PT651805E - Método de ligação intracelular de moléculas-alvo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE LIGAÇÃO INTRACELULAR DE MOLÉCULAS-ALVO" A presente invenção é dirigida a um método de ligação intracelular de moléculas especificas, preferivelmente proteínas. Mais especificamente, este método envolve a expressão intracelular e utilização subsequente de anticorpos específicos para uma molécula desejada. Várias anormalidades parecem resultar da expressão indesejada de uma molécula particular, como uma proteína. Por exemplo, crê-se que muitos tumores resultam da super-expressão de oncogenes celulares, como neu, myc, abl, etc. Crê-se que outras malignidades resultam da expressão de um receptor alterado. Certas doenças são causadas pela expressão celular indesejada de proteínas virais. Por exemplo, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) usa certas células de mamífero para a preparação de proteínas virais codificadas, incluindo proteínas estruturais e enzimas reguladoras. 0 vírus da Leucemia de células T humana de tipo 1 ou 2 (HTLV-1 ou 2) produz tumores em indivíduos infectados em resultado da expressão virai. Essas proteínas virais codificadas podem resultar na reunião de viriões que, por sua vez, podem infectar outras células.

Estratégias terapêuticas incluíram o desenvolvimento de fármacos para abordar selectivamente as proteínas indesejadas, meios de bloqueio intercelular dessas proteínas, por exemplo, CD4 solúveis, e a utilização de fármacos que irão matar selectivamente células que expressam as proteínas indesejadas. 2

Outro método de tratamento que foi sugerido é a transferência de materiais genéticos para células. Por exemplo, por distribuição de genes mediada por receptores, implantação transcariótica e vectores vaivém virais, como transferência de genes retrovirais. Nesses métodos, genericamente referidos como terapia genética, espera-se que células deficientes numa proteína ou que produzem uma proteína disfuncional sejam reparadas por introdução na célula de DNA que codifica para o produto genético normal.

Foi relatada expressão de genes in vivo após injecção directa de DNA do plasma não infeccioso e não oncogénico encapsulado em lipossomas [Nicolau, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. _80q 1068 (1983)], imunolipossomas [Wang, C.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 8_4: 7851 (1987)] e num híbrido lipossoma/membrana de glóbulo vermelho [Kaneda, Y., et al., Science 243: 375 (1989)]. Foi relatada a expressão a partir de uma variedade de sequências genéticas precipitadas com fosfato de cálcio após injecção intraperitoneal directa [Benvenitsy, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 8_3: 9551 (1986); Felgner, P.L., et al., Nature 34 9: 351 (1991)] ou após implementação transcariótica [Seldon, R.F., et al., Science 242: 714 (1987) ]. A abordagem selectiva de genes in vivo também foi conseguida por distribuição de genes mediada por receptores, em que foi utilizado um complexo entre um conjugado asialo-orosomucóide/polilisina e genes de receptores plasmídicos para dirigir a expressão exclusivamente para o fígado, após administração intravenosa [Wu, G.Y., et al., J. Biol. Chem. 2 63: 14621 (1988) ]. É relatado que a transferência de genes retrovirais oferece uma elevada eficiência da infecção, integração e expressão estáveis na maior parte das células 3 [Anderson, W.F., Science 226: 401 (1984)]. A terapia genética in vivo foi iniciada em pacientes com deficiência de ADA, nos quais foram novamente infundidos no seu sangue linfócitos autólogos com o gene ADA, e em pacientes cancerosos com melanoma avançado, nos quais foram novamente infundidos linfócitos que se infiltram em tumores (TIL) contendo o gene para o factor de necrose tumoral (TNF) [Rosenberg, S.A., et al., N. Eng. J. Med. 323: 570 (1990)]. A modificação genética de células que expressam continuamente um inibidor virai e que resultam na inibição de infecção virai foi proposta e referida como imunização intracelular [Baltimore, D., Nature 335: 395-196 (1988)]. Para esta finalidade foram testadas várias abordagens, incluindo ribozimas especificas para o HIV-1 [Sarver, N., et al., Science 227: 1222 (1990)], RNA anti-sentido [Posnansky, M., et al., J. Virol. _65_: 532 (1991)], chamarizes de tar [Sullenger, B.A., et al., Cell _63_: 601 (1990); Lisziewicz, J., et al., VII Internat'l. Conf. AIDS 2_: 28 (1991)], mutantes negativos dominantes e outros [Buonocorel et al., Nature 345: 625-628 (1990); Hasseloff, J., et al., Nature 334: 585-591 (1988); VanderKrol, A.R., et al., BioTechniques _6: 958-976 (1988); Malim, M.H., et al., Cell _58: 205-214 (1989), e Trono, D., et al., Cell 59: 113-120 (1989)] . Um grande obstáculo ao desenvolvimento de protocolos eficazes de inibição de genes utilizando estes RNA anti-sentido ou ribozimas é a capacidade para obter um nivel elevado de expressão do modelo de DNA que codifica o inibidor nas células transformadas, e isto também pode ser um problema potencial para utilizar mutantes negativos dominantes devido à natureza competitiva da inibição. 4

Foi recentemente relatada a possibilidade de expressar e dirigir anticorpos funcionais no citoplasma ou no núcleo de células de mamifero substituindo o lider secretor da cadeia leve e da pesada por lideres citoplasmáticos ou nucleares [Biocca, S., et al., Cytotechnology .5: 549-50 (1991)].

Seria desejável dispor de um método que pudesse ser utilizado para atingir um nivel elevado de expressão de um inibidor para a molécula desejada.

Seria desejável dispor de um método que pudesse abordar especificamente estas moléculas indesejadas e que tivesse aplicabilidade ampla.

Seria desejável dispor de um método que não introduzisse numa célula agentes químicos citotóxicos.

Seria desejável dispor de um método que proporcionasse um meio fácil de abordar selectivamente proteínas indesej adas.

RESUMO DA INVENÇÃO

Descobrimos agora um método pelo qual é possível abordar selectivamente uma molécula indesejada (por vezes referida como molécula-alvo ou antigene-alvo) , preferivelmente uma proteína. Este método compreende a expressão intracelular de um anticorpo capaz de se ligar ao alvo. É distribuída numa célula uma sequência de DNA contendo um número suficiente de nucleótidos que codificam para a porção de um anticorpo capaz de se ligar ao alvo operativamente ligada a um promotor que permitirá a expressão do anticorpo na(s) célula(s) de interesse 5 (cassete do anticorpo). Em seguida, o anticorpo é expresso intracelularmente e liga-se ao alvo, desse modo impedindo o alvo de exercer as suas acções normais. Numa especificação preferida, o gene" do anticorpo da cassete do anticorpo utiliza um cDNA que codifica os dominios variável da cadeia pesada (VH) e variável da cadeia leve (VL) de um anticorpo que podem ser ligados, ao nivel do DNA, por um oligonucleótido apropriado como ponte entre os dois dominios variáveis que, por tradução, formam um único polipéptido (referido como fragmento variável de cadeia única (sFv)) capaz de se ligar a um alvo, como uma proteina. Em certas especificações preferidas também se utiliza uma sequência de nucleótidos que codifica um lider de localização intracelular. Células-alvo preferidas são células infectadas de forma retroviral, como células infectadas com o HIV, em que os alvos são as proteínas codificadas de forma virai. Por exemplo, podem utilizar-se anticorpos dirigidos contra proteínas estruturais, como a glicoproteína do envelope e proteína gag, e/ou dirigidos contra proteínas reguladoras tat, rev, nef, vpu e/ou vpx. Numa especificação preferida utiliza-se um "cocktail" de anticorpos (isto é, mistura de anticorpos) para abordar selectivamente uma variedade de proteínas-alvo virais. Outro alvo preferido inclui oncogenes, tais como receptores de factores de crescimento transmembranares, receptores, factores de crescimento, proteínas de ligação ao nucleótido guanina associado a membranas, etc.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS 6 A Figura 1 mostra a localização de "primers" de PCR para a clonagem de regiões variáveis e constantes de genes da cadeia pesada e leve de imunoglobulinas. A Figura 2 é um diagrama das estruturas de Fv, sFv e sFv-KDEL de um anticorpo amplamente neutralizador para a glicoproteina do envelope, F105. As três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cada cadeia estão sombreadas. A Figura 3 consiste em autorradiogramas que ilustram um impulso-perseguição ("pulse chase") de células COS-1 transfectadas com um plasmideo que expressa fragmentos Fab de um anticorpo amplamente neutralizador para a glicoproteina do envelope. A Figura 4 é uma autorradiografia de um gel de SDS-poliacrilamida 12,5% que ilustra proteínas imunoprecipitadas de um lisato ou meio de cultura de células. A Figura 5 mostra a coloração imunofluorescente de células transformadas. A Figura 6A e Figura 6B são autorradiogramas de géis de poliacrilamida que mostram sFv 105 (A) ou sFv 105-KDEL (B) coprecipitado com a glicoproteina do HIV-1. A Figura 7 mostra a inibição da formação de sincícios em células que expressam sFv ou sFv-KDEL. A Figura 8 consiste em autorradiogramas de um anticorpo de cadeia única com uma sequência de localização que exibe ligação específica para a glicoproteina do HIV-1 em células. A Figura 9 consiste em autorradiogramas mostrando que um anticorpo de cadeia única para um alvo particular não é coprecipitado com proteínas não relacionadas. 7 A Figura 10 consiste em autorradiogramas mostrando que um anticorpo anti-tat retido intracelularmente não se liga à glicoproteina do HIV-1. A Figura 11 mostra a produção de HIV-1 infeccioso em células que expressam sFv ou sFv-KDEL. A Figura 12 mostra o titulo de virus por formação de sincicios em células SupTl. A Figura 13 consiste em autorradiogramas mostrando células SupT transformadas de modo estável com um anticorpo de cadeia única sob o controlo de um promotor indutível ou de um promotor do CMV. A Figura 14 mostra a estratégia da transferência genética mediada por anticorpos. A Figura 15 mostra a síntese de conjugados anticorpo-polilisina. A Figura 16 consiste em autorradiogramas mostrando a expressão do sFv F105 em células SupT infectadas com o HIV com concentrações variáveis da proteina tat.

As Figuras 17A até 17D mostram a análise de FACS da expressão da gpl20 em células SupT CD4 infectadas com o HIV-1 e transduzidas de forma estável com o sFv F105.

As Figuras 18A até 18D mostram a expressão de CD4 de superfície em células SupT infectadas com o HIV-1 transduzidas com sFv F105. A Figura 19 mostra o resultado de estudos de formação de sincicios após infecção de células vectoriais SupT ou células SupT sFv 105 com o HIV-1. A Figura 20 mostra a transactivação de células que expressam um plasmídeo contendo um repórter LTR do HIV-1-CAT transfectado com Tat a concentrações variáveis. A Figura 21 mostra a actividade da tat na presença de três anticorpos diferentes para a tat. 8 A Figura 22 mostra a actividade da tat para os anticorpos da Figura 21 numa concentração diferente dos anticorpos.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de abordagem selectiva de uma molécula particular (molécula-alvo), preferivelmente uma proteina, tal como uma proteina indesejada. Este método compreende a expressão intracelular de um anticorpo que é capaz de se ligar a um alvo especifico (por exemplo, uma proteina-alvo), em que o anticorpo tem uma sequência lider que é uma sequência secretora funcional, isto é, funcional de modo que o anticorpo expresso seja segregado pela célula, e o anticorpo também contém uma sequência de retenção intracelular. Esses anticorpos ligar-se-ão ao alvo intracelularmente. Tal como é aqui utilizado, o termo anticorpo refere-se a pelo menos àquela porção de uma imunoglobulina capaz de se ligar selectivamente a um alvo, como uma proteina. 0 anticorpo é expresso a partir de uma sequência de DNA que contém um número suficiente de nucleótidos que codificam para a porção de um anticorpo

capaz de se ligar ao alvo, referido aqui como gene do anticorpo. 0 gene está operativamente ligado a um promotor que permitirá a expressão do anticorpo na(s) célula (s) de interesse. Promotores são bem conhecidos na área e podem ser facilmente seleccionados, dependendo do tipo de célula que se pretende abordar selectivamente. Suplementarmente, a utilização de promotores indutiveis, que também são bem conhecidos na área, é preferida nalgumas especificações. Tal como quando a função de uma proteina-alvo resulta da sua super-expressão. Em seguida, ao "ligar o promotor", pode obter-se selectivamente a expressão do anticorpo. A 9 sequência completa do gene do anticorpo e promotor é descrita aqui como uma cassete do anticorpo. A cassete é distribuída na célula por qualquer um de alguns meios descritos abaixo, que permitem a distribuição intracelular de um gene. A cassete resulta na expressão intracelular do anticorpo. Em seguida, o anticorpo expresso pode ligar-se ao antigene-alvo. Isto permite uma grande variedade de aplicações úteis.

