CN117999286A - 用于治疗癌症的CD33 x Vδ2多特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多特异性抗体和包含所述抗体的药物组合物、制备所述抗体的方法和所述抗体靶向CD33的用途以及它们在治疗疾病例如癌症中的用途。

Description

用于治疗癌症的CD33 x Vδ2多特异性抗体

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2022年3月8日，名为SEQLTXT-1.txt，大小为212千字节。

技术领域

本发明涉及多特异性抗体和包含所述抗体的药物组合物、制备所述抗体的方法和所述抗体靶向CD33的用途以及它们在治疗疾病例如癌症中的用途。

背景技术

由于急性髓系白血病(AML)母细胞的异质性和缺乏AML特异性抗原，AML的靶向免疫疗法仍然是一项重大的临床挑战。几种针对CD33的免疫疗法目前正在进行AML的1期或2期临床试验，例如CD33xCD3 T细胞重定向分子和多种自体或同种异体CART或NK细胞疗法。

Vγ9Vδ2T细胞代表了有意义的T细胞亚群，可用于探索肿瘤细胞免疫疗法。它们占循环T细胞群的1％-5％，并且在广泛的癌症集中普遍存在，它们的浸润与突变负荷无关。这些T细胞感知靶细胞上的嗜乳脂蛋白(BTN)配体家族中磷酸抗原介导的构象变化，并有效地杀伤这些细胞。Vγ9Vδ2T细胞受PDL1对肿瘤细胞抑制的影响较小，并且Vγ9Vδ2T细胞群不含Treg。这是有关系的，因为Treg被CD3双特异性T细胞接合剂激活已证明会限制后者的活性。此外，磷酸抗原激活的嗜乳脂蛋白(BTN3A，CD227)的差异表达可能有助于γδT细胞对癌细胞的抗肿瘤活性高于正常细胞。

发明内容

本发明的目的是提供能够进行CD33依赖性γδT细胞重定向的多特异性或双特异性抗体。

本发明的目的是提供由与高亲和力或低亲和力Vδ2结合剂配对的不同CD33结合剂构成的多特异性或双特异性抗体。

本发明的目的是提供与Vγ9Vδ2T细胞联合对CD33+癌细胞和原发性AML母细胞具有细胞毒性的多特异性或双特异性抗体。

本发明的目的是提供在不同细胞系中诱导有效和选择性T细胞介导的细胞毒性的多特异性或双特异性抗体。

本发明的目的是提供与现有疗法相比在安全性和功效方面具有优势的多特异性或双特异性抗体。

本发明的目的是提供诱导Vγ9Vδ2T细胞的靶依赖性脱粒、激活和增殖的多特异性或双特异性抗体。

本发明的目的是提供显示相比于健康CD14+细胞(单核细胞)优先杀伤THP-1癌细胞的多特异性或双特异性抗体。

附图说明

图1：CD33xVδ2双特异性抗体与表达CD33的细胞结合。THP-1细胞与不同浓度的CD33xVδ2双特异性抗体或阴性对照抗体(RSV(B21M)xVδ2双特异性抗体)一起孵育。通过FACS使用Alexa647缀合的F(ab')2山羊抗人IgG(H+L)(杰克逊公司(Jackson))检测结合。(A)CD33xVδ2双特异性抗体，含有JL2、JL3、JL5或JL6作为CD33结合结构域和6H4作为Vδ2结合结构域。(B)CD33xVδ2双特异性抗体，含有JL2、JL3、JL5或JL6作为CD33结合结构域和5D3作为Vδ2结合结构域。

图2：CD33xVδ2双特异性抗体与Vγ9Vδ2T细胞结合。从健康供体中分离和扩增的多克隆Vγ9Vδ2T细胞与不同浓度的CD33xVδ2双特异性抗体、RSV(B21M)xVδ2双特异性抗体或阴性对照抗体(LAVA-188，针对两个不相关靶标的双特异性抗体)一起孵育。通过FACS使用Alexa647缀合的F(ab')2山羊抗人IgG(H+L)(杰克逊公司(Jackson))检测结合。(A)CD33xVδ2双特异性抗体，含有JL2、JL3、JL5或JL6作为CD33结合结构域和6H4作为Vδ2结合结构域和LAVA-188。(B)CD33xVδ2双特异性抗体，含有JL2、JL3、JL5或JL6作为CD33结合结构域和5D3作为Vδ2结合结构域和LAVA-188。

图3：CD33xVδ2双特异性抗体比健康CD14+细胞优先介导肿瘤细胞的杀伤。THP-1靶细胞(分图A)或CD14+靶细胞(分图B)与不同浓度的CD33xVδ2双特异性抗体(JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4或JL5x5D3)或阴性对照抗体(RSV(B21M)x6H4或RSV(B21M)x5D3)一起孵育。以5:1的效应细胞比靶细胞的比率添加供体PBMC(效应细胞)，并在孵育后确定特异性裂解。

图4：CD33xVδ2双特异性抗体诱导Vγ9Vδ2T细胞的增殖。Vγ9Vδ2T细胞(效应细胞)和THP-1细胞(靶细胞)与1nM CD33xVδ2双特异性抗体(JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4或JL5x5D3)以1:20的效应细胞比靶细胞的比率一起孵育。在孵育1、4、7、11和14天后确定Vγ9Vδ2T细胞数量的增加倍数。分图A和B代表来自两个不同供体的Vγ9Vδ2T细胞。阴性对照是抗体RSV(B21M)x6H4和RSV(B21M)x5D3及培养基。

具体实施方式

定义

术语“第一”和“第二”抗原结合区在本文中使用时不是指它们在抗体中的取向/位置，即它们对于N-或C-末端没有意义。在权利要求和说明书中术语“第一”和“第二”仅用于正确和一致地指两个不同抗原结合区。

术语“CD33”在本文中使用时是指人CD33，其序列在UniProtKB-P20138中示出。

术语“人Vδ2”在本文中使用时是指Vγ9Vδ2-T细胞受体(TCR)的重排的δ2链。基因库：CAA51166.1，给出了δ2序列的示例。TRDV2，T细胞受体δ可变2，代表可变区(UniProtKB-A0JD36(A0JD36_人)给出了TRDV2序列的示例)。“结合Vγ9Vδ2-TCR的Vδ2链”是指抗体可以结合作为单独的分子和/或作为Vγ9Vδ2-TCR(T细胞受体)的一部分的δ2链。然而，抗体不会与作为单独分子的γ9链结合。

术语“人Vγ9”在本文中使用时是指Vγ9Vδ2-T细胞受体(TCR)的重排的γ9链。基因库：NG_001336.2，给出了γ9序列的示例。TRGV9，T细胞受体γ可变9，代表可变区(UniProtKB-Q99603_人给出了TRGV9序列的示例)。

免疫球蛋白的Fc(可结晶片段)区定义为抗体的片段，其通常在用木瓜蛋白酶消化抗体后产生，包括免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区。抗体重链的恒定结构域定义了抗体同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。Fc区介导抗体的与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统蛋白质的效应子功能。

如本文所用，术语“铰链区”旨在指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人IgG1抗体的铰链区对应于根据EU编号的氨基酸216-230。

如本文所用，术语“CH2区”或“CH2结构域”意指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于根据EU编号的氨基酸231-340。然而，CH2区也可以属于本文所述的任何其他抗体同种型。

如本文所用，术语“CH3区”或“CH3结构域”意指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如人IgG1抗体的CH3区对应于根据EU编号的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以属于本文所述的任何其他抗体同种型。

然而，在一些实施方案中，抗体的Fc区已被修饰为惰性；“惰性”是指具有最小能力或没有能力结合任何Fcγ受体、诱导Fc介导的FcR交联或通过单个抗体的两个Fc区诱导FcR介导的靶抗原交联。此外，惰性Fc区可能无法结合C1q。

如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白(亚)类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、IgM或其任何同种异型，例如下表2的那些同种异型)。每个重链同种型可以与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。本发明的抗体可以具有任何同种型。

在本发明的上下文中，“竞争(competition)”或“能够竞争(able to compete)”或“竞争(competes)”是指在结合特定结合配偶体(例如，靶标)的另一个分子(例如，结合相同靶标的不同抗体)存在下，特定结合分子(例如，抗体)结合特定该结合配偶体的倾向的任何可检测到的显著降低。典型地，竞争意指如通过例如ELISA分析或流式细胞术使用足量的两种或更多种竞争分子(例如抗体)确定的由于存在另一个分子(例如作为抗体)而引起的在结合方面减少至少约25％，例如至少约50％，例如至少约75％，例如至少90％。通过竞争性抑制确定结合特异性的方法可以例如在以下中找到：Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology,Greene PublishingAssoc,and Wiley InterScience N.Y.,(1992,1993)，以及Muller,Meth.Enzymol.92,589-601(1983))。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。

过渡术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”旨在暗示它们在专利用语中的公认含义；即，(i)“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，并且是包括端值在内或末端开放的，并且不排除附加的、未列出的要素或方法步骤；(ii)“由……组成”排除权利要求书未指定的任何要素、步骤或成分；以及(iii)“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及本质上不影响受权利要求书保护的发明的基本及新颖特征的材料或步骤”。还提供了以短语“包括”(或其等同形式)描述的实施方案，如以“由……组成”和“基本上由……组成”独立描述的那些实施方案。

“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于该值是如何测量或测定的，即测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施方案或说明书其他地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内或多至5％的范围(取较大者)。

“活化”或“刺激”或“活化的”“刺激的”是指诱导细胞的生物状态的变化，从而导致活化标志物的表达、细胞因子产生、增殖或介导靶细胞的细胞毒性。细胞可以受主要刺激信号活化。共刺激信号可以放大初级信号的幅度并阻抑初始刺激后的细胞死亡，从而产生更持久的活化状态并因此产生更高的细胞毒性能力。

“替代支架”是指包含与高构象耐受性可变结构域相关的结构化核心的单链蛋白质框架。可变结构域耐受待引入的变化而会不损害支架完整性，因此可工程化和选择可变结构域以与特异性抗原结合。

“抗原”是指能够由抗原结合结构域或能够介导免疫应答的T细胞受体结合的任何分子(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、它们的部分或它们的组合)。示例性免疫应答包括抗体产生和免疫细胞诸如T细胞、B细胞或NK细胞的活化。抗原可以是基因表达的、合成的或从生物样本(诸如组织样本、肿瘤样本、细胞或具有其他生物组分的流体、生物体、蛋白质/抗原的亚基、杀伤或灭活的全细胞或裂解物)中纯化的。

“抗原结合区”或“抗原结合结构域”或“抗原结合位点”是指抗体的结合抗原的部分。抗原结合区可以是合成的、酶促获得的或基因工程化的多肽，并且包括结合抗原的免疫球蛋白的部分，如VH、VL、VH和VL、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd和Fv片段、由一个VH结构域或一个VL结构域组成的单结构域抗体(dAb)、鲨鱼可变IgNAR结构域、骆驼化VH结构域、VHH结构域、由模拟抗体的CDR的氨基酸残基组成的最小识别单元，如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和LCDR1、LCDR2和/或LCDR3、结合抗原的替代支架，和包含该抗原结合区的多特异性蛋白质。抗原结合结构域(如VH和VL)可以经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单个抗体设计，其中VH/VL结构域可以在分子内或在分子间配对(VH和VL结构域由分开的单链表达的那些情况下)，以形成单价抗原结合结构域，如单链Fv(scFv)或双抗体。抗原结合区也可以与其他抗体、蛋白质、抗原结合片段或替代支架缀合，这些抗体、蛋白质、抗原结合片段或替代支架缀合可以是单特异性或多特异性的，以对双特异性和多特异性蛋白质进行工程化。

