TW202328193A - 用於治療癌症的CD33 x Vδ2多特異性抗體 - Google Patents

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羅伯特 羅弗斯
莎拉 埃拉斯卡爾
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Abstract

本發明關於多特異性抗體和包含所述抗體之藥物組成物、製備所述抗體之方法和所述抗體靶向CD33之用途以及它們在治療疾病例如癌症中之用途。

Description

用於治療癌症的CD33　x　Vδ2多特異性抗體
序列表
本申請包含已以ASCII格式電子提交的序列表，並特此藉由引用整體併入。所述ASCII副本創建於2022年3月8日，名為SEQLTXT-1.txt，大小為212千位元組。
本發明關於多特異性抗體和包含所述抗體之藥物組成物、製備所述抗體之方法和所述抗體靶向CD33之用途以及它們在治療疾病例如癌症中之用途。
由於急性骨髓性白血病（AML）母細胞之異質性和缺乏AML特異性抗原，AML之靶向免疫療法仍然是一項重大的臨床挑戰。幾種針對CD33的免疫療法目前正在進行AML之1期或2期臨床試驗，例如CD33xCD3 T細胞重定向分子和多種自體或同種異體CAR T或NK細胞療法。
Vγ9Vδ2 T細胞代表了有意義的T細胞亞群，可用於探索腫瘤細胞免疫療法。它們占循環T細胞群之1%-5%，並且在廣泛的癌症集中普遍存在，它們的浸潤與突變負荷無關。該等T細胞感知靶細胞上的嗜乳脂蛋白（BTN）配體家族中磷酸抗原介導的構象變化，並有效地殺傷該等細胞。Vγ9Vδ2 T細胞受PDL1對腫瘤細胞抑制的影響較小，並且Vγ9Vδ2 T細胞群不含Treg。這係有關係的，因為Treg被CD3雙特異性T細胞接合劑活化已證明會限制後者的活性。此外，磷酸抗原活化的嗜乳脂蛋白（BTN3A，CD227）之差異表現可能有助於γδ T細胞對癌細胞的抗腫瘤活性高於正常細胞。
本發明之目的係提供能夠進行CD33依賴性γδ T細胞重定向之多特異性或雙特異性抗體。
本發明之目的係提供由與高親和力或低親和力Vδ2結合劑配對的不同CD33結合劑構成之多特異性或雙特異性抗體。
本發明之目的係提供與Vγ9Vδ2 T細胞聯合對CD33+癌細胞和原發性AML母細胞具有細胞毒性之多特異性或雙特異性抗體。
本發明之目的係提供在不同細胞系中誘導有效和選擇性T細胞介導的細胞毒性之多特異性或雙特異性抗體。
本發明之目的係提供與現有療法相比在安全性和功效方面具有優勢之多特異性或雙特異性抗體。
本發明之目的係提供誘導Vγ9Vδ2 T細胞的靶依賴性去顆粒、活化和增殖之多特異性或雙特異性抗體。
本發明之目的係提供顯示相比於健康CD14+細胞（單核細胞）優先殺傷THP-1癌細胞之多特異性或雙特異性抗體。
定義
術語「 第一」和「 第二」抗原結合區在本文中使用時不是指它們在抗體中的取向/位置，即它們對於N-或C-末端沒有意義。在申請專利範圍和說明書中術語「第一」和「第二」僅用於正確和一致地指兩個不同抗原結合區。
術語「 CD33」在本文中使用時係指人CD33，其序列在UniProtKB - P20138中示出。
術語「 人 Vδ2」在本文中使用時係指Vγ9Vδ2-T細胞受體（TCR）之重排的δ2鏈。GenBank: CAA51166.1給出了δ2序列之實例。TRDV2，T細胞受體δ可變2，代表可變區（UniProtKB - A0JD36（A0JD36_人）給出了TRDV2序列之實例）。「結合Vγ9Vδ2-TCR的Vδ2鏈」係指抗體可以結合作為單獨的分子和/或作為Vγ9Vδ2-TCR（T細胞受體）的一部分之δ2鏈。然而，抗體不會與作為單獨分子的γ9鏈結合。
術語「 人 Vγ9」在本文中使用時係指Vγ9Vδ2-T細胞受體（TCR）之重排的γ9鏈。GenBank: NG_001336.2給出了γ9序列之實例。TRGV9，T細胞受體γ可變9，代表可變區（UniProtKB - Q99603_人給出了TRGV9序列之實例）。
免疫球蛋白之 Fc （可結晶片段）區定義為抗體之片段，其通常在用木瓜蛋白酶消化抗體後產生，包括免疫球蛋白之兩個CH2-CH3區和連接區，例如鉸鏈區。抗體重鏈之恒定結構域定義了抗體同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。Fc區介導抗體的與稱為Fc受體的細胞表面受體和補體系統蛋白質之效應子功能。
如本文所用，術語「 鉸鏈區」旨在指免疫球蛋白重鏈之鉸鏈區。因此，例如人IgG1抗體之鉸鏈區對應於根據EU編號的胺基酸216-230。
如本文所用，術語「 CH2 區」或「 CH2 結構域」意指免疫球蛋白重鏈之CH2區。因此，例如人IgG1抗體之CH2區對應於根據EU編號的胺基酸231-340。然而，CH2區也可以屬於本文所述之任何其他抗體同種型。
如本文所用，術語「 CH3 區」或「 CH3 結構域」意指免疫球蛋白重鏈之CH3區。因此，例如人IgG1抗體之CH3區對應於根據EU編號的胺基酸341-447。然而，CH3區也可以屬於本文所述之任何其他抗體同種型。
然而，在一些實施方式中，抗體之Fc區已被修飾為惰性；「 惰性」係指具有最小能力或沒有能力結合任何Fcγ受體、誘導Fc介導的FcR交聯或藉由單個抗體之兩個Fc區誘導FcR介導的靶抗原交聯。此外，惰性Fc區可能無法結合C1q。
如本文所用，術語「 同種型」係指由重鏈恒定區基因編碼的免疫球蛋白（亞）類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、IgM或其任何異型，例如下表2之那些異型）。每個重鏈同種型可以與kappa（κ）或lambda（λ）輕鏈組合。本發明之抗體可以具有任何同種型。
在本發明之上下文中，「 競爭（ competition ）」或「 能夠競爭（ able to compete ）」或「 競爭（ competes ）」係指在特定結合配偶體（例如，靶標）的另一個分子（例如，結合相同靶標之不同抗體）存在下，特定結合分子（例如，抗體）結合特定該結合配偶體的傾向的任何可檢測到的顯著降低。典型地，競爭意指如藉由例如ELISA分析或流動式細胞分析術使用足量的兩種或更多種競爭分子（例如抗體）確定的由於存在另一個分子（例如作為抗體）而引起的在結合方面減少至少約25%，例如至少約50%，例如至少約75%，例如至少90%。藉由競爭性抑制確定結合特異性的其他方法可以例如在以下中找到：Harlow 等人, Antibodies: A Laboratory Manual [抗體：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社] , 冷泉港, 紐約, (1988), Colligan 等人, 編輯, Current Protocols in Immunology [當代免疫學實驗手冊], Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience [格林出版協會和威利國際科學出版公司] 紐約, (1992, 1993), 和Muller, Meth. Enzymol. [酶學方法] 92, 589-601 (1983)。
如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「 一個 / 一種（a/an ）」以及「 該（the）」包括複數指示物，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，提到「一個細胞」包括兩個或更多個細胞之組合等。
過渡術語「 包含」、「 基本上由 …… 組成」和「 由 …… 組成」旨在暗示它們在專利白話中通常被接受的含義；即，(i) 「包含（comprising）」同義於「包括（including）」、「含有（containing）」或「以……為特徵的」係包括性的或係開放式的，並且不排除另外的未列舉的要素或方法步驟；(ii) 「由……組成」不包括未在申請專利範圍中指定的任何要素、步驟或成分；並且 (iii) 「基本上由……組成」將申請專利範圍之範圍限制為要求保護的發明的指定材料或步驟「以及不對一或多種基本和新穎特徵產生實質性影響的那些」。作為實施方式，用短語「包含」（或其等效物）描述的實施方式還提供了用「由……組成」和「基本上由……組成」獨立描述的那些。
「 約（about）」意指由熟悉該項技術者確定的特定值在可接受的誤差範圍之內，這將部分地取決於該值係怎樣測定或確定的，即，受到測量系統之限制。除非在實例中或本說明書之其他地方對特定的測定、結果或實施方式的背景下另外明確說明，「約」意指根據本領域的實踐在一個標準偏差之內，或在高達5%的範圍內，以較大者為準。
「 活化（activation，activated）」或「 刺激（stimulation，stimulated）」係指誘導細胞的生物學狀態之改變，導致活化標記物之表現、細胞介素產生、增殖，或介導靶細胞之細胞毒性。可以藉由初級刺激訊息活化細胞。共刺激訊息可以放大初級訊息之量級，並在初始刺激後抑制細胞死亡，導致更持久的活化狀態，從而具有更高的細胞毒性能力。
「 替代支架」係指含有與高構象耐受性的可變結構域相關的結構核心之單鏈蛋白框架。可變結構域容忍在不損害支架完整性的情況下引入變異，因此可以對可變結構域進行工程化並選擇與特定抗原的結合。
「 抗原」係指能夠被能夠介導免疫響應的抗原結合結構域或T細胞受體結合的任何分子（例如，蛋白質、肽、多糖、醣蛋白、醣脂、核酸、其部分、或其組合）。示例性免疫響應包括抗體產生和免疫細胞（如T細胞、B細胞或NK細胞）之活化。抗原可由基因表現、合成或從生物樣本（如組織樣本、腫瘤樣本、細胞或具有其他生物組分、生物體、蛋白質/抗原的亞基的液體、殺傷或失活的全細胞或裂解物）中純化。
「 抗原結合區」或「 抗原結合結構域」或「 抗原結合位點」係指抗體之結合抗原的部分。抗原結合區可為合成的、酶促獲得的或基因工程化的多肽，並且包括結合抗原的免疫球蛋白之部分，如VH、VL、VH和VL、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fd和Fv片段、由一個VH結構域或一個VL結構域組成的單結構域抗體（dAb）、鯊魚可變IgNAR結構域、駱駝化VH結構域、VHH結構域、由類比抗體之CDR的胺基酸殘基組成的最小識別單元，如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和LCDR1、LCDR2和/或LCDR3、結合抗原的替代支架，和包含該抗原結合區的多特異性蛋白質。抗原結合結構域（如VH和VL）可以經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單個抗體設計，其中VH/VL結構域可以在分子內或在分子間配對（VH和VL結構域由分開的單鏈表現的那些情況下），以形成單價抗原結合結構域，如單鏈Fv（scFv）或雙抗體。抗原結合區也可以與其他抗體、蛋白質、抗原結合片段或替代支架軛合，該等抗體、蛋白質、抗原結合片段或替代支架軛合可為單特異性或多特異性的，以對雙特異性和多特異性蛋白質進行工程化。
「 抗體」意指廣義的，並且包括免疫球蛋白分子，該等免疫球蛋白分子包括單株抗體（包括鼠、人、人源化和嵌合單株抗體），抗原結合片段，多特異性抗體（如雙特異性、三特異性、四特異性等），二聚、四聚或多聚抗體，單鏈抗體，結構域抗體以及包含所需特異性的抗原結合位點的免疫球蛋白分子之任何其他修飾組態。重鏈由重鏈可變區（VH）和重鏈恒定區（由結構域（CH1、鉸鏈、CH2和CH3）構成）構成。輕鏈，如果存在的話，由輕鏈可變區（VL）和輕鏈恒定區（CL）組成。VH和VL區可進一步細分為高度變異區（稱為互補決定區（CDR）），它們散佈有框架區（FR）。VH或VL從胺基到羧基末端由按以下順序排列的三個CDR和四個FR片段組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根據重鏈恒定結構域胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為五大類（IgA、IgD、IgE、IgG和IgM）。IgA和IgG進一步細分為同種型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基於其恒定結構域之胺基酸序列，任何脊椎動物物種之抗體輕鏈可以分為兩種明顯不同的類型中之一種，即κ（kappa）和λ（lambda）。
「 雙特異性」係指特異性結合兩個不同的抗原或相同抗原內的兩個不同的表位的分子（如抗體）。雙特異性分子可能與其他相關抗原（例如與來自其他物種（同源物），如人、猴或猿類，例如石蟹獼猴（ Macaca fascicularis，cynomolgus monkey，cyno）或黑猩猩（ Pan troglodytes）的相同抗原）具有交叉反應性，或可以結合兩個或更多個不同的抗原之間共用的表位。
不同類別的雙特異性抗體之實例包括但不限於 (i) 具有互補CH3結構域以促成異源二聚化的IgG樣分子；(ii) 重組IgG樣雙重靶向分子，其中分子之兩側各含有至少兩種不同抗體之Fab片段或Fab片段之部分；(iii) IgG融合分子，其中全長IgG抗體融合至額外的Fab片段或Fab片段之部分；(iv) Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定的雙抗體與重鏈恒定結構域、Fc區或其部分融合；(v) Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，融合到重鏈恒定結構域、Fc區或其部分；和 (vi) 基於scFv和雙抗體的抗體和重鏈抗體（例如結構域抗體，Nanobodies®），其中不同的單鏈Fv分子或不同的雙抗體或不同的重鏈抗體（例如，結構域抗體，Nanobodies®）融合到彼此或與重鏈恒定結構域、Fc區或其部分融合的其他或另一種蛋白質或載劑分子。
具有互補CH3結構域分子的IgG樣分子之實例包括但不限於Triomab®（特賴恩製藥/費森尤斯生物技術公司（Trion Pharma/Fresenius Biotech））、杵臼結構（Knobs-into-Holes）（基因技術公司（Genentech））、CrossMAbs（羅氏公司（Roche））和靜電匹配的（美商安進公司（Amgen）、日本中外製藥株式會社（Chugai）、抗癌藥物公司（Oncomed））、LUZ-Y（基因技術公司, Wranik 等人 J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012年11月1日）、DIG-體和PIG-體（Pharmabcine公司, WO 2010134666, WO 2014081202）、股交換工程化的結構域體（SEEDbody）（默克雪蘭諾公司（EMD Serono））、Biclonics（Merus公司, WO 2013157953）、FcΔAdp（再生元公司（Regeneron））、雙特異性IgG1和IgG2（輝瑞公司/瑞納特公司（Pfizer/Rinat））、不對稱支架（Zymeworks公司/默克公司）、mAb-Fv（森科公司（Xencor））、二價雙特異性抗體（羅氏公司, WO 2009080254）和DuoBody®分子（Genmab公司）。
重組IgG樣雙重靶向分子之實例包括但不限於雙重靶向（DT）-Ig（葛蘭素史克公司（GSK）/Domantis公司, WO 2009058383）、二合一抗體（基因技術公司, Bostrom, 等人 2009. Science [科學] 323, 1610-1614）、交聯Mab（卡馬諾斯癌症中心（Karmanos Cancer Center））、mAb2（F-Star公司）、Zybodies TM（Zyngenia公司, LaFleur 等人 MAbs [單株抗體]. 2013年3月-4月;5(2):208-18）、具有共同輕鏈的方法、κλ體（NovImmune公司, WO 2012023053）和CovX-體®（CovX/輝瑞公司, Doppalapudi, V.R., 等人 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. [生物有機化學與藥物化學通訊] 17,501-506）。
IgG融合分子之實例包括但不限於雙重可變結構域（DVD）-Ig（雅培公司（Abbott））、雙重結構域雙頭抗體（聯合利華公司（Unilever）；賽諾菲-安萬特公司（Sanofi Aventis））、IgG樣雙特異性抗體（ImClone公司/禮來公司（Eli Lilly）, Lewis 等人 Nat Biotechnol. [自然生物技術] 2014年2月;32(2):191-8）、Ts2Ab（英商梅迪繆思有限公司（MedImmune）/阿斯利康公司（AZ）, Dimasi 等人 J Mol Biol. [分子生物學雜誌] 2009年10月30日;393(3):672-92）和BsAb（Zymogenetics公司, WO 2010111625）、HERCULES（百健艾迪公司（Biogen Idec））、scFv融合物（諾華公司（Novartis））、scFv融合物（常州亞當生物技術公司（Changzhou Adam Biotech Inc））和TvAb（羅氏公司）。
Fc融合分子之實例包括但不限於scFv/Fc融合物（學術機構（Academic Institution）, Pearce 等人 Biochem Mol Biol Int. [生物化學與分子生物學國際版] 1997年9月;42(6):1179）、SCORPION（Emergent BioSolutions公司/祖比仁藥物公司（Trubion）, Blankenship JW, 等人 AACR 100th Annual meeting 2009 [2009年AACR第100屆年會] (摘要#5465); Zymogenetics公司/百時美施貴寶公司（BMS）, WO 2010111625）、雙重親和力重靶向技術（Fc-DARTTM）（宏基因公司（MacroGenics））和雙(ScFv)2-Fab（國家抗體藥物研究中心—中國（National Research Center for Antibody Medicine - China））。
Fab融合雙特異性抗體之實例包括但不限於F(ab) 2（美達瑞公司（Medarex）/美商安進公司（AMGEN））、雙重作用或雙-Fab（基因技術公司）、對接鎖定（Dock-and-Lock）®（DNL）（免疫醫療公司（ImmunoMedics））、二價雙特異性（Biotecnol公司）和Fab-Fv（優時比製藥公司（UCB-Celltech））。
基於scFv的雙抗體和結構域抗體之實例包括但不限於雙特異性T細胞接合劑（BiTE®）（Micromet公司、串聯雙抗體（Tandab）（Affimed公司）、雙重親和力重靶向技術（DARTTM）（宏基因公司）、單鏈雙抗體（學術（Academic）, Lawrence FEBS Lett. [FEBS快報] 1998年4月3日;425(3):479-84）、TCR樣抗體（AIT, ReceptorLogics公司）、人血清白蛋白ScFv融合物（梅裡馬克公司（Merrimack）, WO 2010059315）和COMBODY分子（Epigen生物技術公司（Epigen Biotech）, Zhu等人 Immunol Cell Biol. [免疫與細胞生物學] 2010年8月;88(6):667-75）、雙重靶向奈米抗體®（Ablynx公司, Hmila等人, FASEB J. [美國實驗生物學會聯合會會誌] 2010）、雙重靶向型僅有重鏈的結構域抗體。本發明之多特異性抗體可為VHH-Fc形式，即該抗體包含兩個或更多個藉由人Fc區二聚物彼此連接的單結構域抗原結合區。在這種形式中，每個單結構域抗原結合區與Fc區多肽融合，兩個融合多肽藉由鉸鏈區中的雙硫鍵形成二聚雙特異性抗體。這樣的構建體通常不包含完整的或任何CH1或輕鏈序列。WO06064136之圖12B提供了這種形式的實例之圖示。
雙特異性抗體也可為混合形式。例如，一個抗原結合區可為Fab或scFv形式，而另一個抗原結合區可以由單結構域抗體構成或由單結構域抗體組成。這樣的構建體可以另外包含Fc區並且其藉由鉸鏈區連接Fc多肽。
「 互補決定區」（CDR）係結合抗原的抗體區。VH中有三個CDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和VL中有三個CDR（如果存在）（LCDR1、LCDR2、LCDR3）。可以使用各種描述定義CDR，如Kabat（Wu等人 (1970) J Exp Med [實驗醫學雜誌] 132: 211-50）；Kabat等人., Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列], 第5版編輯. Public Health Service [公共衛生署], National Institutes of Health [國立衛生研究院], 貝什斯達, 馬里蘭州, 1991）、Chothia（Chothia等人 (1987) J Mol Biol [分子生物學雜誌] 196: 901-17）、IMGT（Lefranc等人 (2003) Dev Comp Immunol [發展與比較免疫學] 27: 55-77）、AbM（Martin和Thornton J Bmol Biol [分子生物學雜誌] 263: 800-15, 1996）或Contact，其基於複雜晶體結構的分析（MacCallum, R. M., Martin, A. C. R.和Thornton, J. T. 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography [抗體-抗原相互作用：接觸分析和結合位點圖形]」 J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 262:732--745）。描述了各種描述和可變區編號之間的對應關係（參見例如 Lefranc等人 (2003) Dev Comp Immunol [發展與比較免疫學] 27: 55-77；Honegger和Pluckthun, J Mol Biol [分子生物學雜誌] (2001) 309:657-70；國際免疫遺傳學（IMGT）數據庫；網路資源，www.imgt.org）。可用程式如UCL Business PLC的abYsis可用於描繪CDR。如本文所用，術語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」和「LCDR3」包括藉由supra、Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact描述的方法中之任一種定義的CDR，除非說明書中另有明確說明。具有SEQ ID NO. 1至48的序列之CDR根據Kabat，同上定義。
「 表現載體」係指可在生物系統中或在重構的生物系統中利用以指導由表現載體中存在的多核苷酸序列編碼的多肽的翻譯之載體。
「 單結構域抗體」、「 dAb」、「 VHH」或「 dAb 片段」係指由VH結構域組成的抗體片段（Ward等人, Nature [自然] 341:544 546 (1989)）。本發明之第二抗原結合區可為單結構域抗體。單結構域抗體（sdAb，也稱為Nanobody®或VHH）係熟悉該項技術者熟知的，參見例如Hamers-Casterman等人 (1993) Nature [自然] 363:446, Roovers等人 (2007) Curr Opin Mol Ther [分子療法之當前觀點] 9:327和Krah等人 (2016) Immunopharmacol Immunotoxicol [免疫藥理學和免疫毒理學] 38:21。單結構域抗體包含單個CDR1、單個CDR2和單個CDR3。單結構域抗體之實例係僅有重鏈之抗體之可變片段、天然不包含輕鏈之抗體、衍生自常規抗體之單結構域抗體和工程化的抗體。單結構域抗體可以來源於任何物種，包括小鼠、人、駱駝、駱馬、鯊魚、山羊、兔和乳牛。例如，天然存在的VHH分子可以來源於駱駝科物種中產生的抗體，例如駱駝、單峰駱駝、駱馬、羊駝和原駝。與完整抗體一樣，單結構域抗體能夠選擇性地結合單個特定抗原。單結構域抗體可能僅包含免疫球蛋白鏈之可變結構域，即CDR1、CDR2和CDR3以及框架區。
「 Fab」或「 Fab 片段」係指由VH、CH1、VL和CL結構域組成的抗體片段。
「 F(ab’) 2 」或「 F(ab’) 2 片段」係指含有藉由雙硫鍵在鉸鏈區連接在一起的兩個Fab片段之抗體片段。
「 Fd」或「 Fd 片段」係指由VH和CH1結構域組成的抗體片段。
「 Fv」或「 Fv 片段」係指由來自抗體之單臂的VH和VL結構域組成的抗體片段。
「 宿主細胞」係指含有異源核酸的任何細胞。示例性異源核酸係載體（例如，表現載體）。
「 人抗體」係指經優化以在投與於人受試者時具有最小的免疫響應之抗體。人抗體之可變區源自人免疫球蛋白序列。如果人抗體含有恒定區或恒定區之一部分，則該恒定區也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗體之可變區係從使用人種系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系統獲得，則人抗體包含「源自」人源序列的重鏈和輕鏈可變區。此類示例性系統係在噬菌體上顯示的人免疫球蛋白基因文庫，以及攜帶人免疫球蛋白基因座的轉基因非人動物，如小鼠或大鼠。由於獲得人抗體所使用的系統與人免疫球蛋白基因座之間的差異、體細胞突變的引入或有意將取代引入框架、CDR或恒定區中，因此當與在人中表現的免疫球蛋白相比時，「人抗體」典型地含有胺基酸差異。典型地，「人抗體」之胺基酸序列與人種系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些情況下，「人抗體」可以含有源自人框架序列分析的共有框架序列，例如如以下中所述之：Knappik等人 (2000) J Mol Biol [分子生物學雜誌] 296:57-86），或併入噬菌體上顯示的人免疫球蛋白基因文庫的合成HCDR3，例如如以下中所述之：Shi等人 (2010) J Mol Biol [分子生物學雜誌] 397:385-96和國際專利公開案號WO 2009/085462。至少一個CDR源自非人物種之抗體不包括在「人抗體」之定義中。
「 人源化抗體」係指至少一個CDR源自非人物種並且至少一個框架源自人免疫球蛋白序列之抗體。人源化抗體可以在框架中包括取代，使得框架可以不是表現的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白種系基因序列之精確拷貝。
「 分離的」係指已經基本從產生分子的系統（如重組細胞）之其他組分中分離和/或純化的分子之同質群體（如合成的多核苷酸或多肽），以及經過至少一個純化或分離步驟的蛋白質。「分離的」係指基本上不含其他細胞物質和/或化學物質的分子，並且涵蓋分離至較高純度（如至80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的純度）的分子。
「 多特異性」係指特異性結合兩個或更多個不同的抗原或相同抗原內的兩個或更多個不同的表位的分子（如抗體）。多特異性分子可能與其他相關抗原（例如與來自其他物種（同源物），如人、猴或猿類，例如石蟹獼猴（ Macaca fascicularis，cynomolgus，cyno）或黑猩猩（ Pan troglodytes）的相同抗原）具有交叉反應性，或可以結合兩個或更多個不同的抗原之間共用的表位。
當參考核酸或胺基酸使用時，「 有效地連接」和類似短語係指分別處於彼此的功能關係中的核酸序列或胺基酸序列之有效連接。例如，有效地連接的啟動子、強化子元件、開讀框、5’和3’UTR以及終止子序列導致核酸分子（例如，RNA）之精確產生，並且在一些情況下導致多肽之產生（即，開讀框之表現）。有效地連接的肽係指肽之功能結構域之間處於彼此適當的距離，以賦予每個結構域的預期功能之肽。
「 藥物組成物」係指由活性成分和藥學上可接受的載劑組合所產生的組成物。
「 藥學上可接受的載劑」或「賦形劑」係指藥物組成物中除活性成分以外的、對受試者無毒的成分。示例性藥學上可接受的載劑係緩衝液、穩定劑或防腐劑。
