KR20240055002A - 암 치료를 위한 CD33 x Vδ2 다중특이성 항체 - Google Patents

암 치료를 위한 CD33 x Vδ2 다중특이성 항체 Download PDF

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KR20240055002A
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패트릭 존 두난
쉐리 린 라 포르테
산자야 싱
폴 윌렘 헨리 아이다 파렌
사브리나 줄리아 루이자 머랫
로버터스 코넬리스 루버스
사라 모하메드 에이 엘라슈카르
울리크 필리파르
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 다중특이성 항체 및 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 상기 항체의 제조 공정, 및 CD33을 표적화하는 상기 항체의 용도, 및 질병, 예를 들어 암의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 CD33 x Vδ2 다중특이성 항체
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 2022년 3월 8일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 SEQLTXT-1.txt이며, 크기가 212 킬로바이트이다.
기술분야
본 발명은 다중특이성 항체 및 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 상기 항체의 제조 공정, 및 CD33을 표적화하는 상기 항체의 용도, 및 질병, 예를 들어 암의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
급성 골수성 백혈병(AML)에서의 표적화된 면역요법은 AML 아세포의 불균질한 성질 및 AML-특이적 항원의 결여로 인해 실질적으로 임상적인 난제로 남아 있다. CD33을 표적화하는 몇몇 면역요법은 현재 CD33xCD3 T-세포 재유도 분자 및 다수의 자가(autologous) 또는 동종이계(allogeneic) CAR T 또는 NK 세포 요법과 같은 AML에서의 1상 또는 2상 임상 시험을 거치고 있는 중이다.
Vγ9Vδ2 T-세포는 종양 세포 면역요법을 조사하기 위한 T-세포의 흥미로운 하위세트를 나타낸다. 이들은 순환 T-세포 집단의 1 내지 5%를 나타내고, 광범위한 암의 세트에서 우세한데, 이들은 돌연변이 하중(mutational load)과 무관하게 암을 침윤시킨다. 이들 T 세포는 표적 세포 상의 리간드들의 부티로필린(BTN) 패밀리에서 포스포-항원-매개 입체형태 변화를 감지하고 이들 세포를 효율적으로 살해한다. Vγ9Vδ2 T-세포는 종양 세포 상에서 PDL1에 의한 억제에 의해 덜 영향을 받으며, Vγ9Vδ2 T-세포 집단은 Treg를 함유하지 않는다. 이는 CD3 이중특이성 T-세포 인게이저(engager)에 의한 Treg의 활성화가 후자의 활성을 제한하는 것으로 밝혀진 것과 관련이 있다. 또한, 포스포-항원-활성화된 부티로필린(BTN3A, CD227)의 차별적 발현은 정상 세포에 비해 암 세포에 대한 γδ T-세포의 더 큰 항종양 활성에 기여할 수 있다.
본 발명의 목적은 CD33-의존적 γδ T-세포 재유도가 가능한 다중특이성 또는 이중특이성 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 고친화성 또는 저친화성 Vδ2 결합제 중 어느 하나와 쌍을 이룬 상이한 CD33 결합제로 구성된 다중특이성 또는 이중특이성 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 Vγ9Vδ2 T 세포와 함께 CD33+ 암 세포 및 1차 AML 아세포에 대해 세포독성인 다중특이성 또는 이중특이성 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상이한 세포주에서 강력하고 선택적인 T-세포 매개 세포독성을 유도하는 다중특이성 또는 이중특이성 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 기존의 요법과 대비하여 안전성 및 효능과 관련하여 이점을 제공하는 다중특이성 또는 이중특이성 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 Vγ9Vδ2 T-세포의 표적-의존적 탈과립화, 활성화 및 증식을 유도하는 다중특이성 또는 이중특이성 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 건강한 CD14+ 세포(단핵구)에 비해 THP-1 암 세포의 우선적인 살해를 나타내는 다중특이성 또는 이중특이성 항체를 제공하는 것이다.
도 1: CD33xVδ2 이중특이성 항체는 CD33-발현 세포에 결합한다. THP-1 세포를 다양한 농도의 CD33xVδ2 이중특이성 항체 또는 음성 대조 항체(RSV(B21M)xVδ2 이중특이성 항체)와 함께 인큐베이션하였다. Alexa Fluor® 647 접합된 F(ab')2 염소 항-인간 IgG(H+L)(Jackson)을 사용하여 FACS에 의해 결합을 검출하였다. (A) CD33 결합 도메인으로서 JL2, JL3, JL5, 또는 JL6을 그리고 Vδ2 결합 도메인으로서 6H4를 함유하는 CD33xVδ2 이중특이성 항체. (B) CD33 결합 도메인으로서 JL2, JL3, JL5, 또는 JL6을 그리고 Vδ2 결합 도메인으로서 5D3을 함유하는 CD33xVδ2 이중특이성 항체.
도 2: CD33xVδ2 이중특이성 항체는 Vγ9Vδ2 T 세포에 결합한다. 건강한 공여자로부터 단리 및 증폭된 다중클론 Vγ9Vδ2 T 세포를 다양한 농도의 CD33xVδ2 이중특이성 항체, RSV(B21M)xVδ2 이중특이성 항체 또는 음성 대조 항체(LAVA-188, 2개의 비관련 표적에 대해 유도된 이중특이성 항체)와 함께 인큐베이션하였다. Alexa Fluor® 647 접합된 F(ab')2 염소 항-인간 IgG(H+L)(Jackson)을 사용하여 FACS에 의해 결합을 검출하였다. (A) CD33 결합 도메인으로서 JL2, JL3, JL5, 또는 JL6을 그리고 Vδ2 결합 도메인으로서 6H4를 함유하는 CD33xVδ2 이중특이성 항체 및 LAVA-188. (B) CD33 결합 도메인으로서 JL2, JL3, JL5, 또는 JL6을 그리고 Vδ2 결합 도메인으로서 5D3을 함유하는 CD33xVδ2 이중특이성 항체 및 LAVA-188.
도 3: CD33xVδ2 이중특이성 항체는 건강한 CD14 + 세포에 비해 종양 세포의 살해를 우선적으로 매개한다. THP-1 표적 세포(패널 A) 또는 CD14+ 표적 세포(패널 B)를 다양한 농도의 CD33xVδ2 이중특이성 항체(JL3x6H4, JL5x6H4, JL6x6H4 또는 JL5x5D3) 또는 음성 대조 항체(RSV(B21M)x6H4 또는 RSV(B21M)x5D3)와 함께 인큐베이션하였다. 공여자 PBMC(이펙터 세포)를 5:1 이펙터 세포 대 표적 세포 비로 첨가하고, 인큐베이션 후, 특이적 용해를 결정하였다.
도 4: CD33xVδ2 이중특이성 항체는 Vγ9Vδ2 T 세포의 증식을 유도한다. Vγ9Vδ2 T 세포(이펙터 세포) 및 THP-1 세포(표적 세포)를 1:20 이펙터 세포 대 표적 세포 비로 1 nM의 CD33xVδ2 이중특이성 항체(JL3x6H4, JL5x6H4, JL6x6H4 또는 JL5x5D3)와 함께 인큐베이션하였다. Vγ9Vδ2 T 세포의 수의 배수 증가를 1, 4, 7, 11 및 14일의 인큐베이션 후에 결정하였다. 패널 A 및 패널 B는 2명의 상이한 공여자로부터의 Vγ9Vδ2 T 세포를 나타낸다. 음성 대조군은 항체 RSV(B21M)x6H4 및 RSV(B21M)x5D3 및 배지였다.
정의
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "제1" 및 "제2" 항원-결합 영역은 항체에서의 이들의 배향/위치를 지칭하지 않는데, 즉, 이들은 N- 또는 C-말단과 관련하여 의미를 갖지 않는다. 용어 "제1" 및 "제2"는 단지 청구범위 및 상세한 설명에서 2개의 상이한 항원-결합 영역을 정확하고 일관되게 지칭하는 역할을 할 뿐이다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "CD33"은 인간 CD33을 지칭하며, 이의 서열은 UniProtKB - P20138에 제시되어 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "인간 Vδ2"는 Vγ9Vδ2-T 세포 수용체(TCR)의 재배열된 δ2 사슬을 지칭한다. GenBank: CAA51166.1은 δ2 서열의 예를 제공한다. TRDV2(T cell receptor delta variable 2, T 세포 수용체 델타 변수 2)는 가변 영역을 나타낸다(UniProtKB - A0JD36(A0JD36_HUMAN)은 TRDV2 서열의 예를 제공함). "Vγ9Vδ2-TCR의 Vδ2 사슬에 결합하는"은 항체가 별개의 분자로서 그리고/또는 Vγ9Vδ2-TCR(T 세포 수용체)의 일부로서 δ2 사슬에 결합할 수 있음을 의미한다. 그러나, 항체는 별개의 분자로서 γ9 사슬에 결합하지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "인간 Vγ9"는 Vγ9Vδ2-T 세포 수용체(TCR)의 재배열된 γ9 사슬을 지칭한다. GenBank: NG_001336.2는 γ9 서열의 예를 제공한다. TRGV9(T cell receptor gamma variable 9, T 세포 수용체 감마 변수 9)는 가변 영역을 나타낸다(UniProtKB - Q99603_HUMAN은 TRGV9 서열의 예를 제공함).
면역글로불린의 Fc(단편 결정화가능) 영역은, 전형적으로 파파인에 의한 항체의 분해 후에 생성되고 면역글로불린의 2개의 CH2-CH3 영역 및 연결 영역, 예를 들어 힌지 영역을 포함하는 항체의 단편으로서 정의된다. 항체 중쇄의 불변 도메인은 항체 동종형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, 또는 IgE를 정의한다. Fc 영역은 보체 시스템의 Fc 수용체 및 단백질로 불리는 세포 표면 수용체를 사용하여 항체의 이펙터 기능을 매개한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 면역글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭하고자 한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 EU 넘버링에 따라 아미노산 216 내지 230에 상응한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭하고자 한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 EU 넘버링에 따라 아미노산 231 내지 340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 다른 항체 동종형일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭하고자 한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 EU 넘버링에 따라 아미노산 341 내지 447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 다른 항체 동종형일 수 있다.
그러나, 일부 실시 형태에서, 항체의 Fc 영역은 불활성이 되도록 변형되었으며; "불활성"이란, 임의의 Fc감마 수용체에 결합할 수 있는 능력이 최소이거나 전혀 없는 Fc 영역이 FcR의 Fc-매개 교차결합을 유도하거나, 개별 항체들의 2개의 Fc 영역을 통해 표적 항원의 FcR-매개 교차결합을 유도한다는 것을 의미한다. 불활성 Fc 영역은 또한 C1q에 결합할 수 없다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "동종형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 (하위)부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, IgM, 또는 이들의 임의의 동종이인자형(allotype), 예컨대 하기 표 2의 동종이인자형)를 지칭한다. 각각의 중쇄 동종형은 카파(κ) 또는 람다(λ) 경쇄 중 어느 하나와 조합될 수 있다. 본 발명의 항체는 임의의 동종형을 가질 수 있다.
본 발명과 관련하여, "경쟁" 또는 "경쟁할 수 있는" 또는 "경쟁한다"는 특정 결합 분자(예를 들어, 항체)가, 특정 결합 파트너(예를 들어, 표적)에 결합하는 다른 분자(예를 들어, 동일한 표적에 결합하는 상이한 항체)의 존재 하에서, 특정 결합 파트너에 결합하는 경향에 있어서 검출가능할 정도로 유의한 임의의 감소를 지칭한다. 전형적으로, 경쟁은, 예를 들어, 충분한 양의 2개 이상의 경쟁 분자, 예를 들어 항체를 사용하여, 예를 들어 ELISA 분석 또는 유세포측정에 의해 결정될 때, 다른 분자, 예컨대 항체의 존재에 의해 야기되는, 결합에 있어서의 적어도 약 25% 감소, 예컨대 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 90% 감소를 의미한다. 경쟁적 억제에 의한 결합 특이성을 결정하기 위한 추가적인 방법은, 예를 들어 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988], 문헌[Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience N. Y., (1992, 1993)], 및 문헌[Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983)]에서 찾을 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
이행 용어 "포함하는", "~로 본질적으로 이루어진", 및 "~로 이루어진"은 특허 용어에서 그들의 일반적으로 허용되는 의미를 함축하는 것으로 의도되며; 즉, (i) "구비하는", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어인 "포함하는"은 포괄적 또는 개방형(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않으며; (ii) "~로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제하고; (iii) "~로 본질적으로 이루어진"은 명시된 재료 또는 단계, 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들"로 청구범위의 범주를 제한한다. 어구 "포함하는"(또는 이의 등가적 표현)의 관점에서 기재된 실시 형태는 또한 "~로 이루어진" 및 "~로 본질적으로 이루어진"의 관점에서 독립적으로 기재된 것들을 실시 형태로서 제공한다.
"약"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값이 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 어떻게 그 값이 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 제한사항에 부분적으로 좌우될 것이다. 특정 검정, 결과 또는 실시 형태와 관련하여 실시예에서 또는 명세서에서의 어딘가 다른 곳에서 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "약"은 당업계의 관행에 따른 1 표준 편차, 또는 최대 5%의 범위 어느 쪽이든 더 큰 값 이내에 있음을 의미한다.
"활성화" 또는 "자극" 또는 "활성화된" 또는 "자극된"은 활성화 마커의 발현, 사이토카인 생성, 증식 또는 표적 세포의 세포독성 매개를 가져오는 세포의 생물학적 상태에 있어서의 변화의 유도를 지칭한다. 세포는 1차 자극 신호에 의해 활성화될 수 있다. 공동자극성 신호는 1차 신호의 크기를 증폭시키고 초기 자극 후 세포사를 억제하여 더 지속적인 활성화 상태 및 이에 따른 더 높은 세포독성 능력을 가져올 수 있다.
"대체 스캐폴드"는 높은 입체형태 허용범위(conformational tolerance)의 가변 도메인과 관련된 구조화된 코어를 함유하는 단일쇄 단백질 프레임워크를 지칭한다. 가변 도메인은, 스캐폴드 완전성(integrity)을 손상시키지 않고서, 도입되는 변이에 견디며, 이에 따라 가변 도메인은 특이적 항원에 결합하도록 조작 및 선택될 수 있다.
