KR102587941B1 - 향상된 효능작용 및 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자 - Google Patents

향상된 효능작용 및 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 향상된 효능작용 및 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자에 관한 것이다.

Description

향상된 효능작용 및 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자
서열 목록
본 출원은 EFS-웨브를 통해 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 2017년 6월 26일자로 생성된 ASCII 텍스트 파일은 JBI5094WOPCT_ST25.txt로 명명되고 크기가 205 킬로바이트이다.
기술분야
본 발명은 향상된 효능작용 및 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자에 관한 것이다.
원하는 치료 반응을 달성하기 위한 목적 항체 및 다른 Fc-도메인 함유 분자에 대한 공학적 피팅은, 예를 들어 항체 이펙터 기능, 반감기, 및 안정성을 조절하기 위한 Fc 도메인 공학적 접근법을 포함한다. 또한, 종양 괴사 인자(TNFR) 수퍼패밀리 구성원에 결합하는 항체와 같은 소정 유형의 분자에 대해, 그들의 항-종양 면역 효과를 자극하기 위한 효능작용을 유도하기 위한 공학적 접근법이 개발되었다.
항체 및 다른 Fc-도메인 함유 치료 작제물의 Fc 도메인-매개 기능을 조절하기 위한 추가의 공학적 접근법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 단리된 조작된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공하며, 여기서 항체는 모 야생형 항체에 비교할 때 T437R 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함한다.
본 발명은 또한 T437R 돌연변이를 포함하는 단리된 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 단리된 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 단리된 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공하는 단계, T437R 돌연변이, K248E 돌연변이, K338A 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이를 항체 내로 도입하여 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 조작된 항체를 생성하는 단계, 및 조작된 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적(agonistic) 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 모 야생형 항체에 비교할 때 T437R 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하는 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 항체를 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 Fc 도메인 내에 T437R 돌연변이를 포함하는 단리된 Fc 도메인 함유 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 Fc 도메인 내에 K338A 돌연변이를 포함하는 단리된 Fc 도메인 함유 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 Fc 도메인 내에 T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 단리된 Fc 도메인 함유 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 Fc 도메인 내에 T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 단리된 Fc 도메인 함유 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 Fc 도메인 내에 T437R 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 함유 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 또는 74의 Fc 도메인을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 또는 86의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 Fc 도메인 함유 분자가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 Fc 도메인 함유 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 Fc 도메인 함유 분자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료에 사용하기 위한, 모 야생형 항체에 비교할 때 T437R 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하는 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료를 위한 약제의 제조에서, T437R 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하는 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체의 용도를 제공한다.
도 1은 각각의 CH2 도메인의 충돌(clash)을 나타내는 다량체 모델 내의 CH3 도메인에 대한 정렬 후의 인간 IgG1 Fc(단백질 데이터 뱅크 엔트리 3AVE)의 결정 구조로부터 유래된 2개의 하프(half) Fc 분자(흑색 및 밝은 회색)를 나타낸다.
도 2a는 용액 중의 단독으로 돌연변이된 항체 OX4020E5IgG1K248E, OX4020E5IgG1T437R, OX4020E5IgG1K338A의 효능적 활성을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 2b는 Daudi 세포와 가교결합될 때 단독으로 돌연변이된 항체 OX4020E5IgG1K248E, OX4020E5IgG1T437R, OX4020E5IgG1K338A의 효능적 활성을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 2c는 용액 중의 OX4020E5IgG1T437R 및 OX4020E5IgG1에 비교하여 이중 돌연변이된 항체 OX4020E5IgG1T437R/K248E, OX4020E5IgG1T437R/K338A, 및 OX4020E5IgG1K248E/K338A의 효능적 활성을 나타내며, 효능작용은 OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 2d는 Daudi 세포와 가교결합시 OX4020E5IgG1T437R/K248E의 효능적 활성이 향상됨을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 2e는 Daudi 세포와 가교결합시 OX4020E5IgG1T437R/K338A의 효능적 활성이 향상됨을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 2f는 Daudi 세포와 가교결합시 OX4020E5IgG1의 효능적 활성이 향상됨을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 2g는 Daudi 세포와 가교결합시 OX4020E5IgG1T437R의 효능적 활성이 향상됨을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 3a는 용액 중의 OX40SF2IgG1T437R, OX40SF2IgG1T437R/K248E, OX40SF2IgG1T437R/K338A, 및 OX40SF2IgG1의 효능적 활성을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 3b는 Daudi 세포와 가교결합시 OX40SF2IgG1T437R의 효능적 활성이 향상됨을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 3c는 Daudi 세포와 가교결합시 OX40SF2IgG1T437R/K248E의 효능적 활성이 향상됨을 나타내며, 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 4a는 OX40SF2IgG1T437R의 효능적 활성이 FcγRIIB 의존성 방식으로 가교결합에 의해 추가로 향상됨을 나타낸다. 향상은 항-FcγRIIB 항체 2B6에 의해 차단되었다. 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 4b는 OX40SF2IgG1T437R/K248E의 효능적 활성이 FcγRIIB 의존성 방식으로 가교결합에 의해 추가로 향상됨을 나타낸다. 향상은 항-FcγRIIB 항체 2B6에 의해 차단되었다. 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 5는 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1T437R, 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E에 대한 NanoBRET™ PPI 검정으로부터 얻어진 보정된 생물발광 공명 에너지 전달(BRET: bioluminescence resonance energy transfer) 비를 나타내며, 이는 OX40-발현 세포의 표면 상의 항체 다량체화의 정도를 나타낸다. OX40SF2IgG1T437R/K248E 및 OX40SF2IgG1E345R은 10 내지 1000 ng/mL 범위의 농도에 걸쳐 상승된 보정된 NanoBRET 비를 나타냈으며, 이는 세포 표면에서의 항체 회합을 나타낸다. OX40SF2IgG1 및 OX40SF2IgG1T437R에 대한 보정된 NanoBRET 비는 배경 수준이었다. n= Nanoluc에 접합된 항체. h= Halotag에 접합된 항체.
도 6은 Fc 침묵 항체 OX40SF2IgG2sigma 및 OX40SF2IgG4PAA에 대한 효능작용을 T437R/K248E 돌연변이가 구조함을 나타낸다. 효능작용은 1 ㎍/mL OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가되었다.
도 7은 OX40SF2IgG1에 비교할 때 OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E가 증가된 효능으로 ADCC를 매개함을 나타낸다. Y-축은 항체가 없는 샘플에 비교하여 ADCC 활성의 활성화 배수를 나타낸다.
도 8은 OX40SF2IgG1에 비교할 때 유사한 수준으로 OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E가 ADCP를 매개함을 나타낸다. Y-축은 살해된 세포의 백분율(%)을 나타낸다.
도 9a는 OX40SF2IgG1에 비교할 때 OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E가 CDC를 향상시켰음을 나타낸다. Y-축은 세포독성의 백분율(%)을 나타낸다.
도 9b는 OX40SF2IgG2sigma에 비교할 때 OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E가 증가된 효능으로 ADCP를 매개함을 나타낸다. Y-축은 살해된 세포의 백분율(%)을 나타낸다.
도 10은 표시된 항체를 투여한 Tg32 반접합성 마우스의 PK 프로파일을 나타낸다. 데이터는 곡선의 선형(베타) 단계의 최초 시간에 대해 정규화하였고, 2 mg/㎏ 체중 볼루스 용량 후에 용량에 대한 % 최대 농도로서 표현하였다. 3개의 그룹에 대한 14 일 및 21 일에서의 혈청 농도는, 수준이 검출가능한 범위 미만이었기 때문에 나타내지 않는다. 각각의 데이터 점은 그룹 당 5 마리의 동물의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11은 표시된 항체를 투여한 Tg32 동형접합성 SCID 마우스의 PK 프로파일을 나타낸다. 반감기 값, t1/2을 하기와 같이 추정하였다: OX40SF2IgG1T437R, t1/2 = 9.5 ± 0.7 일; OX40SF2IgG1T437R/K248E, t1/2 = 8.3 ± 0.5 일; OX40SF2IgG1, t1/2 = 9.2 ± 0.6 일.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태를 설명하기 위한 것이며, 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 실시하는 데 사용될 수 있지만, 예시적인 재료 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
"항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체" 또는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
"TNFR 수퍼패밀리 구성원"은 TNFR의 자연 발생 변이체를 포함하는, 표 1에 나타낸 수용체를 포함하는, TNFR 수퍼패밀리에 속하는 수용체를 포함한다. TNFR은 전형적으로 I 형 막관통 단백질로서 발현되며, 그들의 세포외 도메인 내에 1 내지 6개의 시스테인-풍부 도메인을 함유한다. 신호전달은 TNFR 삼량체로서 발생한다. 각각의 TNFR에 대한 하나의 동형에 대한 아미노산 서열이 표 1에 나타나 있다. 특정 TNFR의 리간드(들)가 또한 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
Figure 112019023173897-pct00001
서열 번호 1
서열 번호 2
서열 번호 3
서열 번호 4
서열 번호 5
서열 번호 6
서열 번호 7
서열 번호 8
서열 번호 9
서열 번호 10
서열 번호 11
서열 번호 12
서열 번호 13
서열 번호 14
서열 번호 15
서열 번호 16
서열 번호 17
서열 번호 18
서열 번호 19
서열 번호 20
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"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "결합한다"는 다른 항원에 대해서보다 더 큰 친화성으로 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 또는 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 내의 에피토프에 결합하는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 지칭한다. 전형적으로, 결합에 대한 평형 해리 상수(KD)가 약 1×10-8 M 이하, 예를 들어 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-12 M 이하인 경우에 항체는 "특이적으로 결합"하며, 전형적으로 KD는 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하는 그의 KD보다 100배 이상 더 작다. 표준 절차를 사용하여 KD를 측정할 수 있다. 그러나, 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 또는 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는, 다른 관련 항원에 대한, 예를 들어 다른 종, 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스(cynomolgus), 사이노(cyno)), 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지, 침프(chimp)), 또는 칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus)(코먼 마모셋(common marmoset), 마모셋)로부터의 동일한 항원(상동체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 단일특이성 항체는 하나의 항원 또는 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 이중특이성 항체는 2개의 별개의 항원 또는 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
"항체"는 넓은 의미를 의미하며, 뮤린, 인간, 인간화, 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체, 항체 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체, 도메인 항체를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. "전장(full length) 항체 분자"는 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)로 이루어진다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR 세그먼트로 구성되며, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.
"상보성 결정 영역(CDR)"은 항체 내의 "항원 결합 부위"이다. CDR은 다양한 용어를 사용하여 정의될 수 있다: (i) 상보성 결정 영역(CDR), VH 내의 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL 내의 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3)는 서열 가변성에 기초한다(문헌[Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50]; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV", VH 내의 3개(H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개(L1, L2, L3)는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조 내에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17]). International ImMunoGeneTics(IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원-결합 부위의 표준화된 넘버링 및 정의를 제공한다. CDR, HV, 및 IMGT 도해 사이의 관련성이 문헌[Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]에 기재되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"은 본 명세서에서 달리 명시적으로 기재되어 있지 않는 한, 상기 기재된 카밧, 초티아 또는 IMGT 중 어느 하나의 방법에 의해 정의된 CDR을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 부류, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로 배정될 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그들의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 배정될 수 있다.
"항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위, 예컨대 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2 및 3, 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 보유하는 면역글로불린 분자의 일부분을 지칭한다. 항체 단편은 잘 알려진 Fab, F(ab')2, Fd, 및 Fv 단편뿐만 아니라, 하나의 VH 도메인 또는 하나의 VL 도메인으로 구성된 도메인 항체(dAb)를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성하기 위해, VH/VL 도메인은 분자 간에, 또는 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일쇄 항체 작제물에 의해 발현되는 경우에는 분자내에, 쌍을 이룰 수 있으며; 이는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1998/44001호, WO1988/01649호, WO1994/13804호, 및 WO1992/01047호에 기재되어 있다.
"단일클론 항체"는, 항체 중쇄로부터 C-말단 라이신을 제거하는 것과 같은 가능한 잘 알려진 변경 또는 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아미드화와 같은 아미노산의 번역-후 변형(들)으로 인한 변경을 제외하고는, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄 내에 단일 아미노산 조성을 갖는 항체 집단을 지칭한다. 단일클론 항체는, 이중특이성 또는 다중특이성 단일클론 항체가 2개 이상의 별개의 항원 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 제외하고는, 전형적으로 하나의 항원 에피토프에 특이적으로 결합한다. 단일클론 항체는 항체 집단 내에 이종 글리코실화를 가질 수 있다. 단일클론 항체는 단일특이성 또는 다중특이성이거나, 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이중특이성 항체는 용어 단일클론 항체에 포함된다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다(예를 들어, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체에는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). "단리된 항체"는 더 높은 순도로 단리된 항체, 예컨대 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도인 항체를 포함한다.
"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 항원 결합 부위 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되고 인간 대상체에게 투여될 경우에 최소 면역 반응을 갖도록 최적화되는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 이 항체가 불변 영역 또는 불변 영역의 일부분을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 기원의 서열로부터 유래된다.
인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 예시적인 시스템은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 담지하는 유전자도입 인간 이외의 동물, 예컨대 마우스 또는 래트를 포함한다. "인간 항체"는, 항체를 얻기 위해 사용한 시스템과 인간 면역글로불린 유전자좌 사이의 차이, 체세포 돌연변이의 도입, 또는 프레임워크 또는 항원 결합 부위 내로의 의도적인 치환 도입, 또는 둘 모두로 인해, 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 비교할 때 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 전형적으로, 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 경우에 "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al. (2000) J Mol Biol 296: 57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 공통 프레임워크 서열을 함유하거나, 예를 들어 문헌[Shi et al. (2010) J Mol Biol 397: 385-96] 및 국제 특허 출원 공개 제WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 혼입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다.
인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 인간 항체는, 합성 CDR 및/또는 합성 프레임워크를 혼입시킨 파지 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 생성될 수 있거나, 시험관내 돌연변이생성(in vitro mutagenesis)을 거쳐서 항체 특성을 개선하여, 생체내에서 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리에 의해 발현되지 않는 항체를 생성할 수 있다.
항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
"재조합"은 재조합 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체 및 다른 단백질을 지칭한다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 말한다. 에피토프는 전형적으로 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징과 더불어 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 이루어질 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다. 항체 "에피토프"는 에피토프를 확인하기 위해 사용되는 방법론에 따라 달라진다.
"이중특이성"은 2개의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 이중특이성 항체는 다른 관련 항원들에 대한, 예를 들어 다른 종, 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(사이노몰거스, 사이노), 판 트로글로디테스(침팬지, 침프) 또는 칼리트릭스 자쿠스(코먼 마모셋, 마모셋)로부터의 동일한 항원(상동체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프와 결합할 수 있다.
"다중특이성"은 2개 이상의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개 이상의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
"벡터"는 생물 시스템 내에서 복제가 가능하거나, 이러한 시스템 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 생물학적 시스템, 예컨대 세포, 바이러스, 동물, 식물, 및 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 성분을 이용하는 재구성된 생물학적 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 요소, 예컨대 복제 기점, 폴리아데닐화 신호, 또는 선택 마커를 함유한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥인 DNA 또는 RNA 분자, cDNA, 또는 이들의 하이브리드일 수 있다.
"발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 지칭한다.
"폴리뉴클레오티드"는 당-포스페이트 골격 또는 다른 균등한 공유결합적 화학 특성에 의해 공유 연결된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 합성 분자를 지칭한다. cDNA는 합성 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.
"폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합으로 결합된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
"약"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값이 허용 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 값을 측정하거나 결정하는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 특정 검정, 결과 또는 실시 형태와 관련하여 실시예에서 또는 명세서에서의 어딘가 다른 곳에서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "약"은 당업계의 관행에 따른 1 표준 편차, 또는 최대 5%의 범위 어느 쪽이든 더 큰 값 이내에 있음을 의미한다.
"결합가(valent)"는 분자 내의 항원에 특이적인 명시된 수의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 그렇기 때문에, 용어 "1가", "2가", "4가", 및 "6가"는 분자 내의 항원에 특이적인 각각 1개, 2개, 4개, 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.
