JP2022033769A - 強化されたアゴニスト活性を有する、Ｆｃが遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体及びその使用方法 - Google Patents
強化されたアゴニスト活性を有する、Ｆｃが遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体及びその使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】強化されたアゴニスト活性を有する遺伝子操作を受けた抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体及びその使用方法を提供する。【解決手段】単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、前記突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、前記抗体を提供する。【選択図】なし
Description
（配列表）
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される配列表を含み、その全内容は参照により
その全体が本明細書に組み込まれている。２０１７年７月３１日に作成されたＡＳＣＩＩ
テキストファイルは、ファイル名がＪＢＩ５０９５ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり
、サイズは１６８キロバイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される配列表を含み、その全内容は参照により
その全体が本明細書に組み込まれている。２０１７年７月３１日に作成されたＡＳＣＩＩ
テキストファイルは、ファイル名がＪＢＩ５０９５ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり
、サイズは１６８キロバイトである。
（発明の分野）
本発明は、強化されたアゴニスト活性を有する遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー抗体及びその使用方法に関する。
本発明は、強化されたアゴニスト活性を有する遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー抗体及びその使用方法に関する。
抗腫瘍免疫効果を賦活するモノクローナル抗体は、癌治療法の重要な分類として台頭し
つつある。これらの多くは、免疫賦活性腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor re
ceptor、ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーに対するものである。最近の研究によっ
て、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性及び治療活性が、Ｆｃ
を介したＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への架橋に依存していることが示された（Ｌｉ ｅｔ
ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：１０３０～４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ
．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６２：９４１～
８）。Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＢは、スカフォールドとして作用して、下流の細
胞内シグナル伝達を活性化するための必要条件である受容体のクラスタリングを促進する
抗体の多量体化を促進する（Ｂｒｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１
３：３７１６～２５）。
つつある。これらの多くは、免疫賦活性腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor re
ceptor、ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーに対するものである。最近の研究によっ
て、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性及び治療活性が、Ｆｃ
を介したＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への架橋に依存していることが示された（Ｌｉ ｅｔ
ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：１０３０～４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ
．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６２：９４１～
８）。Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩＩＢは、スカフォールドとして作用して、下流の細
胞内シグナル伝達を活性化するための必要条件である受容体のクラスタリングを促進する
抗体の多量体化を促進する（Ｂｒｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ １１
３：３７１６～２５）。
抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の抗腫瘍活性を更に最適化するためのアプ
ローチでは、そのＦｃγＲＩＩＢ会合を改善するために抗体のＦｃ領域を遺伝子操作して
きた。置換Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８
Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒは、ＦｃγＲＩＩＢ会合を選択的に強化することが報告され
ている（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６～
３３；Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅ
ｌ ２６：５８９～９８）。ＦｃγＲＩＩＢ会合の最適化は実行可能なアプローチである
が、このような遺伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性は、局所腫瘍微小環境における
ＦｃγＲ発現細胞の密度に依存するので、このような抗体の有効性が多少制限されること
がある。
ローチでは、そのＦｃγＲＩＩＢ会合を改善するために抗体のＦｃ領域を遺伝子操作して
きた。置換Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８
Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒは、ＦｃγＲＩＩＢ会合を選択的に強化することが報告され
ている（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６～
３３；Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅ
ｌ ２６：５８９～９８）。ＦｃγＲＩＩＢ会合の最適化は実行可能なアプローチである
が、このような遺伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性は、局所腫瘍微小環境における
ＦｃγＲ発現細胞の密度に依存するので、このような抗体の有効性が多少制限されること
がある。
したがって、更なる最適化された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が必要と
されている。
されている。
本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー
抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ
／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、当
該突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提
供する。
抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ
／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、当
該突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提
供する。
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物も提供する
。
。
また、本発明は、被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニ
スト活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変
異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入して、ＴＮＦＲスー
パーファミリーメンバーに特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成することと、
遺伝子操作を受けた抗体を被験体に投与することとを含む、上記方法を提供する。
スト活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変
異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入して、ＴＮＦＲスー
パーファミリーメンバーに特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成することと、
遺伝子操作を受けた抗体を被験体に投与することとを含む、上記方法を提供する。
また、本発明は、被験体における癌を治療する方法であって、癌を治療するのに十分な
時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又
はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメ
ンバー抗体を被験体に投与することを含む、上記方法を提供する。
時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又
はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメ
ンバー抗体を被験体に投与することを含む、上記方法を提供する。
また、本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメ
ンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３
４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含
み、癌の治療における使用について、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴ
ニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
ンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３
４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含
み、癌の治療における使用について、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴ
ニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
また、本発明は、癌を治療するための医薬品の製造における、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ
３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残
基の付番はＥＵインデックスに従う）を含む、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ
Ｒ）スーパーファミリーメンバー抗体の使用を提供する。
３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残
基の付番はＥＵインデックスに従う）を含む、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ
Ｒ）スーパーファミリーメンバー抗体の使用を提供する。
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）全
ての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用さ
れる。
ての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用さ
れる。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を
意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用さ
れる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一
般的に理解されているものと同じ意味を有する。
意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用さ
れる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一
般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験
を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明
を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明
を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａ
ｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象
を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞
の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
ｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象
を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞
の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
「抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体」又は「抗ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバー抗体」とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特
異的に結合する抗体を指す。
ＦＲスーパーファミリーメンバー抗体」とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特
異的に結合する抗体を指す。
「ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー」には、ＴＮＦＲの自然発生変異体をはじめと
する、表１に示す受容体などのＴＮＦＲスーパーファミリーに属する受容体が含まれる。
ＴＮＦＲは、典型的には、Ｉ型膜貫通タンパク質として発現し、その細胞外ドメインに１
～６個のシステインリッチドメインを含有する。シグナル伝達は、ＴＮＦＲ三量体として
生じる。各ＴＮＦＲごとに１つのアイソフォームのアミノ酸配列を表１に示す。ＴＮＦＲ
のリガンドも表１に示す。
する、表１に示す受容体などのＴＮＦＲスーパーファミリーに属する受容体が含まれる。
ＴＮＦＲは、典型的には、Ｉ型膜貫通タンパク質として発現し、その細胞外ドメインに１
～６個のシステインリッチドメインを含有する。シグナル伝達は、ＴＮＦＲ三量体として
生じる。各ＴＮＦＲごとに１つのアイソフォームのアミノ酸配列を表１に示す。ＴＮＦＲ
のリガンドも表１に示す。
「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「結合する」とは、抗ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー抗体が、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー又は当該特定の
ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー内のエピトープに対して、他の抗原に対するよりも
高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、結合についての平衡解離定数（
ＫＤ）が約１×１０－８Ｍ以下、例えば約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下
、約１×１０－１１Ｍ以下又は約１×１０－１２Ｍ以下であるときに「特異的に結合し、
典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合については、そのＫＤ
の少なくとも１００分の１のＫＤで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定するこ
とができる。しかし、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー又は当該特定のＴＮＦ
Ｒスーパーファミリーメンバー内のエピトープに特異的に結合する抗ＴＮＦＲスーパーフ
ァミリーメンバー抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ
ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔ
ｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ（コモ
ンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して
交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに
特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピ
トープに特異的に結合する。
ファミリーメンバー抗体が、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー又は当該特定の
ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー内のエピトープに対して、他の抗原に対するよりも
高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、結合についての平衡解離定数（
ＫＤ）が約１×１０－８Ｍ以下、例えば約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下
、約１×１０－１１Ｍ以下又は約１×１０－１２Ｍ以下であるときに「特異的に結合し、
典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合については、そのＫＤ
の少なくとも１００分の１のＫＤで結合する。解離定数は標準的手法を用いて測定するこ
とができる。しかし、特定のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー又は当該特定のＴＮＦ
Ｒスーパーファミリーメンバー内のエピトープに特異的に結合する抗ＴＮＦＲスーパーフ
ァミリーメンバー抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ
ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔ
ｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ（コモ
ンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して
交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、１つの抗原又は１つのエピトープに
特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピ
トープに特異的に結合する。
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体
を含むモノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体
、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原
結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構造を含む免疫グロブリン分
子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている２本
の重鎖（heavy chains、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chains、ＬＣ）、並びにこれらの
多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（heavy chain vari
able region、ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３のドメイ
ンで構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（
ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在し
ており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及
びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、Ｆ
Ｒ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つの
ＦＲセグメントで構成される。
を含むモノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体
、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原
結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構造を含む免疫グロブリン分
子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている２本
の重鎖（heavy chains、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chains、ＬＣ）、並びにこれらの
多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（heavy chain vari
able region、ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３のドメイ
ンで構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（
ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在し
ており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及
びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、Ｆ
Ｒ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つの
ＦＲセグメントで構成される。
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体における「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、
様々な用語を用いて定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣ
ＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する相補性決定
領域（Complementarity Determining Regions、ＣＤＲ）は配列多様性に基づく（Ｗｕ
ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１３２：２１１～５０；Ｋａｂａｔ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃ
ｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する「超可変性領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈ
ｉａ及びＬｅｓｋによって定義されているとおり、構造が超可変性である抗体可変ドメイ
ンの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６
：９０１～１７）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭ
ＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位につ
いての標準化付番及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応関係
については、（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ ２７：５５～７７に記載されている。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、
「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、
及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂ
ａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義さ
れるＣＤＲを含む。
様々な用語を用いて定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣ
ＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する相補性決定
領域（Complementarity Determining Regions、ＣＤＲ）は配列多様性に基づく（Ｗｕ
ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１３２：２１１～５０；Ｋａｂａｔ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃ
ｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する「超可変性領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈ
ｉａ及びＬｅｓｋによって定義されているとおり、構造が超可変性である抗体可変ドメイ
ンの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６
：９０１～１７）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭ
ＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位につ
いての標準化付番及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応関係
については、（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ ２７：５５～７７に記載されている。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、
「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、
及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂ
ａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義さ
れるＣＤＲを含む。
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、
すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及び
ＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇ
Ｇ４へと更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのア
ミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ
（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及び
ＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇ
Ｇ４へと更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのア
ミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ
（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
「抗体フラグメント」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決
定領域（ＨＣＤＲ）１、２、及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２、及び３、
重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保持する免疫グロブリン分子の一部
を指す。抗体フラグメントとしては、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖフラ
グメント、並びに１つのＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。合
成リンカーを介してＶＨドメイン及びＶＬドメインを互いに連結して様々な種類の一本鎖
抗体の設計を形成することが可能であり、その場合、ＶＨ／ＶＬドメインは、分子内で対
形成してもよく、又はＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構造物によって
発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの一価抗原結合部
位又はダイアボディを形成してもよい。これらは、例えば、国際公開第１９９８／４４０
０１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号及び同第１９９２／
０１０４７号に記載されている。
定領域（ＨＣＤＲ）１、２、及び３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２、及び３、
重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保持する免疫グロブリン分子の一部
を指す。抗体フラグメントとしては、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖフラ
グメント、並びに１つのＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられる。合
成リンカーを介してＶＨドメイン及びＶＬドメインを互いに連結して様々な種類の一本鎖
抗体の設計を形成することが可能であり、その場合、ＶＨ／ＶＬドメインは、分子内で対
形成してもよく、又はＶＨドメイン及びＶＬドメインが別々の一本鎖抗体構造物によって
発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などの一価抗原結合部
位又はダイアボディを形成してもよい。これらは、例えば、国際公開第１９９８／４４０
０１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号及び同第１９９２／
０１０４７号に記載されている。
「モノクローナル抗体」とは、抗体重鎖からＣ末端リシンを除去するなどの可能な周知
の変化、あるいはメチオニンの酸化又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなど
のアミノ酸の翻訳後修飾による変化を除いて、各重鎖及び各軽鎖のアミノ酸組成が単一で
ある抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原エピトープに結合する二
重特異性のモノクローナル抗体を除き、典型的には１つの抗原エピトープに結合する。モ
ノクローナル抗体は、抗体集団中に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗
体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二価
抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
の変化、あるいはメチオニンの酸化又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなど
のアミノ酸の翻訳後修飾による変化を除いて、各重鎖及び各軽鎖のアミノ酸組成が単一で
ある抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原エピトープに結合する二
重特異性のモノクローナル抗体を除き、典型的には１つの抗原エピトープに結合する。モ
ノクローナル抗体は、抗体集団中に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗
体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二価
抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体又
は抗体フラグメントを指す（例えば、例えばＯＸ－４０に特異的に結合する単離された抗
体は、ＯＸ－４０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。「単離され
た抗体」は、純度が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％
、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、又は１００％の抗体など、高純度に単離された抗体を包含する。
は抗体フラグメントを指す（例えば、例えばＯＸ－４０に特異的に結合する単離された抗
体は、ＯＸ－４０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。「単離され
た抗体」は、純度が８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％
、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、又は１００％の抗体など、高純度に単離された抗体を包含する。
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒ
ト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換
を含んでいてもよく、その結果、当該フレームワークが、発現したヒト免疫グロブリン又
はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでない場合もある。
ト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換
を含んでいてもよく、その結果、当該フレームワークが、発現したヒト免疫グロブリン又
はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでない場合もある。
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来す
る重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指し、ヒト被験体に投与されたときに免
疫応答が最小限に抑えられるように最適化される。抗体が定常領域又は定常領域の一部を
含む場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
る重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指し、ヒト被験体に投与されたときに免
疫応答が最小限に抑えられるように最適化される。抗体が定常領域又は定常領域の一部を
含む場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロ
ブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領
域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系の代表的なものには、ファージ上に提示された
ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン
遺伝子座を保有するマウス又はラットなどといったヒト以外の遺伝子導入動物を含む。「
ヒト抗体」は、抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために用いられる系間の違い
、体細胞突然変異の導入、あるいはフレームワーク若しくは抗原結合部位又はこれら両方
への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロ
ブリン遺伝子と比べてアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生
殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされている
アミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、
８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒ
ト抗体」は、例えば（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
２９６：５７～８６）に記載されているヒトフレームワーク配列解析から得られたコン
センサスフレームワーク配列、又は例えば（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５～９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載さ
れている、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに組み
込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。
ブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領
域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系の代表的なものには、ファージ上に提示された
ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン
遺伝子座を保有するマウス又はラットなどといったヒト以外の遺伝子導入動物を含む。「
ヒト抗体」は、抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために用いられる系間の違い
、体細胞突然変異の導入、あるいはフレームワーク若しくは抗原結合部位又はこれら両方
への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロ
ブリン遺伝子と比べてアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生
殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされている
アミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、
８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒ
ト抗体」は、例えば（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
２９６：５７～８６）に記載されているヒトフレームワーク配列解析から得られたコン
センサスフレームワーク配列、又は例えば（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５～９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載さ
れている、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに組み
込まれた合成ＨＣＤＲ３を含み得る。
ヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ファージディスプレイ組み込み合成Ｃ
ＤＲ及び／又は合成フレームワークなどの系を用いて作製することもでき、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ突然変異誘発に供して抗体特性を改善した結果、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生
殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。
ＤＲ及び／又は合成フレームワークなどの系を用いて作製することもでき、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ突然変異誘発に供して抗体特性を改善した結果、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生
殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。
抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「組み換え体」とは、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体及
びその他のタンパク質を指す。
びその他のタンパク質を指す。
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは典型的に
は、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又
は多糖側鎖などの部分の表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性
を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続
なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部
分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するように
なる。抗体の「エピトープ」は、エピトープを同定するために使用される方法論に依存す
る。
は、化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性など）部分の表面集団、例えばアミノ酸又
は多糖側鎖などの部分の表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性
を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び／又は不連続
なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部
分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するように
なる。抗体の「エピトープ」は、エピトープを同定するために使用される方法論に依存す
る。
「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特
異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、
例えばＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ
ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊ
ａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種由来の同じ抗原（
ホモログ）に対して交差反応性を有し得るか、あるいは２つ以上の異なる抗原間で共有さ
れているエピトープに結合し得る。
異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、
例えばＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ
ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊ
ａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの他の種由来の同じ抗原（
ホモログ）に対して交差反応性を有し得るか、あるいは２つ以上の異なる抗原間で共有さ
れているエピトープに結合し得る。
「多重特異性」とは、２つ以上の異なる抗原又は同じ抗原内の２つ以上の異なるエピト
ープに特異的に結合する抗体を指す。
ープに特異的に結合する抗体を指す。
「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる
、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製
することができる生物学的要素を利用して、例えば、細胞、ウイルス、動物、植物などの
生物系及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進す
る機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメント
を含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分
子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製
することができる生物学的要素を利用して、例えば、細胞、ウイルス、動物、植物などの
生物系及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進す
る機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメント
を含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分
子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコード
されるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利
用できるベクターを指す。
されるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利
用できるベクターを指す。
「ポリヌクレオチド」は、糖－リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結
合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、合成ポリヌクレオチドの典型
例である。
合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。ｃＤＮＡは、合成ポリヌクレオチドの典型
例である。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチ
ドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸か
らなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
ドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。５０個未満のアミノ酸か
らなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。
本明細書で使用されるとき、「癌細胞」又は「腫瘍細胞」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ
ｖｉｖｏ又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を
有する癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。これら変化は、必ずしも新たな遺伝物質
の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム
核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は
発癌物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形
質転換／癌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏにおける、形態
学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マ
ーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖な
どによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ
ｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４
年））。
ｖｉｖｏ又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は導入された表現型の変化を
有する癌性、前癌性、又は形質転換細胞を指す。これら変化は、必ずしも新たな遺伝物質
の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム
核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は
発癌物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形
質転換／癌は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏにおける、形態
学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マ
ーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖な
どによって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ
ｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４
年））。
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であるこ
とを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事
項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は
明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に
従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味す
る。
とを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事
項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は
明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に
従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味す
る。
「価数」は、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が指定された数存在することを指
す。そのため、「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」なる用語はそれぞれ、抗原
に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。
す。そのため、「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」なる用語はそれぞれ、抗原
に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。
「アゴニスト」とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの少なくとも１つの生物活
性を誘導する抗体であって、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの天然リガンドによっ
て誘導されるものに結合する抗体を指す。例示的なアゴニスト活性としては、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏアッセイにおいてＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリ
ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生の誘導、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）における
ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ－ＤＲの表面発現の増加によって評価されるＤ