疾病或障礙之「 預防（ Prevent ， preventing ， prevention ，或 prophylaxis）」意指預防受試者發生障礙。
兩個序列之間的 「序列同一性」百分比係序列共用的相同位置數量之函數（即，%同一性 = 相同位置數量/位置總數 × 100），將空位數量和每個空位之長度考慮在內，需要引入它們以便最佳比對兩個序列。兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已併入ALIGN程式（2.0版）中的E. Meyers和W. Miller（Comput. Appl. Biosci. [電腦應用生物科學], 4:11-17 (1988)）的演算法，利用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12、空位罰分4來確定。此外，兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已併入GCG套裝軟體中的GAP程式（可從 www_gcg_com獲得）中的Needleman和Wunsch, J. Mol, Biol. [分子生物學雜誌] 48:444-453, (1970)演算法，利用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來確定。
「單鏈 Fv」或「 scFv」係指包含含有輕鏈可變區（VL）的至少一個抗體片段和含有重鏈可變區（VH）的至少一個抗體片段之融合蛋白，其中該VL和VH經由多肽連接子連續連接，並且能夠表現為單鏈多肽。除非另有說明，否則如本文所用，scFv可具有任一種順序的VL和VH可變區，例如，相對於多肽之N末端和C末端，scFv可以包含VL-連接子-VH或可以包含VH-連接子-VL。
「 特異性地結合（ specifically binds 、 specifically binding ）」、「 特異性結合（ specific binding ）」或「 結合」係指蛋白質的分子與或能夠與抗原或抗原內的表位以大於對其他抗原的親和力結合。典型地，蛋白質的分子以約1 x 10 -7M或更小，例如約5 x 10 -8M或更小、約1 x 10 -8M或更小、約1 x 10 -9M或更小、約1 x 10 -10M或更小、或約1 x 10 -11M或更小、或約1 x 10 -12M或更小的平衡解離常數（K D），典型地，比其與非特異性抗原（例如，BSA，酪蛋白）結合的K D小至少一百倍的K D與抗原或抗原內的表位結合。
「 受試者」包括任何人或非人動物。「非人動物」包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、乳牛、雞、兩棲動物、爬蟲動物等。術語「受試者」和「患者」在本文中也可互換使用。
「 T 細胞」和「 T 淋巴球」在本文中可互換並同義使用。T細胞包括胸腺細胞、初始T淋巴球、記憶T細胞、未成熟T淋巴球、成熟T淋巴球、靜息T淋巴球或活化的T淋巴球。T細胞可為T輔助（Th）細胞，例如T輔助1（Th1）或T輔助2（Th2）細胞。T細胞可為輔助T細胞（HTL；CD4 +T細胞）CD4 +T細胞、細胞毒性T細胞（CTL；CD8 +T細胞）、腫瘤浸潤性細胞毒性T細胞（TIL；CD8 +T細胞）、CD4 +CD8 +T細胞、γ-δ T細胞或任何其他T細胞亞群。還包括「NKT細胞」，其係指T細胞之特殊群體，該等NKT細胞表現半恒定型αβ T細胞受體，還表現典型的與NK細胞相關的各種分子標記，如NK1.1。NKT細胞包括NK1.1 +和NK1.1 -、以及CD4 +、CD4 -、CD8 +和CD8 -細胞。NKT細胞上的TCR係獨特的，它能識別MHC I樣分子CD1d呈現的醣脂抗原。NKT細胞由於能夠產生促進炎症或免疫耐受的細胞介素，所以可能具有保護或有害作用。還包括「γ-δ T細胞（γδ T細胞）」，其係指特化的T細胞群，它們表面具有獨特的TCR，能夠識別非經典T細胞抗原，並且不像大多數T細胞（其中TCR由指定的α-和β-TCR鏈的兩條醣蛋白鏈組成），γδ T細胞中的TCR由γ鏈和δ鏈組成。存在不同類型的γ鏈和δ鏈，例如在Vγ9Vδ2 T細胞上共表現的Vγ9和Vδ2鏈。γδ T細胞可以在免疫監視和免疫調節中起作用，並且發現該等γδ T細胞係IL-17之重要來源，並誘導強烈的CD8+細胞毒性T細胞響應。還包括「調節性T細胞」或「Treg」，其係指抑制異常或過度免疫響應並在免疫耐受中起作用的T細胞。Tregs係典型的轉錄因子Foxp3-陽性CD4+T細胞，並且還可以包括轉錄因子Foxp3-陰性調節性T細胞（產生IL-10的CD4+T細胞）。
在本文可互換使用的「 治療有效量」或「 有效量」係指以必要的劑量和在必要的時間段內有效實現所需治療結果的量。治療有效量可以根據如個體之疾病狀態、年齡、性別和體重以及治療劑或治療劑之組合在個體中引起所需響應的能力等因素而變化。有效的治療劑或治療劑之組合之實例指標包括，例如，改善患者之健康、減少腫瘤負荷、阻止或減緩腫瘤之生長、和/或癌細胞未轉移到身體的其他位置。
疾病或障礙（如癌症）之「 治療（ Treat， treating或 treatment）」係指完成以下一項或多項：減輕障礙之嚴重程度和/或減少持續時間、抑制所治療障礙的症狀特徵之惡化、限制或預防曾患該障礙的受試者中該障礙之復發、或限制或預防曾有該障礙的症狀的受試者中症狀之復發。
「 腫瘤細胞」或「 癌細胞」係指體內、離體或組織培養中具有自發或誘導表現型改變的癌細胞、癌前期細胞或轉化細胞。該等改變不需要涉及新遺傳物質之攝取。儘管轉化可能是由於轉化病毒感染並引入新的基因組核酸、攝取外源核酸所致，但是轉化也可能自發地或者暴露於致癌物後發生，從而使內源性的基因發生突變。轉化/癌症以以下為例：形態變化、細胞永生化、生長控制異常、病灶形成、增殖、惡性腫瘤、腫瘤特異性標誌物水平之調控、侵襲、腫瘤在合適的動物宿主如裸鼠等體外、體內和離體生長。
「 變體」、「 突變」或「 改變」係指藉由一或多種修飾（例如一或多種取代、插入或缺失）而不同於參考多肽或參考多核苷酸之多肽或多核苷酸。
除非另有明確說明，否則貫穿本說明書的抗體恒定區中的胺基酸殘基編號係根據EU索引，如描述於Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列]，第5版編輯，Public Health Service [公共衛生署], National Institutes of Health [國立衛生研究院]，貝什斯達，馬里蘭州， (1991)中。 [ 表 1]. 序列表：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
JL5 HCDR1 NYYWS 1
JL5 HCDR2 HIYSTGNIHYNPSLKS 2
JL5 HCDR3 DNGAALFDY 3
JL5 LCDR1 SGSSSNIGSNIVN 4
JL5 LCDR2 SNNQRPS 5
JL5 LCDR3 AAWDDSLNGPV 6
JL6 HCDR1 SYYWG 7
JL6 HCDR2 YIYYSGSTNYNPSLKS 8
JL6 HCDR3 MWEILGFDP 9
JL6 LCDR1 SGSSSNIGSNPVN 10
JL6 LCDR2 SNNQRPS 11
JL6 LCDR3 AAWDDSLNGPV 12
JL2 HCDR1 SYWMT 13
JL2 HCDR2 NIKQDGSERYYVDSVKG 14
JL2 HCDR3 EVGYNWNQGGYFDY 15
JL2 LCDR1 RSSQSLLHSDGYNYLD 16
JL2 LCDR2 LGSYRAS 17
JL2 LCDR3 MQVLQTPWT 18
JL3 HCDR1 NYYWS 19
JL3 HCDR2 HIFSTGHINYDSSLKS 20
JL3 HCDR3 DNGAALFDF 21
JL3 LCDR1 SGSSSNIGSNIVN 22
JL3 LCDR2 SDNQRPS 23
JL3 LCDR3 AAWDDSLNGPV 24
5D3 CDR1 NYAMG 25
5D3 CDR2 VISWSGGSTYYADSVKG 26
5D3 CDR3 QFSGASTVVAGTALDYDY 27
6H4 CDR1 NYGMG 28
6H4 CDR2 GISWSGGSTDYADSVKG 29
6H4 CDR3 VFSGAETAYYPSDDYDY 30
6H3 CDR1 NYGMG 31
6H3 CDR2 GITWSGGSTHYADLVKG 32
6H3 CDR3 VFSGAETAYYPSTEYDY 33
6G3 CDR1 NYGMG 34
6G3 CDR2 GISWSGGSTYYADSVKG 35
6G3 CDR3 VFSGAETAQYPSYDYDY 36
5C8 CDR1 NYAMX，其中X係G或S 37
5C8 CDR2 AISWSGGSTSYADSVKG 38
5C8 CDR3 QFSGADYGFGRLGIRGYEYDY 39
5F5 CDR1 NYAMG 40
5F5 CDR2 AISWSGGSTYYADSVKG 41
5F5 CDR3 MFSGSESQLVVVITNLYEYDY 42
6A1 CDR1 NYAMG 43
6A1 CDR2 TISWSGGSTYYADSVKG 44
6A1 CDR3 AFSGSDYANTKKEVEYDY 45
6E4 CDR1 DYCIA 46
6E4 CDR2 CITTSDGSTYYADSVKG 47
6E4 CDR3 YFGYGCYGGAQDYRAMDY 48
JL5 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAG KGLEWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRS VTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSS 49
JL5 VL QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADY YCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVL 50
JL6 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVSS 51
JL6 VL QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGT APKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL 52
JL2 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVTV SS 53
JL2 VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQVLQTPWTFGQGTKVEIK 54
JL3 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGQGTLVTVSS 55
JL3 VL QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVL 56
5D3 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQ APGKEREFVTVISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCAAQFSGASTVVAGTALDYDYW GQGTRVTVSS 57
6H4 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQ APGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWG QGTQVTVSS 58
6E3 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQ APGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRLTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWG QGTQVTVSS 59
6C1 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQ APGKKRESVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWG QGTQVTVSS 60
6H3VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRPFSNYGMGWFRQ APGKEREFVAGITWSGGSTHYADLVKGRFTISRDNAKNTV HLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSTEYDYWGQ GTQVTVSS 61
6G3VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFNNYGMGWFRQ APGKEREFVAGISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAQYPSYDYDYWG QGTQVTVSS 62
5C8 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQ APGKEREFVAAISWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSPKPEDTAIYYCAAQFSGADYGFGRLGIRGYEYDYWGQGTQVTVSS 63
5F5 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQ APGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCAAMFSGSESQLVVVITNLYEYD YWGQGTQVTVSS 64
6A1 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQ APGKEREFVATISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCAAAFSGSDYANTKKEVEYDYW GQGTQVTVSS 65
6E4 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDDYCIAWFRQ APGKEREPVSCITTSDGSTYYADSVKGRFTISSDNAKNTV YLQMNRLKPEDTAVYYCAAYFGYGCYGGAQDYRAMDYWGKGTLVTVSS 66
連接子1 GGSEGKSSGSGSESKSTGGS 67
連接子2 GGGSGGGS 68
連接子3 GGGSGGGSGGGS 69
連接子4 GGGSGGGSGGGSGGGS 70
連接子5 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS 71
連接子6 GGGGSGGGGSGGGGS 72
連接子7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 73
連接子8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 74
連接子9 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 75
連接子10 IRPRAIGGSKPRVA 76
連接子11 GKGGSGKGGSGKGGS 77
連接子12 GGKGSGGKGSGGKGS 78
連接子13 GGGKSGGGKSGGGKS 79
連接子14 GKGKSGKGKSGKGKS 80
連接子15 GGGKSGGKGSGKGGS 81
連接子16 GKPGSGKPGSGKPGS 82
連接子17 GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 83
連接子18 GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS 84
連接子19 STAGDTHLGGEDFD 85
連接子20 GEGGSGEGGSGEGGS 86
連接子21 GGEGSGGEGSGGEGS 87
連接子22 GEGESGEGESGEGES 88
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連接子24 GEGESGEGESGEGESGEGES 90
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連接子26 PRGASKSGSASQTGSAPGS 92
連接子27 GTAAAGAGAAGGAAAGAAG 93
連接子28 GTSGSSGSGSGGSGSGGGG 94
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連接子30 GSGS 96
連接子31 APAPAPAPAP 97
連接子32 APAPAPAPAPAPAPAPAPAP 98
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連接子34 GGGGS 100
JL5x6H4 重鏈1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAG KGLEWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRS VTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX 其中X係可以存在或可以不存在的K 101
JL5x6H4 輕鏈1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADY YCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 102
JL5x6H4 重鏈2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 103
JL5x5D3 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAG KGLEWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRS VTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX 其中X係可以存在或可以不存在的K 104
JL5x5D3 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADY YCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 105
JL5x5D3 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQAPGKEREFVTVISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQFSGASTVVAGTALDYDYWGQGTRVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITRE PEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 106
JL6x6H4 重鏈1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 107
JL6x6H4 輕鏈1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGT APKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEEL QANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 108
JL6x6H4 重鏈2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 109
JL6x5D3 重鏈1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 110
JL6x5D3 輕鏈1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGT APKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEEL QANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 111
JL6x5D3 重鏈2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQAPGKEREFVTVISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQFSGASTVVAGTALDYDYWGQGTRVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITRE PEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 112
JL2x6H4 重鏈1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 113
JL2x6H4 輕鏈1 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQVLQTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 114
JL2x6H4 重鏈2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 115
JL2x5D3 重鏈1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 116
JL2x5D3 輕鏈1 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQVLQTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 117
JL2x5D3 重鏈2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQAPGKEREFVTVISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQFSGASTVVAGTALDYDYWGQGTRVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITRE PEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 118
JL3x6H4 重鏈1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 119
JL3x6H4 輕鏈1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 120
JL3x6H4 重鏈2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 121
JL3x5D3 重鏈1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 122
JL3x5D3 輕鏈1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 123
JL3x5D3 重鏈2 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQAPGKEREFVTVISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQFSGASTVVAGTALDYDYWGQGTRVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITRE PEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX, 其中X係可以存在或可以不存在的K 124
IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 125
IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD ISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 126
IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 127
IgG1的Fc區 EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 128
人Vδ2 MQRISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCS MKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDTLGMGGEYTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIR INLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL 129
ScFv CD33 JL5 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADY YCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVL GGSEGKSSGSGSESKSTGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAG KGLEWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRS VTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSS 130
ScFv CD33 JL6 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGT APKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL GGSEGKSSGSGSESKSTGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVSS 131
ScFv CD33 JL2 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQVLQTPWTFGQGTKVEIK GGSEGKSSGSGSESKSTGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVTV SS 132
ScFv CD33 JL3 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVL GGSEGKSSGSGSESKSTGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGQGTLVTVSS 133
本發明之其他方面和實施方式
