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Description

発明の分野
本発明は、Fc領域における3つの修飾から生じる、細胞活性化に至るいかなるFc受容体媒介性機能も誘導しない点で不活性である第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含む、抗体などの、タンパク質に関する。
発明の背景
抗体のFc領域によって媒介されるエフェクター機能は、病原体の死滅ならびに抗原のクリアランスおよび分解といった、外来性実体の破壊を可能にする。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）および抗体依存性細胞媒介性食作用（ADCP）は、Fc受容体（FcR）を保有する細胞にFc領域が結合することによって惹起され、一方、補体依存性細胞傷害作用（CDC）は、補体活性化の古典的経路を惹起するC1qにFc領域が結合することによって惹起される。
ADCCおよび補体活性化などの、Fc媒介性エフェクター機能は、癌の治療のために使用されるモノクローナル抗体の治療効果に寄与することが示唆された（Weiner et al. Cell 2012, 148: 1081-1084）。
Fc領域への結合によって引き起こされる望まれない効果、例えば、サイトカインストームおよび関連する毒性効果または血小板凝集を減少させるために、変異アミノ酸配列を有する抗体断片または抗体を提供することによって、以前にも努力がなされた。例えば、Fab、F(ab')2、またはscFv分子などの抗体断片は、Fcエフェクター機能を本質的に欠いているが、短いインビボ半減期を有し、半減期を延長するために追加の修飾を必要とし得る。TaoおよびMorrison(1989)は、グリコシル化（aglycosylated）キメラマウス-ヒトIgGの研究を記載している。Boltら(1993)は、インビトロ免疫抑制作用を保持しているヒト化非分裂促進性CD3モノクローナル抗体の作製を記載している。
CanfieldおよびMorrison(2003)は、高親和性Fc受容体についてのヒトIgGの結合親和性が、CH2ドメイン中の複数のアミノ酸によって決定され、ヒンジ領域によって調節されることを記載している。
Hezarahら(2001)は、ヒト免疫不全ウイルス1型に対する広域中和抗体の変異体の一団のエフェクター機能活性を記載している。
Armourら(2003)は、ヒトIgG野生型および変異抗体によるヒトFcγRIIaおよびFcγRIIb受容体への示差的結合を記載している。
Idusogieら(2000)は、ヒトIgG1 Fcを有するキメラ抗体である、リツキサン上のC1q結合部位のマッピングを記載している。
Shieldsら(2001)は、FcγRI、FcγRII、RcγRIII、およびFcRnについてのヒトIgG1上の結合部位の高分解能マッピング、ならびにFcγRへの改善された結合を有するIgG1変異体の設計を記載している。
Oganesyanら(2008)は、エフェクター機能の欠如について操作されたヒトFc断片の構造キャラクタリゼーションを記載している。
Duncanら(2008)は、IgG上のヒト高親和性Fc受容体についての結合部位の位置決めを記載している。
Parrenら(1992)は、ヒト単球、好中球、および血小板上の低親和性FcγRIIa(CD32)とIgGサブクラスとの相互作用を記載している。
Newmanら(2001)は、ヒトCD4に対する霊長類化IgG抗体のFc領域の修飾が、チンパンジーにおいて、CD4受容体を調節する能力を保持するが、CD4(+)T細胞を激減させないことを記載している。
あるいは、抗体のヒンジ領域がFcγRおよび補体との相互作用に関して重要であると報告された。Dall'Acquaら(2006)は、ヒンジ領域の操作によるヒトIgG1のエフェクター機能の調節を記載している。しかし、以前に操作されたFc領域はいずれも、完全にはFc媒介性機能を欠いていない。さらに、免疫原性およびインビボ半減期に対するこれらの特定の変異の影響は不明である場合が多い。
上述したように、様々な特定のエフェクター機能を誘導することができず、同時に、保存された薬物動態特性を有する、タンパク質の必要性が存在する。本発明はそのようなタンパク質を提供する。
本発明は、野生型タンパク質または抗体と比較して非活性のFc領域を有するタンパク質および抗体を提供する。理論に拘束されないが、前記タンパク質および抗体は、Fc受容体結合などの、Fc領域とエフェクター成分との相互作用によって引き起こされる様々なエフェクター機能を誘導することができないと考えられる。
従って、一局面において、本発明は、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含むタンパク質に関し、第1および第2ポリペプチドは各々、少なくとも免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を含み、第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、L、L、およびDではない。
別の局面において、本発明は、親タンパク質の変異体に関する。
別の局面において、本発明は、本発明に従うタンパク質または変異体を含む組成物に関する。
別の局面において、本発明は、本発明に従うタンパク質または変異体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
本発明はまた、疾患の治療における使用のための本発明に従うタンパク質、変異体、組成物、または薬学的組成物の使用に関する。
本発明の別の局面は、本発明に従うタンパク質、変異体、組成物、または薬学的組成物を対象へ投与する工程を含む、癌の治療方法に関する。
[本発明1001]
第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含むタンパク質であって、該第1および第2ポリペプチドが各々、少なくとも免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含み、該第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、それぞれL、L、およびDではない、タンパク質。
[本発明1002]
前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、それぞれL、L、およびDではなく、ヒトIgG1重鎖における位置N297およびP331に対応する位置におけるアミノ酸が、それぞれQおよびSではない、本発明1001のタンパク質。
[本発明1003]
前記タンパク質が、わずか10%、例えばわずか8%、わずか7%、わずか5%、わずか3%、わずか1%、およびわずか0%しか野生型タンパク質から逸脱しない血漿クリアランス速度（mL/日/kg）を有し、血漿クリアランス速度が、曲線下面積（AUC）で割った対象へ投与される用量（μg/kg）によって算出され、AUC値が濃度-時間曲線から決定される、本発明1001または1002のいずれかのタンパク質。
[本発明1004]
前記第1および第2ポリペプチドが、それぞれ免疫グロブリンの第1および第2重鎖である、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1005]
前記第1および第2ポリペプチドが、それぞれ第1および第2結合領域をさらに含む、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1006]
前記タンパク質が、免疫グロブリンの第1および第2軽鎖をさらに含み、該第1軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第1重鎖と連結されており、該第2軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第2重鎖と連結されており、それによって、第1結合領域および第2結合領域がそれぞれ形成されている、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1007]
前記第1および第2結合領域のうちの少なくとも1つがCD3に結合する、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1008]
少なくとも前記第1ポリペプチドのヒトIgG1重鎖におけるL234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、それぞれL、L、およびDではなく、前記第1結合領域がCD3に結合する、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1009]
前記第1および第2結合領域の両方がCD3に結合する、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1010]
前記タンパク質が、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、末梢血単核細胞（PBMC）に基づく機能アッセイにおいてCD69発現を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したFc媒介性CD69発現を媒介する、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1011]
前記タンパク質が、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、PBMCに基づく機能アッセイにおいてT細胞増殖を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したFc媒介性T細胞増殖を媒介する、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1012]
前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、疎水性アミノ酸または極性アミノ酸である、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1013]
前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、脂肪族非荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸、または酸性アミノ酸である、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1014]
前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応するアミノ酸が、それぞれF、E、およびA；またはA、A、およびAである、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1015]
前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応するアミノ酸が、それぞれF、E、およびAである、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1016]
免疫グロブリン重鎖のアイソタイプが、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択される、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1017]
少なくとも前記第1結合領域が、
a．SEQ ID NO：6に示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：12に示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域；
b．SEQ ID NO：8に示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：12に示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域；ならびに
c．SEQ ID NO：9に示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：10に示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域
からなる群より選択される、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1018]
前記第1および第2ポリペプチドの両方が本発明1001〜1016のいずれかに記載されるものである、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1019]
前記第1結合領域が前記第2結合領域とは異なる標的に結合する、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1020]
前記標的が、異なる細胞上に存在する、本発明1019のタンパク質。
[本発明1021]
前記第1ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、F405、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、前記第2ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、F405、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、かつ該第1および該第2ポリペプチドの該置換が同じ位置においてではない、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1022]
ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸が、前記第1ポリペプチドにおいてLであり、かつヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸が、前記第2ポリペプチドにおいてRであるか、またはその逆である、本発明1021のタンパク質。
[本発明1023]
抗体である、前記本発明のいずれかのタンパク質。
[本発明1024]
タンパク質が二重特異性抗体である、本発明1001〜1023のいずれかのタンパク質。
[本発明1025]
前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖におけるL234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、それぞれF、E、およびAであり、かつ前記第1結合領域がCD3に結合し、かつ前記第2結合領域が癌特異的標的に結合する、本発明1024のタンパク質。
[本発明1026]
前記本発明のいずれかに記載される、親タンパク質の変異体。
[本発明1027]
抗体である、本発明1026の変異体。
[本発明1028]
前記本発明のいずれかのタンパク質または変異体を含む、組成物。
[本発明1029]
本発明1001〜1025のいずれかのタンパク質、または本発明1026および1027のいずれかの変異体、ならびに薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1030]
疾患の治療における使用のための、本発明1001〜1025のいずれかのタンパク質、本発明1026および1027のいずれかの変異体、本発明1028の組成物、または本発明1029の薬学的組成物。
[本発明1031]
本発明1001〜1025のいずれかのタンパク質、本発明1026および1027のいずれかの変異体、本発明1028の組成物、または本発明1029の薬学的組成物を対象へ投与する工程を含む、癌の治療方法。
[本発明1032]
疾患が、癌、感染症、または自己免疫疾患である、本発明1030〜1031のいずれかの使用または方法。
Jurkat細胞(図1A、B)またはAU565細胞(図1C、D)上のそれらの特異的標的へのIgG1-CD3 (IgG1-huCLB-T3/4-F405L)またはIgG1-HER2 (IgG1-HER2-169-K409R)単一特異性抗体変異体およびbsIgG1-CD3xHER2 (IgG1-huCLB-T3/4xHER2-169)二重特異性抗体変異体の結合曲線。示されるデータは、実施例2に記載されるような、各細胞株についての1つの代表的実験の平均蛍光強度（MFI）である。 Jurkat細胞(図2Aおよび2B)またはAU565細胞(図2Cおよび2D)上のそれらの特異的標的へのIgG1-CD3(IgG1-huCLB-T3/4-F405L)またはIgG1-HER2 (IgG1-HER2-169-K409R)単一特異性抗体変異体およびbsIgG1 CD3 x HER2 (IgG1-huCLB-T3/4 x HER2-169)二重特異性抗体変異体の結合曲線。示されるデータは、実施例2に記載されるような、各細胞株についての1つの代表的実験の平均蛍光強度（MFI）である。 実施例3に記載されるようなPBMC培養物中のT細胞上のCD69発現のFACS分析。PBMC培養物を、滴定された（titrated）IgG1-CD3 (huCLB-T3/4)抗体変異体で処理した。3つの実験の代表的な例を示す。 実施例4に記載されるようなELISAにおいて測定されたT細胞増殖。PBMCを抗体変異体と共に3日間インキュベートした。2つの独立した実験からの代表的な結果を示す。 野生型および抗体変異体（N297Q、LFLE、LFLENQ、LFLEDA、DANQ、LFLEDANQPS［図5A〜G］）によるT細胞媒介性細胞傷害の誘導を、実施例5に記載されるように測定した。デュプレットで（in duplet）行った1つの実験からの平均値を示す。 野生型および抗体変異体（LFLEDA、LALA［図6A〜C］）によるT細胞媒介性細胞傷害の誘導を、実施例5に記載されるように測定した。デュプレットで行った2つの実験からの平均値を示す。 実施例5に記載されるような、非活性単一特異性IgG1-CD3または二重特異性IgG-CD3xHER2抗体変異体と腫瘍細胞およびPBMCのインキュベーション後の上清中のサイトカイン放出（GM-CSF(図7A)、IFNγ(図7B)、IL-1β(図7C)、IL-2(図7D)、IL-6(図7E)、IL-8(図7F)、IL-10(図7G)、IL-12(図7H)、およびTNFα(図7I)とのインキュベーション）。 単一特異性IgG1-CD3（図8A、8C）および二重特異性IgG1-CD3xHER2（図8B、8D）、ならびにそれらの非活性抗体変異体へのC1qの結合を、実施例7に記載されるようにELISAによって評価した。結果は、2回行った実験の代表である。 高親和性FcγRIへのIgG1-CD3抗体変異体（図9A）N297Q、LFLE、LFLEDA、LFLENQ、DANQ、およびLFLEDANQPSならびに（図9B）LFLEDAおよびLALAの結合を、実施例8に記載されるようにFACS分析によって評価した。2つの実験の平均値を示す。 非活性抗体変異体の薬物動態（PK）分析を、実施例9に記載されるように野生型IgG1-CD3抗体のそれと比較した。図10Aは、時間に対してプロットされたヒトIgG1の血漿濃度を示す。図10Bは、実施例9に記載されるように算出された血漿クリアランス速度を示す。水平の点線はSCIDマウス中のヒトIgG1抗体の平均クリアランス速度（10 mL/日/kg）を示す。 ヒトT細胞株Jurkatへの（図11A）IgG1-huCD3の単一特異性抗体変異体および（図11B）二重特異性抗体変異体bsIgG1 huCD3xHER2の結合曲線。示されるデータは、実施例10に記載されるように、1つの代表的実験の平均蛍光強度(MFI)である。表は、最大半量結合（EC50）を生じさせる抗体濃度(μg/mL)を示す。 カニクイザルT細胞株HCS-Fへの（図12A）IgG1-huCD3の単一特異性抗体変異体および（図12B）二重特異性抗体変異体bsIgG1 huCD3xHER2の結合曲線。示されるデータは、実施例10に記載されるように、1つの代表的実験の平均蛍光強度(MFI)である。 IgG1-huCD3抗体変異体をPBMC上において滴定した。PBMC培養物中のT細胞上のCD69の発現を、実施例11に記載されるように、FACS分析によって測定した。これらの実験を2回行い、1つの実験からの代表的な結果を示す。 実施例12に記載されるように、ヒト（図14A）またはカニクイザル（図14B）PBMCを、IgG1-huCD3抗体変異体と共に3日間インキュベートし、その後、増殖を細胞増殖ELISAによって測定した。2つの独立した実験からの代表的な結果を示す。 非活性LFLEDA変異を有するヒト化CD3（huCD3）抗体変異体によるヒト（図15A）およびカニクイザル（図15B）T細胞媒介性細胞傷害の誘導を、実施例13に説明されるように測定した。デュプレットで行った2つの独立した実験からの代表的な結果を示す。
発明の詳細な説明
本明細書に記載するように、抗体のFc領域中のアミノ酸位置における特定の修飾が、タンパク質を不活性にする非活性修飾であることがわかった。具体的には、特定の態様が、野生型抗体の血漿クリアランス速度に匹敵するインビボ血漿クリアランス速度を有することが示された。
用語「非活性」は、本明細書で用いる場合、本発明に従うタンパク質と、単球など広範囲のエフェクター細胞上に存在するFc受容体（FcR）との、または補体経路を活性化するためのC1qとの相互作用の阻害または消失を指すように意図される。
用語「Fc領域」は、本明細書で用いる場合、N末端からC末端の向きに少なくともヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を含む領域のことを指すように意図される。
本発明は、一局面において、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含むタンパク質に関し、第1および第2ポリペプチドは各々、少なくとも免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を含み、第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、L、L、およびDではない。
用語「タンパク質」は、本明細書で用いる場合、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の1つまたは複数の鎖を含む大きな生体分子を指すように意図される。アミノ酸の単一の鎖はまた「ポリペプチド」と呼ばれ得る。従って、本発明の文脈中のタンパク質は1つまたは複数のポリペプチドからなり得る。本発明に従うタンパク質は、任意のタイプのタンパク質、例えば、抗体、または親抗体の変異体であり得る。
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、典型的な生理的条件下で、意味のある期間、例えば少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間もしくはそれより長い、約48時間もしくはそれより長い、約3日、4日、5日、6日、7日もしくはそれより長い日数など、または任意の他の妥当な機能的に定められた期間（例えば、抗原に対する抗体結合に伴う生理的応答を誘導、促進、増強および／もしくは調節するのに十分な時間、ならびに／または抗体がエフェクター活性を動員するのに十分な時間）の半減期で抗原へ特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそれらのいずれかの誘導体を指すように意図される。抗原と相互作用する結合領域（または結合ドメイン、これは本明細書で用いられ得、両方とも同じ意味を有する）は、免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含む。抗体（Ab）の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および補体系の成分（例えば補体活性化の古典的経路における第一成分であるC1q）を含む、宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。上述の通り、別の記述があるか、または文脈と明らかに食い違う場合を除き、本明細書における抗体という用語は、抗原と特異的に相互作用する、例えば結合する、能力を保っている抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって果たされ得ることは示されている。用語「抗体」内に包含される結合性断片の例には、(i) Fab'またはFab断片、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片、またはWO2007059782(Genmab A/S)に記載の一価抗体；(ii) F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片；(iii) VHおよびCH1ドメインから本質的になるFd断片；(iv) 抗体の単一アームのVLおよびVHドメインから本質的になるFv断片、(v) dAb断片(Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989))、これはVHドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれる(Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11) :484-90)；(vi) ラクダ科動物またはナノボディ(Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1) : 111-24)ならびに(vii) 単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、VLおよびVH領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を用いて、連結され得る（単鎖抗体または単鎖Fv（scFv）として公知；例えば、Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)およびHuston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)を参照のこと）。別の記述があるか、または文脈によって明らかに示される場合を除き、このような単鎖抗体は、抗体という用語内に包含される。このような断片は抗体の意味内に一般に含まれるが、それらは、集合的におよび各々独立して本発明の特有の特徴であり、異なる生物学的特性および有用性を示す。本発明の文脈中のこれらおよび他の有用な抗体断片を本明細書においてさらに議論する。抗体という用語は、別に指定する場合を除き、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）、抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに酵素的切断、ペプチド合成、および組換え手法などの任意の公知の技術によって提供される、抗原へ特異的に結合する能力を保持している抗体断片（抗原結合性断片）も含むことが理解されるべきである。作製される抗体は、任意のアイソタイプを有し得る。