"항원"은 면역 반응을 매개할 수 있는 T-세포 수용체 또는 항원-결합 도메인에 의해 결합될 수 있는 임의의 분자(예를 들어, 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 당지질, 핵산, 이들의 부분, 또는 이들의 조합)를 지칭한다. 예시적인 면역 반응은 항체 생성, 및 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포와 같은 면역 세포의 활성화를 포함한다. 항원은 생물학적 샘플, 예컨대 조직 샘플, 종양 샘플, 세포, 또는 다른 생물학적 성분, 유기체, 단백질/항원의 하위단위, 살해된 또는 비활성화된 전세포(whole cell) 또는 용해물을 갖는 유체로부터 합성되거나 정제된 유전자에 의해 발현될 수 있다.
"항원-결합 영역" 또는 "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 부위"는 항원에 결합하는 항체의 일부분을 지칭한다. 항원-결합 영역은 합성 폴리펩티드이거나, 효소적으로 얻을 수 있는 폴리펩티드이거나, 유전자 조작된 폴리펩티드일 수 있으며, 항원에 결합하는 면역글로불린의 일부분, 예컨대 VH, VL, VH 및 VL, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 Fv 단편, 1개의 VH 도메인 또는 1개의 VL 도메인으로 이루어진 단일-도메인 항체(dAb), 상어 가변 IgNAR 도메인, 낙타화(camelized) VH 도메인, VHH 도메인, 항체의 CDR을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위, 예컨대 FR3-CDR3-FR4 부분, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 항원에 결합하는 대체 스캐폴드, 및 항원-결합 영역을 포함하는 다중특이성 단백질을 포함한다. 항원-결합 도메인들(예컨대, VH 및 VL)은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 분자내에, 또는 VH 도메인과 VL 도메인이 별개의 단일쇄에 의해 발현되는 경우에는 분자간에 쌍을 형성하여 1가 항원-결합 도메인, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 다이아바디(diabody)를 형성할 수 있다. 항원-결합 영역은 또한 이중특이성 및 다중특이성 단백질을 조작하기 위해 단일특이성 또는 다중특이성일 수 있는 다른 항체, 단백질, 항원-결합 단편 또는 대체 스캐폴드에 접합될 수 있다.
"항체"는 광의를 의미하며, 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함한 단일클론 항체, 항원-결합 단편, 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성 등), 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체, 도메인 항체를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 존재하는 경우, 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. VH 또는 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR 세그먼트로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
"이중특이성"은 2개의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분자(예컨대, 항체)를 지칭한다. 이중특이성 분자는 다른 관련 항원들에 대한, 예를 들어 다른 종(상동체), 예컨대 인간, 원숭이, 또는 유인원, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스 원숭이, 사이노), 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)로부터의 동일한 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프에 결합할 수 있다.
이중특이성 항체의 각종 부류의 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: (i) 이종이량체화를 강제로 수행하도록 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; (ii) 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자 - 여기서는, 분자의 2개의 측 각각이 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유함 -; (iii) IgG 융합 분자 - 여기서는, 전장 IgG 항체가 추가 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합됨 -; (iv) Fc 융합 분자 - 여기서는, 단일쇄 Fv 분자 또는 안정화된 다이아바디가 중쇄 불변 도메인, Fc 영역 또는 이의 일부에 융합됨 -; (v) Fab 융합 분자 - 여기서는, 상이한 Fab 단편들이 함께 융합됨; 중쇄 불변 도메인, Fc 영역 또는 이의 일부에 융합됨; 및 (vi) scFv- 및 다이아바디-기반 및 중쇄 항체(예를 들어, 도메인 항체, 나노바디(Nanobodies®)) - 여기서는, 상이한 단일쇄 Fv 분자들 또는 상이한 다이아바디들 또는 상이한 중쇄 항체들(예를 들어, 도메인 항체, 나노바디(Nanobodies®))이 중쇄 불변 도메인, Fc 영역 또는 이의 일부에 융합된 서로 또는 다른 단백질 또는 운반체 분자에 융합됨.
상보적 CH3 도메인 분자를 갖는 IgG-유사 분자의 예에는 Triomab®(Trion Pharma/Fresenius Biotech), 노브-인투-홀(Knob-into-Hole)(Genentech), CrossMAb(Roche) 및 정전기적으로 일치된 형태(electrostatically-matched)(Amgen, Chugai, Oncomed), LUZ-Y(문헌[Genentech, Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1]), DIG-바디 및 PIG-바디(Pharmabcine, 국제 특허 출원 공개 WO2010134666호, WO2014081202호), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody)(EMD Serono), Biclonics(Merus, 국제 특허 출원 공개 WO2013157953호), FcΔAdp(Regeneron), 이중특이성 IgG1 및 IgG2(Pfizer/Rinat), Azymetric 스캐폴드(Zymeworks/Merck), mAb-Fv(Xencor), 2가 이중특이성 항체(Roche, 국제 특허 출원 공개 WO2009080254) 및 DuoBody® 분자(Genmab)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자의 예에는 이중 표적화(DT)-Ig(GSK/Domantis, 국제 특허 출원 공개 WO2009058383호), 투-인-원 항체(Two-in-one Antibody)(문헌[Genentech, Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614]), 가교결합된(Cross-linked) Mab(문헌[Karmanos Cancer Center]), mAb2(F-Star), Zybodies™(Zyngenia, 문헌[LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18]), 공통 경쇄를 사용한 접근, κλBodies(NovImmune, 국제 특허 출원 공개 WO2012023053호) 및 CovX-body®(CovX/Pfizer, 문헌[Doppalapudi, V.R., et al 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506])가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
IgG 융합 분자의 예에는 이중 가변 도메인(DVD)-Ig(Abbott), 이중 도메인 이중 헤드 항체(Unilever; Sanofi Aventis), IgG-유사 이중특이체(ImClone/Eli Lilly, 문헌[Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb; 32(2): 191-8]), Ts2Ab(MedImmune/AZ, 문헌[Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30; 393(3): 672-92]) 및 BsAb(Zymogenetics, 국제 특허 출원 공개 WO2010111625호), HERCULES(Biogen Idec), scFv 융합체(Novartis), scFv 융합체(Changzhou Adam Biotech Inc) 및 TvAb(Roche)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
Fc 융합 분자의 예에는 scFv/Fc 융합체(Academic Institution, 문헌[Pearce et al Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179]), SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion, 문헌[Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009(Abstract #5465)]; Zymogenetics/BMS, 국제 특허 출원 공개 WO2010111625호), 이중 친화성 재표적화 기술(Dual Affinity Retargeting Technology)(Fc-DARTTM)(MacroGenics) 및 이중(ScFv)2-Fab(National Research Center for Antibody Medicine - China)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
Fab 융합 이중특이성 항체의 예에는 F(ab)2(Medarex/AMGEN), 이중-작용체(Dual-Action) 또는 Bis-Fab(Genentech), 독-앤드-록(Dock-and-Lock, DNL)(ImmunoMedics), 2가 이중특이체(Bivalent Bispecific)(Biotecnol) 및 Fab-Fv(UCB-Celltech)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
ScFv-, 다이아바디-기반 및 도메인 항체의 예에는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE®)(Micromet, 탠덤 다이아바디(Tandab)(Affimed), 이중 친화성 재표적화 기술(DARTTM)(MacroGenics), 단일쇄 다이아바디(Academic, 문헌[Lawrence FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84]), TCR-유사 항체(AIT, ReceptorLogics), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체(Merrimack, 국제 특허 출원 공개 WO2010059315호) 및 COMBODY 분자(Epigen Biotech, 문헌[Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75]), 이중 표적화 나노바디(dual targeting nanobodies®)(Ablynx, 문헌[Hmila et al., FASEB J. 2010]), 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 다중특이성 항체는 VHH-Fc 포맷일 수 있으며, 즉, 항체는 인간 Fc 영역 이량체를 통해 서로 연결된 2개 이상의 단일-도메인 항원-결합 영역을 포함한다. 이 포맷에서는, 각각의 단일-도메인 항원-결합 영역이 Fc 영역 폴리펩티드에 융합되고, 2개의 융합 폴리펩티드는 힌지 영역에서 이황화물 가교를 통해 이량체성 이중특이성 항체를 형성한다. 그러한 작제물은 전형적으로 완전 또는 임의의 CH1 또는 경쇄 서열을 함유하지 않는다. 국제 특허 출원 공개 WO06064136호의 도 12b는 이러한 포맷의 예의 예시를 제공한다.
이중특이성 항체는 또한 혼합 포맷일 수 있다. 예를 들어, 하나의 항원-결합 영역은 Fab 또는 scFv 포맷일 수 있고, 나머지 다른 하나의 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체로 구성되거나 이로 이루어질 수 있다. 그러한 작제물은 추가적으로 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 이 영역은 힌지 영역을 통해 Fc 폴리펩티드들을 연결한다.
"상보성 결정 영역"(CDR)은 항원에 결합하는 항체 영역이다. VH 내에 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 존재하고, VL(존재하는 경우) 내에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 존재한다. CDR은 하기와 같은 다양한 도해(delineation)를 사용하여 정의될 수 있다: 카바트(Kabat)(문헌[Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50]; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]), 초티아(Chothia)(문헌[Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17]), IMGT(문헌[Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]), AbM(문헌[Martin and Thornton J Bmol Biol 263: 800-15, 1996]), 또는 Contact - 이는 이용가능한 복잡한 결정 구조의 분석에 기초함 - (문헌[MacCallum, R. M., Martin, A. C. R. and Thornton, J. T. "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography" J. Mol. Biol. 262:732-745]). 이러한 다양한 도해와 가변 영역 넘버링 사이의 상응성이 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]; 문헌[Honegger and Pluckthun, J Mol Biol (2001) 309:657-70]; International ImMunoGeneTics (IMGT) 데이터베이스; 웹 자원(Web resource), www.imgt.org 참조). UCL Business PLC의 abYsis와 같은 이용가능한 프로그램을 사용하여 CDR을 상세하게 설명할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"은 본 명세서에 달리 명시적으로 기재되어 있지 않는 한, 상기에 기재된 방법들인 카바트, 초티아, IMGT, AbM, 또는 Contact 중 임의의 것에 의해 정의된 CDR을 포함한다. 서열 번호 1 내지 48을 갖는 서열의 CDR은 카바트(상기 참조)에 따라 정의된다.
"발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 지칭한다.
"단일-도메인 항체", "dAb", "VHH" 또는 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다(문헌[Ward et al., Nature 341:544 546 (1989)]). 본 발명의 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체일 수 있다. 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디(Nanobody®)로도 불림, 또는 VHH)는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446, Roovers et al. (2007) Curr Opin Mol Ther 9:327] 및 문헌[Krah et al. (2016) Immunopharmacol Immunotoxicol 38:21]을 참조한다. 단일-도메인 항체는 단일 CDR1, 단일 CDR2 및 단일 CDR3을 포함한다. 단일-도메인 항체의 예는 중쇄-전용 항체의 가변 단편, 천연적으로 경쇄를 포함하지 않는 항체, 통상적인 항체로부터 유래되는 단일-도메인 항체, 및 조작된 항체이다. 단일-도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 포함한 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 VHH 분자는 낙타과 종에서, 예를 들어 낙타, 단봉낙타, 라마, 알파카 및 과나코에서 발생되는 항체로부터 유래될 수 있다. 전 항체(whole antibody)와 마찬가지로, 단일-도메인 항체는 단일 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 단일-도메인 항체는 단지 면역글로불린 사슬의 가변 도메인, 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 프레임워크 영역만을 함유할 수 있다.
"Fab" 또는 "Fab 단편"은 VH, CH1, VL 및 CL 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다.
"F(ab') 2 " 또는 "F(ab') 2 단편"은 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 함유하는 항체 단편을 지칭한다.
"Fd" 또는 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다.
"Fv" 또는 "Fv 단편"은 항체의 단일 아암(arm)으로부터의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다.
"숙주 세포"는 이종 핵산을 함유하는 임의의 세포를 지칭한다. 예시적인 이종 핵산은 벡터(예를 들어, 발현 벡터)이다.
"인간 항체"는 인간 대상체에게 투여될 때 최소한의 면역 반응을 갖도록 최적화된 항체를 지칭한다. 인간 항체의 가변 영역은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체가 불변 영역 또는 불변 영역의 일부분을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체는, 인간 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열(germline) 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 예시적인 시스템은 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 유전자도입 비인간 동물, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자좌를 보유하는 마우스 또는 래트이다. "인간 항체"는 전형적으로, 인간 항체 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 얻는 데 사용되는 시스템간의 차이, 체세포 돌연변이의 도입 또는 프레임워크, CDR, 또는 불변 영역 내로의 치환의 의도적인 도입, 또는 둘 모두로 인해 인간에서 발현된 면역글로불린과 비교하여 아미노산 차이를 함유한다. 전형적으로, "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하거나, 또는, 예를 들어 문헌[Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96] 및 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 도입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다. 적어도 하나의 CDR이 비인간 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
"인간화 항체"는, 하나 이상의 CDR이 비인간 종으로부터 유래되고, 적어도 하나의 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
"단리된"은 분자가 생성되는 시스템, 예컨대 재조합 세포의 다른 성분으로부터 실질적으로 분리되고/되거나 정제된 분자(예컨대, 합성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)의 상동 집단뿐만 아니라, 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 단백질을 지칭한다. "단리된"은 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 분자를 지칭하며, 더 높은 순도로, 예컨대 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도로 단리된 분자를 포함한다.
"다중특이성"은 2개 이상의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개 이상의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대 항체를 지칭한다. 다중특이성 분자는 다른 관련 항원들에 대한, 예를 들어 다른 종(상동체), 예컨대 인간, 원숭이, 또는 유인원, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스, 사이노), 또는 판 트로글로디테스로부터의 동일한 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된" 및 유사한 어구는 핵산 또는 아미노산과 관련하여 사용될 때, 서로 기능적 관계에 놓여진, 각각 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 작동가능한 연결을 지칭한다. 예를 들어, 작동가능하게 연결된 프로모터, 인핸서 요소, 오픈 리딩 프레임, 5' 및 3' UTR, 및 종결자 서열은 핵산 분자(예를 들어, RNA)의 정확한 생성을 가져오고 일부 경우에는 폴리펩티드의 생성을 가져온다(즉, 오픈 리딩 프레임의 발현). 작동가능하게 연결된 펩티드는, 기능적 도메인들이 각 도메인의 의도된 기능을 부여하기 위해 서로 적절한 거리를 두고 배치된 펩티드를 지칭한다.
"약제학적 조성물"은 활성 성분과 약제학적으로 허용되는 담체의 배합으로부터 생성된 조성물을 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "부형제"는 활성 성분 이외의, 대상체에게 비독성인 약제학적 조성물 내의 성분을 지칭한다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 완충제, 안정제, 또는 방부제이다.