Ｃ分化の誘導、Ｂ細胞増殖の増加又はＢ細胞におけるＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、Ｃ
Ｄ８６及びＨＬＡ－ＤＲの表面発現の増加によって評価されるＢ細胞の活性化、抗原に既
に曝露された患者から単離されたＰＢＭＣによるインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の
産生によって評価される抗原特異的Ｔ細胞リコール応答の誘導、並びにＣＤ４＋又はＣＤ
８＋Ｔ細胞増殖の誘導が挙げられる。アゴニスト活性（例えば、アゴニズム）は、架橋依
存性である場合もあり、抗体架橋に依存しない場合もある。
性を誘導する抗体であって、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの天然リガンドによっ
て誘導されるものに結合する抗体を指す。例示的なアゴニスト活性としては、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏアッセイにおいてＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリ
ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生の誘導、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）における
ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ－ＤＲの表面発現の増加によって評価されるＤ
Ｃ分化の誘導、Ｂ細胞増殖の増加又はＢ細胞におけるＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、Ｃ
Ｄ８６及びＨＬＡ－ＤＲの表面発現の増加によって評価されるＢ細胞の活性化、抗原に既
に曝露された患者から単離されたＰＢＭＣによるインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の
産生によって評価される抗原特異的Ｔ細胞リコール応答の誘導、並びにＣＤ４＋又はＣＤ
８＋Ｔ細胞増殖の誘導が挙げられる。アゴニスト活性（例えば、アゴニズム）は、架橋依
存性である場合もあり、抗体架橋に依存しない場合もある。
「強化されたアゴニスト活性」又は「強化されたアゴニズム」とは、ＮＦκＢ誘導性プ
ロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗ＴＮＦＲ
スーパーファミリーメンバー抗体によって誘導される産生によってアゴニスト活性が測定
されるとき、親野生型抗体と比べて遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメ
ンバー抗体のアゴニズムが改善されたことを指す。遺伝子操作を受けた抗体は、架橋依存
的又は架橋非依存的に１μｇ／ｍＬの抗体濃度の野生型親抗体と比べて少なくとも２０％
高いレベルでＳＥＡＰ産生を誘導するとき、「強化されたアゴニスト活性」を有する。
ロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗ＴＮＦＲ
スーパーファミリーメンバー抗体によって誘導される産生によってアゴニスト活性が測定
されるとき、親野生型抗体と比べて遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメ
ンバー抗体のアゴニズムが改善されたことを指す。遺伝子操作を受けた抗体は、架橋依存
的又は架橋非依存的に１μｇ／ｍＬの抗体濃度の野生型親抗体と比べて少なくとも２０％
高いレベルでＳＥＡＰ産生を誘導するとき、「強化されたアゴニスト活性」を有する。
「架橋」とは、ＦｃγＲ、例えば、シス型又はトランス型のＦｃγＲＩＩｂに結合する
抗体によって誘導され、その結果、ＴＮＦＲの抗体によって誘導される多量体化及びＴＮ
ＦＲアゴニスト活性の誘導が生じる、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを発現してい
る細胞における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の高次多量体化を指す。架橋
は、本明細書に記載されるとおり、架橋剤としての抗ヒトＦ（ａｂ’）２、又はＲａｊｉ
細胞などのＦｃγＲＩＩｂを発現している細胞を使用することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ
で評価することができる。
抗体によって誘導され、その結果、ＴＮＦＲの抗体によって誘導される多量体化及びＴＮ
ＦＲアゴニスト活性の誘導が生じる、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを発現してい
る細胞における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の高次多量体化を指す。架橋
は、本明細書に記載されるとおり、架橋剤としての抗ヒトＦ（ａｂ’）２、又はＲａｊｉ
細胞などのＦｃγＲＩＩｂを発現している細胞を使用することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ
で評価することができる。
「抗体架橋に依存しないアゴニスト活性」とは、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＢを
発現しているＲａｊｉ細胞の非存在下において、溶液中で本明細書の実施例３に記載のＨ
ＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）リポーターアッセイにおいてＳＥＡＰの産生を抗体が誘導するこ
とを意味する。
発現しているＲａｊｉ細胞の非存在下において、溶液中で本明細書の実施例３に記載のＨ
ＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）リポーターアッセイにおいてＳＥＡＰの産生を抗体が誘導するこ
とを意味する。
「被験体」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」には、例えば、非ヒ
ト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物
及び非哺乳動物などのすべての脊椎動物が含まれる。
ト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物
及び非哺乳動物などのすべての脊椎動物が含まれる。
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、特に明示的に
指定しない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ
Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅ
ａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のとおりＥＵインデックスに従
う。
指定しない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ
Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅ
ａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のとおりＥＵインデックスに従
う。
表２に示すとおり、従来の１文字及び３文字アミノ酸コードが本明細書で使用される。
組成物
本発明は、抗体エフェクター機能のアイソタイプ依存性調節に加えて強化されたアゴニ
スト活性を示す、改善された特性を有する遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミ
リーメンバー抗体を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、表面細胞において抗ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を多量体化する置換が、架橋に依存せずに当該抗体
のアゴニスト活性を強化するという知見に基づいている。
本発明は、抗体エフェクター機能のアイソタイプ依存性調節に加えて強化されたアゴニ
スト活性を示す、改善された特性を有する遺伝子操作を受けた抗ＴＮＦＲスーパーファミ
リーメンバー抗体を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、表面細胞において抗ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を多量体化する置換が、架橋に依存せずに当該抗体
のアゴニスト活性を強化するという知見に基づいている。
本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー
抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、所望により、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｓ４４０
Ｙ突然変異、又はＥ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を更に含み（残基の付番はＥＵインデ
ックスに従う）、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する
、上記抗体を提供する。
抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、所望により、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｓ４４０
Ｙ突然変異、又はＥ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を更に含み（残基の付番はＥＵインデ
ックスに従う）、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する
、上記抗体を提供する。
また、本発明は、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメ
ンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３
４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含
み、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を
提供する。
ンバー抗体であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３
４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含
み、突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を
提供する。
Ｅ３４５Ｒ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の
アゴニスト活性を強化することが示された。
アゴニスト活性を強化することが示された。
Ｅ４３０Ｇ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の
アゴニスト活性を強化することが示された。
アゴニスト活性を強化することが示された。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメ
ンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
ンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ置換は、本明細書において、抗ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
ファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化することが示された。
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ
３４５Ｒ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ３４５Ｒ突然変異
を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
３４５Ｒ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ３４５Ｒ突然変異
を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ
４３０Ｇ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ４３０Ｇ突然変異
を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
４３０Ｇ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ４３０Ｇ突然変異
を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ
３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ３４
５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する
、上記抗体を提供する。
３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、Ｅ３４
５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する
、上記抗体を提供する。
また、本発明は、単離された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体であって、Ｅ
３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を
含み、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を有しない親抗体と比べて強化され
たアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を
含み、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を有しない親抗体と比べて強化され
たアゴニスト活性を有する、上記抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、Ｆ
ｃγＲ抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有する。したがって、ＦｃγＲ架橋に依存
しないアゴニスト活性を有する本発明の抗体は、そのアゴニスト活性について、腫瘍微小
環境においてＦｃγＲを発現している細胞のバイオアベイラビリティ及び密度に依存せず
、十分なＦｃγＲ細胞浸潤を欠く環境においてＴＮＦＲシグナル伝達を誘導することがで
きる。
ｃγＲ抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有する。したがって、ＦｃγＲ架橋に依存
しないアゴニスト活性を有する本発明の抗体は、そのアゴニスト活性について、腫瘍微小
環境においてＦｃγＲを発現している細胞のバイオアベイラビリティ及び密度に依存せず
、十分なＦｃγＲ細胞浸潤を欠く環境においてＴＮＦＲシグナル伝達を誘導することがで
きる。
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、天然リガンドよりも低いアゴ
ニズムのレベルを示し得るので、改善された安全性プロファイルを提供することができる
。
ニズムのレベルを示し得るので、改善された安全性プロファイルを提供することができる
。
「親抗体」とは、本発明の遺伝子操作を受けた抗体を産生するために使用される抗ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を指す。
ＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を指す。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cel
lular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を媒介する。
lular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（antibody-dependent cel
l phagocytosis、ＡＤＣＰ）を媒介する。
l phagocytosis、ＡＤＣＰ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
いくつかの実施形態では、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性
エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ
４３５Ｒ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然
変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用すること
ができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置
である。
エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ
４３５Ｒ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然
変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用すること
ができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置
である。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ
突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ
突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変
異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変
異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ
／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ
／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更
に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更
に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ
／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ
／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ３アイソタ
イプである。
イプである。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含
む。
イプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含
む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、抗体架橋に依存し
ないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－２９３細胞由来のＮＦκＢ
誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗
体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
ないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－２９３細胞由来のＮＦκＢ
誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗
体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列
番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ
４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、Ｃ
Ｄ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受
容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１
３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲ
リン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）
、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２
０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴ
Ｒ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス
受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合
する。
ファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列
番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ
４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、Ｃ
Ｄ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受
容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１
３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲ
リン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）
、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２
０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴ
Ｒ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス
受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合
する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列
番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列
番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
ファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
ファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
ファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
ファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適
である。
である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍の治療において使用するの
に好適である。
に好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ
）の治療において使用するのに好適である。
）の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上皮ＮＳＣＬＣの治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌腫（renal cell carcinoma
、ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌腫又は腎乳頭状細胞癌腫）、又はその転移巣の治療にお
いて使用するのに好適である。
、ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌腫又は腎乳頭状細胞癌腫）、又はその転移巣の治療にお
いて使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌（nasopharyngeal carcino
ma、ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
ma、ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療において使用する
のに好適である。
のに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療において使用するの
に好適である。
に好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮癌腫の治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管の癌腫の治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器癌の治療において使用する
のに好適である。
のに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療において使用する
のに好適である。
のに好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸癌の治療において使用するの
に好適である。
に好適である。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の転移巣の治療において使用
するのに好適である。
するのに好適である。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
いくつかの実施形態では、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む本発明の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性
エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ
４３０Ｇ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然
変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用すること
ができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置
である。
エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。したがって、Ｅ
４３０Ｇ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然
変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用すること
ができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置
である。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ
突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ
突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変
異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変
異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ１アイソタ
イプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ
／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ
／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更
に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異を更
に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ２アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ
／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ
／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ３アイソタ
イプである。
イプである。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更
に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
イプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＩｇＧ４アイソタ
イプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含
む。
イプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含
む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、抗体架橋に依存し
ないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－２９３細胞由来のＮＦκＢ
誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗
体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
ないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－２９３細胞由来のＮＦκＢ
誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の抗
体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列
番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ
４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、Ｃ
Ｄ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受
容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１
３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲ
リン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）
、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２
０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴ
Ｒ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス
受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合
する。
ファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受容体２（配列
番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ
４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列番号７）、Ｃ
Ｄ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、デス受
容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１（配列番号１
３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オステオプロテゲ
リン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配列番号１８）
、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（配列番号２
０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２２）、ＧＩＴ
Ｒ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号２５）、デス
受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号２７）に結合
する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列
番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ４０（配列
番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
ファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
ファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
ファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
ファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
ファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適
である。
である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用するのに好適
である。
である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍の治療において使用するの
に好適である。
に好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ
）の治療において使用するのに好適である。
）の治療において使用するのに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上皮ＮＳＣＬＣの治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）（例えば、腎
明細胞癌腫又は腎乳頭状細胞癌腫）、又はその転移巣の治療において使用するのに好適で
ある。
明細胞癌腫又は腎乳頭状細胞癌腫）、又はその転移巣の治療において使用するのに好適で
ある。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌（ＮＰＣ）の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療において使用する
のに好適である。
のに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療において使用するの
に好適である。
に好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮癌腫の治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管の癌腫の治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治療において使用するのに好
適である。
適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療において使用するのに
好適である。
好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器癌の治療において使用する
のに好適である。
のに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療において使用する
のに好適である。
のに好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸癌の治療において使用するの
に好適である。
に好適である。
Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の転移巣の治療において使用
するのに好適である。
するのに好適である。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
いくつかの実施形態では、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む本発明の抗体は、抗
体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。し
たがって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減
又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望まし
くない場合に使用することができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ
２７抗体による治療的処置である。
体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に含み得る。し
たがって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減
又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦＲ発現細胞の枯渇が望まし
くない場合に使用することができる。例示的なこのような場合は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ
２７抗体による治療的処置である。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ
／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ
／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ
／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３
５８Ｍ突然変異を更に含む。
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ
／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３
５８Ｍ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
Ｇ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
Ｇ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
Ｇ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
Ｇ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ
／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
突然変異を更に含む。
Ｇ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ
／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
Ｇ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ
／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ３アイソタイプである。
Ｇ３アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
Ｇ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、Ｉｇ
Ｇ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を含む。
Ｇ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、抗体
架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－２９３細胞由
来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（Ｓ
ＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－２９３細胞由
来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスファターゼ（Ｓ
ＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受
容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番
号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列
番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１
０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１
（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オス
テオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配
列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター
（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２
２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号
２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号
２７）に結合する。
ＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死因子受
容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（配列番
号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３（配列
番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列番号１
０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受容体１
（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）、オス
テオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣＩ（配
列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター
（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列番号２
２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配列番号
２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配列番号
２７）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、Ｃ
Ｄ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に
結合する。
ＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８）、Ｃ
Ｄ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２３）に
結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
ＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
ＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
ＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
ＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含み、ＴＮ
ＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
ＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用
するのに好適である。
するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療において使用
するのに好適である。
するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍の治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治療において使
用するのに好適である。
用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌
（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ
の治療において使用するのに好適である。
の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（
例えば、腎明細胞癌又は腎乳頭状細胞癌）、又はその転移巣の治療において使用するのに
好適である。
例えば、腎明細胞癌又は腎乳頭状細胞癌）、又はその転移巣の治療において使用するのに
好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌（ＮＰＣ）の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸癌の治療にお
いて使用するのに好適である。
いて使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌又は去勢抵抗
性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使
用するのに好適である。
用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治療において使
用するのに好適である。
用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌の治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の扁平上皮癌腫
の治療において使用するのに好適である。
の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は胃腸管の癌腫
の治療において使用するのに好適である。
の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治療において使
用するのに好適である。
用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治療において使
用するのに好適である。
用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の治療において
使用するのに好適である。
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器癌の治療にお
いて使用するのに好適である。
いて使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜症の治療にお
いて使用するのに好適である。
いて使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸癌の治療におい
て使用するのに好適である。
て使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の転移巣の治療
において使用するのに好適である。
において使用するのに好適である。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含む。
を含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を媒介する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＤＣを媒介する。
いくつかの実施形態では、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む本発明
の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に
含み得る。したがって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介
性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦ
Ｒ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用することができる。例示的なこのような場合
は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置である。
の抗体は、抗体Ｆｃ媒介性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を更に
含み得る。したがって、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異及び抗体Ｆｃ媒介
性エフェクター機能を低減又は消失させる第２の突然変異を含む本発明の抗体は、ＴＮＦ
Ｒ発現細胞の枯渇が望ましくない場合に使用することができる。例示的なこのような場合
は、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ２７抗体による治療的処置である。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ
／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ｆ
／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ
／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３
６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＫ２１４Ｔ
／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３
６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異
を更に含む。
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異
を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ１アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ１と比べてＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異
を更に含む。
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ
／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異
を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ
／Ｇ２３７Ａ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＶ２３４Ａ
／Ｇ２３７Ａ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ
／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ２アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ２と比べてＨ２６８Ｑ
／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
を含み、ＩｇＧ３アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＦ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ
／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ
／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ
／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む
。
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ
／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異を更に含む
。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ
／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、所望により、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ
／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を更に含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を含む。
を含み、ＩｇＧ４アイソタイプであり、野生型ＩｇＧ４と比べてＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ
／Ｌ２３５Ａ突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－
２９３細胞由来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスフ
ァターゼ（ＳＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される
。
を含み、抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有し、当該アゴニスト活性は、Ｈｅｋ－
２９３細胞由来のＮＦκＢ誘導性プロモーターの制御下で発現する分泌型アルカリホスフ
ァターゼ（ＳＥＡＰ）の抗体によって誘導される産生を測定することによって測定される
。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫
瘍壊死因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ
４０（配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受
容体３（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７
（配列番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デ
コイ受容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号
１５）、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、
ＴＡＣＩ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メ
ディエーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原
（配列番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体
６（配列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容
体（配列番号２７）に結合する。
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫
瘍壊死因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ
４０（配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受
容体３（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７
（配列番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デ
コイ受容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号
１５）、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、
ＴＡＣＩ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メ
ディエーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原
（配列番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体
６（配列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容
体（配列番号２７）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列
番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列
番号２３）に結合する。
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列
番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列
番号２３）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＯＸ４０（配列番号４）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ２７（配列番号８）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ４０（配列番号５）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＣＤ１３７（配列番号１０）に結合する。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
を含み、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＧＩＴＲ（配列番号２３）に結合する。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療
において使用するのに好適である。
において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、癌の治療
において使用するのに好適である。
において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、固形腫瘍
の治療において使用するのに好適である。
の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、黒色腫の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺癌の治
療において使用するのに好適である。
療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、扁平上皮
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、非扁平上
皮ＮＳＣＬＣの治療において使用するのに好適である。
皮ＮＳＣＬＣの治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肺腺癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、腎細胞癌
（ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌又は腎乳頭状細胞癌）、又はその転移巣の治療において
使用するのに好適である。
（ＲＣＣ）（例えば、腎明細胞癌又は腎乳頭状細胞癌）、又はその転移巣の治療において
使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、中皮腫の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、上咽頭癌
（ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
（ＮＰＣ）の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、結腸直腸
癌の治療において使用するのに好適である。
癌の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、前立腺癌
又は去勢抵抗性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
又は去勢抵抗性前立腺癌の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治
療において使用するのに好適である。
療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵巣癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、胃癌の治
療において使用するのに好適である。
療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、肝臓癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、膵臓癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、甲状腺癌
の治療において使用するのに好適である。
の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、頭頸部の
扁平上皮癌腫の治療において使用するのに好適である。
扁平上皮癌腫の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、食道又は
胃腸管の癌腫の治療において使用するのに好適である。
胃腸管の癌腫の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、乳癌の治
療において使用するのに好適である。
療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、卵管癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、脳癌の治
療において使用するのに好適である。
療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿道癌の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、尿生殖器
癌の治療において使用するのに好適である。
癌の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮内膜
症の治療において使用するのに好適である。
症の治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、子宮頸の
治療において使用するのに好適である。
治療において使用するのに好適である。
Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗体は、治療、例えば、当該癌の
転移巣の治療において使用するのに好適である。
転移巣の治療において使用するのに好適である。
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、エ
フェクター細胞で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介した、抗体被膜標的細胞と
、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ及び好中球などの溶解活性を有するエフ
ェクター細胞との相互作用に依存して、細胞死を誘導する機序である。例えば、ＮＫ細胞
はＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩ
ＩＩＡを発現する。ＴＮＦＲ発現細胞などの抗体被膜標的細胞の死滅は、膜孔形成タンパ
ク質及びプロテアーゼの分泌を通じたエフェクター細胞の活性により生じる。本発明の抗
体のＡＤＣＣ活性を評価するために、抗体を免疫エフェクター細胞と組み合わせてＴＮＦ
Ｒ発現細胞に添加してよく、当該免疫エフェクター細胞は抗原抗体複合体によって活性化
され、その結果、標的細胞の細胞溶解が生じ得る。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識
（例えば、放射性基質、蛍光染料又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出するこ
とができる。そのようなアッセイの代表的なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞が挙げられる。例示的な標的細胞としては、Ｔｒｅｇなどの内
因的に又は組み換えでＴＮＦＲを発現する細胞が挙げられる。例示的なアッセイでは、標
的細胞は、１標的細胞に対して５０エフェクター細胞の比で使用される。標的細胞を、３
７℃で２０分間ＢＡＴＤＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で予標識し、２回洗浄し、ＤＭＥ
Ｍ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）
に再懸濁させる。標的（１×１０４細胞）及びエフェクター細胞（０．５×１０６細胞）
を合わせ、１００μＬの細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに添加する。試験抗体を
含むか又は含まない、更なる１００μＬを添加する。プレートを２００ｇで３分間遠心分
離し、３７℃で２時間インキュベートし、次いで、２００ｇで３分間再び遠心分離する。
１ウェル当たり合計２０μＬの上清を除去し、２００μＬのＤＥＬＰＨＩＡ Ｅｕｒｏｐ
ｉｕｍ系試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によって細胞溶解を測定する。０．６７
％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対
してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの
自然放出によって最小対照を求める。あるいは、受容体の活性化が本明細書に記載される
ルシフェラーゼリポーターの発現を引き起こすリポーター遺伝子アッセイにおいてＦｃγ
ＲＩＩＩＡの活性化を評価することによってＡＤＣＣ活性を評価することができる。
フェクター細胞で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介した、抗体被膜標的細胞と
、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ及び好中球などの溶解活性を有するエフ
ェクター細胞との相互作用に依存して、細胞死を誘導する機序である。例えば、ＮＫ細胞
はＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩ
ＩＩＡを発現する。ＴＮＦＲ発現細胞などの抗体被膜標的細胞の死滅は、膜孔形成タンパ
ク質及びプロテアーゼの分泌を通じたエフェクター細胞の活性により生じる。本発明の抗
体のＡＤＣＣ活性を評価するために、抗体を免疫エフェクター細胞と組み合わせてＴＮＦ
Ｒ発現細胞に添加してよく、当該免疫エフェクター細胞は抗原抗体複合体によって活性化
され、その結果、標的細胞の細胞溶解が生じ得る。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識
（例えば、放射性基質、蛍光染料又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出するこ
とができる。そのようなアッセイの代表的なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞が挙げられる。例示的な標的細胞としては、Ｔｒｅｇなどの内
因的に又は組み換えでＴＮＦＲを発現する細胞が挙げられる。例示的なアッセイでは、標
的細胞は、１標的細胞に対して５０エフェクター細胞の比で使用される。標的細胞を、３
７℃で２０分間ＢＡＴＤＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で予標識し、２回洗浄し、ＤＭＥ
Ｍ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）
に再懸濁させる。標的（１×１０４細胞）及びエフェクター細胞（０．５×１０６細胞）
を合わせ、１００μＬの細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに添加する。試験抗体を
含むか又は含まない、更なる１００μＬを添加する。プレートを２００ｇで３分間遠心分
離し、３７℃で２時間インキュベートし、次いで、２００ｇで３分間再び遠心分離する。
１ウェル当たり合計２０μＬの上清を除去し、２００μＬのＤＥＬＰＨＩＡ Ｅｕｒｏｐ
ｉｕｍ系試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によって細胞溶解を測定する。０．６７
％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対
してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの
自然放出によって最小対照を求める。あるいは、受容体の活性化が本明細書に記載される
ルシフェラーゼリポーターの発現を引き起こすリポーター遺伝子アッセイにおいてＦｃγ
ＲＩＩＩＡの活性化を評価することによってＡＤＣＣ活性を評価することができる。
「抗体依存性細胞貪食」（「ＡＤＣＰ」）とは、例えばマクロファージ又は樹状細胞な
どの貪食細胞による取り込みにより、抗体被覆標的細胞を排除する機序を指す。ＡＤＣＰ
は、エフェクター細胞として単球由来マクロファージを用い、ＧＦＰ又は別の標識分子を
発現するように遺伝子操作された標的細胞として、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標
）ＣＣＬ－２１３（商標））、又はＴＮＦＲを発現しているＢ細胞性白血病若しくはリン
パ腫若しくは腫瘍の細胞を用いて評価され得る。エフェクター：標的細胞比は、例えば４
：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加し又は添加せずに、
標的細胞と共に４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクタ
ーゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び
抗ＣＤ１４抗体を用いて同定され得、貪食の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋
ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光の割合（％）に基づいて決定され得る。
どの貪食細胞による取り込みにより、抗体被覆標的細胞を排除する機序を指す。ＡＤＣＰ
は、エフェクター細胞として単球由来マクロファージを用い、ＧＦＰ又は別の標識分子を
発現するように遺伝子操作された標的細胞として、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標
）ＣＣＬ－２１３（商標））、又はＴＮＦＲを発現しているＢ細胞性白血病若しくはリン
パ腫若しくは腫瘍の細胞を用いて評価され得る。エフェクター：標的細胞比は、例えば４
：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加し又は添加せずに、
標的細胞と共に４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクタ
ーゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び
抗ＣＤ１４抗体を用いて同定され得、貪食の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋
ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光の割合（％）に基づいて決定され得る。
本発明の抗体のエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣは、
活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、又は補体への当該抗体の結合を強化する抗体Ｆｃに更
なる突然変異を導入することによって更に強化され得る。
活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、又は補体への当該抗体の結合を強化する抗体Ｆｃに更
なる突然変異を導入することによって更に強化され得る。
活性化Ｆｃγに対する本発明の抗体の結合を増加させるため及び／又は抗体のエフェク
ター機能を強化するために変異させることができるＦｃの位置は、例えば米国特許第６，
７３７，０５６号、米国特許公開第２０１５／０２５９４３４号、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１～６０４、Ｌａｚａｒ
ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０
３：４００５～１０、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ６７：８８８２～９０、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７：２５１７～２７及びＤｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．
（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３に記載されているものであり、２３
６、２３９、２４３、２５６、２９０、２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２
６、３３０、３３２、３３３、３３４、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０位
を含む（残基の付番はＥＵインデックスに従う）。単独で又は組み合わせて行うことがで
きる代表的な突然変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０
Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３
３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌ突然変異である。ＡＤＣＣ
又はＡＤＣＰが増加した抗体が生じる例示的な突然変異の組み合わせは、ＩｇＧ１におけ
るＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９
２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ
２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２
Ｅ突然変異である。
ター機能を強化するために変異させることができるＦｃの位置は、例えば米国特許第６，
７３７，０５６号、米国特許公開第２０１５／０２５９４３４号、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１～６０４、Ｌａｚａｒ
ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０
３：４００５～１０、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ６７：８８８２～９０、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７：２５１７～２７及びＤｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．
（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３に記載されているものであり、２３
６、２３９、２４３、２５６、２９０、２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２
６、３３０、３３２、３３３、３３４、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０位
を含む（残基の付番はＥＵインデックスに従う）。単独で又は組み合わせて行うことがで
きる代表的な突然変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０
Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３
３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌ突然変異である。ＡＤＣＣ
又はＡＤＣＰが増加した抗体が生じる例示的な突然変異の組み合わせは、ＩｇＧ１におけ
るＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９
２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ
２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２
Ｅ突然変異である。
本発明の抗体のＣＤＣを強化するために突然変異させることができるＦｃの位置は、例
えば国際公開第２０１４／１０８１９８号、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１
）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１～５及びＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０
）ＭＡｂｓ ２：１８１～９に記載されているものであり、２６７、２６８、３２４、３
２６、３３３、３４５及び４３０位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる代
表的な突然変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ
３３３Ａ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔ突然変異である。ＣＤＣが増加した抗
体が生じる例示的な突然変異の組み合わせは、ＩｇＧ１におけるＫ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ
、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６
７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異である。
えば国際公開第２０１４／１０８１９８号、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１
）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１～５及びＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０
）ＭＡｂｓ ２：１８１～９に記載されているものであり、２６７、２６８、３２４、３
２６、３３３、３４５及び４３０位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる代
表的な突然変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ
３３３Ａ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔ突然変異である。ＣＤＣが増加した抗
体が生じる例示的な突然変異の組み合わせは、ＩｇＧ１におけるＫ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ
、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６
７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異である。
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、標的に結合した抗体のＦｃエフェクタード
メインが補体成分Ｃ１ｑに結合して活性化し、次に、当該補体成分が補体カスケードを活
性化して標的細胞を死に至らしめる、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた
、標的細胞表面に対する補体成分の沈着を生じさせて、白血球への補体受容体（例えば、
ＣＲ３）の結合によって、ＡＤＣＣを容易にする。ＴＮＦＲ発現細胞のＣＤＣは、例えば
、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％ ＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５細胞／ウェル（５０μ
Ｌ／ウェル）でＤａｕｄｉ細胞をプレーティングし、０～１００μｇ／ｍＬの最終的な濃
度になるように５０μＬの試験抗体をウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュ
ベートし、１１μＬのプールしたヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間
インキュベートすることによって測定できる。溶解した細胞の割合（％）は、標準の方法
を使用して、ＦＡＣＳアッセイ内のヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る
。
メインが補体成分Ｃ１ｑに結合して活性化し、次に、当該補体成分が補体カスケードを活
性化して標的細胞を死に至らしめる、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた
、標的細胞表面に対する補体成分の沈着を生じさせて、白血球への補体受容体（例えば、
ＣＲ３）の結合によって、ＡＤＣＣを容易にする。ＴＮＦＲ発現細胞のＣＤＣは、例えば
、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％ ＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５細胞／ウェル（５０μ
Ｌ／ウェル）でＤａｕｄｉ細胞をプレーティングし、０～１００μｇ／ｍＬの最終的な濃
度になるように５０μＬの試験抗体をウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュ
ベートし、１１μＬのプールしたヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間
インキュベートすることによって測定できる。溶解した細胞の割合（％）は、標準の方法
を使用して、ＦＡＣＳアッセイ内のヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る
。
本発明の抗体のＡＤＣＣを誘導する能力は、当該抗体のオリゴ糖成分を遺伝子操作する
ことによっても強化することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７にお
いてＮ－グリコシル化され、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ
１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により産生さ
れる抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領
域に結合した二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤ
Ｃ活性を変更することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合によって抗体のＡＤＣＣを
増強する。このようなｍＡｂは、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的
高度に脱フコシル化された抗体の発現を成功させることが報告されている様々な方法、例
えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ６４：２４９～６５）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用
（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３
３～４０）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ
ａｌ．（２０１０）ＭＡｂｓ ２：４０５～１５）、宿主細胞株としてのラットハイブ
リドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６～７３）、α１，６－フコシルトランスフェラーゼ
（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．
（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１～８）、又はβ－１，
４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジα－マンノシダーゼ
ＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシンとの共発現（
Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２
～６；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ
９３：８５１～６１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂ
ｉｏｅｎｇ ９９：６５２～６５）などを使用して実現され得る。
ことによっても強化することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７にお
いてＮ－グリコシル化され、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ
１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により産生さ
れる抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領
域に結合した二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤ
Ｃ活性を変更することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合によって抗体のＡＤＣＣを
増強する。このようなｍＡｂは、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的
高度に脱フコシル化された抗体の発現を成功させることが報告されている様々な方法、例
えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ６４：２４９～６５）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用
（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３
３～４０）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ
ａｌ．（２０１０）ＭＡｂｓ ２：４０５～１５）、宿主細胞株としてのラットハイブ
リドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６～７３）、α１，６－フコシルトランスフェラーゼ
（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．
（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１～８）、又はβ－１，
４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジα－マンノシダーゼ
ＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシンとの共発現（
Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２
～６；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ
９３：８５１～６１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂ
ｉｏｅｎｇ ９９：６５２～６５）などを使用して実現され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、抗
体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強化する第２の突然変異を含む。
体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強化する第２の突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、Ｇ
２３６Ａ突然変異、Ｓ２３９Ｄ突然変異、Ｆ２４３Ｌ突然変異、Ｔ２５６Ａ突然変異、Ｋ
２９０Ａ突然変異、Ｒ２９２Ｐ突然変異、Ｓ２９８Ａ突然変異、Ｙ３００Ｌ突然変異、Ｖ
３０５Ｌ突然変異、Ｋ３２６Ａ突然変異、Ａ３３０Ｋ突然変異、Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｅ
３３３Ａ突然変異、Ｋ３３４Ａ突然変異、Ａ３３９Ｔ突然変異、Ｐ３９６Ｌ突然変異、Ｓ
２６７Ｅ突然変異、Ｈ２６８Ｆ突然変異、Ｓ３２４Ｔ突然変異、Ｋ３２６Ａ突然変異、Ｋ
３２６Ｗ突然変異、Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｅ４３０Ｓ突然変異、Ｅ４３０Ｆ突然変異及び
Ｅ４３０Ｔ突然変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣ
ＤＣを強化する第２の突然変異を含む。
２３６Ａ突然変異、Ｓ２３９Ｄ突然変異、Ｆ２４３Ｌ突然変異、Ｔ２５６Ａ突然変異、Ｋ
２９０Ａ突然変異、Ｒ２９２Ｐ突然変異、Ｓ２９８Ａ突然変異、Ｙ３００Ｌ突然変異、Ｖ
３０５Ｌ突然変異、Ｋ３２６Ａ突然変異、Ａ３３０Ｋ突然変異、Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｅ
３３３Ａ突然変異、Ｋ３３４Ａ突然変異、Ａ３３９Ｔ突然変異、Ｐ３９６Ｌ突然変異、Ｓ
２６７Ｅ突然変異、Ｈ２６８Ｆ突然変異、Ｓ３２４Ｔ突然変異、Ｋ３２６Ａ突然変異、Ｋ
３２６Ｗ突然変異、Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｅ４３０Ｓ突然変異、Ｅ４３０Ｆ突然変異及び
Ｅ４３０Ｔ突然変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣ
ＤＣを強化する第２の突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、Ｓ
２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ突然変異、Ｆ２４
３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ突然変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９
６Ｌ突然変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ突然変異
、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｋ
３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６
８Ｆ突然変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ突然変異及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４
Ｔ突然変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強
化する第２の突然変異を含む。
２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ突然変異、Ｆ２４
３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ突然変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９
６Ｌ突然変異、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ突然変異
、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｋ
３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ突然変異、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６
８Ｆ突然変異、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ突然変異及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４
Ｔ突然変異からなる群から選択される、抗体のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを強
化する第２の突然変異を含む。
本発明の抗体のＡＤＣＣを誘導する能力は、当該抗体のオリゴ糖成分を遺伝子操作する
ことによって強化することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７におい
てＮ－グリコシル化され、大部分のグリカンは、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１
Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により産生され
る抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域
に結合した二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ
活性を変更することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合によって抗体のＡＤＣＣを増
強する。
ことによって強化することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７におい
てＮ－グリコシル化され、大部分のグリカンは、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１
Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により産生され
る抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域
に結合した二分岐の複合体型オリゴ糖からのコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ
活性を変更することなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合によって抗体のＡＤＣＣを増
強する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、約
０％～約１５％、例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８
％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％のフコース含量を有する二分岐
グリカン構造を有する。
０％～約１５％、例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８
％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％のフコース含量を有する二分岐
グリカン構造を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、約
５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、
１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、
１％又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。
５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、
１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、
１％又は０％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。
「フコース含量」とは、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する
。フコースの相対量は、全糖構造に関するフコース含有構造の割合である。これらは、複
数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているとおり、
Ｎ－グリコシダーゼＦで処理されたサンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、並びにオ
リゴ構造及び高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカ
ンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／
又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単
糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに結合
したままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴う
か又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素を
用いた消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）による、ｍＡｂの
成分ペプチドへの消化、並びにそれに続くＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＣ）による分離
、検出、及び定量化、あるいは５）Ａｓｎ２９７でＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた酵素による
特異的脱グリコシル化による、ｍＡｂオリゴ糖のｍＡｂタンパク質からの分離、により特
徴付けられ、定量化され得る。放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実験的
質量を理論的質量と比較することによるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（matrix-a
ssisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析、イオン交換ＨＰＬＣ（
ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ
）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量化、並びに高性能キャピラリー
電気泳動－レーザ誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induc
ed fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量化によって、グリ
カン構造の精密な特性評価を可能にする様々な補助的技術によって分離及び同定すること
ができる。
。フコースの相対量は、全糖構造に関するフコース含有構造の割合である。これらは、複
数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているとおり、
Ｎ－グリコシダーゼＦで処理されたサンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、並びにオ
リゴ構造及び高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカ
ンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／
又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単
糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに結合
したままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴う
か又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素を
用いた消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）による、ｍＡｂの
成分ペプチドへの消化、並びにそれに続くＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＣ）による分離
、検出、及び定量化、あるいは５）Ａｓｎ２９７でＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた酵素による
特異的脱グリコシル化による、ｍＡｂオリゴ糖のｍＡｂタンパク質からの分離、により特
徴付けられ、定量化され得る。放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実験的
質量を理論的質量と比較することによるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（matrix-a
ssisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析、イオン交換ＨＰＬＣ（
ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ
）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量化、並びに高性能キャピラリー
電気泳動－レーザ誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induc
ed fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量化によって、グリ
カン構造の精密な特性評価を可能にする様々な補助的技術によって分離及び同定すること
ができる。
「低フコース」又は「低フコース含量」とは、抗体が約０％～１５％のフコース含量を
有することを指す。
有することを指す。
「正常なフコース」又は「正常なフコース含量」とは、抗体が約５０％を超える、典型
的には、約６０％、７０％、８０％を超える、又は８５％を超えるフコース含量を有する
ことを指す。
的には、約６０％、７０％、８０％を超える、又は８５％を超えるフコース含量を有する
ことを指す。
エフェクター機能が望ましくない場合、本発明の抗体を更に遺伝子操作して、活性化Ｆ
ｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する当該抗体の結合を減少させる及び／又はＣ１ｑ結合、補
体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）若しくは抗体
依存性細胞媒介性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低下させる少なく
とも１つの突然変異を当該抗体Ｆｃに導入してもよい。
ｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する当該抗体の結合を減少させる及び／又はＣ１ｑ結合、補
体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）若しくは抗体
依存性細胞媒介性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低下させる少なく
とも１つの突然変異を当該抗体Ｆｃに導入してもよい。
活性化ＦｃγＲに対する抗体の結合を減少させ、続いて、エフェクター機能を低下させ
るために突然変異させることができるＦｃの位置は、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａ
ｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１～６０４、国際公開第２０
１１／０６６５０１号、米国特許第６，７３７，０５６号及び同第５，６２４，８２１号
、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：１６～２６、Ａ
ｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３
７～４３、Ｂｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：４
０３～１１、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６
８：５６３～７１、Ｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ ２５：１２５６～６４、Ｇｈｅｖａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｃｌｉ
ｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１８：２９２９～３８、Ａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＭＡｂｓ
，１：５７２～９に記載されているものであり、２１４、２３３、２３４、２３５、２３
６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２
７、３２８、３２９、３３０、３３１及び３６５位を含む。単独で又は組み合わせて行う
ことができる例示的な突然変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４における
Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２
３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、
Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０
Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ突然
変異である。ＡＤＣＣを低減するために行うことができる例示的な組み合わせ突然変異は
、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ
２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ
１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４におけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ
／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ
２３６－欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ
２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２
８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３
４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｉ
ｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ及びＩｇ
Ｇ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２
３８Ｓである。ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４
７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
るために突然変異させることができるＦｃの位置は、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａ
ｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１～６０４、国際公開第２０
１１／０６６５０１号、米国特許第６，７３７，０５６号及び同第５，６２４，８２１号
、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００：１６～２６、Ａ
ｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３
７～４３、Ｂｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：４
０３～１１、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６
８：５６３～７１、Ｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ ２５：１２５６～６４、Ｇｈｅｖａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｃｌｉ
ｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１８：２９２９～３８、Ａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＭＡｂｓ
，１：５７２～９に記載されているものであり、２１４、２３３、２３４、２３５、２３
６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２
７、３２８、３２９、３３０、３３１及び３６５位を含む。単独で又は組み合わせて行う
ことができる例示的な突然変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４における
Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２
３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、
Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０
Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ突然
変異である。ＡＤＣＣを低減するために行うことができる例示的な組み合わせ突然変異は
、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ
／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ
２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ
１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４におけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ
／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ
２３６－欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ
２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２
８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３
４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｉ
ｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ及びＩｇ
Ｇ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２
３８Ｓである。ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４
７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
ＩｇＧ４の安定性を強化するために、ＩｇＧ４抗体にＳ２２８Ｐ突然変異を施してよい
。
。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｋ２１４Ｔ突然変異、Ｅ２３３Ｐ突然変異
、Ｌ２３４Ｖ突然変異、Ｌ２３４Ａ突然変異、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ突然変異、Ｆ
２３４Ａ突然変異、Ｌ２３５Ａ突然変異、Ｇ２３７Ａ突然変異、Ｐ２３８Ａ突然変異、Ｐ
２３８Ｓ突然変異、Ｄ２６５Ａ突然変異、Ｓ２６７Ｅ突然変異、Ｈ２６８Ａ突然変異、Ｈ
２６８Ｑ突然変異、Ｑ２６８Ａ突然変異、Ｎ２９７Ａ突然変異、Ａ３２７Ｑ突然変異、Ｐ
３２９Ａ突然変異、Ｄ２７０Ａ突然変異、Ｑ２９５Ａ突然変異、Ｖ３０９Ｌ突然変異、Ａ
３２７Ｓ突然変異、Ｌ３２８Ｆ突然変異、Ａ３３０Ｓ突然変異及びＰ３３１Ｓ突然変異か
らなる群から選択される第２の突然変異を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
、Ｌ２３４Ｖ突然変異、Ｌ２３４Ａ突然変異、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ突然変異、Ｆ
２３４Ａ突然変異、Ｌ２３５Ａ突然変異、Ｇ２３７Ａ突然変異、Ｐ２３８Ａ突然変異、Ｐ
２３８Ｓ突然変異、Ｄ２６５Ａ突然変異、Ｓ２６７Ｅ突然変異、Ｈ２６８Ａ突然変異、Ｈ
２６８Ｑ突然変異、Ｑ２６８Ａ突然変異、Ｎ２９７Ａ突然変異、Ａ３２７Ｑ突然変異、Ｐ
３２９Ａ突然変異、Ｄ２７０Ａ突然変異、Ｑ２９５Ａ突然変異、Ｖ３０９Ｌ突然変異、Ａ
３２７Ｓ突然変異、Ｌ３２８Ｆ突然変異、Ａ３３０Ｓ突然変異及びＰ３３１Ｓ突然変異か
らなる群から選択される第２の突然変異を含み、残基の付番はＥＵインデックスに従う。
更なるＦｃ突然変異、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４～２４，Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２
０１０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８：１５７～９，Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ
．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３～６，Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６～５６，Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１～６０４，Ｐｅｔｋｏ
ｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１７５９～６９，Ｄａ
ｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ
３５：８６～９４，Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ ２３：１２８３～８，Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ７０：３２６９～７７ ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２８１９～２５に記載されており、２５０、２５２、２５３、
２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５位を含
むものを導入することによって、本発明の抗体を更に遺伝子操作して抗体の半減期を調節
することもできる。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な突然変異は、Ｔ２
５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、
Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４
Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ及びＨ４３５Ｒ突然変異である。抗体の半減期を延長するた
めに行うことができる例示的な単独又は組み合わせの突然変異は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４
Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ
３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ突然変異である。抗体の半減期を短縮するために行う
ことができる例示的な単独又は組み合わせの突然変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４
３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／
Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒ突然変異である。
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４～２４，Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２
０１０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８：１５７～９，Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ
．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３～６，Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６～５６，Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１～６０４，Ｐｅｔｋｏ
ｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１７５９～６９，Ｄａ
ｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ
３５：８６～９４，Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ ２３：１２８３～８，Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ７０：３２６９～７７ ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２８１９～２５に記載されており、２５０、２５２、２５３、
２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５位を含
むものを導入することによって、本発明の抗体を更に遺伝子操作して抗体の半減期を調節
することもできる。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な突然変異は、Ｔ２
５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、
Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４
Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ及びＨ４３５Ｒ突然変異である。抗体の半減期を延長するた
めに行うことができる例示的な単独又は組み合わせの突然変異は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４
Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ
３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ突然変異である。抗体の半減期を短縮するために行う
ことができる例示的な単独又は組み合わせの突然変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４
３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／
Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒ突然変異である。
保存的修飾を更に含む本発明の抗体も本発明の範囲内である。
「保存的修飾」とは、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に大きく影響する又はこ
れを変えることのないアミノ酸の修飾のことを指す。保存的修飾は、アミノ酸の置換、付
加、及び欠失を含む。保存的置換は、アミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置
き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義
されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば
、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例え
ば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン
、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチ
ジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分
岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、
メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング突然変異誘発につい
て既に記載されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｃｔａ
Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５～６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ
ａｌ．（１９９８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１～２４）、ポリペプチド中の任
意の天然残基をアラニンで置換することもできる。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は
、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）などの既知の方法によ
って行うことができる。あるいは、変異体のライブラリーは、例えば、ランダムコドン（
ＮＮＫ）、又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコード化するＤ
ＶＫコドン）を用いて生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの
特性に関して、本明細書に記載のアッセイを用いて試験することができる。
れを変えることのないアミノ酸の修飾のことを指す。保存的修飾は、アミノ酸の置換、付
加、及び欠失を含む。保存的置換は、アミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置
き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義
されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば
、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例え
ば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン
、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチ
ジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分
岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、
メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング突然変異誘発につい
て既に記載されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｃｔａ
Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５～６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ
ａｌ．（１９９８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１～２４）、ポリペプチド中の任
意の天然残基をアラニンで置換することもできる。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は
、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）などの既知の方法によ
って行うことができる。あるいは、変異体のライブラリーは、例えば、ランダムコドン（
ＮＮＫ）、又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコード化するＤ
ＶＫコドン）を用いて生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの
特性に関して、本明細書に記載のアッセイを用いて試験することができる。
本発明の抗体を、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又はポリエチレングリコー
ル部分の付加（ペグ化）及び脂質化などの非自然発生的な共有結合修飾などのプロセスに
よって翻訳後修飾され得る。こうした修飾はｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで
行われ得る。例えば、本発明の抗体にポリエチレングリコールを融合させる（ＰＥＧ化）
することによって薬物動態のプロファイルを向上させることができる。融合は当業者に既
知の技術によって行われ得る。治療用抗体をＰＥＧと接合させると、機能に干渉すること
なく薬力学的動態が強化されることが示されている（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００
１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６～１９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６：７６１～７０；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐ
ｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９～１８）。
ル部分の付加（ペグ化）及び脂質化などの非自然発生的な共有結合修飾などのプロセスに
よって翻訳後修飾され得る。こうした修飾はｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで
行われ得る。例えば、本発明の抗体にポリエチレングリコールを融合させる（ＰＥＧ化）
することによって薬物動態のプロファイルを向上させることができる。融合は当業者に既
知の技術によって行われ得る。治療用抗体をＰＥＧと接合させると、機能に干渉すること
なく薬力学的動態が強化されることが示されている（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００
１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６～１９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６：７６１～７０；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐ
ｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９～１８）。
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは
生物物理学的特性を改善するために修飾され得る本発明の抗体は、本発明の範囲内である
。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に、（１）固有の安定性に影響を及
ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとの対合に影響するタンパク質
／タンパク質界面相互作用、（３）極性残基及び帯電残基の埋没、（４）極性残基及び帯
電残基のＨ結合ネットワーク、並びに（５）表面電荷及び極性残基の分布を含む多くの要
因によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
３０５：９８９～１０１０）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構
造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、
抗体の安定性に対する該残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を
作製及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つ
には、示差走査熱量計法（ＤＳＣ）によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔｍ）を高
くするというものがある。一般に、タンパク質のＴｍはその安定性と相関しており、溶液
中でのアンフォールディング及び変性のし易さ、並びに当該タンパク質がアンフォールデ
ィングする傾向に依存する分解プロセスとは逆相関している（Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａ
ｌ．（２０００）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１３：３６～４６）。多数の研究で、ＤＳＣによっ
て熱安定性として測定された処方の物理的安定性のランク付けと他の方法によって測定さ
れた物理的安定性との間に相関が見出されている（Ｍａａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１４０：１５５～６８；Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９
７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：２００～８；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａ
ＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８：２００３；Ｂｅｄｕ－Ａｄｄｏ ｅｔ ａｌ．（２
００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：１３５３～６１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０
０４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６～８９）。配合物の研究により、Ｆａｂ
のＴｍは、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている
。
生物物理学的特性を改善するために修飾され得る本発明の抗体は、本発明の範囲内である
。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に、（１）固有の安定性に影響を及
ぼす個々のドメインのコアパッキング、（２）ＨＣとＬＣとの対合に影響するタンパク質
／タンパク質界面相互作用、（３）極性残基及び帯電残基の埋没、（４）極性残基及び帯
電残基のＨ結合ネットワーク、並びに（５）表面電荷及び極性残基の分布を含む多くの要
因によって影響を受ける（Ｗｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
３０５：９８９～１０１０）。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構
造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、
抗体の安定性に対する該残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を
作製及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の１つ
には、示差走査熱量計法（ＤＳＣ）によって測定したときの熱転移中点温度（Ｔｍ）を高
くするというものがある。一般に、タンパク質のＴｍはその安定性と相関しており、溶液
中でのアンフォールディング及び変性のし易さ、並びに当該タンパク質がアンフォールデ
ィングする傾向に依存する分解プロセスとは逆相関している（Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａ
ｌ．（２０００）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１３：３６～４６）。多数の研究で、ＤＳＣによっ
て熱安定性として測定された処方の物理的安定性のランク付けと他の方法によって測定さ
れた物理的安定性との間に相関が見出されている（Ｍａａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１４０：１５５～６８；Ｒｅｍｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９
７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：２００～８；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａ
ＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ．５Ｅ８：２００３；Ｂｅｄｕ－Ａｄｄｏ ｅｔ ａｌ．（２
００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１：１３５３～６１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０
０４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：３０７６～８９）。配合物の研究により、Ｆａｂ
のＴｍは、対応するｍＡｂの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている
。
Ｃ末端リシン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、血流中の内因性循環カルボキシペプ
チダーゼによって注入された抗体から除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４～１２）。製造中、米国特許出願
公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤ
ＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御す
ることができる。抗体のＣＴＬ含量は、公知の方法を用いて測定することができる。
チダーゼによって注入された抗体から除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４～１２）。製造中、米国特許出願
公開第２０１４０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤ
ＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御す
ることができる。抗体のＣＴＬ含量は、公知の方法を用いて測定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、約１０％～約９０％、約２０％～約８０％
、約４０％～約７０％、約５５％～約７０％又は約６０％のＣ末端リシン含量を有する。
、約４０％～約７０％、約５５％～約７０％又は約６０％のＣ末端リシン含量を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、約０％、５％、１０％、２０％、３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のＣ末端リシン含量を有
する。
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のＣ末端リシン含量を有
する。
本発明の抗体を生成する方法
Ｆｃドメインが遺伝子操作を受けた本発明の抗体は、テンプレートとして野生型のＩｇ
Ｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４配列を使用し、標準的なクローニング及び発現
技術を用いて生成することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突
然変異誘発を実施して、抗体Ｆｃに突然変異を導入することができ、本明細書に記載され
る方法を用いてＦｃγＲへの抗体結合、アゴニスト活性、又は他の所望の特性に対する効
果を評価することができる。
Ｆｃドメインが遺伝子操作を受けた本発明の抗体は、テンプレートとして野生型のＩｇ
Ｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４配列を使用し、標準的なクローニング及び発現
技術を用いて生成することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突
然変異誘発を実施して、抗体Ｆｃに突然変異を導入することができ、本明細書に記載され
る方法を用いてＦｃγＲへの抗体結合、アゴニスト活性、又は他の所望の特性に対する効
果を評価することができる。
抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ｄｅ
ｎｏｖｏ生成することができる。
ｎｏｖｏ生成することができる。
例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，
１９７５のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。ハ
イブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット又はサルなど
を、ヒトＴＮＦＲ又はＴＮＦＲの細胞外ドメインで免疫し、続いて、標準的な方法を使用
して、免疫した動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成
する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９～１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，１９８６）。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異
性、交差反応性又はその欠如、及び抗原の親和性などの所望の特性を有する抗体の生成に
ついてスクリーニングする。
１９７５のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。ハ
イブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット又はサルなど
を、ヒトＴＮＦＲ又はＴＮＦＲの細胞外ドメインで免疫し、続いて、標準的な方法を使用
して、免疫した動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成
する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９～１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，１９８６）。１個の不死化したハイブリドーマ細胞から発生したコロニーを、結合特異
性、交差反応性又はその欠如、及び抗原の親和性などの所望の特性を有する抗体の生成に
ついてスクリーニングする。
様々な宿主動物を使用して、本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を産
生することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、抗ヒトＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー抗体を生成することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他のヒト以外
の動物において作製された抗体を、様々な技術を使用してヒト化して、よりヒトに近い配
列を生成することもできる。
生することができる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、抗ヒトＴＮＦＲスーパー
ファミリーメンバー抗体を生成することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス及び他のヒト以外
の動物において作製された抗体を、様々な技術を使用してヒト化して、よりヒトに近い配
列を生成することもできる。
ヒトアクセプターフレームワークの選別を含む例示的なヒト化技術は公知であり、ＣＤ
Ｒグラフト化（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフト化（米国特許第６，
８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ ２８：４８９～９８）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許出願公開第
２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３５
６）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）を含む。これらの方法では、Ｃ
ＤＲの長さの類似性若しくは標準構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親
フレームワークに対する全体的な相同性に基づいて選択され得るヒトフレームワークに親
抗体のＣＤＲを移植する。
Ｒグラフト化（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲグラフト化（米国特許第６，
８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ ２８：４８９～９８）、特異性決定残基のリサーフェシング（米国特許出願公開第
２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適応（米国特許第８，７４８，３５
６）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）を含む。これらの方法では、Ｃ
ＤＲの長さの類似性若しくは標準構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親
フレームワークに対する全体的な相同性に基づいて選択され得るヒトフレームワークに親
抗体のＣＤＲを移植する。
ヒト化抗体は、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号
に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレ
ームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰突然変異）、又は任意のＣＤＲに変異
を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択
性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレ
ームワーク支持残基を組み込むことによって（復帰突然変異）、又は任意のＣＤＲに変異
を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択
性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
ゲノム中にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有する遺伝子導入動物、例えば、
マウス又はラットは、標的タンパク質に対するヒト抗体を生成するために使用することが
でき、例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、同第
２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８
号、及び同第１９９０／０４０３６号、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３６８：８５６～９；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ Ｇｅｎ
ｅｔ ７：１３～２１；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １
８８：４８３～９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ １３：６５～９３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｕ
ｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３～６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９
９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４５～５１；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ
．（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：１４６～５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１～２３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９
９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：１２３６～４３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８：４５５～８に記載さ
れている。このような動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく
、相同又は非相同組み換えを用いて、導入染色体（transchromosome）を用いて、又はミ
ニ遺伝子を用いて、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を
該動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅ
ｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿
ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉ
ｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉ
ａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（
ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用し
て、選択された抗原に対するヒト抗体を提供するべく取り組んでいる可能性がある。
マウス又はラットは、標的タンパク質に対するヒト抗体を生成するために使用することが
でき、例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第９９／４５９６２号、同第
２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８
号、及び同第１９９０／０４０３６号、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３６８：８５６～９；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ Ｇｅｎ
ｅｔ ７：１３～２１；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １
８８：４８３～９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ １３：６５～９３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｕ
ｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３～６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９
９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４５～５１；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ
．（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：１４６～５６；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１～２３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９
９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：１２３６～４３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８：４５５～８に記載さ
れている。このような動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく
、相同又は非相同組み換えを用いて、導入染色体（transchromosome）を用いて、又はミ
ニ遺伝子を用いて、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を
該動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅ
ｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿
ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉ
ｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉ
ａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（
ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用し
て、選択された抗原に対するヒト抗体を提供するべく取り組んでいる可能性がある。
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン又はその一部、例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ
）、又は対合していない若しくは対合している抗体可変領域などを発現するようにファー
ジが遺伝子操作されたファージディスプレイライブラリーから選択され得る（Ｋｎａｐｐ
ｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７～８６；Ｋｒｅｂ
ｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４：６７～８
４；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：
３０９～１４；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５：６１５７～６２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９
９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４～８；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１～９７）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ
ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５～９６及び国際公開第０９／
０８５４６２号）に記載されているバクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合
タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラ
リーから単離され得る。当該ライブラリーを、ヒト及び／又はカニクイザルＴＮＦＲに対
するファージの結合についてスクリーニングし、得られた陽性クローンの特性評価を更に
行い、Ｆａｂをクローンの溶解物から単離し、完全長ＩｇＧとして発現させることができ
る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許
第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第
５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６
，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，
５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号及び同第６，
５９３，０８１号に記載されている。
）、又は対合していない若しくは対合している抗体可変領域などを発現するようにファー
ジが遺伝子操作されたファージディスプレイライブラリーから選択され得る（Ｋｎａｐｐ
ｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７～８６；Ｋｒｅｂ
ｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４：６７～８
４；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：
３０９～１４；Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５：６１５７～６２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９
９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４～８；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１～９７）。本発明の抗体は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ
ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５～９６及び国際公開第０９／
０８５４６２号）に記載されているバクテリオファージｐＩＸコートタンパク質との融合
タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラ
リーから単離され得る。当該ライブラリーを、ヒト及び／又はカニクイザルＴＮＦＲに対
するファージの結合についてスクリーニングし、得られた陽性クローンの特性評価を更に
行い、Ｆａｂをクローンの溶解物から単離し、完全長ＩｇＧとして発現させることができ
る。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許
第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第
５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，９６９，１０８号、同第６
，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，
５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号及び同第６，
５９３，０８１号に記載されている。
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、組み換えタンパク質生成などの
任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あ
るいは細胞全体又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与
されてもよく、抗原は、該抗原又はその一部をコードしている核酸から動物の体内でｄｅ
ｎｏｖｏ形成されてもよい。
任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あ
るいは細胞全体又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与
されてもよく、抗原は、該抗原又はその一部をコードしている核酸から動物の体内でｄｅ
ｎｏｖｏ形成されてもよい。
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のＶＨ／ＶＬ領域は、既存の抗Ｔ
ＮＦＲスーパーファミリー受容体抗体から得ることもできる。
ＮＦＲスーパーファミリー受容体抗体から得ることもできる。
米国特許第８１３３９８３号、同第７９６０５１５号、米国特許出願公開第２０１３／
０２８０２７５号、国際公開第２０１３／０２８２３１号及び米国特許出願公開第２０１
４／０３７７２８４号に記載されている抗ＯＸ４０抗体のＶＨ及びＶＬの領域を使用して
本発明の抗体を遺伝子操作することができる。更に、抗ＯＸ４０抗体のＶＨ／ＶＬ領域Ｍ
ＥＤＩ－６４６９、ＢＭＳ－９８６１７８、ＭＯＸＲ－０９１６、ＭＥＤＩ－６３８３、
ＭＥＤＩ－０５６２、ＰＦ－０４５１８６００又はＧＳＫ－３１７４９９８を使用しても
よい。本発明の遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体を生成するために使用することができ
る更なる例示的なＶＨ及びＶＬの領域は、以下のとおりである：
０２８０２７５号、国際公開第２０１３／０２８２３１号及び米国特許出願公開第２０１
４／０３７７２８４号に記載されている抗ＯＸ４０抗体のＶＨ及びＶＬの領域を使用して
本発明の抗体を遺伝子操作することができる。更に、抗ＯＸ４０抗体のＶＨ／ＶＬ領域Ｍ
ＥＤＩ－６４６９、ＢＭＳ－９８６１７８、ＭＯＸＲ－０９１６、ＭＥＤＩ－６３８３、
ＭＥＤＩ－０５６２、ＰＦ－０４５１８６００又はＧＳＫ－３１７４９９８を使用しても
よい。本発明の遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体を生成するために使用することができ
る更なる例示的なＶＨ及びＶＬの領域は、以下のとおりである：
配列番号５１（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている抗体
ＳＦ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
Ｓ
ＳＦ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
Ｓ
配列番号５２（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている抗体
ＳＦ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＳＦ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号５３（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている１２
Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
Ｓ
Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
Ｓ
配列番号５４（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている１２
Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
Ｈ３ＶＨ１ＶＬ１のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号５５（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている２０
Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＳＤＫＳＡＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＮＹＹＧＳＳＬＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧＲＡＴＬＴＳＤＫＳＡＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＮＹＹＧＳＳＬＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５６（米国特許出願公開第２０１４／０３７７２８４号に記載されている２０
Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
Ｅ５ＶＨ３ＶＬ２のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＣＤ４０抗体のＶＨ及び
ＶＬの領域は、それぞれ、米国特許第７，２８８，２５１号（抗体２１．４．１）及び米
国特許第８，３０３，９５５号に記載されているＣＰ－８７０，８９３及びヒト化Ｓ２Ｃ
６、並びに国際公開第２００１／０５６６０３号、同第２００１／０８３７５５号、同第
２０１３／０３４９０４号及び同第２０１４／０７０９３４号に記載されている抗ＣＤ４
０抗体のものである。本発明の遺伝子操作を受けた抗ＣＤ４０抗体を生成するために使用
することができる更なる例示的なＶＨ及びＶＬの領域は、以下である：
ＶＬの領域は、それぞれ、米国特許第７，２８８，２５１号（抗体２１．４．１）及び米
国特許第８，３０３，９５５号に記載されているＣＰ－８７０，８９３及びヒト化Ｓ２Ｃ
６、並びに国際公開第２００１／０５６６０３号、同第２００１／０８３７５５号、同第
２０１３／０３４９０４号及び同第２０１４／０７０９３４号に記載されている抗ＣＤ４
０抗体のものである。本発明の遺伝子操作を受けた抗ＣＤ４０抗体を生成するために使用
することができる更なる例示的なＶＨ及びＶＬの領域は、以下である：
配列番号５７（Ｍ９抗体のＶＨ）
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＩＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲ
ＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＮＩＹＹＲＧＤＴＹＹＳＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦ
ＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＦＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＩＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲ
ＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＮＩＹＹＲＧＤＴＹＹＳＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦ
ＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＦＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５８（Ｍ９抗体のＶＬ）
ＱＳＡＬＴＱＰＰＳＡＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱ
ＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＶＳＧＬ
ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＡＧＳＮＮＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
ＱＳＡＬＴＱＰＰＳＡＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱ
ＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＶＳＧＬ
ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＡＧＳＮＮＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＧＩＴＲ抗体のＶＨ及び
ＶＬの領域は、米国特許第７，８１２，１３５号、同第８，５９１，８８６号、及び同第
７，６１８，６３２号、又は国際公開第２０１１／０２８６８３号、同第２０１３／０３
９９５４号、同第２００５／００７１９０号及び同第２００７／１３３８２２号に記載さ
れているものである。
ＶＬの領域は、米国特許第７，８１２，１３５号、同第８，５９１，８８６号、及び同第
７，６１８，６３２号、又は国際公開第２０１１／０２８６８３号、同第２０１３／０３
９９５４号、同第２００５／００７１９０号及び同第２００７／１３３８２２号に記載さ
れているものである。
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＣＤ２７抗体のＶＨ及び
ＶＬの領域は、米国特許第９１６９３２５号及び米国特許出願公開第２０１３０１８３３
１６号に記載されているものである。
ＶＬの領域は、米国特許第９１６９３２５号及び米国特許出願公開第２０１３０１８３３
１６号に記載されているものである。
本発明の抗体を遺伝子操作するために使用することができる抗ＣＤ１３７抗体のＶＨ及
びＶＬの領域は、米国特許第７２８８６３８号、同第８７１６４５２号及び同第８８２１
８６７号に記載されているものである。
びＶＬの領域は、米国特許第７２８８６３８号、同第８７１６４５２号及び同第８８２１
８６７号に記載されているものである。
完全長二重特異性抗体に遺伝子操作された本発明の抗体も本発明の範囲内である。
「完全長抗体」とは、２本の完全長抗体重鎖と２本の完全長抗体軽鎖とを有する抗体を
指す。完全長抗体重鎖（ＨＣ）は、周知の重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＨ、Ｃ
Ｈ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。完全長抗体重鎖（ＬＣ）は、周知の軽鎖可変
ドメイン及び定常ドメイン、ＶＬ及びＣＬからなる。完全長抗体は、一方又は両方の重鎖
のいずれかにＣ末端リシン（Ｋ）を欠いていてもよい。
指す。完全長抗体重鎖（ＨＣ）は、周知の重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン、ＶＨ、Ｃ
Ｈ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。完全長抗体重鎖（ＬＣ）は、周知の軽鎖可変
ドメイン及び定常ドメイン、ＶＬ及びＣＬからなる。完全長抗体は、一方又は両方の重鎖
のいずれかにＣ末端リシン（Ｋ）を欠いていてもよい。
完全長二重特異性抗体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの無細胞環境において又は共発
現を使用して、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に好都合にな
るように各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの一特異
性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成され得る。「Ｆａ
ｂアーム」又は「半分子」とは、抗原に特異的に結合する一対の重鎖－軽鎖を意味する。
現を使用して、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に好都合にな
るように各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの一特異
性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成され得る。「Ｆａ
ｂアーム」又は「半分子」とは、抗原に特異的に結合する一対の重鎖－軽鎖を意味する。
Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会
合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少す
る。親単一特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗
体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ド
メインは、解離－会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホ
モ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られる生成物は、それぞ
れ異なるエピトープ、すなわち、ＴＮＦＲにおけるエピトープ及び第２の抗原におけるエ
ピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少す
る。親単一特異性抗体のうちの１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗
体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ド
メインは、解離－会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホ
モ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られる生成物は、それぞ
れ異なるエピトープ、すなわち、ＴＮＦＲにおけるエピトープ及び第２の抗原におけるエ
ピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
「ホモ二量体化」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を指
す。「ホモ二量体」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を
指す。
す。「ホモ二量体」とは、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を
指す。
「ヘテロ二量体化」とは、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作
用を意味する。「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖
を有する抗体を指す。
用を意味する。「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖
を有する抗体を指す。
本発明の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ（
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的適合（electrostati
cally-matched）（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅ
ｄ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）
、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）を使用して二重特異性フォーマットに遺伝子操作する
ことができる。
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的適合（electrostati
cally-matched）（Ｃｈｕｇａｉ，Ａｍｇｅｎ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｏｎｃｏｍｅ
ｄ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）
、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）を使用して二重特異性フォーマットに遺伝子操作する
ことができる。
Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅストラテジ（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号
を参照）では、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸
をＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において突然変異させて、ヘテロ二量体形
成を促進することができる。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特
異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２
の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、「ホー
ル」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用によりヘテロ二量体が形
成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５
Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３
９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６
Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインに
おける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。
を参照）では、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸
をＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において突然変異させて、ヘテロ二量体形
成を促進することができる。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特
異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２
の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、「ホー
ル」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用によりヘテロ二量体が形
成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５
Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３
９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６
Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインに
おける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）。
ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術では、「ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ」ストラテジを利用してＦａ
ｂアーム交換を促進することに加えて、半アームのうちの１つが、得られる二重特異性抗
体の軽鎖を確実に正しく対合させるために交換されたＣＨ１及びＣＬドメインを有する（
例えば、米国特許第８，２４２，２４７号を参照）。
ｂアーム交換を促進することに加えて、半アームのうちの１つが、得られる二重特異性抗
体の軽鎖を確実に正しく対合させるために交換されたＣＨ１及びＣＬドメインを有する（
例えば、米国特許第８，２４２，２４７号を参照）。
他のクロスオーバーストラテジを使用して、一方のアーム又は両方のアームのいずれか
において、二重特異性抗体の重鎖と軽鎖との間若しくは重鎖内で可変ドメイン若しくは定
常ドメイン、又は両方のドメインを交換することによって、完全長二重特異性抗体を生成
することができる。これらの交換としては、例えば、国際特許公開第２００９／０８０２
５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８６号、及び同第２０
０９／０８０２５２号に記載されるＶＨ－ＣＨ１とＶＬ－ＣＬ、ＶＨとＶＬ、ＣＨ３とＣ
Ｌ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。
において、二重特異性抗体の重鎖と軽鎖との間若しくは重鎖内で可変ドメイン若しくは定
常ドメイン、又は両方のドメインを交換することによって、完全長二重特異性抗体を生成
することができる。これらの交換としては、例えば、国際特許公開第２００９／０８０２
５４号、同第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０１８３８６号、及び同第２０
０９／０８０２５２号に記載されるＶＨ－ＣＨ１とＶＬ－ＣＬ、ＶＨとＶＬ、ＣＨ３とＣ
Ｌ、及びＣＨ３とＣＨ１が挙げられる。
他のストラテジ、例えば、あるＣＨ３表面における正に帯電した残基及び第２のＣＨ３
表面における負に帯電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテ
ロ二量体化の促進を使用して二重特異性抗体を生成することができ、これは、米国特許出
願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号
、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０
１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は
、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０
１９５８４９号に記載されるように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／
Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６
Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３
６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／
Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３
５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにお
ける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）により
促進されてもよい。
表面における負に帯電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテ
ロ二量体化の促進を使用して二重特異性抗体を生成することができ、これは、米国特許出
願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号
、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０
１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は
、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０
１９５８４９号に記載されるように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／
Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６
Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３
６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／
Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３
５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにお
ける修飾位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾位置として表現）により
促進されてもよい。
ＬＵＺ－Ｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。この技術では、
（Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７：４３３３
１～９）に記載されているように、ロイシンジッパーをＣＨ３ドメインのＣ末端に付加し
て、精製後に除去される親ｍＡｂからヘテロ二量体アセンブリを駆動する。
（Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７：４３３３
１～９）に記載されているように、ロイシンジッパーをＣＨ３ドメインのＣ末端に付加し
て、精製後に除去される親ｍＡｂからヘテロ二量体アセンブリを駆動する。
ＳＥＥＤｂｏｄｙ技術を利用して、二重特異性抗体を生成することができる。ＳＥＥＤ
ｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許第２００７／０２８７１７０号に
記載されるように、ヘテロ二量体化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択ＩｇＧ
残基を有する。
ｂｏｄｙは、それらの定常ドメインにおいて、米国特許第２００７／０２８７１７０号に
記載されるように、ヘテロ二量体化を促進するためにＩｇＡ残基で置換された選択ＩｇＧ
残基を有する。
二重特異性抗体は、国際特許出願公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法（Ｄｕ
ｏＢｏｄｙ技術）に従って、２つの一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な突然
変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下で２つの親一特異性ホモ二量
体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、無細胞環境においてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで生成されてもよい。この方法においては、第１の単一特異性二価抗体及
び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおけ
る特定の置換を有するように操作されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステ
インがジスルフィド結合の異性化を受けるのに十分な還元条件下においてともにインキュ
ベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換によって二重特異性抗体が生成される。イン
キュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は
、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオ
エリトリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン及びベータ－メルカプトエタノールである。例えば、少な
くとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５
ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で
、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
ｏＢｏｄｙ技術）に従って、２つの一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な突然
変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下で２つの親一特異性ホモ二量
体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、無細胞環境においてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで生成されてもよい。この方法においては、第１の単一特異性二価抗体及
び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおけ
る特定の置換を有するように操作されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステ
インがジスルフィド結合の異性化を受けるのに十分な還元条件下においてともにインキュ
ベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換によって二重特異性抗体が生成される。イン
キュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は
、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオ
エリトリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン及びベータ－メルカプトエタノールである。例えば、少な
くとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５
ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で
、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
抗体のドメイン及び付番は周知である。「非対称」とは、抗体の２本の別個の重鎖の２
つのＣＨ３ドメインにおける非同一の置換を指す。ＩｇＧ１ ＣＨ３領域は、典型的には
、ＩｇＧ１における残基３４１～４４６からなる（残基の付番はＥＵインデックスに従う
）。
つのＣＨ３ドメインにおける非同一の置換を指す。ＩｇＧ１ ＣＨ３領域は、典型的には
、ＩｇＧ１における残基３４１～４４６からなる（残基の付番はＥＵインデックスに従う
）。
本発明の抗体は、様々な周知の抗体形態に設計されてもよい。
医薬組成物／投与
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物を提供する
。治療用途では、本発明の抗体は、薬学的に許容できる担体中に活性成分として有効量の
抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と一
緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、
水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油
、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリ
シンを用いてよい。これらの溶液は滅菌されており、一般には粒子状物質を含まない。こ
れらは、従来の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は
、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容できる補助物質、例えば、ｐ
Ｈ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような
医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％
まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従
って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒ
クル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔ
ｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２
００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ
ｐｐ６９１～１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８～９８９を参照されたい。
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物を提供する
。治療用途では、本発明の抗体は、薬学的に許容できる担体中に活性成分として有効量の
抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」は、本発明の抗体と一
緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、
水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油
、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリ
シンを用いてよい。これらの溶液は滅菌されており、一般には粒子状物質を含まない。こ
れらは、従来の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は
、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容できる補助物質、例えば、ｐ
Ｈ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような
医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％
まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従
って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒ
クル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔ
ｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２
００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ
ｐｐ６９１～１０９２に記載されており、特にｐｐ．９５８～９８９を参照されたい。
本発明の抗体を治療的に使用するための投与方法は、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤
、粉剤、ゲル、粒子の、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイク
ロポンプに入れられた製剤を使用する非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈
内、又は皮下、肺内、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与；又は当該技術分野にお
いて周知の、当業者が理解する他の手段など、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路で
あってよい。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、
軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨
盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑
液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔
内、又は経皮送達によって達成され得る。
、粉剤、ゲル、粒子の、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイク
ロポンプに入れられた製剤を使用する非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈
内、又は皮下、肺内、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与；又は当該技術分野にお
いて周知の、当業者が理解する他の手段など、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路で
あってよい。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、
軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨
盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑
液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔
内、又は経皮送達によって達成され得る。
本発明の抗体は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注入又はボーラス注射により非経口的に
、筋肉内又は皮下又は腹腔内になどの任意の好適な経路によって被験体に投与することが
できる。静脈内注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、若しくは２
４０分間にわたって、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは
１２時間にわたって行ってよい。
、筋肉内又は皮下又は腹腔内になどの任意の好適な経路によって被験体に投与することが
できる。静脈内注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、若しくは２
４０分間にわたって、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは
１２時間にわたって行ってよい。
被験体に投与される用量は、治療されている疾患を軽減するか又は少なくとも部分的に
抑止するのに十分（「治療的に有効な量」）であり、時に、０．００５ｍｇ～約１００ｍ
ｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、若しくは約５ｍｇ～約２５ｍｇ
／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、若しくは約２４ｍｇ
／ｋｇ、又は例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇ／ｋｇであ
り得るが、更に多量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇ
であってもよい。
抑止するのに十分（「治療的に有効な量」）であり、時に、０．００５ｍｇ～約１００ｍ
ｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、若しくは約５ｍｇ～約２５ｍｇ
／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、若しくは約２４ｍｇ
／ｋｇ、又は例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇ／ｋｇであ
り得るが、更に多量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００ｍｇ／ｋｇ
であってもよい。
例えば、５０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｍｇの固定単位用量を与え
てもよく、又は患者の表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２
００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２の用量を与えてもよい。通常、１～８用量（例えば、１
、２、３、４、５、６、７、又は８）が患者を治療するために投与されるが、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用
量を与えてもよい。
てもよく、又は患者の表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２
００、若しくは１００ｍｇ／ｍ２の用量を与えてもよい。通常、１～８用量（例えば、１
、２、３、４、５、６、７、又は８）が患者を治療するために投与されるが、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用
量を与えてもよい。
本発明の抗体の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週
間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月後に、
又はそれ以上後に繰り返すことができる。治療コースの繰り返しも可能であり、長期にわ
たる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であってもよいし、又は異なる
用量であってもよい。例えば、本明細書に記載される本発明の抗体は、静脈内注入によっ
て、８週間にわたって１週間間隔で８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、
更に１６週間にわたって２週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて
、４週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与してよい。
間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月後に、
又はそれ以上後に繰り返すことができる。治療コースの繰り返しも可能であり、長期にわ
たる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であってもよいし、又は異なる
用量であってもよい。例えば、本明細書に記載される本発明の抗体は、静脈内注入によっ
て、８週間にわたって１週間間隔で８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて、
更に１６週間にわたって２週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与し、続いて
、４週間ごとに８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで投与してよい。
例えば、本発明の方法における抗体は、単回投与、又は２４、１２、８、６、４若しく
は２時間ごとの分割投与、又はこれらの任意の組み合わせを使用して、約０．１～１００
ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日当たり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、
５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の１日投薬量として、治療開始
後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０日目のうちの少な
くとも１日に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目のうちの少なくとも１週に、あるい
はこれらの任意の組み合わせで提供され得る。
は２時間ごとの分割投与、又はこれらの任意の組み合わせを使用して、約０．１～１００
ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日当たり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、
５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の１日投薬量として、治療開始
後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０日目のうちの少な
くとも１日に、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目のうちの少なくとも１週に、あるい
はこれらの任意の組み合わせで提供され得る。
また、本発明の方法における抗体は、癌の発現リスクを低下させる、癌の進行における
事象の発生の開始を遅延させる、及び／又は癌が寛解したときの再発リスクを低下させる
ために予防的に投与されてもよい。
事象の発生の開始を遅延させる、及び／又は癌が寛解したときの再発リスクを低下させる
ために予防的に投与されてもよい。
本発明の抗体を、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体に溶解させてもよい。
この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍
結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍
結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
方法及び使用
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、診断上の有用性、並
びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若し
くはｅｘ ｖｉｖｏにおいて培養中の細胞に、又はがん及び感染性疾患などの様々な障害
を治療、予防及び／若しくは診断するために被験体に投与してよい。
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、診断上の有用性、並
びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若し
くはｅｘ ｖｉｖｏにおいて培養中の細胞に、又はがん及び感染性疾患などの様々な障害
を治療、予防及び／若しくは診断するために被験体に投与してよい。
また、本発明は、被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのアゴニスト
活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／
Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入し
て、ＴＮＦＲファミリーの受容体に特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成する
ことと、当該アゴニスト活性を強化するのに十分な時間、当該遺伝子操作を受けた抗体を
当該被験体に投与することとを含む、上記方法を提供する。
活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／
Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入し
て、ＴＮＦＲファミリーの受容体に特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成する
ことと、当該アゴニスト活性を強化するのに十分な時間、当該遺伝子操作を受けた抗体を
当該被験体に投与することとを含む、上記方法を提供する。
また、本発明は、被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのアゴニスト
活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／
Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入し
て、ＴＮＦＲファミリーの受容体に特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成する
ことと、当該遺伝子操作を受けた抗体を当該被験体に投与することとを含む、上記方法を
提供する。
活性を強化する方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／
Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を抗体に導入し
て、ＴＮＦＲファミリーの受容体に特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成する
ことと、当該遺伝子操作を受けた抗体を当該被験体に投与することとを含む、上記方法を
提供する。
また、本発明は、被験体における癌を治療する方法であって、当該癌を治療するのに十
分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異
、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含むＴＮＦＲファミリーの受容体
に特異的に結合する抗体を当該被験体に投与することを含む、上記方法を提供する。
分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ４３０Ｇ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異
、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含むＴＮＦＲファミリーの受容体
に特異的に結合する抗体を当該被験体に投与することを含む、上記方法を提供する。
また、本発明は、被験体における癌を治療する方法であって、当該癌を治療するのに十
分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ
４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリー抗体を当該被験体に
投与することを含む、上記方法を提供する。
分な時間、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異、又はＥ３４５Ｒ／Ｅ
４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリー抗体を当該被験体に
投与することを含む、上記方法を提供する。
本発明の方法では、当該抗体はＡＤＣＣを媒介する。
本発明の方法では、当該抗体はＡＤＣＰを媒介する。
本発明の方法では、当該抗体は、抗体架橋に依存しない抗ＴＮＦＲスーパーファミリー
メンバーのアゴニスト活性を強化する。
メンバーのアゴニスト活性を強化する。
本発明の方法では、当該抗体は、所望により、ＡＤＣＣを低減する第２の突然変異を更
に含む。
に含む。
本発明の方法では、当該被験体はウイルス感染を有する。
本発明の方法では、当該被験体は癌を有する。
本発明の方法では、当該癌は固形腫瘍である。
本発明の方法では、当該固形腫瘍は、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ
Ｃ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣
癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、
乳癌、卵管癌、脳癌、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌又は癌の転移巣である
。
Ｃ）、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣
癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、
乳癌、卵管癌、脳癌、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌又は癌の転移巣である
。
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲは、腫瘍壊死因子受容体１（配列番号１）、腫瘍壊死
因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（
配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３
（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列
番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受
容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）
、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣ
Ｉ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエ
ーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列
番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配
列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配
列番号２７）である。
因子受容体２（配列番号２）、リンホトキシンベータ受容体（配列番号３）、ＯＸ４０（
配列番号４）、ＣＤ４０（配列番号５）、Ｆａｓ受容体（配列番号６）、デコイ受容体３
（配列番号７）、ＣＤ２７（配列番号８）、ＣＤ３０（配列番号９）、ＣＤ１３７（配列
番号１０）、デス受容体４（配列番号１１）、デス受容体５（配列番号１２）、デコイ受
容体１（配列番号１３）、デコイ受容体２（配列番号１４）、ＲＡＮＫ（配列番号１５）
、オステオプロテゲリン（配列番号１６）、ＴＷＥＡＫ受容体（配列番号１７）、ＴＡＣ
Ｉ（配列番号１８）、ＢＡＦＦ受容体（配列番号１９）、ヘルペスウイルス侵入メディエ
ーター（配列番号２０）、神経成長因子受容体（配列番号２１）、Ｂ細胞成熟抗原（配列
番号２２）、ＧＩＴＲ（配列番号２３）、ＴＲＯＹ（配列番号２４）、デス受容体６（配
列番号２５）、デス受容体３（配列番号２６）、又はエクトジスプラシンＡ２受容体（配
列番号２７）である。
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲは、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番号８
）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２
３）である。
）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番号２
３）である。
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＯＸ４０（配列番号４）である。
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＣＤ２７（配列番号８）である。
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＣＤ４０（配列番号５）である。
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＣＤ１３７（配列番号１０）である。
本発明の方法では、当該ＴＮＦＲはＧＩＴＲ（配列番号２３）である。
ＴＮＦＲ１／２／ＴＮＦ－α、ＣＤ７０／ＣＤ２７／ＣＤ２７、ＣＤ１３７／４－１Ｂ
Ｂ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬを含むＴＮＦ
Ｒスーパーファミリーメンバー及びそのリガンドの多くは、癌治療の標的として示されて
おり（Ｂｒｅｍｅｒ，Ｈｉｎｄａｗｉ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
ＩＳＲＮ ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ３７１
８５４，２５ ｐａｇｅｓ；Ｓａｎｍａｍｅｄ ｅｔ ａｌ）、ＴＮＦＲスーパーファミ
リーメンバーを標的とするいくつかのアゴニスト抗体、例えば、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ－４
０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７抗体が、様々な固形腫瘍並びに非ホジキンリ
ンパ腫及びＢ細胞悪性腫瘍などのヘム悪性腫瘍のために臨床開発されている。所望により
エフェクター機能と合わせて、強化されたアゴニスト活性の観点で改善された特性を有す
る抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７及び他の本発明の抗
ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、固形腫瘍を含む様々な癌の治療において治
療的に有効であろう。
Ｂ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬを含むＴＮＦ
Ｒスーパーファミリーメンバー及びそのリガンドの多くは、癌治療の標的として示されて
おり（Ｂｒｅｍｅｒ，Ｈｉｎｄａｗｉ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
ＩＳＲＮ ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ３７１
８５４，２５ ｐａｇｅｓ；Ｓａｎｍａｍｅｄ ｅｔ ａｌ）、ＴＮＦＲスーパーファミ
リーメンバーを標的とするいくつかのアゴニスト抗体、例えば、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ－４
０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７抗体が、様々な固形腫瘍並びに非ホジキンリ
ンパ腫及びＢ細胞悪性腫瘍などのヘム悪性腫瘍のために臨床開発されている。所望により
エフェクター機能と合わせて、強化されたアゴニスト活性の観点で改善された特性を有す
る抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７及び他の本発明の抗
ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、固形腫瘍を含む様々な癌の治療において治
療的に有効であろう。
以上、本発明を一般論として説明したが、本発明の各実施形態を、特許請求の範囲を限
定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例において更に開示する。
定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例において更に開示する。
実施例１：抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を改善するた
めのＦｃ遺伝子操作アプローチ
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する免疫賦活性受容体に対す
るアゴニスト抗体は、癌の免疫療法の有望な薬剤候補として台頭しつつある。アゴニスト
活性及び／又はエフェクター機能を強化することによって抗ＴＮＦＲ抗体の抗腫瘍活性を