“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)构成)构成。轻链，如果存在的话，由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。VH或VL由三个CDR片段和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。

“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的分子(诸如抗体)。双特异性分子可能与其他相关抗原(例如与来自其他物种(同源物)，如人、猴或猿，例如食蟹猴(Macacafascicularis，cynomolgus monkey，cyno)或黑猩猩(Pantroglodytes)的相同抗原)具有交叉反应性，或可以结合两个或更多个不同的抗原之间共享的表位。

不同类别的双特异性抗体的示例包括但不限于(i)具有互补CH3结构域以促成异二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双重靶向分子，其中分子的两侧各含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体融合至额外的Fab片段或Fab片段的部分；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，融合到重链恒定结构域、Fc区或其部分；和(vi)基于scFv和双抗体的抗体和重链抗体(例如结构域抗体，)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体，/>)融合到彼此或与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合的其他或另一种蛋白质或载剂分子。

具有互补CH3结构域分子的IgG样分子的示例包括但不限于(TrionPharma/Fresenius Biotech)、杵臼结构(Knobs-into-Holes)(Genentech)、CrossMAb(Roche)和静电匹配的(Amgen,Chugai,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech，Wranik等人，J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012Nov 1)、DIG-体和PIG-体(Pharmabcine，WO2010134666、WO2014081202)、链交换工程化结构域体(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonics(Merus，WO2013157953)、FcΔAdp(Regeneron)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck)、mAb-Fv(Xencor)、二价双特异性抗体(Roche，WO2009080254)和/>分子(Genmab)。

重组IgG样双重靶向分子的示例包括但不限于双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis，WO2009058383)、二合一抗体(Genentech，Bostrom等人，2009.Science 323，1610-1614)，交联的Mab(Karmanos Cancer Center)，mAb2(F-Star)，Zybodies^TM(Zyngenia，LaFleur等人，MAbs.2013年3月-4月；5(2):208-18)，利用常见轻链的方法、κλBodies(NovImmune，WO2012023053)和(CovX/Pfizer,Doppalapudi,V.R.等人，2007，Bioorg.Med.Chem.Lett.17,501-506)。

IgG融合分子的示例包括但不限于双可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、双结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis)、IgG样双特异性(ImClone/Eli Lilly，Lewis等人，NatBiotechnol.2014年2月；32(2):191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ，Dimasi等人，JMolBiol.2009年10月30日；393(3):672-92)和BSab(Zymogenetics，WO2010111625)、HERCULES(BiogenIdec)、scFv融合体(Novartis)、scFv融合体(Changzhou Adam Biotech Inc)和TvAb(Roche)。

Fc融合分子的示例包括但不限于scFv/Fc融合体(Academic Institution，Pearce等人，Biochem Mol Biol Int.，1997年9月；42(6):1179)、SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion，Blankenship JW等人，AACR 2009年第100届年会(摘要#5465)；Zymogenetics/BMS，WO2010111625)、双重亲和重靶向技术(Fc-DARTTM)(MacroGenics)和双重(scFv)2-Fab(National Research Center for Antibody Medicine-China)。

Fab融合双特异性抗体的示例包括但不限于F(ab)₂(美达瑞公司(Medarex)/美商安进公司(AMGEN))、双重作用或双-Fab(基因技术公司)、对接锁定(DNL)(免疫医疗公司(ImmunoMedics))、二价双特异性(Biotecnol公司)和Fab-Fv(优时比制药公司(UCB-Celltech))。

基于scFv的双抗体和结构域抗体的示例包括但不限于双特异性T细胞接合剂(Micromet公司、串联双抗体(Tandab)(Affimed公司)、双重亲和力重靶向技术(DARTTM)(宏基因公司)、单链双抗体(学术(Academic),Lawrence FEBS Lett.[FEBS快报]1998年4月3日；425(3):479-84)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)，人血清白蛋白scFv融合体(Merrimack，WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech，Zhu等人，Immunol CellBiol.2010年8月；88(6):667-75)、双重靶向/>(Ablynx，Hmila等人，FASEBJ.2010)、双重靶向仅重链结构域抗体。本发明的多特异性抗体可以是VHH-Fc形式，即该抗体包含两个或更多个通过人Fc区二聚体彼此连接的单结构域抗原结合区。在这种形式中，每个单结构域抗原结合区与Fc区多肽融合，两个融合多肽通过铰链区中的二硫键形成二聚双特异性抗体。此类构建体通常不包含完整的或任何CH1或轻链序列。WO06064136的图12B提供了这种形式的示例的图示。

双特异性抗体也可以是混合形式。例如，一个抗原结合区可以是Fab或scFv形式，而另一个抗原结合区可以由单结构域抗体构成或由单结构域抗体组成。这样的构建体可以另外包含Fc区并且其通过铰链区连接Fc多肽。

“互补决定区”(CDR)是结合抗原的抗体区。VH中有三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和VL中有三个CDR(如果存在)(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可使用各种描绘来定义，诸如Kabat(Wu等人，(1970)J Exp Med 132:211-50；Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia等人，(1987)JMolBiol 196:901-17)、IMGT(Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)、AbM(Martin和Thornton J Gap Biol263:800-15，1996)或Contact，其基于对可获得的复杂晶体结构的分析(MacCallum,R.M.,Martin,A.C.R.和Thornton,J.T.“Antibody-antigen interactions:Contact analysisandbinding site topography”J.Mol.Biol.262:732-745)。描述了各种描绘和可变区编号之间的对应关系(参见例如Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol,27:55-77；Honegger和Pluckthun，J Mol Biol(2001)309:657-70；国际免疫遗传学(IMGT)数据库；网络资源，www.imgt.org)。可用程序(诸如UCL Business PLC的abYsis)可用于描绘CDR。如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括通过supra、Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact描述的方法中的任一种定义的CDR，除非说明书中另有明确说明。具有SEQ ID NO.1至48的序列的CDR根据Kabat(同上)定义。

“表达载体”是指可用于生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。

“单结构域抗体”、“dAb”、“VHH”或“dAb片段”是指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature[自然]341:544546(1989))。本发明的第二抗原结合区可以是单结构域抗体。单结构域抗体(sdAb，也称为或VHH)是技术人员熟知的，参见例如Hamers-Casterman等人，(1993)Nature363:446，Roovers等人，(2007)CurrOpinMolTher9:327，以及Krah等人，(2016)ImmunopharmacolImmunotoxicol 38:21。单结构域抗体包含单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3。单结构域抗体的示例是仅有重链的抗体的可变片段、天然不包含轻链的抗体、衍生自常规抗体的单结构域抗体和工程化的抗体。单结构域抗体可以来源于任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、鲨鱼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以来源于骆驼科物种中产生的抗体，例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼。与完整抗体一样，单结构域抗体能够选择性地结合单个特定抗原。单结构域抗体可能仅包含免疫球蛋白链的可变结构域，即CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。

“Fab”或“Fab片段”是指由VH、CH1、VL和CL结构域组成的抗体片段。

“F(ab')₂”或“F(ab')₂片段”是指含有通过二硫桥在铰链区连接在一起的两个Fab片段的抗体片段。

“Fd”或“Fd片段”是指由VH和CH1结构域构成的抗体片段。

“Fv”或“Fv片段”是指由来自抗体的单臂的VH结构域和VL结构域构成的抗体片段。

“宿主细胞”是指含有异源核酸的任何细胞。示例性异源核酸是载体(例如，表达载体)。

“人抗体”是指当施用于人类受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含“源自”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。由于获得人抗体所使用的系统与人免疫球蛋白基因座之间的差异、体细胞突变的引入或有意将取代引入框架、CDR或恒定区中，因此当与在人中表达的免疫球蛋白相比时，“人抗体”典型地含有氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可以包含由人框架序列分析得出的共有框架序列(例如，如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86所述)，或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如，如Shi等人，(2010)JMol Biol 397:385-96和国际专利公布WO2009/085462中所述的)。“人抗体”的定义中不包括其中至少一个CDR源自非人物种的抗体。

“人源化抗体”是指其中至少一个CDR源自非人物种并且至少一个框架源自人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含取代，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确副本。

“分离的”是指已从产生分子的系统(诸如重组细胞)的其他组分中基本上分离和/或纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸或多肽)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的分子，并且涵盖分离至更高纯度(诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度)的分子。

“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或同一抗原内的两个或更多个不同表位的分子，诸如抗体。多特异性分子可能与其他相关抗原(例如与来自其他物种(同源物)，如人、猴或猿，例如食蟹猴(Macacafascicularis，cynomolgus，cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)的相同抗原)具有交叉反应性，或可以结合两个或更多个不同的抗原之间共享的表位。

“操作性连接”和类似短语在用于核酸或氨基酸时，分别是指彼此处于功能关系中的核酸序列或氨基酸序列的操作性连接。例如，操作性连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR和终止子序列导致核酸分子(例如，RNA)的准确产生，并且在一些情况下导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。操作性连接的肽是指其中肽的功能结构域彼此相距适当距离放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。

“药物组合物”是指由活性成分和药学上可接受的载剂组合而成的组合物。

“药学上可接受的载剂”或“赋形剂”是指药物组合物中除活性成分之外的成分，该成分对受试者无毒。示例性的药学上可接受的载剂是缓冲液、稳定剂或防腐剂。

“预防”疾病或病症意指预防受试者中出现病症。

两个序列之间的“序列同一性”百分比是序列共用的相同位置数量的函数(即，％同一性＝相同位置数量/位置总数×100)，将空位数量和每个空位的长度考虑在内，需要引入它们以便最佳比对两个序列。两个氨基酸序列之间的百分比同一性可例如使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.4:11-17(1988))的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120权重残基表、为12的空位长度罚分和为4的空位罚分来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法(该算法已并入GCG软件包的GAP程序中，可在www_gcg_com处获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及为16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和为1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定。

“单链Fv”或“scFv”是指包含含有轻链可变区(VL)的至少一个抗体片段和含有重链可变区(VH)的至少一个抗体片段的融合蛋白，其中VL和VH经由多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽。除非另外指明，否则如本文所用，scFv可以具有任一顺序的VL可变区和VH可变区，例如，相对于多肽的N末端和C末端，该scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。

“特异性地结合”、“特异性结合”或“结合”是指蛋白质的分子与或能够与抗原或抗原内的表位以大于对其他抗原的亲和力结合。典型地，蛋白质的分子以约1x10^-7M或更小，例如约5x10^-8M或更小、约1x10^-8M或更小、约1x10^-9M或更小、约1x10^-10M或更小、或约1x10^-11M或更小、或约1x10^-12 M或更小的平衡解离常数(K_D)与抗原或抗原内的表位结合，典型地，以比其与非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)结合的K_D小至少一百倍的K_D结合。