질병 또는 장애와 관련하여 "예방하다", "예방하는", "예방", 또는 "예방법"은 장애가 대상체에서 발생하는 것을 예방하는 것을 의미한다.
2개의 서열들 사이의 퍼센트 "서열 동일성"은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 PAM120 가중치 잔기(weight residue) 표, 갭 길이 페널티 = 12 및 갭 페널티 = 4를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 사용하여, (www_gcg_com에서 입수가능한) GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 VL과 VH는 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고, 단일쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, scFv는, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 단부 및 C-말단 단부에 대하여, 어느 순서로든 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있으며, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
"특이적으로 결합한다", "특이적 결합", "특이적으로 결합하는" 또는 "결합한다"는 단백질성 분자가 항원 또는 항원 내의 에피토프에 대해 다른 항원들에 대한 친화도보다 더 큰 친화도로 결합하거나 결합할 수 있는 것을 지칭한다. 전형적으로, 단백질성 분자는 약 1x10-7 M 이하, 예를 들어 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 항원 또는 항원 내의 에피토프에 결합하며, 이때 전형적으로 KD는 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하기 위한 그의 KD보다 적어도 100배 더 적다.
"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 용어 "대상체"와 "환자"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
"T 세포"와 "T 림프구"는 본 명세서에서 상호교환 가능하며 동의어로 사용된다. T 세포는 흉선세포, 미감작 T 림프구, 기억 T 세포, 미성숙 T 림프구, 성숙 T 림프구, 휴지 T 림프구, 또는 활성화 T 림프구를 포함한다. T 세포는 T 헬퍼(Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 2(Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포) CD4+ T 세포, 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), 종양 침윤 세포독성 T 세포(TIL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 또는 T 세포의 임의의 다른 하위세트일 수 있다. 또한 "NKT 세포"가 포함되는데, 이는 반-불변성(semi-invariant) αβ T-세포 수용체를 발현하지만, 또한 NK 세포와 전형적으로 관련된 다양한 분자 마커, 예컨대 NK1.1을 발현하는 T 세포들의 특수화된 집단을 지칭한다. NKT 세포는 NK1.1+ 및 NK1.1-뿐만 아니라, CD4+, CD4-, CD8+ 및 CD8- 세포를 포함한다. NKT 세포 상의 TCR은, 그것이 MHC I-유사 분자 CD1d에 의해 제시되는 당지질 항원을 인식한다는 점에서 독특하다. NKT 세포는 염증 또는 면역 관용을 촉진하는 사이토카인을 생성하는 그의 능력에 기인하여 보호 효과 또는 해로운 효과를 가질 수 있다. "감마-델타 T 세포(γδ T 세포)"가 또한 포함되는데, 이는, 비고전적 T 세포 항원을 인식할 수 있는 능력을 갖는, 표면 상에 서로 구별되는 TCR을 갖는 T 세포들의 특수화된 집단을 지칭하고, TCR이 α- 및 β-TCR 사슬로 지정된 2개의 당단백질 사슬로 구성되는 대부분의 T 세포와 달리, γδ T 세포 내의 TCR은 γ-사슬 및 δ-사슬로 구성된다. 상이한 유형의 γ-사슬 및 δ-사슬이 존재하며, 이를 테면, 예를 들어, Vγ9Vδ2 T 세포 상에서 공동발현되는 Vγ9 사슬과 Vδ2 사슬이 있다. γδ T 세포는 면역감시 및 면역조절에 있어서 역할을 할 수 있으며, IL-17의 중요한 공급원이고 강력한 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다. "조절성 T 세포" 또는 "Treg"가 또한 포함되는데, 이는, 비정상적이거나 과도한 면역 반응을 억제하고 면역 관용에서 역할을 하는 T 세포를 지칭한다. Treg는 전형적으로 전사 인자 Foxp3-양성 CD4+ T 세포이며, 또한 IL-10-생성 CD4+ T 세포인 전사 인자 Foxp3-음성 조절성 T 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되는 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 치료제 또는 치료제들의 병용물이 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 변동될 수 있다. 유효한 치료제 또는 치료제들의 병용물의 예시적인 지표는, 예를 들어 환자의 개선된 웰빙(well-being), 종양 부하(tumor burden)의 감소, 종양의 정지성 또는 지연성 성장, 및/또는 체내의 다른 위치로의 암 세포의 전이의 부재를 포함한다.
암과 같은 질병 또는 장애와 관련하여 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 하기 중 하나 이상을 달성하는 것을 지칭한다: 장애의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시킴; 치료되는 장애에 특징적인 증상의 악화를 억제함; 이전에 장애를 가졌던 대상체에서 그러한 장애의 재발을 제한하거나 예방함; 또는 장애에 대해 이전에 증상을 나타낸 대상체에서 증상의 재발을 제한하거나 예방함.
"종양 세포" 또는 "암 세포"는 생체내, 생체외(ex vivo), 또는 조직 배양에서의 암성, 전암성, 또는 형질전환 세포를 지칭하며, 이는 자발적이거나 유도된 표현형 변화를 갖는다. 이러한 변화가 반드시 새로운 유전 물질의 흡수를 수반하지는 않는다. 형질전환이 형질전환 바이러스에 의한 감염 및 새로운 게놈 핵산의 도입, 또는 외인성 핵산의 흡수로부터 일어날 수 있기는 하지만, 이는 또한 자발적으로 또는 발암물질에 대한 노출 후에 일어날 수 있으며, 그럼으로써 내인성 유전자를 돌연변이화할 수 있다. 형질전환/암은 시험관내에서, 생체내에서, 그리고 생체외에서 누드 마우스 등과 같은 적합한 동물 숙주에서의 형태학적 변화, 세포의 불멸화, 비정상 성장 제어, 병소 형성, 증식, 악성종양, 종양 특이적 마커 수준의 조절, 침습성, 종양 성장에 의해 예시된다.
"변이체", "돌연변이체" 또는 "변경된"은 하나 이상의 변형, 예를 들어 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 참조 폴리펩티드 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본 명세서 전체에 걸쳐 항체 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 따른다.
[표 1]
본 발명의 추가의 태양 및 실시 형태
전술한 바와 같이, 제1 태양에서, 본 발명은 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 단리된 다중특이성 항체에 관한 것으로, 상기 제1 항원-결합 영역은
a) 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6;
a) 각각 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12;
d) 각각 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18; 또는
e) 각각 서열 번호 19, 20, 21, 22, 23, 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고;
상기 제2 항원-결합 영역은 상기 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체의 Vδ2 사슬에 결합한다.
상기 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체일 수 있고,
a) 각각 서열 번호 25, 26, 및 27;
b) 각각 서열 번호 28, 29, 및 30;
c) 각각 서열 번호 31, 32, 및 33;
d) 각각 서열 번호 34, 35, 및 36;
e) 각각 서열 번호 37, 38, 및 39;
f) 각각 서열 번호 40, 41, 및 42;
g) 각각 서열 번호 43, 44, 및 45; 또는
h) 각각 서열 번호 46, 47, 및 48의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
제1 항원-결합 영역은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
제1 항원-결합 영역은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있고, 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체이고, 각각 서열 번호 28, 29, 및 30의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
제1 항원-결합 영역은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함할 수 있고, 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체이고, 각각 서열 번호 25, 26, 및 27의 CDR1, CDR2, 및 CD3을 포함한다.
제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체이고, 각각 서열 번호 28, 29, 및 30의 CDR1, CDR2, 및 CD3을 포함한다.
본 발명의 다중특이성 항체는
a) 서열 번호 49의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 50의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 51의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 52의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 53의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 54의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 55의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 56의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원-결합 영역;
및
a) 서열 번호 57과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 58과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 59와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 60과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
e) 서열 번호 61과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
f) 서열 번호 62와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
g) 서열 번호 63과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
h) 서열 번호 64와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
i) 서열 번호 65와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
j) 서열 번호 66과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는 인간 Vδ2에 결합하기 위해 서열 번호 57 내지 66으로부터 선택되는 서열을 갖는 항체와 경쟁하는 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는 서열 번호 57 내지 66으로부터 선택되는 서열을 갖는 항체와 동일하게 인간 Vδ2 상의 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는
a) 서열 번호 49의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 50의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원-결합 영역;
및
a) 서열 번호 57과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 58과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 59와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 60과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
e) 서열 번호 61과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
f) 서열 번호 62와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
g) 서열 번호 63과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
h) 서열 번호 64와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
i) 서열 번호 65와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
j) 서열 번호 66과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는
b) 서열 번호 51의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 52의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원-결합 영역;
및
a) 서열 번호 57과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 58과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 59와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 60과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
e) 서열 번호 61과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
f) 서열 번호 62와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
g) 서열 번호 63과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
h) 서열 번호 64와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
i) 서열 번호 65와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
j) 서열 번호 66과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는
c) 서열 번호 53의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 54의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원-결합 영역;
및
a) 서열 번호 57과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 58과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 59와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 60과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
e) 서열 번호 61과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
f) 서열 번호 62와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
g) 서열 번호 63과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
h) 서열 번호 64와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
i) 서열 번호 65와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
j) 서열 번호 66과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는
d) 서열 번호 55의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 56의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원-결합 영역;
및
a) 서열 번호 57과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 58과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 59와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 60과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
e) 서열 번호 61과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
f) 서열 번호 62와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
g) 서열 번호 63과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
h) 서열 번호 64와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
i) 서열 번호 65와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
j) 서열 번호 66과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는
a) 서열 번호 49의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 50의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 51의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 52의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 53의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 54의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 55의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 56의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원-결합 영역;
및
b) 서열 번호 58과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는
a) 서열 번호 49의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 50의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 번호 51의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 52의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
c) 서열 번호 53의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 54의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
d) 서열 번호 55의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 56의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 항원-결합 영역;
및
a) 서열 번호 57과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 서열의 변이체는 바람직하게는 개시된 서열의 보존적 변형을 포함한다. "보존적 변형"은 아미노산 변형을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 주지 않거나 그를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 잘 규정되어 있고, 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄(예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 황-함유 측쇄 (시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 더욱이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 대해 이전에 기재된 바와 같다(문헌[MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67]; 문헌[Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1-24]). 본 발명의 항체에 대한 아미노산 치환은 알려진 방법에 의해, 예를 들어 PCR 돌연변이생성(미국 특허 제4,683,195호)에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는데, 예를 들어 무작위 (NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산 (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩함 - 을 사용하여 생성할 수 있다. 생성되는 변이체들은 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 그들의 특성에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는 임의의 적합한 항체 포맷을 가질 수 있다. 많은 항체 포맷이 당업계에 기재되어 있다.
다중특이성 항체는 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역을 포함하는 Fab, scFv, (scFv)2, Fv, F(ab')2 또는 Fd를 포함할 수 있다.
인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역은 임의의 적합한 포맷(예를 들어, Fab, scFv, (scFv)2, Fv, F(ab')2, Fd 또는 단일-도메인 항체)일 수 있다. 다중특이성 항체는 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하거나 이로 이루어진 단일-도메인 항체를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역을 포함하는 Fab, 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 단일-도메인 항체를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역을 포함하는 scFv, 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 단일-도메인 항체를 포함할 수 있다.
항체 포맷에 따라, 항원-결합 영역들 또는 이의 부분들은 동일한 폴리펩티드 사슬의 일부이고 단일 오픈 리딩 프레임으로부터 발현될 수 있다. 그러한 실시 형태에서, 항원-결합 영역 서열들 사이에 링커 서열이 사용될 수 있다.
다중특이성 항체는 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역을 포함하는 scFv, 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 VHH를 포함할 수 있으며, scFv는 펩티드 링커를 포함하며, 펩티드 링커는 선택적으로 서열 번호 67 내지 99, 예컨대 서열 번호 67에 제시된 링커들의 군으로부터 선택된다.
제1 항원-결합 영역과 제2 항원-결합 영역은 펩티드 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 연결될 수 있으며, 선택적으로 펩티드 링커는 서열 번호 100에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다중특이성 항체는 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 수 있으며, 여기서 제1 항원-결합 영역은 제2 항원-결합 영역의 N-말단에 위치된다. N-말단에서 C-말단으로의 순서는 VL-제1 링커-VH-제2 링커-VHH일 수 있으며, 여기서 VL은 제1 항원-결합 도메인의 경쇄 가변 영역이고, 제1 링커는 펩티드 링커이고, VH는 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 가변 영역이고, 제2 링커는 펩티드 링커이고, VHH는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 단일-도메인 항체이다. 다중특이성 항체는 단일 오픈 리딩 프레임에 의해 인코딩될 수 있으며, 여기서 제1 항원-결합 영역은 제2 항원-결합 영역의 C-말단에 위치된다.
본 발명의 다중특이성 항체는 불변 영역 서열, 예컨대 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드로 이루어진 Fc 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 다중특이성 항체는 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역을 포함하는 Fab, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 VHH, 및 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 49의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 50의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 49의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 50의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 51의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 52의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 51의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 52의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 53의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 54의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 53의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 54의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 55의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 56의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다중특이성 항체는
- 서열 번호 55의 VH 및 중쇄 불변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드,
- 서열 번호 56의 VL 및 경쇄 불변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 단리된 다중특이성 항체는
a) 서열 번호 101, 102 및 103에 제시된 폴리펩티드;
b) 서열 번호 104, 105 및 106에 제시된 폴리펩티드;
c) 서열 번호 107, 108 및 109에 제시된 폴리펩티드;
d) 서열 번호 110, 111 및 112에 제시된 폴리펩티드;
e) 서열 번호 113, 114 및 115에 제시된 폴리펩티드;
f) 서열 번호 116, 117 및 118에 제시된 폴리펩티드;
g) 서열 번호 119, 120 및 121에 제시된 폴리펩티드; 또는
h) 서열 번호 122, 123 및 124에 제시된 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 단리된 다중특이성 항체는 이중특이성 항체일 수 있다.
본 발명의 단리된 다중특이성 항체는 CD33에 1가로 결합할 수 있고, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 1가로 결합할 수 있다.
본 발명의 항체의 제1 항원-결합 영역 및/또는 제2 항원-결합 영역은 인간 또는 인간화된 것일 수 있다.