如上所述，在第一方面，本發明關於分離的多特異性抗體，其包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區和能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區；其中該第一抗原結合區包含以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別地，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6； a)  分別地，SEQ ID NO: 7、8、9、10、11和12； d) 分別地，SEQ ID NO: 13、14、15、16、17和18；或者 e)  分別地，SEQ ID NO: 19、20、21、22、23和24；並且 其中該第二抗原結合區結合該Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈。
該第二抗原結合區可為單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CDR3： a)  分別地，SEQ ID NO: 25、26和27； b) 分別地，SEQ ID NO: 28、29和30； c)  分別地，SEQ ID NO: 31、32和33； d) 分別地，SEQ ID NO: 34、35和36； e)  分別地，SEQ ID NO: 37、38和39； f)  分別地，SEQ ID NO: 40、41和42； g) 分別地，SEQ ID NO: 43、44和45；或者 h) 分別地，SEQ ID NO: 46、47和48。
該第一抗原結合區可以包含分別係SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
該第一抗原結合區可以包含分別係SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且該第二抗原結合區係單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CDR3：分別地，SEQ ID NO: 28、29和30。
該第一抗原結合區可以包含分別係SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且該第二抗原結合區係單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CD3：分別地，SEQ ID NO: 25、26和27。
該第二抗原結合區係單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CD3：分別地，SEQ ID NO: 28、29和30。
本發明之多特異性抗體可包含第一抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 49的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 50的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 51的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 52的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 53的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 54的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 55的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 56的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； 以及 第二抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 57具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 58具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 59具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 60具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； e) 與SEQ ID NO: 61具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； f) 與SEQ ID NO: 62具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； g) 與SEQ ID NO: 63具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； h) 與SEQ ID NO: 64具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； i) 與SEQ ID NO: 65具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列；或者 j) 與SEQ ID NO: 66具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
本發明之多特異性抗體可包含第二抗原結合區，該第二抗原結合區與具有選自SEQ ID NO: 57至66的序列之抗體競爭結合人Vδ2。
本發明之多特異性抗體可包含第二抗原結合區，該第二抗原結合區與具有選自SEQ ID NO: 57至66的序列之抗體結合人Vδ2上的相同表位。
本發明之多特異性抗體可包含第一抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 49的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 50的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； 以及 第二抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 57具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 58具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 59具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 60具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； e) 與SEQ ID NO: 61具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； f) 與SEQ ID NO: 62具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； g) 與SEQ ID NO: 63具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； h) 與SEQ ID NO: 64具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； i) 與SEQ ID NO: 65具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列；或者 j) 與SEQ ID NO: 66具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
本發明之多特異性抗體可包含第一抗原結合區，其包含以下或由以下組成： b) 與SEQ ID NO: 51的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 52的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； 以及 第二抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 57具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 58具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 59具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 60具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； e) 與SEQ ID NO: 61具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； f) 與SEQ ID NO: 62具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； g) 與SEQ ID NO: 63具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； h) 與SEQ ID NO: 64具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； i) 與SEQ ID NO: 65具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列；或者 j) 與SEQ ID NO: 66具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
本發明之多特異性抗體可包含第一抗原結合區，其包含以下或由以下組成： c) 與SEQ ID NO: 53的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 54的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； 以及 第二抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 57具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 58具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 59具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 60具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； e) 與SEQ ID NO: 61具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； f) 與SEQ ID NO: 62具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； g) 與SEQ ID NO: 63具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； h) 與SEQ ID NO: 64具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； i) 與SEQ ID NO: 65具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列；或者 j) 與SEQ ID NO: 66具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
本發明之多特異性抗體可包含第一抗原結合區，其包含以下或由以下組成： d) 與SEQ ID NO: 55的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 56的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； 以及 第二抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 57具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 58具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 59具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 60具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； e) 與SEQ ID NO: 61具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； f) 與SEQ ID NO: 62具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； g) 與SEQ ID NO: 63具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； h) 與SEQ ID NO: 64具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； i) 與SEQ ID NO: 65具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列；或者 j) 與SEQ ID NO: 66具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
本發明之多特異性抗體可包含第一抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 49的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 50的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 51的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 52的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 53的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 54的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 55的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 56的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； 以及 第二抗原結合區，其包含以下或由以下組成： b) 與SEQ ID NO: 58具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
本發明之多特異性抗體可包含第一抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 49的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 50的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 51的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 52的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 53的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 54的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 55的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 56的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； 以及 第二抗原結合區，其包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 57具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
本文揭露的序列之變體較佳的是包含揭露的序列之保守修飾。「保守修飾」係指未顯著影響或改變含有胺基酸修飾的抗體的結合特徵之胺基酸修飾。保守修飾包括胺基酸取代、添加和缺失。保守胺基酸取代係胺基酸被具有類似側鏈的胺基酸殘基所替代的那些。明確定義了具有類似側鏈的胺基酸殘基之家族，並且包括具有以下側鏈的胺基酸：酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、非極性側鏈（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸）、芳香族側鏈（例如，苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸）、脂族側鏈（例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸）、醯胺（例如，天冬醯胺、麩醯胺）、β-分支側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）和含硫側鏈（半胱胺酸、甲硫胺酸）。此外，多肽中之任何天然殘基還可以用丙胺酸取代，如先前丙胺酸掃描誘變中所述（MacLennan等人， (1988) Acta Physiol Scand Suppl[斯堪的生理學學報增刊] 643:55-67；Sasaki等人, (1988) Adv Biophys[生物物理學進展] 35:1-24)。可以藉由已知方法，例如藉由PCR誘變（美國專利案號4,683,195）進行本發明之抗體的胺基酸取代。可替代地，可以例如使用編碼11個胺基酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp）的隨機（NNK）或非隨機密碼子（例如DVK密碼子）產生變體文庫。可以使用本文所述之測定法來測試所得變體之特徵。
本發明之多特異性抗體可以具有任何合適的抗體形式。本領域已經描述了許多抗體形式。
多特異性抗體可包含Fab、scFv、(scFv) 2、Fv、F(ab’) 2或Fd，其包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區。
能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區可為任何合適的形式，例如Fab、scFv、(scFv) 2、Fv、F(ab’) 2、Fd或單結構域抗體。多特異性抗體可以包含單結構域抗體，該單結構域抗體包含能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區或由其組成。
多特異性抗體可以包括包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區的Fab和包含能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區之單結構域抗體。
多特異性抗體可以包括包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區的scFv和包含能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區之單結構域抗體。
取決於抗體形式，抗原結合區或其部分可為相同多肽鏈之一部分並且從單個開讀框表現。在這樣的實施方式中，可以在抗原結合區序列之間使用連接子序列。
多特異性抗體可以包括包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區的scFv和包含能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區的VHH，並且scFv包含肽連接子，該肽連接子視需要地選自SEQ ID NO: 67至99中（例如SEQ ID NO: 67）所示的連接子之群組。
第一抗原結合區和第二抗原結合區可以直接或藉由肽連接子間接共價連接，視需要地其中肽連接子包含SEQ ID NO: 100中所示的序列或由其組成。
多特異性抗體可由單一開讀框編碼，其中第一抗原結合區位於第二抗原結合區之N末端。N末端到C末端的順序可為VL-第一連接子-VH-第二連接子-VHH，其中VL係第一抗原結合結構域之輕鏈可變區，第一連接子係肽連接子，VH係第一抗原結合結構域之重鏈可變區，第二連接子係肽連接子並且VHH係包含第二抗原結合區之單結構域抗體。多特異性抗體可由單一開讀框編碼，其中第一抗原結合區位於第二抗原結合區之C末端。
本發明之多特異性抗體可以包含恒定區序列，例如由第一Fc多肽和第二Fc多肽組成的Fc區。因此，多特異性抗體可以包括包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區的Fab、包含能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區的VHH、和Fc區。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 49的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 50的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc序列。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 49的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 50的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc序列。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 51的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 52的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc序列。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 51的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 52的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc序列。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 53的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 54的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc序列。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 53的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 54的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc序列。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 55的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 56的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc序列。
多特異性抗體可以包含： -   第一多肽，其包含SEQ ID NO: 55的VH和重鏈恒定序列， -   第二多肽，其包含SEQ ID NO: 56的VL和輕鏈恒定序列，和 -   第三多肽，其包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc序列。
本發明之分離的多特異性抗體可以包含以下或由以下組成： a) SEQ ID NO: 101、102和103所示的多肽； b) SEQ ID NO: 104、105和106所示的多肽； c) SEQ ID NO: 107、108和109所示的多肽； d) SEQ ID NO: 110、111和112所示的多肽； e) SEQ ID NO: 113、114和115所示的多肽； f) SEQ ID NO: 116、117和118所示的多肽； g) SEQ ID NO: 119、120和121所示的多肽；或者 h) SEQ ID NO: 122、123和124所示的多肽。
本發明之分離的多特異性抗體可為雙特異性抗體。
本發明之分離的多特異性抗體可以單價結合CD33並且單價結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體。
本發明抗體之第一抗原結合區和/或第二抗原結合區可為人的或人源化的。
多特異性抗體可以能夠在靶細胞存在的情況下誘導人Vγ9Vδ2 T細胞之增殖，在1 nM的抗體濃度下10天後增加超過10倍或超過50倍，例如，當如本文實例中所述進行測試時。
本發明之多特異性抗體可以能夠在Vγ9Vδ2-T細胞存在下介導THP-1細胞之殺傷，包括以低效應細胞比靶細胞的比率。因此，本發明多特異性抗體可以能夠在Vγ9Vδ2-T細胞（E）存在下以E:T比率1 : 20介導THP-1細胞（T）之殺傷，其中EC50低於1 nM，例如0.5 nM，例如低於200 pM，例如低於150 pM，例如低於100 pM，例如，當如本文實例中所述進行測試時。
本發明之多特異性抗體可以能夠介導殺傷來自血液癌症患者的表現人CD33的細胞。
本發明之多特異性抗體可以能夠相比於非腫瘤細胞例如來自健康供體的CD14+細胞優先介導CD33陽性腫瘤細胞例如THP-1細胞之殺傷，例如，當如本文實例中所述進行測試時。 同種型、異型和工程化的 Fc
存在於本揭露之抗體中的Ig恒定區或該Ig恒定區之片段（如Fc區）可為任何異型或同種型。
本揭露之分離的多特異性抗體可以包含Ig恒定區或其片段，例如片段可結晶區（「Fc」區）。所述Ig恒定區或其片段選自由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型組成之群組。
Ig恒定區或該Ig恒定區之片段可為任何異型。可以預期，異型對Ig恒定區之特性（如結合或Fc介導的效應子功能）沒有影響。包含其片段的Ig恒定區的治療性抗體之免疫原性與輸注反應之風險增加和治療響應之持續時間降低有關（Baert等人， (2003) N Engl J Med[新英格蘭醫學雜誌] 348:602—08）。包含其片段的Ig恒定區的治療性抗體在宿主中誘導免疫響應之程度可以部分由Ig恒定區之異型確定（Stickler等人, (2011) Genes and Immunity[基因與免疫] 12:213-21）。Ig恒定區異型與抗體之恒定區序列中特定位置的胺基酸序列變異有關。表2示出了選擇的IgG1、IgG2和IgG4異型。 [ 表 2].
