KR102554331B1 - 향상된 효능적 활성을 갖는 Fc 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 향상된 효능적 활성을 갖는 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
Description
서열 목록
본 출원은 EFS-웨브를 통해 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 2017년 7월 31일자로 생성된 ASCII 텍스트 파일은 JBI5095WOPCT_ST25.txt로 명명되고 크기가 168 킬로바이트이다.
기술분야
본 발명은 향상된 효능적(agonistic) 활성을 갖는 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
항종양 면역 효과를 자극하는 단일클론 항체는 중요한 부류의 암 치료제로서 부각되고 있다. 그들 중 다수는 면역자극 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원에 대해 지향된다. 최근의 연구는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성 및 치료적 활성이 Fc를 통한 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 가교결합에 의존한다는 것을 나타냈다(문헌[Li et al. (2011) Science 333: 1030-4]; 문헌[White et al. (2013) Cancer Immunol Immunother 62: 941-8]). Fcγ 수용체, 특히 FcγRIIB는 하류 세포내 신호전달을 활성화하는 전제 조건인 수용체 클러스터링을 촉진하는 항체 다량체화를 용이하게 하는 스캐폴드(scaffold)로서 작용한다(문헌[Bruhns et al. (2009) Blood 113: 3716-25]).
항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 항종양 활성을 추가로 최적화하기 위한 접근법은 그의 FcγRIIB 결합을 개선하기 위해 항체의 Fc 영역을 조작하는 것이었다. 치환 S267E/L328F 및 E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R은 FcγRIIB 결합을 선택적으로 향상시키는 것으로 보고되어 있다(문헌[Chu et al. (2008) Mol Immunol 45: 3926-33]; 문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]). FcγRIIB 결합을 최적화하는 것이 실행가능한 접근법이지만, 그러한 조작된 항체의 효능적 활성은 국소 종양 미세환경에서 FcγR 발현 세포의 밀도에 의존하며, 따라서 그러한 항체의 효능은 다소 제한될 수 있다.
따라서, 추가의 최적화된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은, E345R 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하며, 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 항체 내로 도입하여 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 조작된 항체를 생성하는 단계, 및 조작된 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이, E430G 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y를 포함하는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 암의 치료에 사용하기 위한, E345R 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하며, 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 암의 치료를 위한 약제의 제조에서, E345R 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하는 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체의 용도를 제공한다.
도 1a는 항-OX40 항체의 효능적 활성이 가교-결합 의존적임을 나타낸다. OX40SF2IgG1은 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 가교결합제 단백질 G 비드의 존재 하에서만 신호전달을 유도하였다. 단백질 G 비드의 부재 또는 존재 하에 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40 리간드 또는 OX40SF2IgG1를 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 OX40 및 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하였다. SEAP 리포터 유전자 발현을 반영하는 650 nm에서의 OD를 시험 제제의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=4)으로 제시된다.
도 1b는 Raji 세포와의 공동 배양이 천연 인간 IgG1 Fc를 갖는 SF2 항체의 효능적 활성을 유의적으로 향상시키지 못함을 나타낸다. Raji 세포와의 공동 배양의 존재 또는 부재 하에 증가하는 농도(10 내지 1000 ng/mL)의 OX40SF2IgG1 항체를 HEK-Blue: OX40 세포와 함께 인큐베이션하고, 그들의 효능적 활성을 HEK-Blue NF-κB 리포터 검정에 의해 평가하였다. 1 ㎍/mL OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화된 항-OX40 항체의 효능적 활성을 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다(데이터는 평균 ± SEM(n= 14)으로 제시되었다).
도 2a는 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12가 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 FcγRIIB에 대한 향상된 결합을 갖는다는 것을 나타낸다. FcγRIIB를 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 2b는 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 OX40SF2IgG1S267E/L328F는 FcγRIIA에 대한 향상된 결합을 갖는 반면에, OX40SF2IgG1V12는 유사한 결합을 가졌음을 나타낸다. FcγRIIA를 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 2c는 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 OX40SF2IgG1V12는 FcγRI에 대한 감소된 결합을 갖는 반면에, OX40SF2IgG1S267E/L328F는 유사한 결합을 가졌음을 나타낸다. FcγRI을 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 2d는 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12가 FcγRIIIA에 대한 결합을 제거하였음을 나타낸다. FcγRIIIA를 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 3a는 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12가 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 FcγRIIB 수용체를 발현하는 Raji 세포에 대한 향상된 결합을 갖는다는 것을 나타낸다. 증가하는 농도(3 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12를 Raji 세포에 대한 그들의 결합에 대해 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 3)으로 제시된다.
도 3b는 Raji 세포에 대한 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12의 결합이 FcγRIIB 의존적임을 나타낸다. Raji 세포를 5 ㎍/ml의 항-FcγRIIB 항체 2B6으로 사전처리하고, 1 ㎍/ml의 항체의 Raji 세포에 대한 결합을 유세포 분석에 의해 평가하였다. 나타낸 바와 같은 2B6 항체에 의한 사전차단의 존재 또는 부재 하에 결합의 평균 형광 신호가 막대 그래프에서 평균 ± SEM(n= 3)으로 제시된다.
도 3c는 OX40SF2IgG1S267E/L328F의 효능적 활성이 Raji 세포 상의 FcγRIIB에 의한 항체 가교 결합에 의존한다는 것을 나타낸다. 일부 검정에서 공동 배양의 개시 전에 5 ㎍/ml의 항-FcγRIIB 항체 2B6 항체와 함께 사전-인큐베이션된 Raji 세포와의 공동 배양의 존재 또는 부재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1S267E/L328F를 인큐베이션하였다. y 축은 1 ㎍/ml의 OX40 리간드에 의해 매개되는 퍼센트 활성으로서 정규화된 항-OX40 항체의 효능적 활성을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 3d는 OX40SF2IgG1V12의 효능적 활성이 Raji 세포 상의 FcγRIIB에 의한 항체 가교 결합에 의존한다는 것을 나타낸다. 일부 검정에서 공동 배양의 개시 전에 5 ㎍/ml의 항-FcγRIIB(2B6) 항체와 함께 사전-인큐베이션된 Raji 세포와의 공동 배양의 존재 또는 부재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1V12를 인큐베이션하였다. y 축은 1 ㎍/ml의 OX40 리간드에 의해 매개되는 퍼센트 활성으로서 정규화된 항-OX40 항체의 효능적 활성을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 4a는 OX40SF2IgG1V12 및 OX40SF2IgG1S267E/L328F가 ADCC를 제거하였음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1S267E/L328F, OX40SF2IgG1V12, 및 OX40SF2IgG1을, 이펙터 세포와 공동 배양된 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고 ADCC 리포터 생물검정을 수행하였다. ADCC 활성의 배수 활성화(항체를 첨가하지 않은 대조군 샘플에 대한)를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 4b는 OX40SF2IgG1V12 및 OX40SF2IgG1S267E/L328F가 그들의 ADCP 활성을 보유함을 나타낸다. 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1S267E/L328F, OX40SF2IgG1V12, 및 OX40SF2IgG1을, 분화된 대식세포와 공동 배양된 OX40을 안정하게 발현하는 GFP 양성 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고, GFP 양성 표적 세포의 식작용을 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. ADCP 활성을 반영하는, 제거된 GFP 양성 세포의 백분율을 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 4c는 OX40SF2IgG1V12가 분화된 대식세포에 대한 감소된 결합을 갖는 반면에, OX40SF2IgG1S267E/L328F는 야생형 항체(OX40SF2IgG1)와 유사한 수준으로 대식세포에 결합함을 나타낸다. 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12 항체를 분화된 대식세포와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석 검정을 사용하여 그들의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 4d는 OX40SF2IgG1V12 및 OX40SF2IgG1S267E/L328F가 CDC를 매개하지 않음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 내지 10,000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12 항체를 토끼 보체의 존재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하였다. 용해된 세포의 세포질로부터 방출된 락테이트 탈수소효소(LDH) 활성을 측정함으로써 CDC 활성을 정량화하고, Triton X-100에 의해 용해된 것에 대한 퍼센트 세포독성으로서 표현하였다(데이터는 평균 + S.E.(n = 7)로 제시되었다).
도 5는 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y에 대한 NanoBRET™ PPI 검정으로부터 얻어진 보정된 생물발광 공명 에너지 전달(BRET: bioluminescence resonance energy transfer) 비를 나타내며, 이는 OX40-발현 세포의 표면 상의 항체 다량체화의 정도를 나타낸다. OX40SF2IgG1-n, OX40SF2IgG1E345R-n, OX40SF2IgG1E430G-n, OX40SF2IgG1E345R/E430G-n, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y-n은 C-말단 Nanoluc 서열과 인-프레임(in-frame)인 작제물이다. OX40SF2IgG1-h, OX40SF2IgG1E345R-h, OX40SF2IgG1E430G-h, OX40SF2IgG1E345R/E430G-h, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y-h는 C-말단 Halotag 서열과 인-프레임인 작제물이다. OX40 세포를 안정적으로 발현하는 HEK-Blue™ 세포에 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 Nanoluc® 공여자 항체 및 Halo Tag® 수용자 항체 둘 모두를 적용하고 NanoBRET PPI 검정을 수행하였다. 평균 보정된 BRET 비를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 2)으로 제시된다.
도 6a는 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 OX40SF2IgG1에 비교할 때 OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y의 향상된 효능적 활성을 나타낸다. OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포에 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y 항체를 적용하고, SEAP 분비를 측정하였다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 9)으로 제시된다.
도 6b는 Raji 세포와 OX40SF2IgG1E345R의 가교결합이 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 항체의 효능적 활성을 추가로 부스팅함을 나타낸다. 항-FcγRIIB 항체 2B6에 의한 Raji 세포 상의 FcγRIIB 의 사전-차단은 부스팅을 제거하였다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 8)으로 제시된다.
도 6c는 Raji 세포의 존재 하에 가교결합되거나 단독으로, Fc 수용체에 결합함에 있어서 침묵하는 OX40SF2IgG2sigma 항체가 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 효능적 활성을 갖지 않음을 나타낸다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 8)으로 제시된다.
도 6d는 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 E345R 돌연변이가 OX40SF2IgG2sigma의 효능적 활성을 구조하였음을 나타낸다. 그러나, Raji 세포와의 가교결합은 그의 효능적 활성을 추가로 부스팅하지 못하였다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 8)으로 제시된다.
도 7a는 야생형 항체(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 OX40SF2IgG1E345R이 향상된 ADCC를 가지며, Fc 침묵 OX40SF2IgG2sigma 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R 항체가 ADCC를 제거하였음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG2sigma, 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R을, 이펙터 세포와 공동 배양된 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고 ADCC 리포터 생물검정을 수행하였다. 항체가 없는 샘플에 비교할 때 ADCC의 활성화 배수를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 4)으로 제시된다.
도 7b는 OX40SF2IgG1E345R이 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)의 ADCP와 유사한 ADCP를 가지며, 이펙터 침묵 항체(OX40SF2IgG2sigmaE345R)에서 E345R이 ADCP를 구조함을 나타낸다. 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG2sigma, 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R 항체를, 분화된 대식세포와 함께 OX40을 안정하게 발현하는 GFP 양성 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고, GFP 양성 표적 세포의 식작용을 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. ADCP 활성을 반영하는, 제거된 GFP 양성 세포의 백분율을 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 9)으로 제시된다.
도 7c는 E345R 돌연변이가 OX20SF2IgG1E345R의 향상된 CDC 활성을 유발했지만 이펙터 침묵 OX40SF2IgG2sigmaE345R에는 효과가 없었음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 내지 10,000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG2sigma, 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R 항체를 토끼 보체의 존재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하였다. 용해된 세포의 세포질로부터 방출된 LDH 활성을 측정함으로써 CDC 활성을 정량화하고, Triton X-100에 의해 용해된 것에 대한 퍼센트 세포독성으로서 표현하였다(데이터는 평균 + S.E.(n = 6)로 제시되었다).
도 1b는 Raji 세포와의 공동 배양이 천연 인간 IgG1 Fc를 갖는 SF2 항체의 효능적 활성을 유의적으로 향상시키지 못함을 나타낸다. Raji 세포와의 공동 배양의 존재 또는 부재 하에 증가하는 농도(10 내지 1000 ng/mL)의 OX40SF2IgG1 항체를 HEK-Blue: OX40 세포와 함께 인큐베이션하고, 그들의 효능적 활성을 HEK-Blue NF-κB 리포터 검정에 의해 평가하였다. 1 ㎍/mL OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화된 항-OX40 항체의 효능적 활성을 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다(데이터는 평균 ± SEM(n= 14)으로 제시되었다).
도 2a는 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12가 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 FcγRIIB에 대한 향상된 결합을 갖는다는 것을 나타낸다. FcγRIIB를 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 2b는 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 OX40SF2IgG1S267E/L328F는 FcγRIIA에 대한 향상된 결합을 갖는 반면에, OX40SF2IgG1V12는 유사한 결합을 가졌음을 나타낸다. FcγRIIA를 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 2c는 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 OX40SF2IgG1V12는 FcγRI에 대한 감소된 결합을 갖는 반면에, OX40SF2IgG1S267E/L328F는 유사한 결합을 가졌음을 나타낸다. FcγRI을 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 2d는 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12가 FcγRIIIA에 대한 결합을 제거하였음을 나타낸다. FcγRIIIA를 발현하는 Expi293F 세포를 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석을 사용하여 항체의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 3a는 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12가 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 FcγRIIB 수용체를 발현하는 Raji 세포에 대한 향상된 결합을 갖는다는 것을 나타낸다. 증가하는 농도(3 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12를 Raji 세포에 대한 그들의 결합에 대해 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 3)으로 제시된다.
도 3b는 Raji 세포에 대한 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12의 결합이 FcγRIIB 의존적임을 나타낸다. Raji 세포를 5 ㎍/ml의 항-FcγRIIB 항체 2B6으로 사전처리하고, 1 ㎍/ml의 항체의 Raji 세포에 대한 결합을 유세포 분석에 의해 평가하였다. 나타낸 바와 같은 2B6 항체에 의한 사전차단의 존재 또는 부재 하에 결합의 평균 형광 신호가 막대 그래프에서 평균 ± SEM(n= 3)으로 제시된다.
도 3c는 OX40SF2IgG1S267E/L328F의 효능적 활성이 Raji 세포 상의 FcγRIIB에 의한 항체 가교 결합에 의존한다는 것을 나타낸다. 일부 검정에서 공동 배양의 개시 전에 5 ㎍/ml의 항-FcγRIIB 항체 2B6 항체와 함께 사전-인큐베이션된 Raji 세포와의 공동 배양의 존재 또는 부재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1S267E/L328F를 인큐베이션하였다. y 축은 1 ㎍/ml의 OX40 리간드에 의해 매개되는 퍼센트 활성으로서 정규화된 항-OX40 항체의 효능적 활성을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 3d는 OX40SF2IgG1V12의 효능적 활성이 Raji 세포 상의 FcγRIIB에 의한 항체 가교 결합에 의존한다는 것을 나타낸다. 일부 검정에서 공동 배양의 개시 전에 5 ㎍/ml의 항-FcγRIIB(2B6) 항체와 함께 사전-인큐베이션된 Raji 세포와의 공동 배양의 존재 또는 부재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1V12를 인큐베이션하였다. y 축은 1 ㎍/ml의 OX40 리간드에 의해 매개되는 퍼센트 활성으로서 정규화된 항-OX40 항체의 효능적 활성을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 4a는 OX40SF2IgG1V12 및 OX40SF2IgG1S267E/L328F가 ADCC를 제거하였음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1S267E/L328F, OX40SF2IgG1V12, 및 OX40SF2IgG1을, 이펙터 세포와 공동 배양된 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고 ADCC 리포터 생물검정을 수행하였다. ADCC 활성의 배수 활성화(항체를 첨가하지 않은 대조군 샘플에 대한)를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 4b는 OX40SF2IgG1V12 및 OX40SF2IgG1S267E/L328F가 그들의 ADCP 활성을 보유함을 나타낸다. 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1S267E/L328F, OX40SF2IgG1V12, 및 OX40SF2IgG1을, 분화된 대식세포와 공동 배양된 OX40을 안정하게 발현하는 GFP 양성 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고, GFP 양성 표적 세포의 식작용을 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. ADCP 활성을 반영하는, 제거된 GFP 양성 세포의 백분율을 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 6)으로 제시된다.
도 4c는 OX40SF2IgG1V12가 분화된 대식세포에 대한 감소된 결합을 갖는 반면에, OX40SF2IgG1S267E/L328F는 야생형 항체(OX40SF2IgG1)와 유사한 수준으로 대식세포에 결합함을 나타낸다. 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12 항체를 분화된 대식세포와 함께 인큐베이션하고, 유세포 분석 검정을 사용하여 그들의 결합을 평가하였다. 평균 형광 신호를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 2)으로 제시된다.
도 4d는 OX40SF2IgG1V12 및 OX40SF2IgG1S267E/L328F가 CDC를 매개하지 않음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 내지 10,000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1S267E/L328F, 및 OX40SF2IgG1V12 항체를 토끼 보체의 존재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하였다. 용해된 세포의 세포질로부터 방출된 락테이트 탈수소효소(LDH) 활성을 측정함으로써 CDC 활성을 정량화하고, Triton X-100에 의해 용해된 것에 대한 퍼센트 세포독성으로서 표현하였다(데이터는 평균 + S.E.(n = 7)로 제시되었다).
도 5는 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y에 대한 NanoBRET™ PPI 검정으로부터 얻어진 보정된 생물발광 공명 에너지 전달(BRET: bioluminescence resonance energy transfer) 비를 나타내며, 이는 OX40-발현 세포의 표면 상의 항체 다량체화의 정도를 나타낸다. OX40SF2IgG1-n, OX40SF2IgG1E345R-n, OX40SF2IgG1E430G-n, OX40SF2IgG1E345R/E430G-n, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y-n은 C-말단 Nanoluc 서열과 인-프레임(in-frame)인 작제물이다. OX40SF2IgG1-h, OX40SF2IgG1E345R-h, OX40SF2IgG1E430G-h, OX40SF2IgG1E345R/E430G-h, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y-h는 C-말단 Halotag 서열과 인-프레임인 작제물이다. OX40 세포를 안정적으로 발현하는 HEK-Blue™ 세포에 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 Nanoluc® 공여자 항체 및 Halo Tag® 수용자 항체 둘 모두를 적용하고 NanoBRET PPI 검정을 수행하였다. 평균 보정된 BRET 비를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 2)으로 제시된다.
도 6a는 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 OX40SF2IgG1에 비교할 때 OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y의 향상된 효능적 활성을 나타낸다. OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포에 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y 항체를 적용하고, SEAP 분비를 측정하였다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 9)으로 제시된다.
도 6b는 Raji 세포와 OX40SF2IgG1E345R의 가교결합이 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 항체의 효능적 활성을 추가로 부스팅함을 나타낸다. 항-FcγRIIB 항체 2B6에 의한 Raji 세포 상의 FcγRIIB 의 사전-차단은 부스팅을 제거하였다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 8)으로 제시된다.
도 6c는 Raji 세포의 존재 하에 가교결합되거나 단독으로, Fc 수용체에 결합함에 있어서 침묵하는 OX40SF2IgG2sigma 항체가 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 효능적 활성을 갖지 않음을 나타낸다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 8)으로 제시된다.
도 6d는 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 E345R 돌연변이가 OX40SF2IgG2sigma의 효능적 활성을 구조하였음을 나타낸다. 그러나, Raji 세포와의 가교결합은 그의 효능적 활성을 추가로 부스팅하지 못하였다. 효능적 활성을 1 ㎍/ml OX40 리간드에 의해 유도되는 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하고 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 8)으로 제시된다.