"효능제"는, TNFR 수퍼패밀리 구성원의 천연 리간드에 의해 유도되는, 항체가 결합하는 TNFR 수퍼패밀리 구성원의 하나 이상의 생물학적 활성을 유도하는 항체를 지칭한다. 예시적인 효능적 활성은 시험관내 검정에서 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 생성의 유도, 수지상 세포(DC) 상에서 증가된 CD80, CD83, CD86, 및 HLA-DR 표면 발현에 의해 평가되는 DC 분화의 유도, B 세포 상에서 증가된 B 세포 증식 또는 증가된 CD23, CD80, CD83, CD86, 및 HLA-DR 표면 발현에 의해 평가되는 B 세포의 활성화, 이전에 항원에 노출된 환자로부터 단리된 PBMC에 의한 인터페론-γ(IFN-γ)의 생성에 의해 평가되는 항원-특이적 T 세포 기억 반응의 유도, 및 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식의 유도를 포함한다. 효능적 활성(예를 들어, 효능작용)은 가교결합 의존적이거나 항체 가교결합에 독립적일 수 있다.
NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체-유도 생성에 의해 효능적 활성이 측정되는 경우, "향상된 효능적 활성" 또는 "향상된 효능작용"은 모 야생형 항체에 비교할 때 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능작용의 개선을 지칭한다. 조작된 항체는, 그것이 가교결합 의존적 또는 가교결합 독립적인 방식으로 1 ㎍/mL의 항체 농도에서 야생형 모 항체에 비교할 때 20% 이상 더 높은 수준으로 SEAP 생성을 유도할 경우에 "향상된 효능적 활성"을 갖는다.
"가교결합"은, FcγR에 결합하는 항체, 예를 들어 FcγRIIB 시스 또는 트랜스, 및 후속적인 TNFR 효능적 활성의 유도에 의해 유도되는, TNFR 수퍼패밀리 구성원을 발현하는 세포 상의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 고차 다량체화(higher order multimerization)를 지칭한다. 가교결합제로서의 항-인간 F(ab')2, 또는 FcγRIIB를 발현하는 세포, 예컨대 Raji 세포를 사용함으로써 시험관 내에서 가교결합을 평가할 수 있다.
"항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성"은, 본 명세서에서 실시예 3에 기재된 바와 같은 HEK-Blue™ 리포터 검정에서, FcγR을 발현하는 Raji 세포, 예를 들어 FcγRIIB의 부재 하의 용액 중에 항체가 SEAP의 생성을 유도함을 의미한다.
"Fc 도메인 함유 분자"는 적어도 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 단량체형, 이량체형, 또는 헤테로이량체형 단백질을 지칭한다. 예시적인 Fc 도메인 함유 분자는, Fc 도메인에 연결된 표 1에 나타낸 것과 같은, TNFR 리간드의 세포외 도메인을 함유하는 융합 단백질이다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본 명세서 전체에 걸쳐 항체 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 따른다.
표 2에 나타낸 바와 같은 종래의 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드가 본 명세서에 사용된다.
[표 2]
Figure 112019023173897-pct00058
조성물
본 발명은 향상된 효능적 활성 및 임의로 향상된 이펙터 기능을 갖는 조작된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체, 및 항체의 사용 및 제조 방법을 제공한다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 Fc 영역 내에 소정 돌연변이를 도입하는 것이 향상된 효능작용 및 임의로 향상된 이펙터 기능을 갖는 조작된 항체를 생성한다는 확인에 기초한다.
본 발명은 조작된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공하며, 여기서 항체는 모 야생형 항체에 비교할 때 T437R 돌연변이를 포함하고, 임의로 K248E 돌연변이 또는 K338A 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 추가로 포함한다.
본 발명은 조작된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공하며, 여기서 항체는 모 야생형 항체에 비교할 때 T437R 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 63의 중쇄 불변 영역(HC)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 64의 중쇄 불변 영역(HC)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 65의 중쇄 불변 영역(HC)을 포함한다.
서열 번호 63(T437R 돌연변이를 갖는 IgG1 항체)
서열 번호 64(T437R/K248E 돌연변이를 갖는 IgG1 항체)
서열 번호 65(T437R/K338A 돌연변이를 갖는 IgG1 항체)
일부 실시 형태에서, 항체는 모 야생형 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는다.
일부 실시 형태에서는, Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 효능적 활성을 측정한다.
T437R 돌연변이는 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시킨다.
T437R/K248E 돌연변이는 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시킨다.
T437R/K338A 돌연변이는 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시킨다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식작용(ADCP: antibody-dependent cell phagocytosis)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG1 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/F234A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG1 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG1 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG1 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG2 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG2 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG2 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG4 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG4 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG4 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG4 동종형이며, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 IgG4 동종형이며, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체 가교결합에 독립적으로 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 FcγR-매개 항체 가교결합에 독립적으로 효능적 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 항체는 그들의 효능적 활성을 위해 종양 미세환경에서 FcγR을 발현하는 세포의 생체이용률 및 밀도에 의존하지 않을 수 있으며, 충분한 FcγR 세포 침윤이 결여된 환경에서 TNFR 신호전달을 유도할 수 있다.
본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 천연 리간드의 것보다 낮은 효능작용의 수준을 나타낼 수 있으며, 따라서 개선된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다.
일부 실시 형태에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원은 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26) 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)이다.
일부 실시 형태에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원은 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)이다.
일부 실시 형태에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원은 OX40(서열 번호 4)이다.
일부 실시 형태에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원은 CD27(서열 번호 8)이다.
일부 실시 형태에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원은 CD40(서열 번호 5)이다.
일부 실시 형태에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원은 CD137(서열 번호 10)이다.
일부 실시 형태에서, TNFR 수퍼패밀리 구성원은 GITR(서열 번호 23)이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 서열 번호 63의 불변 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며 ADCC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이 및 IgG1 동종형을 포함하며 ADCC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며 ADCP를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 ADCP를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 CDC를 매개한다.
S267E/L328F 돌연변이(문헌[Chu et al. (2008) Mol Immunol 45: 3926-33]) 또는 E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R 돌연변이(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98])를 도입함으로써 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키기 위한 보고된 Fc 공학적 노력은 ADCC가 제거된 항체를 생성하였다. Chu 및 Mimoto에 의해 기재된 항체와는 대조적으로, T437R 돌연변이를 포함하는 본 발명의 IgG1 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는, 항-종양 면역을 향상시키기 위한 종양 미세환경에서의 GITR 및/또는 OX-40 발현 Treg 세포의 고갈이다.
일부 실시 형태에서, T437R 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, T437R 돌연변이, 및 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는 항-CD40 또는 항-CD27 항체를 이용한 치료적 처리이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 서열 번호 66의 불변 영역을 포함한다.
서열 번호 66 T437R을 갖는 IgG1sigma
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 서열 번호 67의 불변 영역을 포함한다.
서열 번호 67 T437R을 갖는 IgG2sigma
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
T437R 돌연변이 및 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 그들의 가교결합 독립적인 효능적 활성을 유지하였지만, ADCC를 매개할 수 없었다. 따라서, T437R 돌연변이 및 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 갖는 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
T437R 돌연변이 및 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 그들의 가교결합 독립적인 효능적 활성을 유지하였지만, ADCC를 매개할 수 없었다. 따라서, T437R 돌연변이 및 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 갖는 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 서열 번호 68의 불변 영역을 포함한다.
서열 번호 68 T437R을 갖는 IgG4PAA
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고, 항체 가교결합에 독립적으로 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26) 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD27(서열 번호 8)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD40(서열 번호 5)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD137(서열 번호 10)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 고형 종양의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 흑색종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비-편평상피 NSCLC의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐 선암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 신장 투명 세포 암종 또는 신장 유두상 세포 암종) 또는 그의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 중피종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비인두 암종(NPC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 결장직장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 난소암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 간암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 췌장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 갑상선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 두경부의 편평상피세포 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 식도 또는 위장관의 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 유방암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 나팔관암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 뇌암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 요도암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 그리고 하기 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 및 모두 중 일부 실시 형태에서, 고형 종양은 비뇨생식기암이다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁내막증의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁경부암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 64의 HC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며 ADCC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 ADCC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며 ADCP를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 ADCP를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 CDC를 매개한다.
S267E/L328F 돌연변이(문헌[Chu et al. (2008) Mol Immunol 45: 3926-33]) 또는 E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R 돌연변이(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98])를 도입함으로써 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키기 위한 보고된 Fc 공학적 노력은 ADCC가 제거된 항체를 생성하였다. Chu 및 Mimoto에 의해 기재된 항체와는 대조적으로, T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 본 발명의 IgG1 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는, 항-종양 면역 효과를 향상시키기 위한 종양 미세환경에서의 GITR 및/또는 OX-40 발현 Treg 세포의 고갈이다.
일부 실시 형태에서, T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, T437R/K248E 돌연변이, 및 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는 항-CD40 또는 항-CD27 항체를 이용한 치료적 처리이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 서열 번호 69의 불변 영역을 포함한다.
서열 번호 69 T437R/K248E를 갖는 IgG1sigma
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 서열 번호 70의 불변 영역을 포함한다.
서열 번호 70 T437R/K248E를 갖는 IgG2sigma
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 서열 번호 71의 불변 영역을 포함한다.
서열 번호 71 T437R/K248E를 갖는 IgG4PAA
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고, 항체 가교결합에 독립적으로 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26) 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD27(서열 번호 8)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD40(서열 번호 5)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD137(서열 번호 10)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 고형 종양의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 흑색종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비-편평상피 NSCLC의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐 선암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 신장 투명 세포 암종 또는 신장 유두상 세포 암종) 또는 그의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 중피종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비인두 암종(NPC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 결장직장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 난소암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 간암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 췌장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 갑상선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 두경부의 편평상피세포 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 식도 또는 위장관의 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 유방암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 나팔관암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 뇌암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 요도암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 그리고 하기 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 및 모두 중 일부 실시 형태에서, 고형 종양은 비뇨생식기암이다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁내막증의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁경부암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 65의 HC를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며 ADCC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 ADCC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며 ADCP를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 ADCP를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 IgG1 동종형이며 CDC를 매개한다.
S267E/L328F 돌연변이(문헌[Chu et al. (2008) Mol Immunol 45: 3926-33]) 또는 E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R 돌연변이(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98])를 도입함으로써 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키기 위한 보고된 Fc 공학적 노력은 ADCC가 제거된 항체를 생성하였다. Chu 및 Mimoto에 의해 기재된 항체와는 대조적으로, T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 본 발명의 IgG1 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는, 항-종양 면역을 향상시키기 위한 종양 미세환경에서의 GITR 및/또는 OX-40 발현 Treg 세포의 고갈이다.
일부 실시 형태에서, T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, T437R/K338A 돌연변이, 및 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는 항-CD40 또는 항-CD27 항체를 이용한 치료적 처리이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 72의 HC를 포함한다.
서열 번호 72: T437R/K338A를 갖는 IgG1sigma
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 73의 HC를 포함한다.
서열 번호 73: T437R/K338A를 갖는 IgG2sigma
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 74의 HC를 포함한다.
서열 번호 74: T437R/K338A를 갖는 IgG4PAA
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고, 항체 가교결합에 독립적으로 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26) 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD27(서열 번호 8)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD40(서열 번호 5)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD137(서열 번호 10)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 고형 종양의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 흑색종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비-편평상피 NSCLC의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐 선암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 신장 투명 세포 암종 또는 신장 유두상 세포 암종) 또는 그의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 중피종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비인두 암종(NPC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 결장직장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 난소암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 간암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 췌장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 갑상선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 두경부의 편평상피세포 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 식도 또는 위장관의 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 유방암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 나팔관암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 뇌암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 요도암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 그리고 하기 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 및 모두 중 일부 실시 형태에서, 고형 종양은 비뇨생식기암이다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁내막증의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁경부암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
"항체-의존성 세포성 세포독성", "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 이펙터 세포 상에서 발현되는 Fc 감마 수용체(FcγR)를 통한, 항체-코팅된 표적 세포와 용해 활성을 갖는 이펙터 세포, 예컨대 자연 살해 세포, 단핵구, 대식세포 및 호중구의 상호작용에 의존하는 세포사를 유도하기 위한 기전이다. 예를 들어, NK 세포는 FcγRIIIA를 발현하며, 한편 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIIIA를 발현한다. 항체-코팅된 표적 세포, 예컨대 TNFR 발현 세포의 사멸은 막 세공 형성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통한 이펙터 세포 활성으로 인해 발생한다. 본 발명의 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 항체는 면역 이펙터 세포와 조합되어 항체가 결합하는 표적을 발현하는 세포에 첨가될 수 있으며, 이는 항원 항체 복합체에 의해 활성화되어 표적 세포의 세포용해를 유발할 수 있다. 세포용해는 용해된 세포로부터의 표지(예를 들어, 방사성 기질, 형광 염료, 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 검출될 수 있다. 그러한 검정을 위한 예시적인 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 예시적인 검정에서, 표적 세포는 1 표적 세포 대 50 이펙터 세포의 비로 사용된다. 표적 세포를 37℃에서 20 분 동안 BATDA(PerkinElmer)로 사전-표지하고, 2회 세척하고, DMEM, 10% 열-불활성화 FBS, 2 mM L-글루타민(모두 Invitrogen으로부터) 중에 재현탁한다. 표적(1×104개 세포) 및 이펙터 세포(0.5×106개 세포)를 합하고, 100 μl의 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰에 첨가한다. 시험 항체가 있거나 없는 추가적인 100 μl를 첨가한다. 플레이트를 200 g에서 3 분 동안 원심분리하고, 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 200 g에서 3 분 동안 다시 원심분리한다. 웰 당 총 20 μl의 상청액을 제거하고, 200 μl의 DELPHIA 유로퓸-기반의 시약(PerkinElmer)의 첨가에 의해 세포 용해를 측정한다. 0.67%(w/v) Triton X-100(Sigma Aldrich)을 이용하는 최대 세포독성, 및 임의의 항체의 부재 하에 표적 세포로부터의 BATDA의 자발적인 방출에 의해 결정된 최소 대조군에 대해 데이터를 정규화한다. 대안적으로, 수용체의 활성화가 본 명세서에 기재된 바와 같은 루시퍼라제 리포터의 발현을 유발하는 리포터 유전자 검정에서 FcγRIIIA의 활성화를 평가함으로써 ADCC 활성을 평가할 수 있다.
"항체-의존성 세포 식작용"("ADCP")은 식세포, 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포에 의한 내재화에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 제거의 기전을 지칭한다. 단핵구-유래 대식세포를 이펙터 세포로서, 그리고 항체가 결합하는 표적을 발현하는 Daudi 세포(ATCC® CCL-213™) 또는 B 세포 백혈병 또는 림프종 또는 종양 세포를 GFP 또는 다른 표지된 분자를 발현하도록 조작된 표적 세포로서 사용함으로써 ADCP를 평가할 수 있다. 이펙터 대 표적 세포 비는, 예를 들어 4:1일 수 있다. 시험 항체의 존재 또는 부재 하에 4 시간 동안 이펙터 세포를 표적 세포와 함께 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후에, 세포는 아큐타제를 사용하여 탈착될 수 있다. 대식세포는 형광 표지에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체로 확인할 수 있으며, % 식작용은 표준 방법을 사용하여 CD11+CD14+ 대식세포에서의 % GFP 형광에 기초하여 결정할 수 있다.
본 발명의 항체의 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC는 항체 Fc 내로 추가의 돌연변이를 도입함으로써 추가로 향상될 수 있으며, 이는 활성화 Fcγ 수용체(FcγR) 또는 보체에 대한 항체의 결합을 향상시킨다.
활성화 FcγR에 대한 본 발명의 항체의 결합을 증가시키고/시키거나 항체 이펙터 기능을 향상시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호, 미국 특허 출원 공개 제2015/0259434호, 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604], 문헌[Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103: 4005-10], 문헌[Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res 67: 8882-90], 문헌[Richards et al. (2008) Mol Cancer Ther 7: 2517-27], 문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3]에 기재된 것들이며, 위치 236, 239, 243, 256, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 360, 339, 378, 396, 또는 430을 포함한다(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름). 단독으로 또는 조합하여 실행될 수 있는 예시적인 돌연변이는 G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T, 및 P396L 돌연변이이다. 증가된 ADCC 또는 ADCP를 갖는 항체를 생성하는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, 및 G236A/S239D/I332E 돌연변이이다.