増強できるいくつかのＦｃ遺伝子操作アプローチが最近見出された。
めのＦｃ遺伝子操作アプローチ
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する免疫賦活性受容体に対す
るアゴニスト抗体は、癌の免疫療法の有望な薬剤候補として台頭しつつある。アゴニスト
活性及び／又はエフェクター機能を強化することによって抗ＴＮＦＲ抗体の抗腫瘍活性を
増強できるいくつかのＦｃ遺伝子操作アプローチが最近見出された。
抗腫瘍免疫を賦活するモノクローナル抗体は、癌治療法の重要な分類として台頭しつつ
ある（Ｍｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４８０：４８０～９；
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：２２７～
４２）。免疫チェックポイント受容体を標的とする抗体であるＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１
は、進行黒色腫、肺癌の単剤療法として承認されており、他の種類のヒト癌の治療につい
て評価されている。阻害経路を標的とすることに加えて、Ｔ細胞及び抗原提示細胞上の免
疫賦活性受容体に対するアゴニスト抗体も抗腫瘍免疫を賦活することができ、癌免疫療法
の臨床開発の有望な領域として台頭しつつある（Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４
）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ２：７）。
ある（Ｍｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４８０：４８０～９；
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：２２７～
４２）。免疫チェックポイント受容体を標的とする抗体であるＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１
は、進行黒色腫、肺癌の単剤療法として承認されており、他の種類のヒト癌の治療につい
て評価されている。阻害経路を標的とすることに加えて、Ｔ細胞及び抗原提示細胞上の免
疫賦活性受容体に対するアゴニスト抗体も抗腫瘍免疫を賦活することができ、癌免疫療法
の臨床開発の有望な領域として台頭しつつある（Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４
）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ２：７）。
多くの免疫賦活性受容体は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属し
ている。これらのうち、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ及びＧＩＴＲは、エフェクター
Ｔ細胞及びそのリガンドで発現し、アゴニスト抗体はこれら受容体を活性化してＴ細胞の
増殖及び活性化を刺激することができる（Ｋａｎａｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：７３０６～１４；Ｇｒａｍａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１
９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：６５１０～７；Ｐｏｌｌｏｋ ｅｔ ａｌ．（１
９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：７７１～８１；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ
ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ３：３７）。ＣＤ４０は
抗原提示細胞で発現し、この受容体の活性化が、活性化Ｔ細胞に対する腫瘍抗原のより効
果的な提示を促進する（Ｍａｎｇｓｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ ２１：１１１５～２６）。これらＴＮＦ受容体に対する治療用抗体のアゴ
ニスト活性がその抗腫瘍活性にとって重要であることを多くのエビデンスが示している（
Ｍａｎｇｓｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：１
１１５～２６；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９１：４１７４
～８３；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １９：１０
１～１３）。他方、いくつかのＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えば、ＯＸ４０
及びＧＩＴＲは、腫瘍免疫を負に調節する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において発現が増加
した。いくつかの研究で、抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体が、抗体のエフェクター機能に
よって腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞の選択的除去を促進し得ることが明らかになっ
ている（Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０：１
６８５～９３；Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ ９２：４７５～８０）。制御性Ｔ細胞のこのような抗体媒介性死滅は、治療
用抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性について、抗体媒介性エフェクターＴ細胞
の活性化よりも重要であり得る。
ている。これらのうち、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ及びＧＩＴＲは、エフェクター
Ｔ細胞及びそのリガンドで発現し、アゴニスト抗体はこれら受容体を活性化してＴ細胞の
増殖及び活性化を刺激することができる（Ｋａｎａｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：７３０６～１４；Ｇｒａｍａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（１
９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：６５１０～７；Ｐｏｌｌｏｋ ｅｔ ａｌ．（１
９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：７７１～８１；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ
ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ３：３７）。ＣＤ４０は
抗原提示細胞で発現し、この受容体の活性化が、活性化Ｔ細胞に対する腫瘍抗原のより効
果的な提示を促進する（Ｍａｎｇｓｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ ２１：１１１５～２６）。これらＴＮＦ受容体に対する治療用抗体のアゴ
ニスト活性がその抗腫瘍活性にとって重要であることを多くのエビデンスが示している（
Ｍａｎｇｓｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：１
１１５～２６；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９１：４１７４
～８３；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １９：１０
１～１３）。他方、いくつかのＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えば、ＯＸ４０
及びＧＩＴＲは、腫瘍免疫を負に調節する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において発現が増加
した。いくつかの研究で、抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体が、抗体のエフェクター機能に
よって腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞の選択的除去を促進し得ることが明らかになっ
ている（Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０：１
６８５～９３；Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ ９２：４７５～８０）。制御性Ｔ細胞のこのような抗体媒介性死滅は、治療
用抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性について、抗体媒介性エフェクターＴ細胞
の活性化よりも重要であり得る。
蓄積されつつあるエビデンスでは、免疫調節性抗体は、そのアゴニスト活性及びエフェ
クター機能のために様々な種類のＦｃ受容体と会合することが示された。下流のシグナル
伝達経路を活性化するためには、ＴＮＦＲの三量化が必要である。しかし、１つの抗体分
子は、一般的に、十分なＴＮＦ受容体をクラスタリングするのに十分ではなく、その代わ
り、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける受容体活性化には抗体の架橋が必要である（Ｍｏ
ｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４：３１１２～２１．
Ｒｅｃｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈ
ｅ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＦｃγＲＩＩＢ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃ
ｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＴＮＦＲ
ｔａｒｇｅｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＣＤ４０（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ３３３：１０３０～４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６２：９４１～８），ｄｅａｔｈ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ ５（ＤＲ５）（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌ １９：１０１～１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９：１０９６６～７１）ａｎｄ ＣＤ９５（Ｘｕ
ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１：５６２～８）。ＩｇＧ Ｆｃの
ＦｃγＲＩＩＢ受容体への架橋によって、１よりも多くの抗体分子を多量体化することが
でき、続いて、シグナル伝達経路を活性化するために十分なＴＮＦＲのクラスタリングを
促進することができる。他方、抗体のエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ
は、様々な活性化Ｆｃγ受容体との相互作用に依存している。腫瘍内制御性Ｔ細胞を選択
的に除去することによって活性化Ｆｃγ受容体が免疫調節性抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗
体の抗腫瘍活性に寄与することが、マウスにおける研究によって明らかになった（Ｂｕｌ
ｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０：１６８５～９３；
（Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
９２：４７５～８０）．Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｈａｖｅ ｐｏｏ
ｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ
ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｘｃｅｐｔ ＦｃγＲＩ（Ｇｕｉｌｌｉａｍ
ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：９４～１０８）
。
クター機能のために様々な種類のＦｃ受容体と会合することが示された。下流のシグナル
伝達経路を活性化するためには、ＴＮＦＲの三量化が必要である。しかし、１つの抗体分
子は、一般的に、十分なＴＮＦ受容体をクラスタリングするのに十分ではなく、その代わ
り、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける受容体活性化には抗体の架橋が必要である（Ｍｏ
ｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４：３１１２～２１．
Ｒｅｃｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈ
ｅ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＦｃγＲＩＩＢ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃ
ｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＴＮＦＲ
ｔａｒｇｅｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＣＤ４０（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ３３３：１０３０～４；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６２：９４１～８），ｄｅａｔｈ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ ５（ＤＲ５）（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌ １９：１０１～１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９：１０９６６～７１）ａｎｄ ＣＤ９５（Ｘｕ
ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１：５６２～８）。ＩｇＧ Ｆｃの
ＦｃγＲＩＩＢ受容体への架橋によって、１よりも多くの抗体分子を多量体化することが
でき、続いて、シグナル伝達経路を活性化するために十分なＴＮＦＲのクラスタリングを
促進することができる。他方、抗体のエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ
は、様々な活性化Ｆｃγ受容体との相互作用に依存している。腫瘍内制御性Ｔ細胞を選択
的に除去することによって活性化Ｆｃγ受容体が免疫調節性抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ抗
体の抗腫瘍活性に寄与することが、マウスにおける研究によって明らかになった（Ｂｕｌ
ｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０：１６８５～９３；
（Ｂｕｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
９２：４７５～８０）．Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｈａｖｅ ｐｏｏ
ｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ
ｈｕｍａｎ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｘｃｅｐｔ ＦｃγＲＩ（Ｇｕｉｌｌｉａｍ
ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：９４～１０８）
。
免疫賦活性ＴＮＦ受容体に対するアゴニスト抗体の抗腫瘍活性を最適化するために、１
つのアプローチは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を遺伝子操作してそのＦｃγ受容体の会合、特
に、ＴＮＦ受容体抗体のアゴニズムを媒介するＦｃγＲＩＩＢ受容体との会合を改善する
ことである。これに関して、Ｃｈｕらは、ＦｃγＲＩＩＢ結合親和性が強化されたＩｇＧ
１ ＦｃにおけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異について記載している（Ｃｈｕ ｅｔ
ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６～３３。このような突然
変異を有するように遺伝子操作を受けた抗ＣＤ１９抗体は、初代ヒトＢ細胞のＢ細胞受容
体媒介性活性化の阻害を改善することが示された。しかし、更なる研究によって、このよ
うなＦｃ変異体が活性化ＦｃγＲＩＩＡ受容体のＲ１３１アロタイプへの結合も強化する
ことが明らかになった（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎ
ｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：５８９～９８。近年、Ｍｉｍｏｔｏらは、ＦｃγＲＩＩＡ受
容体のＨ１３１アロタイプ又はＲ１３１アロタイプへの結合増加を伴わずにＦｃγＲＩＩ
Ｂ会合が選択的に強化された、Ｖ１２突然変異と総称されるＩｇＧ１ Ｆｃにおける６つ
の突然変異のセットを報告した（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：５８９～９８。遺伝子操作を受けたＶ１２突然変異
を有する抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ会合に依存してはるかに強化さ
れたアゴニスト活性を示した。
つのアプローチは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を遺伝子操作してそのＦｃγ受容体の会合、特
に、ＴＮＦ受容体抗体のアゴニズムを媒介するＦｃγＲＩＩＢ受容体との会合を改善する
ことである。これに関して、Ｃｈｕらは、ＦｃγＲＩＩＢ結合親和性が強化されたＩｇＧ
１ ＦｃにおけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異について記載している（Ｃｈｕ ｅｔ
ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６～３３。このような突然
変異を有するように遺伝子操作を受けた抗ＣＤ１９抗体は、初代ヒトＢ細胞のＢ細胞受容
体媒介性活性化の阻害を改善することが示された。しかし、更なる研究によって、このよ
うなＦｃ変異体が活性化ＦｃγＲＩＩＡ受容体のＲ１３１アロタイプへの結合も強化する
ことが明らかになった（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎ
ｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：５８９～９８。近年、Ｍｉｍｏｔｏらは、ＦｃγＲＩＩＡ受
容体のＨ１３１アロタイプ又はＲ１３１アロタイプへの結合増加を伴わずにＦｃγＲＩＩ
Ｂ会合が選択的に強化された、Ｖ１２突然変異と総称されるＩｇＧ１ Ｆｃにおける６つ
の突然変異のセットを報告した（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：５８９～９８。遺伝子操作を受けたＶ１２突然変異
を有する抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ会合に依存してはるかに強化さ
れたアゴニスト活性を示した。
ＦｃγＲＩＩＢ会合の最適化は実行可能なアプローチであるが、このような遺伝子操作
を受けた抗体のアゴニスト活性は、局所腫瘍微小環境におけるＦｃγ受容体の発現に大き
く依存し、このような抗体の有効性は解剖学的作用部位に限定されることがある。Ｆｃγ
受容体の会合に依存しない免疫賦活性抗体のアゴニズムを増強する試みにおいて、ヒトＩ
ｇＧ２が、ＣＤ４０、４－１ＢＢ及びＣＤ２８受容体について、免疫賦活性抗体に超アゴ
ニスト活性を付与し得ることがＷｈｉｔｅらによって最近報告された（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ
ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７：１３８～４８）。この活性は、Ｉ
ｇＧ２サブタイプのヒンジ領域におけるジスルフィド結合の独特な構造によって付与され
、ＦｃγＲＩＩＢ会合には依存しない。他方、ＦｃγＲＩＩＢに対する架橋の目的が受容
体を活性化するためにアゴニスト抗体のクラスタリングを増加させることのみである場合
、本発明者らは、抗体の多量体化を促進し得るこれらＦｃ突然変異が、ＦｃγＲＩＩＢを
架橋させる必要なくＴＮＦ受容体への抗体のアゴニズムを強化し得ると仮定した。Ｄｉｅ
ｂｏｌｄｅｒらは、選択的Ｆｃ突然変異が、細胞表面の標的に結合した際にＩｇＧ抗体の
六量体の形成を促進し得ると報告した（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３）。このようなＩｇＧ六量体は補体依存性細胞傷
害（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）を大きく活性化できることが報告さ
れているが、本発明者らは、別の出願で、ＴＮＦ受容体を認識するオリゴマー化抗体が受
容体のクラスタリングを促進することによってこのような受容体を活性化できると請求し
ている。
を受けた抗体のアゴニスト活性は、局所腫瘍微小環境におけるＦｃγ受容体の発現に大き
く依存し、このような抗体の有効性は解剖学的作用部位に限定されることがある。Ｆｃγ
受容体の会合に依存しない免疫賦活性抗体のアゴニズムを増強する試みにおいて、ヒトＩ
ｇＧ２が、ＣＤ４０、４－１ＢＢ及びＣＤ２８受容体について、免疫賦活性抗体に超アゴ
ニスト活性を付与し得ることがＷｈｉｔｅらによって最近報告された（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ
ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７：１３８～４８）。この活性は、Ｉ
ｇＧ２サブタイプのヒンジ領域におけるジスルフィド結合の独特な構造によって付与され
、ＦｃγＲＩＩＢ会合には依存しない。他方、ＦｃγＲＩＩＢに対する架橋の目的が受容
体を活性化するためにアゴニスト抗体のクラスタリングを増加させることのみである場合
、本発明者らは、抗体の多量体化を促進し得るこれらＦｃ突然変異が、ＦｃγＲＩＩＢを
架橋させる必要なくＴＮＦ受容体への抗体のアゴニズムを強化し得ると仮定した。Ｄｉｅ
ｂｏｌｄｅｒらは、選択的Ｆｃ突然変異が、細胞表面の標的に結合した際にＩｇＧ抗体の
六量体の形成を促進し得ると報告した（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３）。このようなＩｇＧ六量体は補体依存性細胞傷
害（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）を大きく活性化できることが報告さ
れているが、本発明者らは、別の出願で、ＴＮＦ受容体を認識するオリゴマー化抗体が受
容体のクラスタリングを促進することによってこのような受容体を活性化できると請求し
ている。
この研究は、抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムの強化に対する様々なＦｃ遺伝子操作アプロ
ーチの評価について説明している。更に、遺伝子操作を受けた抗体のＡＤＣＣ及びＡＤＣ
Ｐエフェクター機能に対するＦｃ突然変異の効果についても評価された。このような研究
は、抗腫瘍活性が改善されたＯＸ４０及び他のＴＮＦ受容体に対する遺伝子操作を受けた
抗体の設計の指針に役立ち得る。
ーチの評価について説明している。更に、遺伝子操作を受けた抗体のＡＤＣＣ及びＡＤＣ
Ｐエフェクター機能に対するＦｃ突然変異の効果についても評価された。このような研究
は、抗腫瘍活性が改善されたＯＸ４０及び他のＴＮＦ受容体に対する遺伝子操作を受けた
抗体の設計の指針に役立ち得る。
実施例２：材料及び方法
抗ＯＸ４０抗体のＦｃ遺伝子操作
抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２のＶＨ及びＶＬの領域（ＶＨ：配列番号５１、ＶＬ：配列番号５
２）をヒト野生型ＩｇＧ１又はＩｇＧ２にクローニングし、選択置換でＦｃを遺伝子操作
して、抗体のアゴニスト活性及びエフェクター機能に対する当該置換の効果を評価した。
生成された抗体及びそのＦｃ置換の名称を表３に示す。
抗ＯＸ４０抗体のＦｃ遺伝子操作
抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２のＶＨ及びＶＬの領域（ＶＨ：配列番号５１、ＶＬ：配列番号５
２）をヒト野生型ＩｇＧ１又はＩｇＧ２にクローニングし、選択置換でＦｃを遺伝子操作
して、抗体のアゴニスト活性及びエフェクター機能に対する当該置換の効果を評価した。
生成された抗体及びそのＦｃ置換の名称を表３に示す。
配列番号６３ Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ
ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ
ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号６４ Ｅ４３０Ｇ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ
ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ
ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号６５ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ
ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ
ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴ
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号６６ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を有するＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＲＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ
ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ
ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＧＡＬＨＮＨＹＴ
ＱＫＹＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ
ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ
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ＱＫＹＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号６７ Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するＩｇＧ２ｓｉｇｍａ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
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抗体の発現及び精製
抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードしているプラスミドを、トランスフェク
ションキットの説明書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って１：３（ＨＣ：
ＬＣ）のモル比でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクショ
ンの５日後に細胞をスピンダウンし、上清を０．２μｍのフィルタに通した。Ｏｃｔｅｔ
（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、抗体発現の力価を定量した。キットの説明書（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってプレパックドプロテイン
Ａスピンカラムを使用して抗体の精製を実施した。精製された抗体を透析によってＤＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．２）にバッファ交換し、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によってタンパク質
濃度を求めた。還元されたサンプル及び還元されていないサンプルの高性能サイズ排除ク
ロマトグラフィ（high-performance size-exclusion chromatography、ＨＰ－ＳＥＣ）及
びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子の品質及び完全性を評価した。
抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードしているプラスミドを、トランスフェク
ションキットの説明書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って１：３（ＨＣ：
ＬＣ）のモル比でＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクショ
ンの５日後に細胞をスピンダウンし、上清を０．２μｍのフィルタに通した。Ｏｃｔｅｔ
（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、抗体発現の力価を定量した。キットの説明書（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってプレパックドプロテイン
Ａスピンカラムを使用して抗体の精製を実施した。精製された抗体を透析によってＤＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．２）にバッファ交換し、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によってタンパク質
濃度を求めた。還元されたサンプル及び還元されていないサンプルの高性能サイズ排除ク
ロマトグラフィ（high-performance size-exclusion chromatography、ＨＰ－ＳＥＣ）及
びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子の品質及び完全性を評価した。
ＮａｎｏＢＲＥＴタンパク質－タンパク質相互作用アッセイ
抗ＯＸ４０ ＳＦ２抗体の軽鎖のコーディング配列を、それぞれ、Ｃ末端Ｎａｎｏｌｕ
ｃ及びＨａｌｏｔａｇ配列とインフレームになるようにｐＮＬＦ－Ｃ及びｐＨＴＣ ｈａ
ｌｏｔａｇベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。Ｎ
ａｎｏｌｕｃ又はＨａｌｏｔａｇが軽鎖のＣ末端に結合しているＦｃが遺伝子操作を受け
たＳＦ２を発現させるために、これら軽鎖をＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２
ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ抗体の重鎖と対合させた。標準的なプロテ
インＡスピンカラムを使用して、これら修飾された抗体を精製した。
抗ＯＸ４０ ＳＦ２抗体の軽鎖のコーディング配列を、それぞれ、Ｃ末端Ｎａｎｏｌｕ
ｃ及びＨａｌｏｔａｇ配列とインフレームになるようにｐＮＬＦ－Ｃ及びｐＨＴＣ ｈａ
ｌｏｔａｇベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。Ｎ
ａｎｏｌｕｃ又はＨａｌｏｔａｇが軽鎖のＣ末端に結合しているＦｃが遺伝子操作を受け
たＳＦ２を発現させるために、これら軽鎖をＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２
ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ抗体の重鎖と対合させた。標準的なプロテ
インＡスピンカラムを使用して、これら修飾された抗体を精製した。
ＮａｎｏＢＲＥＴタンパク質－タンパク質相互作用アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）によって細胞表面における抗体の多量体化について調べるために、９６
ウェルアッセイプレートの各ウェルに０．２５×１０５個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０
細胞を播種し、３７℃で一晩培養した。次の日、５０μＬのアッセイ培地（Ｏｐｔｉ－Ｍ
ＥＭ Ｉ還元血清培地、フェノールレッド無し＋４％ ＦＢＳ）中、等濃度のＮａｎｏｌ
ｕｃタグ付抗体（ドナー）及びＨａｌｏｔａｇタグ付抗体（アクセプター）を細胞に適用
した。５０μＬのアッセイ培地で１：１０００希釈されたＨａｌｏｔａｇ ６１８リガン
ドを実験ウェルに添加し、アッセイ培地でＤＭＳＯを１：１０００希釈することによって
リガンド無しの対照ウェルも設定した。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞を
アッセイ培地で２回洗浄し、１００μＬのアッセイ培地に再懸濁した。ＦＢＳを含まない
アッセイ培地で１：２００希釈した２５μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ基質を各ウェルに添加し
た。３０秒間振盪した後、ドナーの発光（４６０ｎｍ）及びアクセプターの発光（６１８
ｎｍ）をＥｎｖｉｓｉｏｎによって測定した。ミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）による生のＮ
ａｎｏＢＲＥＴ比の値をＲａｗＢＲＥＴ＝６１８ｎｍＥｍ／４６０ｎｍＥｍ×１０００と
して算出した。ドナーが寄与するバックグラウンド又は蛍光漏れ（bleed through）を計
算に入れるために、ミリＢＲＥＴ単位による補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比の値をＣｏｒ
ｒｅｃｔｅｄＢＲＥＴ＝ＲａｗＢＲＥＴ実験サンプル－ＲａｗＢＲＥＴリガンド無し対照
サンプルとして算出し、これは、タンパク質－タンパク質相互作用に起因する生物発光タ
ンパク質ドナーから蛍光タンパク質アクセプターへのエネルギー転移を反映している。
ｉｓｏｎ，ＷＩ）によって細胞表面における抗体の多量体化について調べるために、９６
ウェルアッセイプレートの各ウェルに０．２５×１０５個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０
細胞を播種し、３７℃で一晩培養した。次の日、５０μＬのアッセイ培地（Ｏｐｔｉ－Ｍ
ＥＭ Ｉ還元血清培地、フェノールレッド無し＋４％ ＦＢＳ）中、等濃度のＮａｎｏｌ
ｕｃタグ付抗体（ドナー）及びＨａｌｏｔａｇタグ付抗体（アクセプター）を細胞に適用
した。５０μＬのアッセイ培地で１：１０００希釈されたＨａｌｏｔａｇ ６１８リガン
ドを実験ウェルに添加し、アッセイ培地でＤＭＳＯを１：１０００希釈することによって
リガンド無しの対照ウェルも設定した。３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞を
アッセイ培地で２回洗浄し、１００μＬのアッセイ培地に再懸濁した。ＦＢＳを含まない
アッセイ培地で１：２００希釈した２５μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ基質を各ウェルに添加し
た。３０秒間振盪した後、ドナーの発光（４６０ｎｍ）及びアクセプターの発光（６１８
ｎｍ）をＥｎｖｉｓｉｏｎによって測定した。ミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）による生のＮ
ａｎｏＢＲＥＴ比の値をＲａｗＢＲＥＴ＝６１８ｎｍＥｍ／４６０ｎｍＥｍ×１０００と
して算出した。ドナーが寄与するバックグラウンド又は蛍光漏れ（bleed through）を計
算に入れるために、ミリＢＲＥＴ単位による補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比の値をＣｏｒ
ｒｅｃｔｅｄＢＲＥＴ＝ＲａｗＢＲＥＴ実験サンプル－ＲａｗＢＲＥＴリガンド無し対照
サンプルとして算出し、これは、タンパク質－タンパク質相互作用に起因する生物発光タ
ンパク質ドナーから蛍光タンパク質アクセプターへのエネルギー転移を反映している。
フローサイトメトリー染色
ヒトＦｃγＲＩ（ＮＭ＿０００５６６）（配列番号５９）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＮＭ＿０
２１６４２）（配列番号６０）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＮＭ＿００４００１）（配列番号６１
）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＮＭ＿０００５６９）（配列番号６２）（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を
コードしているｃＤＮＡを発現するプラスミドを、Ｅｘｐｉｆｅｃｔｍｉｎｅ２９３トラ
ンスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＥｘｐｉ２９
３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にフロー
サイトメトリーアッセイを実施した。トランスフェクトされたＦｃ受容体の発現を確認す
るために、その特異的抗体、ＦｃγＲＩについては１０．１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ）、ＦｃγＲＩＩＡについてはＩＶ．３（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）、ＦｃγＲＩＩＢについては２Ｂ６（インハウスで調製）（Ｖｅｒｉ ｅｔ ａｌ．
（２００７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２１：３９２～４０４、及びＦｃγＲＩＩＩＡに
ついては３Ｇ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、陽性対照としてフローサイトメトリ
ー染色において使用した。抗ＯＸ４０抗体のＦｃγＲＩＩＢ受容体への結合を試験するた
めにＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－８６）も使用した。
ヒトＦｃγＲＩ（ＮＭ＿０００５６６）（配列番号５９）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＮＭ＿０
２１６４２）（配列番号６０）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＮＭ＿００４００１）（配列番号６１
）及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＮＭ＿０００５６９）（配列番号６２）（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を
コードしているｃＤＮＡを発現するプラスミドを、Ｅｘｐｉｆｅｃｔｍｉｎｅ２９３トラ
ンスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＥｘｐｉ２９
３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にフロー
サイトメトリーアッセイを実施した。トランスフェクトされたＦｃ受容体の発現を確認す
るために、その特異的抗体、ＦｃγＲＩについては１０．１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ）、ＦｃγＲＩＩＡについてはＩＶ．３（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）、ＦｃγＲＩＩＢについては２Ｂ６（インハウスで調製）（Ｖｅｒｉ ｅｔ ａｌ．
（２００７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２１：３９２～４０４、及びＦｃγＲＩＩＩＡに
ついては３Ｇ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、陽性対照としてフローサイトメトリ
ー染色において使用した。抗ＯＸ４０抗体のＦｃγＲＩＩＢ受容体への結合を試験するた
めにＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－８６）も使用した。
９６ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０５個の細胞を播種し、ＢＳＡ染色バッフ
ァ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中において４℃で３０
分間ブロックした。細胞を、氷上において４℃で１．５時間、試験抗体と共にインキュベ
ートした。ＢＳＡ染色バッファで２回洗浄した後、Ｒ－ＰＥで標識された抗ヒト又は抗マ
ウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）と共に細胞を４℃で４５分間インキュベートした。細胞を染色バッファで２
回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ（
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含
有する１５０μＬの染色バッファ中に再懸濁させた。それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使
用して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって、染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ
７シグナルを検出した。生細胞をＤＲＡＱ７排除でゲートし、収集された少なくとも１０
，０００生細胞事象について幾何平均蛍光シグナルを求めた。解析にはＦｌｏｗＪｏソフ
トウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用した。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体
濃度の対数としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によって非線形回帰分析を行い、ＥＣ５０値を算出した
。
ァ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中において４℃で３０
分間ブロックした。細胞を、氷上において４℃で１．５時間、試験抗体と共にインキュベ
ートした。ＢＳＡ染色バッファで２回洗浄した後、Ｒ－ＰＥで標識された抗ヒト又は抗マ
ウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）と共に細胞を４℃で４５分間インキュベートした。細胞を染色バッファで２
回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ（
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含
有する１５０μＬの染色バッファ中に再懸濁させた。それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使
用して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって、染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ
７シグナルを検出した。生細胞をＤＲＡＱ７排除でゲートし、収集された少なくとも１０
，０００生細胞事象について幾何平均蛍光シグナルを求めた。解析にはＦｌｏｗＪｏソフ
トウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用した。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体
濃度の対数としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によって非線形回帰分析を行い、ＥＣ５０値を算出した
。
配列番号５９
ＭＷＦＬＴＴＬＬＬＷＶＰＶＤＧＱＶＤＴＴＫＡＶＩＴＬＱＰＰＷＶＳＶＦＱＥＥＴＶＴ
ＬＨＣＥＶＬＨＬＰＧＳＳＳＴＱＷＦＬＮＧＴＡＴＱＴＳＴＰＳＹＲＩＴＳＡＳＶＮＤＳ
ＧＥＹＲＣＱＲＧＬＳＧＲＳＤＰＩＱＬＥＩＨＲＧＷＬＬＬＱＶＳＳＲＶＦＴＥＧＥＰＬ
ＡＬＲＣＨＡＷＫＤＫＬＶＹＮＶＬＹＹＲＮＧＫＡＦＫＦＦＨＷＮＳＮＬＴＩＬＫＴＮＩ
ＳＨＮＧＴＹＨＣＳＧＭＧＫＨＲＹＴＳＡＧＩＳＶＴＶＫＥＬＦＰＡＰＶＬＮＡＳＶＴＳ
ＰＬＬＥＧＮＬＶＴＬＳＣＥＴＫＬＬＬＱＲＰＧＬＱＬＹＦＳＦＹＭＧＳＫＴＬＲＧＲＮ
ＴＳＳＥＹＱＩＬＴＡＲＲＥＤＳＧＬＹＷＣＥＡＡＴＥＤＧＮＶＬＫＲＳＰＥＬＥＬＱＶ
ＬＧＬＱＬＰＴＰＶＷＦＨＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩＲＫＥＬＫＲＫ
ＫＫＷＤＬＥＩＳＬＤＳＧＨＥＫＫＶＩＳＳＬＱＥＤＲＨＬＥＥＥＬＫＣＱＥＱＫＥＥＱ
ＬＱＥＧＶＨＲＫＥＰＱＧＡＴ
ＭＷＦＬＴＴＬＬＬＷＶＰＶＤＧＱＶＤＴＴＫＡＶＩＴＬＱＰＰＷＶＳＶＦＱＥＥＴＶＴ
ＬＨＣＥＶＬＨＬＰＧＳＳＳＴＱＷＦＬＮＧＴＡＴＱＴＳＴＰＳＹＲＩＴＳＡＳＶＮＤＳ
ＧＥＹＲＣＱＲＧＬＳＧＲＳＤＰＩＱＬＥＩＨＲＧＷＬＬＬＱＶＳＳＲＶＦＴＥＧＥＰＬ
ＡＬＲＣＨＡＷＫＤＫＬＶＹＮＶＬＹＹＲＮＧＫＡＦＫＦＦＨＷＮＳＮＬＴＩＬＫＴＮＩ
ＳＨＮＧＴＹＨＣＳＧＭＧＫＨＲＹＴＳＡＧＩＳＶＴＶＫＥＬＦＰＡＰＶＬＮＡＳＶＴＳ
ＰＬＬＥＧＮＬＶＴＬＳＣＥＴＫＬＬＬＱＲＰＧＬＱＬＹＦＳＦＹＭＧＳＫＴＬＲＧＲＮ
ＴＳＳＥＹＱＩＬＴＡＲＲＥＤＳＧＬＹＷＣＥＡＡＴＥＤＧＮＶＬＫＲＳＰＥＬＥＬＱＶ
ＬＧＬＱＬＰＴＰＶＷＦＨＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩＲＫＥＬＫＲＫ
ＫＫＷＤＬＥＩＳＬＤＳＧＨＥＫＫＶＩＳＳＬＱＥＤＲＨＬＥＥＥＬＫＣＱＥＱＫＥＥＱ
ＬＱＥＧＶＨＲＫＥＰＱＧＡＴ
配列番号６０
ＭＴＭＥＴＱＭＳＱＮＶＣＰＲＮＬＷＬＬＱＰＬＴＶＬＬＬＬＡＳＡＤＳＱＡＡＰＰＫＡ
ＶＬＫＬＥＰＰＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＱＧＡＲＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬ
ＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳ
ＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＭＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫ
ＳＱＫＦＳＨＬＤＰＴＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＦＳＳＫＰＶ
ＴＩＴＶＱＶＰＳＭＧＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＩＡＴＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣ
ＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹ
ＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
ＭＴＭＥＴＱＭＳＱＮＶＣＰＲＮＬＷＬＬＱＰＬＴＶＬＬＬＬＡＳＡＤＳＱＡＡＰＰＫＡ
ＶＬＫＬＥＰＰＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＱＧＡＲＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬ
ＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳ
ＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＭＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫ
ＳＱＫＦＳＨＬＤＰＴＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＦＳＳＫＰＶ
ＴＩＴＶＱＶＰＳＭＧＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＩＡＴＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣ
ＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹ
ＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ
配列番号６１
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶ
ＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤ
ＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬ
ＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬ
ＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩ
ＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡ
ＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＬＰＧＹＰＥＣＲＥＭＧＥＴＬＰＥＫＰＡＮＰＴＮＰＤＥ
ＡＤＫＶＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨＰＤＡＬＥＥＰＤＤＱＮＲＩ
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶ
ＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤ
ＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬ
ＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬ
ＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩ
ＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡ
ＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＬＰＧＹＰＥＣＲＥＭＧＥＴＬＰＥＫＰＡＮＰＴＮＰＤＥ
ＡＤＫＶＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨＰＤＡＬＥＥＰＤＤＱＮＲＩ
配列番号６２
ＭＡＥＧＴＬＷＱＩＬＣＶＳＳＤＡＱＰＱＴＦＥＧＶＫＧＡＤＰＰＴＬＰＰＧＳＦＬＰＧ
ＰＶＬＷＷＧＳＬＡＲＬＱＴＥＫＳＤＥＶＳＲＫＧＮＷＷＶＴＥＭＧＧＧＡＧＥＲＬＦＴ
ＳＳＣＬＶＧＬＶＰＬＧＬＲＩＳＬＶＴＣＰＬＱＣＧＩＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳ
ＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤ
ＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴ
ＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡ
ＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬ
ＦＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＳＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭ
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ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＮＦκＢリポーターアッセイ
ＮＦ－κＢ誘導性プロモーター（ＩＦＮ－βミニマルプロモーター）の制御下で分泌型
アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）受容体遺伝子を発現するように遺伝子操作を受けた
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１細胞にＯＸ４０発現プラスミド（ｐＵＮＯ１－ｈＯ
Ｘ４０）をトランスフェクトすることによって、ヒトＯＸ４０を発現する安定なＨＥＫ－
Ｂｌｕｅリポーター細胞株（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０）を樹立した。リポーターアッ
セイでは、２００μＬの培養培地に再懸濁させた１×１０５個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ
４０細胞を９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに分注し、ＯＸ４０リガンド又は抗Ｏ
Ｘ４０抗体を添加した。架橋の効果を試験するために、１μＬのプロテインＧ磁気ビーズ
（Ｐｉｅｒｃｅ）、又は１×１０５個のＲａｊｉ細胞を同じアッセイウェルに添加した。
３７℃で一晩インキュベートした後、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ検出キット（Ｉｎｖｉｖｏ
ｇｅｎ）を使用して誘導された分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポーター遺
伝子の発現を定量することによって、抗体のアゴニスト活性を評価した。簡潔に述べると