“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。

“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中是可互换的，并且在本文中同义使用。T细胞包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、记忆T细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助性(Th)细胞，例如T辅助性1(Th1)或T辅助性2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4⁺T细胞)、CD4⁺T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8⁺T细胞)、CD4⁺CD8⁺T细胞、γ-δT细胞、或T细胞的任何其他亚群。还包括“NKT细胞”，是指表达半不变αβT细胞受体但也表达通常与NK细胞相关联的多种分子标志物(诸如NK1.1)的特化T细胞群。NKT细胞包括NK1.1⁺细胞和NK1.1-细胞，以及CD4⁺细胞、CD4-细胞、CD8⁺细胞和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR是独特的，它能识别MHC I样分子CD1d表示的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可具有保护作用或有害作用。还包括“γ-δT细胞(γδT细胞)”，其是指特化的T细胞群，它们表面具有独特的TCR，能够识别非经典T细胞抗原，并且不像大多数T细胞(其中TCR由指定的α-和β-TCR链的两条糖蛋白链组成)，γδT细胞中的TCR由γ链和δ链组成。存在不同类型的γ-链和δ-链，诸如例如在Vγ9Vδ2T细胞中共表达的Vγ9链和Vδ2链。γδT细胞可以在免疫监视和免疫调节中发挥作用，并且据发现是IL-17的重要来源并且诱导稳健的CD8+细胞毒性T细胞应答。还包括“调节性T细胞”或“Treg”，其是指抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。Treg通常是转录因子Foxp3-阳性CD4+T细胞，并且还可包括转录因子Foxp3-阴性调节性T细胞，它们是产生IL-10的CD4+T细胞。

“治疗有效量”或“有效量”在本文中互换使用，是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括，例如：患者健康状况的改善、肿瘤负荷的减少、肿瘤生长的遏止或减慢和/或癌细胞没有向身体其他部位转移的情况。

疾病或病症诸如癌症的“治疗”是指实现以下项中的一者或多者：降低病症的严重程度和/或减少其持续时间，抑制所治疗病症的特征性症状的恶化，限制或防止先前患有病症的受试者中病症的复发，或者限制或防止先前有病症的症状的受试者中症状的复发。

“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指体内、离体或组织培养中具有自发或诱导表型改变的癌细胞、癌前期细胞或转化细胞。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。虽然转化可由感染转化病毒以及整合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标志物水平调节、侵入、肿瘤生长。

“变体”、“突变体”或“改变的”是指因一处或多处修饰(例如，一个或多个取代、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。

除非另有明确说明，否则在整个说明书中，根据EU索引进行抗体恒定区中的氨基酸残基的编号，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中描述的。

表1.序列表：

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

本发明的其他方面和实施方案

如上所述，在第一方面，本发明涉及分离的多特异性抗体，其包含能够结合人CD33的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区；其中该第一抗原结合区包含以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：

a)分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；

a)分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；

d)分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18；或

e)分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24；并且

其中该第二抗原结合区结合该Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链。

该第二抗原结合区可以是单结构域抗体并且包含以下的CDR1、CDR2和CDR3：

a)分别为SEQ ID NO:25、26和27；

b)分别为SEQ ID NO:28、29和30；

c)分别为SEQ ID NO:31、32和33；

d)分别为SEQ ID NO:34、35和36；

e)分别为SEQ ID NO:37、38和39；

f)分别为SEQ ID NO:40、41和42；

g)分别为SEQ ID NO:43、44和45；或

h)分别为SEQ ID NO:46、47和48。

该第一抗原结合区可以包含分别是SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。

该第一抗原结合区可包含分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且该第二抗原结合区为单结构域抗体并且包含分别为SEQID NO:28、29和30的CDR1、CDR2和CDR3。

该第一抗原结合区可包含分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且该第二抗原结合区为单结构域抗体并且包含分别为SEQID NO:25、26和27的CDR1、CDR2和CD3。

该第二抗原结合区是单结构域抗体并且包含分别为SEQ ID NO:28、29和30的CDR1、CDR2和CD3。

本发明的多特异性抗体可包含第一抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:49的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:50的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:51的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:52的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:53的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:54的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:55的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:56的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；以及

第二抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:57具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:58具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:59具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:60具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

e)与SEQ ID NO:61具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

f)与SEQ ID NO:62具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

g)与SEQ ID NO:63具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

h)与SEQ ID NO:64具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

i)与SEQ ID NO:65具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；或者

j)与SEQ ID NO:66具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列。

本发明的多特异性抗体可包含第二抗原结合区，该第二抗原结合区与具有选自SEQ ID NO:57至66的序列的抗体竞争结合人Vδ2。

本发明的多特异性抗体可包含第二抗原结合区，该第二抗原结合区与具有选自SEQ ID NO:57至66的序列的抗体结合人Vδ2上的相同表位。

本发明的多特异性抗体可包含第一抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:49的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:50的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；以及

第二抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:57具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:58具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:59具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:60具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

e)与SEQ ID NO:61具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

f)与SEQ ID NO:62具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

g)与SEQ ID NO:63具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

h)与SEQ ID NO:64具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

i)与SEQ ID NO:65具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；或者

j)与SEQ ID NO:66具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列。

本发明的多特异性抗体可包含第一抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

b)与SEQ ID NO:51的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:52的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；以及

第二抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:57具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:58具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:59具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:60具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

e)与SEQ ID NO:61具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

f)与SEQ ID NO:62具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

g)与SEQ ID NO:63具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

h)与SEQ ID NO:64具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

i)与SEQ ID NO:65具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；或者

j)与SEQ ID NO:66具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列。

本发明的多特异性抗体可包含第一抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

c)与SEQ ID NO:53的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:54的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；以及

第二抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:57具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:58具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:59具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:60具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

e)与SEQ ID NO:61具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

f)与SEQ ID NO:62具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

g)与SEQ ID NO:63具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

h)与SEQ ID NO:64具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

i)与SEQ ID NO:65具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；或者

j)与SEQ ID NO:66具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列。

本发明的多特异性抗体可包含第一抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

d)与SEQ ID NO:55的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:56的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；以及

第二抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:57具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:58具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:59具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:60具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

e)与SEQ ID NO:61具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

f)与SEQ ID NO:62具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

g)与SEQ ID NO:63具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

h)与SEQ ID NO:64具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

i)与SEQ ID NO:65具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；或者

j)与SEQ ID NO:66具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列。

本发明的多特异性抗体可包含第一抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:49的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:50的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:51的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:52的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:53的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:54的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:55的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:56的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；以及

第二抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

b)与SEQ ID NO:58具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％

序列同一性的序列。

本发明的多特异性抗体可包含第一抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:49的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:50的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:51的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:52的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:53的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:54的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:55的VH序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:56的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；以及

第二抗原结合区，其包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:57具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列。

本文所公开的序列的变体优选地包含所公开的序列的保守修饰。“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸修饰的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可被丙氨酸取代，如先前针对丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，(1988)Acta PhysiolScand Suppl 643:55-67；Sasaki等人，(1988)Adv Biophys 35:1-24)。可以通过已知方法，例如通过PCR诱变(美国专利4,683,195号)进行本发明的抗体的氨基酸取代。另选地，可例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))来产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得变体的特征。

本发明的多特异性抗体可以具有任何合适的抗体形式。本领域已经描述了许多抗体形式。

多特异性抗体可包含Fab、scFv、(scFv)₂、Fv、F(ab')₂或Fd，其包含能够结合人CD33的第一抗原结合区。

能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区可以是任何合适的形式，例如Fab、scFv、(scFv)₂、Fv、F(ab')₂、Fd或单结构域抗体。多特异性抗体可以包含单结构域抗体，该单结构域抗体包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区或由其组成。

多特异性抗体可以包括包含能够结合人CD33的第一抗原结合区的Fab和包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区的单结构域抗体。

多特异性抗体可以包括包含能够结合人CD33的第一抗原结合区的scFv和包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区的单结构域抗体。

取决于抗体形式，抗原结合区或其部分可以是相同多肽链的一部分并且从单个开放阅读框表达。在此类实施方案中，可以在抗原结合区序列之间使用接头序列。

多特异性抗体可包含scFv和VHH，该scFv包含能够结合人CD33的第一抗原结合区，该VHH包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区，并且该scFv包含肽接头，该肽接头任选地选自SEQ ID NO:67至99，诸如SEQ ID NO:67所示的接头组。

第一抗原结合区和第二抗原结合区可以直接或通过肽接头间接共价连接，任选地其中肽接头包含SEQ ID NO:100中所示的序列或由其组成。

多特异性抗体可由单一开放阅读框编码，其中第一抗原结合区位于第二抗原结合区的N末端。从N末端到C末端的顺序可以为VL-第一接头-VH-第二接头-VHH，其中VL是第一抗原结合结构域的轻链可变区，第一接头是肽接头，VH是第一抗原结合结构域的重链可变区，第二接头是肽接头，并且VHH是包含第二抗原结合区的单结构域抗体。多特异性抗体可由单一开放阅读框编码，其中第一抗原结合区位于第二抗原结合区的C末端。

本发明的多特异性抗体可以包含恒定区序列，例如由第一Fc多肽和第二Fc多肽组成的Fc区。因此，多特异性抗体可以包括包含能够结合人CD33的第一抗原结合区的Fab、包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区的VHH、和Fc区。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:49的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:50的VL和轻链恒定序列，和

-第三多肽，其包含SEQ ID NO:58的VHH和Fc序列。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:49的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:50的VL和轻链恒定序列，和

-第三多肽，其包含SEQ ID NO:57的VHH和Fc序列。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:51的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:52的VL和轻链恒定序列，和-第三多肽，其包含SEQID NO:58的VHH和Fc序列。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:51的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:52的VL和轻链恒定序列，和-第三多肽，其包含SEQID NO:57的VHH和Fc序列。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:53的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:54的VL和轻链恒定序列，和-第三多肽，其包含SEQID NO:58的VHH和Fc序列。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:53的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:54的VL和轻链恒定序列，和-第三多肽，其包含SEQID NO:57的VHH和Fc序列。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:55的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:56的VL和轻链恒定序列，和-第三多肽，其包含SEQID NO:58的VHH和Fc序列。

多特异性抗体可以包含：

-第一多肽，其包含SEQ ID NO:55的VH和重链恒定序列，

-第二多肽，其包含SEQ ID NO:56的VL和轻链恒定序列，和-第三多肽，其包含SEQID NO:57的VHH和Fc序列。

本发明的分离的多特异性抗体可以包含以下或由以下组成：

a)SEQ ID NO:101、102和103所示的多肽；

b)SEQ ID NO:104、105和106所示的多肽；

c)SEQ ID NO:107、108和109所示的多肽；

d)SEQ ID NO:110、111和112所示的多肽；

e)SEQ ID NO:113、114和115所示的多肽；

f)SEQ ID NO:116、117和118所示的多肽；

g)SEQ ID NO:119、120和121所示的多肽；或者

h)SEQ ID NO:122、123和124所示的多肽。

本发明的分离的多特异性抗体可以是双特异性抗体。

本发明的分离的多特异性抗体可以单价结合CD33并且单价结合人Vγ9Vδ2T细胞受体。

本发明抗体的第一抗原结合区和/或第二抗原结合区可以是人的或人源化的。

多特异性抗体可以能够在靶细胞存在下诱导人Vγ9Vδ2T细胞的增殖，在1nM的抗体浓度下10天后增加超过10倍或超过50倍，例如，当如本文实施例中所述进行测试时。

本发明的多特异性抗体可以能够在Vγ9Vδ2-T细胞存在下介导THP-1细胞的杀伤，包括以低效应细胞比靶细胞的比率。因此，本发明的多特异性抗体可以能够在Vγ9Vδ2-T细胞(E)存在下以E:T比率1:20介导THP-1细胞(T)的杀伤，其中EC50低于1nM，诸如0.5nM，诸如低于200pM，诸如低于150pM，诸如低于100pM，例如，当如本文实施例中所述进行测试时。

本发明的多特异性抗体可以能够介导来自血液癌症患者的表达人CD33的细胞的杀伤。

本发明的多特异性抗体可以能够相比于非肿瘤细胞例如来自健康供体的CD14+细胞优先介导CD33阳性肿瘤细胞例如THP-1细胞的杀伤，例如，当如本文实施例中所述进行测试时。

同种型、同种异型和Fc工程化

存在于本公开的抗体中的Ig恒定区或该Ig恒定区的片段(如Fc区)可以是任何同种异型或同种型。

本公开的分离的多特异性抗体可以包含Ig恒定区或其片段，例如片段可结晶区(“Fc”区)。所述Ig恒定区或其片段选自由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型组成的组。

Ig恒定区或Ig恒定区的片段可以是任何同种异型的。可以预期，同种异型对Ig恒定区的特性(如结合或Fc介导的效应子功能)没有影响。包含其片段的Ig恒定区的治疗性抗体的免疫原性与输注反应的风险增加和治疗反应的持续时间降低有关(Baert等人，(2003)N Engl J Med[新英格兰医学杂志]348:602--08)。包含其片段的Ig恒定区的治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可以部分地由Ig恒定区的同种异型确定(Stickler等人，(2011)Genes and Immunity[基因与免疫]12:213-21)。Ig恒定区同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置的氨基酸序列变异有关。表2示出了选择的IgG1、IgG2和IgG4同种异型。

表2.