抗体が断片、例えば結合性断片である場合、前記断片は本明細書に記載のFc領域へ融合されることが、本発明の文脈内において理解されるべきである。それによって、抗体は、本発明の範囲内に入る、融合タンパク質となり得る。従って、一態様において、タンパク質は融合タンパク質である。
用語「免疫グロブリン重鎖」または「免疫グロブリンの重鎖」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリンの重鎖のうちの1つを指すように意図される。重鎖は、典型的に、免疫グロブリンのアイソタイプを規定する重鎖定常領域（本明細書ではCHと略記）および重鎖可変領域（本明細書ではVHと略記）で構成される。重鎖定常領域は、典型的に、CH1、CH2およびCH3という3つのドメインで構成される。用語「免疫グロブリン」は、本明細書で用いる場合、1対の軽（L）低分子量鎖および1対の重（H）鎖という2対のポリペプチド鎖からなり、その4つすべてがジスルフィド結合によって相互接続されている可能性のある、構造的に類縁性のある糖タンパク質のクラスを指すように意図される。免疫グロブリンの構造は十分に特徴づけられている（例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)を参照のこと）。免疫グロブリンの構造内で、2つの重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」におけるジスルフィド結合を介して相互接続されている。重鎖と同様に、各軽鎖は、典型的に、いくつかの領域；軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略記）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、典型的に、CLという1つのドメインで構成される。さらに、VH領域およびVL領域を、フレームワーク領域（FR）と称される、より保存された領域の間に散在する、相補性決定領域（CDR）とも称される超可変性の領域（または超可変領域、これらは構造的に画定されたループの配列および／または形態の点で超可変性であり得る）にさらに細分することもできる。各VHおよびVLは、典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4（Lefranc MP et al, Dev Comp Immunol Jan:27(1):55-77(2003)も参照のこと）。
用語「全長抗体」は、本明細書で用いる場合、そのアイソタイプの野生型抗体に通常認められるものに対応する重鎖および軽鎖の定常ドメインおよび可変ドメインのすべてを含む抗体（例えば、親抗体または変異型抗体）を指す。
用語「ヒト抗体」は、本明細書で用いる場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異、挿入、または欠失）を含んでもよい。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で用いる場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に接ぎ合わされた抗体は含まないものとする。
用語「第1ポリペプチド」および「第2ポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列が同一であっても異なっていてもよいポリペプチのセットを指す。別の記述または記載がある場合を除き、野生型タンパク質の場合、第1および第2ポリペプチドは同一のアミノ酸配列を有する。
用語「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgEもしくはIgM）またはそれらの任意のアロタイプ、例えばIgG1m(za)およびIgG1m(f)）を指す。従って、一態様において、タンパク質は、IgG1クラスまたはその任意のアロタイプの免疫グロブリンの重鎖を含む。さらに、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）もしくはラムダ（λ）軽鎖、またはそれらの任意のアロタイプのいずれかと組み合わせることができる。
用語「ヒンジ領域」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指す。従って、例えば、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域は、Kabatに記載されたEuナンバリングシステムによるアミノ酸216〜230に対応する（Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition -US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)に記載）。
用語「CH2領域」または「CH2ドメイン」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン重鎖のCH2領域を指す。従って、例えば、ヒトIgG1抗体のCH2領域は、Euナンバリングシステムによるアミノ酸231〜340に対応する。しかし、CH2領域が、本明細書に記載したような他のサブタイプのいずれかであってもよい。
用語「CH3領域」または「CH3ドメイン」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン重鎖のCH3領域を指す。従って、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、Euナンバリングシステムによるアミノ酸341〜447に対応する。しかし、CH3領域が、本明細書に記載したような他のサブタイプのいずれかであってもよい。
用語「位置に対応するアミノ酸」は、本明細書で用いる場合、ヒトIgG1重鎖におけるアミノ酸位置番号を指す。別の記述があるか、または文脈と食い違う場合を除き、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書において、Euインデックス・オブ・ナンバリング（Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)に記載）に従って番号付けされている。従って、別の配列におけるアミノ酸またはセグメント「に対応する」、1つの配列におけるアミノ酸またはセグメントとは、ALIGN、ClustalWまたは類似のものなどの標準的な配列アラインメントプログラムを、典型的にはデフォルト設定で用いて、他のアミノ酸またはセグメントとアラインメントされて、ヒトIgG1重鎖に対して少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％の同一性を有するもののことである。配列における配列またはセグメントをアラインメントし、それによって本発明に従うアミノ酸位置へ配列における対応の位置を決定する方法は、当技術分野において周知と考えられる。
本発明の文脈において、アミノ酸は、保存的または非保存的クラスによって定義され得る。従って、アミノ酸のクラスは、以下の表のうちの1つまたは複数において示され得る。
保存的クラスのアミノ酸残基
Figure 0006604851
アミノ酸残基の代替の物理的および機能的な分類
Figure 0006604851
本発明の文脈において、タンパク質における置換は以下のように示される：
元のアミノ酸−位置−置換されたアミノ酸；
周知のアミノ酸命名法を参照して、任意のアミノ酸残基を示すためのコードXaaおよびXを含む、三文字コードまたは一文字コードが用いられる。したがって、「L234F」または「Leu234Phe」という表記は、タンパク質が、野生型タンパク質での位置234におけるアミノ酸に対応するタンパク質アミノ酸の位置に、ロイシンのフェニルアラニンによる置換を含むことを意味する。
所定の位置におけるアミノ酸の任意の他のアミノ酸への置換は、以下のように呼ばれる：
元のアミノ酸−位置；または例えば「L234」。
元のアミノ酸および／または置換されたアミノ酸が、2つ以上の、ただし全てではないアミノ酸を含み得る修飾については、2つ以上のアミノ酸は「,」または「/」によって分けられ得る。例えば、位置234におけるロイシンのフェニルアラニン、アルギニン、リジンまたはトリプトファンへの置換は以下である：
「Leu234Phe,Arg,Lys,Trp」または「L234F,R,K,W」または「L234F/R/K/W」または「L234をF, R, KまたはWに」。
このような表記は、本発明の文脈において互換的に用いることができるが、同じ意味および目的を有する。
その上、用語「置換」は、他の19種の天然アミノ酸のいずれか1つへの置換、または非天然アミノ酸などの他のアミノ酸への置換も包含する。例えば、位置234におけるアミノ酸Lの置換には、以下の置換のそれぞれが含まれる：234A、234C、234D、234E、234F、234G、234H、234I、234K、234M、234N、234Q、234R、234S、234T、234V、234W、234P、および234Y。ところで、これは234Xとの表記と等価であり、ここでXは元のアミノ酸以外の任意のアミノ酸を表している。また、これらの置換を、L234A、L234Cなど、またはL234A,Cなど、またはL234A/C/などと表すこともできる。同じことが、本明細書で言及する各位置およびあらゆる位置についても同様に成り立ち、そのような置換の任意のものが本明細書に具体的に含まれる。アミノ酸配列が「X」または「Xaa」を含む場合、前記XまたはXaaは任意のアミノ酸を示すことが、当技術分野において周知である。従って、XまたはXaaは、典型的に、20個の天然に存在するアミノ酸のいずれかを示し得る。用語「天然に存在する」は、本明細書で用いる場合、以下のアミノ酸残基のいずれか1つを指す；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびシステイン。
用語「アミノ酸」および「アミノ酸残基」は、互換的に用いることができる。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、L、L、およびDではなく、ヒトIgG1重鎖における位置N297およびP331に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、QおよびSではない。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、L、L、およびDではなく、ヒトIgG1重鎖における位置N297およびP331に対応する位置におけるアミノ酸は置換されていない。この文脈において、用語「置換されていない」は、別の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸で置換されていない、ヒトIgG1重鎖におけるアミノ酸位置N297およびP331にあるアミノ酸を指す。従って、ヒトIgG1重鎖における位置に対応する位置における「置換されていない」アミノ酸は、特定の位置のアミノ酸が、ヒトIgG1重鎖における天然に存在するアミノ酸と同じであることを意味する。
Fc媒介性エフェクター機能は、ヒト免疫グロブリンG（IgG）分子の生物学的活性の一部分を形成する。このようなエフェクター機能の例としては、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）および補体依存性細胞傷害作用（CDC）が挙げられ、これらはFc領域への様々なエフェクター分子の結合によって引き起こされる。本発明の文脈において、「Fc結合」、「Fc受容体結合」、「FcR結合」、および「FcRへの抗体Fc領域の結合」は、Fc受容体（FcR）またはエフェクター分子へのFc領域の結合を指す。用語「FcγR結合」および「FcγRI結合」は、それぞれ、Fcガンマ受容体およびFcガンマ受容体IへのFc領域への結合またはFc領域との結合を指す。場合によっては、CD3抗体がT細胞に結合する場合、CD3抗体のFc領域は、他の細胞、例えば単球上に存在するFcRへ結合し、これは、T細胞の活性化をもたらす。このようなT細胞の非標的化活性化は望まれない場合がある。しかし、標的化T細胞活性化は、癌などの様々な適応症の治療のために非常に望ましい場合がある。特定の細胞、例えば腫瘍細胞へのT細胞のターゲッティングは、二重特異性抗体の使用によって促進され得、ここで、結合領域の一方は、T細胞上に存在するCD3に結合し、他方の結合領域は、例えば腫瘍細胞上の、標的特異的抗原に結合する。Fc媒介性架橋による望まれない標的化T細胞活性化は、回避されるべきであり、Fc領域をこのような活性について不活性にすることによって無効にされ得る。それによって、存在するFc受容体と前記不活性Fc領域との相互作用が妨げられる。本発明の抗体は、いくつかの異なるアッセイにおいて試験した場合、完全に不活性であることがわかった；即ち、実施例3〜9および11〜13を参照のこと。アミノ酸置換L234F、L235E、およびD265Aを含むCD3抗体は、実施例に記載されるように、Fc媒介性T細胞増殖、T細胞上のFc媒介性CD69発現、細胞傷害性アッセイにおける非特異的死滅およびサイトカイン放出、ならびにインビトロC1q結合の抑止を示した。同様に、アミノ酸置換L234F、L235E、およびN297Qを含む抗体は、匹敵する結果を示した。従って、本発明の、タンパク質、例えば抗体は、野生型タンパク質と比較した場合にいくつかのアッセイにおいて優れた結果を明らかに示す。
用語「不活性」、「不活性な」、または「非活性の」は、本明細書で用いる場合、少なくともいずれのFcγ受容体にも結合することができない、FcRのFc媒介性架橋を誘導することができない、または個々のタンパク質（例えば抗体）の2つのFc領域による標的抗原のFcR媒介性架橋を誘導することができない、またはC1qに結合することができない、Fc領域を指す。
用語「架橋」は、本明細書で用いる場合、抗体の二価相互作用による、表面タンパク質であり得る2つのタンパク質の架橋、または、抗体Fc領域とFcR保有細胞との相互作用を介して抗体によって結合される2つのタンパク質の架橋、または、抗体と標的抗原保有細胞上の標的抗原との相互作用を介して抗体が結合されるFc受容体の架橋を指す。
用語「非特異的死滅」は、本明細書で用いる場合、腫瘍標的抗原非依存性活性化を介する、T細胞または他のエフェクター細胞の細胞傷害機能による細胞の死滅を指す。
用語「増殖」は、本明細書で用いる場合、細胞発生および細胞分裂の文脈における細胞成長を指す。
従って、本発明は、Fc媒介性T細胞活性化を可能にせず、補体系を誘導せず、Fcγ受容体に結合せず、しかし同時に、野生型タンパク質の血漿クリアランス速度に匹敵する血漿クリアランス速度を有する、タンパク質に関する。このようなタンパク質はまた、二重特異性フォーマットで使用され得る。
従って、一態様において、タンパク質は、わずか10%、例えばわずか8%、わずか7%、わずか5%、わずか3%、わずか1%、およびわずか0%しか野生型タンパク質から逸脱しない血漿クリアランス速度を有する。
特定の態様において、タンパク質は、わずか10%、例えばわずか8%、わずか7%、わずか5%、わずか3%、わずか1%、およびわずか0%しか野生型タンパク質から逸脱しない血漿クリアランス速度（mL/日/kg）を有し、血漿クリアランス速度は、曲線下面積（AUC）で割った対象へ投与される用量（μg/kg）によって算出され、AUC値は濃度-時間曲線から決定される。
特定の態様において、血漿クリアランス速度（mL/日/kg）が、定量的ELISAアッセイにおいて測定される405nmでの吸光度に基づいて算出される場合（試験サンプルは、血清などの血液サンプルである）、タンパク質は、わずか10%、例えばわずか8%、わずか7%、わずか5%、わずか3%、わずか1%、およびわずか0%しか野生型タンパク質から逸脱しない血漿クリアランス速度を有する。
用語「定量的ELISA」は、本明細書で用いる場合、あるタンパク質がサンプル中に存在するかまたは存在しないかを評価することを可能にし、同時に、サンプル中のタンパク質の濃度値を提供する、ELISAを指す。定量的ELISAを行うために、正確な標準曲線を作成し、サンプル中のタンパク質濃度を決定しなければならない。標準曲線は、典型的に、標的分子の既知濃度溶液の系列希釈である。このように、定量的ELISAにおいて、サンプルの光学密度（OD）を標準曲線と比較する。
特定の態様において、血漿クリアランス速度（mL/日/kg）が、(i)捕捉抗体、例えば抗-ヒトIgG-カッパ抗体、(ii)タンパク質を認識する検出抗体、例えば抗-ヒトIgG-HRP抗体の工程を含む定量的ELISAアッセイにおいて測定される405nmでの吸光度に基づいて算出される場合、タンパク質は、わずか10%、例えばわずか8%、わずか7%、わずか5%、わずか3%、わずか1%、およびわずか0%しか野生型タンパク質から逸脱しない血漿クリアランス速度を有する。
用語「捕捉抗体」は、本明細書で用いる場合、ELISAプレートへコーティングされる非標識抗体を指す。捕捉抗体は、測定されるサンプル由来の関心対象のタンパク質を検出／捕捉するために使用される。
用語「検出抗体」は、本明細書で用いる場合、捕捉抗体へ結合される関心対象のタンパク質を検出するために使用される、標識抗体を指す。標識は、発色性基質から着色生成物への変換を触媒することができる酵素からなる。着色生成物は、発色性基質に依存して典型的に405nm付近の、特定のODで測定することによって、定量化することができる。
特定の態様において、タンパク質は、わずか10%、例えばわずか8%、わずか7%、わずか5%、わずか3%、わずか1%、およびわずか0%しか野生型タンパク質から逸脱しない血漿クリアランス速度を有し、血漿クリアランス速度（mL/日/kg）は、以下の工程を含むELISAアッセイにおいて測定される405nmでの吸光度に基づいて算出される：(i)ELISAプレートをマウス-抗-ヒトIgG-カッパ抗体でコーティングする工程、(II)0.2% BSA/PBSでブロッキングする工程、(iii)血液サンプルの希釈物と共にインキュベートする工程、(iv)プレートを洗浄する工程、(v)ヤギ-抗-ヒトIgG-HRP抗体と共にインキュベートする工程、(vi)1 mg/mL 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)でプレートを発色させる工程、および(vii)100μLの2%シュウ酸を添加して反応を停止させる工程。
用語「血漿クリアランス速度」は、本明細書で用いる場合、生きている生物への投与後にタンパク質が血液から除去される速度の定量的尺度を指す。抗体の血漿クリアランスの評価は、実施例9に記載されるように、SCIDマウスにおいて評価され得る。従って、一態様において、血漿クリアランス速度は、以下の工程を含むアッセイによって測定される：単回i.v.用量の100μg（5 mg/kg）の抗体を7〜10週齢のC.B-17 SCIDマウス（CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl, Charles-River）に注射する工程、一定の時間間隔で血液サンプルを採取する工程、ヘパリン含有バイアル中へ血液を収集する工程、10,000 x gで5分間遠心分離する工程、PBS中のマウス-抗-ヒトIgG-カッパ抗体で4℃にて一晩96-ウェルELISAプレートをコーティングする工程、プレートを洗浄する工程、室温にて1時間0.2% BSA/PBSでブロッキングする工程、室温で1時間血液サンプルの希釈物（0.2% BSA/PBST中で1/50から1/2400へ）または標準曲線と共にインキュベートする工程、プレートをPBSTで洗浄する工程、室温で1時間ヤギ-抗-ヒトIgG-HRP抗体と共にインキュベートする工程、1 mg/mL 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)で約30分間発色させる工程、100μLの2%シュウ酸を添加しそれによって反応を停止させる工程、好適なマイクロプレートリーダーにおいて405 nmでの吸光度を測定する工程、抗体を定量化する工程、グラフにおいて時間(日)に対して抗体血漿濃度(μg/mL)をプロットする工程、ならびに血漿クリアランス速度（mL/日/kg）を算出する工程。
血漿クリアランス速度（mL/日/kg）は、以下の等式に従って曲線下面積（AUC）に基づいて算出され得る；
Figure 0006604851
式中、AUC値は濃度-時間曲線から決定される。
用語「逸脱する」は、本明細書で用いる場合、血漿クリアランス速度を参照する場合、野生型タンパク質の血漿クリアランス速度と比較しての、生きている生物への投与後にタンパク質が血液から除去される速度の定量的尺度の差異を指す。従って、逸脱または差異は、パーセンテージ差異として与えられ得る。
用語「野生型」は、本発明のタンパク質の比較に関して本明細書で用いる場合、本発明に従う3つのアミノ酸位置を除いては、比較される本発明のタンパク質と同一であるタンパク質を指す。野生型タンパク質は、本発明の3つの修飾のアミノ酸位置でポリペプチド鎖の天然に存在するアミノ酸を含む；即ち、本発明に従うアミノ酸修飾を含まないタンパク質。具体的には、本発明に関して野生型抗体は、抗体がIgG1抗体である場合、位置234および235でロイシン、ならびに位置265でアスパラギン酸を含む。従って、野生型タンパク質、例えば抗体は、例えばFcγ受容体に結合することができる、活性タンパク質のままである。野生型タンパク質および本発明に従うタンパク質は、例えば、タンパク質を二重特異性にするなどのために、本発明のもの以外のアミノ酸修飾を含む場合がある。従って、「野生型」は、具体的には、ヒトIgG1重鎖における位置234、235、および265に対応する位置におけるアミノ酸を指し、アミノ酸は、前記位置において、天然に存在するアミノ酸以外のいかなるアミノ酸へも置換されていない。
用語「ELISA」は、本明細書で用いる場合、物質を同定するために抗体および色変化を用いる試験である、酵素結合免疫吸着検定法（enzyme-linked immunosorbent assay）を指す。第1特異的抗体をプレート表面へ付着させる。それによって、サンプル由来のタンパク質を添加し、ここで、前記第1特異的抗体への結合が試験される。サンプル由来のタンパク質に結合する第2抗体を添加する。第2抗体は酵素へ連結されており、最終工程において、酵素の基質を含有する物質を添加する。その後の反応は、検出可能なシグナル、最も一般には基質の色変化を生じさせる。ELISA法の概念は、当技術分野において周知であり、ELISAを行う様々な様式が、評価され得る本発明に従うタンパク質を評価するための方法の一部分であることが想定される。従って、この解釈は限定と理解されないべきであり、何故ならば、実施例4または5に記載されるようなELISAの様々な形式が行われ得るためである。
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、典型的に、本発明のタンパク質に応答するヒトである。
実施例9において見られ得るように、ヒトIgG1重鎖における、それぞれ、L234、L235、およびD265に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む抗体は、野生型抗体に匹敵する血漿クリアランス速度を示し、このことは予想されなかった。T細胞活性化、T細胞増殖、非特異的死滅、サイトカイン放出およびC1qを試験した場合に匹敵する結果を示した、アミノ酸置換L234F、L235E、およびN297Qを含む別の試験した抗体は、野生型抗体に匹敵する血漿クリアランス速度を有さなかった。アミノ酸置換L234FおよびL235Eのみを含む抗体、アミノ酸置換L234F、L235E、D265A、N297Q、およびP331Sを含む抗体、ならびにアミノ酸置換D265AおよびN297Qを含む抗体について同じことが観察された。
一態様において、第1および第2ポリペプチドは、それぞれ、免疫グロブリンの第1および第2重鎖である。
タンパク質が抗体である態様において、第1および第2ポリペプチドは、抗体の第1および第2免疫グロブリン重鎖と同じ目的および意味を有する。従って、このような態様において、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドは、抗体の、それぞれ、第1重鎖および第2重鎖と理解されるべきである。
一態様において、第1および第2ポリペプチドは、それぞれ、第1および第2結合領域をさらに含む。
用語「結合領域」は、本明細書で用いる場合、例えば、細胞、細菌、またはビリオン上に存在する、ポリペプチドなどの、任意の分子へ結合することができるタンパク質の領域を指す。結合領域は、細胞、細菌、またはビリオンへ結合することができる、タンパク質、タンパク質リガンド、受容体、抗原結合領域、またはリガンド結合領域などの、ポリペプチド配列であり得る。具体的には、結合領域は抗原結合領域である。結合領域が例えば受容体である場合、タンパク質は、免疫グロブリンのFcドメインと前記受容体との融合タンパク質として作製されている場合がある。結合領域が抗原結合領域である場合、タンパク質は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体、または重鎖のみの抗体、またはScFv-Fc融合物などの、抗体であり得る。
