BR112015000167B1 - Proteína dimérica, proteína, composição, kit de partes e seus usos, bem como método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeo, cada um compreendendo pelo menos as regiões ch2 e ch3 de uma cadeia pesada de igg1 humana e proteína dimérica variante - Google Patents

Abstract

proteína dimérica, hexâmero, composição, métodos para aumentar oligomerização em solução e/ou uma função efetora de uma proteína dimérica e para formação de imagem de pelo menos uma parte do corpo de humano ou outro mamífero, proteína dimérica variante, kit de partes, e, uso de uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes. a presente invenção refere-se a proteína diméricas compreendendo aminoácidos em três diferentes posições que são diferentes daquelas presentes em um igg1 de humano. seis das ditas proteínas diméricas são capazes de formar uma estrutura hexamérica em solução.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a proteínas diméricas, por exemplo, anticorpos, compreendendo pelo menos três mutações, comparadas com uma proteína dimérica precursora. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a tais proteínas diméricas que são capazes de formar estruturas hexaméricas, por exemplo, estruturas hexaméricas em solução. A presente invenção também refere-se a usos de tais proteínas diméricas e composições compreendendo tais proteínas diméricas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As funções efetoras mediadas pela região Fc de um anticorpo permitem a destruição de entidades estrangeiras, tal como a matança de patógenos e a depuração e degradação de antígenos. Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) é iniciada por ligação das células que carregam região Fc para o receptor Fc (FcR), enquanto citotoxicidade dependente do complemento (CDC) é iniciada por ligação da região Fc em C1q, que inicia a via clássica de ativação do complemento.

[003] Cada anticorpo IgG contém dois sítios de ligação para C1q,um em cada região constante de cadeia pesada (Fc). Uma única molécula de IgG em solução, entretanto, não ativa o complemento, já que a afinidade de IgG monomérico para C1q é muito fraca (Kd ~10-4 M) (Sledge et al., 1973 J. Biol. Chem. 248, 2818-13; Hughes-Jones et al., 1979 Mol. Immunol. 16,697-701). Associação acionada por antígeno de IgG pode levar a ligação muito mais firme da molécula de C1q multivalente (Kd ~10-8 M) e ativação do complemento (Burton et al., 1990 Mol. Immunol. 22, 161-206). Ao contrário, IgM existe naturalmente em pentâmeros ou hexâmeros covalentemente ligados e, mediante ligação de pentâmeros e hexâmeros de antígeno IgM expressos ou imobilizados celulares, podem eficientemente elicitar CDC. Ligação de antígeno é uma exigência para introduzir uma mudança conformacional em IgM para expor os sítios de ligação de C1q (Feinstein et al., 1986, Immunology Today, 169-174).

[004] Sugeriu-se também que IgG pode obter ativação do complemento pela formação de estruturas de anel hexaméricas, através de interação dos domínios CH2/CH3 da região Fc (Burton et al., 1990 Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69). Foi observada evidência suportando a existência de tais estruturas de IgG hexaméricas em cristais bidimensionais (Reidler et al., 1986 I Handbook of Experimental Immunology 4th edit. (Weir, D. M. ed.), pp17.1-17.5. Blackwell, Edinburgh; Pinteric et al., 1971 Immunochem. 8, 1041-5) e cristais tridimensionais, bem como para IgG1, IgG2a e IgG4 e Fc de humano em solução (Kuznetsov et al., 2000 J Struct. Biol. 131, 108-115). Uma formação de anel hexamérica foi também observada na estrutura cristalina do cpVkeqtrq KÍI3K fg humano b12 direcionado para HIV-1 gp120 (1HZH em PDB) (Saphire et al., Science 2001 Aug 10;293(5532),1155-9). No anel de hexâmero b12, seis sítios de ligação de C1q acessíveis foram apresentados na superfície do hexâmero, um de cada qual dos seis anticorpos, enquanto os outros seis sítios de ligação ficaram voltados para baixo.

[005] C1q se assemelha a um ramalhete de tulipas com seis cabeças globulares, contendo as regiões de combinação de anticorpo, amarradas em seis hastes colagenosas [Perkins et al., 1985 Biochem J. 228, 13-26; Poon et al., 1983 J Mol Biol. 168, 563-77; Reid et al., 1983 Biochem Soc Trans 11, 112; Weiss et al., 1986 J. Mol. Biol. 189, 573-81]. Observou-se que C1q ajusta na montagem hexamérica da estrutura cristalina 1HZH de b12, de forma que cada qual das seis cabeças globulares ficasse em contato com um dos seis sítios de ligação de C1q (Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co., 5-32 Lwn{ 4232= "Ervutd Structure of an intact human IgG: implications for HIV-1 neutralization and ghhgeVqt HwpeVkqp”. Vjguku by Erica Ollmann Saphire, for the Scripps Research Institute, La Jolla, California. November 2000). Observou-se que mutações em aminoácidos selecionados nas interfaces de Fc observados entre anticorpos b12 relacionados a simetria- na estrutura cristalina diminuem a avidez de ligação de C1q, indicando a contribuição desses aminoácidos para a interação Fc:Fc intermolecular.

[006] Mekhaiel DNA et al, Nature Scientific Reports, 1:124, 19 October 2011, revelam proteínas de fusão de Fc de humano poliméricas com funções efetoras modificadas.

[007] WO0042072 revela variantes de polipeptídeo com funções efetoras alteradas.

[008] S20080089892 revela variantes da região Fc.

[009] WO2006105062 revela regiões Fc do anticorpo alteradas e seus usos.

[0010] A presente invenção refere-se a proteínas diméricas compreendendo certos resíduos de aminoácido, em que seis das ditas proteínas diméricas são capazes de formar formas hexaméricas não covalentes em solução.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo, cada polipeptídeo compreendendo pelo menos regiões CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que, nos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos: os aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é Y, K, R, ou W; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente.

[0012] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um oligômero compreendendo pelo menos duas proteínas diméricas não covalentemente associadas da presente invenção.

[0013] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um hexâmero compreendendo seis proteínas diméricas não covalentemente associadas da presente invenção.

[0014] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo a proteína dimérica da presente invenção, um ou mais anticorpos, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0015] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma primeira proteína dimérica de acordo com a presente invenção, uma segunda proteína dimérica de acordo com a presente invenção, e opcionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0016] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de aumentar oligomerização em solução e/ou uma função efetora de uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeos, cada qual compreendendo pelo menos regiões CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina, o método compreendendo introduzir nos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos, substituições de aminoácido pelo menos nas posições correspondentes a E345, E430 e em uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[0017] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína dimérica variante preparada pelo método da presente invenção.

[0018] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit de partes compreendendo uma primeira proteína dimérica de acordo com a presente invenção, e uma segunda proteína dimérica de acordo com a presente invenção, para uso simultâneo, separado ou sequencial em formação de imagem, diagnóstico ou terapia.

[0019] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para formação de imagem de pelo menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero, compreendendo administrar uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com a presente invenção.

[0020] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratar uma infecção bacteriana, viral ou parasítica, para formação de imagem de pelo menos uma parte do corpo de humano ou outro mamífero, ou para modular depuração de uma molécula alvo do corpo de um humano ou outro mamífero, compreendendo administrar uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com a presente invenção.

[0021] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar uma doença, tal como câncer, doenças autoimunes, rejeições de transplante de órgão, e depleção de C1q no sistema humoral, compreendendo a administração de uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição, kit ou partes de acordo com a presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0022] Figura 1: (A) Representação esquemática de moléculas de IgG em formação de hexâmero.

[0023] Figura 2: Alinhamento de sequência dos segmentos de Fc de IgG1, IgG1f, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM de humano correspondente aos resíduos P247 a K447 na cadeia pesada de IgG1, usando software Clustal 2.1, conforme numerado pelo índice Eu apresentado em Kabat. A sequência do IgG1 mostrada (SEQ ID NO:6) representa resíduos 130 a 330 da região constante de cadeia pesada de IgG1 de humano (SEQ ID NO:1; UniProt No. de acesso P01857) e a sequência do IgG1m(f) mostrada (SEQ ID NO:7) representa resíduos 130 a 330 do IgG1m(f) da variante alotípica (SEQ ID NO:5); a sequência do IgG2 mostrada (SEQ ID NO:8) representa resíduos 126 a 326 da região constante de cadeia pesada de IgG2 (SEQ ID NO:2; UniProt No. de acesso P01859); e a sequência do IgG3 mostrada (SEQ ID NO:9) representa resíduos 177 a 377 da região constante de cadeia pesada de IgG3 (SEQ ID NO:3; UniProt No. de acesso P01860); e a sequência de o IgG4 mostrada (SEQ ID NO:10) representa resíduos 127 a 327 da região constante de cadeia pesada de IgG4 (SEQ ID NO:4; UniProt No. de acesso P01861); e a sequência do IgE mostrada (SEQ ID NO:11) representa resíduos 225-428 da região constante de IgE (No. de acesso Uniprot P01854); e a sequência do IgA1 mostrada (SEQ ID NO:12) representa resíduos 133353 da região constante de IgA1 (No. de acesso Uniprot P01876); e a sequência de o IgA2 mostrada (SEQ ID NO:13) representa resíduos 120-340 da região constante de IgA2 (SEQ ID NO:8; No. de acesso Uniprot P01877); e a sequência do IgM mostrada (SEQ ID NO:14) representa resíduos 230-452 da região constante de IgM (No. de acesso Uniprot P01871); e a sequência do IgD mostrada (SEQ ID NO:15) representa resíduos 176-384 da região constante de IgD (No. de acesso Uniprot P01880).

[0024] Figura 3A e B: Alinhamento de sequência de 2F8 do anticorpo anti-EGFr em uma espinha dorsal de IgG1 (SEQ ID NO:3), IgG4 (SEQ ID NO:5) e (parcial) IgG3 (SEQ ID NO:6). Numeração de aminoácido de acordo com Kabat de acordo com o índice Eu, são representados (ambos descritos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

[0025] Figura 4: Vista detalhada das interações K439/S440 entre o Fc de moléculas adjacentes (Fc e HeÓ." respectivamente) em um arranjo oligomérico (por exemplo, hexamérico), ilustrando a interação entre oqnfiewncu"fg"He"g"HeÓ tipo selvagem, não modificadas.

[0026] Figura 5: CDC mediada por mutantes de anticorpo HuMAb 005 de CD38 nas células CD38-positivo. (A) Eficácia de CDC nas células Daudi por uma série de concentrações de mutantes 005. (B) Eficácia de CDC nas células Raji por uma série de concentrações de mutantes de HuMAb 005. (C) eficácia de CDC de mutante E345R de HuMAb 005 tanto com 20% quanto com 50% de NHS em células Wien133. (D) Eficácia de CDC de mutantes E345R de HuMAb 005 e 7D8 tanto com 20% quanto com 50% de NHS nas células Raji. Amostras de anticorpo não purificadas isoladas de transfecções transientes foram testadas. Como um controle negativo, sobrenadante de células falsotransfectadas foi usado.

[0027] Figura 6: CDC por mutantes tipo selvagem e E345R de anticorpo HuMAb 005 de CD38 em um experimento de competição com um peptídeo de ligação de Fc. Lise de célula foi medida depois de CDC em células Daudi anticorpo-opsonizado incubado com uma série de concentrações do peptídeo de DCAWHLGELVWCT de ligação de Fc (SEQ ID NO:7). Amostras de anticorpo não purificadas isoladas de transfecções transientes foram usadas. Como um controle negativo, sobrenadante de células falsotransfectadas foi usado.

[0028] Figura 7: CDC em células Wien133 CD20 e CD38 positivas por mutantes 7D8 do anticorpo CD20 (A), mutantes 005 do anticorpo CD38 (B), misturas de mutantes 005 do anticorpo CD38 e mutantes 7D8 do anticorpo CD20 (C) e (D).

[0029] Figura 8A e B: Avaliação da eficácia in vivo de IgG1-005- E345R em um modelo de xenoenxerto subcutâneo com células Raji-luc #2D1.

[0030] Figura 9: CDC nas células Wien133 CD38-positivas, EGFR- negativas por anticorpo biespecífico de CD38/EGFR com a mutação de E345R.

[0031] Figura 10A e B: CDC em células Wien133 CD20-positivas, negativas de CD38 ou células Raji por anticorpo biespecífico de CD20/CD38 com e sem a mutação de E345R.

[0032] Figura 11: CDC em células A431 EGFR-positivas por anticorpo de EGFR 2F8 com a mutação de E345R.

[0033] Figura 12A e B: CDC mediada por anticorpos do mutante E345R.

[0034] Figura 13: Análise de colocalização de anticorpos TF (FITC) com marcador lisossomal LAMP1 (APC).

[0035] Figura 14A-D: Introdução de E345R resultou em matança mediada por CDC melhorada comparada com rituximabe tipo selvagem testado em diferentes linhagens de célula B.

[0036] Figura 14E: Introdução de E345R resultou em maior matança mediada por CDC máxima comparada com rituximabe tipo selvagem, independente dos níveis de expressão das proteínas CD46 regulatórias de complemento (A), CD55 (B) ou CD59 (C) em diferentes linhagens de célula B com níveis de expressão de CD20 comparáveis.

[0037] Figura 15: Cinética de CDC. Anticorpos E345R resultam em lise celular alvo mais rápida e mais substancial por CDC comparado com anticorpos tipo selvagem.

[0038] Figura 16: Cinética de CDC. Introdução da mutação de E345R no anticorpo CD38xCD20 biespecífico resulta em lise celular alvo mediada por CDC mais rápida e mais substancial.

[0039] Figura 17: Cinética de CDC. Introdução da mutação de E345R em anticorpo biespecífico EGFRxCD38 que liga monovalentemente nas células Raji EGFR negativas, resulta em lise celular alvo mediada por CDC mais rápida e mais substancial do que o EGFRxCD38 biespecífico sem mutação de E345R.

[0040] Figura 18A-F: CDC em células Wien133 por uma combinação de um anticorpo tipo selvagem com um anticorpo mutante contendo (A-C) E345R e Q386K ou (D-F) E345R, E430G e Q386K. Mutantes b12 de IgG1 não ligam células Wien133 e foram usados como anticorpos de controle negativo.

[0041] Figura 19: Eficácia de CDC de anticorpos de isótipo de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 contendo a mutação de E345R.

[0042] Figura 20: Introdução da mutação E345R estabilizante de Fc- Fc em anticorpo 005 de CD38 tipo selvagem resulta em matança melhorada de células de CLL primárias em um ex vivo ensaio de CDC (média ± erro padrão da média).

[0043] Figura 21: Análise PAGE de variante do anticorpo IgG1-005- E345R/E430G/S440Y. Precursornel esquerdo: SDS-PAGE, condições não redutoras. Precursornel do meio: SDS-PAGE, condições redutoras. Precursornel direito: PAGE nativa. Note: pista 1: anticorpo controle de IgG1- b12. Pista 2: IgG1-005-E345R/E430G. Pista 3: IgG1-005- E345R/E430G/S440Y.

[0044] Figura 22: Análise HP-SEC de tipo selvagem anticorpo IgG1- 005. Monômero de fração (isto é, anticorpos simples) foi estimado em >99%.

[0045] Figura 23: Análise HP-SEC de variante do anticorpo IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y. Fração de oligômero foi estimada em aproximadamente 79%.

[0046] Figura 24: Sobreposição dos perfis HP-SEC de anticorpo IgG1-005 tipo selvagem (linha tracejada) e IgG1-005-E345R/E430G/S440Y (linha cheia).

[0047] Figura 25: ELISA de ligação de C1q com IgG1-005, IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y e IgG1-005-E345R. Série de concentrações dos anticorpos indicados foi revestida nos poços e incubada com um C1q de concentração fixo.

[0048] Figura 26: Eficácia de CDC por uma série de concentrações de IgG1-005-WT, IgG1-005-E345R/E430G/S440Y e IgG1-005-E345R em células Ramos CD38-positivo.

[0049] Figura 27: Ensaio repórter de ADCC usando células Raji CD38-positivo e uma série de concentrações de IgG1-005-WT, IgG1-005- E345R/E430G/S440Y e IgG1-005-E345R

[0050] Figura 28: Concentrações plasmáticas de IgG de humano em camundongos SCID no momento determinado por ELISA de IgG de humano total. Círculos pretos: IgG1-005 tipo selvagem; triângulos pretos: IgG1-005- E345R/E430G/S440Y.

[0051] Figura 29: Taxa de depuração de IgG de humano administrado em camundongos SCID conforme determinado pelo ELISA anti-CD38. Círculos pretos: IgG1-005 tipo selvagem; triângulos pretos: IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y.

[0052] Figura 30: Perfil HP-SEC de IgG1-005 em Na2SO4 0,1 M/fosfato de sódio 0,1 M pH 6,8.

[0053] Figura 31: Perfil HP-SEC de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y em Na2SO4 0,1 M/fosfato de sódio 0,1 M pH 6,8.

[0054] Figura 32: Sobreposição de perfis HP-SEC de IgG1-005 em NaCl 0,15 M/citrato 0,1 M pH 6,8 (linha tracejada) e pH 5,0 (linha cheia).

[0055] Figura 33: Perfil HP-SEC de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y em NaCl 0,15 M/citrato 0,1 M pH 6,8 (linha tracejada) e pH 5,0 (linha cheia).

[0056] Figura 34: Análise HP-SEC de anticorpos mutantes triplos IgG1-005-RGY, IgG-7D8-RGY, IgG1-ritux-RGY, IgG1-2F8-RGY e IgG1- M1-RGY.

[0057] Figura 35: E345R/E430G/S440Y triplos anticorpos CD20 mutantes mostram matança melhorada de células de CLL CD20-positivas primárias em um ensaio ex vivo com anticorpos derivados de 7D8 (A) e anticorpos derivados de rituximabe (B).

[0058] Figura 36: Análise HP-SEC de IgG1-005-RGY (A), IgG2- 005-RGY (B), IgG3-005-RGY (C) e IgG4-005-RGY (D). Porcentagens indicam multímeros totais como fração de área de pico total.

[0059] Figura 37: Eficácia de CDC por uma série de concentrações de variantes do anticorpo 005 em diferentes espinhas dorsais do isótipo de IgG em células Daudi (A) e Wien133 (B) CD38-positivo.

[0060] Figura 38: Análise HP-SEC de IgG1-005-KGY (A), IgG1- 005-RSY (B), IgG1-005-RGW (C) e IgG1-005-RGI (D).

[0061] Figura 39: Eficácia de CDC por uma série de concentrações de IgG1-005-RGY, IgG1-005-KGY, IgG1-005-RSY, IgG1-005-RGW, e IgG1-005-RGI em células Wien133 (A) e Ramos (B) CD38-positivo.

[0062] Figura 40: Análise HP-SEC de IGG1-005-RGE, IgG1-005- RGK e uma mistura de IgG1-005-RGE + IgG1-005-RGK (AU indica “unidades arbitrárias’^

[0063] Figura 41: Análise HP-SEC de IgG1-005-RGE, IgG1-005- RGIK e uma mistura de IgG1-005-RGE + IgG1-005-RGIK (AU indica “unidades arbitrárias’+0"

[0064] Figura 42: Sobreposição de traços HP-SEC de mistura de IgG1-005-RGE + IgG1-005-RGK e mistura de IgG1-005-RGE + IgG1-005- RGIK (AU indica “unidades arbitrárias’+0"

[0065] Figura 43: Análise HP-SEC de triplo fragmento Fc mutante (Fc-RGY).

[0066] Figura 44: Análise FACS de células A431 (A) e Daudi (B) incubadas com misturas de Fc-RGY-647 com anticorpos IgG1-RGY de comprimento total.

[0067] Figura 45 A e B: Análise HP-SEC de IgG1-005-RGY em diferentes níveis de pH. Porcentagens indicam oligômeros totais como fração de área de pico total.

[0068] Figura 46: Morte celular programada é induzida em variantes isotípicas diferentes de anticorpos IgG por introdução de RGY de mutação tripla.

[0069] Figura 47: Análise HP-SEC de IgG1-005-RGY (linha cheia) e IgM-005 hexamérico (linha tracejada).

[0070] Figura 48: Eficácia de CDC por uma série de concentrações de IgG1-005, IgG1-005-RGY, IgM-005 em células Daudi (A) e Wien133 (B) CD38-positivo.

[0071] Figura 49: Ensaio de CDC in vitro com IgG1-2F8-RGY em células A431 de linhagens celulares de tumor sólido (A) e Difi (B).

[0072] Figura 50: C4d produzido por anticorpos em soro de humano normal como uma medida para ativação do complemento em solução.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0073] O termo “imunoglobulina” refere-se a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas consistindo em dois pares de cadeias de polipeptídeo, um par de cadeias leves (L) e um par de cadeias pesadas (H) de baixo peso molecular, todas quatro potencialmente interconectadas por ligações de dissulfeto. A estrutura de imunoglobulinas foi bem caracterizada. Vide, por exemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Resumidamente, cada cadeia pesada tipicamente é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida tipicamente de três domínios, CH1, CH2, e CH3. As cadeias pesadas são interconectadas por meio de ligações de dissulfeto na assim chamada “região articulada”0"Cada cadeia leve é compreendida tipicamente de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida tipicamente de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas nas regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis em sequência e/ou forma de laços estruturalmente definidos), também chamadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FRs). Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas da terminação amino até terminação carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (vide também Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)). A menos que de outra forma estabelecido ou contradito pelo contexto, os aminoácidos das sequências de região constante são aqui numerados de acordo com o índice ou numeração Eu (descritos em Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of imunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)).

[0074] A expressão “região articulada” da maneira aqui usada aqui visa referir-se à região articulada de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, por exemplo, a região articulada de um anticorpo de IgG1 de humano corresponde aos aminoácidos 216-230 de acordo com a numeração Eu apresentada em Kabat.

[0075] A expressão “região CH2”"ou “domínio CH2” da maneira aqui usada visa referir-se à região CH2 de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, por exemplo, a região CH2 de um anticorpo de IgG1 de humano corresponde a aminoácidos 231-340 de acordo com o sistema de numeração Eu. Entretanto, a região CH2 pode também ser qualquer um dos outros subtipos descritos aqui.

[0076] A expressão “região CH3”"ou “domínio CH3” da maneira aqui usada visa referir-se à região CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, por exemplo, a região CH3 de um anticorpo de IgG1 de humano corresponde aos aminoácidos 341-447 de acordo com o sistema de numeração Eu. Entretanto, a região CH3 pode também ser qualquer um dos outros subtipos descritos aqui.

[0077] “Região Fc”, “fragmento Fc” ou “domínio Fc”, que podem ser usados indiferentemente aqui, referem-se a uma região de anticorpo compreendendo, na direção do terminal N a C, pelo menos uma região articulada, um domínio CH2 e um domínio CH3. Uma região Fc de um anticorpo de IgG1 pode, por exemplo, ser gerado por digestão de um anticorpo de IgG1 com papaína.

[0078] A expressão “fragmento Fab”" no contexto da presente invenção, refere-se a um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, que compreende as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve bem como a região constante de cadeia leve e a região CH1 de uma imunoglobulina. A “região CH1”" refere-se, por exemplo, à região de um anticorpo de IgG1 de humano correspondente aos aminoácidos 118-215 de acordo com o sistema de numeração Eu. Assim, o fragmento Fab compreende a região de ligação de uma imunoglobulina.

[0079] O termo “anticorpo”" *Cd+" no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, ou um derivado de qualquer um destes, que tem a capacidade de ligar especificamente em um antígeno em condições fisiológicas típicas com uma meia vida de períodos de tempo significativos, tais como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de oito horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de três, quatro, cinco, seis, sete ou mais dias, etc., ou qualquer outro período funcionalmente definido relevante (tal como um tempo suficiente para introduzir, promover, melhorar, e/ou modular uma resposta fisiológica associada com ligação de anticorpo no antígeno e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar um atividade efetora). O anticorpo da presente invenção compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno. Um anticorpo no geral contém duas regiões CH2-CH3 e uma região de conexão, por exemplo, uma região articulada, por exemplo, pelo menos um domínio Fc. Assim, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma região Fc e uma região de ligação de antígeno. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes qw “He” dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina nos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (tais como células efetoras) e componentes do sistema do complemento tal como C1q, o primeiro componente no caminho clássico de ativação do complemento. Um anticorpo pode também ser um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico ou molécula similar. A expressão “anticorpo biespecífico”" refere-se a um anticorpo com especificidades para pelo menos dois epítopos diferentes, tipicamente não sobrepostos. Tais epítopos podem ser nos mesmos ou em diferentes alvos. Se os epítopos forem em diferentes alvos, tais alvos podem ser nas mesmas células ou em diferentes células ou tipos de célula. Conforme indicado anteriormente, a menos que de outra forma estabelecido ou claramente contradito pelo contexto, o termo anticorpo aqui inclui fragmentos de um anticorpo que compreende pelo menos uma porção de uma região Fc e que retém a capacidade de ligar especificamente no antígeno. Tais fragmentos podem ser fornecidos por qualquer técnica conhecida, tais como clivagem enzimática, sínteses de peptídeo e técnicas de expressão recombinante. Mostrou-se que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "Ab" ou “anticorpo” incluem, mas sem limitações, anticorpos monovalentes (descritos em WO2007059782 por Genmab); anticorpos de cadeia pesada, consistindo somente em duas cadeias pesadas e de ocorrência natural em, por exemplo, camelídeos (por exemplo, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), domínio projetado por troca de fita (SEED ou Seed-body) que são assimétricos e moléculas tipo anticorpo biespecífico (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); HeΔCfr *Tgigpgtqp. YQ42323739;4+. Azymetric Scaffold (Zymeworks/Merck, WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011/028952), Imunoglobulina de domínio variável duplo (Abbott, DVD-Ig, No. de patente U.S. 7.612.181); anticorpos de cabeça dupla de duplo domínio (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Di-diacorpo (ImClone/Eli Lilly), formatos de anticorpo saliências em buracos (Genentech, WO9850431); DuoBody (Genmab, WO 2011/131746); Electrostatic steering antibody formats (Amgen, EP1870459 and WO 2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304A2); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAbs (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), anticorpos de domínio de alvejamento duplo (GSK/Domantis), Anticorpos dois-em-um que reconhecem dois alvos (Genentech, NovImmune), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), CovX-body (CovX/Pfizer), biespecíficos tipo IgG (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74), e DIG-body e PIG-body (Pharmabcine), e moléculas de realvejamento de afinidade dupla (Fc-DART ou Ig-DART, por Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538), Zycorpos (Zyngenia), abordagens com cadeia leve comum (Crucell/ Merus, US7262028) ou cadeias pesadas comuns (mnCorpos por NovImmune), bem como fusão de proteínas compreendendo um polipeptídeo sequência fundida em um fragmento de anticorpo contendo um domínio Fc como fusões-scFv, como BsAb da ZymoGenetics/BMS), HERCULES da Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS da Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), fusão de scFv da Novartis, fusão de scFv da Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb da Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb2 da f-Star (WO2008/003116), e duplas fusões de scFv. Deve-se também entender que o termo anticorpo, a menos que de outra forma especificada, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (tais como anticorpos monoclonais de humano), misturas de anticorpo (policlonais recombinantes) por exemplo, gerados por tecnologias explicadas por Symphogen and Merus (Oligoclonics), e polipeptídeos tipo anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo assim gerado pode potencialmente possuir qualquer isótipo.

[0080] A expressão “anticorpo de comprimento total” quando usada aqui, refere-se a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo precursor ou variante) que contém todos os domínios constantes e variáveis de cadeia pesada e leve correspondentes aqueles que são normalmente encontrados em um anticorpo tipo selvagem deste isótipo.

[0081] A expressão “anticorpo de humano”. da maneira aqui usada, visa incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal de humano. Os anticorpos de humano da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinal de humano (por exemplo, mutações, inserções ou deleções introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, a expressão “anticorpo de humano”. da maneira aqui usada, não visa incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linha germinal de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foi enxertado nas sequências de estrutura de humano.

[0082] As expressões "anticorpo monoclonal". “Ab monoclonal”. "composição de anticorpo monoclonal". “oCd”. ou similares, da maneira aqui usada refere-se a uma preparação de moléculas Ab de única composição molecular. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo particular. Dessa maneira, a expressão "anticorpo monoclonal de humano" refere-se a Abs exibindo uma única especificidade de ligação que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal de humano. Os mAbs de humano podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico ou transcromossômico, tal como um camundongo transgênico, com um genoma compreendendo um repertório transgene de cadeia pesada e um repertório transgene de cadeia leve de humano, rearranjados para produzir um anticorpo de humano funcional e fundido em uma célula imortalizada.

[0083] Da maneira aqui usada, "isótipo" refere-se à classe de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgE, ou IgM ou qualquer alotipos desses tais como IgG1m(za) e IgG1m(f)) que é codificada por genes da região constante de cadeia pesada. Adicionalmente, cada isótipo de cadeia pesada pode ser combinado com uma cadeia leve tanto kappa (m) quanto lambda (n).

[0084] A expressão “anticorpo monovalente”"no contexto da presente invenção significa que uma molécula do anticorpo é capaz de ligar somente com um domínio de ligação do anticorpo em um antígeno, por exemplo, tem uma única interação antígeno-anticorpo, e assim não é capaz de ligação cruzada do antígeno.

[0085] Uma “região de ligação” da maneira aqui usada pode ser uma sequência de polipeptídeos, tal como uma proteína, ligante de proteína, receptor, uma região de ligação de antígeno, ou uma região de ligação do ligante capaz de ligar em um alvo associado com uma célula, bactéria, vírion, ou similares. Uma região de ligação pode, por exemplo, compreender parte de um receptor, ligante do receptor ou região de ligação de antígeno de uma imunoglobulina ou anticorpo.

[0086] Da maneira aqui usada, deve-se entender que o termo “alvo” está no contexto da presente invenção como uma molécula na qual a região de ligação do polipeptídeo compreendendo um CH2, CH3, e opcionalmente uma região articulada, e uma região de ligação se liga. Quando usado no contexto da ligação de um anticorpo inclui qualquer antígeno em direção ao qual anticorpo salientado é direcionado. Os termos “antígeno”"e “alvo”"podem ser usados em relação a um anticorpo indiferentemente e constituiu o mesmo significado e propósito com relação a qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção.

[0087] Da maneira aqui usada, o termo "ligação'' no contexto da ligação de um anticorpo em um antígeno predeterminado tipicamente é uma ligação com uma afinidade correspondente a um KD de cerca de 10-6 M ou menos, por exemplo, 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos, ou cerca de 10-11 M ou ainda menos quando determinado, por exemplo, por tecnologia de ressonância de plasmônio de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como o ligante e o anticorpo como o analito, e liga no antígeno predeterminado com uma afinidade correspondente a um KD que é pelo menos dez vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menor, por exemplo, pelo menos 1.000 vezes menor, tal como pelo menos 10.000 vezes menor, por exemplo, pelo menos 100.000 vezes menor que sua afinidade para ligação em um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) sem ser o antígeno predeterminado ou um antígeno estritamente relacionado. A quantidade com a qual a afinidade é menor depende do KD do anticorpo, de forma que quando o KD do anticorpo é muito baixo (ou seja, o anticorpo é altamente específico), então a quantidade com a qual a afinidade para o antígeno é menor que a afinidade para um antígeno não específico pode ser pelo menos 10.000 vezes. O termo "KD" (M), da maneira aqui usada, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.

[0088] Uma “variante” da presente invenção denota uma molécula,por exemplo, proteína dimérica ou que compreende uma ou mais mutações comparadas com uma “molécula precursora”." por exemplo, “proteína dimérica precursora”." tal como um “anticorpo precursor”0"Para uma variante do anticorpo, formatos de anticorpo precursor exemplares incluem, mas sem limitações, um anticorpo tipo selvagem, um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo contendo Fc, um anticorpo biespecífico, um anticorpo de humano, ou qualquer combinação dos mesmos. Mutações exemplares incluem deleções de aminoácido, inserções, e substituições de aminoácidos na sequência de aminoácido precursor. Substituições de aminoácido podem trocar um aminoácido nativo por um outro aminoácido de ocorrência natural, ou por um derivado de aminoácido de não ocorrência natural. A substituição de aminoácido pode ser conservativa ou não conservativa. No contexto da presente invenção, substituições conservativas podem ser definidas por substituições nas classes de aminoácidos refletidas em uma ou mais das três tabelas seguintes: Classes de resíduo de aminoácido para substituições conservativas

Classes de substituição de resíduo de aminoácido conservativa alternative

Classificações Físicas e Funcionais Alternativas de Resíduos de Aminoácido

[0089] No contexto da presente invenção, uma substituição em uma variante é indicada como: Aminoácido original - posição - aminoácido substituído;

[0090] Com referência à nomenclatura bem reconhecida para aminoácidos, o código de três letras, ou código de uma letra, são usados, incluindo os códigos Xaa e X para indicar resíduo de aminoácido. Dessa maneira, a notação “G567T” ou "Glu565Arg” significa que a variante compreende uma substituição de ácido glutâmico com arginina na posição de aminoácido variante correspondente ao aminoácido na posição 345 no anticorpo precursor, quando as duas são alinhadas da maneira indicada a seguir.

[0091] Onde uma posição como tal não está presente em um anticorpo, mas a variante compreende uma inserção de um aminoácido, por exemplo: Posição - aminoácido substituído; a notação, por exemplo, “66:G” é usada.

[0092] Tal notação é particular relevante com relação a modificação(s) em uma série de polipeptídeos ou anticorpos homólogos.

[0093] Similarmente quando a identidade do(s) resíduo(s) de aminoácido de substituição é irrelevante: Aminoácido original - posição; ou “G567”

[0094] Para uma modificação onde o(s) aminoácido(s) original(s) e/ou aminoácido(s) substituído(s) pode compreender mais que um, mas não todos aminoácido(s), o uso de ácido glutâmico em substituição a para arginina, Lisina ou Triptofano na posição 345:“inw567Cti,N{U,Vtr” ou “G567R,M,W” ou “G567R1M1W” ou “G567 a R, K ou W” pode ser usado indiferentemente no contexto da invenção.

[0095] Além disso, a expressão “uma substituição” abrange uma substituição em qualquer um dos outros dezenove aminoácidos naturais, ou em outros aminoácidos, tais como aminoácidos não naturais. Por exemplo, uma substituição de aminoácido E na posição 345 inclui cada qual das seguintes substituições: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 345I, 345K, 345L, 345M, 345N, 345Q, 345R, 345S, 345T, 345V, 345W, 345P e 345Y. Isto é, a propósito, equivalente a designações 345X, em que o X designa qualquer aminoácido sem ser o aminoácido original. Essas substituições podem também ser designadas E345A, E345C, etc., ou E345A,C, etc., ou E345A/C/etc. O mesmo se aplica por analogia a toda e qualquer posição mencionada aqui, para incluir especificamente aqui qualquer uma de tais substituições.

[0096] As expressões “aminoácido”" e “resíduo de aminoácido”" podem ser usadas indiferentemente.

[0097] A referência a “F1G578”" no presente contexto refere-se a variantes alotípicas na sequência de IgG1 de humano. No alotipo IgG1m(za) de IgG1 de humano o aminoácido na posição 356 é D, enquanto, no alotipo IgG1m(f) de IgG1 de humano, o aminoácido na posição 356 é E.

[0098] A menos que de outra forma estabelecido ou contradito pelo contexto, referência a um número de posição de aminoácido refere-se ao número de posição de aminoácido em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[0099] Um aminoácido ou segmento em uma sequência que “corresponde a” um aminoácido ou segmento em uma outra sequência é um que (i) alinha com o outro aminoácido ou segmento usando um programa de alinhamento de sequência padrão tais como ALIGN, ClustalW ou similar, tipicamente a ajustes padrão e (ii) tem uma identidade de sequência para SEQ ID NO:1 de pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%. Por exemplo, os alinhamentos de sequência mostrados nas figuras 2 e 3 podem ser usados para identificar qualquer aminoácido nas sequências Fc de imunoglobulina mostradas que corresponde a um aminoácido particular na sequência Fc de IgG1.

[00100] Com propósitos da presente invenção, um aminoácido em uma posição em uma sequência de aminoácido que corresponde a uma posição específica em uma outra sequência de aminoácido de referência, bem como o grau de identidade entre duas sequências de aminoácido ou nucleotídeos, pode ser determinado por alinhamento das duas sequências. Aqui, a menos que de outra forma indicado ou contradito pelo contexto, a sequência de aminoácido de referência é a sequência de aminoácido de cadeia pesada de IgG1 de humano. O programa “Cnkip”" que é um alinhamento Needleman- Wunsch (isto é, um alinhamento global) pode ser usado para alinhamento de sequências de polipeptídeo, bem como nucleotídeos. A matriz de pontuação padrão BLOSUM50 ou BLOSUM62 pode ser usada para alinhamentos de polipeptídeo, e a matriz de identidade padrão pode ser usada para alinhamentos de nucleotídeos, a penalidade do primeiro resíduo de uma lacuna é -12 para polipeptídeos e -16 para nucleotídeos. As penalidades para resíduos adicionais de uma lacuna são -2 para polipeptídeos, e -4 para nucleotídeos. “Align”"é parte da versão do pacote FASTA v20u6 (vide W. R. Pearson d F0" L0" Nkrocp" *3;::+." “Kortqxgf" Vqqnu" for Biological sequence Cpcn{uku”." RPCU" :7<4666-2448, and Y0" T0" Rgctuqp" *3;;2+" “Tcrkf" and Sensitive sequence Comparison with FASTP and HCUVC”." Methods in Enzymology 183:63-98). Proteína FASTA usa o algoritmo Smith-Waterman ugo nkokVc>«q pq tcocnjq fg ncewpc *xkfg “UokVj-YcVgtocp éclgontiiiq”. V. F. Smith and M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biolo. 147:195-197). Alinhamentos representativos entre regiões Fc de cadeias pesadas de imunoglobulina sãos mostrados nas figuras 2 e 3.

[00101] O termo "vetor", da maneira aqui usada, visa referir-se a uma molécula do ácido nucleico capaz de induzir transcrição de um segmento de ácido nucleico ligado no vetor. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que é na forma de um laço de DNA de fita dupla circular. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que o segmento de ácido nucleico pode ser ligado no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula do hospedeiro na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissomais). Outros vetores (tais como vetores de mamífero não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula do hospedeiro mediante introdução na célula do hospedeiro e, por meio disso, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes nos quais eles são operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou, simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante são frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indiferentemente, uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, a presente invenção visa incluir outras tais formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (tais como retrovírus defectivo de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem a funções equivalentes.

[00102] A expressão "célula do hospedeiro recombinante" (ou, simplesmente, "célula do hospedeiro"), da maneira aqui usada, visa referir-se a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. Deve-se entender que tais termos não visam referir-se somente à célula objeto particular, mas também à progênie de uma célula como essa. Em virtude de certas modificações poderem ocorrer em gerações em sucessão devido tanto a mutação quanto influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica a da célula precursora, mas está ainda incluída no escopo da expressão "célula do hospedeiro" da maneira aqui usada. Células do hospedeiro recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células HEK-293, PER.C6, células NS0, e células linfocíticas, e células procarióticas tais como E. coli e outros hospedeiros eucarióticos tais como células de planta e fungos.

[00103] O termo “VtcpufeeVqoc”. da maneira aqui usada, inclui células do hospedeiro eucarióticas recombinantes que expressam o Ab ou um antígeno alvo, tais como células CHO, PER.C6, células NS0, células HEK- 293, células de planta, ou fungos, incluindo células de levedura.

[00104] Da maneira aqui usada, a expressão "célula efetora" refere-se a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, oposto às fases cognitiva e ativação de uma resposta imune. Células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mieloide ou linfoide, por exemplo, linfócitos (tais como células B e células T incluindo células T citolíticas (CTLs)), células matadoras, células matadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tais como neutrófilos, granulócitos, células mast e basófilos. Algumas células efetoras expressam receptores Fc (FcRs) ou receptores de complemento e realizam funções imunes específicas. Em algumas modalidades, uma célula efetora tal como, por exemplo, uma célula matadora natural, é capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e células Kupffer que expressam FcRs, estão envolvidas em matança específica de células alvos e que apresentam antígenos para outros componentes do sistema imune, ou ligação nas células que apresentam antígenos. Em algumas modalidades, a ADCC pode ser adicionalmente melhorada por ativação do complemento clássica acionada pelo anticorpo resultando na deposição de fragmentos de C3 ativados na célula alvo. Produtos de clivagem de C3 são ligantes em receptores de complemento (CRs), tal como CR3, expresso em células mieloides. O reconhecimento de fragmentos de complemento por CRs nas células efetoras pode promover ADCC mediada por receptor Fc melhorado. Em algumas modalidades, ativação do complemento clássica acionada pelo anticorpo leva a fragmentos de C3 na célula alvo. Esses produtos de clivagem de C3 podem promover citotoxicidade celular dependente do complemento direta (CDCC). Em algumas modalidades, uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo, partícula alvo ou célula alvo. A expressão de um FcR particular ou receptor do complemento em uma célula efetora pode ser regulada por fatores humorais tais como citocinas. Por exemplo, observou-se que expressão de HeyTI foi é suprarregulada por intgiTgron y *IHP Y+ e/ou G-CSF. Esta expressão melhorada aumenta a atividade citotóxica de células que carregam HeyTI eqpVtc alvos. Uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo ou fagocitar ou lisar uma célula alvo. Em algumas modalidades, ativação do complemento clássica acionada pelo anticorpo leva a fragmentos de C3 na célula alvo. Esses produtos de clivagem de C3 podem promover fagocitose direta por células efetoras ou indiretamente melhorando fagocitose mediada por anticorpo.

[00105] Da maneira aqui usada, a expressão “funções efetoras” refere-se a funções que são uma consequência da ligação de uma proteína dimérica, tal como um anticorpo, para o seu alvo, tal como um antígeno, opcionalmente em uma célula, em uma membrana da célula, em um vírion, ou em uma outra partícula. Exemplos de funções efetoras incluem (i) ligação de C1q, (ii) ativação do complemento, (iii) citotoxicidade dependente do complemento (CDC), (iv) formação de oligômero, (v) estabilidade do oligômero, (vi) citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), (vii) ligação de FcRn, (viii) ligação do receptor Fc-gama, (ix) fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), (x) citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC), (xi) citotoxicidade melhorada do complemento, (xii) ligação no receptor do complemento de um anticorpo opsonizado mediado pelo anticorpo, (xiii) internalização, (xiv) inframodulação, (xv) indução de apoptose, (xvi) opsonização, (xvii) modulação de proliferação, tais como redução de proliferação, inibição ou estímulo, e (xii) uma combinação de qualquer de (i) a (xvi).

[00106] Da maneira aqui usada, o termo “afinidade” é a intensidade de ligação de uma molécula, por exemplo, um anticorpo, em um outro, por exemplo, um alvo ou antígeno, em um único sítio, tal como a ligação monovalente de um sítio de ligação de antígeno individual de um anticorpo em um antígeno.

[00107] Da maneira aqui usada, o termo “avidez”" refere-se à intensidade combinada de múltiplos sítios de ligação entre duas estruturas, tal como entre múltiplos sítios de ligação de antígeno de anticorpos simultaneamente interagindo com um alvo ou, por exemplo, entre anticorpo e C1q. Quando mais que uma interação de ligação está presente, as duas estruturas somente dissociarão quando todos os sítios de ligação dissociarem, e assim, a taxa de dissociação será menor que para os sítios de ligação individual, e por meio disso fornecendo uma maior intensidade ligação total efetiva (avidez) comparada com a intensidade de ligação dos sítios de ligação individuais (afinidade).