/>

可通过血流中的内源性循环羧肽酶从Ig恒定区中去除C末端赖氨酸(CTL)(Cai等人，(2011)Biotechnol Bioeng 108:404-412)。在制备期间，可通过控制胞外Zn²⁺、EDTA或EDTA-Fe³⁺的浓度，将CTL去除控制到小于最大水平，如美国专利公布US20140273092中所述。蛋白质中的CTL含量可使用已知方法测定。

与抗原结合片段缀合的Ig恒定区可具有0％至100％、约10％至约90％、约20％至约80％、约40％至约70％、约55％至约70％、或约60％的C末端赖氨酸含量。

可以对与抗原结合结构域缀合的Ig恒定区或其片段进行Fc区突变，以调节它们与Fc受体的结合，从而调节它们的效应子功能，例如ADCC、ADCP和/或ADCP和/或药代动力学特性。这可以通过将突变引入Fc来实现，该突变(i)调节突变的Fc与活化FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)、和抑制性FcγRIIb的结合；和/或(ii)降低Fc效应子功能，例如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)，减少通过双特异性抗体与Fc受体阳性细胞结合介导的抗原非依赖性T细胞激活。

本公开的分离的多特异性抗体的Fc区可以是惰性的。本公开的分离的多特异性抗体的惰性Fc区可以在第一Fc多肽和第二Fc多肽中的一者或两者中包含在对应于234的位置处的Ala，在对应于235的位置处的Ala，以及在对应于265的位置处的Ser，其中编号是根据Eu。

Fc区可包含至少一个突变，其导致抗体与Fcγ受体((FcγR)的结合减少。可以突变以减少抗体与活化FcγR的结合并随后降低效应子功能的Fc位置包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合产生的示例性突变为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的突变K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S。导致抗体ADCC降低的示例性组合突变是以下突变：IgG1上的L234A/L235A、IgG1上的L234A/L235A/D265S、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的F234A/L235A、IgG4上的S228P/F234A/L235A、所有Ig同种型上的N297A、IgG2上的V234A/G237A、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的S267E/L328F、IgG1上的L234F/L235E/D265A、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、和IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。

导致抗体CDC降低的示例性突变是K322A突变。

熟知的S228P突变可在IgG4抗体中产生，以增强IgG4稳定性。

导致该抗体与FcγR的结合减少的该至少一个突变可以选自由以下组成的组：F234A/L235A、L234A/L235A、L234A/L235A/D265S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失的/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236缺失的/G237A/P238S，其中残基编号是根据EU索引。

本公开的抗体可以在Fc区包含至少一个突变，其增强蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合和/或增强Fc效应子功能，如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或吞噬作用(ADCP)。

Fc区可包含至少一个导致抗体与FcγR的结合增强的突变。导致该蛋白质与FcγR的结合增强的该至少一个突变选自由以下组成的组：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中残基编号是根据EU索引。

可以突变以增加抗体与活化FcγR的结合和/或增强Fc效应子功能的Fc位置包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430(残基编号是根据EU索引)。可单独地或组合进行的示例性突变为G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T和P396L。导致抗体ADCC或ADCP增加的示例性组合突变是S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E。

可以突变以增强CDC的Fc位置包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独地或组合产生的示例性突变为S267E、F1268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F和E430T。导致抗体CDC增加的示例性组合突变是K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T。

本文所述的具体突变是分别与SEQ ID NO:125、126和127的IgG1、IgG2和IgG4野生型氨基酸序列比较时的突变。

可使用流式细胞术在经工程化以表达每个受体的细胞上评估抗体与FcγR或FcRn的结合。在示例性结合测定中，将2×10⁵个细胞/孔接种到96孔板中并在BSA染色缓冲液(BDBiosciences，SanJose，USA)中在4℃下封闭30min。将细胞与测试抗体在冰上在4℃下温育1.5小时。在用BSA染色缓冲液洗涤两次之后，将细胞与R-PE标记的抗人IgG二级抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)在4℃下一起温育45min。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于150μL的含有1:200稀释的DRAQ7活/死染色剂的染色缓冲液(CellSignaling Technology,Danvers,USA)中。分别使用B2和B4通道，通过Miltenyi MACSQuant流式细胞仪(美国奥本市的Miltenyi Biotec(Miltenyi Biotec,Auburn,USA))检测经染色细胞的PE和DRAQ7信号。活细胞根据DRAQ7排除法进行门控，并且测定所收集的至少10,000个活事件的几何平均荧光信号。使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。数据绘制为抗体浓度对数相对于平均荧光信号。进行非线性回归分析。

可以发生突变以调节半衰期(例如，与FcRn结合)的Fc位置包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可单独地或组合产生的示例性突变为突变T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。可产生以增加半衰期的示例性单突变或组合突变为突变M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A。可产生以减小半衰期的示例性单突变或组合突变为突变H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R。

换句话讲，在本公开的分离的多特异性抗体中，第一Fc多肽和第二Fc多肽中的一者或两者中的Fc区可以包含在对应于252的位置处的Tyr，在对应于254的位置处的Thr，以及对应于256的位置处的Glu，其中编号是根据Eu。

本公开的抗原结合片段可被工程化为可使用Fab臂交换产生的全长多特异性抗体，在Fab臂交换中将取代引入到Ig恒定区CH3结构域内的两个单特异性二价抗体中，这促进体外Fab臂交换。在方法中，两个单特异性二价抗体可以经工程化以使其在CH3域有一定的取代，这促进异二聚体的稳定性；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换生成双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可以使用的示例性还原剂是2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选地还原剂选自由2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦组成的组。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH 7.0或pH 7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。

可以使用的CH3突变包括以下技术，如杵臼结构(Knob-in-Hole)突变(基因技术公司)、静电匹配的突变(日本中外制药株式会社、美商安进公司、诺和诺德公司(NovoNordisk)、抗癌药物公司、Merus公司)、链交换工程化的结构域体(SEEDbody)(默克雪兰诺公司)、突变(Genmab公司)和其他非对称突变(例如Zymeworks公司)。

旋钮空穴突变公开于例如WO1996/027011中，并且包括CH3区域的界面上的突变，其中具有小侧链(空穴)的氨基酸被引入第一CH3区域，而具有大侧链(旋钮)的氨基酸被引入第二CH3区域，导致第一CH3区域和第二CH3区域之间的优先相互作用。形成杵和臼的示例性CH3区突变是T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。换句话讲，在本公开的分离的多特异性抗体中，第一Fc多肽可以包含在对应于366的位置处的Trp，第二Fc多肽可以包含在对应于366的位置处的Ser，在对应于368的位置处的Ala和在对应于407的位置处的Val，或反之亦然，其中编号是根据Eu。

重链异源二聚体的形成可通过使用静电相互作用，通过取代第一CH3区上的带正电残基和第二CH3区上的带负电残基来促进，如US2010/0015133、US2009/0182127、US2010/028637或US2011/0123532所述。

可用于促进重链异源二聚化的其他非对称突变是L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F 、 Y407A/T366A_K409F 或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W ， 如US2012/0149876或US2013/0195849(Zymeworks)所述。

SEEDbody突变涉及用IgA残基取代所选IgG残基以促进重链异源二聚化，如US20070287170所述。

可使用的其他示例性突变是R409D_K370E/D399K_E357K、S354C_T366W/Y349C_T366S_L368A_Y407V 、Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V、 T366K/L351D、L351K/Y349E 、 L351K/Y349D 、 L351K/L368E 、L351Y_Y407A/T366A_K409F、 L351Y_Y407A/T366V_K409F、K392D/D399K 、 K392D/E356K 、K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D 、K392D_K409D/D356K_D399K，如WO2007/147901、WO 2011/143545、WO2013157954、WO2013096291和US2018/0118849所述。

突变(Genmab)公开于例如US9150663和US2014/0303356中，并且包括突变F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH和Y407LWQ/K409AGRH。

附加的双特异性或多特异性结构包括双可变结构域免疫球蛋白(DVD)(国际专利公布号WO2009/134776；DVD是全长抗体，其包含具有VH1-接头-VH2-CH结构的重链和具有VL1-接头-VL2-CL结构的轻链；接头是任选的)、包括多种二聚化结构域以连接具有不同特异性的两个抗体臂的结构诸如亮氨酸拉链或胶原二聚化结构域(国际专利公布号WO2012/022811、美国专利号5,932,448和美国专利号6,833,441)、缀合在一起的两个或更多个结构域抗体(dAb)、双价抗体、仅重链抗体诸如骆驼科抗体和工程化骆驼科抗体、双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mab(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)和CovX-主体(CovX/Pfizer)、IgG样双特异性抗体(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)和TvAb(Roche)、ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion，Zymogenetics/BMS)、双亲和重靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)和双(ScFv)₂-Fab(National Research Center for Antibody Medicine--China)、双功能或Bis-Fab(Genentech)、对接锁定(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。基于ScFv的、基于双价抗体的结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞衔接器(BiTE)(Micromet)、串联双价抗体(Tandab)(Affimed)、双亲和重靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双价抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双重靶向纳米抗体(Ablynx)、双重靶向仅重链结构域抗体。

在本公开的分离的多特异性抗体中，第一Ig恒定区或第一Ig恒定区的片段和第二Ig恒定区或第二Ig恒定区的片段可以包含在至少一个突变，其调节与蛋白A的结合。此类修饰对于抗体生产期间中的纯化目的可能是有利的这样的至少一个突变可以存在于第一Fc多肽或第二Fc多肽中，或两者中。

调节与蛋白A的结合的该至少一个突变是H435R/Y436F，其中残基编号是根据EU索引。第一Ig恒定区或该第一Ig恒定区的片段以及第二Ig恒定区或该第二Ig恒定区的片段可以包含L234A/L235A/D265S、M252Y/S254T/T256E和H435R/Y436F突变，其中残基编号是根据EU索引。