用語「結合」は、本明細書で用いる場合、所定の抗原または標的、例えば受容体へのタンパク質の結合を指し、そこへの結合は、典型的には、例えば、抗原をリガンドとして、タンパク質を分析物として用いてBIAcore 3000計器で表面プラズモン共鳴（SPR）技術によって決定した場合に、KDが約10-6 Mもしくはそれ未満、例えば、10-7 Mもしくはそれ未満、例えば約10-8 Mもしくはそれ未満、例えば約10-9 Mもしくはそれ未満、約10-10 Mもしくはそれ未満、または約10-11 Mもしくはさらにはそれ未満などに対応する親和性での結合であり、所定の抗原または近縁関係にある抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）に対する結合のその親和性よりも、少なくとも10分の1の低さ、例えば少なくとも100分の1の低さ、例えば少なくとも1,000分の1の低さ、例えば少なくとも10,000分の1の低さ、例えば少なくとも100,000分の1の低さなどのKDに対応する親和性で、所定の抗原と結合する。親和性がより低くなる量はタンパク質のKDに依存し、そのため、タンパク質のKDが極めて低い（すなわち、タンパク質の特異性が高い）場合には、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低くなる量は、少なくとも10,000分の1となることがある。用語「KD」（M）は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
用語「KD」（M）は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
用語「KA」（M-1）は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用の結合平衡定数を指し、kaをkdで割ることによって得られる。
用語「kd」（sec-1）は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値はまたkoff値とも呼ばれる。
用語「ka」（M-1 x sec-1）は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度定数を指す。
一態様において、タンパク質は、免疫グロブリンの第1および第2軽鎖をさらに含み、前記第1軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第1重鎖と連結されており、前記第2軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第2重鎖と連結されており、それによって、それぞれ、第1結合領域および第2結合領域が形成されている。
用語「ジスルフィド架橋」は、本明細書で用いる場合、2つのシステイン残基間の共有結合を指し、即ち、前記相互作用はまた、Cys-Cys相互作用とも呼ばれ得る。
本発明に従うタンパク質は単一特異性であり得、これは、本発明の文脈において、その結合領域で同じエピトープへ結合するタンパク質を指す。しかし、本発明は、単一特異性タンパク質に限定されず、多重特異性タンパク質、例えば、二重特異性タンパク質にも関する。従って、一態様において、第1および第2結合領域のうちの少なくとも1つはCD3に結合する。特定の態様において、前記第1結合領域はCD3に結合し、前記第2結合領域は関心対象の任意の他の標的に結合する。このような他の標的は、腫瘍特異的標的または癌特異的標的であり得る。
用語「ヒトCD3」は、本明細書で用いる場合、T細胞補助受容体タンパク質複合体の一部であり、4つの別個の鎖から構成される、ヒト表面抗原分類3を指す。哺乳動物において、この複合体は、CD3γ（ガンマ）鎖（ヒトCD3γ鎖 182アミノ酸、Swissprot P09693、およびcyno CD3γ 181アミノ酸、Swissprot Q95LI7）、CD3δ（デルタ）鎖（171アミノ酸、ヒトCD3δ Swissprot P04234 SEQ ID NO：14、およびcyno CD3δ Swissprot Q95LI8）、2つのCD3ε（イプシロン）鎖（ヒトCD3ε 207アミノ酸、Swissprot P07766、成熟ヒトCD3イプシロン SEQ ID NO：13；cyno CD3ε 198アミノ酸、Swissprot Q95LI5、成熟cyno CD3イプシロン SEQ ID NO：21）、およびCD3ζ鎖（ゼータ）鎖（ヒトCD3ζ 164アミノ酸、Swissprot P20963、cyno CD3ζ 166アミノ酸、Swissprot Q09TK0）を含有する。これらの鎖は、T細胞受容体（TCR）として公知の分子と会合し、Tリンパ球において活性化シグナルを生じさせる。TCRおよびCD3分子は一緒にTCR複合体を構成する。
特定の態様において、前記第1および第2結合領域のうちの少なくとも1つは、ヒトCD3のイプシロン鎖（SEQ ID NO：14）などの、CD3のイプシロン鎖に結合する。さらに別の特定の態様において、前記第1および第2結合領域のうちの少なくとも1つは、成熟ヒトCD3ε（イプシロン）のN末端部のアミノ酸1〜27（SEQ ID NO：14で示される成熟ヒトCD3イプシロンのアミノ酸1〜27）内のエピトープに結合する。特定の態様において、タンパク質は、カニクイザル（SEQ ID NO：21で示される成熟cyno CD3イプシロン）およびアカゲザルなどの、他の非ヒト霊長動物種とさらに交差反応さえし得る。
用語「成熟」は、本明細書で用いる場合、いかなるシグナルまたはリーダー配列も含まないタンパク質を指す。成熟タンパク質を決定すること、または成熟タンパク質の配列を同定する方法は、当業者に周知である。
ある特定の態様において、少なくとも前記第1ポリペプチドのヒトIgG1重鎖におけるL234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、L、L、およびDではなく、前記第1結合領域はCD3に結合する。
一態様において、第1および第2結合領域の両方がCD3に結合する。
本発明者らは、Fcγ受容体結合、補体のFc結合、および抗体などのタンパク質の不活性を評価するために適しているさらなる追加の因子を評価した。抗CD3抗体の場合、そのような追加の因子の1つは、T細胞活性化マーカーCD69の発現レベルであり、これは、リンパ活性化の間必要とされる最も初期の誘導性細胞表面糖タンパク質である。
従って、一態様において、本発明のタンパク質は、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、CD69発現によってT細胞活性化を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%および100%低下したFc媒介性T細胞活性化を媒介する。用語「CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合」は、タンパク質が単一特異性抗体として前記アッセイにおいて試験される場合に観察されるタンパク質のそのような特徴を指す。しかし、CD3に結合する単一特異性抗体に本発明のタンパク質を限定するようには理解されるべきではなく、何故ならば、そのような特徴を含む本発明のタンパク質は、本明細書に記載されるような他のフォーマットで、例えば二重特異性または多重特異性抗体で使用され得るためである。
特定の態様において、タンパク質は、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、末梢血単核細胞（PBMC）に基づく機能アッセイにおいてCD69発現を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したFc媒介性CD69発現を媒介する。
別の態様において、タンパク質は、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、PBMCに基づく機能アッセイにおいてCD69発現によってT細胞活性化を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したFc媒介性T細胞活性化を媒介する。
特定の態様において、タンパク質は、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、(i)抗体と共に37℃で5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーター中約16〜24時間PBMCをインキュベートする工程、(ii)細胞を洗浄する工程、(iii)マウス抗-ヒトCD28-PEおよびマウス-抗-ヒトCD69-APC抗体で4℃にて細胞を染色する工程、ならびに(iv)フローサイトメトリーによってCD28陽性細胞上のCD69発現を測定する工程を含む末梢血単核細胞（PBMC）に基づく機能アッセイにおいてCD69発現を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したCD69発現を媒介する。
用語「低下した」は、本明細書で用いる場合、T細胞活性化マーカーCD69の発現レベルを参照する場合、T細胞が野生型タンパク質によって結合される場合のCD69の発現レベルと比較した場合のCD69の発現レベルの低下を指し、但し、タンパク質の結合領域の両方がCD3に結合する。CD69の発現を低下させるタンパク質の能力は、実施例3に記載されるように、PBMCに基づく機能アッセイによって評価してもよい。従って、一態様において、CD69の発現は、以下の工程を含む方法によって測定される：1〜1000 ng/mLの範囲の抗体と共にPBMCを37℃で5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーター中16〜24時間インキュベートする工程、細胞を洗浄する工程、マウス抗-ヒトCD28-PEおよびマウス-抗-ヒトCD69-APC抗体で4℃にて細胞を染色する工程、ならびにフローサイトメトリーによってCD28陽性細胞上のCD69発現を測定する工程。
用語「CD69」は、本明細書で用いる場合、CD69遺伝子によってコードされるヒト膜貫通C型レクチンタンパク質である、表面抗原分類69を指す。インビボおよびインビトロの両方での、Tリンパ球およびナチュラルキラー（NK）細胞の活性化は、CD69の発現を誘導する。CD69は、増殖を含む細胞活性化事象に関与するシグナル伝達受容体として機能し、血小板およびナチュラルキラー細胞を含む、リンパ球中のシグナル伝達受容体として機能し、かつ特定の遺伝子を誘導する。
用語「末梢血単核細胞（PBMC）に基づく機能アッセイ」は、本明細書で用いる場合、本発明のタンパク質の機能的特徴、例えば、T細胞増殖またはCD69発現に影響を与える前記タンパク質の能力を評価するために使用されるアッセイを指し、ここで、存在する唯一の細胞が末梢血単核細胞である。実施例3に記載されるようなPBMCに基づく機能アッセイは、以下の工程を含む：(i)抗体と共に37℃で5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーター中約16〜24時間PBMCをインキュベートする工程、(ii)細胞を洗浄する工程、(iii)マウス抗-ヒトCD28-PEおよびマウス-抗-ヒトCD69-APC抗体で4℃にて細胞を染色する工程、ならびに(iv)CD69発現を評価する場合、フローサイトメトリーによってCD28陽性細胞上のCD69発現を測定する工程。
T細胞活性化を誘導する抗CD3抗体、または結合および架橋後にT細胞を活性化することができる潜在的にアゴニスティックな抗体の能力は、それらのFcR結合能力に依存する。本発明は、T細胞上にCD69発現を生じさせないタンパク質を提供し、これは、本発明に従うタンパク質はFcγ受容体結合を可能にしないことを示している。用語「Fcγ受容体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するFc受容体のグループを指し、オプソニン化された（コーティングされた）微生物のファゴサイトーシスを誘発するために最も重要なFc受容体である。このファミリーはいくつかのメンバー、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)を含み、これらは、それらの異なる分子構造に起因してそれらの抗体親和性の点で異なる。
本発明者らは、アミノ酸置換L234F、L235E、およびD265Aを含む単一特異性抗体がT細胞へ結合する場合、CD69の無または低発現が観察されることを示した（実施例3および11を参照のこと）。従って、具体的な態様において、T細胞活性化マーカーCD69の発現レベルは完全に低下する。
用語「Fc媒介性T細胞活性化」は、本明細書で用いる場合、FcR保有細胞上のFcRへ抗体Fc領域の結合によって媒介されるT細胞の任意の活性化を指す。Fc領域は、N末端からC末端の向きに少なくともヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むタンパク質領域のことを指す。IgG1抗体のFc領域は、例えば、パパインによるIgG1抗体の消化によって生成できる。
用語「hrs.」は、本明細書で用いる場合、「時間」の略語を指す。
別の態様において、タンパク質は、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、PBMCに基づく機能アッセイにおいてT細胞増殖を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したFc媒介性T細胞増殖を媒介する。
一態様において、タンパク質は、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、(i)抗体と共に37℃で5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーター中3日間PBMCをインキュベートする工程、(ii)細胞DNA中へ組み込まれることが可能な薬剤を添加する工程、(iii)3〜8時間インキュベートする工程、(iv)細胞をペレット化する工程、(v)細胞をELISAプレートへコーティングする工程、(vi)抗-DNA組み込み化薬剤（anti-DNA incorporated agent）と共に室温で60〜120分間インキュベートする工程を含むPBMCに基づく機能アッセイにおいてT細胞増殖を測定した場合に、少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したFc媒介性T細胞増殖を媒介する。
特定の態様において、タンパク質は、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、(i)抗体と共に37℃で5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーター中3日間PBMCをインキュベートする工程、(ii)BrdUを添加する工程、(iii)5時間インキュベートする工程、(iv)細胞をペレット化する工程、(v)細胞をELISAプレートへコーティングする工程、(vi)抗-BrdU-ペルオキシダーゼと共に室温で90分間インキュベートする工程、(vii)1 mg/mL 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)で約30分間プレートを発色させる工程、(viii)100μLの2%シュウ酸を添加して反応を停止させる工程、および(xi)405nmでの吸光度を測定する工程を含むPBMCに基づく機能アッセイにおいてT細胞増殖を測定した場合に、少なくとも50%、例えば少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、および100%低下したFc媒介性T細胞増殖を媒介する。
用語「低下した」は、本明細書で用いる場合、T細胞増殖を参照する場合、野生型タンパク質によって結合されたT細胞の増殖の誘導と比較した場合のT細胞の増殖を誘導する本発明に従うタンパク質の能力の低下を指し、但し、タンパク質の結合領域の両方がCD3に結合する。T細胞増殖を誘導するタンパク質の能力の低下は、実施例4に記載されるように、PBMCに基づく機能アッセイによって評価してもよい。従って、一態様において、T細胞増殖は、以下の工程を含む方法によって測定される：1〜1000 ng/mLの範囲の抗体と共にPBMCを37℃で5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーター中3日間インキュベートする工程、増殖中の細胞のDNA中へ組み込まれる、BrdUなどの、化学化合物を添加する工程、5時間インキュベートする工程、細胞をペレット化する工程、細胞を乾燥させる工程、任意で細胞を4℃で保存する工程、細胞をELISAプレートへコーティングする工程、抗-BrdU-ペルオキシダーゼと共に室温で90分間インキュベートする工程、1 mg/mL 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)で約30分間発色させる工程、100μLの2%シュウ酸を添加して反応を停止させる工程、および好適なマイクロプレートリーダーにおいて405 nmでの吸光度を測定する工程。
用語「BrdU」は、本明細書で用いる場合、チミジンのホモログである、5-ブロモ-2'-デオキウリジンを指す。BrdUが細胞培養物へ一定期間の間（例えば4時間）添加される場合、それは増殖中の細胞のDNA中へ組み込まれる。細胞を固定した後、組み込まれたBrdUの検出を、抗-BrdU-ペルオキシダーゼを用いてELISAによって行ってもよい。従って、BrdU組み込みは増殖についての尺度である。
具体的な態様において、T細胞増殖は完全に低下する。従って、T細胞の増殖は観察されない場合があるか、または、増殖のレベルは、本発明に従うタンパク質で処理されていないか、もしくは野生型タンパク質で処理されているT細胞の増殖と等しい場合がある。本発明は、T細胞の増殖を全く生じさせない、アミノ酸置換L234F、L235E、およびD265Aを含む抗体を提供し、これは、実施例4および12に記載されるように、本発明に従うタンパク質がFcγ受容体結合を可能にしないことを示している。
さらに、本発明に従う抗体、即ち、アミノ酸置換L234F、L235E、およびD265Aを含む抗体は、腫瘍細胞を死滅させるその能力を保持することが示された。実施例5において見られ得るように、本発明に従うアミノ酸置換は、抗体の効能にほとんど影響を有さない。細胞傷害性効能についての本発明に従うタンパク質の試験は、以下の工程を含む細胞傷害性アッセイにおいて行われ得る：(i)腫瘍細胞を細胞プレートに置く工程、(ii)用量反応系列で、抗体希釈物などの、サンプルを添加する工程、(iii)細胞プレートを約3時間インキュベートする工程、(iv)全血由来の単離PBCMを添加する工程、(v)プレートを3日間インキュベートする工程、(vi)プレートを洗浄する工程、(vii)10% Alamar Blueを含有する培養培地と共に4時間プレートをインキュベートする工程、および(viii)細胞生存性を測定する工程。
本明細書に記載のアッセイ条件を満たす単一特異性抗体は、二重特異性抗体の基礎を形成し得、即ち、結合領域のうちの1つがCD3に結合する二重特異性抗体は、本明細書に記載されるような、要件を満たし、かつ、機能アッセイにおいて低下したCD69発現および／またはFc媒介性T細胞増殖を媒介する能力について試験された、任意の単一特異性CD3抗体から生じ得る。
本発明者らは、第1結合領域がCD3に結合しかつ第2結合領域が癌特異的抗原（HER2）に結合する、アミノ酸置換L234F、L235E、およびD265Aを含む二重特異性抗体が、非活性変異を有さない野生型二重特異性抗体と比較した場合に少なくとも匹敵する効能で、AU365細胞の用量依存的死滅を誘導する能力に加えて（実施例5および13に記載される通り）、本発明に従う二重特異性抗体はまた、実施例6に記載されるように、非特異的死滅によって引き起こされるサイトカイン放出の阻害を示すことを示した。本発明に従う二重特異性抗体の存在下での標的およびエフェクター細胞のインキュベーションは、非特異的死滅によって引き起こされるいかなるサイトカイン産生ももたらさず（実施例5に記載される通り）、一方、野生型抗体は、より高いサイトカイン産生を示すことが示され、これは、他のエフェクター細胞との架橋によるT細胞の非特異的活性化に起因すると考えられる。従って、一態様において、第1および第2ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、L、L、およびDではなく、前記第1結合領域はCD3に結合し、前記第2結合領域は腫瘍特異的標的に結合する。
用語「サイトカイン放出」は、本明細書で用いる場合、例えばT細胞の活性化時の、インターロイキンおよびインターフェロンなどの、サイトカインの放出を指すように意図される。サイトカインは、先天免疫、適応免疫、および炎症を含む広範囲の生物学的活性に関与する。サイトカインは、それらが放出された細胞タイプを活性化し得、従って、より多くのサイトカインを産生するよう刺激し得る。
サイトカイン放出を誘導する本発明に従うタンパク質の能力は、以下の工程を含むアッセイにおいて決定され得る：(i)上述の細胞傷害性アッセイ由来の上清をプレートにおいて室温で約1〜2時間インキュベートする工程、(ii)試験されるサイトカインに対する抗体を含む溶液（このような溶液はDetection Antibody Solutionであり得る）をプレートへ添加してさらに1〜2時間インキュベートする工程、、(iii)プレートを洗浄する工程、(iv)読まれるシグナルを増強するためのコンダクター、例えばRead Buffer Tを添加する工程、および(v)化学発光を測定する工程。
上述したように、補体活性化は、いくつかの抗体が誘導することができるエフェクター機能である。補体カスケードにおける第1段階は、C1qのFc結合であり、従って、抗体のCDC能力についての指標として役立つ。本発明は抗体の不活性に関するため、補体活性化は望まれず、従って、抗体へのC1qの沈着を、実施例7に記載されるようにELISAによって測定した。前記実施例において測定されるように、本発明に従う抗体はC1q結合を抑止し、このことは、本発明の抗体はCDCを誘導することができないことを示唆している。
用語「C1q結合」は、本明細書で用いる場合、抗体がその抗原へ結合される場合の、前記抗体へのC1qの結合を指すように意図される。用語「その抗原へ結合される」は、本明細書で用いる場合、インビボおよびインビトロの両方での抗体のその抗原への結合を指す。
従って、C1q結合という本発明に従うタンパク質の能力は、抗-ヒトC1qを添加する工程および抗-ウサギIgG-Fc-HRP抗体を添加する工程を含むELISAによって測定され得る。
具体的には、C1q結合という本発明に従うタンパク質の能力は、以下の工程を含むELISAによって測定され得る：(i)ELISAプレートを希釈系列のタンパク質でコーティングする工程、(ii)プレートをブロッキングする工程、(iii)3%血清を添加する工程、(iv)37℃で1時間プレートをインキュベートする工程、(v)プレートを洗浄する工程、(vi)抗-ヒトC1qを添加する工程、(vi)室温で1時間プレートをインキュベートする工程、(vii)プレートを洗浄する工程、(viii)抗-ウサギIgG-Fc-HRP抗体を添加する工程、(ix)室温で1時間プレートをインキュベートする工程、(x)プレートを洗浄する工程、(xi)プレートを発色させる工程、および(xii)OD405 nmを測定する工程。
本発明に従うタンパク質のさらなる分析は、実施例8に記載されるようにFcγRI結合を測定することを含み得る。上述したように、Fcγ受容体は、Fcγ受容体の5つの異なる変異体から構成される、Fc受容体のグループである。FcγRIは高親和性Fc受容体であり、これは、FcγRIとタンパク質のFc領域との結合が強いことを意味する。FcγRIへの結合が阻害されるかまたはさらには抑止され得る場合、それは、タンパク質の不活性の良好な指標である。従って、FcγRIへのタンパク質のFc結合の評価は、前記タンパク質の不活性を決定する別の方法である。一態様において、本発明に従うタンパク質は、FcγRIへのFc結合を完全に抑止した。本発明に従うタンパク質のFcγRI結合能力は、以下の工程を含むフローサイトメトリーによって評価され得る：(i)試験される抗体と共におよそ30分間4℃でFcγRI陽性細胞をインキュベートする工程；(ii)細胞を洗浄する工程、(iii)抗-ヒトIgG-PE F(ab')2抗体でおよそ30分間4℃にて細胞を染色する工程、(iv)細胞を洗浄する工程、および(v)細胞の平均蛍光を測定する工程。
用語「approx.」は、本明細書で用いる場合、用語「およそ」の略語を指す。
本明細書に記載されるように、前記抗体の前記第1および第2ポリペプチドが、アミノ酸置換L234F、L235E、およびD265Aを含み、第1結合領域がCD3に結合する、本発明に従う抗体は、野生型抗体と比較した場合、CD69の発現を完全に低下させ、それによってT細胞活性化を抑止し（実施例3）、T細胞増殖を完全に低下させ（実施例4）、非特異的死滅を完全に低下させ（実施例5）、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、即ち、抗体の2つの結合領域が同じ標的に結合する場合、サイトカイン放出を完全に低下させ（実施例6）、C1q結合を抑止し（実施例7）、ならびにFcγRI結合を完全に低下させる（実施例8）ことがわかった。従って、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応するアミノ酸位置は、前述の特徴を有する抗体を提供するための、抗体中の非常に重要な位置であると考えられる。
従って、一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応するアミノ酸は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V、およびWからなる群より選択され、位置D265に対応するアミノ酸は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、Y、V、およびWからなる群より選択される。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、疎水性または極性アミノ酸である。
用語「疎水性」は、アミノ酸残基に関して本明細書で用いる場合、A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W、およびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を指す。従って、一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、WおよびYからなるアミノ酸の群より選択され、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W、およびYからなる群より選択される。