Praticamente qualquer tipo de molécula biológica pode servir de antigene, por exemplo, metabolitos intermediários, açúcares, lípidos, autacóides e hormonas, bem como macromoléculas, tais como hidratos de carbono complexos, fosfolípidos, ácidos nucleicos, como RNA e DNA, e proteínas. 0 técnico experimentado pode gerar anticorpos que se irão ligar especificamente às moléculas pequenas e às macromoléculas. Por exemplo, com moléculas pequenas, habitualmente liga-se a molécula pequena (por vezes referida como hapteno) a uma macromolécula (por vezes referida como transportador) antes da imunização. 0 complexo hapteno-transportador actua como imunogene. Assim, conhecem-se anticorpos que se irão ligar especificamente a uma gama ampla de alvos. As moléculas-alvo preferidas incluem proteínas, RNA, DNA e haptenos. Mais preferivelmente, os alvos são proteínas, RNA e DNA. Ainda mais preferivelmente, o alvo é uma proteína.

Foi relatado que a super-expressão de alguns oncogenes está associada a transformação celular maligna. Por exemplo, a amplificação de myc foi relatada em culturas de células de carcinoma do cólon COLO 320, na linha de células 10 de carcinoma da mama SKBR3 e em linhas de células de carcinoma do pulmão. A amplificação de N-myc foi relatada em linhas de células de neuroblastoma e em retinoblastoma. Também foi relatado que a amplificação de c-abl, c-myb e outros oncogenes está associada a transformação maligna. Ver capítulo 12 "Human Oncogenes", páginas 487-543, de "RNA Tumor Viruses, Molecular Biology of Tumor Viruses", 2a Edição, Weiss, R. et al., Editores (Cold Spring Harbor Laboratory (1985)).

Também foi relatado que níveis elevados de vários oncogenes proporcionam o risco de recorrência do tumor. Por exemplo, foi relatada uma correlação entre o nível de neu/c-erbB-2 e a causa e decurso de cancro da mama humano. Ver Paterson, M.C., et al., Câncer Research 5_1: 556-567 (1991) ; níveis elevados de myc, int-2 e hst-1 também foram associados a cancro da mama. De modo semelhante, foi mostrado que níveis elevados do receptor para o EGF, EGF-R, estão associados a cancro da mama. Grimaux, M., et al., Int. J. Câncer 4_5: 255-262 (1990). Também foi relatado que a super-expressão destes e de outros oncogenes está associada a outros cancros.

Muitos oncogenes exibem alguma homologia com genes envolvidos no crescimento celular. Por exemplo, ver a tabela abaixo. 11

TABELA CATEGORIA ONCOGENE GENE CELULAR HOMÓLOGO Factores de Crescimento PDGF-/2 tipo FGF Factores de crescimento transmembranares ErbB neu (erbB-2 HER-2 Fms ros, kit e outros receptor do EGF receptor do M-CSF Tirosina-quinases associadas a membranas abl Proteínas de ligação ao nucleótido guanina associadas a membranas família2 src fes.fps3 K-, N- e H-ras Serina-treonina quinases citoplasmáticas Raf/mil mos Receptores de hormonas citoplasmídicas erbA Receptor da hormona da tiróide Factores nucleares c-myc, N-myc, L-myc, fos, jun, myb, ets, ski e outros Anti-oncogenes RB Outros Bcl-2 Bcl-1 Int-1 1Adaptado de Druker, B.J., et al., N. Eng. J. of Mol. 321: 1383-1392 (1989). PDGF designa factor de crescimento derivado de plaquetas, FGF factor de crescimento de fibroblastos, EGF factor de crescimento epidérmico e M-CSF factor de crescimento de fagócitos mononucleares. 2A família inclui src, fgr, yes, lck, hck, fyn, lyn e tkl. 3A localização subcelular destes produtos de oncogenes é incerta

Foram relatados anticorpos para a maior parte destes oncogenes. Para além da super-expressão de oncogenes (por vezes referidos como oncs), alguns oncogenes sofrem uma mutação de um proto-onc (gene normal para proteína normal) num onc (gene cuja proteína pode causar transformação maligna), o que parece resultar em transformação maligna de células. Por exemplo, mutações pontuais do gene ras nos codões para a p21 da ras nas posições dos resíduos 12, 13 e 61 resultaram em proteínas p21 da ras mutantes que estão 12 associadas a vários cancros. Conhecem-se anticorpos específicos para muitos destes mutantes da ras.

De modo semelhante, a expressão de proteínas virais pode conduzir a doenças que resultam em enfermidade e mesmo morte. 0 vírus pode consistir em vírus de RNA ou DNA. Por exemplo, um tipo de vírus de RNA, retrovírus, é tipicamente classificado como fazendo parte de uma de três sub-famílias, nomeadamente oncovírus, spumavírus e lentivírus. A infecção por oncovírus está tipicamente associada a perturbações malignas. As proteínas virais codificadas incluem gag, pol e do envelope. Nalguns casos, o vírus contém oncogenes que codificam uma proteína capaz de proceder à transformação maligna de uma célula em cultura. Os lentivírus resultam em infecção que é geralmente lenta e causam doenças debilitantes crónicas após um longo período de latência. Adicionalmente, os genes que codificam as proteínas estruturais gag, pol e do envelope também codificam uma variedade de proteínas reguladoras. 0 RNA e/ou DNA do vírus pode tomar conta da maquinaria da célula para produzir a proteína codificada de modo virai.

Por exemplo, o HTLV-1 é um retrovírus que é o agente etiológico de leucemia-linfoma de células T do adulto (ATLL), um neoplasma agressivo de células T CD4+ [Poiesz, B.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 1J_: 7415-7419 (1980)]. As proteínas virais expressas por esse vírus resultam na transformação da célula. Os genes e produtos genéticos de tax e rex parecem ser importantes no que se refere à tumorigenicidade. Assim, são um agrupamento preferido de moléculas-alvo. 13 0 HIV constitui uma família de lentivírus, incluindo o HIV-1 e HIV-2, que são os agentes etiológicos de doenças de imunodeficiência, como a síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) e perturbações relacionadas [Barre-Sinoussi et al., Science 220: 868-871 (1983); Gallo et al.r Science 224: 500-503 (1984); Levy et al., Science 225: 840-842 (1984); Popovic et al.r Science 224: 497-500 (1984)]. O Vírus de Epstein-Barr foi associado a alguns tumores, como surtos seleccionados de linfoma de Burkitt, cancro nasofaríngeo e linfomas B em indivíduos com imunossupressão [zur Hausen, H., Science 254: 1167-1173 (1991)]. O vírus da Hepatite B foi associado a cancro hepatocelular [zur Hausen, Science, supra]. Em particular, parece estar envolvida a fase de leitura aberta X do vírus [Ibid]. Em conformidade, será preferível no presente método um anticorpo que aborde selectivamente esta região ou produtos de expressão desta região.

Os papilomavírus foram associados a cancro anogenital [Ibid] . Nestes vírus, os genes E6 e E7 parecem estar envolvidos e serão bons alvos.

Através da ligação intracelular a ácidos nucleicos, como um provírus de DNA, pode ser prevenida ou inibida a integração do vírus na célula. Através da ligação ao RNA do vírus é possível interferir na sua expressão de proteínas virais. Foram extensamente estudados anticorpos anti-nucleótidos [Van Es, J.H., et al., J. of Immun. 149: 2234-2240 (1992); Brigido, M.M., et al., J. of Immun. 150: 469- 479 (1993); Stollar, B.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 4469-4473 (1986); Eilat, D., et al., J. of Immun. 14 141: 1745-1753 (1988); Brigido, Μ.M., et al., J. of Immun. 146: 2005-2009 (1991)] e os anticorpos partilham as mesmas caracteristicas básicas.

Estes anticorpos podem ser produzidos e/ou rastreados por técnicas comuns, tal como utilizando uma sequência de nucleótidos, como RN A, para rastrear uma biblioteca contendo anticorpos [Tsai, D.E. , et al., J. of Immun. 150: 1137-1145 (1993); Okano, Y., et al., J. of Immun. 149:

1093-1098 (1992); Tsai, D.E., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 8864-8868 (1992)].

Também é possível, preferivelmente, seleccionar e/ou conceber anticorpos para abordar selectivamente e interferir num sítio de ligação importante de ácidos nucleicos. Por exemplo, o elemento TAR dos vírus da imunodeficiência de primatas. Esta sequência de ácido nucleico está presente na 5' LTR e responde à tat, resultando em expressão intensificada da proteína virai.

Através da ligação intracelular destes oncogenes e vírus a proteínas-alvo é possível inactivar o funcionamento normal dessas proteínas, reduzindo ou evitando o efeito destrutivo da proteína.

Por exemplo, a ligação a uma proteína que tem de ser suplementarmente processada, como uma proteína receptora, uma proteína do envelope virai, por exemplo, gpl60 do HIV, pode reduzir significativamente a clivagem da proteína nos seus componentes activos. Como outro exemplo, a proteína capsídica, por exemplo, a proteína capsídica do HIV, é modificada de forma co-tradução pela adição do ácido gordo, o ácido mirístico. Aparentemente, o ácido mirístico está 15 envolvido na ligação da proteína precursora capsídica à superfície interna de células. Em provírus do HIV que foram alterados de modo a não serem capazes de adicionar este ácido mirístico, o provírus não é infeccioso. Estudos do processo de miristilação revelam um requisito de glicina na posição dois desde o terminal amino e também em resíduos de aminoácidos em seis até dez aminoácidos desde o sítio da miristilação. Assim, a ligação de um anticorpo à proteína nestes sítios e perto destes pode inactivar a miristilação.

De modo semelhante, a ligação a uma proteína que tenha um domínio externo importante pode restringir o efeito da proteína.

Noutra especificação, através da ligação a uma proteína receptora disfuncional é possível bloquear as interacções indesejadas que podem resultar em disfunção celular, como transformação maligna.

Por exemplo, muitas proteínas, como receptores de superfície, proteínas transmembranares, etc., são processadas através do retículo endoplasmático (por vezes referido como ER) - aparato de Golgi. Exemplos dessas proteínas incluem neu, glicoproteínas do envelope, como as dos lentivírus de primatas, por exemplo, HIV-1 ou HIV-2. Através da utilização de anticorpos que possam ser distribuídos nessa região da célula e ser específicos para uma proteína particular é possível inactivar a função dessa proteína sem inactivar outras funções celulares. Por exemplo, os factores PDGF-/2 e tipo FGF produzidos por sis e int-2 passam através do ER. Estes factores estão envolvidos em muitos cancros. Assim, para além de abordar selectivamente o receptor, é possível abordar 16 selectivamente os factores de crescimento utilizando anticorpos para aqueles.