도 7a는 야생형 항체(OX40SF2IgG1)에 비교할 때 OX40SF2IgG1E345R이 향상된 ADCC를 가지며, Fc 침묵 OX40SF2IgG2sigma 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R 항체가 ADCC를 제거하였음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 ng/ml 내지 1000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG2sigma, 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R을, 이펙터 세포와 공동 배양된 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고 ADCC 리포터 생물검정을 수행하였다. 항체가 없는 샘플에 비교할 때 ADCC의 활성화 배수를 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 4)으로 제시된다.
도 7b는 OX40SF2IgG1E345R이 야생형 IgG1(OX40SF2IgG1)의 ADCP와 유사한 ADCP를 가지며, 이펙터 침묵 항체(OX40SF2IgG2sigmaE345R)에서 E345R이 ADCP를 구조함을 나타낸다. 증가하는 농도(1 ng/ml 내지 10000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG2sigma, 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R 항체를, 분화된 대식세포와 함께 OX40을 안정하게 발현하는 GFP 양성 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하고, GFP 양성 표적 세포의 식작용을 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. ADCP 활성을 반영하는, 제거된 GFP 양성 세포의 백분율을 시험 항체의 농도에 대하여 플로팅하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n ≥ 9)으로 제시된다.
도 7c는 E345R 돌연변이가 OX20SF2IgG1E345R의 향상된 CDC 활성을 유발했지만 이펙터 침묵 OX40SF2IgG2sigmaE345R에는 효과가 없었음을 나타낸다. 증가하는 농도(10 내지 10,000 ng/ml)의 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG2sigma, 및 OX40SF2IgG2sigmaE345R 항체를 토끼 보체의 존재 하에 OX40을 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 세포와 함께 인큐베이션하였다. 용해된 세포의 세포질로부터 방출된 LDH 활성을 측정함으로써 CDC 활성을 정량화하고, Triton X-100에 의해 용해된 것에 대한 퍼센트 세포독성으로서 표현하였다(데이터는 평균 + S.E.(n = 6)로 제시되었다).
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태를 설명하기 위한 것이며, 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 실시하는 데 사용될 수 있지만, 예시적인 재료 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
"항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체" 또는 "항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체"는 TNFR 수퍼패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
"TNFR 수퍼패밀리 구성원"은 TNFR의 자연 발생 변이체를 포함하는, 표 1에 나타낸 수용체를 포함하는, TNFR 수퍼패밀리에 속하는 수용체를 포함한다. TNFR은 전형적으로 I 형 막관통 단백질로서 발현되며, 그들의 세포외 도메인 내에 1 내지 6개의 시스테인-풍부 도메인을 함유한다. 신호전달은 TNFR 삼량체로서 발생한다. 각각의 TNFR에 대한 하나의 동형에 대한 아미노산 서열이 표 1에 나타나 있다. TNFR의 리간드(들)가 또한 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "결합한다"는 다른 항원에 대해서보다 더 큰 친화성으로 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 또는 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 내의 에피토프에 결합하는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 지칭한다. 전형적으로, 결합에 대한 평형 해리 상수(KD)가 약 1x10-8 M 이하, 예를 들어 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하인 경우에 항체는 "특이적으로 결합"하며, 전형적으로 KD는 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하는 그의 KD보다 100배 이상 더 작다. 표준 절차를 사용하여 해리 상수를 측정할 수 있다. 그러나, 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 또는 특정 TNFR 수퍼패밀리 구성원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는, 다른 관련 항원에 대한, 예를 들어 다른 종, 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스(cynomolgus), 사이노(cyno)), 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지, 침프(chimp)), 또는 칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus)(코먼 마모셋(common marmoset), 마모셋)로부터의 동일한 항원(상동체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 단일특이성 항체는 하나의 항원 또는 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 이중특이성 항체는 2개의 별개의 항원 또는 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
"항체"는 넓은 의미를 의미하며, 뮤린, 인간, 인간화, 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체, 항체 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체, 도메인 항체를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. "전장(full-length) 항체 분자"는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)뿐만 아니라 그의 다량체(예를 들어, IgM)로 이루어진다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR 세그먼트로 아미노-말단부터 카복시-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4.
"상보성 결정 영역(CDR)"은 항체 내의 "항원 결합 부위"이다. CDR은 다양한 용어를 사용하여 정의될 수 있다: (i) 상보성 결정 영역(CDR), VH 내의 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL 내의 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3)는 서열 가변성에 기초한다(문헌[Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50]; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV", VH 내의 3개(H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개(L1, L2, L3)는 Chothia 및 Lesk에 의해 정의된 바와 같이 구조 내에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17]). International ImMunoGeneTics(IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원-결합 부위의 표준화된 번호화 및 정의를 제공한다. CDR, HV, 및 IMGT 도해 사이의 관련성이 문헌[Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]에 기재되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"은 본 명세서에서 달리 명시적으로 기재되어 있지 않는 한, 상기 기재된 카밧, 초티아 또는 IMGT 중 어느 하나의 방법에 의해 정의된 CDR을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
"항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위, 예컨대 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2 및 3, 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 보유하는 면역글로불린 분자의 일부분을 지칭한다. 항체 단편은 잘 알려진 Fab, F(ab')2, Fd, 및 Fv 단편뿐만 아니라, 하나의 VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb)도 포함한다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성하기 위해, VH/VL 도메인은 분자 간에, 또는 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일쇄 항체 작제물에 의해 발현되는 경우에는 분자내에, 쌍을 이룰 수 있으며; 이는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1998/44001호, WO1988/01649호, WO1994/13804호, 및 WO1992/01047호에 기재되어 있다.
"단일클론 항체"는, 항체 중쇄로부터 C-말단 라이신을 제거하는 것과 같은 가능한 잘 알려진 변경 또는 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아미드화와 같은 아미노산의 번역-후 변형(들)으로 인한 변경을 제외하고는, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄 내에 단일 아미노산 조성을 갖는 항체 집단을 지칭한다. 단일클론 항체는, 이중특이성 단일클론 항체가 2개의 별개의 항원 에피토프와 결합하는 것을 제외하고는, 전형적으로 하나의 항원 에피토프와 결합한다. 단일클론 항체는 항체 집단 내에 이종 글리코실화를 가질 수 있다. 단일클론 항체는 단일특이성 또는 다중특이성이거나, 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이중특이성 항체는 용어 단일클론 항체에 포함된다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다(예를 들어, OX-40에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 OX-40 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). "단리된 항체"는 더 높은 순도로 단리된 항체, 예컨대 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도인 항체를 포함한다.
"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 항원 결합 부위 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되고 인간 대상체에게 투여될 경우에 최소 면역 반응을 갖도록 최적화되는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 이 항체가 불변 영역 또는 불변 영역의 일부분을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 기원의 서열로부터 유래된다.
인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 예시적인 시스템은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 담지하는 유전자도입 인간 이외의 동물, 예컨대 마우스 또는 래트를 포함한다. "인간 항체"는, 항체를 얻기 위해 사용한 시스템과 인간 면역글로불린 유전자좌 사이의 차이, 체세포 돌연변이의 도입, 또는 프레임워크 또는 항원 결합 부위 내로의 의도적인 치환 도입, 또는 둘 모두로 인해, 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 비교할 때 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 전형적으로, "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 공통 프레임워크 서열을 함유하거나, 예를 들어 문헌[Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96] 및 국제 특허 출원 공개 제WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 혼입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다.
인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 인간 항체는, 합성 CDR 및/또는 합성 프레임워크를 혼입시킨 파지 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 생성될 수 있거나, 시험관내 돌연변이생성(in vitro mutagenesis)을 거쳐서 항체 특성을 개선하여, 생체내에서 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리에 의해 발현되지 않는 항체를 생성할 수 있다.
항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
"재조합"은 재조합 방법에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체 및 다른 단백질을 지칭한다.
"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 말한다. 에피토프는 전형적으로 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징과 더불어 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 이루어질 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다. 항체 "에피토프"는 에피토프를 확인하기 위해 사용되는 방법론에 따라 달라진다.
"이중특이성"은 2개의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 이중특이성 항체는 다른 관련 항원들에 대한, 예를 들어 다른 종, 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(사이노몰거스, 사이노), 판 트로글로디테스(침팬지, 침프) 또는 칼리트릭스 자쿠스(코먼 마모셋, 마모셋)로부터의 동일한 항원(상동체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프와 결합할 수 있다.
"다중특이성"은 2개 이상의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개 이상의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
"벡터"는 생물 시스템 내에서 복제가 가능하거나, 이러한 시스템 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 생물학적 시스템, 예컨대 세포, 바이러스, 동물, 식물, 및 벡터를 복제할 수 있는 생물학적 성분을 이용하는 재구성된 생물학적 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 요소, 예컨대 복제 기점, 폴리아데닐화 신호, 또는 선택 마커를 함유한다. 벡터 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥인 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 하이브리드일 수 있다.
"발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 지칭한다.
"폴리뉴클레오티드"는 당-포스페이트 골격 또는 다른 균등한 공유결합적 화학 특성에 의해 공유 연결된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 합성 분자를 지칭한다. cDNA는 합성 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.
"폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합으로 결합된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "암 세포" 또는 "종양 세포"는 생체내, 생체외, 또는 조직 배양에서의 암성, 전암성, 또는 형질전환 세포를 지칭하며, 이는 자발적이거나 유도된 표현형 변화를 갖는다. 이러한 변화가 반드시 새로운 유전 물질의 흡수를 수반하지는 않는다. 형질전환은 형질전환 바이러스에 의한 감염 및 새로운 게놈 핵산의 혼입, 외인성 핵산의 흡수로부터 일어날 수 있지만, 또는 그것이 자발적으로 또는 발암물질에 대한 노출 후에 일어남으로써 내인성 유전자를 돌연변이화할 수도 있다. 형질전환/암은 시험관내, 생체내, 및 생체외에서 누드 마우스 등과 같은 적합한 동물 숙주 내의 형태학적 변화, 세포의 불멸화, 비정상 성장 제어, 병소 형성, 증식, 악성종양, 종양 특이적 표지자 수준의 변조(modulation), 침습성, 종양 성장에 의해 예시된다(문헌[Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)]).
"약"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값이 허용 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 값을 측정하거나 결정하는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 특정 검정, 결과 또는 실시 형태와 관련하여 실시예에서 또는 명세서에서의 어딘가 다른 곳에서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "약"은 당업계의 관행에 따른 1 표준 편차, 또는 최대 5%의 범위 어느 쪽이든 더 큰 값 이내에 있음을 의미한다.
"결합가(valent)"는 분자 내의 항원에 특이적인 명시된 수의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 그렇기 때문에, 용어 "1가", "2가", "4가", 및 "6가"는 분자 내의 항원에 특이적인 각각 1개, 2개, 4개, 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.
"효능제"는, TNFR 수퍼패밀리 구성원의 천연 리간드에 의해 유도되는, 항체가 결합하는 TNFR 수퍼패밀리 구성원의 하나 이상의 생물학적 활성을 유도하는 항체를 지칭한다. 예시적인 효능적 활성은 시험관내 검정에서 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 생성의 유도, 수지상 세포(DC) 상에서 증가된 CD80, CD83, CD86, 및 HLA-DR 표면 발현에 의해 평가되는 DC 분화의 유도, B 세포 상에서 증가된 B 세포 증식 또는 증가된 CD23, CD80, CD83, CD86, 및 HLA-DR 표면 발현에 의해 평가되는 B 세포의 활성화, 이전에 항원에 노출된 환자로부터 단리된 PBMC에 의한 인터페론-γ(IFN-γ)의 생성에 의해 평가되는 항원-특이적 T 세포 기억 반응의 유도, 및 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식의 유도를 포함한다. 효능적 활성(예를 들어, 효능작용)은 가교결합 의존적이거나 항체 가교결합에 독립적일 수 있다.
NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체-유도 생성에 의해 효능적 활성이 측정되는 경우, "향상된 효능적 활성" 또는 "향상된 효능작용"은 모 야생형 항체에 비교할 때 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능작용의 개선을 지칭한다. 조작된 항체는, 그것이 가교결합 의존적이거나 가교결합 독립적인 방식으로 1 ㎍/mL의 항체 농도에서 야생형 모 항체에 비교할 때 20% 이상 더 높은 수준으로 SEAP 생성을 유도할 경우에 "향상된 효능적 활성"을 갖는다.
"가교결합"은, TNFR의 항체-유도 다량체화 및 TNFR 효능적 활성의 유도를 유발하는, FcγR에 결합하는 항체, 예를 들어 Fc±RIIb 시스 또는 트랜스에 의해 유도되는, TNFR 수퍼패밀리 구성원을 발현하는 세포 상의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 고차 다량체화(higher order multimerization)를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 가교결합제로서의 항-인간 F(ab')2, 또는 Fc±RIIb를 발현하는 세포, 예컨대 Raji 세포를 사용함으로써 시험관 내에서 가교결합을 평가할 수 있다.
"항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성"은, 본 명세서에서 실시예 3에 기재된 바와 같은 HEK-Blue™ 리포터 검정에서, FcγR을 발현하는 Raji 세포, 예를 들어 Fc±RIIB의 부재 하의 용액 중에 항체가 SEAP의 생성을 유도함을 의미한다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본 명세서 전체에 걸쳐 항체 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호화는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 따른다.
표 2에 나타낸 바와 같은 종래의 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드가 본 명세서에 사용된다.
[표 2]
조성물
본 발명은, 항체 이펙터 기능의 동종형-의존성 조절과 커플링된 향상된 효능적 활성을 나타내는 개선된 특성을 갖는 조작된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다. 본 발명은, 표면 세포 상의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 다량체화하는 치환이 가교결합에 독립적으로 항체의 효능적 활성을 향상시킨다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은, E345R 돌연변이를 포함하고, 임의로 E430G 돌연변이, S440Y 돌연변이, 또는 E430G/S440Y 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 추가로 포함하며, 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하며, 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 명세서에서 E345R 치환은 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키는 것으로 나타났다.
본 명세서에서 E430G 치환은 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키는 것으로 나타났다.
본 명세서에서 E345R/E430G 치환은 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키는 것으로 나타났다.
본 명세서에서 E345R/E430G/S440Y 치환은 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 향상시키는 것으로 나타났다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하며, E345R 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, E430G 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하며, E430G 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, E345R/E430G 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하며, E345R/E430G 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, E345R/E430G/S440Y 돌연변이(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하며, E345R/E430G/S440Y 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적 활성을 갖는 단리된 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 FcγR 항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 갖는다. 따라서, Fc±R 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 갖는 본 발명의 항체는, 그들의 효능적 활성을 위해 종양 미세환경에서 FcγR을 발현하는 세포의 생체이용률 및 밀도에 의존하지 않으며, 충분한 FcγR 세포 침윤이 결여된 환경에서 TNFR 신호전달을 유도할 수 있다.
본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 천연 리간드의 것보다 낮은 효능작용의 수준을 나타낼 수 있으며, 따라서 개선된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다.
"모 항체"는 본 발명의 조작된 항체를 생성하기 위해 사용되는 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 지칭한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식작용(ADCP: antibody-dependent cell phagocytosis)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, E345R 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, E435R 돌연변이, 및 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는 항-CD40 또는 항-CD27 항체를 이용한 치료적 처리이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형의 것이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고, 항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26), 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD27(서열 번호 8)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD40(서열 번호 5)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD137(서열 번호 10)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 고형 종양의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 흑색종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비-편평상피 NSCLC의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐 선암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 신장 투명 세포 암종 또는 신장 유두상 세포 암종) 또는 그의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 중피종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비인두 암종(NPC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 결장직장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 난소암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 간암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 췌장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 갑상선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 두경부의 편평상피세포 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 식도 또는 위장관의 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 유방암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 나팔관암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 뇌암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 요도암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비뇨생식기암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁내막증의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁경부암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식작용(ADCP)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, E430G 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, E430G 돌연변이, 및 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는 항-CD40 또는 항-CD27 항체를 이용한 치료적 처리이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형의 것이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고, 항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26), 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD27(서열 번호 8)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD40(서열 번호 5)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD137(서열 번호 10)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 고형 종양의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 흑색종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비-편평상피 NSCLC의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐 선암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 신장 투명 세포 암종 또는 신장 유두상 세포 암종) 또는 그의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 중피종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비인두 암종(NPC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 결장직장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 난소암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 간암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 췌장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 갑상선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 두경부의 편평상피세포 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 식도 또는 위장관의 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 유방암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 나팔관암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 뇌암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 요도암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비뇨생식기암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁내막증의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁경부암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식작용(ADCP)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, E345R/E430G 돌연변이, 및 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는 항-CD40 또는 항-CD27 항체를 이용한 치료적 처리이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고, 항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26), 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD27(서열 번호 8)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD40(서열 번호 5)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD137(서열 번호 10)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 고형 종양의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 흑색종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비-편평상피 NSCLC의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐 선암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 신장 투명 세포 암종 또는 신장 유두상 세포 암종) 또는 그의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 중피종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비인두 암종(NPC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 결장직장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 난소암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 간암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 췌장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 갑상선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 두경부의 편평상피세포 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 식도 또는 위장관의 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 유방암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 나팔관암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 뇌암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 요도암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비뇨생식기암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁내막증의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁경부암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식작용(ADCP)을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 CDC를 매개한다.
일부 실시 형태에서, E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, E345R/E430G/S440Y 돌연변이, 및 항체 Fc 매개 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 제2 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 TNFR 발현 세포의 고갈이 바람직하지 않은 경우에 사용될 수 있다. 예시적인 그러한 경우는 항-CD40 또는 항-CD27 항체를 이용한 치료적 처리이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234F/L235E/D265A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG1 동종형이고, 야생형 IgG1에 비교할 때 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 V234A/G237A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG2 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG2에 비교할 때 H268Q/V309L/A330S/P331S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고 IgG3 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 이는 임의로, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하며, IgG4 동종형이고, 야생형 IgG4에 비교할 때 S228P/F234A/L235A 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고, 항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 가지며, 여기서 효능적 활성은 Hek-293 세포로부터 NFκB-유도성 프로모터의 제어 하에 발현되는 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 항체-유도 생성을 측정함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26), 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 OX40(서열 번호 4)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD27(서열 번호 8)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD40(서열 번호 5)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고 TNFR 수퍼패밀리 구성원 CD137(서열 번호 10)에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하고, TNFR 수퍼패밀리 구성원 GITR(서열 번호 23)에 결합한다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 고형 종양의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 흑색종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비-편평상피 NSCLC의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 폐 선암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 신장 세포 암종(RCC)(예를 들어, 신장 투명 세포 암종 또는 신장 유두상 세포 암종) 또는 그의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 중피종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비인두 암종(NPC)의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 결장직장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 전립선암 또는 거세-저항성 전립선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 난소암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 위장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 간암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 췌장암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 갑상선암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 두경부의 편평상피세포 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 식도 또는 위장관의 암종의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 유방암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 나팔관암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 뇌암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 요도암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 비뇨생식기암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁내막증의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 자궁경부암의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체는, 예를 들어 암의 전이 병변의 치료에서 요법에 사용하기에 적합하다.