[00108] Da maneira aqui usada, o termo “oligômero” refere-se a uma estrutura que consiste em mais que um, mas um número limitado de unidades de um tipo de molécula específico (tal como, por exemplo, anticorpo ou outras moléculas de proteína dimérica de acordo com a invenção) ao contrário de um polímero que, pelo menos em princípio, consiste em um número não limitado de unidades. Assim, um oligômero de acordo com a invenção, consiste em um número ilimitado de proteínas diméricas de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção. Oligômeros exemplares são dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros e dodecâmeros. Prefixos em grego são frequentemente usados para designar o número de unidades de monômero no oligômero, por exemplo, um tetrâmero sendo composto de quatro unidades e um hexâmero de seis unidades. Igualmente, o termo “oligomerização”, da maneira aqui usada, visa referir-se a um processo que converte moléculas em um grau finito de polimerização. Aqui, observa-se que anticorpos e/ou outras proteínas diméricas de acordo com a invenção, podem formar oligômeros, tais como hexâmeros, por meio de associação não covalente de domínios Fc em solução em certas condições de pH, conforme descrito no Exemplo 31, ou, no caso de proteínas diméricas compreendendo regiões de ligação alvo, depois de ligação no alvo, por exemplo, em uma superfície da célula. Oligomerização em solução pode ser avaliada, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 20. Em uma modalidade particular, a oligomerização em solução pode ser determinada realizando fracionamento de HP-SEC (cromatografia de exclusão de tamanho de alta pressão) usando uma resina de cromatografia de exclusão de tamanho adequada com um tamanho de poro de separar moléculas na faixa de 50 kDa a 1.000 kDa, conectada em um detector de absorbância; separando em amostras de 50 μL contendo 1,25 μg/mL proteína a 1 mL/minuto em NébSO.i 0,1 M /fosfato de sódio 0,1 M tamponadas a pH 6,8; usando um software adequado para processar resultados; e expressando por pico como porcentagem de área de pico total. A oligomerização de anticorpos depois da ligação de antígeno pode ser avaliada (por exemplo, usando uma citotoxicidade dependente do complemento descrita nos Exemplos 3, 6, e 21). Em uma modalidade particular, CDC pode ser determinado pré-incubando células de suspensão a uma concentração de 1 x 106 células/ mL em placas de 96 poços de base redonda com um anticorpo a uma concentração final variando de 0,0003 a 30,0 μg/mL em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente; adicionando soro de humano normal a uma concentração final de 20%, 30% ou 50%; incubando a 37°C por 45 minutos; colocando as placas em gelo; adicionando 10 μL de iodeto de propídio; e determinando lise celular por análise de FACS.

[00109] A expressão “ligação de C1q”. da maneira aqui usada, visa referir-se à ligação de C1q no contexto da ligação de C1q em um anticorpo ligado no seu antígeno. Deve-se entender que o anticorpo ligado no seu antígeno ocorre tanto in vivo quanto in vitro no contexto descrito aqui. Ligação de C1q pode ser avaliada, por exemplo, usando anticorpo imobilizado na superfície artificial (por exemplo, plástico em placas para ELISA, conforme descrito no exemplo 21). Em uma modalidade particular, ligação de C1q pode ser determinada revestindo placas ELISA de 96 poços por toda a noite a 4°C com anticorpo em PBS a uma concentração variando de 0,007 a 2,0 μg/mL; lavando as placas; bloqueando com 0,5x PBS/Tween 20 0,025%/gelatina 0,1%; incubando sequencialmente por 1 hora em placas a 37°C com 3% de soro de humano agrupado, C1q de coelho anti-humano, IgG- HRP de suíno anti-coelho, por lavagem intermediária; revelando as placas por cerca de 30 minutos com 1 mg/mL de 4.4Ó-azino-bis 3-ácido etilbenzotiazolina-6-sulfônico; adicionando 322 μN de ácido oxálico 2%; e medindo a absorbância a 405 nm em uma leitora de microplaca. Deve-se entender que a ligação de C1q em um oligômero de anticorpo é aqui como uma interação multivalente resultando em ligação de alta avidez.

[00110] Da maneira aqui usada, a expressão “ativação do complemento”"refere-se à ativação do caminho do complemento clássico, que é disparada pela ligação de C1q do componente do complemento em um anticorpo ligado no seu antígeno. C1q é a primeira proteína nos eventos iniciais da cascata de complemento clássica que envolve uma série de reações de clivagem que culmina na formação de uma atividade enzimática denominada C3 convertase, que cliva componente C3 do complemento em C3b e C3a. C3b liga covalentemente em C5 na membrana para formar C5b que por sua vez dispara os últimos eventos de ativação do complemento no qual componentes C5b, C6, C7, C8 e C9 de complemento terminal montam no complexo de ataque da membrana (MAC). A cascata de complemento resulta na criação de poros devido ao fato de que causa lise celular, também conhecida como CDC. Ativação do complemento pode ser avaliada usando, cinética de CDC (descrito nos exemplos 14, 15 e 16), ensaios de CDC (descritos nos exemplos 3 e 21) ou pelo método de deposição celular de C3b e C4b descrito em Beurskens et al April 1, 2012 vol. 188 no. 7 3532-3541.

[00111] A expressão “citotoxicidade dependente do complemento” *“EFE”+. da maneira aqui usada, visa referir-se ao processo de ativação do complemento mediada por anticorpo levando a lise de uma célula ou vírion em decorrência de poros na membrana que são criados por montagem de MAC, quando o anticorpo é ligado no seu alvo na dita célula ou vírion. CDC pode ser avaliada por ensaios in vitro tais como um ensaio de CDC no qual soro de humano normal é usado como uma fonte de complemento, da maneira descrita anteriormente, por exemplo, no exemplo 3 e 21.

[00112] A expressão “citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo”"*“CFEE”+ da maneira aqui usada visa referir-se a um mecanismo de matança de células alvos revestidas com anticorpo ou vírions por células que expressam receptores Fc que reconhece a região constante do anticorpo ligado. ADCC pode ser determinada usando métodos tal como, por exemplo, o ensaio ADCC descrito no exemplo 21. Em uma modalidade particular, ADCC pode ser determinado por incubação de células com anticorpo a uma concentração variando de 0,5 a 250 ng/mL; e quantificando atividade ADCC com um kit de ensaio reportador bioluminescente ADCC.

[00113] A expressão “fagocitose celular dependente de anticorpo”" *“CDER”+ da maneira aqui usada visa referir-se a um mecanismo de eliminação de células alvos revestidas de anticorpo ou vírions por internalização por fagócitos. A célula alvo revestida por anticorpo ou vírion internalizado está contida em uma vesícula denominada um fagossomo, que então funde com um ou mais lisossomos para formar um fagolisossomo. ADCP pode ser avaliada usando um ensaio de citotoxicidade in vitro com macrófagos como células efetoras e microscopia de vídeo conforme descrito por van Bij et al. in Journal of Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, Pages 677-685 ou conforme descrito no exemplo 24, por exemplo, para fagócitos S. aureus por PMN.

[00114] A expressão “citotoxicidade celular dependente do complemento” *“EDEE”+ da maneira aqui usada visa referir-se a um mecanismo de matança de células alvos ou vírions por células que expressam receptores de complemento que reconhecem produtos de clivagem de 3 complementos (C3) que são covalentemente ligados nas células alvos ou vírions em decorrência de ativação do complemento mediada por anticorpo. CDCC pode ser avaliada de uma maneira similar conforme descrito para ADCC mas, na presença de soro de humano normal esgotado de C5 complemento.

[00115] O termo “inframodulação”. da maneira aqui usada, visa referir-se a um processo que diminui o número de moléculas, tais como antígenos ou receptores, em uma superfície celular, por exemplo, por ligação de um anticorpo em um receptor.

[00116] O termo “internalização”. da maneira aqui usada, visa referir- se a qualquer mecanismo pelo qual uma proteína dimérica da presente invenção, por exemplo, um anticorpo ou polipeptídeo contendo Fc, é internalizado em uma célula que expressa alvo da superfície da célula e/ou do meio em volta, por exemplo, por meio de endocitose. A internalização de um anticorpo pode ser avaliada usando um ensaio direto medindo a quantidade de anticorpo internalizado (tal como, por exemplo, o ensaio de colocalização lisossomal descrito no exemplo 12).

[00117] A expressão “morte de célula programada” ou “REF”. da maneira aqui usada refere-se a morte de uma célula em qualquer forma mediada por uma sinalização intracelular. Três formas de PCD são encontradas; apoptose, autofagia e necrose/oncose. Em uma modalidade particular, qualquer das três formas de morte celular programada pode ser determinada cultivando 1,0x105 células por 24 horas em placas de base U de 96 poços na presença de anticorpo a uma concentração variando de 0,0025 a 10 μg/mL; manchando células mortas com anexina V-FITC usando um kit de ensaio de ligação de anexina adequado de acordo com as instruções do fabricante; e determinando a quantidade de células V-FITC-positiva de anexina usando análise FACS.

[00118] O termo “apoptose”. da maneira aqui usada, refere-se ao tipo mais bem caracterizado de morte celular programada em virtude de sua importância em desenvolvimento e homeostase, e na patogênese de diferentes doenças, tal como câncer. Células apoptóticas morrem de um modo controlado em resposta a uma variedade de sinais extrínsecos ou intrínsecos (por exemplo, ativação de receptores do fator de necrose tumoral (TNF), dano no DNA, caminhos mitocondriais). Eventos bioquímicos levam a mudanças celulares características (morfologia) e morte. As marcas registradas de morte apoptótica da célula incluem formação de bolha, exposição de fosfatidilserina na face extracelular da membrana plasmática, ativação de caspases, rompimento de membrana mitocondrial potencial, contração da célula, condensação de cromatina, fragmentação de DNA e condensação de DNA. Ligação de um anticorpo em um certo receptor pode induzir apoptose.

[00119] O termo “autofagia”. da maneira aqui usada, refere-se a uma degradação seletiva de moléculas ou estruturas intracelulares, tais como proteínas com enovelamento incorreto e organelas danificadas, e é uma importante função homeostática. Autofagia realiza junto com o Sistema de Proteassoma de Ubiquitina (UPS) para degradar proteínas agregadas/mal enoveladas que são ubiquitinadas, marcando-as para degradação por autofagia. A carga ubiquitinada é carregada no fagóforo e envolve sua carga formando uma vesícula de membrana dupla, o autofagossomo. O lisossomo funde com o autofagossomo e a carga é degradada dentro do autolisossomo.

[00120] O termo “necrose” ou “oncose”. da maneira aqui usada, refere- se a uma morte da célula descontrolada caracterizada por intumescimento da célula, bem como destruição da membrana plasmática e organelas subcelulares, sem fragmentação e condensação nuclear. Morte de célula necrótica é considerada um fenômeno heterogêneo incluindo morte da célula tanto programada quanto acidental.

[00121] O termo “proliferação”. da maneira aqui usada refere-se a um aumento no número de células em decorrência de crescimento celular e divisão celular.

[00122] O termo “conjugado anticorpo-medicamento”. da maneira aqui usada refere-se a uma proteína dimérica da presente invenção, por exemplo, um anticorpo ou polipeptídeo contendo Fc, com especificidade para pelo menos um tipo de célula maligna, um medicamento, e um ligante que acopla o medicamento, por exemplo, no anticorpo. O ligante é clivável ou não clivável na presença da célula maligna; em que o conjugado anticorpo- medicamento mata a célula maligna.

[00123] A expressão “captação de conjugado anticorpo-medicamento”. da maneira aqui usada refere-se ao processo no qual conjugados anticorpo- medicamento são ligados em um alvo em uma célula seguido por captação/engolfamento pela membrana da célula e por meio disso é extraído para a célula. Captação de conjugado anticorpo-medicamento pode ser avaliada como “internalização mediada por anticorpo e matança celular por ADC anti-TF em um ensaio de matança in vitro”"conforme descrito em WO 2011/157741.

[00124] O termo “HeTp”. da maneira aqui usada visa referir-se a receptor Fc neonatal que é um receptor Fc. Ele foi primeiro descoberto em roedores como um receptor exclusivo capaz de transportar IgG de leite da precursora através do epitélio de tripa de roedor recém-nascido na corrente sanguínea do recém-nascido. Estudos adicionais revelaram um receptor similar em humanos. Em humanos, entretanto, ele é encontrado na placenta para ajudar facilitar o transportar de IgG da precursora para o feto em crescimento e ele também mostrou desempenhar um papel no monitoramento de degradação de IgG. FcRn liga IgG em pH acídico de 6,0 a 6,5 mas, não a pH neutro ou maior. Portanto, FcRn pode ligar IgG do lúmen intestinal (o interior da tripa) em um pH levemente acídico e permitir transporte unidirecional eficiente para o lado basolateral (dentro do corpo) onde o pH é neutro a básico (pH 7,0 a 7,5). Este receptor também desempenha um papel em salvamento adulto de IgG através de sua ocorrência no caminho de endocitose em células endoteliais. Receptores de FcRn nos endossomos acídicos ligam em IgG internalizado através de pinocitose, reciclando-os para a superfície da célula, liberando-os no pH básico de sangue, por meio disso impedindo-os de passar por degradação lisossomal. Este mecanismo pode fornecer uma explanação para a maior meia vida de IgG no sangue comparada com outros isótipos.

[00125] A expressão “Proteína A”, da maneira aqui usada visa referir- se a uma proteína de superfície 56 kDa MSCRAMM originalmente encontrada na parede da célula da bactéria Staphylococcus aureus. Ela é codificada pelo gene spa e seu regulamento é controlado por topologia de DNA, osmolaridade celular, e um sistema de dois componentes denominado ArlS-ArlR. Observou-se que ela tem uso em pesquisa bioquímica em virtude de sua capacidade de ligar imunoglobulinas. Ela é composta de cinco domínios de ligação homólogo de Ig que dobram em um feixe de três hélices. Cada qual domínio é capaz de ligar proteínas de muitas espécies de mamífero, mais notavelmente IgGs. Ele liga a região Fc de cadeia pesada da maioria das imunoglobulinas (sobrepondo o sítio de ligação conservado de receptores de FcRn) e também interage com a região Fab da família VH3 de humano. Através dessas interações em soro, moléculas de IgG ligam nas bactérias por meio de sua região Fc em vez de apenas por meio de suas regiões Fab, pelas quais as bactérias rompem opsonização, ativação do complemento e fagocitose.

[00126] A expressão “proteína I”. da maneira aqui usada visa referir- se a uma proteína de ligação de imunoglobulina expressa no grupo C e bactérias G estreptococais muito similares a proteína A, mas com especificidades diferentes. É uma proteína da superfície da célula 65-kDa (proteína G G148) e uma 58 kDa (proteína G C40) que encontrou aplicação em anticorpos de purificação através de sua ligação na região Fc.

Proteína dimérica

[00127] A presente invenção refere-se em um aspecto a uma proteína dimérica compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo, cada polipeptídeo compreendendo pelo menos regiões CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que, nos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos: os aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E,e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é Y, K, R ou W; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente. Cada qual das posições S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 corresponde à posição em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00128] Em uma modalidade, em cada qual dos ditos primeiro e segundo polipeptídeos: os aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E, e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é Y, K, R ou W; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente. Cada qual de posições S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 corresponde à posição em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00129] O primeiro e segundo polipeptídeos da proteína dimérica de acordo com a invenção dimerizam formando interação covalente ou não covalente. Uma interação como esta pode ser encontrada em qualquer região dos polipeptídeos. Exemplos de interação covalente são qualquer interação de peptídeo CxxC, em que o “x” representa qualquer aminoácido e o “C” representa resíduos de cisteína. Um outro exemplo é um domínio constante de cadeia TCRalfa e um domínio constante de cadeia TCRbeta. Exemplos em interação não covalente pode ser um zíper de leucina tal como descrito em Moll et al, Prot.Science, 2001, 10:649-655. Em uma modalidade, os ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos podem compreender adicionalmente uma região capaz de ligação covalente entre os ditos primeiro e segundo polipeptídeos.

[00130] Em uma modalidade, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos adicionalmente compreendem uma região articulada.

[00131] Com certos propósitos da presente invenção, basta uma parte da região articulada, tais como posições de aminoácido correspondentes a 226-230. Assim, em uma modalidade, o primeiro e/ou segundo polipeptídeo podem compreender adicionalmente aminoácidos nas posições correspondentes às posições 226-230 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00132] Em uma modalidade, nos ditos primeiro e segundo polipeptídeos o aminoácido nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, não são E, e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é Y ou W; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente.

[00133] Em uma modalidade, nos ditos primeiro e segundo polipeptídeos, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E, e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é Y, K, R ou W; não Y; não E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente.

[00134] Assim, uma modalidade de presente invenção refere-se à proteína dimérica compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo, cada polipeptídeo compreendendo pelo menos, CH2, CH3 e regiões de dobradiça de uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que os aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é Y ou W; não Y; não E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente.

[00135] Em uma modalidade, os primeiro e segundo polipeptídeos são interconectados por meio de ligações de dissulfeto da região articulada.

[00136] A menos que de outra forma estabelecido ou contradito pelo contexto, as posições de aminoácido mencionadas referem-se a uma posição de aminoácido em uma cadeia pesada de IgG1 de humano em qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção.

[00137] Além disso, a menos que de outra forma estabelecido ou contradito pelo contexto, a numeração de aminoácido é de acordo com numeração Eu apresentada em Kabat, da maneira descrita anteriormente.

[00138] A proteína dimérica pode ser preparada a partir de uma proteína dimérica precursora, e por meio disso ser considerada uma proteína dimérica variante, introduzindo mutações nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, e em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições correspondentes a S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, em que o aminoácido introduzido na posição correspondente a S440 é Y, K, R ou W. Nas outras posições de aminoácido, qualquer aminoácido pode ser introduzido, por exemplo, qualquer aminoácido de ocorrência natural.

[00139] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a E345 é, para um ou ambos, tal como cada qual, dos ditos primeiro e segundo polipeptídeos da proteína dimérica, selecionado, por exemplo, separadamente do grupo que consiste em R, Q, N, K, Y, A, C, D, F, G, H, I, L, M, P, S, T, V e W, tal como do grupo que consiste em R, Q, N, K e Y.

[00140] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a E345 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, selecionado, por exemplo, separadamente do grupo que consiste em R, Q, K e Y.

[00141] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a E345 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, R.

[00142] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a E430 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, selecionado, por exemplo, separadamente do grupo que consiste em G, T, S, F, H, A, C, D, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W e Y, tal como do grupo que consiste em G, T, S, F e H.

[00143] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a E430 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, selecionado, por exemplo, separadamente do grupo que consiste em G, T, S e F.

[00144] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a E430 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, G.

[00145] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a S440 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, selecionado, por exemplo, separadamente do grupo que consiste em Y ou W.

[00146] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a S440 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, W.

[00147] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a S440 é, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, Y.

[00148] Em uma modalidade, o aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste em Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é, em um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, (a) I, N, Q, S, T, R, A, E, F, H, K, L, M ou V, tais como I, N, Q ou S; (b)R, G, T, I, L, M, K, H, S, V, Y, Q, N, W, F, A, ou C; (c) R; (d) V, L, M, D, Q, K, R, N, H, S, T, W ou Y, tais como V, L ou M; (e) W, H, K, Q, R, D, E, S, T, ou Y, tais como W, H, K, Q ou R; (f) N, S, T, A, H, K, Q, R, W ou Y, tais como N, S ou T; (g) V, L, N, Q, E, S ou T, tais como V, L, N ou Q; (h) L, G, I ou V; para cada posição, respectivamente.

[00149] O aminoácido nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, e em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254, pode, em uma modalidade, ser o mesmo no primeiro e segundo polipeptídeo; ou ele pode ser diferente. Os aminoácidos nas ditas posições podem ser diferentes, por exemplo, se a proteína dimérica for uma proteína heterodimérica, tal como um anticorpo biespecífico descrito aqui.

[00150] Os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 podem, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica ser um dos seguintes exemplos não limitantes; E345K/E430G/S440Y, E345Q/E430G/S440W, E345Y/E430G/S440Y, E345R/E430T/S440W, E345Q/E430T/S440Y, E345N/E430T/S440W, E345R/E430S/S440Y, E345K/E430S/S440W, E345N/E430S/S440Y, E345Y/E430S/S440W, E345K/E430F/S440Y, E345Q/E430F/S440W, E345N/E430F/S440R, E345Y/E430F/S440K e E345Y/E430F/S440R.

[00151] Em uma modalidade, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são, para um ou ambos, tal como cada qual dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, R, G e Y, respectivamente.

[00152] Em uma modalidade alternativa, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são, para os ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, K, G, e Y, respectivamente.

[00153] Em uma modalidade alternativa, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, e S440 são, para os ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, R, S, e Y, respectivamente.

[00154] Em uma modalidade alternativa, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são, para os ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, R, G, e W, respectivamente.

[00155] Em uma modalidade alternativa, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e Y436 são, para os ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, R, G, e I, respectivamente.

[00156] Em uma modalidade alternativa, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, Y436 e S440 são, para os ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, R, G, I, e K, respectivamente.

[00157] Em uma modalidade, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são, para o ditos primeiro e/segundo polipeptídeos das proteínas diméricas, R, G, e K, respectivamente.

[00158] Conforme descrito aqui, a presente invenção inter alia refere- se a proteínas diméricas compreendendo aminoácidos em três posições que são diferentes daqueles naturalmente presentes na região CH2/CH3 de uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00159] Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo polipeptídeos da proteína dimérica são interconectados por meio de ligações de dissulfeto da região articulada.

[00160] Em uma modalidade, o isótipo de cadeia pesada de imunoglobulina é selecionado do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM. O isótipo do primeiro e segundo polipeptídeos pode ser diferente mas, em uma modalidade particular, ele é o mesmo. Em uma modalidade, o isótipo do primeiro e segundo polipeptídeos é diferente, tal como o isótipo do dito primeiro polipeptídeo pode ser uma cadeia pesada de IgG1 de imunoglobulina e o isótipo do dito segundo polipeptídeo pode ser uma cadeia pesada de imunoglobulina de IgG4. O exemplo não deve ser entendido como limitante e, assim, outras combinações de isótipos são consideradas compreendidas na presente invenção.

[00161] Qualquer posição de aminoácido, ou mutação em uma posição de aminoácido, descrita aqui como correspondente a uma posição de aminoácido em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, pode ser identificada ou introduzida em sua posição equivalente em IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgD e IgM da maneira definida pelo alinhamento na figura 2 para obter uma proteína dimérica de acordo com a invenção.

[00162] Em uma modalidade particular, o isótipo de cadeia pesada de imunoglobulina é selecionado do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, tal como IgG1.

[00163] Em uma outra modalidade, o isótipo de cadeia pesada de imunoglobulina é selecionado do grupo que consiste em IgA1 e IgA2.

[00164] Em uma outra modalidade, o isótipo de cadeia pesada de imunoglobulina é selecionado do grupo que consiste em IgE, IgD e IgM.

[00165] Em uma modalidade, a cadeia pesada de imunoglobulina é de origem mamífera.

[00166] Em uma modalidade, a cadeia pesada de imunoglobulina é de origem primata ou murina, tal como origem humana.

[00167] Em uma modalidade, pelo menos um dos polipeptídeos da proteína dimérica compreende uma região de ligação que liga especificamente em um alvo.

[00168] Em uma modalidade adicional, tanto o primeiro quanto segundo polipeptídeo compreende uma região de ligação, tal como uma região de ligação de antígeno, especificamente ligação em um alvo. A região de ligação, tal como uma região de ligação de antígeno, do primeiro e segundo polipeptídeos podem ligar no mesmo alvo, opcionalmente em epítopos diferentes do mesmo alvo, ou eles podem ligar em alvos diferentes.

[00169] As regiões de ligação do primeiro e/ou segundo polipeptídeo podem ser regiões de ligação de antígeno.

[00170] A dita região de ligação pode ligar qualquer alvo, em que o alvo pode, por exemplo, ser uma molécula presente em uma célula, bactéria, parasita ou vírion.

[00171] Em uma modalidade particular, o alvo pode ser um antígeno.

[00172] Em uma modalidade adicional o dito antígeno pode ser expresso na superfície de uma célula, tal como uma célula de tumor de humano.

[00173] Em uma modalidade, o dito antígeno é associado com uma membrana da célula.

[00174] Em uma outra modalidade, o dito antígeno é associado com um vírion, opcionalmente em que o antígeno é compreendido no revestimento da proteína ou em um envelope de lipídio do vírion.

[00175] Em uma modalidade adicional, o alvo no qual regiões de ligação se ligam pode ser um antígeno expresso na superfície de uma célula bacteriana ou um vírion.

[00176] Em uma outra modalidade, a célula bacteriana é selecionada do grupo que consiste em S. aureus, S. epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides e Mycobacterium tuberculosis.

[00177] Exemplos de alvos ou antígenos incluem, mas sem limitações: 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; receptor de célula T alfa/beta (TCR); AXL; antígeno antrax ANGPT2; anticorpo antimedicamento (ADA) BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antígeno associado com carcinoma CTAA16,88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD55SC1; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; CRF-1; Cripto; DLL4; receptor de Morte 4; receptor de Morte 5; ED-B; EFNA2; EGFR; receptor B de Endotelina; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; FAS (aka APO-1, CD95); Fc gama RI; FCER2; FGFR3; cadeia beta II de fibrina; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; G-28 glicolipídio; GD1a; GD-2; GM-1; GD3 gangliosídeo; GM3; GDF2; GLP1R; Glipican-3; GPNMB; GRP78; influenza Haemophilus; HBV (vírus da hepatite B); HCMV (humano citomegalovírus); homólogo da proteína 90 de choque térmico [Candida albicans]; glicoproteína gD do vírus simplex da herpes; HGF; HIV-1; laço V3 de HIV-1 IIIB gp120; HLA-DRB (HLA-DR beta); anticorpos anti-humanos de humano (HAHA); anticorpos antimurino de humano (HAMA); vírus sincicial respiratório de humano, glicoproteína F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 biespecífico; IgE, IgE Fc; IGF1R; região de conexão de IGHE; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; subunidade do receptor beta de interleucina-2; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-x; Lewis-y; lipídio A, domínio de lipopolissacarídeo LPS; LTA; lipídio A; Mannan (Candida albicans); MET; proteases microbianas tais como Staphylococcus aureus gluV8 e Streptococcus pyogenes IdeS; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; mielina; NCA-90 antígeno de célula de granulócito; Nectin 4; Neisseria meningitides, NGF; proteína de ligação de octômero contendo domínio não POU (NONO); NRP; NY-ESO-1; O-glicano; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserina; PTK-7; serotipo Pseudomonas aeruginosa IATS O11; RSV (vírus sincicial respiratório de humano, glicoproteína F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; subunidade B de toxina II tipo Shiga [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; ácido lipoteicoico da epiderme de Staphylococcus; pneumonia de Streptococcus; TAF-15; receptor alfa-beta da célula T; Fator do Tecido (TF); TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; Vimentin; erbB1 (EGFR); erbB2 (HER2); erbB3; erbB4; MUC-1; CXCR5; c-Met; proteína envelope HERV; periostina; Bigh3; SPARC; BCR; e MRP3.

[00178] Em uma modalidade adicional, os antígenos podem ser selecionados de CD20, EGFr e CD38, opcionalmente, a proteína dimérica da presente invenção pode ser selecionada de 7D8, 2F8, 003 e 005 conforme descrito aqui compreendendo as posições de aminoácido da maneira definida pela presente invenção. Assim, 7D8, 2F8, 003 e 005, podem ser usados como uma proteína dimérica precursora de acordo com a presente invenção.

[00179] Em uma modalidade, pelo menos um dos polipeptídeos da proteína dimérica, compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00180] Em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção é um anticorpo.

[00181] Em uma modalidade adicional, em que a proteína dimérica é um anticorpo, um ou ambos, tal como cada qual, do primeiro e segundo polipeptídeos compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina para formar uma primeira e uma segunda região de ligação de antígeno, opcionalmente ligando no mesmo antígeno.

[00182] Em uma outra modalidade, em que a proteína dimérica é um anticorpo, um ou ambos, tal como cada qual, do primeiro e segundo polipeptídeos compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina associada com uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo regiões variáveis e constantes de cadeia leve para formar uma primeira e uma segunda região de ligação de antígeno, opcionalmente ligando no mesmo antígeno. Em uma modalidade como essa, deve-se entender que os ditos primeiro e segundo polipeptídeos compreendendo regiões variáveis e constantes de cadeia pesada de imunoglobulina são associados com uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo regiões variáveis e constantes de cadeia leve por ligações de dissulfeto intercadeia entre os domínios constantes da dita cadeia pesada e a dita cadeia leve e, por meio disso, formando uma primeira e uma segunda região de ligação de antígeno, opcionalmente ligando no mesmo antígeno.

[00183] Em uma modalidade adicional, em que a proteína dimérica é um anticorpo, um ou ambos dos polipeptídeos compreendem uma região constante de cadeia pesada de comprimento total, tal como uma região constante de cadeia pesada de comprimento total de IgG1 de humano.

[00184] As regiões CH2 e CH3 do primeiro e/ou segundo polipeptídeos podem, exceto pelas posições de aminoácido definidos pela presente invenção, compreender aminoácidos 114-223 e 224-330, respectivamente, da SEQ ID NO:1; aminoácidos 111-219 e 220-326, respectivamente, da SEQ ID NO:2; aminoácidos 161-270 e 271-377, respectivamente, da SEQ ID NO:3; aminoácidos 111-220 e 221-327, respectivamente, da SEQ ID NO:4; ou aminoácidos 114-223 e 224-330, respectivamente, da SEQ ID NO:5.

[00185] Os ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos podem compreender adicionalmente uma região articulada, em que a dita região articulada compreende aminoácidos 99-113 da SEQ ID NO:1; aminoácidos 99-110 da SEQ ID NO:2; aminoácidos 99-160 da SEQ ID NO:3; aminoácidos 99-110 da SEQ ID NO:4; ou aminoácidos 99-113 da SEQ ID NO:5.

[00186] Os primeiro e/ou segundo polipeptídeo podem, exceto pelas posições de aminoácido definidas pela presente invenção, compreender uma sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, e 5.

[00187] A proteína dimérica da presente invenção pode, em uma modalidade particular, da maneira descrita anteriormente, ser um anticorpo. Além disso, a proteína dimérica, por exemplo, um anticorpo, pode também ser preparada introduzindo mutações em uma proteína dimérica precursora, por exemplo, um anticorpo precursor, nos aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, e um aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254. Os exemplos de anticorpos podem assim referir-se a “um anticorpo da presente invenção” ou “um anticorpo variante da presente invenção”, e um “anticorpo precursor”

[00188] Exemplos de anticorpos adequados incluem, mas sem limitações, anticorpos de cadeia pesada de anticorpos monovalentes, consistindo somente em duas cadeias pesadas e de ocorrência natural, por exemplo, em camelídeos (por exemplo, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), domínio projetado por troca de fita (SEED ou Seed-body) que são assimétricos e moléculas tipo anticorpo biespecífico (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); HeΔCfr *Tgigpgtqp, YQ42323739;4+, Azymetric Scaffold (Zymeworks/Merck, WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011/028952), Imunoglobulina de domínio variável duplo (Abbott, DVD-Ig, No. de patente U.S. 7.612,181); Anticorpos de cabeça dupla de duplo domínio (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Di- diacorpo (ImClone/Eli Lilly), formatos de anticorpo saliências em buracos (Genentech, WO9850431); DuoBody (Genmab, WO 2011/131746); formatos de anticorpo de direção eletrostática (Amgen, EP1870459 e WO 2009089004; Chugai, US201.000155133; Oncomed, WO2010129304A2); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAbs (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), anticorpos de domínio de duplo alvejamento (GSK/Domantis), anticorpos dois em um que reconhecem dois alvos (Genentech, NovImmune), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), CovX-body (CovX/Pfizer), biespecíficos tipo IgG (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 6574), e DIG-body e PIG-body (Pharmabcine), e moléculas de alvejamento de dupla afinidade (Fc-DART ou Ig-DART, por Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538), Zycorpos (Zyngenia), abordagens com cadeia leve comum (Crucell/ Merus, US7262028) ou cadeias pesadas comuns (mnBodies da NovImmune), bem como proteínas de fusão compreendendo uma sequência de polipeptídeos fundida com um fragmento de anticorpo contendo um domínio Fc tipo fusões de scFv, tipo BsAb da ZymoGenetics/BMS), HERCULES da Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS da Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), fusão de scFv da Novartis, fusão de scFv da Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb da Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb2 da f-Star (WO2008/003116) fusões duplas de scFv, um minianticorpo, e um duplo alvejamento (DT)-Ig anticorpo. Deve-se também entender que o termo anticorpo, a menos que de outra forma especificada, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (tais como anticorpos monoclonais de humano), misturas de anticorpo (policlonais recombinantes), por exemplo, gerados por tecnologias explicadas por Symphogen and Merus (Oligoclonics), e polipeptídeos tipo anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo assim gerado pode potencialmente possuir qualquer isótipo.

[00189] O anticorpo precursor ou um anticorpo da presente invenção pode ser preparado de formatos de anticorpos tipo selvagem ou anticorpo de ocorrência não natural como qualquer daqueles descritos aqui, por exemplo, proteínas heterodiméricas, que são usadas como material de partida no qual as modificações relevantes de acordo com a presente invenção, são introduzidas. Os anticorpos da presente invenção podem, por exemplo, ser produzidos pelo primeiro método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante. Anticorpos monoclonais podem também ser isolados de biblioteca de anticorpo fago usando a técnica descrita, por exemplo, em Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991). Anticorpos monoclonais podem ser obtidos de qualquer fonte adequada.Assim, por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser obtidos de hibridomas preparados de células B esplênicas de murino obtidas de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo, na forma de células que expressam o antígeno na superfície, ou um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Anticorpos monoclonais podem também ser obtidos de hibridomas derivados de células que expressam anticorpo de mamíferos humanos ou não humanos imunizados tais como coelhos, ratos, cães, primatas, etc.

[00190] O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo de humano. Anticorpos monoclonais de humano podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos, por exemplo, camundongos HuMAb, que carregam partes do sistema imune de humano sem ser aquele do sistema de camundongo. O camundongo HuMAb contém um minilocus do gene de imunoglobulina de humano que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada *μ g y+ g ngxg K fg jwocpq p«q rearranjadas, junto com mutações alvejadas que inativam a loci de cadeia μ e k endógenos (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856 859 (1994)). Dessa maneira, os camundongos apresentam reduzida expressão de IgM de camundongo ou k e em resposta a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve de humano introduzidos, passam por comutação de classe e mutação somática para gerar cpvkeqtrqu oqpqenqpcku k fg IgG de humano de alta afinidade, (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAb é descrita com detalhes em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotecnologia 14, 845 851 (1996). Vide também US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425. US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187. Esplenócitos desses camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais de humano de acordo com técnicas bem conhecida.

[00191] Adicionalmente, anticorpos de humano da presente invenção ou anticorpos da presente invenção de outras espécies podem ser identificados através de tecnologias tipo exibição, incluindo, mas sem limitações, exibição de fago, exibição retroviral, exibição ribossomal, exibição de mamífero, exibição de levedura e outras técnicas conhecidas, e as moléculas resultantes podem ser submetidas a maturação adicional, tal como maturação de afinidade, já que tais técnicas são bem conhecidas.

[00192] O anticorpo não está limitado a anticorpos que têm um domínio natural Fc, por exemplo, de humano, mas ele pode também ser um anticorpo com outras mutações além daquelas da presente invenção, tais como, por exemplo, mutações que afetam glicosilação, ligação de C1q, ligação no receptor Fc, ou permitem que o anticorpo seja um anticorpo biespecífico. Pela expressão “anticorpo natural” deve-se entender qualquer anticorpo que não compreende nenhuma mutação geneticamente introduzida. Um anticorpo que compreende variações de ocorrência natural, por exemplo, diferentes alotipos, é assim entendido como um “anticorpo natural”"no sentido da presente invenção. Tais anticorpos podem servir como um molde ou material de partida, por exemplo, anticorpo precursor, para introduzir as mutações de acordo com a presente invenção, e por meio disso fornecer os anticorpos da invenção. Um exemplo de um anticorpo compreendendo outras mutações daquelas da presente invenção é um anticorpo biespecífico descrito em WO2011/131746 (Genmab), utilizando condições redutoras para promover troca de meia molécula de dois anticorpos compreendendo regiões CH3 correspondidas tipo IgG4, assim formando anticorpos biespecíficos sem formação concomitante de agregados. Outros exemplos de anticorpos incluem, mas sem limitações, anticorpos biespecíficos tais como heterodiméricos bispecíficos: Triomabs (Fresenius); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat Neurosciences Corporation); FcFAdp (Regeneron); Saliências em buracos (Genentech); de direção Eletrostática (Amgen, Chugai, Oncomed); SEEDbodies (Merck); andaime Azimétrico (Zymeworks); mAb- Fv (Xencor); e LUZ-Y (Genentch). Outros formatos exemplares de anticorpo incluem, mas sem limitações, um anticorpo tipo selvagem, um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo contendo Fc, um anticorpo de humano, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00193] Anticorpos monoclonais para uso na presente invenção podem ser produzido, por exemplo, pelo primeiro método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante. Anticorpos monoclonais podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Anticorpos monoclonais podem ser obtidos de qualquer fonte adequada. Assim, por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser obtidos de hibridomas preparados de células B esplênicas de murino obtidas de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo, em forma de células que expressam o antígeno na superfície, ou um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Anticorpos monoclonais podem também ser obtidos de hibridomas derivados de células que expressam anticorpo de mamíferos humanos ou não humanos imunizados tais como ratos, cães, primatas, etc.

[00194] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de humano.Anticorpos monoclonais de humano direcionados para qualquer antígeno podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que carregam partes do sistema imune de humano sem ser o sistema de camundongo. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundongos HuMAb® e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como “camundongos transgênicos".

[00195] O camundongo HuMAb® contém um miniloci do gene de imunoglobulina de humano que codifica sequências de imunoglobulina de ecfgkc rgucfc *μ g 7) g ngxg K de humano não rearranjada, junto com mutações alvejadas que inativam o loci de cadeia - g K gpf„igpq (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Dessa maneira, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM de camundongo ou k e, em resposta a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve de humano introduzidos, passam por comutação da classe e mutação somática para gerar IgG de humano de alta afinidade, cpvkeqtrqu oqpqenqpcku k (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAb® é descrita com detalhes em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotecnologia 14, 845-851 (1996). Vide também US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.

[00196] Os camundongos HCo7, HCo12, HCo17 e HCo20 têm um rompimento de JKD em seus genes de cadeia leve (kappa) endógenos (conforme descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), um rompimento de CMD em seus genes de cadeia pesada endógenos (conforme descrito no Exemplo 1 de WO 01/14424), e um transgene de cadeia leve kappa de humano KCo5 (conforme descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Adicionalmente, os camundongos Hco7 têm um transgene de cadeia pesada de humano HCo7 (conforme descrito em US 5.770.429), os camundongos HCo12 têm um transgene de cadeia pesada de humano HCo12 (conforme descrito no Exemplo 2 de WO 01/14424), os camundongos HCo17 têm um transgene de cadeia pesada de humano HCo17 (conforme descrito no Exemplo 2 de WO 01/09187) e os camundongos HCo20 têm um transgene de cadeia pesada de humano HCo20. Os camundongos resultantes expressam transgene de cadeia pesada e leve kappa de imunoglobulina de humano em um homozigoto de fundo para rompimento do loci de cadeia pesada e leve kappa de camundongo endógeno.

[00197] Na cepa de camundongo KM, o gene de cadeia leve kappa de camundongo endógeno foi homozigotamente rompido conforme descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) e o gene de cadeia pesada e camundongo endógeno foi homozigotamente rompido conforme descrito no Exemplo 1 de WO 01/09187. Esta cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve kappa de humano, KCo5, conforme descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de camundongo também carrega um transcromossomo de cadeia pesada de humano composto de 14 fragmentos de cromossomo hCF (SC20) conforme descrito em WO 02/43478. Camundongos HCo12-Balb/C podem ser gerado por cruzando HCo12 em KCo5[J/K](Balb), conforme descrito em WO/2009/097006. Esplenócitos desses camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais de humano de acordo com técnicas bem conhecidas.

[00198] Adicionalmente, quaisquer regiões de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidas de anticorpos de humano ou anticorpos de outras espécies identificadas através de tecnologias tipo exibição, incluindo, mas sem limitações, exibição de fago, exibição retroviral, exibição ribossomal, e outras técnicas, usando técnicas bem conhecidas e as moléculas resultantes podem ser submetidas a maturação adicional, tal como maturação de afinidade, já que tais técnicas são bem conhecidas na (vide, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (exibição de fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (exibição de fago), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (exibição ribossomal), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (exibição de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), e US 5.733.743). Se tecnologias de exibição forem utilizadas para produzir anticorpos que não são de humano, tais anticorpos podem ser humanizados.

[00199] A proteína dimérica, por exemplo, anticorpo da presente invenção pode compreender cadeia pesada de IgG1 de humano compreendendo, exceto pelas mutações descritas aqui, a sequência da SEQ ID NO: 1 (UniProt No. de acesso P01857), tal como compreendendo o segmento relevante, I253 a K447, por exemplo, P247 a K447, correspondente a os resíduos sublinhados 136 a 330, por exemplo, 130 a 330, da região constante de cadeia pesada de IgG1 de humano; SEQ ID NO:1: 1 astkgpsvfp apsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslsswt vpssslgtqt yicnvnhkps πtkvdkkvep 101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmlsrtp evtcvwdvs 151 hedpevkfnw yvdqvevhna ktkpreeqyπ styrvvsvlt vlhqdwlnqk 201 evkckvsπka Ipapiektis kakqqprepq vytlppsrde Itknqvsltc 251 Ivkgfypsdl avewesngqp eππykttppv IdsdgsfTIv skltvdksrw 301 qqqnvfscgv mheglhπhyt qkslslspqk

[00200] O alotipo do IgG1 referenciado anteriormente é IgG1m(za). O domínio CH1, região articulada, domínio CH2 e domínio CH3 na SEQ ID NO:1 são, para a presente invenção, aminoácidos 1-98, 99-113, 114-223 e 224-330, respectivamente. O domínio CH1, região articulada, domínio CH2 e domínio CH3, quando numerados de acordo com numeração Eu apresentada em Kabat, são numerados como aminoácidos 118-215, 216-230, 231-340, e 340-447, respectivamente.

[00201] A proteína dimérica, por exemplo, anticorpo da presente invenção pode também compreender uma cadeia pesada de IgG2 de humano compreendendo, exceto pelas mutações descritas aqui, a sequência da SEQ ID NO:2. Resíduos de aminoácidos I253 a K447, por exemplo, P247 a K447, de cadeia pesada de IgG1 correspondem aos resíduos sublinhados 132 a 326, por exemplo, 126 a 326, da região constante de cadeia pesada de IgG2 (número de acesso P01859; SEQ ID NO:2) 1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssnfgtqt ytcnvdhkps πtkvdktver 101 kccvecppcp appvagpsvf Ifppkpkdtl misrtpevtc vvvdvshedp 151 evqfnwyvdg vevhnaktkp rβeqfnstfr vvsvltvvhq dwlngkeykc 201 kvsnkqlpap iektisktkq qpretxjvytl ppsreemtkn qvsltclvkg 251 fypsdidvew esngαoennv kttppmldsd qgfflvsklt vdksrwqqgn 301 vfscsvmhea Ihnhvtαksl slspgk

[00202] O domínio CH1, região articulada, domínio CH2 e domínio CH3 na SEQ ID NO:2 são, para a presente invenção, aminoácidos 1-98, 99110, 111-219 e 220-326, respectivamente.

[00203] A proteína dimérica, por exemplo, anticorpo, da presente invenção pode também compreender uma cadeia pesada de IgG3 de humano compreendendo, exceto pelas mutações descrias aqui a sequência da SEQ ID NO:3. Resíduos de aminoácidos I253 a K447, por exemplo, P247 a K447, de cadeia pesada de IgG1 correspondem aos resíduos 183 a 377, por exemplo, 177 a 377, da região constante de cadeia pesada de IgG3 (UniProt No. de acesso P01860, SEQ ID NO:3), sublinhada da seguinte maneira: 1 astkgpsvfp lapcsrstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgw 51 htfjpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt ytcnvnhkps ntkvdkrvel 101 ktplgdttht cprcpepksc dtpppcprcp epkscdtppp cprcpepksc 151 dtpppcprcp apellggpsv flfppkpkdt Imisrtpevt cvvvdvshed 201 pevqfkwYvd qvevhπaktk preeqyπstf rvvsvltvlh qdwlnqkeyk 251 çkvgnkalDa pigktigktk qqprepqvyt Ippgreemtk nqvsltclvk 301 qfypsdiave wessqqpenn vπttppmlds dqsfflyskl tvdksrwqqq 351 πlfccsvmhe glhnrftqks Iglgpqk

[00204] O domínio CH1, região articulada, domínio CH2 e domínio CH3 na SEQ ID NO:3 são, para a presente invenção, aminoácidos 1-98, 99160, 161-270 e 271-377, respectivamente.