Os factores de crescimento também são expressos por muitas células malignas diferentes, tais como de tumores de síndromas carcinóides, e estas seriam outro alvo.

Também pode utilizar-se este método para inactivar uma função que é indesejável numa altura particular. Por exemplo, as moléculas de MHC de classe I e classe II são importantes no reconhecimento de antigenes pelos sistemas imunológicos [Teyton, L., et al., The New Biologist 4_: 441-447 (1992); Cox, J.H., et al., Science 247: 715-718 (1990); Peters, P.J., et ai., Nature 349: 669-676 (1991); Hackett, Nature 349: 655-656 (1991)]. No entanto, esse reconhecimento imunológico, particularmente de moléculas de MHC de classe II, pode causar problemas, tais como em transplantes de órgãos [Schreiner, G.F., et al., Science 240: 1032-1033 (1988)]. Assim, ao abordar selectivamente moléculas de classe II com transplantes de órgãos é possivel regular negativamente a resposta imunológica do hospedeiro. Preferivelmente, estas moléculas podem ser abordadas selectivamente em diferentes alturas da sua via de processamento. Preferivelmente, utiliza-se um promotor indutivel para o gene do anticorpo.

Assim, ao tomar em consideração o alvo particular, o técnico experimentado pode conceber muitas variações deste método.

Por exemplo, o gene do envelope do HIV-1 dirige a sintese de uma poliglicoproteina precursora denominada gpl60. Esta proteína é modificada pela adição de múltiplos 17 açúcares N-ligados à medida que entra no retículo endoplasmático [Allan, J.S., et al., Science 228: 1091-1094 (1985); Robey, W.G., Science 228: 593-595 (1985); DiMarzo-

Veronese, F., et al.r Science 229: 1402-1405 (1985);

Willey, R.L., Cell Biol. 8_5: 9580-9584 (1988)]. Em seguida, o precursor da proteína do envelope glicosilado é clivado no aparato de Golgi, dando origem a uma proteína do envelope madura constituída por uma glicoproteína exterior, gpl20, e uma proteína transmembranar, gp41 [Willey, Cell Biol., supra; Stein, B.S., et al., J. Biol. Chem. 2 65: 2640-2649 (1990); Earl, P.L., et al., J. Virol. 65: 2047- 2055 (1991)]. O complexo da glicoproteína do envelope é ancorado ao envelope do virião e infecta membranas celulares pela gp41 através de interacções não covalentes [DiMarzo-Veronese, Science, supra; Gelderblom, H.R., et al., Lancet úi: 1016-1017 (1985)]. Após a ligação da glicoproteína exterior gpl20 ao receptor CD4, a fusão das membranas virai e da célula-hospedeiro permite a entrada do vírus [Stein, B.S., Cell 4_9: 659-668 (1987)]. Pensa-se que o domínio fusogénico do complexo gpl20/gp41 reside no terminal amino da gp41 porque esta região exibe homologia de sequências com um domínio fusogénico de outras proteínas virais [Gallaher, W.R., Cell 5_0: 327-328 (1987); Gonzalez-

Scarano, F., AIDS Res. Hum. Retrovir. _3: 245-252 (1987)] e porque mutações nesta região inactivam o vírus e evitam a fusão virai [Kowalski, M., et al., Science 237: 1351-1355 (1987); Kowalski, M., et al., J. Virol. ú5: 281-291 (1991); McCune, J.M., et al., Cell 5_3: 55-67 (1988)].

Enquanto a gpl20 e gp41 processadas são transportadas para a superfície da célula e segregadas como parte do virião do vírus, por vezes referidas como partículas virais, a gpl60 não clivada é distribuída em lisossomas 18 para degradação. Normalmente, o processo de clivagem é relativamente ineficaz. Assim, o método que consiste em utilizar anticorpos intracelulares para se ligarem à gpl60 sintetizada de novo no lúmen do retículo endoplasmático e inibirem o seu transporte para o aparato de Golgi reduz grandemente a quantidade de proteína disponível para a clivagem em gpl20 e gp41. Em conformidade, as partículas virais produzidas têm quantidades muito decrescidas de gpl20 e gp41 na sua superfície. Essas partículas não são consideradas infecciosas. Esta discussão das proteínas gpl60/120/41 do HIV-1 é exemplificativa de outras proteínas do envelope e proteínas processadas. As mesmas técnicas utilizadas aqui podem ser adaptadas por técnicas conhecidas com base na presente revelação.

Adicionalmente, a proteína do envelope dos vírus da imunodeficiência foi implicada noutros aspectos da doença [DeRossi, A., et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. 8_3: 4297-4301 (1986)].

Por exemplo, a infecção de culturas de células pelo HIV gera, tipicamente, uma infecção aguda e/ou crónica. Em ambos os casos é produzido vírus, sendo libertado por brotamento na membrana celular. Uma infecção aguda é tipicamente caracterizada por um efeito citopático, manifestado por vacuolização de células e formação de sincícios e, consequentemente, lise celular [Laurent-Crawford, Virol. 185: 829-839 (1991)]. Em culturas de tecidos, os efeitos citopáticos do HIV-1 consistem em formação de células gigantes multinucleadas (sincícios) e lise de células isoladas [Popovic, M., Science 224: 497-500 (1984); Somasundarin, M., et al., J. Virol. _61: 3114-3119 (1987)]. A formação de sincícios é mediada apenas pela 19 proteína do envelope do HIV-1 expressa na superfície da célula infectada [Sodroski, J., et al., Nature 322: 470-474 (1986); Lifson, J.D., et al., Nature 323: 725-728 (1986)]. O envelope liga-se ao receptor CD4 presente em células adjacentes e depois, via uma reacção de fusão análoga à envolvida na entrada do vírus, as membranas celulares reunidas são fundidas, formando-se heterocariontes. A lise de células isoladas também depende de uma fusão membranar eficiente induzida pelas glicoproteínas do envelope, uma vez que algumas mutações no terminal amino da gp41 resultam em vírus competentes para replicação que estão atenuados quanto à formação de sincícios e lise de células isoladas [Kowalski, M.L., et al., J. Virol. 65, supra (1991)]. Também foi relatado que alterações de aminoácidos na gpl20 que processam o precursor gpl60 podem diminuir a lise de células isoladas [Stevenson, M., et al., J. Virol. _64_: 3792-3803 (1990)] e que a lise de células isoladas requer níveis adequados de expressão de CD4 independentemente do nível de expressão de proteínas virais ou de DNA virai na célula infectada [De Rossi, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, supra].

Adicionalmente, a glicoproteína do envelope do HIV foi implicada, por algumas pessoas diferentes, na explicação do inicio da imunodeficiência associada em indivíduos infectados. Siliciano, R.F., et al. [Cell 5_4: 561-575 (1988)] mostraram que um subconjunto de clones específicos da gpl20 CD4+ manifestou actividade citolítica e lise de células T CD4+ autólogas não infectadas na presença da gpl20 num processo que depende estritamente da captação de gpl20 por células T mediada por CD4. Uma vez que a gpl20 pode ser libertada de células infectadas, este mecanismo 20 autocitolítico dependente de CD4 pode contribuir para a depleção profunda de células T CD4+ em pacientes com SIDA. Kion, T.A., et al. [Science 253: 1138-1140 (1991)] e Hoffman, G.W., et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_8: 3060-3064 (1991)] mostraram que se desenvolve uma rede idiotipica autoimune em infecções pelo HIV-1 conducente ao desenvolvimento de anticorpos autoimunes que destroem células T CD4+. Desenvolve-se este mecanismo autoimune devido às homologias de sequências entre a gpl20 e moléculas de MHC de classe II [Young, J.A.T., Nature 333: 215 (1988)]. Foram demonstrados efeitos imunossupressores da gpl20 sobre a proliferação de células T CD4+ em resposta a estímulos antigénicos [Hoxie, J.A., et al., Science 234: 1123-1127 (1986); Diamond, D.C., et al., J. Imnunol. 141: 3715-3717 (1988); Gurley, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 1993-1997 (1989); Crise, B., et al., J. Virol. 66: 2296-2301 (1992)]. Estes estudos sugerem que doenças de imunodeficiência, como a provocada pelo HIV-1, podem afectar o reconhecimento de antigenes restringidos ao complexo principal de histocompatibilidade II independentemente da perda de células T CD4+. Em neurónios de roedores, foi mostrado que a gpl20 provoca um aumento do cálcio intracelular e toxicidade neuronal [Dreyer, E.B., et al., Science 248: 364-367 (1990)], um efeito que poderá ser mediado por activação da endonuclease nuclear. Adicionalmente, também foi proposta a ocorrência da morte de células T induzida por activação, ou apoptose, in vivo, sendo responsável pela depleção progressiva de células T CD4+ que conduz a SIDA [Groux, H., et al., J. Exp. Med. 175: 331-340 (1992); Meyaard, L., et al., Science 257: 217-219 (1992) ] . A gpl20 solúvel in vitro e in vivo pode interagir com receptores CD4 em células não infectadas, conduzindo a uma activação celular abortada e, desse modo, 21 desencadeando a apoptose [McConkey, D.J., et al., Immunol. Today 1_1: 120-121 (1990); Pinching, A.J., et al., Immunol. Today ]A: 256-259 (1990); Newell, M.K., et al., Nature 347; 286-289 (1988)]. Também foi proposto que a glicoproteína do envelope pode actuar como super-antigene, ligando-se apenas à região β variável do receptor de antigenes de células T, desse modo induzindo estimulação maciça e expansão dessas células T seguido de deleção ou anergia. Pantaleo, G., et al., N. Eng. J. of Med. 238: 327-335 (1993) . Assim, ao diminuir a quantidade de gpl20, os efeitos associados à SIDA podem ser atenuados e retardados.

Como será aqui discutido mais pormenorizadamente, determinámos que a expressão intracelular de um anticorpo para o seu alvo, por exemplo, o anticorpo para a glicoproteína do envelope ou o anticorpo para a proteína tat do HIV, resulta num anticorpo que se liga ao alvo, por exemplo, a glicoproteína do envelope ou proteína tat, respectivamente, na célula e previne o processamento suplementar. O presente método é altamente específico e não afecta adversamente o funcionamento celular. Assim, uma proteína do envelope mutante que contenha uma única mutação pontual que anula a capacidade da proteína para se ligar ao seu anticorpo será processada normalmente em células que expressam a proteína de forma constitutiva. De modo semelhante, anticorpos de cadeia única para outras proteínas não afectarão o processamento da proteína do envelope. Em consequência, a presente metodologia permite utilizar um anticorpo específico para uma proteína particular e resulta num processo que pode ser concebido para doenças específicas. Adicionalmente, a metodologia pode ser utilizada profilacticamente. Pode mesmo colocar-se o anticorpo sob o controlo de um promotor que será 22 especificamente activado pelo alvo (por exemplo, uma LTR do HIV) , desse modo ligando o anticorpo só quando o alvo estiver presente. Outros tipos de promotores indutiveis são conhecidos na área e podem ser seleccionados e utilizados com base na presente revelação. A utilização dos presentes anticorpos não afecta o processamento de outras proteínas. Por exemplo, o anticorpo para a glicoproteína do envelope do HIV não se liga a outras glicoproteínas do envelope e não previne o processamento dessa proteína. Por exemplo, o processamento de glicoproteínas do envelope não relacionadas, como a glicoproteína do envelope do Bunyavírus, não será afectado. Mostrámos que células que são sujeitas ao presente método, por exemplo, por distribuição intracelular de um anticorpo para a proteína do envelope de modo a produzir uma célula que expressa constitutivamente esse anticorpo, resultam numa redução de 1 000 até 10 000 vezes da actividade de partículas virais produzidas em comparação com o vírus de células paternas.