다중특이성 항체는, 예를 들어 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 때, 표적 세포의 존재 하에서 1 nM의 항체 농도에서 10일 후에 10배 초과 또는 50배 초과의 증가로 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 증식을 유도할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는 Vγ9Vδ2-T 세포의 존재 하에서 THP-1 세포의 살해를 매개할 수 있으며, 이에는 낮은 이펙터 대 표적 세포 비가 포함된다. 따라서, 본 발명의 다중특이성 항체는 Vγ9Vδ2-T 세포(E)의 존재 하에서 THP-1 세포(T)의 살해를 매개할 수 있는데, 즉, 예를 들어 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 때, 1:20의 E:T 비에서 1 nM 미만, 예컨대 0.5 nM, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 150 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만의 EC50으로 매개할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는 혈액암 환자로부터의 인간 CD33-발현 세포의 살해를 매개할 수 있다.
본 발명의 다중특이성 항체는, 예를 들어 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 시험될 때, 비종양 세포, 예를 들어 건강한 공여자로부터의 CD14+ 세포에 비해 CD33-양성 종양 세포, 예를 들어 THP-1 세포의 살해를 우선적으로 매개할 수 있다.
동종형, 동종이인자형 및 Fc 조작
본 발명의 항체에 존재하는 Fc 영역과 같은 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편은 임의의 동종이인자형 또는 동종형일 수 있다.
본 발명의 단리된 다중특이성 항체는 Ig 불변 영역 또는 이의 단편, 예를 들어 단편 결정화가능 영역("Fc" 영역)을 포함할 수 있다. 상기 Ig 불변 영역 또는 이의 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편은 임의의 동종이인자형일 수 있다. 동종이인자형은 Ig 불변 영역의 특성, 예컨대 결합 또는 Fc-매개 이펙터 기능에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. Ig 불변 영역 또는 이의 단편을 포함하는 치료용 항체의 면역원성은 주입 반응의 위험성 증가 및 치료 반응의 지속 기간의 감소와 관련이 있다(문헌[Baert et al., (2003) N Engl J Med 348:602-08]). Ig 불변 영역 또는 이의 단편을 포함하는 치료용 항체가 숙주에서 면역 반응을 유도하는 정도는 Ig 불변 영역의 동종이인자형에 의해 부분적으로 결정될 수 있다(문헌[Stickler et al., (2011) Genes and Immunity 12:213-21]). Ig 불변 영역 동종이인자형은 항체의 불변 영역 서열의 특정 위치에서의 아미노산 서열 변이와 관련이 있다. 표 2는 선택된 IgG1, IgG2, 및 IgG4 동종이인자형을 나타낸다.
[표 2]
C-말단 라이신(CTL)은 혈류 중의 내인성 순환 카르복시펩티다제에 의해 Ig 불변 영역으로부터 제거될 수 있다(문헌[Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108:404-412]). 제조 동안에, CTL 제거는, 미국 특허 출원 공개 제20140273092호에 기재된 바와 같이, 세포외 Zn2+, EDTA 또는 EDTA - Fe3+의 농도를 제어하는 것에 의해 최대 수준 미만으로 제어될 수 있다. 단백질의 CTL 함량은 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
항원-결합 단편에 접합된 Ig 불변 영역은 0% 내지 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 또는 약 60%의 C-말단 라이신 함량을 가질 수 있다.
항원-결합 도메인에 접합된 Ig 불변 영역 또는 이의 단편에 대해 Fc 영역 돌연변이가 수행되어, Fc 수용체에 대한 그들의 결합을 조절하고, 그럼으로써 이들의 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 및/또는 ADCP 및/또는 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 이는 Fc 내로 (i) 활성화 FcγR(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIII), 및 억제성 FcγRIIb에 대한 돌연변이된 Fc의 결합을 조절하고/하거나; (ii) Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체-의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 식세포작용(ADCP)을 감소시키고, Fc 수용체-양성 세포에 대한 이중특이성 항체의 결합을 통해 매개되는 항원-비의존성 T 세포 활성화를 감소시키는 돌연변이(들)를 도입함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 단리된 다중특이성 항체의 Fc 영역은 불활성일 수 있다. 본 발명의 단리된 다중특이성 항체의 불활성 Fc 영역은 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두에서 234에 상응하는 위치에 존재하는 Ala, 235에 상응하는 위치에 존재하는 Ala, 및 265에 상응하는 위치에 존재하는 Ser을 포함할 수 있으며, 상기 넘버링은 Eu에 따른다.
Fc 영역은 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 항체의 감소된 결합을 가져오는 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 활성화 FcγR에 대한 항체의 결합을 감소시키고 후속으로 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는 위치 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 및 365를 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 이루어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 gG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에서의 돌연변이 K214T, E233P, L234V, L234A, G236의 결실, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S 및 P331S이다. 감소된 ADCC를 갖는 항체를 가져오는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 돌연변이 L234A/L235A, IgG1 상의 돌연변이 L234A/L235A/D265S, IgG2 상의 돌연변이 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, IgG4 상의 돌연변이 F234A/L235A, IgG4 상의 돌연변이 S228P/F234A/ L235A, 모든 Ig 동종형 상의 돌연변이 N297A, IgG2 상의 돌연변이 V234A/G237A, IgG1 상의 돌연변이 K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, IgG2 상의 돌연변이 H268Q/V309L/ A330S/P331S, IgG1 상의 돌연변이 S267E/L328F, IgG1 상의 돌연변이 L234F/L235E/D265A, IgG1 상의 돌연변이 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, IgG4 상의 돌연변이 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 IgG4 상의 돌연변이 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S이다. IgG2로부터의 잔기 117 내지 260 및 IgG4로부터의 잔기 261 내지 447을 갖는 Fc와 같은 하이브리드 IgG2/4 Fc 도메인이 또한 사용될 수 있다.
감소된 CDC를 갖는 항체를 가져오는 예시적인 돌연변이는 K322A 돌연변이이다.
잘 알려진 S228P 돌연변이가, IgG4 안정성을 향상시키기 위해 IgG4에서 이루어질 수 있다.
FcγR에 대한 항체의 감소된 결합을 가져오는 적어도 하나의 돌연변이는 F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
본 발명의 항체는 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 단백질의 결합을 향상시키고/시키거나, Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 및/또는 식세포작용(ADCP)을 향상시키는 Fc 영역 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다.
Fc 영역은 FcγR에 대한 항체의 향상된 결합을 가져오는 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. FcγR에 대한 단백질의 향상된 결합을 가져오는 적어도 하나의 돌연변이는 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및 G236A/S239D/I332E로 이루어진 군으로부터 선택되며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
활성화 FcγR에 대한 항체의 결합을 증가시키고/시키거나 Fc 이펙터 기능을 향상시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는 위치 236, 239, 243, 256,290,292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 또는 430(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름)을 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 이루어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T 및 P396L이다. 증가된 ADCC 또는 ADCP를 갖는 항체를 가져오는 예시적인 조합 돌연변이는 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및 G236A/S239D/I332E이다.
CDC를 향상시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는 위치 267, 268, 324, 326, 333, 345 및 430을 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 이루어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 S267E, F1268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430S, E430F 및 E430T이다. 증가된 CDC를 갖는 항체를 가져오는 예시적인 조합 돌연변이는 K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T 및 S267E/H268F/S324T이다.
본 명세서에 기재된 특정 돌연변이는, 각각 서열 번호 125, 126 및 127의 IgG1, IgG2 및 IgG4 야생형 아미노산 서열과 비교할 때 돌연변이이다.
FcγR 또는 FcRn에 대한 항체의 결합은 유세포측정을 사용하여 각각의 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 세포에서 평가될 수 있다. 예시적인 결합 검정에서, 웰당 2 x 105개의 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고, BSA 염색 완충액(미국 산호세 소재의 BD Biosciences) 중에서 4℃에서 30분 동안 차단시킨다. 세포를 얼음 상에서 시험 항체와 함께 4℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한다. BSA 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 R-PE 표지된 항-인간 IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories)와 함께 4℃에서 45분 동안 인큐베이션한다. 세포를 염색 완충액 중에서 2회 세척한 후, 1:200 희석된 DRAQ7 생/사(live/dead) 염색제(미국 덴버스 소재의 Cell Signaling Technology)를 함유하는 150 μL의 염색 완충액 중에 재현탁한다. 염색된 세포의 PE 및 DRAQ7 신호는, 각각 B2 및 B4 채널을 사용하여 Miltenyi MACSQuant 유세포 분석기(미국 어번 소재의 Miltenyi Biotec)에 의해 검출한다. 생세포를 DRAQ7 배제에 대해 게이팅하고, 수집된 적어도 10,000개의 생 사건(live event)에 대해 기하 평균 형광 신호를 결정한다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 분석에 사용한다. 데이터를 항체 농도 vs. 평균 형광 신호의 로그로서 도표로 나타낸다. 비선형 회귀 분석을 수행한다.
반감기를 조절하기 위해 돌연변이될 수 있는 Fc 위치(예를 들어, FcRn에 대한 결합)는 위치 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 및 435를 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 이루어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 돌연변이 T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A 및 H435R이다. 반감기를 증가시키기 위해 이루어질 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 돌연변이는 돌연변이 M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A 및 T307A/E380A/N434A이다. 반감기를 감소시키기 위해 이루어질 수 있는 예시적인 단독 또는 조합 돌연변이는 돌연변이 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A 및 H435R이다.
다시 말하면, 본 발명의 단리된 다중특이성 항체에서, Fc 영역은 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두에서 252에 상응하는 위치에 존재하는 Tyr, 254에 상응하는 위치에 존재하는 Thr, 및 256에 상응하는 위치에 존재하는 Glu를 포함할 수 있으며, 넘버링은 Eu에 따른다.
본 발명의 항원-결합 단편은 Fab 아암 교환을 사용하여 생성될 수 있는 전장 다중특이성 항체로 조작될 수 있는데, 여기서는 시험관내에서 Fab 아암 교환을 촉진하는 Ig 불변 영역 CH3 도메인 내에, 2개의 단일특이성 2가 항체 내로 치환이 도입된다. 이들 방법에서, 2개의 단일특이성 2가 항체는 CH3 도메인에서 이종이량체 안정성을 촉진하는 소정의 치환을 갖도록 조작될 수 있으며; 이들 항체는 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화물 결합 이성질화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에서 함께 인큐베이션되고; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 CH3 돌연변이는 노브-인-홀(Knob-in-Hole) 돌연변이(Genentech), 정전기적으로 일치된 돌연변이(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed, Merus), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(Strand Exchange Engineered Domain body, SEEDbody) (EMD Serono), Duobody® 돌연변이(Genmab), 및 다른 비대칭 돌연변이(예를 들어, Zymeworks)와 같은 기술을 포함한다.
노브-인-홀 돌연변이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1996/027011호에 개시되어 있으며, CH3 영역의 계면 상의 돌연변이를 포함하는데, 여기서는 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 CH3 영역 내로 도입되고 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 CH3 영역 내로 도입되어, 그 결과 제1 CH3 영역과 제2 CH3 영역 사이의 우선적인 상호작용을 가져온다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 영역 돌연변이는 T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V이다. 다시 말하면, 본 발명의 단리된 다중특이성 항체에서, 제1 Fc 폴리펩티드는 366에 상응하는 위치에 존재하는 Trp를 포함할 수 있고, 제2 Fc 폴리펩티드는 366에 상응하는 위치에 존재하는 Ser, 368에 상응하는 위치에 존재하는 Ala, 및 407에 상응하는 위치에 존재하는 Val을 포함할 수 있거나, 또는 그 반대도 가능하며, 상기 넘버링은 Eu에 따른다.
중쇄 이종이량체 형성은 미국 특허 출원 공개 제2010/0015133호, 미국 특허 출원 공개 제2009/0182127호, 미국 특허 출원 공개 제2010/028637호 또는 미국 특허 출원 공개 제2011/0123532호에 기재된 바와 같이 제1 CH3 영역 상에 양으로 하전된 잔기를 그리고 제2 CH3 영역 상에 음으로 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용함으로써 촉진될 수 있다.
중쇄 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있는 다른 비대칭 돌연변이는 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같은 L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W(Zymeworks)이다.
SEEDbody 돌연변이는 미국 특허 출원 공개 제20070287170호에 기재된 바와 같이, 선택된 IgG 잔기를 IgA 잔기로 치환하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것을 수반한다.
사용될 수 있는 다른 예시적인 돌연변이는 국제 특허 출원 공개 WO2007/147901호, WO 2011/143545호, WO2013157954호, WO2013096291호 및 미국 특허 출원 공개 제2018/0118849호에 기재된 바와 같은 R409D_K370E/D399K_E357K, S354C_T366W/Y349C_ T366S_L368A_Y407V, Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V, T366K/L351D, L351K/Y349E, L351K/Y349D, L351K/L368E, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, K392D/D399K, K392D/E356K, K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D, K392D_K409D/D356K_D399K이다.
Duobody® 돌연변이(Genmab)는, 예를 들어 미국 특허 제9150663호 및 미국 특허 출원 공개 제2014/0303356호에 개시되어 있으며, 돌연변이 F405L/K409R, 야생형/F405L_R409K, T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R, T366ADEFGHILMQVY/K409R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH 및 Y407LWQ/K409AGRH를 포함한다.
추가의 이중특이성 또는 다중특이성 구조는 이중 가변 도메인 면역글로불린(Dual Variable Domain Immunoglobulin, DVD) (국제 특허 출원 공개 WO2009/134776호; DVD는 구조 VH1-링커-VH2-CH를 갖는 중쇄 및 구조 VL1-링커-VL2-CL을 갖는 경쇄를 포함하는 전장 항체이며; 링커는 선택적임), 상이한 특이성을 갖는 2개의 항체 아암을 연결하기 위한 다양한 이량체화 도메인, 예컨대 류신 지퍼 또는 콜라겐 이량체화 도메인을 포함하는 구조(국제 특허 출원 공개 WO2012/022811호, 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 제6,833,441호), 함께 접합된 2개 이상의 도메인 항체(dAb), 다이아바디, 중쇄 단독 항체, 예컨대 낙타 항체 및 조작된 낙타 항체, 이중 표적화(DT)-Ig(GSK/Domantis), 투-인-원 항체(Genentech), 가교결합된 Mab(Karmanos Cancer Center), mAb2(F-Star) 및 CovX-바디(CovX/Pfizer), IgG-유사 이중특이성(InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab(MedImmune/AZ) 및 BsAb(Zymogenetics), HERCULES(Biogen Idec) 및 TvAb(Roche), ScFv/Fc 융합체(Academic Institution), SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), 이중 친화성 재표적화 기술(Fc-DART) (MacroGenics) 및 이중(ScFv)2-Fab(National Research Center for Antibody Medicine - China), 이중-작용 또는 Bis-Fab(Genentech), 독-앤드-록(DNL) (ImmunoMedics), 2가 이중특이성(Biotecnol) 및 Fab-Fv(UCB-Celltech)를 포함한다. ScFv-, 다이아바디-기반 및 도메인 항체는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE) (Micromet), 탠덤 다이아바디(Tandab) (Affimed), 이중 친화성 재표적화 기술(DART) (MacroGenics), 단일쇄 다이아바디(Academic), TCR-유사 항체(AIT, ReceptorLogics), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체(Merrimack) 및 COMBODY(Epigen Biotech), 이중 표적화 나노바디(Ablynx), 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 단리된 다중특이성 항체에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 단백질 A에 대한 결합을 조절하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 그러한 변형은 항체 생성 동안 정제 목적에 유리할 수 있다. 그러한 적어도 하나의 돌연변이는 제1 또는 제2 Fc 폴리펩티드에, 또는 둘 모두에 존재할 수 있다.
