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gin, Arg, Ser ou Thr, por exemplo, Leu, Met, Gly, Ala, Vai, Ile, His, Asn, Pro, Trp, ou Cys, na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00228] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das modalidades descritas aqui, a dita primeira região CH3 tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e a dita
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79/163 segunda região CH3 tem um Ala, Gly, His, He, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00229] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a dita primeira região CH3 tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e a dita segunda região CH3 tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.
[00230] Em uma outra modalidade do anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a primeira região CH3 tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met, por exemplo Gly, Ala, Val, He, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr ou Cys, na posição 409 e a segunda região CH3 tem (i) um aminoácido diferente de Phe, Leu and Met, por exemplo, Gly, Ala, Val, He, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um aminoácido diferente de Asp, Cys, Pro, Glu ou Gin, por exemplo, Phe, Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asn, Trp, Tyr, ou Cys, na posição 399 ou (iv) um aminoácido diferente de Lys, Arg, Ser, Thr, ou Trp, por exemplo, Phe, Leu, Met, Ala, Val, Gly, He, Asn, His, Asp, Glu, Gin, Pro, Tyr, ou Cys, na posição 366.
[00231] Em uma modalidade, a primeira região CH3 tem um Arg, Ala, His ou Gly na posição 409, e a segunda região CH3 tem (i) um Lys, Gin, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um Ala, Gly, lie, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His,
Lys, Arg ou Tyr na posição 399, ou
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80/163 (iv) um Ala, Asp, Glu, His, Asn, Vai, Gin, Phe, Gly, He, Leu,
Met, ou Tyr na posição 366.
[00232] Em uma modalidade, a primeira região CH3 tem um Arg na posição 409, e a segunda região CH3 tem (i) um Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Vai, ou Trp na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399, ou (iv) um Ala, Asp, Glu, His, Asn, Vai, Gin na posição 366.
[00233] Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada, em que cada uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas compreende pelo menos um região de dobradiça, uma região CH2 e CH3, em que (i) o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita segunda cadeia pesada, ou (ii) o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita segunda cadeia pesada.
[00234] Além das substituições de aminoácidos especificadas acima, as ditas primeira e segunda cadeias pesadas podem conter outras substituições, deleção ou inserções de aminoácidos em relação a sequências de cadeias pesadas do tipo selvagem.
[00235] Em uma modalidade adicional, os ditos primeiro e segundo braços Fab (ou domínios constantes da cadeia pesada) compreendem, exceto pelas mutações especificadas, uma sequência CH3 selecionada independentemente dentre as seguintes: (IgGlm(a)) (SEQ ID NO:96), (IgGlm(f)) (SEQ ID NO:97), e (IgGlm(ax) (SEQ ID NO:98).
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81/163 [00236] Em uma modalidade, nem a dita primeira nem a segunda sequência Fc compreende uma sequência Cys-Pro-Ser-Cys na região de dobradiça (núcleo).
[00237] Em uma modalidade adicional, tanto a dita primeira quanto a segunda sequência Fc compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de dobradiça (núcleo).
Métodos para preparar anticorpos biespecíficos [00238] Métodos tradicionais como o hibridoma híbrido e métodos de conjugação química (Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649) podem ser usados na preparação dos anticorpos biespecíficos da invenção. A coexpressão em uma célula hospedeira de dois anticorpos, consistindo em diferentes cadeias pesadas e leves, leva a uma mistura de possíveis produtos de anticorpos além do anticorpo biespecífico desejado, que pode então ser isolado por, por exemplo, cromatografia de afinidade ou métodos similares.
[00239] Estratégias que favorecem a formação de um produto biespecífico funcional, mediante a coexpressão de diferentes construções de anticorpos também podem ser usadas, por exemplo, o método descrito por Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219). A fusão de hibridomas de rato e camundongo produzindo anticorpos diferentes leva a um número limitado de proteínas heterodiméricas devido ao emparelhamento de cadeia pesada/leve restrito a espécies preferenciais. Outra estratégia para promover a formação de heterodímeros sobre os homodímeros é uma estratégia de “knob-into-hole” na qual uma protuberância é introduzida em um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada e uma cavidade correspondente em um segundo polipeptídeo de cadeia pesada, de modo que a protuberância possa ser posicionada na cavidade na interface dessas duas cadeias pesadas, de modo a promover a formação de heterodímeros e impedir a formação de homodímeros. As “protuberâncias” são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo por cadeias laterais
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82/163 maiores. “Cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo, substituindo grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (patente US 5.731.168). Os documentos EP1870459 (Chugai) e W02009089004 (Amgen) descrevem outras estratégias para favorecer a formação de heterodímeros mediante a coexpressão de diferentes domínios de anticorpos em uma célula hospedeira. Nesses métodos, um ou mais resíduos que compõem a interface CH3-CH3 em ambos os domínios CH3 são substituídos por um aminoácido carregado, de modo que a formação de homodímeros seja eletrostaticamente desfavorável e a heterodimerização seja eletrostaticamente favorável. O documento W02007110205 (Merck) descreve ainda outra estratégia, em que as diferenças entre os domínios CH3 IgG e IgA são exploradas para promover a heterodimerização.
[00240] Outro método in vitro para a produção de anticorpos biespecíficos foi descrito no documento W02008119353 (Genmab), em que um anticorpo biespecífico é formado pela troca de “braço Fab” ou “meia molécula” (permuta de uma cadeia pesada e cadeia leve afixada) entre dois anticorpos IgG4 ou tipo IgG4 monoespecíficos após incubação sob condições de redução. O produto resultante é um anticorpo biespecífico com dois braços Fab que podem compreender sequências diferentes.
[00241] Um método preferido para a preparação de anticorpos biespecíficos, como anticorpos CD3xPD-Ll biespecíficos, da presente invenção inclui os métodos descritos em WO2011131746 e W02013060867 (Genmab) compreendendo as seguintes etapas:
a) prover um primeiro anticorpo compreendendo uma região Fc, a dita região Fc compreendendo uma primeira região CH3;
b) prover um segundo anticorpo compreendendo uma segunda região Fc, a dita região Fc compreendendo uma segunda região CH3, em que o primeiro anticorpo é um anticorpo PD-L1 de acordo
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83/163 com a invenção e o segundo anticorpo é capaz de se ligar a um epítopo diferente de PD-L1 ou a um antígeno diferente, como CD3 humano, ou viceversa; e em que as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte do que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3;
c) incubar o dito primeiro anticorpo em conjunto com o dito segundo anticorpo sob condições de redução; e
d) obter o dito anticorpo biespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico de PD-LlxCD3.
[00242] De modo similar, é provido um método para a produção de um anticorpo de acordo com a invenção, compreendendo as etapas de:
a) cultivar uma célula hospedeira produzindo um primeiro anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definida aqui e purificar o dito primeiro anticorpo da cultura;
b) cultivar uma célula hospedeira produzindo um segundo anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um epítopo diferente de PD-L1 ou um antígeno diferente, por exemplo, uma região de ligação ao CD3e humano como definida aqui, purificar o dito segundo anticorpo da cultura;
c) incubar o dito primeiro anticorpo em conjunto com o dito segundo anticorpo sob condições de redução suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sofram isomerização da ligação dissulfeto, e
d) obter o dito anticorpo biespecífico.
[00243] Em uma modalidade, o dito primeiro anticorpo juntamente com o dito segundo anticorpo são incubados sob condições de redução suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sofram
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84/163 isomerização da ligação dissulfeto, em que a interação heterodimérica entre os ditos primeiro e o segundo anticorpos no anticorpo heterodimérico resultante é tal que não ocorre troca de braço Fab a 0,5 mM de GSH após 24 horas a 37°C.
[00244] Sem se limitar à teoria, na etapa c), as ligações dissulfeto de cadeia pesada nas regiões de dobradiça dos anticorpos parentais são reduzidas e as cisteínas resultantes são então capazes de formar ligação dissulfeto de cadeia pesada com resíduos de cisteína de outra molécula de anticorpo parental (originalmente com uma especificidade diferente). Em uma modalidade desse método, as condições de redução na etapa c) compreendem a adição de um agente redutor, por exemplo, um agente redutor selecionado do grupo que consiste em: 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutationa, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta-mercapto-etanol, preferivelmente um agente redutor selecionado do grupo consiste em: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol e tris (2carboxietil)fosfina. Em uma modalidade adicional, a etapa c) compreende restaurar as condições para se tomarem não redutoras ou menos redutoras, por exemplo, pela remoção de um agente redutor, por exemplo, por dessalinização.
[00245] Para esse método, qualquer um dos anticorpos, por exemplo, os anticorpos CD3 e PD-L1 descritos acima podem ser usados, incluindo o primeiro e o segundo anticorpos CD3 e PD-L1, respectivamente, compreendendo uma primeira e/ou segunda região Fc. Exemplos dessas primeira e segunda regiões Fc, incluindo a combinação dessas primeira e segunda regiões Fc, podem incluir qualquer uma das descritas acima. Em uma modalidade particular, o primeiro e o segundo anticorpos, por exemplo, os anticorpos CD3 e PD-L1, respectivamente, podem ser escolhidos de modo a obter um anticorpo biespecífico como aqui descrito.
[00246] Em uma modalidade desse método, os ditos primeiro e/ou
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[00247] As regiões Fc do primeiro e do segundo anticorpos podem ser de qualquer isótipo, incluindo, mas não se limitando a IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em uma modalidade desse método, as regiões Fc dos ditos primeiro e segundo anticorpos são do isótipo IgGl. Em uma outra modalidade, uma das regiões Fc dos ditos anticorpos é do isótipo IgGl e a outra do isótipo IgG4. Na última modalidade, o anticorpo biespecífico resultante compreende uma sequência Fc de uma IgGl e uma sequência Fc de IgG4 e, portanto, pode ter propriedades intermediárias interessantes em relação à ativação de funções efetoras.
[00248] Em uma modalidade adicional, uma das proteínas iniciais do anticorpo foi engenheirada para não se ligar à proteína A, permitindo assim separar a proteína heterodimérica da dita proteína inicial homodimérica passando o produto sobre uma coluna de proteína A.
[00249] Como descrito acima, as sequências das primeira e segunda regiões CH3 dos anticorpos iniciais homodiméricos são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte do que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3. Mais detalhes sobre essas interações e como elas podem ser alcançadas são providas nos documentos WO2011131746 e WO2013060867 (Genmab), que são aqui incorporados por referência na totalidade.
[00250] Em particular, um anticorpo biespecífico estável, por exemplo, um anticorpo CD3xPD-Ll biespecífico, pode ser obtido com alto rendimento usando o método acima da invenção com base em dois anticorpos iniciais homodiméricos que se ligam a PD-L1 e um antígeno diferente ou um epítopo diferente de PD-L1, por exemplo, CD3, respectivamente, e contêm apenas algumas mutações conservativas e assimétricas nas regiões CH3. Mutações assimétricas significam que as sequências das ditas primeira e segunda
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86/163 regiões CH3 contêm substituições de aminoácidos em posições não idênticas. [00251] Os anticorpos biespecíficos da invenção também podem ser obtidos por coexpressão de construções que codificam o primeiro e o segundo polipeptídeos em uma única célula. Assim, em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para a produção de um anticorpo biespecífico, o dito método compreendendo as seguintes etapas:
a) prover uma primeira construção de ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptideo compreendendo uma primeira sequência Fe e uma primeira região de ligação ao antígeno de uma primeira cadeia pesada de anticorpo, a dita primeira sequência Fe compreendendo uma primeira região CH3,
b) prover uma segunda construção de ácido nucleico que codifica um segundo polipeptideo compreendendo uma segunda sequência Fe e uma segunda região de ligação ao antígeno de uma segunda cadeia pesada de anticorpo, a dita segunda sequência Fe compreendendo uma segunda região CH3, em que as sequências das ditas primeira e segunda regiões CH3 são diferentes e são tais que a interação heterodimérica entre as ditas primeira e segunda regiões CH3 é mais forte do que cada uma das interações homodiméricas das ditas primeira e segunda regiões CH3, e em que a dita primeira proteína homodimérica tem um aminoácido diferente de Lys, Leu ou Met na posição 409 e a dita segunda proteína homodimérica tem uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 399, 405 e 407, opcionalmente, em que as ditas primeira e segunda construções de ácido nucleico codificam sequências de cadeia leve dos ditos primeiro e segundo anticorpos
c) coexpressar as ditas primeira e segunda construções de ácido nucleico em uma célula hospedeira, e
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d) obter a dita proteína heterodimérica a partir da cultura de células.
Materiais e métodos para a produção de anticorpos da invenção [00252] Em aspectos adicionais, a invenção refere-se a materiais e métodos para a produção recombinante de anticorpos de acordo com a invenção. Os vetores de expressão adequados, incluindo promotores, intensificadores, etc., e células hospedeiras adequadas para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica.
[00253] Assim, em um aspecto, é provida uma construção de ácido nucleico compreendendo:
(i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definido aqui, e/ou (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definido aqui. [00254] Em uma modalidade, a construção de ácido nucleico compreende adicionalmente:
(i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um epítopo diferente de PD-L1 ou um antígeno diferente, por exemplo, CD3e humano como definido aqui, e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um epítopo diferente de PD-L1 ou um antígeno diferente, por exemplo, CD3e humano como definido aqui.
[00255] Em um aspecto ainda mais adicional, a invenção refere-se a um vetor de expressão compreendendo construções de ácido nucleico como
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88/163 aqui definido acima.
[00256] Um vetor de expressão no contexto da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácidos nucleicos cromossômicos, não cromossômicos e sintéticos (uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto adequado de elementos de controle de expressão). Exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago e vetores de ácido nucleico viral (RNA ou DNA). Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, um ácido nucleico que codifica o anticorpo PD-L1 ou CD3, é compreendido em um vetor de DNA ou RNA nu, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descrito em, por exemplo, Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), um vetor de ácido nucleico compactado (como descrito em, por exemplo, US 6.077.835 e/ou WO 00/70087), um vetor plasmídico como pBR322, pUC 19/18, ou pUC 118/119, um vetor de ácido nucleico de tamanho mínimo de “mosca” (como descrito em, por exemplo, Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ou como uma construção precipitada de vetor de ácido nucleico, como uma construção precipitada de Ca3(P04)2 (como descrito em, por exemplo, W0200046147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), e Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Tais vetores de ácidos nucleicos e o uso dos mesmos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, US 5.589.466 e US 5.973.972).
[00257] Em uma modalidade, o vetor é adequado para a expressão do anticorpo, por exemplo, o anticorpo PD-L1 e/ou o anticorpo CD3 em uma célula bacteriana. Exemplos de tais vetores incluem vetores de expressão como BlueScript (Stratagene), vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), vetores pET (Novagen, Madison WI) e
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89/163 similares).
[00258] Um vetor de expressão pode também ou alternativamente ser um vetor adequado para expressão em um sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para expressão em um sistema de levedura pode ser utilizado. Os vetores adequados incluem, por exemplo, vetores compreendendo promotores constitutivos ou induzíveis, como fator alfa, álcool oxidase e PGH (revisado em: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), and Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
[00259] Um vetor de expressão pode também ou alternativamente ser um vetor adequado para expressão em células de mamífero, por exemplo, um vetor compreendendo glutamina sintetase como marcador selecionável, como os vetores descritos em Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175.
[00260] Um ácido nucleico e/ou vetor também pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de secreção/localização, que pode alvejar um polipeptídeo, como uma cadeia polipeptídica nascente, para o espaço periplásmico ou para o meio de cultura de células. Tais sequências são conhecidas na técnica e incluem peptídeos de sinal ou líderes de secreção.
[00261] O vetor de expressão pode compreender ou estar associado a qualquer promotor, intensificador e outros elementos facilitadores da expressão. Exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão fortes (por exemplo, promotor/intensificador de CMV IE humano, bem como promoteres RSV, SV40, SL3-3, MMTV, e HIV LTR), sequências de terminação poli (A) eficazes, uma origem de replicação para o produto plasmídeo em E. coli, um gene de resistência a antibióticos como marcador selecionável e/ou um local de clonagem conveniente (por exemplo, um poliligante). Os ácidos nucleicos também podem compreender um promotor induzível em oposição a um promotor constitutivo, como CMV IE.
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90/163 [00262] Em uma modalidade, o vetor de expressão que codifica anticorpo, por exemplo, o vetor de expressão que codifica o anticorpo PD-L1 e/ou CD3 pode ser posicionado e/ou dispensado à célula hospedeira ou animal hospedeiro através de um vetor viral.
[00263] Em um aspecto ainda mais adicional, a invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo uma ou mais das construções de ácido nucleico ou o vetor de expressão especificado aqui acima.
[00264] Assim, a presente invenção também se refere a uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica recombinante que produz um anticorpo da presente invenção, como um transfectoma.
[00265] Exemplos de células hospedeiras incluem, por exemplo, células de leveduras, bactérias, plantas e mamíferos, como células CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 ou NS0 ou células linfocíticas. Uma célula hospedeira preferida é uma célula CHO-K1.
[00266] Por exemplo, em uma modalidade, a célula hospedeira pode compreender uma primeira e uma segunda construção de ácido nucleico integrado de maneira estável no genoma celular. Em outra modalidade, a presente invenção provê uma célula compreendendo um ácido nucleico não integrado, como um elemento de expressão plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo ou linear, que compreende uma primeira e uma segunda construção de ácido nucleico, conforme especificado acima.
[00267] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um hibridoma que produz um anticorpo PD-L1 como aqui definido.