还可以将本公开的抗原结合结构域工程化到包含三条多肽链的多特异性抗体。在此类设计中，至少一个抗原结合结构域呈scFv的形式。示例性设计包括(其中“1”指示第一抗原结合结构域，“2”指示第二抗原结合结构域，并且“3”指示第三抗原结合结构域：

设计1：A链)scFv1-CH2-CH3；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3

设计2：A链)scFv1-铰链-CH2-CH3；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3

设计3：A链)scFv1-CH1-铰链-CH2-CH3；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3

设计4：A链)CH2-CH3-scFv1；B链)VL2-CL；C链)VH2-CH1-铰链-CH2-CH3

可以将CH3工程化并入设计1-4中，诸如突变L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如US2012/0149876或US2013/0195849(Zymeworks)所述。

糖工程

通过工程化Ig恒定区或Ig恒定区寡糖组分的片段，可以增强与Ig恒定区或Ig恒定区片段缀合的抗原结合结构域介导ADCC的能力。人IgG1或IgG3可以在Asn297处被N-糖基化，其中大多数聚糖以熟知的二天线型G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式存在。由非工程化CHO细胞产生的含有抗体的Ig恒定区通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从附接到与Ig恒定区或该Ig恒定区的片段缀合的抗原结合结构域的二天线型复合物型寡糖中去除核心岩藻糖，经由改善FcγRIIIa结合增强了抗体的ADCC，而不改变抗原结合或CDC活性。此类抗体可以使用所报告的用于引起具有双分枝复合物型Fc低聚糖的相对较高去岩藻糖基化免疫球蛋白的成功表达的不同方法实现，这些方法诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology 64:249-65,2012)、应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，JBiol Chem277:26733-26740,2002)、应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs；2(4):405-415,2010；PMID:20562582)、应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem 278:3466-3473,2003)、引入特异性针对1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng 88:901-908,2004)，或共表达β-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或强效α-甘露糖苷酶I抑制剂几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem 281:5032-5036,2006；Ferrara等人，Biotechnol Bioeng 93:851-861,2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng 99:652-65,2008)。

与本公开的Ig恒定区或Ig恒定区片段缀合的抗原结合结构域可具有二天线型聚糖结构，该二天线型聚糖结构的岩藻糖含量为约1％与约15％之间，例如约15％、14％、13％、12％、11％10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。另选地，与Ig恒定区或Ig恒定区片段缀合的抗原结合结构域可具有岩藻糖含量为约50％、40％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的聚糖结构。

“岩藻糖含量”意指Asn297处糖链内的岩藻糖单糖的量。岩藻糖的相对量为含岩藻糖的结构相对于所有糖结构的百分比。这些可通过多种方法进行表征和定量，例如：1)使用经N-糖苷酶F处理的样品(例如，复合结构、混合结构及低聚甘露糖结构和高甘露糖结构)的MALDI-TOF，如国际专利公布号WO2008/0775462所述；2)通过酶促释放Asn297聚糖，随后衍生化并通过具有荧光检测的HPLC(UPLC)和/或HPLC-MS(UPLC-MS)检测/定量；3)在用或不用Endo S或其他酶处理Asn297聚糖的情况下，对天然或还原后的mAb进行完整蛋白分析，所述其他酶在第一GlcNAc单糖和第二GlcNAc单糖之间进行切割，留下连接至第一GlcNAc的岩藻糖；4)通过酶消化(例如，胰蛋白酶或肽链内切酶Lys-C)将mAb消化为成分肽，随后通过HPLC-MS(UPLC-MS)进行分离、检测和定量；5)通过用PNGase F在Asn 297处进行特异性酶促去糖基化将mAb低聚糖与mAb蛋白质分离。可通过各种互补技术对由此释放的低聚糖进行荧光团标记、分离并鉴定，这些技术允许：采用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法，通过比较实验质量与理论质量来对聚糖结构进行精细表征；通过离子交换HPLC(GlycoSep C)确定唾液酸化程度；通过正相HPLC(GlycoSep N)，根据亲水性标准分离和定量低聚糖形式；以及通过高效毛细管电泳激光诱导荧光(HPCE-LIF)分离和定量低聚糖。

如本文所用，“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指与Ig恒定区或Ig恒定区片段缀合的抗原结合结构域，其岩藻糖含量约为1％-15％。

如本文所用的“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指与Ig恒定区或Ig恒定区片段缀合的抗原结合结构域，其岩藻糖含量约为50％以上，通常为约80％以上或85％以上。

多核苷酸、宿主细胞和载体

本公开还提供了分离的多核苷酸，或编码本公开的任何多特异性抗体的多核苷酸的组合。这些多特异性抗体包含结合CD33的抗原结合结构域和结合Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链的抗原结合结构域。

本发明还提供了编码任何CD33结合抗体或其片段的分离的多核苷酸。

本发明还提供了编码SEQ ID NO:49、51、53或55的VH的分离的多核苷酸。

本发明还提供了编码SEQ ID NO:50、52、54或56的VL的分离的多核苷酸。

本公开的一些实施方案还提供了分离或纯化的核酸，其包含与编码本公开的CD33和Vδ2结合双特异性抗体的多核苷酸互补的多核苷酸或在严格条件下与编码本公开的CD33和Vδ2结合双特异性抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。

在严格条件下杂交的多核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。所谓“高严格条件”，意味着多核苷酸以可检测到的比非特异性杂交更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少量分散错配的多核苷酸与恰好具有与该核苷酸序列匹配的少量小区域(例如3个至12个碱基)的随机序列区分开的条件。这种小的互补区域比14个至17个或更多个碱基的全长互补序列更容易解链，并且高严格杂交使得它们能够容易区分。相对高严格条件将包括例如低盐条件和/或高温条件，诸如在约50℃至70℃的温度下由约0.02M至0.1M的NaCl或等同物提供的条件。此类高严格条件在核苷酸序列与模板或靶链之间容许极少错配(如果有的话)。一般认为，通过添加增量的甲酰胺可以使条件更严格。

本公开的多核苷酸序列可以可操作地连接至一种或多种调节元件，诸如允许核苷酸序列在预期宿主细胞中表达的启动子或增强子。多核苷酸可以是cDNA。启动子可以是强启动子、弱启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或发育特异性启动子。可以使用的示例性启动子是次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸等。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地发挥功能，并适合与所述实施方案一起使用。此类病毒启动子包括细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子、SV40的早期和晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、马罗尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和其他逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。也可以使用诱导型启动子诸如金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、强力霉素诱导型启动子、含有一种或多种干扰素刺激的应答元件(ISRE)的启动子，这些应答元件诸如蛋白激酶R 2',5'-寡聚腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1等。

本发明还提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体。本公开还提供了包含本发明的多核苷酸的表达载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的合成多核甘酸引入给定生物体或遗传背景的载体。编码本公开的CD33和Vδ2结合抗体的多核苷酸可以可操作地连接至一种或多种表达载体中的控制序列，其确保CD33和Vδ2结合抗体的表达。此类调节元件可包含转录启动子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体还可以包括一种或多种非转录元件(如复制起点)、连接至待表达的基因上的合适的启动子和增强子、其他5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(如必要的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。

所述表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键，或这两种类型的键。非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间键不妨碍载体的转录或复制。

一且载体己经并入适当的宿主中，则宿主在适合于高水平表达由并入的多核苷酸编码的本公开的CD33和Vδ2结合抗体的条件下维持。用于转化脊椎动物细胞的表达介体中的转录和翻译控制序列可由病毒源提供。示例性介体可如Okayama和Berg，3Mol.Cell.Biol.280(1983)所述进行构建。

本公开的载体也可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。将IRES序列包含在融合载体中可能有利于增强某些抗体的表达。在一些实施方案中，载体系统将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，SV40)，这些位点可在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在ORF之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如IRES基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。

本公开的载体可以是圆形的或线性的。可将它们制备成包含在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可源自例如ColE1、SV40、2μ质粒、λ、牛乳头状瘤病毒等。

可将重组表达载体设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于两者。而且，可将重组表达载体制备用于组成型表达或用于诱导型表达。

另外，可以将重组表达载体制备成包括自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达该基因的细胞对试剂例如药物敏感并且在细胞与试剂接触或暴露于试剂时导致细胞死亡的基因。自杀基因是本领域已知的，包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。

载体还可包含本领域熟知的选择标记。选择标记包括阳性和阴性选择标记。标记基因包括杀生物剂抗性(例如对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷型宿主中提供原养型的互补作用等等。示例性标记基因包括抗生素抗性基因(例如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、组氨醇x抗性基因)、谷氨酰胺合酶基因、HSV-TK、用于更昔洛韦选择的HSV-TK衍生物或用于6-甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7Gene Ther.1738-1743(2000))。编码选择标志物或克隆位点的核酸序列可在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。

可使用的示例性载体为细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)和pEE12.4(Lonza)。另外的载体包括pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。可以使用噬菌体载体，诸如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII(Stratagene)。示例性的植物表达载体包括pBI01、pBI01.2、pBI121、pBI101.3和pBIN19(Clontech)。示例性的动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。

载体可包含(i)编码SEQ ID NO:49、51、53或54的VH的多核苷酸；(ii)编码SEQ IDNO:50、52、54或56的VL的多核苷酸；(iii)编码SEQ ID NO:57或58的VHH的多核苷酸；(iv)或它们的任何组合。这些多核苷酸可以在相同宿主细胞中从一种或多种表达载体共表达。

在一些实施方案中，载体包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含：

a)SEQ ID NO:49的VH和SEQ ID NO:50的VL；

b)SEQ ID NO:51的VH和SEQ ID NO:52的VL；

c)SEQ ID NO:53的VH和SEQ ID NO:54的VL；

d)SEQ ID NO:55的VH和SEQ ID NO:56的VL；

e)SEQ ID NO:67-100中任一者的接头；

f)SEQ ID NO:130-133的ScFv；

g)SEQ ID NO:57或58的VHH；

h)SEQ ID NO:128的Fc区；或者

i)它们的任何组合。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的一个或多个载体。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此此类子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)(诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)))以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生化细胞系，如杂交瘤或骨髓瘤细胞系如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚州，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，索尔兹伯里(Salisbury)，威尔特郡，英国，ECACC号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO-K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。

本公开还提供了一种产生本公开的抗体的方法，该方法包括在使K2结合蛋白质表达的条件下培养本公开的宿主细胞，以及回收由该宿主细胞产生的抗体。制备蛋白质和纯化蛋白质的方法是已知的。一经合成(化学或重组)，则可以根据标准程序纯化抗体，这些标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法、高效液相色谱法(HPLC)纯化、凝胶电泳等(一般参见Scopes,Protein Purification[蛋白质纯化](Springer-Verlag[柏林斯普林格出版社]，纽约，(1982))。主题蛋白可以是基本上纯的，例如，至少约80％至85％纯度、至少约85％至90％纯度、至少约90％至95％纯度、或至少约98％至99％、或更大纯度，例如，不含除主题蛋白以外的污染物如细胞碎片、大分子等。

可以使用标准分子生物学方法将编码本公开的抗体的多核苷酸并入载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。因此，本发明提供了产生包含表达本发明的核苷酸的多肽的方法，该核苷酸编码本发明的多肽。