단백질 A에 대한 결합을 조절하는 적어도 하나의 돌연변이는 H435R/Y436F이며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 L234A/L235A/D265S, M252Y/S254T/T256E 및 H435R/Y436F 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
본 발명의 항원-결합 도메인은 또한 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 다중특이성 항체로 조작될 수 있다. 그러한 설계에서, 적어도 하나의 항원-결합 도메인은 scFv의 형태이다. 예시적인 설계는 다음을 포함한다(여기서, "1"은 제1 항원-결합 도메인을 나타내고, "2"는 제2 항원-결합 도메인을 나타내고, "3"은 제3 항원-결합 도메인을 나타냄):
설계 1: 사슬 A) scFv1- CH2-CH3; 사슬 B) VL2-CL; 사슬 C) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3
설계 2: 사슬 A) scFv1- 힌지- CH2-CH3; 사슬 B) VL2-CL; 사슬 C) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3
설계 3: 사슬 A) scFv1-CH1-힌지-CH2-CH3; 사슬 B) VL2-CL; 사슬 C) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3
설계 4: 사슬 A) CH2-CH3-scFv1; 사슬 B) VL2-CL; 사슬 C) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3
미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호(Zymeworks)에 기재된 바와 같은 돌연변이 L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W와 같은 CH3 조작이 설계 1 내지 설계 4 내로 도입될 수 있다.
당조작(glycoengineering)
ADCC를 매개하는 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 접합된 항원-결합 도메인의 능력은 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 잘 알려진 바이안테나리(biantennary) G0, G0F, G1, G1F, G2 또는 G2F 형태의 글리칸의 대부분에 의해 Asn297에서 N-글리코실화될 수 있다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생성된 Ig 불변 영역 함유 단백질은 전형적으로 적어도 약 85%의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 접합된 항원-결합 도메인에 부착된 바이안테너리 복합형 올리고당으로부터의 코어 푸코스의 제거는 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 그러한 항체는 바이안테나리 복합형의 Fc 올리고당을 담지하는 비교적 고도로 탈푸코실화된 면역글로불린의 성공적인 발현으로 이어지는 것으로 보고된 상이한 방법들을 사용하여 달성될 수 있는데, 이러한 방법에는, 예컨대 하기와 같은 것이 있다: 배양물 오스몰랄 농도(osmolality)의 제어(문헌[Konno et al., Cytotechnology 64(:249-65, 2012)]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 Lec13의 적용(문헌[Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 EB66의 적용(문헌[Olivier et al., MAbs;2(4): 405-415, 2010; PMID:20562582]), 숙주 세포주로서의 래트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용(문헌[Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003]), 특이적으로 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자에 대한 짧은 간섭(small interfering) RNA의 도입(문헌[Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004]), 또는 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III과 골지(Golgi) α-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 억제제인 키푸넨신(kifunensine)의 공발현(문헌[Ferrara et al., J Biol Chem281:5032-5036, 2006], 문헌[Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006]; 문헌[Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008]).
본 발명의 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 접합된 항원-결합 도메인은 약 1% 내지 약 15%, 예를 들어 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 푸코스 함량을 갖는 바이안테너리 글리칸 구조를 가질 수 있다. 대안적으로, Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 접합된 항원-결합 도메인은 약 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20%의 푸코스 함량을 갖는 글리칸 구조를 가질 수 있다.
"푸코스 함량"은 Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코스 단당의 양을 의미한다. 푸코스의 상대량은 모든 당구조(glycostructure)에 대한 푸코스-함유 구조의 백분율이다. 이들은, 예를 들어 하기와 같은 다수의 방법에 의해 특성화 및 정량화될 수 있다: 1) 국제 특허 출원 공개 WO2008/0775462호에 기재된 바와 같이 N-글리코시다제 F 처리된 샘플(예를 들어, 복합, 혼성, 및 올리고- 및 고-만노스 구조)의 MALDI-TOF를 사용하는 방법; 2) Asn297 글리칸의 효소적 방출을 행하고, 후속으로, 유도체화하고, 형광 검출을 사용하는 HPLC(UPLC) 및/또는 HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 검출/정량화함에 의한 방법; 3) 엔도(Endo) S, 또는 제1 GlcNAc 단당과 제2 GlcNAc 단당 사이를 절단하여 푸코스가 제1 GlcNAc에 부착된 상태로 남겨 두는 다른 효소로 Asn297 글리칸을 처리하거나 처리하지 않고서, 천연 또는 환원된 mAb의 온전한 단백질을 분석하는 방법; 4) 효소적 분해(예를 들어, 트립신 또는 엔도펩티다제 Lys-C)에 의해 mAb를 구성 펩티드들로 효소분해하고, 후속으로 HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 분리, 검출 및 정량화하는 방법; 5) Asn297에서의 PNGase F에 의한 특이적인 효소적 탈글리코실화에 의해 mAb 단백질로부터 mAb 올리고당을 분리하는 방법. 이렇게 방출된 올리고당은 형광단으로 표지되고, 하기를 가능하게 하는 다양한 상보적 기법에 의해 분리 및 확인될 수 있다: 실험 질량과 이론 질량의 비교에 의한 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 질량 분석법에 의한 글리칸 구조의 미세한 특성화, 이온 교환 HPLC(GlycoSep C)에 의한 시알화도(degree of sialylation)의 결정, 순상 HPLC(글리코셉 N)에 의한 친수성 기준에 따른 올리고당 형태의 분리 및 정량화, 및 고성능 모세관 전기영동-레이저 유도 형광(high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence, HPCE-LIF)에 의한 올리고당의 분리 및 정량화.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "저 푸코스" 또는 "저 푸코스 함량"은 약 1% 내지 15%의 푸코스 함량을 갖는, Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 접합된 항원-결합 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정상 푸코스" 또는 "정상 푸코스 함량"은 약 50% 초과, 전형적으로 약 80% 초과 또는 85% 초과의 푸코스 함량을 갖는, Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 접합된 항원-결합 도메인을 지칭한다.
폴리뉴클레오티드, 숙주 세포 및 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 다중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 그러한 폴리뉴클레오티드들의 조합을 제공한다. 이들 다중특이성 항체는 CD33에 결합하는 항원-결합 도메인, 및 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체의 Vδ2 사슬에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 임의의 CD33 결합 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 49, 51, 53, 또는 55의 VH를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 50, 52, 54, 또는 56의 VL을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일부 실시 형태는 또한 본 발명의 CD33 및 Vδ2 결합 이중특이성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들, 또는 본 발명의 CD33 및 Vδ2 결합 이중특이성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들에 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드들에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리되거나 정제된 핵산을 제공한다.
엄격한 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드는 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화될 수 있다. "높은 엄격성 조건"이란, 폴리뉴클레오티드가 비특이적 혼성화보다 검출가능하게 더 강한 양으로 표적 서열(본 명세서에 기재된 핵산들 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 혼성화됨을 의미한다. 높은 엄격성 조건은 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 구별하게 될 조건, 또는 몇몇 작은 영역(예를 들어, 3 내지 12개의 염기)이 뉴클레오티드 서열과 우연히 매칭된 랜덤 서열로부터 단지 몇몇 산포된 불일치를 함유하는 조건을 포함한다. 그러한 작은 상보성 영역은 14 내지 17개 또는 그 이상의 염기의 전장 보체(full-length complement)보다 더 용이하게 융해되고, 높은 엄격성 혼성화는 이들을 용이하게 구별가능하게 한다. 비교적 높은 엄격성 조건은, 예를 들어 약 50 내지 70℃의 온도에서 약 0.02 내지 0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 것과 같은 저염 및/또는 고온 조건을 포함할 것이다. 상기 높은 엄격성 조건은 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의 불일치를 거의 허용하지 않는다. 일반적으로, 증가하는 양의 포름아미드의 첨가에 의해 조건이 더 엄격하게 될 수 있음이 이해된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 의도된 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다. 프로모터는 강한, 약한, 조직-특이적, 유도성 또는 발달-특이적 프로모터일 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 등이다. 게다가, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능하고, 기재된 실시 형태와 함께 사용하기에 적합하다. 그러한 바이러스성 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus, RSV), 및 다른 레트로바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터, 독시사이클린-유도성 프로모터, 하나 이상의 인터페론-자극 반응 요소(ISRE), 예컨대 단백질 키나제 R 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제, Mx 유전자, ADAR1을 함유하는 프로모터 등이 또한 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 발현용 벡터, 트랜스포존 기반 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 백그라운드 내로 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드를 도입시키기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 본 발명의 CD33 및 Vδ2 결합 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CD33 및 Vδ2 결합 항체의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 조절 요소는 전사 프로모터, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 하나 이상의 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 발현시키고자 하는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹(flanking) 비전사 서열, 5' 또는 3' 비번역 서열(예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위), 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위, 또는 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 숙주에서 복제하는 능력을 부여하는 복제 기점이 또한 포함될 수 있다.
발현 벡터는 자연 발생 또는 비자연 발생 뉴클레오티드간 결합, 또는 두 결합 유형 모두를 포함할 수 있다. 비자연 발생 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합은 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.
일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되었으면, 숙주는 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 본 발명의 CD33 및 Vδ2 결합 항체의 고수준 발현에 적합한 조건 하에서 유지된다. 척추동물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터에서의 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예시적인 벡터가 문헌[Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)]에 의해 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 융합 벡터 내로의 IRES 서열의 포함은 일부 항체의 발현을 향상시키는 데 유익할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터 시스템은 하나 이상의 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40)를 포함할 것이며, 이는 상기 언급된 핵산 서열들 중 임의의 것의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 벡터 성분들은 (즉, ORF들 사이에의 "스페이서" 뉴클레오티드의 도입에 의해) 유전자 산물을 발현시키기 위한 최적의 간격을 제공하는 방식으로 인접하게 연결 또는 배열될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 위치될 수 있다. 조절 요소, 예컨대 IRES 모티프는 또한 발현을 위한 최적의 간격을 제공하도록 배열될 수 있다.
본 발명의 벡터는 원형 또는 선형일 수 있다. 이들은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 기능하는 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어 ColE1, SV40, 2 μ 플라스미드, λ, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
재조합 발현 벡터는 일시적 발현을 위해, 안정한 발현을 위해, 또는 둘 모두를 위해 설계될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현을 위해 또는 유도성 발현을 위해 제조될 수 있다.
또한, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포가 죽게 하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는, 유전자가 발현되는 세포 상에서 작용제(agent), 예를 들어 약물에 대한 감수성을 부여하고, 세포가 작용제와 접촉되거나 그에 노출될 때 세포가 죽게 하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(TK) 유전자, 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 및 니트로리덕타제를 포함한다.
벡터는 또한 선택 마커를 포함할 수 있으며, 선택 마커는 당업계에 잘 알려져 있다. 선택 마커는 양성 및 음성 선택 마커를 포함한다. 마커 유전자는 살생제 저항성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 저항성, 영양요구성 숙주에서 원영양성을 제공하기 위한 상보성 등을 포함한다. 예시적인 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 페니실린 저항성 유전자, 히스티디놀 저항성 유전자, 히스티디놀 x 저항성 유전자), 글루타민 신타제 유전자, HSV-TK, 간시클로비르 선택을 위한 HSV-TK 유도체, 또는 6-메틸푸린 선택을 위한 세균성 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 유전자를 포함한다(문헌[Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)]). 선택 마커 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
사용될 수 있는 예시적인 벡터는 다음과 같다: 세균 벡터: pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a(미국 캘리포니아주 라호이아 소재의 Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5(스웨덴 웁살라 소재의 Pharmacia). 진핵세포 벡터: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia), pEE6.4(Lonza) 및 pEE12.4(Lonza). 추가의 벡터는 pUC 시리즈(미국 메릴랜드주 글렌 버니 소재의 Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(미국 캘리포니아주 라졸라 소재의 Stratagene), pET 시리즈(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Novagen), pGEX 시리즈(스웨덴 웁살라 소재의 Pharmacia Biotech), 및 pEX 시리즈(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clontech)를 포함한다. 박테리오파지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λEMBL4, 및 λNM1149, λZapII(Stratagene)가 사용될 수 있다. 예시적인 식물 발현 벡터는 pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3, 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예에는 pEUK-Cl, pMAM, 및 pMAMneo(Clontech)가 포함된다. 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
벡터는 (i) 서열 번호 49, 51, 53, 또는 54의 VH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (ii) 서열 번호 50, 52, 54 또는 56의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (iii) 서열 번호 57 또는 58의 VHH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (iv) 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는 동일한 숙주 세포에서 하나 이상의 발현 벡터와 공동발현될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 벡터는
a) 서열 번호 49의 VH 및 서열 번호 50의 VL;
b) 서열 번호 51의 VH 및 서열 번호 52의 VL;
c) 서열 번호 53의 VH 및 서열 번호 54의 VL;
d) 서열 번호 55의 VH 및 서열 번호 56의 VL;
e) 서열 번호 67 내지 100 중 어느 하나의 링커;
f) 서열 번호 130 내지 133의 ScFv;
g) 서열 번호 57 또는 58의 VHH;
h) 서열 번호 128의 Fc 영역; 또는
i) 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. "숙주 세포"는 벡터가 내부에 도입된 세포를 지칭한다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손, 그리고 또한 특정 대상 세포로부터 생성된 안정한 세포주도 지칭하고자 함이 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후세대에서 소정의 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 간균강(bacilli), 예컨대 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균과(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 원핵 숙주 세포의 예이다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로미세스(Saccharomyces)(예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae)) 및 피키아가 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0(미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0(영국 윌트셔주 솔즈베리 소재의 ECACC(European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 CHO-K1SV(미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 Lonza Biologics), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래되는 것들을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 K2 결합 단백질이 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 단백질의 제조 방법 및 이의 정제 방법은 알려져 있다. 일단 (화학적으로 또는 재조합적으로) 합성되면, 항체는 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제, 겔 전기영동 등을 포함한 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(전반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982))] 참조). 대상 단백질은 실질적으로 순수할 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 80% 내지 85% 순도, 적어도 약 85% 내지 90% 순도, 적어도 약 90% 내지 95% 순도, 또는 적어도 약 98% 내지 99% 순도, 또는 그 이상일 수 있으며, 예를 들어 대상 단백질 이외의 세포 잔해, 거대분자 등과 같은 오염물이 없다.