用語「極性」は、アミノ酸残基に関して本明細書で用いる場合、C、D、E、H、K、N、Q、R、S、およびTからなる群より選択される任意のアミノ酸残基を指す。従って、一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、C、D、E、H、K、N、Q、R、S、およびTからなるアミノ酸の群より選択され、ヒト重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、C、E、H、K、N、Q、R、S、およびTからなる群より選択される。
特定の態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、およびYからなる群より選択され、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、およびYからなる群より選択される。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖におけるL234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、疎水性または極性アミノ酸である。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、WおよびYからなるアミノ酸の群より選択され、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、C、F、G、H、I、M、R、T、V、W、およびYからなる群より選択される。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、C、D、E、H、K、N、Q、R、S、およびTからなるアミノ酸の群より選択され、ヒト重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、C、E、H、K、N、Q、R、S、およびTからなる群より選択される。
特定の態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、およびYからなる群より選択され、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、およびYからなる群より選択される。
別の態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、脂肪族非荷電、芳香族または酸性アミノ酸である。
用語「脂肪族非荷電」は、アミノ酸残基に関して本明細書で用いる場合、A、G、I、L、およびVからなる群より選択される任意のアミノ酸残基を指す。従って、一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、G、I、L、およびVからなる群より選択され、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、G、I、およびVからなる群より選択される。
用語「芳香族」は、アミノ酸残基に関して本明細書で用いる場合、F、T、およびWからなる群より選択される任意のアミノ酸残基を指す。従って、一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は各々、F、T、およびWからなる群より選択される。
用語「酸性」は、アミノ酸残基に関して本明細書で用いる場合、DおよびEからなる群より選択される任意のアミノ酸残基を指す。従って、一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は各々、DおよびEからなる群より選択される。
特定の態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、E、F、G、I、L、T、V、およびWからなる群より選択され、L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、D、E、F、G、I、T、V、およびWからなる群より選択される。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖におけるL234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、脂肪族非荷電、芳香族または酸性アミノ酸である。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、G、I、L、およびVからなる群より選択され、ヒトIgG1重鎖における位置L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、G、I、およびVからなる群より選択される。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は各々、DおよびEからなる群より選択される。
特定の態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置D265に対応する位置におけるアミノ酸は、A、E、F、G、I、L、T、V、およびWからなる群より選択され、L234およびL235に対応する位置におけるアミノ酸は各々、A、D、E、F、G、I、T、V、およびWからなる群より選択される。
さらなる態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応するアミノ酸は、それぞれ、F、E、およびA；またはA、A、およびAである。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、F、E、およびA；またはA、A、およびAである。
特定の態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応するアミノ酸は、それぞれ、F、E、およびAである。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、F、E、およびAである。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドのうちの少なくとも1つにおいて、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235、およびD265に対応するアミノ酸は、それぞれ、A、A、およびAである。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、A、A、およびAである。
用語「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのクラス（例えばIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4）またはそれらの任意のアロタイプ、例えばIgG1m(za)およびIgG1m(f)）を指す。さらに、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）もしくはラムダ（λ）軽鎖またはそれらの任意のアロタイプのいずれかと組み合わせることができる。
従って、一態様において、免疫グロブリン重鎖のアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択される。免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリンクラスの各々内の任意のアロタイプ、例えば、IgG1m(f)（SEQ ID NO：13）であり得る。従って、ある特定の態様において、免疫グロブリン重鎖のアイソタイプは、IgG1、またはその任意のアロタイプ、例えばIgG1m(f)である。
別の態様において、少なくとも前記第1結合領域が；
a．SEQ ID NO：6で示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：12で示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域；
b．SEQ ID NO：8で示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：12で示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域；ならびに
c．SEQ ID NO：9で示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：10で示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域、
からなる群より選択される。
一態様において、前記第1および第2ポリペプチドは両方とも、上述の態様のいずれかに従う。
一態様において、第2結合領域は、前記第1結合領域とは異なる標的に結合する。従って、タンパク質は、二重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体である。用語「二重特異性タンパク質」または「二重特異性抗体」は、2つの異なる、典型的には重なり合わないエピトープに対する特異性を有するタンパク質または抗体を指し、2つの異なる結合領域を含む。そのようなエピトープは、同一の標的上にあってもよく、または異なる標的上にあってもよい。エピトープが異なる標的にある場合、そのような標的は同一の細胞上にあってもよく、または異なる細胞もしくは細胞タイプ上にあってもよい。
用語「標的」は、本明細書で用いる場合、本発明に従うタンパク質の結合領域が結合する分子を指す。抗体の結合の文脈で用いる場合、惹起された抗体が向けられる任意の抗原を含む。
従って、一態様において、タンパク質は二重特異性抗体である。
二重特異性抗体による、受容体阻害またはT細胞動員などの、様々な適用があり、ここで、エフェクター細胞または補体への治療用抗体のFc領域のFc結合は、必要とされず、またはさらには望ましくなく、何故ならば、それは、望まれない細胞傷害性に寄与し得るためである。従って、ヒトCD3へ1つの結合領域で結合する二重特異性抗体は、細胞傷害性T細胞を動員することができるだろう。活性IgG Fc領域を有するCD3二重特異性抗体は、FcγR-発現性細胞による架橋、FcγR-発現性細胞の不適当な活性化、ならびにその後のサイトカインストームおよび関連する毒性効果、または血小板凝集を介して、腫瘍細胞の非存在下で、望まれないアゴニズムを誘導し得る。従って、非活性Fc領域を有するCD3二重特異性抗体は、潜在的な望まれない細胞活性化を防ぐために有利である。
本発明に従う二重特異性抗体は、いかなる特定の二重特異性フォーマットまたはその製造方法にも限定されない。
本発明において使用され得る二重特異性抗体分子の例には、（i）異なる抗原結合領域を含む2つのアームを有する単一の抗体、（ii）例えば追加のペプチドリンカーによって縦列に連結された2つのscFvを介して、2つの異なるエピトープに対する特異性を有する単鎖抗体；（iii）短いペプチド結合を通じて各軽鎖および重鎖がタンデムになった2つの可変ドメインを含む二重可変ドメイン抗体（DVD-Ig）（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig（商標）) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)）；（iv）化学的に結合した二重特異性(Fab')2断片；（v）2つの単鎖ダイアボディの融合の結果、標的抗原のそれぞれに対して2つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体が生じるTandab；（vi）scFvとダイアボディの組み合わせの結果、多価分子が生じるフレキシボディ（flexibody）；（vii）プロテインキナーゼAの中の「二量体化・ドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドック・アンド・ロック（dock and lock）」分子、これはFabに適用されると、2つの同一なFab断片が1つの異なるFab断片と連結したものからなる三価の二重特異性結合タンパク質を生じ得る；（viii）例えば、2つのscFvがヒトFabアームの両端と融合したものを含む、いわゆるScorpion分子；ならびに（ix）ダイアボディ、が含まれる。
一態様において、本発明の二重特異性抗体は、ダイアボディ、クロスボディ（cross-body）、または本発明に記載されたもののような制御下でのFabアーム交換（例えば、WO 11/131746に記載）を介して得られる二重特異性抗体である。
様々なクラスの二重特異性抗体の例には、以下のものが非限定的に含まれる：(i)ヘテロ二量体化を強制的に行わせる相補的CH3ドメインを有するIgG様分子；(ii)分子の両側がそれぞれ、少なくとも2種類の異なる抗体のFab断片またはFab断片の一部を含む、組換えIgG様二重標的指向性分子；(iii)全長IgG抗体が追加のFab断片またはFab断片の一部と融合されたIgG融合分子；(iv)単鎖Fv分子または安定化されたダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Fc領域またはそれらの一部と融合された、Fc融合分子；(v)異なるFab断片が融合して1つになり、重鎖定常ドメイン、Fc領域またはそれらの一部と融合された、Fab融合分子；および(vi)異なる単鎖Fv分子または異なるダイアボディまたは異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに、または重鎖定常ドメイン、Fc領域もしくはそれらの一部と融合された別のタンパク質もしくは担体分子と融合された、ScFvおよびダイアボディを基にした抗体および重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）。
相補的CH3ドメイン分子を有するIgG様分子の例には、トリオマブ（Triomab）／クアドローマ（Quadroma）（Trion Pharma／Fresenius Biotech; Roche, WO2011069104）、ノブ・イントゥー・ホールズ（Knobs-into-Holes）（Genentech, WO9850431）、CrossMAb（Roche, WO2011117329）およびエレクトロスタティカリー・マッチド（electrostatically-matched）（Amgen, EP1870459およびWO2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304）、LUZ-Y（Genentech）、DIG-bodyおよびPIG-body (Pharmabcine)、ストランド交換操作ドメインボディ（Strand Exchange Engineered Domain body）（SEEDbody）（EMD Serono, WO2007110205）、Biclonics（Merus）、FcΔAdp（Regeneron, WO201015792）、二重特異性IgG1およびIgG2（Pfizer／Rinat, WO11143545）、Azymetric scaffold（Zymeworks/Merck, WO2012058768）、mAb-Fv（Xencor, WO2011028952）、二価二重特異性抗体（Roche）ならびにDuoBody（Genmab A/S, WO2011131746）が非限定的に含まれる。
組換えIgG様二重標的指向性分子の例には、二重標的指向性（DT）-Ig抗体（Dual Targeting (DT)-Ig）（GSK／Domantis）、ツー・イン・ワン（Two-in-one）抗体（Genentech）、架橋Mab（Cross-linked Mab）（Karmanos Cancer Center）、mAb2（F-Star, WO2008003116）、Zybodies（Zyngenia）、共通の軽鎖を用いるアプローチ（Crucell/Merus, US7,262,028）、κλBodies（NovImmune）およびCovX-body（CovX／Pfizer）が非限定的に含まれる。
IgG融合分子の例には、二重可変ドメイン(DVD)-Ig（Dual Variable Domain (DVD)-Ig）（Abbott, US7,612,181）、二重ドメイン双頭抗体（Dual domain double head antibody）（Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923）、IgG様二重特異性（ImClone／Eli Lilly）、Ts2Ab（MedImmune/AZ）およびBsAb（Zymogenetics）、HERCULES（Biogen Idec, US007951918）、scFv融合物（Novartis）、scFv融合物（Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246）ならびにTvAb（Roche, WO2012025525, WO2012025530）が非限定的に含まれる。
Fc融合分子の例には、ScFv/Fc Fusion（Academic Institution）、SCORPION（Emergent BioSolutions／Trubion、Zymogenetics／BMS）、Dual Affinity Retargeting Technology（Fc-DART）（MacroGenics, WO2008157379, WO2010/080538）およびDual(ScFv)2-Fab（National Research Center for Antibody Medicine-China）が非限定的に含まれる。
Fab融合二重特異性抗体の例には、F(ab)2（Medarex／AMGEN）、Dual-ActionまたはBis-Fab（Genentech）、Dock-and-Lock（DNL）（ImmunoMedics）、Bivalent Bispecific（Biotecnol）およびFab-Fv（UCB-Celltech）が非限定的に含まれる。
ScFvに基づく抗体、ダイアボディに基づく抗体およびドメイン抗体の例には、Bispecific T Cell Engager（BiTE）（Micromet、Tandem Diabody（Tandab）（Affimed）、Dual Affinity Retargeting Technology（DART）（MacroGenics）、Single-chain Diabody（Academic）、TCR-like Antibodies（AIT, ReceptorLogics）、Human Serum Albumin ScFv Fusion（Merrimack）およびCOMBODY（Epigen Biotech）、二重標的指向性ナノボディ（Ablynx）、二重標的指向性の重鎖のみのドメイン抗体（dual targeting heavy chain only domain antibody）が非限定的に含まれる。
本明細書に記載のアッセイ条件を満たす任意の単一特異性抗体が、二重特異性抗体の基礎を形成し得、即ち、結合領域のうちの1つがCD3に結合する二重特異性抗体は、機能アッセイにおいて試験され、本明細書に記載されるような要件を満たす、任意の単一特異性CD3抗体から生じ得ることが、さらに想定される。このような二重特異性抗体は、WO2011/131746に記載の方法によって提供され得、これは参照により本明細書に組み入れられる。
従って、特定の態様において、前記第1ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、F405、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが、置換されており、前記第2ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、F405、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが、置換されており、かつ前記第1および前記第2ポリペプチドの前記置換が同じ位置においてではない。この文脈において、用語「置換された」は、別の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸で置換されている特定のアミノ酸位置におけるアミノ酸を指す。従って、ヒトIgG1重鎖における位置に対応する位置における「置換された」アミノ酸は、特定の位置でのアミノ酸が、IgG1重鎖中の天然に存在するアミノ酸とは異なることを意味する。
一態様において、前記第1ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸は、K、LまたはMではなく、ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸は、Fであり、前記第2ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、F405、およびY407からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸は、置換されている。
一態様において、前記第1ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸は、K、LまたはMではなく、ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸は、Fであり、前記第2ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸は、Fではなく、ヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸は、Kである。
一態様において、前記第1ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸は、F、R、およびGではなく、ヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸は、Kであり、前記第2ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、Y407、およびK409からなる群より選択される位置に対応する位置におけるアミノ酸にうち少なくとも1つは、置換されている。
一態様において、前記第1ポリペプチドにおいて、ヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸は、K、LまたはMではなく、ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸は、Fであり、ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸は、Fではなく、ヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸は、Kである。
さらなる態様において、ヒトIgG1重鎖におけるF405に対応する位置におけるアミノ酸は、前記第1ポリペプチドにおいてLであり、ヒトIgG1重鎖におけるK409に対応する位置におけるアミノ酸は、前記第2ポリペプチドにおいてRであるか、またはその逆である。
一態様において、標的は、異なる細胞上に存在する。特定の態様において、第1結合領域は、T細胞上に存在するCD3に結合し、第2結合領域は、癌細胞上に存在する腫瘍特異的標的に結合する。それによって、二重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体は、2つの異なる細胞タイプに結合する。両方の細胞タイプが噛み合わせられる（engage）と、T細胞、特に細胞傷害性T細胞（CD8+ T細胞）の活性化が、T細胞と癌／腫瘍細胞との特異的相互作用によって誘発される。従って、本発明に従うタンパク質は、T細胞の活性化および癌細胞の死滅の魅力的な方法を提供する。
従って、特定の態様において、タンパク質は二重特異性抗体であり、前記第1および第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖におけるL234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸は、それぞれ、F、E、およびAであり、前記第1結合領域はCD3に結合し、前記第2結合領域は癌特異的標的に結合する。
一態様において、本明細書に記載の任意の局面または態様に従うタンパク質は、抗体である。一態様において、タンパク質は二重特異性抗体である。一態様において、抗体は全長抗体またはヒト抗体である。一態様において、抗体はヒトIgG1抗体である。
さらに、本明細書に記載される任意の局面または態様に従う野生型タンパク質はまた、親タンパク質であり得ることが想定される。従って、本発明はまた、そのような親タンパク質の変異体に関する。従って、本発明に従う任意のタンパク質はまた、親タンパク質を修飾することによって得られる、親タンパク質の変異体と見なされ得ることが、想定される。
本発明に従うタンパク質は、ヒトIgG1重鎖におけるL234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸置換を、野生型タンパク質の第1および／または第2ポリペプチド中へ導入する工程を含む方法によって作製できる。
本発明に従う変異体は、ヒトIgG1重鎖におけるL234、L235、およびD265に対応する位置におけるアミノ酸置換を、親タンパク質の第1および／または第2ポリペプチド中へ導入する工程を含む方法によって作製できる。
抗体を作製する方法は当業者に周知である。しかし、本発明に従う抗体を作製する非限定的な例は、非ヒト動物、例えばマウスを免疫処置する工程、非ヒト動物から抗体を得る工程、組換え技術によって本発明に従ってFc領域にアミノ酸変異を導入する工程、組換え技術によって得られた核酸を好適な発現システムにおいて発現させる工程、および発現された抗体を精製する工程を含む方法によるものであり得る。
本明細書に記載されるように、本発明は、一態様において、免疫グロブリンの2つの重鎖の少なくとも1つにおいて、ヒトIGG1重鎖における位置L234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、それぞれ、L、L、およびDではない、抗体に関する。従って、本発明のタンパク質は、抗体の前記位置に変異を導入することによって作製できる。前記変異が導入される抗体は、「親抗体」と見なされ得る。修飾前の本発明の出発物質として用いられる、野生型抗体であり得る、「親」抗体は、例えば、Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えDNA法によって作製されてもよい。また、モノクローナル抗体を、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991)に記載された手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体は任意の適した供給源から得ることができる。したがって、例えば、モノクローナル抗体を、関心対象の抗原による免疫処置を受けたマウスから得られたマウス脾臓B細胞から作製されたハイブリドーマから、例えば、表面上に抗原を発現する細胞の形態で、または関心対象の抗原をコードする核酸の形態で得ることができる。また、モノクローナル抗体を、免疫処置を受けたヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、イヌ、霊長動物など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得ることもできる。