"항체-의존성 세포성 세포독성", "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 이펙터 세포 상에서 발현되는 Fc 감마 수용체(Fc±R)를 통한, 항체-코팅된 표적 세포와 용해 활성을 갖는 이펙터 세포, 예컨대 자연 살해 세포, 단핵구, 대식세포 및 호중구의 상호작용에 의존하는 세포사를 유도하기 위한 기전이다. 예를 들어, NK 세포는 Fc±RIIIA를 발현하며, 한편 단핵구는 Fc±RI, Fc±RII, 및 Fc±RIIIA를 발현한다. 항체-코팅된 표적 세포, 예컨대 TNFR 발현 세포의 사멸은 막 세공 형성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통한 이펙터 세포 활성으로 인해 발생한다. 본 발명의 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 면역 이펙터 세포와 조합된 TNFR 발현 세포에 항체를 첨가할 수 있으며, 이는 항원 항체 복합체에 의해 활성화되어 표적 세포의 세포용해를 유발할 수 있다. 세포용해는 용해된 세포로부터의 표지(예를 들어, 방사성 기질, 형광 염료, 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 검출될 수 있다. 그러한 검정을 위한 예시적인 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 예시적인 표적 세포는 내인성으로 또는 재조합에 의해 TNFR을 발현하는 세포, 예컨대 Treg를 포함한다. 예시적인 검정에서, 표적 세포는 1 표적 세포 대 50 이펙터 세포의 비로 사용된다. 표적 세포를 37℃에서 20 분 동안 BATDA(PerkinElmer)로 사전-표지하고, 2회 세척하고, DMEM, 10% 열-불활성화 FBS, 2 mM L-글루타민(모두 Invitrogen으로부터) 중에 재현탁한다. 표적(1x104개 세포) 및 이펙터 세포(0.5x106개 세포)를 합하고, 100 μl의 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰에 첨가한다. 시험 항체가 있거나 없는 추가적인 100 μl를 첨가한다. 플레이트를 200 g에서 3 분 동안 원심분리하고, 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 200 g에서 3 분 동안 다시 원심분리한다. 웰 당 총 20 μl의 상청액을 제거하고, 200 μl의 DELPHIA 유로퓸-기반의 시약(PerkinElmer)의 첨가에 의해 세포 용해를 측정한다. 0.67% Triton X-100(Sigma Aldrich)을 이용하는 최대 세포독성, 및 임의의 항체의 부재 하에 표적 세포로부터의 BATDA의 자발적인 방출에 의해 결정된 최소 대조군에 대해 데이터를 정규화한다. 대안적으로, 수용체의 활성화가 본 명세서에 기재된 바와 같은 루시퍼라제 리포터의 발현을 유발하는 리포터 유전자 검정에서 FcγRIIIA의 활성화를 평가함으로써 ADCC 활성을 평가할 수 있다.
"항체-의존성 세포 식작용"("ADCP")은 식세포, 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포에 의한 내재화에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 제거의 기전을 지칭한다. ADCP는, 이펙터 세포로서 단핵구-유래 대식세포를, 그리고 GFP 또는 다른 표지된 분자를 발현하도록 조작된 표적 세포로서 다우디 세포(ATCC® CCL-213™) 또는 TNFR을 발현하는 B 세포 백혈병 또는 림프종 또는 종양 세포를 사용함으로써 평가될 수 있다. 이펙터:표적 세포 비는, 예를 들어 4:1일 수 있다. 본 발명의 항체의 존재 또는 부재 하에 이펙터 세포를 표적 세포와 4 시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후에, 세포는 아큐타제를 사용하여 탈착될 수 있다. 대식세포는 형광 표지에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체로 확인할 수 있으며, % 식작용은 표준 방법을 사용하여 CD11+CD14+ 대식세포에서의 % GFP 형광에 기초하여 결정할 수 있다.
본 발명의 항체의 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC는 항체 Fc 내로 추가의 돌연변이를 도입함으로써 추가로 향상될 수 있으며, 이는 활성화 Fc± 수용체(Fc±R) 또는 보체에 대한 항체의 결합을 향상시킨다.
활성화 Fc±에 대한 본 발명의 항체의 결합을 증가시키고/시키거나 항체 이펙터 기능을 향상시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호, 미국 특허 출원 공개 제2015/0259434호, 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604], 문헌[Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103: 4005-10], 문헌[Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res 67: 8882-90], 문헌[Richards et al. (2008) Mol Cancer Ther 7: 2517-27], 및 문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3]에 기재된 것들이며, 위치 236, 239, 243, 256, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 360, 339, 378, 396, 또는 430을 포함한다(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름). 단독으로 또는 조합하여 실행될 수 있는 예시적인 돌연변이는 G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T, 및 P396L 돌연변이이다. 증가된 ADCC 또는 ADCP를 갖는 항체를 생성하는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, 및 G236A/S239D/I332E 돌연변이이다.
본 발명의 항체의 CDC를 향상시키기 위해 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 국제 특허 출원 제WO2014/108198호, 문헌[Idusogie et al. (2001) J Immunol 166: 2571-5], 및 문헌[Moore et al. (2010) MAbs 2: 181-9]에 기재된 것들이며, 위치 267, 268, 324, 326, 333, 345, 및 430을 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 실행될 수 있는 예시적인 돌연변이는 S267E, H268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E430S, E430F, 및 E430T 돌연변이이다. 증가된 CDC를 갖는 항체를 생성하는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T, 및 S267E/H268F/S324T 돌연변이이다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는, 표적-결합된 항체의 Fc 이펙터 도메인이 보체 성분 C1q에 결합하여 활성화하고, 이는 결국 보체 캐스케이드를 활성화하여 표적 세포사를 유발하는 세포사 유도 기전을 지칭한다. 보체의 활성화는 또한 표적 세포 표면 상에의 보체 성분의 침착을 가져올 수 있는데, 이는 백혈구 상의 보체 수용체(예를 들어, CR3)에 결합함으로써 ADCC를 용이하게 한다. 예를 들어 RPMI-B(1% BSA로 보충된 RPMI) 중에 1×105개의 세포/웰(50 μl/웰)로 Daudi 세포를 플레이팅하고, 0 내지 100 ㎍/ml의 최종 농도로 웰에 50 μl의 시험 항체를 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 반응물을 인큐베이션하고, 11 μl의 혼주된 인간 혈청을 웰에 첨가하고, 37℃에서 45 분 동안 반응물을 인큐베이션함으로써 TNFR 발현 세포의 CDC를 측정할 수 있다. 용해된 세포의 백분율(%)은 표준 방법을 사용하여 FACS 검정에서 % 프로피듐 요오다이드 염색된 세포로서 검출될 수 있다.
ADCC를 유도하는 본 발명의 항체의 능력은 또한 그들의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상시킬 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 잘 알려진 바이안테나리(biantennary) G0, G0F, G1, G1F, G2, 또는 G2F 형태의 대부분의 글리칸에 의해 Asn297에서 N-글리코실화된다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 전형적으로 약 85% 이상의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 바이안테나리 복합체-유형은 올리고당으로부터의 코어(core) 푸코스의 제거는, 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서, 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 바이안테나리 복합체-유형의 Fc 올리고당을 담지하는 비교적 고도로 탈푸코실화된 항체의 성공적인 발현을 유발하는 것으로 보고된 상이한 방법, 예컨대 배양물 삼투질 농도(osmolality)의 제어(문헌[Konno et al. (2012) Cytotechnology 64: 249-65]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 Lec13의 적용(문헌[Shields et al. (2002) J Biol Chem 277: 26733-40]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 EB66의 적용(문헌[Olivier et al. (2010) MAbs 2: 405-15]), 숙주 세포주로서의 래트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용(문헌[Shinkawa et al. (2003) J Biol Chem 278: 3466-73]), 특이적으로 α 1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자에 대한 짧은 간섭(small interfering) RNA의 도입(문헌[Mori et al. (2004) Biotechnol Bioeng 88: 901-8]), 또는 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III과 골지(Golgi) α-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 억제제인 키푸넨신(kifunensine)의 공발현(문헌[Ferrara et al. (2006) J Biol Chem 281: 5032-6]; 문헌[Ferrara et al. (2006) J Biol Chem 281: 5032-6]; 문헌[Ferrara et al. (2006) Biotechnol Bioeng 93: 851-61]; 문헌[Zhou et al. (2008) Biotechnol Bioeng 99: 652-65])을 사용하여 그러한 mAb를 달성할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 항체의 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC를 향상시키는 제2 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 G236A 돌연변이, S239D 돌연변이, F243L 돌연변이, T256A 돌연변이, K290A 돌연변이, R292P 돌연변이, S298A 돌연변이, Y300L 돌연변이, V305L 돌연변이, K326A 돌연변이, A330K 돌연변이, I332E 돌연변이, E333A 돌연변이, K334A 돌연변이, A339T 돌연변이, P396L 돌연변이, S267E 돌연변이, H268F 돌연변이, S324T 돌연변이, K326A 돌연변이, K326W 돌연변이, E333A 돌연변이, E430S 돌연변이, E430F 돌연변이, 및 E430T 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체의 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC를 향상시키는 제2 돌연변이를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 S239D/I332E 돌연변이, S298A/E333A/K334A 돌연변이, F243L/R292P/Y300L 돌연변이, F243L/R292P/Y300L/P396L 돌연변이, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 돌연변이, G236A/S239D/I332E 돌연변이, K326A/E333A 돌연변이, K326W/E333A 돌연변이, H268F/S324T 돌연변이, S267E/H268F 돌연변이, S267E/S324T 돌연변이, 및 S267E/H268F/S324T 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체의 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC를 향상시키는 제2 돌연변이를 포함한다.
ADCC를 유도하는 본 발명의 항체의 능력은 그들의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상시킬 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 대부분 잘 알려진 바이안테나리 G0, G0F, G1, G1F, G2, 또는 G2F 형태의 글리칸에 의해 Asn297에서 N-글리코실화된다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 전형적으로 약 85% 이상의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 바이안테나리 복합체-유형은 올리고당으로부터의 코어(core) 푸코스의 제거는, 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서, 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 푸코스 함량이 약 0% 내지 약 15%, 예를 들어 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%인 바이안테나리 글리칸 구조를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 푸코스 함량이 약 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%인 바이안테나리 글리칸 구조를 갖는다.
"푸코스 함량"은 Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코스 단당의 양을 의미한다. 푸코스의 상대량은 모든 당구조(glycostructure)에 대한 푸코스-함유 구조의 백분율이다. 이들은, 예를 들어 하기와 같은 다수의 방법에 의해 특성화 및 정량화될 수 있다: 1) 국제 특허 출원 공개 WO2008/077546호에 기재된 바와 같이 N-글리코시다제 F 처리된 샘플(예를 들어, 복합, 혼성, 및 올리고- 및 고-만노스 구조)의 MALDI-TOF를 사용하는 방법; 2) Asn297 글리칸의 효소적 방출을 행하고, 후속으로, 유도체화하고, 형광 검출을 사용하는 HPLC(UPLC) 및/또는 HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 검출/정량화함에 의한 방법; 3) 엔도(Endo) S, 또는 제1 GlcNAc 단당과 제2 GlcNAc 단당 사이를 절단하여 푸코스가 제1 GlcNAc에 부착된 상태로 남겨 두는 다른 효소로 Asn297 글리칸을 처리하거나 처리하지 않고서, 천연 또는 환원된 mAb의 온전한 단백질을 분석하는 방법; 4) 효소적 분해(예를 들어, 트립신 또는 엔도펩티다제 Lys-C)에 의해 mAb를 구성성분 펩티드로의 분해하고, 이어서 HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 분리, 검출, 및 정량화하는 방법; 또는 5) Asn 297에서의 PNGase F를 이용한 특이적 효소적 탈글리코실화에 의해 mAb 단백질로부터 mAb 올리고당을 분리하는 방법. 방출된 올리고당은 형광단으로 표지되고, 실험 질량과 이론 질량의 비교에 의한 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI: matrix-assisted laser desorption ionization) 질량 분석법에 의한 글리칸 구조의 미세 특성화, 이온 교환 HPLC(GlycoSep C)에 의한 시알릴화도(degree of sialylation)의 결정, 순상 HPLC(GlycoSep N)에 의한 친수성 기준에 따른 올리고당 형태의 분리 및 정량화, 및 고성능 모세관 전기영동-레이저 유도 형광(HPCE-LIF: high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence)에 의한 올리고당의 분리 및 정량화를 가능하게 하는 다양한 상보적 기술에 의해 분리 및 확인될 수 있다.
"저 푸코스" 또는 "저 푸코스 함량"은 푸코스 함량이 약 0% 내지 15%인 항체를 지칭한다.
"정상 푸코스" 또는 "정상 푸코스 함량"은 푸코스 함량이 약 50% 초과, 전형적으로 약 60%, 70%, 80% 초과, 또는 85% 초과인 항체를 지칭한다.
이펙터 기능성을 원하지 않는 경우에, 본 발명의 항체를 추가로 조작하여 활성화 Fc± 수용체(Fc±R)에 대한 항체의 결합을 감소시키고/시키거나 Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 또는 식작용(ADCP)을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 항체 Fc 내에 도입할 수 있다.
활성화 Fc±R에 대한 항체의 결합을 감소시키고, 이어서 이펙터 기능을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는, 예를 들어 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604], 국제 특허 출원 공개 제WO2011/066501호, 미국 특허 제6,737,056호 및 제5,624,821호, 문헌[Xu et al. (2000) Cell Immunol 200: 16-26], 문헌[Alegre et al. (1994) Transplantation 57: 1537-43], 문헌[Bolt et al. (1993) Eur J Immunol 23: 403-11], 문헌[Cole et al. (1999) Transplantation 68: 563-71], 문헌[Rother et al. (2007) Nat Biotechnol 25: 1256-64], 문헌[Ghevaert et al. (2008) J Clin Invest 118: 2929-38], 문헌[An et al. (2009) MAbs 1: 572-9]에 기재된 것들이며, 위치 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331, 및 365를 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 실행될 수 있는 예시적인 돌연변이는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 상의 K214T, E233P, L234V, L234A, G236의 결실, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S, 및 P331S 돌연변이이다. ADCC를 감소시키기 위해 실행될 수 있는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 L234A/L235A, IgG2 상의 V234A,/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, IgG4 상의 F234A/L235A, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 상의 N297A, IgG2 상의 V234A/G237A, IgG1 상의 K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, IgG2 상의 H268Q/V309L/A330S/P331S, IgG1 상의 S267E/L328F, IgG1 상의 L234F/L235E/D265A, IgG1 상의 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S, 및 IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S이다. IgG2로부터의 잔기 117-260 및 IgG4로부터의 잔기 261-447을 갖는 Fc와 같은 하이브리드 IgG2/4 Fc 도메인이 또한 사용될 수 있다.
S228P 돌연변이를 IgG4 항체 내로 실행하여 IgG4 안정성을 향상시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 K214T 돌연변이, E233P 돌연변이, L234V 돌연변이, L234A 돌연변이, G236의 결실, V234A 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, G237A 돌연변이, P238A 돌연변이, P238S 돌연변이, D265A 돌연변이, S267E 돌연변이, H268A 돌연변이, H268Q 돌연변이, Q268A 돌연변이, N297A 돌연변이, A327Q 돌연변이, P329A 돌연변이, D270A 돌연변이, Q295A 돌연변이, V309L 돌연변이, A327S 돌연변이, L328F 돌연변이, A330S 돌연변이, 및 P331S 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 돌연변이를 포함하며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
예를 들어 문헌[Dall'Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-24], 문헌[Zalevsky et al. (2010) Nat Biotechnol 28: 157-9], 문헌[Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279: 6213-6], 문헌[Hinton et al. (2006) J Immunol 176: 346-56], 문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604], 문헌[Petkova et al. (2006) Int Immunol 18: 1759-69], 문헌[Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab Dispos 35: 86-94], 문헌[Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23: 1283-8], 문헌[Yeung et al. (2010) Cancer Res 70: 3269-77], 및 문헌[Kim et al. (1999) Eur J Immunol 29: 2819-25]에 기재되고, 위치 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434, 및 435를 포함하는 것들과 같은 추가의 Fc 돌연변이를 도입함으로써, 본 발명의 항체를 추가로 조작하여 항체 반감기를 조절할 수 있다. 단독으로 또는 조합하여 실행될 수 있는 예시적인 돌연변이는 T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A, 및 H435R 돌연변이이다. 항체의 반감기를 증가시키기 위해 실행될 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 돌연변이는 M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A, 및 T307A/E380A/N434A 돌연변이이다. 항체의 반감기를 감소시키기 위해 실행할 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 돌연변이는 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A, 및 H435R 돌연변이이다.
보존적 변형을 추가로 포함하는 본 발명의 항체는 본 발명의 범주 내에 있다.
"보존적 변형"은 그 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 말한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 잘 규정되어 있고, 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄 (예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 황-함유 측쇄 (시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 추가로, 알라닌 스캐닝(scanning) 돌연변이생성(문헌[MacLennan et al. (1998) Acta Physiol Scand Suppl 643: 55-67]; 문헌[Sasaki et al. (1998) Adv Biophys 35: 1-24])에 대해 이전에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기를 또한 알라닌으로 치환할 수 있다. 본 발명의 항체에 대한 아미노산 치환은 알려진 방법, 예를 들어 PCR 돌연변이생성(미국 특허 제4,683,195호)에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는데, 예를 들어 무작위 (NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산 (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩함 - 을 사용하여 생성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여, 생성된 항체 변이체의 특성을 시험할 수 있다.
본 발명의 항체는 글리코실화, 이성체화, 탈글리코실화, 또는 비-천연 발생 공유적 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 첨가(페길화) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 그러한 변형은 생체내에서 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합되어(PEG화), 이의 약물동태학적 프로파일을 개선할 수 있다. 접합은 당업자에게 알려진 기법에 의해 수행될 수 있다. 치료 항체와 PEG의 접합은 기능을 방해하지 않으면서 약동력학적 특성을 향상시키는 것으로 나타났다(문헌[Leong et al. (2001) Cytokine 16: 106-19]; 문헌[Yang et al. (2003) Protein Eng 16: 761-70]; 문헌[Knight et al. (2004) Platelets 15: 409-18]).
본 발명의 항체는 안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화성, 면역원성 또는 다른 바람직한 생물학적 특성 또는 생물물리학적 특성을 개선하도록 변형될 수 있으며, 이는 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은 (1) 개별 도메인의 고유의 안정성에 영향을 주는 그들의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 쌍형성(pairing)에 영향을 주는 단백질/단백질 계면 상호작용, (3) 극성 및 하전된 잔기의 매몰(burial), (4) 극성 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크; 및 (5) 다른 분자내 및 분자간 힘 중에서 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 포함하는 다수의 인자에 의해 영향을 받는다(문헌[Worn et al. (2001) J Mol Biol 305: 989-1010]). 잠재적인 구조 불안정화 잔기를 항체의 결정 구조에 기초하거나, 또는 소정 경우에는 분자 모델링에 의해 확인할 수 있으며, 확인된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성에 대한 잔기의 영향력을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키기 위한 방법 중 하나는 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 측정되는 바와 같은 열 전이 중간점(Tm)을 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질 Tm은 그의 안정성과는 상관관계에 있고, 용액 중에서의 풀림(unfolding) 및 변성, 그리고 단백질이 풀리는 경향에 따라 달라지는 분해 과정에 대한 그의 감수성과는 역상관관계에 있다(문헌[Remmele et al. (2000) Biopharm. 13: 36-46]). 다수의 연구에서 DSC에 의해 열 안정성으로서 측정된 제형의 물리적 안정성과 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성의 순위 사이의 상관관계가 밝혀졌다(문헌[Maa et al. (1996) Int. J. Pharm. 140: 155-68]; 문헌[Remmele et al., Pharm. Res. 15: 200-8]; 문헌[Gupta et al. (2003)AAPS PharmSci. 5E8: 2003]; 문헌[Bedu-Addo et al. (2004) Pharm. Res. 21: 1353-61]; 문헌[Zhang et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93: 3076-89]). 제형 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기적인 물리적 안정성에 영향을 준다는 것을 시사한다.