異型 多樣性位置處的胺基酸殘基（殘基編號：EU索引）
IgG2 IgG4 IgG1
189 282 309 422 214 356 358 431
G2m(n) T M
G2m(n-) P V
G2m(n)/(n-) T V
nG4m(a) L R
G1m(17) K E M A
G1m(17,1) K D L A
G1m(3) R E M A
可藉由血流中的內源性循環羧肽酶從Ig恒定區去除C末端離胺酸（CTL）（Cai等人, (2011) Biotechnol Bioeng[生物技術與生物工程] 108:404-412）。如美國專利公開案號US20140273092中所述，在製造過程中，可以藉由控制細胞外Zn 2+、EDTA或EDTA-Fe 3+之濃度，將CTL之去除控制在最大水平以下。可以使用已知方法測定蛋白質之CTL含量。
與抗原結合片段軛合的Ig恒定區可具有0%至100%、約10%至約90%、約20%至約80%、約40%至約70%、約55%至約70%、或約60%的C末端離胺酸含量。
可以對與抗原結合結構域軛合的Ig恒定區或其片段進行Fc區突變，以調節它們與Fc受體的結合，從而調節它們的效應子功能，例如ADCC、ADCP和/或ADCP和/或藥物動力學特性。這可以藉由向Fc中引入一或多個突變來實現，該突變 (i) 調節突變的Fc與活化性FcγR（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII）和抑制性FcγRIIb之結合；和/或 (ii) 降低Fc效應子功能，例如C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）或吞噬作用（ADCP），減少藉由雙特異性抗體與Fc受體陽性細胞結合介導的抗原非依賴性T細胞活化。
本揭露之分離的多特異性抗體之Fc區可為惰性的。本揭露之分離的多特異性抗體之惰性Fc區可以在第一和第二Fc多肽之一或兩者中包含在對應於234的位置處的Ala，在對應於235的位置處的Ala，以及在對應於265的位置處的Ser，其中編號係根據Eu。
Fc區可包含至少一個突變，其導致抗體與Fcγ受體（FcγR）之結合減少。可以發生突變以降低抗體與活化性FcγR之結合隨後降低效應子功能的Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可以單獨或組合進行的示例性突變IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的突變K214T、E233P、L234V、L234A、G236的缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S。導致抗體ADCC降低的示例性組合突變係以下突變：IgG1上的L234A/L235A、IgG1上的L234A/L235A/D265S、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的F234A/L235A、IgG4上的S228P/F234A/L235A、所有Ig同種型上的N297A、IgG2上的V234A/G237A、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的S267E/L328F、IgG1上的L234F/L235E/D265A、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、和IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S。還可以使用雜合IgG2/4 Fc結構域，如具有來自IgG2的殘基117-260和來自IgG4的殘基261-447的Fc。
導致抗體CDC降低的示例性突變係K322A突變。
可以在IgG4中進行熟知的S228P突變以增強IgG4穩定性。
導致該抗體與FcγR的結合降低的該至少一個突變可以選自由以下組成之群組：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中殘基根據EU索引編號。
本揭露之抗體可以在Fc區包含至少一個突變，其增強蛋白質與Fcγ受體（FcγR）之結合和/或增強Fc效應子功能，如C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）和/或吞噬作用（ADCP）。
Fc區可以包含至少一個導致抗體與FcγR結合增強的突變。導致該蛋白質與FcγR的結合增強的該至少一個突變選自由以下組成之群組：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中殘基根據EU索引編號。
可以發生突變以增加抗體與活化性FcγR的結合和/或增強效應子功能的Fc位置包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430（殘基根據EU索引編號）。可以單獨或組合進行的示例性突變係G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T和P396L。導致抗體ADCC或ADCP增加的示例性組合突變係S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E。
可以發生突變以增強CDC的Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345和430。可以單獨或組合進行的示例性突變係S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F或E430T。導致抗體CDC增加的示例性組合突變係K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T。
當與分別為SEQ ID NO：125、126和127的IgG1、IgG2和IgG4野生型胺基酸序列相比時，本文所述之特異性突變係突變。
可以使用流動式細胞分析術在工程化以表現每種受體的細胞上評估抗體與FcγR或FcRn的結合。在示例性結合測定中，將每孔2 x 10 5細胞接種在96孔板中，並在BSA染色緩衝液（BD生物科學公司（BD Biosciences），聖約瑟（San Jose），美國）中於4°C封閉30分鐘。將細胞與測試抗體在冰上於4°C孵育1.5小時。用BSA染色緩衝液洗滌兩次後，將細胞與R-PE標記的抗人IgG二級抗體（傑克遜免疫研究實驗室公司（Jackson Immunoresearch Laboratories））在4°C孵育45分鐘。將細胞在染色緩衝液中洗滌兩次，然後重懸於150 μL含有1 : 200稀釋的DRAQ7活/死染色劑（細胞傳訊技術公司（Cell Signaling Technology），丹弗斯，美國）的染色緩衝液中。分別使用B2和B4通道，藉由Miltenyi MACSQuant流式細胞儀（美國奧本的美天旎生物技術公司（Miltenyi Biotec，Auburn，USA））檢測染色細胞的PE和DRAQ7用DRAQ7排除對活細胞進行門控，並確定收集的至少10,000個活事件的幾何平均螢光訊息。FlowJo軟體（樹星公司（Tree Star）用於分析。數據繪製為抗體濃度相比於平均螢光訊息的對數。進行非線性迴歸分析。
可以發生突變以調節半衰期（例如，與FcRn結合）的Fc位置包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可以單獨或組合進行的示例性突變係突變T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。可以增加半衰期的示例性單獨或組合突變係突變M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A。可以減少半衰期的示例性單獨或組合突變係突變H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R。
換言之，在本揭露之分離的多特異性抗體中，第一和第二Fc多肽之一或兩者中的Fc區可以包含在對應於252的位置處的Tyr，在對應於254的位置處的Thr，以及對應於256的位置處的Glu，其中編號係根據Eu。
本揭露之抗原結合片段可被工程化為可使用Fab臂交換產生的全長多特異性抗體，在Fab臂交換中將取代引入到Ig恒定區CH3結構域內的兩個單特異性二價抗體中，這促進體外Fab臂交換。在方法中，兩個單特異性二價抗體可以經工程化以使其在CH3域有一定的取代，這促進異二聚物的穩定性；將抗體在足以使鉸鏈區中的半胱胺酸發生雙硫鍵異構化的還原條件下一起孵育；從而藉由Fab臂交換產生雙特異性抗體。孵育條件最好可以恢復到非還原性。可以使用的示例性還原劑係2-巰基乙胺（2-MEA）、二硫蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇（DTE）、麩胱甘肽、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、L-半胱胺酸和β-巰基乙醇，較佳的是還原劑選自由2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇和三(2-羧乙基)膦組成之群組。例如，在至少25 mM 2-MEA的存在下或在至少0.5 mM二硫蘇糖醇的存在下，在5-8的pH（例如可以使用在為7.0的pH或7.4的pH值）下，在至少20°C的溫度下孵育至少90 min。
可以使用的CH3突變包括以下技術，如杵臼結構（Knob-in-Hole）突變（基因技術公司）、靜電匹配的突變（日本中外製藥株式會社、美商安進公司、諾和諾德公司（NovoNordisk）、抗癌藥物公司、Merus公司）、股交換工程化的結構域體（SEEDbody）（默克雪蘭諾公司）、Duobody®突變（Genmab公司）和其他非對稱突變（例如Zymeworks公司）。
杵臼結構突變例如在WO1996/027011中揭露，並且包括CH3區的介面上的突變，在CH3區中將具有小側鏈（臼（hole））的胺基酸引入第一CH3區並且將具有大側鏈（杵（knob））的胺基酸引入第二CH3區，這導致第一CH3區和第二CH3區之間的優先相互作用。形成杵和臼的示例性CH3區突變係T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。換言之，在本發明之分離的多特異性抗體中，第一Fc多肽可以在對應於366的位置處包含Trp，第二Fc多肽可以包含在對應於366的位置處的Ser，在對應於368的位置處的Ala和在對應於407的位置處的Val，或反之亦然，其中編號係根據Eu。
如US2010/0015133、US2009/0182127、US2010/028637或US2011/0123532中所述，可以藉由使用靜電相互作用（藉由取代第一CH3區上的帶正電荷的殘基和第二CH3區上的帶負電荷的殘基）促進重鏈異二聚物形成。
如US2012/0149876或US2013/0195849（Zymeworks公司）中所述，可用於促進重鏈異源二聚物化的其他非對稱突變係L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W。
如US20070287170中所述，SEEDbody突變涉及用IgA殘基取代選擇的IgG殘基以促進重鏈異源二聚物化。
如WO2007/147901、WO 2011/143545、WO 2013157954、WO 2013096291和US2018/0118849中所述，可以使用的其他示例性突變係R409D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_ T366S_L368A_Y407V、Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V、T366K/L351D、L351K/Y349E、L351K/Y349D、L351K/L368E、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K、K392D/E356K、K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D、K392D_K409D/D356K_D399K。
Duobody®突變（Genmab公司）揭露於例如US9150663和US2014/0303356中並且包括突變F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH和Y407LWQ/K409AGRH。
其他雙特異性或多特異性結構包括雙重可變結構域免疫球蛋白（DVD）（國際專利公開案號WO2009/134776；DVD係含有具有VH1-連接子-VH2-CH結構的重鏈和具有VL1-連接子-VL2-CL結構的輕鏈之全長抗體；連接子係視需要的）、包括連接兩個具有不同特異性的抗體臂的各種二聚化結構域之結構，如白胺酸拉鍊或膠原二聚化結構域（國際專利公開案號WO2012/022811、美國專利案號5,932,448；美國專利案號6,833,441）、兩個或更多個軛合在一起的結構域抗體（dAb）、雙抗體、僅有重鏈之抗體，如駱駝科（camelid）抗體和工程化的駱駝科抗體、雙重靶向（DT）-Ig（葛蘭素史克公司（GSK）/Domantis公司）、二合一抗體（基因技術公司）、交聯Mab（卡馬諾斯癌症中心（Karmanos Cancer Center））、mAb2（F-Star公司）和CovX體（CovX公司/輝瑞公司（Pfizer））、IgG樣雙特異性（InnClone公司/禮來公司（Eli Lilly））、Ts2Ab（英商梅迪繆思有限公司（MedImmune）/阿斯利康公司（AZ））和BsAb（Zymogenetics公司）、HERCULES（百健艾迪公司（Biogen Idec））和TvAb（羅氏公司（Roche））、ScFv/Fc融合物（學術機構（Academic Institution））、SCORPION（Emergent BioSolutions公司/祖比仁藥物公司（Trubion）、Zymogenetics公司/百時美施貴寶公司（BMS））、雙重親和力重靶向技術（Fc-DART）（宏基因公司（MacroGenics））和雙(ScFv) 2-Fab（國家抗體藥物研究中心--中國）、雙重作用或雙Fab（基因技術公司）、對接鎖定（Dock-and-Lock，DNL）（免疫醫療公司（ImmunoMedics））、二價雙特異性（Biotecnol公司）和Fab-Fv（優時比製藥公司（UCB-Celltech））。基於ScFv的抗體、基於雙抗體的抗體和結構域抗體包括但不限於雙特異性T細胞接合劑（BiTE）（Micromet公司）、串聯雙抗體（Tandab）（Affimed公司）、雙重親和力重靶向技術（DART）（宏基因公司）、單鏈雙抗體（學術（Academic））、TCR樣抗體（AIT，ReceptorLogics公司）、人血清白蛋白ScFv融合物（梅裡馬克公司（Merrimack））和COMBODY（Epigen生物技術公司（Epigen Biotech））、雙重靶向奈米抗體（Ablynx公司）、雙重靶向型僅有重鏈的結構域抗體。
在本揭露之分離的多特異性抗體中，第一Ig恒定區或第一Ig恒定區之片段和第二Ig恒定區或第二Ig恒定區之片段可以包含在至少一個突變，其調節與蛋白A的結合。這樣的修飾可以有利於抗體生產過程中的純化目的。這樣的至少一個突變可以存在於第一或第二Fc多肽中，或兩者中。
調節與蛋白A的結合的該至少一個突變係H435R/Y436F，其中殘基根據EU索引編號。第一Ig恒定區或該第一Ig恒定區之片段和第二Ig恒定區或該第二Ig恒定區之片段可以包含L234A/L235A/D265S、M252Y/S254T/T256E和H435R/Y436F 突變，其中殘基根據EU索引編號。
還可以將本揭露之抗原結合結構域工程化到包含三條多肽鏈的多特異性抗體。在此類設計中，至少一個抗原結合結構域係scFv的形式。示例性設計包括（其中「1」表示第一抗原結合結構域，「2」表示第二抗原結合結構域以及「3」表示第三抗原結合結構域： 設計1：A鏈) scFv1-CH2-CH3；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計2：A鏈) scFv1-鉸鏈-CH2-CH3；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計3：A鏈) scFv1-CH1-鉸鏈-CH2-CH3；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 設計4：A鏈) CH2-CH3-scFv1；B鏈) VL2-CL；C鏈) VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3
如US2012/0149876或US2013/0195849（Zymeworks公司）中所述，可以將工程化的CH3引入設計1-4，如突變L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W。 糖工程化
藉由工程化Ig恒定區或Ig恒定區寡糖組分之片段，可以增強與Ig恒定區或Ig恒定區片段軛合的抗原結合結構域介導ADCC之能力。人IgG1或IgG3可以在Asn297處被N-糖基化，其中大多數聚糖以熟知的二天線型G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式存在。由非工程化CHO細胞產生的含有抗體的Ig恒定區通常具有約至少85%的聚糖岩藻糖含量。從附接到與Ig恒定區或該Ig恒定區之片段軛合的抗原結合結構域的二天線型複合物型寡糖中去除核心岩藻糖，經由改善FcγRIIIa結合增強了抗體的ADCC，而不改變抗原結合或CDC活性。可以使用報導的不同方法來獲得這樣的抗體，該等方法可導致相對較高的去岩藻糖基化免疫球蛋白之成功表現，該等去岩藻糖基化免疫球蛋白帶有Fc寡糖的二天線型複合物型，如控制培養物莫耳滲透壓濃度（Konno 等人, Cytotechnology [細胞技術] 64(:249-65, 2012)）、變體CHO系Lec13作為宿主細胞系的應用（Shields 等人， J Biol Chem [生物化學雜誌] 277: 26733 -26740, 2002）、變體CHO系EB66作為宿主細胞系的應用（Olivier等人, MAbs [單株抗體]; 2(4): 405-415, 2010; PMID:20562582）、大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系的應用（Shinkawa 等人, J Biol Chem [生物化學雜誌] 278: 3466 -3473, 2003）、針對1,6-岩藻糖基轉移酶（FUT8）基因的小干擾RNA特異性的引入（Mori 等人, Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 88: 901 -908, 2004）、或β-1,4-N-乙醯葡萄糖胺轉移酶III和Golgi α-甘露醣苷酶II或有效的α-甘露醣苷酶I抑制劑、幾夫鹼（kifunensine）的共表現（Ferrara 等人, J Biol Chem  [生物化學雜誌] 281: 5032 -5036, 2006，Ferrara 等人, Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 93: 851 -861, 2006；Xhou 等, Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 99:652-65, 2008）。
與本揭露之Ig恒定區或Ig恒定區片段軛合的抗原結合結構域可具有二天線型聚糖結構，該二天線型聚糖結構之岩藻糖含量為約1%與約15%之間，例如約15%、14%、13%、12%、11% 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。可替代地，與Ig恒定區或Ig恒定區片段軛合的抗原結合結構域可具有岩藻糖含量為約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%或20%的聚糖結構。
「岩藻糖含量」係指糖鏈中Asn297處的岩藻糖單糖之含量。岩藻糖之相對量係含岩藻糖結構相對於所有糖結構之百分比。該等可以藉由多種方法表徵和量化，例如：1) 使用如國際專利公開案號WO2008/077546 2中所述之N-醣苷酶F之MALDI-TOF處理過的樣本（例如複合物，雜合物以及寡甘露糖和高甘露糖結構）； 2) 藉由酶促釋放Asn297聚糖，隨後進行衍生化，並藉由具有螢光檢測的HPLC（UPLC）和/或HPLC-MS（UPLC-MS）進行檢測/定量；3) 用或不用Endo S或在第一GlcNAc單糖和第二GlcNAc單糖之間裂解的其他酶處理Asn297聚糖，對天然或還原的mAb之完整的蛋白進行分析，使岩藻糖附接在第一GlcNAc上；4) 藉由酶消化（例如，胰蛋白酶或內肽酶Lys-C）將mAb消化成組成肽，隨後藉由HPLC-MS（UPLC-MS）進行分離、檢測和定量；5) 藉由用Asn 297 PNG酶F進行特異性酶去糖基化，將mAb寡糖從mAb蛋白中分離出來。這樣釋放出來的寡糖可以用螢光團進行標記，藉由各種互補技術進行分離和鑒定，該等技術允許：藉由基質輔助雷射脫附游離（MALDI）質譜法，將實驗質量和理論質量進行對比，對聚糖結構進行精細表徵；藉由離子交換HPLC（GlycoSep C）確定唾液酸化程度；藉由正相HPLC（GlycoSep N）根據親水性標準對寡糖形式進行分離和定量；藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光（HPCE-LIF）對寡糖進行分離和定量。