Regiões Fc [00268] Em algumas modalidades, o anticorpo de acordo com a presente invenção compreende, além das regiões de ligação ao antígeno, uma região Fc que consiste nas sequências Fc das duas cadeias pesadas.
[00269] A primeira e a segunda sequências Fc podem ser de qualquer isótipo, incluindo, mas não se limitando a IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, e podem
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91/163 compreender uma ou mais mutações ou modificações. Em uma modalidade, cada uma das primeira e segunda sequências Fc é do isótipo IgG4 ou derivada do mesmo, opcionalmente com uma ou mais mutações ou modificações. Em uma outra modalidade, cada uma das primeira e segunda sequências Fc é do isótipo IgGl ou derivada do mesmo, opcionalmente com uma ou mais mutações ou modificações. Em uma outra modalidade, uma das sequências Fc é do isótipo IgGl e a outra do isótipo IgG4, ou é derivada desses respectivos isótipos, opcionalmente com uma ou mais mutações ou modificações.
[00270] Em uma modalidade, uma ou ambas as sequências Fc são deficientes em função efetora. Por exemplo, a(s) sequência(s) Fc pode(m) ser de um isótipo IgG4 ou de um tipo não IgG4, por exemplo IgGl, IgG2 ou IgG3, que foi modificada de tal forma que a capacidade de mediar funções efetoras, como ADCC, foi reduzida ou mesmo eliminada. Tais mutações foram descritas, por exemplo, em Dall’Acqua WF et al., J Immunol. 177(21:1129-1138 (2006) e Hezareh M, J Virol.; 75(24):12161-12168 (2001). Em uma outra modalidade, uma ou ambas as sequências Fc compreendem uma sequência de tipo selvagem de IgGl.
[00271] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem compreender modificações na região Fc. Quando um anticorpo compreende tais modificações, ele pode se tomar um anticorpo inerte ou não ativador. O termo “inércia”, “inerte” ou “não ativador”, como usado aqui, refere-se a uma região Fc que é pelo menos incapaz de ligar quaisquer receptores Fcy, induzir a reticulação mediada por Fc de FcRs ou induzir a reticulação mediada por FcR de antígenos alvo através de duas regiões Fc de anticorpos individuais, ou não é capaz de se ligar a Clq. A inércia de uma região Fc de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico, é vantajosamente testada usando o anticorpo em um formato monoespecífico.
[00272] Várias variantes podem ser construídas para tomar a região Fc de um anticorpo inativa para interações com os receptores Fcy (gama) e Clq
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92/163 para o desenvolvimento terapêutico de anticorpos. Exemplos de tais variantes são aqui descritos.
[00273] Assim, em uma modalidade do anticorpo da invenção, o dito anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada, em que uma ou ambas as cadeias pesadas são modificadas para que o anticorpo induza a função efetora mediada por Fc em menor extensão em relação a um anticorpo que é idêntico, exceto por compreender a primeira e a segunda cadeias pesadas não modificadas. A dita função efetora mediada por Fc pode ser medida determinando a expressão de CD69 mediada por Fc, ligando-se a receptores Fcy, ligando-se a Clq ou induzindo a reticulação mediada por Fc de FcRs.
[00274] Em tal modalidade, as sequências constantes da cadeia pesada foram modificadas para que o dito anticorpo reduza a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparado a um anticorpo (não modificado) do tipo selvagem, em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional baseado em PBMC, por exemplo, como descrito no Exemplo 3 de W02015001085.
[00275] Em uma outra modalidade, as sequências constantes das cadeias pesada e leve foram modificadas para que a ligação de Clq ao dito anticorpo seja reduzida em comparação com um anticorpo não modificado em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou 100%, em que a ligação a Clq é determinada por ELISA.
[00276] Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada para que o dito anticorpo medeie a proliferação reduzida de células T mediada por Fc em comparação com um anticorpo não modificado em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de células T é medida em um ensaio funcional baseado em
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 99/222 / 163 células mononucleares do sangue periférico (PBMC).
[00277] Assim, os aminoácidos na região Fe que desempenham um papel dominante nas interações com Clq e os receptores Fcy podem ser modificados.
[00278] Exemplos de posições de aminoácidos que podem ser modificados, por exemplo, em um anticorpo de isótipo IgGl, incluem as posições L234, L235 e P331. As combinações das mesmas, tais como L234F/L235E/P331S, podem causar uma diminuição profunda na ligação a CD64, CD32, CD16 e Clq humano.
[00279] Portanto, em uma modalidade, o aminoácido em pelo menos uma posição correspondente a L234, L235 e P331 pode ser A, A e S, respectivamente (Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200(1): 16-26; Oganesyan et al., 2008, Acta Cryst. (D64):700-4). Além disso, as substituições de aminoácidos L234F e L235E podem resultar em regiões Fe com interações anuladas com os receptores Fey e Clq (Canfield et al., 1991, J. Exp. Med. (173): 1483-91; Duncan et al., 1988, Nature (332):738-40). Portanto, em uma modalidade, os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 podem ser F e E, respectivamente. Uma substituição de aminoácidos D265A pode diminuir a ligação a todos os receptores Fcy e impedir a ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604). Portanto, em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a D265 pode ser A. A ligação a Clq pode ser anulada por mutação das posições D270, K322, P329 e P331. A mutação dessas posições para D270A ou K322A ou P329A ou P331A pode tomar o anticorpo deficiente na atividade de CDC Idusogie EE, et al., 2000, J. Immunol. 164: 4178-84). Portanto, em uma modalidade, os aminoácidos em pelo menos uma posição correspondente a D270, K322, P329 e P331 podem ser A, A, A, e A, respectivamente.
[00280] Uma abordagem alternativa para minimizar a interação da região Fe com os receptores Fcy e Clq é pela remoção do local de
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94/163 glicosilação de um anticorpo. A mutação da posição N297 para, por exemplo, Q, A ou E remove um local de glicosilação que é crítico para as interações de receptor IgG-Fc gama. Portanto, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a N297 pode ser G, Q, A ou E Leabman et al., 2013, MAbs; 5 (6): 896-903). Outra abordagem alternativa para minimizar a interação da região Fc com os receptores Fcy pode ser obtida pelas seguintes mutações; P238A, A327Q, P329A ou E233P/L234V/L235A/G236del (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591-604).
[00281] Altemativamente, as subclasses de IgG2 e IgG4 humanas são consideradas naturalmente comprometidas em suas interações com os receptores gama Clq e Fc, embora tenham sido relatadas interações com os receptores Fcy (Parren et al., 1992, J. Clin Invest. 90: 1537-1546; Bruhns et al., 2009, Blood 113: 3716-3725). Mutações que anulam essas interações residuais podem ser feitas em ambos os isótipos, resultando na redução de efeitos colaterais indesejados associados à ligação ao FcR. Para IgG2, incluem L234A e G237A e para IgG4, L235E. Portanto, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a L234 e G237 em uma cadeia pesada de IgG2 humana pode ser A e A, respectivamente. Em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a L235 em uma cadeia pesada de IgG4 humana pode ser E.
[00282] Outras abordagens para minimizar ainda mais a interação com os receptores Fcy e Clq nos anticorpos IgG2 incluem aquelas descritas em WO2011066501 e Lightle, S., et al., 2010, Protein Science (19):753-62.
[00283] A região de dobradiça do anticorpo também pode ser importante em relação às interações com os receptores Fcy e complemento (Brekke et al., 2006, J Immunol 177:1129-1138; Dall’Acqua WF, et al., 2006, J Immunol 177:1129-1138). Consequentemente, mutações ou deleção da região de dobradiça podem influenciar as funções efetoras de um anticorpo.
[00284] Dessa forma, em uma modalidade, o anticorpo compreende
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 101/222 / 163 uma primeira e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina, em que, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas de imunoglobulina, um ou mais aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgGl humana não são L, L, D, N e P, respectivamente.
[00285] Em uma modalidade, em ambas as primeira e segunda cadeias pesadas, um ou mais aminoácidos na posição correspondente às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgGl humana não são L, L, D, N, e P, respectivamente.
[00286] Em uma modalidade, em ambas as ditas primeira e segunda cadeias pesadas, o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana não é D.
[00287] Dessa forma, em uma modalidade, em ambas as ditas primeira e segunda cadeias pesadas, o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana é selecionado do grupo que consiste em: A e E.
[00288] Em uma modalidade adicional, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas, os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana não são L e L, respectivamente.
[00289] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas, os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana são F e E, respectivamente.
[00290] Em uma modalidade, em ambas as ditas primeira e segunda cadeias pesadas, os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana são F e E, respectivamente.
[00291] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas
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96/163 primeira e segunda cadeias pesadas, os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de
IgGl humana são F, E, e A, respectivamente.
[00292] Em uma modalidade particularmente preferida, em ambas as ditas primeira e segunda cadeias pesadas, os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana são F, E, e A, respectivamente.
[00293] Em uma modalidade particularmente preferida adicional, o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada em que as posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F e E, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda cadeia pesada é R, ou (ii) a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é R, e a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda pesada cadeia é L.
[00294] Em uma modalidade particularmente preferida adicional, o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada em que as posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F, E, e A, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma
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[00295] As variantes de anticorpo com a combinação de três substituições de aminoácidos L234F, L235E e D265A e além disso a mutação K409R ou F405L são aqui denominadas com o sufixo “FEAR” ou “FEAL”, respectivamente.
[00296] Aqui, huCD3-H!Ll refere-se ao anticorpo anti-CD3 SP34 humanizado com sequências VH e VL como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 25 e 29.
[00297] Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico da invenção compreende:
(i) uma meia molécula derivada de IgGl-huCD3-HlLl-FEAL, e um anticorpo de meia molécula derivado de IgGl-PDLl-338-FEAR, IgGlPDL1-511-FEAR ou IgGl-PDLl-547-FEAR, ou (ii) uma meia molécula derivada de IgGl-huCD3-HlLlFEAR, e um anticorpo de meia molécula derivado de IgGl-PDLl-338-FEAL, IgGl-PDLl-511-FEAL ou IgGl-PDLl-547-FEAL.
[00298] Em uma modalidade adicional, a primeira cadeia pesada ou meia molécula compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO:90 e a segunda cadeia pesada compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO:89.
[00299] Em uma modalidade adicional da invenção, um ou ambos os anticorpos que fazem parte do anticorpo biespecífico foram engenheirados para reduzir ou aumentar a ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn), a fim de manipular a meia-vida sérica do anticorpo biespecífico. As técnicas para
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98/163 aumentar ou reduzir a meia-vida sérica são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Dall’Acqua et al. 2006, J. Biol. Chem., 281:23514-24; Hinton et al. 2006, J. Immunol., 176:346-56; e Zalevsky et al. 2010 Nat. Biotechnol.,
28:157-9.
Conjugados [00300] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê anticorpos que estão ligados ou conjugados a uma ou mais frações terapêuticas, como uma citocina, um imunossupressor, uma molécula imunoestimulante e/ou um radioisótopo. Tais conjugados são aqui chamados de “imunoconjugados” ou “conjugados de fármacos”. Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são chamados de “imunotoxinas”.
[00301] Em uma modalidade, a primeira e/ou a segunda sequência Fe são conjugadas com um fármaco ou um pró-fármaco ou contêm um grupo aceitador para o mesmo. Esse grupo aceitador pode, por exemplo, ser um aminoácido não natural.
Composições [00302] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00303] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um anticorpo da presente invenção ou uma combinação de diferentes anticorpos da presente invenção.
[00304] As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com técnicas convencionais, como as descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode, por exemplo, incluir diluentes, cargas, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, como Tween-20 ou
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Tween-80), estabilizadores (por exemplo, açúcares ou aminoácidos livres de proteínas), conservantes, fixadores de tecidos, solubilizadores e/ou outros materiais adequados para inclusão em uma composição farmacêutica.
[00305] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos adequados, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes retardantes de absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis com um anticorpo da presente invenção. Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, etanol, dextrose, polióis (como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, soluções coloidais de carboximetilcelulose, goma tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila e/ou vários tampões. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.
[00306] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.
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100/163 [00307] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender agentes de isotonicidade, como açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.
[00308] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via de administração escolhida, como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, conservantes ou tampões, que podem intensificar a vida útil ou a eficácia da composição farmacêutica. Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados com carreadores que protegerão o anticorpo contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de dispensação microencapsulados. Tais carreadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Os métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos pelos versados na técnica.
[00309] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes, por exemplo, como enumerados acima, como requerido, seguido de microfiltração por esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários, por exemplo, a partir dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que rendem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução
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101/163 previamente filtrada esterilizada do mesmo.
[00310] Os níveis reais de dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas podem variar de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração em particular, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizadas, ou a amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico que está sendo utilizado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas utilizadas, idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e histórico médico anterior do paciente em tratamento e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
[00311] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via e modo adequado. Em uma modalidade, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada por via parenteral. “Administrado por via parenteral”, como usado aqui, significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, geralmente por injeção, e inclui injeção e infusão epidérmica, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, intracraniana, intratorácica, epidural e intraestemal.
[00312] Em uma modalidade, essa composição farmacêutica é administrada por injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.
Usos [00313] Em um aspecto, a invenção refere-se ao anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, ou à composição
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102/163 farmacêutica como aqui descrita, para uso como um medicamento.
[00314] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, ou à composição farmacêutica como aqui descrita para uso no tratamento de uma doença, como câncer.
[00315] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades descritas neste documento, ou da composição farmacêutica como aqui descrita a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00316] Em particular, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser úteis em contextos terapêuticos nos quais é desejável o alvejamento específico e a morte mediada por células T que expressam PDLl, e eles podem ser mais eficientes em comparação com um anticorpo antiPD-L1 regular em certas indicações e configurações.
[00317] Os anticorpos da invenção também têm utilidade adicional na terapia e diagnóstico de uma variedade de doenças relacionadas à PD-L1. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados para induzir in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: inibir o crescimento e/ou a diferenciação de uma célula que expressa PD-L1; matar uma célula que expressa PD-L1; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa PD-L1 na presença de células efetoras humanas; mediar CDC de uma célula que expressa PD-L1 na presença de complemento; mediar a apoptose de uma célula que expressa PD-L1; e/ou induzir translocação em balsas lipídicas após ligação de PD-L1.
[00318] Em um aspecto, a invenção refere-se ao anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, ou à composição farmacêutica como aqui descrita para uso no tratamento de câncer.
[00319] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao anticorpo de
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103 / 163 acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, ou à composição farmacêutica como aqui descrita para uso no tratamento de doença cancerígena distinguida pela presença de tumores sólidos.
[00320] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas, ou à composição farmacêutica como aqui descrita para uso no tratamento de doenças cancerígenas selecionadas do grupo que consiste em: melanoma, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, câncer de mama, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de esôfago, câncer de pâncreas, câncer de fígado, carcinoma de timoma e timico, câncer de cérebro, glioma, carcinoma adrenocortical, câncer de tireoide, outros cânceres de pele, sarcoma, mieloma múltiplo, leucemia, linfoma, síndromes mielodisplásicas, câncer de ovário, câncer de endometriose, câncer de próstata, câncer de pênis, linfoma de Hodgkins, linfoma não Hodgkins, carcinoma de células de Merkel e mesotelioma.
[00321] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso de um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para a fabricação de um medicamento, como um medicamento para tratamento de câncer, por exemplo, câncer distinguido pela presença de tumores sólidos ou um câncer selecionado do grupo que consiste em: melanoma, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de cabeça e pescoço.
[00322] A presente invenção também se refere a um método para inibir o crescimento e/ou proliferação de uma ou mais células tumorais que expressam PD-L1, compreendendo a administração de um anticorpo da presente invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00323] A presente invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer, compreendendo
a) selecionar um indivíduo que sofre de um câncer compreendendo células tumorais que expressam PD-L1, e
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b) administrar ao indivíduo o anticorpo da presente invenção ou uma composição farmacêutica da presente invenção.
[00324] Os regimes de dosagem nos métodos de tratamento e usos acima são ajustados para prover a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. As composições parenterais podem ser formuladas na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem.
[00325] As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para os anticorpos dependem da doença ou condição a ser tratada e podem ser determinados pelos versados na técnica. Uma faixa não limitativa exemplificativa para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção é de cerca de 0,001 a 10 mg/kg, como cerca de 0,001 a 5 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,001 a 2 mg/kg, como cerca de 0,001 a 1 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,001, cerca de 0,01, cerca de 0,1, cerca de 1 ou cerca de 10 mg/kg. Uma outra faixa não limitativa exemplificativa para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da presente invenção é de cerca de 0,1 a 100 mg/kg, como cerca de 0,1 a 50 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,1 a 20 mg/kg, como cerca de 0,1 a 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 0,3, cerca de 1, cerca de 3, cerca de 5 ou cerca de 8 mg/kg.
[00326] Um médico ou veterinário com habilidade na técnica pode determinar e prescrever prontamente a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou o veterinário podería iniciar doses do anticorpo utilizado na composição farmacêutica em níveis inferiores aos necessários para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de um anticorpo da presente invenção
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105 / 163 será a quantidade do composto que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. A administração pode, por exemplo, ser parenteral, como intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em uma modalidade, os anticorpos podem ser administrados por infusão em uma dosagem semanal calculada em mg/m2. Tais dosagens podem, por exemplo, se basear nas dosagens de mg/kg fornecidas acima, de acordo com o seguinte: dose (mg/kg) x 70: 1,8. Essa administração pode ser repetida, por exemplo, 1 a 8 vezes, como 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua durante um período de 2 a 24 horas, como de 2 a 12 horas. Em uma modalidade, os anticorpos podem ser administrados por infusão contínua lenta por um longo período, como mais de 24 horas, para reduzir os efeitos colaterais tóxicos.