본 발명의 항체의 CDC를 향상시키기 위해 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 국제 특허 출원 제WO2014/108198호, 문헌[Idusogie et al. (2001) J Immunol 166: 2571-5], 및 문헌[Moore et al. (2010) MAbs 2: 181-9]에 기재된 것들이며, 위치 267, 268, 324, 326, 333, 345, 및 430을 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 실행될 수 있는 예시적인 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E430S, E430F, 및 E430T 돌연변이이다. 증가된 CDC를 갖는 항체를 생성하는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T, 및 S267E/H268F/S324T 돌연변이이다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는, 표적-결합된 항체의 Fc 이펙터 도메인이 보체 성분 C1q에 결합하여 활성화하고, 이는 결국 보체 캐스케이드를 활성화하여 표적 세포사를 유발하는 세포사 유도 기전을 지칭한다. 보체의 활성화는 또한 표적 세포 표면 상에의 보체 성분의 침착을 가져올 수 있는데, 이는 백혈구 상의 보체 수용체(예를 들어, CR3)에 결합함으로써 ADCC를 용이하게 한다. 예를 들어 RPMI-B(1% BSA로 보충된 RPMI) 중에 1×105개의 세포/웰(50 μl/웰)로 Daudi 세포를 플레이팅하고, 0 내지 100 ㎍/ml의 최종 농도로 웰에 50 μl의 시험 항체를 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 반응물을 인큐베이션하고, 11 μl의 혼주된 인간 혈청을 웰에 첨가하고, 37℃에서 45 분 동안 반응물을 인큐베이션함으로써 세포의 CDC를 측정할 수 있다. 용해된 세포의 백분율(%)은 표준 방법을 사용하여 FACS 검정에서 % 프로피듐 요오다이드 염색된 세포로서 검출될 수 있다.
ADCC를 유도하는 본 발명의 항체의 능력은 또한 그들의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상시킬 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 대부분 잘 알려진 바이안테나리(biantennary) G0, G0F, G1, G1F, G2, 또는 G2F 형태의 글리칸에 의해 Asn297에서 N-글리코실화된다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 전형적으로 약 85% 이상의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 바이안테나리 복합체-유형은 올리고당으로부터의 코어(core) 푸코스의 제거는, 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서, 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 바이안테나리 복합체-유형의 Fc 올리고당을 담지하는 비교적 고도로 탈푸코실화된 항체의 성공적인 발현을 유발하는 것으로 보고된 상이한 방법, 예컨대 배양물 삼투질 농도(osmolality)의 제어(문헌[Konno et al. (2012) Cytotechnology 64: 249-65]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 Lec13의 적용(문헌[Shields et al. (2002) J Biol Chem 277: 26733-40]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 EB66의 적용(문헌[Olivier et al. (2010) MAbs 2: 405-15]), 숙주 세포주로서의 래트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용(문헌[Shinkawa et al. (2003) J Biol Chem 278: 3466-73]), 특이적으로 α 1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자에 대한 짧은 간섭(small interfering) RNA의 도입(문헌[Mori et al. (2004) Biotechnol Bioeng 88: 901-8]), 또는 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III과 골지(Golgi) α-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 억제제인 키푸넨신(kifunensine)의 공발현(문헌[Ferrara et al. (2006) Biotechnol Bioeng 93: 851-61]; 문헌[Ferrara et al. (2006) J Biol Chem 281: 5032-6])을 사용하여 그러한 mAb를 달성할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 항체의 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC를 향상시키는 제2 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 G236A 돌연변이, S239D 돌연변이, F243L 돌연변이, T256A 돌연변이, K290A 돌연변이, R292P 돌연변이, S298A 돌연변이, Y300L 돌연변이, V305L 돌연변이, K326A 돌연변이, A330K 돌연변이, I332E 돌연변이, E333A 돌연변이, K334A 돌연변이, A339T 돌연변이, P396L 돌연변이, S267E 돌연변이, H268F 돌연변이, S324T 돌연변이, K326A 돌연변이, K326W 돌연변이, E333A 돌연변이, E430S 돌연변이, E430F 돌연변이, 및 E430T 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체의 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC를 향상시키는 제2 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 S239D/I332E 돌연변이, S298A/E333A/K334A 돌연변이, F243L/R292P/Y300L 돌연변이, F243L/R292P/Y300L/P396L 돌연변이, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 돌연변이, G236A/S239D/I332E 돌연변이, K326A/E333A 돌연변이, K326W/E333A 돌연변이, H268F/S324T 돌연변이, S267E/H268F 돌연변이, S267E/S324T 돌연변이, 및 S267E/H268F/S324T 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체의 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC를 향상시키는 제2 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 푸코스 함량이 약 0% 내지 약 15%, 예를 들어 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%인 바이안테나리 글리칸 구조를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 푸코스 함량이 약 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%인 바이안테나리 글리칸 구조를 갖는다.
"푸코스 함량"은 Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코스 단당의 양을 의미한다. 푸코스의 상대량은 모든 당구조(glycostructure)에 대한 푸코스-함유 구조의 백분율이다. 이들은, 예를 들어 하기와 같은 다수의 방법에 의해 특성화 및 정량화될 수 있다: 1) 국제 특허 출원 공개 WO2008/077546호에 기재된 바와 같이 N-글리코시다제 F 처리된 샘플(예를 들어, 복합, 혼성, 및 올리고- 및 고-만노스 구조)의 MALDI-TOF를 사용하는 방법; 2) Asn297 글리칸의 효소적 방출을 행하고, 후속으로, 유도체화하고, 형광 검출을 사용하는 HPLC(UPLC) 및/또는 HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 검출/정량화함에 의한 방법; 3) 엔도(Endo) S, 또는 제1 GlcNAc 단당과 제2 GlcNAc 단당 사이를 절단하여 푸코스가 제1 GlcNAc에 부착된 상태로 남겨 두는 다른 효소로 Asn297 글리칸을 처리하거나 처리하지 않고서, 천연 또는 환원된 mAb의 온전한 단백질을 분석하는 방법; 4) 효소적 분해(예를 들어, 트립신 또는 엔도펩티다제 Lys-C)에 의해 mAb를 구성성분 펩티드로의 분해하고, 이어서 HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 분리, 검출, 및 정량화하는 방법; 또는 5) Asn 297에서의 PNGase F를 이용한 특이적 효소적 탈글리코실화에 의해 mAb 단백질로부터 mAb 올리고당을 분리하는 방법. 방출된 올리고당은 형광단으로 표지되고, 실험 질량과 이론 질량의 비교에 의한 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI: matrix-assisted laser desorption ionization) 질량 분석법에 의한 글리칸 구조의 미세 특성화, 이온 교환 HPLC(GlycoSep C)에 의한 시알릴화도(degree of sialylation)의 결정, 순상 HPLC(GlycoSep N)에 의한 친수성 기준에 따른 올리고당 형태의 분리 및 정량화, 및 고성능 모세관 전기영동-레이저 유도 형광(HPCE-LIF: high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence)에 의한 올리고당의 분리 및 정량화를 가능하게 하는 다양한 상보적 기술에 의해 분리 및 확인될 수 있다.
"저 푸코스" 또는 "저 푸코스 함량"은 푸코스 함량이 약 0% 내지 15%인 항체를 지칭한다.
"정상 푸코스" 또는 "정상 푸코스 함량"은 푸코스 함량이 약 50% 초과, 전형적으로 약 60%, 70%, 80% 초과, 또는 85% 초과인 항체를 지칭한다.
이펙터 기능성을 원하지 않는 경우에, 본 발명의 항체를 추가로 조작하여 활성화 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 항체의 결합을 감소시키고/시키거나 Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 또는 식작용(ADCP)을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 항체 Fc 내에 도입할 수 있다.
활성화 FcγR에 대한 항체의 결합을 감소시키고, 이어서 이펙터 기능을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604], 국제 특허 출원 공개 제WO2011/066501호, 미국 특허 제6,737,056호 및 제5,624,821호, 문헌[Xu et al. (2000) Cell Immunol 200: 16-26], 문헌[Alegre et al. (1994) Transplantation 57: 1537-43], 문헌[Bolt et al. (1993) Eur J Immunol 23: 403-11], 문헌[Cole et al. (1999) Transplantation 68: 563-71], 문헌[Rother et al. (2007) Nat Biotechnol 25: 1256-64], 문헌[Ghevaert et al. (2008) J Clin Invest 118: 2929-38], 문헌[An et al. (2009) MAbs 1: 572-9]에 기재된 것들이며, 위치 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331, 및 365를 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 이루어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 상의 K214T, E233P, L234V, L234A, G236의 결실, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S, 및 P331S 돌연변이이다. ADCC를 감소시키기 위해 실행될 수 있는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 L234A/L235A, IgG2 상의 V234A,/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, IgG4 상의 F234A/L235A, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 상의 N297A, IgG2 상의 V234A/G237A, IgG1 상의 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, IgG2 상의 H268Q/V309L/A330S/P331S, IgG1 상의 S267E/L328F, IgG1 상의 L234F/L235E/D265A, IgG1 상의 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S, 및 IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S이다. IgG2로부터의 잔기 117-260 및 IgG4로부터의 잔기 261-447을 갖는 Fc와 같은 하이브리드 IgG2/4 Fc 도메인이 또한 사용될 수 있다.
S228P 돌연변이를 IgG4 항체 내로 실행하여 IgG4 안정성을 향상시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 K214T 돌연변이, E233P 돌연변이, L234V 돌연변이, L234A 돌연변이, G236의 결실, V234A 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, G237A 돌연변이, P238A 돌연변이, P238S 돌연변이, D265A 돌연변이, S267E 돌연변이, H268A 돌연변이, H268Q 돌연변이, Q268A 돌연변이, N297A 돌연변이, A327Q 돌연변이, P329A 돌연변이, D270A 돌연변이, Q295A 돌연변이, V309L 돌연변이, A327S 돌연변이, L328F 돌연변이, A330S 돌연변이, 및 P331S 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 돌연변이를 포함하며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
예를 들어 문헌[Dall'Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-24], 문헌[Zalevsky et al. (2010) Nat Biotechnol 28: 157-9], 문헌[Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279: 6213-6], 문헌[Hinton et al. (2006) J Immunol 176: 346-56], 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604], 문헌[Petkova et al. (2006) Int Immunol 18: 1759-69], 문헌[Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab Dispos 35: 86-94], 문헌[Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23: 1283-8], 문헌[Yeung et al. (2010) Cancer Res 70: 3269-77], 및 문헌[Kim et al. (1999) Eur J Immunol 29: 2819-25]에 기재되고, 위치 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434, 및 435를 포함하는 것들과 같은 추가의 Fc 돌연변이를 도입함으로써, 본 발명의 항체를 추가로 조작하여 항체 반감기를 추가로 조절할 수 있다. 단독으로 또는 조합하여 실행될 수 있는 예시적인 돌연변이는 T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A, 및 H435R 돌연변이이다. 항체의 반감기를 증가시키기 위해 실행될 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 돌연변이는 M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A, 및 T307A/E380A/N434A 돌연변이이다. 항체의 반감기를 단축하기 위해 실행할 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 돌연변이는 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A, 및 H435R 돌연변이이다.
보존적 변형을 추가로 포함하는 본 발명의 항체는 본 발명의 범주 내에 있다.
"보존적 변형"은 보존적 변형을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의적으로 영향을 주지 않거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 잘 규정되어 있고, 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄 (예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 황-함유 측쇄 (시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 추가로, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 대해 이전에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있다. 본 발명의 항체에 대한 아미노산 치환은 알려진 방법에 의해, 예를 들어 PCR 돌연변이생성에 의해 실행될 수 있다. 대안적으로, 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는데, 예를 들어 무작위 (NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산 (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩함 - 을 사용하여 생성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여, 생성된 항체 변이체의 특성을 시험할 수 있다.
본 발명의 항체는 글리코실화, 이성체화, 탈글리코실화, 또는 비-천연 발생 공유적 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 첨가(페길화) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 그러한 변형은 생체내에서 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합되어(PEG화), 이의 약물동태학적 프로파일을 개선할 수 있다. 접합은 당업자에게 알려진 기법에 의해 수행될 수 있다. 치료 항체와 PEG의 접합은 기능을 간섭하지 않으면서, 약력학을 증진시키는 것으로 보인다
본 발명의 항체는 안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화성, 면역원성 또는 다른 바람직한 생물학적 특성 또는 생물물리학적 특성을 개선하도록 변형될 수 있으며, 이는 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은 (1) 그들의 본래 안정성에 영향을 미치는 개별 도메인의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 페어링(pairing)에 영향을 갖는 단백질/단백질 인터페이스(interface) 상호작용, (3) 극성 또는 하전된 잔기의 매몰(burial), (4) 극성 또는 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크, 및 (5) 다른 분자내 및 분자간 힘 중의 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 포함하는 다수의 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 잠재적인 구조 불안정화 잔기를 항체의 결정 구조에 기초하거나, 또는 소정 경우에는 분자 모델링에 의해 확인할 수 있으며, 확인된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성에 대한 잔기의 영향력을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키기 위한 방법 중 하나는 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 측정되는 바와 같은 열 전이 중간점(Tm)을 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질Tm은 그의 안정성과는 상관관계에 있고, 용액 중에서의 풀림(unfolding) 및 변성, 및 단백질이 풀리는 경향에 의존하는 분해 과정에 대한 그의 감수성과는 역상관관계에 있다. 다수의 연구에서 DSC에 의해 열 안정성으로서 측정된 제형의 물리적 안정성과 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성의 순위 사이의 상관관계가 발견되었다(문헌[Maa et al. (1996) Int. J. Pharm. 140: 155-68]; 문헌[Remmele et al., Pharm. Res. 15: 200-8]; 문헌[Gupta et al. (2003)AAPS PharmSci. 5E8: 2003]; 문헌[Bedu-Addo et al., Pharm. Res. 21: 1353-61]; 문헌[Zhang et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93: 3076-89]). 제형 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기적인 물리적 안정성에 영향을 준다는 것을 시사한다.
혈류 내의 내인성 순환 카르복시펩티다제에 의해 주사된 항체로부터 C-말단 라이신(CTL)을 제거할 수 있다(문헌[Cai et al. (2011) Biotechnol Bioeng 108: 404-12]). 미국 특허 출원 공개 US20140273092호에 기재된 바와 같이, 세포외 Zn2+, EDTA 또는 EDTA ― Fe3+의 농도를 제어하여 제조 동안 CTL 제거를 최대 수준 미만으로 제어할 수 있다. 항체 내의 CTL 함량은 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 C-말단 라이신 함량은 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 또는 약 60%이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 C-말단 라이신 함량은 약 0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다.
본 발명의 항체의 생성 방법
조작된 Fc 도메인을 갖는 본 발명의 항체는 야생형 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서열을 주형으로서 사용하는 표준 클로닝 및 발현 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 부위-지정 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성을 수행하여 항체 Fc 내에 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 FcγR에 대한 항체 결합, 효능적 활성, 또는 다른 관심 특성에 대한 효과를 평가할 수 있다.
항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 VH 및 VL 도메인은 드 노보(de novo)로 생성될 수 있다.
예를 들어, 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256: 495-7]의 하이브리도마 방법을 사용하여 단일클론 항체를 생성할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 숙주 동물, 예컨대 햄스터, 래트 또는 원숭이를 인간 TNFR 또는 TNFR의 세포외 도메인으로 면역화한 후, 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 표준 방법을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 단일 불멸화(immortalized) 하이브리도마 세포로부터 발생되는 콜로니를 원하는 특성, 예컨대 항원에 대한 결합의 특이성, 교차-반응성 또는 그의 결여, 및 친화성을 갖는 항체의 생성에 대해 스크리닝한다.
다양한 숙주 동물을 사용하여 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, Balb/c 마우스를 사용하여 마우스 항-인간 TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 생성할 수 있다. Balb/c 마우스 및 다른 인간 이외의 동물에서 제조된 항체는 더 인간-유사한 서열을 생성하기 위하여 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
인간 수용자 프레임워크의 선택을 포함하는 예시적인 인간화 기술이 알려져 있으며, CDR 이식(미국 특허 제5,225,539호), SDR 이식(미국 특허 제6,818,749호), 재표면화(Resurfacing)(문헌[Padlan (1991) Mol Immunol 28:489-98]), 특이성 결정 잔기 재표면화(미국 특허 출원 공개 제2010/0261620호), 인간 프레임워크 적응화(미국 특허 제8,748,356호), 또는 초인간화(미국 특허 제7,709, 226호)를 포함한다. 이러한 방법에서는, 모 항체의 CDR을 인간 프레임워크에 전달하며, 이는 모 프레임워크에 대한 이들의 전체 상동성에 기초하여, CDR 길이의 유사성, 표준 구조 동일성 또는 이들의 조합에 기초하여 선택될 수 있다.
국제 특허 출원 공개 제WO1090/007861호 및 제WO1992/22653호에 기재된 것들과 같은 기술에 의해 결합 친화성을 보존하기 위해 변경된 프레임워크 지지 잔기를 혼입시키거나(복귀 돌연변이), 예를 들어 항체의 친화성을 개선하기 위해 임의의 CDR에 변이를 도입함으로써, 원하는 항원에 대한 그들의 선택성 또는 친화성을 개선하도록 인간화 항체를 추가로 최적화할 수 있다.