본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 벡터 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 형질전환, 배양, 항체 발현 및 정제는 잘 알려진 방법을 사용하여 행해진다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 생성 방법을 제공한다.
폴리펩티드가 상이한 핵산들에 의해 인코딩되는 별개의 사슬들로 형성되는 경우, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 생성 방법을 제공한다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 49의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 50의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 51의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 52의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 53의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 54의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 55의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 56의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 58의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 49의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 50의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 51의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 52의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 53의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 54의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 55의 VH 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 56의 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고, 본 발명의 제3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 57의 VHH 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드가 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 변형된 뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸) 우라실, 카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5"-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-아이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-아이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, 및 2,6-다이아미노퓨린이다.
의학적 용도 및 치료 방법
본 발명의 단리된 다중특이성 또는 이중특이성 항체는, 특히 암의 치료를 위한 약제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체에 의한 치료에 적합할 수 있는 예시적인 암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN), 골수증식성 신생물(MPN), 및 혼합 표현형 급성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액암을 포함한다.
본 발명의 다른 태양은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 청구범위에 정의된 바와 같은 다중특이성 또는 이중특이성 항체로서, 상기 방법은 상기 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 상기 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 단리된 이중특이성 CD33/δ2 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
투여/약제학적 조성물
본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 다중특이성 또는 이중특이성 CD33/δ2 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 다중특이성 또는 이중특이성 CD33/δ2 항체는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 분자 또는 본 발명의 항체의 농도는 폭넓게, 즉, 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 적어도 약 1 중량%까지, 많게는 15 또는 20 중량%까지 달라질 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.
본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 이러한 작용제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐, 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장) 투여로서, 이러한 투여에서는 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자 형태이고, 주사기, 이식 장치, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 담긴 제형; 또는 당업자에 의해 인식되는 다른 수단을 사용하는데, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg/kg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg/kg 또는 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg/kg의 본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체를 함유하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내(IV) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 환자에게 투여될 수 있다. IV 주입은 짧게는 15분에 걸쳐서, 그러나 더 흔하게는 30분, 60분, 90분 또는 심지어 2, 3, 4, 5, 6 또는 7시간 동안 제공될 수 있다. 본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체는 또한 질병의 부위(예를 들어, 종양 그 자체) 내로 직접 주사될 수 있다. 암을 갖는 환자에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하며("치료적 유효량"), 때때로 0.1 내지 10 mg/kg 체중, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg일 수 있지만, 더욱 더 클 수 있으며, 예를 들어 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg일 수 있다. 고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적에 기초해서, 예를 들어 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m2일 수 있다. 암을 치료하기 위해 통상 1 내지 8회(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 10, 12, 20회 또는 그 횟수 이상의 용량이 제공될 수 있다. 본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다.
예를 들어, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 80 kg의 환자에 대한 투여의 경우 약 200 ml의 멸균 링거액 및 약 8 mg 내지 약 2400 mg, 약 400 mg 내지 약 1600 mg, 또는 약 400 mg 내지 약 800 mg의 이중특이성 CD33/δ2 항체를 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 방법이 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체는 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 잘 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체는 제2 치료제와 동시에, 순차적으로, 또는 별개로 병용하여 투여될 수 있다. 제2 치료제는 화학요법제 또는 표적화된 항암 요법일 수 있다.
이중특이성 CD33/δ2 항체는 당업자에게 알려진 화학치료 약물들 또는 다른 항암 치료제들 중 어느 하나 이상과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체가 제2 치료제와 병용하여 투여될 때, 이러한 병용은 임의의 편리한 기간에 걸쳐 일어날 수 있다. 예를 들어, 이중특이성 CD33/δ2 항체와 제2 치료제는 동일한 날에, 그리고 심지어는 동일한 정맥내 주입으로 환자에게 투여될 수 있다. 그러나, 이중특이성 CD33/δ2 항체와 제2 치료제는 또한 하루씩 교대로, 또는 1주씩, 2주씩 또는 1개월씩 교대로, 기타 등등으로 투여될 수 있다. 일부 방법에서, 이중특이성 CD33/δ2 항체와 제2 치료제는 치료되고 있는 환자에서 이들이 검출가능한 수준으로 (예를 들어, 혈청 중에) 동시에 존재하기에 충분한 시간 근접성을 두고서 투여된다. 일부 방법에서, 일정 기간에 걸쳐 다회의 용량들로 이루어진 이중특이성 CD33/δ2 항체의 전체 치료 과정 이후에 또는 이전에 다회의 용량들로 또한 이루어진 제2 치료제의 치료 과정이 행해진다. 일부 방법에서, 두 번째로 투여되는 이중특이성 CD33/δ2 항체에 의한 치료는 환자가 초기에 투여된 제2 치료제에 대한 저항성을 갖거나 저항성이 발생되는 경우 시작된다. 환자는 이중특이성 CD33/δ2 항체 및 제2 치료제 중 하나 또는 둘 모두에 의한 치료를 단지 단회 과정만으로 또는 다회의 과정으로 제공받을 수 있다. 1일, 2일 또는 수일 또는 수주의 회복 기간이 이중특이성 CD33/δ2 항체와 제2 치료제의 투여 사이에서 사용될 수 있다. 적합한 치료 계획(treatment regimen)이 제2 치료제에 대해 이미 확립되어 있을 때, 그러한 계획은 본 발명의 이중특이성 CD33/δ2 항체와 병용하여 사용될 수 있다.
이중특이성 CD33/δ2 항체는, 선택적으로 제2 치료제와 병용하여, 외부 빔 방사, 세기 조절 방사선 요법(intensity modulated radiation therapy, IMRT) 및 임의의 형태의 방사선 수술 - 감마 나이프(Gamma Knife), 사이버나이프(Cyberknife), 리낙(Linac), 및 조직내 방사(interstitial radiation)(예를 들어, 이식된 방사성 시드, 글리아사이트 벌룬(GliaSite balloon))를 포함함 - 을 포함하는 임의의 형태의 방사선 요법과 함께 그리고/또는 수술과 함께 투여될 수 있다.
표 3은 AbM, 카바트, 초티아, IMGT 및 Contact 체계에 따라 정의된 바와 같은 JL5 항체(서열 번호 49의 VH 및 서열 번호 50의 VL을 갖는 항체)의 CDR 서열의 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 3]
표 4는 AbM, 카바트, 초티아, IMGT 및 Contact 체계에 따라 정의된 바와 같은 JL6 항체(서열 번호 51의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 갖는 항체)의 CDR 서열의 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 4]
표 5는 AbM, 카바트, 초티아, IMGT 및 Contact 체계에 따라 정의된 바와 같은 JL2 항체(서열 번호 53의 VH 및 서열 번호 54의 VL을 갖는 항체)의 CDR 서열의 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 5]
표 6은 AbM, 카바트, 초티아, IMGT 및 Contact 체계에 따라 정의된 바와 같은 JL3 항체(서열 번호 55의 VH 및 서열 번호 56의 VL을 갖는 항체)의 CDR 서열의 아미노산 서열을 나타낸다.
[표 6]
본 발명을 일반적인 개념으로 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이며, 이때 실시예는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1. CD33 항원 생성
인간 CD33 세포외 도메인(ECD) 또는 이의 하위도메인을 인코딩하는 발현 작제물을, 6X His-태그 서열(서열 번호 246)을 갖는 골수계 세포 표면 항원 CD33(Uniprot 수탁 번호 P20138) 및 이의 도메인 주석의 서열에 기초하여 설계하거나, C-말단에 6X His-태그 서열(서열 번호 246)이 있는, 인간 혈청 알부민(HSA)의 C34S 변이체에 대한 융합 단백질로서 설계되었다. 사이노몰거스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)로부터의 CD33(ECD) 또는 이의 하위도메인을 인코딩하는 유사한 발현 작제물을 NCBI 수탁 번호 XP_005590138.1에 기초하여 설계하였다. 생성된 항원의 아미노산 서열이 표 7에 제시되어 있다.
인간 및 사이노 CD33 전장 ECD 또는 하위도메인 발현 작제물을 제조자 프로토콜에 따라 Expifectamine을 사용하여 HEK293 유래 세포, Expi293(Gibco/Thermo Fisher Scientific) 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 회전식 진탕기 상에서 8% CO2로 37℃에서 5일 동안 세포를 인큐베이션한 후에 수집하였다. 단백질을 발현하는 세포를 원심분리에 의해 제거하고, His-태그가 있는 가용성 CD33 단백질을 Ni NTA Sepharose 6 Fast Flow 수지(GE Healthcare)를 사용하는 고정화된 금속-이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 배지로부터 정제하고, 후속으로 제조자의 사양에 따라 Zeba™ 스핀 탈염 컬럼(Spin Desalting Column)(7K MWCO, 10 mL; ThermoScientific 카탈로그 번호: 89893)을 사용하여 칼슘 또는 마그네슘이 없는 1X 둘베코 인산염 식염수 완충액(pH 7.2) 중으로 완충액 교환하였다.
[표 7]
실시예 2. 항-CD33 x δ2 항체의 생성
다음과 같이 Ablexis 유전자도입 마우스 기술을 사용하여 항체를 생성하였다. 인간/마우스 면역글로불린을 생성하도록 AlivaMab 마우스를 조작하였다. AlivaMab 유전자도입 마우스를 재조합 인간 CD33 단백질(표 7로부터 항원 선택)로 면역화하였다. 림프구를 2차 림프계 기관으로부터 추출하고, 하이브리도마 생성을 위해 FO 마우스 골수종 세포주와 융합시키거나 FACS를 통한 단세포 분류를 수행하였다. 하이브리도마 상층액을 인간 CD33 ECD를 과발현하는 인간 배아 신장(HEK) 세포에 결합하기 위해 MSD 전기화학발광에 의해 스크리닝하였다. 스크리닝으로부터 확인된 샘플을 모 HEK 세포(음성 신호)와 대비하여 인간 CD33 ECD를 과발현하는 HEK 세포(양성 신호)에 대한 결합에 대해 FACS로 추가로 검정하였다. 확인된 세포 결합제를 ELISA를 사용하여 경쇄 동종형으로 분류하였다. 단세포 분류 상층액을 재조합 인간 CD33 단백질에 대한 결합에 대하여 MSD 전기화학발광에 의해 스크리닝하였다. 원하는 결합 프로파일을 갖는 몇몇 히트(hit)를 선택하고 서열분석하였다.
V 영역 클로닝을 하기와 같이 수행하였다. Qiagen® RNeasy Plus Mini Kit에 의해 정제된 RNA 및 B 세포 용해물 둘 모두를 사용하여, Smarter cDNA 합성 키트(미국 캘리포니아주 마운트 뷰 소재의 Clontech)를 사용한 cDNA 합성을 수행하였다. cDNA 합성을 용이하게 하기 위하여, oligodT를 사용하여 모든 메신저 RNA의 역전사를 프라이밍한 후 Smarter IIA 올리고뉴클레오티드에 의한 "5' 캡핑"을 수행하였다. Smarter IIA 캡을 표적화하는 5' 프라이머 및 CH1 내의 컨센서스 영역을 표적화하는 3' 프라이머를 사용하는 2-단계 PCR 증폭을 사용하여 VH 및 VL 단편의 후속 증폭을 수행하였다. 간략하게 말하면, 매 50 μl마다의 PCR 반응은 20 μM의 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 25 μl의 PrimeStar Max DNA 폴리머라제 프리믹스(Clontech), 2 μl의 비정제된 cDNA, 및 21 μl의 이중-증류된 H2O로 이루어진다. 사이클링 프로그램은 94℃에서 3분 동안 수행하는 것에서 시작한 후, 35회 사이클(30초 동안 94℃, 1분 동안 55℃, 1분 동안 68℃)을 수행하고, 72℃에서 7분 동안 수행하는 것으로 종료한다. 제2 라운드의 PCR을 각각의 Lonza 모 벡터(VH 및 VL) 내의 각각의 영역을 "오버랩"하는 15 bp의 상보적 연장을 함유하는 VL 및 VH 제2 라운드 프라이머를 사용하여 수행하였다. 제2 라운드 PCR을 하기 프로그램으로 수행하였다: 94℃에서 3분 동안; 35회 사이클(30초 동안 94℃, 1분 동안 55℃, 1분 동안 68℃); 그리고 72℃에서 7분 동안 수행한 후 종료함. In-Fusion® HD Cloning Kit(Clonetech, U.S.A.)를 Lonza huIgK 또는 Lambda 벡터 내로의 VL 유전자의, 그리고 Lonza huIgG1 벡터 내로의 VH 유전자의 지향적 클로닝에 사용하였다. In-Fusion® HD Cloning을 촉진하기 위하여, In-Fusion® HD Cloning을 수행하기 전에 PCR 산물을 클로닝 인핸서(Cloning Enhancer)로 처리하였다. 제조사의 프로토콜(Clonetech, U.S.A.)에 따라 클로닝 및 형질전환을 수행하였다. Mini-prep DNA에 생거(Sanger) 서열분석을 거쳐서 완전한 V-유전자 단편이 획득되었음을 확인하였다.