如本文所用，「低岩藻糖」或「低岩藻糖含量」係指與Ig恒定區或Ig恒定區片段軛合的抗原結合結構域，其岩藻糖含量約為1%-15%。
如本文所用的「正常岩藻糖」或「正常岩藻糖含量」係指與Ig恒定區或Ig恒定區片段軛合的抗原結合結構域，其岩藻糖含量約為50%以上，通常為約80%以上或85%以上。 多核苷酸、宿主細胞和載體
本揭露還提供了分離的多核苷酸，或編碼本揭露之任何多特異性抗體的多核苷酸之組合。該等多特異性抗體包含結合CD33的抗原結合結構域和結合Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈之抗原結合結構域。
本發明還提供了編碼任何CD33結合抗體或其片段的分離的多核苷酸。
本發明還提供了編碼SEQ ID NO: 49、51、53或55的VH的分離的多核苷酸。
本發明還提供了編碼SEQ ID NO: 50、52、54或56的VL的分離的多核苷酸。
本揭露之一些實施方式還提供了分離或純化的核酸，其包含與編碼本揭露之CD33和Vδ2結合雙特異性抗體的多核苷酸互補的多核苷酸或在嚴格條件下與編碼本揭露之CD33和Vδ2結合雙特異性抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。
在嚴格條件下雜交的多核苷酸可以在高嚴格條件下雜交。「高嚴格條件」意指多核苷酸以與非特異性雜交相比可檢測地更強的量與靶序列（本文所述之核酸中之任何一種的核苷酸序列）特異性雜交。高嚴格條件包括將具有完全互補序列的多核苷酸，或僅含有少量分散誤配的多核苷酸與偶然有幾個小區域（例如，3-12個鹼基）與核苷酸序列相匹配的隨機序列區分開來的條件。這種互補小區域比14-17個或更多鹼基的全長補體更容易融化，並且高嚴格雜交使它們易於區分。相對高嚴格條件可以包括，例如，低鹽和/或高溫度條件，如在約50°C-70°C的溫度下，由約0.02-0.1 M NaCl或等價物提供的條件。這種高嚴格條件幾乎不能容忍核苷酸序列與模板或靶鏈之間的誤配（如果有的話）。通常應理解，藉由添加增加數量的甲醯胺可以使條件更加嚴格。
本揭露之多核苷酸序列可以可操作地連接至一或多個調控元件，如啟動子或強化子，以允許核苷酸序列在預期的宿主細胞中表現。多核苷酸可為cDNA。該啟動子可為強、弱、組織特異性、可誘導的或發育特異性的啟動子。可以使用的示例性啟動子係次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白、人肌凝蛋白、人血紅素、人肌肉肌酸等。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中具有組成型功能，並且適合與所述實施方式一起使用。此類病毒啟動子包括巨細胞病毒（CMV）立即早期啟動子、SV40的早期和晚期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）啟動子、莫洛尼（Maloney）白血病毒之長末端重複序列（LTR）、人類免疫缺乏病毒（HIV）、艾司坦氏-巴爾氏病毒（Epstein Barr Virus，EBV）、勞斯肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus，RSV）、和其他反轉錄病毒、以及單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子。也可以使用可誘導的啟動子如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導的啟動子、去氧羥四環素誘導的啟動子、含有一或多個干擾素刺激的響應元件（ISRE）（如蛋白激酶R 2’,5’-寡腺苷酸合成酶）的啟動子，Mx基因、ADAR1等。
本發明還提供了包含本發明之一或多種多核苷酸之載體。本揭露還提供了包含本發明之多核苷酸之表現載體。此類載體可為質體載體、病毒載體、用於桿狀病毒表現的載體、基於轉座子的載體或任何其他適於藉由任何手段將本發明之合成多核甘酸引入給定生物體或遺傳背景的載體。編碼本揭露之CD33和Vδ2結合抗體的多核苷酸可以可操作地連接到一或多種表現載體中之控制序列，其確保CD33和Vδ2結合抗體之表現。此類調控元件可以包括轉錄啟動子、編碼合適的mRNA核糖體結合位點之序列、和控制轉錄和翻譯的終止之序列。表現載體還可以包括一或多種非轉錄元件（如複製起點）、連接至待表現的基因上的合適的啟動子和強化子、其他5’或3’側翼非轉錄序列、5’或3’非翻譯序列（如必要的核糖體結合位點）、聚腺苷酸化位點、剪接供體和接受位或轉錄終止序列。也可以併入賦予在宿主中進行複製的能力的複製起點。
表現載體可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸間鍵聯、或兩種類型的鍵聯。非天然存在的或改變的核苷酸或核苷酸間鍵聯不妨礙載體之轉錄或複製。
一且載體己經併入到適當的宿主中，則宿主在適合於高水平表現由併入的多核苷酸編碼的本揭露之CD33和Vδ2結合抗體的條件下維持。用於轉化脊椎動物細胞的表現載體中的轉錄和翻譯控制序列可由病毒源提供。示例性載體可以如Okayama和Berg, 3 Mol. Cell. Biol. [分子細胞生物學] 280 (1983) 所述構建。
本揭露之載體還可以含有一或多個內部核糖體進入位址（IRES）。將IRES序列包含在融合載體中可能有利於增強某些抗體之表現。在一些實施方式中，載體系統將包括一或多個聚腺苷酸化位點（例如，SV40），該等聚腺苷酸化位點可以在上述核酸序列中之任一個的上游或下游。載體組分可以以提供表現基因產物的最佳間隔的方式（即，藉由在ORF之間引入「間隔子」核苷酸）連續連接或排列，或以另一種方式定位。調控元件（如IRES模體）也可以排列以提供最佳表現間隔。
本揭露之載體可為環形的或線性的。它們可以製備成包含在原核或真核宿主細胞中起作用的複製系統。複製系統可以衍生自例如ColE1、SV40、2μ質體、λ、牛乳頭狀瘤病毒等。
重組表現載體可以設計用於暫態表現、穩定表現或兩者。同樣，可以製備重組表現載體用於組成型表現或用於誘導的表現。
此外，可以製備重組表現載體以包括自殺基因。如本文所用，術語「自殺基因」係指導致表現自殺基因的細胞死亡之基因。自殺基因可為賦予該基因所表現的細胞對藥劑（例如藥物）的敏感性，並在細胞接觸或暴露於該藥劑時導致細胞死亡的基因。自殺基因在本領域係已知的並且包括，例如，單純疱疹病毒（HSV）胸苷激酶（TK）基因、胞嘧啶去胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基還原酶。
載體還可以包含本領域熟知的選擇標記。選擇標記包括陽性和陰性選擇標記。標記基因包括殺生物劑抗性，例如，對抗生素、重金屬等的抗性，在營養缺陷宿主中的互補以提供原營養等。示例性標記基因包括抗生素抗性基因（例如，新黴素抗性基因、潮黴素抗性基因、康黴素抗性基因、四環素抗性基因、青黴素抗性基因、組胺醇抗性基因、組胺醇x抗性基因）、麩醯胺合酶基因、用於更昔洛韋（ganciclovir）選擇的HSV-TK、HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇的細菌嘌呤核苷磷酸化酶基因（Gadi等人, 7 Gene Ther [基因治療]. 1738-1743 (2000)）。編碼選擇標記或選殖位點的核酸序列可以在編碼目的多肽或選殖位點的核酸序列之上游或下游。
可以使用的示例性載體係細菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（斯曲傑公司（Stratagene），拉荷雅（La Jolla），加利福尼亞州，美國）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5（法瑪西亞公司（Pharmacia），烏普沙拉（Uppsala），瑞典）。真核的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG（斯曲傑公司）pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL（法瑪西亞公司）、pEE6.4（龍沙集團（Lonza））和pEE12.4（龍沙集團）。另外的載體包括pUC系列（富酶泰斯生命科學公司，葛籣一級尼，馬里蘭州）、pBluescript系列（斯曲傑公司、拉荷雅，加利福尼亞州）、pET系列（諾瓦基公司（Novagen），麥迪遜，威斯康辛州）、pGEX系列（瑪西亞生物技術公司（Pharmacia Biotech），烏普沙拉（Uppsala），瑞典）和pEX系列（Clontech公司，帕洛阿爾托（Palo Alto），加利福尼亞州）。噬菌體載體可以使用，如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII（斯曲傑公司）。示例性植物表現載體包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19（Clontech公司）。示例性動物表現載體包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo（Clontech公司）。表現載體可為病毒載體，例如，反轉錄病毒載體，例如，γ反轉錄病毒載體。
該載體可以包含 (i) 編碼SEQ ID NO: 49、51、53或54的VH之多核苷酸；(ii) 編碼SEQ ID NO: 50、52、54或56的VL之多核苷酸；(iii) 編碼SEQ ID NO: 57或58的VHH之多核苷酸；(iv) 或其任何組合。該等多核苷酸可以在相同宿主細胞中從一或多種表現載體共表現。
在一些實施方式中，載體包含編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含： a)  SEQ ID NO: 49的VH和SEQ ID NO: 50的VL； b) SEQ ID NO: 51的VH和SEQ ID NO: 52的VL； c)  SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 54的VL； d) SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 56的VL； e)  SEQ ID NO: 67-100中任一個的連接子； f)  SEQ ID NO: 130-133的ScFv； g) SEQ ID NO: 57或58的VHH； h) SEQ ID NO: 128的Fc區；或者 i)  其任何組合。
本發明還提供了宿主細胞，該宿主細胞包含本發明之一或多種載體。「宿主細胞」係指已向其中引入了載體的細胞。應當理解，術語宿主細胞不僅係指特定的受試細胞，而且係指這樣的細胞之後代，以及由特定受試細胞產生的穩定細胞系。因為由於突變或環境影響，某些修飾可能在後代中發生，所以這樣的後代可能與親本細胞不同，但仍包括在本文所用的術語「宿主細胞」之範圍內。這種宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、植物細胞或古細菌細胞。大腸桿菌（ Escherichia coli）、桿菌（如枯草芽孢桿菌、和其他腸桿菌，如沙門氏菌、沙雷氏菌（Serratia））、和各種假單胞菌物種係原核宿主細胞之實例。其他微生物（例如酵母）也可用於表現。酵母屬（例如，釀酒酵母（S. cerevisiae））和畢赤酵母屬係合適的酵母宿主細胞之實例。示例性真核細胞可為哺乳動物、昆蟲、禽或其它動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系，如融合瘤或骨髓瘤細胞系如SP2/0（美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），馬納沙斯，維吉尼亞州，CRL-1581）、NS0（歐洲細胞培養物保藏中心（European Collection of Cell Cultures，ECACC），索茲斯柏立（Salisbury），威爾特郡，英國，ECACC號85110503）、FO（ATCC CRL-1646）和Ag653（ATCC CRL-1580）鼠細胞系。示例性人骨髓瘤細胞系係U266（ATTC CRL-TIB-196）。其它有用的細胞系包括源自中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的那些，如CHO-K1SV（龍沙生物醫藥股份有限公司（Lonza Biologics），沃克斯維爾，馬里蘭州）、CHO-K1（ATCC CRL-61）或DG44。
本揭露還提供了產生本揭露之抗體之方法，該方法包括在表現K2結合蛋白的條件下培養本揭露之宿主細胞，並回收由宿主細胞產生的抗體。製備蛋白質和純化它們的方法係已知的。一經合成（化學或重組），則可以根據標準程序純化抗體，該等標準程序包括硫酸銨沈澱、親和柱、柱層析法、高效液相層析法（HPLC）純化、凝膠電泳等（一般參見Scopes, Protein Purification [蛋白質純化] (Springer-Verlag [柏林斯普林格出版社], 紐約, (1982)）。主題蛋白可為基本上純的，例如，至少約80%至85%純度、至少約85%至90%純度、至少約90%至95%純度、或至少約98%至99%、或更大純度，例如，不含除主題蛋白以外的污染物如細胞碎片、大分子等。
可以使用標準分子生物學方法將編碼本揭露之抗體的多核苷酸併入載體。使用熟知的方法進行宿主細胞轉化、培養、抗體表現和純化。因此，本發明提供了產生包含表現本發明的核苷酸的多肽之方法，該核苷酸編碼本發明之多肽。
當多肽由藉由不同核酸編碼的分離的鏈形成時，本發明提供了產生多肽之方法，該多肽包含表現本發明的核苷酸，該等核苷酸編碼本發明之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 49的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 50的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc多肽之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 51的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 52的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc多肽之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 53的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 54的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc多肽之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 55的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 56的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 58的VHH和Fc多肽之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 49的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 50的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc多肽之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 51的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 52的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc多肽之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 53的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 54的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc多肽之多肽。
本發明之第一多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 55的VH和重鏈恒定區之多肽，本發明之第二多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 56的VL和輕鏈恒定區之多肽，並且本發明之第三多核苷酸可以編碼包含SEQ ID NO: 57的VHH和Fc多肽之多肽。
修飾的核苷酸可用於產生本揭露之多核苷酸。示例性修飾的核苷酸係5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、羧甲基胺甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N 6-取代的腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷、5″-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N 6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、懷丁苷（wybutoxosine）、假尿嘧啶、辮苷（queuosine）、β-D-半乳糖基辮苷、肌苷、N 6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、和2,6-二胺基嘌呤。 醫療用途和治療方法
本揭露之分離的多特異性或雙特異性抗體可以用作藥物，特別是用於治療癌症。
適合用本發明之雙特異性CD33/δ2抗體治療的示例性癌症包括選自由以下組成之群組的血液癌症：白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴球性白血病（ALL）、彌漫型大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓性白血病（CML）、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤（DPDCN）、骨髓增生性腫瘤（MPN）、和混合表現型急性白血病。
本發明之另一個方面係如申請專利範圍中定義的多特異性或雙特異性抗體，其用於治療患有癌症的受試者之方法中，該方法包括將治療有效量的本發明之分離的雙特異性CD33/δ2抗體投與給有需要的患者足以治療癌症的時間。 投與 / 藥物組成物
本揭露提供了包含如本文揭露的多特異性或雙特異性CD33/δ2抗體和藥學上可接受的載劑或賦形劑之藥物組成物。對於治療用途，本發明之多特異性或雙特異性CD33/δ2抗體可以製備為藥物組成物，該藥物組成物含有有效量的抗體作為藥學上可接受的載劑中的活性成分。術語「載劑」係指與活性化合物一起投與的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。此類媒劑可為液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成起源的那些油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。例如，可以使用0.4%鹽水和0.3%甘胺酸。該等溶液係無菌的，通常不含顆粒物質。它們可藉由常規的熟知滅菌技術（例如過濾）進行滅菌。組成物可以根據需要包含藥學上可接受的輔助物質以接近生理條件，例如pH調節劑和緩沖劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑和著色劑等。本揭露之分子或本發明之抗體在這種藥物配製物中的濃度可以廣泛變化，即按重量計從小於約0.5%，通常到至少約1%至多達15%或20%，並且將根據選擇的特定投與方式主要基於所需的劑量、流體體積、黏性等進行選擇。包含其他人蛋白如人血清白蛋白在內的合適的媒劑和配製物描述在例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓:藥物科學與實踐], 第21版, Troy, D.B.編輯, 利平科特·威廉姆斯和威爾金斯出版社（Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia）, PA 2006, 第5部分, Pharmaceutical Manufacturing [藥物製造] 第691-1092頁 , 具體參見第958-989頁。