、４０μＬの細胞培養上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬と混合し、適切な
青色を発色するまで３７℃でインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレー
トリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用
して６５０ｎｍにおけるＯＤを測定した。抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を、１μｇ／
ｍＬ ＯＸ４０リガンドによって誘導されたものに対する活性パーセントとして正規化し
た。
ＮＦ－κＢ誘導性プロモーター（ＩＦＮ－βミニマルプロモーター）の制御下で分泌型
アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）受容体遺伝子を発現するように遺伝子操作を受けた
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１細胞にＯＸ４０発現プラスミド（ｐＵＮＯ１－ｈＯ
Ｘ４０）をトランスフェクトすることによって、ヒトＯＸ４０を発現する安定なＨＥＫ－
Ｂｌｕｅリポーター細胞株（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０）を樹立した。リポーターアッ
セイでは、２００μＬの培養培地に再懸濁させた１×１０５個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ
４０細胞を９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに分注し、ＯＸ４０リガンド又は抗Ｏ
Ｘ４０抗体を添加した。架橋の効果を試験するために、１μＬのプロテインＧ磁気ビーズ
（Ｐｉｅｒｃｅ）、又は１×１０５個のＲａｊｉ細胞を同じアッセイウェルに添加した。
３７℃で一晩インキュベートした後、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ検出キット（Ｉｎｖｉｖｏ
ｇｅｎ）を使用して誘導された分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポーター遺
伝子の発現を定量することによって、抗体のアゴニスト活性を評価した。簡潔に述べると
、４０μＬの細胞培養上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬と混合し、適切な
青色を発色するまで３７℃でインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレー
トリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用
して６５０ｎｍにおけるＯＤを測定した。抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を、１μｇ／
ｍＬ ＯＸ４０リガンドによって誘導されたものに対する活性パーセントとして正規化し
た。
ＡＤＣＣアッセイ
製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって指示されているとおり、ＡＤＣＣリポーターバイ
オアッセイによって抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。簡潔に述べると、一晩９
６ウェルプレートにプレーティングした１ウェルあたり２５，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕ
ｅ：ＯＸ４０細胞を、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の活性化によってルシフェラーゼリポータ
ーが発現する遺伝子操作を受けたエフェクター細胞と混合した。抗ＯＸ４０抗体を細胞に
添加し、３７℃で６時間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試
薬を添加し、ルシフェラーゼシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎによって定量した。抗ＯＸ４０
抗体のＡＤＣＣ活性を、試験抗体を添加しなかったものに対するルシフェラーゼシグナル
の活性化の倍数として表した。
製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって指示されているとおり、ＡＤＣＣリポーターバイ
オアッセイによって抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。簡潔に述べると、一晩９
６ウェルプレートにプレーティングした１ウェルあたり２５，０００個のＨＥＫ－Ｂｌｕ
ｅ：ＯＸ４０細胞を、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の活性化によってルシフェラーゼリポータ
ーが発現する遺伝子操作を受けたエフェクター細胞と混合した。抗ＯＸ４０抗体を細胞に
添加し、３７℃で６時間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試
薬を添加し、ルシフェラーゼシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎによって定量した。抗ＯＸ４０
抗体のＡＤＣＣ活性を、試験抗体を添加しなかったものに対するルシフェラーゼシグナル
の活性化の倍数として表した。
ＡＤＣＰアッセイ
Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ
：ＯＸ４０細胞に感染させることによって、ＧＦＰを発現するＯＸ４０標的細胞株を樹立
した。安定なＧＦＰ発現細胞をピューロマイシンで選抜した。ＣＤ１６が枯渇していない
ネガティブヒト単球濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用
して、ＰＢＭＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ）からヒトＣＤ１４＋ＣＤ１
６＋単球を単離した。１０％ ＦＢＳを含有するＸ－ＶＩＶＯ－１０培地（Ｌｏｎｚａ）
に単離された単球をプレーティングし、７日間にわたって２５ｎｇ／ｍＬのマクロファー
ジコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加することによって単球からマクロ
ファージを分化させた。分化の最後の２４時間、ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を添加した。ＡＤＣＰアッセイでは、１×１０５細胞／ウェルの分化した
マクロファージを、９６ウェルＵ底プレートにおける２００μＬの培地（ＤＭＥＭ＋１０
％ ＦＢＳ）中０．２５×１０５細胞／ウェルのＧＦＰ発現ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０
細胞と混合した（４：１比）。試験抗体を添加し、３７℃のインキュベータ内で２４時間
プレートをインキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して細
胞を剥離し、ＢＳＡ染色バッファに再懸濁させた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合している抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）でマクロファージを染色した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ
フローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）を使用
して、フローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞及
びＡｌｅｘａ６４７陽性マクロファージを同定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅ
ｅ Ｓｔａｒ）を用いてデータを解析し、以下の式を用いてＧＦＰ蛍光の減少を測定する
ことによって、ＡＤＣＰ媒介性細胞死滅を求めた：死滅した標的細胞の割合＝（（最低濃
度の抗体によるＧＦＰ＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１４－細胞の割合）－（試験濃度の抗体に
よるＧＦＰ＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１４－細胞の割合））／（最低濃度の抗体によるＧＦ
Ｐ＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１４－細胞の割合）×１００。
Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ
：ＯＸ４０細胞に感染させることによって、ＧＦＰを発現するＯＸ４０標的細胞株を樹立
した。安定なＧＦＰ発現細胞をピューロマイシンで選抜した。ＣＤ１６が枯渇していない
ネガティブヒト単球濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用
して、ＰＢＭＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ）からヒトＣＤ１４＋ＣＤ１
６＋単球を単離した。１０％ ＦＢＳを含有するＸ－ＶＩＶＯ－１０培地（Ｌｏｎｚａ）
に単離された単球をプレーティングし、７日間にわたって２５ｎｇ／ｍＬのマクロファー
ジコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加することによって単球からマクロ
ファージを分化させた。分化の最後の２４時間、ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を添加した。ＡＤＣＰアッセイでは、１×１０５細胞／ウェルの分化した
マクロファージを、９６ウェルＵ底プレートにおける２００μＬの培地（ＤＭＥＭ＋１０
％ ＦＢＳ）中０．２５×１０５細胞／ウェルのＧＦＰ発現ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０
細胞と混合した（４：１比）。試験抗体を添加し、３７℃のインキュベータ内で２４時間
プレートをインキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して細
胞を剥離し、ＢＳＡ染色バッファに再懸濁させた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合している抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）でマクロファージを染色した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ
フローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）を使用
して、フローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞及
びＡｌｅｘａ６４７陽性マクロファージを同定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅ
ｅ Ｓｔａｒ）を用いてデータを解析し、以下の式を用いてＧＦＰ蛍光の減少を測定する
ことによって、ＡＤＣＰ媒介性細胞死滅を求めた：死滅した標的細胞の割合＝（（最低濃
度の抗体によるＧＦＰ＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１４－細胞の割合）－（試験濃度の抗体に
よるＧＦＰ＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１４－細胞の割合））／（最低濃度の抗体によるＧＦ
Ｐ＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１４－細胞の割合）×１００。
ＣＤＣアッセイ
補体媒介性細胞死滅アッセイによって抗ＯＸ４０抗体のＣＤＣ活性を評価した。簡潔に
述べると、１×１０５個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を６．７％（ｖ／ｖ）ウサギ
補体（Ｃｅｄａｒ Ｌａｎｅ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）及び試
験抗体と共に１時間インキュベートした。製造業者の指示書（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って、溶解したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：
ＯＸ４０細胞のサイトゾルから上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼの活性を細胞傷害
検出キットによって測定した。補体媒介性細胞傷害を、０．６７％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ－１００によって溶解したものに対する細胞傷害のパーセントとして表した。
補体媒介性細胞死滅アッセイによって抗ＯＸ４０抗体のＣＤＣ活性を評価した。簡潔に
述べると、１×１０５個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を６．７％（ｖ／ｖ）ウサギ
補体（Ｃｅｄａｒ Ｌａｎｅ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）及び試
験抗体と共に１時間インキュベートした。製造業者の指示書（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って、溶解したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：
ＯＸ４０細胞のサイトゾルから上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼの活性を細胞傷害
検出キットによって測定した。補体媒介性細胞傷害を、０．６７％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ－１００によって溶解したものに対する細胞傷害のパーセントとして表した。
実施例３．抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムを評価するためのＮＦκＢリポーターアッセイ
の確立
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＯＸ４０は、ＴＮＦ受容体関連因子
（ＴＲＡＦ）に結合することによって核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）シグナル伝達経路を活
性化する。ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性に対するＦｃ遺伝子操作の寄与について調べる
ために、ＮＦκＢ誘導性プロモーター下で安定的にヒトＯＸ４０及びＳＥＡＰを発現する
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）リポーター細胞株を樹立した。ＯＸ４０リガンドは、ＳＥＡＰ
リポーター遺伝子を発現させるトランスフェクトされたＯＸ４０受容体を用量依存的に活
性化した（図１Ａ）。次いで、このリポーターアッセイによって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ
１抗体をそのアゴニスト活性について評価した。抗体は単独でわずかにアゴニスト活性を
示したが、プロテインＧビーズに固定化されたＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、用量依存
的に、１０００ｎｇ／ｍＬではＯＸ４０リガンドよりも高いレベルまでリポーター遺伝子
の発現を刺激することができ（図１Ａ）、これは、アゴニスト活性に抗体架橋が必要であ
ることを示す。
の確立
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＯＸ４０は、ＴＮＦ受容体関連因子
（ＴＲＡＦ）に結合することによって核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）シグナル伝達経路を活
性化する。ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性に対するＦｃ遺伝子操作の寄与について調べる
ために、ＮＦκＢ誘導性プロモーター下で安定的にヒトＯＸ４０及びＳＥＡＰを発現する
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）リポーター細胞株を樹立した。ＯＸ４０リガンドは、ＳＥＡＰ
リポーター遺伝子を発現させるトランスフェクトされたＯＸ４０受容体を用量依存的に活
性化した（図１Ａ）。次いで、このリポーターアッセイによって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ
１抗体をそのアゴニスト活性について評価した。抗体は単独でわずかにアゴニスト活性を
示したが、プロテインＧビーズに固定化されたＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、用量依存
的に、１０００ｎｇ／ｍＬではＯＸ４０リガンドよりも高いレベルまでリポーター遺伝子
の発現を刺激することができ（図１Ａ）、これは、アゴニスト活性に抗体架橋が必要であ
ることを示す。
最近の研究では、ＦｃγＲＩＩＢにより架橋活性がもたらされ、ＴＮＦ受容体抗体のア
ゴニスト活性を促進できることが明らかになった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅ
ｌｌ Ｃｙｃｌｅ １１：３３４３～４）。ＦｃγＲＩＩＢが主に発現するヒトＢリンパ
芽球Ｒａｊｉ細胞と共にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を共培養することによって、リ
ポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＢの架橋効果を評価した（Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ
ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：２３８４～９１）。しかし、Ｒａｊｉ細胞と共
培養しても天然ＩｇＧ１を有するＳＦ２抗体のアゴニスト活性を有意に強化することはで
きなかった（図１Ｂ）。
ゴニスト活性を促進できることが明らかになった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅ
ｌｌ Ｃｙｃｌｅ １１：３３４３～４）。ＦｃγＲＩＩＢが主に発現するヒトＢリンパ
芽球Ｒａｊｉ細胞と共にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を共培養することによって、リ
ポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＢの架橋効果を評価した（Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ
ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：２３８４～９１）。しかし、Ｒａｊｉ細胞と共
培養しても天然ＩｇＧ１を有するＳＦ２抗体のアゴニスト活性を有意に強化することはで
きなかった（図１Ｂ）。
実施例４．Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体の特性
評価
抗体ＦｃにおけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異及びＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２
３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ突然変異（本明細書ではＶ１２突然変異と
称する）は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する当該抗体の結合を強化することが判明してい
る。抗ＯＸ４０抗体におけるこのような突然変異の効果を評価するために、Ｓ２６７Ｅ／
Ｌ３２８Ｆ二重突然変異（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）及びＶ１２
突然変異（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２）を有するＩｇＧ１として抗ＯＸ４０抗体ＳＦ
２をクローニングした。
評価
抗体ＦｃにおけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異及びＥ２３３Ｄ／Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２
３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ突然変異（本明細書ではＶ１２突然変異と
称する）は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する当該抗体の結合を強化することが判明してい
る。抗ＯＸ４０抗体におけるこのような突然変異の効果を評価するために、Ｓ２６７Ｅ／
Ｌ３２８Ｆ二重突然変異（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）及びＶ１２
突然変異（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２）を有するＩｇＧ１として抗ＯＸ４０抗体ＳＦ
２をクローニングした。
ＦｃγＲへの結合
一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞において発現している様々なＦ
ｃγＲに対する遺伝子操作を受けた抗体の結合を、フローサイトメトリーによって評価し
た。ＦｃγＲＩＩＢについて、天然ＩｇＧ１を有するＯＸ４０ＳＦ２抗体の結合は少ない
が、遺伝子操作を受けたＦｃ突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性の増大を伴
う抗ＯＸ４０抗体を強く助長し、ＥＣ５０（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２
８Ｆについては４５９ｎｇ／ｍＬ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２については５０２ｎ
ｇ／ｍＬ）は２Ｂ６（４３１ｎｇ／ｍＬ）と同等であり、抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ
１よりもはるかに高く、ＦｃγＲＩＩＢを優先的に認識する（図２Ａ）。同様のフローサ
イトメトリーアッセイを実施して、一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細
胞において発現しているＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１アロタイプに対する、遺伝子操作を受
けた抗ＯＸ４０抗体の結合を評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２はＯＸ４０ＳＦ２
ＩｇＧ１と同様にＦｃγＲＩＩＡに対して少ない結合を示したが、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ突然変異は、２０倍効力が高いＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（ＥＣ５０：２１６ｎｇ／ｍＬ
）に対するより強力な結合を促進する（図２Ｂ）。このデータは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ及びＶ１２突然変異がいずれもＦｃγＲＩＩＢ結合の強化を促進するが、Ｖ１２突然変
異の効果がより特異的であるという以前の知見と一致している。
一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞において発現している様々なＦ
ｃγＲに対する遺伝子操作を受けた抗体の結合を、フローサイトメトリーによって評価し
た。ＦｃγＲＩＩＢについて、天然ＩｇＧ１を有するＯＸ４０ＳＦ２抗体の結合は少ない
が、遺伝子操作を受けたＦｃ突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性の増大を伴
う抗ＯＸ４０抗体を強く助長し、ＥＣ５０（ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２
８Ｆについては４５９ｎｇ／ｍＬ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２については５０２ｎ
ｇ／ｍＬ）は２Ｂ６（４３１ｎｇ／ｍＬ）と同等であり、抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ
１よりもはるかに高く、ＦｃγＲＩＩＢを優先的に認識する（図２Ａ）。同様のフローサ
イトメトリーアッセイを実施して、一過的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細
胞において発現しているＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１アロタイプに対する、遺伝子操作を受
けた抗ＯＸ４０抗体の結合を評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２はＯＸ４０ＳＦ２
ＩｇＧ１と同様にＦｃγＲＩＩＡに対して少ない結合を示したが、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ突然変異は、２０倍効力が高いＦｃγＲＩＩＡＲ１３１（ＥＣ５０：２１６ｎｇ／ｍＬ
）に対するより強力な結合を促進する（図２Ｂ）。このデータは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ及びＶ１２突然変異がいずれもＦｃγＲＩＩＢ結合の強化を促進するが、Ｖ１２突然変
異の効果がより特異的であるという以前の知見と一致している。
ＦｃγＲＩでは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１は高い親和性を示し、ＥＣ５０は３２６ｎｇ
／ｍＬであった（図２Ｃ）。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、Ｏ
Ｘ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様の結合特性を示したが、Ｖ１２突然変異は、ＦｃγＲＩに対
するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体の結合を有意に抑制する。フローサイトメトリー
アッセイによって、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体
の結合も評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、ＥＣ５０は７４４ｎｇ／ｍＬでＦｃ
γＲＩＩＩＡに対する結合を示したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ
及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合活性を示さなかっ
た（図２Ｄ）。
／ｍＬであった（図２Ｃ）。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、Ｏ
Ｘ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様の結合特性を示したが、Ｖ１２突然変異は、ＦｃγＲＩに対
するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体の結合を有意に抑制する。フローサイトメトリー
アッセイによって、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体
の結合も評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、ＥＣ５０は７４４ｎｇ／ｍＬでＦｃ
γＲＩＩＩＡに対する結合を示したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ
及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合活性を示さなかっ
た（図２Ｄ）。
アゴニズム
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性の
増大を伴うＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体を助長するので、これら強化された結合によって
抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムが増加し得るかどうかをＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＮＦκＢリポー
ターアッセイによって評価した。まず、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のＲａｊｉ細
胞への結合をフローサイトメトリーアッセイによって評価した。ＦｃγＲＩＩＢ受容体で
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（図２Ａ）と比べて効力は低かったが、Ｏ
Ｘ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、Ｒ
ａｊｉ細胞に対して用量依存的結合を示し、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１は示さなかった（図
３Ａ）。Ｒａｊｉ細胞に対する結合がＦｃγＲＩＩＢによって媒介されることを確認する
ために、Ｒａｊｉ細胞を５μｇ／ｍＬの２Ｂ６抗体で前処理した後、遺伝子操作を受けた
抗ＯＸ４０抗体のＲａｊｉ細胞に対する結合を評価した。２Ｂ６抗体によるＲａｊｉ細胞
におけるＦｃγＲＩＩＢのプレブロックはＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２のＲａｊｉ細胞への結合を有意に抑制することが観
察された（図３Ｂ）。
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性の
増大を伴うＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体を助長するので、これら強化された結合によって
抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムが増加し得るかどうかをＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＮＦκＢリポー
ターアッセイによって評価した。まず、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のＲａｊｉ細
胞への結合をフローサイトメトリーアッセイによって評価した。ＦｃγＲＩＩＢ受容体で
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（図２Ａ）と比べて効力は低かったが、Ｏ
Ｘ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２は、Ｒ
ａｊｉ細胞に対して用量依存的結合を示し、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１は示さなかった（図
３Ａ）。Ｒａｊｉ細胞に対する結合がＦｃγＲＩＩＢによって媒介されることを確認する
ために、Ｒａｊｉ細胞を５μｇ／ｍＬの２Ｂ６抗体で前処理した後、遺伝子操作を受けた
抗ＯＸ４０抗体のＲａｊｉ細胞に対する結合を評価した。２Ｂ６抗体によるＲａｊｉ細胞
におけるＦｃγＲＩＩＢのプレブロックはＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２のＲａｊｉ細胞への結合を有意に抑制することが観
察された（図３Ｂ）。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイでは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２も、Ｒａｊｉ細胞の非存在下に
おいて有意なアゴニスト活性を示さなかった。しかし、Ｒａｊｉ細胞とＨＥＫ－Ｂｌｕｅ
：ＯＸ４０細胞を共培養すると、これら遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体は劇的に増加
したアゴニズムを示し、１０００ｎｇ／ｍＬにおける効力は同濃度のＯＸ４０リガンドと
比べて２倍超高かった（図３Ｃ及び図３Ｄ）。更に、Ｒａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩ
Ｂをプレブロックするために２Ｂ６抗体を添加したとき、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６
７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体については、アゴニズムのＲａ
ｊｉ細胞依存性強化が有意に抑制され（図３Ｃ及び図３Ｄ）、これは、遺伝子操作を受け
た抗体のアゴニスト活性がＦｃγＲＩＩＢ架橋によって媒介されたことを示す。
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２も、Ｒａｊｉ細胞の非存在下に
おいて有意なアゴニスト活性を示さなかった。しかし、Ｒａｊｉ細胞とＨＥＫ－Ｂｌｕｅ
：ＯＸ４０細胞を共培養すると、これら遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体は劇的に増加
したアゴニズムを示し、１０００ｎｇ／ｍＬにおける効力は同濃度のＯＸ４０リガンドと
比べて２倍超高かった（図３Ｃ及び図３Ｄ）。更に、Ｒａｊｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩ
Ｂをプレブロックするために２Ｂ６抗体を添加したとき、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６
７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体については、アゴニズムのＲａ
ｊｉ細胞依存性強化が有意に抑制され（図３Ｃ及び図３Ｄ）、これは、遺伝子操作を受け
た抗体のアゴニスト活性がＦｃγＲＩＩＢ架橋によって媒介されたことを示す。
Ｆｃのエフェクター機能
エフェクター細胞における生物発光リポーター遺伝子の発現がＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性
ＡＤＣＣの活性化を反映するリポーターバイオアッセイによって、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ及びＶ１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を調べた。ＨＥＫ－Ｂｌｕ
ｅ：ＯＸ４０標的細胞とＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているエフェクター細胞とを共培養し
たとき、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１はリポーター遺伝子の発現を用量依存的に活性化した。
しかし、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１
２もリポーター遺伝子の発現を誘導せず（図４Ａ）、これは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及
びＶ１２突然変異がＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を抑制したことを示す。
この結果は、遺伝子操作を受けた抗体におけるＦｃγＲＩＩＩＡへの結合活性の喪失と一
致する（図２Ｄ）。
エフェクター細胞における生物発光リポーター遺伝子の発現がＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性
ＡＤＣＣの活性化を反映するリポーターバイオアッセイによって、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８
Ｆ及びＶ１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を調べた。ＨＥＫ－Ｂｌｕ
ｅ：ＯＸ４０標的細胞とＦｃγＲＩＩＩＡを発現しているエフェクター細胞とを共培養し
たとき、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１はリポーター遺伝子の発現を用量依存的に活性化した。
しかし、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１
２もリポーター遺伝子の発現を誘導せず（図４Ａ）、これは、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及
びＶ１２突然変異がＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を抑制したことを示す。
この結果は、遺伝子操作を受けた抗体におけるＦｃγＲＩＩＩＡへの結合活性の喪失と一
致する（図２Ｄ）。
単離された単球から分化したマクロファージによるＧＦＰを発現しているＨＥＫ－Ｂｌ
ｕｅ：ＯＸ４０細胞の貪食を評価するアッセイにおいて、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ
１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体の抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性についても
調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、マクロファージによるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ
４０標的細胞の死滅を用量依存的に媒介した。Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異もＶ１２
突然変異も、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を有意に変化させなかった（図
４Ｂ）。遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の分化したマクロファージへの結合をフロー
サイトメトリーアッセイによって評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２
８Ｆ抗体はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体と同様のマクロファージへの結合親和性を有して
いたが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体は、ＡＤＣＰアッセイでは活性があったもの
の、マクロファージに対する結合は有意に減少した（図４Ｃ）。
ｕｅ：ＯＸ４０細胞の貪食を評価するアッセイにおいて、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ
１２突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体の抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性についても
調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、マクロファージによるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ
４０標的細胞の死滅を用量依存的に媒介した。Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異もＶ１２
突然変異も、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を有意に変化させなかった（図
４Ｂ）。遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の分化したマクロファージへの結合をフロー
サイトメトリーアッセイによって評価した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２
８Ｆ抗体はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体と同様のマクロファージへの結合親和性を有して
いたが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２抗体は、ＡＤＣＰアッセイでは活性があったもの
の、マクロファージに対する結合は有意に減少した（図４Ｃ）。
ウサギ補体の存在下におけるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の溶解を評価するアッセ
イにおいて、抗体媒介性ＣＤＣについて調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、１０，
０００ｎｇ／ｍＬ以下でＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞に対する有意なＣＤＣ活性
を引き起こさなかった。同様に、Ｖ１２突然変異もＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異も、
天然ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する抗体よりも高いＣＤＣ活性を促進しなかった（
図４Ｄ）。
イにおいて、抗体媒介性ＣＤＣについて調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、１０，
０００ｎｇ／ｍＬ以下でＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞に対する有意なＣＤＣ活性
を引き起こさなかった。同様に、Ｖ１２突然変異もＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異も、
天然ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する抗体よりも高いＣＤＣ活性を促進しなかった（
図４Ｄ）。
実施例５．Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ突然変異を単独で又は組み合わせて
有する抗ＯＸ４０抗体の特性評価
Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは、細胞表面抗原に結合したときにＩｇＧ１抗体の六量体化を誘
導し、抗体のエフェクター機能ＡＤＣＣ及びＣＤＣを強化するＦｃ突然変異のセット（Ｅ
３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ）を同定した（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．
（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３）。このような多量体化抗体が、受
容体を活性化するための必要条件であるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの凝集を促
進することによって抗ＴＮＦＲスーパーファミリー抗体のアゴニズムを強化し得ると仮定
した。
有する抗ＯＸ４０抗体の特性評価
Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは、細胞表面抗原に結合したときにＩｇＧ１抗体の六量体化を誘
導し、抗体のエフェクター機能ＡＤＣＣ及びＣＤＣを強化するＦｃ突然変異のセット（Ｅ
３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ）を同定した（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．
（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３）。このような多量体化抗体が、受
容体を活性化するための必要条件であるＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの凝集を促
進することによって抗ＴＮＦＲスーパーファミリー抗体のアゴニズムを強化し得ると仮定
した。
仮説を検証するために、抗ＯＸ４０抗体ＳＦ２のＩｇＧ１に対して単独のＥ３４５Ｒ、
Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ突然変異、又は当該突然変異の組み合わせで遺伝子操作を行い
、表３に示す得られた抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１
Ｅ４３０Ｇ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２Ｉｇ
Ｇ１ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙを特性評価した。
Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ突然変異、又は当該突然変異の組み合わせで遺伝子操作を行い
、表３に示す得られた抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１
Ｅ４３０Ｇ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２Ｉｇ
Ｇ１ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙを特性評価した。
抗体の多量体化
ＳＥＣ分析によって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ
４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ抗体が、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１のように溶液中でモノマーとして存在することが明らかになった。しかし、ＳＥＣ
分析によって、三重変異抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０
Ｙのピークが約９００ｋＤａであることが明らかになり、これは、その抗体の六量体の存
在を示す。この所見は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異が溶液相において
容易に六量体の形成を促進するという報告された知見と一致する（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３。
ＳＥＣ分析によって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ
４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ抗体が、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１のように溶液中でモノマーとして存在することが明らかになった。しかし、ＳＥＣ
分析によって、三重変異抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０
Ｙのピークが約９００ｋＤａであることが明らかになり、これは、その抗体の六量体の存
在を示す。この所見は、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異が溶液相において
容易に六量体の形成を促進するという報告された知見と一致する（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３。
遺伝子操作を受けた抗体が、細胞表面における抗原に結合したときに多量体化するかど
うかを評価するために、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）タンパク質－タンパク質相互作用（pr
otein-protein interaction、ＰＰＩ）アッセイを実施した。このアッセイは、生物発光
タンパク質ドナーから蛍光タンパク質アクセプターへのエネルギー転移を測定することに
よってタンパク質－タンパク質相互作用を検出する、近接度に基づくアッセイである。生
成された抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ、
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ
／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙを、それぞれ、ドナー及びアクセプターとして抗体軽鎖のＣ末
端に結合しているＮａｎｏｌｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ又は蛍光標識されたＨａｌ
ｏＴａｇ（登録商標）のいずれかを有するように更に遺伝子操作した。タグ付き抗体は、
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＮＦκＢリポーターアッセイにおいて対応するタグの付いていない抗
体と同等の機能活性を示した（データ不図示）。ドナー及びアクセプター抗体をＨＥＫ－
Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に適用することによってＮａｎｏＢＲＥＴ ＰＰＩアッセイを実
施し、算出され補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比は多量体化抗体の会合を反映する。ＯＸ４
０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体はバックグラウンドの補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比を示したが、
ＩｇＧの六量体化を促進する突然変異を有するＳＦ２抗体は、１０～１０００ｎｇ／ｍＬ
の濃度にわたってはるかに高い補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比を示した（図５）。補正さ
れたＮａｎｏＢＲＥＴ比の値によって反映される細胞表面における抗体会合の程度は、以
下の順序であった：ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ＞ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ＞ＯＸ
４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１。この結果は、会合の程度が異
なるにもかかわらず、野生型ＩｇＧ１を除く全ての抗体が細胞表面で多量体化したことを
示した。
うかを評価するために、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）タンパク質－タンパク質相互作用（pr
otein-protein interaction、ＰＰＩ）アッセイを実施した。このアッセイは、生物発光
タンパク質ドナーから蛍光タンパク質アクセプターへのエネルギー転移を測定することに
よってタンパク質－タンパク質相互作用を検出する、近接度に基づくアッセイである。生
成された抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ、
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ
／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙを、それぞれ、ドナー及びアクセプターとして抗体軽鎖のＣ末
端に結合しているＮａｎｏｌｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ又は蛍光標識されたＨａｌ
ｏＴａｇ（登録商標）のいずれかを有するように更に遺伝子操作した。タグ付き抗体は、
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＮＦκＢリポーターアッセイにおいて対応するタグの付いていない抗
体と同等の機能活性を示した（データ不図示）。ドナー及びアクセプター抗体をＨＥＫ－
Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に適用することによってＮａｎｏＢＲＥＴ ＰＰＩアッセイを実
施し、算出され補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比は多量体化抗体の会合を反映する。ＯＸ４
０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体はバックグラウンドの補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比を示したが、
ＩｇＧの六量体化を促進する突然変異を有するＳＦ２抗体は、１０～１０００ｎｇ／ｍＬ
の濃度にわたってはるかに高い補正されたＮａｎｏＢＲＥＴ比を示した（図５）。補正さ
れたＮａｎｏＢＲＥＴ比の値によって反映される細胞表面における抗体会合の程度は、以
下の順序であった：ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ＞ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ＞ＯＸ
４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇ＞ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１。この結果は、会合の程度が異
なるにもかかわらず、野生型ＩｇＧ１を除く全ての抗体が細胞表面で多量体化したことを
示した。
遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムの改善はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存し
ない
抗体のアゴニスト活性に対するＥ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ置換の効果を評
価するために、遺伝子操作を受けた抗体をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーター
アッセイで特性評価した。生成された抗体は全てアゴニスト活性を示した。抗体は最も高
い多量体化度を有さなかったが（図５）、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、ＯＸ４
０リガンドの活性と比べて最も改善されたアゴニスト活性を示した（図６Ａ）。