인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 그들의 유전체 내에 담지하는 마우스 또는 래트와 같은 유전자도입 동물을 사용하여 표적 단백질에 대한 인간 항체를 생성할 수 있으며, 이는 예를 들어 미국 특허 제6,150,584호, 국제 특허 출원 공개 제WO99/45962호, 국제 특허 출원 공개 제WO2002/066630호, 제WO2002/43478호, 제WO2002/043478호, 및 제WO1990/04036호, 문헌[Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-9]; 문헌[Green et al. (1994) Nat Genet 7: 13-21]; 문헌[Lonberg et al. (1995) Int Rev Immunol 13: 65-93]; 문헌[Bruggemann et al. (1991) Eur J Immunol 21: 1323-6]에 기재되어 있다. 이러한 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실될 수 있고, 상동적 또는 비상동적 재조합을 사용하거나, 도입염색체(transchromosome)를 사용하거나, 미니유전자(minigene)를 사용하여, 하나 이상의 완전하거나 부분적인 인간 면역글로불린 유전자좌를 동물의 유전체로 삽입할 수 있다. Regeneron(http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT)(http://_www_omtinc_net), KyMab(http://_www_kymab_com), Trianni(http://_www.trianni_com), 및 Ablexis(http://_www_ablexis_com)와 같은 회사들이 상기 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해 지향된 인간 항체를 제공하는 데에 관여할 수 있다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 또는 그의 일부, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체(scFv), 또는 쌍을 이루지 않거나 쌍을 이루는 항체 가변 영역을 발현하도록 조작된다. 본 발명의 항체는, 문헌[Shi et al. (2010) J Mol Biol 397: 385-96] 및 국제 특허 출원 공개 제WO09/085462호에 기재된 바와 같이, 예를 들어 박테리오파지 pIX 외피 단백질과의 융합 단백질로서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 라이브러리는 인간 및/또는 사이노 TNFR에 결합하는 파지에 대해 스크리닝될 수 있고, 얻어진 양성 클론은 추가로 특성화될 수 있으며, Fab는 클론 용해물로부터 단리되어 전장 IgG로서 발현될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5, 580,717호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호에 기재되어 있다.
면역원성 항원의 제조 및 단일클론 항체 생성은 임의의 적합한 기법, 예컨대 재조합 단백질 생성을 사용하여 실행될 수 있다. 면역원성 항원을 정제된 단백질, 또는 전세포, 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태로 동물에게 투여할 수 있거나, 항원은 상기 항원 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산으로부터 동물의 체내에서 드 노보(de novo)로 형성될 수 있다.
본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 VH/VL 영역은 또한 기존의 항-TNFR 수퍼패밀리 수용체 항체로부터 얻어질 수 있다.
미국 특허 제US8133983호, 미국 특허 제US7960515호, 미국 특허 출원 공개 제US2013/0280275호, 국제 특허 출원 공개 제WO2013/028231호 및 미국 특허 출원 공개 제US2014/0377284호에 기재된 항-OX40 항체의 VH 및 VL 영역을 사용하여 본 발명의 항체를 조작할 수 있다. 추가로, 항-OX40 항체 MEDI-6469, BMS-986178, MOXR-0916, MEDI-6383, MEDI-0562, PF-04518600, 또는 GSK-3174998의 VH/VL 영역이 사용될 수 있다. 본 발명의 조작된 항-OX40 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있는 예시적인 VH 및 VL 영역은 하기와 같다:
서열 번호 51(제US2014/0377284호에 기재된 항체 SF2의 VH)
서열 번호 52(제US2014/0377284호에 기재된 항체 SF2의 VL)
서열 번호 53(제US2014/0377284호에 기재된 12H3VH1VL1의 VH)
서열 번호 54(제US2014/0377284호에 기재된 12H3VH1VL1의 VL)
서열 번호 55(제US2014/0377284호에 기재된 20E5VH3VL2의 VH)
서열 번호 56(제US2014/0377284호에 기재된 20E5VH3VL2의 VL)
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-CD40 항체의 VH 및 VL 영역은, 각각 미국 특허 제7,288,251호(항체 21.4.1) 및 미국 특허 제8,303,955호에 기재된 CP-870,893 및 인간화 S2C6, 및 국제 특허 출원 공개 제WO2001/056603호, 제WO2001/083755호, 제WO2013/034904호, 및 제WO2014/070934호에 기재된 항-CD40 항체의 것들이다. 본 발명의 조작된 항-CD40 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있는 예시적인 VH 및 VL 영역은 하기와 같다:
서열 번호 57(M9 항체의 VH)
서열 번호 58(M9 항체의 VL)
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-GITR 항체의 VH 및 VL 영역은 미국 특허 제7,812,135호, 제8,591,886호, 및 제7,618,632호, 또는 국제 특허 출원 공개 제WO2011/028683호, 제WO2013/039954호, 제WO2005/007190호, 및 제WO2007/133822호에 기재된 것들이다.
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-CD27 항체의 VH 및 VL 영역은 미국 특허 제US9169325호 및 미국 특허 출원 공개 제US20130183316호에 기재된 것들이다.
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-CD137 항체의 VH 및 VL 영역은 미국 특허 제US7288638호, 제US8716452호, 및 제US8821867호에 기재된 것들이다.
전장 이중특이성 항체로 조작된 본 발명의 항체는 본 발명의 범주 내에 있다.
"전장 항체"는 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 전장 항체 중쇄(HC)는 잘 알려진 중쇄 가변 및 불변 도메인 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 전장 항체 경쇄(LC)는 잘 알려진 경쇄 가변 및 불변 도메인 VL 및 CL로 이루어진다. 전장 항체는 어느 하나 또는 둘 모두의 중쇄에 C-말단 라이신(K)이 결여되어 있을 수 있다.
공발현을 사용하거나 무세포 환경에서의 시험관내에서 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 헤테로이량체 형성을 촉진하기 위해 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입함으로써, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 전장 이중특이성 항체를 생성할 수 있다. "Fab-아암" 또는 "하프 분자"는 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다.
Fab 아암 교환 반응은 이황화-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은, 각각이 별개의 에피토프, 즉 TNFR 상의 에피토프 및 제2 항원 상의 에피토프에 결합하는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 이중특이성 항체이다.
"동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
노브-인-홀(Knob-in-Hole)(Genentech), CrossMAb(Roche) 및 정전기적-일치(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y(Genentech), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono), Biclonic(Merus)을 사용하여 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 이중특이성 포맷으로 조작할 수 있다.
노브-인-홀 전략에서(예를 들어, 국제 출원 공개 제WO 2006/028936호 참조), 인간 IgG 내에 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용으로 인해 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 하기와 같이 제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현된다: T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S, 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
CrossMAb 기술에서는, Fab 아암 교환을 촉진하기 위해 "노브-인-홀" 전략을 이용하는 것에 더하여, 하프 아암들 중 하나는 생성되는 이중특이성 항체의 정확한 경쇄 쌍 형성을 보장하기 위해 교환된 CH1 및 CL 도메인을 갖는다(예를 들어, 미국 특허 제8,242,247호 참조).
한쪽 또는 양쪽 아암에서, 중쇄와 경쇄 사이에서 또는 이중특이성 항체 내의 중쇄 내에서 가변 또는 불변 도메인, 또는 두 도메인 모두를 교환함으로써 전장 이중특이성 항체를 생성하기 위하여 다른 크로스-오버 전략이 사용될 수 있다. 이들 교환은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2009/080254호, WO2009/080251호, WO2009/018386호 및 WO2009/080252호에 기재된 바와 같이 VH-CH1을 VL-CL로, VH를 VL로, CH3을 CL로 그리고 CH3을 CH1로 교환하는 것을 포함한다.
이중특이성 항체를 생성하기 위해 하나의 CH3 표면에서 양성 하전된 잔기 및 제2 CH3 표면에서 음성 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 제US2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 US2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 US2010/028637호, 또는 미국 특허 출원 공개 US2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제US2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제US2013/0195849호에 기재된 바와 같이 제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현된 하기 치환에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
이중특이성 항체를 생성하기 위하여 LUZ-Y 기술이 이용될 수 있다. 이 기술에서는, 문헌[Wranik et al. (2012) J Biol Chem 287: 43331-9]에 기재된 바와 같이, 류신 지퍼를 CH3 도메인의 C 말단 내로 첨가하여 모 mAb로부터의 이종이량체 조립을 유도하고, 이를 정제 후에 제거한다.
이중특이성 항체를 생성하기 위하여 SEEDbody 기술이 이용될 수 있다. SEEDbody는, 그의 불변 도메인에서, 선택된 IgG 잔기가 IgA 잔기로 치환되어 있어서, 이종이량체화를 촉진시키는데, 이는 미국 특허 출원 공개 제20070287170호에 기재된 바와 같다.
국제 특허 출원 공개 제WO2011/131746호(DuoBody technology)에 기재된 방법에 따라, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입하고 다이설파이드 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 이중특이성 항체를 시험관내에서 생성할 수 있다. 상기 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체 및 제2 단일특이성 2가 항체는 이종이량체 안정성을 촉진하는 CH3 도메인에서의 소정 치환을 갖도록 조작되며; 항체는 힌지 영역의 시스테인이 다이설파이드 결합 이성질화를 거치기에 충분한 환원 조건 하에서 함께 인큐베이션되어; Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건을 최적으로 비환원성 상태로 되돌릴 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인, 및 베타-메르캅토에탄올이다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
항체 도메인 및 넘버링은 잘 알려져 있다. "비대칭"은 항체 내의 2개의 별도의 중쇄에서 2개의 CH3 도메인 내의 동일하지 않은 치환을 지칭한다. IgG1 CH3 영역은 전형적으로 IgG1 상의 잔기 341-446으로 이루어진다(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름).
본 발명의 항체는 다양한 잘 알려진 항체 형태로 조작될 수 있다.
Fc 도메인 함유 분자
본 발명은 또한 Fc 도메인 내에 T437R 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하는 단리된 Fc 도메인 함유 분자를 제공한다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K248E 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K338A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인은 IgG1 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인은 IgG2 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인은 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인은 IgG4 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R 돌연변이를 포함하며 IgG1 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R 돌연변이를 포함하며 IgG2 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R 돌연변이를 포함하며 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R 돌연변이를 포함하며 IgG4 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며 IgG1 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며 IgG2 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K248E 돌연변이를 포함하며 IgG4 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며 IgG1 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며 IgG2 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 T437R/K338A 돌연변이를 포함하며 IgG4 동종형이다.
포유류 IgG 중쇄의 불변 영역 서열은 CH1-힌지-CH2-CH3과 같은 서열로 표기한다. IgG의 "힌지", "힌지 영역", 또는 "힌지 도메인"은 일반적으로 EU 인덱스에 따라 Glu216을 포함하고 인간 IgG1의 Pro230에서 종결되는 것으로 정의되지만, 기능적으로, 쇄의 가요성 부분은 Glu216 내지 Gly237과 같은 상부 및 하부 힌지 영역들로 명명되는 추가의 잔기들을 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 하부 힌지는 Fc감마R 결합이 일반적으로 기인하는 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로 지칭되었다. 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 최초 및 최종 시스테인 잔기를 위치시킴으로써 다른 IgG 동종형의 힌지 영역을 IgG1 서열과 정렬할 수 있다. EU 인덱스에 따라 넘버링된 바와 같이, 경계가 약간 변동될 수 있지만, CH1 도메인은 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대한 VH 도메인 및 아미노 말단에 인접하고, 면역글로불린 중쇄의 제1(대부분의 아미노 말단) 불변 영역, 예를 들어 대략 EU 위치 118 내지 215를 포함한다. Fc 도메인은 아미노산 231로부터 아미노산 447 까지 연장되고; CH2 도메인은 대략 Ala231 내지 Lys340 또는 Gly341이며, CH3은 대략 Gly341 또는 Gln342 내지 Lys447이다. CH1 영역의 IgG 중쇄 불변 영역의 잔기는 Lys에서 종결된다. Fc 도메인 함유 분자는 적어도 항체 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 따라서 적어도 IgG 중쇄 불변 영역의 대략 Ala231 내지 Lys447의 영역을 포함한다. Fc 도메인 함유 분자는 힌지 영역의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다.
예시적인 Fc 도메인 함유 분자는 이종성 단백질 또는 단백질의 일부, 예컨대 펩티드, 사이토카인, 케모카인, 또는 막 단백질의 세포외 도메인, 예컨대 TNFR 리간드의 세포외 도메인, 예컨대 표 1에 열거된 것들에 커플링된, 적어도 항체 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 이종성 융합 단백질이다.
본 발명의 Fc 도메인 함유 분자는 표준 분자 생물학 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 Fc 도메인 함유 분자를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 75의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 76의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 77의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 78의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 79의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 80의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 81의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 82의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 83의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 84의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 86의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
서열 번호 75 IgG1 T437R을 암호화하는 cDNA
서열 번호 76 IgG1 T437R/K248E를 암호화하는 cDNA
서열 번호 77 IgG1 T437R/K338A를 암호화하는 cDNA
서열 번호 78 IgG1sigma T437R을 암호화하는 cDNA
서열 번호 79 IgG1sigma T437R/K248E를 암호화하는 cDNA
서열 번호 80 IgG1sigma T437R/K338A를 암호화하는 cDNA
서열 번호 81 IgG2sigma T437R을 암호화하는 cDNA
서열 번호 82 IgG2sigma T437R/K248E를 암호화하는 cDNA
서열 번호 83 IgG2sigma T437R/K338A를 암호화하는 cDNA
서열 번호 84 IgG4PAA T437R을 암호화하는 cDNA
서열 번호 85 IgG4PAA T437R/K248E를 암호화하는 cDNA
서열 번호 86 IgG4PAA T437R/K338A를 암호화하는 cDNA
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 75의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 76의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 77의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 78의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 79의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 80의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 81의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 82의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 83의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 84의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 85의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열 번호 86의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, Fc 도메인 함유 분자가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 Fc 도메인 함유 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 Fc 도메인 함유 분자의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시 형태에서, Fc 도메인 함유 분자는 항체이다.
약제학적 조성물/투여
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 활성 성분으로서 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. "담체"는 본 발명의 항체와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법 (예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 증점제, 윤활제, 및 착색제 등과 같은 생리적 조건에 근접시키기 위해 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자의 농도는 약 0.5 중량% 미만으로부터, 통상적으로 약 1 중량% 이상까지, 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요한 용량, 유체 부피, 점도 등에 주로 기초하여 선택될 수 있다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.
본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자의 치료적 용도를 위한 투여 방식은, 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자의 형태이고; 주사기, 이식 장치, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 함유된 제형; 또는 당업계에 잘 알려진 바와 같이 당업자에게 인정되는 다른 수단을 사용하여, 항체를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐, 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장)일 수 있다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 종양내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내(i.v.) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 대상체에게 투여될 수 있다. i.v. 주입은, 예를 들어 15, 30, 60, 90, 120, 180, 또는 240 분, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 시간에 걸쳐 제공될 수 있다.
대상체에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하고("치료적 유효량"), 간혹 0.005 mg 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 0.05 mg 내지 약 30 mg/㎏ 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg/㎏, 또는 약 4 mg/㎏, 약 8 mg/㎏, 약 16 mg/㎏ 또는 약 24 mg/㎏, 또는, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 높을 수 있으며, 예를 들어 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/㎏일 수 있다.
고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적에 기초해서, 예를 들어 500, 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m2일 수 있다. 환자를 치료하기 위해 통상 1 내지 8회 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 또는 그 횟수 이상의 용량이 제공될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자의 투여는 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 5 주, 6 주, 7 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자는 정맥내 주입에 의해 8주 동안 매주 간격으로 8 mg/㎏ 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 추가의 16주 동안 2주마다 8 mg/㎏ 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 4주마다 8 mg/㎏ 또는 16 mg/㎏으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에서 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자는, 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 일 중 하나 이상에, 또는 대안적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 주 중 하나 이상, 또는 이들의 조합에, 매 24, 12, 8, 6, 4, 또는 2 시간마다의 단회 또는 분할 용량, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여, 일일 투여량으로서 1 일당 약 0.1 내지 100 mg/㎏, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/㎏의 양으로 제공될 수 있다.
본 발명의 방법에서 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자는 또한, 암 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 암 진행에서의 사건의 발생의 개시를 지연시키고/시키거나, 암이 관해기에 있을 때 재발 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자는 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 잘 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
방법 및 용도
본 발명의 항체 또는 Fc 도메인 함유 분자는 시험관내 및 생체내 진단적 유용성뿐만 아니라 치료적 유용성 및 예방적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 암 및 감염성 장애와 같은 다양한 장애를 치료, 예방, 및/또는 진단하기 위해 대상에게 투여되거나 배양 중인 세포에, 시험관내, 또는 생체외 투여될 수 있다.