本發明之雙特異性CD33/δ2抗體的治療用途之投與方式可為將藥劑遞送至宿主的任何合適的途徑，例如腸胃外投與，例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮下、肺、經黏膜（口服、鼻內、陰道內、直腸），使用呈片劑、膠囊、溶液、粉末、凝膠、顆粒的配製物；以及包含在注射器、植入裝置、滲透泵、藥筒、微型泵中；或本領域熟知的熟悉該項技術者理解的其他方式。位點特異性投與可以藉由例如關節內、支氣管內、腹腔內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心內、骨內、盆腔內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、血管內、膀胱內、病灶內、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮遞送來實現。
因此，用於肌內注射的本發明之藥物組成物可以被製備成含有1 ml無菌緩衝水以及約1 ng至約100 mg/kg，例如約50 ng至約30 mg/kg或更較佳的是約5 mg至約25 mg/kg之間的本發明之雙特異性CD33/δ2抗體。
本發明之雙特異性CD33/δ2抗體可以藉由任何合適的途徑投與於患者，例如藉由靜脈內（IV）輸注或推注、肌肉內或皮下或腹膜內非腸道投與。IV輸注可以在短短15分鐘內進行，但更常見的是30分鐘、60分鐘、90分鐘甚至2、3、4、5、6或7小時。本發明之雙特異性CD33/δ2抗體也可以直接注射到疾病部位（例如，腫瘤本身）。給予患有癌症的患者之劑量足以減輕或至少部分阻止所治療的疾病（「治療有效量」）並且有時可為0.1至10 mg/kg體重，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg，但可以甚至更高，例如15、20、30、40、50、60、70、80、90或100 mg/kg。也可以給予固定的單位劑量，例如50、100、200、500或1000 mg，或者劑量可以基於患者的表面積，例如、400、300、250、200或100 mg/m 2。通常可以投與1至8個劑量（例如、1、2、3、4、5、6、7或8個）來治療癌症，但可以投與10、12、20或更多個劑量。可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間後重複投與本發明之雙特異性CD33/δ2抗體。重複的療程亦為可能的，長期投與亦為如此。重複投與可以以相同劑量或不同劑量。
例如，用於靜脈輸注的包含本發明之雙特異性CD33/δ2抗體之藥物組成物可以被製成含有約200 ml無菌林格氏液、約8 mg至約2400 mg、約400 mg至約1600 mg、或約400 mg至約800 mg的雙特異性CD33/δ2抗體用於投與給80-kg的患者。用於製備可腸胃外投與的組成物之方法係熟知的，並且更詳細地描述於例如「Remington’s Pharmaceutical Science [雷明頓藥物科學]」, 第15版, Mack Publishing Company [麥克出版公司], 賓夕法尼亞州伊斯頓中。
本發明之雙特異性CD33/δ2抗體可以冷凍乾燥用於儲存，並在使用前重構於適合的載劑中。已證明此技術對於常規蛋白質製劑係有效的，並且可以使用熟知的冷凍乾燥和重構技術。
本發明之雙特異性CD33/δ2抗體可以與第二治療劑同時、依次或分開地組合投與。第二治療劑可為化療劑或靶向抗癌療法。
雙特異性CD33/δ2抗體可以與任何一或多種化學治療藥物或熟悉該項技術者已知的其他抗癌治療劑一起投與。
當本發明之雙特異性CD33/δ2抗體與第二治療劑組合投與時，該組合可以在任何方便的時間範圍內進行。例如，雙特異性CD33/δ2抗體和第二治療劑可以在同一天，甚至在同一靜脈輸注中投與於患者。然而，雙特異性CD33/δ2抗體和第二治療劑也可以交替幾天或交替幾週、兩週或幾個月等投與。在一些方法中，雙特異性CD33/δ2抗體和第二治療劑以足夠接近的時間投與，以使它們在被治療的患者中同時以可檢測的水平存在（例如，在血清中）。在一些方法中，由一段時間內的多個劑量組成的雙特異性CD33/δ2抗體之整個療程之後或之前係同樣由多個劑量組成的第二治療劑之療程。在一些方法中，如果患者對最初投與的第二治療劑具有抗性或產生抗性，則開始用第二投與的雙特異性CD33/δ2抗體進行治療。患者可以只接受一個療程或多個療程的雙特異性CD33/δ2抗體和第二治療劑之一或兩者。在投與雙特異性CD33/δ2抗體和第二治療劑之間可以使用1、2或幾天或幾週的恢復期。當已經為第二治療劑建立了合適的治療方案時，該方案可以與本發明之雙特異性CD33/δ2抗體組合使用。
雙特異性CD33/δ2抗體，視需要與第二治療劑組合，可以與任何形式的放射療法一起投與，包括外束放射、強度調製放射療法（IMRT）和任何形式的放射外科手術，包括伽瑪刀、射波刀、直線加速器、和組織間放射（例如植入放射性種子、GliaSite球囊）和/或手術。
表3示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的JL5抗體（具有SEQ ID NO: 49的VH和SEQ ID NO: 50的VL的抗體）的CDR序列之胺基酸序列。 [ 表 3].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GASIRNYYWS （SEQ ID NO: 134） HIYSTGNIH （SEQ ID NO: 135） DNGAALFDY （SEQ ID NO: 136） SGSSSNIGSNIVN （SEQ ID NO: 137） SNNQRPS （SEQ ID NO: 138） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 139）
Kabat NYYWS （SEQ ID NO: 1） HIYSTGNIHYNPSLKS （SEQ ID NO: 2） DNGAALFDY （SEQ ID NO: 3） SGSSSNIGSNIVN （SEQ ID NO: 4） SNNQRPS （SEQ ID NO: 5） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 6）
Chothia GASIRNY （SEQ ID NO: 140） YSTGN （SEQ ID NO: 141） DNGAALFD （SEQ ID NO: 142） SSSNIGSNI （SEQ ID NO: 143） SNN （SEQ ID NO: 144） WDDSLNGP （SEQ ID NO: 145）
IMGT GASIRNYY （SEQ ID NO: 146） IYSTGNI （SEQ ID NO: 147） ARDNGAALFDY （SEQ ID NO: 148） SSNIGSNI （SEQ ID NO: 149） SNN （SEQ ID NO: 150） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 151）
Contact RNYYWS （SEQ ID NO: 152） WLGHIYSTGNIH （SEQ ID NO: 153） ARDNGAALFD （SEQ ID NO: 154） IGSNIVNWY （SEQ ID NO: 155） LLIYSNNQRP （SEQ ID NO: 156） AAWDDSLNGP （SEQ ID NO: 157）
表4示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的JL6抗體（具有SEQ ID NO: 51的VH和SEQ ID NO: 52的VL的抗體）的CDR序列之胺基酸序列。 [ 表 4].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GGSISSYYWG （SEQ ID NO: 158） YIYYSGSTN（SEQ ID NO: 159） MWEILGFDP（SEQ ID NO: 160） SGSSSNIGSNPVN（SEQ ID NO: 161） SNNQRPS（SEQ ID NO: 162） AAWDDSLNGPV（SEQ ID NO: 163）
Kabat SYYWG（SEQ ID NO: 7） YIYYSGSTNYNPSLKS（SEQ ID NO: 8） MWEILGFDP（SEQ ID NO: 9） SGSSSNIGSNPVN（SEQ ID NO: 10） SNNQRPS（SEQ ID NO: 11） AAWDDSLNGPV（SEQ ID NO: 12）
Chothia GGSISSY（SEQ ID NO: 164） YYSGS（SEQ ID NO: 165） MWEILGFD（SEQ ID NO: 166） SSSNIGSNP（SEQ ID NO: 167） SNN（SEQ ID NO: 168） WDDSLNGP（SEQ ID NO: 169）
IMGT GGSISSYY（SEQ ID NO: 170） IYYSGST（SEQ ID NO: 171） ARMWEILGFDP（SEQ ID NO: 172） SSNIGSNP（SEQ ID NO: 173） SNN（SEQ ID NO: 174） AAWDDSLNGPV（SEQ ID NO: 175）
Contact SSYYWG（SEQ ID NO: 176） WIGYIYYSGSTN（SEQ ID NO: 177） ARMWEILGFD（SEQ ID NO: 178） IGSNPVNWY（SEQ ID NO: 179） LLIYSNNQRP（SEQ ID NO: 180） AAWDDSLNGP（SEQ ID NO: 181）
表5示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的JL2抗體（具有SEQ ID NO: 53的VH和SEQ ID NO: 54的VL的抗體）的CDR序列之胺基酸序列。 [ 表 5].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GFTFSSYWMT （SEQ ID NO: 182） NIKQDGSERY （SEQ ID NO: 183） EVGYNWNQGGYFDY （SEQ ID NO: 184） RSSQSLLHSDGYNYLD （SEQ ID NO: 185） LGSYRAS （SEQ ID NO: 186） MQVLQTPWT （SEQ ID NO: 187）
Kabat SYWMT （SEQ ID NO: 13） NIKQDGSERYYVDSVKG （SEQ ID NO: 14） EVGYNWNQGGYFDY （SEQ ID NO: 15） RSSQSLLHSDGYNYLD （SEQ ID NO: 16） LGSYRAS （SEQ ID NO: 17） MQVLQTPWT （SEQ ID NO: 18）
Chothia GFTFSSY （SEQ ID NO: 188） KQDGSE （SEQ ID NO: 189） EVGYNWNQGGYFD （SEQ ID NO: 190） SQSLLHSDGYNY （SEQ ID NO: 191） LGS （SEQ ID NO: 192） VLQTPW （SEQ ID NO: 193）
IMGT GFTFSSYW （SEQ ID NO: 194） IKQDGSER （SEQ ID NO: 195） AREVGYNWNQGGYFDY （SEQ ID NO: 196） QSLLHSDGYNY （SEQ ID NO: 197） LGS （SEQ ID NO: 198） MQVLQTPWT （SEQ ID NO: 199）
Contact SSYWMT （SEQ ID NO: 200） WVANIKQDGSERY （SEQ ID NO: 201） AREVGYNWNQGGYFD （SEQ ID NO: 202） LHSDGYNYLDWY （SEQ ID NO: 203） LLIYLGSYRA （SEQ ID NO: 204） MQVLQTPW （SEQ ID NO: 205）
表6示出了根據AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系統定義的JL3抗體（具有SEQ ID NO: 55的VH和SEQ ID NO: 56的VL的抗體）的CDR序列之胺基酸序列。 [ 表 6].
HC1 HC2 HC3 LC1 LC2 LC3
AbM GGSIRNYYWS （SEQ ID NO: 206） HIFSTGHIN （SEQ ID NO: 207） DNGAALFDF （SEQ ID NO: 208） SGSSSNIGSNIVN （SEQ ID NO: 209） SDNQRPS （SEQ ID NO: 210） AAWDDSLNGPV（SEQ ID NO: 211）
Kabat NYYWS （SEQ ID NO: 19） HIFSTGHINYDSSLKS （SEQ ID NO: 20） DNGAALFDF （SEQ ID NO: 21） SGSSSNIGSNIVN （SEQ ID NO: 22） SDNQRPS （SEQ ID NO: 23） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 24）
Chothia GGSIRNY （SEQ ID NO: 212） FSTGH （SEQ ID NO: 213） DNGAALFD （SEQ ID NO: 214） SSSNIGSNI （SEQ ID NO: 215） SDN （SEQ ID NO: 216） WDDSLNGP （SEQ ID NO: 217）
IMGT GGSIRNYY （SEQ ID NO: 218） IFSTGHI （SEQ ID NO: 219） ARDNGAALFDF （SEQ ID NO: 220） SSNIGSNI （SEQ ID NO: 221） SDN （SEQ ID NO: 222） AAWDDSLNGPV （SEQ ID NO: 223）
Contact RNYYWS （SEQ ID NO: 224） WFGHIFSTGHIN （SEQ ID NO: 225） ARDNGAALFD （SEQ ID NO: 226） IGSNIVNWY （SEQ ID NO: 227） LLLYSDNQRP （SEQ ID NO: 228） AAWDDSLNGP （SEQ ID NO: 229）
儘管已經籠統地描述了本發明，但本發明之實施方式將在以下實例中進一步揭露，該等實例不應被解釋為限制申請專利範圍之範圍。 實例 實例 1. CD33 抗原生成
編碼人CD33細胞外結構域（ECD）或其子結構域的表現構建體係基於骨髓細胞表面抗原CD33（Uniprot登錄號P20138）的序列及其結構域注釋設計的，該結構域注釋具有6X His標籤序列（SEQ ID NO: 246）或作為與人血清白蛋白（HSA）（C端具有6X His標籤序列（SEQ ID NO: 246））的C34S變體之融合蛋白。基於NCBI登錄號XP_005590138.1，設計了編碼來自石蟹獼猴（cynomolgus monkey，Macaca fascicularis）的CD33（ECD）或其子結構域的相似表現構建體。產生的抗原之胺基酸序列顯示在表7中。
根據製造商之方案，使用Expifectamine將人和石蟹獼猴CD33全長ECD或子結構域表現構建體暫態轉染到HEK293衍生細胞Expi293（博科公司（Gibco）/賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific））中。在收穫前，將細胞在定軌振盪器上以8% CO 2在37°C下孵育5天。藉由離心去除表現蛋白質的細胞，並使用固定化金屬離子親和層析法（IMAC），使用Ni NTA瓊脂糖6快速（Sepharose 6 Fast Flow）樹脂（GE醫療公司（GE Healthcare））從培養基中純化帶有his標籤的可溶性CD33蛋白，隨後使用Zeba™ Spin Desalting柱（7K MWCO，10 mL；賽默科技公司，目錄號：89893），按照製造商之說明，將緩衝液交換到1X 杜氏磷酸鹽水（Dubelcco’s Phosphate Saline）緩衝液（pH 7.2，無鈣或鎂）中。 [ 表 7].CD33抗原之胺基酸序列。
蛋白 AA ID 描述 胺基酸序列
C33W1 HSA N末端融合；石蟹獼猴CD33ECD-HSA(C34S)-6xHis DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTE RTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSGSGSENLY FQGVRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPR LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELL FFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAK QRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLV TDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLK ECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC KHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCT ESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH （SEQ ID NO: 230）
C33W2 HSA N末端融合；人CD33ECD-Tev-HSA(C34S)-6xHis DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTER TIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSGSGSE NLYFQGVRSSSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSK LVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDV CKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSK CCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSE KERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHHH （SEQ ID NO: 231）
C33W3 HSA N末端融合；hCD33 Ig樣V型結構域（Uniprot P20138，V136-H259）在C末端與HSA和6xHis標籤（SEQ ID NO: 246）融合 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRN NCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTD LTHRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTV ATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVR PEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFA KRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECC EKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLV NRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIK KQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLHHHHHH （SEQ ID NO: 232）
C33W4 HSA N末端融合；hCD33 Ig樣C2型結構域（Uniprot P20138，V136-H259）在C末端與HSA和6xHis標籤（SEQ ID NO: 246）融合 VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKF GERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECC HGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHE CYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLV RYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCA EDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSA LEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGLHHHHHH （SEQ ID NO: 233）
C33W8 hCD33_Ig樣V型結構域 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRN NCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTD LTHRGSHHHHHH （SEQ ID NO: 234）