ない
抗体のアゴニスト活性に対するＥ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ及びＳ４４０Ｙ置換の効果を評
価するために、遺伝子操作を受けた抗体をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーター
アッセイで特性評価した。生成された抗体は全てアゴニスト活性を示した。抗体は最も高
い多量体化度を有さなかったが（図５）、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、ＯＸ４
０リガンドの活性と比べて最も改善されたアゴニスト活性を示した（図６Ａ）。
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ４３０Ｇは、最も低いアゴニスト活性の改善を示したが、Ｏ
Ｘ４０ＳＦ２ＩｇＧ１ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ
／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲとＯＸ４０ＳＦ２Ｉｇ
Ｇ１Ｅ４３０Ｇとの間のアゴニズムの程度を示した（図６Ａ）。
Ｘ４０ＳＦ２ＩｇＧ１ Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ
／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲとＯＸ４０ＳＦ２Ｉｇ
Ｇ１Ｅ４３０Ｇとの間のアゴニズムの程度を示した（図６Ａ）。
Ｅ３４５は、ＩｇＧサブタイプの中で保存されている残基である。また、サイレントＩ
ｇＧ２ｓｉｇｍａＦｃを有する抗ＯＸ４０抗体においてもＥ３４５Ｒ突然変異の遺伝子操
作を行い、その結果、抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒが得られた。Ｈ
ＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイによって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２
ｓｉｇｍａはわずかしかアゴニスト活性を有しないが（図６Ｃ）、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ
２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒは用量依存的にアゴニズムを示す（図６Ｄ）ことが明らかになっ
た。これは、Ｅ３４５Ｒ突然変異が複数のＩｇＧサブタイプにわたってアゴニズムの強化
を促進し得ることを示した。
ｇＧ２ｓｉｇｍａＦｃを有する抗ＯＸ４０抗体においてもＥ３４５Ｒ突然変異の遺伝子操
作を行い、その結果、抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒが得られた。Ｈ
ＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイによって、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２
ｓｉｇｍａはわずかしかアゴニスト活性を有しないが（図６Ｃ）、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ
２ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒは用量依存的にアゴニズムを示す（図６Ｄ）ことが明らかになっ
た。これは、Ｅ３４５Ｒ突然変異が複数のＩｇＧサブタイプにわたってアゴニズムの強化
を促進し得ることを示した。
ＦｃγＲＩＩＢ架橋は、ＩｇＧサブタイプに依存してＥ３４５Ｒ突然変異を有する抗Ｏ
Ｘ４０抗体のアゴニズムを更に増強する
Ｅ３４５Ｒ突然変異はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｓｉｇｍ
ａのＦｃを有する抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムを促進し得るが、それでもなお、Ｒａｊｉ
細胞と共培養したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に遺伝子操作を受けた抗体を適用した
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイによって、ＦｃγＲＩＩＢ架橋の
効果について調べた。Ｒａｊｉ細胞の存在は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ抗体の
アゴニズムを更に増強することができ、Ｒａｊｉ細胞と共培養しない場合と比べて試験濃
度全体にわたって活性が２倍を超えて増加する（図６Ｂ）ことが観察された。Ｒａｊｉ細
胞におけるＦｃγＲＩＩＢ受容体をプレブロックするために２Ｂ６抗体を添加したとき、
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲのアゴニズムのＲａｊｉ細胞媒介性増強は完全に阻害
され、アゴニスト活性はＲａｊｉ細胞と共培養しない場合と同様のレベルまで低下したが
、これはアゴニズムの増強がＦｃγＲＩＩＢ架橋によって駆動されることを示す。
Ｘ４０抗体のアゴニズムを更に増強する
Ｅ３４５Ｒ突然変異はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｓｉｇｍ
ａのＦｃを有する抗ＯＸ４０抗体のアゴニズムを促進し得るが、それでもなお、Ｒａｊｉ
細胞と共培養したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に遺伝子操作を受けた抗体を適用した
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦκＢリポーターアッセイによって、ＦｃγＲＩＩＢ架橋の
効果について調べた。Ｒａｊｉ細胞の存在は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒ抗体の
アゴニズムを更に増強することができ、Ｒａｊｉ細胞と共培養しない場合と比べて試験濃
度全体にわたって活性が２倍を超えて増加する（図６Ｂ）ことが観察された。Ｒａｊｉ細
胞におけるＦｃγＲＩＩＢ受容体をプレブロックするために２Ｂ６抗体を添加したとき、
ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５ＲのアゴニズムのＲａｊｉ細胞媒介性増強は完全に阻害
され、アゴニスト活性はＲａｊｉ細胞と共培養しない場合と同様のレベルまで低下したが
、これはアゴニズムの増強がＦｃγＲＩＩＢ架橋によって駆動されることを示す。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するか又は有しないＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体の
アゴニズムに対するＦｃγＲＩＩＢ架橋を評価するために、同様のアッセイを設定した。
Ｒａｊｉ細胞の存在は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ又はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２
ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒ抗体のいずれにおいてもアゴニスト活性を増強できないことが見出
された（図６Ｃ及び図６Ｄ）。このデータは、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗
体のアゴニズムのＲａｊｉ細胞によって媒介される増強がＩｇＧサブタイプに依存してお
り、ＩｇＧ１ Ｆｃに対しては効果があるが、サイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａ Ｆｃに対
しては効果がないことを示した。
アゴニズムに対するＦｃγＲＩＩＢ架橋を評価するために、同様のアッセイを設定した。
Ｒａｊｉ細胞の存在は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ又はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２
ｓｉｇｍａＥ３４５Ｒ抗体のいずれにおいてもアゴニスト活性を増強できないことが見出
された（図６Ｃ及び図６Ｄ）。このデータは、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗
体のアゴニズムのＲａｊｉ細胞によって媒介される増強がＩｇＧサブタイプに依存してお
り、ＩｇＧ１ Ｆｃに対しては効果があるが、サイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａ Ｆｃに対
しては効果がないことを示した。
Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のエフェクター機能
ＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイによって、Ｅ３４５Ｒ突然
変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を調べた。Ｅ３４５Ｒ突然変異は、抗ＯＸ４
０抗体のＡＤＣＣを改善した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１と比べてＡＤＣＣを改善した（図７Ａ）。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉ
ｇｍａはＡＤＣＣ活性を示さず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａへのＥ３４５Ｒ突然
変異の導入はＡＤＣＣに対して効果を有しなかった。
ＦｃγＲＩＩＩＡ媒介性ＡＤＣＣリポーターバイオアッセイによって、Ｅ３４５Ｒ突然
変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ活性を調べた。Ｅ３４５Ｒ突然変異は、抗ＯＸ４
０抗体のＡＤＣＣを改善した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１と比べてＡＤＣＣを改善した（図７Ａ）。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉ
ｇｍａはＡＤＣＣ活性を示さず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａへのＥ３４５Ｒ突然
変異の導入はＡＤＣＣに対して効果を有しなかった。
分化したマクロファージによるＧＦＰを発現しているＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞
の貪食によって、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＰ活性についても
調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、マクロファージによるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ
４０標的細胞の死滅を用量依存的に媒介したが、Ｅ３４５Ｒ突然変異の導入はＯＸ４０Ｓ
Ｆ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性をわずかに強化しただけであった（図７Ｂ）。対照的に
、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａはＡＤＣＰ活性を有していなかったが、ＯＸ４０Ｓ
Ｆ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａへのＥ３４５Ｒ突然変異の導入はＡＤＣＰを改善した（図７Ｂ）
。
の貪食によって、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有する抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＰ活性についても
調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体は、マクロファージによるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ
４０標的細胞の死滅を用量依存的に媒介したが、Ｅ３４５Ｒ突然変異の導入はＯＸ４０Ｓ
Ｆ２ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性をわずかに強化しただけであった（図７Ｂ）。対照的に
、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａはＡＤＣＰ活性を有していなかったが、ＯＸ４０Ｓ
Ｆ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａへのＥ３４５Ｒ突然変異の導入はＡＤＣＰを改善した（図７Ｂ）
。
ウサギ補体の存在下におけるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の溶解を評価するアッセ
イにおいて、抗体媒介性ＣＤＣについて調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体はＨＥＫ－
Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞に対する有意なＣＤＣ活性を媒介しなかったが、Ｅ３４５Ｒ
突然変異は、ＣＤＣ活性の増加を伴うＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体を用量依存的に助長し
た。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体はこのアッセイにおいてＣＤＣ活
性を有しておらず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体におけるＥ３４５Ｒ突然変異
は、そのＣＤＣ活性におけるサイレンシングを変化させなかった（図７Ｃ）。
イにおいて、抗体媒介性ＣＤＣについて調べた。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体はＨＥＫ－
Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞に対する有意なＣＤＣ活性を媒介しなかったが、Ｅ３４５Ｒ
突然変異は、ＣＤＣ活性の増加を伴うＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体を用量依存的に助長し
た。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体はこのアッセイにおいてＣＤＣ活
性を有しておらず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ抗体におけるＥ３４５Ｒ突然変異
は、そのＣＤＣ活性におけるサイレンシングを変化させなかった（図７Ｃ）。
考察
免疫賦活性ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに対するアゴニスト抗体は、癌治療法
のための有望な薬剤として台頭しつつある。最近のＦｃを遺伝子操作する試みは、置換Ｓ
２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２をＦｃに導入することによって抗ＴＮＦＲスーパーファ
ミリー抗体のＦｃγＲＩＩＢとの会合を最適化することを介してそのアゴニスト活性を強
化することによって、当該抗体をその抗腫瘍免疫について最適化することに向けられてい
る（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６～３３
；Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ
２６：５８９～９８）。
免疫賦活性ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに対するアゴニスト抗体は、癌治療法
のための有望な薬剤として台頭しつつある。最近のＦｃを遺伝子操作する試みは、置換Ｓ
２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２をＦｃに導入することによって抗ＴＮＦＲスーパーファ
ミリー抗体のＦｃγＲＩＩＢとの会合を最適化することを介してそのアゴニスト活性を強
化することによって、当該抗体をその抗腫瘍免疫について最適化することに向けられてい
る（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６～３３
；Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ
２６：５８９～９８）。
本明細書において抗ＯＸ４０抗体に適用したとき、報告されたＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ
及びＶ１２突然変異は、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＲａｊｉ細胞
のいずれかで発現したＦｃγＲＩＩＢに対する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の結合
を強化し、架橋依存的にアゴニスト活性を強化した。アゴニズムの程度は、Ｓ２６７Ｅ／
Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異のいずれについても同等であった。ＯＸ４０抗体における
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を強化すると同
時にＦｃγＲＩＩＩＡへの抗体結合を阻害したが、これは、Ｍｉｍｏｔｏによって報告さ
れた結果と一致している（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：５８９～９８。結果として、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及び
Ｖ１２突然変異は、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣを完全に阻害したが、
このＡＤＣＣは、ＮＫ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＩＡによって大部分が媒介される
。
及びＶ１２突然変異は、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞又はＲａｊｉ細胞
のいずれかで発現したＦｃγＲＩＩＢに対する遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体の結合
を強化し、架橋依存的にアゴニスト活性を強化した。アゴニズムの程度は、Ｓ２６７Ｅ／
Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異のいずれについても同等であった。ＯＸ４０抗体における
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を強化すると同
時にＦｃγＲＩＩＩＡへの抗体結合を阻害したが、これは、Ｍｉｍｏｔｏによって報告さ
れた結果と一致している（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：５８９～９８。結果として、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及び
Ｖ１２突然変異は、遺伝子操作を受けた抗ＯＸ４０抗体のＡＤＣＣを完全に阻害したが、
このＡＤＣＣは、ＮＫ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＩＡによって大部分が媒介される
。
ＣＤ２０などの腫瘍関連抗原に対する抗体の六量体化を誘導する突然変異（Ｄｉｅｂｏ
ｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３（Ｅ３４５
Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ４４０Ｙ）が抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を誘導することも本明
細書において見出された。しかし、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異について
報告されたものとは対照的に、改善されたアゴニスト活性はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存し
ていなかった。Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、及びＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ二重突然変異を有
する抗ＯＸ４０抗体は溶液中でモノマーとして存在するが、当該抗体は細胞表面における
ＯＸ４０に結合すると多量体化した。多量体化した抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ発現細胞の非
存在下において強化されたアゴニスト活性を示したが、これは恐らく細胞上におけるＯＸ
４０のクラスタリングの増加が促進されたことによるものである。二重Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４
３０Ｇ及び三重Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異によって、単一突然変異の
みと比べてより高次の抗体多量体化が生じたが、単一のＥ３４５Ｒ突然変異から最高のア
ゴニスト活性を有する抗体が得られた。何らかの特定の理論に束縛されるものではないが
、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するオリゴマー化した抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を有する抗
体よりもＯＸ４０受容体のクラスタリングの促進についてより好ましい構造を有すると考
えられる。
ｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３：１２６０～３（Ｅ３４５
Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、Ｓ４４０Ｙ）が抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性を誘導することも本明
細書において見出された。しかし、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ及びＶ１２突然変異について
報告されたものとは対照的に、改善されたアゴニスト活性はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存し
ていなかった。Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、及びＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ二重突然変異を有
する抗ＯＸ４０抗体は溶液中でモノマーとして存在するが、当該抗体は細胞表面における
ＯＸ４０に結合すると多量体化した。多量体化した抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ発現細胞の非
存在下において強化されたアゴニスト活性を示したが、これは恐らく細胞上におけるＯＸ
４０のクラスタリングの増加が促進されたことによるものである。二重Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４
３０Ｇ及び三重Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異によって、単一突然変異の
みと比べてより高次の抗体多量体化が生じたが、単一のＥ３４５Ｒ突然変異から最高のア
ゴニスト活性を有する抗体が得られた。何らかの特定の理論に束縛されるものではないが
、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するオリゴマー化した抗体は、Ｅ４３０Ｇ突然変異を有する抗
体よりもＯＸ４０受容体のクラスタリングの促進についてより好ましい構造を有すると考
えられる。
Ｅ３４５Ｒ突然変異はＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにアゴニズムを強化したが、Ｆｃ
γＲＩＩＢ発現細胞の存在がＥ３４５Ｒ突然変異を有する抗体のアゴニズムを更に強化す
ることが見出された。このアゴニズムの更なる増強は、遺伝子操作を受けた抗体とＲａｊ
ｉ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＢとの相互作用に依存していたが、その理由は、Ｆｃ
γＲとの結合においてサイレントであるＩｇＧｓｉｇｍａ抗体ではアゴニズムの増強がみ
られず、Ｒａｊｉ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＢをプレブロックすることによってア
ゴニズムが抑制されたためである。多量体化抗体はモノマーの抗体と比べてＦｃγ受容体
に対してより高い親和性を有することが報告されている（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（２００
９）ＭＡｂｓ １：４９１～５０４）。実際、本明細書に提示される結果は、溶液中で部
分的に六量体形態であるＯＸ４０ＳＦ２Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙが、溶液中
でモノマーとして存在するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５
Ｒ抗体と比べて、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現しているＦｃγＲ
ＩＩＢに対してはるかに強力な結合を有することを示す（データ不図示）。細胞表面にお
けるＯＸ４０に結合しているオリゴマー化ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、Ｒａｊ
ｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢに対する結合を増加させ得、次に、抗体の多量体化を更に
安定化し、アゴニズムの増強をもたらす受容体のクラスタリングを促進すると仮定する。
γＲＩＩＢ発現細胞の存在がＥ３４５Ｒ突然変異を有する抗体のアゴニズムを更に強化す
ることが見出された。このアゴニズムの更なる増強は、遺伝子操作を受けた抗体とＲａｊ
ｉ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＢとの相互作用に依存していたが、その理由は、Ｆｃ
γＲとの結合においてサイレントであるＩｇＧｓｉｇｍａ抗体ではアゴニズムの増強がみ
られず、Ｒａｊｉ細胞で発現しているＦｃγＲＩＩＢをプレブロックすることによってア
ゴニズムが抑制されたためである。多量体化抗体はモノマーの抗体と比べてＦｃγ受容体
に対してより高い親和性を有することが報告されている（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（２００
９）ＭＡｂｓ １：４９１～５０４）。実際、本明細書に提示される結果は、溶液中で部
分的に六量体形態であるＯＸ４０ＳＦ２Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙが、溶液中
でモノマーとして存在するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５
Ｒ抗体と比べて、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現しているＦｃγＲ
ＩＩＢに対してはるかに強力な結合を有することを示す（データ不図示）。細胞表面にお
けるＯＸ４０に結合しているオリゴマー化ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｅ３４５Ｒは、Ｒａｊ
ｉ細胞におけるＦｃγＲＩＩＢに対する結合を増加させ得、次に、抗体の多量体化を更に
安定化し、アゴニズムの増強をもたらす受容体のクラスタリングを促進すると仮定する。
抗ＯＸ４０抗体に導入されたＥ３４５Ｒ突然変異は、抗体のＡＤＣＣ活性の効力を強化
した。この効果は、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合することができるＩｇＧ１における遺伝子操
作を受けた抗体に特異的であったが、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合しないＩｇＧ２ｓｉｇｍａ
における抗体に対しては特異的ではなかった。これら所見は、ＩｇＧ１抗体のＥ３４５Ｒ
媒介性ＡＤＣＣ活性の強化が、細胞表面におけるＯＸ４０を認識した際のＦｃγＲＩＩＩ
Ａとオリゴマー化抗体との結合増加を介したものである可能性が高いことを示唆していた
。
した。この効果は、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合することができるＩｇＧ１における遺伝子操
作を受けた抗体に特異的であったが、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合しないＩｇＧ２ｓｉｇｍａ
における抗体に対しては特異的ではなかった。これら所見は、ＩｇＧ１抗体のＥ３４５Ｒ
媒介性ＡＤＣＣ活性の強化が、細胞表面におけるＯＸ４０を認識した際のＦｃγＲＩＩＩ
Ａとオリゴマー化抗体との結合増加を介したものである可能性が高いことを示唆していた
。
天然ＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗ＯＸ４０抗体に対して、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８ＦもＶ１
２突然変異もＡＤＣＰに有意な影響を与えなかった。これは、貪食を媒介するマクロファ
ージで発現している主なＦｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＡに対する結合を強化することが
報告された（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ
Ｓｅｌ ２６：５８９～９８）Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異については予想外であ
り得る。しかし、ＦｃγＲＩＩＡに加えて、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡを含むいく
つかのＦｃ受容体は、標的細胞のＩｇＧ抗体によって媒介される貪食に寄与する（Ｉｎｄ
ｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６：４３８９～９９）。ＯＸ４０ＳＦ２
ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のＦｃγＲＩに
対する結合効力を示したが、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合は抑制した。更に、強化され
たＦｃγＲＩＩＡ結合の程度は、高親和性ＦｃγＲＩ受容体に対する結合と全く同等のレ
ベルであった。その結果、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、ＯＸ
４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のマクロファージに対する結合効力を示し、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１に比べてＡＤＣＰ活性の強化は示さなかった。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１
Ｖ１２抗体は、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合が減少し、ＦｃγＲＩＩＡ
に対する結合効力は変化しなかったが、これによって、マクロファージに対する結合の有
意な減少を説明することができる。それにもかかわらず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２
抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のＡＤＣＰ活性を示した。この矛盾の理由は未知
である。同様に、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体についてＡＤ
ＣＰ活性の有意な増加は観察されなかったが、このような突然変異は、遺伝子操作を受け
た抗体のＡＤＣＣ活性を有意に強化した。興味深いことに、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉ
ｇｍａはＡＤＣＰ活性を有していなかったが、Ｅ３４５Ｒ突然変異は、サイレントＦｃを
有するこの抗体に対して有意なＡＤＣＰ活性を付与した。
２突然変異もＡＤＣＰに有意な影響を与えなかった。これは、貪食を媒介するマクロファ
ージで発現している主なＦｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＡに対する結合を強化することが
報告された（Ｍｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ
Ｓｅｌ ２６：５８９～９８）Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ突然変異については予想外であ
り得る。しかし、ＦｃγＲＩＩＡに加えて、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡを含むいく
つかのＦｃ受容体は、標的細胞のＩｇＧ抗体によって媒介される貪食に寄与する（Ｉｎｄ
ｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６：４３８９～９９）。ＯＸ４０ＳＦ２
ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のＦｃγＲＩに
対する結合効力を示したが、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合は抑制した。更に、強化され
たＦｃγＲＩＩＡ結合の程度は、高親和性ＦｃγＲＩ受容体に対する結合と全く同等のレ
ベルであった。その結果、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ抗体は、ＯＸ
４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のマクロファージに対する結合効力を示し、ＯＸ４０ＳＦ２Ｉ
ｇＧ１に比べてＡＤＣＰ活性の強化は示さなかった。対照的に、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１
Ｖ１２抗体は、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合が減少し、ＦｃγＲＩＩＡ
に対する結合効力は変化しなかったが、これによって、マクロファージに対する結合の有
意な減少を説明することができる。それにもかかわらず、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１Ｖ１２
抗体は、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同様のＡＤＣＰ活性を示した。この矛盾の理由は未知
である。同様に、Ｅ３４５Ｒ突然変異を有するＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１抗体についてＡＤ
ＣＰ活性の有意な増加は観察されなかったが、このような突然変異は、遺伝子操作を受け
た抗体のＡＤＣＣ活性を有意に強化した。興味深いことに、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉ
ｇｍａはＡＤＣＰ活性を有していなかったが、Ｅ３４５Ｒ突然変異は、サイレントＦｃを
有するこの抗体に対して有意なＡＤＣＰ活性を付与した。
本研究において評価されたいくつかのＦｃ遺伝子操作アプローチはそれぞれ、同時に遺
伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性を強化し、エフェクター機能を調節することにお
いて独特の特性を与える。ＡＤＣＣの要件に依存して、様々な遺伝子操作アプローチは、
ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに結合する治療用抗体に対して想定され得る。例え
ば、ＣＤ４０及びＣＤ２７に結合する抗体は、細胞枯渇のリスクを最小化するために、改
善されたアゴニスト活性ではあるが最小のＡＤＣＣから利点を享受し得る。したがって、
ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ若しくはＶ１２、又はＩｇＧ２ｓｉｇｍａにお
けるＥ３４５Ｒを使用して、改善されたＣＤ４０及びＣＤ２７抗体を生成し得る。対照的
に、例えば制御性Ｔ細胞を除去するためにＡＤＣＣ活性が望ましいとき、ＩｇＧ１におけ
るＥ３４５Ｒ突然変異を使用することができる。例えば、ＯＸ４０又はＧＩＴＲに結合す
る抗体は、改善されたアゴニスト活性及び強化されたＡＤＣＣの利点を享受し得る。
伝子操作を受けた抗体のアゴニスト活性を強化し、エフェクター機能を調節することにお
いて独特の特性を与える。ＡＤＣＣの要件に依存して、様々な遺伝子操作アプローチは、
ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに結合する治療用抗体に対して想定され得る。例え
ば、ＣＤ４０及びＣＤ２７に結合する抗体は、細胞枯渇のリスクを最小化するために、改
善されたアゴニスト活性ではあるが最小のＡＤＣＣから利点を享受し得る。したがって、
ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ若しくはＶ１２、又はＩｇＧ２ｓｉｇｍａにお
けるＥ３４５Ｒを使用して、改善されたＣＤ４０及びＣＤ２７抗体を生成し得る。対照的
に、例えば制御性Ｔ細胞を除去するためにＡＤＣＣ活性が望ましいとき、ＩｇＧ１におけ
るＥ３４５Ｒ突然変異を使用することができる。例えば、ＯＸ４０又はＧＩＴＲに結合す
る抗体は、改善されたアゴニスト活性及び強化されたＡＤＣＣの利点を享受し得る。
別の検討事項は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に対する依存性がアゴニズムの強化にとって望ま
しいかどうかである。Ｅ３４５Ｒ突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにアゴニズ
ムの増加を促進することができ、これにより、局所微小環境におけるＦｃγＲの発現レベ
ルに関係なく規定の治療活性を有する抗体を備えておくことができ、特に、ＦｃγＲ低発
現細胞が浸潤している癌の種類について有利である。しかし、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存
しないことで、アゴニズムが非特異的に賦活されることがあり、これによって望ましくな
いオフターゲット効果が生じる場合がある。このような場合、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ又
はＶ１２突然変異を使用され得る。異なるＦｃ受容体に対する結合活性の変化、免疫原性
、ＰＫプロファイル、及び遺伝子操作を受けた抗体の開発可能性を含む他の要因も、最適
な遺伝子操作アプローチの選択において考慮しなければならない。
しいかどうかである。Ｅ３４５Ｒ突然変異は、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存せずにアゴニズ
ムの増加を促進することができ、これにより、局所微小環境におけるＦｃγＲの発現レベ
ルに関係なく規定の治療活性を有する抗体を備えておくことができ、特に、ＦｃγＲ低発
現細胞が浸潤している癌の種類について有利である。しかし、ＦｃγＲＩＩＢ架橋に依存
しないことで、アゴニズムが非特異的に賦活されることがあり、これによって望ましくな
いオフターゲット効果が生じる場合がある。このような場合、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ又
はＶ１２突然変異を使用され得る。異なるＦｃ受容体に対する結合活性の変化、免疫原性
、ＰＫプロファイル、及び遺伝子操作を受けた抗体の開発可能性を含む他の要因も、最適
な遺伝子操作アプローチの選択において考慮しなければならない。
Claims (33)
- 単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であっ
て、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ
／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、前記突然変異を
有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有する、前記抗体。 - 前記Ｅ３４５Ｒ突然変異を含む、請求項１に記載の抗体。
- 前記Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異を含む、請求項１に記載の抗体。
- 前記Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を含む、請求項１に記載の抗体。
- 抗体架橋に依存しないアゴニスト活性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の
抗体。 - ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１～５のい
ずれか一項に記載の抗体。 - 配列番号６３、６４、６５、６６又は６７のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいず
れか一項に記載の抗体。 - 第２の突然変異を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ２
におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／
Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ４にお
けるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ
２９７Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけ
るＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３
３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／
Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５
Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２
６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異、又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２
３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異である、請求項７
に記載の抗体。 - 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ２における前記Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／
Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項９に記載の抗
体。 - 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１における前記Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／
Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項９に記載の抗
体。 - 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ４における前記Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突
然変異である、請求項９に記載の抗体。 - 前記ＴＮＦＲファミリーの前記受容体が、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番
号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配列番
号２３）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。 - 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容できる担体とを含む、医
薬組成物。 - 被験体における抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を強化す
る方法であって、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ
／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異を前記抗体に導入して、前記ＴＮＦＲスーパーファミ
リーメンバーに特異的に結合する遺伝子操作を受けた抗体を生成することと、前記遺伝子
操作を受けた抗体を前記被験体に投与することとを含む、前記方法。 - 前記抗体が、第２の突然変異を更に含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ２
におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／
Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ４にお
けるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ
２９７Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけ
るＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３
３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／
Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５
Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２
６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異、又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２
３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異である、請求項１
６に記載の方法。 - 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ２における前記Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／
Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項１７に記載の
方法。 - 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１における前記Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／
Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異である、請求項１７に記載の
方法。 - 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ４における前記Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突
然変異である、請求項１７に記載の方法。 - 前記被験体が癌を有する、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が固形腫瘍である、請求項２１に記載の方法。
- 前記固形腫瘍が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮Ｎ
ＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、
膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌
、尿道癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、請求項２２
に記載の方法。 - 前記ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーが、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配
列番号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）、又はＧＩＴＲ（配
列番号２３）である、請求項１５～２３のいずれか一項に記載の方法。 - 被験体における癌を治療する方法であって、前記癌を治療するのに十分な時間、Ｅ３４
５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０
Ｙ突然変異を含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を前記被験体に投与するこ
とを含む、前記方法。 - 前記抗体が、第２の突然変異を更に含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記第２の突然変異が、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ２
におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／
Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ＩｇＧ４にお
けるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ
２９７Ａ突然変異、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけ
るＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３
３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ突然変異、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／
Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５
Ａ突然変異、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２
６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異又はＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３
４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ突然変異である、請求項２６
に記載の方法。 - 前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬ
Ｃ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌
、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道
癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、請求項２５～２７
のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＴＮＦＲファミリーの前記受容体が、ＯＸ４０（配列番号４）、ＣＤ２７（配列番
号８）、ＣＤ４０（配列番号５）、ＣＤ１３７（配列番号１０）又はＧＩＴＲ（配列番号
２３）である、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。 - 単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体であっ
て、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ
／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵインデックスに従う）を含み、癌の治療におけ
る使用について、前記突然変異を有しない親抗体と比べて強化されたアゴニスト活性を有
する、前記抗体。 - 前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬ
Ｃ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌
、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道
癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、前記癌の治療にお
いて使用するための請求項３０に記載の抗体。 - 癌を治療するための医薬品の製造における、Ｅ３４５Ｒ突然変異、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３
０Ｇ突然変異又はＥ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ突然変異（残基の付番はＥＵイン
デックスに従う）を含む、単離された抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミ
リーメンバー抗体の使用。 - 前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平上皮ＮＳＣＬ
Ｃ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌
、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮癌腫、食道又は胃腸管の癌腫、乳癌、卵管癌、脳癌、尿道
癌、尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移巣である、請求項３２に記載
の使用。
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