본 발명은 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공하는 단계, T437R 돌연변이, K248E 돌연변이, K338A 돌연변이, T437R/K248E 돌연변이, 또는 T437R/K338A 돌연변이를 항체 내로 도입하여 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 조작된 항체를 생성하는 단계, 및 조작된 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 T437R 돌연변이, K248E 돌연변이, T437R/K338A 돌연변이, 또는 T437R/K248E를 포함하는 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 항체를 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 항체는 ADCC를 매개한다.
본 발명의 방법에서, 항체는 ADCP를 매개한다.
본 발명의 방법에서, 항체는 CDC를 매개한다.
본 발명의 일부 방법에서, 항체는 항체 가교결합에 독립적으로 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원의 효능적 활성을 향상시키며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
본 발명의 방법에서, 항체는 임의로 ADCC를 감소시키는 제2 돌연변이를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법에서, 대상체는 바이러스 감염을 갖는다.
본 발명의 방법에서, 대상체는 암을 갖는다.
본 발명의 방법에서, 암은 고형 종양이다.
본 발명의 방법에서, 고형 종양은 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26) 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 OX40(서열 번호 4)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 CD27(서열 번호 8)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 CD40(서열 번호 5)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 CD137(서열 번호 10)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 GITR(서열 번호 23)이다.
TNFR1/2/TNF-α, CD70/CD27, CD137/4-1BB, OX40/OX40L, CD40/CD40L, GITR/GITRL을 포함하는, TNFR 수퍼패밀리 구성원 및 그들의 리간드 중 다수는 암 요법을 위한 표적으로서 시사되어 왔으며, TNFR 수퍼패밀리 구성원을 표적으로 하는 몇몇 효능적 항체, 예컨대 항-CD40, 항-OX-40, 항-GITR, 항-CD27, 항-CD137 항체가 다양한 고형 종양뿐만 아니라, 비-호지킨 림프종 및 B-세포 악성종양과 같은 헴 악성종양에 대해 임상 개발 중이다. 항-CD40, 항-OX40, 항-GITR, 항-CD27, 항-CD137, 및 이펙터 기능성과 임의로 커플링된 그들의 향상된 효능적 활성의 관점에서 개선된 특성을 갖는 본 발명의 다른 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 고형 종양을 포함하는 다양한 암의 치료에서 치료적으로 효과적일 것이다.
본 발명을 일반적인 개념으로 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이며, 이때 실시예는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 개선하기 위한 Fc 공학적 접근법
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리에 속하는 면역자극 수용체에 대해 지향된 효능적 항체는 암 면역요법을 위한 유망한 약물 후보로서 부각되고 있다. 그들의 효능적 활성 및/또는 이펙터 기능을 향상시킴으로써 항-TNFR 항체의 항-종양 활성을 증대시킬 수 있는 몇몇 Fc 공학적 접근법이 최근에 발견되었다.
항종양 면역을 자극하는 단일클론 항체는 암 치료제의 중요한 부류로서 부각되고 있다(문헌[Mellman et al. (2011) Nature 480: 480-9])(문헌[Chen et al. (2013) Nat Rev Immunol 13: 227-42]). 면역 체크포인트 수용체 CTLA-4 및 PD-1을 표적화하는 항체는 진행된 흑색종, 폐암에 대한 단일요법으로서 승인되었고, 다른 유형의 인간 암의 치료에 대해 평가되었다. 억제 경로를 표적화하는 것 이외에, T 세포 및 항원 제시 세포 상의 면역자극 수용체에 대해 지향된 효능적 항체는 또한 항종양 면역을 자극할 수 있고 암 면역요법을 위한 임상 개발의 유망한 영역으로서 부각되고 있다(문헌[Schaer et al. (2014) J Immunother Cancer 2: 7]).
다수의 면역자극 수용체는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 수퍼패밀리에 속한다. 그들 중에서, OX40, CD27, 4-1BB, 및 GITR은 이펙터 T 세포 상에서 발현되고, 그들의 리간드 및 효능적 항체는 T 세포의 증식 및 활성화를 자극하도록 이들 수용체를 활성화할 수 있다(문헌[Kanamaru et al. (2004) J Immunol 172: 7306-14])(문헌[Gramaglia et al. (1998) J Immunol 161: 6510-7]), 문헌[Pollok et al. (1993) J Immunol 150: 771-81])(문헌[Ramakrishna et al. (2015) J Immunother Cancer 3: 37]). CD40은 항원 제시 세포 상에서 발현되고, 이 수용체의 활성화는 활성화된 T 세포에 대한 종양 항원의 더 효과적인 제시를 용이하게 한다(문헌[Khalil et al. (2007) Update Cancer Ther 2: 61-5])(문헌[Mangsbo et al. (2015) Clin Cancer Res 21: 1115-26]). 다수의 증거는 이들 TNF 수용체에 대한 치료 항체의 효능적 활성이 그들의 항-종양 활성에 중요함을 나타냈다(문헌[Mangsbo et al. (2015) Clin Cancer Res 21: 1115-26])(문헌[He et al. (2013) J Immunol 191: 4174-83])(문헌[Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19: 101-13]). 반면에, 몇몇 TNFR 수퍼패밀리 구성원, 예컨대 OX40 및 GITR은 종양 면역을 음성 조절하는 조절 T 세포(Treg) 상에서 상승된 발현을 갖는다. 몇몇 연구는 항-OX40 및 항-GITR 항체가 항체의 이펙터 기능에 의해 종양 미세환경에서 조절 T 세포의 선택적 제거를 용이하게 할 수 있음을 규명하였다(문헌[Bulliard et al. (2013) J Exp Med 210: 1685-93])(문헌[Bulliard et al. (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-80]). 조절 T 세포의 그러한 항체-매개 살해는 치료 항-OX40 및 항-GITR 항체의 항-종양 활성을 위한 이펙터 T 세포의 항체-매개 활성화보다 더 중요할 수 있다.
축적되는 증거는 면역조절 항체가 그들의 효능적 활성 및 이펙터 기능을 위해 상이한 유형의 Fc 수용체에 결합함을 나타냈다. 하류 신호전달 경로를 활성화시키기 위해서는, TNFR 삼량체화가 필요하다. 그러나, 하나의 항체 분자는 통상적으로 충분한 TNF 수용체를 클러스터링하기에 충분하지 않으며; 대신, 시험관내 검정에서 수용체 활성화를 위해 항체 가교결합이 필요하다(문헌[Morris et al. (2007) Mol Immunol 44: 3112-21]). 마우스에서의 최근의 연구는, CD40(문헌[Li et al. (2011) Science 333: 1030-4])(문헌[White et al. (2011) J Immunol 187: 1754-63]), 사멸 수용체 5(DR5)(문헌[Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19: 101-13])(문헌[Li et al. (2012) Cell Cycle 11: 3343-4]), 및 CD95(문헌[Xu et al. (2003) J Immunol 171: 562-8])를 포함하는 다수의 TNFR 표적에 대한 항체의 효능적 활성을 위해 억제성 FcγRIIB 수용체에 대한 결합이 결정적임을 나타냈다. FcγRIIB 수용체에 대한 IgG Fc의 가교결합은 하나 초과의 항체 분자를 다량체화할 수 있으며, 이는 결국 신호전달 경로 활성화를 위한 충분한 TNFR의 클러스터링을 용이하게 할 수 있다. 반면에, ADCC 및 ADCP와 같은 항체 이펙터 기능은 다양한 활성화 Fcγ 수용체와의 상호작용에 의존한다. 마우스에서의 연구는, 활성화 Fcγ 수용체가 종양내 조절 T 세포를 선택적으로 제거함으로써 면역조절 항-OX40 및 항-GITR 항체의 항종양 활성에 기여한다는 것을 규명하였다(문헌[Bulliard et al. (2013) J Exp Med 210: 1685-93])(문헌[Bulliard et al. (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-80]).
인간 IgG 항체는 FcγRI을 제외한 대부분의 인간 Fc 수용체에 대한 결합 친화성이 저조하다(문헌[Guilliams et al. (2014) Nat Rev Immunol 14: 94-108]). 면역자극 TNF 수용체에 대한 효능제 항체의 항종양 활성을 최적화하기 위해, 하나의 접근법은 IgG 항체의 Fc 영역을 조작하여 그의 Fcγ 수용체 결합, 특히 FcγRIIB 수용체와의 결합을 개선하는 것이다. 이와 관련하여, Chu 등은 향상된 FcγRIIB 결합 친화성을 갖는 IgG1 Fc에서의 S267E/L328F 돌연변이를 기재하였다(문헌[Chu et al. (2008) Mol Immunol 45: 3926-33]). 그러한 돌연변이로 조작된 항-CD19 항체는 1차 인간 B 세포의 B 세포 수용체-매개 활성화의 개선된 억제를 나타냈다. 그러나, 추가의 연구는 그러한 Fc 변이체가 또한 활성화 FcγRIIA 수용체의 R131 동종이형에 대한 향상된 결합을 갖는다는 것을 규명하였다(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]). 최근에, Mimoto 등은, FcγRIIA 수용체의 H131 또는 R131 동종이형에 대한 관련된 증가된 결합 없이 선택적으로 향상된 FcγRIIB 결합을 갖는, 집합적으로 V12 돌연변이라고 명명된, IgG1 Fc에서의 6 가지 돌연변이의 세트를 보고하였다(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]). 조작된 V12 돌연변이를 갖는 항-CD137 효능적 항체는 FcγRIIB 결합에 의존하는 훨씬 향상된 효능적 활성을 나타냈다.
FcγRIIB 결합을 최적화하는 것이 실행가능한 접근법이지만, 그러한 조작된 항체의 효능적 활성은 국소 미세환경에서의 FcγR 발현에 크게 의존하며, 그러한 항체의 효능은 해부학적 작용 부위로 제한될 수 있다. FcγRIIB에 대한 가교결합의 목적이 단지 수용체 활성화를 위한 효능적 항체의 클러스터링을 증가시키는 것이라면, 본 발명자들은 항체 다량체화를 촉진할 수 있는 Fc 돌연변이가 FcγRIIB 가교결합을 필요로 하지 않으면서 TNF 수용체에 대한 항체의 효능작용을 향상시킬 수 있다는 가설을 제기했다. Diebolder 등은 세포 표면 상의 표적에 결합시에 IgG 항체가 육량체로 형성되는 것을 선택적 Fc 돌연변이가 용이하게 할 수 있다는 것을 보고하였다(문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3]). 그러한 IgG 육량체가 보체-의존성 세포독성(CDC)을 크게 활성화시킬 수 있는 것으로 보고되었지만, 본 발명자들은 수용체 클러스터링을 촉진함으로써 TNF 수용체에 대한 올리고머화된 항체가 수용체를 활성화시킬 수 있다는 것이 다른 응용일 수 있다고 생각한다.
이 연구는 항-OX40 항체의 효능작용의 향상에 대한 상이한 Fc 공학적 접근법의 평가를 기재한다. 한편, 조작된 항체의 ADCC 및 ADCP 이펙터 기능에 대한 Fc 돌연변이의 효과를 또한 평가하였다. 그러한 연구는 개선된 항-종양 활성을 갖는 OX40 및 다른 TNF 수용체에 대한 조작된 항체의 설계를 안내하는 것을 도울 수 있다.
실시예 2 Fc 도메인의 다량체 회합을 용이하게 하는 인간 IgG에 대한 돌연변이의 확인
Fc-매개 다량체화를 용이하게 함으로써 효능적 활성을 향상시킬 수 있는 인간 IgG에 대한 돌연변이를 확인할 목적으로, RCSB 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 기탁된 구조(문헌[Berman et al. (2000) Nucleic Acids Res 28: 235-42])의 서열-기반 검색을 먼저 수행하여 Fc 도메인을 함유하는 이들 항목들을 확인하였다. 그 목록으로부터, 구조의 서브세트에 대한 결정학적 대칭의 적용은 다량체화를 촉진하는 돌연변이의 확인을 지원하기 위한 모델로서 사용될 수 있는 Fc 도메인의 폐쇄된 육량체 배열을 생성할 것이라는 예상으로, 육방정계 결정 패밀리에 속하는 결정으로부터 생성되는 구조를 조사하였다. 따라서 HIV-1 gp120(PDB 1HZH)에 대한 특이성을 갖는 온전한 IgG1 분자의 결정 구조(문헌[Saphire et al. (2001) Science 293: 1155-9])는, Fc 도메인이 패킹되어 폐환 구성을 형성하는 것으로 확인되었다.
Diebolder 등은 이전에 구조 1HZH에서 관찰된 것과 유사한 IgG 분자의 육량체 회합이 CDC 활성화에 중요할 수 있다는 가설을 제기하였고, 육량체화를 용이하게 하는 돌연변이의 확인을 위해 이 모델을 사용하였다(문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3]). 다량체 모델은 분자의 폐환 배열을 안정화시키는 대부분의 접촉이 이웃하는 Fc 분자의 CH3 도메인들 사이에 있음을 규명하였다. 따라서, 분자가 다량체 모델에서 관찰되는 바와 같이 패킹되어야 한다면, 다량체화를 용이하게 하는 한 가지 방법은, 이웃하는 CH3 표면과의 상호작용을 최적화하기 위해 CH3 표면 상의 잔기를 돌연변이하는 것을 가정하였다. 결정 구조 3AVE에 존재하는 IgG1 Fc의 CH3 도메인을 다량체 모델의 것들 상에 오버레이할 때, 이웃하는 Fc 도메인으로부터의 3AVE CH2 도메인의 충돌이 관찰되었다(도 1). 그러한 충돌은 또한 Davies 등에 의해 언급되었지만, CH2 도메인 AB 루프 내의 입체배좌 변화가 그러한 충돌이 발생하는 것을 방지할 수 있다는 것을 시사하였다(문헌[Davies et al. (2014) Mol. Immunol. 62:46-53]). 대안적으로, 다량체 모델에서 CH2 및 CH3 도메인들 사이의 변경된 각도는 인접한 분자의 CH2 도메인들 사이의 충돌 없이 기재된 바와 같이 CH3 도메인이 패킹되는 것을 가능하게 하였다.
따라서, CH3 도메인에 대한 CH2 도메인의 향상된 가요성은, CH2가 입체 충돌(steric clash)을 회피하고 잠재적으로 패킹 상호작용에 유리하게 기여할 입체배좌를 더 쉽게 채택하는 것을 가능하게 함으로써, Fc 분자가 다량체 배열로 더 용이하게 조립되는 것을 가능하게 할 것임을 가정하였다. CH2:CH3 계면에 대한 돌연변이는 CH2 도메인 가요성을 변경하는 것으로 나타났다(문헌[Frank et al. (2014) J Mol Biol 426: 1799-811])(문헌[Teplyakov et al. (2013) Mol Immunol 56: 131-9]). 따라서, IgG 다량체화를 촉진하기 위한 2 가지 부류의 돌연변이가 정의되었으며, 이는 분자간 접촉의 최적화를 통해 Fc-간 CH3:CH3 상호작용을 향상시키는 것들, 및 CH2 도메인의 향상된 가요성을 촉진하기 위해 분자내 CH2:CH3 계면을 약화시키는 것들이다. 프로그램 Coot 및 PyMol을 사용하여 다량체 모델을 수동으로 검사하였으며, 가정된 기전 중 하나 이상에 의해 다량체화를 용이하게 하는 것으로 예상되는 돌연변이의 목록을 창안하였다. 다양한 돌연변이를 항-OX40 항체 20E5 상에서 조작하고, 용액 중의, 또는 Raji 세포와 가교결합된 그들의 효능적 활성에 대해 시험하였다. 이들 초기 실험으로부터, 추가 연구를 위해 Fc 돌연변이 K248E, K338A, 및 T437R을 선택하였다.