C33W9 hCD33 Ig樣C2型結構域 VHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGS HHHHHH （SEQ ID NO: 235）
C33W10 MuIgV_人IgC2嵌合體 CD33-6xHis_v1 QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTE RTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH （SEQ ID NO: 236）
C33W12 MuIgV_石蟹獼猴IgC2嵌合體 CD33-6xHis_v1 QDLEFQLVAPESVTVEEGLCVHVPCSVFYPSIKLTLGPVTGSWLRKGVSLHEDSPVATSDPRQLVQKATQGRFQLLGDPQKHDCSLFIRDAQKNDTGMYFFRVVREPFVRYSYKKSQLSLHVTSLSRTPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMS AAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTT ERTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGRKARKQGVVQGSHHHHHH （SEQ ID NO: 237）
C33W49 來自具有C末端6xHis標籤（SEQ ID NO: 246）的Uniprot P20138的人CD33 ECD（D18-H259） DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRN NCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTD LTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTER TIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGSHHHHHH （SEQ ID NO: 238）
C33W50 來自具有C末端6xHis標籤（SEQ ID NO: 246）的XP_005590138.1的石蟹獼猴CD33 ECD（D37-Q274） DPRVRLEVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPVPYHTRNSPVHGYWFREGAIVSLDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMEKGSTKYSYKSTQLSVHVTDLTHRPQILIPGALDPDHSKNLTCSVPWACEQGTPPIFSWMSAAPTSLGLRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFPGAGVTTE RTIQLNVSYASQNPRTDIFLGDGSGKQGVVQGSHHHHHH （SEQ ID NO: 239）
C33W51 來自具有6xHis標籤（SEQ ID NO: 246）的Uniprot P20138的人CD33 ECD（D18-G241） DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRN NCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTD LTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTER TIQLNVTYVPQNPTTGHHHHHH （SEQ ID NO: 240）
實例 2. 抗 CD33 x δ2 抗體之生成
如下使用Ablexis轉基因小鼠技術生成抗體。AlivaMab小鼠經過工程化以產生人/小鼠免疫球蛋白。用重組人CD33蛋白（從表7中選擇的抗原）免疫AlivaMab轉基因小鼠。從次級淋巴器官中提取淋巴球，並與FO小鼠骨髓瘤細胞系融合以產生融合瘤，或經由FACS進行單細胞分選。針對與過表現人CD33 ECD的人胎腎（HEK）細胞的結合，藉由MSD電化學發光篩選融合瘤上清液。與親本HEK細胞（陰性訊息）相比，用FACS進一步分析從篩選中鑒定出的樣本與過表現人CD33 ECD的HEK細胞（陽性訊息）的結合。使用ELISA對確認的細胞結合劑進行輕鏈同種型。藉由MSD電化學發光法篩選單細胞分選上清液與重組人CD33蛋白的結合。選擇了幾個具有所需結合特徵的命中，並進行了定序。
如下進行V區選殖。使用Smarter cDNA合成套組（kit）（Clontech公司，芒廷維尤（Mountain View），加利福尼亞州），將藉由Qiagen® RNeasy Plus Mini套組純化的RNA和B細胞裂解物用於進行cDNA合成。為了促進cDNA之合成，使用oligodT活化所有傳訊者RNA的反轉錄，然後用Smarter IIA寡核苷酸進行「5’加帽」。隨後的VH和VL片段的擴增係使用靶向Smarter IIA帽的5’引物和靶向CH1中的共識區的3’引物，使用2步PCR擴增進行的。簡而言之，每個50 μl PCR反應由20 µM的正向和反向引物混合物、25 μl的PrimeStar Max DNA聚合酶預混合物（Clontech公司）、2 μl的未純化的cDNA、以及21 μl的雙蒸餾H2O組成。循環程式開始於94°C持續3分鐘，然後係35個循環（94°C 30秒，55°C 1分鐘，68°C 1分鐘），並在72°C持續7分鐘結束。使用包含15 bp互補延伸的VL和VH第二輪引物進行第二輪PCR，該等互補延伸在它們各自的Lonza母載體（VH和VL）中「重疊」各自的區域。第二輪PCR以以下程式進行：94°C持續3 min；35個循環（94°C 30秒，55°C 1分鐘，68°C 1分鐘），並在72°C持續7分鐘結束。In-Fusion® HD選殖套組（選殖技術公司（Clonetech），美國）用於將VL基因定向選殖到Lonza huIgK或λ載體中，並將VH基因定向選殖到Lonza huIgG1載體中。為了便於In-Fusion® HD選殖，在進行In-Fusion® HD選殖之前，用選殖強化子處理PCR產物。選殖和轉化按照製造商之方案進行（Clonetech公司，美國）。對迷你製備型DNA進行Sanger定序，以確認獲得了完整的V基因片段。
按照製造商之建議，藉由用編碼蛋白質的純化質體DNA暫態轉染，在ExpiCHO-S™細胞（賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific）；沃爾珊，麻塞諸塞州，目錄號A29127）中表現抗CD33抗體。簡而言之，將ExpiCHO-S™細胞懸浮在ExpiCHO™表現培養基（賽默飛世爾科技公司，目錄號A29100）中，並置於設定在37oC，8% CO2和125 RPM的定軌振盪培養箱中。在轉染前將細胞傳代並稀釋到6.0 x 106個細胞/ml，保持細胞活力在99.0%或更高。使用ExpiFectamine™CHO轉染套組（賽默飛世爾科技公司，目錄號A29131）進行暫態轉染。對於每ml要轉染的稀釋細胞，使用0.5微克的編碼DNA的scFv Fc融合物和0.5微克的pAdVAntage DNA（普洛麥格公司（Promega），目錄號E1711），並稀釋到OptiPRO™SFM複合培養基中。將ExpiFectamine™ CHO試劑以1:4的比率（v/v，DNA:試劑）使用，並稀釋到OptiPRO™中。將稀釋的DNA和轉染試劑結合一分鐘，允許DNA/脂質複合物形成，然後將其添加到細胞中。過夜孵育後，按照製造商之標準方案，將ExpiCHO™飼料和ExpiFectamine™ CHO強化子添加至細胞。在收穫培養液之前，將細胞在37oC的定軌振盪下（125 rpm）孵育七天。將暫態轉染的ExpiCHO-S™細胞之培養上清液藉由離心（30 min，3000 rcf）澄清，然後過濾（0.2 µm PES膜，康寧；康寧公司（Corning），紐約）。
如下進行蛋白質純化。使用AKTAXpress層析系統，將過濾的細胞培養上清液載入到預先平衡的（1xDPBS，pH 7.2）MabSelect Sure蛋白A柱（GE醫療公司）上。上樣後，用10倍柱體積的1xDPBS（pH 7.2）洗滌柱。將蛋白質用10倍柱體積的0.1 M乙酸鈉（Na）（pH 3.5）洗脫。藉由添加2.5 M Tris HCl（pH 7.5）至洗脫級分體積的20%（v/v）來立即中和蛋白質級分。將峰級分合併並過濾（0.2 μm）。藉由分析型粒徑篩析HPLC（Agilent HPLC系統）評估純化的蛋白質之品質。 實例 3. 雙特異性 CD33xVδ2 抗體之生成
使用杵臼突變製備雙特異性分子，以生成與Fc融合的CD33結合劑和與Fc融合的VHH Vδ2結合劑之異二聚物。使用的結合Vδ2的VHH序列係WO 2015156673中描述的抗體6H4和抗體5D3。6H4序列如SEQ ID NO: 58所示。5D3序列如SEQ ID NO: 57所示。
結合CD33的Fab在臼Fc上，結合Vδ2的VHH在杵Fc上。CD33 VH和人CH1恒定區與Fc上的含有幾個突變L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366S/L368A/Y407V_H435R/Y436F的鉸鏈融合。將AAS突變引入兩條重鏈之Fc部分以使Fc受體緘默化。將YTE（M252Y/S254T/T256E）突變引入JL5的兩條重鏈之Fc部分以增加半衰期。結合δ2的VHH與鉸鏈和杵Fc融合，包括以下突變：C220S_L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366W。
將RF突變引入臼重鏈以幫助純化。
製備了以下Fab(CD33)xVHH(Vδ2)構建體：
CD33抗體JL5與Vδ2抗體6H4組合（JL5x6H4），對應於序列SEQ ID NO: 101、102和103。
CD33抗體JL5與Vδ2抗體5D3組合（JL5x5D3），對應於序列SEQ ID NO: 104、105和106。
CD33抗體JL6與Vδ2抗體6H4組合（JL6x6H4），對應於序列SEQ ID NO: 107、108和109；但沒有YTE突變。
CD33抗體JL6與Vδ2抗體5D3組合（JL6x5D3），對應於序列SEQ ID NO: 110、111和112；但沒有YTE突變。
CD33抗體JL2與Vδ2抗體6H4組合（JL2x6H4），對應於序列SEQ ID NO: 113、114和115；但沒有YTE突變。
CD33抗體JL2與Vδ2抗體5D3組合（JL2x5D3），對應於序列SEQ ID NO: 116、117和118；但沒有YTE突變。
CD33抗體JL3與Vδ2抗體6H4組合（JL3x6H4），對應於序列SEQ ID NO: 119、120和121；但沒有YTE突變。
CD33抗體JL3與Vδ2抗體5D3組合（JL3x5D3），對應於序列SEQ ID NO: 122、123和124；但沒有YTE突變。
該等分子在CHO細胞系中表現並藉由ProA捕獲隨後CH1親和捕獲進行純化。簡而言之，抗體最初藉由Mab Select SuRe蛋白A柱（GE醫療公司）純化。將柱用PBS（pH 7.2）平衡，並以2 mL/min的流速載入發酵上清液。上樣後，用4倍柱體積的PBS洗滌柱，隨後在30 mM乙酸鈉（pH 3.5）中洗脫。將藉由280 nm吸光度監測到的含有蛋白質峰的級分合併，並且藉由添加1% 3 M乙酸鈉將pH 9.0中和到pH 5.0。藉由CH1捕獲進一步純化抗體並在組胺酸緩衝液中洗脫。 實例 4 ：雙特異性 CD33xVδ2 抗體結合表現 CD33 的細胞和 Vγ9Vδ2 細胞介紹
測試了雙特異性CD33xVδ2抗體與表現CD33的細胞和Vγ9Vδ2細胞結合的能力。 材料與方法 細胞系
在RPMI 1640 ATCC mod（博科公司（Gibco））、10%熱滅活FBS、50 ug/ml慶大黴素和2-巰基乙醇中培養表現CD33的急性單核球白血病（AML）細胞系THP-1（ECACC，西格瑪公司（Sigma））。如前所述生成純化的Vγ9Vδ2-T細胞系（de Bruin等人(2017), Oncoimmunology [腫瘤免疫學] 7(1): e1375641）。簡而言之，將Vδ2 +-T細胞使用FITC軛合的抗Vδ2 TCR（貝克曼庫爾特公司（Beckman Coulter），殖株IMMU 389）與抗小鼠IgG微珠（美天旎生物技術公司（Miltenyi Biotec））組合從健康供體（HD）PBMC分離並且每週用由以下組成的經輻照飼養混合物培養：來自2個健康供體的PBMC、JY 細胞、IL-7（10 U/mL）、IL-15（10 ng/mL，R＆D系統公司（R＆D Systems））和植物血凝素（50 ng/ml PHA；賽默飛世爾科學公司（Thermo Fisher Scientific））。Vγ9Vδ2-T細胞系之純度維持在 ＞ 90%和 ＜ 5% CD4+。 雙特異性抗體結合
為了評估CD33結合，將THP-1細胞在4°C與濃度範圍為316 - 0.00316 nM的雙特異性抗體JL2x6H4、JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4、B21Mx6H4、JL2x5D3、JL3x5D3、JL5x5D3、JL6x5D3或B21Mx5D3孵育45-60分鐘。
為了評估Vδ2結合，將Vγ9Vδ2細胞在4°C與濃度範圍為316 - 0.00316 nM的雙特異性抗體JL2x6H4、JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4、B21Mx6H4、JL2x5D3、JL3x5D3、JL5x5D3、JL6x5D3或B21Mx5D3或與結合gp120和另一個不相關靶標的雙特異性抗體孵育45-60分鐘。
藉由與Alexa Fluor® 647軛合的F(ab’)2山羊抗人IgG抗體（H+L）（傑克遜公司）在4°C孵育30分鐘來檢測結合的雙特異性抗體。 FACS
藉由FACS Celesta（BD）測量樣本，並使用FlowJo軟體（FlowJo）分析數據。 結果
發現所有雙特異性CD33xVδ2抗體都與表現CD33的THP-1細胞結合（圖1）。正如預期的那樣，具有呼吸道合胞病毒（RSV）結合結構域（B21M）而不是CD33結合結構域的陰性對照抗體不與THP-1細胞結合。
此外，發現所有雙特異性CD33xVδ2抗體都與Vγ9Vδ2 T細胞結合（圖2）。正如預期的那樣，RSVxVδ2抗體也結合Vγ9Vδ2 T細胞，而沒有Vδ2結合結構域的陰性對照抗體不結合該等細胞。與含有5D3作為Vδ2結合結構域的雙特異性抗體相比，含有6H4作為Vδ2結合結構域的雙特異性CD33xVδ2抗體以更高的親和力結合Vγ9Vδ2 T細胞。 實例 5 ：雙特異性 CD33xVδ2 抗體可介導針對表現 CD33 的細胞之細胞毒性介紹
如實例4所述，雙特異性CD33xVδ2抗體結合表現CD33的細胞和Vγ9Vδ2-T細胞。隨後測試了雙特異性抗體是否可以誘導對表現CD33的腫瘤細胞之細胞毒性。 材料與方法 細胞系
如實例4中所述使表現CD33的THP-1細胞（靶細胞）和Vγ9Vδ2-T細胞（效應細胞）生長。 細胞毒性測定
將THP-1靶細胞用細胞跟蹤紫（CTV）標記，並在雙特異性CD33xVδ2抗體或陰性對照抗體（RSVxVδ2）存在下和Vγ9Vδ2-T效應細胞（E）以1 : 1或1 : 20（E : T）比率（2,500個效應細胞和50,000個靶細胞，比率為1 : 20）在37°C孵育。測試了從5 nM開始的九個5倍稀釋的抗體濃度系列。22和94小時後，使用7-胺基放線菌素D（7AAD）對死細胞進行染色。藉由確定CTV+ 7AAD-細胞之百分比來確定THP-1細胞殺傷。使用Prism軟體（GraphPad）藉由非線性迴歸確定EC50。 結果
測量THP-1細胞之殺傷並確定EC50。在陰性對照抗體存在下未觀察到殺傷。然而，所有雙特異性CD33xVδ2抗體都能夠介導THP-1腫瘤細胞之殺傷。通常，包含基於6H4的Vδ2結合結構域之抗體比包含基於5D3的結合結構域之抗體更有效（更低的EC50）（表8）。具有JL3或JL5CD33結合結構域的雙特異性抗體比包含JL2或JL6結構域的雙特異性抗體更有效。甚至在1 : 20的效應細胞比靶細胞的比率下，也可以看到有效的殺傷。 [ 表 8]
抗體 細胞毒性 EC50 （ pM ） E:T 1:1 - 22 小時 細胞毒性 EC50 （ pM ） E:T 1:20 - 94 小時
JL2x6H4 4 20
JL3x6H4 2.5 12
JL5x6H4 5.4 15
JL6x6H4 6.2 30
JL2x5D3 28 380*
JL3x5D3 15 77
JL5x5D3 12 45
JL6x5D3 63 560*
*估計，最高濃度沒有平臺 實例 6 ：雙特異性 CD33xVδ2 抗體相比於健康細胞優先誘導殺傷腫瘤細胞介紹
如實例5中所述，雙特異性CD33xVδ2抗體可以誘導對表現CD33的腫瘤細胞之細胞毒性。隨後測試了使用來自新鮮血液的PBMC作為效應細胞是否也可以獲得細胞毒性，以及CD33xVδ2抗體是否也誘導對健康CD33陽性CD14+細胞之細胞毒性。 材料與方法 細胞系
如實例5中所述使表現CD33的THP-1細胞（靶細胞）生長。來自健康供體志願者的經肝素處理的全血獲得自血液供應服務商Sanquin，並且用於分離周邊血單核細胞（PBMC）。使用Lymphoprep TM密度梯度離心分離PBMC。
為了確定Vγ9Vδ2-T細胞之百分比，將PBMC用PerCP-Cy5.5標記的抗CD3 mAb（博奇公司（Biolegend）殖株SK7）、PE標記的抗TCR Vγ9 mAb（博奇公司殖株B6）和FITC標記的抗TCR Vδ2 mAb（貝克曼庫爾特公司殖株IM1464）染色。使用PE-Cy7標記的抗CD14 mAb（博奇公司殖株63D3）、APC標記的抗CD33 mAb（博奇公司殖株WM53）確定THP-1和CD14+單核細胞上的CD33表現。 細胞毒性測定
將THP-1靶細胞用細胞跟蹤紫（CTV）標記，並在雙特異性CD33xVδ2抗體或陰性對照抗體（RSVxVδ2）存在下和PBMC效應細胞（E）以5 : 1（E : T）比率（250,000個效應細胞和50,000個靶細胞）在37°C孵育。測試了從5 nM開始的六個5倍稀釋的抗體濃度系列。94小時後，將細胞用PE-Cy7標記的抗CD14 mAb和7AAD染色。根據CTV+ 7AAD-細胞之百分比確定THP-1細胞殺傷，而根據CTV- CD14+ 7AAD-細胞之百分比確定單核細胞殺傷。 結果
靶細胞之殺傷如圖3所示。發現PBMC（包含總PBMC的1.84% Vγ9+Vδ2+T細胞）能夠在雙特異性CD33xVδ2抗體存在下介導THP-1腫瘤細胞之殺傷（圖A）。另一方面，健康CD14+靶細胞幾乎沒有發生裂解（圖B）。這表明雙特異性CD33xVδ2抗體相比於健康細胞優先介導殺傷腫瘤細胞。這種差異似乎不是由於THP-1靶細胞和CD14+靶細胞之間CD33表現之差異，因為與THP-1細胞相比，發現CD14+細胞上的CD33表現高約兩倍。 實例 7 ：雙特異性 CD33xVδ2 抗體誘導 Vγ9Vδ2 T 細胞增殖介紹
隨後測試了雙特異性CD33xVδ2抗體是否在CD33陽性靶細胞存在下誘導Vγ9Vδ2 T細胞增殖。 材料與方法 細胞系
如實例4中所述使表現CD33的THP-1細胞（靶細胞）生長。如實例4中所述培養來自兩個不同供體之Vγ9Vδ2 T細胞（效應細胞）。 增值測定
將THP-1靶細胞用細胞跟蹤紫（CTV）進行標記。將Vγ9Vδ2效應細胞在50 IU/mL IL-2存在下用細胞跟蹤遠紅（CTFR）進行標記。將靶細胞和效應細胞在37°C、5% CO 2（200 ul/孔）下以1:20的效應細胞比靶細胞的比率（50,000個靶細胞，2,500個效應細胞）在1 nM雙特異性抗體存在下共同孵育。123計數eBeads™計數珠（英傑公司（Invitrogen））用於評估第0天、第1天、第4天、第7天、第11天和第14天的細胞數。 結果
Vγ9Vδ2效應細胞之增殖如圖4所示。發現所有雙特異性CD33xVδ2抗體都能夠誘導來自兩個不同供體之Vγ9Vδ2效應細胞之增殖。在雙特異性RSVxVδ2抗體存在下未觀察到增殖，表明增殖依賴於靶細胞之存在。 實例 8 ：雙特異性 scFv CD33xVδ2 抗體可介導針對表現 CD33 的細胞之細胞毒性介紹
當CD33結合臂以scFv形式提供時，測試了雙特異性抗體是否可以誘導對表現CD33的腫瘤細胞之細胞毒性。 材料與方法 細胞系
如實例5所述使來自兩個不同供體（供體104和供體156）的表現CD33的THP-1細胞（靶細胞）和Vγ9Vδ2-T細胞（效應細胞）生長。 scFv-VHH 雙特異性分子之產生
scFv-VHH雙特異性分子如下生成：使用scFv (VL-L-VH)-L-VHH的固定設計，其中在VL和VH之間具有「鳥」連接子，在scFv和VHH之間具有固定的短5胺基酸連接子（GGGGS（SEQ ID NO: 100）），以及在C末端蛋白質具有C-標籤。雙特異性scFv VHH分子之胺基酸序列被逆翻譯為cDNA，然後進行密碼子優化以在人細胞中表現。添加了調控元件：N-末端科札克序列和C-末端終止密碼子，並且cDNA被製成合成基因。將cDNA選殖到合適的載體中並驗證其序列。藉由在HEK293_E細胞中暫態轉染所得質體來進行蛋白質之表現。藉由C-標籤親和層析和凝膠過濾從培養上清液純化蛋白質。