[00327] Em uma modalidade, os anticorpos podem ser administrados em uma dosagem semanal calculada como uma dose fixa por até 8 vezes, como de 4 a 6 vezes quando administrados uma vez por semana. Esse regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. Tais dosagens fixas podem, por exemplo, se basear nas dosagens de mg/kg providas acima, com uma estimativa de peso corporal de 70 kg. A dosagem pode ser determinada ou ajustada medindo a quantidade de anticorpo da presente invenção no sangue após a administração, por exemplo, retirando uma amostra biológica e usando anticorpos anti-idiotípicos que têm como alvo a região de ligação ao antígeno PD-L1 dos anticorpos da presente invenção.
[00328] Em uma modalidade, os anticorpos podem ser administrados como terapia de manutenção, como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
[00329] Um anticorpo também pode ser administrado profilaticamente para reduzir o risco de desenvolver câncer, atrasar o início da ocorrência de um evento na progressão do câncer e/ou reduzir o risco de recorrência quando
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106/163 um câncer está em remissão.
[00330] Os anticorpos da invenção também podem ser administrados em terapia combinada, isto é, combinados com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Consequentemente, em uma modalidade, o medicamento contendo anticorpo é para combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como um agente citotóxico, quimioterapêutico ou antiangiogênico.
[00331] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um anticorpo anti-idiotípico que se liga à região de ligação a PD-L1, conforme definido em qualquer uma das modalidades aqui descritas.
[00332] Itens adicionais da presente descrição:
1. Um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que o anticorpo inibe a ligação da PD-L1 humana à PD-1 humana, e (i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547], ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547], mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511].
[00333] 2. O anticorpo de acordo com o item 1, em que o dito anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e
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107 / 163 uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338].
[00334] 3. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57 [476].
[00335] 4. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é bloqueada pela ligação de um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 110 [625].
[00336] 5. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
[00337] 6. O anticorpo de acordo com o item 1, em que o dito anticorpo:
(i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22
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108/163 [547].
[00338] 7. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4 e 6, em que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 113 (RI 13), 123 (Y123) e 125 (R125) na SEQ ID NO: 94 foram substituídos por alaninas é reduzida em comparação com a ligação à PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - l,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13 [338].
[00339] 8. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1 a 2 e 6, em que o dito anticorpo se liga a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos na posição 113 (RI 13), o resíduo de aminoácido na posição 123 (Y123) e/ou o resíduo de aminoácido na posição 125 (RI25) da SEQ ID NO: 94.
[00340] 9. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1, 3, 4 e
6, em que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 19 (F19), 42 (F42), 45 (E45), 46 (K46), 94 (L94) e 116 (1116) na SEQ ID NO: 94 foi/foram substituído(s) por alaninas é reduzida em comparação com a PDL1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - 1,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é
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109/163 calculada como estabelecido no Exemplo 13 [511].
[00341] 10. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1, 3, 4 e
6, em que o dito anticorpo se liga a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: os resíduos de aminoácidos na posição 45 (E45), o resíduo de aminoácido na posição 46 (K46); e/ou o resíduo de aminoácido na posição 94 (L94) da SEQ ID NO: 94.
[00342] 11.0 anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1, 5 e 6, em que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 58 (E58) e 113 (Rl 13) na SEQ ID NO: 94 foi/foram substituído(s) por alaninas é reduzida em comparação com a PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - 1,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13 [547].
[00343] 12. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1, 5 e 6, em que o dito anticorpo se liga a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo o resíduo de aminoácido na posição 58 (E58) e/ou o resíduo de aminoácido na posição 113 (Rl 13) da SEQ ID NO: 94.
[00344] 13. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste nas
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110/163 sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:21.
[00345] 14. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente [338], ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente [511], ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO :24, respectivamente [547]. [00346] 15. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VH selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8 e
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SEQ ID NO: 18.
[00347] 16. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:22.
[00348] 17. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende:
(i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22 [547].
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112/163 [00349] 18. O anticorpo de acordo com o item 17, em que as ditas sequências VH e VL compreendem, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente, e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VH têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas.
[00350] 19. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito anticorpo é capaz de induzir a lise dependente da dose de células epiteliais de um adenocarcinoma, como MDA-MB-231 através de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).
[00351] 20. O anticorpo de acordo com o item 19, em que o dito anticorpo é capaz de reduzir o número de células em uma cultura das ditas células epiteliais em pelo menos 5%, como pelo menos 6%, 7%, 8%, 9% ou pelo menos 10% como resultado da lise celular.
[00352] 21. O anticorpo de acordo com o item 19 ou 20, em que a
ADCC é determinada in vitro em um ensaio de liberação de 51Cr, como o ensaio descrito no exemplo 14.
[00353] 22. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 19 a 20, em que a ADCC é determinada in vitro, incubando as ditas células epiteliais com uma composição compreendendo o anticorpo e células efetoras, como células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), por 4 horas a 37°C,
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5% CCh, a quantidade de anticorpo na dita composição estando dentro da faixa de 0,1 a 1 qg/mL e a razão de células efetoras para células epiteliais sendo de 100:1.
[00354] 23. O anticorpo de acordo com o item 19 ou 20, em que a dita lise de células epiteliais é determinada in vitro em um ensaio repórter de luciferase como substituto da ADCC, como o bioensaio repórter luminescente de ADCC descrito no exemplo 14.
[00355] 24. O anticorpo de acordo com o item 23, em que a ADCC é determinada in vitro por
i) contato de uma cultura das ditas células epiteliais com uma composição compreendendo o anticorpo e as células T humanas Jurkat que expressam estavelmente FcyRIIIa (CD 16) e luciferase de vagalume (células efetoras), em uma razão de célula efetora:célula epitelial de 1:1, ii) ajuste da cultura das células epiteliais e células efetoras à temperatura ambiente por 15 minutos, iii) incubação da cultura das células epiteliais e células efetoras com um substrato de luciferase, e iv) determinação da produção de luciferase na dita cultura celular;
a quantidade de anticorpo na dita composição estando dentro da faixa de 0,5 a 250 ng/mL e a razão de células efetoras para células epiteliais sendo de 1:1.
[00356] 25. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 19, 20, e 24, em que quando a ADCC das ditas células epiteliais é determinada em um ensaio repórter de luciferase, tal como um ensaio repórter definido no item 23 ou 24, então a ADCC observada após a incubação de uma cultura das células epiteliais com uma composição de teste compreendendo o dito anticorpo é de pelo menos 1,5 vezes a ADCC observada após a incubação de uma cultura das células epiteliais com uma composição compreendendo
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114/163 anticorpo de referência; a ADCC sendo determinada como unidades de luminescência relativa (RLU), a concentração de anticorpo na dita composição de teste e na dita composição compreendendo um anticorpo de referência sendo a mesma e dentro da faixa de 20 a 250 ng/ml, e o anticorpo de referência sendo selecionado de:
a) um anticorpo compreendendo a sequência VH estabelecida na SEQ ID NO: 74 e a sequência VL estabelecida na SEQ ID NO: 78; e
b) um anticorpo compreendendo a sequência VH estabelecida na SEQ ID NO: 81 e a sequência VL estabelecida na SEQ ID NO: 85. [00357] 26. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
[00358] 27. Um anticorpo que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que o dito anticorpo compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 33, 34 e 35, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:37, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:38, respectivamente [321], ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas
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SEQ ID NOs: 47, 48 e 49, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:51, a sequência DVI, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:52, respectivamente [421], ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:58, a sequência RDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:59, respectivamente [476], ou (iv) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 61, 62 e 63, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:65, a sequência DDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:66, respectivamente [516], ou (v) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 107, 108 e 109, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:111, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 113, respectivamente [625], ou (vi) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 68, 69 e 70, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:72, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:73, respectivamente [632]. [00359] 28. O anticorpo de acordo com o item 27, em que o dito
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116/163 anticorpo compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:32 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:36 [321], ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:46 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:50 [421], ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57 [476], ou (iv) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:60 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:64 [516], ou (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 110 [625], ou (vi) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:67 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:71 [632].
[00360] 29. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito anticorpo é monovalente.
[00361] 30. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito anticorpo é um anticorpo bivalente com duas regiões de ligação ao antígeno capazes de se ligar à PD-L1 humana e em que as ditas duas regiões de ligação ao antígeno têm sequências de região variável idênticas.
[00362] 31. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito anticorpo é um anticorpo biespecífico bivalente que, além da dita (primeira) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana, compreende uma (segunda) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno não é CD3e humano.
[00363] 32. Um anticorpo biespecífico que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), em que a
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117/163 região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana tem os recursos estabelecidos em qualquer um dos itens anteriores.
[00364] 33. O anticorpo biespecífico de acordo com o item 32, em que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
[00365] 34. O anticorpo biespecífico de acordo com o item 32 ou 33, em que compreende:
(i) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7 [338], respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (ii) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH)
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118/163 compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17 [338], respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (iii) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:23, a sequência DDN e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:24 [547], respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
[00366] 35. O anticorpo biespecífico de acordo com qualquer um dos itens 32 a 34, em que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao
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CD3e humano compreende uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID
NO:25 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29.
[00367] 36. O anticorpo biespecífico de acordo com o item 32, em que o dito anticorpo biespecífico:
(i) tem uma afinidade menor para a ligação ao CD3e humano em comparação com um anticorpo que tem uma região de ligação ao antígeno capaz de compreender uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:25 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, preferivelmente em que a dita afinidade é pelo menos 2 vezes menor, por exemplo pelo menos 5 vezes menor, como pelo menos 10 vezes menor, por exemplo pelo menos 25 vezes menor, tal como pelo menos 50 vezes menor, e (ii) é capaz de mediar a citotoxicidade dependente da concentração de células MDA-MB-231, células PC-3 e/ou células HELA ao usar PBMCs ou células T purificadas como células efetoras, por exemplo, quando testado como descrito no Exemplo 11 aqui.
[00368] 37. O anticorpo biespecífico de acordo com o item 36, distinguido pelo fato de que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 99, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 100, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a
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120/163 sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 101, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (iv) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 102, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (v) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 103, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (vi) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 104, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (vii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 105, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com
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121/163 as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
[00369] 38. O anticorpo biespecífico de acordo com o item 36 ou 37, em que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:39 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:40 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:41 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (iv) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:42 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:43 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (vi) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:44 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (vii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:45 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29.
[00370] 39. Um anticorpo multiespecífico que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana tem os recursos estabelecidos em qualquer um dos itens 1 a 31.
[00371] 40. O anticorpo multiespecífico de acordo com o item 39, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve (VL)
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122/163 compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência
VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4 [338], SEQ ID NO: 11 [511] e SEQ ID NO:21 [547].
[00372] 41. O anticorpo multiespecífico de acordo com o item 40, em que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente [338], ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente [511], ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO :24, respectivamente [547]. [00373] 42. O anticorpo multiespecífico de acordo com o item 40 ou
41, em que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à
PD-L1 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VH selecionada do grupo
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123 / 163 que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:1 [338], SEQ ID
NO:8 [511] e SEQ ID NO:18 [547].
[00374] 43. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 40 a 42, em que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste nas sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:5 [338], SEQ ID NO: 15 [511]e SEQ ID NO:22 [547].
[00375] 44. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 40 a 43, em que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a
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124/163 sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22 [547].
[00376] 45. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 40 a 44, em que as ditas sequências VH e VL compreendem, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente, e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VH têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas.
[00377] 46. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 40 a 45, em que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
(i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
[00378] 47. Um anticorpo multiespecífico que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito anticorpo:
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125 / 163 (i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :22, ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15.
[00379] 48. O anticorpo multiespecífico de acordo com o item 47, em que o dito anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5.
[00380] 49. Um anticorpo multiespecífico que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57.
[00381] 50. O anticorpo multiespecífico de acordo com o item 49, em que o anticorpo inibe a ligação de PD-L1 humana à PD-1 humana.
[00382] 51.0 anticorpo multiespecífico de acordo com o item 49 ou
50, em que o anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
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126/163 [00383] 52. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 49 a 51, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na
SEQ ID NO:22.
[00384] 53. Um anticorpo multiespecífico que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a dita primeira região de ligação ao antígeno:
(i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
[00385] 54. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 40 a 53, em que o anticorpo é biespecífico.
[00386] 55. O anticorpo multiespecífico de acordo com o item 54, em que o anticorpo é bivalente.
[00387] 56. O anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 40 a 55, em que o anticorpo é capaz de se ligar a um segundo antígeno e o dito segundo antígeno não é CD3e humano.
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127 / 163 [00388] 57. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.
[00389] 58. O anticorpo de acordo com o item 57, em que o anticorpo é um anticorpo IgGl de comprimento total.
[00390] 59. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
[00391] 60. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 32 a 59, em que o anticorpo compreende duas meias moléculas, cada uma compreendendo uma região de ligação ao antígeno, em que (i) a(s) meia(s) molécula(s) que compreende(m) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é/são quimérica(s), e/ou (ii) a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é quimérica.
[00392] 61. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que (i) a(s) região(ões) de ligação ao antígeno capaz(es) de se ligar à PD-L1 humana é/são humanizada(s), e/ou (ii) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humanizada.
[00393] 62. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que (i) a(s) região(ões) de ligação ao antígeno capaz(es) de se ligar à PD-L1 humana é/são humana(s), e/ou (ii) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humana.
[00394] 63. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que cada uma das regiões de ligação ao antígeno compreende
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128/163 uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região variável da cadeia leve (VL), e em que as ditas regiões variáveis compreendem três sequências
CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente.
[00395] 64. O anticorpo de acordo com o item 63, em que o anticorpo compreende duas regiões constantes da cadeia pesada (CH) e duas regiões constantes da cadeia (CL).
[00396] 65. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o anticorpo compreende uma primeira e segunda cadeia pesada, em que cada uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas compreende pelo menos uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma CH3, em que na dita primeira cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, F405, Y407 e K409 (de acordo com a numeração da UE) foi substituído e, na dita segunda cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, F405, Y407 e K409 (de acordo com a numeração da UE) foi substituído, e em que a dita primeira e a dita segunda cadeias pesadas não são substituídas nas mesmas posições.
[00397] 66. O anticorpo de acordo com o item 65, em que (i) o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita segunda cadeia pesada, ou (ii) o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita segunda cadeia pesada.
[00398] 67. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens
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129/163 anteriores, em que o dito anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada e em que uma ou ambas as cadeias pesadas são modificadas para que o anticorpo induza a função efetora mediada por Fc em menor extensão em relação a um anticorpo que é idêntico, exceto para compreender a primeira e a segunda cadeias pesadas não modificadas.
[00399] 68. O anticorpo de acordo com o item 67, em que a dita função efetora mediada por Fc é medida por determinação da expressão de CD69 mediada por Fc, por ligação a receptores Fcy, por ligação a Clq ou por indução de reticulação mediada por Fc de FcRs.
[00400] 69. O anticorpo de acordo com o item 67 ou 68, em que as sequências constantes das cadeias pesada e leve foram modificadas para que o dito anticorpo reduza a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparado a um anticorpo do tipo selvagem, em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional baseado em PBMC.
[00401] 70. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada, em que, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas, um ou mais aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE não são L, L, D, N e P, respectivamente.
[00402] 71.0 anticorpo de acordo com o item 70, em que as posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE são F e E, respectivamente, nas ditas primeira e segunda cadeias pesadas.
[00403] 72. O anticorpo de acordo com o item 71, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira e uma segunda
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130/163 cadeia pesada e em que as posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F e E, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda cadeia pesada é R, ou (ii) a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é R, e a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda pesada cadeia é L.
[00404] 73. O anticorpo de acordo com o item 70, em que as posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE são F, E, e A, respectivamente, nas ditas primeira e segunda cadeias pesadas.
[00405] 74. O anticorpo de acordo com o item 73, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada e em que as posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F, E, e A, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda cadeia pesada é R, ou (ii) a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é R, e a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda
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131/163 pesada cadeia é L.
[00406] 75. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o anticorpo não se liga à PD-L2 humana.
[00407] 76. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o anticorpo liga a PD-L1 humana com uma Kd de cerca de 10'8 M ou menos, tal como cerca de IO'9 M ou menos, por exemplo, cerca de IO'10 M ou menos, quando determinado como descrito no Exemplo 8 aqui.
[00408] 77. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o anticorpo medeia a citotoxicidade dependente da concentração de células MDA-MB-231, células PC-3 e/ou células HELA ao usar células T purificadas como células efetoras, quando testado como descrito no Exemplo 11 aqui.
[00409] 78. Uma construção de ácido nucleico que compreende:
(i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definido em qualquer um dos itens 1 a 31, e/ou (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definido em qualquer um dos itens 1 a 31.
[00410] 79. A construção de ácido nucleico de acordo com o item 73, compreendendo adicionalmente (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano como definido em qualquer um dos itens 33 a 38, e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma região de
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132/163 ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano como definido em qualquer um dos itens 33 a 38.
[00411] 80. Um vetor de expressão que compreende uma construção de ácido nucleico como definida no item 78 ou 79.
[00412] 81. Uma célula hospedeira que compreende uma construção de ácido nucleico como definida no item 78 ou 79 ou um vetor de expressão como definido no item 80.