Muitos outros sítios podem ser abordados selectivamente. Por exemplo, a abordagem selectiva do lado citoplasmático de um receptor membranar. A transdução do sinal ocorre através da cauda citoplasmática [Luttrell, L.M., et al., Science 259: 1453-1457 (1993); Epstein, R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10435-10439 (1992)]. Por exemplo, ao utilizar o receptor neu/erbB-2 ou receptor da proteína G é possível abordar selectivamente o laço ou cauda citoplasmática, desse modo prevenindo essa transdução do sinal. Por exemplo, utilizam-se preferivelmente anticorpos para receptores activados, tal como para 23 aminoácidos fosforilados. Assim, a reunião de receptores-alvo pode ser reduzida.

Os anticorpos ligar-se-ão especificamente ao alvo, por exemplo, uma proteína, e, assim, podem competir eficazmente com outras moléculas que também formarão complexos com a proteína. Para assegurar que os anticorpos da presente invenção podem competir com êxito com outras moléculas, aqueles devem reter pelo menos cerca de 75% da eficácia de ligação do anticorpo completo para esse alvo, isto é, com regiões constantes e variáveis. Mais preferivelmente, tem pelo menos 85% da eficácia de ligação do anticorpo completo. Ainda mais preferivelmente, tem pelo menos 90% da eficácia de ligação do anticorpo completo. Ainda mais preferivelmente, tem pelo menos 95% da eficácia de ligação.

Desenvolvemos um método que é amplamente aplicável a uma gama grande de moléculas-alvo , incluindo proteínas, RN A, DNA, haptenos, fosfolípidos, hidratos de carbono, etc. , como será discutido abaixo.

As moléculas-alvo podem estar presentes numa gama ampla de hospedeiros. Por exemplo, animais, pássaros e plantas. Preferivelmente, o alvo consiste em animais, incluindo humanos. Mais preferivelmente, a espécie é industrialmente importante, como aves domésticas, porcos, gado, vacas, ovelhas, etc. Muito preferivelmente, a espécie consiste em humanos.

Apesar dos anticorpos conseguirem reconhecer um número quase ilimitado de moléculas estranhas, na natureza, os anticorpos reconhecem estruturas exteriores à célula [Winter, G., et al., Nature 34 9: 293 (1991)]. Depois de 24 serem sintetizados, os anticorpos são segregados para o fluido envolvente ou permanecem ligados à membrana exterior da célula [Klein, "Immunology" Blackwell Scientific Publications, Cambridge, MA 1990] . Descobrimos um meio para expressar anticorpos que retêm a capacidade para se ligarem especificamente a um alvo intracelularmente.

Assim, pode obter-se especificidade para um alvo particular utilizando o próprio sistema imunológico. Para gerar um anticorpo utiliza-se o alvo ou uma respectiva porção antigénica ou um complexo hapteno-transportador. Isto pode ser feito por técnicas comuns.

Por exemplo, as regiões de ligação de antigenes ou variáveis são formadas pela interacção dos dominios pesado variável (VH) e leve variável (VL) nos terminais amino das cadeias. O fragmento mais pequeno contendo um sitio de ligação completo é referido como Fv e é um heterodímero dos domínios VH e VL. No entanto, é possível obter ligação sem um sítio de ligação completo. Por exemplo, pode obter-se actividade de ligação de antigenes utilizando apenas um domínio de ligação da cadeia pesada (dAbs, também referidos como anticorpos de um único domínio) . Como dito acima, na presente invenção, pode utilizar-se um gene que codifica para esse fragmento de anticorpo, desde que retenha capacidade de ligação suficiente em comparação com o anticorpo paterno. Preferivelmente, utiliza-se pelo menos um heterodímero de VH e VL (Fv) . A determinação das estruturas tridimensionais de fragmentos de anticorpos por cristalografia de raios X conduziu ao entendimento de que cada um dos domínios variáveis está dobrado numa estrutura característica 25 composta por nove filamentos de folhas β estreitamente empacotadas. A estrutura mantém-se apesar da variação de sequências nos domínios VH e VL [Depreval, C., et al.r J. Mol. Biol. 102; 657 (1976); Padlan, E.A., Q. Rev. Biophys. 10: 35 (1977)]. A análise de dados de sequências primárias de anticorpos permitiu determinar a existência de duas classes de sequências de regiões variáveis. Sequências hipervariáveis e sequências de arcabouço ("framework") [Kabat, E.A., et al., "Sequences of Protein of Immunoloqical Interest" 4a edição, U.S. Dept. Health and Human Services (1987)]. As sequências de arcabouço são responsáveis pelo dobramento correcto em folhas β dos domínios VH e VL e pelas interacções inter-cadeias que reúnem os domínios. Cada domínio variável contém três sequências hipervariáveis que aparecem como laços. As seis sequências hipervariáveis da reqião variável, três da VH e três da VL, que formam o sítio de ligação de antigenes são referidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs).

Ao clonar os genes das regiões variáveis para ambas as cadeias VH e VL de interesse é possível expressar estas proteínas em bactérias e testar rapidamente a sua função. Um método consiste em utilizar mRNA de hibridoma ou mRNA esplénico como modelo para a amplificação por PCR desses genes [Huse et al., Science 246: 1276 (1989)]. Assim, é possível rastrear facilmente um anticorpo para assegurar que tem afinidade de ligação suficiente para o antigene. A afinidade de ligação (Kd) deve ser pelo menos cerca de 10”7 1/M, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10”8 1/M. A Figura 1 mostra os genes de imunoglobulinas e a localização de "primers" de PCR. Ilustram-se os genes de 26 imunoglobulinas da cadeia leve e pesada com os segmentos V, D e J anotados, bem como as regiões constantes. Também estão representadas as regiões CDR. Os "primers" para amplificação por PCR podem consistir em RNA ou DNA genómico, como mostrado para a amplificação dos genes Fv e Fab.

Numa especificação preferida, os genes que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada codificam um agente de ligação para perfazer um anticorpo de cadeia única (sFv). 0 sFv dobrar-se-á apropriadamente mesmo nas condições redutoras por vezes encontradas intracelularmente. 0 sFv compreende, tipicamente, um único péptido com a sequência VH-agente de ligação-VL ou VL-agente de ligação-VH. 0 agente de ligação é escolhido de modo a permitir a ligação da cadeia pesada e da cadeia leve na sua orientação conformacional apropriada. Ver, por exemplo, Huston, J.S., et ai., Methods in Enzym. 203: 46-121 (1991). Assim, o agente de ligação deve conseguir abranger a distância de 3,5 nm entre os seus pontos de fusão para os domínios variáveis sem distorcer a conformação do Fv nativa. Os resíduos de aminoácidos que constituem o agente de ligação devem ser tais que conseguem abranger esta distância e deve consistir em 5 aminoácidos ou mais. Também é necessário seleccionar os aminoácidos escolhidos de modo que o agente de ligação seja hidrófilo, para que não fique enterrado no anticorpo. Preferivelmente, o agente de ligação deve ter pelo menos cerca de 10 resíduos de comprimento. Ainda mais preferivelmente, deve ter cerca de 15 resíduos. Se bem que o agente de ligação não deva ser demasiado pequeno, também não deve ser demasiado grande de modo a poder resultar em interferência estérica com o sítio de combinação. Em consequência, deve ter preferivelmente 25 resíduos ou 27 menos. 0 agente de ligação (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 (ID SEQ NO: 1) é um agente de ligação preferido amplamente aplicável a muitos anticorpos, pois proporciona flexibilidade suficiente. Outros agentes de ligação incluem:

Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (ID SEQ NO: 2), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (ID SEQ NO: 3), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gin (ID SEQ NO: 4), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Vai Asp (ID SEQ NO: 5), Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly (ID SEQ NO: 6), Lys Glu Ser Gly Ser Vai Ser Ser Glu Gin Leu Ala Gin Phe Arg Ser Leu Asp (ID SEQ NO: 7), e Glu Ser Gly Ser Vai Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp (ID SEQ NO: 8). Alternativamente, pode escolher-se um 15-mero, tal como o agente de ligação (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (ID SEQ NO: 1) , apesar de se poder utilizar qualquer sequência e, por mutagénese, distribuir aleatoriamente os aminoácidos no agente de ligação; depois, com vectores de expressão em fagos, escolher os anticorpos com os diferentes agentes de ligação e rastrear quanto ao anticorpo de cadeia única de afinidade mais elevada gerado.

Preferivelmente, não se utilizam nucleótidos que codifiquem a região constante completa dos anticorpos. Mais preferivelmente, o gene codifica menos de seis aminoácidos da região constante.

Como discutido acima, o sistema imunológico pode preparar o anticorpo que se irá ligar a uma molécula específica, como uma proteína-alvo, por técnicas imunológicas comuns. Por exemplo, utilizando a proteína ou um respectivo fragmento imunogénico ou um péptido 28 sintetizado quimicamente com base nessa proteína. Qualquer uma destas sequências pode ser conjugada, se desejado, a hemocianina de lapa californiana (KLH) e utilizada para dirigir um anticorpo em animais tais como ratinhos, coelhos, ratos e hamsters. Em seguida, os animais são sacrificados, obtendo-se os seus baços. São produzidos anticorpos monoclonais utilizando técnicas comuns de fusão para formar células de hibridoma. Ver Kohler, G., et al., Nature 256: 495 (1975). Tipicamente, este procedimento envolve fundir uma célula produtora de anticorpos (isto é, baço) com uma linha celular imortalizada, como células de mieloma, para produzir a célula híbrida.

Outro método de preparação de anticorpos utiliza técnicas de imunização in vitro, tal como utilizar células do baço, por exemplo, uma cultura de células de baço murino, injectar um antigene e depois rastrear quanto a um anticorpo produzido por esse antigene. Com este método podem utilizar-se apenas 0,1 microgramas de antigene, embora seja preferido cerca de 1 micrograma/mililitro. Para a imunização in vitro, células de baço são recolhidas, por exemplo, células de baço de ratinhos, e são incubadas na quantidade desejada, por exemplo, 1 x 107 células/mililitro, em meio mais o antigene desejado numa concentração tipicamente próxima de 1 micrograma/mililitro. Em seguida, adiciona-se à cultura de células um de vários adjuvantes, dependendo dos resultados do ensaio de placas imunológicas com filtros. Estes adjuvantes incluem N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina [Boss, Methods in Enzymology 121: 27-33 (1986)]. Mitogene de Salmonella typhimurium ["Technical Bulletin", Ribi ImmunoChem. Res. Inc., Hamilton, Montana] ou acondicionamento de células T, que podem ser produzidos por técnicas convencionais [ver 29

Borrebaeck, C.A.K., Mol. Immunol. 2_1: 841-845 (1984); Borrebaeck, C.A.K., J. Immunol. 136: 3710-3715 (1986)] ou obtidos comercialmente, por exemplo, da Hannah Biologics, Inc., ou Ribi ImmunoChem. Research Inc. As células do baço são incubadas com o antigene durante guatro dias e depois são colhidas.

Em seguida, suspensões de células isoladas das células de baço de ratinho imunizadas in vitro são incubadas, por exemplo, em membranas de antigene-nitrocelulose em placas de microfiltração, como as disponibilizadas pela Millipore, Corp. Os anticorpos produzidos são detectados utilizando uma etiqueta para os anticorpos, como anticorpo secundário etiquetado com peroxidase de rábano bravo, como IgA, IgG e IgM de coelho anti-ratinho. Na determinação do isotipo dos anticorpos segregados podem utilizar-se anticorpos específicos para a cadeia pesada de coelho anti-ratinho biotinilados, como os da Zymed Lab., Inc., seguidos de um reagente de peroxidase de rábano bravo-avidina, como o disponibilizado pela Vector Lab.