혈류 내의 내인성 순환 카르복시펩티다제에 의해 주사된 항체로부터 C-말단 라이신(CTL)이 제거될 수 있다(문헌[Cai et al. (2011) Biotechnol Bioeng 108: 404-12]). 미국 특허 출원 공개 US20140273092호에 기재된 바와 같이, 세포외 Zn2+, EDTA 또는 EDTA - Fe3+의 농도를 제어하여 제조 동안 CTL 제거를 최대 수준 미만으로 제어할 수 있다. 항체 내의 CTL 함량은 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 C-말단 라이신 함량은 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 또는 약 60%이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체의 C-말단 라이신 함량은 약 0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다.
본 발명의 항체의 생성 방법
조작된 Fc 도메인을 갖는 본 발명의 항체는 야생형 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서열을 주형으로서 사용하는 표준 클로닝 및 발현 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 부위-지정 돌연변이생성 또는 PCR-매개 돌연변이생성을 수행하여 항체 Fc 내에 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 FcγR에 대한 항체 결합, 효능적 활성, 또는 다른 관심 특성에 대한 효과를 평가할 수 있다.
항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 VH 및 VL 도메인은 드 노보(de novo)로 생성될 수 있다.
예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]의 하이브리도마 방법을 단일클론 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 숙주 동물, 예컨대 햄스터, 래트, 또는 원숭이를 인간 TNFR 또는 TNFR의 세포외 도메인으로 면역화한 후, 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 표준 방법을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1986]). 단일 불멸화(immortalized) 하이브리도마 세포로부터 발생되는 콜로니를 원하는 특성, 예컨대 항원에 대한 결합의 특이성, 교차-반응성 또는 그의 결여, 및 친화성을 갖는 항체의 생성에 대해 스크리닝한다.
다양한 숙주 동물을 사용하여 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, Balb/c 마우스를 사용하여 마우스 항-인간 TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 생성할 수 있다. Balb/c 마우스 및 다른 인간 이외의 동물에서 제조된 항체는 더 인간-유사한 서열을 생성하기 위하여 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
인간 수용자 프레임워크의 선택을 포함하는 예시적인 인간화 기술이 알려져 있으며, CDR 이식(미국 특허 제5,225,539호), SDR 이식(미국 특허 제6,818,749호), 재표면화(Resurfacing)(문헌[Padlan (1991) Mol Immunol 28:489-98]), 특이성 결정 잔기 재표면화(미국 특허 출원 공개 제2010/0261620호), 인간 프레임워크 적응화(미국 특허 제8,748,356호), 또는 초인간화(미국 특허 제7,709, 226호)를 포함한다. 이러한 방법에서는, 모 항체의 CDR을 인간 프레임워크에 전달하며, 이는 모 프레임워크에 대한 이들의 전체 상동성에 기초하여, CDR 길이의 유사성, 표준 구조 동일성 또는 이들의 조합에 기초하여 선택될 수 있다.
인간화 항체는, 국제 특허 출원 공개 WO1090/007861호 및 WO1992/22653호에 기재된 것들과 같은 기술로 결합 친화도를 보존하기 위해 변경된 프레임워크 지지 잔기를 혼입시키거나(복귀 돌연변이), 예를 들어 항체의 친화도를 개선하기 위해 변이를 임의의 CDR에 도입시켜 원하는 항원에 대한 이들의 선택성 또는 친화도를 개선하도록 추가로 최적화될 수 있다.
인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 그들의 유전체 내에 담지하는 마우스 또는 래트와 같은 유전자도입 동물을 사용하여 표적 단백질에 대한 인간 항체를 생성할 수 있으며, 이는 예를 들어 미국 특허 제6,150,584호, 국제 특허 출원 공개 제WO99/45962호, 국제 특허 출원 공개 제WO2002/066630호, 제WO2002/43478호, 제WO2002/043478호, 및 제WO1990/04036호, 문헌[Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-9]; 문헌[Green et al. (1994) Nat Genet 7: 13-21]; 문헌[Green et al. (1998) J Exp Med 188: 483-95]; 문헌[Lonberg et al. (1995) Int Rev Immunol 13: 65-93]; 문헌[Bruggemann et al. (1991) Eur J Immunol 21: 1323-6]; 문헌[Fishwild et al. (1996) Nat Biotechnol 14: 845-51]; 문헌[Mendez et al. (1997) Nat Genet 15: 146-56]; 문헌[Green (1999) J Immunol Methods 231: 11-23]; 문헌[Yang et al. (1999) Cancer Res 59: 1236-43]; 문헌[Bruggemann et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8: 455-8]에 기재되어 있다. 이러한 동물의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실될 수 있고, 상동적 또는 비상동적 재조합을 사용하거나, 도입염색체(transchromosome)를 사용하거나, 미니유전자(minigene)를 사용하여, 하나 이상의 완전하거나 부분적인 인간 면역글로불린 유전자좌를 동물의 유전체로 삽입할 수 있다. Regeneron(http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT)(http://_www_omtinc_net), KyMab(http://_www_kymab_com), Trianni(http://_www.trianni_com), 및 Ablexis(http://_www_ablexis_com)와 같은 회사들이 상기 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해 지향된 인간 항체를 제공하는 데에 관여할 수 있다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 또는 그의 일부, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체(scFv), 또는 쌍을 이루지 않거나 쌍을 이루는 항체 가변 영역을 발현시키도록 조작된다(문헌[Knappik et al. (2000) J Mol Biol 296: 57-86]; 문헌[Krebs et al. (2001) J Immunol Methods 254: 67-84]; 문헌[Vaughan et al. (1996) Nat Biotechnol 14: 309-14]; 문헌[Sheets et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95: 6157-62]; 문헌[Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-8]; 문헌[Marks et al. (1991) J Mol Biol 222: 581-97]). 본 발명의 항체는, 문헌[Shi et al. (2010) J Mol Biol 397: 385-96] 및 국제 특허 출원 공개 제WO09/085462호에 기재된 바와 같이, 예를 들어 박테리오파지 pIX 외피 단백질과의 융합 단백질로서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 라이브러리는 인간 및/또는 사이노 TNFR에 결합하는 파지에 대해 스크리닝될 수 있고, 얻어진 양성 클론은 추가로 특성화될 수 있으며, Fab는 클론 용해물로부터 단리되어 전장 IgG로서 발현된다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5, 580,717호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호에 기재되어 있다.
면역원성 항원의 제조 및 단일클론 항체 생성은 임의의 적합한 기법, 예컨대 재조합 단백질 생성을 사용하여 실행될 수 있다. 면역원성 항원을 정제된 단백질, 또는 전세포, 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태로 동물에게 투여하 수 있거나, 항원은 상기 항원 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산으로부터 동물의 체내에서 드 노보(de novo)로 형성될 수 있다.
본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 VH/VL 영역은 또한 기존의 항-TNFR 수퍼패밀리 수용체 항체로부터 얻어질 수 있다.
미국 특허 제US8133983호, 미국 특허 제US7960515호, 미국 특허 출원 공개 제US2013/0280275호, 국제 특허 출원 공개 제WO2013/028231호, 및 미국 특허 출원 공개 제US2014/0377284호에 기재된 항-OX40 항체의 VH 및 VL 영역을 사용하여 본 발명의 항체를 조작할 수 있다. 추가로, 항-OX40 항체 MEDI-6469, BMS-986178, MOXR-0916, MEDI-6383, MEDI-0562, PF-04518600, 또는 GSK-3174998의 VH/VL 영역이 사용될 수 있다. 본 발명의 조작된 항-OX40 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있는 추가의 예시적인 VH 및 VL 영역은 하기와 같다:
서열 번호 51(제US2014/0377284호에 기재된 항체 SF2의 VH)
서열 번호 52(제US2014/0377284호에 기재된 항체 SF2의 VL)
서열 번호 53(제US2014/0377284호에 기재된 12H3VH1VL1의 VH)
서열 번호 54(제US2014/0377284호에 기재된 12H3VH1VL1의 VL)
서열 번호 55(제US2014/0377284호에 기재된 20E5VH3VL2의 VH)
서열 번호 56(제US2014/0377284호에 기재된 20E5VH3VL2의 VL)
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-CD40 항체의 VH 및 VL 영역은, 각각 미국 특허 제7,288,251호(항체 21.4.1) 및 미국 특허 제8,303,955호에 기재된 CP-870,893 및 인간화 S2C6, 및 국제 특허 출원 공개 제WO2001/056603호, 제WO2001/083755호, 제WO2013/034904호, 및 제WO2014/070934호에 기재된 항-CD40 항체의 것들이다. 본 발명의 조작된 항-CD40 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있는 추가의 예시적인 VH 및 VL 영역은 하기와 같다:
서열 번호 57(M9 항체의 VH)
서열 번호 58(M9 항체의 VL)
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-GITR 항체의 VH 및 VL 영역은 미국 특허 제7,812,135호, 제8,591,886호, 및 제7,618,632호, 또는 국제 특허 출원 공개 제WO2011/028683호, 제WO2013/039954호, 제WO2005/007190호, 및 제WO2007/133822호에 기재된 것들이다.
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-CD27 항체의 VH 및 VL 영역은 미국 특허 제US9169325호 및 미국 특허 출원 공개 제US20130183316호에 기재된 것들이다.
본 발명의 항체를 조작하기 위해 사용할 수 있는 항-CD137 항체의 VH 및 VL 영역은 미국 특허 제7288638호, 제8716452호, 및 제8821867호에 기재된 것들이다.
전장 이중특이성 항체로 조작된 본 발명의 항체는 본 발명의 범주 내에 있다.
"전장 항체"는 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 전장 항체 중쇄(HC)는 잘 알려진 중쇄 가변 및 불변 도메인 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 전장 항체 경쇄(LC)는 잘 알려진 경쇄 가변 및 불변 도메인 VL 및 CL로 이루어진다. 전장 항체는 어느 하나 또는 둘 모두의 중쇄에 C-말단 라이신(K)이 결여되어 있을 수 있다.
공발현을 사용하거나 무세포 환경에서의 시험관내에서 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 헤테로이량체 형성을 촉진하기 위해 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입함으로써, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 전장 이중특이성 항체를 생성할 수 있다. "Fab-아암" 또는 "하프 분자"는 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다.
Fab 아암 교환 반응은 이황화-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은, 각각이 별개의 에피토프, 즉 TNFR 상의 에피토프 및 제2 항원 상의 에피토프에 결합하는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 이중특이성 항체이다.
"동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
노브-인-홀(Knob-in-Hole)(Genentech), CrossMAb(Roche) 및 정전기적-일치(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y(Genentech), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono), Biclonic(Merus)을 사용하여 본 발명의 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체를 이중특이성 포맷으로 조작할 수 있다.
노브-인-홀 전략에서(예를 들어, 국제 출원 공개 제WO 2006/028936호 참조), 인간 IgG 내에 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용으로 인해 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 다음과 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
CrossMAb 기술에서는, Fab 아암 교환을 촉진하기 위해 "노브-인-홀" 전략을 이용하는 것에 더하여, 하프 아암들 중 하나는 생성되는 이중특이성 항체의 정확한 경쇄 쌍 형성을 보장하기 위해 교환된 CH1 및 CL 도메인을 갖는다(예를 들어, 미국 특허 제8,242,247호 참조).
한쪽 또는 양쪽 아암에서, 중쇄와 경쇄 사이에서 또는 이중특이성 항체 내의 중쇄 내에서 가변 또는 불변 도메인, 또는 두 도메인 모두를 교환함으로써 전장 이중특이성 항체를 생성하기 위하여 다른 크로스-오버 전략이 사용될 수 있다. 이들 교환은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2009/080254호, WO2009/080251호, WO2009/018386호 및 WO2009/080252호에 기재된 바와 같이 VH-CH1을 VL-CL로, VH를 VL로, CH3을 CL로 그리고 CH3을 CH1로 교환하는 것을 포함한다.
이중특이성 항체를 생성하기 위해 하나의 CH3 표면에서 양성 하전된 잔기 및 제2 CH3 표면에서 음성 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 제US2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 US2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 US2010/028637호, 또는 미국 특허 출원 공개 US2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같이 하기의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
이중특이성 항체를 생성하기 위하여 LUZ-Y 기술이 이용될 수 있다. 이 기술에서는, 문헌[Wranik et al. (2012) J Biol Chem 287: 43331-9]에 기재된 바와 같이, 류신 지퍼를 CH3 도메인의 C 말단 내로 첨가하여 모 mAb로부터의 이종이량체 조립을 유도하고, 이를 정제 후에 제거한다.
이중특이성 항체를 생성하기 위하여 SEEDbody 기술이 이용될 수 있다. SEEDbody는, 그의 불변 도메인에서, 선택된 IgG 잔기가 IgA 잔기로 치환되어 있어서, 이종이량체화를 촉진시키는데, 이는 미국 특허 출원 공개 제20070287170호에 기재된 바와 같다.
국제 특허 출원 공개 제WO2011/131746호(DuoBody technology)에 기재된 방법에 따라, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입하고 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 이중특이성 항체를 시험관내에서 생성할 수 있다. 상기 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체 및 제2 단일특이성 2가 항체는 이종이량체 안정성을 촉진하는 CH3 도메인에서의 소정 치환을 갖도록 조작되며; 항체는 힌지 영역의 시스테인이 다이설파이드 결합 이성질화를 거치기에 충분한 환원 조건 하에서 함께 인큐베이션되어; Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건을 최적으로 비환원성 상태로 되돌릴 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인, 및 베타-메르캅토에탄올이다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
항체 도메인 및 넘버링은 잘 알려져 있다. "비대칭"은 항체 내의 2개의 별도의 중쇄에서 2개의 CH3 도메인 내의 동일하지 않은 치환을 지칭한다. IgG1 CH3 영역은 전형적으로 IgG1 상의 잔기 341-446으로 이루어진다(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름).
본 발명의 항체는 다양한 잘 알려진 항체 형태로 조작될 수 있다.
약제학적 조성물/투여
본 발명은 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 활성 성분으로서 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. "담체"는 본 발명의 항체와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법 (예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정화제, 증점제, 윤활제, 및 착색제 등과 같은 생리적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 약 0.5 중량% 미만으로부터, 통상 약 1 중량% 이상까지, 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 수 있다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.
본 발명의 항체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은, 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자의 형태이고; 주사기, 이식 장치, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 함유된 제형; 또는 당업계에 잘 공지된 바와 같이 당업자에게 인정되는 다른 수단을 사용하여, 항체를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐, 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장)일 수 있다. 또는 당업자에 의해 인식되는 다른 수단을 사용하는데, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 종양내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내(i.v.) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 대상에게 투여될 수 있다. i.v. 주입은, 예를 들어 15, 30, 60, 90, 120, 180, 또는 240분, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간에 걸쳐 제공될 수 있다.
대상체에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하고 ("치료적 유효량"), 때때로 0.005 mg 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 0.05 mg 내지 약 30 mg/㎏ 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg/㎏, 또는 약 4 mg/㎏, 약 8 mg/㎏, 약 16 mg/㎏ 또는 약 24 mg/㎏, 또는, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 높을 수 있으며, 예를 들어 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏일 수 있다.
고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적에 기초해서, 예를 들어 500, 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m2일 수 있다. 환자를 치료하기 위해 통상 1 내지 8회 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 또는 그 횟수 이상의 용량이 제공될 수 있다.
본 발명의 항체의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체는 정맥내 주입에 의해 8 주 동안 매주 간격으로 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 추가적인 16 주 동안 2 주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 4 주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에서 항체는, 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 일 중 하나 이상에, 또는 대안적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 주 중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합에, 매 24, 12, 8, 6, 4, 또는 2 시간마다의 단회 또는 분할 용량, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여, 일일 투여량으로서 1 일당 약 0.1 내지 100 mg/㎏, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mg/㎏의 양으로 제공될 수 있다.
본 발명의 방법에서 항체는 또한, 암 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 암 진행에서의 사건의 발생의 개시를 지연시키고/시키거나, 암이 관해기에 있을 때 재발 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 잘 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
방법 및 용도
본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단적 유용성뿐만 아니라 치료적 유용성 및 예방적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 암 및 감염성 장애와 같은 다양한 장애를 치료, 예방, 및/또는 진단하기 위해 대상에게 투여되거나 배양 중인 세포에, 시험관내, 또는 생체외 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이, E430G 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 항체 내로 도입하여 TNFR 패밀리의 수용체에 특이적으로 결합하는 조작된 항체를 생성하는 단계, 및 조작된 항체를 효능적 활성을 향상시키기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원의 효능적 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이, E430G 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 항체 내로 도입하여 TNFR 패밀리의 수용체에 특이적으로 결합하는 조작된 항체를 생성하는 단계, 및 조작된 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원의 효능적 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이, E430G 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y를 포함하는 TNFR 패밀리의 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, E345R 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y를 포함하는 항-TNFR 수퍼패밀리 항체를 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 항체는 ADCC를 매개한다.
본 발명의 방법에서, 항체는 ADCP를 매개한다.
본 발명의 방법에서, 항체는 항체 가교결합에 독립적으로 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원의 효능적 활성을 향상시킨다.
본 발명의 방법에서, 항체는 임의로 ADCC를 감소시키는 제2 돌연변이(들)를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법에서, 대상체는 바이러스 감염을 갖는다.
본 발명의 방법에서, 대상체는 암을 갖는다.
본 발명의 방법에서, 암은 고형 종양이다.
본 발명의 방법에서, 고형 종양은 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 종양 괴사 인자 수용체 1(서열 번호 1), 종양 괴사 인자 수용체 2(서열 번호 2), 림포톡신 베타 수용체(서열 번호 3), OX40(서열 번호 4), CD40(서열 번호 5), Fas 수용체(서열 번호 6), 유인 수용체 3(서열 번호 7), CD27(서열 번호 8), CD30(서열 번호 9), CD137(서열 번호 10), 사멸 수용체 4(서열 번호 11), 사멸 수용체 5(서열 번호 12), 유인 수용체 1(서열 번호 13), 유인 수용체 2(서열 번호 14), RANK(서열 번호 15), 오스테오프로테게린(서열 번호 16), TWEAK 수용체(서열 번호 17), TACI(서열 번호 18), BAFF 수용체(서열 번호 19), 헤르페스바이러스 유입 매개체(서열 번호 20), 신경 성장 인자 수용체(서열 번호 21), B-세포 성숙 항원(서열 번호 22), GITR(서열 번호 23), TROY(서열 번호 24), 사멸 수용체 6(서열 번호 25), 사멸 수용체 3(서열 번호 26), 또는 엑토디스플라신 A2 수용체(서열 번호 27)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 OX40(서열 번호 4), CD27(서열 번호 8), CD40(서열 번호 5), CD137(서열 번호 10), 또는 GITR(서열 번호 23)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 OX40(서열 번호 4)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 CD27(서열 번호 8)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 CD40(서열 번호 5)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 CD137(서열 번호 10)이다.
본 발명의 방법에서, TNFR은 GITR(서열 번호 23)이다.
TNFR1/2/TNF-α, CD70/CD27/CD27, CD137/4-1BB, OX40/OX40L, CD40/CD40L, GITR/GITRL을 포함하는, TNFR 수퍼패밀리 구성원 및 그들의 리간드 중 다수는 암 요법을 위한 표적으로서 시사되어 왔으며(문헌[Bremer, Hindawi Publishin Corporation ISRN oncology Volume 2013, Article ID 371854, 25 pages; Sanmamed et al]), TNFR 수퍼패밀리 구성원을 표적으로 하는 몇몇 효능적 항체, 예컨대 항-CD40, 항-OX-40, 항-GITR, 항-CD27, 항-CD137 항체가 다양한 고형 종양뿐만 아니라, 비-호지킨 림프종 및 B-세포 악성종양과 같은 헴 악성종양에 대해 임상 개발 중이다. 항-CD40, 항-OX40, 항-GITR, 항-CD27, 항-CD137, 및 이펙터 기능성과 임의로 커플링된 그들의 향상된 효능적 활성의 관점에서 개선된 특성을 갖는 본 발명의 다른 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체는 고형 종양을 포함하는 다양한 암의 치료에서 치료적으로 효과적일 것임을 예상할 수 있다.