親抗体は、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。別の態様において、抗体はヒト抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウス、例えば、HuMAbマウスを用いて作製できる。HuMAbマウスは、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座位を、内因性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的化変異とともに含む（Lonberg, N. et al., Nature 368, 856 859 (1994)）。そのため、このマウスはマウスIgMまたはκの発現の低下を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子が免疫処置に応答してクラススイッチおよび体細胞変異を受け、高親和性ヒトIgG,κモノクローナル抗体を生じる（Lonberg, N. et al. (1994)、前記；Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994)、Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995)ならびにHarding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995)に総説）。HuMAbマウスの作製は、Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992)、Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993)、Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994)、Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994)、Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845 851 (1996)に詳細に記載されている。また、US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918およびWO 01/09187も参照されたい。これらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を用いて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを周知の手法に従って作製できる。
さらに、本発明のヒト抗体、または他の種由来の本発明の抗体を、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、酵母ディスプレイおよび当技術分野において公知の他の手法を非限定的に含むディスプレイ型の技術によって同定して、その結果得られた分子を、当技術分野において周知である手法のような、さらなる成熟、例えば親和性成熟などに供することもできる。
親抗体は、天然型の、例えばヒトFcドメインを有する抗体には限定されず、それが本発明のもの以外の他の変異、例えば、グリコシル化に影響を及ぼす変異、または抗体が二重特異性抗体であることを可能にする変異などを有する抗体であってもよい。「天然型の抗体」という用語は、遺伝的に導入されたいかなる変異も含まない、あらゆる抗体を意味する。天然に存在する修飾を含む抗体、例えば種々のアロタイプは、それ故、本発明の趣旨においては「天然型の抗体」と解釈されるべきであり、それによって、親抗体と理解され得る。そのような抗体は、本発明に従う1つまたは複数の変異についてのテンプレートとして役立てることができ、それによって、本発明の変異抗体を得ることができる。本発明のもの以外の他の変異を含む親抗体の一例は、WO2011/131746（Genmab）に記載されたような二重特異性抗体、または本明細書に記載の任意の二重特異性抗体に関連する他の変異である。
親抗体は任意の標的に結合し得る。
本発明に用いるためのモノクローナル抗体は、例えば、Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えDNA法によって作製されてもよい。また、モノクローナル抗体を、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)に記載された手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体は任意の適した供給源から得ることができる。したがって、例えば、モノクローナル抗体を、関心対象の抗原による免疫処置を受けたマウスから得られたマウス脾臓B細胞から調製されたハイブリドーマから、例えば、表面上に抗原を発現する細胞の形態で、または関心対象の抗原をコードする核酸の形態で得ることができる。また、モノクローナル抗体を、免疫処置を受けたヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばラット、イヌ、霊長動物など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得ることもできる。
一態様において、抗体はヒト抗体である。任意の抗原を対象とするヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを用いて作製できる。そのようなトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスには、それぞれ、本明細書においてHuMAb（登録商標）マウスおよびKMマウスと称されるマウスが含まれ、それらは本明細書において「トランスジェニックマウス」と総称される。
HuMAb（登録商標）マウスは、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座位を、内因性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的化変異とともに含む（Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)）。そのため、このマウスはマウスIgMまたはκの発現の低下を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は免疫処置に応答してクラススイッチおよび体細胞変異を受け、高親和性ヒトIgG,κモノクローナル抗体を生じる（Lonberg, N. et al. (1994)、前記；Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994)、Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995)およびHarding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)に総説）。HuMAb（登録商標）マウスの作製は、Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992)、Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993)、Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994)、Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994)、Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に詳細に記載されている。また、US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918およびWO 01/09187も参照されたい。
HCo7、HCo12、HCo17およびHCo20マウスは、それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるJKD破壊（Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)に記載されたように）、それらの内因性重鎖遺伝子におけるCMD破壊（WO 01/14424号の実施例1に記載されたように）、およびKCo5ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に記載されたように）を有する。さらに、Hco7マウスはHCo7ヒト重鎖導入遺伝子を有し（US 5,770,429号に記載されたように）、HCo12マウスはHCo12ヒト重鎖導入遺伝子を有し（WO 01/14424号の実施例2に記載されたように）、HCo17マウスはHCo17ヒト重鎖導入遺伝子を有し（WO 01/09187号の実施例2に記載されたように）、HCo20マウスはHCo20ヒト重鎖導入遺伝子を有する。その結果生じたマウスは、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖座位がホモ接合性に破壊されたバックグラウンドにおいて、ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖導入遺伝子を発現する。
KMマウス系統では、Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)に記載されたように内因性マウスκ軽鎖遺伝子がホモ接合性に破壊されており、WO 01/09187号の実施例1に記載されたように内因性マウス重鎖遺伝子がホモ接合性に破壊されている。このマウス系統は、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に記載されたように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子KCo5を有する。このマウス系統はまた、WO 02/43478号に記載されたように、染色体14断片hCF（SC20）で構成されるヒト重鎖トランスクロモソームも有する。HCo12-Balb/Cマウスは、WO/2009/097006号に記載されたように、HCo12をKCo5[J/K](Balb)と交雑させることによって作製できる。
これらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を用いて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを周知の手法に従って作製できる。
さらに、任意の抗原結合領域を、当技術分野において周知の手法を用いる、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイおよび他の手法を非限定的に含むディスプレイ型の技術によって同定されたヒト抗体または他の種由来の抗体から得ることもでき、その結果得られた分子を、当技術分野において周知である手法のような、さらなる成熟、例えば親和性成熟などに供することもできる（例えば、Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991)（ファージディスプレイ）、Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996)（ファージディスプレイ）、Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997)（リボソームディスプレイ）、Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988)（ファージディスプレイ）、Scott TIBS 17, 241-245 (1992)、Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990)、Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993)、Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992)、およびUS 5,733,743を参照のこと）。ディスプレイ技術を用いてヒト性ではない抗体を作製する場合には、そのような抗体をヒト化することもできる。
本発明に従うタンパク質および変異体の発現のためのシステムは、当業者について当技術分野において周知であり、本明細書に記載されるものを含むがこれらに限定されない。
一局面において、本発明は、本明細書に記載の任意の局面および態様に従うタンパク質または変異体を含む組成物を提供する。
核酸および発現構築物
さらなる局面において、本発明は、ヒトIgG1重鎖におけるL234、L235およびD265に対応する位置におけるアミノ酸が、L、L、およびDではない、本発明に従う第1または第2ポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明に従う第1または第2ポリペプチドをコードする核酸が、本明細書に記載の特定のアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含むことが、さらに想定される。従って、一態様において、核酸は、SEQ ID NO：20に従う配列を有する第1または第2ポリペプチドをコードする。SEQ ID NO：20で示されるアミノ酸配列において、特定の3つのアミノ酸置換L234F、L235EおよびD265Aはボールドの下線付き文字によって示されている。
別の局面において、本発明は、本発明における使用のためのヒトCD3抗体、ヒト化CD3抗体またはキメラCD3抗体の配列をコードする核酸、そのような抗体の配列をコードする発現ベクター、そのような発現ベクターを含む宿主細胞、そのような抗体を産生するハイブリドーマ、および適切な条件下でそのような宿主細胞またはハイブリドーマを培養し、それによって抗体を産生させ、任意で回収することによる、そのような抗体を産生する方法に関する。ヒト化CD3抗体はまた「huCD3」とも示され得る。
一態様において、本発明は、SEQ ID NO：21または28に従うアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
一態様において、本発明は、SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、および12、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。別の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO：3および15より選択されるVH CDR3アミノ酸配列のうちのいずれか1つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO：6、7、8、および9より選択されるVHアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO：10、11、および12より選択されるVLアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、発現ベクターは、ヒト抗体軽鎖の定常領域、ヒト抗体重鎖の定常領域、または両方をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO：13のヒト抗体重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の態様において、発現ベクターは、上記のアミノ酸配列のうちの1つまたは複数の変異体をコードするヌクレオチド配列を含み、前記変異体は、多くとも25個のアミノ酸修飾、例えば、多くとも20個、例えば、多くとも15、14、13、12、または11個のアミノ酸修飾、例えば、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のアミノ酸修飾、例えば、欠失もしくは挿入、好ましくは置換、例えば、保存的置換、または、前記配列のいずれかに対して少なくとも80%の同一性、例えば、上述のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも85%の同一性または90%の同一性または95%の同一性、例えば、96%の同一性または97%の同一性または98%の同一性または99%の同一性を有する。
本発明の文脈中の発現ベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（適当な発現制御エレメントのセットを含む核酸配列）を含む任意の適当なベクターであり得る。そのようなベクターの例には、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組み合わせから得られるベクター、ならびにウイルス核酸（RNAまたはDNA）ベクターが含まれる。一態様において、ヒト化CD3抗体をコードする核酸は、例えば、（例えば、Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)に記載されるような）線状発現エレメント、（例えば、US 6,077,835および／もしくはWO 00/70087に記載されるような）コンパクト核酸ベクター、プラスミドベクター、例えばpBR322、pUC 19/18もしくはpUC 118/119、（例えば、Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)に記載されるような）「ミッジ（midge）」ミニマルサイズ核酸ベクター、または（例えば、WO 00/46147、Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986)、Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)、およびCoraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)に記載されるような）沈降核酸ベクター構築物、例えばCaPO4 -沈降構築物を含む、ネイキッドDNAまたはRNAベクター中に含まれる。そのような核酸ベクターおよびそれらの使用法は当技術分野で周知である（例えば、US 5,589,466およびUS 5,973,972を参照のこと）。
一態様において、ベクターは、細菌細胞中でのヒト化CD3抗体、第1および第2ポリペプチドの発現に適している。このようなベクターの例としては、BlueScript (Stratagene)、pINベクター(Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989))、pETベクター(Novagen, Madison WI)などの発現ベクターが挙げられる。
同様にまたは代わりに、発現ベクターは、酵母システム中での発現に適したベクターであり得る。酵母システム中での発現に適した任意のベクターが利用され得る。適当なベクターには、例えば、構成性または誘導性プロモーター、例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHを含むベクターが含まれる（F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)、およびGrant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)において総説されている）。
核酸および／またはベクターはまた、ポリペプチド、例えば新生ポリペプチド鎖を細胞膜周辺腔または細胞培養培地へと標的化できる分泌／局在化配列をコードする核酸配列を含み得る。そのような配列は当技術分野で公知であり、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、オルガネラ標的配列（例えば、核局在化配列、ER保留シグナル、ミトコンドリア移行配列、葉緑体移行配列）、膜局在化／アンカー配列（例えば、輸送停止配列、GPIアンカー配列）等が含まれる。
本発明の発現ベクターにおいて、CD3抗体をコードする核酸ならびに第1および第2ポリペプチド核酸は、任意の適当なプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現促進エレメントを含み得るまたはそれらを伴い得る。そのようなエレメントの例には、強発現プロモーター（例えば、ヒトCMV IEプロモーター／エンハンサーならびにRSV、SV40、SL3-3、MMTV、およびHIV LTRプロモーター）、有効なポリ(A)終止配列、大腸菌（E. coli）内でのプラスミドプロダクトのための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が含まれる。核酸はまた、CMV IE等の構成性プロモーターとは逆の誘導性プロモーターを含み得る（当業者はそのような用語が特定条件下での遺伝子発現の程度を実際に表すものであることを理解しているであろう）。
一態様において、CD3抗体をコードする発現ベクターならびに第1および第2ポリペプチド発現ベクターは、ウイルスベクターを介して宿主細胞または宿主動物内に配置されるおよび／または送達される。
そのような発現ベクターは、CD3抗体ならびに第1および第2ポリペプチドの組換え産生に使用され得る。
一局面において、本明細書に記載される任意の局面または態様のCD3抗体ならびに第1および第2ポリペプチドは、抗体を産生する組換え真核生物宿主細胞または組換え原核生物宿主細胞の使用によって提供される。従って、本発明は、本明細書で定義されるCD3抗体、第1および第2ポリペプチド、または免疫グロブリンを産生する組換え真核生物宿主細胞または組換え原核生物宿主細胞、例えばトランスフェクトーマを提供する。宿主細胞の例には、酵母、細菌および哺乳動物細胞、例えば、CHOまたはHEK-293細胞が含まれる。例えば、一態様において、宿主細胞は、本明細書に記載のCD3抗体の発現をコードする配列を含む、細胞のゲノムに安定的に組み込まれた核酸を含む。一態様において、宿主細胞は、本明細書に記載の第1または第2ポリペプチドの発現をコードする配列を含む、細胞のゲノムに安定的に組み込まれた核酸を含む。別の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載のCD3抗体、第1または第2ポリペプチドの発現をコードする配列を含む、非組み込み型の核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線状発現エレメントを含む。
「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で用いる場合、発現ベクターが導入された細胞を指すことを意図している。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを意図していることが理解されるべきである。突然変異または環境的影響のいずれかに起因してある種の修飾が後続世代で起こり得るため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるものの、それでもなお、本明細書で用いる「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。組換え宿主細胞には、例えば、トランスフェクトーマ、例えば、CHO細胞、HEK-293細胞、PER.C6、NS0細胞およびリンパ球細胞、ならびに原核細胞、例えば、大腸菌、ならびに植物細胞および真菌といった他の真核生物宿主が含まれる。
「トランスフェクトーマ」という用語は、本明細書で用いる場合、抗体または標的抗原を発現する組換え真核生物宿主細胞、例えば、CHO細胞、PER.C6、NS0細胞、HEK-293細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌を含む。
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体の製造方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
a)本明細書上記に記載の本発明のハイブリドーマまたは宿主細胞を培養する工程、および
b)培養培地から本発明の抗体を回収および／または精製する工程。
さらなる局面において、抗体の配列をコードするヌクレオチド配列は、第2部分、例えば治療用ポリペプチドを、さらにコードする。例示的な治療用ポリペプチドは本明細書の他箇所に記載される。一態様において、本発明は、抗体融合タンパク質の製造方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
a)そのようなヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程、および
b)培養培地から抗体融合タンパク質を回収および／または精製する工程。
薬学的組成物
一局面において、本発明は、本明細書に記載の局面および態様のいずれかに規定されるような、抗体などの、タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。
薬学的組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されたものなどの従来の手法に従って、薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに他の任意の公知の補助剤および添加剤とともに製剤化できる。
薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに他の任意の公知の補助剤および添加剤は、本発明のタンパク質、変異体または抗体および選択される投与様式に適しているべきである。薬学的組成物の担体および他の成分に関する適性は、抗原結合時に、本発明の選択される化合物または薬学的組成物の所望の生物学的特性に及ぼす重大な負の影響がないこと（例えば、実質的な影響に満たない（相対的阻害が10％またはそれ未満、相対的阻害が5％またはそれ未満など））に基づいて判定される。
また、本発明の薬学的組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤、例えばTween-20またはTween-80など）、安定化剤（例えば、糖、またはタンパク質非含有アミノ酸）、保存料、組織固定剤、溶解補助剤、および／または薬学的組成物に含めるのに適した他の材料を含んでもよい。
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物および投与様式で望ましい治療応答を達成するのに有効であり、その患者に毒性を示さない活性成分の量となるよう、変更され得る。選択される投薬量レベルは、使用される本発明の特定の組成物もしくはそのアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の継続期間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられるその他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、総合的な健康状態および病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含む、様々な薬物動態要因に依存する。
薬学的組成物は、任意の適当な経路および様式によって投与され得る。本発明のタンパク質、変異体または抗体をインビボおよびインビトロで投与するのに適した経路は当技術分野で周知であり、これは当業者によって選択され得るものである。
一態様において、本発明の薬学的組成物は非経口投与される。
句「非経口投与」および「非経口投与される」は、本明細書で用いる場合、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によるものであり、これには上皮、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれる。
一態様において、薬学的組成物は、静脈内または皮下注射または注入によって投与される。
薬学的に許容される担体には、本発明のタンパク質、変異体または抗体と生理的に適合性のある、任意のおよびすべての適した溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤、酸化防止剤および吸収遅延剤などが含まれる。
本発明の薬学的組成物中に使用し得る適した水性および非水性担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適した混合物、植物油、例えばオリーブ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、およびゴマ油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントゴムおよび注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチル、ならびに／または様々な緩衝液が含まれる。他の担体も薬学の技術分野では周知である。
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散系、滅菌注射用溶液または分散系の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学活性のある物質のためのそのような媒質および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。従来の任意の媒質または作用物質が活性化合物と不適合性でない限り、本発明の薬学的組成物におけるそれらの使用を想定している。「活性化合物」を指す場合、本発明に従うタンパク質、抗体、親タンパク質または親抗体の変異体も指すことを想定している。
適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散系の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持できる。
本発明の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される酸化防止剤、例えば、（1）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（2）油溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなど；および（3）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸なども含み得る。
本発明の薬学的組成物はまた、組成物中に、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、グリセロールなど、または塩化ナトリウムといった等張剤も含み得る。
本発明の薬学的組成物はまた、薬学的組成物の貯蔵寿命または有効性を増強し得る、選択される投与経路にとって適切な1つまたは複数の補助剤、例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存料または緩衝剤も含有し得る。本発明のタンパク質、変異体および抗体を、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を急速放出から保護すると考えられる担体を用いて調製してもよい。そのような担体には、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリル、生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの単独のもの、またはワックスもしくは当技術分野において周知の他の材料を伴ったものが含まれ得る。そのような製剤の調製のための方法は、当業者に一般に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
一態様において、本発明のタンパク質、抗体、または親タンパク質もしくは親抗体の変異体は、インビボでの適正な分布が確実に得られるように製剤化できる。非経口的投与のための薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散系、および滅菌注射用溶液または分散系の即時調製ための滅菌粉末が含まれる。薬学活性のある物質のためのそのような媒質および作用物質の使用は、当技術分野において公知である。従来の任意の媒質または作用物質が活性化合物と不適合性でない限り、本発明の薬学的組成物におけるそれらの使用を想定している。他の活性化合物または治療用化合物を組成物中に組み入れることもできる。
注射用の薬学的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の秩序立った構造として製剤化できる。担体が、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適した混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含有する水性溶媒または非水性溶媒または分散媒であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散系の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持できる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の長期的な吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって成し遂げられ得る。滅菌注射用溶液は、例えば上記に列挙したような成分の1つまたは組み合わせとともに、必要な量の活性化合物を適切な溶媒中に組み入れ、必要に応じて、その後に滅菌精密濾過を行うことによって調製できる。一般に、分散系は、基本的な分散媒、および例えば上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例には、有効成分に任意の別の所望の成分が加わったものの粉末が、あらかじめ滅菌濾過したそれらの溶液から得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）がある。
滅菌注射用溶液は、上記に列挙したような成分の1つまたは組み合わせとともに、必要な量の活性化合物を適切な溶媒中に組み入れ、必要に応じて、その後に滅菌精密濾過を行うことによって調製できる。一般に、分散系は、基本的な分散媒、および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例には、有効成分に任意の別の所望の成分が加わったものの粉末が、あらかじめ滅菌濾過したそれらの溶液から得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）がある。
治療適用
別の局面において、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載の任意の局面または態様に規定されるような本発明のタンパク質、例えば抗体、または薬学的組成物に関する。
別の局面において、本発明は、疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の任意の局面または態様に規定されるような本発明のタンパク質、変異体、抗体、または薬学的組成物に関する。
本発明のタンパク質、変異体、抗体、または薬学的組成物は、細胞傷害性T細胞のエフェクター機構が望まれる治療において使用され得る。例えば、タンパク質、変異体、または抗体は、癌、炎症性疾患または自己免疫疾患などの障害を治療または予防するために、培養細胞に、例えばインビトロもしくはエクスビボで、またはヒト対象に、例えばインビボで投与され得る。本明細書で用いる場合、用語「対象」は、典型的に、タンパク質、変異体、抗体、または薬学的組成物に応答するヒトである。対象には、例えば、標的機能を調節することによってまたは細胞を死滅させることによって、直接的または間接的に是正または改善され得る障害を有するヒト患者が含まれる。
別の局面において、本発明は、T細胞の動員が治療または予防に寄与する、癌などの、障害の治療または予防のための方法を提供し、この方法は、その必要がある対象への治療有効量の本発明のタンパク質、変異体、抗体、または薬学的組成物の投与を含む。方法は、典型的に、障害を治療または予防するために有効な量のタンパク質、変異体、または抗体を対象へ投与することを含む。
ある特定の局面において、本発明は、本明細書に記載の任意の局面および態様に規定される本発明のタンパク質、変異体、抗体、または薬学的組成物を投与する工程を含む、癌の治療方法に関する。
別の局面において、本発明は、疾患が癌、炎症性疾患または自己免疫疾患である、本明細書に記載の任意の局面および態様に規定される本発明の使用または方法に関する。
腫瘍特異的標的を過剰発現する細胞は、本発明のタンパク質、変異体または抗体についての特に良好な標的であり、何故ならば、タンパク質、変異体、または抗体の2つの結合領域のうちの1つによるT細胞の動員が、T細胞の細胞傷害活性を誘発するためである。この機構は、通常、得ることが困難であり、何故ならば、細胞傷害活性の誘発は、癌細胞の除去において適切に作用しないためである。
タンパク質、変異体、または抗体の有効投薬量および投薬計画は、処置したい疾患または状態に依存し、これは当業者によって決定され得るものである。
当技術分野の通常の技能を有する医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師は、薬学的組成物において用いられるタンパク質、変異体、または抗体の用量を望ましい治療効果の達成に必要とされるよりも低いレベルから開始し、そしてこの用量を望ましい効果が達成されるまで徐々に増やしていくことができる。一般に、本発明の組成物の適当な用量は、特定の投薬計画に従い治療効果を生じるのに効果的な最小限の用量であるタンパク質、変異体、または抗体の量である。そのような有効用量は、一般に、上記の要因に依存する。
例えば、治療用途における「有効量」は、疾患の進行を安定させる能力によって測定され得る。癌を阻害する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における効果を予測する動物モデルシステムにおいて評価され得る。あるいは、組成物のこの特性は、当業者に公知のインビトロアッセイによって、細胞成長を阻害するまたは細胞傷害性を誘導するタンパク質、変異体、または抗体の能力を試験することにより評価され得る。治療有効量の治療用化合物、即ち、本発明に従う治療用のタンパク質、変異体、抗体、または薬学的組成物は、腫瘍サイズを減少させるかまたはそうでなければ対象の症状を改善し得る。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重篤度、および選択された特定の組成物または投与経路等の要因に基づきそのような量を決定することができる。
本発明のタンパク質、変異体または抗体の治療有効量についての例示的で非限定的な範囲は、約0.001〜10 mg/kg、例えば、約0.001〜5 mg/kg、例えば約0.001〜2 mg/kg、例えば約0.001〜1 mg/kg、例えば約0.001、約0.01、約0.1、約1または約10 mg/kgである。
投与は、例えば、静脈内、筋内、腹腔内または皮下であり得、例えば、標的部位の近傍に投与され得る。
上記の治療方法および使用における投薬計画は、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）を提供するよう調節される。例えば、単回ボーラスが投与されることもあり、いくつかに分割された用量が時間をかけて投与されることもあり、またはその用量が、治療状況の緊急度によって示されるように、比例して減少または増加されることもある。
一態様において、治療の間、例えば既定の時点で、治療の効果がモニターされる。
望ましい場合、薬学的組成物の有効一日用量は、その日の中で適当な間隔で、任意で単位投薬形態で、別々に投与される2、3、4、5、6つまたはそれ以上の小用量として投与され得る。別の態様において、タンパク質、変異体、抗体、または薬学的組成物は、任意の望ましくない副作用を最小限に抑えるために、長期間、例えば24時間超にわたる緩やかな連続注入によって投与される。
本発明のタンパク質、変異体、または抗体は単独で投与することが可能であるが、このタンパク質、変異体、または抗体を上記のような薬学的組成物として投与することが好ましい。
有効用量の本発明のタンパク質、変異体、または抗体はまた、1週間、2週間または3週間の投薬期間を用いて投与され得る。この投薬期間は、例えば8週間、12週間または臨床的進展がみられるまで、に制限され得る。
一態様において、タンパク質、抗体または変異体は、mg/m2によって算出される一1週間投薬量で注入によって投与され得る。例えば、そのような投薬量は、例えば、以下に従って上記に提供されたmg/kg投薬量に基づき得る：用量(mg/kg) x 70 : 1.8。そのような投与は、例えば、1〜8回、例えば3〜5回反復され得る。投与は、2〜24時間、例えば2〜12時間の期間にわたる連続注入によって実施され得る。一態様において、タンパク質、抗体または変異体は、毒性副作用を減らすために、長期間、例えば24時間超にわたる緩やかな連続注入によって投与され得る。
一態様において、タンパク質、抗体または変異体は、週1回与えられる場合、8回まで、例えば4〜6回についての固定用量として算出される一週間投薬量で投与され得る。そのような計画は、必要に応じて、例えば6ヶ月または12ヶ月後に、1回または複数回反復され得る。そのような固定投薬量は、例えば、体重を70 kgと推定して、上記に提供されたmg/kg投薬量に基づき得る。投薬量は、例えば生物学的サンプルを採取し、本発明のタンパク質、抗体または変異体の結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することによって、投与後の血中の本発明のタンパク質、抗体または変異体の量を測定することにより決定または調節され得る。
一態様において、タンパク質、抗体または変異体は、維持療法として、例えば週1回ずつ6ヶ月またはそれ以上の期間、投与され得る。
タンパク質、抗体または変異体はまた、癌の発症のリスクを減らすために、癌進行上の事象の発生を遅らせるために、および／または癌が寛解状態にある場合に再発のリスクを減らすために、予防的に投与され得る。
非経口組成物は、投与を容易にし投薬量を均一にするために単位投薬形態として処方され得る。単位投薬形態は、本明細書で使用される場合、治療される対象についての単位投薬として適した物理的に分かれている単位を指し；各単位は、望ましい治療効果を生ずるよう算出された既定量の活性化合物を、必要とされる薬学的担体と共に含む。本発明の単位投薬形態の詳細は、（a）活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに（b）個体における過敏症への対処のためのそのような活性化合物の配合という当技術分野に特有の制約、によって決定されかつそれに直接的に依存する。
タンパク質、変異体、抗体、または抗体はまた、癌の発症のリスクを減らすために、癌進行上の事象の発生を遅らせるために、および／または癌が寛解状態にある場合に再発のリスクを減らすために、予防的に投与され得る。これは、存在すると考えられる腫瘍の位置決めが他の生物学的要因のために困難な患者において特に有用であり得る。
診断適用
本発明の非活性タンパク質はまた、本明細書に記載されるタンパク質を含む組成物を用いて、診断目的で使用され得る。従って、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質を用いる診断方法および組成物を提供する。そのような方法および組成物は、純粋な診断目的で、例えば、疾患の検出または同定に、および治療的処置の進展のモニタリング、疾患の進行のモニタリング、処置後の状態の評価、疾患の再発のモニタリング、疾患の発症のリスクの評価等に使用することができる。
一局面において、本発明のタンパク質は、患者から採取されたサンプル中における標的のレベルまたは細胞表面に関心対象の標的を発現する細胞のレベルを検出することによって、エクスビボで、例えば、そこへタンパク質が結合し、関心対象の特異的標的を発現する細胞が疾患の指標となるまたはその病理に関与している疾患の診断に、使用される。これは、例えば、試験したいサンプルを、任意で対照サンプルと共に、本発明に従うタンパク質と、そのタンパク質が標的に結合できる条件下で接触させることによって達成され得る。その後、複合体の形成が（例えば、ELISAを用いて）検出され得る。試験サンプルと共に対照サンプルを用いる場合、タンパク質またはタンパク質-標的複合体のレベルは、両方のサンプルにおいて分析され、そして試験サンプル中におけるタンパク質またはタンパク質-標的複合体の統計的に有意に高いレベルが、対照サンプルと比較して試験サンプル中における標的のより高いレベルを示す。
本発明のタンパク質を使用することができる従来的な免疫アッセイの例には、ELISA、RIA、FACSアッセイ、プラズモン共鳴アッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、組織の免疫組織化学、ウェスタンブロットおよび／または免疫沈降が含まれるがこれらに限定されない。
一態様において、本発明は、サンプル中の標的または標的発現細胞の存在を検出するための方法であって、
− サンプルと本発明のタンパク質とを、タンパク質がサンプル中の標的に結合できる条件下で接触させる工程；および
− 複合体が形成されたかどうかを分析する工程
を含む方法に関する。典型的には、サンプルは、生物学的サンプルである。
一態様において、サンプルは、特異的標的および／または標的発現細胞を含むことが既知のまたはそれが疑われる組織サンプルである。例えば、標的発現のインサイチュー検出は、患者から組織学的試料を取り出し、そしてそのような試料に本発明の抗体を提供することによって達成され得る。タンパク質は、タンパク質を試料に適用することによってまたはタンパク質を試料に上乗せすることによって提供され得、その後に適当な手段を用いて検出される。その後、標的または標的発現細胞の存在だけでなく、（例えば、癌細胞の拡散の評価に関連して）試験された組織における標的または標的発現細胞の分布も決定することができる。本発明を用いる際、当業者は、任意の様々な組織学的方法（例えば、染色手順）がそのようなインサイチュー検出を達成するために修正され得ることを容易に理解するであろう。
上記のアッセイにおいて、タンパク質は、結合されたタンパク質を検出できるよう、検出可能な物質で標識され得る。あるいは、結合された（一次）特異的タンパク質は、検出可能な物質で標識され一次特異的タンパク質へ結合する、抗体によって検出され得る。
サンプル中の標的のレベルはまた、検出可能な物質で標識された標的標準および未標識の標的特異的タンパク質を用いる競合免疫アッセイによって概算することもできる。このタイプのアッセイにおいては、生物学的サンプル、標識された標的標準および標的特異的タンパク質が組み合わされ、そして未標識の標的特異的タンパク質に結合した標識標的標準の量が決定される。生物学的サンプル中の標的の量は、標的特異的タンパク質に結合した標識標的標準の量に反比例する。
インビトロ診断技術において使用される標的特異的タンパク質、二次抗体および／または標的標準に適した標識には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれるがこれらに限定されない。適当な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適当な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；適当な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドおよびフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例には、ルミノールが含まれ；そして適当な放射性物質の例には、125I、131I、35S、および3Hが含まれる。
一局面において、本発明の標的特異的タンパク質は、標的発現組織、例えば腫瘍のインビボ画像化において使用される。インビボ法では、それらの迅速に分布する動態から、抗体断片、例えば(Fab')2、FabおよびFab'断片が特に有利である。
インビボ画像化は、任意の適当な技術によって実施することができる。例えば、99Tc、131I、111Inまたはその他のガンマ線を放出する同位体で標識された標的特異的タンパク質（例えば、抗体または断片）は、典型的には低エネルギー高解像度コリメーターまたは低エネルギー多目的コリメーターを用いるガンマシンチレーションカメラ（例えば、Elscint Apex 409ECTデバイス）により標的発現組織、例えば腫瘍内の標的特異的タンパク質の蓄積または分布を画像化するために使用され得る。あるいは、89Zr、76Br、18Fまたはその他の陽電子を放出する放射性核種による標識が、陽電子放出断層撮影（PET）を用いて腫瘍内の標的特異的タンパク質、抗体、または抗体断片の分布を画像化するのに使用され得る。そのような技術を使用して得られる画像は、例えば、癌／腫瘍細胞の存在のバイオマーカーとして標的を使用する場合、患者、哺乳動物または組織における標的の生体内分布を評価するのに使用され得る。この技術のバリエーションには、ガンマカメラ技術よりも画像化を改善する磁気共鳴画像化（MRI）の使用が含まれ得る。従来的な免疫シンチグラフィーの方法および原理は、例えば、Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988)、Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990)およびBrown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.)(Chapman & Hall 1993)に記載されている。さらに、同様にまたは代わりに、そのような画像は、腫瘍を除去するための外科技術の基礎として機能し得る。さらに、そのようなインビボ画像化技術は、患者が（他のバイオマーカー、転移等の存在に基づき）腫瘍を有することが同定されたがその腫瘍が伝統的な分析技術では同定することができない状況で、腫瘍の同定および局在化を実現し得る。これらの方法はすべて、本発明の特徴である。
本発明によって提供されるインビボ画像化およびその他の診断方法は、ヒト患者（例えば、過去に癌と診断されていない患者または癌からの回復／寛解期にある患者）における微小転移の検出に特に有用である。
一態様において、本発明は、本発明の標的特異的タンパク質を、検出を促進する放射線不透過剤にコンジュゲートし、このコンジュゲートタンパク質を、例えば血流への注射によって宿主に投与し、そして宿主における標識タンパク質の存在および位置をアッセイする、インビボ画像化法を提供する。この技術および本明細書で提供される任意のその他の診断方法を通じて、本発明は、ヒト患者もしくはヒト患者から採取された生物学的サンプルにおいて疾患関連細胞の存在をスクリーニングする方法および／または標的特異的ADC療法の前に標的特異的タンパク質の分布を評価する方法を提供する。
診断画像化のために、放射性同位元素は、直接的または中間官能基を用いることによる間接的のいずれかで、標的特異的タンパク質に結合され得る。有用な中間官能基には、キレーター、例えばエチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸が含まれる（例えば、US 5,057,313を参照のこと）。