Os produtos insolúveis da reacção enzimática são visualizados na forma de placas azuis na membrana. Estas placas são contadas, por exemplo, utilizando uma ampliação de 25 vezes. A membrana de nitrocelulose das placas de microfiltração absorve facilmente uma variedade de antigenes, e a unidade de filtração utilizada para o passo de lavagem é preferida porque facilita o ensaio das placas.

Em seguida, procede-se ao rastreio dos anticorpos por técnicas comuns, para encontrar anticorpos de interesse. Culturas contendo os anticorpos de interesse são desenvolvidas e induzidas e os sobrenadantes são passados 30 por um filtro, por exemplo, um filtro de 0,45 micrómetros, e depois por uma coluna, por exemplo, uma coluna de afinidade de antigenes ou uma coluna anti-péptido marcador. Testa-se a afinidade de ligação utilizando uma técnica de filtração em mini-gel. Ver, por exemplo, Niedel, J., Biol. Chem. 256: 9295 (1981). Também pode utilizar-se um segundo ensaio, como um radioimunoensaio utilizando esférulas magnéticas acopladas, por exemplo, a IgG anti-coelho, para separar antigene etiquetado com I livre de antigene etiquetado com 125I ligado a um anticorpo de coelho anti-péptido marcador. Numa alternativa preferida podem medir-se velocidades de "associação" e velocidades de "dissociação" utilizando, por exemplo, um sistema analítico à base de biossensores, como "BIAcore" da Pharmacia Biosensor AB [ver Nature 361: 186-187 (1993)].

Esta última técnica é preferida à imunização in vivo porque o método in vivo requer tipicamente cerca de 50 microgramas de antigene por ratinho por injecção e, habitualmente, fazem-se dois reforços após a imunização primária para o método in vivo.

Alternativamente, é possivel utilizar um anticorpo conhecido para a proteina-alvo. Assim, podem obter-se anticorpos para a proteína-alvo desejada. Depois sintetiza-se, como descrito abaixo, um gene para pelo menos a porção de ligação de antigenes do anticorpo. Nalgumas especificações preferidas, o gene também irá codificar uma sequência de localização intracelular para o retículo endoplasmático, etc. Quando se pretender expressão no sistema secretor de anticorpos normal ER, como o retículo endoplasmático, aparato de Golgi, deverá utilizar-se uma sequência líder. Para reter esses anticorpos num sítio 31 específico utiliza-se uma sequência de localização, como a sequência KDEL.

Podem preparar-se genes de anticorpos com base na presente revelação utilizando técnicas conhecidas.

Ao utilizar qualquer um destes anticorpos podem construir-se genes de VH e VL. Por exemplo, criando bibliotecas de VH e VL de células de baço murino que foram imunizadas pela técnica de imunização in vitro descrita acima ou por imunização in vivo convencional, e de linhas de células de hibridoma que já foram produzidas ou que estão comercialmente disponíveis. Também podem utilizar-se bibliotecas de VH e VL comercialmente disponíveis. Um método envolve utilizar as células de baço para obter mRNA que é utilizado para síntese por cDNA. Pode preparar-se cDNA de filamentação dupla utilizando PCR para amplificar a região variável com um "primer" para a região V N-terminal degenerado e um "primer" para a região J, ou com "primers" específicos para a família VH, por exemplo, ratinho-12, humano-7.

Por exemplo, os genes dos domínios VH e VL de um anticorpo amplamente neutralizador para a glicoproteína do envelope do HIV-1, como F105 [Olshevsky et al., J. Virol. 64: 5701-5707 (1990); Thali et al., J. Virol. 65: 6188-6193 (1991), e Posner et al., J. Immunol. 146: 4325-4332 (1991)] podem ser clonados e sequenciados. O primeiro filamento de cDNA pode ser sintetizado a partir de RNA total utilizando iniciação ("priming") com oligo dT e a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney, de acordo com procedimentos conhecidos. Este primeiro filamento de cDNA é então utilizado para efectuar reacções de PCR. 32

Utilizam-se condições típicas de PCR, por exemplo, 25 até 30 ciclos, para amplificar o cDNA dos genes de imunoglobulina. Seguidamente efectua-se análise de sequências de DNA [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 19_: 5463-5467 (1977)].

Os pares de "primers" para a cadeia pesada consistem num "primer" VH directo e num "primer" JH reverso, cada um contendo sitios de restrição convenientes para clonagem. Por exemplo, pode utilizar-se a base de dados de Kabat de imunoglobulinas [Kabat et al., supra] para analisar a distribuição de aminoácidos e codões presente nas sete famílias distintas de VH humana. A partir daqui é concebido o "primer" 5' VH universal de 35 pares de bases. Pode utilizar-se um "primer" como TTTGCGGCCGCTCAGGTGCA (G/A) CTGCTCGAGTC (T/C) GG (ID SEQ NO: 9) que é degenerado para dois nucleótidos diferentes em duas posições e que irá hibridizar para a extremidade 5' de sequências FR1. Um sítio de restrição, como o sítio 5' Not I (sublinhado à esquerda), pode ser introduzido para clonar o DNA amplificado, estando localizado a 5' do primeiro codão para o gene de VH. De modo semelhante, também pode introduzir-se um segundo sítio de restrição, como um sítio Xhol interno (sublinhado à direita).

De modo semelhante, pode conceber-se um oligonucleótido da região JH com 66 pares de bases para iniciação reversa na extremidade 3' do gene da cadeia pesada variável, por exemploAGATCCGCCGCCACCGCTCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGA GGT GACCGTGACC (A/G) (G/T) GGT (ID SEQ NO: 10) . Este "primer" contém, adicionalmente, uma sequência de 45 nucleótidos que codifica um agente de ligação, como o agente de interligação (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (ID SEQ NO: 1). Este 33 "primer" tem duas posições degeneradas com dois nucleótidos em cada posição, com base na sequência de nucleótidos dos seis minigenes da região JH humana. Podem utilizar-se sitios de restrição; por exemplo, um sitio BspEI (sublinhado à esquerda) é introduzido no agente de interligação para ligação de extremidades coesivas com o "primer" Vkappa directo com sobreposição. Também é introduzido um sitio BsTEII interno (sublinhado à direita) para procedimentos suplementares de permuta de agentes de ligação.

Uma estratégia semelhante, utilizando o agente de interligação de 45 nucleótidos, é incorporada na concepção do "primer" Vkappa humano de 69 nucleótidos. Há quatro famílias de genes Vkappa humanos. 0 "primer" 5' Vkappa GGTGG CGGTGGCTCCGGAGGTGGTGGGAGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTC (G/C)(T/A) G (A/C) TGACCCAGTCTCCA (ID SEQ NO:' 1), que irá hibridizar para a extremidade 5' da sequência FR1, é degenerado em 3 posições (2 nucleótidos cada). A porção do agente de interligação pode conter um sítio BspEI para clonagem de extremidades coesivas com o "primer" JH reverso, e também podem utilizar-se outros sítios de restrição. Também pode introduzir-se um sítio Saci interno (sublinhado à direita) para permitir procedimentos suplementares de permuta de agentes de ligação. 0 "primer" Ckappa reverso de 47 nucleótidos (posições de Kabat 109-113) GGG TCTAGACTCGAGGATCCTTATTAACGCGTTGGTGCAGC CACAGT (ID SEQ NO: 12) é concebido de modo a ser complementar às regiões constantes de cadeias kapa (posições de Kabat 109-113). Este "primer" irá hibridizar para a extremidade mais a 5' da região constante de kapa. O "primer" contém um sítio MluI interno (sublinhado à 34 direita) seguindo dois codões de terminação. Adicionalmente, múltiplos sitios de restrição, como Bam Hl Xhol/Xbal (sublinhados à esquerda) podem ser introduzidos após os codões de terminação em série. Também pode conceber-se um "primer" C-kappa reverso de nucleótidos semelhante, como um "primer" de 59 nucleótidos, que conterá um sinal para um sitio intracelular particular, como um sinal de retenção para o retículo endoplasmático carboxi-terminal, Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (ID SEQ NO: 13) (SEKDEL), GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTTGGTGCAGCCACAGT (ID SEQ NO: 14). Podem introduzir-se sítios de restrição múltipla semelhantes (Bam Hl Xhol/Xbal) após os codões de terminação em série.

Depois de determinada a sequência de nucleótidos primária para os genes da cadeia pesada e kapa e de determinados os genes da linha germinativa, pode então conceber-se um "primer" de PCR com base na sequência líder do gene da linha germinativa VH 71-4. Por exemplo, o "primer" líder de VH 71-4 TTTACCATGGAACATCTGTGGTTC (ID SEQ NO: 15) tem um sítio 5' Ncol (sublinhado). Utiliza-se este "primer" líder (P-L) em conjunção com um segundo "primer" JH para experiências de amplificação por PCR. 0 oligonucleótido da região JH de 35 pares de bases é concebido de modo a conter a mesma sequência para iniciação reversa na extremidade 3' do gene da cadeia pesada variável, TTAGCGCGCTGAGGTGACCGTGACC (A/G)(G/T)GGT (ID SEQ NO: 16).

Este "primer" tem duas posições degeneradas, com dois nucleótidos em cada posição. Um sítio BssH II (sublinhado à esquerda) a 3' e imediatamente adjacente ao codão que determina o último aminoácido da região J permite clonagem conveniente na extremidade 3' do gene de VH. Também se 35 introduz um sítio BstE II interno (sublinhado à direita). Utiliza-se esta sequência para amplificar a sequência VL. Em seguida, os fragmentos amplificados pelos "primers" P-L ("primer" líder) e agente de ligação de P ("primer" reverso) e P-K ("primer" V2) e P-CK ("primer" CK reverso) são clonados num vector de expressão, tal como pRc/CMV (Invitrogen), e o produto recombinante resultante tem um péptido de sinal, agente de ligação inter-cadeias VH e sequências VL sob o controlo de um promotor, como o promotor do CMV. 0 técnico experimentado pode facilmente escolher outros promotores que irão expressar o gene no sistema celular escolhido, por exemplo, uma célula de mamífero, preferivelmente células humanas.

Este anticorpo de cadeia única pode ser preparado, com base na presente revelação, por qualquer um de alguns meios conhecidos. Por exemplo, os fragmentos de PCR Vh/Jh-ICL e ICL-Vkappa/Ckappa são digeridos com Not I/Bsp EI e Bsp El/Xba I, respectivamente, e são clonados num plasmídeo, como pSL1180 (Pharmacia), utilizando como hospedeiros bactérias SURE (Strategy). 0 sFv resultante é digerido com enzimas de restrição e o fragmento Not I/Bgl II é clonado no sítio Not I/Bam Hl que está localizado a 3' do péptido de sinal peLB num vector de expressão pET. Em seguida, o plasmídeo resultante é transformado no hospedeiro apropriado, como BL21 (DE3). Obtêm-se fragmentos plasmídicos após tempos adequados, por exemplo, 2 até 4 horas após indução a 24° com IPTG 0,2 mM, sendo testados quanto à sua capacidade para se ligarem ao seu alvo, por exemplo, actividade de ligação de gpl20, por técnicas comuns, por exemplo, ELISA utilizando placas de ELISA (Dynatech Labs) revestidas com gpl20 (American Biotechnology, Inc.) e detecção com anticorpo de cabra anti-cadeia kapa humana purificado numa 36 coluna de afinidade acoplada a fosfatase alcalina. A gpl20 ligada ao sFv é bloqueada por CD4 solúvel e é absorvida numa coluna de afinidade de gpl20 (Affi-Gel, BioRad, Inc.) e é eluida da mesma.