본 발명을 일반적인 개념으로 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이며, 이때 실시예는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 항-TNFR 수퍼패밀리 구성원 항체의 효능적 활성을 개선하기 위한 Fc 공학적 접근법
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리에 속하는 면역자극 수용체에 대해 지향된 효능적 항체는 암 면역요법을 위한 유망한 약물 후보로서 부각되고 있다. 그들의 효능적 활성 및/또는 이펙터 기능을 향상시킴으로써 항-TNFR 항체의 항-종양 활성을 증대시킬 수 있는 몇몇 Fc 공학적 접근법이 최근에 발견되었다.
항종양 면역을 자극하는 단일클론 항체는 암 치료제의 중요한 부류로서 부각되고 있다(문헌[Mellman et al. (2011) Nature 480: 480-9]; 문헌[Chen et al. (2013) Nat Rev Immunol 13: 227-42]). 면역 체크포인트 수용체 CTLA-4 및 PD-1을 표적화하는 항체는 진행된 흑색종, 폐암에 대한 단일요법으로서 승인되었고, 다른 유형의 인간 암의 치료에 대해 평가되었다. 억제 경로를 표적화하는 것 이외에, T 세포 및 항원 제시 세포 상의 면역자극 수용체에 대해 지향된 효능제 항체는 또한 항종양 면역을 자극할 수 있고 암 면역요법을 위한 임상 개발의 유망한 영역으로서 부각되고 있다(문헌[Schaer et al. (2014) J Immunother Cancer 2: 7]).
다수의 면역자극 수용체는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 수퍼패밀리에 속한다. 이들 중에서, OX40, CD27, 4-1BB, 및 GITR은 이펙터 T 세포 상에서 발현되고, 그들의 리간드 및 효능제 항체는 이들 수용체를 활성화하여 T 세포의 증식 및 활성화를 자극할 수 있다(문헌[Kanamaru et al. (2004)J Immunol 172:7306-14]; 문헌[Gramaglia et al. (1998) J Immunol 161: 6510-7]; 문헌[Pollok et al. (1993) J Immunol 150: 771-81]; 문헌[Ramakrishna et al. (2015) J Immunother Cancer 3: 37]). CD40은 항원 제시 세포 상에서 발현되고, 이 수용체의 활성화는 활성화된 T 세포에 대한 종양 항원의 더 효과적인 제시를 용이하게 한다(문헌[Mangsbo et al. (2015) Clin Cancer Res 21: 1115-26]). 다수의 증거는 이들 TNF 수용체에 대한 치료 항체의 효능적 활성이 그들의 항-종양 활성에 중요함을 나타냈다(문헌[Mangsbo et al. (2015) Clin Cancer Res 21: 1115-26]; 문헌[He et al. (2013) J Immunol 191: 4174-83]; 문헌[Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19: 101-13]). 반면에, 몇몇 TNFR 수퍼패밀리 구성원, 예컨대 OX40 및 GITR은 종양 면역을 음성 조절하는 조절 T 세포(Treg) 상에서 상승된 발현을 갖는다. 몇몇 연구는 항-OX40 및 항-GITR 항체가 항체의 이펙터 기능에 의해 종양 미세환경에서 조절 T 세포의 선택적 제거를 용이하게 할 수 있음을 규명하였다(문헌[Bulliard et al. (2013) J Exp Med 210: 1685-93]); 문헌[Bulliard et al. (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-80]). 조절 T 세포의 그러한 항체-매개 살해는 치료 항-OX40 및 항-GITR 항체의 항-종양 활성을 위한 이펙터 T 세포의 항체-매개 활성화보다 더 중요할 수 있다.
축적되는 증거는 면역조절 항체가 그들의 효능적 활성 및 이펙터 기능을 위해 상이한 유형의 Fc 수용체에 결합함을 나타냈다. 하류 신호전달 경로를 활성화하기 위해서는, TNFR 삼량체화가 필요하다. 그러나, 하나의 항체 분자는 통상적으로 충분한 TNF 수용체를 클러스터링하기에 충분하지 않으며; 대신, 시험관내 검정에서 수용체 활성화를 위해 항체 가교결합이 필요하다(문헌[Morris et al. (2007) Mol Immunol 44: 3112-21]). 마우스에서의 최근의 연구는, CD40(문헌[Li et al. (2011)Science 335:1030-4]; 문헌[White et al. (2013) Cancer Immunol Immunother 62: 941-8]), 사멸 수용체 5(DR5)(문헌[Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19: 101-13]; 문헌[Li et al. (2012) Proc Natl Acad Sci U S A 109: 10966-71]), 및 CD95(문헌[Xu et al. (2003) J Immunol 171: 562-8])를 포함하는 다수의 TNFR 표적에 대한 항체의 효능적 활성을 위해 억제성 FcγRIIB 수용체에 대한 결합이 결정적임을 나타냈다. FcγRIIB 수용체에 대한 IgG Fc의 가교결합은 하나 초과의 항체 분자를 다량체화할 수 있으며, 이는 결국 신호전달 경로 활성화를 위한 충분한 TNFR의 클러스터링을 용이하게 할 수 있다. 반면에, ADCC 및 ADCP와 같은 항체 이펙터 기능은 다양한 활성화 Fcγ 수용체와의 상호작용에 의존한다. 마우스에서의 연구는, 활성화 Fcγ 수용체가 종양내 조절 T 세포를 선택적으로 제거함으로써 면역조절 항-OX40 및 항-GITR 항체의 항종양 활성에 기여한다는 것을 규명하였다(문헌[Bulliard et al. (2013) J Exp Med 210: 1685-93]; 문헌[Bulliard et al. (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-80]).
인간 IgG 항체는 FcγRI을 제외한 대부분의 인간 Fc 수용체에 대한 결합 친화성이 저조하다(문헌[Guilliams et al. (2014) Nat Rev Immunol 14: 94-108]). 면역자극 TNF 수용체에 대한 효능제 항체의 항종양 활성을 최적화하기 위해, 하나의 접근법은 IgG 항체의 Fc 영역을 조작하여 그의 Fcγ 수용체 결합, 특히 TNF 수용체 항체의 효능작용을 매개하는 FcγRIIB 수용체와의 결합을 개선하는 것이다. 이와 관련하여, Chu 등은 향상된 FcγRIIB 결합 친화성을 갖는 IgG1 Fc에서의 S267E/L328F 돌연변이를 기재하였다(문헌[Chu et al. (2008) Mol Immunol 45: 3926-33]). 그러한 돌연변이로 조작된 항-CD19 항체는 1차 인간 B 세포의 B 세포 수용체-매개 활성화의 개선된 억제를 나타냈다. 그러나, 추가의 연구는 그러한 Fc 변이체가 또한 활성화 FcγRIIA 수용체의 R131 동종이형에 대한 향상된 결합을 갖는다는 것을 규명하였다(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]). 최근에, Mimoto 등은, FcγRIIA 수용체의 H131 또는 R131 동종이형에 대한 관련된 증가된 결합 없이 선택적으로 향상된 FcγRIIB 결합을 갖는, 집합적으로 V12 돌연변이라고 명명된, IgG1 Fc에서의 6 가지 돌연변이의 세트를 보고하였다(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]). 조작된 V12 돌연변이를 갖는 항-CD137 효능적 항체는 FcγRIIB 결합에 의존하는 훨씬 향상된 효능적 활성을 나타냈다.
FcγRIIB 결합을 최적화하는 것이 실행가능한 접근법이지만, 그러한 조작된 항체의 효능적 활성은 국소 미세환경에서의 Fcγ 수용체 발현에 크게 의존하며, 그러한 항체의 효능은 해부학적 작용 부위로 제한될 수 있다. Fcγ 수용체 결합에 독립적으로 면역자극 항체의 효능작용을 증대시키기 위한 노력으로, 최근에 White 등은 인간 IgG2가 CD40, 4-1BB, 및 CD28 수용체에 대한 면역자극 항체에 과효능적 활성을 부여할 수 있다는 것을 보고하였다(문헌[White et al. (2015) Cancer Cell 27: 138-48]). 이러한 활성은 IgG2 아형의 힌지 영역 내의 이황화물 결합의 독특한 구성에 의해 부여되며, FcγRIIB 결합에 의존하지 않는다. 반면에, FcγRIIB에 대한 가교결합의 목적이 단지 수용체 활성화를 위한 효능적 항체의 클러스터링을 증가시키는 것이라면, 본 발명자들은 항체 다량체화를 촉진할 수 있는 Fc 돌연변이가 FcγRIIB 가교결합을 필요로 하지 않으면서 TNF 수용체에 대한 항체의 효능작용을 향상시킬 수 있다는 가설을 제기했다. Diebolder 등은 세포 표면 상의 표적에 결합시에 IgG 항체가 육량체로 형성되는 것을 선택적 Fc 돌연변이가 용이하게 할 수 있다는 것을 보고하였다(문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3]). 그러한 IgG 육량체가 보체-의존성 세포독성(CDC)을 크게 활성화할 수 있는 것으로 보고되었지만, 다른 출원에 대해 본 발명자들은 TNF 수용체를 인식하는 올리고머화된 항체가 수용체 클러스터링을 촉진함으로써 그러한 수용체를 활성화할 수 있다는 주장을 제시한다.
이 연구는 항-OX40 항체의 효능작용의 향상에 대한 상이한 Fc 공학적 접근법의 평가를 기재한다. 한편, 조작된 항체의 ADCC 및 ADCP 이펙터 기능에 대한 Fc 돌연변이의 효과를 또한 평가하였다. 그러한 연구는 개선된 항-종양 활성을 갖는 OX40 및 다른 TNF 수용체에 대한 조작된 항체의 설계를 안내하는 것을 도울 수 있다.
실시예 2 재료 및 방법
항-OX40 항체의 Fc 조작
항-OX40 항체 SF2의 VH 및 VL 영역(VH: 서열 번호 51, VL: 서열 번호 52)을 인간 야생형 IgG1 또는 IgG2 상에 클로닝하고, 선택된 치환을 Fc 상에 조작하여 항체 및 이펙터 기능의 효능적 활성에 대한 치환의 효과를 평가하였다. 생성된 항체의 명칭 및 그들의 Fc 치환이 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
서열 번호 63 E345R 돌연변이를 갖는 IgG1
서열 번호 64 E430G 돌연변이를 갖는 IgG1
서열 번호 65 E345R/E430G 돌연변이를 갖는 IgG1
서열 번호 66 E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 갖는 IgG1
서열 번호 67 E345R 돌연변이를 갖는 IgG2sigma
항체의 발현 및 정제
트랜스펙션 키트 설명서(Life Technologies)에 따라 항체 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 암호화하는 플라스미드를 1:3(HC: LC) 몰 비로 Expi293F 세포 내로 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한지 5 일 후에 세포를 스핀 다운하고, 상청액을 0.2 μm 필터에 통과시켰다. 항체 발현의 역가를 Octet(ForteBio)를 사용하여 정량화하였다. 키트 설명서(GE Healthcare Life Sciences)에 따라 사전 패킹된 단백질 A 스핀 컬럼을 사용하여 항체 정제를 실행하였다. 정제된 항체를 투석에 의해 DPBS, pH7.2로 완충액-교환하고, 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 환원된 샘플 및 비-환원된 샘플의 SDS-PAGE 및 고성능 크기-배제 크로마토그래피(HP-SEC)에 의해 분자의 품질 및 완전성을 평가하였다.
NanoBRET 단백질-단백질 상호작용 검정
항-OX40 SF2 항체의 경쇄에 대한 코딩 서열을, 각각 C-말단 Nanoluc 및 Halotag 서열을 갖는 프레임에서 pNLF-C 및 pHTC halotag 벡터(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)내로 클로닝하였다. 이들 경쇄는 OX40SF2IgG1, OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y 항체에 대한 중쇄와 쌍을 이루어, 경쇄의 C-말단에 부착된 Nanoluc 또는 Halotag를 갖는 Fc 조작된 SF2 항체를 발현시켰다. 표준 단백질 A 스핀 컬럼을 사용하여 이들 변형된 항체를 정제하였다.
NanoBRET 단백질-단백질 상호작용 검정(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)에 의해 세포 표면 상의 항체 다량체화를 연구하기 위하여, 0.25 x105개의 HEK-Blue: OX40 세포를 96-웰 검정 플레이트의 각각의 웰에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음 날에, 50 μl 검정 배지(Opti-MEM 저혈청 배지(reduced serum medium), 페놀 레드 없음 + 4% FBS)중의 동일한 농도의 Nanoluc-태깅된 항체(공여자) 및 Halotag-태깅된 항체(수용자)를 세포에 적용하였다. 50 μl 검정 배지 중에 1:1000으로 희석된 Halotag 618 리간드를 실험 웰에 첨가하고, 검정 배지 중에 DMSO를 1:1000으로 희석함으로써 리간드가 없는 대조군 웰을 또한 설정하였다. 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 검정 배지로 2회 세척하고, 100 μl 검정 배지 중에 재현탁시켰다. FBS가 없는 검정 배지 중에 1:200으로 희석된 25 μl의 Nano-Glo 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 30 초 동안 진탕한 후에, 공여자 방출(460 nm) 및 수용자 방출(618 nm)을 Envision에 의해 측정하였다. milliBRET 단위(mBU)를 갖는 원시 NanoBRET 비(raw NanoBRET ratio) 값을 RawBRET= 618 nmEm/460 nmEm* 1000으로서 계산하였다. 공여자-기여 배경 또는 블리드 스루(bleed through)를 감안하기 위해, milliBRET 단위를 갖는 보정된 NanoBRET 비 값을 CorrectedBRET = RawBRET실험 샘플 - RawBRET기간드가 없는 대조군 샘플로서 계산하였으며, 이는 단백질-단백질 상호작용으로 인한 생물발광 단백질 공여자로부터 형광 단백질 수용자로의 에너지 전달을 반영한다.
유세포 분석 염색
인간 FcγRI(NM_000566)(서열 번호 59), FcγRIIA(NM_021642)(서열 번호 60), FcγRIIB(NM_004001)(서열 번호 61), 및 FcγRIIIA(NM_000569)(서열 번호 62)(Origene)를 암호화하는 cDNA를 발현하는 플라스미드를 Expifectmine293 트랜스펙션 키트(Life Technologies)에 의해 Expi293F 세포 내로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48 시간에 유세포 분석 검정을 수행하였다. 트랜스펙션된 Fc 수용체의 발현을 확인하기 위해, 그들의 특이적 항체, FcγRI에 대한 10.1(BD Pharmingen), FcγRIIA에 대한 IV.3(StemCell Technologies), FcγRIIB에 대한 2B6(자체 제조)(문헌[Veri et al. (2007) Immunology 121: 392-404]), 및 FcγRIIIA에 대한 3G8(BD Pharmingen)을 양성 대조군으로서 유세포 분석 염색에 사용하였다. Raji 세포(ATCC: CCL-86)를 또한 사용하여 FcγRIIB 수용체에 대한 항-OX40 항체의 결합을 시험하였다.
웰 당 2x105개의 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, BSA 염색 완충액(미국 산호세 소재의 BD Biosciences) 중에 30 분 동안 4℃에서 차단하였다. 세포를 얼음 상에서 1.5 시간 동안 4℃에서 시험 항체와 함께 인큐베이션하였다. BSA 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 R-PE 표지된 항-인간 또는 항-마우스 IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories)와 함께 45 분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충액 중에 2회 세척한 후, 1:200으로 희석된 DRAQ7 생/사(live/dead) 염색(미국 댄버스 소재의 Cell Signaling Technology)을 함유하는 염색 완충액 150 μL 중에 재현탁시켰다. 염색된 세포의 PE 및 DRAQ7 신호를, 각각 B2 및 B4 채널을 사용하여 Miltenyi MACSQuant 유세포 분석기(미국 어번 소재의 Miltenyi Biotec)에 의해 검출하였다. 살아있는 세포를 DRAQ7 배제에 대해 게이팅(gate)하였고, 수집한 10,000개 이상의 살아있는 이벤트에 대해 기하 평균 형광 신호를 결정하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 분석에 사용하였다. 데이터는 항체 농도 대 평균 형광 신호의 로그함수로서 플로팅하였다. GraphPad Prism 6(GraphPad Software, Inc.)에 의해 비선형 회귀 분석을 수행하고 EC50 값을 계산하였다.
서열 번호 59
서열 번호 60
서열 번호 61
서열 번호 62
HEK-Blue NFkB 리포터 검정
NF-κB-유도성 프로모터(IFN-β 최소 프로모터)의 제어 하에 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 HEK-Blue™ Null 1 세포 내로 OX40 발현 플라스미드(pUNO1-hOX40)를 트랜스펙션시킴으로써, 인간 OX40을 발현하는 안정한 HEK-Blue 리포터 세포주(HEK-Blue: OX40)를 확립하였다. 리포터 검정을 위해, 200 μl의 배양 배지 중에 재현탁된 1x105개의 HEK-Blue: OX40 세포를 96-웰 검정 플레이트의 각각의 웰에 분취하고 OX40 리간드 또는 항-OX40 항체를 첨가하였다. 가교결합 효과를 시험하기 위하여, 1 μl의 단백질 G 자기 비드(Pierce) 또는 1x105개의 Raji 세포를 동일한 검정 웰에 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후에, Quanti-Blue 검출 키트(Invivogen)를 사용하여 유도된 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자 발현을 정량화함으로써, 항체의 효능적 활성을 평가하였다. 약술하면, 40 μl의 세포 배양 상청액을 160 μl의 Quant-Blue 시약과 혼합하고, 적절한 청색 색상이 발생할 때까지 37℃에서 인큐베이션하였다. SpectraMax 마이크로플레이트 판독기(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 Molecular Devices)를 사용하여 650 nm에서 OD를 측정하였다. 항-OX40 항체의 효능적 활성을 1 ㎍/ml의 OX40 리간드에 의해 유도된 것에 대한 퍼센트 활성으로서 정규화하였다.
ADCC 검정
제조업체(Promega)에 의해 지시되는 바와 같이 ADCC 리포터 생물검정에 의해 항-OX40 항체의 ADCC 활성을 평가하였다. 약술하면, 96-웰 플레이트 내에 하룻밤 플레이팅된 웰 당 25,000개의 HEK-Blue: OX40 세포를, FcγRIIIA 수용체의 활성화가 루시퍼라제 리포터의 발현을 유발하는 조작된 이펙터 세포와 혼합하였다. 항-OX40 항체를 세포에 첨가하고, 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Bio-Glo 루시퍼라제 시약을 첨가하고, 루시퍼라제 신호를 Envision에 의해 정량화하였다. 시험 항체가 첨가되지 않은 것에 대한 루시퍼라제 신호의 활성화의 배수로서 항-OX40 항체의 ADCC 활성을 표현하였다.