当多肽由通过不同核酸编码的分离的链形成时，本发明提供了产生多肽的方法，该多肽包含表达本发明的核苷酸，这些核苷酸编码本发明的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:49的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:50的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:58的VHH和Fc多肽的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:51的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:52的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:58的VHH和Fc多肽的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:53的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:54的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:58的VHH和Fc多肽的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:55的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:56的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:58的VHH和Fc多肽的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:49的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:50的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:57的VHH和Fc多肽的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:51的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:52的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:57的VHH和Fc多肽的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:53的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:54的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:57的VHH和Fc多肽的多肽。

本发明的第一多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:55的VH和重链恒定区的多肽，本发明的第二多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:56的VL和轻链恒定区的多肽，并且本发明的第三多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO:57的VHH和Fc多肽的多肽。

经修饰的核苷酸可以用于生成本公开的多核苷酸。示例性经修饰核苷酸是5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基喹啉、5″-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N⁶-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

医疗用途和治疗方法

本公开的分离的多特异性或双特异性抗体可以用作药物，特别是用于治疗癌症。

适合用本发明的双特异性CD33/δ2抗体治疗的示例性癌症包括选自由以下组成的组的血液癌症：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓系白血病(CML)、母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤(DPDCN)、骨髓增殖性肿瘤(MPN)、和混合表型急性白血病。

本发明的另一个方面是如权利要求中所定义的多特异性或双特异性抗体在治疗患有癌症的受试者的方法中的用途，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的分离的双特异性CD33/δ2抗体并持续足以治疗癌症的时间。

施用/药物组合物

本公开提供了包含如本文所公开的多特异性或双特异性CD33/δ2抗体和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。对于治疗用途，本发明的多特异性或双特异性CD33/δ2抗体可以被制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗体作为药学上可接受的载剂中的活性成分。术语“载剂”是指与活性化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此类媒剂可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。该组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。本公开的分子或本发明的抗体在此类药物制剂中的浓度可广泛变化，即按重量计，从小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15或20％，并且可根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其他人蛋白(例如人血清白蛋白)在内的合适的媒剂和制剂例如描述于，例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy，第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing，第691-1092页，具体参见第958-989页。

本发明的双特异性CD33/δ2抗体的治疗用途的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适的途径，例如肠胃外施用，例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下、肺、经粘膜(口服、鼻内、阴道内、直肠)，使用呈片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒的配制品；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或技术人员所理解的本领域熟知的其他方式。位点特异性施用可以通过例如关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送来实现。

因此，用于肌内注射的本发明的药物组合物可以被制备成含有1ml无菌缓冲水以及约1ng/kg至约100mg/kg，例如约50ng/kg至约30mg/kg或更优选地约5mg/kg至约25mg/kg之间的本发明的双特异性CD33/δ2抗体。

本发明的双特异性CD33/δ2抗体可以通过任何合适的途径施用于患者，例如通过静脉内(IV)输注或推注、肌肉内或皮下或腹膜内非肠道施用。IV输注可以在短短15分钟内进行，但更常见的是30分钟、60分钟、90分钟甚至2、3、4、5、6或7小时。本发明的双特异性CD33/δ2抗体也可以直接注射到疾病部位(例如，肿瘤本身)。给予患有癌症的患者的剂量足以减轻或至少部分阻止所治疗的疾病(“治疗有效量”)并且有时可以是0.1至10mg/kg体重，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg，但可以甚至更高，例如15、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。也可以给予固定的单位剂量，例如50、100、200、500或1000mg，或者剂量可以基于患者的表面积，例如、400、300、250、200或100mg/m²。通常可以施用1至8个剂量(例如、1、2、3、4、5、6、7或8个)来治疗癌症，但可以施用10、12、20或更多个剂量。可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间后重复施用本发明的双特异性CD33/δ2抗体。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。

例如，用于静脉输注的包含本发明的双特异性CD33/δ2抗体的药物组合物可以被制成含有约200ml无菌林格氏液、约8mg至约2400mg、约400mg至约1600mg、或约400mg至约800mg的双特异性CD33/δ2抗体用于施用给80-kg的患者。用于制备可肠胃外施用的组合物的方法是熟知的，并且更详细地描述于例如“Remington's Pharmaceutical Science[雷明顿药物科学]”，第15版，MackPublishing Company[麦克出版公司]，宾夕法尼亚州伊斯顿中。

本发明的双特异性CD33/δ2抗体可以冻干用于储存，并在使用前重构于适合的载剂中。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。

本发明的双特异性CD33/δ2抗体可以与第二治疗剂同时、依次或分开地组合施用。第二治疗剂可以是化疗剂或靶向抗癌疗法。

双特异性CD33/δ2抗体可以与任何一种或多种化学治疗药物或本领域技术人员已知的其他抗癌治疗剂一起施用。

当本发明的双特异性CD33/δ2抗体与第二治疗剂组合施用时，该组合可以在任何方便的时间范围内进行。例如，双特异性CD33/δ2抗体和第二治疗剂可以在同一天，甚至在同一静脉输注中施用于患者。然而，双特异性CD33/δ2抗体和第二治疗剂也可以交替几天或交替几周、两周或几个月等施用。在一些方法中，双特异性CD33/δ2抗体和第二治疗剂以足够接近的时间施用，以使它们在被治疗的患者中同时以可检测的水平存在(例如，在血清中)。在一些方法中，由一段时间内的多个剂量组成的双特异性CD33/δ2抗体的整个疗程之后或之前是同样由多个剂量组成的第二治疗剂的疗程。在一些方法中，如果患者对最初施用的第二治疗剂具有抗性或产生抗性，则开始用第二施用的双特异性CD33/δ2抗体进行治疗。患者可以只接受一个疗程或多个疗程的双特异性CD33/δ2抗体和第二治疗剂之一或两者。在施用双特异性CD33/δ2抗体和第二治疗剂之间可以使用1、2或几天或几周的恢复期。当已经为第二治疗剂建立了合适的治疗方案时，该方案可以与本发明的双特异性CD33/δ2抗体组合使用。

双特异性CD33/δ2抗体，任选与第二治疗剂组合，可以与任何形式的放射疗法一起施用，包括外束放射、强度调制放射疗法(IMRT)和任何形式的放射外科手术，包括伽玛刀、射波刀、直线加速器、和组织间放射(例如植入放射性种子、GliaSite球囊)和/或外科手术。

表3示出了根据AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系统定义的JL5抗体(具有SEQID NO:49的VH和SEQ ID NO:50的VL的抗体)的CDR序列的氨基酸序列。

表3.

表4示出了根据AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系统定义的JL6抗体(具有SEQID NO:51的VH和SEQ ID NO:52的VL的抗体)的CDR序列的氨基酸序列。

表4.

表5示出了根据AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系统定义的JL2抗体(具有SEQID NO:53的VH和SEQ ID NO:54的VL的抗体)的CDR序列的氨基酸序列。

表5.

表6示出了根据AbM、Kabat、Chothia、IMGT和Contact系统定义的JL3抗体(具有SEQID NO:55的VH和SEQ ID NO:56的VL的抗体)的CDR序列的氨基酸序列。

表6.

虽然已经概括地描述了本发明，但是本发明的实施方案还将在以下实施例中进一步公开，以下实施例不应理解为限制权利要求的范围。

实施例

实施例1.CD33抗原生成

编码人CD33细胞外结构域(ECD)或其子结构域的表达构建体是基于骨髓细胞表面抗原CD33(Uniprot登录号P20138)的序列及其结构域注释设计的，该结构域注释具有6XHis标签序列(SEQ ID NO:246)或作为与人血清白蛋白(HSA)(C端具有6X His标签序列(SEQID NO:246))的C34S变体的融合蛋白。基于NCBI登录号XP_005590138.1，设计了编码来自食蟹猴(cynomolgus monkey，Macaca fascicularis)的CD33(ECD)或其子结构域的相似表达构建体。产生的抗原的氨基酸序列示于表7中。

根据制造商的方案，使用Expifectamine将人和食蟹猴CD33全长ECD或子结构域表达构建体瞬时转染到HEK293衍生细胞Expi293(博科公司(Gibco)/赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中。在收获前，将细胞在定轨振荡器上以8％CO₂在37℃下孵育5天。通过离心去除表达蛋白质的细胞，并使用固定化金属离子亲和色谱法(IMAC)，使用镍NTA琼脂糖凝胶6FF(Ni NTA Sepharose 6Fast Flow resin)树脂(GE Healthcare)从培养基中纯化带有his标签的可溶性CD33蛋白，随后使用Zeba^TMSpin Desalting柱(7K MWCO，10mL；ThermoScientific，目录号：89893)，按照制造商的说明，将缓冲液交换到1X杜氏磷酸盐水(Dubelcco's Phosphate Saline)缓冲液(pH 7.2，无钙或镁)中。

表7.CD33抗原的氨基酸序列。

/>

/>

/>

实施例2.抗CD33 xδ2抗体的生成

如下使用Ablexis转基因小鼠技术生成抗体。AlivaMab小鼠经过工程化以产生人/小鼠免疫球蛋白。用重组人CD33蛋白(从表7中选择的抗原)免疫AlivaMab转基因小鼠。从次级淋巴器官中提取淋巴细胞，并与FO小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤，或通过FACS进行单细胞分选。针对与过表达人CD33 ECD的人胚胎肾(HEK)细胞的结合，通过MSD电化学发光筛选杂交瘤上清液。与亲本HEK细胞(阴性信号)相比，用FACS进一步分析从筛选中鉴定出的样品与过表达人CD33 ECD的HEK细胞(阳性信号)的结合。使用ELISA对确认的细胞结合剂进行轻链同种型。通过MSD电化学发光筛选与重组人CD33蛋白结合的单细胞分选上清液。选择了几个具有所需结合特征的命中，并进行了测序。

如下进行V区克隆。使用Smarter cDNA合成试剂盒(Clontech公司，芒廷维尤(Mountain View)，加利福尼亚州)，将通过RNeasy Plus Mini试剂盒纯化的RNA和B细胞裂解物用于进行cDNA合成。为了促进cDNA的合成，使用oligodT启动所有信使RNA的逆转录，然后用Smarter IIA寡核苷酸进行“5'加帽”。使用靶向SmarterIIA帽的5'引物和靶向CH1中的共有区的3'引物并使用2步PCR扩增来进行VH片段和VL片段的后续扩增。简而言之，每个50μl PCR反应由20μM的正向和反向引物混合物、25μl的PrimeStar Max DNA聚合酶预混合物(Clontech公司)、2μl的未纯化的cDNA、以及21μl的双蒸馏H2O组成。循环程序开始于94℃持续3min，随后是35个循环(94℃持续30秒，55℃持续1min，68℃持续1min)，并且结束于72℃持续7min。用含有15bp互补延伸的VL和VH第二轮引物进行第二轮PCR，该互补延伸与它们相应的Lonza母载体(VH和VL)中的相应区域“重叠”。第二轮PCR用以下程序进行：94℃持续3min；35个循环(94℃持续30秒，55℃持续1min，68℃持续1min)，并且结束于72℃持续7min。/>HD克隆试剂盒(Clonetech,U.S.A.)用于将VL基因定向克隆到LonzahuIgK或λ载体中，并将VH基因定向克隆到LonzahuIgG1载体中。为了便于/>HD克隆，在进行/>HD克隆之前，用克隆增强子处理PCR产物。克隆和转化按照制造商的方案进行(Clonetech公司，美国)。对小量制备的DNA进行Sanger测序，以确认获得了完整的V基因片段。