Os "primers" lider VH 71-4 e Je-BssH II são utilizados para amplificar por PCR um fragmento sem intrões contendo o péptido lider e gene da cadeia pesada rearranjado. 0 fragmento é clonado com extremidades planas, na direcção directa ("forward"), num sitio Eco RV presente num plasmideo, por exemplo, pSL1180. Subsequentemente obtém-se um fragmento Nco I/Bst Eli, que é combinado com o fragmento Bst ΕΙΙ/Sph I, por exemplo, de sFv F105 de pSL1180, numa ligação de três porções, com pSL1180 digerido com Nco I/SpH I, para produzir VH 71-4/SCA. Pode construir-se um VH 71-4 SCA contendo a sequência SEKDEL carboxil-terminal utilizando um produto de PCR ICL-Vkappa-SEKDEL, que é sujeito a tratamento das extremidades e clonado, na direcção directa, num sítio Eco RV em pSL1180. 0 fragmento é removido por digestão com Bsp E I/Xba I e é combinado com o fragmento Nco Ι/Bsp EI de VH 71-4/SCA numa ligação em três partes com pSL1180 digerido com Nco I/Xba I, para produzir VH 71-4/KDEL. Antes da clonagem em pRC/CMV (Invitrogen), um agente de ligação de conversão de Eco RI em Hind III é introduzido em pSL 1180 digerido com Eco RI contendo os dois anticorpos de cadeia única. Subsequentemente, um fragmento Hind III/Xba I de ambos os anticorpos de cadeia única é obtido e clonado em pRC/CMV digerido com Hind III/XBa I, para produzir pRC/SCA e pRC/KDEL.

Ver a Figura 2, que é um diagrama das estruturas de Fv, sFv e sFv-KDEL de um anticorpo amplamente neutralizador, 37 F105. As três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cada cadeia estão sombreadas.

Podem utilizar-se estratégias semelhantes para preparar virtualmente quaisquer outros anticorpos. Por exemplo, utilizando a combinação de purificação de mRNA, sintese de cDNA de filamentação simples e amplificação por PCR utilizando os "primers" degenerados de VH e JH discutidos acima pode obter-se um produto de aproximadamente 350 pares de bases de células de baço imunizadas contra tat e de linhas de células de hibridoma anti-tat. Utilizando as mesmas técnicas, como descrito para cadeias pesadas, pode obter-se um produto do gene Vkappa de 320 pares de bases de células de baço imunizadas contra tat e de linhas de células de hibridoma anti-tat utilizando os "primers" degenerados Vkappa e JkapPa discutidos acima. Depois de obtidos, os domínios VH e VL podem ser utilizados para construir fragmentos sFv, Fv ou Fab.

Um alvo preferido é processado pelo retículo endoplasmático, onde as proteínas são tipicamente produzidas.

No entanto, há casos em que se deseja um grau mais elevado de especificidade intracelular. Por exemplo, na abordagem selectiva de proteínas nucleares, RNA, DNA ou proteínas ou ácidos nucleicos celulares que são subsequentemente processados. Por exemplo, com proteínas codificadas de forma virai, como lentivírus, as proteínas estruturais são tipicamente expressas ao nível citoplasmático, ao passo que proteínas reguladoras podem ser expressas no núcleo ou perto deste. Assim e preferivelmente, utilizam-se sequências de localização para 38 esses alvos. Os nossos anticorpos podem ser distribuídos intracelularmente e aí podem ser expressos e podem ligar-se a uma proteína-alvo.

As sequências de localização foram divididas em sinais de direccionamento ("routing"), sinais de saída, sinais de retenção ou salvamento e sinais de topologia membranar-paragem de transferência [Pugsley, A.P., "Protein Targeting" Academic Press, Inc. (1989)]. Por exemplo, para dirigir o anticorpo para uma localização específica podem utilizar-se sequências de localização específicas. Por exemplo, sinais tais como Lys Asp Glu Leu (ID SEQ NO: 17) [Munro et ai., Cell 48: 899-907 (1987)], Asp Asp Glu Leu (ID SEQ NO: 18), Asp Glu Glu Leu (ID SEQ NO: 19), Gin Glu Asp Leu (ID SEQ NO: 20) e Arg Asp Glu Leu (ID SEQ NO: 21) [Hangej orden et al., J. Biol. Chem. 266: 6015 (1991)], para o retículo endoplasmático; Pro Lys Lys Lys Arg Lys Vai (ID SEQ NO: 22) [Lanford et al., Cell -46: 575 (1986)], Pro Gin Lys Lys Ile Lys Ser (ID SEQ NO: 23) [Stanton, L.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA _83: 1772 (1986)], Gin Pro Lys Lys Pro (ID SEQ NO: 24) [Harlow et al., Mol. Cell Biol. 5: 1605 (1985)], Arg Lys Lys Arg (ID SEQ NO: 56), para o núcleo, e Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala His Gin (ID SEQ NO: 25) [Seomi et al., J. Virology _64 : 1803 (1990)], Arg Gin Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg, Gin Arg (ID SEQ NO: 26) [Kubota et al., Biochem. and Biophy. Res. Comm. 162: 963 (1989)], Met Pro Leu Thr Arg Arg Arg Pro Ala Ala Ser Gin Ala Leu Ala Pro Pro Thr Pro (ID SEQ NO: 27) [Siomi et al., Cell 55: 197 (1988)] para a região nucleolar; Met Asp Asp Gin Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gin Leu Pro (ID SEQ NO: 28) [Bakke et al., Cell 63: 707-716 (1990)] para o compartimento endossomal. Quanto à abordagem selectiva de lipossomas ver Letourneur et al., 39

Cell 6_9: 1183 (1992) . Podem utilizar-se sequências de miristoilação para dirigir o anticorpo para a membrana do plasma. A Tabela I apresenta as sequências amino-terminais de N-miristoil-proteinas conhecidas e a sua localização subcelular. Adicionalmente, como mostrado na Tabela I abaixo, podem utilizar-se sequências de miristoilação para dirigir os anticorpos para diferentes localizações subcelulares, como a região nuclear. Também podem utilizar-se sequências de localização para dirigir anticorpos para organelos, como as mitocôndrias e o aparato de Golgi. A sequência Met Leu Phe Asn Leu Arg Xaa Xaa Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg His Gly His Asn Phe Met Vai Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gin Pro Leu Xaa (ID SEQ NO: 29) pode ser utilizada para dirigir o anticorpo para a matriz mitocondrial (Pugsley, supra). Ver Tang et ai., J. Bio. Chem. 207: 10122 quanto à localização de proteínas no aparato de Golgi.

Mostrámos que, ao utilizar sequências de localização, é possivel que os anticorpos sejam expressos e/ou fiquem retidos numa região intracelular onde normalmente não aparecem. Por exemplo, após a expressão, retivemos um anticorpo para tat no ER. De modo semelhante, expressámos anticorpos anti-envelope do HIV e anti-tat no citoplasma.

Para demonstrar que anticorpos de cadeia única podem ser expressos numa região intercelular onde normalmente não aparecem, expressámos anticorpos no citoplasma. Por exemplo, utilizando anticorpos expressos de forma citoplasmática que foram modificados na extremidade 3' de modo a incluírem sinais de localização adicionais, por exemplo, o sinal de localização nuclear do SV40 para expressão no núcleo ou relocalização no núcleo. Por exemplo, o anticorpo de cadeia única F105, que é 40 tipicamente expresso no ER, foi novamente amplificado, contendo um novo "primer" 5' que hibridiza para a região de arcabouço 1 do anticorpo. Em consequência, não contém o péptido lider, mas contém um sinal forte de começo da iniciação com uma metionina extra na extremidade 5' como codão de inicio. Este "primer" tem um sitio HindIII na extremidade 5', seguido do sitio Ncol que contém o codão de inicio Met. TTT-AAG-CTT-ACC-ATG-GCC-CAG-GTG-CAG-CTG-CAG-GAG-TCG-GG (ID SEQ NO: 57) e codifica para Met Ala Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly (ID SEQ NO: 58) . Para além dessa metionina, que está bem no meio do sitio Ncol, há um aminoácido adicional, Ala. Na extremidade carboxi do péptido de sinal para a expressão bacteriana há uma clivagem Ala-Met-Ala. A clivagem para o periplasma ocorre imediatamente após o segundo Ala e antes do primeiro aminoácido do arcabouço. Assim, é um "primer" versátil que pode ser utilizado ou modificado e utilizado em muitas situações. Por exemplo, pode partir-se do sitio Ncol pela endonuclease apropriada e cloná-lo num vector de expressão bacteriano. O mesmo "primer" pode ser reutilizado para amplificar ou para recolher o material amplificado que ainda tem o sitio HindIII e digeri-lo com HindIII. Assim, temos um anticorpo de cadeia única com a metionina adicional, bem como um Ala na extremidade 5', que pode ser clonado num vector, como o vector de expressão pRC/CMV, transfectado com lipofecção, etiquetado de forma radioactiva com 35S metionina e imunoprecipitado com anticorpo anti-kapa. Utilizámos a técnica e obtivemos expressão de um anticorpo para envelope no citoplasma. Pode utilizar-se esta estratégia básica e modificar o anticorpo com a finalidade de dispor também de um sinal de localização para transportar o anticorpo expresso para um alvo desejado. Por exemplo, utilizando um anticorpo de 41 cadeia única, como o anticorpo para tat, e amplificando-o novamente na extremidade 5' com um "primer" que hibridiza para a região 1 de arcabouço da região variável e que tem um residuo metionina para um codão de inicio e um sitio HindIII para clonagem. Em seguida, este gene do anticorpo é novamente amplificado para clonagem e expressão em pRC/CMV. Adicionalmente, esse anticorpo é suplementarmente modificado de modo que, para além de utilizar esse novo "primer" 5' para expressão citoplasmática, o terminal C contenha o sinal de localização nuclear do SV40. Assim, o anticorpo pode ser expresso no citoplasma e, nos casos em que também utilizámos, por exemplo, o sinal de localização nuclear do SV40, transportado para o núcleo.

Utilizámos estas duas formas do anticorpo, bem como dois controlos negativos. Os controlos negativos incluem diferentes cadeias kapa que foram amplificadas a partir do mesmo mieloma. Preparámos várias construções de anticorpos de cadeia única anti-tat aptas a serem expressas no citoplasma. A partir da linha de células de mieloma, que produz o anticorpo monoclonal anti-tat, também foram amplificados dois anticorpos de cadeia única diferentes, contendo as diferentes cadeias kapa, com a sequência de localização nuclear do SV40. Assim, preparámos anticorpos de cadeia única para serem expressos no citoplasma com ou sem um sinal de localização nuclear. Para mostrar a especificidade do anticorpo também se utilizou a cadeia leve incorrecta. As quatro formas desse anticorpo foram expressas em células eucarióticas. Nestas experiências, os quatro plasmideos diferentes foram transfectados em células COS, e estas experiências foram realizadas com e sem co-expressão de um plasmídeo de expressão deque expressa a tat. 0 anticorpo do envelope KDEL foi instável até o 42 ligando ou a gpl20 se ter ligado a ele, de modo que confirmámos que o mesmo poderia ocorrer no citoplasma. Os quatro anticorpos foram expressos com e sem tat. Ao imunoprecipitar esses lisatos etiquetados de forma radioactiva de células COS com uma reunião de imunoglobulinas de coelho anti-ratinho e por autorradiografia, parece que, na presença da proteina tat, ocorre uma imunoprecipitação mais forte dos anticorpos do que na ausência da tat.