실시예 3 재료 및 방법
항-OX40 항체의 Fc 조작
항-OX40 항체 20E5VH3VL2(본 명세서에서 20E5로 불림)(VH: 서열 번호 55, VL: 서열 번호 56)의 VH 및 VL 영역을 인간 야생형 IgG1 또는 IgG2 상에 클로닝하고, 선택된 치환을 Fc 상에 조작하여 항체 및 이펙터 기능의 효능적 활성에 대한 치환의 효과를 평가하였다. 생성된 항체의 명칭 및 그들의 Fc 치환이 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
Figure 112019023173897-pct00102
항체의 발현 및 정제
트랜스펙션 키트 설명서(Life Technologies)에 따라 항체 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 암호화하는 플라스미드를 1:3(HC: LC) 몰 비로 Expi293F 세포 내로 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한지 5 일 후에 세포를 스핀 다운하고, 상청액을 0.2 μm 필터에 통과시켰다. 항체 발현의 역가를 Octet(ForteBio)를 사용하여 정량화하였다. 키트 설명서(GE Healthcare Life Sciences)에 따라 사전 패킹된 단백질 A 스핀 컬럼을 사용하여 항체 정제를 실행하였다. 정제된 항체를 투석에 의해 DPBS, pH7.2로 완충액-교환하고, 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 환원된 샘플 및 비-환원된 샘플의 SDS-PAGE 및 고성능 크기-배제 크로마토그래피(HP-SEC)에 의해 품질을 평가하였다.
NanoBRET 단백질-단백질 상호작용 검정
항-OX40 SF2 항체의 경쇄에 대한 코딩 서열을, 각각 C-말단 Nanoluc 및 Halotag 서열을 갖는 프레임에서 pNLF-C 및 pHTC halotag 벡터(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)내로 클로닝하였다. 이들 경쇄는 중쇄와 쌍을 이루어, 경쇄의 C-말단에 부착된 Nanoluc 또는 Halotag를 갖는 Fc 조작된 SF2 항체를 발현시켰다. 표준 단백질 A 스핀 컬럼을 사용하여 이들 변형된 항체를 정제하였다.
NanoBRET 단백질-단백질 상호작용 검정(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)에 의해 세포 표면 상의 항체 다량체화를 연구하기 위하여, 0.25 ×105개의 HEK-Blue: OX40 세포를 96-웰 검정 플레이트의 각각의 웰에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음 날에, 50 μl 검정 배지(Opti-MEM 저혈청 배지(reduced serum medium), 페놀 레드 없음 + 4% FBS)중의 동일한 농도의 Nanoluc-태깅된 항체(공여자) 및 Halotag-태깅된 항체(수용자)를 세포에 적용하였다. 50 μl 검정 배지 중에 1:1000으로 희석된 Halotag 618 리간드를 실험 웰에 첨가하고, 검정 배지 중에 DMSO를 1:1000으로 희석함으로써 리간드가 없는 대조군 웰을 또한 설정하였다. 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 검정 배지로 2회 세척하고, 100 μl 검정 배지 중에 재현탁시켰다. FBS가 없는 검정 배지 중에 1:200으로 희석된 25 μl의 Nano-Glo 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 30 초 동안 진탕한 후에, 공여자 방출(460 nm)및 수용자 방출(618 nm)을 Envision에 의해 측정하였다. milliBRET 단위(mBU)를 갖는 원시 NanoBRET 비(raw NanoBRET ratio) 값을 RawBRET= 618 nmEm/460 nmEm* 1000으로서 계산하였다. 공여자-기여 배경 또는 블리드 스루(bleed through)를 감안하기 위해, milliBRET 단위를 갖는 보정된 NanoBRET 비 값을 CorrectedBRET = RawBRET실험 샘플 ― RawBRET리간드가 없는 대조군 샘플로서 계산하였으며, 이는 단백질-단백질 상호작용으로 인한 생물발광 단백질 공여자로부터 형광 단백질 수용자로의 에너지 전달을 반영한다.
유세포분석 염색
인간 FcγRI(NM_000566)(서열 번호 59), FcγRIIA(NM_021642)(서열 번호 60), FcγRIIB(NM_004001)(서열 번호 61), 및 FcγRIIIA(NM_000569)(서열 번호 62)(Origene)를 암호화하는 cDNA를 발현하는 플라스미드를 ExpiFectamine 293 트랜스펙션 키트(Life Technologies)에 의해 Expi293F 세포 내로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48 시간에 유세포분석 검정을 수행하였다. 트랜스펙션된 Fc 수용체의 발현을 확인하기 위해, 그들의 특이적 항체, FcγRI에 대한 10.1(BD Pharmingen), FcγRIIA에 대한 IV.3(StemCell Technologies), FcγRIIB에 대한 2B6(자체 제조)(문헌[Veri et al. (2007) Immunology 121: 392-404]), 및 FcγRIIIA에 대한 3G8(BD Pharmingen)을 양성 대조군으로서 유세포분석 염색에 사용하였다. Raji 세포(ATCC: CCL-86)를 또한 사용하여 FcγRIIB 수용체에 대한 항-OX40 항체의 결합을 시험하였다.
웰 당 2×105개의 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, BSA 염색 완충액(미국 산호세 소재의 BD Biosciences) 중에 30 분 동안 4℃에서 차단하였다. 세포를 얼음 상에서 1.5 시간 동안 4℃에서 시험 항체와 함께 인큐베이션하였다. BSA 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 R-PE 표지된 항-인간 또는 항-마우스 IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories)와 함께 45 분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충액 중에 2회 세척한 후, 1:200으로 희석된 DRAQ7 생/사(live/dead) 염색(미국 댄버스 소재의 Cell Signaling Technology)을 함유하는 염색 완충액 150 μL 중에 재현탁시켰다. 염색된 세포의 PE 및 DRAQ7 신호를, 각각 B2 및 B4 채널을 사용하여 Miltenyi MACSQuant 유세포분석기(미국 어번 소재의 Miltenyi Biotec)에 의해 검출하였다. 살아있는 세포를 DRAQ7 배제에 대해 게이팅(gate)하였고, 수집한 10,000개 이상의 살아있는 이벤트에 대해 기하 평균 형광 신호를 결정하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 분석에 사용하였다. 데이터는 항체 농도 대 평균 형광 신호의 로그함수로서 플로팅하였다. GraphPad Prism 6(GraphPad Software, Inc.)에 의해 비선형 회귀 분석을 수행하고 EC50 값을 계산하였다.
서열 번호 59
서열 번호 60
서열 번호 61
서열 번호 62
HEK-Blue NF-ΚB 리포터 검정
NF-κB-유도성 프로모터(IFN-β 최소 프로모터)의 제어 하에 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 HEK-Blue™ Null 1 세포 내로 OX40 발현 플라스미드(pUNO1-hOX40)를 트랜스펙션시킴으로써, 인간 OX40(HEK-Blue: OX40)을 발현하는 안정한 HEK-Blue 리포터 세포주를 확립하였다. 리포터 검정을 위해, 200 μl의 배양 배지 중에 재현탁된 1×105개의 HEK-Blue: OX40 세포를 96-웰 검정 플레이트의 각각의 웰에 분취하고 OX40 리간드 또는 항-OX40 항체를 첨가하였다. 가교결합 효과를 시험하기 위하여, 1 μl의 단백질 G 자기 비드(Pierce) 또는 1×105개의 Raji 세포를 동일한 검정 웰에 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후에, Quanti-Blue 검출 키트(Invivogen)를 사용하여 유도된 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자 발현을 정량화함으로써, 항체의 효능적 활성을 평가하였다. 약술하면, 40 μl의 세포 배양 상청액을 160 μl의 Quant-Blue 시약과 혼합하고, 적절한 청색 색상이 발생할 때까지 37℃에서 인큐베이션하였다. SpectraMax 마이크로플레이트 판독기(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 Molecular Devices)를 사용하여 650 nm에서 OD를 측정하였다. 항-OX40 항체의 효능적 활성을 1 ㎍/mL의 OX40 리간드에 의해 유도된 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하였다.
ADCC 검정
제조업체(Promega)에 의해 지시되는 바와 같이 ADCC 리포터 생물검정에 의해 항-OX40 항체의 ADCC 활성을 평가하였다. 약술하면, 96-웰 플레이트 내에 하룻밤 플레이팅된 웰 당 25,000개의 HEK-Blue: OX40 세포를, FcγRIIIA 수용체의 활성화가 루시퍼라제 리포터의 발현을 유발하는 조작된 이펙터 세포와 혼합하였다. 항-OX40 항체를 세포에 첨가하고, 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Bio-Glo 루시퍼라제 시약을 첨가하고, 루시퍼라제 신호를 Envision에 의해 정량화하였다. 시험 항체가 첨가되지 않은 것에 대한 루시퍼라제 신호의 활성화의 배수로서 항-OX40 항체의 ADCC 활성을 표현하였다.
CDC 검정
항-OX40 항체의 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 보체-매개 세포 살해 검정에 의해 평가하였다. 약술하면, 100,000개의 HEK-Blue: OX40 세포를 토끼 보체(Cedar Lane Labs) 및 시험 항-OX40 항체와 함께 1 시간 동안 96-웰 플레이트 내에서 인큐베이션하였다. 용해된 HEK-Blue: OX40 세포의 세포질로부터 상청액 내로 방출된 락테이트 탈수소효소(LDH)의 활성을 세포독성 검출 키트(Roche)에 의해 정량화하였다. 보체-매개 세포독성은 Triton X-100에 의해 용해된 것에 대한 퍼센트 세포독성으로서 표현하였다.
ADCP 검정
터보 GFP 형질도입 입자(Sigma Aldrich)로 HEK-Blue: OX40 세포를 감염시킴으로써 GFP를 발현하는 OX40 표적 세포주를 확립하였다. 안정한 GFP-발현 세포를 퓨로마이신으로 선택하였다. CD16 고갈이 없는 음성 인간 단핵구 농축 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 PBMC(Biologics Specialty)로부터 인간 CD14+CD16+ 단핵구를 단리하였다. 단리된 단핵구를 10% FBS를 함유하는 X-VIVO-10 배지(Lonza) 중에 플레이팅하고, 25 ng/mL의 대식세포 콜로니-자극 인자(R&D Systems)를 7 일 동안 첨가함으로써 단핵구로부터 대식세포를 분화시켰다. IFNγ(50 ng/mL; R&D Systems)를 분화의 최종 24 시간 동안 첨가하였다. ADCP 검정을 위해, 96-웰 U-바닥 플레이트에서 200 μl의 배지(DMEM + 10% FBS) 중에 1 × 105개의 세포/웰의 분화된 대식세포를 0.25 × 105개의 세포/웰의 GFP-발현 HEK-Blue: OX40 세포(4 : 1 비)와 혼합하였다. 시험 항체를 첨가하고 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Accutase(Sigma)를 사용하여 세포를 탈착시키고 BSA 염색 완충액 중에 재현탁시켰다. Alexa Fluor 647(Invitrogen)에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체(BD Biosciences)로 대식세포를 염색하였다. Miltenyi MACSQuant 유세포분석기(미국 오번 소재의 Miltenyi Biotec)를 사용하는 유세포분석에 의해 GFP 양성 HEK-Blue: OX40 표적 세포 및 Alexa647 양성 대식세포를 확인하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 사용하여 데이터를 분석하고, 하기 수학식을 사용하여 GFP 형광의 감소를 측정함으로써 ADCP-매개 세포 살해를 결정하였다: 살해된 표적 세포의 백분율=((최저 농도의 항체를 갖는 GFP+, CD11b-, CD14- 세포의 백분율)―(시험 농도의 항체를 갖는 GFP+, CD11b-, CD14- 세포의 백분율))/(최저 농도의 항체를 갖는 GFP+, CD11b-, CD14- 세포의 백분율)×100.
실시예 4 단독 또는 조합 K248E, K338A, 및 T437R 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 특성화
항체 효능작용
최근의 연구는 FcγRIIB가 가교결합 활성을 제공하고 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 촉진할 수 있음을 나타냈다(문헌[Li et al. (2012) Cell Cycle 11: 3343-4]). 따라서, 생성된 항체 OX4020E5IgG1K248E, OX4020E5IgG1T437R, OX4020E5IgG1K338A, OX4020E5IgG1T437R/K248E, OX4020E5IgG1T437R/K338A, 및 OX4020E5IgG1K248E/K338A의 효능적 특성에 대한 돌연변이 K248E, K338A, 및 T437R의 단독 또는 조합 효과(표 3에 나타낸 바와 같음)를 용액 중에, 그리고 인간 B 림프아구성 Raji 세포와 가교결합시킨 후에 시험하였으며, 이는 대부분 HEK-Blue™ 리포터 검정에서 FcγRIIB를 발현한다(문헌[Rankin et al. (2006) Blood 108: 2384-91]).
도 2a는, OX40 리간드(OX40L)에 대한 퍼센트(%) 활성으로서 평가된, 용액 중의 단독으로 돌연변이된 항체 OX4020E5IgG1K248E, OX4020E5IgG1T437R, 및 OX4020E5IgG1K338A의 효능적 활성을 나타낸다. 모든 항체는 용액 중에 효능작용을 나타냈다. Daudi 세포와의 가교결합은 효능작용을 더 증가시켰으며, T437R 돌연변이를 갖는 항체는 최고 효능적 활성을 나타낸다(도 2b). 모든 이중 돌연변이된 항체 OX4020E5IgG1T437R/K248E, OX4020E5IgG1T437R/K338A, 및 OX4020E5IgG1K248E/K338A는 용액 중의 야생형 IgG1 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 나타냈다(도 2c). 야생형 항체 OX4020E5IgG1에 대해 관찰된 더 높은 수준에서(도 2f), Daudi 세포와 가교결합될 때 OX4020E5IgG1T437R/K248E(도 2d) 및 OX4020E5IgG1T437R/K338A(도 2e)에 대해 효능적 활성이 실질적으로 향상되었다. OX4020E5IgG1T437R을 Daudi 세포와 가교결합시키는 것 또한 그 항체의 효능적 활성을 향상시켰다(도 2g).
제2 항-OX40 항체 SF2의 VH/VL 영역(VH: 서열 번호 51, VL: 서열 번호 52)을 단독으로 또는 조합하여 돌연변이된 Fc 도메인 상에서 조작하여 항체 OX40SF2IgG1T437R, OX40SF2IgG1T437R/K248E, 및 OX40SF2IgG1T437R/K338A를 생성하였다. 용액 중에, 그리고 Daudi 세포와의 가교결합시에, 이들 항체를 그들의 효능작용에 대해 시험하였다. 조작된 20E5 항체와 유사하게, T437R 또는 T437R/K248E 및 T437R/K338A 돌연변이를 갖는 SF2-유래 항체는 용액 중의 야생형 모 항체에 비교할 때 향상된 효능작용을 가졌다(즉, 가교결합 독립적 효능작용)(도 3a). Daudi 세포와의 가교결합은 OX40SF2IgG1T437R(도 3b) 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E(도 3c)의 효능작용을 향상시켰다.
FcγRIIB를 발현하는 B 세포로부터 유래된 다른 세포주인 Raji 세포와 항체를 가교결합시켰을 때, 조작된 항-OX40 SF2 항체에 대한 효능작용의 유사한 부스팅 효과가 관찰되었다. 항-FcγRIIB 항체 2B6이 OX40SF2IgG1T437R(도 4a) 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E(도 4b)에 대한 효능작용에서 Raji-세포 매개 부스팅을 차단하였으므로, 가교결합은 FcγRIIB-매개인 것으로 확인되었다.
항체 다량체화
용액 중의 조작된 항-OX40 SF2 항체의 응집 상태를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가하였다. 약술하면, 항체를 TSKgel G3SW 컬럼(Tosoh Bioscience LLC) 상에 주입하고, 그들의 크기를 크로마토그래피에 의해 해상하였다. Fc 돌연변이를 갖는 조작된 항체는 천연 IgG1 Fc를 갖는 항체와 유사하게 약 8.5 분에서 용출된 주요 단백질 피크를 가졌으며, 이는 용액 중의 조작된 항체의 우세한 단량체 형태를 나타낸다. 항체 중 일부는 항체의 올리고머 형태일 수 있는 작은 분율(< 5%)의 고분자량 단백질 피크를 나타냈다.
조작된 항체가 세포 표면에서 항원에 결합할 때 다량체화되는지 여부를 평가하기 위하여, 조작된 항-OX40 SF2 항체 상에서 NanoBRET 단백질-단백질 상호작용(PPI) 검정(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)을 수행하였다. 천연 IgG1을 갖는 SF2 항체 및 T437R, T437R/K248E, 또는 E345R 돌연변이를 갖는 SF2 항체를 각각 공여자 및 수용자로서 경쇄의 C-말단에 부착된 Nanoluc 태그 또는 Halotag를 갖도록 추가로 조작하였다. OX40을 안정적으로 발현하는 HEK-Blue™ 세포에 공여자 및 수용자 항체를 적용함으로써 NanoBRET PPI 검정을 수행하였다. 계산된 보정된 NanoBRET 비는 다량체화된 항체의 회합을 반영한다.