항-CD33 항체를, 제조자의 권장사항에 따라 상기 단백질을 인코딩하는 정제된 플라스미드 DNA에 의한 일시적 형질감염에 의해 ExpiCHO-S™ 세포(ThermoFisher Scientific; 미국 매사추세츠주 월섬 소재, Cat # A29127)에서 발현시켰다. 간략하게 말하면, 37℃, 8% CO2 및 125 RPM으로 설정된 회전 진탕 인큐베이터 내에서 ExpiCHO™ 발현 배지(ThermoFisher Scientific, Cat # A29100) 중에 ExpiCHO-S™ 세포를 현탁 상태로 유지하였다. 세포를 계대배양하고 형질감염 전에 ml 당 6.0 x 106개의 세포로 희석하여, 세포 생존율을 99.0% 이상으로 유지하였다. ExpiFectamine™ CHO 형질감염 키트(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 A29131)를 사용하여 일시적 형질감염을 행하였다. 형질감염시키려는 매 ml마다의 희석된 세포에 대해, 0.5 마이크로그램의 scFv Fc 융합 인코딩 DNA 및 0.5 마이크로그램의 pAdVAntage DNA(Promega, Cat# E1711)를 사용하고, OptiPRO™ SFM 복합체 형성 배지 중에 희석시켰다. ExpiFectamine™ CHO 시약을 1:4 비(v/v, DNA:시약)로 사용하고, OptiPRO™ 중에 희석시켰다. 희석된 DNA와 형질감염 시약을 1분 동안 배합하여, DNA/지질 복합체 형성을 가능하게 하고, 이어서 세포에 첨가하였다. 하룻밤 인큐베이션 후에, 제조자의 표준 프로토콜에 따라 ExpiCHO™ 공급물 및 ExpiFectamine™ CHO 인핸서를 세포에 첨가하였다. 세포를 배양 브로쓰를 수집하기 전에 7일 동안 37℃에서 회전 진탕(125 rpm)하면서 인큐베이션하였다. 일시적으로 형질감염된 ExpiCHO-S™ 세포로부터의 배양 상층액을 원심분리(30분, 3000 rcf) 후에 여과(0.2 μm PES 막, 미국 뉴욕주 코닝 소재의 Corning)를 통해 청징화하였다.
다음과 같이 단백질 정제를 수행하였다. 여과된 세포 배양 상층액을 AKTAXpress 크로마토그래피 시스템을 사용하는 사전평형화된(1xDPBS, pH 7.2) MabSelect Sure 단백질 A 컬럼(GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 로딩 후에, 컬럼을 10 컬럼 부피의 1xDPBS(pH 7.2)로 세척하였다. 단백질을 10 컬럼 부피의 0.1 M 소듐(Na) 아세테이트(pH 3.5)로 용리하였다. 용리 분획 부피의 20% (v/v)까지 2.5 M Tris HCl(pH 7.5)을 첨가함으로써 단백질 분획을 즉시 중화시켰다. 피크 분획을 풀링하고 여과하였다(0.2 μm). 정제된 단백질의 품질을 분석용 크기 배제 HPLC(Agilent HPLC 시스템)에 의해 평가하였다.
실시예 3. 이중특이성 CD33xV델타2 항체의 생성
노브-인투-홀 돌연변이를 사용하여, Fc에 융합된 CD33 결합제와 Fc에 융합된 VHH V델타2 결합제의 이종이량체를 생성하여 이중특이성 분자를 제조하였다. 사용된 V델타2 결합 VHH 서열은 국제 특허 출원 공개 WO2015156673호에 기재된 항체 6H4 및 항체 5D3이었다. 6H4 서열은 서열 번호 58에 제시되어 있다. 5D3 서열은 서열 번호 57에 제시되어 있다.
CD33 결합 Fab는 홀 Fc 상에 있고 V델타2 결합 VHH는 노브 Fc 상에 있었다. CD33 VH 및 인간 CH1 불변 영역을 몇몇 돌연변이 L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366S/L368A/Y407V_H435R/Y436F를 함유하는 Fc 상의 힌지와 융합하였다. AAS 돌연변이를 양쪽 중쇄의 Fc 부분 내로 도입하여 Fc 수용체가 침묵되게 하였다. YTE(M252Y/S254T/T256E) 돌연변이를 JL5의 양쪽 중쇄의 Fc 부분 내로 도입하여 반감기를 증가시켰다. 델타2 결합 VHH를 하기 돌연변이를 포함하는 힌지 및 노브 Fc에 융합하였다: C220S_L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366W.
RF 돌연변이를 홀 중쇄 상에 도입하여 정제를 도왔다.
하기 Fab(CD33)xVHH(Vδ2) 작제물을 제조하였다:
서열 번호 101, 102 및 103의 서열에 상응하는 V델타2 항체 6H4와 조합된 CD33 항체 JL5(JL5x6H4).
서열 번호 104, 105 및 106의 서열에 상응하는 V델타2 항체 5D3과 조합된 CD33 항체 JL5(JL5x5D3).
서열 번호 107, 108 및 109의 서열에 상응하는 V델타2 항체 6H4와 조합된 CD33 항체 JL6(JL6x6H4); 그러나 YTE 돌연변이는 없음.
서열 번호 110, 111 및 112의 서열에 상응하는 V델타2 항체 5D3과 조합된 CD33 항체 JL6(JL6x5D3); 그러나 YTE 돌연변이는 없음.
서열 번호 113, 114 및 115의 서열에 상응하는 V델타2 항체 6H4와 조합된 CD33 항체 JL2(JL2x6H4); 그러나 YTE 돌연변이는 없음.
서열 번호 116, 117 및 118의 서열에 상응하는 V델타2 항체 5D3과 조합된 CD33 항체 JL2(JL2x5D3); 그러나 YTE 돌연변이는 없음.
서열 번호 119, 120 및 121의 서열에 상응하는 V델타2 항체 6H4와 조합된 CD33 항체 JL3(JL3x6H4); 그러나 YTE 돌연변이는 없음.
서열 번호 122, 123 및 124의 서열에 상응하는 V델타2 항체 5D3과 조합된 CD33 항체 JL3(JL3x5D3); 그러나 YTE 돌연변이는 없음.
분자를 CHO 세포주에서 발현시키고, ProA 포획 후, CH1 친화성 포획에 의해 정제하였다. 간략하게 말하면, 항체를 초기에 Mab Select SuRe 단백질 A 컬럼(GE Healthcare)에 의해 정제하였다. 컬럼을 PBS(pH 7.2)로 평형화시키고, 2 mL/분의 유량으로 발효 상층액을 로딩하였다. 로딩 후에, 컬럼을 4 컬럼 부피의 PBS로 세척한 후, 30 mM 소듐 아세테이트(pH 3.5) 중에 용리시켰다. 280 nm에서의 흡광도에 의해 모니터링된 바와 같은 단백질 피크를 함유하는 분획들을 풀링하고, 1%의 3 M 소듐 아세테이트(pH 9.0)를 첨가함으로써 pH 5.0으로 중화시켰다. 항체를 CH1 포획에 의해 추가로 정제하고, 히스티딘 완충액 중에서 용리시켰다.
실시예 4: 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 CD33-발현 세포 및 Vγ9Vδ2 세포에 결합한다
서론
이중특이성 CD33xVδ2 항체가 CD33-발현 세포 및 Vγ9Vδ2 세포에 결합할 수 있는 능력을 시험하였다.
재료 및 방법
세포주
CD33-발현 급성 단핵구 백혈병(AML) 세포주 THP-1(ECACC, Sigma)을 RPMI 1640 ATCC mod(Gibco), 10% 열 불활성화된 FBS, 50 ug/ml의 젠타마이신 및 2-메르캅토에탄올 중에서 배양하였다. 정제된 Vγ9Vδ2-T 세포주를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다(문헌[de Bruin et al.(2017), Oncoimmunology 7(1): e1375641]). 간단히 말하면, 항-마우스 IgG 마이크로비드(Miltenyi Biotec)와 조합하여 FITC-접합된 항-Vδ2 TCR(Beckman Coulter, 클론 IMMU 389)을 사용하여 건강한 공여자(HD) PBMC로부터 Vδ2+-T 세포를 단리하고, 2명의 건강한 공여자로부터의 PBMC, JY 세포, IL-7(10 U/ml), IL-15(10 ng/ml, R&D Systems), 및 피토헤마글루티닌(50 ng/ml의 PHA; Thermo Fisher Scientific)으로 이루어진 조사된 공급기 믹스(irradiated feeder mix)와 함께 매주 배양하였다. Vγ9Vδ2-T 세포주의 순도를 90% 초과로 유지하고 5% 미만의 CD4+였다.
이중특이성 항체 결합
CD33 결합을 평가하기 위해, THP-1 세포를 316 내지 0.00316 nM의 농도 범위의 이중특이성 항체 JL2x6H4, JL3x6H4, JL5x6H4, JL6x6H4, B21Mx6H4, JL2x5D3, JL3x5D3, JL5x5D3, JL6x5D3 또는 B21Mx5D3과 함께 4℃에서 45 내지 60분 동안 인큐베이션하였다.
Vδ2 결합을 평가하기 위해, Vγ9Vδ2 세포를 316 내지 0.00316 nM의 농도 범위의 이중특이성 항체 JL2x6H4, JL3x6H4, JL5x6H4, JL6x6H4, B21Mx6H4, JL2x5D3, JL3x5D3, JL5x5D3, JL6x5D3 또는 B21Mx5D3과 함께, 또는 gp120 및 다른 비관련 표적에 결합하는 이중특이성 항체와 함께 4℃에서 45 내지 60분 동안 인큐베이션하였다.
4℃에서 30분 동안 Alexa Fluor® 647 접합된 F(ab')2 염소 항-인간 IgG 항체(H+L)(Jackson)와 함께 인큐베이션함으로써, 결합된 이중특이성 항체를 검출하였다.
FACS
샘플을 FACS Celesta(BD)에 의해 측정하고, FlowJo 소프트웨어(FlowJo)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
모든 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 CD33-발현 THP-1 세포에 결합하는 것으로 확인되었다(도 1). 예상된 바와 같이, CD33 결합 도메인 대신에 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 결합 도메인(B21M)을 갖는 음성 대조 항체는 THP-1 세포에 결합하지 않았다.
더욱이, 모든 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 Vγ9Vδ2 T 세포에 결합하는 것으로 확인되었다(도 2). 예상된 바와 같이, RSVxVδ2 항체는 또한 Vγ9Vδ2 T 세포에 결합하는 반면, Vδ2 결합 도메인이 없는 음성 대조 항체는 이들 세포에 결합하지 않았다. Vδ2 결합 도메인으로서 6H4를 함유한 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 Vδ2 결합 도메인으로서 5D3을 함유한 이중특이성 항체보다 Vγ9Vδ2 T 세포에 대해 더 높은 친화도로 결합하였다.
실시예 5: 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 CD33-발현 세포에 대한 세포독성을 매개할 수 있다
서론
실시예 4에 기재된 바와 같이, 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 CD33-발현 세포 및 Vγ9Vδ2-T 세포 둘 모두에 결합한다. 후속으로, 이중특이성 항체가 CD33-발현 종양 세포에 대한 세포독성을 유도할 수 있는지의 여부를 시험하였다.
재료 및 방법
세포주
CD33-발현 THP-1 세포(표적 세포) 및 Vγ9Vδ2-T 세포(이펙터 세포)를 실시예 4에 기재된 바와 같이 성장시켰다.
세포독성 검정
THP-1 표적 세포를 CellTrace Violet(CTV)으로 표지하고, 이중특이성 CD33xVδ2 항체 또는 음성 대조 항체(RSVxVδ2) 및 Vγ9Vδ2-T 이펙터 세포(E)의 존재 하에서 1:1 또는 1:20(E:T) 비(1:20 비의 경우 2,500개의 이펙터 세포와 50,000개의 표적 세포)로 37℃에서 인큐베이션하였다. 5 nM에서 시작하여 9개의 5배 희석의 항체 농도 시리즈를 시험하였다. 22시간 및 94시간 후에, 7-아미노악티노마이신 D(7AAD)를 사용하여 죽은 세포를 염색하였다. CTV+ 7AAD- 세포의 백분율을 결정함으로써 THP-1 세포 살해를 결정하였다. Prism 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 비선형 회귀에 의해 EC50을 결정하였다.
결과
THP-1 세포의 살해를 측정하고 EC50을 결정하였다. 음성 대조 항체의 존재 하에서는 살해가 관찰되지 않았다. 그러나, 모든 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 THP-1 종양 세포의 살해를 매개할 수 있었다. 일반적으로, 6H4-기반 Vδ2 결합 도메인을 포함하는 항체가 5D3-기반 결합 도메인을 포함하는 항체보다 더 강력하였다(더 낮은 EC50)(표 8). JL3 또는 JL5 CD33 결합 도메인을 갖는 이중특이성 항체는 JL2 또는 JL6 도메인을 포함하는 것들보다 더 강력하였다. 심지어는 1:20 이펙터 대 표적 세포 비에서도 효율적인 살해가 관찰되었다.
[표 8]
실시예 6: 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 건강한 세포에 비해 종양 세포의 살해를 우선적으로 유도한다
서론
실시예 5에 기재된 바와 같이, 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 CD33-발현 종양 세포에 대한 세포독성을 유도할 수 있다. 후속으로, 이펙터 세포로서 신선한 혈액으로부터의 PBMC를 사용하여 세포독성이 또한 얻어질 수 있는지의 여부, 그리고 CD33xVδ2 항체가 또한 건강한 CD33 양성, CD14+ 세포에 대한 세포독성을 유도하는지의 여부를 시험하였다.
재료 및 방법
세포주
CD33-발현 THP-1 세포(표적 세포)를 실시예 5에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 건강한 공여자 지원자로부터의 헤파린-처리된 전혈을 혈액 공급 서비스 Sanquin으로부터 입수하고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단리에 사용하였다. Lymphoprep™ 밀도 구배 원심분리를 사용하여 PBMC를 단리하였다.
Vγ9Vδ2-T 세포의 백분율을 결정하기 위해, PBMC를 PerCP-Cy5.5 표지된 항-CD3 mAb(Biolegend, 클론 SK7), PE 표지된 항-TCR Vγ9 mAb(Biolegend, 클론 B6) 및 FITC 표지된 항-TCR Vδ2 mAb(Beckman Coulter, 클론 IM1464)로 염색하였다. THP-1 및 CD14+ 단핵구 세포 상의 CD33 발현을 PE-Cy7 표지된 항-CD14 mAb(Biolegend, 클론 63D3), APC 표지된 항-CD33 mAb(Biolegend, 클론 WM53)를 사용하여 결정하였다.
세포독성 검정
THP-1 표적 세포를 CellTrace Violet(CTV)으로 표지하고, 이중특이성 CD33xVδ2 항체 또는 음성 대조 항체(RSVxVδ2) 및 PBMC 이펙터 세포(E)의 존재 하에서 5:1(E:T) 비(250,000개의 이펙터 세포와 50,000개의 표적 세포)로 37℃에서 인큐베이션하였다. 5 nM에서 시작하여 6개의 5배 희석의 항체 농도 시리즈를 시험하였다. 94시간 후에, 세포를 PE-Cy7 표지된 항-CD14 mAb 및 7AAD로 염색하였다. THP-1 세포 살해는 CTV+ 7AAD- 세포의 백분율에 기초하여 결정한 반면, 단핵구 살해는 CTV- CD14+ 7AAD- 세포의 백분율에 기초하여 결정하였다.