[00205] A proteína dimérica, por exemplo, anticorpo, da presente invenção pode também compreender uma cadeia pesada de IgG4 de humano compreendendo, exceto pelas mutações descritas aqui, a sequência da SEQ ID NO:4. Resíduos de aminoácidos I253 a K447, por exemplo, P247 a K447, de cadeia pesada de IgG1 correspondem aos resíduos sublinhados 133 a 327, por exemplo, 127 a 327, da região constante de cadeia pesada de IgG4 (número de acesso P01859, SEQ ID NO:4) 1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslsswt vpssslgtkt ytcnvdhkps ntkvdkrves 101 kygppcpscp apeflggpsv flfppkpkdt Imisrtpevt çvvvçlvscied 151 pevqfnwyvd qvevhnaktk preeqfnstv rvvsvltvlh qdwlnqkeyk 201 ckvsnkglps siektiskak gqprepqvyt Ippsqeemtk nqvsltclvk 251 gfyπsdiave wesngqpenn ykttppvlds dgsfflysrl tvdksrwqeg 301 nvfsc$vmhe alhnhytcjks Iglslgk

[00206] O domínio CH1, região articulada, domínio CH2 e domínio CH3 na SEQ ID NO:4 são, para a presente invenção, aminoácidos 1-98, 99110, 111-220 e 221-327, respectivamente.

[00207] A proteína dimérica, por exemplo, anticorpo, da presente invenção pode também compreender uma cadeia pesada do alotipo IgG1m(f) de humano compreendendo, exceto pelas mutações descritas aqui, a sequência da SEQ ID NO:5. Resíduos de aminoácidos I253 a K447 de cadeia pesada do alotipo IgG1m(f) correspondem aos resíduos sublinhados 136-330 da SEQ ID NO:5 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv Si htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep 101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs 151 hedpevkfnw yvdqvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqçlwlnqk 201 evkckvsnka Ipaplektis kakαqprepq vvtlDPsree mtkπαvsltc 251 Ivkofvpsdi avewesnqqp ennykttppv Idsdosfflv skltvdksrw 301 qqqnvfscsv mhealhnhvt qkslslspqk

[00208] O domínio CH1, região articulada, domínio CH2 e domínio CH3 na SEQ ID NO:5 são, para a presente invenção, aminoácidos 1-98, 99113, 114-223 e 224-330, respectivamente.

[00209] A proteína dimérica da presente invenção pode ser de um outro alotipo de imunoglobulinas de IgG1 de humano, tais como IgG1m(a), IgG1m(z) e IgG1m(x). Foi descrito que tais alotipos contêm aminoácido diferente em uma ou mais posições correspondentes a posições 214, 356, 358, e 431 de acordo com numeração Eu apresentada em Kabat.

[00210] Um alinhamento dos respectivos segmentos das regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG1m(f), IgA1, IgA2, IgE, IgD e IgM é mostrado na figura 2. Dessa maneira, qualquer posição de aminoácido, ou mutação em uma posição de aminoácido, descrita aqui como correspondente a uma posição de aminoácido em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, pode ser identificada ou introduzida na sua posição equivalente em IgG2, IgG3, IgG4, IgG1m(f), IgA1, IgA2, IgE, IgD e IgM da maneira definida pelo alinhamento na figura 2 para obter uma proteína dimérica de acordo com a invenção.

[00211] Em qualquer aspecto ou modalidade de uma proteína dimérica da presente invenção, o primeiro e/ou segundo polipeptídeo da proteína dimérica podem compreender a sequência de resíduos 130 a 330 da SEQ ID NO:1, resíduos 126 a 326 da SEQ ID NO:2, resíduos 177 a 377 da SEQ ID NO:3, resíduos 127 a 327 da SEQ ID NO:4, ou resíduos 130 a 330 da SEQ ID NO:5.

[00212] Em uma modalidade, o primeiro e/ou segundo polipeptídeo da proteína dimérica compreendem uma sequência selecionados da SEQ ID No.: 1-5, tais como SEQ ID No.:1, SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.:4, ou SEQ ID No.:5.

[00213] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de humano de comprimento total, tais como um anticorpo de humano de comprimento total de IgG1.

[00214] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgG1 de humano, por exemplo, o alotipo IgG1m(za) ou IgG1m(f), opcionalmente em que o primeiro e/ou segundo polipeptídeo, por exemplo, ambos polipeptídeos, compreendem, exceto pelas mutações descritas aqui, SEQ ID NO:1 ou 5. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de humano que pode ser qualquer dos alotipos conhecidos neste isótipo.

[00215] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2 de humano, opcionalmente em que o primeiro e/ou segundo polipeptídeo, por exemplo, ambos polipeptídeos, compreendem SEQ ID NO:2.

[00216] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgG3 de humano, opcionalmente em que o primeiro e/ou segundo polipeptídeo, por exemplo, ambos polipeptídeos, compreendem SEQ ID NO:3.

[00217] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4 de humano, opcionalmente em que o primeiro e/ou segundo polipeptídeo, por exemplo, ambos polipeptídeos, compreendem SEQ ID NO:4.

[00218] Em modalidades particulares de qualquer proteína dimérica da presente invenção, o primeiro e/ou segundo polipeptídeo, por exemplo, ambos polipeptídeos, da proteína dimérica compreendem uma sequência de aminoácido que tem um grau de identidade para aminoácidos P247 a K447, por exemplo, I253 a K447, da SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 e 5 de pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou de pelo menos cerca de 99%, exceto pelas posições de aminoácido definidos pela presente invenção.

[00219] Assim, o primeiro e/ou segundo polipeptídeo, por exemplo,ambos polipeptídeos, da proteína dimérica podem compreender uma sequência de acordo com SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No: 4, ou SEQ ID No:5, exceto por qualquer resíduo de aminoácido da presente invenção e definido aqui.

[00220] Os inventores da presente invenção observaram que sete anticorpos nos quais os aminoácidos E, E e S nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 de uma cadeia pesada de IgG1 de humano foram substituídos com os aminoácidos R, G e Y, respectivamente, são capazes de formar estruturas hexaméricas não covalentes em solução.

[00221] Consequentemente, em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção é predominantemente em forma oligomérica, tal como forma hexamérica, em um tampão de fosfato a um pH de cerca de 6,8.

[00222] Consequentemente, em uma modalidade, uma proteína dimérica da presente invenção é capaz de formar uma estrutura hexamérica não covalente nas condições descritas no exemplo 20 ou 23, por exemplo, em uma solução de fosfato de sódio 12,6 mM, NaCl 140 mM a pH 7,4, ou em uma solução de Na2SO4 0,1 M, fosfato de sódio 0,1 M a pH 6,8, ou em uma solução de NaCl 0,15 M, tampão de citrato 0,1M a pH 6,8. No contexto da presente invenção a expressão “capaz de formar estrutura hexamérica não covalente” significa que mais que 30%, tal como mais que 40%, ou mais que 50%, ou mais que 60%, ou mais que 70%, ou mais que 80%, ou mais que 85%, ou mais que 90%, ou mais que 95% das proteínas diméricas, por exemplo, anticorpos são em uma estrutura hexamérica não covalente, determinada conforme descrito no Exemplo 20. Em uma modalidade adicional, a proteína dimérica da presente invenção não é capaz de formar estrutura não covalente em uma solução de NaCl 0,15 M, tampão de citrato 0,1M a pH 5,0. A expressão “não é capaz para formar estrutura hexamérica não covalente” significa no contexto da presente invenção que menos que 10%, tal como menos que 8%, ou menos que 7%, ou menos que 6%, ou menos que 5%, ou menos que 4%, ou menos que 3%, ou menos que 2%, ou menos que 1%, ou menos que 0,5% das proteínas diméricas, por exemplo, anticorpos, são em uma estrutura hexamérica não covalente, determinada conforme descrito no Exemplo 20. Assim, em uma modalidade, a estrutura hexamérica pode ser determinada realizando fracionamento de HP-SEC (cromatografia de exclusão de tamanho de alta pressão) usando uma resina de cromatografia de exclusão de tamanho adequada com um tamanho de poro capaz de separar moléculas na faixa de 50 kDa a 1.000 kDa, conectadas em um detector de absorbância; separando em amostras de 50 μL contendo 1,25 μg/mL de proteína a 1 mL/minuto em NébSO.i 0,1 M/fosfato de sódio 0,1 M tamponados a pH 6,8; usando software adequado para processar resultados; e expressando por pico como porcentagem de área de pico total.

[00223] A capacidade de uma proteína dimérica da presente invenção formar um oligomérico, por exemplo, uma estrutura hexamérica torna a proteína dimérica adequada para alvos de ligação não somente presente em uma célula mas, também alvos solúveis. Assim, a proteína dimérica da presente invenção pode, por exemplo, ser usada para remover fatores solúveis, por exemplo, toxinas bacterianas, ou outros fatores não desejados, da corrente sanguínea, tais como componentes do complemento, por exemplo, C1q.

[00224] Fenotipagem de eritrócitos, tal como determinação do estado Rhesus D, é importante em caso de transfusões de sangue e para determinar o risco de doença hemolítica de um recém-nascido. Para a fenotipagem de eritrócitos atualmente, anticorpos de IgG monoclonais são usados em um teste de laboratório, por exemplo, Teste de Coombs. Entretanto, muitos dos IgGs usados nesses ensaios induzem aglutinação fraca. No lugar de IgG, estruturas oligoméricas, por exemplo, estruturas hexaméricas, das proteínas diméricas da presente invenção podem ser usadas como reagente em ensaios de fenotipagem. O uso de uma estrutura oligomérica estável, tal como uma hexamérica, das proteínas diméricas da presente invenção para fenotipagem de eritrócito pode ter diversas vantagens, tal como a estrutura oligomérica poderia por si mesmo induzir ligação cruzada de células eliminando a necessidade de um anticorpo secundário, poderia melhorar a sensibilidade do ensaio, e duas ou mais proteínas diméricas com diferentes regiões de ligação poderiam ser usadas para fenotipagem de múltiplos antígenos de eritrócito simultaneamente. Assim, em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção pode ser usada para fenotipagem de eritrócitos. Em uma modalidade, duas ou mais, tais como três, quatro, cinco ou sete, proteínas diméricas da presente invenção com diferentes regiões de ligação podem ser usadas para fenotipagem de múltiplos antígenos de eritrócito.

[00225] Em uma modalidade adicional, a proteína dimérica da presente invenção tem uma maior função efetora comparada com uma proteína dimérica precursora. A proteína dimérica da presente invenção pode ser considerada uma variante de uma proteína dimérica precursora, em que a variante compreende mutações de aminoácido nas posições 345, 430, e uma mutação de aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254, comparada com a proteína dimérica precursora. Uma proteína dimérica precursora é neste contexto uma proteína dimérica na qual os aminoácidos dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos correspondem àquele de uma cadeia pesada de IgG1 de humano nas posições E345, E430 e aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254, em que a posição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254, corresponde àqueles de uma cadeia pesada de IgG1 de humano nesta posição. Da maneira descrita anteriormente, a proteína dimérica precursora pode ser qualquer isótipo.

[00226] Para um anticorpo, tipicamente, a eficácia do anticorpo pode ser expressa pelo valor de EC50, que é a concentração do anticorpo necessária para obter 50% do efeito máximo. Isto se aplica similarmente a uma proteína dimérica da presente invenção.

[00227] Efeito máximo é o efeito obtido quando uma quantidade de saturação do anticorpo é usada, na qual a saturação visa referir-se à quantidade de anticorpo na qual todos os antígenos para o anticorpo são ligados pelo anticorpo. Esta similaridade aplica uma proteína dimérica da presente invenção.

[00228] A expressão “aumento de uma função efetora” ou “melhora de uma função efetora” refere-se no contexto da presente invenção a uma diminuição no valor de EC50 da proteína dimérica da presente invenção comparada com a proteína dimérica precursora. A diminuição no valor de EC50 pode, por exemplo, ser pelo menos ou cerca de 2 vezes, tal como pelo menos ou cerca de 3 vezes, ou pelo menos ou cerca de 5 vezes, ou pelo menos ou cerca de 10 vezes. Alternativamente."“aumento de uma função efetora”"ou “melhora de uma função efetora”" significa que existe um aumento na quantidade máxima de células lisadas (onde a quantidade total de células é estabelecida a 100%), por exemplo, de 10% a 100% de todas as células, tal como em cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, e cerca de 100% nas condições onde a proteína dimérica precursora lisa menos que 100% de todas as células.

[00229] Uma proteína dimérica poderia ser testada quanto ao aumento ou melhoria da função efetora clonando o domínio variável de cadeia pesada de IgG1-005 ou IgG1-7D8 na proteína dimérica e testando sua eficácia em ensaios de CDC, tal como descrito para Daudi (Exemplo 3) e Wien (Exemplo 6). Em uma modalidade, eficácia de CDC pode ser determinada pré- incubando células de suspensão a uma concentração de 1 x 106 células/mL em placas de 96 poços de base redonda com um anticorpo na faixa de 0,0003 a 30,0 μg/mL de concentração final em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente, adicionando soro de humano normal a uma concentração de 20%, 30% ou 50% da concentração final, incubando a 37°C por 45 minutos, colocando as placas em gelo, adicionando 10 μL de iodeto de propídio, e determinando lise celular por análise de FACS.

[00230] Usando um domínio variável de IgG1-7D8 HC e células Daudi, um aumento seria definido por um EC50 mais que 2 vezes menor do que o EC50 de IgG1-7D8 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes menor que a concentração na qual a lise meio maximal é observada. Usando um domínio variável de IgG1-005 HC e células Daudi, um aumento seria definido por um EC50 mais que 2 vezes menor do que o EC50 de IgG1-005 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes menor que a concentração na qual a lise meio maximal é observada. Usando um domínio variável de IgG1-7D8 HC e células Wien133, um aumento seria definido por um EC50 mais que 2 vezes menor do que o EC50 de IgG1-7D8 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes menor que a concentração na qual a lise meio maximal é observada. Usando um domínio variável de IgG1-005 HC e células Wien133, um aumento seria definido por um aumento na lise maximal variando de 10% a 100% de todas as células, tal como em cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, e cerca de 100%. Um aumento na eficácia de CDC poderia também ser definido por um EC50 mais que 2 vezes menor do que o EC50 de IgG1-005 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes menor que a concentração na qual a lise meio maximal é observada nas condições onde lise celular de Wien133 é detectável.

[00231] Os inventores da presente invenção observaram que um anticorpo em que os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E, E e S, respectivamente têm um menor valor de EC50 para ligação em C1q e um menor valor de EC50 para CDC (vide exemplo 21) comparado com o mesmo anticorpo em que os aminoácidos nas ditas posições são E, E e S, respectivamente.

[00232] Em uma modalidade adicional, uma função efetora, tal como CDC, da proteína dimérica da presente invenção, pode ser aumentada quando a proteína dimérica é ligada no seu alvo em uma célula ou vírion, onde o alvo está presente no vírion ou membrana da célula, comparada com a proteína dimérica precursora.

Outra(s) posição(s) de aminoácido

[00233] Os primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica da presente invenção podem compreender adicionalmente outros aminoácidos específicos na(s) posição(s) indicada(s). Conforme descrito aqui, uma proteína dimérica da presente invenção, por exemplo, um anticorpo, pode ser preparada introduzindo mutações nas posições de aminoácido da maneira especificada pela presente invenção. Exemplos de outras posições de aminoácidos, ou mutações adicionais como essas, incluem posições de aminoácidos onde o aminoácido específico afeta uma ou mais funções efetoras da proteína dimérica. Exemplos de tais aminoácidos incluem resíduos de aminoácido que são capazes de melhorar CDC, ligação de C1q, ligação do receptor de Fc-gama ou ligação de FcRn e/ou melhorar funções efetoras mediadas por receptor de Fc-y

[00234] Exemplos de funções efetoras incluem (i) ligação de C1q, (ii) ativação do complemento, (iii) CDC, (iv) formação de oligômero, (v) estabilidade do oligômero, (vi) citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), (vii) ligação de FcRn, (viii) ligação do receptor de Fc- gama, (ix) fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), (x) citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC), (xi) citotoxicidade melhorada do complemento, (xii) ligação no receptor do complemento de um anticorpo opsonizado mediado pelo anticorpo, (xiii) internalização, (xiv) inframodulação, (xv) indução de apoptose, (xvi) opsonização, (xvii) modulação de proliferação, tais como redução de proliferação, inibição, e estímulo, e (xvii) uma combinação de qualquer de (i) a (xvi), de uma proteína dimérica, tal como um anticorpo quando, por exemplo, ligado no seu antígeno em uma célula, em uma membrana da célula, em um vírion, ou em uma outra partícula.

[00235] Em uma modalidade, uma proteína dimérica de acordo com a invenção, compreende adicionalmente um resíduo de aminoácido, ou uma modificação de um resíduo de aminoácido, que é conhecido por melhorar CDC, por exemplo, uma troca de segmentos entre isótipos de IgG para gerar moléculas de IgG quiméricas (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 386372); uma ou mais substituições de aminoácido na região articulada *FcnnÓCeswc" gv" cn0." 4228" L" Koowpqn" 399." 334;-1138), e/ou uma ou mais substituições de aminoácido no sítio de ligação de C1q, ou próximo a ele, no domínio CH2, centralizado em torno dos resíduos D270, K322, P329, e P331 (Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564; WO 99/51642; Moore et al., 2010 mAbs 2(2), 181-189). Por exemplo, em uma modalidade, uma proteína dimérica de acordo com a invenção, compreende adicionalmente uma combinação de qualquer uma das substituições de aminoácido S267E, H268F, S324T, S239D, G236A e I332E, fornecendo função efetora melhorada por meio de CDC ou ADCC (Moore et al., 2010 mAbs 2(2), 181-189 e WO 2011/091078 A2). Outras mutações de Fc que afetam a ligação nos receptores de Fc (descritas em WO 2006/105062, WO 00/42072, patente U.S. 6.737.056 e patente U.S. 7.083.784) ou propriedades físicas dos anticorpos (descritas em WO 2007/005612 A1) podem também ser usadas nas variantes da invenção.

[00236] Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido empelo menos uma posição correspondente a S267, H268, S324, S239, G236 e I332 pode ser E, F, T, D, A e E, respectivamente.

[00237] Em uma modalidade, uma proteína dimérica de acordo com a invenção, compreende adicionalmente modificações que melhoram a função efetora mediada por ligação do receptor de Fc-gama e/ou receptor de Fc- gama. Tais modificações incluem (i) reduzir a quantidade de fucose na glicosilação anexada no CH2 (glicoprodução) (Aana P, et al., Nat Biotechnol 1999; 17: 176-80; Niwa R, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 6248-55.)), e (ii) mutagênese direcionada ao sítio de aminoácidos nas regiões de dobradiça ou CH2 de anticorpos (produção de proteína) (Lazar GA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 4005-10).

[00238] Em uma outra modalidade, tais mutações adicionais podem ser mutações que inibem ou reduzem as funções efetoras da proteína dimérica. Em aplicações clínicas onde encaixe do sistema imune não é exigido e pode ainda causar efeitos colaterais indesejáveis o primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica podem então ser adicionalmente mutados no domínio CH2 para abolir interações C1q e/ou FcGamaReceptor.

[00239] Alguns resíduos de aminoácido no domínio Fc que desempenham um papel dominante nas interações com C1q e os FcGamaReceptores foram identificados. Posições 234 e 235 mostraram ter um forte efeito de modulação na ligação de Fc de humano em CD64 de humano (Canfield & Morrison, 1991; Chappel et al., 1991; Hezareh et al., 2001), CD32A (Hezareh et al., 2001; Armour et al., 2003), CD16 (Hezareh et al., 2001) e C1q (Xu et al., 2000; Hezareh et al., 2001). A posição 331 de CH2 mostrou ser um determinante principal para ligação de IgG de humano em CD64 de humano (Canfield & Morrison, 1991, J Exp Med.;173 :1483-91) e C1q (Tao et al., 1993; Idusogie et al., 2000) e uma mutação tripla L234F/L235E/P331S causa uma grande diminuição na ligação em CD64, CD32A, CD16 e C1q de humano.

[00240] Com base neste conhecimento, diversas variantes foram descritas para tornar domínio Fc inativo para interações com receptores Fcgama e C1q para desenvolvimento do anticorpo terapêutico.

[00241] Para mutação de IgG1, foram descritos L234A e L235A e P331S (Hezareh M, et al., J Virol 2001, 75:12161-12168, Xu D et al. Cell Immunol 2000, 200:16-26, Shields RL, et al. J Biol Chem 2001, 276:65916604) e L234A combinado com L235A foi usado na clínica (Herold KC, et al.. Diabetes 2005, 54:1763-1769). Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em pelo menos uma posição correspondente a L234, L235 e P331, pode ser A, A, e S, respectivamente.

[00242] Também, foi descrito que mutação dessas mesmas posições para L234F e L235E resulta em domínios Fc com interações anuladas com FcGamaReceptores e C1q (Oganesyan Acta Cryst. (2008). D64, 700--704, Canfield & Morrison, 1991 J Exp Med.;173 :1483-91., Duncan, 1988 Nature 332:738-40). Consequentemente, em uma modalidade, os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 podem ser F e E, respectivamente.

[00243] Mutação na posição D265A mostrou ligação diminuída em todos os receptores de Fci e impediu ADCC (Shields RL et al. J Biol Chem 2001, 276:6591-6604). Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a D265 pode ser A.

[00244] Ligação em C1q poderia ser anulada mutando posições D270, K322, P329, e P331 (Idusogie et al., J Immunol 2000, 164:4178-4184). Mutação dessas posições em qualquer D270A ou K322A ou P329A ou P331A torna o anticorpo deficiente em atividade de CDC. Consequentemente, em uma modalidade, os aminoácidos em pelo menos uma posição correspondente a D270, K322, P329 e P331 pode ser A, A, A, e A, respectivamente.

[00245] Uma abordagem alternativa para minimizar a interação do domínio Fc com Receptores de Fcgama e C1q é por remoção do sítio de glicosilação de um anticorpo. Mutação da posição N297 para, por exemplo, Q, A, e E remove um sítio de glicosilação que é crítico para interações do receptor de IgG-Fcgama (Tao and Morrison, J Immunol. 1989 Oct 15;143(8):2595-601, Bolt S et al., Eur J Immunol 1993, 23:403-411). Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a N297 pode ser Q, A ou E.

[00246] Alternativamente, subclasses de IgG2 e IgG4 de humano são naturalmente comprometidas em suas interações com C1q e FcgamaReceptores. Entretanto, foi descritas interações residuais com FeyTgegrVqtgu (FcgamaReceptores) (Parren et al., J Clin Invest 1992, 90:1537-1546.). Foram descritas mutações anulando essas interações residuais para ambos isótipos e resultam em redução de efeitos colaterais indesejáveis associados com ligação de FcR. Para mutação de IgG2, foram descritos L234A e G237A (Cole MS et al. J Immunol 1997, 159:3613-3621, e, para IgG4, L235E foi descrito (Reddy MP et al., J Immunol 2000, 164:1925-1933). Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a L234 e G237 em uma cadeia pesada de IgG2 de humano pode ser A e A, respectivamente. Em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a L235 em uma cadeia pesada de IgG4 de humano pode ser E.

[00247] Foram descritas outras abordagens para minimizar adicionalmente a interação com FcgamaReceptores e anticorpos IgG2 de C1q em WO 2011/066501 A1 (PCT/US2010/058188) e Lightle, S., et al.; Protein Science (19):753-62 (2010).

[00248] Alternativamente, a região articulada do anticorpo é de importância em relação a interações com FcgamaReceptores e complemento. Foi descrito que mutações na região articulada influenciam funções efetoras de um anticorpo (Brekke et al., J Immunol 2006, 177:1129-335:."FcnnÓCeswc" WF, et al. J Immunol 2006, 177:1129-1138. Tanto mutação quanto deleção da região articulada afetarão as funções efetoras de Fc de um anticorpo.

[00249] Consequentemente, em uma modalidade, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica da presente invenção podem compreender adicionalmente qualquer uma das mutações mencionadas anteriormente que inibem ou reduzem uma ou mais funções efetoras da proteína dimérica.

[00250] Combinação de conjuntos de mutações descritas anteriormente pode resultar em um domínio Fc ainda mais inerte, por exemplo, combinação de mutações L234F, L235E, D265A; ou L234F, L235E, N297Q e D265A em um Domínio Fc de IgG1 ou outras variações geradas pela informação descrita anteriormente. Consequentemente, em uma modalidade, os aminoácidos em pelo menos uma ou uma combinação de posições correspondentes a L234, L235, D265; ou L234, L235, N297 e D265, podem ser F, E, A, F, E, Q e A, respectivamente.

[00251] Em uma modalidade, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos, por exemplo, ambos polipeptídeos da proteína dimérica da presente invenção, podem compreender adicionalmente qualquer combinação das mutações mencionadas anteriormente que inibem ou reduzem uma ou mais funções efetoras da proteína dimérica.

[00252] Tipicamente, o efeito de um anticorpo em uma função efetora pode ser medido pelo valor de EC50, que é a concentração do anticorpo necessária para obter metade do valor da lise maximal. Isto se aplica similarmente a uma proteína dimérica da presente invenção.

[00253] Lise maximal é o efeito obtido quando uma quantidade de saturação do anticorpo é usada, na qual saturação visa referir-se à quantidade de anticorpo na qual todos os antígenos para o anticorpo são ligados pelo anticorpo. Isto se aplica similarmente a uma proteína dimérica da presente invenção.

[00254] Assim, em uma modalidade, o primeiro e/ou Segundo polipeptídeos da proteína dimérica podem compreender, adicionalmente, substituições de aminoácido nas posições de aminoácido correspondentes a L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, que são F, E, e A, respectivamente.

[00255] A expressão “diminuir uma função efetora” refere-se no contexto da presente invenção que existe um aumento no valor de EC50 da proteína dimérica, comparada com a proteína dimérica precursora, em que proteína dimérica precursora tem o significado da maneira descrita anteriormente. O aumento no valor de EC50 pode, por exemplo, ser pelo menos cerca de 2 vezes, tal como pelo menos ou cerca de 3 vezes, ou pelo menos ou cerca de 5 vezes, ou pelo menos ou cerca de 10 vezes. Alternativamente." “diminuir uma função efetora”" significa que existe uma diminuição na quantidade máxima de células lisadas, por exemplo, de 10% a 100% de todas as células, tais como cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, e cerca de 100% nas condições onde a proteína dimérica precursora lisa menos que 100% de todas as células.

[00256] Uma proteína dimérica poderia ser testada quanto a diminuição da função efetora clonando o domínio variável da cadeia pesada de IgG1-005 ou IgG1-7D8 na proteína dimérica e testar sua eficácia em ensaios de CDC, tal como descrito por Daudi (Exemplo 3) e Wien (Exemplo 6). Usando um domínio variável de IgG1-7D8 HC e células Daudi, uma diminuição seria definida por um EC50 mais que 2 vezes maior do que o EC50 de IgG1-7D8 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes maior, cuja concentração na qual a lise meio maximal é observada. Usando um domínio variável de IgG1-005 HC e células Daudi, uma diminuição seria definida por um EC50 mais que 2 vezes maior do que o EC50 de IgG1-005 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes maior que a concentração na qual a lise meio maximal é observada. Usando um domínio variável de IgG1-7D8 HC e células Wien133, uma diminuição seria definidos por um EC50 mais que 2 vezes maior do que o EC50 de IgG1-7D8 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes maior que a concentração na qual a lise meio maximal é observada. Usando um domínio variável de IgG1-005 HC e células Wien133, uma diminuição seria definida por uma diminuição na lise maximal variando de 10% a 100% de todas as células, tais como cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, e cerca de 100%. Uma diminuição na eficácia de CDC poderia também ser definida por um EC50 mais que 2 vezes maior do que o EC50 de IgG1-005 na condição estudada, tal como um valor de EC50 cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais que 10 vezes maior que a concentração na qual a lise meio maximal é observada nas condições onde lise da célula Wien133 é detectável.

[00257] FcRn é um principal receptor relacionado a classe I do complexo de histocompatibilidade e desempenha um papel na distribuição passiva de (Ig)Gs de imunoglobulina de precursora a jovem e no regulamento de níveis de IgG do soro protegendo IgG de degradação intracelular (Ghetie V et al., Annu Rev Immunol. 18, 739-66 (2000)). Uma vez que FcRn é responsável pela persistência prolongada de IgG e outras proteínas conjugadas Fc no soro, modulação da interação FcRn-Fc permitirá o controle deliberado da meia vida desses agentes na circulação para várias finalidades.

[00258] Em uma modalidade, a proteína dimérica pode compreender outros resíduos de aminoácido ou, adicionalmente, tais como substituições de aminoácido, que afetam o perfil farmacocinético, por exemplo, afetando ligação em FcRn.

[00259] Em uma modalidade, a depuração plasmática de formas hexaméricas de proteínas diméricas de acordo com a presente invenção, é diminuída, por exemplo, para permitir menor dosagem e minimizar reações adversas causadas por altas doses, diminuir a frequência de injeção, maximizar transcitose em sítios de tecido específico, melhorar a eficiência de distribuição transplacental, ou diminuir custos de produção.

[00260] Em uma modalidade adicional, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos, por exemplo, ambos polipeptídeos, da proteína dimérica de acordo com a presente invenção, foram adicionalmente modificados, por exemplo, na região CH2 e/ou CH3, por exemplo, para melhorar o perfil farmacocinético, por exemplo, por meio de melhoria da ligação em FcRn, por exemplo, a pH 6,0. Essas modificações incluem, mas sem limitações, mutações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido P238, T250, M252, I253, S254, R255, T256, D265, E272, N286, K288, V303, V305,T307, L309, H310, Q311, D312, K317, K340, D356, K360, Q362, D376,A378, E380, E382, Q386, E388, S400, D413, S415, S424, M428, H433,N434, H435, Y436, K439 ou K447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat (Shields, R.L., et al, J Biol Chem. 9, 6591-826"*4223+."FcnnÓCeswc."Y0H0."gv"cn."L"Koowpqn0"9, 5171-80 (2002), Hinton, P., et al, J Biol Chem. 8, 6213-8"*4226+."FcnnÓCeswc. W.F., et al, J Biol Chem. 33, 23514-24 (2006), Petkova, S.B., et al, Int Immunol. 12, 1759-69 (2006), Datta-Mannan, A., et al, J Biol Chem. 3, 170917 (2007), Yeung, Y.A., J Immunol. 12, 7663-71 (2009), Kabat, E.A. in US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, 5th edition 662, 680, 689 (1991)). Consequentemente, em uma modalidade, no primeiro e/ou segundo, tais como ambos, polipeptídeos da proteína dimérica, um aminoácido em pelo menos uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em P238, T250, M252, I253, S254, R255, T256, D265, E272, N286, K288, V303, V305, T307, L309, H310, Q311, D312, K317, K340, D356, K360, Q362, D376, A378, E380, E382, Q386, E388, S400, D413, S415, S424, M428, H433, N434, H435, Y436, K439 ou K447; não é P, não T, não M, não I, não S, não R, não T, não D, não E, não N, não K, não V, não V, não T, não L, não H, não Q, não D, não K, não K, não D, não K, não Q, não D, não A, não E, não E, não Q, não E, não S, não D, não S, não S, não M, não H, não N, não H, não Y, não K ou não K, para cada posição, respectivamente.

[00261] Ainda em uma modalidade adicional, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos, por exemplo, ambos polipeptídeos da proteína dimérica de acordo com a presente invenção foram adicionalmente modificados para melhorar o perfil farmacocinético, por meio de melhoria da ligação em FcRn pelas mutações específicas N434A (Shields, R.L., et al, J Biol Chem. 9, 6591-604 (2001)), T307A/E380A/N434A (Shields, R.L., et al, J Biol Chem. 9, 6591-604 (2001)), T250Q/M428L (Hinton, P., et al, J Biol Chem. 8, 6213-6 (2004)) ou O474[1U476V1V478G"*FcnnÓCeswc."Y0H0."gv"cn."L"Koowpqn0";." 5171-80 (2002)), em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat (Kabat, E.A. in US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, 5th edition 662, 680, 689 (1991). Consequentemente, em uma modalidade, um aminoácido na posição correspondente a N434 pode ser A. Em uma outra modalidade, aminoácidos em posições correspondentes a T307, E380 e N434 podem ser A, A e A, respectivamente. Em uma outra modalidade, aminoácidos em posições correspondentes a posições T250 e M428 pode ser Q e L, respectivamente. Em uma outra modalidade, aminoácidos em posições correspondentes a M252, S254 e T256 podem ser Y, T e E, respectivamente. Assim, em uma modalidade, o dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica, podem compreender substituições de aminoácido nas posições de aminoácido correspondentes a E345, E430, N434 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, que não são E; não E; A; e Y ou W, respectivamente.

[00262] Em uma modalidade, a proteína dimérica pode compreender uma substituição de um ou mais de P238, T256, T307, Q311, D312, E380, E382 e N434 em um resíduo de alanina melhorando a ligação de FcRn (Shields RL, et al. J. Biol. Chem. 2001;276:6591); ou uma substituição de aminoácido ou combinação de substituições de aminoácido selecionadas de M252Y/S254T/T256E, M252W, M252Y, M252Y/T256Q, M252F/T256D, V308T/L309P/Q311S, G385D/Q386P/N389S, G385R/Q386T/P387R/N389P, H433K/N434F/Y436H, N434F/Y436H, H433R/N434Y/Y436H,M252Y/S254T/T256E-H433K/N434F/Y436H ou M252Y/S254T/T256E- G385R/Q386T/P387R/N389P em IgG1, aumentando a afinidade para FcRn *FcnnÓCeswc"gv"cn0." supra). Consequentemente, em uma modalidade, um ou mais aminoácidos na(s) posição(s) correspondente(s) a posições daqueles selecionados do grupo que consiste em P238, T256, T307, Q311, D312, E380, E382 e N434 podem, para cada polipeptídeo da proteína dimérica, ser um A para cada posição, respectivamente. Em uma outra modalidade, os aminoácidos nas posições correspondentes a M252, S254 e T256 podem ser Y, T e E, respectivamente; ou, na posição correspondente a M252, podem ser W; ou, em uma posição correspondente a M252, podem ser Y; ou, nas posições correspondentes a M252 e T256, podem ser Y e Q, respectivamente; ou, em posições correspondentes a M252 e T256, podem ser F e D, respectivamente; ou, nas posições correspondentes a V308, L309 e Q311, podem ser T, P e S, respectivamente; ou, nas posições correspondentes a G385, Q386 e N389, podem ser D, P e S, respectivamente; ou, nas posições correspondentes a G385, Q386, P387 e N389, podem ser R, T, R e P, respectivamente; ou nas posições correspondentes a H433, N434 e Y436 podem ser K, F e H, respectivamente; ou nas posições correspondentes a N434 e Y436 podem ser F e H, respectivamente; ou, nas posições correspondentes a H433, N434 e Y436, podem ser R, Y e H, respectivamente; ou, nas posições correspondentes a M252, S254, T256, H433, N434 e Y436, podem ser Y, T, E, K, F e H, respectivamente; ou, nas posições correspondentes a M252, S254, T256, G385, Q386, P387 e N389, podem ser Y, T, E, R, T, R e P, respectivamente.

[00263] Em uma modalidade, a meia vida de formas hexaméricas das proteínas diméricas de acordo com a presente invenção, é encurtada, por exemplo, para assegurar rápida depuração de proteínas diméricas usadas para formação de imagem e/ou radioimunoterapia, ou promover depuração de moléculas alvos patogênica.

[00264] Em uma modalidade adicional, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos, por exemplo, ambos polipeptídeos, da proteína dimérica de acordo com a presente invenção, foram adicionalmente modificados, por exemplo, na região CH2 e/ou CH3, por exemplo, para modular o perfil farmacocinético, por exemplo, por meio de redução ou anulação da ligação em FcRn. Essas modificações incluem, mas sem limitações, mutações em qualquer uma ou mais das posições de aminoácido P238, T250, M252, I253, S254, R255, T256, D265, E272, N286, K288, V303, V305, T307, L309, H310, Q311, D312, K317, K340, D356, K360, Q362, D376, A378, E380, E382, Q386, E388, S400, D413, S415, S424, M428, H433, N434, H435, Y436, K439 ou K447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat (Shields, R.L., et al, J Biol Chem. 9, 6591-826"*4223+."FcnnÓAcqua, W.F., et al, J Immunol. 9, 5171-80 (2002), Hinton, P., et al, J Biol Chem. 8, 6213-8"*4226+."FcnnÓCeswc."Y0H0."gv" al, J Biol Chem. 33, 23514-24 (2006), Petkova, S.B., et al, Int Immunol. 12, 1759-69 (2006), Datta-Mannan, A., et al, J Biol Chem. 3, 1709-17 (2007), Yeung, Y.A., J Immunol. 12, 7663-71 (2009), Kabat, E.A. in US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, 5th edition 662, 680, 689 (1991)). Consequentemente, em uma modalidade, um aminoácido em pelo menos uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em P238, T250, M252, I253, S254, R255, T256, D265, E272, N286, K288, V303, V305, T307, L309, H310, Q311, D312, K317, K340, D356, K360, Q362, D376, A378, E380, E382, Q386, E388, S400, D413, S415, S424, M428, H433, N434, H435, Y436, K439 ou K447; não é P; não T; não M; não I; não S; não R; não T; não D; não E; não N; não K; não V; não V; não T; não L; não H; não Q; não D; não K; não K; não D; não K; não Q; não D; não Um; não E; não E; não Q; não E; não S; não D; não S; não S; não M; não H; não N; não H; não Y; não K ou não K, para cada posição, respectivamente.

[00265] Ainda em uma modalidade adicional, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos, por exemplo, ambos polipeptídeos, da proteína dimérica de acordo com a presente invenção, foram adicionalmente modificados para melhorar o perfil farmacocinético, por meio de redução ou anulação da ligação em FcRn pelas mutações específicas I253A, H310A, H433A, H435A, Y436A, mutações I253A/H310A/H435A (Kim, J. K. et al. Eur. J. Immunol. 29, 2819-2825 (1999), Shields, R.L., et al, J Biol Chem. 9, 6591-604 (2001)), em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat (Kabat, E.A. in US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, 5th edition 662, 680, 689 (1991)). Consequentemente, em uma modalidade, um aminoácido em pelo menos uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em I253, H310, H433, H435 e Y436 pode ser A para cada posição, respectivamente. Em uma outra modalidade, os aminoácidos nas posições correspondentes a I253, H310A e H435A podem cada qual ser A.

[00266] Um outro exemplo de outras posições de aminoácido onde o aminoácido específico pode ser relevante, por exemplo, onde uma proteína dimérica precursora é mutada para mudar o aminoácido pode ser aminoácidos que afetam a interação na região Fc entre proteínas diméricas, por exemplo, anticorpos. Tais mutações podem ser usadas para minimizar a interação de uma proteína dimérica terapêutica, por exemplo, anticorpo terapêutico, com anticorpos naturalmente presentes em um paciente em quem a proteína dimérica terapêutica, por exemplo, anticorpo terapêutico, é administrada.

[00267] Tais resíduos ou mutações de aminoácido foram previamente descritos em PCT/EP12/063339, e incluem combinações de dois resíduos ou mutações de aminoácido que diminuem individualmente uma função efetora mas, quando usados juntos, por exemplo, combinando duas proteínas diméricas, cada qual compreendendo um dos ditos resíduos ou mutações de aminoácido da função efetora, são similares a uma proteína dimérica precursora onde o dito resíduo de aminoácido não é mutado assim, eles correspondem àqueles de uma cadeia pesada de IgG1 de humano. Quando duas proteínas diméricas como essas, cada qual compreendendo um de um par de mutações como esse, são usadas juntas, a especificidade para interação entre as ditas duas proteínas diméricas pode ser aumentada, comparada com a interação entre duas proteínas diméricas compreendendo somente uma das mutações de um par de mutações como esse. Similarmente, a interação entre duas proteínas diméricas, cada qual compreendendo um de um par de mutações como esse, pode também ser mais forte que a interação entre uma proteína dimérica compreendendo somente uma das mutações de um par como esse com uma proteína dimérica não compreendendo nenhuma das mutações do par.

[00268] Consequentemente, em uma modalidade, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica da presente invenção podem compreender adicionalmente uma mutação ou resíduo de aminoácido de acordo com este aspecto.

[00269] Assim, sem se ligar a nenhuma teoria, presume-se que,incluindo duas mutações como essas em uma proteína dimérica terapêutica, a indução de ligação de C1q em um paciente será limitada a complexos oligoméricos contendo proteína dimérica terapêutica, por exemplo, anticorpos, compreendendo uma combinação como essa ou o par de aminoácidos. Isto pode permitir uma redução de qualquer efeito colateral potencial causado por interação da proteína dimérica terapêutica com os anticorpos dos próprios pacientes que não compreendem tais mutações.

[00270] Em uma modalidade particular, uma proteína dimérica pode ser usada em combinação com uma outra proteína dimérica, em que cada qual das proteínas diméricas compreende um dos aminoácidos de um “rat” de aminoácidos como esse. Assim, em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma proteína dimérica compreendendo um dos aminoácidos de um “rat” como esse no primeiro e/ou segundo polipeptídeos. Uma proteína dimérica como essa, por exemplo, uma primeira proteína dimérica, compreendendo um aminoácido de um “rat” como esse pode ser usada junto com uma segunda proteína dimérica compreendendo o primeiro e/ou segundo polipeptídeos o outro aminoácido de um “rat” como esse. Exemplos de tais aminoácidos incluem aqueles da tabela 1. Assim, em uma modalidade adicional, um aminoácido em uma posição correspondente a K439, S440, K447, 448 e 449 pode ser, para cada polipeptídeo da proteína dimérica da presente invenção, conforme descrito na tabela 1.Tabela 1

[00271] Combinações específicas de proteína dimérica compreendendo tais aminoácidos podem ser da maneira descrita aqui.

[00272] Assim, em um aspecto adicional da presente invenção, o aminoácido na posição correspondente a K439 é, para um ou ambos, tal como cada qual, polipeptídeo da proteína dimérica, não K.

[00273] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a K439 é E ou D.

[00274] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a K439 é E.

[00275] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a K439 é D.

[00276] Em uma modalidade, no primeiro ou segundo polipeptídeo da proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, K439 e S440, em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, K, Q, N ou Y; G, S, T, F ou H; E ou D; e Y ou W, respectivamente.

[00277] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, K439 e S440, em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R; G; E; e Y, respectivamente.

[00278] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos, o aminoácido na posição correspondente a S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é K ou R.

[00279] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a S440 é K.

[00280] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a S440 é R.

[00281] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos, os aminoácidos na posição correspondente a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R; G; e K, respectivamente.

[00282] Em uma modalidade adicional da presente invenção, pelo menos um aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste em Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é, para um ou ambos, tal como cada qual, polipeptídeo da proteína dimérica não Y; D ou E; T; E; N; Q; I; e S, para cada posição, respectivamente, e o aminoácido na posição correspondente a S440 é K ou R.

[00283] Em uma modalidade adicional, o aminoácido na posição correspondente a Y436 é I, e o aminoácido correspondente a S440 é K.

[00284] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeo, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, Y436 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R; G; I; e K, respectivamente.