태깅된 항체는 리포터 검정에서 상응하는 비-태그된(un-tagged) 항체와 유사한 기능적 활성을 나타내었으며, 이는 경쇄에서의 태그가 항체의 기능적 특성에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. NanoBRET PPI 분석에서, OX40SF2IgG1 및 OX40SF2IgG1T437R은 배경 보정된 NanoBRET 비를 나타냈다(도 5). 반면에, OX40SF2IgG1T437R/K248E 중 어느 하나를 갖는 SF2 항체는 10 ng/mL 내지 1000 ng/mL의 농도에 걸쳐 훨씬 더 높은 보정된 NanoBRET 비를 나타냈으며(도 5), 이는 항체가 세포 표면에서 다량체화됨을 나타낸다.
다양한 FcγR에 결합하는 항체
일시적으로 트랜스펙션된 Expi293F 세포 상에서 발현된 다양한 FcγR 수용체에 대한 조작된 항-OX40 SF2 항체의 결합을 실시예 3에 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 평가하였다.
돌연변이 T437R 또는 K248E 중 어느 것도 FcγRI 또는 FcγRIIIA에 대한 변이체 항체의 결합에 영향을 미치지 않았으며, 이는 용액 중의 단량체 OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E 항체가 야생형 항체 OX40SF2IgG1에 비교할 때 유사한 결합 특성으로 이들 수용체에 결합했기 때문이다. 항체는 또한, OX40SF2IgG1에 비교할 때 FcγRIIA 및 FcγRIIB에 대한 유사한 결합 효능을 나타냈다. 표 4는 결합에 대한 EC50 값을 나타낸다. FcγRIIB를 발현하는 B 세포주인 Raji 세포에 대한 조작된 항-OX40 SF2 항체의 결합을 또한 유세포분석에 의해 평가하였다. FcγRIIB의 발현이 FcγRIIB 항체 2B6에 의해 검출될 수 있지만, 조작된 항-OX40(SF2) 또는 OX40SF2IgG1 항체 중 어느 것도 Raji 세포에 대한 유의적인 결합을 갖지 않은 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 이소성으로(ectopically) 트랜스펙션된 세포에 비교하여 Raji 세포에서의 FcγRIIB의 더 낮은 발현에 기인한다(데이터는 나타내지 않음).
[표 4]
Figure 112019023173897-pct00107
실시예 5. 이펙터 침묵 형태로 조작된 항-OX40 항체의 특성화
실시예 3에 기재되고 특성화된 방법에 따라 다양한 항체를 이펙터 침묵 Fc 동형 상에 클로닝하고, 발현시키고, 정제하고, 특성화하였다. 생성된 항체는 표 5에 나타나 있다.
[표 5]
Figure 112019023173897-pct00108
항체 응집
용액 중의 조작된 항체의 응집 상태를 실시예 3에 기재된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가하였다. 조작된 항체는 천연 IgG1 Fc를 갖는 상응하는 항체와 유사하게 약 8.5 분에서 용출된 주요 단백질 피크를 가졌으며, 이는 용액 중의 조작된 항체의 우세한 단량체 형태를 나타낸다. 이들 중 일부, 주로 IgG4PAA 항체는, 항체의 올리고머 형태일 수 있는 작은 분율(<3%)의 고분자량 단백질 피크를 나타냈다.
T437R/K248E 돌연변이는 Fc 이펙터 기능 침묵 항체에서 효능작용을 구조한다
용액 중의, 또는 Raji 세포와 가교결합된 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정을 사용하여 OX40SF2IgG2sigma, OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E, OX40SF2IgG4PAA, 및 OX40SF2IgG4PAA/T437R/K248E의 효능적 활성을 평가하였다. OX40SF2IgG2sigma 또는 OX40SF2IgG4PAA 중 어느 것도 용액 중에서 효능적 활성을 갖지 않은 반면에, T437R/K248E 돌연변이는 OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E 및 OX40SF2IgG4PAA/T437R/K248E 둘 모두에서 효능작용을 구조하였다(도 6). Raji 세포와의 가교결합은 효능적 활성의 부스팅에 있어서 최상의 경우에도 미약했다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 6. 조작된 항체의 이펙터 기능
ADCC, ADCP, 및 CDC를 매개하는 T437R 또는 T437R/K248E 돌연변이를 갖는 조작된 항-OX40 항체의 능력을 실시예 3에 기재된 바와 같이 평가하였다.
OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E 둘 모두는 야생형 항체 OX40SF2IgG1에 비교할 때 개선된 효능으로 ADCC를 매개하였다(도 7). OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E 및 OX40SF2IgG4PAA/T437R/K248E 둘 모두가 ADCC를 매개하지 못하는 상태로 유지되었으므로, 이미 이펙터 침묵인 항체에서 돌연변이는 ADCC를 구조하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E 둘 모두는 야생형 OX40SF2IgG1에 의해 매개되는 것과 유사한 수준으로 ADCP를 매개하였다(도 8). OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E는 또한 야생형 항체 OX40SF2IgG1에 비교할 때 개선된 효능으로 CDC를 매개하였다(도 9a). OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E에 대한 ADCP 활성이 OX40FS2IgG2sigma에 대해 관찰된 것에 비해 더 높은 농도에서 상승되었으므로, 이미 이펙터 침묵인 항체에서 돌연변이는 ADCP를 부분적으로 구조하였다(도 9b).
실시예 7. Tg32 반접합성 마우스에서 T437R 및 T437R/K248E 돌연변이를 갖는 항체의 약물동태학적 특성
방법 18 마리의 Tg32 반접합성 마우스(Jackson Labs)에 시험 항체(OX40SF2IgG1T437R, OX40SF2IgG1T437R/K248E, 또는 OX40SF2IgG1)를 2 mg/㎏의 용량으로 그룹 당 5 마리의 동물에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 주사 후 1 시간, 1 일, 3 일, 7 일, 14 일, 및 21 일에 시점들을 취하였다. 표시된 시점에서 CO2-마취된 마우스로부터 일련의 후안와 채혈이 얻어졌고, 최종 채혈은 심장 천자에 의해 얻어졌다. 실온에서 30 분 후에, 혈액 샘플을 2500 rpm에서 15 분 동안 원심분리하고, 분석을 위해 혈청을 수집하였다.
혈청 샘플 중의 인간 IgG 농도를 전기화학발광 면역검정에 의해 결정하였다. Streptavidin Gold multiarray 96-웰 플레이트(Meso Scale Discovery)를 50 μL/웰의 5 ㎍/mL 비오티닐화 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch #109-055-088)로 4℃에서 하룻밤 코팅하고, 0.05% Tween을 갖는 트리스-완충 식염수로 세척하였다. 혈청 샘플 및 표준품을 Starting Block(Thermo Scientific) 중에 희석하고, 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 진탕기 상에서 2 시간 동안 Sulfo-TAG 표지된 마우스 항-인간 Fc 항체, R10Z8E9를 1.5 ㎍/mL로 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. 플레이트를 세척하고, 판독 완충액 T(Meso Scale Discovery)를 첨가하고 MSD Sector Imager 6000 상에서 플레이트를 판독하였다.
시험 샘플의 PK에 영향을 줄 수 있는 현저한 면역 역가를 PK 혈청 샘플이 가졌는지 여부를 결정하기 위하여, 하룻밤 10 ㎍/mL, 4℃에서 각각의 시험 품목으로 코팅된 96-웰 플레이트(Nunc Maxisorb #446612) 상에서 ELISA를 수행하였다. 혈청 샘플을 1% BSA-PBS 중에 희석하고 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 당나귀 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 포획된 항체를 검출하였으며; 이어서, 기질 발생을 위해 OPD 또는 TMB를 첨가하였다. 플레이트를 판독하고 완충액 또는 대조군 혈청 값보다 3배 더 큰 분광광도계 판독치를 양성으로 간주하였으며, 1:1 배수-희석으로서 표현하였다.
Prism 버전 6.02 소프트웨어(GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 자연 로그 농도 대 시간의 선형 회귀에 의해 적합시킨 1-단계 지수 감쇠 모델(1-phase exponential decay model)을 사용하여 PK 연구에 대한 제거 단계의 최종 반감기(t1/2) 계산을 결정하였다. 최소 제곱 비선형 감쇠 모델에 1/적합시킨 농도에 의해 가중치를 주었다. 제거 단계의 반감기 계산은 수학식 t1/2= ln2/β를 사용하여 결정하였으며, 여기서 β는 최초 투여 후에 시작하여 최소 제곱 회귀 분석에 의해 적합시킨 선의 -기울기이다. 항체에 대한 최종 반감기 값은 시험군 내의 각각의 동물에 대해 계산된 t1/2 값의 평균을 취함으로써 결정하였다.
결과
항체의 혈청 IgG 농도 대 시간 프로파일은 반로그 플롯 상에서 시간에 따른 감소를 나타낸다(도 10). 동물의 면역 반응을 시험하였다. OX40SF2IgG1T437R/K248E를 투여한 마우스는 7 일, 14 일, 및 21 일에 유의적인 면역 역가(1:1000 내지 1:14,000)를 나타냈다.
혈청 수준을 곡선의 선형 단계의 최초 시점에 대해 정규화하여, 항체의 PK 프로파일 사이의 차이를 강조하였다. 1 시간의 최초 시점은 마우스가 완전히 투여되었음을 나타냈다. 3 개 이상의 데이터 점을 갖는 동물만을 사용하였고, 면역 역가를 갖는 7 일, 14 일 또는 21 일에서의 동물로부터의 값은 배제하였다.
결과는 T437R 돌연변이를 함유하는 항체가 야생형 항체의 반감기에 비교하여 더 짧은 반감기를 가졌음을 나타냈다. 다양한 항체에 대한 반감기 값은: t1/2= 3.9± 2.1 일인 OX40SF2IgG1T437R; t1/2 = 2.4 ± 0.8 일인 OX40SF2IgG1 T437RK248E, 및 t1/2 = 11.3 ± 1.1 일인 OX40SF2IgG1이었다.
요약하면, PK 연구는 OX40SF2IgG1T437 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E 반감기 값이 11 일의 반감기를 갖는 야생형 IgG1 항체의 반감기에 비교할 때 3 내지 4 배 더 짧았음을 나타냈으며, 이는 마우스 연구에 있어서 정상 범위 내에 있다. 그러나, 혈청 IgG 수준에 유의적으로 영향을 미친 시험 동물, 특히 OX40SF2IgG1T437R/K248E에 대한 그룹에서의 면역 반응에 의해 PK 결과의 해석이 복잡해졌다. 이들 마우스에서 관찰된 임의의 면역 반응은 인간에서 예상되는 것에 상응하지 않으므로, 마우스에서 관찰된 더 짧은 반감기 값은 정상 인간 IgG 순환 혈청 반감기를 반영하지 않을 수 있다.
실시예 8. IgG2 및 IgG4 동종형과 관련하여 항체 다량체화 및 효능작용에 대한 K248E 및 T437R 돌연변이의 효과의 구조적 합리화
IgG1과 IgG2 사이, IgG1과 IgG3, 및 IgG1과 IgG4 사이의 서열 차이를, 그들의 CH3 도메인을 통해 다량체 모델에 정렬된 IgG2 Fc 및 IgG4 Fc의 결정 구조 상에 각각 맵핑하였다. 서열 차이의 위치는 K248 및 T437 둘 모두의 위치로부터 구조적으로 떨어져 있는 것으로 확인되었다. IgG1과 유사하게, 상기 기술된 방식에 의한 IgG2 및 IgG4 Fc 구조의 정렬은 병치된 Fc 도메인들의 CH2 도메인들 사이에 충돌을 유발하였으며, 이는 Fc 도메인들이 다량체 모델에서와 같이 패킹되기 위하여 이들 도메인들이 그들의 관찰된 입체배좌에 대해 재배향되어야 할 것임을 시사한다. IgG1의 경우, CH2 도메인 내의 K248과 K248E 돌연변이를 갖는 CH3 도메인 내의 E380 사이의 분자내 염 가교 상호작용의 붕괴는 CH2:CH3 계면을 약화시켜 CH2 도메인의 재배향 및 다량체화를 용이하게 한다는 가설이 제기되었다. 이러한 염 가교 상호작용은 IgG2 및 IgG4의 구조에서 보존되므로; K248E 돌연변이의 도입은 IgG1에서와 유사하게 기능한다는 가설이 제기될 것이다. 추가로, 다량체 모델에서 Fc-간 CH3:CH3 계면의 잔기는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 사이에서 보존되므로, IgG1에 대한 원래의 가설과 같이 IgG2, IgG3, 또는 IgG4 내로 도입된 T437R 돌연변이는 이웃하는 Fc 내의 E382와의 염 가교 상호작용을 형성함으로써 이러한 계면을 강화한다는 가설이 제기된다. 종합하면, K248E 및 T437R 돌연변이가 IgG 아형(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)에 독립적으로 항-TNFR 항체를 다량체화하고 그의 효능작용을 향상시키는 것으로 실험적으로 확인된다는 것은 구조 모델링으로부터 이루어진 관찰과 일치한다. 이들 돌연변이가 Fc-FcRn 결합 계면 부근에 있지만, 이들 잔기는 FcRn에 직접 접촉하지 않는다(문헌[Martin et al. (2001) Mol Cell 7: 867-77]).
실시예 9. FcRn 유전자도입 SCID 마우스에서 T437R/K248E 돌연변이를 갖는 항체의 약물동태학적 특성
방법 항체 PK 연구를 위해, 4 내지 8 주령의 자성 Tg32 동형접합성 SCID 마우스(스탁 018441, Jackson Laboratory)에 시험 항체를 2 mg/㎏의 용량으로 그룹 당 5 마리의 동물에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 표시된 시점에서 CO2-마취된 마우스로부터 일련의 후안와 채혈이 얻어졌고, 최종 채혈은 심장 천자에 의해 얻어졌다. 실온에서 30 분 후에, 혈액 샘플을 3,000 x g로 15 분 동안 원심분리하고, 분석을 위해 혈청을 수집하였다. PK 연구는 Janssen Research & Development, LLC에서 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.
전기화학발광 면역검정을 사용하여 마우스 혈청 중의 인간 IgG를 결정하였다. Starting Block T20(Thermo Scientific) 중의 50 μL/웰의 2.5 ㎍/mL 바이오티닐화 염소 항 인간 IgG F(ab')2 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories)로 Streptavidin Gold 96 웰 플레이트(Meso Scale Diagnostics)를 4oC에서 하룻밤 코팅하였다. 플레이트를 0.5% Tween 20을 갖는 트리스-완충 식염수(TBST)로 세척하고; 2% 소 혈청 알부민-TBST 중에 희석된 샘플 및 표준품을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 항-인간 Fcγ-범 항체인 Sulfo-TAG 표지된 R10Z8E9를 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. 플레이트를 세척하고, 200 μL의 MSD 판독 완충액을 첨가하고, MSD Sector Imager 6000(Meso Scale Diagnostics) 상에서 플레이트를 판독하였다. GraphPad Prism 6(GraphPad Software)에서 5-파라미터 비선형 회귀 프로그램을 사용하여 표준 곡선으로부터 Ab의 혈청 농도를 결정하였다.
GraphPad Prism 6 (GraphPad Software)를 사용하여 자연 로그 농도 대 시간의 비선형 회귀에 의해 적합시킨 1-단계 지수 감쇠 모델을 사용하여 PK 연구에 대한 제거 단계(β 단계)의 최종 반감기(t1/2) 계산을 결정하였다. 제거 단계(β 단계)의 반감기는 수학식 t1/2 = ln2/β를 사용하여 계산하였으며, 여기서 β는 1 일 후에 시작하여 최소 제곱 회귀 분석에 의해 적합시킨 선의 음성 기울기이다. 최종 항체 반감기 값은 시험군 내의 t1/2 값의 평균이었다. 각각의 항체 대 IgG1에 대한 값을 T-검정에 의해 비교하였으며, 0.05 미만의 p 값은 유의적인 차이를 나타냈다.