[00413] 82. A célula hospedeira de acordo com o item 81, em que a dita célula hospedeira é uma célula de mamífero, como uma célula de ovário de hamster chinês.
[00414] 83. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo como definido em qualquer um dos itens 1 a 77 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00415] 84. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1 a 77 ou composição farmacêutica de acordo com o item 83 para uso como medicamento.
[00416] 85. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1 a 80 ou composição farmacêutica de acordo com o item 70 para uso no tratamento de câncer.
[00417] 86. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1 a 77 ou composição farmacêutica de acordo com o item 70 para uso no tratamento de um câncer distinguido pela presença de tumores sólidos.
[00418] 87. O anticorpo de acordo com qualquer um dos itens 1 a 78 ou composição farmacêutica de acordo com o item 70 para uso no tratamento de um câncer selecionado do grupo que consiste em: melanoma, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de cabeça e pescoço.
[00419] 88. Um método para tratar uma doença que compreende administrar um anticorpo como definido em qualquer um dos itens 1 a 75 ou a composição farmacêutica como definida no item 83 a um indivíduo em
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133/163 necessidade do mesmo.
[00420] 89. Uso de um anticorpo como definido em qualquer um dos itens 1 a 77 para a fabricação de um medicamento, como um medicamento para tratamento de câncer, por exemplo, câncer distinguido pela presença de tumores sólidos ou um câncer selecionado do grupo que consiste em: melanoma, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de cabeça e pescoço.
[00421] 90. O método ou uso de acordo com qualquer um dos itens 83 a 89, em que o método ou uso compreende a combinação com um ou mais agente terapêutico adicional, como um agente quimioterápico.
[00422] 91. Um método para produzir um anticorpo como definido em qualquer um dos itens 1 a 77, compreendendo as etapas de:
a) cultivar uma célula hospedeira produzindo um primeiro anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definida em qualquer um dos itens 1 a 13 e purificar o dito primeiro anticorpo da cultura;
b) cultivar uma célula hospedeira produzindo um segundo anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um epítopo diferente de PD-L1 ou um antígeno diferente, por exemplo, uma região de ligação ao CD3e humano como definida em qualquer um dos itens 14 a 19 e purificar o dito segundo anticorpo da cultura;
c) incubar o dito primeiro anticorpo em conjunto com o dito segundo anticorpo sob condições de redução suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sofram isomerização da ligação dissulfeto, e
d) obter o dito anticorpo biespecífico.
[00423] 92. Um anticorpo anti-idiotípico que se liga à região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definida em qualquer um dos itens 1 a 77.
[00424] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes
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134/163 exemplos que não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Geração de anticorpos PD-L1
Imunização de animais OmniRat e geração de hibridoma [00425] A imunização e geração de hibridoma foram realizadas na Aldevron GmbH (Freiburg, Alemanha). Um cDNA que codifica o aminoácido 19-238 da PD-L1 humana foi clonado nos plasmídeos de expressão proprietários da Aldevron. Grupos de animais OmniRat (ratos transgênicos que expressam um repertório diversificado de anticorpos com idiótipos totalmente humanos; Ligand Pharmaceuticals Inc., San Diego, EUA) foram imunizados por aplicação intradérmica de partículas de ouro revestidas de DNA usando um dispositivo portátil para bombardeio de partículas (“biolística”). A expressão da superfície celular em células HEK transfectadas transitoriamente foi confirmada com um anticorpo anti-PD-Ll baseado em MPDL3280A da Genentech. As amostras de soro foram coletadas após uma série de imunizações e testadas em citometria de fluxo em células HEK transfectadas transitoriamente com os plasmídeos de expressão mencionados acima. As células produtoras de anticorpos foram isoladas e fundidas com células de mieloma de camundongo (Ag8) de acordo com procedimentos padrão. Os hibridomas que produzem anticorpos específicos para PD-L1 foram identificados por triagem no mesmo ensaio descrito acima. Grânulos de células de células de hibridomas positivos foram preparados usando um agente de proteção de RNA (RNAlater, ThermoFisher Scientific, cat. n° AM7020) e posteriormente processados para sequenciamento dos domínios variáveis dos anticorpos.
Análise de sequência dos domínios variáveis do anticorpo PD-L1 e clonagem em vetores de expressão [00426] O RNA total foi preparado a partir de 0,2 a 5x106 células de
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135/163 hibridoma e o DNA complementar 5’-RACE (cDNA) foi preparado a partir do RNA total, usando o kit de amplificação SMART RACE cDNA (Clontech), de acordo com as instruções do fabricante. As regiões de codificação de VH e VL foram amplificadas por PCR e clonadas diretamente, na matriz, nos vetores de expressão pOMTGlf-FEAR-LIC (IgGl humana) e pEFC33D-Kappa (Kappa humano) ou pOMTL-LIC (Lambda humano), por clonagem independente de ligação (Aslanidis, C. and P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990; 18(20): 6069-74). Nesses plasmídeos, as sequências de anticorpos são expressas usando um promotor de CMV. Para cada anticorpo, 8 clones de VL e 8 clones de VH foram sequenciados. As sequências CDR foram definidas de acordo com as definições IMGT [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999; Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)]. Os clones com uma Matriz de Leitura Aberta (ORF) correta foram selecionados para estudo e expressão adicionais. Os produtos LEE PCR de todas as combinações de cadeias pesadas e cadeias leves que foram encontrados por cultura de hibridoma foram coexpressos transitoriamente nas células Expi293F usando ExpiFectamine. Por hibridoma, o par HC/LC que mostrou a melhor ligação em uma tela de dose-resposta homogênea foi selecionado como candidato principal.
[00427] Três anticorpos PD-L1, numerados 338, 511 e 547, respectivamente, foram selecionados para posterior experimentação. Suas sequências de região variável são mostradas na Listagem de Sequências aqui. [00428] Para o anticorpo IgGl-PDLl-511-FEAR, uma variante com mutação pontual nos domínios variáveis foi gerada para remover um resíduo de cisteína que potencialmente podería gerar pontes de dissulfeto indesejadas: IgGl-PDLl-511-FEAR-LC33S. Esse mutante foi gerado por síntese genética (Geneart).
LEE PCR [00429] Os elementos de expressão linear (LEE) foram produzidos
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136/163 amplificando o fragmento contendo o promotor de CMV, as regiões codificadoras de HC ou LC e o sinal poli A contendo elementos dos plasmídeos de expressão. Para isso, as regiões foram amplificadas usando a polimerase de DNA Accuprime Taq (Life Technologies) e os iniciadores CMVPf(BsaI)2 e TkpA(BsaI)r„ realizando 35 ciclos de 45 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C e 2 minutos (LC) ou 3 minutos (HC) a 68°C, usando material de minipreparação de plasmídeo diluído 50x, como um molde de DNA.
Expressão transitória de fragmentos de LEE em células Expi293F [00430] Para expressão de LEE de Abs, 1,11 μΐ da mistura de reação de HC LEE PCR e 1,11 μΐ da mistura de reação de LC PCR foram misturados e transfectados em células Expi293F em um volume total de 125 μΐ usando ExpiFectamin 293 como reagente de transfecção, de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific, EUA), usando placas de 96 poços como recipiente.
Expressão de anticorpos [00431] Os anticorpos foram expressos como IgGl, Kappa (para 338) ou IgGl, Lambda (para 511 e 547). As misturas de DNA plasmídico que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos foram expressas transitoriamente usando a plataforma de expressão Expi293F (Thermo Fisher Scientific, EUA) essencialmente como descrito pelo fabricante.
Ensaio de ligação homogêneo [00432] Os anticorpos foram testados quanto à ligação em uma tela de dose-resposta homogênea usando células CHO transfectadas com PDL1, PDLlmm ou PDLIMf (ver também Exemplo 2). As células CHO não transfectadas foram usadas como controle negativo.
[00433] As células (2,5 χ 105 células/ml) foram misturadas com IgG anti-humano Alexa 647 de cabra, específico do fragmento Fcy (0,2 pg/ml; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 109-605-098). Diluições em série de
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137/163 anticorpos de teste e controle (intervalo de 0,001 a 3 qg/mL em etapas de diluição de 2 vezes) foram preparadas e 2 ql de diluição de anticorpo foram adicionados a 5 ql da mistura célula/conjugado em placas de 1536 poços (Greiner, 789866). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 9 horas, e após isso a intensidade da fluorescência foi determinada usando um citômetro de varredura a laser ImageXpress Velos (Molecular Devices). Purificação de anticorpos [00434] O sobrenadante da cultura foi filtrado sobre filtros sem saída de 0,2 qm, carregado em colunas MabSelect SuRe de 5 mL (GE Healthcare) e eluído com citrato de sódio-NaOH 0,1 M, pH 3. O eluato foi imediatamente neutralizado com Tris-HCI 2M, pH 9 e dialisado durante a noite para Na2HPO4 8,7 mM, NaH2PO4 1,8 mM, NaCl 140,3 mM, pH 7,4 (B.Braun ou GE Healthcare). Alternativamente, após a purificação, o eluato foi carregado em uma coluna de dessalinização HiPrep e o anticorpo foi trocado em tampão de Na2HPO4 8,7 mM, NaH2PO4 1,8 mM, NaCl 140,3 mM, pH 7,4 (B.Braun ou GE Healthcare). Após diálise ou troca de tampão, as amostras foram esterilizadas por filtração por filtros de 0,2 qm sem saída. A pureza foi determinada por CE-SDS usando um LabChip GXII (Caliper Life Sciences, MA) e a concentração de IgG foi medida usando o espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 (Isogen Life Science, Maarssen, Holanda). Os anticorpos purificados foram armazenados a 4°C.
Exemplo 2: Geração de material de triagem
Construções de expressão para PD-L1 [00435] Foram geradas as seguintes construções otimizadas por códon para expressão de PD-L1 de comprimento total: PD-L1 humana (Homo sapiens) (n° de acesso no banco de genes NP_054862), PD-L1 de macaco cinomolgo (Macaca fascicularis) (n° de acesso no banco de genes XP_005581836), PD-L1 de camundongo (Mus musculus) (n° de acesso no banco de genes NP_068693).
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138/163 [00436] Além disso, foi gerada a seguinte construção otimizada por códon para o ECD PD-L1: o domínio extracelular (ECD) da PD-L1 humana (aa 1-238) com um marcador His e marcador C no terminal C (PDLoneECDHisCtag).
[00437] As construções continham locais de restrição adequados para clonagem e uma sequência ideal de Kozak (GCCGCCACC) [Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208]. As construções foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pMA (Geneart).
Construção de expressão para PD-L2 [00438] De modo similar, foi gerada a seguinte construção otimizada por códon para expressão de PD-L2 humana completa: PD-L2 humana (Homo sapiens) (n° de acesso no banco de genes NP_079515)
Expressão em células CHQ-S [00439] As células CHO-S foram transfectadas transitoriamente com o vetor pMA contendo a sequência de codificação para a PD-L1 humana completa, de macaco cinomolgo completa e de camundongo completa, respectivamente.
Purificação de PD-L1 marcada com His [00440] PDLoneECDHisCtag foi expresso em células HEK-293F. O marcador His permite a purificação com cromatografia de afinidade em metal imobilizado. Nesse processo, um quelante fixado na resina cromatográfica é carregado com cátions Co2+. Os sobrenadantes contendo proteínas marcadas com His foram incubados com a resina em modo descontínuo (isto é, solução). A proteína marcada com His se liga fortemente às esferas de resina, enquanto outras proteínas presentes no sobrenadante da cultura não se ligam ou se ligam fracamente em comparação com as proteínas marcadas com His. Após a incubação, as esferas são recuperadas do sobrenadante e acondicionadas em uma coluna. A coluna é lavada para remover proteínas fracamente ligadas. As proteínas marcadas com His fortemente ligadas são
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139/163 então eluídas com um tampão contendo imidazol, que compete com a ligação de His a Co2+. O eluente é removido da proteína por troca de tampão em uma coluna de dessalinização.
Exemplo 3: Anticorpo CD3 humanizado para a geração de anticorpos biespecíficos CD3xPDLl [00441] A geração do anticorpo humanizado IgGl-huCD3-HlLl é descrita no Exemplo 1 do documento W02015001085. O anticorpo huCD3H1L1-FEAL é uma variante deste com as seguintes substituições: L234F, L235E, D265A e F405L, como descrito aqui acima.
Exemplo 4: Geração de anticorpos biespecíficos por troca de braço Fab induzida por 2-MEA [00442] Os anticorpos IgGl biespecíficos foram gerados por troca de braço Fab sob condições de redução controladas. A base para esse método é o uso de domínios CH3 complementares, que promovem a formação de heterodímeros sob condições específicas de ensaio, conforme descrito em WO2011/131746. As mutações F405L e K409R (numeração da UE) foram introduzidas nos anticorpos relevantes para criar pares de anticorpos com domínios CH3 complementares.
[00443] Para gerar anticorpos biespecíficos, os dois anticorpos complementares parentais, cada anticorpo em uma concentração final de 0,5 mg/mL, foram incubados com 2-mercaptoetilamina-HCl 75 mM (2-MEA), em um volume total de 100 pL de TE a 31 °C por 5 horas. A reação de redução foi interrompida removendo o agente redutor 2-MEA usando colunas rotativas (filtros centrífugos Microcon, 30k, Millipore) de acordo com o protocolo do fabricante.
[00444] Os seguintes anticorpos foram usados nos exemplos:
Anticorpos CD3 [00445] IgGl-huCD3-HlLl-FEAL (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:29, respectivamente)
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140/163 bsIgGl-huCD3-Hl LI-FEALxbl2-FEAR is a bispecific antibody using as the second arm the antibody bl2 which is a gpl20 specific antibody (Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23).
Anticorpos PDL1 e anticorpos biespecíficos CD3xPDLl [00446] IgGl-338-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:5, respectivamente)
IgGl-338-F405L bsIgGl- huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR bsIgG 1 -b 12-FEALx3 3 8-FEAR
IgGl-511-LC33S-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 15, respectivamente)
IgGl-511-F405L-LC33S bsIgGl- huCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR bsIgG l-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR
IgGl-547-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO:22, respectivamente)
IgGl-547-F405L bsIgGl- huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR bsIgG 1 -b 12-FEALx547-FEAR
IgGl-321-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:36, respectivamente)
IgGl-421-LC91S-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:50, respectivamente)
IgGl-476-N101Q-LC33S-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:57, respectivamente)
IgG1-625-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO: 106 e SEQ ID NO: 110, respectivamente)
IgGl-632-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:67 e SEQ ID NO:71, respectivamente)
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141/163
IgGl-516-FEAR (com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:60 e SEQ ID NO:64, respectivamente)
IgGl-MPDL3280A-FEAR (com base no anticorpo PDL1
MPDL3280A da Genentech; com as sequências VH e VL estabelecidas nas
SEQ ID NO:74 e SEQ ID NO:78, respectivamente)
IgGl-MPDL3280A-K409R
IgGl-MEDI4736-FEAR (com base no anticorpo PDL1 MEDI4736 da Medlmmune; com as sequências VH e VL estabelecidas nas SEQ ID NO:81 e SEQ ID NO:85, respectivamente)
IgGl-MEDI4736-F405L
Exemplo 5: Ligação de anticorpos PD-L1 ou anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll ou bl2xPD-Ll a células tumorais [00447] Ligação de anticorpos PD-L1 e anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll e bl2xPD-Ll às linhagens celulares tumorais humanas SKMES-1 (carcinoma de células escamosas do pulmão; ATCC; Cat. n° HTB-58) MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama; ATCC; Cat. n° HTB-26), PC-3 (adenocarcinoma da próstata; ATCC; Cat. n° CRL-1435) e HELA (adenocarcinoma do colo do útero; ATCC; Cat. n° CCL-2) foram analisados por citometria de fluxo.
[00448] As células (3-5 x 104 células/poço) foram incubadas em placas de fundo redondo de 96 poços de poliestireno (Greiner bio-one, cat. n° 650101) com diluições seriadas de anticorpos (intervalo de 0,0001 a 10 pg/mL em etapas de diluição de 5 vezes) em 50 pL de PBS/BSA a 0,1%/azida a 0,02% (tampão de coloração) a 4°C por 30 min.
[00449] Após lavagem duas vezes em tampão de coloração, as células foram incubadas em 50 pL de anticorpo secundário a 4°C por 30 min. Como anticorpo secundário, IgG F(ab’)2 anti-humano de cabra conjugado com RFicoeritrina (PE) (Cat. n° 109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA), diluído 1:500 em tampão de coloração,
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142/163 foi usado para todos os experimentos. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em tampão de coloração, ressuspensas em 20 pL de tampão de coloração e analisadas em um aparelho de triagem iQue (Intellicyt Corporation, EUA). As curvas de ligação foram analisadas por regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando o software GraphPad Prism V75.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
[00450] A citometria de fluxo quantitativa (QIFIKIT®, Dako; cat. n° K0078) foi realizada como descrita (Poncelet e Carayon, 1985, J. Immunol. Meth. 85: 65-74), quantificar a expressão alvo na membrana plasmática das células MDA-MB-231, PC-3 e HELA e determinar o número de moléculas de PDL1 ligadas. Foi determinado que as linhagens celulares têm a seguinte densidade antigênica de PD-L1 (ABC, capacidade de ligação ao anticorpo):
• SK-MES-1: aprox. 30.000 ABC/célula • MDA-MB-231: aprox. 21.000 ABC/célula • PC-3: aprox. 6.000 ABC/célula • células HELA: aprox. 2.000 ABC/célula.