[00285] Em uma modalidade, o par de substituições de K439D/E/R e S440D/E/K/R é usado. Assim, em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo compreende K439D/E/R, e o segundo polipeptídeo compreende S440D/E/K/R, ou vice-versa, e em que, no primeiro e/ou segundo polipeptídeos, os aminoácidos correspondentes às posições E345 e E430 não são E. Em uma modalidade adicional, no polipeptídeo compreendendo S440D/E/K/R um dos aminoácidos correspondentes às posições selecionadas do grupo que consiste em Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 não é Y; D ou E; T; E; N; Q; I; e S, para cada posição, respectivamente. Assim, em um outro aspecto da presente invenção, pelo menos um aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste em Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é, para um ou ambos, tal como cada qual, polipeptídeo da proteína dimérica não Y; D ou E; T; E; N; Q; I; e S, para cada posição, respectivamente, e o aminoácido na posição correspondente a S440 não é S, Y ou W.

[00286] Em uma outra modalidade o resíduo de aminoácido na posição correspondente a K447 é, para um ou ambos os polipeptídeos, tal como cada qual, da proteína dimérica D ou E.

[00287] Em uma modalidade adicional, o aminoácido em uma posição correspondente a K447 é D.

[00288] Em uma modalidade adicional, o aminoácido em uma posição correspondente a K447 é E.

[00289] Em uma outra modalidade, o resíduo de aminoácido na posição correspondente a K447 é, para um ou ambos, tal como cada qual do polipeptídeos da proteína dimérica, K, R ou H e os polipeptídeos compreendem: (a) um resíduo de aminoácido na posição 448 que é P; ou (b) um resíduo de aminoácido na posição 448 que é K, R ou H e um resíduo de aminoácido na posição 449 que é P.

[00290] Em uma modalidade adicional, o aminoacido na posicao correspondente a K447 é K.

[00291] Em uma modalidade adicional, o aminoacido na posicao correspondente correspondente a K447 é R.

[00292] Em uma modalidade adicional, o aminoacido na posicao correspondente correspondente a K447 é H.

[00293] Em uma modalidade adicional, o aminoacido na posicao correspondente correspondente a 448 é K.

[00294] Em uma modalidade adicional, o aminoacido na posicao correspondente correspondente a 448 é R.

[00295] Em uma modalidade adicional, o aminoacido na posicao correspondente correspondente a 448 é H.

[00296] Em uma modalidade adicional, o aminoacido na posicao correspondente a Q386 È, para um ou ambos, tal como cada qual, polipeptÌdeo na proteÌna dimÈrica, K.

[00297] Conforme descrito nos exemplos 3-5, variantes dos anticorpos compreendendo somente uma das mutações K439E e S440K teve um KD drasticamente aumentado para C1q, refletindo em uma diminuição da capacidade de ativação do complemento e/ou CDC. Surpreendentemente, observou-se que variantes dos anticorpos de HuMAb 7D8 ou 005 compreendendo ambas mutações tiveram uma ligação de C1q ou CDC restaurada ou aumentada. Sem se ligar a nenhuma teoria específica, o mecanismo subjacente poderia talvez ser explicado pelas respectivas mutações compensando estericamente um com o outro, conforme ilustrado na figura 4.

[00298] Em uma modalidade adicional, um aminoácido em pelo menos uma posição correspondente a L234, L235, G236, G237, S239, P238, T250, M252, I253, S254, R255, T256, D265, S267, H268, D270, E272, N286,K288, N297, V303, V305, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, K317,K322, S324, P329, P331, I332 K340, D356, K360, Q362, D376, A378, E380, E382, G385, Q386, P387, E388, N389, S400, D413, S415, S424, M428,H433, N434, H435, Y436, K439 ou K447 não é, para um ou ambos os polipeptídeos, tal como cada qual, da proteína dimérica, L; não L; não G; não G; não S; não P; não T; não M; não I; não S; não R; não T; não D; não S; não H; não D; não E; não N; não K; não N; não V; não V; não T; não V; não L; não H; não Q; não D; não K; não K; não S; não P; não P; não I; não K; não D; não K; não Q; não D; não A; não E; não E; não G; não Q; não P; não E; não N; não S; não D; não S; não S; não M; não H; não N; não H; não Y; não K e não K, respectivamente.

[00299] Em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção é um homodímero. Assim, em uma modalidade, tanto o primeiro quanto segundo polipeptídeo da proteína dimérica compreende substituições de aminoácido iguais ou idênticas de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção.

Formato heterodimérico

[00300] Em uma outra modalidade, a proteína dimérica da presente invenção é um heterodímero.

[00301] Em uma modalidade adicional, pelo menos um dos polipeptídeos compreende uma região de ligação que liga especificamente em um alvo. Em uma modalidade adicional, cada polipeptídeo da proteína heterodimérica compreende uma região de ligação especificamente ligando em um alvo, opcionalmente o mesmo alvo.

[00302] O alvo pode ser qualquer um daqueles descritos aqui.

[00303] Em uma modalidade adicional, regiões de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo da proteína heterodimérica podem ligar nos epítopos diferentes no mesmo alvo. Em uma outra modalidade, regiões de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo da proteína heterodimérica podem ligar em alvos diferentes.

[00304] Em uma outra modalidade, as regiões de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo da proteína heterodimérica podem ligar em alvos diferentes em células diferentes.

[00305] Em uma modalidade particular, a proteína heterodimérica pode ser um anticorpo biespecífico.

[00306] Em uma modalidade adicional, regiões de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo do dito anticorpo heterodimérico podem ligar em epítopos diferentes os mesmos alvos. Em uma outra modalidade, regiões de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo do dito anticorpo heterodimérico pode ligar em alvos diferentes.

[00307] Em uma outra modalidade, as regiões de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo da proteína heterodimérica podem ligar em alvos diferentes em células diferentes.

[00308] Se a proteína dimérica for uma proteína heterodimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, podem em uma modalidade ser diferentes no primeiro e segundo polipeptídeos, entretanto, eles podem também, em uma outra modalidade, ser os mesmos.

[00309] Os ditos aminoácidos podem, por exemplo, ser diferentes se a proteína heterodimérica for produzida conforme descrito em WO2011/131746.

[00310] O anticorpo biespecífico da presente invenção não é limitado a um formato particular e ele pode ser qualquer um daqueles descritos aqui.

[00311] Moléculas do anticorpo biespecífico exemplares que podem ser usadas na presente invenção compreendem (i) um único anticorpo que tem dois braços compreendendo diferentes regiões de ligação de antígeno, (ii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade para dois epítopos diferentes, por exemplo, por meio de dois scFvs ligados em tandem por um ligante de peptídeo extra; (iii) um anticorpo de domínio variável duplo (DVD- Ig), onde cada cadeia leve e cadeia pesada contém dois domínios variáveis em tandem através de uma curta ligação de peptídeo (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ki™+ Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (iv) um frciogpVq dkgurgeífíeq swkoiecogpVg nkicfq *Hcdó+4; (v) um Tandab, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia única resultando em um anticorpo biespecífico tetravalente que tem dois sítios de ligação para cada qual dos antígenos alvos; (vi) um flexicorpo, que é uma combinação de scFvs com um diacorpo resultando em uma molécula multivalente; (vii) uma assim denominada molécula “atraca e trava”, com base no “domínio de dimerização e docagem” em Proteína Quinase A, que, quando aplicada em Fabs, pode produzir uma proteína de ligação biespecífica trivalente consistindo em dois fragmentos Fab idênticos ligados em um diferente fragmento Fab; (viii) uma molécula assim denominada Scorpion, compreendendo, por exemplo, dois scFvs fundidos em ambas terminações de um braço Fab de humano; e (ix) um diacorpo.

[00312] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo, um corpo cruzado, ou um anticorpo biespecífico obtido por meio de uma troca de braço Fab controlada (tal como descrito em WO 11/131746) como aqueles descritos na presente invenção.

[00313] Exemplos de classes diferentes de anticorpos biespecíficos incluem, mas sem limitações: • moléculas tipo IgG com domínios CH3 complementares para forçar heterodimerização • moléculas de duplo alvejamento tipo IgG recombinantes, em que os dois lados da molécula cada qual contém o fragmento Fab ou parte do fragmento Fab de pelo menos dois diferentes anticorpos; • moléculas de fusão de IgG, em que anticorpos IgG de comprimento total são fundidos em fragmento Fab extra ou partes de fragmento Fab; • moléculas de fusão de Fc, em que moléculas de Fv de cadeia única ou diacorpos estabilizados são fundidas em domínios constantes de cadeia pesada, regiões de Fc ou partes dos mesmos; • moléculas de fusão de Fab, em que diferentes fragmentos de Fab são fundidos juntos, fundidos em domínios constantes de cadeia pesada, regiões de Fc ou partes dos mesmos; • anticorpos baseados em ScFv e diacorpo e de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) em que diferentes moléculas de Fv de cadeia única ou diferentes diacorpos ou diferentes anticorpos de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) são fundidas uma na outra ou em uma outra proteína ou molécula carreador fundida nos domínios constantes de cadeia pesada, regiões de Fc ou partes dos mesmos.

[00314] Exemplos de moléculas tipo IgG com moléculas de domínios CH3 complementares incluem, mas sem limitações, as Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), as saliências em buracos (Genentech), CrossMAbs (Roche) e as correspondidas eletrostaticamente (Amgen, Chugai, Oncomed), as LUZ-Y (Genentech), o corpo de domínio projetado de troca de fita (SEEDbody)(EMD Serono), o Biclonics (Merwu+. HeΔCfr *Tgigpgtqp+. IgG1 e IgG2 biespecíficos (Pfizer/ Rinat), andaime Azimétrico (Zymeworks), mAb-Fv (Xencor), anticorpos biespecíficos bivalentes (Roche) e o DuoBody (Genmab A/S).

[00315] Exemplos de moléculas de duplo alvejamento tipo IgG recombinantes incluem, mas sem limitações, Ig de duplo alvejamento (DT) (GSK/Domantis), Anticorpo dois em um (Genentech), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) e CovX-body (CovX/Pfizer).

[00316] Exemplos de moléculas de fusão de IgG incluem, mas sem limitações, Ig de Domínio Variável Duplo (DVD) (Abbott), biespecíficos tipo IgG (ImClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) e BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) e TvAb (Roche).

[00317] Exemplos de moléculas de fusão de Fc incluem, mas sem limitações, Fusões ScFv/Fc (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Tecnologia de Realvejamento de Afinidade Dupla (Fc-DART) (MacroGenics) e (ScFv)2-Fab Duplo (National Research Center for Antibody Medicine - China).

[00318] Exemplos de anticorpos biespecíficos de fusão de Fab incluem, mas sem limitações, F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Dupla Ação ou Bis-Fab (Genentech), atraca e trava (DNL) (ImmunoMedics), Bispecífico Bivalente (Biotecnol) e Fab-Fv (UCB-Celltech).

[00319] Exemplos de anticorpos a base de ScFv e diacorpo e de domínio incluem, mas sem limitações, Engager Célula T Bisespecífca (BiTE) (Micromet, Tandem Diabody (Tandab) (Affimed), Tecnologia de Realvejamento de Dupla Afinidade (DART) (MacroGenics), Diacorpo de Cadeia Única (Academic), Anticorpos tipo TCR (AIT, ReceptorLogics), Fusão de ScFv Albumina de Soro de Humano (Merrimack) e COMBODY (Epigen Biotech), nanocorpos de duplo alvejamento (Ablynx), cadeia pesada de duplo alvejamento somente anticorpos de domínio.

[00320] Em uma modalidade particular, o anticorpo biespecífico tem formato descrito em WO 2011/131746.

[00321] Assim, em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma proteína heterodimérica de acordo com a presente invenção, em que: o aminoácido em uma posição selecionada de K409, T366, L368, K370, D399, F405, e Y407 não é K, T, L, K, D, F e Y, respectivamente, no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido em uma posição selecionada de F405, T366,L368, K370, D399, Y407, e K409 não é F, T, L, K, D, Y e K,respectivamente, no segundo polipeptídeo.

[00322] Em uma modalidade particular, da proteína heterodimérica, o aminoácido na posição K409 é R no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido na posição F405 é L em o segundo polipeptídeo.

[00323] Dessa maneira, em uma modalidade, as sequências dos ditos primeiro e segundo polipeptídeos contêm resíduos de aminoácido assimétricos ou mutações, isto é, resíduos ou mutações de aminoácido em diferentes posições nos primeiro e segundo polipeptídeos, por exemplo, um aminoácido ou mutação específico na posição 405 em um dos polipeptídeos e um aminoácido específico ou mutação na posição 409 no outro polipeptídeo. Referência aos primeiro e segundo polipeptídeos a este respeito não deve ser entendido como limitante, uma vez que os resíduos ou mutações de aminoácido podem similarmente estar presentes no polipeptídeo oposto. Assim, por exemplo, o aminoácido na posição F405 é L no dito primeiro polipeptídeo, e o aminoácido na posição K409 é R no dito segundo polipeptídeo; ou vice-versa, o aminoácido na posição K409 é R no dito primeiro polipeptídeo, e o aminoácido na posição F405 é L no dito segundo polipeptídeo.

[00324] Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, tais como Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste em: 366, 368, 370, 399, 405 e 407, em que o dito aminoácido não é T, L, K, D, F, e Y. Em uma tal modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Phe na posição 405, por exemplo, Lys, Leu, Met, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Tyr, Trp ou Cys. Em uma modalidade adicional, destes, o dito primeiro polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Phe, Arg ou Gly, por exemplo, Lys, Leu, Met, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Pro, Ala, Val, Ile, Tyr, Trp ou Cys, na posição 405.

[00325] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo compreende um aminoácido sem ser Phe, por exemplo, Lys, Leu, Met, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Tyr, Trp ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma modalidade adicional, destes, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo compreende um aminoácido sem ser Phe, Arg ou Gly na posição 405, por exemplo, Lys, Leu, Met, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Pro, Ala, Val, Ile, Tyr, Trp ou Cys, e um Lys na posição 409.

[00326] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Phe na posição 405 e um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo compreende um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma modalidade adicional, destes, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo compreende um aminoácido sem ser Phe, Arg ou Gly, por exemplo, Lys, Leu, Met, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Pro, Ala, Val, Ile, Tyr, Trp ou Cys, na posição 405 e um Lys na posição 409. Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo compreende Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo compreende um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409.

[00327] Em uma modalidade adicional, o dito primeiro polipeptídeo compreende um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405. Em uma modalidade adicional, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00328] Ainda em uma modalidade adicional, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo compreende um Lys na posição 409, um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00329] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo compreende um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00330] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00331] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Thr na posição 350, um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo compreende um Lys na posição 409 e: a) um Ile na posição 350 e um Leu na posição 405, ou b) um Thr na posição 370 e um Leu na posição 405.

[00332] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo compreende um Thr na posição 350, um Lys na posição 370, um Phe na posição 405 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo compreende um Ile na posição 350, um Thr na posição 370, um Leu na posição 405 e um Lys na posição 409.

[00333] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407, por exemplo, His, Asn, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Trp, Leu, Met ou Cys. Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407.

[00334] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407.

[00335] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407, por exemplo, His, Asn, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Trp, Leu, Met ou Cys, e um Lys na posição 409.

[00336] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00337] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um Tyr na posição 407 e um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o dito segundo polipeptídeo tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00338] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ou Thr na posição 407, por exemplo, His, Asn, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Trp, Leu, Met ou Cys e um Lys na posição 409.

[00339] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo tem um Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00340] Em uma outra modalidade, o dito primeiro polipeptídeo tem um Tyr na posição 407 e um Arg na posição 409 e o dito segundo polipeptídeo tem um Gly, Leu, Met, Asn ou Trp na posição 407 e um Lys na posição 409.

[00341] Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo tem um aminoácido sem ser Lys, Leu ou Met na posição 409, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp ou Cys, e o segundo polipeptídeo tem (i) um aminoácido sem ser Phe, Leu e Met na posição 368, por exemplo, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Lys, Tyr, Trp ou Cys ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um aminoácido sem ser Asp, Cys, Pro, Glu ou Gln na posição 399, por exemplo, Arg, His, Ser, Thr, Asn, Gly, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Leu, ou Met, ou (iv) um aminoácido sem ser Lys, Arg, Ser, Thr, ou Trp na posição 366, por exemplo, Leu, Met, His, Asp, Glu, Asn, Glu, Gly, Pro, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr ou Cys.

[00342] Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo tem um Arg, Ala, His ou Gly na posição 409, e o segundo polipeptídeo tem: (i) um Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399 ou (iv) um Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, ou Tyr na posição 366.

[00343] Em uma modalidade, o primeiro polipeptídeo tem um Arg na posição 409, e o segundo polipeptídeo tem (i) um Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val, ou Trp na posição 368, ou (ii) um Trp na posição 370, ou (iii) um Phe, His, Lys, Arg ou Tyr na posição 399, ou (iv) um Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln na posição 366.

[00344] Além das substituições de aminoácido especificadas anteriormente, os ditos primeiro e segundo polipeptídeos podem conter adicionalmente substituições, deleção ou inserções de aminoácido relativos à sequência Fc tipo selvagem.

[00345] Tais anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção, podem ser gerados conforme descrito no Exemplo 8. Além disso, o efeito na matança de CDC pelas proteínas heterodiméricas geradas pode ser testado, usando um ensaio da maneira aqui usada no exemplo 9. Assim, em uma modalidade particular, matança de CDC pode ser determinada pré-incubando células de suspensão a uma concentração de 1 x 106 células/ mL em placas de 96 poços de base redonda com um anticorpo na faixa de 0,0003 a 30,0 μg/mL de concentração final em um volume total de 100 μL por 15 minutos, em um agitador à temperatura ambiente, adicionando soro de humano normal a uma concentração final de 20%, 30% ou 50%, incubando a 37°C por 45 minutos, colocando as placas em gelo, adicionando 10 μL de iodeto de propídio, e determinando lise celular por análise de FACS.

[00346] Em uma modalidade particular da proteína heterodimérica, o aminoácido em uma posição correspondente a K409 é R no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido em uma posição correspondente a F405 é L em o segundo polipeptídeo, e em que os aminoácidos de cada qual dos ditos primeiro e segundo polipeptídeos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E e um aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 é Y ou W, não Y, não E, não T, não E, não N, não Q, não I e não S, para cada posição, respectivamente.

[00347] Em uma modalidade adicional, particular da proteína heterodimérica, o aminoácido em uma posição correspondente a K409 é R no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido em uma posição correspondente a F405 é L no segundo polipeptídeo, ou vice-versa; e em que os aminoácidos do primeiro e segundo polipeptídeos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são R, G e Y, respectivamente.

[00348] Em uma modalidade particular adicional da proteína heterodimérica, o aminoácido em uma posição correspondente a K409 é R no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido em uma posição correspondente a F405 é L no segundo polipeptídeo, ou vice-versa; e em que os aminoácidos do primeiro e/ou segundo polipeptídeos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são K, G e Y, respectivamente.

[00349] Em uma modalidade particular adicional da proteína heterodimérica, o aminoácido em uma posição correspondente a K409 é R no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido em uma posição correspondente a F405 é L no segundo polipeptídeo, ou vice-versa; e em que os aminoácidos do primeiro e/ou segundo polipeptídeos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são R, S e Y, respectivamente.

[00350] Em uma modalidade particular adicional da proteína heterodimérica, o aminoácido em uma posição correspondente a K409 é R no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido em uma posição correspondente a F405 é L no segundo polipeptídeo, ou vice-versa; e em que os aminoácidos do primeiro e/ou segundo polipeptídeos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são R, G e W, respectivamente.

[00351] Em uma modalidade particular adicional da proteína heterodimérica, o aminoácido em uma posição correspondente a K409 é R no primeiro polipeptídeo, e o aminoácido em uma posição correspondente a F405 é L no segundo polipeptídeo, ou vice-versa; e em que os aminoácidos do primeiro e/ou segundo polipeptídeos nas posições correspondentes a E345, E430 e Y436 são R, G e I, respectivamente.

[00352] Em uma modalidade adicional, qualquer outro aminoácido na proteína heterodimérica pode ser, conforme descrito adicionalmente, na seção “QwVtcu posições de aminoácido” O exemplo 11 mostra que introdução da mutação de E345R em um anticorpo de CD20xEGFR biespecífico aumenta a eficácia de CDC. Assim, em uma modalidade, a eficácia de CDC pode ser determinada pré-incubando células de suspensão de uma concentração de 1 x 106 células/ mL em placas de 96 poços de base redonda com um anticorpo a uma concentração final variando de 0,0003 a 30,0 μg/mL em um volume total de 100 μL por 15 minutos, em um agitador à temperatura ambiente, adicionando soro de humano normal a uma concentração final de 20%, 30% ou 50%, incubando a 37°C por 45 minutos, colocando as placas em gelo, adicionando 10 μL de iodeto de propídio, e determinando lise celular por análise de FACS.

[00353] Exemplos 9, 15 e 16 também descrevem alguns dos anticorpos biespecíficos diferentes.

[00354] O anticorpo biespecífico pode, por exemplo, compreender uma região de ligação de antígeno de um anticorpo CD20 e uma região de ligação de antígeno de um anticorpo CD38, e os aminoácidos de acordo com a presente invenção. Regiões de ligação de CD20 exemplares incluem aquelas de ofatumumab (2F2), 7D8 e 11B8, descritas em WO2004/035607, que estão por meio disso incorporados pela referência na sua íntegra, e rituximab (WO 2005/103081). Regiões de ligação de CD38 exemplares incluem aquelas de 003 e daratumumab (005), descritas em WO2006/099875, que está por meio disso incorporada pela referência na sua íntegra.

[00355] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico liga epítopos diferentes em alvos iguais ou diferentes. Assim, a região de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo pode, em uma modalidade, ligar no mesmo alvo, mas epítopos diferentes. Em uma outra modalidade, a região de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo pode ligar em alvos diferentes.

[00356] Em uma outra modalidade, a região de ligação do primeiro e do segundo polipeptídeo podem ligar em alvos diferentes nas células diferentes.

[00357] Em uma modalidade, os aminoácidos no primeiro e segundo polipeptídeos nas posições correspondentes a E345, E430 e correspondentes a uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são D ou E; E; S; Y; E; T; E; N; Q; I; e S, respectivamente, podem ser os mesmos ou diferentes.

[00358] Em uma modalidade adicional, um ou mais aminoácidos adicionais podem da maneira descrita aqui. Em uma modalidade particular, o aminoácido em uma posição correspondente a K439 é D ou E, em cada qual dos polipeptídeos da proteína heterodimérica. Em uma outra modalidade particular, o aminoácido em uma posição correspondente a S440 é K ou R. Assim, em uma modalidade particular, no dito primeiro polipeptídeo o aminoácido nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, não é E, o aminoácido em pelo menos uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, é Y, K, R, ou W; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente, e o aminoácido na posição correspondente a K439 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é D ou E, e no dito segundo polipeptídeo o aminoácido nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, não é E, o aminoácido na posição S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, é K ou R.

Proteínas de fusão Fc

[00359] Em um aspecto da presente invenção, a proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção é parte de uma proteína de fusão. Uma proteína de fusão de acordo com a invenção, pode referir-se a uma proteína consistindo em dois ou mais fragmentos de proteína covalentemente ligados que não são naturalmente expressos como uma única proteína. Proteínas de fusão podem, por exemplo, ser produzidas por tecnologias clonagem e expressão recombinantes comumente conhecidas na técnica, ou o método de criar proteínas de fusão pode ser pós-produção. Exemplos de tais processos são inteína, proteína ligase, ou outros processos enzimáticos comumente conhecidos na técnica. Assim, entende-se que uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção é a dita proteína dimérica compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo, cada qual compreende pelo menos uma região CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que os dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos podem compreender adicionalmente uma região de ligação.

[00360] Assim, o primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica de acordo com a invenção, podem compreender adicionalmente uma região de ligação. Entende-se que uma região de ligação de acordo com a invenção é uma sequência de polipeptídeos que é capaz de ligar em um alvo. Assim, a região de ligação pode ser uma proteína, ligante de proteína, receptor, uma região de ligação de antígeno, ou uma região de ligação do ligante capaz de ligar em um alvo associado com uma célula, bactéria, vírion, ou similares. Uma região de ligação pode, por exemplo, compreender parte de um receptor, ligante do receptor, ligante, citocina, hormônio, ou região de ligação de antígeno de uma imunoglobulina ou anticorpo.

[00361] Em uma modalidade, a região de ligação é uma citocina que é selecionada do grupo que consiste em IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-4;."MIH."KHPg KHPβ. KHPy. GM-CSF, CD40L, Flt3 ligante, fator de célula tronco, ancestim, e VPHg0

[00362] Em uma modalidade, a região de ligação é uma região de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, os dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita proteína dimérica compreendem, além da região Fc, uma ou mais, ou todas, as outras regiões de um anticorpo, isto é, uma região CH1, uma região VH, uma região CL e/ou uma região VL. Assim, em uma modalidade, o dito primeiro polipeptídeo é um anticorpo de comprimento total. Em uma outra modalidade, o dito segundo polipeptídeo é um anticorpo de comprimento total.

[00363] Em uma outra modalidade, a região de ligação é uma toxina, tal como uma toxina de ocorrência natural.

Conjugados

[00364] Em um aspecto, a proteína dimérica da presente invenção, compreende adicionalmente um medicamento, toxina, radiomarcador, agente radiopaco, agente paramagnético, agente fluorescente, agente fosforescente, agente de intensificação de ultrassom, sialilação, ou polietilenoglicol (PEG), opcionalmente conjugados pelo menos com um dos polipeptídeos por meio de um ligante.

[00365] Em uma modalidade, a dita proteína dimérica é parte de uma proteína de fusão.

[00366] Em uma modalidade, a proteína dimérica da invenção compreende um radiomarcador.

[00367] Em uma modalidade, a proteína dimérica da invenção compreende um agente radiopaco.

[00368] Em uma modalidade, a proteÌna dimÈrica da invenÁ„o compreende um agente paramagnÈtico.

[00369] Em uma modalidade, a proteína dimérica da invenção compreende um agente fluorescente.

[00370] Em uma modalidade, a proteína dimérica da invenção compreende um agente fosforescente.

[00371] Em uma modalidade, a proteína dimérica da invenção compreende um agente de intensificação de ultrassom.

[00372] Em uma modalidade, a proteína dimérica da invenção compreende um polietilenoglicol (PEG).

[00373] Em um outro aspecto, a proteína dimérica da invenção não é conjugada na terminação C com uma outra molécula, tal como uma toxina ou marcador. Em uma modalidade, a proteína dimérica é conjugada com uma outra molécula em um outro sítio, tipicamente em um sítio que não interfere na formação de oligômero. Por exemplo, a proteína dimérica pode, no outro sítio, ser ligada em um composto selecionado do grupo que consiste em uma toxina (incluindo um radioisótopo) um promedicamento ou um medicamento. Um composto como esse pode tornar a matança de células alvos mais efetiva, por exemplo, em terapia de câncer. A proteína dimérica resultante é assim um imunoconjugado.

[00374] Assim, em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma proteína dimérica, tal como um anticorpo ligado ou conjugado com uma ou mais frações terapêuticas, tais como uma citotoxina, um medicamento quimioterapêutico, uma citocina, um imunossupressor, e/ou um radioisótopo. Tais conjugados são referidos aqui como “imunoconjugados” ou “conjugados de medicamento” Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como “imunotoxinas".

[00375] Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para (por exemplo, mata) células. Agentes terapêuticos adequados para formar imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citoclasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidróxi antracina diona, maitansina ou um análogo ou derivado dos mesmos, antibióticos antitumorais enedieno incluindo neocarzinostatina, caliqueamicinas, esperamicinas, dinemicinas, lidamicina, cedarcidina ou análogos ou derivados dos mesmos, antraciclinas, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-de-hidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranol, e puromicina, antimetabólitos (tais como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluoruracila, decarbazina, hidroxiureia, asparaginase, gencitabina, cladribina), agentes de alquilação (tais como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina; bem como duocarmicina A, duocarmicina SA, CC-1065 (raquelmicina a.k.a.), ou análogos ou derivados de CC-1065), dolastatina, pirrol[2,1-c][1,4] benzodiazepinas (PDBs) ou análogos dos mesmos, antibióticos (tal como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos (por exemplo, inibidores de tubulina) tais como monometil auristatina E, monometil auristatina F, ou outro análogos ou derivados de dolastatina 10; inibidores de Histona deacetilase tais como o tricostatina A dos ácidos hidroxâmicos, vorinostat (SAHA), belinostat, LAQ824, e panobinostat bem como os benzamidas, entinostat, CI994, mocetinostat e compostos do ácido alifático tais como fenilbutirato e ácido valproico, inibidores de proteassoma tais como Danoprevir, bortezomib, amatoxinas tais como alfa-amantina, toxina de difteria e moléculas relacionadas (tais como cadeia de difteria A e fragmentos ativos desta e moléculas híbridas); toxina de ricina (tais como ricina A ou uma toxina de cadeia de ricina A desglicolizada), toxina de cólera, uma toxina tipo Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina da coqueluche, toxina de tétano, inibidor protease Bowman-Birk de soja, exotoxina Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, e toxinas de enomicina. Outras moléculas conjugadas adequadas incluem peptídeos antimicrobianos/líticos tais como CLIP, Magainina 2, melitina, Cecropina, e P18; ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina-A de Staphylococcal, proteína antiviral de erva-dos-cancros, toxina de difterina, e endotoxina de Pseudomonas. Vide, por exemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) and Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com uma proteína dimérica da presente invenção conforme descrito em qualquer lugar aqui, tais como, por exemplo, citocinas ou quimiocinas anticâncer, são também candidatas para frações terapêuticas usadas para conjugação com uma proteína dimérica da presente invenção.

[00376] Em uma modalidade, os conjugados de medicamento da presente invenção compreendem uma proteína dimérica conforme revelado aqui, conjugados com análogos e derivados peptídeo de auristatinas ou auristatina (US5635483, US5780588). Auristatinas mostrou interferir na dinâmica de microtúbulo, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) e têm atividade anticancerígena e antifúngica (US5663149) (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965. A fração de medicamento auristatina pode ser anexada na proteína dimérica por meio de um ligante, através da terminação N (amino) ou da terminação C (carbóxi) da fração de medicamento peptídica.

[00377] Modalidades de auristatina exemplares incluem as frações de medicamento monometil auristatina DE e DF ligadas na terminação N, reveladas em Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, número do abstrato 623, apresentado em 28 de março de 2004 e descrito em US 2005/0238649).

[00378] Uma modalidade de auristatina exemplar é MMAE (monometil auristatina E). Uma outra modalidade de auristatina exemplar é MMAF (monometil auristatina F).

[00379] Em uma modalidade, uma proteína dimérica da presente invenção compreende um ácido nucleico conjugado ou molécula associada com ácido nucleico. Em uma modalidade como essa, o ácido nucleico conjugado é um ribonuclease citotóxica, um ácido nucleico antissentido, uma molécula de RNA inibitória (por exemplo, uma molécula de siRNA) ou um ácido nucleico imunoestimulatório (por exemplo, uma molécula de DNA contendo motivo de CpG imunoestimulatório). Em uma outra modalidade, uma proteína dimérica da presente invenção é conjugada com um aptâmero ou um ribozima.

[00380] Em uma modalidade, são fornecidas proteínas diméricas compreendendo um ou mais aminoácidos radiomarcados. Uma proteína dimérica radiomarcada pode ser usada tanto com propósitos de diagnóstico quanto terapêutico (conjugação com moléculas radiomarcadas é um outro recurso possível). Exemplos não limitantes de marcadores para polipeptídeos incluem 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, e 125I, 131I, e 186Re. Métodos para preparar aminoácidos radiomarcados e derivados de peptídeo relacionados são conhecidos na técnica, (vide, por exemplo, Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd Ed., Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) e U.S. 4.681.581, U.S. 4.735.210, U.S. 5.101.827, U.S. 5.102.990 (US RE35.500), U.S. 5.648.471 e U.S. 5.697.902. Por exemplo, um radioisótopo pode ser conjugado pelo método de cloramina-T.

[00381] Em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção é conjugada com um radioisótopo ou com um quelato contendo radioisótopo. Por exemplo, a proteína dimérica pode ser conjugada com um ligante quelante, por exemplo, DOTA, DTPA ou tiuxetano, que permite que a proteína dimérica seja complexada com um radioisótopo. A proteína dimérica pode também ou, alternativamente, compreender ou ser conjugada com um ou mais aminoácidos radiomarcados ou outra molécula radiomarcada. Uma proteína dimérica radiomarcada pode ser usada tanto com propósitos de diagnóstico quanto terapêutico. Em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção é conjugada com um alfaemissor. Exemplos não limitantes 3 14 15 35 90 99 125 111 131 186 de radioisótopos incluem H, C, N, S, Y, Tc, I, In, I, Re, 213Bs, 225Ac e 227Th.

[00382] Em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção pode ser conjugada com uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29. KGH, KHPg. KHPβ. KHPy, IO-CSF, CD40L, Flt3 ligante, fator de célula tronco, ancestim, e VPHg0

[00383] Proteínas diméricas da presente invenção podem também ser quimicamente modificadas por conjugação covalente com um polímeto, por exemplo, aumentando sua meia vide circulante. Polímeros exemplares, e métodos para anexá-los aos peptídeos, são ilustrados, por exemplo, em US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 e US 4.609.546. Polímeros adicionais incluem polióis polioxietilados e poletileno glicol (PEG) (por exemplo, um PEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal como entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000).

[00384] Pode ser empregado qualquer método conhecido na técnica para conjugar a proteína dimérica da presente invenção com a(s) molécula(s) conjugada(s), tais como aquelas descritas anteriormente, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) and Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Tais proteínas diméricas podem ser produzidas conjugando quimicamente a outra fração com o lado do terminal N ou lado do terminal C da proteína dimérica ou fragmento desta (por exemplo, uma cadeia H ou L do anticorpo) (vide, por exemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Tais derivados de proteína dimérica conjugada podem também ser gerados por conjugação com os resíduos internos ou açúcares, onde apropriado.

[00385] Os agentes podem ser acoplados tanto direta quanto indiretamente em uma proteína dimérica da presente invenção. Um exemplo de acoplamento indireto de um segundo agente é acoplamento por meio de uma fração espaçadora ou ligante em cisteína ou resíduos de lisina em um anticorpo biespecífico. Em uma modalidade, uma proteína dimérica é conjugada com uma molécula de promedicamento que pode ser ativada in vivo por um medicamento terapêutico por meio de um espaçador ou ligante. Em algumas modalidades, o ligante é clivável em condições intracelulares, de maneira tal que a clivagem do ligante libera a unidade do medicamento da proteína dimérica no ambiente intracelular. Em algumas modalidades, o ligante é clivável por um clivável agente que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, em um lisossomo ou endossomo ou cavéola). Por exemplo, os espaçadores ou ligantes podem ser cliváveis por enzimas associadas com célula tumoral ou outras condições específicas de tumor, pelo qual o medicamento ativo é formado. Exemplos de tais tecnologias de promedicamento e ligantes são descritos em WO02083180, WO2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 e WO201062171 por Syntarga BV, et al. Tecnologia de anticorpo-promedicamento e análogos de duocarmicina adequados podem também ser encontrados na patente U.S. No. 6.989.452 (Medarex), incorporada aqui pela referência. O ligante pode ser também, ou alternativamente, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma enzima de peptidase ou protease intracelular, incluindo, mas sem limitações, uma protease lisossomal ou endossomal. Em algumas modalidades, o ligante de peptidila tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina, todos os quais são conhecidos para hidrolisar derivados de medicamento de dipeptídeo resultando na liberação de medicamento ativo dentro das células alvos (vide, por exemplo, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Em uma modalidade específica, o ligante de peptidila clivável por uma protease intracelular é um ligante Val-Cit (valina-citrulina) ou um ligante Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (vide, por exemplo, US6214345, que descreve as sínteses de doxorubicina com o ligante Val-Cit e diferentes exemplos de ligantes de Phe-Lys). Exemplos das estruturas de um ligante Val-Cit e um Phe-Lys incluem, mas sem limitações, MC-vc-PAB descritos a seguir, MC- vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB ou MC-Phe-Lys-GABA, em que MC é uma abreviação para maleimido caproil, vc é uma abreviação para Val-Cit, PAB é uma abreviação para p-aminobenzilcarbamato e GABA é uma abreviação para ácido y-aminobutírico. Uma vantagem de usar liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades do soro do conjugado são tipicamente altas.

[00386] Ainda em uma outra modalidade, a unidade de ligante não é clivável e o medicamento é liberado por proteína dimérica ou degradação de anticorpo (vide US 2005/0238649). Tipicamente, um ligante como esses não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Da maneira aqui usada, “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular” no contexto de um ligante significa que não mais que 20%, tipicamente não mais que cerca de 15%, mais tipicamente não mais que cerca de 10%, e ainda mais tipicamente não mais que cerca de 5%, não mais que cerca de 3%, ou não mais que cerca de 1% dos ligantes, em uma amostra de composto do conjugado de medicamento de proteína dimérica, são clivados quando o composto do conjugado de medicamento de proteína dimérica está presente em um ambiente extracelular (por exemplo, plasma). Pode-se determinar se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, por exemplo, incubando o composto do conjugado de medicamento de proteína dimérica com plasma por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e então quantificando a quantidade de medicamento livre presente no plasma. Modalidades exemplares compreendendo MMAE ou MMAF e vários componentes ligante têm as seguintes estruturas (em que Ab significa anticorpo e p, representando o carregamento de medicamento (ou número médio de medicamentos citostáticos ou citotóxicos por molécula do anticorpo), é 1 a cerca de 8, por exemplo, p pode ser de 4-6, tal como de 3-5, ou p pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8).

[00387] Exemplos onde um ligante clivável é combinado com uma auristatina incluem MC-vc-PAB-MMAF (também designado como vcMMAF) e MC-vc-PAB-MMAE (também designado como vcMMAE), em que MC é uma abreviação para maleimido caproil, vc é uma abreviação para o ligante a base de Val-Cit (valina-citrulina), e PAB é uma abreviação para p- aminobenzilcarbamato.

[00388] Outros exemplos incluem auristatinas combinadas com um ligante não clivável, tal como mcMMAF (mc (MC é o mesmo mc neste contexto) é uma abreviação de maleimido caproil).

[00389] Em uma modalidade, a fração ligante de medicamento é vcMMAE. A fração ligante de medicamento vcMMAE e métodos de conjugação são revelados em WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 e US 11/833.028 (Seattle Genetics, Inc.), (que estão incorporados aqui pela referência), e a fração ligante de medicamento vcMMAE é ligada nas proteínas diméricas nas cisteínas usando um método similar aos revelados nelas.

[00390] Em uma modalidade, a fração ligante de medicamento é mcMMAF. A fração ligante de medicamento mcMMAF e métodos de conjugação são revelados em US7498298, US 11/833.954, e WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), (que estão incorporados aqui pela referência), e a fração ligante de medicamento mcMMAF é ligada na proteína dimérica nas cisteínas usando um método similar aos revelados em nelas.

[00391] Em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção é anexada em um ligante quelante, por exemplo, tiuxetano, que permite, por exemplo, que um anticorpo biespecífico seja conjugado com um radioisótopo.

[00392] Em uma modalidade, a proteína dimérica é conjugada em toxinas ou cargas úteis, tais como medicamentos, que têm função ideal a um pH menor que pH neutro.

[00393] Em uma modalidade, tanto o primeiro quanto segundo polipeptídeo da proteína dimérica são acoplados direta ou indiretamente na mesma uma ou mais frações terapêuticas.

[00394] Em uma modalidade, somente o primeiro ou segundo polipeptídeo da proteína dimérica é acoplado direta ou indiretamente em uma ou mais frações terapêuticas.

[00395] Em uma modalidade, o primeiro e segundo polipeptídeos da proteína dimérica são acoplados direta ou indiretamente em diferentes frações terapêuticas. Por exemplo, em modalidades onde a proteína dimérica é um anticorpo biespecífico e é preparada por troca de braço Fab controlada de dois diferentes anticorpos monoespecíficos, por exemplo, um primeiro e segundo anticorpo como anticorpos biespecíficos podem ser obtidos usando anticorpos monoespecíficos que são conjugados ou associados com diferentes frações terapêuticas.

Oligômero

[00396] A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta que proteínas diméricas compreendendo pelo menos as regiões CH2 e CH3, e opcionalmente uma região articulada de cadeias pesadas de imunoglobulina, pode formar oligômeros tais como hexâmeros não somente quando ligados em uma molécula alvo, mas também em solução. A oligomerização ocorre por meio de associação não covalente de regiões de Fc adjacentes, e foi em particular observada para anticorpos com mutações em E345, E430 e S440, conforme descrito nos exemplos.

[00397] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um oligômero compreendendo pelo menos duas proteínas diméricas não covalentemente associadas, cada qual de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descrito.

[00398] Em uma modalidade, a invenção fornece um hexâmero compreendendo sete proteínas diméricas não covalentemente associadas, cada qual de acordo com qualquer um dos aspectos ou modalidades anteriores. Em uma modalidade, pelo menos um, tais como pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou sete proteínas diméricas do hexâmero são anticorpos.

[00399] Em uma modalidade, a invenção fornece um oligômero compreendendo sete proteínas diméricas não covalentemente associadas, pelo menos uma das quais é uma proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção e pelo menos uma das quais é um anticorpo compreendendo um domínio Fc, compreendendo pelo menos regiões CH2 e CH3 e opcionalmente uma região articulada.

[00400] Em uma modalidade, a invenção fornece um hexâmero compreendendo sete moléculas não covalentemente associadas, tais como proteínas diméricas, pelo menos uma das quais é de uma proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade anterior, e pelo menos uma das quais é um anticorpo compreendendo um domínio Fc compreendendo pelo menos regiões CH2, CH3 e de dobradiça, no l pelo menos uma das posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, é E, E e S, respectivamente. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal, o anticorpo monoclonal opcionalmente selecionado dos anticorpos conhecidos denotados “segundos anticorpos” na seção a seguir.

Composições

[00401] A presente invenção também refere-se a uma composição compreendendo uma ou mais proteínas diméricas da presente invenção, opcionalmente na forma de oligômeros, tais como hexâmeros de acordo com qualquer aspecto ou modalidade anterior. A composição da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína dimérica da presente invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais, tais como aquelas reveladas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.

[00402] A composição da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidades da presente invenção, um ou mais anticorpos, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00403] Em uma modalidade particular, a composição compreende uma primeira proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, e uma segunda proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável. Os carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos devem ser adequados para a proteína dimérica da presente invenção e o modo de escolha de administração. A adequabilidade para carreadores e outros componentes de composições farmacêuticas é determinada com base na falta de impacto negativo significante nas propriedades biológicas desejadas da proteína dimérica ou composição farmacêutica da presente invenção (por exemplo, menos que um impacto substancial (10% ou menos de inibição relativa, 5% ou menos de inibição relativa, etc.)) na ligação de antígeno.

[00404] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode também incluir diluentes, cargas, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween-80), estabilizantes (por exemplo, açúcares, álcoois açúcar tais como sorbitol e manitol, ou aminoácidos sem proteína), conservantes, tecido fixadores, solubilizantes, e/ou outros materiais adequados para inclusão em uma composição farmacêutica.

[00405] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes de atraso de absorção adequados e similares que são fisiologicamente compatíveis com uma proteína dimérica da presente invenção.

[00406] Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, salina, salina tamponada com fosfato, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, proprileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo caroço de algodão, e óleo de sésamo, soluções de carboximetil celulose coloidal, goma tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila e/ou vários tampões. Outros carreadores são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas.

[00407] Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões estéreis aquosas e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão estéreis injetáveis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto até o ponto em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com a proteína dimérica, seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é contemplado.

[00408] Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões, e pelo uso de agentes tensoativos.

[00409] Composições farmacêuticas da presente invenção podem também compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfato de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

[00410] Composições farmacêuticas da presente invenção podem também compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.

[00411] As composições farmacêuticas da presente invenção podem também conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via de administração escolhida, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, conservantes ou tampões, que podem aumentar o prazo de validade ou efetividade da composição farmacêutica. A proteína dimérica da presente invenção pode ser preparada com carreadores que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulada. Tais carreadores podem incluir gelatinas, monoestearato de glicerol, diestearato de glicerila, polímeros biocompatíveis biodegradáveis tais como acetato de vinil etileno, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos pelos versados na técnica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drugs Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00412] Em uma modalidade, a proteína dimérica da presente invenção pode ser formulada para assegurar distribuição adequada in vivo. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis para administração parenteral incluem soluções ou dispersões estéreis aquosas e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão estéreis injetáveis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto até o ponto em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com a proteína dimérica, seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é contemplado.