결과
표적 세포의 살해가 도 3에 나타나 있다. PBMC(총 PBMC의 1.84%의 Vγ9+Vδ2+ T 세포를 함유함)는 이중특이성 CD33xVδ2 항체의 존재 하에서 THP-1 종양 세포의 살해를 매개할 수 있는 것으로 확인되었다(패널 A). 다른 한편으로, 건강한 CD14+ 표적 세포의 용해는 거의 일어나지 않았다(패널 B). 이는 이중특이성 CD33xVδ2 항체가 건강한 세포에 비해 종양 세포의 살해를 우선적으로 매개한다는 것을 나타낸다. 이러한 차이는 THP-1 표적 세포와 CD14+ 표적 세포 사이의 CD33 발현의 차이로 인한 것으로 보이지 않는데, 그 이유는, CD33 발현이 THP-1 세포와 비교하여 CD14+ 세포 상에서 약 2배만큼 높은 것으로 확인되었기 때문이다.
실시예 7: 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 Vγ9Vδ2 T 세포의 증식을 유도한다
서론
후속으로, 이중특이성 CD33xVδ2 항체가 CD33 양성 표적 세포의 존재 하에서 Vγ9Vδ2 T 세포의 증식을 유도하는지의 여부를 시험하였다.
재료 및 방법
세포주
CD33-발현 THP-1 세포(표적 세포)를 실시예 4에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 2명의 상이한 공여자로부터의 Vγ9Vδ2 T 세포(이펙터 세포)를 실시예 4에 기재된 바와 같이 배양하였다.
증식 검정
THP-1 표적 세포를 CellTrace Violet(CTV)으로 표지하였다. Vγ9Vδ2 이펙터 세포를 50 IU/mL의 IL-2의 존재 하에서 CellTrace Far Red(CTFR)로 표지하였다. 표적 세포와 이펙터 세포를 1 nM 이중특이성 항체의 존재 하에서 1:20 이펙터 세포 대 표적 세포 비(50,000개의 표적 세포, 2,500개의 이펙터 세포)로 37℃, 5% CO2(200 ul/웰)에서 공동-인큐베이션하였다. 123카운트 eBeads™ Counting Beads(Invitrogen)를 사용하여 일수 0, 일수 1, 일수 4, 일수 7, 일수 11 및 일수 14에서 세포수를 평가하였다.
결과
Vγ9Vδ2 이펙터 세포의 증식이 도 4에 나타나 있다. 모든 이중특이성 CD33xVδ2 항체는 2명의 상이한 공여자로부터의 Vγ9Vδ2 이펙터 세포의 증식을 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 이중특이성 RSVxVδ2 항체의 존재 하에서는 증식이 관찰되지 않았는데, 이는 증식이 표적 세포의 존재에 의존하였음을 나타낸다.
실시예 8: 이중특이성 scFv CD33xVδ2 항체는 CD33-발현 세포에 대한 세포독성을 매개할 수 있다
서론
이러한 이중특이성 항체가, CD33 결합 아암이 scFv 포맷으로 제공될 때 CD33-발현 종양 세포에 대한 세포독성을 유도할 수 있는지의 여부를 시험하였다.
재료 및 방법
세포주
CD33-발현 THP-1 세포(표적 세포), 및 2명의 상이한 공여자(공여자 104 및 공여자 156)로부터의 Vγ9Vδ2-T 세포(이펙터 세포)를 실시예 5에 기재된 바와 같이 성장시켰다.
scFv-VHH 이중특이성 분자의 생성
다음과 같이 scFv-VHH 이중특이성 분자를 생성하였다: VL과 VH 사이에 "버드(bird)" 링커를 갖는 scFv(VL-L-VH)-L-VHH, scFv와 VHH 사이의 고정된 짧은 5-아미노산 링커(GGGGS(서열 번호 100)), 및 단백질의 C-말단에 있는 C-태그의 고정된 설계를 사용하였다. 이중특이성 scFv VHH 분자의 아미노산 서열을 cDNA로 역번역하고, 이어서 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였다. N-말단 코작(Kozak) 서열 및 C-말단 정지 코돈으로서 조절 요소를 부가하고, cDNA를 합성 유전자로서 제조하였다. cDNA를 적합한 벡터 내로 클로닝하고, 이들의 서열을 검증하였다. HEK293_E 세포에서의 생성된 플라스미드의 일시적 형질감염에 의해 단백질의 발현을 수행하였다. C-태그 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과에 의해 배양 상층액으로부터 단백질을 정제하였다.
세포독성 검정
THP-1 표적 세포를 CellTrace Violet(CTV)으로 표지하고, 이중특이성 CD33xVδ2 항체 또는 음성 대조 항체(RSVxVδ2) 및 Vγ9Vδ2-T 이펙터 세포(E)의 존재 하에서 1:1(E:T) 비(50,000개의 이펙터 세포와 50,000개의 표적 세포)로 37℃에서 인큐베이션하였다. 3.16 nM에서 시작하여 10개의 반로그(half-log) 희석의 항체 농도 시리즈를 시험하였다. 24시간 후에, 유세포측정을 사용하여 7AAD- CTV+ 세포의 백분율을 결정함으로써 THP-1 세포 살해를 결정하였다.
결과
THP-1 세포의 살해를 측정하고 EC50 값을 결정하였다. 음성 대조 항체의 존재 하에서는 살해가 관찰되지 않았다. 모든 이중특이성 scFv CD33xVδ2 항체는 THP-1 종양 세포의 살해를 매개할 수 있었다.

Claims (29)

  1. 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하는 단리된 다중특이성 항체로서,
    상기 제1 항원-결합 영역은
    a) 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6;
    a) 각각 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12;
    d) 각각 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18; 또는
    e) 각각 서열 번호 19, 20, 21, 22, 23, 및 24의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고;
    상기 제2 항원-결합 영역은 상기 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체의 Vδ2 사슬에 결합하는, 단리된 다중특이성 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체이고,
    a) 각각 서열 번호 28, 29, 및 30;
    b) 각각 서열 번호 25, 26, 및 27;
    c) 각각 서열 번호 31, 32, 및 33;
    d) 각각 서열 번호 34, 35, 및 36;
    e) 각각 서열 번호 37, 38, 및 39;
    f) 각각 서열 번호 40, 41, 및 42;
    g) 각각 서열 번호 43, 44, 및 45; 또는
    h) 각각 서열 번호 46, 47, 및 48의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 영역은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 영역은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체이고, 각각 서열 번호 28, 29, 및 30의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  5. 제2항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 영역은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체이고, 각각 서열 번호 25, 26, 및 27의 CDR1, CDR2, 및 CD3을 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 영역은 단일-도메인 항체이고, 각각 서열 번호 28, 29, 및 30의 CDR1, CDR2, 및 CD3을 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD33에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 영역 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 영역을 포함하고;
    상기 제1 항원-결합 영역은
    a) 서열 번호 51의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 52의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    b) 서열 번호 49의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 50의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    d) 서열 번호 53의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 54의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
    e) 서열 번호 55의 VH 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열 번호 56의 VL 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고;
    상기 제2 항원-결합 영역은
    a) 서열 번호 58과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    b) 서열 번호 57과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    c) 서열 번호 59와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    d) 서열 번호 60과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    e) 서열 번호 61과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    f) 서열 번호 62와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    g) 서열 번호 63과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    h) 서열 번호 64와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열;
    i) 서열 번호 65와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열; 또는
    j) 서열 번호 66과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 단리된 다중특이성 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    a) 상기 단리된 다중특이성 항체는 Fab, scFv, (scFv)2, Fv, F(ab')2 또는 Fd를 포함하며, 상기 Fab, scFv, (scFv)2, Fv, F(ab')2 또는 Fd는 인간 CD33에 결합할 수 있는 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하거나,
    b) 상기 단리된 다중특이성 항체는
    - 인간 CD33에 결합할 수 있는 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 Fab, 및
    - 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 단일-도메인 항체를 포함하거나; 또는
    c) 상기 단리된 다중특이성 항체는
    - 인간 CD33에 결합할 수 있는 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 scFv, 및
    - 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 단일-도메인 항체를 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단리된 다중특이성 항체는 인간 CD33에 결합할 수 있는 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 scFv, 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 VHH를 포함하고, 상기 scFv는 펩티드 링커를 포함하며, 상기 펩티드 링커는 선택적으로 서열 번호 67 내지 99에 제시된 링커들의 군으로부터 선택되는, 단리된 다중특이성 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 영역과 제2 항원-결합 영역은 펩티드 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 연결되고; 선택적으로, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 100에 제시된 링커인, 단리된 다중특이성 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 영역은 상기 제2 항원-결합 영역의 N-말단에 위치되는, 단리된 다중특이성 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드로 이루어진 Fc 영역을 추가로 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 다중특이성 항체는 인간 CD33에 결합할 수 있는 상기 제1 항원-결합 영역을 포함하는 Fab, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체에 결합할 수 있는 상기 제2 항원-결합 영역을 포함하는 VHH를 포함하고, 상기 단리된 다중특이성 항체는 Fc 영역을 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동종형(isotype)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Ig 불변 영역 또는 이의 단편을 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 불활성인, 단리된 다중특이성 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 Fc 영역은 상기 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두에서 234에 상응하는 위치에 존재하는 Ala, 235에 상응하는 위치에 존재하는 Ala, 및 265에 상응하는 위치에 존재하는 Ser을 포함하며, 상기 넘버링은 Eu에 따른, 단리된 다중특이성 항체.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Fc 폴리펩티드는 366에 상응하는 위치에 존재하는 Trp를 포함하고, 상기 제2 Fc 폴리펩티드는 366에 상응하는 위치에 존재하는 Ser, 368에 상응하는 위치에 존재하는 Ala, 및 407에 상응하는 위치에 존재하는 Val을 포함하거나, 또는 그 반대도 가능하며, 상기 넘버링은 Eu에 따른, 단리된 다중특이성 항체.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 상기 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두에서 252에 상응하는 위치에 존재하는 Tyr, 254에 상응하는 위치에 존재하는 Thr, 및 256에 상응하는 위치에 존재하는 Glu를 포함하며, 상기 넘버링은 Eu에 따른, 단리된 다중특이성 항체.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 상기 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드 중 하나에서 435에 상응하는 위치에 존재하는 Arg, 및 436에 상응하는 위치에 존재하는 Phe를 포함하며, 상기 넘버링은 Eu에 따른, 단리된 다중특이성 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이성 항체는 이중특이성 항체인, 단리된 다중특이성 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 101, 102 및 103에 제시된 폴리펩티드;
    b) 서열 번호 104, 105 및 106에 제시된 폴리펩티드;
    c) 서열 번호 107, 108 및 109에 제시된 폴리펩티드;
    d) 서열 번호 110, 111 및 112에 제시된 폴리펩티드;
    e) 서열 번호 113, 114 및 115에 제시된 폴리펩티드;
    f) 서열 번호 116, 117 및 118에 제시된 폴리펩티드;
    g) 서열 번호 119, 120 및 121에 제시된 폴리펩티드; 또는
    h) 서열 번호 122, 123 및 124에 제시된 폴리펩티드를 포함하는, 단리된 다중특이성 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 단리된 다중특이성 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 단리된 다중특이성 항체.
  24. 혈액암의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 단리된 다중특이성 항체로서,
    선택적으로, 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN), 골수증식성 신생물(MPN), 및 혼합 표현형 급성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 다중특이성 항체.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 다중특이성 항체를 인코딩하는 핵산 작제물, 또는 핵산 작제물들의 조합.
  26. 제25항의 핵산 작제물, 또는 핵산 작제물들의 조합을 포함하는 발현 벡터.
  27. 제25항의 핵산 작제물, 또는 핵산 작제물들의 조합, 또는 제26항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  28. 질병을 치료하는 방법으로서,
    상기 질병의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 다중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 질병은 혈액암이며; 선택적으로, 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병(AML), 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 만성 골수성 백혈병(CML), 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(DPDCN), 골수증식성 신생물(MPN), 및 혼합 표현형 급성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
FR2879605B1 (fr) 2004-12-16 2008-10-17 Centre Nat Rech Scient Cnrse Production de formats d'anticorps et applications immunologiques de ces formats
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
JP2011507519A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ｐＩＸ又はｐＶＩＩへの融合を介したヒトデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリの設計及び作製、ベクター、抗体、及び方法
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BRPI0921586A2 (pt) 2008-11-18 2019-09-24 Merrimack Pharmaceuticals Inc articuladores de albumina de soro humana e conjugados destes
KR20110134494A (ko) 2009-03-27 2011-12-14 자이모제네틱스, 인코포레이티드 항체-수용체 조합물을 포함하는 다중특이적-결합 단백질을 사용하기 위한 조성물 및 방법
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
PL2606064T3 (pl) 2010-08-16 2015-07-31 Novimmune Sa Sposoby wytwarzania wieloswoistych i wielowartościowych przeciwciał
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
PT2771364T (pt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab As Produção de proteínas heterodiméricas
PL2773671T3 (pl) 2011-11-04 2022-01-24 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerycznego z mutacjami w domenie fc
WO2013096291A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
PT2838918T (pt) 2012-04-20 2019-08-23 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas heterrodiméricas do tipo ig
CN104870476B (zh) 2012-11-21 2018-04-13 药物抗体公司 靶向vegfr‑2和dll4的双靶向抗体及包含它的药物组合物
EP2970980B2 (en) 2013-03-15 2022-07-27 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods to control c-terminal lysine, galactose and sialic acid content in recombinant proteins
US10501540B2 (en) 2014-04-10 2019-12-10 Lava Therapeutics B.V. Immunoglobulins binding human Vγ9 Vδ2 T cell receptors
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
JOP20190116A1 (ar) * 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
CA3113605A1 (en) * 2018-09-19 2020-03-26 Lava Therapeutics B.V. Novel bispecific antibodies for use in the treatment of hematological malignancies
EP3792283A1 (en) * 2019-09-16 2021-03-17 Lava Therapeutics B.V. Treatment of cancer comprising administration of vgamma9vdelta2 t cell receptor binding antibodies
KR20230051617A (ko) * 2020-03-13 2023-04-18 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Siglec-3/cd33을 결합시키기 위한 물질 및 방법

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