Ligação a células MDA-MB-231 [00451] A Figura 1 mostra que bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338FEAR (A), bsIgGl-bl2-FEALx338-FEAR (D), bs!gGl-huCD3-HlLlFEALx547-FEAR (B) e bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR (E) mostraram ligação dependente da dose às células MDA-MB-231, com maior ligação máxima do que os anticorpos monoespecíficos bivalentes PD-L1 IgGl-338FEAR e IgGl-547-FEAR. A ligação máxima de bs!gGl-huCD3-HlLlFEALx511-LC33S-FEAR (C) e bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR (F) foi menor que a do anticorpo PD-L1 monoespecífico bivalente IgGl-511LC33S-FEAR.
Ligação a células PC-3 [00452] A Figura 2 mostra que bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338FEAR (A), bsIgGl-bl2-FEALx338-FEAR (D), bsIgGl-huCD3-H!LlPetição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 149/222
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FEALx547-FEAR (B) e bs!gGl-bl2-FEALx547-FEAR (E) mostraram ligação dependente da dose às células PC3. A ligação máxima de bsIgGlhuCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR (C) e bsIgGl-bl2-FEALx511LC33S-FEAR (F) foi menor que a do anticorpo PD-L1 monoespecífico bivalente IgGl-511-LC33S-FEAR.
Ligação a células HELA-3 [00453] A Figura 3 mostra que bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338FEAR (A) e bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR (B) mostraram ligação dependente da dose às células HELA. A ligação máxima de anticorpos monoespecíficos bivalentes PD-L1 IgGl-338-FEAR e IgGl-547-FEAR não pôde ser determinada na faixa de concentração usada. (C) bs!gGl-huCD3HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR não se ligaram às células HELA.
Ligação a células SK-MES-1 [00454] A Figura 4 mostra que bsIgGl-bl2-FEALx338-FEAR (A), e bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR (B) mostraram ligação dependente da dose às células SK-MES-1, com maior ligação máxima do que os anticorpos monoespecíficos bivalentes PD-L1 IgGl-338-FEAR e IgGl-547-FEAR. A ligação máxima de bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR (C) foi menor que a do anticorpo PD-L1 monoespecífico bivalente IgGl-511-LC33S-FEAR.
Exemplo 6: Ligação à PD-L2 humana [00455] Para mostrar ligação específica à PD-L1 e não à PD-L2 humana, a ligação de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR e IgGl-338FEAR, bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR e IgGl-547-FEAR e de bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR a células CHO que expressam PD-L2 humana foi determinada por citometria de fluxo usando um método como descrito acima. Um anticorpo específico PDL2 conjugado com PE (Mylteni, clone MIH18; cat. n° 130-098-651) foi usado como controle positivo. Nenhum dos anticorpos testados se ligou às células
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CH0-PD-L2.
Exemplo 7: Ligação de anticorpos PD-L1 ou anticorpos biespecíficos
CD3xPD-Ll ou bl2xPD-Ll a PD-L1 de macacos cinomolgos [00456] A ligação a células CHO que expressam a PD-L1 de macacos cinomolgos foi determinada por citometria de fluxo, usando um método como descrito acima. A Figura 5 mostra que bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338FEAR (A), bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR (B), bs!gGl-huCD3HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR (C), bsIgGl-bl2-FEALx338-FEAR (D), bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR (E), e bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR (F) mostraram ligação dependente da dose a células CHO que expressam PDL1 de macacos cinomolgos, com maior ligação máxima do que anticorpos monoespecíficos PD-L1 bivalentes IgGl-338-FEAR, IgGl-547-FEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR.
Exemplo 8: Determinação de afinidade de PD-L1 humana e de macacos cinomolgos usando interferometria de biocamada [00457] Em um primeiro conjunto de experimentos, as afinidades para a proteína PD-L1 humana expressa de forma recombinante foram determinadas usando interferometria de biocamada (BLI) em um instrumento Octet HTX (ForteBio). Os biossensores de captura de IgG Fe anti-humano (AHC) (ForteBio) foram carregados por 900 s com anticorpos (1 pg/ml). Após uma linha de base (100 s), foi determinada a associação (1000 s) e a dissociação (2000 s) do PDLoneECDHisCtag no diluente da amostra (ForteBio), usando uma faixa de concentração de 2,67 pg/ml-0,14 pg/ml (100 nM-1,56 nM) com etapas de diluição de 2 vezes. O experimento foi realizado durante agitação a 1000 rpm a 30°C. Os dados foram analisados com o Data Analysis Software v9.0.0.12 (ForteBio), usando o modelo 1:1 e um ajuste completo global com tempo de associação de 1000 s e tempo de dissociação de 200 ou 1000 s. Os traços de dados foram corrigidos por subtração de uma referência de tampão, o eixo Y foi alinhado aos últimos 10 s da linha de base
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145 / 163 e a correção entre etapas, bem como a filtragem de Savitzky-Golay, foram aplicadas. Os traços de dados com uma resposta < 0,05 nm foram excluídos da análise. Como padrão, foi usado o ajuste usando o tempo de dissociação de
1000 s. Um tempo de dissociação de 200 s foi usado para IgGl-511-FEARLC33S, com base no valor de R2 e na inspeção visual do ajuste.
[00458] A tabela 1 mostra os resultados.
Tabela 1: Afinidades de ligação de anticorpos monoespecíficos bivalentes PD-L1 para PD-L1 humana, como determinado por interferometria de biocamada.
Anticorpo Taxa de associação ka (1/Ms) Taxa de dissociação ká (1/s) Xd(M)
IgGl-338-FEAR 7,3E+05 6,4E-05 8,8E-11
IgGl-547-FEAR l,2E+06 3,6E-05 2,9E-11
IgGl-511-LC33S-FEAR l,2E+06 4,5E-03 3,8E-09
[00459] Em um segundo conjunto de experimentos (n=3), foram comparadas as afinidades dos anticorpos PD-L1 com PD-L1 humana e de macacos cinomolgos, determinadas por BLI. A configuração experimental foi a descrita acima, com exceção de • o tempo de carregamento dos biossensores de AHC com anticorpos foi de 600 s;
• a linha de base foi de 300 s;
• além da PDLoneECD-HisCtag (PD-L1 humana, peso molecular teórico de 29 kDa), a proteína PD-L1/B7-H1 de macacos cinomolgos da (Acro Biosystems, cat. n° PD1-C52H4-100, peso molecular teórico de 27,1 kDa) foi usada como antígeno;
• a faixa de concentração do antígeno foi de 0,156 -10 nM (no primeiro experimento) ou de 0,39 - 25 nM (no segundo e no terceiro experimento).
[00460] A tabela 2 mostra os resultados (média de três experimentos).
As afinidades de ligação de IgGl-338-FEAR, IgGl-547-FEAR e IgGl-511LC33S-FEAR para PD-L1 humana estavam na mesma faixa que a mostrada na Tabela 1, com desvio provável devido a variações nas condições do ensaio.
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As afinidades de ligação desses anticorpos à PD-L1 de macacos cinomolgos foram muito similares às da PD-L1 humana. As afinidades de ligação de IgGl-MEDI4738-FEAR e IgGl-MPDL3280A-FEAR também foram determinadas. IgGl-MEDI4738-FEAR mostrou afinidade de ligação similar para PD-L1 humana e de macacos cinomolgos. IgGl-MEDI4738-FEAR mostrou uma grande diferença na afinidade de ligação, com uma média de afinidade 19,7 menor (Xd mais alta) para PD-L1 de macacos cinomolgos do que para PD-L1 humana.
Tabela 2: Afinidades de ligação (média de três experimentos independentes) de anticorpos monoespecíficos bivalentes PD-L1 para PD-L1 humana e de macacos cinomolgos, como determinado por interferometria de biocamada.
Anticorpo Espécie PD-L1 Taxa de associação ka (1/Ms) Taxa de dissociação kí (1/s) Xd(M) Diferença de vezes de Ki>
IgGl-338-FEAR Humano 8,0E+05 2,5E-04 3.1E-10 2,3
Macaco cinomolgo 3,9E+05 2,8E-04 7,3E-10
IgGl-547-FEAR Humano 9,7E+05 1,1E-O4 l,2E-10 2,3
Macaco cinomolgo 4,4E+05 l,2E-04 2,7E-10
IgGl-511- LC33S-FEAR Humano 9,6+05 4,8E-03 5.1E-09 2,3
Macaco cinomolgo 4,5+E05 5,2E-03 l,2E-08
IgGl-MEDI4738FEAR Humano 8,8E+05 3,3E-04 3.7E-10 2,3
Macaco cinomolgo 4,3E+05 3,8E-04 8.6E-10
IgGl- MPDL3280A- FEAR Humano 7,2E+05 3,3E-04 4,6E-10 19,7
Macaco cinomolgo 3,6E+05 3,0E-03 9,0E-09
Exemplo 9: Ensaio de bloqueio cruzado em sanduíche clássico de PD-L1 [00461] O teste de bloqueio cruzado de anticorpos foi realizado usando interferometria de biocamada (BLI) em um instrumento Octet HTX (ForteBio). Os anticorpos (20 pg/ml em tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 6,0 (ForteBio)) foram imobilizados em biossensores reativos à amina de 2a geração (AR2G) (ForteBio) de acordo com as instruções do fabricante. Após uma linha de base (50 s) no Diluente de Amostra (ForteBio), biossensores contendo anticorpos imobilizados foram carregados por 500 s com
PDLoneECDHisCtag (100 nM ou 2,7 pg/ml), após o qual a resposta de
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147 / 163 associação de um segundo anticorpo (10 pg/ml) foi monitorada por 500 s. Os biossensores foram regenerados usando exposições alternadas 3 vezes de 5 s à glicina 10 mM pH 2,5 e diluente de amostra. O experimento foi repetido com um novo conjunto de segundos anticorpos a partir da etapa da linha de base. Cada biossensor foi usado 6 vezes. O experimento foi realizado a 30°C usando uma velocidade de agitação de 1000 rpm. Os dados foram analisados usando o Data Analysis Software v9.0.0.12 (ForteBio). O eixo Y foi alinhado à etapa de associação e a filtragem Savitzky-Golay foi aplicada. A resposta média do tampão foi subtraída da resposta de associação do segundo anticorpo, a fim de corrigir a dissociação de PDLoneECDHisCtag do anticorpo imobilizado. As respostas de associação corrigidas foram plotadas em formato de matriz. Respostas >0,1 nm foram consideradas pares de anticorpos não bloqueadores (resultados indicados como números simples na tabela na Figura 6), respostas abaixo de 0,1 foram consideradas pares de anticorpos bloqueadores (resultados indicados como números em negrito na tabela na Figura 6). Alguns pares de anticorpos mostraram comportamento de deslocamento (indicado pelo asterisco (*) na tabela na Figura 6). Gráficos representativos são mostrados na figura (A) para deslocamento, (B), pares de anticorpos bloqueadores e (C) não bloqueadores.
[00462] Experimentos de bloqueio cruzado foram realizadas para os anticorpos IgGl-338-FEAR, IgGl-547-FEAR, IgGl-511-LC33S-FEAR, IgGl-321-FEAR, IgGl-421-LC91S-FEAR, IgGl-476-N101Q-LC33S-FEAR, IgGl-632-FEAR, IgGl-516-FEAR, IgGl-MPDL3280A-FEAR e IgGlMEDI4736-FEAR. Os resultados estão resumidos na figura 6.
[00463] Os dados mostram que o anticorpo IgGl-511-LC33S-FEAR define um grupo de bloqueio cruzado único, porque bloqueia IgGl-321FEAR, IgGl-338-FEAR, IgGl-476-N101Q-LC33S-FEAR, IgGl-632-FEAR, IgGl-MPDL3280A-FEAR e IgGl-MEDI4736-FEAR, mas não bloqueia a ligação de IgGl-547-FEAR, IgGl-421-LC91S-FEAR ou IgGl-516-FEAR à
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PDL1 humana.
[00464] Além disso, o anticorpo IgGl-547-FEAR define um grupo de bloqueio cruzado único, porque bloqueia IgGl-321-FEAR, IgGl-338-FEAR,
IgGl-421-LC91S-FEAR, IgGl-MPDL3280A-FEAR e IgGl-MEDI4736FEAR, mas não bloqueia a ligação de IgGl-511-LC33S-FEAR, IgGl-476N1O1Q-LC33S-FEAR, IgGl-632-FEAR, IgGl-516-FEAR à PDL1 humana.
[00465] Além disso, o anticorpo IgGl-476-N101Q-LC33S-FEAR mostrou comportamento de deslocamento em combinação com IgGl-321FEAR, IgGl-338-FEAR, IgGl-MPDL3280A-FEAR e IgGl-MEDI4736FEAR, indicando que os anticorpos IgGl-321-FEAR, IgGl-338-FEAR, IgGl-MEDI4736-FEAR e IgGl-MPDL3280A-FEAR se ligam diferentemente à PD-L1 humana em comparação com IgG 1-421-LC19SFEAR, IgGl-547-FEAR, IgGl-LC33S-FEAR, IgGl-632-FEAR e IgGl-516FEAR.
Exemplo 10: Efeito dos anticorpos PD-L1 na interação de PD-1/PD-L1 [00466] O efeito de anticorpos PD-L1 bivalentes e monovalentes na interação de PD-1 e PD-L1 foi determinado em um bioensaio de bloqueio PD1/PD-L1, desenvolvido por Promega (Madison, EUA). Este é um ensaio baseado em células bioluminescentes que consiste em duas linhagens celulares geneticamente engenheiradas: células efetoras PD-1, que são células T Jurkat que expressam PD-1 humana e um repórter de luciferase acionado por um elemento de resposta NFAT (NFAT-RE), e células PD-L1 aAPC/CHO-Kl, que são células CHO-K1 que expressam PD-L1 humana e uma proteína de superfície celular engenheirada projetada para ativar TCRs cognatos de maneira independente de antígeno. Quando os dois tipos de células são cocultivados, a interação de PD-1/PD-L1 inibe a sinalização de TCR e a luminescência mediada por NFAT-RE. A adição de um anticorpo que bloqueia a interação de PD-1/PD-L1 libera o sinal inibitório e resulta na ativação do TCR e na luminescência mediada por NFAT-RE.
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149/163 [00467] As células PD-L1 aAPC/CHO-Kl (Promega, cat. n° J109A) foram descongeladas de acordo com o protocolo do fabricante, ressuspensas em meio F12 de Ham (Promega, cat. n° J123A) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS; Promega, cat. n° J121A) e plaqueadas em placas de cultura de 96 poços com fundo piano (CulturPlate-96, Perkin Elmer, cat. n° 6005680). As placas foram incubadas durante 16 horas a 37°C, 5% de CO?. O sobrenadante foi removido e diluições seriadas de anticorpos (concentração final variando de 5 a 0,001 pg/mL; diluições de quatro vezes em RPMI 1640 [Lonza, cat. n° BE12-115F] contendo 1% de soro fetal bovino [FBS; Promega, cat n° J121A]) foram adicionadas. Foram adicionadas células efetoras PD-1 (Promega, cat. n° J115A; descongeladas de acordo com o protocolo do fabricante e ressuspensas em RPMI/1% de FBS). As placas foram incubadas durante 6 h a 37°C, 5% de CO2. Após o equilíbrio à temperatura ambiente, 40 μΐ de reagente Bio-Glo (substrato de ensaio de luciferase Bio-Glo [Promega, cat. n° G720B] reconstituído em tampão de ensaio de luciferase Bio-Glo [Promega, cat. n° G7198], de acordo com o protocolo do fabricante) foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 5 a 10 minutos e a luminescência foi medida usando um leitor EnVision Multilabel (PerkinElmer). O efeito na interação de PD1-PD-L1, em relação ao controle (sem adição de anticorpo), foi calculado da seguinte forma:
Fator de indução = RLU (induzida em segundo plano)/RLU (sem controle de anticorpos em segundo plano), RLU é unidades de luz relativa [00468] A Figura 7 mostra que os anticorpos monoespecíficos bivalentes IgGl-338-FEAR, IgGl-547-FEAR e IgGl-511-LC33S-FEAR bloquearam eficientemente a interação entre PD1 e PD-L1 de uma maneira dependente da dose. Os anticorpos monovalentes bsIgGl-bl2-FEALx338FEAR e bsIgGl-bl2-FEALx547-FEAR também bloquearam eficientemente a
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150/163 interação de PD1-PD-L1. O bsIgGl-bl2-FEALx511-LC33S-FEAR também bloqueou essa interação, embora com menos eficiência.
Exemplo 11: Citotoxicidade in vitro de anticorpos biespecíficos CD3xPDL1 [00469] Os anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll foram testados em um ensaio de citotoxicidade in vitro usando linhagens celulares tumorais como células alvo e células T purificadas ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) como células efetoras. As células T do creme leucocitário de doadores (Sanquin, Amsterdã, Holanda) foram isoladas usando o coquetel de enriquecimento de células T humanas RosetteSep (Cat: 15021C.1, Stemcell Technologies, França) de acordo com as instruções do fabricante. As PBMCs foram isoladas de 40 mL de creme leucocitário (Sanquin) usando um gradiente de Ficoll (Lonza; meio de separação de linfócitos, cat. n° 17-829E) de acordo com as instruções do fabricante.