[00413] Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

[00414] Composições farmacêuticas para injeção tipicamente devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de medicamento. O carreador pode ser um solvente aquoso ou não aquoso ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, polióis (tais como glicerol, proprileno glicol, polietileno glicol e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de agentes tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como glicerol, manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatinas. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando a proteína dimérica na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes, por exemplo, enumerado anteriormente, conforme exigido, seguido por microfiltração de esterilização. No geral, dispersões são preparadas incorporando a proteína dimérica em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos, por exemplo, daqueles enumerado anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada estéril dos mesmos.

[00415] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando a proteína dimérica na quantidade exigida em um solvente apropriado com uma ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, conforme exigido, seguido por microfiltração de esterilização. No geral, dispersões são preparadas incorporando a proteína dimérica em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produziram um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada estéril dos mesmos.pH

[00416] As composições da invenção podem compreender um sistema tampão adequado para controlar o pH e, por meio disso, o estado de oligomerização da(s) proteína(s) dimérica(s) presente(s). Por exemplo, a um pH de 6,4 ou abaixo, tal como a pH 5,0, uma proteína dimérica de acordo com a invenção é tipicamente predominantemente na forma monomérica, isto é, uma única proteína dimérica, enquanto a pH acima de 6,4, tal como a pH 6,8, uma proteína dimérica é predominantemente na forma oligomérica, tal como forma de hexâmero. A forma hexamérica da proteína dimérica é composta de seis proteínas diméricas que associam não covalentemente umas com as outras para formar uma forma hexamérica. A expressão “forma monomérica” no contexto de proteína dimérica de acordo com a presente invenção refere-se a uma única proteína dimérica individual, que é composta de proteínas diméricas que não associam não covalentemente umas com as outras. O Exemplo 31 descreve como isto pode ser observado ajustando o pH.

[00417] Em uma modalidade, a composição compreende um carreador farmaceuticamente aceitável que é uma solução aquosa tamponada.

[00418] Em uma modalidade, o pH da solução aquosa tamponada é pelo menos cerca de 6,5, tal como de 6,5 a cerca de 9,0, tal como de cerca de 7,0 a cerca de 8,0, tal como cerca de 7,4. Sistemas de tampão adequados para manter um pH nesta faixa e/ou pH fisiológico próximo incluem sistemas de tampão de fosfato. Assim, em uma modalidade, a solução aquosa tamponada é um sistema de tampão de fosfato. Em uma modalidade, a proteína dimérica é predominantemente na forma oligomérica, tal como forma hexamérica, em um tampão de fosfato a um pH de cerca de 6,8.

[00419] Em uma modalidade, o pH da solução aquosa tamponada é menos que pH 6,5, tal como de cerca de 4,0 a 6,4, tal como de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Sistemas de tampão adequado para manter um pH nesta faixa incluem citrato, acetato, histidina e/ou sistemas de tampão a base de glicina. Assim, em uma modalidade, o sistema de tampão é um acetato, histidina, glicina, citrato, nicotinato, lactato e/ou sistema de tampão a base de succinato. Tais sistemas de tampão podem também ser uma combinação de sistemas de tampão. Em uma modalidade, a proteína dimérica é predominantemente em forma monomérica, isto é, única proteína dimérica, a um pH de menos que 6,0, tal como cerca de 5,0.

[00420] Conforme mostrado no exemplo 31, a oligomerização da proteína dimérica de acordo com a invenção é um processo reversível que pode ser controlado por pH. Isto poderia ser usado para aplicação em processamento durante fabricação da proteína dimérica, tais como as etapas de purificação em que coagulação, por exemplo, de colunas de purificação, filtração de fluxo translaminar, filtração de extremidade morta e/ou dispositivos de nanofiltração podem ser evitados abaixando o pH sem comprometer a eficácia do produto final, tal como um anticorpo. Além disso, diminuir o pH abaixo de 6,8, por exemplo, 5,0 e 5,5, durante purificação pode melhorar os rendimentos de purificação, já que a proteína dimérica é predominantemente na forma monomérica e, por meio disso, menos provável de coagular do que a forma hexamérica da proteína dimérica, demonstrado pelo Exemplo 32. Além disso, diminuir o pH abaixo de 6,8 durante a purificação pode permitir remoção de agregados não específicos por cromatografia, tal como usando resinas de troca de cátion fraca. Assim, uma vez que a proteína dimérica foi purificada a um pH abaixo de 6,8, a forma oligomérica, por exemplo, hexamérica pode ser restaurada aumentando o pH da solução para um pH em torno de 6,8.

Misturas

[00421] Em alguns aspectos, a invenção fornece composições compreendendo uma proteína dimérica e uma segunda molécula, em que a segunda molécula também compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo, cada qual compreendendo pelo menos regiões CH2, CH3 e de dobradiça de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, a proteína dimérica deve ser entendida como a proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção, tal como proteína dimérica de uma proteína dimérica precursora, tal como uma proteína dimérica variante de uma proteína dimérica precursora.

[00422] Vantajosamente, as quantidades relativas da(s) proteína(s) dimérica(s) e da segunda molécula nas composições podem ser ajustadas para modular o número médio de unidades de cada proteína dimérica diferente nos oligômeros/hexâmeros formados. Isto, por sua vez, fornece um meio para otimizar as propriedades de função efetora e/ou ligação alvo, quando uma ou mais da(s) proteína(s) dimérica(s) e as segundas moléculas liga(m) um alvo.

[00423] Aspectos e modalidades específicos das composições compreendendo misturas de uma proteína dimérica e uma segunda molécula são descritos a seguir. Embora aplicável a todos os tipos de proteínas diméricas de acordo com a invenção e todos os tipos de segundas moléculas contendo Fc, incluindo, por exemplo, proteínas de fusão Fc com regiões de ligação do ligante, moléculas do anticorpo são particularmente contempladas para ambos componentes.

[00424] Em um aspecto, a composição da invenção compreende uma primeira proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, uma segunda proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00425] Um aspecto, a segunda molécula é uma na qual pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é um normalmente presente nesta posição em uma cadeia pesada de IgG1 nativo. Por exemplo, a cadeia pesada de polipeptídeos da segunda molécula pode compreender E, E e S em cada qual das posições correspondentes a E345, E430 e S440, respectivamente. De acordo com este aspecto, a segunda molécula pode assim compreender, por exemplo, a sequência de região Fc nativa de um IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE de humano ou anticorpo IgM ou, em particular, pelo menos sequência Fc de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 sem substituições de aminoácido em todos os três de E345, E430 e S440.

[00426] Em uma modalidade, a segunda molécula é um anticorpo, em particular, um anticorpo bem conhecido já em uso clínico ou pré-clínico, tal como um anticorpo que tem um perfil de segurança adequado. Em uma modalidade adicional, o dito segundo anticorpo pode ter um perfil de segurança adequado, mas não pode ser eficientemente eficaz.

[00427] Em uma modalidade, também a proteína dimérica é um anticorpo, de forma que a composição compreende um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que somente o primeiro anticorpo é uma proteína dimérica da invenção. A combinação de um primeiro anticorpo que compreende mutações capazes de aumentar uma função efetora e um segundo anticorpo que não compreende uma mutação como essa pode, conforme mostrado no exemplo 17, fornecer uma maior função efetora. Assim, sem se ligar a teoria, acredita-se, por exemplo, que este método pode ser usado para combinar um anticorpo terapêutico, como um segundo anticorpo, que provou ser seguro, mas não eficiente o bastante por si próprio para uma aplicação específica, com uma proteína dimérica de acordo com a invenção, por meio disso resultando em uma combinação que é eficaz.

[00428] Exemplos de segundos anticorpos adequados incluem, mas sem limitações, qualquer um daqueles selecionados do grupo que consiste em: (90Y) clivatuzumab tetraxetan; (90Y) tacatuzumab tetraxetan; (99mTc) fanolesomab; (99mTc) nofetumomab Merpentan; (99mTc) pintumomab; 3F8; 8H9; abagovomab; abatacept; abciximab; Actoxumab; adalimumab; adecatumumab; afelimomab; aflibercept; Afutuzumab; alacizumab pegol; albiglutide; ALD518; alefacept; alemtuzumab; Alirocumab; altumomab; Altumomab pentetate; alvircept sudotox; amatuximab; AMG714/HuMax- IL15; anatumomab mafenatox; Anrukinzumab (= IMA-638); apolizumab; arcitumomab; aselizumab; atacicept; atinumab; Atlizumab (= tocilizumab); atorolimumab; baminarcept; Bapineuzumab; basiliximab; bavituximab; bectumomab; belatacept; belimumab; benralizumab; bertilimumab; besilesomab; bevacizumab; Bezlotoxumab; biciromab; bifarcept; bivatuzumab; Bivatuzumab mertansina; blinatumomab; blosozumab; brentuximab vedotin; briakinumab; briobacept; brodalumab; canakinumab; cantuzumab mertansina; cantuzumab ravtansina; caplacizumab; capromab; Capromab pendetide; carlumab; catumaxomab; CC49; cedelizumab; certolizumab pegol; cetuximab; Ch.14.18; citatuzumab bogatox; cixutumumab; Clazakizumab; clenoliximab; Clivatuzumab tetraxetan; conatumumab; conbercept; CR6261; crenezumab; dacetuzumab; daclizumab; dalantercept; dalotuzumab; daratumumab; Demcizumab; denosumab; Detumomab; Dorlimomab aritox; drozitumab; dulaglutide; ecromeximab; eculizumab; edobacomab; edrecolomab; efalizumab; efungumab; elotuzumab; elsilimomab; enavatuzumab; enlimomab; enlimomab pegol; enokizumab; ensituximab; epitumomab; epitumomab cituxetan; epratuzumab; erlizumab; ertumaxomab; etanercept; etaracizumab; etrolizumab; exbivirumab; Fanolesomab; faralimomab; farletuzumab; Fasinumab; FBTA05; felvizumab; Fezakinumab; ficlatuzumab; figitumumab; flanvolumab; fontolizumab; foralumab; foravirumab; fresolimumab; fulranumab; galiximab; ganitumab; gantenerumab; gavilimomab; gemtuzumab; Gemtuzumab ozogamicin; gevokizumab; girentuximab; glembatumumab; Glembatumumab vedotin; golimumab; Gomiliximab; GS6624; anticorpos anti-CD74; anticorpos anti- cMet conforme revelado em WO 2011/110642; anticorpos anti-Her2 conforme revelado WO 2011/147986 ou WO 2011/147982; anticorpos anti- IL8 conforme revelado em WO 2004/058797; anticorpos anti-TAC conforme revelado em WO 2004/045512; anticorpos de fator anti-tecido (TF) conforme revelado em WO 2010/066803 ou WO 2011/157741; ibalizumab; ibritumomab tiuxetan; icrucumab; igovomab; Imciromab; inclacumab; indatuximab ravtansina; infliximab; inolimomab; inotuzumab ozogamicin; intetumumab; iodine (124I) girentuximab; ipilimumab; iratumumab; itolizumab; ixekizumab; keliximab; labetuzumab; lebrikizumab; lemalesomab; lenercept; lerdelimumab; lexatumumab; libivirumab; lintuzumab; lorvotuzumab mertansina; lucatumumab; lumiliximab; mapatumumab; maslimomab; matuzumab; mavrilimumab; mepolizumab; metelimumab; milatuzumab; minretumomab; mirococept; mitumomab; mogamulizumab; morolimumab; motavizumab; moxetumomab; pasudotox; muromonab-CD3; nacolomab tafenatox; namilumab; naptumomab estafenatox; narnatumab; natalizumab; nebacumab; necitumumab; nerelimomab; nimotuzumab; Nivolumab; Nofetumomab; merpentan; obinutuzumab; Ocaratuzumab; ocrelizumab; odulimomab; ofatumumab; olaratumab; olokizumab; omalizumab; onartuzumab; onercept; oportuzumab monatox; oregovomab; otelixizumab; oxelumab; ozoralizumab; pagibaximab; palivizumab; panitumumab; panobacumab; pascolizumab; pateclizumab; patritumab; pegsunercept; Pemtumomab; pertuzumab; pexelizumab; Pintumomab; Placulumab; ponezumab; priliximab; pritumumab; PRO 140; quilizumab; racotumomab; radretumab; rafivirumab; ramucirumab; ranibizumab; raxibacumab; regavirumab; reslizumab; RG1507/HuMax- IGF1R; RG1512/HuMax-pSelectin; rilonacept; rilotumumab; rituximab; robatumumab; roledumab; romosozumab; rontalizumab; rovelizumab; ruplizumab; samalizumab; sarilumab; satumomab; Satumomab pendetide; secukinumab; sevirumab; sibrotuzumab; sifalimumab; siltuximab; siplizumab; sirukumab; solanezumab; solitomab; Sonepcizumab; sontuzumab; sotatercept; stamulumab; sulesomab; suvizumab; tabalumab; Tacatuzumab tetraxetan; tadocizumab; talizumab; tanezumab; taplitumomab paptox; tefibazumab; telimomab aritox; tenatumomab; teneliximab; teplizumab; teprotumumab; TGN1412; Ticilimumab (= tremelimumab); tigatuzumab; TNX-650; Tocilizumab (= atlizumab); toralizumab; torapsel; tositumomab; tralokinumab; trastuzumab; trastuzumab emtansina; TRBS07; trebananib; tregalizumab; tremelimumab; tucotuzumab celmoleukin; tuvirumab; ublituximab; urelumab; urtoxazumab; ustekinumab; vapaliximab; vatelizumab; vedolizumab; veltuzumab; vepalimomab; vesencumab; visilizumab; volociximab; Vorsetuzumab mafodotin; votumumab; zalutumumab; zanolimumab; ziralimumab; e zolimomab aritox.

[00429] Em um aspecto, a segunda molécula é uma segunda proteína dimérica de acordo com a invenção. Composições de acordo com este aspecto assim compreendem uma mistura de duas ou mais diferentes proteínas diméricas, cada qual de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, tal como descrito anteriormente. Tipicamente, nas condições de pH e/ou ligação alvo corretas, hexâmeros compreendendo duas ou mais diferentes proteínas diméricas podem então se formar na composição, particularmente em uma solução aquosa ou tampão. A primeira e segunda proteínas diméricas da presente invenção terão preferência para oligomerização umas com as outras, comparadas com qualquer proteína dimérica tipo selvagem ou de ocorrência natural conforme mostrado no exemplo 3.

[00430] Em uma modalidade, a composição compreende uma primeira proteína dimérica e uma segunda proteína dimérica, opcionalmente compreendendo adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00431] Em uma modalidade, a presente invenção pode dizer respeito a uma composição compreendendo uma primeira e uma segunda proteína dimérica, em que tanto a primeira quanto a segunda proteínas diméricas compreendem um primeiro e um segundo polipeptídeos, em que em um dos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos, tais como ambos, das ditas primeira e segunda proteínas diméricas, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, não são E, e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253, e S254, correspondente à posição em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, é Y, W, K ou R; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente. A primeira e a segunda proteína dimérica podem ser qualquer proteína dimérica de acordo com a presente invenção.

[00432] Em uma modalidade, uma ou ambos das primeira e segunda proteínas diméricas compreendem polipeptídeos de cadeia pesada em que, para um ou ambos os polipeptídeos, tal como cada qual, o aminoácido na posição correspondente a E345 é selecionado, por exemplo, separadamente, do grupo que consiste em R, Q, N, K, Y, A, C, D, F, G, H, I, L, M, P, S, T, V e W, tal como do grupo que consiste em R, Q, N, K e Y.

[00433] Em uma modalidade, uma ou ambas da primeira e da segunda proteínas diméricas compreendem polipeptídeos de cadeia pesada em que, para um ou ambos os polipeptídeos, tal como cada qual, o aminoácido na posição correspondente a E430 é selecionado, por exemplo, separadamente, do grupo que consiste em G, T, S, F, H, A, C, D, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W e Y, tais como do grupo que consiste em G, T, S, F e H.

[00434] Em uma modalidade, um ou ambas das primeira e segunda proteínas diméricas compreendem polipeptídeos de cadeia pesada em que, para um ou ambos os polipeptídeos, tal como cada qual, o aminoácido em pelo menos uma das posições selecionadas do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253, e S254 corresponde à posição em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, é Y, R, K, ou W; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente.

[00435] Em uma modalidade, as ditas primeira e/ou segunda proteínas diméricas, tais como ambas, compreendem polipeptídeos de cadeia pesada em que, para um ou ambos os polipeptídeos, tal como cada qual, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G e Y, respectivamente.

[00436] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos das ditas primeira e/ou segunda proteínas diméricas, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são K, G e Y, respectivamente.

[00437] Em uma modalidade, nos ditos primeiro e/ou segundo polipeptídeos das ditas primeira e/ou segunda proteínas diméricas, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, S e Y, respectivamente.

[00438] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos das ditas primeira e/ou segunda proteínas diméricas, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G e W, respectivamente.

[00439] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou Segundo polipeptídeos das ditas primeira e/ou segunda proteínas diméricas, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e Y436 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G e I, respectivamente.

[00440] Em uma outra modalidade, uma ou ambos da primeira e segunda proteínas diméricas compreendem polipeptídeos de cadeia pesada onde os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são R; G; e Y ou W, respectivamente, e onde um ou pelo menos um de Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 não é Y; D ou E; T; E; N; Q; I; e S, respectivamente.

[00441] Em uma modalidade, tanto a dita primeira quanto a segunda proteína dimérica compreendem os aminoácidos indicados tanto nos ditos primeiro quanto segundo polipeptídeos e a outra proteína dimérica compreende os aminoácidos indicados somente nos ditos primeiro ou segundo polipeptídeo.

[00442] Em uma modalidade, tanto a dita primeira quanto segunda proteínas diméricas compreendem os aminoácidos indicados tanto no dito primeiro quanto segundo polipeptídeo.

[00443] Em algumas modalidades, os aminoácidos em certas posições nos polipeptídeos de cadeia pesada diferem entre a primeira e segunda proteínas diméricas para ajustar a intensidade ou especificidade da associação não covalente das duas proteínas diméricas. Isto pode ser obtido, por exemplo, usando a primeira e/ou segunda proteínas diméricas com aminoácidos específicos nas posições correspondentes a K439, S440, K447, K448, e/ou K449, da maneira descrita anteriormente.

[00444] Em uma modalidade, os polipeptídeos da primeira proteína dimérica compreendem um aminoácido na posição correspondente a K439 que não é K, e os polipeptídeos da segunda proteína dimérica compreendem um aminoácido na posição correspondente a S440 que não é S, com a condição de que o aminoácido em S440 não seja Y ou W. Por exemplo, na primeira proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K439 pode ser D ou E, e na segunda proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a S440 pode ser K, H ou R, tal como K ou R. Uma estratégia similar pode ser usada para combinações de aminoácidos nas posições correspondentes a K447, 448 e 449. Tabela 2 mostra aminoácidos exemplares para essas posições na primeira proteína dimérica e segunda proteína dimérica para ser usados juntos, separados por um sinal “-”-. Em qualquer um desses aspectos e modalidades, uma ou ambas da primeira e segunda proteínas diméricas podem ser um anticorpo (por exemplo, Ab1 e Ab2, respectivamente). Tabela 2: Posições exemplares e aminoácidos que podem adicionalmente estar presentes em duas proteínas diméricas (por exemplo, Ab1 + Ab2)

[00445] Em uma modalidade adicional, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita primeira proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K439 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é E ou D, opcionalmente E, e no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica o aminoácido na posição correspondente a S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é K ou R, opcionalmente K.

[00446] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita primeira proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, K439 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, K, Q, N, ou Y; G, S, T, F ou H; D ou E; e Y ou W, respectivamente, e, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, K, Q, N, ou Y; G, S, T, F ou H; e K ou R, respectivamente. Em uma modalidade adicional, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da segunda proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a Y436 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano, é I.

[00447] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita primeira proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K439 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é E ou D, opcionalmente E, e, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é K ou R, opcionalmente K, e pelo menos um aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste em Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 correspondente à posição em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não é Y; D ou E; T; E; N; Q; I; e S, respectivamente.

[00448] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita primeira proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, K439 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, E, e Y, respectivamente, e, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, K439 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, K, e K, respectivamente.

[00449] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita primeira proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, K439 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, E e Y, respectivamente, e, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G e K, respectivamente.

[00450] Em uma modalidade, alternativa, no primeiro e/ou Segundo polipeptídeos da primeira proteína dimérica o aminoácido nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em um IgG1 de cadeia pesada de humano são K, G, e Y, respectivamente; ou alternativamente R, G e W, respectivamente; ou alternativamente R, G e K, respectivamente, ou os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e Y436 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, e I, respectivamente. Além disso, no primeiro e/ou segundo polipeptídeos da segunda proteína dimérica os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são K, G, e K, respectivamente; ou alternativamente R, S, e K, respectivamente; ou alternativamente R, G, e R, respectivamente; ou alternativamente R, S, e R, respectivamente.

[00451] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da primeira proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, K439 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, E, e Y, respectivamente, e, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345, E430, Y436 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, I e K, respectivamente.

[00452] Em uma modalidade adicional, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da primeira proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K447 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é D ou E e, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K447 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é K, R ou H, e um aminoácido na posição correspondente a 448 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é P.

[00453] Em uma modalidade, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da primeira proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K447 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é D ou E e, no dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K447 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é K, R ou H, e o aminoácido na posição correspondente a 448 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é K, R ou H, e um aminoácido na posição correspondente a 449 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é P.

[00454] Em uma modalidade, no dito primeiro e segundo polipeptídeos da primeira proteína dimérica, os aminoácidos nas posições correspondentes a K439 e K447 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são D ou E; e D ou E, respectivamente, e, nos ditos primeiro e segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica os aminoácidos nas posições correspondentes a S440, K447 e 448 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são K ou R; K, R ou H; e P, respectivamente.

[00455] Em uma modalidade, tanto a dita primeira quanto segunda proteína dimérica compreendem os aminoácidos indicados tanto no dito primeiro quanto segundo polipeptídeos, e a outra proteína dimérica compreende os aminoácidos indicados somente no dito primeiro ou segundo polipeptídeo.

[00456] Em uma modalidade, tanto a dita primeira quanto segunda proteína dimérica compreendendo os aminoácidos indicados tanto no dito primeiro quanto segundo polipeptídeo. Em uma modalidade adicional, a primeira ou segunda proteína dimérica pode ser um anticorpo, e a outra proteína dimérica pode ser uma proteína de fusão ou um conjugado conforme descrito aqui.

[00457] Em uma modalidade, no primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita primeira proteína dimérica, as posições de aminoácido correspondentes a E345, E430, S440 e K447 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, Y e D/E, respectivamente, e, no primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, as posições de aminoácido correspondentes a E345, E430, S440, K447 e 448 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, Y, K/R/H e P, respectivamente, ou vice-versa.

[00458] Em uma modalidade, no primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita primeira proteína dimérica, as posições de aminoácido correspondentes a E345, E430, S440 e K447 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, Y, e D/E, respectivamente, e, no primeiro e/ou segundo polipeptídeos da dita segunda proteína dimérica, as posições de aminoácido correspondentes a E345, E430, S440, K447, 448 e 449 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são R, G, Y, K/R/H, K/R/H e P, respectivamente, ou vice-versa.

[00459] Em uma modalidade particular, a composição compreendendo uma primeira e uma segunda proteína dimérica, tanto o primeiro quanto o segundo polipeptídeo das ditas primeira e segunda proteínas diméricas compreendem os aminoácidos indicados nas posições específicas.

[00460] Em uma modalidade, pelo menos uma das ditas primeira e segunda proteínas diméricas é um anticorpo.

[00461] Em uma modalidade, tanto a primeira quanto a segunda proteína dimérica são anticorpos.

[00462] Em uma modalidade, a dita primeira e/ou segunda, tal como pelo menos uma das ditas proteínas diméricas, é uma proteína heterodimérica, tal como um anticorpo biespecífico. Ela pode ser qualquer proteína heterodimérica descrita aqui.

[00463] Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo anticorpos ligam no mesmo epítopo do mesmo antígeno.

[00464] Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo anticorpos compreendem as mesma sequências de região de cadeia pesada e leve variável.

[00465] Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo anticorpos ligam em antígenos diferentes ou em epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[00466] Em uma outra modalidade, as ditas primeira e/ou segunda, tal como pelo menos uma, das ditas proteínas diméricas é uma proteína de fusão.

[00467] As proteínas diméricas das composições dos aspectos ou modalidades anteriores podem conter regiões de ligação que ligam em um específico alvo.

[00468] Em uma modalidade, a composição compreende pelo menos uma proteína dimérica adicional de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção, tais como três ou seis, ou tais como quatro, cinco, sete, oito, nove ou mais proteínas diméricas.

[00469] Em uma outra modalidade, as ditas primeira e/ou segunda, tal como pelo menos uma, das ditas proteínas diméricas é um fragmento Fc.

[00470] Em uma modalidade, a composição compreende mais que duas diferentes proteínas diméricas, tais como três, quatro, cinco ou seis de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção.

[00471] Em uma modalidade particular, a composição compreende uma ou mais proteínas diméricas e um fragmento Fc, em que a dita uma ou mais proteínas diméricas compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo, e em que, no primeiro ou segundo polipeptídeo, os aminoácidos nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E, e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 correspondente à posição em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é Y, W, K ou R; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente; e em que o dito fragmento Fc compreende um primeiro e segundo polipeptídeos em que, tanto no dito primeiro quanto segundo polipeptídeo, os aminoácido nas posições correspondentes a E345 e E430 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E, e o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254, correspondente à posição em uma cadeia pesada de IgG1 de humano é Y, W, K ou R; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente. Em uma modalidade adicional, uma ou mais proteína dimérica e/ou fragmento Fc podem ser uma proteína de fusão ou um conjugado.

[00472] Em uma modalidade, a composição compreende duas proteínas diméricas de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção, em que a dita primeira proteína dimérica é ligada em um primeiro promedicamento, e a dita segunda proteína dimérica é ligada em um segundo promedicamento. Por exemplo, um do primeiro e segundo promedicamento pode ser capaz de ativação do outro.

[00473] Em uma modalidade, somente uma da primeira e segunda proteínas diméricas compreende uma região de ligação alvo. Isto pode ser usado, por exemplo, para composições farmacêuticas onde uma proteína dimérica “apenas He” é conjugada com um composto terapêutico ou diagnóstico é misturada com uma proteína dimérica com especificidade de ligação para um alvo.

[00474] Em uma modalidade, tanto a primeira quanto a segunda proteína dimérica compreendem uma região de ligação alvo. Se a primeira e segunda proteínas diméricas são proteínas heterodiméricas, elas podem ligar nos epítopos diferentes no mesmo alvo ou em alvos diferentes. Qualquer combinação com relação a tal ligação é prevista. Selecionando epítopos diferentes e/ou alvos para cada proteína dimérica, formação de hexâmero pode ser otimizada para ocorrer primeiramente nas células, bactérias ou vírions que expressam tanto os epítopos quanto alvos. Isto fornece um mecanismo para guiar uma resposta imune com respeito a tipos de célula específicos. Adicionalmente, uma mistura de proteínas diméricas ligando nos epítopos diferentes na mesma molécula alvo pode fornecer um efeito similar a um anticorpo policlonal.

[00475] Em algumas modalidades, pelo menos uma da primeira e segunda proteínas diméricas é um anticorpo da maneira definida aqui.

[00476] Em uma modalidade, tanto a primeira quanto a segunda proteína dimérica são anticorpos, representando um primeiro e segundo anticorpo. Em uma modalidade, os anticorpos ligam o mesmo epítopo do mesmo antígeno. Opcionalmente, as regiões de ligação de antígeno dos dois anticorpos são idênticas, isto é, compreendem as mesmas sequências de região de cadeia pesada e leve variável.

[00477] Em uma outra modalidade, o primeiro e segundo anticorpos ligam em diferentes antígenos ou em epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[00478] Em uma outra modalidade, o primeiro e segundo anticorpos ligam em antígenos diferentes nas células diferentes.

[00479] Em uma modalidade, o primeiro e segundo anticorpos podem cada qual ser selecionados do grupo que consiste, mas sem limitações, em anticorpo monoespecífico, biespecífico e multiespecíficos. Adicionalmente, em qualquer dos aspectos ou modalidades anteriores, pelo menos uma da primeira e segunda proteínas diméricas pode ser um anticorpo compreendendo pelo menos a região de ligação de antígeno de um anticorpo conhecido em uso clínico ou pré-clínico, por exemplo, selecionado dos “segundos anticorpos” listados anteriormente.

[00480] Exemplos não limitantes de composições incluem: a) uma primeira proteína dimérica que compreende uma região de ligação; b) uma primeira e segunda proteínas diméricas, em que as ditas primeira e segunda proteínas diméricas ligam em epítopos diferentes no mesmo alvo ou em alvos diferentes c) uma primeira proteína dimérica da presente invenção em que a dita primeira proteína dimérica compreende um aminoácido na posição correspondente a K439 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano que não é K, e a segunda proteína dimérica da presente invenção compreende um aminoácido em uma posição correspondente a S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano que não é S, Y, ou W; opcionalmente o aminoácido na posição K439 é E na primeira proteína dimérica e o aminoácido na posição S440 é K na segunda proteína dimérica. d) uma primeira proteína dimérica da presente invenção e uma segunda proteína dimérica em que o aminoácido na segunda proteína dimérica nas posições correspondentes a E345 e E430 de uma cadeia pesada de IgG1 de humano não é E e) uma primeira proteína dimérica da presente invenção e uma segunda proteína dimérica, por exemplo, um segundo anticorpo, em que os aminoácidos na segunda proteína dimérica nas posições correspondentes a E345 ou E430 de uma cadeia pesada de IgG1 de humano não são E. f) uma primeira proteína dimérica e uma segunda proteína dimérica, em que tanto a primeira quanto a segunda proteína dimérica compreendem uma mutação de aminoácido que modula uma ou mais funções efetoras e/ou perfil farmacocinético da dita primeira ou segunda proteína dimérica.

[00481] A primeira e segunda proteínas diméricas podem também incluir combinações dos aspectos descritos em a) a e). Por exemplo, as primeira e segunda proteínas diméricas podem, em particular, compreender ambos os recursos descritos em b) e c).

[00482] Em uma modalidade, a especificidade é aumentada quando uma combinação da primeira e segunda proteínas diméricas é ligada no seu alvo em uma célula ou vírion que expressa o alvo.

[00483] Em qualquer dos aspectos ou modalidades anteriores, a composição pode compreender pelo menos uma proteína dimérica adicional de acordo com a invenção. Por exemplo, a composição pode compreender três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou mais proteínas diméricas, cada qual de acordo com um aspecto ou modalidade da invenção. As quantidades relativas de cada proteína dimérica podem ser ajustadas para otimizar uma propriedade desejada dos hexâmeros formados, por exemplo, especificidade de célula alvo, função efetora, avidez e/ou estabilidade do hexâmero. Adicionalmente, uma composição compreendendo ligação de proteínas diméricas em epítopos diferentes no mesmo alvo pode parecer ou funcionar como uma composição de anticorpos policlonais.

[00484] A proteína dimérica e a segunda a molécula compreendidas em cada qual das composições descritas anteriormente podem alternativamente ser fornecidas como um kit de partes, para uso simultâneo, separado ou sequencial, por exemplo, em formação de imagem ou terapia.

Métodos

[00485] A presente invenção também refere-se a um método de aumentar oligomerização em solução e/ou uma função efetora de uma proteína dimérica precursora compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeos, cada qual compreendendo pelo menos CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina, o método compreendendo introduzir no primeiro e/ou segundo polipeptídeos substituições de aminoácido pelo menos nas posições correspondentes a E345, E430 e em uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00486] Em uma modalidade, a função efetora é citotoxicidade dependente do complemento (CDC).

[00487] Em uma modalidade, os dito primeiro e/ou Segundo polipeptídeos podem compreender adicionalmente uma região capaz de ligação covalente entre os ditos primeiro e segundo polipeptídeos.

[00488] Em uma modalidade, os dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos podem compreender adicionalmente uma região articulada.

[00489] Em uma modalidade, o método compreende introduzir nos ditos primeiro e segundo polipeptídeos substituições de aminoácido pelo menos nas posições correspondentes a E345, E430 e em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00490] Em uma modalidade, o método compreende introduzir nos ditos primeiro e segundo polipeptídeos substituições de aminoácido pelo menos nas posições correspondentes a E345, E430 e em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00491] Assim, em uma modalidade a presente invenção também refere-se a um método de aumentar uma ou ambas de uma função efetora ou oligomerização em solução de uma proteína dimérica precursora, compreendendo um primeiro e segundo polipeptídeos, cada qual compreendendo pelo menos regiões CH2, CH3 e de dobradiça de uma cadeia pesada de imunoglobulina, o método compreendendo introduzir em cada polipeptídeo substituições de aminoácido pelo menos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00492] Em uma modalidade, as substituições de aminoácido são pelo menos nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano.

[00493] Em uma modalidade, a substituição de aminoácidos na posição correspondente a E345 é, para cada polipeptídeo, selecionada do grupo que consiste em 345R, 345Q, 345N, 345K, 345Y, 345A, 345C, 345D, 345F, 345G, 345H, 345I, 345L, 345M, 345P, 345S, 345T, 345V e 345W, tal como do grupo que consiste em 345R, 345Q, 345N, 345K e 345Y.

[00494] Em uma modalidade, a substituição de aminoácido na posição correspondente a E430 é, para cada polipeptídeo, selecionada do grupo que consiste em 430G, 430T, 430S, 430F, 430H, 430A, 430C, 430D, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430V, 430W e 430Y, tal como do grupo que consiste em 430G, 430T, 430S, 430F e 430H.

[00495] Em uma modalidade, a substituição de aminoácido na posição correspondente a S440 é, em cada polipeptídeo, 440Y ou 440W.

[00496] Em uma modalidade, as substituições de aminoácido nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 são 345R, 430G e 440Y, respectivamente.

[00497] Em uma modalidade, as substituições de aminoácido nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são 345K, 430G e 440Y, respectivamente.

[00498] Em uma modalidade, as substituições de aminoácido nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são 345R, 430S e 440Y, respectivamente.

[00499] Em uma modalidade, as substituições de aminoácido nas posições correspondentes a E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são 345R, 430G e 440W, respectivamente.

[00500] Em uma modalidade, as substituições de aminoácido nas posições correspondentes a E345, E430 e Y436 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são 345R, 430G e 436I, respectivamente.

[00501] Em uma modalidade, as substituições de aminoácido nas posições correspondentes a E345, E430, Y436, e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 de humano são 345R, 430G, 436I, e 440Y respectivamente.

[00502] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o isótipo da sequência de cadeia pesada pode selecionado do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM e IgE.

[00503] Em qualquer uma das modalidades anteriores, a cadeia pesada pode ser de origem mamífera.

[00504] Em qualquer uma das modalidades anteriores, a cadeia pesada pode ser de origem primata ou murina, tal como de origem humana.

[00505] Em qualquer uma das modalidades anteriores, cada polipeptídeo pode compreender uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina associada com uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina, compreendendo regiões variáveis e constantes de cadeia leve para formar uma primeira e uma segunda região de ligação de antígeno, opcionalmente ligando no mesmo antígeno.

[00506] Na modalidade anterior, cada polipeptídeo da proteína dimérica pode compreender uma região constante de cadeia pesada de comprimento total, tal como uma região constante de cadeia pesada de comprimento total de IgG1 de humano.

[00507] Em qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína dimérica precursora pode ser um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo de comprimento total de IgG1.

[00508] A invenção também fornece qualquer proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos preparada pelo método de qualquer uma das modalidades anteriores.

[00509] A invenção também fornece uma proteína dimérica variante, tal como um anticorpo variante preparado pelo método de qualquer uma das modalidades anteriores. Especificamente, introdução de mutações nas posições designadas em uma proteína dimérica precursora de acordo com um método da presente invenção pode resultar em uma proteína dimérica da presente invenção. A proteína dimérica pode então ser considerada uma variante da proteína dimérica precursora, por exemplo, uma proteína dimérica variante. Assim, o(s) método(s) da presente invenção pode(m) ser realizado(s) de maneira a obter qualquer proteína dimérica descrita aqui.

[00510] A presente invenção também refere-se a um método para purificação de uma proteína dimérica de acordo com a presente invenção compreendendo purificação em uma coluna de proteína A ou proteína G a um pH abaixo de 6,8, tal como entre 5,0 e 6,5, por exemplo, entre 5,0 e 6,0, por exemplo, entre 5,0 a 5,5, e subsequentemente aumentando o pH acima de 6,8 ou acima de pH 7,0. Tampões para ajustar o pH podem ser qualquer um daqueles descritos aqui.

Kit de partes

[00511] A presente invenção também refere-se a um kit de partes compreendendo uma primeira proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descrito aqui, e uma segunda proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descrito aqui para uso simultâneo, separado ou sequencial em formação de imagem, diagnóstico ou terapia.

Usos

[00512] Conforme descrito aqui, a proteína dimérica da presente invenção forma estruturas hexaméricas em solução, por meio disso se assemelhando a moléculas de IgM. Além disso, da maneira descrita anteriormente, combinações de uma primeira e segunda proteínas diméricas da presente invenção, ou opcionalmente uma segunda molécula que não é uma proteína dimérica de acordo com a invenção, em que os componentes diferentes da combinação ligam em epítopos diferentes no mesmo alvo é prevista para criar composições que se assemelham às composições de anticorpo policlonal. Esses recursos e outros recursos da proteína dimérica da presente invenção a tornam particularmente adequada para certas aplicações. Recurso tipo IgM • IgM tem um principal papel em resposta imune a organismos infecciosos. Ele é um ativador potente do caminho do complemento clássico. • Anticorpos contra carboidratos são frequentemente de isótipo IgM. Carboidratos são alvos potenciais para tratamento de infecções bacterianas, fúngicas ou virais, câncer e doenças autoimunes. • Anticorpos de IgM são descritos por ter propriedades imune regulatórias e ser protetivos em inúmeras doenças autoimunes, como lúpus (SLE) e esclerose múltipla. IgM teriam também um papel protetivo em aterosclerose, infarto miocardial e acidente vascular cerebral, doença de pequeno vaso cerebral e doença de Alzheimer. (Groenwall et al 2012, Frontiers in Immunology 3, 1-10) • Anticorpos de ocorrência natural para células cancerígenas são frequentemente de isótipo IgM. • IgM (e IgA polimérico) tem uma função em exclusão imune no lado luminal das superfícies da mucosa. Para passive imunização, níveis protetivos de IgM (e polimérico IgA) pode ser distribuído diretamente nas superfícies da mucosa. • Produtos a base de IgM estão sendo desenvolvidos para indicações autoimunes, câncer e infecção.

[00513] A proteína dimérica da presente invenção poderia mimetizar os recursos tipo IgM de listados anteriormente quando em uma solução com pH ajustado, tal como pH 6,5 a 7,0, e, portanto, prevê-se que a proteína dimérica da invenção pode ser usada para tratamento de qualquer das ditas indicações.

[00514] Além do mais, ajustando o pH da solução, as proteínas diméricas da invenção podem ser em uma forma monomérica, isto é, como uma única proteína dimérica, ou hexamérica (conforme descrito no Exemplo 32). A expressão “forma monomérica” no contexto de proteína dimérica de acordo com a presente invenção refere-se a uma única proteína dimérica individual, que é composta de proteínas diméricas que não associam não covalentemente umas com as outras. Quando se refere a uma “forma hexamérica” deve-se entender como um complexo de seis proteínas diméricas simples não covalentemente associadas. Prevê-se que métodos de produção e purificação padrões usados para moléculas de IgG podem ser usados para as proteínas diméricas da invenção quando elas são em forma monomérica, tais como, mas sem limitações, o uso de resinas de proteína A e resinas de variante de proteína A para purificação, e o uso de ensaios de detecção do domínio de imunoglobulina a base de proteína A e variante de proteína A, por exemplo, aplicados em controle do processo, e o uso de cromatografia de troca de cátion para remoção de agregado concomitante durante a purificação da proteína, e o uso de nanofiltração para depuração viral, assim evitando problemas frequentemente encontrados durante a produção ou purificação proteínas de IgM. Depuração rápida • A forma hexamérica de proteínas diméricas da presente invenção é rapidamente limpa, a menos que quando combinada com tecnologias impedindo depuração rápida, conforme descrito aqui. Produtos de fragmento Fab, também sendo limpos rapidamente, estão sendo desenvolvidos/usados para tratamento de envenenamento, intoxicação por veneno, e para esgotar ligantes e/ou fatores solúveis em excesso ou abundantes. • Proteínas diméricas da presente invenção podem ter aplicações similares. • Proteínas diméricas da presente invenção podem também ser usadas para esgotar formas solúveis/espalhadas de proteínas da membrana que formariam um coletor para terapia alvejada por célula. Aspectos policlonais • Produtos do anticorpo policlonal têm o potencial de ação sinergística (melhor eficácia), e poderiam superar resistência a terapia adquirida. • Produtos do anticorpo policlonal estão sendo desenvolvidos/usados para tratamento de infecções virais ou bacterianas, intoxicação, (púrpura trobocitopênica imune), toxicidade de Digoxina, rejeição aguda a transplante renal e câncer.

[00515] A proteína dimérica da presente invenção, assim, tem aplicações similares e é, portanto, adequada para uso no tratamento de qualquer das ditas indicações.

[00516] Assim, em uma modalidade, as proteínas diméricas da presente invenção podem ser usadas para tratamento de qualquer das seguintes indicações: Doenças autoimunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (SLE), esclerose múltipla, ótica Neuromielite, síndrome de Sjogrens, síndrome de CREST, opsoclonia, miopatia Inflamatória, doença do tecido conectivo Misturado, esclerose Sistêmica, cirrose biliar Primária, doença Celíaca, síndrome de Miller-Fisher, neuropatia axonal motora Aguda, neuropatia motora Multifocal MMN, artrite Reumatoide, Osteoartrite, hepatite Autoimune, síndrome Anti-fosfolipídio, granulomatose de Wegener, polianginite Microscópica, síndrome de Churg-Strauss, Polimiosite, Esclerolimiosite, Miastenia grave, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, síndrome cerebelar Paraneoplástica, síndrome da pessoa Rígida, encefalite Límbica, coreia de Sydenham, PANDAS, Encefalite, encefalite límbica, Diabetes melito tipo 1, ataxia, Epilepsia parcial contínua, púrpura trobocitopênica Idiopática, anemia Perniciosa, anemia de Addison, falência gonadal Autoimune, doenças hemolíticas Autoimunes, tais como anemia autoimune hematológica e trombocitopenia associada com HIV, Pênfigo, penfigoide Bolhoso, Dermatite hepetiforme, dermatose de IgA Linear, Vitiligo, síndrome de Goodpasture, Miocardite, cardiomiopatia idiopática dilatada, doença de Crohn e colite ulcerativa, câncer, infecções bacterianas, infecções virais e fúngicas, envenenamento e intoxicação, ou doenças vasculares ou outras.

[00517] Exemplos de câncer, incluem, mas sem limitações, vários tipos de câncer tais como: tumores de o sistema nervoso central, câncer da cabeça e pescoço, câncer do pulmão (tais como câncer do pulmão de célula não pequena), câncer de mama câncer (tal como câncer mama triplo negativo), câncer esofageal, câncer do estômago, câncer do fígado e biliar, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer da bexiga, câncer do rim, câncer da próstata, câncer endometrial, câncer do ovário, melanoma maligno, sarcoma (tecido macio por exemplo, osso e músculo), tumores de origem primária desconhecida (isto é, primárias desconhecida), leucemia, câncer da medula óssea (tal como mieloma múltiplo) leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crônica e linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML), câncer de pele, glioma, câncer do cérebro, útero, e reto.