ADCP 검정
터보 GFP 형질도입 입자(Sigma Aldrich)로 HEK-Blue: OX40 세포를 감염시킴으로써 GFP를 발현하는 OX40 표적 세포주를 확립하였다. 안정한 GFP-발현 세포를 퓨로마이신으로 선택하였다. CD16 고갈이 없는 음성 인간 단핵구 농축 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 PBMC(Biologics Specialty)로부터 인간 CD14+CD16+ 단핵구를 단리하였다. 단리된 단핵구를 10% FBS를 함유하는 X-VIVO-10 배지(Lonza) 중에 플레이팅하고, 25 ng/ml의 대식세포 콜로니-자극 인자(R&D Systems)를 7 일 동안 첨가함으로써 단핵구로부터 대식세포를 분화시켰다. IFNγ(50 ng/ml; R&D Systems)를 분화의 최종 24 시간 동안 첨가하였다. ADCP 검정을 위해, 96-웰 U-바닥 플레이트에서 200 μl의 배지(DMEM + 10% FBS) 중에 1 × 105개의 세포/웰의 분화된 대식세포를 0.25 × 105개의 세포/웰의 GFP-발현 HEK-Blue: OX40 세포(4 : 1 비)와 혼합하였다. 시험 항체를 첨가하고 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Accutase(Sigma)를 사용하여 세포를 탈착시키고 BSA 염색 완충액 중에 재현탁시켰다. Alexa Fluor 647(Invitrogen)에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체(BD Biosciences)로 대식세포를 염색하였다. Miltenyi MACSQuant 유세포 분석기(미국 오번 소재의 Miltenyi Biotec)를 사용하는 유세포 분석에 의해 GFP 양성 HEK-Blue: OX40 표적 세포 및 Alexa647 양성 대식세포를 확인하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 사용하여 데이터를 분석하고, 하기 수학식을 사용하여 GFP 형광의 감소를 측정함으로써 ADCP-매개 세포 살해를 결정하였다: 살해된 표적 세포의 백분율=((최저 농도의 항체를 갖는 GFP+, CD11b-, CD14- 세포의 백분율)-(시험 농도의 항체를 갖는 GFP+, CD11b-, CD14- 세포의 백분율))/(최저 농도의 항체를 갖는 GFP+, CD11b-, CD14- 세포의 백분율)×100.
CDC 검정
항-OX40 항체의 CDC 활성을 보체-매개 세포 살해 검정에 의해 평가하였다. 약술하면, 1x 105개의 HEK-Blue:OX40 세포를 6.7%(v/v)의 토끼 보체(캐나다 벌링턴 소재의 Cedar Lane Labs) 및 시험 항체와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 용해된 HEK-Blue: OX40 세포의 세포질로부터상청액 내로 방출된 락테이트 탈수소효소 활성을 제조업체의 설명서(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 Roche Diagnostics)에 따라 세포독성 검출 키트에 의해 측정하였다. 보체-매개 세포독성은 0.67%(v/v)의 Triton X-100에 의해 용해된 것에 대한 퍼센트 세포독성으로서 표현하였다.
실시예 3. 항-OX40 항체의 효능작용의 평가를 위한 NFκB 리포터 검정의 확립
TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 OX40은 TNF 수용체-관련 인자(TRAF)에 결합함으로써 핵 인자 카파B(NFkB) 신호전달 경로를 활성화한다. OX40 항체의 효능적 활성에 대한 Fc 조작의 기여를 연구하기 위하여, NFκB 유도성 프로모터 하에 인간 OX40 및 SEAP를 안정하게 발현하는 HEK-Blue™ 리포터 세포주를 확립하였다. OX40 리간드는 SEAP 리포터 유전자 발현을 유발하는 트랜스펙션된 OX40 수용체를 용량-의존적으로 활성화하였다(도 1a). 이어서, 이러한 리포터 검정에 의해 OX40SF2IgG1 항체를 그의 효능적 활성에 대해 평가하였다. 항체 단독은 효능적 활성을 거의 나타내지 않았지만, 단백질 G 비드 상에 고정된 OX40SF2IgG1 항체는 용량-의존적 방식으로, 그리고 1000 ng/ml에서 OX40 리간드보다 더 양호한 수준으로 리포터 유전자 발현을 자극할 수 있으며(도 1a), 이는 항체 가교결합이 효능적 활성에 필요함을 나타낸다.
최근의 연구는 FcγRIIB가 가교결합 활성을 제공하고 TNF 수용체 항체의 효능적 활성을 용이하게 할 수 있음을 규명하였다(문헌[Li et al. (2012) Cell Cycle 11: 3343-4]). FcγRIIB가 주로 발현되는 인간 B 림프아구성 Raji 세포와 HEK-Blue: OX40 세포를 공동 배양함으로써 리포터 검정에서 FcγRIIB 가교결합 효과를 평가하였다(문헌[Rankin et al. (2006) Blood 108: 2384-91]). 그러나, Raji 세포와의 공동 배양은 천연 IgG1을 갖는 SF2 항체의 효능적 활성을 유의적으로 향상시키지 못하였다(도 1b).
실시예 4. S267E/L328F 및 V12 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 특성화
항체 Fc 내의 S267E/L328F 돌연변이 및 E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R 돌연변이(본 명세서에서 V12 돌연변이로 지칭됨)는 FcγRIIB 수용체에 대한 항체의 결합을 향상시키는 것으로 확인되었다. 항-OX40 항체에 대한 그러한 돌연변이의 효과를 평가하기 위하여, 항-OX-40 항체 SF2를 S267E/L328F 이중 돌연변이(OX40SF2IgG1S267E/L328F)및 V12 돌연변이(OX40SF2IgG1V12)를 갖는 IgG1로서 클로닝하였다.
FcγR에 대한 결합
일시적으로 트랜스펙션된 Expi293F 세포 상에서 발현된 다양한 FcγR에 대한 조작된 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 평가하였다. FcγRIIB에 대해, 천연 IgG1을 갖는 OX40SF2 항체는 결합이 저조하지만, 조작된 Fc 돌연변이는 FcγRIIB를 우선적으로 인식하는 항체인 2B6(431 ng/ml)과 유사하고 OX40SF2IgG1의 것보다 훨씬 더 양호한 EC50(OX40SF2IgG1S267E/L328F에 대해 459 ng/ml 및 OX40SF2IgG1V12에 대해 502 ng/ml)으로 FcγRIIB에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는 항-OX40 항체를 강력하게 촉진한다(도 2a). 유사한 유세포 분석을 수행하여, 일시적으로 트랜스펙션된 Expi293F 세포 상에서 발현된 FcγRIIA의 R131 동종이형에 대한 조작된 항-OX40 항체의 결합을 평가하였다. OX40SF2IgG1V12는 OX40SF2IgG1과 유사하게 FcγRIIA에 대한 결합이 저조하였지만, S267E/L328F 돌연변이는 20배 더 양호한 효능으로 FcγRIIAR131에 대한 더 강력한 결합(EC50: 216 ng/ml)을 용이하게 한다(도 2b). 이러한 데이터는, V12 돌연변이의 효과가 더 특이적이지만, S267E/L328F 및 V12 돌연변이 둘 모두가 향상된 FcγRIIB 결합을 용이하게 한다는 이전의 발견과 일치한다.
FcγRI의 경우, OX40SF2IgG1은 326 ng/ml의 EC50으로 높은 친화성을 나타냈다(도 2c). OX40SF2IgG1S267E/L328F 항체는 OX40SF2IgG1과 유사한 결합 특성을 나타냈지만, V12 돌연변이는 FcγRI에 대한 OX40SF2IgG1V12 항체의 결합을 유의적으로 제거하였다. FcγRIIIA 수용체에 대한 조작된 항-OX40 항체의 결합을 또한 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. OX40SF2IgG1 항체는 744 ng/ml의 EC50으로 FcγRIIIA에 대한 결합을 나타냈지만, OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12는 FcγRIIIA에 대한 결합 활성을 나타내지 않았다(도 2d).
효능작용
S267E/L328F 및 V12 돌연변이가 FcγRIIB에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는 OX40SF2IgG1 항체를 용이하게 하므로, 이들 향상된 결합이 항-OX40 항체의 증가된 효능작용을 유발할 수 있는지 여부를 HEK-Blue NFκB 리포터 검정에 의해 평가하였다. 먼저, Raji 세포에 대한 조작된 항-OX40 항체의 결합을 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. FcγRIIB 수용체로 트랜스펙션된 Expi293F 세포에 비교하여 효능은 덜하지만(도 2a), OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12는 Raji 세포에 대한 용량-의존적 결합을 나타냈으나, OX40SF2IgG1은 그렇지 않았다(도 3a). Raji 세포에 대한 결합이 FcγRIIB에 의해 매개됨을 확인하기 위하여, Raji 세포를 5 ㎍/ml의 2B6 항체로 전처리한 후, 조작된 항-OX40 항체의 Raji 세포에 대한 결합을 평가하였다. 2B6 항체에 의한 Raji 세포 상의 FcγRIIB의 사전-차단은 Raji 세포에 대한 OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12의 결합을 유의적으로 제거하였음이 관찰되었다(도 3b).
HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서, OX40SF2IgG1S267E/L328F 또는 OX40SF2IgG1V12 중 어느 것도 Raji 세포의 부재 하에 유의적인 효능적 활성을 나타내지 않았다. 그러나, 공동 배양된 Raji 세포 및 HEK-Blue: OX40 세포를 이용하면, 이들 조작된 항-OX40 항체는 동일한 농도에서의 OX40 리간드에 비교하여 1000 ng/ml에서 2배 초과의 더 양호한 효능으로 극적으로 증가된 효능작용을 나타냈다(도 3c 및 도 3d). 한편, 2B6 항체를 첨가하여 Raji 세포 상의 FcγRIIB를 사전-차단했을 때, OX40SF2IgG1S267E/L328F 및 OX40SF2IgG1V12 항체에 대한 효능작용의 Raji 세포-의존적 향상은 유의적으로 제거되었으며(도 3c 및 도 3d), 이는 조작된 항체의 효능적 활성이 FcγRIIB 가교결합에 의해 매개되었음을 암시한다.
Fc 이펙터 기능
S267E/L328F 및 V12 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 ADCC 활성을 리포터 생물검정에 의해 연구하였으며, 여기서 이펙터 세포 내의 생물발광 리포터 유전자 발현은 FcγRIIIA-매개 ADCC 활성화를 반영한다. HEK-Blue: OX40 표적 세포를 FcγRIIIA를 발현하는 이펙터 세포와 공동 배양했을 때, OX40SF2IgG1은 리포터 유전자 발현을 용량-의존적으로 활성화하였다. 그러나, OX40SF2IgG1S267E/L328F 또는 OX40SF2IgG1V12 중 어느 것도 리포터 유전자 발현을 유도하지 않았으며(도 4a), 이는 S267E/L328F 및 V12 돌연변이가 OX40SF2IgG1 항체의 ADCC 활성을 제거하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 조작된 항체에 있어서 FcγRIIIA에 대한 결합 활성의 손실과 일치한다(도 2d).
S267E/L328F 및 V12 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 항체 의존성 세포 식작용(ADCP) 활성을 또한, 단리된 단핵구로부터 분화된 대식세포에 의한 GFP-발현된 HEK-Blue: OX40 세포의 식작용을 평가하는 검정에서 연구하였다. OX40SF2IgG1 항체는 대식세포에 의한 HEK-Blue: OX40 표적 세포의 살해를 용량-의존적으로 매개하였다. S267E/L328F 또는 V12 돌연변이 중 어느 것도 OX40SF2IgG1 항체의 ADCP 활성을 유의적으로 변경하지 않았다(도 4b). 분화된 대식세포에 대한 조작된 항-OX40 항체의 결합을 유세포 분석 검정에 의해 평가하였다. OX40SF2IgG1S267E/L328F 항체는 OX40SF2IgG1 항체와 유사한 대식세포에 대한 결합 친화성을 가진 반면에, OX40SF2IgG1V12 항체는 ADCP 검정에서 활성이지만 유의적으로 감소된 대식세포에 대한 결합을 가졌다(도 4c).
토끼 보체의 존재 하에 용해 HEK-Blue: OX40 세포를 평가하는 검정에서 항체-매개 CDC를 연구하였다. OX40SF2IgG1 항체는 10,000 ng/ml까지 HEK-Blue:OX40 표적 세포에 대한 유의적인 CDC 활성을 유발하지 않았다. 마찬가지로, V12 또는 S267E/L328F 돌연변이 중 어느 것도 천연 인간 IgG1 Fc 도메인을 갖는 항체에 대해 더 높은 CDC 활성을 촉진하지 않았다(도 4d).
실시예 5. 단독 또는 조합 E345R, E430G, 및 S440Y 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 특성화
Diebolder 등은 세포 표면 항원에 결합될 때 IgG1 항체의 육량체화를 유도하고 항체 이펙터 기능 ADCC 및 CDC를 향상시킨 Fc 돌연변이의 세트(E345R, E430G, 및 S440Y)를 확인하였다(문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3]). 그러한 다량체화된 항체는 수용체 활성화를 위한 전제 조건인 TNFR 수퍼패밀리 구성원의 응집을 용이하게 함으로써 항-TNFR 수퍼패밀리 항체의 효능작용을 향상시킬 수 있다는 가설이 제기되었다.
가설을 시험하기 위하여, 단일 E345R, E430G, 및 S440Y 돌연변이 또는 조합 돌연변이를 IgG1 상의 항-OX40 항체 SF2 상에 조작하고, 표 3에 나타낸 바와 같이 생성된 항체 OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1 E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1 E345R/E430G/S440Y를 특성화하였다.
항체 다량체화
SEC 분석은 OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G 항체가 마치 OX40SF2IgG1처럼 용액 중의 단량체로서 존재함을 규명하였다. 그러나, SEC 분석은 삼중 돌연변이된 항체 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y에 대해 약 900 kDa 피크를 나타냈으며, 이는 그 항체에 대한 육량체의 존재를 나타낸다. 이러한 관찰은 E345R/E430G/S440Y 돌연변이가 용액상에서 용이하게 육량체 형성을 촉진한다는 보고된 발견과 일치한다(문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3]).
조작된 항체가 세포 표면에서 항원에 결합시에 다량체화되는지 여부를 평가하기 위하여, NanoBRET™ 단백질-단백질 상호작용(PPI) 검정을 수행하였다. 이 분석은 생물발광 단백질 공여자로부터 형광 단백질 수용자로의 에너지 전달을 측정함으로써 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 근접-기반 검정(proximity-based assay)이다. 생성된 항체 OX40SF2IgG1E345R, OX40SF2IgG1E430G, OX40SF2IgG1E345R/E430G, 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y를 각각 공여자 및 수용자로서 항체 경쇄의 C-말단에 부착된 Nanoluc® 루시퍼라제 또는 형광 표지된 Halo Tag®를 갖도록 추가로 조작하였다. 태깅된 항체는 HEK-Blue NFκB 리포터 검정에서 상응하는 비-태깅된(un-tagged) 항체와 유사한 기능적 활성을 나타냈다(데이터는 나타내지 않음). 공여자 및 수용자 항체를 HEK-Blue: OX40 세포에 적용함으로써 NanoBRET PPI 검정을 수행하였고, 계산된 보정된 NanoBRET 비는 다량체화된 항체의 회합을 반영한다. OX40SF2IgG1 항체는 배경 보정된 NanoBRET 비(background corrected NanoBRET ratio)를 나타냈지만, IgG 육량체화를 촉진하는 돌연변이를 갖는 SF2 항체는 10 내지 1000 ng/ml의 농도에 걸쳐 훨씬 더 높은 보정된 NanoBRET 비를 나타냈다(도 5). 보정된 NanoBRET 비 값에 의해 반영되는, 세포 표면에서의 항체 회합의 정도는 하기 순서였다: OX40SF2IgG1E345R/E430G > OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y > OX40SF2IgG1E345R > OX40SF2IgG1E430G>OX40SF2IgG1. 결과는, 야생형 IgG1을 제외한 모든 항체가, 회합의 정도는 다르지만 세포 표면 상에서 다량체화되었음을 나타냈다.
조작된 항-OX40 항체의 개선된 효능작용은 FcγRIIB 가교결합에 독립적이다
조작된 항체를 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에서 특성화하여, 항체의 효능적 활성에 대한 E345R, E430G, 및 S440Y 치환의 효과를 평가하였다. 생성된 모든 항체는 효능적 활성을 나타냈다. OX40SF2IgG1E345R은, 항체가 가장 높은 정도의 다량체화를 갖지는 않았지만(도 5), OX40 리간드의 활성에 비교할 때 가장 많이 개선된 효능적 활성을 나타냈다(도 6a).
OX40SF2IgG1E430G는 가장 적게 개선된 효능적 활성을 나타낸 반면에, OX40SF2IgG1 E345R/E430G 및 OX40SF2IgG1E345R/E430G/S440Y는 OX40SF2IgG1E345R과 OX40SF2IgG1E430G 사이의 효능작용의 정도를 나타냈다(도 6a).
E345는 IgG 아형들 중에서 보존된 잔기이다. 침묵 IgG2sigma Fc를 갖는 항-OX40 항체 상에 E345R 돌연변이를 또한 조작하여, 항체 OX40SF2IgG2sigmaE345R을 생성하였다. HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정은, OX40SF2IgG2sigma는 효능적 활성을 거의 갖지 않는 반면에(도 6c), OX40SF2IgG2sigmaE345R은 용량-의존적 방식으로 효능작용을 나타냈음을 규명하였다(도 6d). 이는 E345R 돌연변이가 다중 IgG 아형들에 걸쳐 효능작용 향상을 용이하게 할 수 있음을 나타냈다.
FcγRIIB 가교결합은 IgG 아형에 따라 E345R 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 효능작용을 추가로 부스팅한다
E345R 돌연변이는 FcγRIIB 가교결합에 독립적으로 IgG1 또는 IgG2sigma Fc를 갖는 항-OX40 항체의 효능작용을 용이하게 할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 Raji 세포와 공동 배양된 HEK-Blue: OX40 세포에 조작된 항체를 적용한 HEK-Blue™ NFκB 리포터 검정에 의해 FcγRIIB 가교결합의 효과를 연구하였다. Raji 세포의 존재는 OX40SF2IgG1E345R 항체의 효능작용을 추가로 부스팅할 수 있으며, Raji 세포 공동 배양이 없는 경우에 비교하여 시험 농도에 걸쳐 활성의 2 배 초과의 증가가 있는 것으로 관찰되었다(도 6b). 2B6 항체를 첨가하여 Raji 세포 상의 FcγRIIB 수용체를 사전-차단했을 때, OX40SF2IgG1E345R에 대한 효능작용의 Raji 세포-매개 부스팅은 완전히 제거되었고, 효능적 활성은 Raji 세포 공동 배양이 없는 경우와 유사한 수준으로 감소되었으며, 이는 효능작용의 부스팅이 FcγRIIB 가교결합에 의해 유도됨을 암시한다.
유사한 검정을 설정하여, E345R 돌연변이의 존재 또는 부재 하의 OX40SF2IgG2sigma 항체의 효능작용에 대한 FcγRIIB 가교결합을 평가하였다. Raji 세포의 존재는 OX40SF2IgG2sigma 또는 OX40SF2IgG2sigmaE345R 항체의 효능적 활성을 부스팅하지 못한 것으로 밝혀졌다(도 6c 및 도 6d). 이 데이터는 E345R 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체에 대한 효능작용의 Raji 세포 매개 부스팅이 IgG 아형에 의존하며, IgG1 Fc 에는 효과가 있지만 침묵 IgG2sigma Fc에는 효과가 없음을 나타냈다.
E345R 돌연변이를 갖는 조작된 항-OX40 항체의 이펙터 기능
E345R 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 ADCC 활성을 FcγRIIIA-매개 ADCC 리포터 생물검정에 의해 연구하였다. E345R 돌연변이는 항-OX40 항체의 ADCC를 개선하였다. OX40SF2IgG1E345R은 OX40SF2IGG1에 비교할 때 개선된 ADCC를 가졌다(도 7a). 반면에, OX40SF2IgG2sigma는 ADCC 활성을 나타내지 않았고, OX40SF2IgG2sigma 상으로의 E345R 돌연변이의 도입은 ADCC에 효과가 없었다.