放射性同位元素および放射線不透過剤に加えて、診断方法は、色素（例えば、ビオチン-ストレプトアビジン複合体を用いて）、造影剤、蛍光化合物または分子および磁気共鳴画像化（MRI）用増強剤（例えば、常磁性イオン）にコンジュゲートされた標的特異的タンパク質を用いて実施され得る（例えば、MRI技術およびMRI増強剤にコンジュゲートされたタンパク質の作製について記載している米国特許第6,331,175号を参照のこと）。そのような診断／検出剤は、MRIで使用するための薬剤、および蛍光化合物から選択され得る。標的特異的タンパク質に放射性金属または常磁性イオンを担持させるために、それを、イオンの結合のために多数のキレート基が付加されている長い尾部を有する試薬と反応させることが必要であり得る。そのような尾部は、ポリマー、例えばポリリジン、多糖、またはそれ以外の、キレート基が結合され得るペンダント基、例えばポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシムおよびこの目的で有用であることが公知の同様の基を有する誘導体化されたもしくは誘導体化可能な鎖であり得る。キレートは、標準的な化学を用いて標的特異的タンパク質にカップリングされ得る。
従って、本発明は、標的特異的タンパク質が、造影剤（例えば、磁気共鳴画像化、コンピュータ断層撮影もしくは超音波コントラスト増強剤）または例えばガンマ、ベータ、アルファ、オージェ電子もしくは陽電子を放出する同位体であり得る放射性核種にコンジュゲートされている、診断用標的特異的タンパク質を提供する。
さらなる局面において、本発明は、サンプルにおける標的抗原または標的発現細胞の存在を検出するためのキットであって、
− 本発明の標的特異的抗体；および
− キットの使用説明書
を含むキットに関する。
一態様において、本発明は、標的特異的タンパク質と、標的特異的タンパク質の標的への結合を検出するための1つまたは複数の試薬とを含む容器を含む、癌診断用のキットを提供する。試薬には、例えば、蛍光タグ、酵素タグまたはその他の検出可能なタグが含まれ得る。試薬には、また、二次もしくは三次抗体、または可視化され得る生成物を生成する酵素反応のための試薬が含まれ得る。一態様において、本発明は、適当な容器に入れられた標識または未標識形態の1つまたは複数の本発明の標的特異的タンパク質、間接的アッセイにおけるインキュベーションのための試薬、およびその標識の性質に依存する、そのようなアッセイにおける検出のための基質または誘導体化剤を含む診断キットを提供する。対照試薬および使用説明書も含まれ得る。
診断キットはまた、組織サンプルまたは宿主における標的の存在の検出のために、標的特異的タンパク質、例えば標識された標的特異的タンパク質と共に使用する目的で供給され得る。そのような診断キットにおいておよび本明細書の他箇所に記載される治療用途のキットにおいて、標的特異的タンパク質は、典型的に、単独でまたは標的細胞もしくはペプチドに特異的な追加の抗体と合わせてのいずれかで、容器に入れられた凍結乾燥の形態で提供され得る。典型的には、薬学的に許容される担体（例えば、不活性希釈剤）および／またはその成分、例えば、Tris、リン酸または炭酸緩衝液、安定化剤、保存剤、殺生物剤、不活性タンパク質、例えば血清アルブミン等もまた含まれ（典型的には、混合するための別個の容器に入れられて）、そして追加の試薬も含まれる（また、典型的には、別個の容器に入れられて）。特定のキットにおいては、典型的には別個の容器内に存在する、標的特異的タンパク質に結合することができる二次抗体も含まれる。二次抗体は、典型的には、標識にコンジュゲートされ、そして本発明の標的特異的タンパク質と同様の様式で処方される。上記および本明細書の他箇所に記載の方法を用いる場合、標的特異的タンパク質は、癌／腫瘍細胞のサブセットを定義し、そのような細胞および関連腫瘍組織を特徴づけるのに使用され得る。
配列
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実施例1−非活性抗体の作製
非活性変異
Fc領域中に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するいくつかの抗体変異体を作製した。非活性Fc領域は、単球などの血液細胞上に存在するFc受容体と、または古典的補体経路を活性化するためにC1qと、抗体が相互作用することを防ぐ。Fc活性の低下を、Fc領域中のアミノ酸置換の異なる組み合わせを含有する抗体変異体において試験した。変異N297Q、L234A、L235A、L234F、L235E、D265A、およびP331Sを含む、最大で5つのアミノ酸置換を導入した。これらの5つのアミノ酸位置のうちの1つまたは複数における置換をK409RおよびF405L IgG1骨格に導入した。以下のFcドメイン変異体を作製した：NQ（N297Q置換を指す）、LFLE（L234F/L235E置換を指す）、LALA（L234A/L235A置換を指す）、LFLENQ（L234F/L235E/N297Q置換を指す）、LFLEDA（L234F/L235E/D265A置換を指す）、DA（D265A置換を指す）、DAPS（D265A/P331S置換を指す）、DANQ（D265A/N297Q置換を指す）、LFLEPS（L234F/L235E/P331S置換を指す）、およびLFLEDANQPS（L234F/L235E/D265A/N297Q/P331S置換を指す）。
CD3抗体
様々なCD3抗体を単一特異性および二重特異性フォーマットで使用した。
いくつかの実施例において、マウス抗体CLB-T3/4のヒト化型である、huCLB-T3/4の重鎖および軽鎖可変領域配列（それぞれ、SEQ ID NO：16および17）を用いた。両方の配列を、関連する発現ベクター中へクローニングし、HEK293F細胞中の同時トランスフェクションによって発現させた。
いくつかの実施例において、US 8,236,308に記載されるようなマウスCD3抗体のヒト化変異体（SEQ ID NO：8に従うVHおよびSEQ ID NO：10に従うVL）（「huCD3」と記載）を用いた。このCD3抗体のヒト化を、EP 0 629 240に記載されるように、生殖細胞系ヒト化（CDRグラフティング）技術の改良版を用いて、Antitope (Cambridge, UK)によって行った。この技術を用いて、4つの異なるVH鎖（SEQ ID NO：6、7、8、および9）ならびに3つの異なるVL鎖（SEQ ID NO：10、11、および12）を設計した。
HER2抗体
実施例のいくつかにおいて、HER2に対する抗体を用いた。このHER2-特異的抗体についてのVHおよびVL配列（VH HER2 169およびVL Her2 160、それぞれ、SEQ ID NO：18および19）は、WO2012143524 [Genmab]；およびLabrijn et al., PNAS 2013, 110 : 5145-50に記載されている。
b12抗体
実施例のいくつかにおいて、抗体b12、gp120特異的抗体（Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23.）を陰性対照として使用した。
発現
抗体を、以下のように、上述の非活性変異有りまたは無しで、さらにそれらのFc領域において修飾して、IgG1,κまたはIgG1,λとして発現させた：IgG1-HER2-K409R、IgG1-b12-K409R、IgG1-CD3-F405L。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、293fectin（Invitrogen, US）を本質的には製造元による記載の通りに用いて、Freestyle HEK293F細胞（Invitrogen, US）に一過性にトランスフェクトした。
抗体の精製
培養上清を0.2μmデッドエンドフィルターに通して濾過し、5mL MabSelect SuReカラム（GE Health Care）にロードして、0.1Mクエン酸ナトリウム-NaOH, pH 3によって溶出させた。溶出液を2M Tris-HCl, pH 9によって直ちに中和し、12.6 mM NaH2PO4、140 mM NaCl, pH 7.4（B. Braun）に対して一晩透析した。あるいは、精製後に、溶出液をHiPrep Desaltingカラムにロードして、抗体を12.6 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、pH 7.4 (B.Braun)緩衝液中へ交換した。透析または緩衝液の交換後に、サンプルを0.20μmデッドエンドフィルターに通して滅菌濾過した。純度をSDS-PAGEによって決定し、濃度を280 nmでの吸光度によって測定した。精製抗体を4℃で保存した。
二重特異性抗体の作製
二重特異性抗体は、DuoBody（登録商標）技術プラットフォームにより、即ち、WO 2011/147986号およびLabrijn et al. (Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50; Gramer et al., MAbs 2013, 5 : 962-973)に記載されたような2-MEA誘導性Fabアーム交換により、インビトロで作製した。この方法の基礎となっているのは、特定のアッセイ条件下でヘテロ二量体の形成を促進する補完的なCH3領域の使用である。この方法による二重特異性抗体の生成が可能になるように、CH3領域にある種の変異を保有するIgG1分子を作製した：親IgG1抗体の一方にはF405L変異があり、もう一方の親IgG1抗体にはK409R変異がある。二重特異性抗体を作製するために、これらの2つの親抗体を、各抗体が最終濃度0.5mg／mLとなるように、総体積500μLのTE中にて、25または75 mM 2-メルカプトエチルアミン-HCl（2-MEA）とともに、31℃で5時間インキュベートした。この還元反応は、25 mL PBSで平衡化された、PD-10カラム(GE-healthcare, 製品番号17-0851-01)を用いることによって還元剤2-MEAが除去されると停止した。脱塩前に、2 mL PBS (B.Braun, 製品番号3623140)をサンプルへ添加し、体積を2.5 mLへ調節した。溶出を3.5 mL PBS中で行った。サンプルをAmicon Ultra遠心分離ユニット(30 kD MWCO, Millipore, 製品番号UFC803096)において収集し、8分間3000x gで遠心分離することによって濃縮した。体積をPBSで500μLへ調節し（必要に応じて）、サンプルを0.2μmフィルター(Millex-GV, 製品番号SLGV004SL)で滅菌濾過した。二重特異性産物を2〜8℃で保存した。
実施例2−JurkatまたはAU565細胞への抗体変異体の結合
CD3陽性Jurkat細胞またはHER2陽性AU565細胞への、精製された抗体変異体IgG1-CD3 (F405L変異を含有する、huCLB-T3/4)、IgG1-HER2 (K409R変異を含有する、HER2-169)、および二重特異性(bs)IgG-CD3 x HER2分子（Fcドメイン中に追加の変異を有する）（実施例1を参照のこと）の結合を、FACS分析によって分析した。細胞(1x10 5細胞/ウェル)を、100μL PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中の抗体調製物の系列希釈物（Jurkat細胞について4倍希釈で範囲2〜10000 ng/mL、およびAU565細胞について4倍希釈で範囲1〜3000 ng/mL）と共に4℃にて30分間ポリスチレン96-ウェル丸底プレート(Greiner bio-one 650101)中でインキュベートした。
PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中で2回洗浄した後、細胞を100μLで二次抗体と共に4℃にて30分間インキュベートした。二次抗体として、PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中に1/100希釈したR-フィコエリトリン(PE)-結合ヤギ-抗-ヒトIgG F(ab')2 (109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)を、全ての実験について使用した。次に、細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中で2回洗浄し、150μLのPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中に再懸濁し、FACS CantoII (BD Biosciences)において分析した。結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を使用して非線形回帰（可変勾配によるシグモイド用量反応）を用いて解析した。
Jurkat細胞へのIgG1-CD3およびbsIgG1-CD3 x HER2抗体変異体の結合は、Fcドメイン中の記載の変異の導入によって影響されず、全ての試験した変異体および野生型抗体について同一であった（図1Aおよび1Bならびに図2Aおよび2B）。
同様に、AU565細胞へのIgG1-HER2およびbsIgG1-CD3 x HER2抗体変異体の結合は、Fcドメイン中の記載の変異の導入によって影響されず、全ての試験した変異体および野生型抗体について同一であった（図1Cおよび1Dならびに図2Cおよび2D）。
実施例3−PBMC培養物中のT細胞上のCD69発現
T細胞上のCD69発現をFACS分析によって評価し、Fcドメイン中に変異を有するIgG1-CD3抗体と共にインキュベーションした後のT細胞の初期活性化を測定した（実施例1を参照のこと）。
PBMCを、Leucosepチューブ(#227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, The Netherlands)を使用して密度勾配分離によって全血またはバフィコートから単離し、PBSで洗浄し、培養培地中に再懸濁した。
IgG1-CD3抗体変異体、陰性対照（IgG1-CD3 Fab）および陽性対照（IgE-CD3）の用量反応系列を、培養培地中に調製し（3倍希釈で1〜1000 ng/mLの範囲）、PBMCを含有する96-ウェル丸底プレートのウェルへ添加した。16〜24時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清（サイトカインを含有する）を収集し、-20℃で保存した。次いで、細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物で洗浄し、マウス-抗-ヒトCD28-PE (854.222.010; Sanquin, Amsterdam, The Netherlands；T細胞マーカー)およびマウス-抗-ヒトCD69-APC抗体 (340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)で4℃にて30分間染色した。未結合抗体を、PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物で2回洗浄することによって除去した。細胞を150μL/ウェルで再懸濁し、CD28陽性細胞上のCD69発現をFACS Canto II (BD Biosciences)において測定した。
図3は、CD69発現が、IgG1-CD3、IgG1-CD3-DAおよびIgG1-CD3-DAPSと共にインキュベートされた細胞上において高かったことを示している。IgG1-CD3-N297QおよびIgG1-CD3-LALAとのインキュベーションは、野生型IgG1-CD3と比較して多少より低い発現レベルのCD69を誘導し、IgG1-CD3-LFLEおよびIgG1-CD3-LFLEPSとのインキュベーションは、より少ない程度にCD69を誘導した。IgG1-CD3 Fab、IgG1-b12、IgG1-CD3-LFLEDA、IgG1-CD3-LFLENQ、IgG1-CD3-DANQおよびIgG1-CD3-LFLEDANQPS抗体とのPBMCのインキュベーションは、T細胞上のCD69のいかなる発現も誘導しなかった。
実施例4−CD3抗体誘導性T細胞増殖
T細胞の増殖に対するCD3抗体変異体（実施例1に記載）の効果を、Roche Applied Science (Cell Proliferation ELISA, BrdUキット, #11647229001; Roche Applied Science, Mannheim, Germany)製の細胞増殖ELISAキットによって評価し、これを製造業者の指示に従って行った。
全血またはバフィコートから単離したPBMCを、IgG1-CD3変異体の希釈系列（0.1〜1000 ng/mLの範囲）と共に96-ウェル培養プレート中でインキュベートした。IgE-CD3およびIgG1-CD3を陽性対照として、IgG1-b12（二重特異性抗体の作製のためにK409R変異を有する）を陰性対照として含めた。抗体との3日間のインキュベーション後、BrdU (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)を培地へ添加し、プレートを5時間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を収集し、-20℃で保存した。プレートを乾燥させ、ELISAを行うまで4℃で保存した。
DNA中のBrdU組み込みを、製造業者の指示(Cell Proliferation ELISA, BrdUキット, # 11647229001 ; Roche Applied Science)に従ってELISAによって測定した。細胞をプレートへ固定し、この後、プレートを、ペルオキシダーゼと結合された抗-BrdU抗体と共に室温(RT)で90分間インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄し、ABTSバッファー（キットと共に提供されたTMB溶液の代わりに）を用いて結合を検出した。ウェルへ2%シュウ酸を添加することによって、30分後に発色を停止させた。次いで、OD405 nmをEL808 ELISAリーダーにおいて測定した。
図4は、IgG1-CD3、IgG1-CD3-DA、およびIgG1-CD3-DAPSとPBMCのインキュベーションが、抗体の非常に低い濃度においてさえ、T細胞の強力な増殖を誘導したことを示している。IgG1-CD3-N297QまたはIgG1-CD3-LALAとのインキュベーションは、用量依存的増殖を誘導し、これはIgE-CD3陽性対照に匹敵した。IgG1-CD3 Fab、IgG1-b12、IgG1-CD3-LFLE、IgG1-CD3-LFLEDA、IgG1-CD3-LFLENQ、IgG1-CD3-LFLEPS、IgG1-CD3-DANQ、およびIgG1-CD3-LFLEDANQPS抗体とPBMCのインキュベーションは、T細胞の増殖を誘導しなかった。
実施例3および4からの結果に基づいて、最小の活性と考えられた変異体のサブセットを、さらなる分析へ供した。
実施例5−非活性抗体変異体によって誘導されるインビトロT細胞媒介性細胞傷害
AU565(ヒト乳癌)細胞を、10% (vol/vol)熱失活CCS、1.5 g/L炭酸水素ナトリウム(Lonza)、1 mMピルビン酸ナトリウム、4.5 g/Lグルコース(Sigma)、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシンが補われたRPMI 1640中で培養した。細胞株を5% (vol/vol)CO2加湿インキュベーターにおいて37℃で維持した。AU565細胞をほぼコンフルエンシーまで培養した。細胞をトリプシン処理し、培養培地中に再懸濁し、セルストレーナーを通過させ、単一細胞懸濁液を得た。5x104細胞を96-ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を37℃、5% CO2で少なくとも3時間インキュベートし、プレートへの付着を可能にした。
末梢血単核細胞（PBMC）を、製造業者のプロトコル（Greiner Bio-one）に従って、Leucosep 30 mLチューブを用いて、健康なボランティア由来の血液から単離した。単離されたPBMCをPBSで洗浄し、培養培地中に再懸濁し、96-ウェルプレート中のAU565腫瘍細胞へ1：1比で添加した。PBMC中に存在するT細胞のパーセンテージを、マウス抗-ヒトCD3-PerCP (BD, #345766)抗体（T細胞を染色するため）を用いて、FACS分析によって測定した。使用したPBMCの集団中のT細胞含有量は典型的に50〜60%であった。
種々のFc変異体、野生型、N297Q、LFLE、LALA、LFLENQ、LFLEDA、DANQ、およびLFLEDENQPSとして発現されたIgG1-b12、IgG1-CD3、IgG1-HER2、ならびに二重特異性CD3xb12およびCD3xHER2抗体の希釈系列（0.004〜1000 ng/mLの範囲の最終濃度）を、培養培地中で調製し、プレートへ添加した。プレートを37℃、5% CO2で3日間インキュベートした。1μΜスタウロスポリン(#S6942-200, Sigma)との細胞のインキュベーションを、100%腫瘍細胞死滅についてのリファレンスとして使用した。インキュベーション後、上清を除去し、後のサイトカイン放出分析（実施例6を参照のこと）のために-20℃で保存した。プレートをPBSで2回洗浄し、10% Alamarブルーを含有する培養培地150μLを各ウェルへ添加した。プレートを37℃、5% CO2で4時間インキュベートした。590 nmでの吸光度を測定した(Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA)。
異なるドナー由来のPBMCを使用して2つの実験を行った。第1実験において、Fc変異体N297Q、LFLE、LFLENQ、LFLEDA、DANQ、およびLFLEDANQPSを試験した（図5A〜G）。第2実験において、Fc変異体LFLEDAおよびLALAを試験した（図6A〜C）。野生型Fcドメインを有する抗体を、リファレンスとして両方の実験に含めた。野生型単一特異性IgG1-CD3または二重特異性CD3xb12抗体とのインキュベーションは、標的細胞の非特異的死滅を誘導した（図5A〜Gおよび6A〜C）。単一特異性IgG1-CD3およびbsIgG1-CD3xb12変異体N297Q（図5A〜G）およびLALA（図6A〜C）は、同じ実験において試験した野生型抗体と比べてより少ない程度とはいえ、いくらかの非特異的標的細胞死滅を依然として誘導した。非特異的死滅は、非活性変異を有する他の試験したIgG1-CD3またはbsIgG1-CD3xb12抗体のいずれによっても誘導されなかった（図5A〜Gおよび6A〜C）。
全ての二重特異性CD3xHER2抗体が、非活性変異を有さない野生型二重特異性CD3xHER2抗体と比較して少なくとも匹敵する効能で、AU565細胞の用量依存的死滅を誘導した（図4A〜Gおよび6A〜C）。最大死滅が非常に低い濃度で生じた。
単一特異性b12またはHER2抗体の野生型または非活性変異体によって、細胞傷害性は誘導されなかった（図4A〜Gおよび6A〜C）。
実施例6−非活性抗体変異体によって誘導されるサイトカイン放出
実施例5において行ったような細胞傷害性アッセイ由来の上清サンプル中に存在するサイトカインを、Pro-inflammatoryキット(MSD, # K15007B-1)を使用して定量化した。
簡単に記載すると、上清およびキャリブレータサンプルをマルチプレックスプレートへ添加し、室温で1〜2時間インキュベートした。その後、キットと共に提供された1x Detection Antibody Solutionを、ウェルへ添加し、さらに1〜2時間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、Read Buffer Tをウェルへ添加し、化学発光をイメージャーにおいて測定した。キャリブレータサンプルから得られた標準曲線を用いて、サイトカイン濃度を算出した。
9個のサイトカイン（IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12）の産生の結果を図7A〜Iに示す。野生型IgG1-CD3は、様々な量での、9個全ての試験したサイトカインの産生を誘導した。単一特異性IgG1-CD3抗体変異体LFLENQ、LFLEDA、DANQ、およびLFLEDANQPSと標的およびエフェクター細胞のインキュベーションは、IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-6、およびIL-10の実質的な産生をもたらさず、少量のIL-8およびIL-12の産生をもたらした。単一特異性IgG1-CD3-LALA変異体と標的およびエフェクター細胞のインキュベーションは、多量のIL-8の産生、少量の7個のサイトカイン（IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12）の産生をもたらし、実質的な量のIL-2の産生をもたらさなかった。
二重特異性IgG1-CD3xHER2抗体は、野生型および非活性変異体の両方ともが、9個全てのサイトカインの産生を誘導した（図7A〜I）。二重特異性IgG1-CD3xHER2抗体によって誘導されたサイトカイン産生は、IL-1βおよびIL-2の産生を除いて、野生型単一特異性IgG1-CD3対照によって誘導されたサイトカイン産生と比較して多少高かった。
実施例7−非活性抗体変異体へのC1qの結合の評価
標的細胞へ結合された抗体とC1qとの相互作用は、補体活性化の古典的経路における第1段階である。野生型IgG1はC1qについての相互作用部位を有するので、ELISAによってこれらの非活性IgG1変異体へのC1qの相互作用を評価した。
IgG1-CD3、bsIgG1-CD3xHER2およびIgG1-CD20（陽性対照）ならびに実施例1において上述したようなそれらの非活性抗体変異体の希釈系列（4倍希釈で範囲7〜30000 ng/mL）を、4℃で一晩かけて、96-ウェルMicrolon ELISAプレート(Greiner, Germany)上にコーティングした。プレートを洗浄し、0.025% Tween 20および0.1%ゼラチンが補われたPBSでブロッキングした。インキュベーションの間に洗浄を行いながら、3％プールヒト血清（Sanquin、製品番号M0008）と共に37℃で1時間、100μL／ウェルのウサギ抗ヒトC1q（DAKO、製品番号A0136、1／4.000）と共にRTで1時間、および検出用抗体としての100μL／ウェルのブタ抗ウサギIgG-HRP（DAKO、P0399、1：10.000）と共にRTで1時間、プレートを逐次的にインキュベートした。1 mg/mL 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)（ABTS；Roche, Mannheim, Germany）を約30分間添加することによって、検出を行った。反応を100μLの2%シュウ酸の添加によって停止させた。吸光度をマイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）において405nmで測定した。対数変換データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いて可変勾配によるシグモイド用量反応曲線に適合させることによって解析した。