[00470] As células MDA-MB-231 (16.000 células/poço), células PC-3 (16.000 células/poço) ou células HELA (10.000 células/poço) foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano (cat: 655180, Greiner-bioone, Holanda) e cultivadas durante a noite a 37°C. As células T foram adicionadas às células tumorais a uma razão E:T = 4:1 para células MDAMB-231 ou PC-3 e E:T = 8:1 para células HELA. PBMC foram adicionadas às células tumorais a uma razão E:T = 10:1. Foram adicionadas diluições seriadas de anticorpos (concentração final variando de 1000 a 0,06 ng/mL; diluições de 4 vezes) e as placas foram incubadas por 48 horas a 37°C. Em seguida, os sobrenadantes foram descartados e as células aderidas foram lavadas duas vezes com PBS. 150 pL de 10% de azul de alamar (cat: DALI 100, Life Technologies, Holanda), preparados em RPMI-1640 (cat: BE12-115F, Lonza, Suíça), contendo 10% de soro bovino doador com ferro (cat: 10371-029, Life Technologies, Holanda), foram adicionados aos poços e incubados por 5h a 37°C. A absorvância foi medida com o leitor de placas
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Envision (PerkinElmer, EUA). As células tratadas com estaurosporina (cat:
S6942, Sigma-Aldrich, US) foram definidas como 0% de viabilidade e as células não tratadas foram definidas como 100% de viabilidade. A “porcentagem de células viáveis” foi calculada da seguinte forma:
% de células viáveis = (amostra de absorvência - células alvo tratadas com estaurosporina por absorvância)/(células alvo não tratadas por absorvência células alvo tratadas com estaurosporina por absorvância) x 100.
Citotoxicidade de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll em células MDAMB-231 [00471] A Figura 8 mostra que bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338FEAR, bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR e bsIgGl-huCD3-HlLlFEALx511-LC33S-FEAR induziram a citotoxicidade dependente de concentração nas células MDA-MB-231, expressando níveis relativamente altos de PD-L1, tanto ao usar células T purificadas (A) quanto PBMCs (B) como células efetoras.
Citotoxicidade de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll em células PC-3 [00472] A Figura 9 mostra que bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338FEAR, bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR e bsIgGl-huCD3-H!LlFEALx511-LC33S-FEAR induziram a citotoxicidade dependente da concentração em células PC-3, tanto ao usar células T purificadas (A) quanto PBMCs (B) como células efetoras. O bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511LC33S-FEAR foi menos eficiente na indução de citotoxicidade em células PC-3, expressando níveis moderados de PD-L1.
Citotoxicidade de anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll em células HELA [00473] A Figura 10 mostra que bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547FEAR foi capaz de induzir citotoxicidade em células HELA, expressando baixos níveis de PD-L1, ao usar células T como células efetoras, e para um doador também ao usar PBMCs. O bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx338-FEAR foi menos capaz de induzir citotoxicidade nas células HELA, e o bsIgGlPetição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 158/222
152/163 huCD3-HlLl-FEALx511-LC33S-FEAR não induziu citotoxicidade nas células HELA.
Exemplo 12: Ativação e proliferação de células T por anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll [00474] Os anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll foram testados em um ensaio in vitro para medir a ativação e proliferação de células T, usando células MDA-MB-231 como células alvo e células T purificadas como células efetoras. IgGl-bl2 (com uma região Fc capaz de interagir com os receptores Fcy e Clq) foi usada como controle negativo. As PBMCs foram isoladas de 40 mL de creme leucocitário (Sanquin) usando um gradiente de Ficoll (Lonza; meio de separação de linfócitos, cat. n° 17-829E) de acordo com as instruções do fabricante. A partir das PBMCs purificadas, as células T foram isoladas usando o coquetel de enriquecimento de células T humanas RosetteSep (Stemcell Technologies, França; cat. n° 15021C.1) de acordo com as instruções do fabricante.
[00475] As células MDA-MB-231 foram marcadas com CellTrace CFSE 0,07 μΜ (ThermoFisher Scientific, cat. n° C34554) de acordo com as instruções do fabricante e semeadas (5.000 células/poço) em placas de 96 poços de fundo piano (Greiner-bio-one, Holanda, cat. n° 655180) e aderiram aos poços durante 4 horas a 37°C. As células T foram adicionadas às células tumorais na razão E:T = 8:1, então 40.000 células/poço. Foram adicionadas diluições seriadas de anticorpos (concentração final variando de 10000 a 1,5 ng/mL; diluições de 3 vezes) e as placas foram incubadas por 4 dias a 37°C.
[00476] Em seguida, os sobrenadantes (contendo células não aderentes) foram transferidos para uma placa com fundo em U de 96 poços (Greiner-bio-one), as células restantes foram colhidas através do tratamento com tripsina-EDTA (Lonza) e combinadas com o sobrenadante celular na placa com fundo em U de 96 poços. As células foram lavadas com PBS (B. Braun) e coradas por 30 minutos a 4°C com um coquetel de anticorpos: 1:200
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 159/222
153/163 anti-huCD4-azul pacífico (Biolegend, cat. n° 300521), 1:50 anti-huCD8-FITC (BD, cat. n° 345772), 1:100 anti-huCD25-PE-Cy7 (eBiosciences, cat. n° 250259-42) e anti-huCD69-PE (BD, cat. n° 555531). As células foram lavadas uma vez com tampão FACS gelado e ressuspensas em 80 pL de tampão FACS suplementado com topro-3-iodo diluído 1:6000 (ThermoFisher Scientific, cat. n° T3605).
[00477] A proliferação de células T foi determinada contando o número total de células CD4pos e CD8pos T em um volume fixo de 50 pL em um citômetro de fluxo. A ativação de células T foi medida contando o número total de células Cd69pospos (marcador de ativação de células T precoce) e Cd25pospos (ativação de células T tardia) em um volume fixo de 50 pL em um citômetro de fluxo. A Figura 11 mostra que todos os anticorpos biespecíficos de CD3xPD-Ll induziram proliferação de células T (indicada pelo aumento no número total de células T). No entanto, foram observadas diferenças na quantidade de células T ativadas e totais entre os diferentes anticorpos biespecíficos CD3xPD-Ll com bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx511-LC33SFEAR sendo o menos eficaz e bsIgGl-huCD3-HlLl-FEALx547-FEAR sendo o mais eficaz.
Exemplo 13. Determinação da contribuição de resíduos de aminoácidos PD-L1 na ligação de anticorpos usando a varredura de alanina.
Projeto da biblioteca [00478] Uma biblioteca de alanina de resíduo único PD-L1 (Uniprot Q9NZQ7) foi sintetizada (Geneart) na qual todos os resíduos de aminoácidos no domínio extracelular da PD-L1 humana foram mutados individualmente para alaninas, exceto para posições que já continham alaninas ou cisteínas. As cisteínas não sofreram mutações para minimizar a chance de ruptura estrutural do antígeno. A biblioteca foi clonada no vetor de expressão pMAC contendo um cassete de expressão CMV/TK-poliA, um gene de resistência a Amp e uma origem de replicação de pBR322.
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 160/222
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Produção e triagem da biblioteca [00479] Os mutantes de alanina e PD-L1 do tipo selvagem foram expressos individualmente em células FreeStyle HEK293 de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Scientific). Um dia após a transfecção, as células foram colhidas. Aproximadamente 100.000 células foram incubadas com 20 μΕ de anticorpo conjugado Alexa488 de interesse no tampão FACS (Tabela 3). As células foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, foram adicionados 150 pL de tampão FACS e as células foram lavadas por centrifugação. As células foram suspensas em 20 pL de tampão FACS fresco (PBS [sem Ca++, Mg++ e vermelho de fenol]/l% de fração V de BSA/0,02% de NaNs) e armazenadas a 4°C até análise por citometria de fluxo usando um aparelho de triagem iQue.
[00480] Todo o experimento foi realizado 4 vezes.
Anticorpo Concentração de estoque Conjugado
BsGl-bl2-FEALx547-FEAR-A488 3 pg/mL Alexa488
BsGl-bl2-FEALx338-FEAR-A488
IgGl-511-FEAR-LC33S-A488
BsG 1 -b 12-FEALx MPDL3280A-FEAR-A488
IgGl -MEDI4736-FEAR
IgG 1-625-FEAR-A488 (usado como controle)
Tabela 3: Anticorpos usados na determinação da contribuição de resíduos de aminoácidos PD-L1 na ligação de anticorpos usando a varredura de alanina. Análise de dados [00481] Para cada amostra, a ligação média do anticorpo por célula foi determinada como a média geométrica da intensidade da fluorescência (gMFI) para a população de células não bloqueadas. A gMFI é influenciada pela afinidade do anticorpo para o mutante de PD-L1 e pelo nível de expressão do mutante de PD-L1 por célula. Como mutações específicas de alanina podem afetar o nível de expressão da superfície do mutante de PD-L1, e para corrigir diferenças de expressão para cada mutante de PD-L1 em geral, os dados foram normalizados contra a intensidade de ligação de um anticorpo de controle específico de PD-L1 sem bloqueio cruzado (IgG1-625-FEARPetição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 161/222
155/163
A488; compreendendo a região variável da cadeia pesada (VH) estabelecida na SEQ ID NO: 106 e a região variável da cadeia leve (VL) estabelecida na
SEQ ID NO: 110), usando a seguinte equação:
normalizada = centred na qual ‘posição aa’ refere-se a um mutante ala específico de PD-L1 ou PD-L1 de tipo selvagem (wt).
[00482] Para expressar perda ou ganho de ligação dos anticorpos em uma escala linear de variação de expressão gênica, foi usado o seguinte cálculo:
Faríaçâo de expressão gênica = .Wijny.tjj.yjte ala ?wnmíízads
X norma iísads / [00483] O ganho de ligação na maioria dos casos será causado pela perda de ligação do anticorpo de referência a mutantes ala específicos.
[00484] Nesses cálculos, as posições de aminoácidos para as quais, ao substituir o aminoácido por alanina, não há perda ou ganho de ligação por um anticorpo específico, resultarão em Ό’, o ganho de ligação resultará em ‘> 0’ e a perda de ligação resultará em ‘<0’. Para corrigir a variação da amostra, apenas resíduos de aminoácidos PD-L1 nos quais a variação de expressão gênica na ligação foi menor que a variação de expressão gênica média - 1,5 x DP (indicado pela linha pontilhada na Figura 12), onde DP é o desvio padrão das variações de expressão gênica calculadas de quatro experimentos independentes para um anticorpo de teste específico, foram considerados ‘mutantes de perda de ligação’.
[00485] Caso a gMFI do anticorpo de controle para um determinado mutante de PD-L1 fosse menor que a gMFI média - 2,5 x DP da gMFIControi Ab média, os dados eram excluídos da análise (quanto aos mutantes de PD-L1, presumiu-se que os níveis de expressão não eram suficientes).
[00486] A Figura 12 mostra a variação de expressão gênica na ligação dos anticorpos PD-L1 a variantes de PD-L1 com mutações ala nas posições
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156/163 a 131 (de acordo com a SEQ ID No 94). Os resultados indicam que a ligação do anticorpo 338 é pelo menos dependente dos aa
RI 13, Y123 e R125 da PD-L1 humana, a ligação do anticorpo 511 é pelo menos dependente dos aa F19, F42, E45, K46, L94 e 1116 da PD-L1 humana, os aminoácidos E45, K46 e L94 estando diretamente envolvidos na ligação do anticorpo e F19, F42 e 1116 estando indiretamente envolvidos na ligação do anticorpo devido a suas cadeias laterais enterradas, a ligação do anticorpo 547 é pelo menos dependente dos aa E58 e RI 13 da PD-L1 humana, a ligação do anticorpo MEDI4736 é pelo menos dependente dos aa RI 13 e RI25 da PD-L1 humana, e a ligação do anticorpo MPDL3280A é pelo menos dependente dos aa RI25 e 1126 da PD-L1 humana, onde 1126 devido à sua cadeia lateral enterrada pode estar indiretamente envolvido na ligação do anticorpo.
Exemplo 14: Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC)
ADCC determinada em um ensaio de liberação de 51Cr [00487] As células MDA-MB-231 (ATCC, cat n° HTB-26) foram colhidas (para obter 7xl06 células), lavadas (duas vezes em PBS, 1500 rpm, 5 min) e coletadas em 2 mL de meio RPMI 1640 suplementado com soro cósmico de vitelo a 10% (CCS) (HyClone, Logan, UT, EUA)), às quais adicionou-se 200 pCi de 51Cr (Chromium-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Holanda). A mistura foi incubada por 1 hora a 37°C durante agitação. Após lavagem (duas vezes em PBS, 1500 rpm, 5 min), as células foram ressuspensas em meio RPMI 1640/10% de CCS e contadas por exclusão de azul de tripano. As células foram ajustadas para uma concentração de IxlO5 células/mL.
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157/163 [00488] Enquanto isso, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas do creme leucocitário fresco (Sanquin, Amsterdã, Holanda) usando centrifugação de densidade de Ficoll padrão de acordo com as instruções do fabricante (meio de separação de linfócitos; Lonza, Verviers, França). Após ressuspensão das células em meio RPMI 1640/10% de CCS, as células foram contadas por exclusão de azul de tripano e ajustadas para IxlO7 células/mL.
[00489] 50 pL de células alvo marcadas com 51Cr foram transferidos para poços de microtitulação e 50 pL de 30 pg/mL de anticorpo PD-L1 foram adicionados (diluídos em RPMI/10% de CCS). Como controle positivo, foi usado um anticorpo contra um alvo não relacionado expresso em células MDA-MB-231. As células foram incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente e adicionou-se 50 pL de células efetoras (PBMCs), resultando em uma razão efetor-alvo de 100:1. Para determinar a quantidade máxima de lise celular, foram adicionados 100 pL de Triton-X100 a 5% em vez de células efetoras. Foram adicionados 100 pL de RPMI 1640/10% de CCS em vez de células efetoras e anticorpo para determinar a quantidade de lise espontânea. Além disso, para determinar o nível de lise celular independente de anticorpo, foram adicionados 50 pL de células efetoras e 50 pL de meio (em vez de anticorpo). As amostras foram incubadas durante 4 h a 37°C, 5% de CO2. Para determinar a quantidade de lise das células alvo, as amostras foram centrifugadas (1200 rpm, 3 min) e 75 pL de sobrenadante foram transferidos para tubos micrônicos, após o que o 51Cr liberado foi contado usando um contador gama. A porcentagem de lise mediada por anticorpos foi calculada da seguinte forma:
(contagem por minuto |cpm| de amostra - cpm de lise independente de anticorpos)
X 100% (cpm de lise máxima - cpm de lise espontânea) [00490] A Figura 13 mostra que IgGl-547-F405L induziu -10% de lise dependente da dose de células MDA-MB-231 através de ADCC. O
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158/163 anticorpo de controle positivo induziu apenas 20% da lise máxima, indicando que a lise total nesse experimento foi bastante baixa. IgGl-511-F405L-LC33S e IgGl-338-F405L não induziram a lise de MDA-MB-231.
ADCC determinada em um bioensaio de repórter de ADCC luminescente [00491] A capacidade dos anticorpos PD-L1 de induzir a reticulação de FcyRIIIa (CD 16), como substituto do ADCC, também foi determinada usando um bioensaio de repórter de ADCC luminescente (Promega, Cat # G7018) em células MDA-MB-231, de acordo com as recomendações do fabricante. Como células efetoras, o kit contém células T humanas Jurkat que são engenheiradas para expressar estavelmente alta afinidade por FcyRIIIa (V158) e um fator nuclear de elemento de resposta a células T ativadas (NFAT) que aciona a expressão da luciferase de vagalume. Resumidamente, as células MDA-MB-231 (12.500 células/poço) foram semeadas em Culture OptiPlates (Perkin Elmer) em Tampão de ensaio de ADCC [meio RPMI-1640 [(Lonza, Cat # BE12-115F) suplementado com soro de IgG baixo a 3,5%] e incubadas por 6 horas a 37°C/5% de CO2 em um volume total de 75 pL contendo séries de concentração de anticorpos (concentrações finais de 0,5 a 250 ng/mL em diluições de 3,5 vezes) e descongeladas as células efetoras de bioensaio de ADCC. Depois de ajustar as placas por 15 minutos à temperatura ambiente (RT), foram adicionados 75 pL de Reagente de Luciferase de Ensaio Bio Glo e as placas foram incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. A produção de luciferase foi quantificada por leitura de luminescência em um leitor EnVision Multilabel (Perkin Elmer). Os níveis de fundo foram determinados a partir de poços aos quais foram adicionadas apenas células alvo e anticorpo (sem células efetoras). Como controle negativo, foram usados poços contendo apenas células alvo e efetoras (sem anticorpo).