[00518] Assim, em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar uma doença, tais como câncer, doenças autoimunes, infecções, diabetes melito, rejeições de transplante de órgão, doenças oftalmológicas e depleção de C1q no sistema umeral, compreendendo a administração de uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição, kit de partes de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção.

[00519] Em uma modalidade, o câncer é um tumor, tal como um tumor no cérebro. A proteína dimérica de acordo com a invenção pode ser usada para obstruir mecanicamente o fluxo sanguíneo em vasos sanguíneo do tumor por injeção diretamente no tumor, tais como tumores do cérebro. A proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção pode ser particularmente usada para introduzir obstrução mecânica em tumores devido a sua capacidade de formar oligômeros, tais como dímero, trímeros, e hexâmeros. Quando a proteína dimérica, tal como um anticorpo de acordo com a presente invenção é usada no tratamento de câncer, é particularmente usada na superação de supressão de mecanismos efetores devido ao baixo pH do microambiente do tumor.

[00520] Em uma modalidade, a proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção é para uso no tratamento de tumores fazendo uso de distribuição de toxinas dependente do pH ou cargas úteis/medicamentos. Em tais usos, o pH mais baixo no sítio do tumor pode ser explicado quando a proteína dimérica, tal como um anticorpo, da presente invenção é fundida em uma toxina ou medicamento que tem função ideal no pH mais baixo no sítio do tumor.

[00521] Em uma modalidade, o método compreende as etapas de administrar na corrente sanguínea uma primeira proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção ligada em um primeiro promedicamento, e uma segunda proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da invenção ligada em um segundo promedicamento.

[00522] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de induzir uma função efetora imunomodulatória, tal como mediada através de CD32b e KIR, em que o método compreende administração da proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção, opcionalmente combinados com sialilação da proteína dimérica. Em um método como esse, a proteína dimérica da invenção induzirá agrupamento das moléculas alvos e, por meio disso, induzirá a função efetora imunomodulatória. Assim, a proteína dimérica de acordo com a invenção pode ser usada como uma alternativa para imunoglobulina intravenosa (IVIG).

[00523] Em uma modalidade, a proteína dimérica, tal como um anticorpo ou proteína de fusão Fc de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção pode ser usada para melhorar a depuração de uma molécula alvo da corrente sanguínea, tais como um ligante, um receptor, uma toxina, C1q, IgE, um anticorpo anti-enxerto, anticorpos anti- humanos de humano (HAHA), anticorpos antimedicamento (ADA), anticorpos antimurino de humano (HAMA), anticorpos antiquiméricos de humano (HACA), compostos farmacêuticos, e compostos imunomodulatórios.

[00524] A proteína dimérica de acordo com a invenção, tal como um fragmento Fc fundido em um antígeno, pode ter efeito imunoestimulatório melhorado quando em forma oligomérica, tal como uma molécula hexamérica, já que o oligômero fornece complexos de antígeno que, por exemplo, estimulam agrupamento de receptores da célula B direcionados para o dito antígeno, e facilitam a maturação de afinidade de receptores da célula B de baixa afinidade inicial apresentando o antígeno em uma forma multivalente. Isto pode ser obtido tanto quando a proteína dimérica de acordo com a invenção é em solução quanto é apresentada na superfície de uma célula, vírion, partícula tipo vírus, embutidos em um lipossomo ou em outras formas suportando apresentação de proteínas transmembranas comumente conhecidas na técnica. Assim, em uma modalidade, a proteína dimérica, tal como um fragmento Fc de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção, é para uso em vacinação, imunização e estímulo a resposta imune. Assim, em uma modalidade, a presente invenção também refere-se a um método para vacinação, imunização e estímulo a resposta imune compreendendo a administração da proteína dimérica conforme descrito aqui.

[00525] A proteína dimérica de acordo com a invenção pode ser usada para criar estruturas supramoleculares, que opcionalmente podem ser montadas de um modo dependente do pH, tanto em solução, bem como em uma superfície, tais como, mas sem limitações, a superfície de uma célula, vírion, partícula tipo vírus, lipossomo, microchipe, superfície sólida, andaime poroso, ou outros métodos para apresentação de proteína comumente conhecida na técnica.

[00526] Em uma modalidade, os dito primeiro e/ou segundo polipeptídeos da proteína dimérica podem compreender um domínio de ligação de proteína, tal como um domínio Fab, ligando especificamente um domínio Fab em um domínio Fc diferente contendo polipeptídeo. A proteína dimérica e sua molécula alvo podem ser usadas para a formação de estruturas supramoleculares, que podem opcionalmente ser montadas em um modo de pH controlado.

[00527] Em uma modalidade, a proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção, é para uso em cristalização de proteína. A proteína dimérica pode ser particularmente usada devido a sua capacidade de formar estruturas oligoméricas em um modo controlado de pH.

[00528] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método de usar a proteína dimérica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, para formação de complexo imune em kits de diagnóstico, tal como um ensaio de aglutinação. Um exemplo de um ensaio de aglutinação é o teste de Coombs.

[00529] Exemplos de infecções bacterianas, incluem, mas sem limitações, infecção de Staphylococcus aureus (S.aureus), por exemplo, Staphylococcus aureus resistente a Meticilina (MRSA), infecção de Pseudomonas aeruginosa, infecções causadas por um bactérias selecionadas do grupo que consiste em S. epiderme, S. pneumonia, Bacillus antracis, Chlamydia trachomatis, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitidas, e Mycobacterium tuberculosis. Exemplos de infecções virais e fúngicas incluem, mas sem limitações, vírus de West Nile, vírus da Dengue, vírus da hepatite C (HCV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), RVS, Aspergillus, Candida albicans, Cryptococcus, Histoplasma, citomegalovírus de humano (HCMV), vírus simplex da herpes, vírus sincicial respiratório de humano, papilomavírus de humano, vírus de Epstein-Barr, Herpesvírus, poxvírus, e vírus da influenza aviária. Exemplos de envenenamento e intoxicação incluem, mas sem limitações, digoxina, Colquicina, veneno de répteis tal como veneno de cobra, veneno de insetos tais como veneno abelha, vespa e lagarta, veneno de aranha, endotoxinas e exotoxinas Microbianas, tais como neurotoxinas de botulínio, toxina de tétano, toxinas Staphylococcal, toxina alfa, toxina Anthrax, toxina da Difteria, toxina da coqueluche, toxina de Shiga, toxina tipo Shiga.

[00530] Exemplos de doenças vasculares e outras podem ser, por exemplo, aterosclerose, infarto miocardial e acidente vascular cerebral, doença de pequeno vaso cerebral, doença de Alzheimer, e depleção de C1q em resistência a insulina hepática induzida por dieta de alta gordura e sistêmica a glicose tolerância, e a depuração de anticorpos anti-enxerto antes ou depois de transplante de órgão.

[00531] Em um aspecto, a presente invenção refere-se à proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com qualquer aspecto ou modalidades descritos aqui, para uso no tratamento de uma doença, tais como uma infecção bacteriana, viral ou parasítica, doença autoimune, câncer, inflamação e/ou redução do risco de choque séptico causado por uma infecção bacteriana.

[00532] Para o tratamento de infecções bacterianas e/ou redução do risco de choque séptico, a proteína dimérica da invenção pode, por exemplo, compreender uma região de ligação especificamente ligando em um lipopolissacarídeo (LPS), um lipo-oligossacarídeo (LOS), um delta endotoxina, toxina de butolínio, exotoxina de difterias Corynebacterium, um superantígeno bacteriano, uma enterotoxina termicamente estável, citolisina, um toxina de formação de canal, uma toxina enzimaticamente ativa ou uma micotoxina.

[00533] Em um outro aspecto, a invenção proporciona o uso da proteína dimérica, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores em formação de imagem, pelo menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero. Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para formação de imagem de pelo menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero, compreendendo administrar uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com qualquer aspecto ou modalidades descritos aqui.

[00534] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratar uma infecção bacteriana, viral ou parasítica, para formação de imagem de pelo menos uma parte do corpo de humano ou outro mamífero, ou para modular depuração de uma molécula alvo do corpo de um humano ou outro mamífero, compreendendo administrar uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição ou kit de partes de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descritos aqui.

[00535] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar uma doença, tal como câncer, doenças autoimunes, rejeições de transplante de órgão, e depleção de C1q no sistema humoral, compreendendo a administração de uma proteína dimérica, oligômero, hexâmero, composição, kit de partes de acordo com qualquer aspecto ou modalidade descrito aqui.

EXEMPLOS Exemplo 1 Projeto e geração de mutantes 005 do anticorpo CD38

[00536] O anticorpo monoclonal de humano HuMab 005 é um IgG1 totalmente de humano, cpVkeqtrq K descrito em WO/2006/099875, que é direcionado para CD38 de humano. Aqui, ele foi usado como um anticorpo modelo para testar a capacidade de mutações de Fc melhorar atividade de CDC. As mutações testadas são listadas na tabela 3.

[00537] Construtos de DNA para os diferentes mutantes foram preparados e transientemente transfectados usando a cadeia pesada de HuMab 005 com alotipo IgG1m(f) como um molde para reações de mutagênese. Resumidamente, mutantes foram preparados usando o kit de mutagênese direcionada ao sítio Quikchange (Stratagene, US). Um oligonucleotídeo iniciador direto e reverso que codifica a mutação desejada foi usado para replicar molde de DNA de plasmídeo de comprimento total que codifica a cadeia pesada 005 com alotipo IgG1m(f). A mistura de DNA resultante foi digerida usando DpnI para remover DNA de plasmídeo da fonte e usada para transformar E. coli. DNA de plasmídeo mutante isoladas de colônias resultantes foi verificado por sequenciamento de DNA (Agowa, Alemanha). Misturas de DNA de plasmídeo que codificam tanto cadeia pesada quanto leve de anticorpos foram transientemente transfectadas em células HEK293F Freestyle (Invitrogen, US) usando 293fectina (Invitrogen, US) essencialmente conforme descrito pelo fabricante.

[00538] Para testar a relevância funcional de interações Fc-Fc oligoméricas na ativação do complemento e CDC, aminoácidos no emplasto hidrofóbico na interface Fc:Fc foram mutados para romper potencialmente a interação lateral Fc-Fc e eficácia de CDC de 005. Mutações I253D e H433A foram introduzidas para mudar a carga nas posições que foram escolhidas com base na estrutura cristalina 1HZH e descritas para ser expostas em emplastos hidrofóbicos no domínio CH2-CH3 (Burton Mol Immunol 1985 Mar;22(3):161-206)).

[00539] A estrutura cristalina 1HZH mostra que I253 e H433 ligam dois diferentes sacos nas posições Fc opostas do anticorpo parceiro. Para excluir a possibilidade de que rompimento de sítios de ligação direta para C1q seja a causa dos efeitos observados em CDC, mutantes K439E e S440K foram gerados. Conforme mostrado na figura 4, K439 e S440 ficam voltados uns para os outras nos lados opostos na interface Fc:Fc, assim, K439E e S440K foram projetados para introduzir perda de CDC como único mutante inibindo a interação Fc:Fc mas, era de se esperar que restaurasse CDC durante a interação de unas com os outros, devido a interações Fc:Fc restauradas na mistura do anticorpo. Tabela 3: Ajuste de mutações que foram introduzidas no domínio CH2-CH3 de 005 (HuMax-CD38).

Exemplo 2 CD38 ligação nas células por HuMab-mutantes 005

[00540] Ligação de amostras de anticorpo não purificadas nas células Daudi e Raji CD38-positivo foi analisada por análise de FACS. 105 células foram incubadas em 322 μN em placas de base redonda de 96 poços de poliestireno com diluições em série de preparações de anticorpo (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 μg/mL) em BSA RPMI1640/0,1% a 4°C por 30 minutos. Depois de lavar duas vezes em BSA RPMI1640/0,1%, as células foram incubadas em 72" μN" com coelho H*cdÓ+2 IgG anti-humano FITC- conjugado (cat.no. F0056; DAKO; 1:150) a 4°C por 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em azido PBS/BSA 0,1%/azido 0,02%, ressuspensas em 322"μN"de PBS/BSA 0,1%/azido 0,02% e analisadas em um FACS Cantoll (BD Biosciences). Curvas de ligação foram analisadas usando software GraphPad Prism V5,01. Como um controle negativo, foi usado sobrenadante de células falsotransfectadas.

[00541] Ligação de HuMab 005 em células Daudi não foi muito afetada pela introdução de mutações de ponto no domínio CH2-CH3. Todos os anticorpos testados ligaram células Daudi de uma maneira dependente da dose. Ligação foi similar a HuMab-005 tipo selvagem para todos os mutantes testados, com a exceção de 005-E345R, que mostrou ligação ligeiramente menor. Entretanto, sem se ligar a nenhuma teoria, a menor ligação pode ser um resultado de ligação diminuída pelo anticorpo secundário. A avidez de ligação real por 005-E345R pode ser similar ou mesmo 005-WT comparado aumentado, entretanto não poderíamos confirmar isto em virtude da falta de anticorpos diretamente marcados.

[00542] Ligação de HuMab-005 em células Raji também não foi muito afetada pela introdução de mutações de ponto no domínio CH2-CH3. Todos os anticorpos testados ligaram células Raji de uma maneira dependente da dose. Ligação máxima foi similar àquela de 005 tipo selvagem para oa mutantes 005-I253D e H433A e menor para os mutantes 005-E435R, K439E, S440K e a combinação de 005-K439E + 005-S440K. Entretanto, sem se ligar a nenhuma teoria, a menor ligação pode ser um resultado de ligação diminuída pelo anticorpo secundário (blindagem do epítopo).

Exemplo 3 Ensaio de CDC nas células CD38-positivo por mutantes do anticorpo de CD38 005

[00543] 0,1 x 106 células Daudi ou Raji foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos não purificados (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 μg/mL) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador a RT. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de C1q (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00544] O impacto da mutação E435R em CDC foi adicionalmente analisado nas células Wien133 com soro de humano normal a diferente concentração (NHS). 0,1 x 106 células Wien133 foram pré-incubadas por 15 minutos em um agitador a RT em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos não purificados (0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 μg/mL) em um volume total de 50 μL. Em seguida, NHS foi adicionado como uma fonte de C1q para atingir uma concentração final tanto de 20% quanto de 50% de NHS em um volume total de 100 μL. A mistura da reação foi incubada em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00545] A Figura 5 mostra que 005-I253D, H443A, K439E e S440K mostraram perda completa de atividade de CDC tanto em células Daudi (Figura 5A) quanto em Raji (Figura 5B), enquanto que o mutante E345R de 005 mostrou atividade fortemente aumentada de CDC em ambas linhagens celulares. Comparável aos dados de 7D8, uma combinação de 005-K439E + 005-S440K, que ambos resultam em perda de CDC como um único mutante, resultou em CDC restaurada. Surpreendentemente, 005-E435R ainda induziu fortemente CDC em células Wien133, nas quais 005 tipo selvagem não é capaz para introduzir matança por CDC (Figura 5C). Matança de CDC por 005-E345R nas células Wien133 foi observada tanto com 20% quanto 50% de concentrações de soro (Figura 5C). Nas células Raji, tanto 7D8-E345R quanto 005-E345R mostraram CDC in vitro melhorado em 50% de soro, com eficácia similar como em 20% de soro (Figura 5D).

[00546] Como a mutação de E345R na região CH2-CH3 resultou em atividade aumentada de CDC tanto no anticorpo CD20 testado 7D8 quanto no anticorpo de CD38 005, a mutação de E345R é considerada uma modificação do anticorpo geral que pode ser aplicada para introduzir ou melhorar CDC.

Exemplo 4 Anticorpos de IgG1 contendo a mutação CDC que melhora E345R são menos sensíveis a inibição de CDC por peptídeo de ligação de Fc DCAWHLGELVWCT do que anticorpos tipo selvagem

[00547] Mutando posições de aminoácido no emplasto hidrofóbico na interface Fc:Fc de IgG, observou-se que a eficácia de CDC é tanto perturbada quanto melhorada. O envolvimento das interações na interface Fc-Fc, e assim possivelmente a formação de uma estrutura oligomérica (por exemplo, anel hexamérico) observada na estrutura cristalina b12, na eficácia de CDC foi adicionalmente explorado. Portanto, um peptídeo de 13 resíduos (DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO:7)) foi usado que alveja um sítio de ligação consenso na região do emplasto hidrofóbico na superfície de Fc de IgG tipo selvagem (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Certamente, a identificação do sítio de ligação consenso na superfície de Fc de IgG como uma região adaptável que é iniciada para interação com uma variedade de moléculas distintas (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83), é consistente com a identificação dos aminoácidos do núcleo no emplasto hidrofóbico que são envolvidos na interação Fc-Fc em a estrutura cristalina b12 de IgG1 (Saphire et al., Science 2001 Aug 10;293 (5532):1155-9). Interações que estão presentes em todas as interfaces de ligação são mediadas por um ajuste compartilhado de seis aminoácidos (Met- 252, Ile-253, Ser-254, Asn-434,His-435, e Tyr-436), bem como contatos da espinha dorsal compartilhados (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Dessa maneira, espera-se que o peptídeo de ligação de Fc afete a interação Fc-Fc e consequentemente a eficácia de CDC.

[00548] 0,1 x 106 células Daudi foram pré-incubadas em 75 μL com 1,0 μg/mL de anticorpo não purificado em placas de 96 poços de base redonda por 10 minutos à temperatura ambiente em um agitador. 25 μL de uma série de concentrações (faixa de concentração final 0,06-60 μg/mL) do peptídeo de ligação de Fc DCAWHLGELVWCT foram adicionados nas células opsonizadas e incubados por 10 minutos em um agitador a RT. Em seguida, 25 μL de NHS foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37 oC por 45 minutos. A reação foi interrompida adicionando 25 μL de meio RPMI resfriado em gelo, suplementados com BSA 0,1%. 15 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por análise de FACS.

[00549] Observou-se que CDC mediada por 005 tipo selvagem (Figura 6) é inibida pelo peptídeo de ligação de Fc DCAWHLGELVWCT de uma maneira dependente da dose. Esses dados de competição sugerem novamente o envolvimento das interações Fc-Fc no emplasto hidrofóbico de IgG na eficácia de CDC. O mutante de IgG1 E345R-005 melhorado por CDC foi menos sensível a competição pelo peptídeo de ligação de Fc comparado com os anticorpos tipo selvagem correspondentes, sugerindo que a mutação de E345R resulta em maior estabilidade da interação Fc-Fc, e consequentemente maior CDC.

Exemplo 5 Maior especificidade de CDC melhorada combinando E345R com mutações K439E e S440K de inibição complementar em uma mistura de dois diferentes anticorpos monoclonais

[00550] Conforme descrito no exemplo 3, mutações K439E e S440K do anticorpo de CD38 005 diminuíram a eficácia de CDC como anticorpos monoclonais. Mistura de anticorpos 005 contendo essas mutações restaurou CDC. CDC eficiente foi assim restrita a células ligadas por ambos anticorpos mutantes simultaneamente. Similarmente, foram observados dados para o anticorpo CD20 7D8 descritos em WO 2004/035607 (dados não mostrados).

[00551] Pode ser vantajoso restringir a melhoria de indução de CDC nas células alvos que expressam dois antígenos específicos simultaneamente, explorando sua expressão combinada para melhorar a seletividade de indução de CDC melhorada. Pode também ser vantajoso restringir a melhoria de indução de CDC em células alvos que são ligadas por misturas de pelo menos dois diferentes anticorpos simultaneamente, os ditos anticorpos ligando um antígeno da superfície da célula idêntico em dois epítopos diferentes simultaneamente, ou em dois epítopos similares ou idênticos de competição cruzada.

[00552] Portanto, para restringir indução de CDC melhorada nas células ligadas tanto por anticorpos de CD20 quanto CD38 simultaneamente, a mutação CDC que melhora E345R foi combinada com mutações de inibição de CDC nos anticorpos 7D8-E345R/K439E, 7D8-E345R/S440K, 005- E345R/S440K e 005-E345R/K439E. Esses anticorpos foram adicionados separadamente ou misturados 1:1 em experimentos de CDC da maneira a seguir. 0,1 x 106 células Wien133 (outros tipos de célula tal como Daudi ou células Raji podem também ser usados) foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos não purificados (concentração final 0,056-10,000 ng/mL em diluições de 3 vezes para 7D8-E345R/K439E, 7D8-E345R/S440K, 005-E345R/S440K ou 005- E345R/K439E) ou misturas de anticorpo (concentrações finais 0,01 μg/mL de anticorpo CD20 misturado com 0-333 ng/mL em anticorpo CD38 em diluições de 3 vezes; ou 3,3 μg/mL de anticorpo CD38 misturados com 0,0056-1,000 ng/mL em anticorpo CD20 em diluições de 3 vezes) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador a RT. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00553] Uma série de concentrações de anticorpo 005-E345R/K439E ou 005-E345R/S440K foi misturada com uma concentração fixa de 0,01 μg/mL de anticorpo mutante duplo 7D8 (concentração máxima com CDC mínima em células Wien133 como um único agente conforme determinado na Figura 7A) para fazer as combinações complementares 005-E345R/K439E + 7D8-E345R/S440K ou 005-E345R/S440K + 7D8-E345R/K439E. Figura 7C mostra que os anticorpos mutantes duplos CD38005 induziram CDC dependentemente da dose na presença de concentração fixa do anticorpo de CD20 7D8-E345R/K439E ou 7D8-E345R/S440K complementar, respectivamente. A eficácia de CDC por essas combinações complementares (Figura 7C) foi comparável com o único anticorpo mutante 005-E345R (melhorador) como um único agente (Figura 7B). Ao contrário, na presença de anticorpo b12 irrelevante, tanto 005-E345R/K439E quanto 005- E345R/S440K dificilmente mostrou qualquer CDC na série de concentrações testada (comparável com 005-E345R/K439E ou 005-E345R/S440K como únicos agentes mostrados na figura 7B).

[00554] Uma série de concentrações de anticorpo 7D8-E345R/K439E ou 7D8-E345R/S440K foi misturada com uma concentração fixa de 3,3 μg/mL anticorpo mutante duplo 005 (mostrando uma CDC pouca, mas limitada em células Wien133 como um único agente conforme determinado pela Figura 7B) para fazer as combinações complementares 7D8- E345R/K439E + 005-E345R/S440K ou 7D8-E345R/S440K + 005- E345R/K439E. Figura 7D mostra que os anticorpos mutantes duplos CD20 de 7D8 induziram CDC muito eficientemente na presença do anticorpo de CD38 005-E345R/K439E ou 005-E345R/S440K complementar respectivamente, mesmo a concentrações mais baixas testadas, se assemelhando não mais que algumas moléculas do anticorpo mutante duplo 7D8 por célula. Para eliminar a contribuição de densidade da cauda Fc aumentada na membrana da célula na CDC melhorada observada pela mistura de anticorpos 7D8 e 005 com mutações K439E e S440K complementares, também foram testadas combinações de anticorpo com mutações não complementares. Figura 7D mostra que combinações não complementares mostraram eficácia muito menor de CDC do que as combinações complementares, em decorrência de interação Fc-Fc menos eficientes do que as combinações complementares.

[00555] Esses dados sugerem que a indução de CDC (melhorada) por anticorpos terapêuticos pode ser limitada para células que ligam simultâneas uma mistura de dois anticorpos complementares, neste caso com diferentes especificidades de antígeno, por meio disso aumentando a especificidade de célula alvo exigindo coexpressão de ambos antígenos.

[00556] Como pose-se ver na figura 7A e 7B, 7D8-E345R/K439E, 005-E345R/S440K, 7D8-E345R/S440K e 005-E345R/K439E exibiram eficiência de CDC limitada em comparação com 7D8-E345R sozinho. Deve- se adicionalmente observar que a mistura de 7D8-E345R/K439E e 7D8- E345R/S440K permitiu CDC com eficiência melhorada comparada com anticorpo 7D8 tipo selvagem como único agente. Igualmente, observou-se que a mistura de 005-E345R/K439E e 005-E345R/S440K permitiu CDC com eficiência melhorada comparada com anticorpo 005 tipo selvagem como único agente (dados não mostrados).

Exemplo 6 Uso de uma abordagem de classificação de mutante para identificar mutações que estimulam oligomerização de anticorpo mediada por interação Fc:Fc detectadas por um ensaio de CDC

[00557] Conforme descrito no exemplo 3, foram identificadas mutações de aminoácido que estimularam CDC para um anticorpo que reconhece os antígenos alvos, CD38, nas múltiplas linhagens celulares que expressam níveis variáveis dos ditos antígenos. Surpreendentemente, a mutação de um único ponto E345R mostrou ser suficiente para doar lise celular dependente de CDC das células Wien133 para o anti-anticorpo de CD38 005, que não conseguiu lisar essas células por CDC em formato IgG1 tipo selvagem.

[00558] Outras mutações sobre ou na periferia da interface Fc:Fc poderiam estimular oligomerização e CDC em um modo análogo. Alternativamente, mutações poderiam indiretamente estimular oligomerização, por exemplo, induzindo alostericamente interações Fc:Fc.

[00559] Para determinar se outras mutações de aminoácido poderiam estimular oligomerização de anticorpo mediada por Fc, uma biblioteca de mutantes anti-CD38 IgG1-005 foi classificada usando ensaios de CDC, tanto individualmente quanto misturada em um modo em pares para selecionar, por exemplo, pares de aminoácidos interagindo através da interface Fc:Fc. Entretanto, a mesma estratégia pode ser aplicada a outros anticorpos, tal como um outro anticorpo IgG1 ou um IgG3.

[00560] Uma biblioteca de mutações focada nas posições indicadas na tabela 4 foi gerada. Mutações foram introduzidas na região Fc de IgG1-005 usando o kit de mutagênese direcionada ao sítio Quikchange (Stratagene, US). Resumidamente, para cada posição de mutação desejada, um oligonucleotídeo iniciador direto e reverso que codifica um códon degenerado no local desejado foi usado para replicar molde de DNA de plasmídeo de comprimento total de cadeia pesada 005 com alotipo IgG1m(f). As misturas de DNA resultante foram digeridas usando DpnI para remover DNA de plasmídeo da fonte e usadas para transformar E. coli. Colônias resultantes foram agrupadas e cultivadas e DNA de plasmídeo foi isolado desses agrupamentos e retransformados em E. coli para obter colônias clonais. DNA de plasmídeo mutante isolado de colônias resultantes foi verificado por sequenciamento de DNA (LGC genomics, Berlin, Alemanha). Cassetes de expressão foram amplificados de DNA de plasmídeo por misturas de PCR e DNA contendo uma cadeia tanto pesada de mutante quanto uma leve tipo selvagem de IgG1-005 foram transientemente transfectadas nas células HEK293F Freestyle (Invitrogen, US) usando 293fectina (Invitrogen, US) essencialmente conforme descrito pelo fabricante. Sobrenadantes de células transfectadas contendo anticorpos mutantes foram coletados. Sobrenadantes de anticorpo mutante foram classificados em ensaios de CDC tanto individualmente quanto em misturas em pares da maneira a seguir.

[00561] 0,1 x 106 células Daudi ou Wien-133 (outros tipos de células tais como células Raji podem ser usados) foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com 1,0 ug/mL de anticorpos não purificados em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador a RT. Em seguida, 30 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 30%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00562] Mutações descritas na tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6 foram selecionadas quanto a sua capacidade de melhorar oligomerização detectada por eficiência de CDC, tanto como um único mutante quanto quando misturada com outros mutantes, por exemplo, voltado para a mutação através da interface Fc:Fc. Mutações podem, opcionalmente, ser classificadas adicionalmente quanto a sua capacidade de não comprometer FcRn, ligação de Proteína-A ou Proteína-G, ADCC, ADCP ou outras funções efetoras mediadas pelo domínio Fc. Combinação de mutações de ponto estimulantes como essas em um domínio Fc podem estimular oligomerização e eficiência de CDC ainda mais.

[00563] Mutações na região CH2-CH3 incorporadas no anticorpo de CD38 005 foram testadas quanto a sua capacidade de inibir oligomerização conforme determinado por CDC em células Daudi. Lise do anticorpo mutante foi comparada com 005 tipo selvagem, para o qual lise foi estabelecida a 100%. O corte para inibição foi estabelecido a 0 86% de lise. Medida dessa maneira, a maioria das mutações testadas inibiu CDC (vide tabela 4).

[00564] Mutações na região CH2-CH3 incorporadas no anticorpo de CD38 005 foram testadas quanto a sua capacidade de melhorar oligomerização conforme determinado por CDC em células Wien133 (Tabela 5). Anticorpo de CD38 005 tipo selvagem não é capaz para introduzir CDC em células Wien133. Mutantes exibindo >39% de lise celular foram pontuados como melhoradores. De forma completamente inesperada, virtualmente todas as substituições de aminoácidos E345 e E430 obtidas estimularam lise celular por CDC. Para verificar este resultado, aminoácidos E345, E430 e S440 foram substituídos com qual mutação possível por mutagênese direcionada ao sítio e testados quanto a sua capacidade de melhorar oligomerização conforme determinado por CDC de células Wien133 usando um novo lote de soro de humano, produzindo lise ligeiramente mais eficiente (Tabela 6). Novamente, todas as substituições de E345 e E430 induziram CDC eficiente de células Wien133.

[00565] As mutações preferidas seguintes causaram >39% de lise celular de células Wien133: P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y e S440W. Tabela 4- Porcentagem de lises de célula Daudi na presença de 1,0 μg/mL de mutações de ponto do anticorpo IgG1-005. IgG1-005 tipo selvagem lisou 66% de células nessas condições. Para cada qual das posições individuais que foi substituída por um outro aminoácido são dados na coluna esquerda externa. O aminoácido substituído para cada posição particular é dado seguido pela porcentagem de lise medida indicada em parênteses () nas fileiras horizontais das posições individuais.

Tabela 5 Porcentagem de lise de células Wien-133 na presença em 1,0 μg/mL de mutantes de ponto do anticorpo IgG1- 005. IgG1-005 tipo selvagem lisou 3% de células nessas condições. Para cada qual das posições individuais que foram substituídas por um outro aminoácido são dadas na coluna esquerda externa. O aminoácido substituído para cada qual posição particular é dado seguido pela porcentagem de lise medida indicada em parênteses () nas fileiras horizontais das posições individuais.

Tabela 6 Porcentagem de lise de células Wien-133 na presença de 1,0 μg/mL de mutantes de ponto do anticorpo IgG1- 005. IgG1-005 tipo selvagem lisou 12% de células nessas condições. Cada qual das posições individuais que foi substituída por um outro aminoácido são dadas na coluna esquerda externa. O aminoácido substituído para cada posição particular é dado seguido pela porcentagem de lise medida indicada em parênteses () nas fileiras horizontais das posições individuais.

Exemplo 7 Eficácia in vivo de IgG1-005-E345R em um modelo de xenoenxerto de linfoma da célula B subcutâneo

[00566] A eficácia antitumoral in vivo de o anticorpo IgG1-005-E345R foi avaliada em um modelo subcutâneo com células Raji-luc #2D1. Essas células mostram ~150.000 moléculas de CD38 por célula (determinadas por análise QIFIKIT, dados não mostrados) e alta expressão do receptor de defesa do complemento. O protocolo para tumor inoculação e medição é basicamente o mesmo descrito no Exemplo 20. No dia 0, 5x106 células Raji- luc #2D1 em 200 μL de PBS foram injetadas s.c. no flanco direito de camundongos SCID. Quando o volume do tumor médio foi 100 mm3 (em torno do dia 7), os camundongos foram classificados em grupos (n=7) e tratados por injeção i.p. de uma dose única de 722 μi de anticorpo por camundongo (25 mg/kg). Grupos em tratamento são mostrados na tabela 7. Tumores foram medidos até um volume do tumor de ponto final de 1.500 mm3 ou até os tumores mostrarem ulcerações ou sérios sinais clínicos serem observados para evitar maiores desconforto.

[00567] A Figura 8A mostra crescimento do tumor médio no dia 21, quando todos os grupos foram ainda completos. Anticorpo IgG1-005 tipo selvagem inibiu ligeiramente o crescimento do tumor, embora isto não tenha sido estatisticamente significante. Somente IgG1-005-E345Rsignificativamente inibida crescimento do tumor comparado com o controle de anticorpo irrelevante no dia 21 (ANOVA a uma variável p< 0,05).

[00568] A Figura 8B mostra um gráfico Kaplan-Meier da porcentagem de camundongos com tamanhos de tumor menores que 500 mm3. Formação de tumor foi significativamente atrasado em camundongos tratados com anticorpo IgG1-005-E345R comparados com camundongos tratados com anticorpo IgG1-b12 de controle negativo (análise Mantel-Cox p<0,001) ou IgG1-005 tipo selvagem (p<0,05).

[00569] Esses dados mostram que a introdução da mutação de E345R no anticorpo de CD38 005 resultou em atividade antitumoral in vivo melhorada. Tabela 7: Grupos em tratamento e dosagem.

Exemplo 8 Ligação monovalente no alvo aumenta adicionalmente a eficácia de CDC de anticorpos E345R

[00570] Uma superfície molecular do anel hexamérico de IgG1 observada na estrutura cristalina b12 demonstra que para cada IgG no anel hexamérico, um dos dois sítios de ligação de C1q é voltado para cima e o outro sítio é voltado para baixo da estrutura do anel, e também um braço Fab de cada anticorpo é orientado para cima e um é orientado para baixo, resultando somente em um braço Fab por anticorpo para fazer parte em ligação de antígeno, sugerindo ligação monovalente por molécula do anticorpo no anel do anticorpo hexamérico. Monovalência pode levar anticorpos mediante ligação de antígeno para uma orientação compatível de hexamerização. Para testar esta hipótese, a eficácia de CDC de um anticorpo CD38/EGFR biespecífico com a mutação de E345R foi testada nas células Wien133 CD38-positivas, EGFR-negativas, nas quais este anticorpo biespecífico pode ligar apenas monovalentemente por meio de CD38, e comparada com a eficácia de CDC do anticorpo CD38 de ligação bivalente, também com a mutação de E345R. O anticorpo monoclonal de humano HuMax-EGFr (2F8, descrito em WO 2004/056847) foi usado como uma base para os anticorpos EGFR descritos neste exemplo.

[00571] Anticorpos biespecíficos foram gerados in vitro de acordo com a plataforma de FwqDqf{™. isto é, troca de braço Fab induzida por 2-MEA conforme descrito em WO 2011/147986. A base para este método é o uso de domínios CH3 complementares, que promovem a formação de heterodímeros em condições de ensaio específicas. Para permitir a produção de anticorpos biespecíficos por este método, moléculas de IgG1 carregando certas mutações no domínio CH3 foram geradas: em um do anticorpo parental de IgG1 e mutação de F405L, no outro anticorpo parental de IgG1 e mutação de K409R. Para gerar anticorpos biespecíficos, esses dois anticorpos parentais, cada anticorpo a uma concentração final de 0,5 mg/mL, foi incubado com 2- mercaptoetilamina-HCl (2-MEA) 25 mM em um volume total de 100 μL de TE a 37°C por 90 minutos. A reação de redução é interrompida quando o agente de redução 2-MEA é removido usando colunas giratórias (Microcon filtros centrífugos, 30k, Millipore) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00572] Para o ensaio de CDC, 0,1 x 106 células Wien133 foram pré- incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos (0,01 a 10,0 μg/mL) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador a RT. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00573] A Figura 9 mostra que, como esperado, anticorpos CD38 na mutação de E345R (IgG1-005 tipo selvagem e IgG-b12-K409R x IgG1-005- F405L) não induziram matança de células Wien133. Também, o anticorpo EGFR IgG1-2F8-E345R/F405L, que não ligou as células Wien133 EGFR- negativa (dados não mostrados), não induziu CDC, como esperado. A introdução da mutação K409R não influenciou a capacidade de o anticorpo IgG1-005-E345R introduzir ~60% de matança nas células Wien133 (descrito no exemplo 10). Interessantemente, o anticorpo CD38/EGFR biespecífico IgG1-005-E345R/K409R x IgG1-2F8-E345R/F405L, que pode ligar apenas monovalentemente nas células Wien133 CD38-positivas, EGFR-negativas, mostrou maior matança máxima de CDC (de ~60% a ~100% de matança).

[00574] Esses dados mostram que alvejamento monovalente pode aumentar adicionalmente a máxima capacidade de matança de anticorpos contendo a CDC que melhora mutação de E345R. Além disso, esses dados mostram que a oligomerização de E345R que aumenta a mutação, medida melhorando a atividade de CDC, pode ser aplicada em outros formatos de anticorpo, tal como DuoBody.

Exemplo 9 A oligomerização que aumenta mutação de E345R pode ser aplicada em outros formatos de anticorpo tal como DuoDofv™

[00575] O efeito da mutação de E345R foi testado em um anticorpo biespecífico do formato DuoBody. Ensaios de CDC foram realizados com anticorpos biespecíficos de CD20/CD38 em células Wien133 e Raji CD20- positivas, CD38-positivo.

[00576] Anticorpos biespecíficos foram gerados conforme descrito no Exemplo 8. Para o ensaio de CDC, 0,1 x 106 células Wien133 ou Raji foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos (0,01 a 30,0μg/mL) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador de 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00577] A Figura 10 mostra que introdução da mutação de E345R CDC melhorada do anticorpo biespecífico IgG1-005-F405L x IgG1-7D8- K409R em células Wien 133 (Figura 10A) e Raji (Figura 10B). Esses dados mostram que a oligomerização de E345R que aumenta mutação pode ser aplicada em outros formatos de anticorpo para melhorar atividade de CDC.

Exemplo 10 E345R resgata CDC por anticorpo de EGFR 2F8, que pode ser adicionalmente melhorado por ligação no alvo monovalente

[00578] Conforme descrito nos Exemplos 3 e 12, CDC melhorou ou resgatou E345R para anticorpos que reconhecem diferentes alvos de tumor hematológico (CD20 e CD38). Para estender a análise a um antígeno do tumor sólido, o efeito de E345R na capacidade de CDC do anticorpo de EGFR 2F8 foi testado em células de carcinoma A431 epidermoide. Além disso, o efeito de alvejamento de EGFR monovalente na indução de CDC mediada por E345R foi testado usando um anticorpo EGFRxCD20 biespecífico (IgG1-2F8-E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R) nas células A431 EGFR-positivas, CD20-negativas.

[00579] Anticorpos biespecíficos foram gerados conforme descrito no Exemplo 8. Para o ensaio de CDC, 5 x 106 células A431/mL foram marcadas com 100 μCi 51Cr por 1 hora a 37°C. As células foram lavadas três vezes com PBS e ressuspensas em meio a uma concentração de 1 x 105 células/mL. 25.000 células marcadas foram incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos não purificados (0-30 μg/mL em diluições de 3 vezes) em um volume total de 100 μL por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, 50 μL de diluição de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 25%) e incubados em um incubador 37 ° C por 1 hora. As células foram centrifugadas (3 minutos a 300xg) e 25 μL sobrenadante foram adicionados a 100 μL microscint em uma OptiPlate de 96 poços branca (PerkinElmer) para incubação em um agitador (750 rpm) por 15 minutos. Liberação de 51Cr foi determinada como contagens por minuto (cpm) em uma contra cintilação. Lise máxima (100%) foi determinada pelo nível de 51Cr medido no sobrenadante de células tratadas com Triton X-100. Lise espontânea foi determinada pelo nível de 51Cr medido no sobrenadante de células incubadas sem anticorpo. Lise celular específica foi calculada de acordo com a fórmula: Lise específica =100 x (cpm da amostra - cpm espontânea)/(cpm máxima - cpm espontânea).

[00580] A Figura 11 mostra que IgG1-2F8-E345R/F405L é capaz de lisar células A431 por CDC, enquanto que 2F8 tipo selvagem não é capaz de matar células A431. Esses dados mostram que a atividade de CDC pode ser resgatada no anticorpo de EGFR 2F8 por introdução da mutação de E345R. Isto estende potencialmente a aplicabilidade da CDC que aumenta a mutação de E345R em anticorpos que alvejam antígeno dos tumores sólidos.

[00581] Anticorpo EGFRxCD20 biespecífico de IgG-2F8- E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R mostrou CDC aumentou adicionalmente nas células A431 EGFR-positivas, CD20-negativas.

[00582] Esses dados adicionalmente suportam a hipótese de que monovalência facilita a formação de interações Fc-Fc e indução subsequente de CDC como postulado para um anticorpo de ligação de CD38 descrito no exemplo 8.

Exemplo 11 E345R aumenta ou resgata CDC por anticorpo CD38 003 e anticorpos CD20 11B8 e rituximab

[00583] Conforme descrito nos Exemplos 3 e 12, E345R aumenta ou induz atividade de CDC de diversos anticorpos com diferentes especificidades de alvo (CD20, CD38 e EGFR), conforme foi testado nas múltiplas linhagens celulares que expressam níveis variáveis dos ditos antígenos. Portanto, introdução da mutação de E345R foi considerada um mecanismo geral para aumentar ou resgatar CDC para anticorpos existentes. Para suportar adicionalmente isto, o efeito da mutação de E345R em CDC foi testado para mais anticorpos com eficácia intrínseca variável de CDC em células Daudi e Wien133: anticorpo CD38 003, descrito em WO 2006/099875 e anticorpos CD20 rituximab (tipo I) e 11B8 (tipo II), descritos em WO 2005/103081. Anticorpos CD20 podem ser divididos em dois subgrupos (Beers et al. Seminars in Hematology 47, (2) 2010, 107-114). Anticorpos CD20 tipo I exibem uma notável capacidade de ativar complemento e elicitar CDC redistribuindo as moléculas de CD20 na membrana plasmática nos rafts lipídicos, que agrupa as regiões Fc do anticorpo e permite ligação de C1q melhorada. Anticorpos CD20 tipo II não trocam apreciavelmente distribuição CD20 e sem agrupamento concomitante, eles são relativamente ineficientes em CDC.

[00584] 0,1 x 106 células Daudi ou Raji foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos não purificados (0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0 μg/mL) em um volume total de 70 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 30 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de C1q (concentração final 30%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00585] A Figura 12 mostra que a mutação de E345R CDC melhorada para todos os anticorpos testados tanto de células Daudi (A) quanto Wien133 (B). Interessantemente, nas concentrações usadas todos os anticorpos que não induziram CDC no formato tipo selvagem, induziram CDC eficientemente depois da introdução da mutação de E345R: CD38 mAb 003 e CD20 tipo II mAb 11B8 nas células Daudi, e CD38 mAbs 005 e 003 e CD20 tipo II mAb 11B8 nas células Wien133. Esses dados sugerem que melhoria de oligomerização de anticorpo, mais especificamente por introdução de uma mutação de E345R, é um mecanismo geral para melhorar ou resgatar CDC por anticorpos existentes.

Exemplo 12 E345R melhora internalização de anticorpos de Fator de Tecido

[00586] Para testar se oligomerização melhorada pode induzir maior internalização do anticorpo, estudos de colocalização de anticorpos Fator de Tecido (TF) tipo selvagem e E345R mutados com o marcador lisossomal LAMP1 foram realizados por microscopia confocal.

[00587] Células SK-OV-3 foram crescidas em lamínulas de vidro (espessura 1,5 micron, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemanha) em meio de cultura de tecido padrão a 37°C por 1 dia. As células foram pré- incubadas por 1 hora com 72 μilmL de leupeptina (Sigma) para bloquear atividade lisossomal, depois do que 32 μilmL de anticorpo de Fator de Tecido (TF) (WO 2010/066803) foram adicionados. As células foram incubadas por mais 1, 3 ou 16 horas a 37°C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente (RT) com 4% de formaldeído (Klinipath). As lâminas foram lavadas com bloqueando tampão (PBS suplementada com 0,1% saponin [Roche] e 2% BSA [Roche]) e incubados por 20 minutos com bloqueando tampão contendo 20 mM NH4Cl para finalizar formaldeído. Lâminas foram lavadas novamente com tampão de bloqueio e incubadas por 45 minutos à temperatura ambiente com um coquetel de CD107a-APC de camundongo-anti-humano (BD Pharmingen) para identificar LAMP1 lisossomal e IgG-FITC de cabra-anti- humano (Jackson) para identificar anticorpos TF. As lâminas foram lavadas novamente com tampão de bloqueio e montadas por toda a noite em lâminas de microscópio usando 42"μN" de meio de montagem (6 gramas de Glicerol [Sigma] e 2,4 gramas de Mowiol 4-88 [Omnilabo] foram dissolvidos em 6 mL água destilada nos quais 12 mL Tris 0,2 M [Sigma] pH 8,5 foram adicionados seguido por incubação por 10 minutos a 5 0-60°C; meio de montagem foi aliquotado e armazenado a -20°C). As lâminas foram imageadas com um microscópio confocal Leica SPE-II (Leica Microsystems) equipado com uma lente objetiva de imersão de óleo 63 x 1,32-0.6 e software LAS-AF.