按照制造商的建议，通过用编码蛋白质的纯化的质粒DNA瞬时转染，在ExpiCHO-S^TM细胞(ThermoFisher Scientific；Waltham,MA，目录号A29127)中表达抗CD33抗体。简而言之，将ExpiCHO-S^TM细胞悬浮在ExpiCHO^TM表达培养基(赛默飞世尔科技公司，目录号A29100)中，并置于设定在37℃，8％CO2和125RPM的定轨振荡培养箱中。在转染至6.0×106个细胞/ml之前，将细胞传代并稀释，从而将细胞活力保持在99.0％或更高。使用ExpiFectamine^TMCHO转染试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号A29131)进行瞬时转染。对于每ml要转染的稀释细胞，使用0.5微克的编码DNA的scFvFc融合物和0.5微克的pAdVAntageDNA(普洛麦格公司(Promega)，目录号E1711)，并稀释到OptiPRO^TMSFM复合培养基中。在1:4比率(v/v，DNA:试剂)下使用ExpiFectamine^TMCHO试剂，并且稀释到OptiPRO^TM中。将所稀释的DNA与转染试剂合并一分钟，允许DNA/脂质复合物形成，然后添加到细胞中。在温育过夜后，根据制造商的标准方案将ExpiCHO^TM进料和ExpiFectamine^TMCHO增强子添加到细胞中。在收获培养液之前，将细胞在37℃处回转振荡(125rpm)温育七天。通过离心(30min，3000rcf)，随后进行过滤(0.2μm PES膜，Corning；Corning,NY)，澄清来自瞬时转染的ExpiCHO-S^TM细胞的培养上清液。

如下进行蛋白质纯化。使用AKTAXpress色谱系统将所过滤的细胞培养上清液装载到预平衡的(1xDPBS，pH 7.2)MabSelect Sure蛋白质A柱(GEHealthcare)上。上样后，用10倍柱体积的1xDPBS(pH 7.2)洗涤柱。用10个柱体积的0.1M乙酸钠(Na)(pH3.5)洗脱蛋白质。通过添加2.5M的Tris HCl(pH 7.5)至洗脱级分体积的20％(v/v)来立即中和蛋白质级分。将峰级分合并并过滤(0.2μm)。通过分析性尺寸排阻HPLC(Agilent HPLC系统)来评估纯化的蛋白质的质量。

实施例3.双特异性CD33xVdelta2抗体的生成

使用杵臼突变制备双特异性分子，以生成与Fc融合的CD33结合剂和与Fc融合的VHH Vδ2结合剂的异二聚体。使用的结合Vδ2的VHH序列是WO2015156673中描述的抗体6H4和抗体5D3。6H4序列如SEQ ID NO:58所示。5D3序列如SEQ ID NO:57所示。

结合CD33的Fab在臼Fc上，结合Vδ2的VHH在杵Fc上。CD33 VH和人CH1恒定区与Fc上的含有几个突变L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366S/L368A/Y407V_H435R/Y436F的铰链融合。将AAS突变引入两条重链的Fc部分以使Fc受体沉默。将YTE(M252Y/S254T/T256E)突变引入JL5的两条重链的Fc部分以增加半衰期。结合δ2的VHH与铰链和杵Fc融合，包括以下突变：C220S_L234A/L235A/D265S_M252Y/S254T/T256E_T366W。

将RF突变引入臼重链以帮助纯化。

制备了以下Fab(CD33)xVHH(Vδ2)构建体：

CD33抗体JL5与Vδ2抗体6H4组合(JL5x6H4)，对应于序列SEQ ID NO:101、102和103。

CD33抗体JL5与Vδ2抗体5D3组合(JL5x5D3)，对应于序列SEQ ID NO:104、105和106。

CD33抗体JL6与Vδ2抗体6H4组合(JL6x6H4)，对应于序列SEQ ID NO:107、108和109；但不具有YTE突变。

CD33抗体JL6与Vδ2抗体5D3组合(JL6x5D3)，对应于序列SEQ ID NO:110、111和112；但不具有YTE突变。

CD33抗体JL2与Vδ2抗体6H4组合(JL2x6H4)，对应于序列SEQ ID NO:113、114和115；但不具有YTE突变。

CD33抗体JL2与Vδ2抗体5D3组合(JL2x5D3)，对应于序列SEQ ID NO:116、117和118；但不具有YTE突变。

CD33抗体JL3与Vδ2抗体6H4组合(JL3x6H4)，对应于序列SEQ ID NO:119、120和121；但不具有YTE突变。

CD33抗体JL3与Vδ2抗体5D3组合(JL3x5D3)，对应于序列SEQ ID NO:122、123和124；但不具有YTE突变。

这些分子在CHO细胞系中表达并通过ProA捕获随后CH1亲和捕获进行纯化。简而言之，抗体最初通过Mab Select SuRe蛋白A柱(GE医疗公司)纯化。用pH 7.2的PBS来平衡柱并且以2mL/min的流速将发酵上清液上样。上样后，将柱用4倍柱体积的PBS洗涤，然后在pH3.5的30mM乙酸钠中洗脱。将含有蛋白质峰的级分合并，并且通过添加1％的3M乙酸钠(pH9.0)中和至pH5.0，该蛋白质峰通过280nm处的吸光度进行监测。通过CH1捕获进一步纯化抗体并在组氨酸缓冲液中洗脱。

实施例4：双特异性CD33xVδ2抗体结合表达CD33的细胞和Vγ9Vδ2细胞

简介

测试了双特异性CD33xVδ2抗体与表达CD33的细胞和Vγ9Vδ2细胞结合的能力。

材料和方法

细胞系

在RPMI 1640ATCC mod(Gibco)、10％热灭活FBS、50ug/ml庆大霉素和2-巯基乙醇中培养表达CD33的急性单核细胞白血病(AML)细胞系THP-1(ECACC，Sigma)。如前所述生成纯化的Vγ9Vδ2-T细胞系(de Bruin等人，(2017),Oncoimmunology7(1):e1375641)。简而言之，将Vδ2⁺-T细胞使用FITC缀合的抗Vδ2TCR(Beckman Coulter，克隆IMMU 389)与抗小鼠IgG微珠(Miltenyi Biotec)组合从健康供体(HD)PBMC分离并且每周用由以下组成的经辐照饲养混合物培养：来自2个健康供体的PBMC、JY细胞、IL-7(10U/mL)、IL-15(10ng/mL，R&DSystems)和植物血凝素(50ng/ml PHA；Thermo Fisher Scientific)。Vγ9Vδ2-T细胞系的纯度维持在>90％和<5％CD4+。

双特异性抗体结合

为了评估CD33结合，将THP-1细胞在4℃与浓度范围为316-0.00316nM的双特异性抗体JL2x6H4、JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4、B21Mx6H4、JL2x5D3、JL3x5D3、JL5x5D3、JL6x5D3或B21Mx5D3温育45分钟至60分钟。

为了评估Vδ2结合，将Vγ9Vδ2细胞在4℃与浓度范围为316-0.00316nM的双特异性抗体JL2x6H4、JL3x6H4、JL5x6H4、JL6x6H4、B21Mx6H4、JL2x5D3、JL3x5D3、JL5x5D3、JL6x5D3或B21Mx5D3或与结合gp120和另一个不相关靶标的双特异性抗体温育45-60分钟。

通过与Alexa647缀合的F(ab')2山羊抗人IgG抗体(H+L)(杰克逊公司)在4℃孵育30分钟来检测结合的双特异性抗体。

FACS

通过FACS Celesta(BD)测量样品，并使用FlowJo软件(FlowJo)分析数据。

结果

发现所有双特异性CD33xVδ2抗体都与表达CD33的THP-1细胞结合(图1)。正如预期的那样，具有呼吸道合胞病毒(RSV)结合结构域(B21M)而不是CD33结合结构域的阴性对照抗体不与THP-1细胞结合。

此外，发现所有双特异性CD33xVδ2抗体都与Vγ9Vδ2T细胞结合(图2)。正如预期的那样，RSVxVδ2抗体也结合Vγ9Vδ2T细胞，而没有Vδ2结合结构域的阴性对照抗体不结合这些细胞。与含有5D3作为Vδ2结合结构域的双特异性抗体相比，含有6H4作为Vδ2结合结构域的双特异性CD33xVδ2抗体以更高的亲和力结合Vγ9Vδ2T细胞。

实施例5：双特异性CD33xVδ2抗体可介导针对表达CD33的细胞的细胞毒性

简介

如实施例4所述，双特异性CD33xVδ2抗体结合表达CD33的细胞和Vγ9Vδ2-T细胞。随后测试了双特异性抗体是否可以诱导对表达CD33的肿瘤细胞的细胞毒性。

材料和方法

细胞系

如实施例4中所述使表达CD33的THP-1细胞(靶细胞)和Vγ9Vδ2-T细胞(效应细胞)生长。

细胞毒性测定

将THP-1靶细胞用细胞跟踪紫(CTV)标记，并在双特异性CD33xVδ2抗体或阴性对照抗体(RSVxVδ2)存在下和Vγ9Vδ2-T效应细胞(E)以1:1或1:20(E:T)比率(2,500个效应细胞和50,000个靶细胞，比率为1:20)在37℃孵育。测试了从5nM开始的九个5倍稀释的抗体浓度系列。22和94小时后，使用7-氨基放线菌素D(7AAD)对死细胞进行染色。通过确定CTV+7AAD-细胞的百分比来确定THP-1细胞杀伤。使用Prism软件(GraphPad)通过非线性回归确定EC50。

结果

测量THP-1细胞的杀伤并确定EC50。在阴性对照抗体存在下未观察到杀伤。然而，所有双特异性CD33xVδ2抗体都能够介导THP-1肿瘤细胞的杀伤。通常，包含基于6H4的Vδ2结合结构域的抗体比包含基于5D3的结合结构域的抗体更有效(更低的EC50)(表8)。具有JL3或JL5CD33结合结构域的双特异性抗体比包含JL2或JL6结构域的双特异性抗体更有效。甚至在1:20的效应细胞比靶细胞的比率下，也可以看到有效的杀伤。

表8

*估计，最高浓度没有平台

实施例6：双特异性CD33xVδ2抗体相比于健康细胞优先诱导肿瘤细胞的杀伤

简介

如实施例5中所述，双特异性CD33xVδ2抗体可以诱导对表达CD33的肿瘤细胞的细胞毒性。随后测试了使用来自新鲜血液的PBMC作为效应细胞是否也可以获得细胞毒性，以及CD33xVδ2抗体是否也诱导对健康CD33阳性CD14+细胞的细胞毒性。

材料和方法

细胞系

如实施例5中所述使表达CD33的THP-1细胞(靶细胞)生长。来自健康供体志愿者的经肝素处理的全血获得自血液供应服务商Sanquin，并且用于分离外周血单核细胞(PBMC)。使用Lymphoprep^TM密度梯度离心法分离PBMC。

为了确定Vγ9Vδ2-T细胞的百分比，将PBMC用PerCP-Cy5.5标记的抗CD3 mAb(博奇公司(Biolegend)克隆SK7)、PE标记的抗TCR Vγ9mAb(博奇公司克隆B6)和FITC标记的抗TCR Vδ2mAb(贝克曼库尔特公司克隆IM1464)染色。使用PE-Cy7标记的抗CD14 mAb(博奇公司克隆63D3)、APC标记的抗CD33 mAb(博奇公司克隆WM53)确定THP-1和CD14+单核细胞上的CD33表达。