[00492] A Figura 14 mostra que IgGl-547-F405L foi altamente eficaz na indução de ADCC como determinado no ensaio repórter. IgGlPetição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 165/222
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MEDI4736-F405L e IgGl-MPDL3280A-K409R também induziram ADCC, mas não na mesma extensão que IgGl-547-F405L. IgGl-511-F405L-LC33S e IgGl-338-F405L não induziram ADCC.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
SEQ ID NO. MARCADOR SEQUÊNCIA
1 VH-338 EVQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRFWMSWVRQAPG KGLEWVANIKQDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRGEDTAVYYCARDDNWNGHFDYWGQGTLVTVSS
2 VH-338-CDR1 GFTFSRFW
3 VH-338-CDR2 IKQDGGEK
4 VH-338-CDR3 ARDDNWNGHFDY
5 VK-338 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAP NLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ QYYGSYITFGQGTRLEIK
6 VK-338-CDR1 QSISSW
VK-338-CDR2 KAS
7 VK-338-CDR3 QQYYGSYIT
8 VH-511 QVQLVQSGSELKKPGASVMVSCKASGYTFTSYVMNWVRQAP GQGLEWMGWINSYTGNPTSAQGFTGRFVFSFDTSVNTAYLQIS SLKAEDTAVYYCARGYCTSTSCYLDYWGQGTLVTVSS
9 VH-511-CDR1 GYTFTSYV
10 VH-511-CDR2 INSYTGNP
11 VH-511-CDR3 ARGYCTSTSCYLDY
12 VL-511 SYELTQPPSVSVSPGHTARITCSGDALPKKYACWFQQKSGQAP VLVIYEDSKRPSGIPERFSGSTSGTMATLTISGAQVEDETDYYCY SADTSGTHRVFGGGTKLTVL
13 VL-511-CDR1 ALPKKY
VL-511-CD R2 EDS
14 VL-511-CD R3 YSADTSGTHRV
15 VL-511-LC33S SYELTQPPSVSVSPGHTARITCSGD ALPKKY AS WFQQKSGQ AP VLVIYEDSKRPSGIPERFSGSTSGTMATLTISGAQVEDETDYYCY SADTSGTHRVFGGGTKLTVL
16 VL-511-LC33S-CDR1 ALPKKY
VL-511-LC33S-CDR2 EDS
17 VL-511-LC33S-CDR3 YSADTSGTHRV
18 VH-547 EVQLLEPGGGLVQPGGSLRLSCEASGSTFSTYAMSWVRQAPGK GLEWVSGFSGSGGFTFYADSVRGRFTISRDSSKNTLFLQMSSLR AEDTAVYYCAIPARGYNYGSFQHWGQGTLVTVSS
19 VH-547-CDR1 GSTFSTYA
20 VH-547-CDR2 FSGSGGFT
21 VH-547-CDR3 AIPARGYNYGSFQH
22 VL-547 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAP VLVVYDDNDRPSGLPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYY CQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
23 VL-547-CDR1 NIGSKS
VL-547-CDR2 DDN
24 VL-547-CDR3 QVWDSSSDHVV
25 VH-huCD3-Hl EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
26 VH-huCD3-Hl-CDRl GFTFNTYA
27 VH-huCD3-Hl-CDR2 IRSKYNNYAT
28 VH-huCD3-Hl-CDR3 VRHGNFGNSYVSWFAY
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29 VL-huCD3-Ll QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPG QAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQADDESI YFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
30 VL-huCD3-Ll-CDRl TGAVTTSNY
VL-huCD3-Ll-CDR2 GTN
31 VL-huCD3-Ll-CDR3 ALWYSNLWV
32 VH-321 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPG KGLEWVANIKQDGNEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYVQMN SLRAEDTAVYYCARDLYYGSGTYPPFDYWGQGTLVTVSS
33 VH-321-CDR 1 GFTFSSYW
34 VH-321-CDR2 IKQDGNEK
35 VH-321-CDR3 ARDLYYGSGTYPPFDY
36 VK-321 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYLQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ QYHSSSYTFGQGTKLEIK
37 VK-321-CDR 1 QSISSW
VK-321-CDR2 KAS
38 VK-321-CDR3 QQYHSSSYT
39 VH-huCD3-Hl-T31P EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNPYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
40 VH-huCD3-Hl-T31M EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNMYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
41 VH-huCD3-Hl-Yl 14V EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYVWGQGTLVTVSS
42 VH-huCD3-Hl-Yl 14M EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAMWGQGTLVTVSS
43 VH-huCD3-Hl-Yl 16R EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFARWGQGTLVTVSS
44 VH-huCD3-Hl-Sl 10A EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVAWFAYWGQGTLVTVSS
45 VH-huCD3-Hl-H101G EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQM NNLKTEDTAMYYCVRGGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
46 VH-421 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQGPG KGLEWVSGIRWNSGSMHYADSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMN SLRAEDTALYYCARAPWYSGAWHPDYWGQGTLVTVSS
47 VH-421-CDR 1 GFTFDDYA
48 VH-421-CDR2 IRWNSGSM
49 VH-421-CDR3 ARAPWYSGAWHPDY
50 VL-421-C91S QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGTYNYVSWYQQHPG KAPKLMIYDVIKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTLSGLQAEDEAD YYCSSYAGTYTLLFGGGTKLTVL
51 VL-421-C91S-CDR1 SSDVGTYNY
VL-421-C91S-CDR2 DVI
52 VL-421-C91S-CDR3 SSYAGTYTLL
53 VH-476-N101Q EVQMLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPG KGLEWVSGIGDSGGSTYHADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKLGQSSGWYDHYYYYGMDVWGQGTTVTV SS
54 VH-476-N101Q-CDR1 GFTFRSYA
55 VH-476-N101Q-CDR2 IGDSGGST
56 VH-476-N101Q-CDR3 AKLGQSSGWYDHYYYYGMDV
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161/163
57 VL-476-C33S SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKYVSWFQQKPGQSPV LVIYRDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADFYCQA WDSSTVVFGGGTKETVE
58 VL-476-C33S-CDR1 KEGNKY
VL-476-C33S-CDR2 RDS
59 VL-476-C33S-CDR3 QAWDSSTVV
60 VH-516 QVQEQESGPGEVKPSDTESETCAVSDYSISSNDWWGWIRQPPG KGEEWIGYIYYSGTGYYNPSEKSRVTISIDTSKNQFSEKENSVTA VDTAVYYCARTRVGARRAFDYWGQGTEVTVSS
61 VH-516-CDR1 DYSISSNDW
62 VH-516-CDR2 IYYSGTG
63 VH-516-CDR3 ARTRVGARRAFDY
64 VL-516 SYVETQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAP VEVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATETISRVEAGDEADYYC QVWDSSSDHVVFGGGTKETVE
65 VL-516-CDR1 NIGSKS
VL-516-CDR2 DDS
66 VL-516-CDR3 QVWDSSSDHVV
67 VH-632 QVQEVESGGGEVKPGGSERESCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGK GEEWVSYIGSSSNTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSEYEQMNSER AEDTAVYSCARDRVKYGSPGSEFDYWGQGTEVTVSS
68 VH-632-CDR1 GFTFSDYY
69 VH-632-CDR2 IGSSSNTI
703 VH-632-CDR3 ARDRVKYGSPGSEFDY
71 VL-632 SYEETQPPSVSVSPGQTARITCSGDAEPKKYAFWYQQKSGQAP VEVIYEDSKRPSGIPERFSGSSSGTMATETISGAQVEDEADYYC YSTASSGDHRVFGGGTKETVE
72 VL-632-CDR1 AEPKKY
VL-632-CDR2 EDS
73 VL-632-CDR3 YSTASSGDHRV
74 VH-MPDL3280A EVQEVESGGGEVQPGGSERESCAASGFTFSDSWIHWYRQAPGK GEEWYAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYEQMNSE RAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTEVTVSS
75 VH-MPDL3280A- CDR1 GFTFSDSW
76 VH-MPDL3280A- CDR2 ISPYGGST
77 VH-MPDL3280A- CDR3 ARRHWPGGFDY
78 VL-MPDL3280A DIQMTQSPSSESASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKA PKEEIYSASFEYSGVPSRFSGSGSGTDFTETISSEQPEDFATYYCQ QYEYHPATFGQGTKVEIK
79 VL-MPDL3280A- CDR1 QDVSTA
VL-MPDL3280A- CDR2 SAS
80 VL-MPDL3280A- CDR3 QQYEYHPAT
81 VH-MEDI4736B EVQEVESGGGEVQPGGSERESCAASGFTFSRYWMSWVRQAPG KGEEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSEYEQMN SERAEDTAVYYCAREGGWFGEEAFDYWGQGTEVTVSS
82 VH-MEDI4736B- CDR1 GFTFSRYW
83 VH-MEDI4736B- CDR2 IKQDGSEK
84 VH-MEDI4736B- CDR3 AREGGWFGEEAFDY
85 VL-MEDI4736B EIVETQSPGTESESPGERATESCRASQRVSSSYEAWYQQKPGQA PREEIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTETISREEPEDFAVYYC QQYGSEPWTFGQGTKVEIK
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162/163
86 VL-MEDI4736B- CDR1 QRVSSSY
VL-MEDI4736B- CDR2 DAS
88 VL-MEDI4736B- CDR3 QQYGSLPWT
89 IgGl-FEAR-Fc ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG altsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhk psntkvdkrvepkscdkthtcppcpapefeggpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvavshedpevkfnwyvdgvevhnaktkp reeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapie ktiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdi avewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqq gnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
90 IgGl-FEAL-Fc astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsg altsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhk psntkvdkrvepkscdkthtcppcpapefeggpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvavshedpevkfnwyvdgvevhnaktkp reeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapie ktiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdi avewesngqpennykttppvldsdgsfllyskltvdksrwqq gnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
91 Kappa-C rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkv dnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvya CEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
92 Lambda-C gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawk adsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsys cqvthegstvektvaptecs
93 IgGlm(f) - VHaa 118-447 numeração UE astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsg altsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhk psntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkp reeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapie ktiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdi avewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqq gnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
94 PD-L1 (n° de acesso no banco de genes NP_054862.1) mrifavfifmtywhllnaftvtvpkdlyvveygsnmtieckfp vekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrar llkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritv kvnapynkinqrilvvdpvtseheltcqaegypkaeviwtssd HQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDP EENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLR KGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
95 Cd38 humano maduro QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKN IGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDAN fylylrarvcencmemdvmsvativivdicitggllllvyyws knrkakakpvtrgagaggrqrgqnkerpppvpnpdyepirkg QRDLYSGLNQRRI
96 Região CH3 de IgGlm(a) GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
97 Região CH3 de IgGlm(f) gqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewes NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
98 Região CH3 de IgGlm(ax) gqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesn GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
99 VH-huCD3-Hl-CDRl- T31P GFTFNPYA
100 VH-huCD3-Hl-CDRl- T31M GFTFNMYA
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163/163
101 VH-huCD3-Hl-CDR3- Y114V VRHGNFGNSYVSWFAV
102 VH-huCD3-Hl-CDR3- Y114M VRHGNFGNSYVSWFAM
103 VH-huCD3-Hl-CDR3- Y116R VRHGNFGNSYVSWFAR
104 VH-huCD3-Hl-CDR3- S110A VRHGNFGNSYVAWFAY
105 VH-huCD3-Hl-CDR3- H101G VRGGNFGNSYVSWFAY
106 VH-7717-625 HMQLVESGGGVAQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPG RGLEWLAVMSYDGETKYYADSVKGRFTISRDNSENTLFLQMN SLRAEDTAVYYCAKDTSNGWNYYFYGMDVWGQGTTVTVSS
107 VH-7717-625 CDR1 GFTFSNYG
108 VH-7717-625 CDR2 MSYDGETK
109 VH-7717-625 CDR3 AKDTSNGWNYYFYGMDV
110 VL-7717-625 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKFASWYQQKSGQAP VLVIYEDSKRPSGIPERVSGSSSGTMATLTISGAQTEDEADYYC YSTDRSGYHWVFGGGTKLTVL
111 VL-7717-625 CDR1 ALPKKF
VL-7717-625 CDR2 EDS
112 VL-7717-625 CDR3 YSTDRSGYHWV
113 IgG 1 m(f)_constante ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
114 IgG 1 -K409R_domínio constante ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
115 IgG 1 -F405L_domínio constante ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 170/222

Claims (89)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que o anticorpo inibe a ligação da PD-L1 humana à PD-1 humana e (i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547], ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547], mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511].
  2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338].
  3. 3. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57 [476].
  4. 4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é bloqueada pela ligação de um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência VL
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    2/29 como estabelecida na SEQ ID NO: 110 [625].
  5. 5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
  6. 6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo:
    (i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
  7. 7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 113 (RI 13), 123 (Y123) e 125 (R125) na SEQ ID NO: 94 foram substituídos por alaninas é reduzida em comparação com a ligação à PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de
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    3/29 alanina - l,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13 [338].
  8. 8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos na posição 113 (R113), o resíduo de aminoácido na posição 123 (Y123) e/ou o resíduo de aminoácido na posição 125 (R125) da SEQ ID NO: 94.
  9. 9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1, 3, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que a ligação do anticorpo a uma PDL1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 19 (F19), 42 (F42), 45 (E45), 46 (K46), 94 (L94) e 116 (1116) na SEQ ID NO: 94 foi/foram substituído(s) por alaninas é reduzida em comparação com a PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - 1,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13 [511].
  10. 10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1, 3, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: os resíduos de aminoácidos na posição 45 (E45), o resíduo de aminoácido na posição 46 (K46); e/ou o resíduo de aminoácido na posição 94 (L94) da SEQ
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    4/29
    ID NO: 94.
  11. 11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a ligação do anticorpo a uma PD-L1 mutante na qual qualquer um ou mais resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes às posições 58 (E58) e 113 (R113) na SEQ ID NO: 94 foi/foram substituído(s) por alaninas é reduzida em comparação com a PD-L1 do tipo selvagem com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 94; a ligação reduzida sendo determinada como a variação de expressão gênica na ligação do dito anticorpo sendo menor que a variação de expressão gênica média na ligação sobre todos os mutantes de alanina - 1,5xDP, em que DP é o desvio padrão de todas as variações de expressão gênica calculadas do anticorpo para a PDL1 mutante e a variação de expressão gênica na ligação é calculada como estabelecido no Exemplo 13 [547].
  12. 12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga a um epítopo na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), o dito epítopo compreendendo o resíduo de aminoácido na posição 58 (E58) e/ou o resíduo de aminoácido na posição 113 (R113)da SEQ ID NO: 94.
  13. 13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste em sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:21.
  14. 14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
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    5/29 (i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente [338], ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente [511], ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO :24, respectivamente [547].
  15. 15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VH selecionada do grupo que consiste em sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 18.
  16. 16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou
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    100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste em sequências estabelecidas nas: SEQ ID
    NO:5, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:22.
  17. 17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
    (i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22 [547].
  18. 18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências VH e VL compreendem, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente, e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VH
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    7/29 têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas.
  19. 19. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é capaz de induzir a lise dependente da dose de células epiteliais de um adenocarcinoma, como MDA-MB-231 através de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).
  20. 20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é capaz de reduzir o número de células em uma cultura das ditas células epiteliais em pelo menos 5%, como pelo menos 6%, 7%, 8%, 9% ou pelo menos 10% como resultado da lise celular.
  21. 21. Anticorpo de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a ADCC é determinada in vitro em um ensaio de liberação de 51Cr, como o ensaio descrito no exemplo 14.
  22. 22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a ADCC é determinada in vitro, incubando as ditas células epiteliais com uma composição compreendendo o anticorpo e células efetoras, como células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), por 4 horas a 37°C, 5% CO2, a quantidade de anticorpo na dita composição estando dentro da faixa de 0,1 a 1 pg/mL e a razão de células efetoras para células epiteliais sendo de 100:1.
  23. 23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 19 ou 20,
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    8/29 caracterizado pelo fato de que a dita lise de células epiteliais é determinada in vitro em um ensaio repórter de luciferase como substituto da ADCC, como o bioensaio repórter luminescente de ADCC descrito no exemplo 14.
  24. 24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a ADCC é determinada in vitro por
    i) contato de uma cultura das ditas células epiteliais com uma composição compreendendo o anticorpo e as células T humanas Jurkat que expressam estavelmente FcyRIIIa (CD 16) e luciferase de vagalume (células efetoras), em uma razão de célula efetora:célula epitelial de 1:1.
    ii) ajuste da cultura das células epiteliais e células efetoras à temperatura ambiente por 15 minutos, iii) incubação da cultura das células epiteliais e células efetoras com um substrato de luciferase, e iv) determinação da produção de luciferase na dita cultura celular;
    a quantidade de anticorpo na dita composição estando dentro da faixa de 0,5 a 250 ng/mL e a razão de células efetoras para células epiteliais sendo de 1:1.
  25. 25. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 20, 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que quando a ADCC das ditas células epiteliais é determinada em um ensaio repórter de luciferase, tal como um ensaio repórter definido na reivindicação 23 ou 24, então a ADCC observada após a incubação de uma cultura das células epiteliais com uma composição de teste compreendendo o dito anticorpo é de pelo menos 1,5 vezes a ADCC observada após a incubação de uma cultura das células epiteliais com uma composição compreendendo anticorpo de referência; a ADCC sendo determinada como unidades de luminescência relativa (RLU), a concentração de anticorpo na dita composição de teste e na dita composição compreendendo um anticorpo de referência sendo a mesma e dentro da faixa
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    9/29 de 20 a 250 ng/ml, e o anticorpo de referência sendo selecionado de:
    a) um anticorpo compreendendo a sequência VH estabelecida na SEQ ID NO: 74 e a sequência VL estabelecida na SEQ ID NO: 78; e
    b) um anticorpo compreendendo a sequência VH estabelecida na SEQ ID NO: 81 e a sequência VL estabelecida na SEQ ID NO: 85.
  26. 26. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
    (i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
  27. 27. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, em que o dito anticorpo compreende:
    (i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 33, 34 e 35, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:37, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:38, respectivamente [321], ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 47, 48 e 49, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:51, a sequência DVI, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:52, respectivamente [421], ou
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    10/29 (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:58, a sequência RDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:59, respectivamente [476], ou (iv) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 61, 62 e 63, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:65, a sequência DDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:66, respectivamente [516], ou (v) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 107, 108 e 109, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:111, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 113, respectivamente [625] (vi) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 68, 69 e 70, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:72, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:73, respectivamente [632].