C1qは、野生型IgG1 Fc領域を有する抗体、IgG1-CD20、IgG1-CD3およびbsIgG1 CD3xHER2への結合を示した（図8）。非活性変異（N297Q、LFLE、LFLENQ、LFLEDA、DA、DAPS、DANQ、LFLEPS、LFLEDANQPS、LALA）を有する評価した抗体変異体の全てにおいて、C1qの結合は検出されなかった（図8）。
実施例8−FcγRIへの非活性抗体変異体の結合
IIa1.6 FcγRI細胞によって発現される高親和性FcγRIへのIgG1-CD3抗体変異体N297Q、LFLE、LFLEDA、LFLENQ、DANQ、LFLEDANQPSおよびLALAの結合を、FACS分析によって評価した。
IIa1.6 FcγRI細胞(Van Vugt et al. Blood 1999, 94: 808-817)を、10% Cosmic仔ウシ血清、25 mg/ml (55 mM)メトトレキサート、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシンが補われたRPMI培地中で培養した。細胞株を5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーター中で37℃で維持した。
IIa1.6 FcγRI細胞(1x105細胞/ウェル)を、ポリスチレン96-ウェル丸底プレート(Greiner bio-one, #650101)において4℃で30分間、抗体調製物の系列希釈物（4倍希釈で範囲10〜10000 ng/mL）と共にインキュベートした。細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物で洗浄し、PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中に1/100希釈したR-フィコエリトリン(PE)-結合ヤギ-抗-ヒトIgG F(ab')2 (109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories)で4℃にて30分間染色した。次いで、細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物で洗浄し、150μLのPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中に再懸濁し、FACS CantoII (BD Biosciences)において分析した。結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を使用して非線形回帰（可変勾配によるシグモイド用量反応）を用いて解析した。
野生型IgG1-CD3抗体は、FcγRIへの強い結合を示した（図9）。IgG1-CD3抗体変異体N297QおよびLALAは、より高い濃度（> 1000 ng/mL；図9）で試験した場合にIIa1.6 FcγRI細胞上のFcγRIへの弱い結合を示した。IIa1.6 FcγRI細胞への実質的な結合は、抗体変異体LFLE、LFLEDA、LFLENQ、DANQおよびLFLEDANQPSについて観察されなかった（図9）。
実施例9−非活性抗体変異体の薬物動態（PK）分析
この試験におけるマウスは、Central Laboratory Animal Facility（Utrecht, The Netherlands）のバリアユニットに収容し、フィルタートップケージに入れた上で、水および飼料を自由に摂取させた。実験はすべて、Utrecht大学の動物倫理委員会によって承認された。7〜10週齢のC.B-17 SCIDマウス（C.B-17/Icr-Prkdc<Scid>/IcrIcoCrl, Charles-River）に対して、1群当たりマウス3匹を用いて、100μgの野生型抗体（IgG1-CD3、IgG1-HER2、またはbsIgG CD3xHER2）またはそれらの非活性変異体（LALA、LFLEDA、LFLENQ、DANQまたはLFLEDANQPS）を静脈内注射した。抗体投与から10分後、4時間後、1日後、2日後、7日後、14日後および21日後に、伏在静脈から50μLの血液サンプルを収集した。血液をヘパリン含有バイアル中に収集し、10,000 x gで5分間遠心分離した。抗体濃度の決定まで血漿を-20℃で貯蔵した。
ヒトIgG濃度を、全hIgGサンドイッチELISAを用いて決定した。このアッセイのために、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）に2μg/mLの濃度でコーティングしたマウスmAb抗ヒトIgG-κクローンMH16（#M1268, CLB Sanquin, The Netherlands）を捕捉用抗体として用いた。0.2％ウシ血清アルブミンが補われたPBSでプレートをブロックした後に、サンプルを添加し、ELISA緩衝液（0.05％Tween 20および0.2％ウシ血清アルブミンが補われたPBS）中に系列希釈した上で、室温（RT）にてプレート振盪機において1時間インキュベートした。その後、プレートをヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（#109-035-098, Jackson, West Grace, PA）と共にインキュベートし、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸) (ABTS; Roche, Mannheim, Germany)で発色させた。2%シュウ酸をウェルへ添加することによって、30分後に反応を停止させた。吸光度をマイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）において405nmで測定した。
血漿クリアランス速度（mL/日/kg）を、以下の等式に従って曲線下面積（AUC）に基づいて算出した。
Figure 0006604851
Graphpad prismソフトウェアを用いてデータ解析を行った。
図10Aは、血漿ヒトIgG濃度が、野生型抗体と比較した場合、抗体変異体N297Q、DANQ、LFLENQ、およびLFLEDANQPSについてより低かったことを示している。抗体変異体LFLEDAおよびLALAについての血漿中のヒトIgG濃度は、野生型抗体のものと同様であった。
図10Bは、抗体変異体N297Q、DANQおよびLFLENQの血漿クリアランス速度が、野生型抗体のそれと比べて2〜3倍より高かったことを示している。抗体変異体LFLEDANQPSのクリアランス速度は、野生型抗体のそれと比べて3〜5倍より高かった。抗体変異体LFLEDAおよびLALAの血漿クリアランス速度は、野生型抗体のそれと同様であった。
実施例10−ヒトおよびカニクイザル（cynomolgous）T細胞株へのヒト化CD3抗体およびその非活性変異体の結合
ヒトT細胞株JurkatまたはカニクイザルT細胞株HSC-Fへの、FcドメインにLFLEDA変異を有するまたは有さないヒト化CD3（huCD3）抗体および二重特異性(bs)IgG1-huCD3 x HER2分子の精製変異体（実施例1を参照のこと）の結合を、FACS分析によって分析した。非活性変異に加えて、LFLEDA抗体変異体は、実施例1に記載されるようにF405LまたはK409R変異を含む。
細胞(1x105細胞/ウェル)を、ポリスチレン96-ウェル丸底プレート(Greiner bio-one 650101)において4℃で30分間、100μLのPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中の抗体調製物の系列希釈物（3倍希釈で範囲5〜10,000 ng/mL）と共にインキュベートした。
PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中で2回洗浄した後、細胞を100μLで二次抗体と共に4℃にて30分間インキュベートした。二次抗体として、PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中に1/100希釈したR-フィコエリトリン(PE)-結合ヤギ-抗-ヒトIgG F(ab')2 (109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)を、全ての実験について使用した。次に、細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中で2回洗浄し、150μLのPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物中に再懸濁し、FACS CantoII (BD Biosciences)において分析した。結合曲線を、GraphPad Prism V5.04ソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を使用して非線形回帰（可変勾配によるシグモイド用量反応）を用いて解析した。
図11Aは、野生型Fc領域を有するIgG1-huCD3変異体H1L1（それぞれ、SEQ ID NO：6および10）、H1L2（それぞれ、SEQ ID NO：6および11）、H1L3（SEQ ID NO：6および12）、H3L3（それぞれ、SEQ ID NO：8および12）およびH4L1（それぞれ、SEQ ID NO：9および10）、ならびにLFLEDA変異を有する親IgG1-CD3およびIgG1-huCD3-H3L1の、Jurkat細胞への結合は、同様であったことを示している。陽性対照として含めたIgG1-huCLB-3/4の結合は、IgG1-huCD3変異体と比較した場合、Jurkat細胞に対して強かった。陰性対照抗体IgG1-b12について結合は観察されなかった。H1は可変重鎖領域VH1を指し、V1は可変軽鎖領域VL1を指すなどである。
図11Bは、二重特異性抗体変異体bsIgG1 CD3 x HER2、bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA、およびbsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDAもJurkat細胞へ結合することを示している。これらの二重特異性抗体についての最大結合値は、単一特異性抗体の最大結合値よりも高い。二重特異性抗体のEC50濃度は6〜10倍より高かった。また、陰性対照抗体IgG1-b12について結合は観察されなかった。
図12Aは、カニクイザルT細胞株HSC-Fへの、野生型Fc領域を有するIgG1-huCD3変異体H1L1、H1L2、H1L3、H3L3およびH4L1（上記に記載した通り）、ならびにLFLEDA変異を有する親IgG1-CD3およびIgG1-huCD3-H3L1の結合が、同様であったことを示している。カニクイザルCD3と交差反応しないhuCLB-3/4、および陰性対照抗体IgG1-b12について結合は観察されなかった。
図12Bは、二重特異性抗体変異体bsIgG1 CD3 x HER2およびbsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDAもHSC-F細胞へ結合することを示している。これらの二重特異性抗体についての最大結合値は、単一特異性抗CD3変異体の最大結合値よりも高い。二重特異性抗体のEC50濃度は、単一特異性抗CD3抗体のそれと比べて10〜12倍より高かった。また、陰性対照抗体IgG1-b12について結合は観察されなかった。
実施例11−ヒト化CD3抗体変異体によるT細胞活性化
T細胞上のCD69発現をFACS分析によって評価し、Fc領域中にLFLEDA変異を有するまたは有さないヒト化CD3（huCD3）抗体変異体とのインキュベーション後のT細胞の初期活性化を測定した。非活性変異に加えて、LFLEDA抗体変異体は、実施例10に記載されるようにF405LまたはK409R変異を含む。
PBMCを、Leucosepチューブ(#227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, The Netherlands)を使用して密度勾配分離によって全血またはバフィコートから単離し、PBSで洗浄し、培養培地中に再懸濁した。
huCD3抗体変異体、陰性対照（IgG1-b12）および陽性対照（IgE-huCD3および親IgG1-CD3）の用量反応系列を、培養培地中に調製し（10倍希釈で0.1〜1,000 ng/mLの範囲）、ヒトまたはカニクイザルPBMCを含有する96-ウェル丸底プレートのウェルへ添加した。16〜24時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清（サイトカインを含有する）を収集し、-20℃で保存した。次いで、細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物で洗浄し、マウス-抗-ヒトCD28-PE (854.222.010; Sanquin, Amsterdam, The Netherlands；T細胞マーカー)およびマウス-抗-ヒトCD69-APC抗体(340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)で4℃にて30分間染色した。未結合抗体を、PBS/0.1% BSA/0.02%アジ化物で2回洗浄することによって除去した。細胞を150μL/ウェルで再懸濁し、CD28陽性細胞上のCD69発現をFACS Canto II (BD Biosciences)において測定した。
図13は、野生型Fc領域を有する親IgG1-CD3およびヒト化IgG1-huCD3変異体が、ヒト（図13A）およびカニクイザル（図13B）起源由来のT細胞上において同様のレベルのCD69発現を誘導したことを示している。非活性（LFLEDA）親IgG1-CD3およびIgG1-huCD3-H3L1変異体は、ヒトT細胞において低レベルのCD69発現を誘導した。カニクイザルT細胞において非活性IgG1-huCD3変異体によってCD69の発現は誘導されなかった。対照抗体IgG1-b12はまた、ヒトまたはカニクイザルT細胞においてCD69の発現を誘導しなかった。
実施例12−ヒト化CD3抗体変異体によって誘導されるT細胞増殖
ヒトおよびカニクイザルT細胞の増殖に対するヒト化CD3（huCD3）抗体変異体（実施例1および10に記載）の効果を、Roche Applied Science (Cell Proliferation ELISA, BrdUキット, #11647229001; Roche Applied Science, Mannheim, Germany)製の細胞増殖ELISAキットによって評価し、これを製造業者の指示に従って行った。
全血またはバフィコートから単離したヒトまたはカニクイザルPBMCを、huCD3抗体変異体の希釈系列（10倍希釈で0.1〜1,000 ng/mLの範囲）と共に96-ウェル培養プレート中でインキュベートした。IgE-CD3およびIgG1-huCLB-T3/4を陽性対照として、IgG1-b12を陰性対照として含めた。抗体との3日間のインキュベーション後、BrdU (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)を培地へ添加し、プレートを5時間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を収集し、-20℃で保存した。プレートを乾燥させ、ELISAを行うまで4℃で保存した。
DNA中のBrdU組み込みを、製造業者の指示（Roche Applied Science、上記に指定されるカタログ番号を参照のこと）に従ってELISAによって測定した。細胞をプレートへ固定し、この後、プレートを、ペルオキシダーゼに結合した抗-BrdU抗体と共にRTで90分間インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄し、ABTSバッファー（キットと共に提供されたTMB溶液の代わりに）を用いて結合を検出した。ウェルへ2%シュウ酸を添加することによって、30分後に発色を停止させた。OD405 nmをEL808 ELISAリーダーにおいて測定した。
図14は、野生型Fc領域を有する親IgG1-CD3およびヒト化IgG1-huCD3変異体とPBMCのインキュベーションが、抗体の非常に低い濃度においてさえ、ヒト（図14A）およびカニクイザル（図14B）T細胞の強力な増殖を誘導したことを示している。IgG1-huCD3抗体の非活性LFLEDA変異体とのインキュベーションは、ヒトまたはカニクイザルT細胞の増殖を誘導しなかった。従って、IgG1-huCD3抗体の非活性変異体は、ヒトT細胞において低レベルのCD69発現を誘導したが（実施例11に示される通り）、ヒトT細胞の増殖はこれらの非活性IgG1-huCD3変異体によって誘導されなかった。
実施例13−ヒト化CD3抗体変異体によって誘導されるインビトロT細胞媒介性細胞傷害
AU565(ヒト乳癌)細胞を、10% (vol/vol)熱失活CCS、1.5 g/L炭酸水素ナトリウム(Lonza)、1 mMピルビン酸ナトリウム、4.5 g/Lグルコース(Sigma)、50 IU/mLペニシリン、および50μg/mLストレプトマイシンが補われたRPMI 1640中で培養した。細胞株を5% (vol/vol) CO2加湿インキュベーターにおいて37℃で維持した。AU565細胞をほぼコンフルエンシーまで培養し、その後、細胞をトリプシン処理し、培養培地中に再懸濁し、セルストレーナーを通過させ、単一細胞懸濁液を得た。5x104細胞を96-ウェル培養プレートの各ウェルに播種し、細胞を37℃、5% CO2で少なくとも3時間インキュベートし、プレートへの付着を可能にした。
ヒトまたはカニクイザルPBMCを全血またはバフィコートから単離した。単離されたPBMCをPBSで洗浄し、培養培地中に再懸濁し、96-ウェルプレート中のAU565腫瘍細胞へ1：1比で添加した。PBMC中に存在するT細胞のパーセンテージを、マウス抗-ヒトCD3-PerCP (BD, #345766)抗体（T細胞を染色するため）を用いて、FACS分析によって測定した。使用したPBMCの集団中のT細胞含有量は典型的に50〜60%であった。
二重特異性抗体変異体bsIgG1 CD3 x HER2、bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA、およびbsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDAの希釈系列（0.001〜1,000 ng/mLの範囲の最終濃度）を、培養培地中で調製し、プレートへ添加した。IgG1-HER2-LFLEDAおよびIgG1-b12を対照として含めた。非活性変異に加えて、LFLEDA抗体変異体は、二重特異性フォーマットでの作製のためにF405LまたはK409R変異を含む（実施例10を参照のこと）。プレートを37℃、5% CO2で3日間インキュベートした。1μΜスタウロスポリン(#S6942-200, Sigma)と細胞のインキュベーションを、100%腫瘍細胞死滅についてのリファレンスとして使用した。プレートをPBSで2回洗浄し、10% Alamarブルーを含有する培養培地150μLを各ウェルへ添加した。プレートを37℃、5% CO2で4時間インキュベートした。590 nmでの吸光度を測定した(Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA)。二重特異性CD3xHER2-LFLEDA抗体変異体（親およびヒト化H3L1変異体）は、ヒトまたはカニクイザルエフェクター細胞を使用して、低濃度でAU565細胞の死滅を誘導した（図15）。カニクイザルCD3との交差反応性を示さないCD3二重特異性抗体huCLB-T3/4xHER2-LFLEDAは、ヒトPBMCを使用した場合に、AU565細胞の死滅のみを誘導した（図15A）。従って、カニクイザルエフェクター細胞をアッセイにおいて使用した場合、標的細胞の死滅は観察されなかった（図15B）。単一特異性IgG1-b12もしくはIgG1-HER2-LFLEDAまたは二重特異性CD3xb12-LFLEDA抗体とのインキュベーションは、標的細胞の非特異的死滅を誘導しなかった（図15）。

Claims (21)

  1. 第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含むタンパク質であって、該第1および第2ポリペプチドが各々、少なくともヒトIgG1免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含み、該第1および第2ポリペプチドの両方において、該ヒトIgG1重鎖の位置L234、L235、D265、N297、およびP331におけるアミノ酸が、それぞれF、E、A、N、およびPであり、ここでアミノ酸位置は、EUインデックスナンバリングに従って番号付けされている、タンパク質。
  2. 前記タンパク質が、10%を超えて野生型タンパク質から逸脱しない血漿クリアランス速度（mL/日/kg）を有し、血漿クリアランス速度が、曲線下面積（AUC）で割った対象へ投与される用量（μg/kg）によって算出され、AUC値が濃度-時間曲線から決定され、
    該野生型タンパク質が、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドの両方において、ヒトIgG1重鎖の位置L234、L235、およびD265におけるアミノ酸が、それぞれL、L、およびDである点を除いて、請求項1に記載のタンパク質と同一である、
    請求項1記載のタンパク質。
  3. 前記第1および第2ポリペプチドが、それぞれ免疫グロブリンの第1および第2重鎖である、請求項1または2記載のタンパク質。
  4. 前記第1および第2ポリペプチドが、それぞれ第1および第2結合領域をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のタンパク質。
  5. 前記タンパク質が、免疫グロブリンの第1および第2軽鎖を含み、該第1軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第1重鎖と連結されており、該第2軽鎖がジスルフィド架橋を介して前記第2重鎖と連結されている、請求項3または4記載のタンパク質。
  6. 前記第1および第2結合領域のうちの少なくとも1つがCD3に結合する、請求項4または5記載のタンパク質。
  7. 前記第1および第2結合領域の両方がCD3に結合する、請求項4〜6のいずれか一項記載のタンパク質。
  8. 前記タンパク質が、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、末梢血単核細胞（PBMC）に基づく機能アッセイにおいてCD69発現を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%低下したFc媒介性CD69発現を媒介する、請求項1〜7のいずれか一項記載のタンパク質。
  9. 前記タンパク質が、CD3に結合する単一特異性抗体として存在する場合、PBMCに基づく機能アッセイにおいてT細胞増殖を測定した場合に、野生型タンパク質と比較して少なくとも50%低下したFc媒介性T細胞増殖を媒介する、請求項1〜8のいずれか一項記載のタンパク質。
  10. a．SEQ ID NO：6に示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：12に示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域；
    b．SEQ ID NO：8に示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：12に示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域；ならびに
    c．SEQ ID NO：9に示される重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO：10に示される軽鎖可変領域配列を含む結合領域
    からなる群より選択される第1結合領域を含む、請求項4〜9のいずれか一項記載のタンパク質。
  11. 前記タンパク質が、第1および第2結合領域を含み、該第1結合領域が該第2結合領域とは異なる標的に結合する、請求項4〜6および10のいずれか一項記載のタンパク質。
  12. 前記標的が、異なる細胞上に存在する、請求項11記載のタンパク質。
  13. 前記第1結合領域がCD3に結合し、前記第2結合領域が癌特異的標的に結合する、請求項11または12記載のタンパク質。
  14. 前記第1ポリペプチドにおいて、前記ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、F405、Y407、およびK409からなる群より選択される位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、前記第2ポリペプチドにおいて、前記ヒトIgG1重鎖におけるT366、L368、K370、D399、F405、Y407、およびK409からなる群より選択される位置におけるアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されており、かつ該第1および該第2ポリペプチドの該置換が同じ位置におけるものではない、請求項1〜13のいずれか一項記載のタンパク質。
  15. ヒトIgG1重鎖におけるF405におけるアミノ酸が、前記第1ポリペプチドにおいてLであり、かつヒトIgG1重鎖におけるK409におけるアミノ酸が、前記第2ポリペプチドにおいてRであるか、またはその逆である、請求項14記載のタンパク質。
  16. 抗体である、請求項1〜15のいずれか一項記載のタンパク質。
  17. タンパク質が二重特異性抗体である、請求項1〜16のいずれか一項記載のタンパク質。
  18. 請求項1〜17のいずれか一項記載のタンパク質を含む、組成物。
  19. 請求項1〜17のいずれか一項記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  20. 疾患の治療における使用のための、請求項1〜17のいずれか一項記載のタンパク質、請求項18記載の組成物、または請求項19記載の薬学的組成物。
  21. 疾患が、癌、感染症、または自己免疫疾患である、請求項20記載のタンパク質、組成物、または薬学的組成物。
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