또한, E345R 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체의 ADCP 활성을 분화된 대식세포에 의한 GFP-발현된 HEK-Blue: OX40 세포의 식작용에 의해 연구하였다. OX40SF2IgG1 항체는 대식세포에 의한 HEK-Blue: OX40 표적 세포의 살해를 용량-의존적으로 매개한 반면에, E345R 돌연변이의 도입은 OX40SF2IgG1 항체의 ADCP 활성을 단지 미약하게 향상시켰다(도 7b). 반면에, OX40SF2IgG2sigma는 ADCP 활성을 갖지 않았지만, OX40SF2IgG2sigma 상으로의 E345R 돌연변이의 도입은 ADCP를 개선하였다(도 7b).
토끼 보체의 존재 하에 용해 HEK-Blue: OX40 세포를 평가하는 검정에서 항체-매개 CDC를 연구하였다. OX40SF2IgG1 항체는 HEK-Blue: OX40 표적 세포에 대한 유의적인 CDC 활성을 매개하지 않았지만,E345R 돌연변이는 더 높은 CDC 활성을 갖는 OX40SF2IgG1 항체를 용량-의존적으로 촉진하였다. 반면에, OX40SF2IgG2sigma 항체는 이러한 검정에서 CDC 활성을 갖지 않았고, OX40SF2IgG2sigma 항체 상의 E345R 돌연변이는 CDC 활성에 있어서의 그의 침묵을 변화시키지 않았다(도 7c).
논의
면역자극 TNFR 수퍼패밀리 구성원들에 대해 지향된 효능적 항체는 암 요법을 위한 유망한 약물로서 부각되고 있다. 최근의 Fc 공학적 노력은 치환 S267E/L328F 및 V12를 Fc 내로 도입함으로써 FcγRIIB와 그들의 결합을 최적화함을 통해 그들의 효능적 활성을 향상시킴으로써 그들의 항종양 면역에 대한 항-TNFR 수퍼패밀리 항체를 최적화하는 것을 지향해 왔다(문헌[Chu et al. (2008)Mol Immunol 45:3926-33]; 문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]).
본 명세서에서 항-OX40 항체에 적용될 때, 보고된 S267E/L328F 및 V12 돌연변이는 트랜스펙션된 Expi293F 세포 또는 Raji 세포에서 발현된 FcγRIIB에 대한 조작된 항-OX40 항체의 결합을 향상시켰으며, 가교결합 의존성 방식으로 그들의 효능적 활성을 향상시켰다. 효능작용의 정도는 S267E/L328F 및 V12 돌연변이 둘 모두에 대해 유사하였다. OX40 항체 내의 S267E/L328F 및 V12 돌연변이는 FcγRIIIB에 대한 결합을 향상시키면서 FcγRIIIA에 대한 항체 결합을 파괴하였으며, 이는 Mimoto에 의해 보고된 것과 일치한다(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]). 결과적으로, S267E/L328F 및 V12 돌연변이는 조작된 항-OX40 항체의 ADCC를 완전히 제거하였으며, 이는 NK 세포 상에서 발현되는 FcγRIIIA에 의해 주로 매개된다.
CD20과 같은 종양 관련 항원에 대한 항체의 육량체화를 유도하는 돌연변이(문헌[Diebolder et al. (2014) Science 343: 1260-3])(E345R, E430G, S440Y)가 항-OX40 항체의 효능적 활성을 유도했다는 것이 또한 본 명세서에서 발견되었다. 그러나, S267E/L328F 및 V12 돌연변이에 대해 보고된 것과는 대조적으로, 개선된 효능적 활성은 FcγRIIB 가교결합에 독립적이었다. E345R, E430G, 및 E345R/E430G 이중 돌연변이를 갖는 항-OX40 항체는 용액 중의 단량체로서 존재하지만, 세포 표면 상의 OX40에 결합시에 그들은 다량체화되었다. 다량체화된 항체는, 아마도 세포 상의 OX40의 증가된 클러스터링의 촉진으로 인해, FcγRIIB-발현 세포의 부재 하에 향상된 효능적 활성을 나타냈다. 이중 E345R/E430G 및 삼중 E345R/E430G/S440Y 돌연변이는 단일 돌연변이 단독에 비교할 때 더 높은 항체 다량체화를 유발하였지만, 단일 E345R 돌연변이는 가장 높은 효능적 활성을 갖는 항체를 유발하였다. 임의의 특정 이론에 의해 구애되고자 하는 것은 아니지만, E345R 돌연변이를 갖는 올리고머화된 항체는 E430G 돌연변이를 갖는 항체보다 OX40 수용체의 클러스터링을 촉진함에 있어서 더 유리한 구성을 갖는 것으로 생각된다.
E345R 돌연변이가 FcγRIIB 가교결합에 독립적으로 효능작용을 향상시켰지만, FcγRIIB-발현 세포의 존재는 E345R 돌연변이를 갖는 항체의 효능작용을 추가로 향상시켰음이 밝혀졌다. 효능작용의 이러한 추가의 부스팅은 Raji 세포 상에서 발현된 FcγRIIB와 조작된 항체의 상호작용에 의존하였는데, 이는 FcγR에 결합함 있어서 침묵하는 IgGsigma 항체 상에서 효능작용의 부스팅이 관찰되지 않았고 Raji 세포 상에서 발현된 FcγRIIB를 사전-차단함으로써 효능작용이 제거되었기 때문이다. 다량체화된 항체는 단량체 상태의 항체에 비교하여 Fcγ 수용체에 대해 더 높은 친화성을 갖는 것으로 보고되었다(문헌[Luo et al. (2009) MAbs 1: 491-504]). 실제로, 본 명세서에 제시된 결과는, 부분적으로 용액 중의 육량체 형태인 OX40SF2E345R/E430G/S440Y가, 용액 중의 단량체로서 존재하는 OX40SF2IgG1 및 OX40SF2IgG1E345R 항체에 비교하여, 트랜스펙션된 Expi293F 세포 상에서 발현된 FcγRIIB에 대한 훨씬 강력한 결합을 갖는다는 것을 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). 세포 표면 상의 OX40에 결합된 올리고머화된 OX40SF2IgG1E345R 은 Raji 세포 상의 FcγRIIB에 대한 증가된 결합을 가질 수 있고, 이는 결국 항체 다량체화를 추가로 안정화하고 효능작용의 부스팅을 유발하는 수용체 클러스터링을 용이하게 한다는 가설이 제기된다.
항-OX40 항체 내로 도입된 E345R 돌연변이는 항체의 ADCC 활성의 효능을 향상시켰다. 효과는 FcγRIIIA에 결합할 수 있는 IgG1 상의 조작된 항체에 특이적이었지만, FcγRIIIA에 결합하지 않는 IgG2sigma 상의 항체에는 그렇지 않았다. 이들 관찰은 IgG1 항체에 대한 ADCC 활성의 E345R-매개 향상이 아마도 세포 표면 상의 OX40을 인식할 때 올리고머화되는 항체와 FcγRIIIA의 증가된 결합을 통한 것이었음을 시사하였다.
천연 IgG1 Fc를 갖는 항-OX40 항체에 대해, S267E/L328F 또는 V12 돌연변이 중 어느 것도 ADCP에 유의적으로 영향을 주지 않았다. 식작용을 매개하는 대식세포 상에 발현되는 주요 Fc 수용체인 FcγRIIA에 대한 결합을 향상시킨 것으로 보고된 S267E/L328F 돌연변이에 대해 이는 의외일 수 있다(문헌[Mimoto et al. (2013) Protein Eng Des Sel 26: 589-98]). 그러나, FcγRIIA 이외에, FcγRI 및 FcγRIIIA를 포함하는 몇몇 Fc 수용체가 표적 세포의 IgG 항체 매개 식작용에 기여한다(문헌[Indik et al. (1995) Blood 86: 4389-99]). OX40SF2IgG1S267E/L328F 항체는 FcγRI에 대해 OX40SF2IgG1과 유사한 결합 효능을 나타냈으나 FcγRIIIA에 대한 결합을 제거하였다. 한편, 향상된 FcγRIIA 결합의 정도는 단지 고친화성 FcγRI 수용체에 대한 그의 결합과 유사한 수준이었다. 결과로서, OX40SF2IgG1S267E/L328F 항체는 대식세포에 대해 OX40SF2IgG1과 유사한 결합 효능을 나타냈으며, 이는 OX40SF2IgG1에 대해 향상된 ADCP 활성을 나타내지 않았다. 반면에, OX40SF2IgG1V12 항체는 FcγRI 및 FcγRIIIA에 대한 감소된 결합, 및 FcγRIIA에 대한 변하지 않은 결합 효능을 가지며, 이는 대식세포에 대한 그의 유의적으로 감소된 결합을 설명할 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, OX40SF2IgG1V12 항체는 OX40SF2IgG1과 유사한 ADCP 활성을 나타냈다. 이 불일치에 대한 이유는 알려지지 않았다. 유사하게, E345R 돌연변이를 갖는 OX40SF2IgG1 항체에 대해 ADCP 활성의 유의적인 증가가 관찰되지 않았지만, 그러한 돌연변이는 조작된 항체의 ADCC 활성을 유의적으로 향상시켰다. 흥미롭게도, OX40SF2IgG2sigma는 ADCP 활성을 갖지 않았지만, E345R 돌연변이는 침묵 Fc를 갖는 이 항체에 유의적인 ADCP 활성을 부여하였다.
본 연구에서 평가된 몇몇 Fc 공학적 접근법 각각은 조작된 항체의 효능적 활성 및 조절 효과 기능을 동시에 향상시킴에 있어서 독특한 특성을 제공한다. ADCC에 대한 요건에 따라, 다양한 공학적 접근법이 TNFR 수퍼패밀리 구성원들에 결합하는 치료적 항체에 대해 구상될 수 있다. 예를 들어, CD40 및 CD27에 결합하는 항체는, 효능적 활성은 개선하지만 세포 고갈의 위험을 최소화하기 위해 ADCC는 최소화함으로써 이익을 얻을 수 있다. 따라서, IgG1 상의 S267E/L328F 또는 V12 또는 IgG2sigma 상의 E345R을 사용하여, 개선된 CD40 및 CD27 항체를 생성할 수 있다. 반면에, 예를 들어 조절 T 세포를 제거하기 위해 ADCC 활성을 원하는 경우, IgG1 상의 E345R 돌연변이가 사용될 수 있다. 예를 들어, OX40 또는 GITR에 결합하는 항체는 개선된 효능적 활성 및 향상된 ADCC로부터 이익을 얻을 수 있다.
다른 고려 사항은, 효능작용 향상을 위해 FcγRIIB 가교결합에 대한 의존성을 원하는지 여부이다. E345R 돌연변이는 FcγRIIB 가교결합에 독립적으로 더 높은 효능작용을 용이하게 할 수 있고, 이는 국소 미세환경에서 FcγR 발현 수준에 무관하게 항체가 정의된 치료적 활성을 갖추게 할 수 있으며, 특히 낮은 FcγR 발현 세포가 침윤된 암 유형에 대한 이점을 가질 수 있다. 그러나, FcγRIIB 가교결합에 대한 비-의존성은 효능작용을 비특이적으로 자극할 수 있으며, 이는 원하지 않는 표적외 효과를 유발할 수 있다. 그러한 경우에, S267E/L328F 또는 V12 돌연변이가 사용될 수 있다. 상이한 Fc 수용체에 대한 변경된 결합 활성, 면역원성, PK 프로파일, 및 조작된 항체의 개발가능성을 포함하는 다른 인자가 또한 최적의 공학적 접근법의 선택에서 고려되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Janssen Biotech, Inc.
Chiu, Mark
Zhang, Di
<120> Fc engineered anti-TNFR superfamily member antibodies having
enhanced agonsitic activity and methods of using them
<130> JBI5095WOPCT
<150> 62/374,347
<151> 2016-08-04
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 455
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys
225 230 235 240
Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu
245 250 255
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser
260 265 270
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val
275 280 285
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys
290 295 300
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly
305 310 315 320
Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn
325 330 335
Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp
340 345 350
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro
355 360 365
Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu
370 375 380
Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala
405 410 415
Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly
420 425 430
Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro
435 440 445
Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg
450 455
<210> 2
<211> 461
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly
260 265 270
Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys
275 280 285
Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro
290 295 300
Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu
305 310 315 320
Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly
340 345 350
Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser
355 360 365
Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile
370 375 380
Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln
385 390 395 400
Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro
405 410 415
Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser
420 425 430
Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro
435 440 445
Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser
450 455 460
<210> 3
<211> 769
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Leu Gly Leu Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu Val Gly Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Cys Val Leu Ser Gln Glu Cys Thr Lys Phe Lys Val Ser Ser
20 25 30
Cys Arg Glu Cys Ile Glu Ser Gly Pro Gly Cys Thr Trp Cys Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Phe Thr Gly Pro Gly Asp Pro Asp Ser Ile Arg Cys Asp Thr
50 55 60
Arg Pro Gln Leu Leu Met Arg Gly Cys Ala Ala Asp Asp Ile Met Asp
65 70 75 80
Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Gln Glu Asp His Asn Gly Gly Gln Lys
85 90 95
Gln Leu Ser Pro Gln Lys Val Thr Leu Tyr Leu Arg Pro Gly Gln Ala
100 105 110
Ala Ala Phe Asn Val Thr Phe Arg Arg Ala Lys Gly Tyr Pro Ile Asp
115 120 125
Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Leu Asp Asp Leu Arg
130 135 140
Asn Val Lys Lys Leu Gly Gly Asp Leu Leu Arg Ala Leu Asn Glu Ile
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Pro Phe Val Asn Thr His Pro Asp Lys Leu Arg Asn Pro Cys Pro
180 185 190
Asn Lys Glu Lys Glu Cys Gln Pro Pro Phe Ala Phe Arg His Val Leu
195 200 205
Lys Leu Thr Asn Asn Ser Asn Gln Phe Gln Thr Glu Val Gly Lys Gln
210 215 220
Leu Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ala Pro Glu Gly Gly Leu Asp Ala Met
225 230 235 240
Met Gln Val Ala Ala Cys Pro Glu Glu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr
245 250 255
Arg Leu Leu Val Phe Ala Thr Asp Asp Gly Phe His Phe Ala Gly Asp
260 265 270
Gly Lys Leu Gly Ala Ile Leu Thr Pro Asn Asp Gly Arg Cys His Leu
275 280 285
Glu Asp Asn Leu Tyr Lys Arg Ser Asn Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val
290 295 300
Gly Gln Leu Ala His Lys Leu Ala Glu Asn Asn Ile Gln Pro Ile Phe
305 310 315 320
Ala Val Thr Ser Arg Met Val Lys Thr Tyr Glu Lys Leu Thr Glu Ile
325 330 335
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340 345 350
Val Gln Leu Ile Lys Asn Ala Tyr Asn Lys Leu Ser Ser Arg Val Phe
355 360 365
Leu Asp His Asn Ala Leu Pro Asp Thr Leu Lys Val Thr Tyr Asp Ser
370 375 380
Phe Cys Ser Asn Gly Val Thr His Arg Asn Gln Pro Arg Gly Asp Cys
385 390 395 400
Asp Gly Val Gln Ile Asn Val Pro Ile Thr Phe Gln Val Lys Val Thr
405 410 415
Ala Thr Glu Cys Ile Gln Glu Gln Ser Phe Val Ile Arg Ala Leu Gly
420 425 430
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435 440 445
Cys Arg Asp Gln Ser Arg Asp Arg Ser Leu Cys His Gly Lys Gly Phe
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Leu Glu Cys Gly Ile Cys Arg Cys Asp Thr Gly Tyr Ile Gly Lys Asn
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Cys Glu Cys Gln Thr Gln Gly Arg Ser Ser Gln Glu Leu Glu Gly Ser
485 490 495
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Val Ile Trp Lys Ala Leu Ile His Leu Ser Asp Leu Arg Glu Tyr Arg
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Ser
<210> 4
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
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65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
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100 105 110
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130 135 140
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Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 5
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
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1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
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100 105 110
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275
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu
245 250 255
Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu
260 265 270
Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys
275 280 285
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290 295 300
Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser
305 310 315 320
Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
325 330 335
<210> 7
<211> 74
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Arg Ala Leu Glu Gly Pro Gly Leu Ser Leu Leu Cys Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Leu Pro Ala Leu Leu Pro Val Pro Ala Val Arg Gly Val Ala Glu
20 25 30
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35 40 45
Arg Leu Leu Gln Ala Leu Arg Val Ala Arg Met Pro Gly Leu Glu Arg
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<210> 8
<211> 260
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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180 185 190
Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser
210 215 220
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245 250 255
Ala Cys Ser Pro
260
<210> 9
<211> 595
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
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1 5 10 15
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Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys
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Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp
50 55 60
Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg
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Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr
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Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
130 135 140
Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys
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Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln
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Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met
180 185 190
Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu
195 200 205
Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp
210 215 220
Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys
225 230 235 240
Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys
245 250 255
Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro
260 265 270
Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile
275 280 285
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290 295 300
Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala
370 375 380
Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly
385 390 395 400
Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile
405 410 415
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420 425 430
Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg
435 440 445
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450 455 460
Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu
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485 490 495
Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn
500 505 510
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515 520 525
Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala
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Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr
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Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met
565 570 575
Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala
580 585 590
Ser Gly Lys
595
<210> 10
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
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Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
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Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 11
<211> 468
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg Val His Leu Gly Ala Phe Leu Ala Val
1 5 10 15
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Ser Ala Arg Ala Arg Ala Gly Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Val His Lys Thr Phe Lys Phe Val Val
85 90 95
Val Gly Val Leu Leu Gln Val Val Pro Ser Ser Ala Ala Thr Ile Lys
100 105 110
Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu His Ser Pro Leu
115 120 125
Gly Glu Leu Cys Pro Pro Gly Ser His Arg Ser Glu His Pro Gly Ala
130 135 140
Cys Asn Arg Cys Thr Glu Gly Val Gly Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn
145 150 155 160
Leu Phe Ala Cys Leu Pro Cys Thr Ala Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu
165 170 175
Arg Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Ala Cys Gln Cys Lys Pro
180 185 190
Gly Thr Phe Arg Asn Asp Asn Ser Ala Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser
195 200 205
Arg Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp
210 215 220
Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Asn Gly His Asn Ile
225 230 235 240
Trp Val Ile Leu Val Val Thr Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Val Ala
245 250 255
Val Leu Ile Val Cys Cys Cys Ile Gly Ser Gly Cys Gly Gly Asp Pro
260 265 270
Lys Cys Met Asp Arg Val Cys Phe Trp Arg Leu Gly Leu Leu Arg Gly
275 280 285
Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala His Asn Glu Ile Leu Ser Asn Ala Asp
290 295 300
Ser Leu Ser Thr Phe Val Ser Glu Gln Gln Met Glu Ser Gln Glu Pro
305 310 315 320
Ala Asp Leu Thr Gly Val Thr Val Gln Ser Pro Gly Glu Ala Gln Cys
325 330 335
Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu
340 345 350
Val Pro Ala Asn Gly Ala Asp Pro Thr Glu Thr Leu Met Leu Phe Phe
355 360 365
Asp Lys Phe Ala Asn Ile Val Pro Phe Asp Ser Trp Asp Gln Leu Met
370 375 380
Arg Gln Leu Asp Leu Thr Lys Asn Glu Ile Asp Val Val Arg Ala Gly
385 390 395 400
Thr Ala Gly Pro Gly Asp Ala Leu Tyr Ala Met Leu Met Lys Trp Val
405 410 415
Asn Lys Thr Gly Arg Asn Ala Ser Ile His Thr Leu Leu Asp Ala Leu
420 425 430
Glu Arg Met Glu Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Ile Gln Asp Leu Leu
435 440 445
Val Asp Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala
450 455 460
Val Ser Leu Glu
465
<210> 12
<211> 440
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
1 5 10 15
Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro
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Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln
50 55 60
Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu
65 70 75 80
Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
85 90 95
Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe
100 105 110
Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro
115 120 125
Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe
130 135 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145 150 155 160
Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Val Pro
180 185 190
Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro
195 200 205
Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val
210 215 220
Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
225 230 235 240
Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu
245 250 255
Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu
260 265 270
Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu
275 280 285
Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser
290 295 300
Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser
305 310 315 320
Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu
325 330 335
Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp
340 345 350
Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile
355 360 365
Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr
370 375 380
Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His
385 390 395 400
Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu
420 425 430
Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser
435 440
<210> 13
<211> 259
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Ala Arg Ile Pro Lys Thr Leu Lys Phe Val Val Val Ile Val Ala
1 5 10 15
Val Leu Leu Pro Val Leu Ala Tyr Ser Ala Thr Thr Ala Arg Gln Glu
20 25 30
Glu Val Pro Gln Gln Thr Val Ala Pro Gln Gln Gln Arg His Ser Phe
35 40 45
Lys Gly Glu Glu Cys Pro Ala Gly Ser His Arg Ser Glu His Thr Gly
50 55 60
Ala Cys Asn Pro Cys Thr Glu Gly Val Asp Tyr Thr Asn Ala Ser Asn
65 70 75 80
Asn Glu Pro Ser Cys Phe Pro Cys Thr Val Cys Lys Ser Asp Gln Lys
85 90 95
His Lys Ser Ser Cys Thr Met Thr Arg Asp Thr Val Cys Gln Cys Lys
100 105 110
Glu Gly Thr Phe Arg Asn Glu Asn Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys
115 120 125
Ser Arg Cys Pro Ser Gly Glu Val Gln Val Ser Asn Cys Thr Ser Trp
130 135 140
Asp Asp Ile Gln Cys Val Glu Glu Phe Gly Ala Asn Ala Thr Val Glu
145 150 155 160
Thr Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Asn Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Asn Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro
180 185 190
Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala
195 200 205
Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala
210 215 220
Glu Glu Thr Met Ile Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Ser His Tyr
225 230 235 240
Leu Ser Cys Thr Ile Val Gly Ile Ile Val Leu Ile Val Leu Leu Ile
245 250 255
Val Phe Val
<210> 14
<211> 386
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Gly Leu Trp Gly Gln Ser Val Pro Thr Ala Ser Ser Ala Arg Ala
1 5 10 15
Gly Arg Tyr Pro Gly Ala Arg Thr Ala Ser Gly Thr Arg Pro Trp Leu
20 25 30
Leu Asp Pro Lys Ile Leu Lys Phe Val Val Phe Ile Val Ala Val Leu
35 40 45
Leu Pro Val Arg Val Asp Ser Ala Thr Ile Pro Arg Gln Asp Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Ser Cys Thr Thr Thr Arg Asp Thr Val Cys Gln Cys Glu Lys Gly
130 135 140
Ser Phe Gln Asp Lys Asn Ser Pro Glu Met Cys Arg Thr Cys Arg Thr
145 150 155 160
Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Ser Asn Cys Thr Pro Arg Ser
165 170 175
Asp Ile Lys Cys Lys Asn Glu Ser Ala Ala Ser Ser Thr Gly Lys Thr
180 185 190
Pro Ala Ala Glu Glu Thr Val Thr Thr Ile Leu Gly Met Leu Ala Ser
195 200 205
Pro Tyr His Tyr Leu Ile Ile Ile Val Val Leu Val Ile Ile Leu Ala
210 215 220
Val Val Val Val Gly Phe Ser Cys Arg Lys Lys Phe Ile Ser Tyr Leu
225 230 235 240
Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Glu Arg Val His Arg
245 250 255
Val Leu Phe Arg Arg Arg Ser Cys Pro Ser Arg Val Pro Gly Ala Glu
260 265 270
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275 280 285
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Gly Val Thr Val Glu Ser Pro Glu Glu Pro Gln Arg Leu Leu Glu Gln
305 310 315 320
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340 345 350
Leu Glu Glu Gly His Ala Lys Glu Thr Ile Gln Asp Gln Leu Val Gly
355 360 365
Ser Glu Lys Leu Phe Tyr Glu Glu Asp Glu Ala Gly Ser Ala Thr Ser
370 375 380
Cys Leu
385
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Leu Val Ala Ala Ile Ile Phe Gly Val Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys
225 230 235 240
Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg
245 250 255
Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Val Ser Thr His
260 265 270
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275 280 285
Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gln
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305 310 315 320
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325 330 335
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485 490 495
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Gly Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu Pro Glu Lys Ala Ser Arg Pro Val
595 600 605
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610 615
<210> 16
<211> 401
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
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Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg
130 135 140
Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys
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Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg
195 200 205
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Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile
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Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu
245 250 255
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260 265 270
Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala
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290 295 300
Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys
305 310 315 320
Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn
325 330 335
Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser
340 345 350
Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr
355 360 365
Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu
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Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys
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Leu
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly
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Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly
20 25 30
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35 40 45
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Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro
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Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser
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Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr
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Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile
115 120 125
Gln
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro
180 185 190
Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala Lys Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro Cys Pro
260 265 270
His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala Gln Glu
275 280 285
Gly Gly Pro Gly Ala
290
<210> 19
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
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Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly
50 55 60
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly
65 70 75 80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val
85 90 95
Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser
100 105 110
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp
115 120 125
Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala
130 135 140
Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser
145 150 155 160
Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr
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Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
180
<210> 20
<211> 283
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Lys Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
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Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
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Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
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130 135 140
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180 185 190
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
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Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
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195 200 205
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245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gln Asn Lys Gln Gly Ala Asn Ser Arg
275 280 285
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290 295 300
Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His
305 310 315 320
Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr
325 330 335
Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn
340 345 350
Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
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Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala
385 390 395 400
Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser
405 410 415
Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val
420 425
<210> 22
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
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130 135 140
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165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 23
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
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Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
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Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
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Val
<210> 24
<211> 423
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Ala Leu Lys Val Leu Leu Glu Gln Glu Lys Thr Phe Phe Thr Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Gly Tyr Leu Ser Cys Lys Val Thr Cys Glu Ser Gly
20 25 30
Asp Cys Arg Gln Gln Glu Phe Arg Asp Arg Ser Gly Asn Cys Val Pro
35 40 45
Cys Asn Gln Cys Gly Pro Gly Met Glu Leu Ser Lys Glu Cys Gly Phe
50 55 60
Gly Tyr Gly Glu Asp Ala Gln Cys Val Thr Cys Arg Leu His Arg Phe
65 70 75 80
Lys Glu Asp Trp Gly Phe Gln Lys Cys Lys Pro Cys Leu Asp Cys Ala
85 90 95
Val Val Asn Arg Phe Gln Lys Ala Asn Cys Ser Ala Thr Ser Asp Ala
100 105 110
Ile Cys Gly Asp Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Val
115 120 125
Gly Phe Gln Asp Met Glu Cys Val Pro Cys Gly Asp Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Tyr Glu Pro His Cys Ala Ser Lys Val Asn Leu Val Lys Ile Ala Ser
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Pro Arg Asp Thr Ala Leu Ala Ala Val Ile Cys Ser
165 170 175
Ala Leu Ala Thr Val Leu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Cys Val Ile Tyr
180 185 190
Cys Lys Arg Gln Phe Met Glu Lys Lys Pro Ser Trp Ser Leu Arg Ser
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Val Gln Thr Cys Gly Pro Val Arg Leu Leu Pro Ser Met Cys Cys
245 250 255
Glu Glu Ala Cys Ser Pro Asn Pro Ala Thr Leu Gly Cys Gly Val His
260 265 270
Ser Ala Ala Ser Leu Gln Ala Arg Asn Ala Gly Pro Ala Gly Glu Met
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Arg Gln Arg Leu Gly Ser Leu
420
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<211> 655
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
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1 5 10 15
Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys
180 185 190
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195 200 205
Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser Ile Gln Glu
260 265 270
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275 280 285
Asn Lys Thr Leu Pro Asn Leu Gln Val Val Asn His Gln Gln Gly Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro Ile Lys Gly Pro Lys Arg Gly His Pro
325 330 335
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340 345 350
Met Ile Val Leu Phe Leu Leu Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Cys
355 360 365
Ser Ile Arg Lys Ser Ser Arg Thr Leu Lys Lys Gly Pro Arg Gln Asp
370 375 380
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
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20 25 30
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Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
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Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
225 230 235 240
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<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
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180 185 190
Pro
<210> 36
<211> 175
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Met Pro Lys Arg Ser Cys Pro Phe Ala Asp Val Ala Pro Leu Gln Leu
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Gln Cys Glu Arg Ala Leu Cys Gly Gln Cys Val Arg Thr Cys Trp Gly
130 135 140
Cys Gly Ser Val Ala Cys Thr Leu Cys Gly Leu Val Asp Cys Ser Asp
145 150 155 160
Met Tyr Glu Lys Val Leu Cys Thr Ser Cys Ala Met Phe Glu Thr
165 170 175
<210> 37
<211> 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly
20 25 30
Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu
35 40 45
Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg
50 55 60
Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly
65 70 75 80
Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys
85 90 95
Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp
115 120 125
Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln
130 135 140
Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu
145 150 155 160
Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val
165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln
180 185 190
Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val
195 200 205
Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val
210 215 220
Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
225 230
<210> 38
<211> 254
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 39
<211> 281
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
275 280
<210> 40
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu
1 5 10 15
Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met
35 40 45
Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val
50 55 60
Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn
85 90 95
Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile
100 105 110
Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
115 120 125
Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro
165 170 175
Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
180 185 190
Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val
195 200 205
Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His
210 215 220
His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val
225 230 235 240
Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
260 265 270
Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu
275 280 285
Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp
290 295 300
Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp
305 310 315
<210> 41
<211> 249
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu
50 55 60
Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp
65 70 75 80
Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu
100 105 110
Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly
115 120 125
Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu
130 135 140
Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr
165 170 175
Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu
180 185 190
Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg
195 200 205
Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His
245
<210> 42
<211> 250
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu
35 40 45
Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg
50 55 60
Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp
65 70 75 80
Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn
85 90 95
Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys
100 105 110
Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys
115 120 125
Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg
130 135 140
Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala
145 150 155 160
Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe
165 170 175
Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr
180 185 190
Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr
195 200 205
Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile
210 215 220
Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro
225 230 235 240
His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
245 250
<210> 43
<211> 285
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
1 5 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu
100 105 110
Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
115 120 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
130 135 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
180 185 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
195 200 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
210 215 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
275 280 285
<210> 44
<211> 296
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Met Glu Ser Met Ala Val Ala Thr Asp Gly Gly Glu Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Pro Ala Gly Ser Gly Leu Ser Ala Ser Gln Arg Arg Ala Glu Leu Arg
20 25 30
Arg Arg Lys Leu Leu Met Asn Ser Glu Gln Arg Ile Asn Arg Ile Met
35 40 45
Gly Phe His Arg Pro Gly Ser Gly Ala Glu Glu Glu Ser Gln Thr Lys
50 55 60
Ser Lys Gln Gln Asp Ser Asp Lys Leu Asn Ser Leu Ser Val Pro Ser
65 70 75 80
Val Ser Lys Arg Val Val Leu Gly Asp Ser Val Ser Thr Gly Thr Thr
85 90 95
Asp Gln Gln Gly Gly Val Ala Glu Val Lys Gly Thr Gln Leu Gly Asp
100 105 110
Lys Leu Asp Ser Phe Ile Lys Pro Pro Glu Cys Ser Ser Asp Val Asn
115 120 125
Leu Glu Leu Arg Gln Arg Asn Arg Gly Asp Leu Thr Ala Asp Ser Val
130 135 140
Gln Arg Gly Ser Arg His Gly Leu Glu Gln Tyr Leu Ser Arg Phe Glu
145 150 155 160
Glu Ala Met Lys Leu Arg Lys Gln Leu Ile Ser Glu Lys Pro Ser Gln
165 170 175
Glu Asp Gly Asn Thr Thr Glu Glu Phe Asp Ser Phe Arg Ile Phe Arg
180 185 190
Leu Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Leu Gly Val Arg Ala Phe Val Cys
195 200 205
Lys Tyr Leu Ser Ile Phe Ala Pro Phe Leu Thr Leu Gln Leu Ala Tyr
210 215 220
Met Gly Leu Tyr Lys Tyr Phe Pro Lys Ser Glu Lys Lys Ile Lys Thr
225 230 235 240
Thr Val Leu Thr Ala Ala Leu Leu Leu Ser Gly Ile Pro Ala Glu Val
245 250 255
Ile Asn Arg Ser Met Asp Thr Tyr Ser Lys Met Gly Glu Val Phe Thr
260 265 270
Asp Leu Cys Val Tyr Phe Phe Thr Phe Ile Phe Cys His Glu Leu Leu
275 280 285
Asp Tyr Trp Gly Ser Glu Val Pro
290 295
<210> 45
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
115 120 125
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
195 200 205
Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
210 215 220
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
225 230 235 240
Ala
<210> 46
<211> 247
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu
20 25 30
Ala Tyr Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly
35 40 45
Pro Lys Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu
50 55 60
His Val Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn
65 70 75 80
Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu
85 90 95
Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg
115 120 125
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
130 135 140
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
165 170 175
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
180 185 190
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
195 200 205
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
210 215 220
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
225 230 235 240
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
245
<210> 47
<211> 257
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Met Ser Ile Leu Phe Tyr Val Ile Phe Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Ile
1 5 10 15
Gln Gly Asn Asn Met Asp Gln Arg Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn
20 25 30
Ser Leu Ile Ile Lys Leu Ile Gln Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu
35 40 45
Ser Lys Gln Met Val Asp Val Lys Glu Asn Tyr Gln Ser Thr Leu Pro
50 55 60
Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Arg Gly Gly Pro Ala Lys Ser
65 70 75 80
Ala Phe Gln Pro Val Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gln Gln
85 90 95
Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Val Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu
100 105 110
Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val Gly Ser Pro Val
115 120 125
Val Ala Asn Arg Thr Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Glu His Lys Ser
130 135 140
His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr
145 150 155 160
Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln Val Thr Val Leu
165 170 175
Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu
180 185 190
Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile
195 200 205
Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Val
210 215 220
Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile
225 230 235 240
Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg
245 250 255
Thr
<210> 48
<211> 210
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu
35 40 45
Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala
50 55 60
Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg
65 70 75 80
Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val
85 90 95
Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp
100 105 110
Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp
130 135 140
Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly
145 150 155 160
Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr
165 170 175
Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp
180 185 190
Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly
195 200 205
Arg Ala
210
<210> 49
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Gly His Thr Ala Asn Lys Pro Cys Leu Ala Lys Phe Glu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ser Lys Trp Gln Met Thr Ser Arg Lys Pro Pro Cys Val Asn Ser Leu
20 25 30
Pro Glu Gly Lys Leu Lys Ile Leu Gln Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Gln Val Ala Pro Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Val Ala Pro Phe Ala
50 55 60
Val Gln Leu Arg Lys Asn Glu Ala Met Leu Gln Thr Leu Thr Ser Asn
65 70 75 80
Ser Thr Ile Tyr Asp Val Gly Gly Thr Tyr Glu Phe His Ala Gly Asp
85 90 95
Ile Ile Asp Leu Ile Phe Asp Asp Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn
100 105 110
Thr Tyr Trp Gly Ile Val Leu Leu Ala Asn Leu Phe Ile Ser
115 120 125
<210> 50
<211> 389
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Met Gly Tyr Pro Glu Val Glu Arg Arg Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Pro Arg Glu Arg Gly Ser Gln Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Pro Ala
20 25 30
Arg Ala Gly Glu Gly Asn Ser Cys Leu Leu Phe Leu Gly Phe Phe Gly
35 40 45
Leu Ser Leu Ala Leu His Leu Leu Thr Leu Cys Cys Tyr Leu Glu Leu
50 55 60
Arg Ser Glu Leu Arg Arg Glu Arg Gly Ala Glu Ser Arg Leu Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Thr Pro Gly Thr Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Gly Gly Leu
85 90 95
Asp Pro Asp Ser Pro Ile Thr Ser His Leu Gly Gln Pro Ser Pro Lys
100 105 110
Gln Gln Pro Leu Glu Pro Gly Glu Ala Ala Leu His Ser Asp Ser Gln
115 120 125
Asp Gly His Gln Met Ala Leu Leu Asn Phe Phe Phe Pro Asp Glu Lys
130 135 140
Pro Tyr Ser Glu Glu Glu Ser Arg Arg Val Arg Arg Asn Lys Arg Ser
145 150 155 160
Lys Ser Asn Glu Gly Ala Asp Gly Pro Val Lys Asn Lys Lys Lys Gly
165 170 175
Lys Lys Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Ile Pro Gly Ile
195 200 205
Pro Gly Thr Thr Val Met Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
210 215 220
Pro Gln Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ala Asp Lys
225 230 235 240
Ala Gly Thr Arg Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln
245 250 255
Gly Ser Ala Ile Gln Val Lys Asn Asp Leu Ser Gly Gly Val Leu Asn
260 265 270
Asp Trp Ser Arg Ile Thr Met Asn Pro Lys Val Phe Lys Leu His Pro
275 280 285
Arg Ser Gly Glu Leu Glu Val Leu Val Asp Gly Thr Tyr Phe Ile Tyr
290 295 300
Ser Gln Val Tyr Tyr Ile Asn Phe Thr Asp Phe Ala Ser Tyr Glu Val
305 310 315 320
Val Val Asp Glu Lys Pro Phe Leu Gln Cys Thr Arg Ser Ile Glu Thr
325 330 335
Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Thr Cys Tyr Thr Ala Gly Val Cys Leu Leu
340 345 350
Lys Ala Arg Gln Lys Ile Ala Val Lys Met Val His Ala Asp Ile Ser
355 360 365
Ile Asn Met Ser Lys His Thr Thr Phe Phe Gly Ala Ile Arg Leu Gly
370 375 380
Glu Ala Pro Ala Ser
385
<210> 51
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of antibody SF2
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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20 25 30
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35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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Thr Val Ser Ser
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Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Leu Pro
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<213> Homo sapiens
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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<213> Artificial Sequence
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<223> IgG1 with E430G mutation
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
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<223> IgG2sigma with E345R mutation
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100 105 110
Pro Ala Ala Ala Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Ala Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Arg
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
Claims (33)
- 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체로서, 상기 항체는 서열 번호 63, 64, 65, 66, 또는 67의 아미노산 서열을 포함하고, E345R 돌연변이, E345R/E430G 돌연변이, 또는 E345R/E430G/S440Y 돌연변이(EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링)를 포함하며, 여기서 상기 항체가 제2 돌연변이를 포함하고, 상기 제2 돌연변이가 IgG2 상의 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S 돌연변이(EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링)를 포함하며, 돌연변이가 없는 모 항체에 비교할 때 향상된 효능적(agonistic) 활성을 갖는 것인, 항체.
- 제1항에 있어서, E345R 돌연변이를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, E345R/E430G 돌연변이를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, E345R/E430G/S440Y 돌연변이를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 항체 가교결합에 독립적인 효능적 활성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, TNFR 패밀리의 수용체가 서열 번호 4인 OX40, 서열 번호 8인 CD27, 서열 번호 5인 CD40, 서열 번호 10인 CD137, 또는 서열 번호 23인 GITR인 것인, 항체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 암이 고형 종양인 약제학적 조성물.
- 제8항에 있어서, 고형 종양이 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변인 약제학적 조성물.
- 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체.
- 제10항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변인, 암의 치료에 사용하기 위한 항체.
- 암의 치료를 위한 약제의 제조에서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원 항체를 사용하기 위한 방법.
- 제12항에 있어서, 암이 흑색종, 폐암, 편평상피 비-소세포 폐암(NSCLC), 비-편평상피 NSCLC, 결장직장암, 전립선암, 거세-저항성 전립선암, 위암, 난소암, 위장암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 두경부의 편평상피세포 암종, 식도 또는 위장관의 암종, 유방암, 나팔관암, 뇌암, 요도암, 비뇨생식기암, 자궁내막증, 자궁경부암, 또는 암의 전이 병변인 것인 방법.
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