[00588] Imagens TIFF de escala cinza de 12-bit foram analisadas quanto a colocalização usando software MetaMorph® (versão Meta Series 6.1, Molecular Devices Inc, Sunnyvale Califórnia, USA). Imagens foram importadas como pilhas e o fundo foi subtraído. Ajustes de patamares idênticos foram usados (ajustados manualmente) para todas as imagens FITC e todas as imagens APC. Colocalização foi representada como intensidade de pixel de FITC na região de interesse (ROI), foram o ROI é composta de todas as regiões positivas de APC. Para comparar diferentes lâminas manchadas com diferentes anticorpos TF, as imagens foram normalizadas usando a intensidade de pixel de APC. CD107a-APC de camundongo-anti-humano foi usado para manchar o marcador lisossomal LAMP1 (CD107a). A intensidade de pixel de LAMP1 não deveria diferir entre vários anticorpos TF imageados.

[00589] Valores normalizados para colocalização de FITC e APC são expressos como unidades arbitrárias de acordo com a formula [(TPI FITC x porcentagem de colocalização)/100] x [1/TPI APC]

[00590] Porcentagem de colocalização = TPI FITC que colocaliza com um pixel APC/TPI APC

[00591] TPI, intensidade de pixel total

[00592] A Figura 13 representa a quantidade de intensidade de FITC de pixel de anticorpos TF mutados tipo selvagem e E345R que sobrepõem com marcador lisossomal APC-marcado. Para cada anticorpo ou condição testada, três diferentes imagens foram analisadas de uma lâmina contendo ~ 1, 3 ou >5 células. Variação foi observada entre as diferentes imagens em cada lâmina. Ficou ainda evidente que a mutação de E345R para anticorpos 011 e 098 resultou em maior colocalização lisossomal depois de 1 hora de incubação, quando comparados com 011 e 098 tipo selvagem. Esses resultados indicam que a mutação E345R induz internalização e colocalização lisossomal mais rápida e poderia, portanto, potencializar conjugados de medicamento do anticorpo.

Exemplo 13 CDC melhorada por mutação de E345R em rituximab em diferentes linhagens de célula B com expressão de CD20 similar, mas níveis diferentes de proteínas regulatórias de complemento ligadas na membrana

[00593] Exemplos 11 e 14 mostram que a eficácia de CDC de rituximab tipo selvagem em células Daudi e Wien133 foi melhorada introduzindo a mutação de E345R. Esta eficácia de CDC melhorada resulta da estabilização mediada por E345R de interações Fc-Fc. A estrutura do anel de anticorpo hexamérica concomitantemente formada na membrana da célula alvo pode então promover geração eficiente do complexo de ataque da membrana facilitando a captura e concentração de componentes do complemento ativados próximos da membrana da célula. Em decorrência desta ativação do complemento eficiente, os efeitos de inibição de proteínas regulatórias de complemento ligadas na membrana (mCRP) poderiam ser parcialmente superados. Sobre-expressão de mCRPs, tal como CD55, CD46 e CD59, é considerada uma barreira para imunoterapia bem sucedida com anticorpos monoclonais antitumorais (Jurianz et al., Mol Immunol 1999 36:929-39; Fishelson et al. Mol Immunol 2003 40:109-23, Gorter et al., Immunol Today 1999 20:576-82, Zell et al., Clin Exp Immunol. 2007 Dec 150(3):576-84). Portanto, a eficácia de rituximab-E345R foi comparada com aquela de rituximab tipo selvagem em uma série de linhagens de célula B com diferentes níveis das mCRPs de CD46, CD55 e CD59, mas níveis comparáveis à expressão de CD20 alvo.

[00594] As linhagens de célula B Daudi, WIL2-S, WSU-NHL, MEC-2 e ARH-77 expressam quantidades comparáveis de moléculas de CD20 (~250.000 capacidade de ligação de anticorpo específico - sABC) conforme determinado por análise QIFIKIT (dados não mostrados). Para comparar os níveis de expressão de proteínas regulatórias de complemento entre essas linhagens celulares, análise QIFIKIT foi realizada para determinar os níveis de CD46 (CD46, CBL488 de camundongo anti-humano, clone J4.48 Chemicon), CD55 (CD55, CBL511 de camundongo anti-humano, Clone BRIC216, Chemicon), e CD59 (CD59, MCA1054x de camundongo anti- humano, clone MEM-43, Serotec).

[00595] Para o ensaio de CDC, 0,1 x 106 células foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpo de saturação (0,002-40,0 μg/mL em diluições de 4 vezes) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS. A matança máxima mediada por CDC foi calculada de dois experimentos independentes usando os melhores dos valores de ajuste de um ajuste não linear em GraphPad PRISM 5.

[00596] A Figura 14A-D mostra que introdução de E345R em rituximab tipo selvagem resultou em eficácia de CDC melhorada observada por uma maior lise maximal e menor EC50 para todas as linhagens de célula B testadas.

[00597] A Figura 14E mostra que a matança máxima mediada por CDC induzida pelo mutante rituximab-E345R foi quase maior que por rituximab tipo selvagem, independente dos níveis de expressão das proteínas regulatórias de complemento ligadas na membrana. Esses dados indicam que introdução de E345R melhora o potencial terapêutico de anticorpos monoclonais, já que as células tumorais são menos efetivas em evadir ataque do complemento mediado por anticorpo pelos anticorpos contendo E345R.

Exemplo 14 Comparação de cinética de CDC para anticorpos tipo selvagem e E345R

[00598] Introdução da interação Fc:Fc que estabiliza mutação de E345R mostrou melhorar ou resgatar CDC observada por menores valores de EC50 e maior lise maximal para diferentes anticorpos em diferentes linhagens celulares descritas no exemplo 3 (anticorpo de CD38 005 em Daudi, Raji e Wien133) e Exemplo 11 (anticorpo CD38 003 e anticorpos CD20 rituximab e 11B8 em Daudi e Wien133). Em seguida, a cinética das reações de CDC foi analisada para elucidar adicionalmente a diferença na eficácia de CDC entre anticorpos tipo selvagem e E345R.

[00599] 0,1 x 106 células Raji foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com anticorpo a uma concentração de saturação (10,0 μg/mL) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por diferentes períodos de tempo, variando entre 0 e 60 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00600] A Figura 15A mostra que anticorpo tipo selvagem CD20 IgG1-7D8 mostrou uma matança máxima mediada por CDC de 80% das células Raji, que já atingiram depois de 5 minutos nas condições testadas. Entretanto, para IgG-7D8-E345R, 80% de matança de células Raji foram observados ainda mais cedo, depois de 3 minutos. Lise maximal por IgG- 7D8-E345R (95%) foi também atingida depois de 5 minutos.

[00601] A Figura 15B mostra que também para rituximab de anticorpo tipo selvagem CD20, que é menos potente do que 7D8 para introduzir CDC nas células Raji usadas, introdução da mutação de E345R resultou em matança mais rápida das células alvos. Rituximab tipo selvagem mostrou uma matança máxima mediada por CDC de 32%, que foi atingida depois de 20 minutos. Rituximab-E345R atingiu 32% de matança já depois de aproximadamente 3 minutos e notavelmente, lise maximal por rituximab- E345R (85%) foi também atingida depois de 20 minutos.

[00602] A Figura 15C+D mostra que as células Raji usadas, que são resistentes a matança mediada por CDC por anticorpos tipo selvagem CD38 IgG1-003 e IgG1-005, poderiam ser mortas rapidamente introduzindo a mutação de E345R. IgG1-003-E345R e IgG1-005-E345R mostraram CDC maximal (50% e 60%, respectivamente) já depois de 5 minutos.

[00603] Resumidamente, anticorpos E345R são mais potentes do que suas contrapartes tipo selvagem, que resultam de uma combinação de maior eficácia (menor EC50), maior lise maximal e uma cinética mais rápida da reação de CDC.

Exemplo 15 Comparação de cinética de CDC para anticorpos biespecíficos com ou sem mutação de E345R

[00604] No exemplo 9, é descrito que a mutação de E345R pode ser aplicada no IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R do anticorpo biespecífico de CD38xCD20 que foi gerado pela plataforma DuoBody, resultando em uma capacidade de matança melhorada observada por uma diminuição da EC50 em ensaios de CDC em células Raji e Wien133. Em seguida, a cinética da reação de CDC foi analisada para elucidar adicionalmente a diferença na eficácia de CDC entre os anticorpos biespecíficos de CD38xCD20 com e sem E345R.

[00605] 0,1 x 106 células Raji foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com anticorpo a uma concentração de saturação (10,0 μg/mL) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37 oC por diferentes períodos de tempo, variando entre 0 e 60 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00606] A Figura 16 mostra que o IgG1-005-F405L x IgG1-7D8- K409R do anticorpo biespecífico induziu uma matança máxima mediada por CDC de 83%, que foi atingida depois de 10 minutos. Introdução de E345R resultou em uma maior matança maximal por IgG1-005-E345R-F405L x IgG1-7D8-E345R-K409R (98%), que foi já atingida depois de 2 minutos. Esses dados indicam que introdução da mutação de E345R estabilizante de Fc-Fc no anticorpo biespecífico resulta em uma matança acelerada mediada por CDC das células alvos.

Exemplo 16 Comparação de cinética de CDC para anticorpos de ligação monovalente com e sem E345R

[00607] Exemplo 8 mostra que ligação no alvo monovalente melhorou adicionalmente a eficácia de CDC de anticorpos E345R observada por maior lise maximal com um anticorpo biespecífico de CD38xEGFR nas células Wien133 CD38-positivas, EGFR-negativas. Em seguida, a cinética da reação de CDC foi analisada para elucidar adicionalmente a diferença em matança mediada por capacidade de CDC entre anticorpos monovalentemente de ligados com e sem E345R.

[00608] Anticorpos de CD38xEGFR e CD20xEGFR, biespecíficos com ou sem a mutação de E345R foram gerados in vitro de acordo com a plataforma DuoBody conforme descrito no Exemplo 8. A eficácia de CDC dos anticorpos de CD38xEGFR biespecíficos foi testada nas células Raji CD38-positivas, EGFR-negativas, nas quais os anticorpos biespecíficos podem ligar apenas monovalentemente por meio de CD38. 0,1 x 106 células Raji foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com anticorpo a uma concentração de saturação (10,0 μg/mL) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37 oC por diferentes períodos de tempo, variando entre 0 e 60 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00609] A Figura 17 mostra que anticorpo biespecífico de CD38xEGFR (IgG1-005-K409R x IgG1-2F8-F405L) induziu uma matança máxima mediada por CDC de 55%, que foi atingida depois de aproximadamente 10 minutos. Introdução de E345R resultou em uma maior matança maximal (96%), que foi já atingida em 5 minutos.

[00610] A Figura 17 mostra que anticorpo biespecífico de CD20xEGFR (IgG1-7D8-K409R x IgG1-2F8-F405L) induziu uma matança máxima mediada por CDC de 85%, que foi atingida depois de aproximadamente 5 minutos. Entretanto, com o anticorpo de CD20xEGFR com E345R introduzido, 85% de lise foi observada mais rápida depois de 2 minutos. Lise maximal pelo anticorpo de CD20xEGFR E345R (97%) foi também atingida depois de 5 minutos.

[00611] Resumidamente, introdução da mutação de E345R nesses anticorpos de ligação monovalente resultou em anticorpos mais potentes, que resultaram de uma combinação de maior lise maximal e uma cinética mais rápida da reação de CDC.

Exemplo 17 CDC por uma combinação de anticorpos terapêuticos e E345R/Q386K

[00612] Conforme descrito no exemplo 6, anticorpos mutantes de CD38 derivados de IgG1-005 poderiam induzir CDC eficiente em células Wien133 quando a posição de E345 do anticorpo tipo selvagem foi substituída por qualquer aminoácido sem ser Glutamato (E). Isto sugere que oligomerização, como um pré-requisito de CDC, é prejudicada pela presença da cadeia lateral de glutamato na posição 345 do anticorpo. Uma vez que E345 em um Fc está em proximidade imediata com Q386 na voltado para a segunda fração de Fc na estrutura do anel de anticorpo hexamérica, o impedimento mediado por E345 de oligomerização em um primeiro anticorpo poderia possivelmente ser removido por substituições na posição Q386 de um segundo anticorpo. Isto permitiria então E345 que o primeiro anticorpo interaja melhor com a posição 386 mutada no segundo anticorpo em caso de ambos anticorpos serem combinados. Para testar esta hipótese, ensaios de CDC foram realizados em Wien133, nas quais anticorpos tipo selvagem (IgG1-003, IgG1-005 ou IgG1-11B8) foram misturados com IgG1-005- E345R/Q386K ou IgG1-005-E345R/Q386K/E430G como um exemplo.

[00613] 0,1 x 106 células Wien133 foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de IgG1-005- E345R/Q386K, IgG1-005-E345R/Q386K/E430G não purificada ou controle de anticorpo (0,0001-20,0 μg/mL em 3,3 diluições de 3 vezes) na presença ou ausência de 1,0 ou 10,0 μg/mL de anticorpo IgG1-003, IgG1-005 ou IgG1- 11B8 tipo selvagem em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00614] A Figura 18A/B/C mostra que anticorpo CD38 IgG1-005- E345R/Q386K induziu lises de célula Wien133 mediadas por CDC de um modo dependente da dose (linha tracejada). Combinação de IgG1-005- E345R/Q386K com 1 ou 32 μilmL de anticorpo tipo selvagem CD38 IgG1- 003 (Figura 18A) ou anticorpo tipo selvagem CD20 IgG1-11B8 (Figura 18B) resultou em uma maior lise maximal de célula. Combinação de IgG1- 005-E345R/Q386K com IgG1-005 tipo selvagem inibiu CDC de um modo dependente da dose, possivelmente competindo com o sítio de ligação (Figura 18C).

[00615] A Figura 18D/E/F mostra resultados similares para anticorpo CD38 IgG1-005-E345R/Q386K/E430G.

[00616] Esses dados indicam que anticorpos IgG1-003 e IgG1-11B8 tipo selvagem participaram da oligomerização de anticorpo e ativação de CDC quando combinados com IgG1-005-E345R/Q386K ou IgG1-005- E345R/Q386K/E430G. Em tais combinações, o impedimento de oligomerização pela posição de E345 que está presente no anticorpo tipo selvagem poderia ser removido pelo menos parcialmente pela substituição de Q386K no anticorpo mutante. Esta aplicação é, em particular, interessante para melhorar terapias com anticorpos que são tipo selvagem na posição de E345, tais como rituximab, ofatumumab, daratumumab ou trastuzumab. Também, anticorpos de indução de oligomerização como esses podem promover formação de complexos ligados na célula com anticorpos do próprio paciente direcionados para células alvos tipo células tumorais ou bactérias.

[00617] Exemplo 6 descreve múltiplos aminoácidos além do E345 que melhoram CDC mediante mutação, por exemplo, E430 e S440, das quais mutações específicas induziram CDC eficiente em células Wien133 quando incorporadas em anticorpo CD38 IgG1-005. Com a exceção de mutantes I253 e Y436, as mutações melhoradoras de oligomerização identificadas contataram aminoácidos não mutados voltados para a segunda fração de Fc na estrutura hexamérica do anel. Portanto, pode-se esperar que as mutações melhoradoras de oligomerização identificadas, tanto sozinhas quanto combinadas, também promovam oligomerização com anticorpos não mutados, e otimização adicional de tais mutantes poderia ser obtida por uma estratégia de seleção similar àquela aplicada no exemplo 6.

Exemplo 18 E345R induziu CDC em isótipos do anticorpo IgG2, IgG3 e IgG4

[00618] Para testar se a introdução de mutações de promoção de oligomerização pode estimular a atividade de CDC de isótipos de anticorpo não IgG1, variantes isotípicas do anticorpo CD38 IgG1-005 foram gerados com domínios constantes de IgG2, IgG3 ou IgG4 de humano produzindo IgG2-005, IgG3-005 e IgG4-005 por métodos conhecido na técnica. Além disso, a oligomerização que aumenta mutação de E345R foi introduzida em todos esses anticorpos, produzindo IgG2-005-E345R, IgG3-005-E345R e IgG4-005-E345R. De uma maneira similar, também IgG2-003 e IgG2-003- E345R foram gerados do anticorpo CD38 IgG1-003. Eficácia de CDC dos diferentes isótipos foi comparada em um ensaio de CDC in vitro.

[00619] 0,1 x 106 células Wien133 foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com 32 μilmL de anticorpos não purificados em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. IgG1-005-E345R foram adicionados a 3,0 μi1mL. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00620] A Figura 19 mostra que IgG2-005, IgG2-003, IgG3-005 e IgG4-005 foram incapazes de lisar tanto células Daudi (A) quanto Wien133 (B) eficientemente nas condições testadas (os ~20% de lise observados foram considerados como fundo). Introdução da mutação de E345R permitiu CDC potente em células Daudi por todos os isótipos de IgG testados. Esses resultados foram confirmados usando CDC em células Wien133, embora IgG3-005-E345R exibiu atividade limitada de CDC com relação às outras variantes isotípicas. Esses dados indicam que, além de IgG1, uma oligomerização que aumenta mutação tal como E345R pode também ser aplicada para promover atividade de CDC de anticorpos de IgG2, IgG3 e IgG4.

Exemplo 19 CDC por IgG1-005 e IgG1-005-E345R em um ensaio ex vivo de CDC em células de leucemia linfocítica crônica de célula B CD38-positiva (CLL) derivadas do paciente.

[00621] Células primárias criopreservadas de amostras de paciente de CLL foram obtidas do biobanco hematológico de CDB-IDIBAPS-Hospital Clinic (Dr. Elias Campo, Hematopathology Unit, Department of Pathology, Hospital Clinic, Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), University de Barcelona, Barcelona, Espanha), ou de estudos clínicos pela National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (Dr. Adrian Wiestner, NHLBI, Hematology Branch of the National Institutes of Health (NIH), Bethesda). Consentimento informado foi obtido de todos os pacientes de acordo com o Institutional Ethics Committee of the Hospital Clinic (Barcelona, Espanha) ou o Institutional Reveiw Board of the NIH and the Declaration of Helsinki. Todas as amostras foram genética e imunofenotipicamente caracterizadas.

[00622] As amostras de CLL foram categorizadas em dois grupos de acordo com sua expressão de CD38 determinada por FACS: cinco amostras foram incluídas no grupo alto CD38 (entre 50% e 98% da expressão de CD38 nas células Daudi) e quatro amostras foram incluídas no grupo baixo CD38 (entre 0,5% e 3% da expressão de CD38 nas células Daudi).

[00623] Células de CLL fluorescentemente marcadas (marcando com 5 μM de Calceína AM) foram incubadas com uma série de concentrações de anticorpo (0,01-12 μilmL em diluições de 10 vezes). Em seguida, soro de humano normal foi adicionado nas células de anticorpo opsonizado (100.000 células/poço) como uma fonte de complemento (10% de concentração final) e incubado por 45 minutos a 37 °C. Sobrenadantes foram recuperados e fluorescência foi lida em um fluorômetro HT U{pgtgy™ como uma medida para lise celular. Matança celular foi calculada da maneira a seguir: Lise específica = 100 x (amostra-lise espontânea)/(lise máxima - lise espontânea) onde lise máxima é determinada por uma amostra de células tratadas com Triton 1%, e lise espontânea é determinada pelas amostras onde células foram incubadas na presença de 10% de NHS sem anticorpo.

[00624] A Figura 20 mostra que IgG1-005-E345R melhorou fortemente a eficácia de CDC comparado com IgG1-005 tipo selvagem tanto em células de CLL primárias com alta expressão de CD38 quanto em células de CLL primárias com baixa expressão de CD38.

Exemplo 20 IgG1-005-E345R/E430G/S440Y forma complexos hexaméricos não covalentes em solução

[00625] O triplo mutante IgG1-005-E345R/E430G/S440Y foi preparado usando o kit de mutagênese direcionada ao sítio Quikchange (Stratagene, US). Resumidamente, oligonucleotídeos iniciadores diretos e reversos que codificam a mutação desejada E345R foram usados para replicar molde de DNA de plasmídeo de comprimento total que codifica a cadeia pesada 005 de IgG1 com alotipo IgG1m(f). A mistura de DNA resultante foi digerida usando DpnI para remover DNA de plasmídeo da fonte e usada para transformar E. coli. DNA de plasmídeo mutante isolado de colônias resultantes foi verificado por sequenciamento de DNA (Agowa, Alemanha). A mutação E430G foi introduzida na espinha dorsal de IgG1-005-E345R usando a mesma estratégia. A mutação S440Y foi introduzida na espinha dorsal de IgG1-005-E345R/E430G usando a mesma estratégia. Misturas de DNA de plasmídeo que codifica anticorpos tanto de cadeia pesada quanto leve de foram transientemente transfectadas nas células HEK293F Freestyle (Invitrogen, US) usando 293fectin (Invitrogen, US), essencialmente conforme descrito pelo fabricante. O anticorpo resultante é um homodímero contendo a mutação tripla E345R/E430G/S440Y em ambas as cadeias pesadas.

[00626] Anticorpos de IgG1-005 e IgG1-005-E345R/E430G/S440Y foram purificados por cromatografia de afinidade da proteína A. Os sobrenadantes da cultura de célula foram filtrados em um filtro de extremidade morta de 0,20 μM, seguido por carregamento em uma coluna de proteína A de 5 mL (rProtein A FF, GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e eluição do IgG com ácido cítrico NaOH 0,1 M, pH 3. O eluato foi imediatamente neutralizado com Tris-HCl 2 M, pH 9 e dialisado por toda a noite em fosfato de sódio 12,6 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 (B. Braun, Oss, Países Baixos). Depois de diálise, as amostras foram filtradas estéreis em um filtro de extremidade morta de 0,20 μM. proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE, PAGE nativa, HP-SEC, dispersão de luz em múltiplos ângulos (MALS), e dispersão de luz dinâmica (DLS).

[00627] SDS-PAGE foi realizada em condições redutoras e não redutoras em 4 a 12% de géis NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Breda, Países Baixos) usando um método Laemmli modificado (Laemmli 1970 Nature 227(5259): 680-5), onde as amostras foram corridas a pH neutro. Os géis de SDS-PAGE foram manchados com Coomassie e digitalmente imageados usando o GeneGenius (Synoptics, Cambridge, UK). Figura 21 mostra que IgG1-005-E345R/E430G/S440Y exibiu comportamento típico de anticorpos de IgG1 com cadeias pesadas e leves ligadas por dissulfeto. Uma única espécie molecular com MW aparente de aproximadamente 150 kDa foi visível nas condições não redutoras, enquanto, nas condições redutoras, uma cadeia pesada com MW aparente de 50 kDa e cadeia leve de 26 kDa foi visível. Concluímos que, em condições desnaturantes, uma molécula monomérica é formada exibindo comportamento altamente similar aos anticorpos de IgG1 tipo selvagem.

[00628] PAGE nativa foi realizada nas condições não redutoras usando um gel de proteína Sebia Hydragel 15/30 (Westburg, Leusden, Países Baixos), manchando violeta ácida e correndo em um instrumento Hydrasys (Sebia, Vilvoorde, Bélgica). Figura 21 mostra que IgG1-005- E345R/E430G/S440Y corre a uma altura similar àquela do controle de anticorpo de IgG1-b12 não relacionado, embora ligeiramente mais difusa. O manchamento difuso observado poderia ser causado por formação de complexos instáveis mas, nessas condições de PAGE, o IgG1-005- E345R/E430G/S440Y comportou predominantemente como uma molécula de IgG 1 monomérica.

[00629] Fracionamento de HP-SEC foi realizado usando uma unidade de separação Waters Alliance 2975 (Waters, Etten-Leur, Países Baixos) conectada em uma coluna TSK HP-SEC (G3000SWxl; Toso Biosciences, via Omnilabo, Breda, Países Baixos), um detector X duplo Waters 2487 de absorbância (Waters), e uma unidade de detecção Mini Dawn Treos MALS (Wyatt). Amostras de 50 μL contendo 1,25 μg/mL de proteína foram separadas a 1 mL/minuto em Na2SO4 0,1 M/fosfato de sódio 0,1 M tamponadas a pH 6,8. Resultados foram processados usando software Empower versão 2002 e expressos por pico como porcentagem de área de pico total. Figura 22 mostra que >99% de IgG1-005 tipo selvagem consistiram em IgG monomérico intato, sem praticamente nenhum agregado formado. Figura 23 mostra que o triplo mutante IgG1-005- E345R/E430G/S440Y mostra um grande oligômero da fração que foi estimado em 79%, enquanto 21% da população eluíram em um pico observado no tempo de eluição esperado para uma espécie monomérica.

[00630] Uma sobreposição dos perfis HP-SEC de IgG1-005 e IgG1-005-E345R/E430G/S440Y tipo selvagem é mostrada na figura 24 e ilustra adicionalmente a diferença de comportamento entre os dois anticorpos. IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y claramente formou altos complexos de MW, embora esses complexos parecessem ser sensíveis a separação de HP-SEC, conforme indicado pela quantidade significativa de proteína eluindo entre os dois picos. Possivelmente, o cisalhamento causado por separação de HP-SEC pode desestabilizar os complexos não covalentes formados por montagem de monômeros de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y.

[00631] Para avaliar o tamanho do complexo oligomérico observado na amostra de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y, o peso molecular médio do eluato de HP-SEC foi determinado por dispersão de luz em múltiplos ângulos (MALS). Enquanto o pico monomérico secundário eluiu com um MW médio aparente de 143 kDa (145,4 kDa esperado), o pico multimérico eluiu com um MW médio aparente de 772 kDa, ou aproximadamente 5,4 subunidades monoméricas. O MW do complexo é provavelmente subestimado devido à instabilidade do complexo nessas condições. Por exemplo, uma mistura co- eluindo de 88% de espécie hexamérica e 12% de espécie monomérica resultaria em um tamanho observado de complexo médio de 5,4 unidades de monômero.

[00632] Para avaliar o peso molecular aparente em solução, na ausência do cisalhamento possivelmente induzido por interações com a matriz HP-SEC, análise de dispersão de luz dinâmica (DLS) foi realizada. 45 μL de 0,2 μM de IgG1-005 (3,80 mg/mL) ou IgG1-005-E345R/E430G/S440Y (2,86 mg/mL) filtrada em PBS pH 7,4 foram analisados usando um instrumento DynaPro-801 (Protein Solutions Inc/Wyatt, Dernbach, Alemanha) em uma cubeta de quartzo de 100 μL, registrando vinte medições consecutivas por experimento, em três experimentos independentes. Calibrado usando o MW de BSA como uma referência, o MW de IgG1-005 aparente foi 141,7 kDa (esperado 145,4), enquanto IgG1-005-E345R/E430G/S440Y exibiu um MW de aproximadamente 875,6 kDa, ou 6,17 subunidades monoméricas. Nenhuma indicação de oligomerização foi observada para o anticorpo IgG1- 005, enquanto IgG1-005-E345R/E430G/S440Y sugeriu formação de complexo altamente eficiente.

[00633] Resumidamente, os dados biofísicos indicam que mutante IgG1-005-E345R/E430G/S440Y forma moléculas tipo IgG ligadas por dissulfeto que são monoméricas, isto é, única proteína dimérica, nas condições desnaturantes observadas por SDS-PAGE e forma complexos hexaméricos em solução observados por DLS. O cisalhamento imposto por PAGE nativa foi suficiente para dissociar completamente os complexos, enquanto HP-SEC desestabilizou parcialmente complexos predominantemente hexaméricos, conforme indicado pela presença de uma fração de monômeros secundária.

Exemplo 21 Ensaios funcionais com IgG1-005, IgG1-005-E345R/E430G/S440Y e IgG1-005-E345R ELISA de ligação de C1q

[00634] Ligação de C1q por IgG1-005 tipo selvagem, triplo mutante IgG1-005-E345R-E430G-S440Y e IgG1-005-E345R foi testada em um ELISA no qual os anticorpos purificados foram imobilizados na superfície de plástico, realizando multimerização de anticorpo aleatória. Soro de humano agrupado foi usado como uma fonte de C1q.

[00635] Placas ELISA Microlon de 96 poços (Greiner, Alemanha) foram revestidas por toda a noite a 4°C com uma série de diluições dos anticorpos em PBS (faixa de 0,007-25,0 μg/mL em diluições de 2,5 vezes). As placas foram lavadas e bloqueadas com 422 gN/poço de PBS 0,5x suplementada com Tween 20 0,025% e gelatina 0,1%. Com lavagens entre incubações, as placas foram sequencialmente incubadas com 3% de soro de humano agrupados (Sanquin, product# M0008) por 1 hora a 37°C, com 100 gN/poço de C1q de coelho anti-humano (DAKO, product# A0136, 1/4,000) por 1 hora à temperatura ambiente, e com 322"gN/poço de IgG-HRP de suíno anti-coelho (DAKO, P0399, 1:10.000) como anticorpo de detecção por 1 hora à temperatura ambiente. Desenvolvimento foi realizado por cerca de 30 minutos com 1 mg/mL de 4.4Ó-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6- sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). A reação foi interrompida pela adição de 322 μL de ácido oxálico 2%. Absorbância foi medida a 405 nm em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT). Dados Log transformados foram analisados ajustando curvas de resposta a dose sigmoidais com inclinação variável usando software GraphPad Prism. A partir das curvas de resposta a doses sigmoidais, os valores de EC50 foram calculados.

[00636] A Figura 25 e Tabela 8 mostram que IgG1-005- E345R/E430G/S440Y mostrou ligação de C1q mais eficiente do que IgG1- 005 e IgG1-005-E345R de WT medido por ELISA (menor valor de EC50). Eficácia do revestimento foi testada para os três anticorpos e observou-se que eram similares (não mostradas).Tabela 8: EC50 para ligação de C1q em ELISA

Ensaio de CDC nas células Ramos CD38-positivo

[00637] 0,1 x 106 células Ramos foram pré-incubadas em placas de 96 poços de base redonda com uma série de concentrações de anticorpos purificados (10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,005, 0,0025, 0,0013, 0,0006 e 0,0003 μg/mL) em um volume total de 100 μL por 15 minutos em um agitador à temperatura ambiente. Em seguida, 25 μL de soro de humano normal foram adicionados como uma fonte de complemento (concentração final 20%) e incubados em um incubador a 37°C por 45 minutos. A reação foi interrompida colocando as placas em gelo. 10 μL de iodeto de propídio foram adicionados e lise celular foi determinada por FACS.

[00638] Um modelo de três fases foi usado para ajustar os dados de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y e o valor de EC50 do meio foi calculado (Tabela 9). IgG1-005-WT e IgG1-005-E345R poderiam ser ajustados ajustando curvas de resposta a dose sigmoidais com inclinação variável. A partir da curva de resposta a dose sigmoidal, o valor de EC50 foi calculado (Tabela 9). Software GraphPad Prism foi usado para ajustar os dados (Figura 26). IgG1-005-E345R/E430G/S440Y mostrou atividade aumentada de CDC comparada com Anticorpos IgG1-005 e IgG1-005- E345R tipo selvagem nas células Ramos. O modelo de três fases de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y pode ser explicado pelo fato de que a baixas concentrações (entre 0,0003 e 0,03 μg/mL) os anticorpos em um hexâmero estável não ligam todos em um alvo para introduzir CDC eficiente. Efetivamente, sítios de ligação de C1q de superfície da célula são criados por ligando IgG1-005-E345R/E430G/S440Y já a baixas concentrações de anticorpo, em virtude de o agrupamento de antígenos não se necessário para hexamerização do anticorpo. Tabela 9: EC50 para CDC

Ensaio repórter de ADCC usando células Raji CD38-positivo

[00639] Atividade de ADCC de anti-anticorpos CD38 opsonizados em célula Raji alvo foi medida usando um ensaio repórter bioluminescentes de ADCC (Promega Madison, WI, USA) no qual ativação do caminho biológico nas células efetoras é quantificada.

[00640] O ensaio reportador usa as células efetoras Jurkat transfectadas estavelmente com o gene para xctkcpVg fq tgegrVqt fg HeyTIIIc, V158 (alta afinidade), e o gene reportado de luciferase de vagalume clonado depois de um elemento de resposta de NFAT (fator nuclear de células T ativadas) acionando expressão de luciferase. Ligação de anticorpo no receptor de HeyTIIIc nas células efetoras induz transcrição de gene mediada por NFAT e, assim, expressão de luciferase que é quantificada pela etapa de leitura de luminescência. Células Raji foram incubadas com uma série de concentrações de anticorpos purificados (250, 71,4, 20,4, 5,8, 1,7 e 0,5 ng/mL). Vide para descrição adicional dos materiais e métodos o manual técnico fornecido por Promega. IgG1-005-E345R/E430G/S440Y induziu caminho ativação NFAT depois de encaixe do tgegrVqt fg HeyTIIIc. Figura 27 mostra que células Raji opsonizadas com IgG1-005-E345R/E430G/S440Y induziram ativação de células efetoras mediada por FcgRIIIa medida no ensaio reportado. O valor de EC50 para IgG1-005-E345R/E430G/S440Y foi maior do que para IgG1-005 e IgG1-005-E345R tipo selvagem (Tabela 10). Entretanto, o sinal maximal para IgG1-005-E345R/E430G/S440Y foi maior do que para IgG1-005 e IgG1-005- E345R tipo selvagem (Tabela 10). Tabela 10 : EC50 e maximal sinal para ADCC ensaio reporter

Exemplo 22 Pharmacokinetic (PK) análise de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y comparada com IgG1-005 tipo selvagem

[00641] Os camundongos neste estudo foram alojados em uma unidade de barreira do Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, Países Baixos) e mantidos em gaiolas topo de filtro com água e alimento fornecido ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados pelo Utrecht University animal ethics committee. Os camundongos SCID (C.B-17/IcrCrl-scid-BR, Charles- River) foram injetados intravenosamente com 722 μi de anticorpo (IgG1-005 ou IgG1-005-E345/E430G/S440Y tipo selvagem) usando 3 camundongos por grupo.

[00642] 50 μL de amostras de sangue foram coletados da veia safena a 10 minutos, 4 horas, 1 dia, 2 dias, 7 dias, 14 dias e 21 dias depois de administração de anticorpo. Sangue foi coletado em frascos contendo heparina e centrifugado por 5 minutos a 10.000 g. Plasma foi armazenado a - 20°C até a determinação de concentrações de anticorpo.

[00643] Concentrações de IgG de humano específicas foram determinadas usando um sanduíche ELISA de hIgG e CD38 específico total. Para o ELISA de hIgG total, mAb de camundongo anti-IgG de humano-kapa clone MH16 (#M1268, CLB Sanquin, Países Baixos), revestido nas placas ELISA Microlon de 96 poços (Greiner, Alemanha) a uma concentração de 2 μilmL foi usado como anticorpo de captura. Depois de bloquear as placas com PBS suplementada com albumina de soro bovino 0,2%, as amostras foram adicionadas, tampão ELISA diluído serialmente (PBS suplementado com Tween 20 0,05% e albumina de soro bovino 0,2%), e incubadas em um agitador de placa por 1 hora à temperatura ambiente (RT). As placas foram subsequentemente incubadas com imunoglobulina de IgG de cabra anti- humano (#109-035-098, Jackson, West Grace, PA) e desenvolvidas com 4.4Ó- azino-bis (ácido 3-etilbenztiazolina-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). Absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm. Para o ELISA de CD38 específico, extracelular domínio de CD38 His marcado foi revestido com placas ELISA Microlon de 96 poços (Greiner, Alemanha) a uma concentração de 4"μi1mL. Depois de bloquear as placas com tampão ELISA, as amostras diluídas serialmente com tampão ELISA foram adicionadas e incubadas em um agitador de placa por 1 hora à temperatura ambiente (RT). As placas foram subsequentemente incubadas com 30 ng/mL de camundongo IgG1 anti humano-HRP, (Sanquin M1328, clone MH161-1) e desenvolvidas com 4.4Ó-azino-bis (ácido 3- etilbenztiazolina-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). Absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm.

[00644] A Figura 28 mostra que as concentrações plasmáticas de IgG de humano foram consideravelmente menores para mutante IgG1-005- E345R/E430G/S440Y do que para IgG1-005 tipo selvagem em todos os pontos de tempo testados. Figura 29 mostra que a taxa de depuração de IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y foi aproximadamente 50x maior do que aquela de WT IgG1-005.

Exemplo 23 O estado de oligomérico IgG1-005-E345R/E430G/S440Y pode ser controlado por composição de tampão

[00645] Fracionamento de HP-SEC de anticorpos de IgG1-005 e IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y foi realizado usando uma unidade de separação Waters Alliance 2975 (Waters, Etten-Leur, Países Baixos) conectada em uma coluna TSK HP-SEC (G3000SWxl; Toso Biosciences, via Omnilabo, Breda, Países Baixos), um fgVgeVqt fg cduqtdâpekc X fwrnq Waters 2487 (Waters), e uma unidade de detecção Mini Dawn Treos MALS (Wyatt). Amostras de 50 μL contendo 1,0 μg/mL de proteína foram separadas a 1 mL/minuto nas diferentes condições de tampão. Resultados foram processados usando software Empower versão 2002 e expressos por pico como porcentagem de área de pico total.

[00646] A Figura 30 mostra os perfis de eluição de HP-SEC registrados em Na2SO4 0,1 M/fosfato de sódio 0,1 M tamponados a pH 6,8. A pH 6,8, >99% de anticorpos IgG1-005 tipo selvagem eluiram como espécie monomérica. Ao contrário, o perfil de HP-SEC de IgG1-005- E345R/E430G/S440Y neste tampão mostrado na figura 31 mostra um oligômero da fração de 77%, enquanto 23% da população eluiram como uma espécie monomérica. Conforme descrito no exemplo 19, a fração de monômero secundário restante pode ser causada por dissociação induzida pela coluna, uma vez que não foi observado nenhum traço de monômero de IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y durante análise modo em lotes usando dispersão de luz dinâmica nessas condições.

[00647] A Figura 32 mostra uma sobreposição dos perfis de eluição de HP-SEC de IgG1-005 registrados em NaCl 0,15 M/citrato 0,1 M tamponados a pH 6,8 (linha tracejada) e pH 5,0 (linha cheia). O perfil de HP-SEC de IgG1-005 em tampão de citrato tanto a pH 6,8 quanto pH 5,0 foi altamente comparável com o comportamento em tampão de fosfato a pH 6,8, com >99% da proteína eluindo como espécie monomérica.

[00648] A Figura 33 mostra uma sobreposição dos perfis de eluição de HP-SEC de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y registrados em NaCl 0,15 M/citrato 0,1 M tamponados a pH 6,8 (linha tracejada) e pH 5,0 (linha cheia). Consistente com o comportamento em fosfato a pH 6,8, em citrato pH 6,8 o anticorpo exibiu 84% de oligomerização. Totalmente ao contrário, diminuição do pH para 5,0 reverteu drasticamente a oligomerização de IgG1-005- E345R/E430G/S440Y. O multímero da fração caiu para menos que 1%, com >99% da proteína eluindo como uma espécie monomérica. A desmontagem de oligômeros foi específica para condições de baixo pH e não causada usando citrato como um componente de tampão, conforme mostrado pela oligomerização eficiente em citrato tamponado a pH 6,8.

[00649] Resumidamente, bastou abaixar o pH de 6,8 para 5,0 para desmontar completamente hexâmeros do anticorpo de fase de solução, um efeito que pode ser explicado pela modificação de carga de aminoácidos de histidina presentes na interface Fc:Fc crucial para montagem de anticorpo hexamérico. Além do mais, este comportamento foi específico para variantes dos anticorpos contendo mutações que induziram automontagem mediada por Fc, como IgG1-005-E345R/E430G/S440Y, enquanto anticorpos tipo selvagem permaneceram monoméricos em ambos os níveis de pH.

Exemplo 24 Introdução das mutações estáveis de hexâmero de Fc-Fc E345R/E430G/S440Y resultará em maior atividade bactericida de anticorpos IgG contra bactérias que expressam proteínas de superfície de ligação de Fc.

[00650] A cascata de sistema de complemento é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra patógenos e pode ser dividida em três diferentes vias de ativação para reconhecer patógenos: i) o caminho mediado pelo anticorpo, que é ativado mediante ligação de C1q no anticorpo ligado no patógeno, ii) a lectina e iii) o caminho alternativo, no qual o sistema do complemento reconhece diretamente e é disparado pelo patógeno na ausência de anticorpo. Os três caminhos convergem na etapa de clivagem de deposição de C3 e C3b. Micro-organismos desenvolveram múltiplos mecanismos de complemento evasão, um dos quais é mediado por proteína A [Joiner Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:201-30; Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12):948-58]. Proteína A foi primeiramente identificada na parede da célula de Staphylococcus aureus e é bem conhecida por sua ligação na região Fc de IgG (Deisenhofer et al., Biochem (1981) 20, 2361-70; Uhlen et al., J. Biol. Chem (1984) 259,1695-1702). Até agora, o efeito antifagocitótico de proteína A e seu papel na patogênese de S. Aureus foram explicados pela interação entre proteína A e IgG, que resulta em uma orientação de anticorpo incorreta a ser reconhecida pelo receptor Fc de neutrófilo (Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12):948-58). No exemplo 4, mostrou-se que CDC mediada por anticorpos de IgG1 específicos de célula B foi inibida pelo peptídeo de ligação de Fc de competição DCAWHLGELVWCT. O peptídeo alveja o sítio de ligação consenso em Fc de IgG que coincide com a sítio de ligação para proteína A, proteína G e fator reumatoide (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Com base nesses dados, especulou-se que o mecanismo de evasão de complemento bacteriano mediado por proteína A poderia funcionar competindo com a ligação de Fc, resultando em desestabilização da interação Fc-Fc de um anticorpo específico de micróbio, e consequentemente inibição de ativação do complemento mediada por anticorpo. Alem disso, no exemplo 4, mostrou-se também que anticorpos de IgG1 específicos da célula B contendo a mutação de E345R melhoradora de CDC foram menos sensíveis a inibição de CDC pelo peptídeo de ligação de Fc de competição DCAWHLGELVWCT do que o anticorpo precursor tipo selvagem. Extrapolando esses resultados para proteínas de ligação de Fc expressas nos micróbios, maior estabilização das interações Fc-Fc de IgG1 pela mutação de E345R tornariam o anticorpo específico de micróbios menos propenso a inibição do complemento por uma estratégia de escape do patógeno por meio de competição de ligação de Fc por proteínas de superfície microbianas, tal como proteína A. Consequentemente, introdução da mutação de E345R em anticorpos IgG direcionados para uma bactéria resultaria em maior deposição de C3b nas bactérias e maior atividade bactericida comparada com os anticorpos tipo selvagem precursores. Espera- se que um hexâmero estabilizado (IgG-E345R/E430G/S440Y) que já é oligomerizado antes ligação em um micróbio alvo seja ainda mais resiliente, por exemplo, a ligação de proteína A do que anticorpos IgG contendo a única mutação de E345R. Consequentemente, introdução das mutações E345R/E430G/S440Y em anticorpos IgG direcionados para micróbios resultaria em maior deposição de C3b em micróbios e maior atividade microbiana comparados com os anticorpos tipo selvagem precursores.