Mostrámos que os anticorpos para a tat podem inibir a actividade da tat. Por exemplo, em células HeLa que expressam um plasmídeo contendo o repórter LTR-CAT do HIV-1, apenas 0,01 μρ do plasmídeo que expressa a tat podem resultar em transactivação 25X. A adição de 10 ou 5 μρ de anticorpo SCA anti-tat (VK) , SCA anti-tat com o sinal de localização nuclear do SV40 (VK SV40) e SCA anti-tat com uma sequência líder de imunoglobulina, para dirigir o anticorpo para o ER, que foram co-transfectados com 0,1 μρ de um plasmídeo que expressa a tat nessas células HeLa, mostrou que a expressão intracelular dos anticorpos para tat pode reduzir significativamente a actividade da tat (ver Figuras 21 e 22). O anticorpo para tat com o líder de imunoglobulina serve de controlo negativo nestas experiências. A 10 μρ, o VK anti-tat exibe apenas 4% da actividade do SCA anti-tat expresso no ER, onde não está presente a tat.

Os sinais de localização podem estar situados em qualquer parte do anticorpo desde que o sinal esteja exposto no anticorpo e a sua colocação não destrua a capacidade de ligação do anticorpo. Por exemplo, pode ser 43 43 no agente anticorpo colocado no terminal carboxi ou amino, ou mesmo de ligação entre a cadeia pesada e leve de um sFv, desde que satisfaça as condições acima. TABELA 1 SEQUÊNCIA AMINO-TERMINAL4 LOCALIZAÇÃO SUECELULAR5 PROTEÍNA REFERENCIA GCVCSSNP (ID SEQ NO:30} PM Marchifdon, et «i., Proc. Nstl. Acad. Sei. USA 81: 7679-7882 (1384} Voronova,et ai., Mo!. Ce!) Bffl/.4:2705-2713 (1984} GQ7VTTPL (ID SEQ NO:31} PM de Mlú. V Henderson, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 333-343 (1987) GQELSQHE {ID SEQ NO. 32) PM QSCJ de fvl-PMV Rhee, et ai., J. Viro!. 61: 1045-1053 (1987) Schuitz. et Viro!. 46: 355-361 (1983) GNSPSYNP { ID SEQ NO ; 33) PM gag de BLV Sci'tUÍÍZ,et ai.,d Viro!. 133: 431-437(1984) GVSGSKGG (ID SEQ NO:34} PM gag de mmtv Schuitz, et al. , sLtpf3 GGTiTTPL (ID SEQ NO:35} PM gag de FCLV Schuitz, et ai ., supra GQTLTTPL (ID SEQ NO:36} PM gag de BaEV Schuitz, et al. , SUpfií GQiFSRSA ( ID SEQ NO : 37) PM gag de HTLV-f Ootsuyama, et ai., jpn j. Câncer Res. 76: 1132-1135(1985) GQÍHGLSP (ID SEQ NO:38} PM gag de hTLV-S! Ootsuyama, et ai., supm 44 (Continuação SEQUÊNCIA ÃMIHO-TERMIHAL4 LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR5 PROTEÍNA REFERENCIA GARASVLS (ID SEQ HO :39} PM gag BIV{HTLV-íí!) Ratner, et ai., Nature 313: 277-284 (1985) GCTLSAEE (ID SEQ HO :40} PM subunidade « de 6o de cérebro bovino Schuitz, et ai., Biocnem. Bkiphys Res Comrmm. 148:1234-1239(1987} GQNLSTSN (ID SEQ NO ::41} ER pré-Sl do Vírus da Hepatite 6 Persirtg, et ai., j. viro! 61: 1872-1677(1987} GAALTSLV (ID SEQ NO :42) N VP2 do Vírus Polioma Sfreuii. et ai., Nature326: 619-822 (1987} GAALTLLG (ID SEQ NO :43) N VP2 do Vírus SV40 Strei.tst, et ai., supra GAQVSSOK (ID SEQ NO :44} S,ER VP4 de Poliovirus Chow, et ai., Natum 3'27: 482-486 (1987} Paul et ai., Proa Νε>:ί. Acsd. Sei. USA 84: 7827-7831 (1987) UAQLSRNT (ID SEQ N0-:45) S,ER VF4 de Enterovirus Bovino PfíUL et al. , supra GNAAÂAKK (ID SEQ NO :46) G,S.N C quinase dependente de cAMP Can', et al., Proc Nati Acsd. Sa. USA 79: 6128-6131 (1982) GNEASYPL (ID SEQ NO :47} S,C calcineurina B Mkert. et ai., FE3S Lutt. 150:314-318 «1982> GSSKSKPK (ID SEQ NO :48} PM, C peosFc SchuSíz. et al., Science 227:427-429 (1985} 4Para auxiliar o leitor, utiliza-se na Tabela o código de aminoácidos padrão de uma única letra; as sequências de aminoácidos utilizando o código de três letras estão apresentadas na Listagem de Sequências. 5As abreviaturas são: PM, membranas do plasma; G, Golgi; N, Nuclear; C, Citoesqueleto; s, citoplasma (solúvel); M, membrana.

Para manter estes anticorpos na célula é preferível que o anticorpo expresso não contenha os dominios completos da região constante. Cremos ser nesta região que há sequências especificas que auxiliam a secreção do anticorpo pela célula. Por exemplo, construímos um anticorpo sFv amplamente neutralizador para uma glicoproteina do envelope que contém apenas seis aminoácidos da região constante que não é segregado em grandes quantidades pela célula, ao passo que o anticorpo Fab inalterado para essa proteina é 45 segregado. Este tipo de concepção, para deixar de fora essas sequências, pode ser facilmente implementada pela selecção e omissão de nucleótidos que codificam para o anticorpo. Apesar de ter sido discutido neste exemplo um anticorpo amplamente neutralizador, os anticorpos utilizados não têm que ser amplamente neutralizadores. A neutralização não é necessária; ao invés, é necessário que o anticorpo se ligue ao alvo. Assim e preferivelmente, procura-se um epitopo da molécula conservado e acessível.

Alternativamente, quando o sinal secretor for retido, a utilização de sequências de retenção intracelular, como KDEL para o retículo endoplasmático, deve manter a maior parte dos anticorpos expressos no interior da célula.

Descobrimos que o anticorpo sFv expresso ainda se ligará à proteína BiP, o que poderá ajudar a manter o complexo anticorpo-alvo resultante no interior da célula.

Por exemplo, o Fab F105 ligar-se-á à glicoproteína do envelope em várias localizações dentro e fora da célula à medida que é segregado. Em conformidade, se a molécula-alvo, neste exemplo a glicoproteína do envelope, não estiver toda ligada numa localização, a utilização desse anticorpo apto a ser segregado permite abordar selectivamente a proteína em múltiplas localizações. Descobrimos que, ao utilizar células, como células COS, transformadas de forma estável pelo gene do anticorpo Fab F105, conseguimos obter expressão constitutiva de Fabs F105. Estas linhas de células segregam os Fabs a uma taxa de cerca de 1-3 μg/ml. Esta quantidade pode ser alterada, consoante o desejado, pelo técnico experimentado utilizando intensificadores e promotores diferentes. Como mencionado 46 acima, o Fab segregado pode abordar selectivamente a molécula em diferentes localizações intracelulares à medida que é segregado. Adicionalmente, o Fab também pode abordar selectivamente qualquer molécula que possa ter escapado da célula, extracelularmente. Por exemplo, tal como abordar selectivamente a glicoproteína do envelope à medida que é processada, desse modo reduzindo grandemente a quantidade de proteína processada, também pode ligar-se à gpl20 no virião livre e impedi-la de infectar outro receptor CD4 ou uma célula não infectada. Por exemplo, a utilização destes Fabs F105 em células COS infectadas com o HIV inibiu a formação de sincícios.

Tal como é aqui utilizado, o termo gene para o anticorpo pode abranger genes para as regiões da cadeia pesada e cadeia leve. Adicionalmente, o gene está operativamente ligado a um promotor ou promotores, o que resulta na sua expressão. Promotores que irão permitir a expressão em células de mamífero são bem conhecidos e incluem o promotor do CMV, uma LTR virai, como a LTR do vírus do sarcoma de Rous, LTR do HIV, LTR do HTLV-1, o promotor inicial do SV40, o promotor UV5 de lac de E. coli e o promotor do vírus tk de herpes simplex. Esta sequência de DNA é descrita como cassete do anticorpo. A cassete do anticorpo é distribuída na célula por qualquer um dos meios conhecidos. Ver, por exemplo, Miller, A.D., Nature 357: 455-460 (1992); Anderson, W.F., Science 256: 808-813 (1992); Wu et al., J. of Biol. Chem. 2 63: 14621-14624 (1988). Por exemplo, uma cassete contendo estes genes de anticorpo, como o gene sFv, pode ser dirigida para uma célula particular por algumas técnicas. Na discussão abaixo iremos discutir os genes sFv que codificam para 47 anticorpos para o HIV, que seriam preferivelmente introduzidos em células T CD4+. No entanto, as técnicas descritas podem ser facilmente utilizadas para introduzir os genes de anticorpo noutras células, preferivelmente células humanas. Por exemplo, utilizando um vector de expressão de mamifero, como um vector de Herpes, um vector de adenovirus ou um vector de variola, um vector retroviral, um plasmideo ligado a um anticorpo, etc. Estes vectores podem ser utilizados para a transdução de células por técnicas comuns bem conhecidas do técnico experimentado. Preferivelmente, esta cassete é introduzida na célula utilizando um vector virai do HIV, que é defeituoso no empacotamento de sequências do HIV mas que, preferencialmente, irá abordar selectivamente células susceptiveis ao HIV. Adicionalmente, pode utilizar-se um promotor que irá expressar diferencialmente o gene na célula-alvo desejada. Por exemplo, utilizando uma LTR do HIV como promotor, em que o alvo consiste em células infectadas com o HIV. Nesse caso, as proteínas virais do HIV presentes na célula, como a tat, podem resultar em expressão intensificada do anticorpo, em comparação com células não infectadas. Noutra especificação, é possível transduzir células que têm maior risco de sofrer infecção virai, como células CD4. A expressão intracelular do anticorpo permite a sua ligação ao alvo. Isto inactiva o funcionamento do alvo, por exemplo, uma proteína, incluindo o funcionamento indesejado. Por exemplo, expressar o sFv de um anticorpo amplamente neutralizador para a glicoproteína do envelope pode bloquear intracelularmente o transporte e interacção com as moléculas CD4 da glicoproteína do HIV-1, bem como a clivagem da proteína. Clonámos o sFv sem qualquer sinal de 48 orientação e esse anticorpo sFv com um sinal de retenção no reticulo endoplasmático (KDEL). Em seguida, estes foram inseridos intracelularmente em células de mamífero utilizando, por exemplo, um vector de expressão em células de mamífero, apesar de ser preferido um vector retroviral com esta construção de anticorpo. Como outro exemplo, utilizar um anticorpo específico para neu que é dirigido para tecido da mama pode ajudar a manter a proteína neu na célula. A expressão destes anticorpos não deve danificar as células. De facto, se o "ligando" para o qual é dirigido o anticorpo não estiver presente, o anticorpo pode ser concebido de modo a degradar-se. Por exemplo, o anticorpo para a glicoproteína do envelope com uma sequência de retenção KDEL foi degradado logo após a síntese, a menos que a glicoproteína do envelope do HIV-1 estivesse presente para formar um complexo anticorpo-ligando. Em contraste, o anticorpo de cadeia única para a glicoproteína do envelope expresso sem o sinal de retenção não foi degradado de modo semelhante; ao invés, foi possível detectá-lo após etiquetagem radioactiva de uma imunoprecipitação com anticorpo policlonal para a cadeia K ou cadeia pesada de imunoglobulina humana nas células transfectadas. Em ambos os casos, as células transformadas parecem ter morfologia e velocidades de crescimento normais. Ver, por exemplo, a Figura 4, que mostra células COS transformadas que foram estabelecidas por selecção com neomicina, que expressam o anticorpo de cadeia única ou a cadeia única com a sequência KDEL, que é retido no retículo endoplasmático. Este anticorpo ligou-se à proteína gpl60 do HIV-1 e foi possível co-precipitá-lo com anti-K ou anti-gpl20. Detectou-se muito pouca gpl20 mesmo numa amostra de perseguição de quatro 49 horas da célula transformada com sFv, ao passo que se detectou uma fracção de gpl20 nas células transformadas com vector e, em menos quantidade, em células transformadas com sFv KDEL (ver Figura 5) . Assim, mostra-se que o anticorpo sFv expresso se liga à proteína gpl60 e evita o processamento suplementar da proteína gpl60. Numa especificação preferida, um anticorpo para a gp41 também será distribuído nessa célula, para abordar selectivamente qualquer proteína gpl60 que tenha sido clivada.