细胞毒性测定

将THP-1靶细胞用细胞跟踪紫(CTV)标记，并在双特异性CD33xVδ2抗体或阴性对照抗体(RSVxVδ2)存在下和PBMC效应细胞(E)以5:1(E:T)比率(250,000个效应细胞和50,000个靶细胞)在37℃温育。测试了从5nM开始的六个5倍稀释的抗体浓度系列。94小时后，将细胞用PE-Cy7标记的抗CD14 mAb和7AAD染色。根据CTV+7AAD-细胞的百分比确定THP-1细胞杀伤，而根据CTV-CD14+7AAD-细胞的百分比确定单核细胞杀伤。

结果

靶细胞的杀伤如图3所示。发现PBMC(包含总PBMC的1.84％Vγ9+Vδ2+T细胞)能够在双特异性CD33xVδ2抗体存在下介导THP-1肿瘤细胞的杀伤(图A)。另一方面，健康CD14+靶细胞几乎没有发生裂解(图B)。这表明双特异性CD33xVδ2抗体相比于健康细胞优先介导肿瘤细胞的杀伤。这种差异似乎不是由于THP-1靶细胞和CD14+靶细胞之间CD33表达的差异，因为与THP-1细胞相比，发现CD14+细胞上的CD33表达高约两倍。

实施例7：双特异性CD33xVδ2抗体诱导Vγ9Vδ2T细胞的增殖

简介

随后测试了双特异性CD33xVδ2抗体是否在CD33阳性靶细胞存在下诱导Vγ9Vδ2T细胞的增殖。

材料和方法

细胞系

如实施例4中所述使表达CD33的THP-1细胞(靶细胞)生长。如实施例4中所述培养来自两个不同供体的Vγ9Vδ2T细胞(效应细胞)。

增值测定

将THP-1靶细胞用细胞跟踪紫(CTV)进行标记。将Vγ9Vδ2效应细胞在50IU/mLIL-2存在下用细胞跟踪远红(CTFR)进行标记。将靶细胞和效应细胞在37℃、5％CO₂(200ul/孔)下以1:20的效应细胞比靶细胞的比率(50,000个靶细胞，2,500个效应细胞)在1nM双特异性抗体存在下共同孵育。123计数eBeads^TM计数珠(英杰公司(Invitrogen))用于评估第0天、第1天、第4天、第7天、第11天和第14天的细胞数。

结果

Vγ9Vδ2效应细胞的增殖如图4所示。发现所有双特异性CD33xVδ2抗体都能够诱导来自两个不同供体的Vγ9Vδ2效应细胞的增殖。在双特异性RSVxVδ2抗体存在下未观察到增殖，表明增殖依赖于靶细胞的存在。

实施例8：双特异性scFvCD33xVδ2抗体可介导针对表达CD33的细胞的细胞毒性

简介

当CD33结合臂以scFv形式提供时，测试了双特异性抗体是否可以诱导对表达CD33的肿瘤细胞的细胞毒性。

材料和方法

细胞系

如实施例5所述使来自两个不同供体(供体104和供体156)的表达CD33的THP-1细胞(靶细胞)和Vγ9Vδ2-T细胞(效应细胞)生长。

scFv-VHH双特异性分子的产生

scFv-VHH双特异性分子如下产生：使用scFv(VL-L-VH)-L-VHH的固定设计，其中在VL和VH之间具有“鸟”接头，在scFv和VHH之间具有固定的短5氨基酸接头(GGGGS(SEQ IDNO:100))，以及在C末端蛋白质具有C标签。双特异性scFv VHH分子的氨基酸序列被逆翻译为cDNA，然后进行密码子优化以在人细胞中表达。添加调节元件：N末端科扎克序列和C末端终止密码子，并且cDNA被制成合成基因。将cDNA克隆到合适的载体中并验证其序列。通过在HEK293_E细胞中瞬时转染所得质粒来进行蛋白质的表达。通过C标签亲和色谱法和凝胶过滤从培养上清液纯化蛋白质。

/>

细胞毒性测定

将THP-1靶细胞用细胞跟踪紫(CTV)标记，并在双特异性CD33xVδ2抗体或阴性对照抗体(RSVxVδ2)存在下和Vγ9Vδ2-T效应细胞(E)以1:1(E:T)比率(50,000个效应细胞和50,000个靶细胞)在37℃孵育。测试了从3.16nM开始的10个半对数稀释的抗体浓度系列。24小时后，通过使用流式细胞术确定7AAD-CTV+细胞的百分比来确定THP-1细胞杀伤。

结果

测量THP-1细胞的杀伤并确定EC50值。在阴性对照抗体存在下未观察到杀伤。所有双特异性scFv CD33xVδ2抗体都能够介导THP-1肿瘤细胞的杀伤。

^*#估计，最高或最低浓度没有平台

Claims (29)

1.一种分离的多特异性抗体，所述分离的多特异性抗体包含能够结合人CD33的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区；

其中所述第一抗原结合区包含以下的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：

a)分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；

a)分别为SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；

d)分别为SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18；或者

e)分别为SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24；并且

其中所述第二抗原结合区结合所述Vγ9Vδ2T细胞受体的Vδ2链。

2.根据权利要求1所述的分离的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合区是单结构域抗体并且包含以下的CDR1、CDR2和CDR3：

a)分别为SEQ ID NO:28、29和30；

b)分别为SEQ ID NO:25、26和27；

c)分别为SEQ ID NO:31、32和33；

d)分别为SEQ ID NO:34、35和36；

e)分别为SEQ ID NO:37、38和39；

f)分别为SEQ ID NO:40、41和42；

g)分别为SEQ ID NO:43、44和45；或者

h)分别为SEQ ID NO:46、47和48。

3.根据权利要求2所述的分离的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。

4.根据权利要求2所述的分离的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述第二抗原结合区为单结构域抗体并且包含分别为SEQ ID NO:28、29和30的CDR1、CDR2和CDR3。

5.根据权利要求2所述的分离的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含分别为SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述第二抗原结合区为单结构域抗体并且包含分别为SEQ ID NO:25、26和27的CDR1、CDR2和CD3。

6.根据权利要求1所述的分离的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合区是单结构域抗体并且包含分别为SEQ ID NO:28、29和30的CDR1、CDR2和CD3。

7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多特异性抗体，所述分离的多特异性抗体包含能够结合人CD33的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区；

其中所述第一抗原结合区包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:51的VH序列具有至少90％、92％、94％、

96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:

52的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:49的VH序列具有至少90％、92％、94％、

96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:

50的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:53的VH序列具有至少90％、92％、94％、

96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:

54的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

e)与SEQ ID NO:55的VH序列具有至少90％、92％、94％、

96％、98％或100％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:

56的VL序列具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；或者

并且

其中所述第二抗原结合区包含以下或由以下组成：

a)与SEQ ID NO:58具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

b)与SEQ ID NO:57具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

c)与SEQ ID NO:59具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

d)与SEQ ID NO:60具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

e)与SEQ ID NO:61具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

f)与SEQ ID NO:62具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

g)与SEQ ID NO:63具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

h)与SEQ ID NO:64具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；

i)与SEQ ID NO:65具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列；或者

j)与SEQ ID NO:66具有至少90％、92％、94％、96％、98％或100％序列同一性的序列。

8.根据权利要求1所述的分离的多特异性抗体，其中

a)所述分离的多特异性抗体包含Fab、scFv、(scFv)₂、Fv、F(ab')₂或Fd，其中所述Fab、scFv、(scFv)₂、Fv、F(ab')₂或Fd包含能够结合人CD33的第一抗原结合区，或者

b)所述分离的多特异性抗体包含：

-包含能够结合人CD33的所述第一抗原结合区的Fab，和

-包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的所述第二抗原结合区的单结构域抗体；或者，

c)所述分离的多特异性抗体包含：

-包含能够结合人CD33的所述第一抗原结合区的scFv，和

-包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的所述第二抗原结合区的单结构域抗体。

9.根据权利要求8所述的分离的多特异性抗体，其中所述分离的多特异性抗体包含scFv和VHH，所述scFv包含能够结合人CD33的第一抗原结合区，所述VHH包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区，并且其中所述scFv包含肽接头，所述肽接头任选地选自SEQ ID NO:67至99所示的接头的组。

10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区经由肽接头直接或间接共价连接；任选地，其中所述肽接头是SEQID NO:100中所示的接头。

11.根据权利要求10所述的分离的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区位于所述第二抗原结合区的N末端。

12.根据前述权利要求中任一项的分离的多特异性抗体，所述分离的多特异性抗体还包含由第一Fc多肽和第二Fc多肽组成的Fc区。

13.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中所述分离的多特异性抗体包含Fab、VHH，所述Fab包含能够结合人CD33的第一抗原结合区，所述VHH包含能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区，并且其中所述分离的多特异性抗体包含Fc区。

14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多特异性抗体，所述分离的多特异性抗体包含选自由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型组成的组的Ig恒定区或其片段。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中所述Fc区是惰性的。

16.根据权利要求15所述的分离的多特异性抗体，其中在所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽中的一者或两者中的所述Fc区包含在对应于234的位置处的Ala，在对应于235的位置处的Ala，以及在对应于265的位置处的Ser，其中编号是根据Eu。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中所述第一Fc多肽包含在对应于366的位置处的Trp并且所述第二Fc多肽包含在对应于366的位置处的Ser、在对应于368的位置处的Ala和在对应于407的位置处的Val，或反之亦然，其中编号是根据Eu。

18.根据权利要求12至17中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中在所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽中的一者或两者中的所述Fc区包含在对应于252的位置处的Tyr、在对应于254的位置处的Thr和在对应于256的位置处的Glu，其中编号是根据Eu。

19.根据权利要求12至18中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中在所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽中的一者或两者中的所述Fc区包含在对应于435的位置处的Arg和在对应于436的位置处的Phe，其中编号是根据Eu。

20.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。

21.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多特异性抗体，所述分离的多特异性抗体包含：

a)SEQ ID NO:101、102和103所示的多肽；

b)SEQ ID NO:104、105和106所示的多肽；

c)SEQ ID NO:107、108和109所示的多肽；

d)SEQ ID NO:110、111和112所示的多肽；

e)SEQ ID NO:113、114和115所示的多肽；

f)SEQ ID NO:116、117和118所示的多肽；

g)SEQ ID NO:119、120和121所示的多肽；或者

h)SEQ ID NO:122、123和124所示的多肽。

22.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至21中任一项所述的分离的多特异性抗体以及药学上可接受的载剂。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的分离的多特异性抗体，所述分离的多特异性抗体用作药物。

24.根据权利要求1至21中任一项所述的分离的多特异性抗体，所述分离的多特异性抗体用于治疗血液癌症；任选地，其中所述血液癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓系白血病(CML)、母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤(DPDCN)、骨髓增殖性肿瘤(MPN)、和混合表型急性白血病。

25.一种核酸构建体或核酸构建体的组合，所述核酸构建体或核酸构建体的组合编码根据权利要求1至21中任一项所述的多特异性抗体。

26.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求25所述的核酸构建体或核酸构建体的组合。

27.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据权利要求25所述的核酸构建体或核酸构建体的组合或者根据权利要求26所述的表达载体。

28.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的人类受试者施用根据权利要求1至21中任一项所述的多特异性抗体。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述疾病是血液癌症；任选地，其中所述血液癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓系白血病(CML)、母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤(DPDCN)、骨髓增殖性肿瘤(MPN)、和混合表型急性白血病。