결과
제2 PK 연구를 수행하여, FcRn 유전자도입 SCID(중증 조합 면역결핍) 마우스에서 OX40SF2IgG1T437R 및 OX40SF2IgG1T437R/K248E를 평가하였으며, 이들은 기능성 B 및 T 림프구가 결핍되어 있으므로 시험 항체에 대한 최소 면역 반응을 갖는다. Tg32 동형접합성 SCID 마우스(5 마리의 마우스/그룹)에 2 mg/㎏ 용량의 항체를 정맥내 주사하였다. 주사 후 1 시간, 및 1, 3, 7, 14, 및 21 일에 각각의 동물로부터 일련의 후안와 채혈을 얻었다. 혈청을 제조하고, 전기화학발광 면역검정에 의해 인간 IgG의 양을 결정하였다. 각각의 항체에 대한 평균 혈청 농도를 도 11에 나타냈다. 모든 샘플에 있어서, 21 일의 과정에 걸쳐 혈청 농도의 선형 감소가 있었으며, 시험군 사이에서 유의적인 차이(p <0.05)가 관찰되지 않았다. 반감기 값, t1/2을 하기와 같이 추정하였다: OX40SF2IgG1T437R, t1/2 = 9.5 ± 0.7 일; OX40SF2IgG1T437R/K248E, t1/2 = 8.3 ± 0.5 일; OX40SF2IgG1, t1/2 = 9.2 ± 0.6 일. 이들 데이터는 천연 IgG1 Fc에 의한 것과 유사한 조작된 항체의 PK 프로파일을 규명하였다.
이러한 PK 연구에서 SCID 마우스의 사용은, 비-SCID 마우스를 사용하는 이전의 PK 연구에서의 결과를 복잡해지게 한 시험 항체에 대한 마우스 면역 반응을 유의적으로 감소시켰다. 따라서, SCID 마우스에서 관찰된 유사한 PK 프로파일은 정상 인간 IgG 순환 혈청 반감기를 반영할 것이다.
실시예 10. FcRn에 대한 조작된 항체의 결합
방법 FcRn에 대한 경쟁적 결합의 시험관내 검정
경쟁 결합 검정을 사용하여 폴리-히스티딘 친화성 태그(FcRn-His6)를 갖는 재조합 인간 FcRn 세포외 도메인에 대한 상이한 항체 샘플의 상대적인 친화성을 평가하였다. 96-웰 구리-코팅된 플레이트(Thermo Scientific)를 사용하여 PBS 중 5 ㎍/mL에서 FcRn-His6을 포획하였고, 그 후에 플레이트를 0.15 M NaCl, 0.02% Tween 20 으로 세척한 후, 차단 시약(0.05 M MES [2-(N-모폴리노)에탄설폰산], 0.025% 소 혈청 알부민(BSA), 0.001% Tween-20, pH 6.0, 10% chemiBLOCKER(Millipore))과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척한 후, 고정된 1 ㎍/mL 농도의 지시제 항체(비오티닐화된 인간 IgG1 단일클론 항체)의 존재 하에 차단 시약 중의 경쟁자 시험 항체의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 상기와 같이 3회 세척한 후, 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)의 1:10,000 희석액과 함께 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하여 비오티닐화 항체를 결합시켰다. 플레이트를 상기와 같이 5회 세척하고, 안정한 정지(stable stop)를 갖는 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 퍼옥시다제 기질(Fitzgerald Industries International)을 첨가하고 4 분 동안 인큐베이션함으로써 결합된 스트렙타비딘-HRP를 검출하였다. 0.5 M HCl의 첨가에 의해 발색을 정지시켰다. 450 nm 파장에서 SpectraMax Plus384 플레이트 판독기(Molecular Devices)로 광학 밀도를 결정하였다.
결과
T437R 및 K248E 돌연변이가 둘 모두 FcRn 수용체에 대한 알려진 결합 부위에 근접하여 위치되므로, 시험관내 경쟁 결합 검정을 사용하여, 본 발명자들의 변이체 항체와 FcRn의 적당한 상호작용으로 이들 돌연변이에 의한 방해 가능성를 평가하였다. FcRn 결합에 대해 비오티닐화 인간 IgG1과 경쟁함에 있어서, OX40SF2IgG1T437R/K248E 및 OX40SF2IgG1T437R 둘 모두는 OX40SF2IgG1(IC50: 1.5 ㎍/ml)에 비해 외견상 유사한 효능(IC50: 각각 1.6 ㎍/ml 및 1.1 ㎍/ml)을 나타냈으며, 이는 FcRn 결합에 대한 조작된 돌연변이의 외견상 영향이 없거나 거의 없음을 나타낸다. 이러한 결과는, PK를 변화시키는 다른 잠재적인 영향의 부재 하에, T437R 및 K248E 돌연변이가 혈청 반감기에 유의적인 영향을 미치지 않을 것임을 예측하였다.
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gaccatttcc 660 aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag gtgtataccc tgcctcccag cagagaggag 720 atgaccaaga accaggtgag cctcacctgc ctggtcaagg gattctaccc ctccgacatc 780 gccgtggaat gggaaagcaa cggccagccc gagaataact acaagaccac ccctcctgtg 840 ctggattccg acggctcctt ctttctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggca atgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacagg 960 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaaa 990 <210> 79 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA encoding IgG1sigma T437R/K248E <400> 79 gccagcacca agggcccaag cgtgtttccc ctggccccta gcagcaagag cacctccggc 60 ggaacagctg ctctgggctg cctggtgaaa gattacttcc ccgaacccgt gaccgtgtcc 120 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cataccttcc ctgctgtgct gcagagcagc 180 ggactgtaca gcctgtccag cgtggtgacc gtgcccagca gctccctggg aacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 300 aagagctgcg ataagacaca cacctgcccc ccctgtcctg ctcctgaagc tgccggcgct 360 agcagcgtgt ttctgttccc ccctaagccc gaggacacac tgatgatcag cagaaccccc 420 gaggtgacat gtgtggtggt ggacgtgtcc gctgaggacc ccgaggtcaa gtttaactgg 480 tacgtcgatg gcgtggaggt gcataacgcc aaaaccaagc ctagggagga gcagtacaac 540 agcacctaca gagtggtctc cgtcctcacc gtgctccatc aggactggct gaacggcaag 600 gagtataagt gcaaagtgag caacaaggcc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatttcc 660 aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag gtgtataccc tgcctcccag cagagaggag 720 atgaccaaga accaggtgag cctcacctgc ctggtcaagg gattctaccc ctccgacatc 780 gccgtggaat gggaaagcaa cggccagccc gagaataact acaagaccac ccctcctgtg 840 ctggattccg acggctcctt ctttctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggca atgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacagg 960 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaaa 990 <210> 80 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA encoding IgG1sigma T437R/K338A <400> 80 gccagcacca agggcccaag cgtgtttccc ctggccccta gcagcaagag cacctccggc 60 ggaacagctg ctctgggctg cctggtgaaa gattacttcc ccgaacccgt gaccgtgtcc 120 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cataccttcc ctgctgtgct gcagagcagc 180 ggactgtaca gcctgtccag cgtggtgacc gtgcccagca gctccctggg aacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 300 aagagctgcg ataagacaca cacctgcccc ccctgtcctg ctcctgaagc tgccggcgct 360 agcagcgtgt ttctgttccc ccctaagccc aaggacacac tgatgatcag cagaaccccc 420 gaggtgacat gtgtggtggt ggacgtgtcc gctgaggacc ccgaggtcaa gtttaactgg 480 tacgtcgatg gcgtggaggt gcataacgcc aaaaccaagc ctagggagga gcagtacaac 540 agcacctaca gagtggtctc cgtcctcacc gtgctccatc aggactggct gaacggcaag 600 gagtataagt gcaaagtgag caacaaggcc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatttcc 660 gctgccaagg gccagcctag ggagcctcag gtgtataccc tgcctcccag cagagaggag 720 atgaccaaga accaggtgag cctcacctgc ctggtcaagg gattctaccc ctccgacatc 780 gccgtggaat gggaaagcaa cggccagccc gagaataact acaagaccac ccctcctgtg 840 ctggattccg acggctcctt ctttctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggca atgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacagg 960 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaaa 990 <210> 81 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA encoding IgG2sigma T437R <400> 81 gccagcacca agggcccatc cgtgtttccc ctggctccct gtagcaggtc caccagcgag 60 agcacagccg ccctgggatg tctggtgaag gactatttcc ccgaacctgt gaccgtcagc 120 tggaacagcg gcgctctgac aagcggcgtg cacacatttc ccgccgtgct gcagtccagc 180 ggcctgtaca gcctgtccag cgtggtgacc gtgcctagca gcaatttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtggacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagac cgtggagagg 300 aagtgctgcg tggaatgccc tccctgtcct gctcctcctg ctgctgccag ctccgtgttc 360 ctgttccccc ccaaacccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccctga ggtcacctgt 420 gtggtggtgg acgtgagcgc cgaggatccc gaggtgcagt ttaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc acaacgccaa gacaaagccc agggaggaac agttcaacag caccttcagg 540 gtggtctccg tgctgaccgt gctgcatcag gactggctga acggcaagga gtacaaatgc 600 aaggtgagca ataagggcct ccccagcagc atcgaaaaga ccatcagcaa aaccaagggc 660 cagcctagag agccccaggt gtacacactc cctccctcca gggaggagat gaccaagaac 720 caggtgagcc tcacctgcct ggtgaaaggc ttctacccca gcgatatcgc cgtggagtgg 780 gagtccaatg gccagcccga gaataactac aaaaccaccc cccccatgct ggacagcgac 840 ggctccttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcagatggca gcagggaaac 900 gtgttctcct gcagcgtgat gcacgaagcc ctgcacaacc attacagaca gaagagcctg 960 agcctgagcc ccggcaag 978 <210> 82 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA encoding IgG2sigma T437R/K248E <400> 82 gccagcacca agggcccatc cgtgtttccc ctggctccct gtagcaggtc caccagcgag 60 agcacagccg ccctgggatg tctggtgaag gactatttcc ccgaacctgt gaccgtcagc 120 tggaacagcg gcgctctgac aagcggcgtg cacacatttc ccgccgtgct gcagtccagc 180 ggcctgtaca gcctgtccag cgtggtgacc gtgcctagca gcaatttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtggacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagac cgtggagagg 300 aagtgctgcg tggaatgccc tccctgtcct gctcctcctg ctgctgccag ctccgtgttc 360 ctgttccccc ccaaacccga ggacaccctg atgatcagca ggacccctga ggtcacctgt 420 gtggtggtgg acgtgagcgc cgaggatccc gaggtgcagt ttaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc acaacgccaa gacaaagccc agggaggaac agttcaacag caccttcagg 540 gtggtctccg tgctgaccgt gctgcatcag gactggctga acggcaagga gtacaaatgc 600 aaggtgagca ataagggcct ccccagcagc atcgaaaaga ccatcagcaa aaccaagggc 660 cagcctagag agccccaggt gtacacactc cctccctcca gggaggagat gaccaagaac 720 caggtgagcc tcacctgcct ggtgaaaggc ttctacccca gcgatatcgc cgtggagtgg 780 gagtccaatg gccagcccga gaataactac aaaaccaccc cccccatgct ggacagcgac 840 ggctccttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcagatggca gcagggaaac 900 gtgttctcct gcagcgtgat gcacgaagcc ctgcacaacc attacagaca gaagagcctg 960 agcctgagcc ccggcaag 978 <210> 83 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA encoding IgG2sigma T437R/K338A <400> 83 gccagcacca agggcccatc cgtgtttccc ctggctccct gtagcaggtc caccagcgag 60 agcacagccg ccctgggatg tctggtgaag gactatttcc ccgaacctgt gaccgtcagc 120 tggaacagcg gcgctctgac aagcggcgtg cacacatttc ccgccgtgct gcagtccagc 180 ggcctgtaca gcctgtccag cgtggtgacc gtgcctagca gcaatttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtggacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagac cgtggagagg 300 aagtgctgcg tggaatgccc tccctgtcct gctcctcctg ctgctgccag ctccgtgttc 360 ctgttccccc ccaaacccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccctga ggtcacctgt 420 gtggtggtgg acgtgagcgc cgaggatccc gaggtgcagt ttaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc acaacgccaa gacaaagccc agggaggaac agttcaacag caccttcagg 540 gtggtctccg tgctgaccgt gctgcatcag gactggctga acggcaagga gtacaaatgc 600 aaggtgagca ataagggcct ccccagcagc atcgaaaaga ccatcagcgc caccaagggc 660 cagcctagag agccccaggt gtacacactc cctccctcca gggaggagat gaccaagaac 720 caggtgagcc tcacctgcct ggtgaaaggc ttctacccca gcgatatcgc cgtggagtgg 780 gagtccaatg gccagcccga gaataactac aaaaccaccc cccccatgct ggacagcgac 840 ggctccttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcagatggca gcagggaaac 900 gtgttctcct gcagcgtgat gcacgaagcc ctgcacaacc attacagaca gaagagcctg 960 agcctgagcc ccggcaag 978 <210> 84 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA encoding IgG4PAA T437R <400> 84 gccagcacca agggcccaag cgtgttccct ctggccccct gtagcaggag caccagcgag 60 tccacagccg ctctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcctgt gaccgtgagc 120 tggaacagcg gagccctgac aagcggagtg 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acggccagcc cgagaacaac tacaagacaa ccccccccgt gctggattcc 840 gacggctcct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agtccaggtg gcaggagggc 900 aatgtgttct cctgtagcgt gatgcacgag gccctccaca atcactacag gcagaagagc 960 ctgagcctgt ccctgggcaa a 981 <210> 86 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4PAA T437R/K338A <400> 86 gccagcacca agggcccaag cgtgttccct ctggccccct gtagcaggag caccagcgag 60 tccacagccg ctctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcctgt gaccgtgagc 120 tggaacagcg gagccctgac aagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcaatcctcc 180 ggactgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgcctagca gcagcctggg aaccaagacc 240 tacacctgca acgtggacca taagcccagc aacaccaagg tggacaagag ggtggagagc 300 aagtacggcc ccccttgtcc tccttgccct gcccctgaag ctgctggagg acccagcgtg 360 ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatta gcaggacccc cgaggtgacc 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggat cccgaggtgc agtttaactg gtacgtggac 480 ggcgtggagg tgcacaacgc taaaaccaaa cccagggagg agcagttcaa cagcacctat 540 agggtggtga gcgtgctcac cgtgctgcac caggactggc 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Claims (56)

  1. 단리된 조작된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체로서, 여기서 상기 항체는 모 야생형 항체에 비교할 때 T437R/K248E 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하고, 여기서 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형인 것인, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 모 야생형 항체에 비교할 때 향상된 효능적(agonistic) 활성을 갖는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 매개하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 항체-의존성 세포 식작용(ADCP: antibody-dependent cell phagocytosis)을 매개하는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 보체-의존성 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity)을 매개하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 제2 돌연변이를 추가로 포함하는 항체.
  7. 제6항에 있어서, 제2 돌연변이가 IgG1 상의 L234A/L235A 돌연변이, IgG2 상의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이, IgG4 상의 F234A/L235A 돌연변이, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A 돌연변이, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 상의 N297A 돌연변이, IgG2 상의 V234A/G237A 돌연변이, IgG1 상의 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이, IgG2 상의 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이, IgG1 상의 L234F/L235E/D265A 돌연변이, IgG1 상의 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이, 또는 IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이인 항체.
  8. 제7항에 있어서, 제2 돌연변이가 IgG2 상의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이인 항체.
  9. 제7항에 있어서, 제2 돌연변이가 IgG1 상의 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이인 항체.
  10. 제7항에 있어서, 제2 돌연변이가 IgG4 상의 S228P/F234A/L235A 돌연변이인 항체.
  11. 제1항에 있어서, TNFR 수퍼패밀리 구성원이 서열 번호 4인 OX40, 서열 번호 8인 CD27, 서열 번호 5인 CD40, 서열 번호 10인 CD137, 또는 서열 번호 23인 GITR인 항체.
  12. 제1항에 있어서, 항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 갖는 항체.
  13. 제1항에 있어서, 서열 번호 64, 69, 70, 또는 71의 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 암이 고형 종양인 것인, 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 고형 종양이 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변인 것인, 약제학적 조성물.
  17. Fc 도메인 내에 T437R/K248E 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하고, 여기서 상기 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형인 것인, 단리된 Fc 도메인 함유 분자.
  18. 제17항에 있어서, 단일클론 항체인 Fc 도메인 함유 분자.
  19. 제17항에 있어서, 서열 번호 64, 69, 70, 또는 71의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인 함유 분자.
  20. a. Fc 도메인 내에 T437R/K248E 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 함유 분자를 암호화하거나;
    b. 서열 번호 64, 69, 70, 또는 71의 Fc 도메인을 암호화하거나;
    c. 서열 번호 76, 79, 82, 또는 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  23. 제21항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. Fc 도메인 함유 분자가 발현되는 조건에서 제23항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 Fc 도메인 함유 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 제17항의 Fc 도메인 함유 분자의 제조 방법.
  25. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  26. 제25항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변인, 암의 치료에 사용하기 위한 항체.
  27. 암의 치료를 위한 약제의 제조에서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체를 사용하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변인 방법.
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