SEQ ID. 碼 描述 序列
54 JL2 VL JL2之輕鏈可變區 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQVLQTPWTFGQGTKVEIK
67 鳥連接子 GGSEGKSSGSGSESKSTGGS
53 JL2 VH JL2之重鏈可變區 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSERYYVDSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVGYNWNQGGYFDYWGQGTLVTVSS
100 G4S連接子 連接子 GGGGS
58 6H4 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYGMGWFRQAPGKKREFVAGISWSGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAVFSGAETAYYPSDDYDYWGQGTQVTVSS
245 C-標籤 標籤 AAAEPEA
56 JL3 VL JL3之輕鏈可變區 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLLYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGTGTKVTVL
55 JL3 VH JL3之重鏈可變區 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIRNYYWSWIRQSAGKELEWFGHIFSTGHINYDSSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDFWGQGTLVTVSS
50 JL5 VL JL5之輕鏈可變區 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNIVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRVSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGPGTKVTVL
49 JL5 VH JL5之重鏈可變區 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASIRNYYWSWIRQTAGKGLEWLGHIYSTGNIHYNPSLKSRVTMSVDTSNNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARDNGAALFDYWGQGTLVTVSS
52 JL6 VL JL6之輕鏈可變區 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNPVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL
51 JL6 VH JL6之重鏈可變區 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMWEILGFDPWGQGTLVTVSS
57 5D3 VHH EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSNYAMGWFRQAPGKEREFVTVISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQFSGASTVVAGTALDYDYWGQGTRVTVSS
241 JL1 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCEASGFTFSVSAIHWVRQASGKGLEWIGRIRSKGNSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMDSLKTEDTAVYYCTRHNDKWNYYGLDVWGQGTTVTVSS
242 JL1 VL DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLFSNGYKFLDWYLQRPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQALQTPPTFGGGTKVEIK
243 JL4 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVASIKRDGSDKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMHSLRAEDTAVYYCAKGEFDYWGQGTLVTVSS
244 JL4 VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVAVYYCLQGTHWPWTFGQGTKVEIK
細胞毒性測定
將THP-1靶細胞用細胞跟蹤紫（CTV）標記，並在雙特異性CD33xVδ2抗體或陰性對照抗體（RSVxVδ2）存在下和Vγ9Vδ2-T效應細胞（E）以1 : 1（E : T）比率（50,000個效應細胞和50,000個靶細胞）在37°C孵育。測試了從3.16 nM開始的10個半對數稀釋的抗體濃度系列。24小時後，藉由使用流動式細胞分析術確定7AAD- CTV+細胞之百分比來確定THP-1細胞殺傷。 結果
測量THP-1細胞之殺傷並確定EC50值。在陰性對照抗體存在下未觀察到殺傷。所有雙特異性scFv CD33xVδ2抗體都能夠介導THP-1腫瘤細胞之殺傷。
抗體 細胞毒性 EC50 （ nM ） 供體 104 細胞毒性 EC50 （ nM ） 供體 156
JL1x6H4 0.011 0.0098
JL2x6H4 0.00097* 0.00077*
JL3x6H4 0.00079* 0.00099*
JL4x6H4 0.00040* 0.00035*
JL5x6H4 0.0013* 0.0019*
JL6x6H4 0.0012 0.0013
JL1x5D3 0.61# 0.43#
JL2x5D3 0.0027 0.0019*
JL3x5D3 0.0013* 0.0008*
JL4x5D3 0.027# 0.023
JL5x5D3 0.00093* 0.0007*
JL6x5D3 0.0044 0.0029
*#估計，最高或最低濃度沒有平臺
無
[ 圖 1] ： CD33xVδ2 雙特異性抗體與表現 CD33 的細胞結合。THP-1細胞與不同濃度的CD33xVδ2雙特異性抗體或陰性對照抗體（RSV(B21M)xVδ2雙特異性抗體）一起孵育。藉由FACS使用Alexa Fluor® 647軛合的F(ab’)2山羊抗人IgG（H+L）（傑克遜公司（Jackson））檢測結合。(A) CD33xVδ2雙特異性抗體，含有JL2、JL3、JL5或JL6作為CD33結合結構域和6H4作為Vδ2結合結構域。(B) CD33xVδ2雙特異性抗體，含有JL2、JL3、JL5或JL6作為CD33結合結構域和5D3作為Vδ2結合結構域。
[ 圖 2] ： CD33xVδ2 雙特異性抗體與 Vγ9Vδ2 T 細胞結合。從健康供體中分離和擴增的多株Vγ9Vδ2 T細胞與不同濃度的CD33xVδ2雙特異性抗體、RSV(B21M)xVδ2雙特異性抗體或陰性對照抗體（LAVA-188，針對兩個不相關靶標的雙特異性抗體）一起孵育。藉由FACS使用Alexa Fluor® 647軛合的F(ab’)2山羊抗人IgG（H+L）（傑克遜公司（Jackson））檢測結合。(A) CD33xVδ2雙特異性抗體，含有JL2、JL3、JL5或JL6作為CD33結合結構域和6H4作為Vδ2結合結構域和LAVA-188。(B) CD33xVδ2雙特異性抗體，含有JL2、JL3、JL5或JL6作為CD33結合結構域和5D3作為Vδ2結合結構域和LAVA-188。
[ 圖 3] ： CD33xVδ2 雙特異性抗體比健康 CD14+ 細胞優先介導腫瘤細胞殺傷。THP-1靶細胞（分圖A）或CD14+靶細胞（分圖B）與不同濃度的CD33xVδ2雙特異性抗體（JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4或JL5x5D3）或陰性對照抗體（RSV(B21M)x6H4或RSV(B21M)x5D3）一起孵育。以5 : 1的效應細胞比靶細胞的比率添加供體PBMC（效應細胞），並在孵育後確定特異性裂解。
[ 圖 4] ： CD33xVδ2 雙特異性抗體誘導 Vγ9Vδ2 T 細胞增殖。Vγ9Vδ2 T細胞（效應細胞）和THP-1細胞（靶細胞）與1 nM CD33xVδ2雙特異性抗體（JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4或JL5x5D3）以1 : 20的效應細胞比靶細胞的比率一起孵育。在孵育1、4、7、11和14天後確定Vγ9Vδ2 T細胞數量之增加倍數。分圖A和B代表來自兩個不同供體之Vγ9Vδ2 T細胞。陰性對照係抗體RSV(B21M)x6H4和RSV(B21M)x5D3及培養基。
無
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Claims (27)

  1. 一種分離的多特異性抗體，其包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區和能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區； 其中該第一抗原結合區包含以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： a)  分別地，SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6； a)  分別地，SEQ ID NO: 7、8、9、10、11和12； d) 分別地，SEQ ID NO: 13、14、15、16、17和18；或者 e)  分別地，SEQ ID NO: 19、20、21、22、23和24；並且 其中該第二抗原結合區結合該Vγ9Vδ2 T細胞受體之Vδ2鏈。
  2. 如請求項1所述之分離的多特異性抗體，其中該第二抗原結合區係單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CDR3： a)  分別地，SEQ ID NO: 28、29和30； b) 分別地，SEQ ID NO: 25、26和27； c)  分別地，SEQ ID NO: 31、32和33； d) 分別地，SEQ ID NO: 34、35和36； e)  分別地，SEQ ID NO: 37、38和39； f)  分別地，SEQ ID NO: 40、41和42； g) 分別地，SEQ ID NO: 43、44和45；或者 h) 分別地，SEQ ID NO: 46、47和48。
  3. 如請求項2所述之分離的多特異性抗體，其中該第一抗原結合區包含分別係SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  4. 如請求項2所述之分離的多特異性抗體，其中該第一抗原結合區包含分別係SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且該第二抗原結合區係單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CDR3：分別地，SEQ ID NO: 28、29和30。
  5. 如請求項2所述之分離的多特異性抗體，其中該第一抗原結合區包含分別係SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且該第二抗原結合區係單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CD3：分別地，SEQ ID NO: 25、26和27。
  6. 如請求項1所述之分離的多特異性抗體，其中該第二抗原結合區係單結構域抗體並且包含以下的CDR1、CDR2和CD3：分別地，SEQ ID NO: 28、29和30。
  7. 如前述請求項中任一項所述之分離的多特異性抗體，其包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區和能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體之第二抗原結合區； 其中該第一抗原結合區包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 51的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 52的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 49的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 50的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 53的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 54的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； e) 與SEQ ID NO: 55的VH序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列，以及與SEQ ID NO: 56的VL序列具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列；或者 並且 其中該第二抗原結合區包含以下或由以下組成： a) 與SEQ ID NO: 58具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； b) 與SEQ ID NO: 57具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； c) 與SEQ ID NO: 59具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； d) 與SEQ ID NO: 60具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； e) 與SEQ ID NO: 61具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； f) 與SEQ ID NO: 62具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； g) 與SEQ ID NO: 63具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； h) 與SEQ ID NO: 64具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列； i) 與SEQ ID NO: 65具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列；或者 j) 與SEQ ID NO: 66具有至少90%、92%、94%、96%、98%或100%序列同一性之序列。
  8. 如請求項1所述之分離的多特異性抗體，其中 a) 該分離的多特異性抗體包含Fab、scFv、(scFv) 2、Fv、F(ab’) 2或Fd，其中所述Fab、scFv、(scFv) 2、Fv、F(ab’) 2或Fd包含能夠結合人CD33之第一抗原結合區，或 b) 該分離的多特異性抗體包含： - 含有能夠結合人CD33的該第一抗原結合區的Fab，和 - 含有能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體的該第二抗原結合區之單結構域抗體；或 c) 該分離的多特異性抗體包含： - 含有能夠結合人CD33的該第一抗原結合區的scFv，和 - 含有能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體的該第二抗原結合區之單結構域抗體。
  9. 如請求項8所述之分離的多特異性抗體，其中該分離的多特異性抗體包含：含有能夠結合人CD33的該第一抗原結合區的scFv和含有能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體的該第二抗原結合區的VHH，並且其中該scFv包含肽連接子，該肽連接子視需要地選自SEQ ID NO: 67至99所示的連接子之群組。
  10. 如前述請求項中任一項所述之分離的多特異性抗體，其中該第一抗原結合區和第二抗原結合區直接或藉由肽連接子間接共價連接；視需要地，其中該肽連接子係SEQ ID NO: 100中所示的連接子。
  11. 如請求項10所述之分離的多特異性抗體，其中該第一抗原結合區位於該第二抗原結合區之N末端。
  12. 如前述請求項中任一項所述之分離的多特異性抗體，其進一步包含由第一Fc多肽和第二Fc多肽組成的Fc區。
  13. 如請求項1至8中任一項所述之分離的多特異性抗體，其中該分離的多特異性抗體包含：含有能夠結合人CD33的該第一抗原結合區的Fab、含有能夠結合人Vγ9Vδ2 T細胞受體的該第二抗原結合區的VHH，並且其中該分離的多特異性抗體包含Fc區。
  14. 如前述請求項中任一項所述之分離的多特異性抗體，其包含選自由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型組成之群組的Ig恒定區或其片段。
  15. 如請求項12至14中任一項所述之分離的多特異性抗體，其中該Fc區係惰性的。
  16. 如請求項15所述之分離的多特異性抗體，其中在該第一和第二Fc多肽之一或兩者中的該Fc區包含在對應於234的位置處的Ala，在對應於235的位置處的Ala，以及在對應於265的位置處的Ser，其中編號係根據Eu。
  17. 如請求項12至16中任一項所述之分離的多特異性抗體，其中該第一Fc多肽包含在對應於366的位置處的Trp並且該第二Fc多肽包含在對應於366的位置處的Ser、在對應於368的位置處的Ala和在對應於407的位置處的Val，或反之亦然，其中編號係根據Eu。
  18. 如請求項12至17中任一項所述之分離的多特異性抗體，其中該第一和第二Fc多肽之一或兩者中的該Fc區包含在對應於252的位置處的Tyr、在對應於254的位置處的Thr和在對應於256的位置處的Glu，其中編號係根據Eu。
  19. 如請求項12至18中任一項所述之分離的多特異性抗體，其中在該第一和第二Fc多肽之一中的該Fc區包含在對應於435的位置處的Arg和在對應於436的位置處的Phe，其中編號係根據Eu。
  20. 如前述請求項中任一項所述之分離的多特異性抗體，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
  21. 如前述請求項中任一項所述之分離的多特異性抗體，其包含： a) SEQ ID NO: 101、102和103所示的多肽； b) SEQ ID NO: 104、105和106所示的多肽； c) SEQ ID NO: 107、108和109所示的多肽； d) SEQ ID NO: 110、111和112所示的多肽； e) SEQ ID NO: 113、114和115所示的多肽； f) SEQ ID NO: 116、117和118所示的多肽； g) SEQ ID NO: 119、120和121所示的多肽；或 h) SEQ ID NO: 122、123和124所示的多肽。
  22. 一種藥物組成物，其包含如請求項1-21中任一項所述之分離的多特異性抗體和藥學上可接受的載劑。
  23. 如請求項1-21中任一項所述之分離的多特異性抗體，用作藥物。
  24. 如請求項1-21中任一項所述之分離的多特異性抗體，用於治療血液癌症；視需要地，其中該血液癌症選自由以下組成之群組：白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病（AML）、骨髓發育不良症候群（MDS）、急性淋巴球性白血病（ALL）、彌漫型大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性骨髓性白血病（CML）、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤（DPDCN）、骨髓增生性腫瘤（MPN）、和混合表現型急性白血病。
  25. 一種核酸構建體或核酸構建體組合，該核酸構建體或核酸構建體組合編碼如請求項1-21中任一項所述之多特異性抗體。
  26. 一種包含如請求項25所述之核酸構建體或核酸構建體組合之表現載體。
  27. 一種分離的宿主細胞，其包含如請求項25所述之核酸構建體或核酸構建體組合或如請求項26所述之表現載體。
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