  28. 28. Anticorpo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende:
    (i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:32 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:36 [321], ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:46 e
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 180/222
    11/29 uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:50 [421], ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57 [476], ou (iv) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:60 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:64 [516], ou uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 110 [625], (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:67 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:71 [632].
  29. 29. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é monovalente.
  30. 30. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo bivalente com duas regiões de ligação ao antígeno capazes de se ligar à PDL1 humana e em que as ditas duas regiões de ligação ao antígeno têm sequências de região variável idênticas.
  31. 31. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo biespecífico bivalente que, além da dita (primeira) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana, compreende uma (segunda) região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito segundo antígeno não é CD3e humano.
  32. 32. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), em que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana tem os recursos estabelecidos em qualquer uma das reivindicações anteriores.
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 181/222 n/29
  33. 33. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
  34. 34. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (i) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7 [338], respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (ii) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 182/222
    13/29 leve (VL) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17 [338], respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (iii) uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PDL1 humana compreendendo uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:23, a sequência DDN e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:24 [547], respectivamente, e uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreendendo (a) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
  35. 35. Anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato de que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:25 e uma sequência VL como estabelecida
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 183/222
    14/29 na SEQ ID NO:29.
  36. 36. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo biespecífico:
    (i) tem uma afinidade menor para a ligação ao CD3e humano em comparação com um anticorpo que tem uma região de ligação ao antígeno capaz de compreender uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:25 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, preferivelmente em que a dita afinidade é pelo menos 2 vezes menor, por exemplo pelo menos 5 vezes menor, como pelo menos 10 vezes menor, por exemplo pelo menos 25 vezes menor, tal como pelo menos 50 vezes menor, e (ii) é capaz de mediar a citotoxicidade dependente da concentração de células MDA-MB-231, células PC-3 e/ou células HELA ao usar PBMCs ou células T purificadas como células efetoras, por exemplo, quando testado como descrito no Exemplo 11 aqui.
  37. 37. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende:
    (i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 99, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 100, 27 e 28, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 184/222
    15/29 (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 101, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (iv) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 102, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (v) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 103, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (vi) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecido nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 104, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente, ou (vii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 26, 27 e 105, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:30, a sequência GTN, e a
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 185/222
    16/29 sequência como estabelecida na SEQ ID NO:31, respectivamente.
  38. 38. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano compreende:
    (i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:39 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:40 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:41 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (iv) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:42 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (v) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:43 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (vi) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:44 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29, ou (vii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:45 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:29.
  39. 39. Anticorpo multiespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana tem os recursos estabelecidos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.
  40. 40. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a dita região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 186/222
    17/29 região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1,
    CDR2 e CDR3, em que a sequência VH CDR3 é selecionada do grupo que consiste em sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:4 [338], SEQ ID
    NO: 11 [511] e SEQ ID NO:21 [547].
  41. 41. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
    (i) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2, 3 e 4, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO:6, a sequência KAS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO:7, respectivamente [338], ou (ii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO: 16, a sequência EDS, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 17, respectivamente [511], ou (iii) uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21, respectivamente, e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 com as sequências como estabelecidas na SEQ ID NO :23, a sequência DDN, e a sequência como estabelecida na SEQ ID NO :24, respectivamente [547].
  42. 42. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos
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    18/29
    99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência
    VH selecionada do grupo que consiste em sequências estabelecidas nas: SEQ
    ID NO: 1 [338], SEQ ID NO:8 [511] e SEQ ID NO: 18 [547].
  43. 43. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência VL selecionada do grupo que consiste em sequências estabelecidas nas: SEQ ID NO:5 [338], SEQ ID NO: 15 [511]e SEQ ID NO:22 [547].
  44. 44. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pelo fato de que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
    (i) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:1 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO:8 e uma sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VH estabelecida na: SEQ ID NO: 18 e uma
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 188/222
    19/29 sequência VL que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência VL estabelecida na: SEQ ID NO:22 [547].
  45. 45. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 44, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências VH e VL compreendem, cada uma, três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, ER1, ER2, ER3 e ER4, respectivamente, e em que as respectivas sequências estruturais ER1, ER2, ER3 e ER4 combinadas da VH têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais ER1, ER2, ER3 e ER4 combinadas das ditas sequências VH e em que as sequências VH CDR não são mutadas e em que as respectivas sequências estruturais ER1, ER2, ER3 e ER4 combinadas da VL têm pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as respectivas sequências estruturais ER1, ER2, ER3 e ER4 combinadas das ditas sequências VL e em que as sequências VL CDR não são mutadas.
  46. 46. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que a dita primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana compreende:
    (i) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
  47. 47. Anticorpo multiespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar
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    20/29 a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que o dito anticorpo:
    (i) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO :22, ou (ii) compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22, mas não compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15.
  48. 48. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compete pela ligação à PDL1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5.
  49. 49. Anticorpo multiespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana não é deslocada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:53 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:57.
  50. 50. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a ligação de PD-L1 humana à PD-1 humana.
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    21/29
  51. 51. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compete pela ligação à PD-L1 humana com um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
  52. 52. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 51, caracterizado pelo fato de que a ligação do dito anticorpo à PD-L1 humana é bloqueada por um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22.
  53. 53. Anticorpo multiespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana e uma segunda região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um segundo antígeno ou a um epítopo diferente de PD-L1 humana, em que a dita primeira região de ligação ao antígeno:
    (i) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:1 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:5 [338], ou (ii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO: 15 [511], ou (iii) é capaz de se ligar ao mesmo epítopo da PD-L1 humana como um anticorpo compreendendo uma sequência VH como estabelecida na SEQ ID NO: 18 e uma sequência VL como estabelecida na SEQ ID NO:22 [547].
  54. 54. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é
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    22/29 biespecífico.
  55. 55. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é bivalente.
  56. 56. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de se ligar a um segundo antígeno e o dito segundo antígeno não é CD3e humano.
  57. 57. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.
  58. 58. Anticorpo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgGl de comprimento total.
  59. 59. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
  60. 60. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 59, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende duas meias moléculas, cada uma compreendendo uma região de ligação ao antígeno, em que (i) a(s) meia(s) molécula(s) que compreende(m) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana é/são quimérica(s), e/ou (ii) a meia molécula que compreende a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é quimérica.
  61. 61. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que (i) a(s) região(ões) de ligação ao antígeno capaz(es) de se ligar à PD-L1 humana é/são humanizada(s), e/ou
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    23/29 (ii) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humanizada.
  62. 62. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que (i) a(s) região(ões) de ligação ao antígeno capaz(es) de se ligar à PD-L1 humana é/são humana(s), e/ou (ii) a região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano (epsilon), se presente, é humana.
  63. 63. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada uma das regiões de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região variável da cadeia leve (VL), e em que as ditas regiões variáveis compreendem três sequências CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, e quatro sequências estruturais, ER1, ER2, ER3 e ER4, respectivamente.
  64. 64. Anticorpo de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende duas regiões constantes da cadeia pesada (CH) e duas regiões constantes da cadeia (CL).
  65. 65. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma primeira e segunda cadeia pesada, em que cada uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas compreende pelo menos uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma CH3, em que na dita primeira cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, E405, Y407 e K409 (de acordo com a numeração da UE) foi substituído e, na dita segunda cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, F405, Y407 e K409 (de acordo com a numeração da UE) foi substituído, e em que a dita primeira e a dita segunda cadeias pesadas não
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    24/29 são substituídas nas mesmas posições.
  66. 66. Anticorpo de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que (i) o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita segunda cadeia pesada, ou (ii) o aminoácido na posição correspondente a K409 (de acordo com a numeração da UE) é R na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 (de acordo com a numeração da UE) é L na dita segunda cadeia pesada.
  67. 67. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada e em que uma ou ambas as cadeias pesadas são modificadas para que o anticorpo induza a função efetora mediada por Fc em menor extensão em relação a um anticorpo que é idêntico, exceto para compreender a primeira e a segunda cadeias pesadas não modificadas.
  68. 68. Anticorpo de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a dita função efetora mediada por Fc é medida por determinação da expressão de CD69 mediada por Fc, por ligação a receptores Fcy, por ligação a Clq ou por indução de reticulação mediada por Fc de FcRs.
  69. 69. Anticorpo de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que as sequências constantes das cadeias pesada e leve foram modificadas para que o dito anticorpo reduza a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparado a um anticorpo do tipo selvagem, em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional baseado em PBMC.
  70. 70. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 194/222
    25/29 primeira e uma segunda cadeia pesada, em que, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas, um ou mais aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE não são L, L, D,
    N e P, respectivamente.
  71. 71. Anticorpo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que as posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE são F e E, respectivamente, nas ditas primeira e segunda cadeias pesadas.
  72. 72. Anticorpo de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada e em que as posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F e E, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda cadeia pesada é R, ou (ii) a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é R, e a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda pesada cadeia é L.
  73. 73. Anticorpo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que as posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE são F, E, e A, respectivamente, nas ditas primeira e segunda cadeias pesadas.
  74. 74. Anticorpo de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico compreendendo uma
    Petição 870190108812, de 25/10/2019, pág. 195/222
    26/29 primeira e uma segunda cadeia pesada e em que as posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada e da segunda cadeia pesada são F, E, e A, respectivamente, e em que (i) a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é L, e a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda cadeia pesada é R, ou (ii) a posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da primeira cadeia pesada é R, e a posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgGl humana de acordo com a numeração da UE da segunda pesada cadeia é L.
  75. 75. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga à PD-L2 humana.
  76. 76. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga a PD-L1 humana com uma Kd de cerca de IO'8 M ou menos, tal como cerca de IO'9 M ou menos, por exemplo, cerca de IO'10 M ou menos, quando determinado como descrito no Exemplo 8 aqui.
  77. 77. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo medeia a citotoxicidade dependente da concentração de células MDA-MB-231, células PC-3 e/ou células HELA ao usar células T purificadas como células efetoras, quando testado como descrito no Exemplo 11 aqui.
  78. 78. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende:
    (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma região de
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    27/29 ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, e/ou (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.
  79. 79. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano como definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 38, e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar ao CD3e humano como definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 38.
    80. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 78 ou 79. 81. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende uma construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 78 ou 79 ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 80. 82. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 81,
    caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira é uma célula de mamífero, como uma célula de ovário de hamster chinês.
  80. 83. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações
    1 a 77 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
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    28/29
  81. 84. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 77 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 83, caracterizado(a) pelo fato de ser para uso como um medicamento.
  82. 85. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 70, caracterizado(a) pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer.
  83. 86. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 77 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 70, caracterizado(a) pelo fato de ser para uso no tratamento de um câncer distinguido pela presença de tumores sólidos.
  84. 87. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78 ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 70, caracterizado(a) pelo fato de ser para uso no tratamento de um câncer selecionado do grupo que consiste em: melanoma, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de cabeça e pescoço.
  85. 88. Método para tratar uma doença, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 75 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 83 a um indivíduo em necessidade do mesmo.
  86. 89. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 77, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento, como um medicamento para tratamento de câncer, por exemplo, câncer distinguido pela presença de tumores sólidos ou um câncer selecionado do grupo que consiste em: melanoma, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de cabeça e pescoço.
  87. 90. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 89, caracterizado pelo fato de que o método ou uso compreende a combinação com um ou mais agente terapêutico adicional, como um agente quimioterápico.
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    29/29
  88. 91. Método para produzir um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 77, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    a) cultivar uma célula hospedeira produzindo um primeiro anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e purificar o dito primeiro anticorpo da cultura;
    b) cultivar uma célula hospedeira produzindo um segundo anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno capaz de se ligar a um epítopo diferente de PD-L1 ou um antígeno diferente, por exemplo, uma região de ligação ao CD3e humano como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 19 e purificar o dito segundo anticorpo da cultura;
    c) incubar o dito primeiro anticorpo em conjunto com o dito segundo anticorpo sob condições de redução suficientes para permitir que as cisteínas na região de dobradiça sofram isomerização da ligação dissulfeto, e
    d) obter o dito anticorpo biespecífico.
  89. 92. Anticorpo anti-idiotípico, caracterizado pelo fato de que se liga à região de ligação ao antígeno capaz de se ligar à PD-L1 humana como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 77.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3099704B1 (en) 2014-01-27 2021-03-17 Molecular Templates, Inc. Mhc class i epitope delivering polypeptides
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
MX2017010072A (es) * 2015-02-05 2017-11-09 Molecular Templates Inc Moleculas multivalentes que se enlazan a cd20, las cuales comprenden regiones efectoras de la subunidad a de la toxina shiga, y composiciones enriquecidas de las mismas.
KR20240038121A (ko) 2015-05-30 2024-03-22 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 스캐폴드 및 이를 포함하는 세포-표적화 분자
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
KR102557126B1 (ko) 2016-12-07 2023-07-18 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 부위 특이적 접합을 위한 시가 독소 a 서브유닛 작동체 폴리펩타이드, 시가 독소 작동체 스캐폴드, 및 세포-표적화 분자
IL267990B2 (en) 2017-01-25 2024-04-01 Molecular Templates Inc Cell-targeted molecules containing Shiga toxin A subunit activators and nonimmune CD8 T-cell epitopes
WO2018222949A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
SG11202000198QA (en) * 2017-08-04 2020-02-27 Genmab As Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof
AU2019256383A1 (en) 2018-04-17 2020-11-26 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-CD27 and anti-PD-L1 antibodies and bispecific constructs
MX2019009726A (es) 2018-04-17 2020-02-05 Molecular Templates Inc Moleculas con direccion hacia her2 que comprenden andamiajes de la sub-unidad a de la toxina shiga desinmunizados.
CN109053891B (zh) * 2018-09-17 2021-12-21 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用
WO2020081493A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CN113454111A (zh) * 2018-11-06 2021-09-28 健玛保 抗体配制剂
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
CN114423793A (zh) 2019-09-18 2022-04-29 分子模板公司 包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子
WO2023057571A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
WO2023187460A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Mabtree Biologics Ag Human antibody or antigen binding fragment thereof specific against pd-l1 to enhance t-cell function

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6355271B1 (en) 1999-02-03 2002-03-12 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
EP3287144A1 (en) 2002-07-03 2018-02-28 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiating compositions
ES2442615T5 (es) 2002-07-18 2023-03-16 Merus Nv Producción recombinante de mezclas de anticuerpos
WO2005004809A2 (en) 2003-07-01 2005-01-20 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
CN104356236B (zh) 2005-07-01 2020-07-03 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
WO2008119353A1 (en) 2007-03-29 2008-10-09 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
JP5718637B2 (ja) 2007-06-21 2015-05-13 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 共有結合型ダイアボディおよびその使用
EP2535349A1 (en) 2007-09-26 2012-12-19 UCB Pharma S.A. Dual specificity antibody fusions
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
WO2009089004A1 (en) 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
AU2009296392B2 (en) 2008-09-26 2016-06-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-PD-1, PD-L1, and PD-L2 antibodies and uses therefor
WO2010059315A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
PE20120341A1 (es) 2008-12-09 2012-04-24 Genentech Inc Anticuerpos anti-pd-l1 y su uso para mejorar la funcion de celulas t
CN106432503B (zh) 2008-12-19 2020-03-06 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
KR20110134494A (ko) 2009-03-27 2011-12-14 자이모제네틱스, 인코포레이티드 항체-수용체 조합물을 포함하는 다중특이적-결합 단백질을 사용하기 위한 조성물 및 방법
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
KR101573109B1 (ko) * 2009-11-24 2015-12-01 메디뮨 리미티드 Ｂ７―ｈ１에 대한 표적화된 결합 물질
PT2506871T (pt) 2009-11-30 2016-11-07 Janssen Biotech Inc Mutantes de fc de anticorpos com funções efetoras inutilizadas
CA2781682A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Genentech, Inc. Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
SG184427A1 (en) 2010-04-20 2012-11-29 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
RU2608640C2 (ru) 2010-08-16 2017-01-23 Новиммун С.А. Способы получения мультиспецифичных и мультивалентных антител
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
WO2012025525A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
LT2771364T (lt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab A/S Heterodimerinių baltymų gamyba
LT2785375T (lt) 2011-11-28 2020-11-10 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1 antikūnai ir jų panaudojimas
NZ630551A (en) 2012-04-20 2017-11-24 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
EP3489254B9 (en) 2012-04-30 2022-12-21 Biocon Limited Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
US9856320B2 (en) 2012-05-15 2018-01-02 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting PD-1/PD-L1 signaling
ES2848052T3 (es) 2012-08-03 2021-08-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Anticuerpos de unión dual anti-PD-L1 y PD-L2 de agente individual y métodos de uso
WO2014055897A2 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
AU2013348570B2 (en) 2012-11-21 2017-01-12 Pharmabcine Inc. Dual-target antibody targeting VEGFR-2 and DLL4, and pharmaceutical composition comprising same
KR20230073341A (ko) * 2013-07-05 2023-05-25 젠맵 에이/에스 인간화 또는 키메라 cd3 항체
CN105669862A (zh) * 2014-11-21 2016-06-15 上海中信国健药业股份有限公司 抗人pd-l1/kir双特异性抗体及其制备方法和应用
IL310467A (en) 2015-07-15 2024-03-01 Genmab As Human CD3 antibodies or chimeras
SG11202000198QA (en) * 2017-08-04 2020-02-27 Genmab As Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof

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