[00651] Para testar se oligomerização de IgG1-005- E345R/E430/S440Y pode inibir ligação em proteína A, preparações de proteína purificada de IgG1-005 e IgG1-005-E345R/E430/S440Y foram analisadas por dois métodos ortogonais: 1) determinação da concentração de IgG medindo absorbância a comprimento de onda de 280 nm usando um espectofotômetro Nanodrop ND-1,000 (Isogen Life Science, Maarssen, Países Baixos). 2. determinação da concentração de IgG usando um instrumento Octet QK (Fortebio, Menlo Park, USA), em Diluente de Amostra Octet e usando pontas se sensor de proteína A prontas para uso (Fortebio, Menlo Park, USA) em comparação direta com uma curva de referência padrão de IgG (Siemens).

[00652] Determinando a razão entre a concentração determinada por A280 sobre a concentração determinada usando proteína A Octet, observou-se que IgG1-005-E345R/E430/S440Y é certamente menos propenso a ligar proteína A do que IgG1-005 (tabela 11). Tabela 11: Concentrações de anticorpo por absorbância a 280 nm e proteína A Octet

[00653] Como uma medida in vitro para matança bacteriana mediada por complemento, tanto fagocitose por neutrófilos quanto a geração de C3a no plasma, que coincide com deposição de C3b nas bactérias, podem ser determinadas. Certamente, foi descrito que deposição de C3b em S. Aureus resulta em fagocitose melhorada e correlaciona com matança bacteriana (Rooijakkers et. Al., Nature Immunology 2005: 6,920-927).

[00654] S. Aureus será marcado com FITC incubando uma cultura bacteriana que cresce exponencialmente com 100 μg/mL de FITC por 1 hora a 37°C em tampão de carbonato 0,1 M (pH 9,6). Células nucleares polimorfas de humano (PMN) serão isoladas usando um gradiente Ficoll. Bactérias FITC-marcadas serão opsonizadas com uma série de concentrações de anticorpos específicos com ou sem mutação E345R/E430G/S440Y. Fagocitose será realizada in vitro incubando 1x108 bactérias FITC-marcadas opsonizadas PMN de humano na presença de 25% de soro esgotado de IgG como fonte de complemento por 25 minutos a 37°C em um volume total de 200 μL sob agitação vigorosa. As células serão fixas e eritrócitos lisados por incubação com solução de lise BD FACS por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar, fagocitose será medida por FACS. A população de neutrófilo será selecionada através de controle de dispersão direta e lateral e fagocitose será expressa como a fluorescência média na população de neutrófilo. Alternativamente, geração de C3a será medida nas amostras por ELISA como uma medida para ativação do complemento e deposição de C3b.

[00655] Espera-se que os anticorpos específicos S. Aureus contendo a mutação E345R/E430G/S440Y induzam mais ativação do complemento e fagocitose por neutrófilos do que os anticorpos tipo selvagem precursores. Um exemplo de um anticorpo que poderia ser usado em tais experimentos é o IgG1 monoclonal quimérico pagibaximab (BSYX-A110; Biosynexus), alvejando ácido Lipoteicoico (LTA) que é embutido na parede da célula de estafilicoco (Baker, Nat Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1491-3; Weisman et al., Int Immunopharmacol. 2009 May; 9 (5):639-44).

Exemplo 25 A formação de complexos de IgGh examérico não covalente introduzindo a mutação tripla E345R/E430G/S440Y ocorre independente do domínio Fab.

[00656] A formação em solução de complexos de anticorpo hexamérico ligados não covalentemente introduzindo a mutação tripla E345R/E430G/S440Y (RGY) foi demonstrada para anticorpo de CD38 005 no exemplo 20. Neste experimento, formação de complexos de IgGh examérico não covalente de outros anticorpos de IgG1 de humano que diferem nos seus domínios Fab: anticorpos CD20 7D8 e rituximab, anticorpo de EGFR 2F8 e anticorpo de manana C. Albicans M1g1. A geração e purificação dos anticorpos mutantes triplos e análises de HP-SEC foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 20.

[00657] A Figura 34 mostra que todos os anticorpos mutantes triplos mostraram uma grande fração de oligômero: IgG1-7D8-RGY (67,2%) (Figura 34A), IgG1-ritux-RGY (83,6%) (Figura 34B), IgG1-2F8-RGY (74,5%) (Figura 34C) e IgG1-M1-RGY (74,5%) (Figura 34D). Esses dados indicam que o conceito de E345R/E430G/S440Y para induzir automontagem de anticorpos nos hexâmeros em solução pode ser geralmente aplicado em sequências de IgG1, independente da estrutura primária do domínio Fab.

Exemplo 26 CDC por anticorpos CD20 contendo a mutação tripla E345R/E430G/S440Y em um ensaio de CDC ex vivo em células de CLL CD20-positivas derivadas do paciente.

[00658] Células B CD19+/CD5+ PB de CLL congeladas (recidivas/ refratárias) isoladas das células mononucleares de sangue periférico de CLL foram adquiridas de Allcells, Emeryville, CA. CDC foi realizada conforme descrito no Exemplo 21, com a exceção de que 20.000 células por placa de 96 poços foram usadas. Expressão de CD20 foi determinada como Capacidade de Ligação do Anticorpo Específico 39.000 (sABC) por QIFIKIT, Dako, Glostrup, Denmark. Figura 35 mostra que anticorpos CD20 contendo a mutação tripla E345R/E430G/S440Y mostraram atividade de CDC funcional nas células de CLL primárias CD20-positivas. Introdução da mutação E345R/E430G/S440Y resultou em matança mediada por CDC mais eficiente (menor EC50) de células de CLL primárias por 7D8 (Figura 35A) e permitiu CDC potente por rituximab, que não mostrou nenhuma atividade de matança no formato WT (Figura 35B).

Exemplo 27 Introdução de mutação tripla E345R/E430G/S440Y para indução de hexamerização e maior CDC pode ser aplicada em diferentes isótipos do anticorpo.

[00659] Variantes isotípicos do anticorpo CD38 IgG1-005 foram geradas com domínios constantes de IgG2, IgG3 ou IgG4 de humano produzindo IgG2-005, IgG3-005 e IgG4-005 por métodos conhecidos na técnica. Além disso, a mutação tripla E345R/E430G/S440Y foi introduzida em todos esses anticorpos, produzindo IgG2-005-RGY, IgG3-005-RGY e IgG4-005-RGY.

[00660] Análise HP-SEC dos diferentes isótipos foi realizada conforme descrito no Exemplo 20.

[00661] A Figura 36 mostra que as isoformas testadas contendo a mutação tripla E345R/E430G/S440Y formaram complexos hexaméricos em solução: IgG1-005-RGY (79,2% multimérica) (Figura 36A), IgG2-005-RGY (46,1% multimérica) (Figura 36B), IgG3-005-RGY (37,8% multimérica) (Figura 36C), e IgG4-005-RGY (84,4% multimérica) (Figura 36D).

[00662] A eficácia de CDC dos diferentes isótipos foi comparada testando uma série de concentrações de anticorpo não purificado (0,0003-10 μg/mL em diluições de 2 vezes) em um ensaio de CDC in vitro descrito no Exemplo 18. Figura 37 mostra que introdução da mutação tripla de RGY permitiu CDC potente em células Daudi (Figura 37A) por todos os isótipos de IgG testados. Esses resultados foram confirmados usando CDC em células Wien133 (Figura 37B), embora IgG3-005-RGY exibisse atividade de CDC limitada com relação a outras variantes isotípicas. Esses dados para os triplos mutantes de RGY são similares aos mostrados para mutantes E345R no exemplo 18, Figura 19.

Exemplo 28 Combinações de mutações para induzir a formação de complexos oligoméricos não covalentes em solução

[00663] Exemplo 20 descreve que o anticorpo IgG1-005 contendo as três mutações E345R, E430G e S440Y (RGY) forma complexos oligoméricos em solução. Anticorpos contendo variantes desta mutação tripla com uma substituição de aminoácido em qualquer uma dessas três posições foram testados quanto a sua capacidade de formar complexos oligoméricos em solução. Como um exemplo da classe de substituições de E345R possíveis, consistindo em E345 a A/C/D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y, E345K foi testado em combinação com E430G/S440Y. Como um exemplo da classe de substituições de E430G possíveis, consistindo em E430 a A/C/D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y, E430S foi testado em combinação com E345R/S440Y. A classe de substituições de S440Y possíveis consiste em proteínas com um aminoácido em pelo menos uma posição selecionada do grupo que consiste em S440, Y436, D/E356, T359, E382, N434, Q438, I253 e S254, que é Y ou W; não Y; não D ou E; não T; não E; não N; não Q; não I; e não S, para cada posição, respectivamente. Como um exemplo desta classe de substituições de S440Y, Y436I e S440W foram testados em combinação com E345R/E430G. Combinações de mutação E345K/E430G/S440Y (denotada RGY), E345R/E430S/S440Y (denotada RSY), E345R/E430G/S440W (RGW denotado), ou E345R/E430G/Y436I (denotada RGI) foram introduzidas no anticorpo CD38 IgG1-005 por métodos conhecidos na técnica, produzindo IgG1-005-KGY, IgG1-005-RSY, IgG1- 005-RGW e IgG1-005-RGI, respectivamente.

[00664] Análise HP-SEC foi realizada conforme descrito no Exemplo 20. Figura 38 mostra que, similar a IgG1-005-RGY (Exemplo 20, Figura 23), IgG1-005-KGY (Figura 38A), IgG1-005-RSY (Figura 38B) e IgG1-005- RGW (Figura 38C) formaram complexos oligoméricos em solução com eficiência variada. Para mutantes IgG1-005-KGY e IgG1-005-RGW, o sinal A280 observado migrando entre os picos de oligômero e monômero sugeriu que o método HP-SEC pode contribuir para a desestabilização de complexos oligoméricos, conforme descrito no Exemplo 20.

[00665] A eficácia de CDC dos anticorpos foi comparada testando uma série de concentrações de anticorpo não purificado (0,0003-10 μg/mL em diluições de 3 vezes) em um ensaio de CDC in vitro conforme descrito no Exemplo 18. Figura 39A mostra que todas as combinações de mutação tripla testadas dotaram IgG-005 com a capacidade de matar células Wien133 em um ensaio de CDC in vitro, onde IgG-005 tipo selvagem não mostra nenhuma matança. Figura 39B mostra que também células Ramos foram mortas mais eficientemente pelos anticorpos mutantes triplos testados comparadas com IgG1-005 tipo selvagem.

[00666] Esses dados mostram que oligomerização em solução e/ou indução de CDC pode ser induzida por IgG1-005-KGY, IgG1-005-RSY, IgG1-005-RGW e IgG1-005-RGI, sugerindo que mutações selecionadas de quaisquer possíveis substituições de E345R de aminoácido de ocorrência natural, quaisquer possíveis substituições de E430G de aminoácido de ocorrência natural, ou os aminoácidos triptofano ou tirosina podem ser possíveis aminoácidos usados em substituição a S440, podem ser usados em substituição a E345R, E430G e S440Y, respectivamente. Além disso, os dados de HP-SEC sugerem que tais substituições podem modular a intensidade de interação entre as subunidades de Fc contendo polipeptídeo do complexo oligomérico.

Exemplo 29 Anticorpos contendo mutações triplas E345R/E430G/S440Y podem ser montados nos anéis hetero-oligoméricos

[00667] Exemplo 5, Figura 7 demonstra que anticorpos contendo uma das duas mutações K439E ou S440K complementares, ilustrados na figura 4, são inibidos em sua atividade de CDC, enquanto que eles poderiam formar complexos capazes de ativação de CDC quando misturados. Exemplo 20 descreve a construção de anticorpo IgG1-005-E345R/E430G/S440Y (aqui referido como IgG1-005-RGY), que formou complexos em solução oligoméricos, mais provavelmente hexamérica, que também mostraram atividade aumentada de CDC comparada com IgG1-005 tipo selvagem (Exemplo 21, Figura 26). Exemplo 28 descreve que também IgG1-005-KGY, IgG1-005-RSY, IgG1-005-RGW e IgG-005-RGI mostraram CDC melhorada comparada com IgG1-005. Para testar se oligomerização na fase de solução poderia ser restrita às misturas de anticorpos não autointeragentes, foram geradas variantes do anticorpo de IgG1-005-RGY que continham cada qual uma das duas mutações K439E ou S440K complementares que impediram auto-oligomerização.

[00668] Mutação K439E foi introduzida no IgG1-005- E345R/E430G/S440Y por métodos conhecidos na técnica, produzindo IgG1- 005-E345R/E430G/K439E/S440Y (IgG1-005-RGEY). Mutação S440K foi introduzida no IgG1-005-E345R/E430G por métodos conhecidos na técnica, produzindo IgG1-005-E345R/E430G/S440K (IgG1-005-RGK). Mutações Y436I e S440K foram introduzidas no IgG1-005-E345R/E430G por métodos conhecidos na técnica, produzindo IgG1-005-E345R/E430G/Y436I/S440K (IgG1-005-RGIK). A base lógica para incluir Y436I em IgG1-005-RGIK foi para compensar para a ausência da oligomerização aumentando mutação S440Y.

[00669] Análise de HP-SEC das diferentes variantes do anticorpo e misturas equimolares de anticorpo foram realizadas conforme descrito no Exemplo 20, mas usando PBS (fosfato de sódio 12,6 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4; B. Braun, Oss, Países Baixos) como a fase móvel. Figura 40 mostra que a introdução de K439E em IgG1-005-RGY impediu auto-oligomerização de IgG1-005-RGEY (2,7% de multímeros). Igualmente, substituição de S440Y em IgG1-005-RGY com mutação S440K impediu auto-oligomerização de IgG1-005-RGK (2,2% de multímeros). Notavelmente, uma mistura da fase de solução monomérica (isto é, anticorpos diméricos únicos) IgG1-005-RGEY mais IgG1-005-RGK formaram espécies oligoméricas com mobilidade de HP-SEC equivalente como IgG1-005-RGY (65% de multímeros), embora com menor eficiência do que IgG1-005-RGY (84% de multímeros).

[00670] A Figura 41 mostra que a introdução de Y436I mais S440K no IgG1-005-E345R/E430G impediu auto-oligomerização de IgG1-005- RGIK (1,8% de multímeros). Novamente, uma mistura de IgG1-005-RGEY monomérico da fase de solução mais IgG1-005-RGIK formou espécies oligoméricas com mobilidade de HP-SEC equivalente a IgG1-005-RGY, mas agora com alta eficiência (93% de multímeros).

[00671] A Figura 42 mostra uma comparação direta de mistura de IgG1-005-RGEY mais IgG1-005-RGK com a mistura de IgG1-005-RGEY mais IgG1-005-RGIK, demonstrando que IgG1-005-RGIK (65% de multímeros) poderia induzir oligomerização heteromérica com IgG1-005- RGEY mais eficientemente do que IgG1-005-RGK (93% de multímeros). A presença da extra oligomerização e mutação Y436I melhoradora de CDC em IgG1-005-RGIK aparentemente estabilizou a formação de complexos com IgG1-005-E345R/E430G/K439E/S440Y.

[00672] Resumidamente, anticorpos IgG1-005 contendo mutações E345R/E430G e as mutações K439E/S440Y, ou S440K ou Y436I/S440K que inibem auto-oligomerização adicional poderiam ser reagrupados nos complexos multiméricos, misturando moléculas do anticorpo com mutações complementares (K439E em um anticorpo, S440K no outro).

Exemplo 30 Fragmentos Fc podem ser recrutados para a superfície da célula por anticorpos de ligação de célula, se ambos componentes contiverem as mutações triplas E345R/E430G/S440Y

[00673] As três mutações E345R, E430G e S440Y foram introduzidas em um Fragmento Fc de IgG1m(f) por métodos conhecidos na técnica, criando Fc-RGY. Proteína foi expressa e purificada conforme descrito no Exemplo 20. Análise de HP-SEC da Fc-RGY foi realizada conforme descrito no Exemplo 20. Figura 43 mostra que, nas condições de HP-SEC usadas, Fc- RGY mostrou aproximadamente 28% de monômeros e 72% de oligômeros distribuídos em múltiplos estados, medidos por fração de área de pico para a área total.

[00674] Em seguida foi testado se fragmentos Fc-RGY poderiam ser recrutados em complexos oligoméricos com anticorpos IgG1-RGY em solução. Portanto, 6 μg/mL de Fc-RGY Alexa-647-marcado (Fc-RGY-A647)) foram misturados 1:1 com uma série de concentrações (0,001-3 μg/mL em diluições de 3 vezes) de um anticorpo EGFR-específico ou CD20-específico. Imediatamente depois da mistura, as amostras foram adicionadas em 0,1 x 106 células A431 EGFR-positivas ou Daudi CD20-positivas e incubados por 45 minutos a 4 °C. Depois de lavar as células duas vezes com BSA RPMI1640/0,1% (3 minutos, 1.200 rpm), as células foram ressuspensas em PBS/BSA 0,1%/azido 0,02% e analisadas em um FACS Canto ll (BD Biosciences).

[00675] A Figura 44A mostra que a mistura de Fc-RGY-A647 com anticorpo de IgG1-2F8-RGY EGFR-específico resultou em um sinal fluorescente dependente da dose nas células A431 EGFR-positivas. Ao contrário, o IgG1-7D8-RGY CD20-específico foi não capaz de recrutar Fc- RGY-A647 para as células A431 CD20-negativas. Nenhuma das outras combinações de controle testadas de Fc-RGY-A647 misturada tanto com IgG1-2F8 quanto com IgG1-2F8-E345R resultou em um sinal fluorescente. Também, nenhuma das combinações de controle de IgG1-RTX-A647 CD20- específico misturadas com IgG1-2F8 nem IgG1-2F8-RGY induziu um sinal fluorescente nas células A431.

[00676] Esses dados indicam que o fragmento Fc-RGY marcado foi especificamente recrutado para as células A431 por incorporação nos complexos oligoméricos com anticorpos de IgG1-2F8-RGY que ligam EGFR nas células A431.

[00677] Similarmente, a figura 44B mostra que os anticorpos de IgG1- 7D8-RGY e IgG1-RTX-RGY CD20-específicos foram capazes de recrutar fragmentos Fc-RGY-A647 para células Daudi CD20-positivas. Ao contrário, o IgG1-2F8-RGY EGFR-específico não foi capaz de recrutar Fc-RGY-A647 para as células Daudi EGFR-negativas. Amostras de controle negativo tanto de Fc-RGY-A647 sozinho quanto Fc-RGY-A647 misturadas com IgG1-7D8 ou IgG1-RTX não produziram um sinal fluorescente nas células Daudi.

[00678] Resumidamente, esses dados mostram que moléculas de Fc-RGY podem formar complexos em solução e podem ser recrutadas para as células por anticorpos contendo RGY que ligam especificamente a células.

Exemplo 31 Oligomerização reversível de moléculas do anticorpo com mutações que melhoram a interação Fc-Fc pode ser controlada por pH.

[00679] Exemplo 23 mostrou que o anticorpo IgG1-005- E345R/E430G/S440Y, aqui abreviado como IgG1-005-RGY, foi capaz de hexamerização a pH 6,8, enquanto, abaixando o pH para 5,0, dissolveu o complexo hexamérico em subunidades monoméricas individuais. Para caracterizar esta propriedade com detalhes, ácido cítrico 50 mM e Na2HPO4 100 mM foram misturados em diferentes razões para gerar tampões de fase móvel a pH 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 e 7,0. Amostras de IgG1-005-RGY foram trocadas nesses tampões e separadas por HP-SEC usando a fase móvel de correspondência. Figura 45A mostra que diminuição do pH resultou em desmontagem de complexos multiméricos nas subunidades monoméricas; que foi necessário um pH de aproximadamente 5,0 para eliminar multímeros da mistura; e que, a pH 6,0, aproximadamente metade dos complexos foi desmontada.

[00680] A capacidade de controlar o estado do anticorpo oligomérico abaixando e aumentando o pH de um modo reversível poderia ser usada para aplicações de processamento a montante ou a jusante durante a fabricação. Para testar se desmontagem mediada por pH foi reversível, uma amostra com hexâmeros do anticorpo foi levada para o pH 5,0 e dividida nas duas amostras, um das quais foi levada de volta para o pH 7,0. Figura 45B mostra que a amostra que foi exposta a pH 5,0 e subsequentemente levada de volta para pH 7,0 (pH 7,0 rev) formou complexos de anticorpo com uma eficiência altamente similar à amostra de referência mantida a pH 7,0.

Exemplo 32 Purificação da proteína de IgG1-RGY e eficiência de processamento a jusante podem ser controladas pela escolha de condição de pH do tampão

[00681] Purificação da proteína A é um alicerce de processamento a jusante de anticorpo e implementada em um grande número de processos de fabricação de anticorpo. Em virtude de o sítio de ligação de proteína A parcialmente sobrepor hexamerização de mediação da interface de interação de Fc:Fc de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y, aqui abreviada como IgG1-005- RGY, carregamento de coluna de proteínas A foi tentado a pH 7,4, permissivo de hexamerização e a pH 5,0, que bloqueia hexamerização, conforme demonstrado no exemplo 23.

[00682] No exemplo 20, foi descrita a clonagem de anticorpo IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y, aqui abreviada como IgG1-005-RGY. IgG1-005- RGY foi expresso em células EXPI293F essencialmente da maneira descrita pelo fabricante (Invitrogen), depois do que o sobrenadante foi coletado por centrifugação a 300 g por 10 minutos. Sobrenadante foi concentrado 4 vezes usando um dispositivo de filtração de fluxo MiniKros M15S-260-01P Hollow Fiber Tangential com uma membrana de corte 50 kDa (SpectrumLabs, Rancho Dominguez CA, USA), produzindo sobrenadante com uma concentração de proteína de 1,1 g/L. O sobrenadante foi dividido em duas partes, uma das quais foi mantida ao pH original de 7,5, enquanto o outro lote teve o pH ajustado a pH 5,0 por adição em gotas de ácido cítrico 1,0 M- NaOH pH 3,0. Ambos lotes foram filtrados em um filtro de extremidade morta de 0,20 μM.

[00683] O lote de sobrenadante mantido a pH 7,5 foi carregado a uma baixa vazão de 109 cm/h para mimetizar condições de processamento a jusante em escala de fabricação, em uma coluna de proteína A de 1,0 mL (HiTrap MabSelectSuRe, GE Healthcare, Uppsala, Suécia), que foi consecutivamente lavada com PBS (fosfato de sódio 12,6 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4; B. Braun, Oss, Países Baixos), depois do que a proteína de IgG ligada foi eluída usando ácido cítrico 0,1 M-NaOH, pH 3,0. O eluato foi imediatamente neutralizado com Tris-HCl 2 M, pH 9,0 e dialisado por toda a noite em PBS. Depois da diálise, a amostra foi filtrada estéril em um filtro de extremidade morta de 0,20 μM.

[00684] O lote levado ao pH 5,0 foi carregado a uma vazão de 109 cm/h na mesma coluna de proteína A de 1,0 mL (HiTrap MabSelectSuRe), que foi consecutivamente lavada com ácido cítrico 20 mM/citrato pH 5,0, depois do que a proteína de IgG ligada foi eluída usando ácido cítrico 0,1 M- NaOH, pH 3,0. O eluato foi imediatamente neutralizado com Tris-HCl 2 M, pH 9,0 e dialisado por toda a noite em PBS. Depois da diálise, a amostra foi filtrada estéril em um filtro de extremidade morta de 0,20 μM.

[00685] Fluxos diretos de ambas as purificações de proteína foram coletados e purificados usando uma coluna MabSelect SuRe de 5,0 mL produzindo aproximadamente 50 mg de proteína, demonstrando que a coluna MabSelectSuRe de 1,0 mL foi saturada efetivamente.

[00686] Os rendimentos de IgG1-005-RGY foram determinados medindo A280 das amostras de eluição dialisadas usando um dispositivo Nanodrop (ThermoScientific, Wilmington DE, USA). Purificação da proteína A em escala de 1,0 mL a pH 7,0 produziu 21,45 mg de IgG1-005-RGY, enquanto purificação a pH 5,0 produziu 29,14 mg de IgG1-005-RGY. Conclusivamente, a rendimento da proteína aumentou aproximadamente 36% realizando a ligação de anticorpo na proteína A em condições mantendo IgG1-005-RGY monomérico.

Exemplo 33 Morte de célula programada (PDC) por IgG2-005 hexamérico estável

[00687] Para testar se diferentes variantes isotípicas de anticorpos IgG contendo a mutação tripla E345R/E430G/S440Y poderiam induzir morte de célula programada (PCD), anticorpo IgG2-005-E345R/E430G/S440Y (IgG2- 005-RGY) foi gerado por métodos conhecidos na técnica. 1,0*105 células Ramos que expressam CD38 foram cultivadas por 24 horas em placas de base U de 96 poços (Nalgene Nunc) na presença de uma série de diluições (10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,005 e 0,0025 μg/mL) de IgG2-005, IgG2-005-RGY tipo selvagem, IgM-005 hexamérico ou anticorpos de controle de humano IgG1-2F8 e IgG1-2F8-RGY, que reconhecem EGFR, que não é expresso nas células Ramos. PCD foi quantificada depois dessas 24 horas manchando com anexina V-FITC (ensaio de ligação de anexina; BD Biosciences, San Diego, Califórnia, USA) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de células V-FITC-positivas de anexina foi determinada usando um FACS (BD).

[00688] A Figura 46 mostra que IgG2-005-RGY demonstrou capacidade de morte celular programada melhorada comparado com IgG2- 005 tipo selvagem e anticorpos de controle IgG1-2F8 e IgG1-2F8-RGY. IgM Hexamérico não induziu PCD nas condições testadas.

Exemplo 34 IgG-005-RGY contra CD38 excede IgM-005 hexamérico em um ensaio de CDC nas células B

[00689] Para comparar a eficácia de CDC de IgG1-005-RGY com aquela de IgM, o domínio VH de IgG1-005 foi clonado em uma espinha dorsal de IgM por métodos conhecidos na técnica, e expressa na ausência de cadeia J para produzir hexâmeros de IgM contra CD38. A construção de IgG1-005-E345R/E430G/S440Y (aqui referido como IgG1-005-RGY) foi descrita no exemplo 20.

[00690] Análise HP-SEC dos diferentes anticorpos foi realizada conforme descrito no Exemplo 20, mas usando PBS (fosfato de sódio 12,6 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4; B. Braun, Oss, Países Baixos) como a fase móvel. Figura 47 mostra que IgM-005 expresso na ausência de cadeia-J produziu uma molécula com mobilidade ligeiramente maior em HP-SEC do que IgG1-005-RGY, como era de se esperar, devido ao maior peso molecular de IgM hexamérico comparado com IgG1-005-RGY hexamérico.

[00691] A eficácia de CDC de IgG1-005-RGY foi comparada com IgG1-005 tipo selvagem e IgM-005 hexamérico testando uma série de concentrações de anticorpo (0,0003-10 μg/mL em diluições de 2 vezes) em um ensaio de CDC in vitro conforme descrito no Exemplo 18. Figura 48 mostra que IgG1-005-RGY mostrou atividade mais potente de CDC nas células Daudi e Wien133 do que IgM-005 hexamérico. IgG1-005 tipo selvagem mostrou menor eficácia de CDC do que IgG1-005-RGY e IgM-005 nas células Daudi, e nenhuma atividade de matança nas células Wien133. IgG1-b12 foi usado como um anticorpo de controle negativo de não ligação de célula. Concentrações de IgG1-005 monomérico (isto é, única proteína dimérica), IgG1-005-RGY hexamérico e IgM-005 hexamérico são indicadas como equivalentes de ligação de C1q para permitir comparação de complexos de IgG não covalente e IgM covalente com diferente peso molecular.

[00692] Resumidamente, IgG1-005-RGY poderia induzir lises mediadas por complemento de células alvos mais eficientemente do que IgM- 005 a concentrações de anticorpo que ligam quantidades equivalentes de C1q.

Exemplo 35 Introdução das mutações triplas E345R/E430G/S440Y no anticorpo IgG1-2F8 anti-EGFR aumenta a eficácia lise de mediada por CDC de linhagens celulares de tumor sólido de EGFR-positivas.

[00693] Para testar se a introdução das mutações triplas E345R/E430G/S440Y em um anticorpo alvo de tumor sólido poderia levar a ativação de lise mediada por complemento, IgG1-2F8-E345R/E430G/S440Y (aqui referido como IgG1-2F8-RGY) foi gerado por métodos conhecidos na técnica.

[00694] A eficácia de CDC por IgG1-2F8-RGY foi testada em linhagens de células A431 e Difi tumorais EGFR-positivas e foi comparada com IgG1-2F8 tipo selvagem e os anticorpos de controle IgG1-005 e IgG1- 005-RGY. Os anticorpos de controle reconhecem CD38, que não é expresso nem em células nem A431 nem Difi.

[00695] Depois que as células de tumor sólido foram desanexadas usando tripsina-EDTA em salina tamponada com fosfato (PBS), as células foram lavadas e passadas através de um filtro de célula náilon de 40 μm (DB FalconTM) e ressuspensas em PBS a uma concentração de 1,0x106 células/mL. As células foram manchadas por 30 minutos a 37°C usando SYBR Green (SYBR Green 57563 in DMSO, Invitrogen, diluídas 25.000 x). Depois de centrifugação (1.200 rpm, 5 minutos à temperatura ambiente), as células foram ressuspensas em BSA RPMI1640/0,1% a uma concentração de 3,0x105 células/mL. Diluições de anticorpo em série (0,0003-10 μg/mL) foram preparadas em RPMI/BSA 0,1% suplementado com TOPRO-3 (iodeto de TOPRO-3 T3605, diluídas 1.600 x). As células foram semeadas a 30.000 células por poço em placas de base plana de 96 poços (placas pretas de 96 poços ADI™ 65376:2 HOCV+= Depois de adição das diluições de anticorpo em série, as placas foram incubadas por 15 minutos em um agitador (300 rpm, RT). Soro de Humano Normal (NHS, Sanquin) foi adicionado a concentração final de 20%. As placas foram incubadas por 45 minutos a 37°C. As quantidades de células mortas (TOPRO-3 positiva) e células totais (SYBR Green positiva) foram determinadas usando um citômetro de formação de imagem Celigo® (Brooks Life Science Systems). Resultados foram analisados usando GraphPad Prism 5,04.

[00696] A Figura 49 mostra que a eficácia para introduzir lise mediada por complemento de células de tumor sólido EGFR-positivas foi consideravelmente maior para IgG1-2F8-RGY do que IgG1 tipo selvagem- 2F8.

Exemplo 36 IgG1-005-RGY mostra ativação do complemento independente do alvo ao contrário de IgG1-005 tipo selvagem.

[00697] No exemplo 20, foi descrita a clonagem de anticorpo IgG1- 005-E345R/E430G/S440Y, aqui abreviado como IgG1-005-RGY. Para testar se IgG1-005-RGY poderia ativar o complemento em solução na ausência de células alvos, a formação de C4d, foi analisado um marcador para ativação do caminho de complemento clássico. Ativação do complemento foi determinada medindo concentrações de C4d depois de incubar 100 μg/mL de anticorpo em 90% de soro de humano normal por 1 hora a 37 °C em microplacas de polipropileno de 96 poços de baixa ligação de proteína (forma de U e estéril; Greiner 650261). As concentrações de C4d foram medidas em um ELISA (MicroVue C4d EIA kit, Quidel Corporation) de acordo com as instruções do fabricante. Uma amostra IgG termicamente agregado (HAG) foi usada como controle e positivo para ativação do complemento em solução. Figura 50 mostra que HAG induziu produção de C4d eficiente, enquanto IgG-005 tipo selvagem não mostrou ativação do complemento nessas condições. Ao contrário, IgG1-005-RGY induziu níveis de C4d elevados, indicativo de ativação do complemento em solução.

EQUIVALENTES

[00698] Versados na técnica perceberão, ou poderão determinar usando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes devem ser englobados pelas reivindicações seguintes. Toda e qualquer combinação de modalidades reveladas nas reivindicações dependentes são também contempladas no escopo da invenção.

Claims (43)

1. Proteína dimérica caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo, cada polipeptídeo compreendendo pelo menos as regiões CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de IgG1 humana (conforme estabelecida na SEQ ID: 6 ou para a variante IgG1m (f) SEQ ID NO: 7), IgG2 (conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8), IgG3 (conforme estabelecida na SEQ ID NO: 9) ou IgG4 pesado cadeia (conforme estabelecida na SEQ ID NO: 10), em que pelo menos um dos polipeptídeos compreende uma região de ligação que se liga especificamente a um alvo, em que no referido primeiro e segundo polipeptídeo, os aminoácidos nas posições a) E345 é selecionado a partir do grupo que consiste em R e K, b) E430 é selecionado a partir do grupo que consiste em G e S, e c) S440 é Y ou W, em que os aminoácidos são numerados de acordo com a numeração Eu, conforme estabelecido em Kabat.

2. Proteína dimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que em ambos os polipeptídeos, os aminoácidos nas posições E345, E430 e S440 são R, G e Y, respectivamente; ou alternativamente K, G e Y, respectivamente; ou alternativamente R, S e Y, respectivamente; ou alternativamente R, G e W, respectivamente.

3. Proteína dimérica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos polipeptídeos compreende uma região de ligação que se liga especificamente a um alvo, o alvo é uma molécula presente em uma célula, bactéria ou vírion.

4. Proteína dimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é um anticorpo.

5. Proteína dimérica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que cada um dos primeiro e segundo polipeptídeos compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina associada a uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina compreendendo regiões variáveis e constantes de cadeia leve para formar uma primeira e uma segunda região de ligação ao antígeno, opcionalmente ligando-se ao mesmo antígeno.

6. Proteína dimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que no referido primeiro e segundo polipeptídeo o aminoácido na posição K439 não é K, por exemplo, E ou D.

7. Proteína dimérica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que em ambos os polipeptídeos, por exemplo, cada polipeptídeo, os aminoácidos nas posições E345, E430, K439 e S440 são R, G, E e Y.

8. Proteína dimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que no referido primeiro e segundo polipeptídeos o resíduo de aminoácido na posição K447 é D ou E e/ou o aminoácido na posição Q386 é K.

9. Proteína dimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que no referido primeiro e segundo polipeptídeos o resíduo de aminoácido na posição K447 é K, R ou H e o(s) polipeptídeo(s) compreende(m) a) um resíduo de aminoácido na posição 448 que é P; ou b) um resíduo de aminoácido na posição 448 que é K, R ou H e um resíduo de aminoácido na posição 449 que é P.

10. Proteína dimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o aminoácido em pelo menos uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em L234, L235, G236, G237, S239, P238, T250, M252, I253, S254, R255, T256, D265, S267, H268, D270, E272, N286, K288, N297, V303, V305, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, K317, K322, S324, P329, P331, I332 K340, D , Q362, D376, A378, E380, E382, G385, Q386, P387, E388, N389, S400, D413, S415, S424, M428, H433, N434, H435, Y436, K439 e K447 não é L; não L; não G; não G; não S; não P; não T; não M; não eu; não S; não R; não T; não D; não S; não H; não D; Nota; não N; não K; não N; nao V; nao V; não T; nao V; não L; não H; não Q; não D; não K; não K; não S; não P; não P; não eu; não K; não D; não K; não Q; não D; não A; Nota; Nota; não G; não Q; não P; Nota; não N; não S; não D; não S; não S; não M; não H; não N; não H; não Y; e não K, respectivamente.

11. Proteína dimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é um homodímero ou um heterodímero.

12. Proteína dimérica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que os referidos primeiro e segundo polipeptídeos compreendem cada um um CH2, CH3 e regiões de dobradiça de uma cadeia pesada de IgG1 humana, e em que o aminoácido em uma posição selecionada de K409, T366, L368, K370, D399, F405 e Y407 não é K, T, L, K, D, F e Y, respectivamente, no primeiro polipeptídeo, por exemplo, K409 é R, e o aminoácido em uma posição selecionada de F405, T366, L368, K370, D399, Y407 e K409 não é F, T, L, K, D, Y e K, respectivamente, no segundo polipeptídeo, por exemplo, F405 é L.

13. Proteína dimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que está predominantemente na forma oligomérica, tal como a forma hexamérica, em um tampão de fosfato a um pH de 6,8, que está predominantemente na forma monomérica a um pH inferior a 6,0, como 5,0.

14. Proteína, caracterizado pelo fato de que está predominantemente em forma hexamérica em um tampão de fosfato em pH de 6,8 e que está predominantemente na forma monomérica a um pH inferior a 6,0, em que compreende seis proteínas diméricas associadas não covalentemente, cada uma como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Proteína, caracterizado pelo fato de que está predominantemente em forma hexamérica em um tampão de fosfato em pH de 6,8 e que está predominantemente na forma monomérica a um pH inferior a 6,0, em que compreende seis moléculas associadas não covalentemente, pelo menos uma das quais é uma proteína dimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e pelo menos uma das quais é um anticorpo que compreende um domínio Fc que compreende pelo menos CH2, CH3 e regiões de dobradiça, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal.

16. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína dimérica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e/a proteína, como definida na reivindicação 14 ou 15, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira proteína dimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo de uma primeira proteína dimérica, em que os aminoácidos nas posições E345, E430, K439 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são R, G, E e Y, respectivamente, e um primeiro e segundo polipeptídeo de uma segunda proteína dimérica, em que os aminoácidos nas posições E345, E430, Y436 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são R, G, I e K, respectivamente.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que tanto a primeira quanto a segunda proteínas diméricas compreendem o primeiro e o segundo polipeptídeos, em que nos referidos primeiro e segundo polipeptídeos das referidas primeira e segunda proteínas diméricas os aminoácidos nas posições a. E345 é selecionado a partir do grupo que consiste em R e K, b. E430 é selecionado a partir do grupo que consiste em G e S, e c. S440 é Y ou W.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que em ambos os referidos primeiro e segundo polipeptídeos da referida primeira e segunda proteína dimérica, os aminoácidos nas posições E345, E430 e S440 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são R, G e Y, respectivamente.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 20, caracterizada pelo fato de que no referido primeiro e/ou segundo polipeptídeo da primeira proteína dimérica, o aminoácido na posição K447 é D ou E, e no referido primeiro e/ou segundo polipéptido da segunda proteína dimérica, o aminoácido na posição correspondente a K447 é K, R ou H; um aminoácido na posição 448 é P, K, R ou H; e/ou um aminoácido na posição 449 é P.

22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das primeira e segunda proteínas diméricas é um anticorpo.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo anticorpos se ligam a diferentes antígenos ou a diferentes epítopos no mesmo antígeno.

24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizada pelo fato de que o carreador farmaceuticamente aceitável é uma solução aquosa tamponada, e em que o pH da solução aquosa tamponada é de pelo menos 6,5, tal como de 6,5 a 9,0, tal como de 7,0 a 8,0, tal como 7,4.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende um sistema tampão de fosfato, e em que o pH da solução aquosa tamponada é inferior a pH 6,5, tal como de 4,0 a 6,4, tal como de 5,0 a 6,0.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que compreende um sistema tampão de acetato, histidina, glicina, citrato, nicotinato, lactato e/ou succinato.

27. Método para aumentar a oligomerização em solução de uma proteína dimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, o método caracterizado pelo fato de que compreende a introdução no referido primeiro e segundo polipeptídeo, substituições de aminoácidos em pelo menos as posições a. E345 é selecionado a partir do grupo que consiste em R e K, b. E430 é selecionado a partir do grupo que consiste em G e S, e c. S440 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é Y ou W, em que os aminoácidos são numerados de acordo com a numeração Eu, conforme estabelecido em Kabat.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos nas posições E345, E430 e S440 são 345R, 430G e 440Y, respectivamente, ou alternativamente 345K, 430G e 440Y, respectivamente; ou alternativamente 345R, 430S e 440Y, respectivamente; ou alternativamente 345R, 430G e 440W, respectivamente.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a proteína dimérica é um anticorpo.

30. Proteína dimérica variante, caracterizada pelo fato de ser preparada pelo método como definido na reivindicação 27 ou 28.

31. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira proteína dimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e uma segunda proteína dimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 para uso simultâneo, separado ou sequencial em imagens, diagnósticos ou terapia.

32. Uso de uma proteína dimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para: (i) tratamento de uma doença, como uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, doença autoimune, câncer, inflamação e/ou redução do risco de choque séptico causado por uma infecção bacteriana; ou (ii) tratamento de câncer, doenças autoimunes, rejeições de transplantes de órgãos e depleção de C1q no sistema humoral em um humano

33. Uso de uma proteína como definida na reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para: (i) tratamento de uma doença, como uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, doença autoimune, câncer, inflamação e/ou redução do risco de choque séptico causado por uma infecção bacteriana; ou (ii) tratamento de câncer, doenças autoimunes, rejeições de transplantes de órgãos e depleção de C1q no sistema humoral em um humano

34. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 26, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para: (i) tratamento de uma doença, como uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, doença autoimune, câncer, inflamação e/ou redução do risco de choque séptico causado por uma infecção bacteriana; ou (ii) tratamento de câncer, doenças autoimunes, rejeições de transplantes de órgãos e depleção de C1q no sistema humoral em um humano

35. Uso de um kit de partes, como definido na reivindicação 31, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para: (i) tratamento de uma doença, como uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, doença autoimune, câncer, inflamação e/ou redução do risco de choque séptico causado por uma infecção bacteriana; ou (ii) tratamento de câncer, doenças autoimunes, rejeições de transplantes de órgãos e depleção de C1q no sistema humoral em um humano

36. Proteína dimérica como definda em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a proteína dimérica compreende uma região de ligação que se liga especificamente a um lipopolissacarídeo (LPS), um lipooligossacarídeo (LOS), uma endotoxina delta, toxina botulínica, exotoxina de Corynebacterium diphtheriae, um superantígeno bacteriano, uma enterotoxina estável ao calor, citolisina, uma toxina formadora de canal, uma toxina enzimaticamente ativa ou uma micotoxina.

37. Proteína de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a proteína dimérica compreende uma região de ligação que se liga especificamente a um lipopolissacarídeo (LPS), um lipooligossacarídeo (LOS), uma endotoxina delta, toxina botulínica, exotoxina de Corynebacterium diphtheriae, um superantígeno bacteriano, uma enterotoxina estável ao calor, citolisina, uma toxina formadora de canal, uma toxina enzimaticamente ativa ou uma micotoxina.

38. Composição como definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 26, caracterizada pelo fato de que a proteína dimérica compreende uma região de ligação que se liga especificamente a um lipopolissacarídeo (LPS), um lipooligossacarídeo (LOS), uma endotoxina delta, toxina botulínica, exotoxina de Corynebacterium diphtheriae, um superantígeno bacteriano, uma enterotoxina estável ao calor, citolisina, uma toxina formadora de canal, uma toxina enzimaticamente ativa ou uma micotoxina.

39. Kit de partes como definido na reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a proteína dimérica compreende uma região de ligação que se liga especificamente a um lipopolissacarídeo (LPS), um lipooligossacarídeo (LOS), uma endotoxina delta, toxina botulínica, exotoxina de Corynebacterium diphtheriae, um superantígeno bacteriano, uma enterotoxina estável ao calor, citolisina, uma toxina formadora de canal, uma toxina enzimaticamente ativa ou uma micotoxina.

40. Uso de uma proteína dimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 36, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, para imagiologia de pelo menos uma parte do corpo de um ser humano ou outro mamífero, ou para modular a eliminação de uma molécula alvo do corpo de um ser humano ou outro mamífero.

41. Uso de uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 14, 15 e 37, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, para imagiologia de pelo menos uma parte do corpo de um ser humano ou outro mamífero, ou para modular a eliminação de uma molécula alvo do corpo de um ser humano ou outro mamífero.

42. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 26 e 38, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, para imagiologia de pelo menos uma parte do corpo de um ser humano ou outro mamífero, ou para modular a eliminação de uma molécula alvo do corpo de um ser humano ou outro mamífero.

43. Uso de um kit de partes, como definido na reivindicação 31 e 39, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção bacteriana, viral ou parasitária, para imagiologia de pelo menos uma parte do corpo de um ser humano ou outro mamífero, ou para modular a eliminação de uma molécula alvo do corpo de um ser humano ou outro mamífero.

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