Uma estratégia alternativa consiste em colocar a expressão do anticorpo sob o controlo de um promotor indutível. Preferivelmente, o promotor será indutível por um efeito do alvo. Por exemplo, pode utilizar-se como promotor uma LTR virai, como uma LTR do HIV. 0 vírus HIV produz proteínas, por exemplo, tat, que "ligam" o promotor.

Como explicado acima, o produto sFv-KDEL, apesar de ser rapidamente degradado sem o alvo presente, não pareceu ser rapidamente degradado quando a glicoproteína do HIV-1 estava presente. Assim, uma banda de sFv-KDEL tornou-se visível num gel de poliacrilamida após etiquetagem radioactiva e imunoprecipitação. Esta proteína também co-precipitou com a glicoproteína do HIV-1, apesar de se ter detectado uma pequena porção de gpl20, o que sugere um bloqueio incompleto do transporte da glicoproteína possivelmente devido à degradação rápida de anticorpo sintetizado de novo antes da ligação ao ligando. A coloração por imunofluorescência quanto a sFv-KDEL nas células transformadas, que co-expressam a glicoproteína do HIV-1, revelou um padrão de coloração no retículo endoplasmático, sugerindo que o anticorpo se tornou estável 50 após ligação ao seu ligando e que permaneceu no retículo endoplasmático. A presença da proteína-alvo também ajuda o dobramento do anticorpo no estado conformacional correcto. Como mencionado acima, estes complexos anticorpo-ligando evitam a operação do alvo no seu modo típico. Por exemplo, a fusão citopática mediada pelas gpl20/41 do HIV-1 é inibida nas células. Isto é ilustrado por co-transfecção de células HeLa CD4+ com pSVIIIenv que expressa a glicoproteína do HIV-1 e DNAs plasmídicos de sFv ou sFv-KDEL numa razão de 1:5, ou por transfecção das células transformadas com pSVIII. As células contendo o anticorpo intracelular exibiram uma redução significativa da formação de sincícios, ao passo que não se observou redução significativa da formação de sincícios em células transformadas ou transfectadas com o vector que não expressou o anticorpo, indicando que o anticorpo intracelular pode inibir a fusão citopática bloqueando o transporte da glicoproteína do HIV para a membrana plasmídica e/ou a interacção da glicoproteína do HIV-1 com as moléculas CD4 em células adjacentes, mesmo que os complexos sFv-gpl20 consigam atingir a superfície da célula.

Suplementarmente, estas células contendo anticorpo intracelular produziram muito poucas partículas do HIV-1 infecciosas. As células que expressam o anticorpo intracelular foram transfectadas com DNA pró-viral do HIV-1 infeccioso, e podem utilizar-se os sobrenadantes das células transfectadas para infectar o linfócito humano CD4 SupTl. Observa-se nessas células uma cinética de infecções dramaticamente mais lenta, em comparação com a de células 51 transformadas com vector, apesar de se terem observado quantidades comparáveis de actividade da p24 nos sobrenadantes de todas estas células, o que pode indicar que partículas do HIV-1 não infecciosas podem ser produzidas na ausência da glicoproteína do HIV-1.

As células sFvl05 SupT mantêm o fenótipo paterno, conseguem responder apropriadamente a estímulos externos e são resistentes aos efeitos citopáticos da infecção com o HIV-1, e as células infectadas produzem partículas do vírus HIV-1 cuja infectividade está acentuadamente decrescida.

Isto demonstra ser possível utilizar o presente método para intervir numa infecção virai, como infecção pelo HIV-1, utilizando um anticorpo expresso intracelularmente, como um anticorpo de cadeia única manipulado, e que, por ligação aos produtos genéticos disfuncionais ou indesejados, é possível atenuar os efeitos indesejáveis. Utilizando a mesma estratégia básica deve ser possível intervir noutras doenças virais e metabólicas, como infecções por vírus de DNA, como vírus herpes simplex e de RNA, como HTLV-1 e 2. Preferivelmente, este método será utilizado contra vírus de longa duração e/ou não facilmente susceptíveis a outras formas de tratamento.

0 presente método permite uma gama ampla de abordagens, mesmo contra a mesma doença. Por exemplo, anticorpos contra a transcriptase reversa podem interferir em funções da proteína de ligação ao modelo [DeVico, A.L., et al.r J. of Biol. Chem. 2 66: 6774-6779 (1991)] . Anticorpos para esta proteína são conhecidos e incluem C2003, que se liga a uma sequência da porção C-terminal do componente p66 [Ibid]. Este anticorpo também se liga ao HIV-2 [DeVico, A.L., AIDS 52

Res. & H. Retro. _5: 51-60 (1989)]. Esses anticorpos podem ser rastreados a partir de soros de pacientes e os anticorpos podem ser clonados como descrito acima.

Outra abordagem consiste em abordar selectivamente uma sequência de ácido nucleico critica no virus, como o elemento TAR. O elemento tar, que responde à tat, está localizado na extremidade 5' de RNA virai mensageiro. Foi mostrado que a ligação da tat a este elemento tar resulta em ausência de repressão da inibição da tradução do tar in vitro. Adicionalmente, o elemento tar aumenta a iniciação da transcrição e também actua como anti-atenuador do alongamento da transcrição. Ao dirigir um anticorpo contra a sequência tar, irá ocorrer inibição da ligação da tat e haverá um decréscimo dramático da eficiência da transcrição. Isto acabará por resultar na inibição ou redução da produção do virus. Pode utilizar-se uma abordagem semelhante para produzir anticorpos contra o elemento de resposta a rev (RRE). O rev controla a síntese de proteínas estruturais virais, incluindo a proteína capsídica, enzimas de replicação e a glicoproteína do envelope. A proteína rev controla a expressão de proteínas de viriões ao controlar a acumulação no citoplasma de espécies de RNA. Na ausência de actividade da rev acumulam-se pequenas espécies de RNA virai multiplamente processado, na presença da rev acumulam-se RNA's mensageiros da glicoproteína do envelope parcialmente processados. Anticorpos dirigidos contra o RRE devem inibir a ligação da rev ao RRE e, em consequência, inibir o grande efeito biológico da rev. Em resumo, a proteína rev regula a síntese de capsídeos, enzimas de replicação e produção da glicoproteína do envelope ao regular a acumulação de espécies de RNA mensageiro de onde são produzidas. RNA's 53 mensageiros de proteínas estruturais requerem ligação da proteína rev à estrutura de RNA dobrado denominada RRE para a relocalização do núcleo para o citoplasma. A inibição da ligação da rev por um anticorpo anti-rev deve prevenir a expressão do vírus pelas células infectadas. Esses anticorpos para TAR ou RRE podem ser sintetizados utilizando tecnologias conhecidas, com base na revelação. Por exemplo, é possível rastrear uma biblioteca de RNA com um anticorpo para obter o anticorpo desejado.

Foi proposto que a formação de tumores e metástases dependem da angiogénese (isto é, formação de novos vasos sanguíneos capilares) [Folkman et al., "Origins of Human Câncer: A Comprehensive Review" Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)]. Por exemplo, verificou-se que melanoma humano produz várias proteínas com actividade angiogénica, incluindo o factor de crescimento de fibroblastos (bFGF), factor de transformação do crescimento alfa (TGFa) e factor de transformação do crescimento beta [Herlyn et al., Lab. Invest. 5_6: 461 (1987)]. Ao utilizar essas proteínas como alvos para anticorpos intracelulares, a formação de tumores e metástases podem ser limitadas.

Foi sugerido que alterações nas posições 12, 13 ou 61 das proteínas p21 ras resultam em formação de tumores. Utilizar a proteína mutante como alvo para um anticorpo intracelular, que consegue distinguir a ras oncogénica da proto-ras, deve limitar a formação de tumores. São conhecidos na área anticorpos capazes de efectuar essa ligação específica. É preferível utilizar uma abordagem de "cocktail" (isto é, mistura de anticorpos) ao lidar com proteínas virais 54 indesejadas, desse modo abordando selectivamente uma variedade de proteínas virais de uma só vez e tornando mais difícil a evolução de mutantes que irão produzir uma proteína-alvo funcional que consegue evitar o anticorpo. Por exemplo, é preferido um "cocktail" de anticorpos para pelo menos a qlicoproteína do envelope e tat. Outros "cocktails" incluem anticorpos para a transcriptase reversa, TAR, RRE, etc. Esses "cocktails" podem ser administrados juntamente ou por co-transfecções. É preferido abordar selectivamente não mais de cerca de três proteínas na mesma região intracelular, preferivelmente não mais de cerca de duas. Por exemplo, a abordagem selectiva de gpl60 e gp41 no retículo endoplasmático. Desde que outro alvo intracelular esteja numa região celular diferente, isto é, núcleo versus retículo endoplasmático, também pode ser abordado selectivamente sem exercer um efeito prejudicial na produção de anticorpos. Um "cocktail" de anticorpos preferido consiste em anticorpos para pelo menos uma proteína virai estrutural, como capsídeo ou do envelope, e um para proteínas reguladoras, como rev do HIV, tat, HTLV-1 ou tax, ou para uma sequência de ácido nucleico, como TAR ou RRE.

Outro "cocktail" de anticorpos preferido consiste em anticorpos para o mesmo alvo mas em várias localizações intracelulares. Isto pode ser feito utilizando diferentes sequências de localização. Assim, se algum alvo não estiver ligado ao anticorpo numa localização e, por exemplo, for suplementarmente processado, pode ser abordado selectivamente numa localização subsequente. Por exemplo, com a glicoproteína do envelope, podem utilizar-se sequências de localização para abordar selectivamente a proteína nalgumas alturas da sua via de processamento. 55

Alternativamente, podem utilizar-se múltiplos anticorpos para abordar selectivamente diferentes epítopos de moléculas. Por exemplo, utilizar um anticorpo para abordar selectivamente a região de ligação de CD4 de uma glicoproteina do envelope e um segundo anticorpo para abordar selectivamente o dominio fusogénico da gp41.

Para proteínas codificadas pelo HIV, um vector preferido teria dois anticorpos para proteínas capsídicas ou do envelope e pelo menos um para uma proteína reguladora. Por exemplo, para gpl60, gp41, tat e rev. Outro "cocktail" incluiria anticorpos para o mRNA virai e proteína que ele codifica.

Outras proteínas-alvo preferidas codificadas pelo HIV são nef, vpr, e para o HIV-1 vpu, e para o HIV-2 vpx. Mais preferivelmente, nef e vpu. Por exemplo, a proteína nef existe no citoplasma, estando também ligada à superfície interna da membrana do plasma. A proteína é modificada de forma co-tradução por adição de ácido mirístico ao penúltimo resíduo glicina do terminal amino. A proteína vpr foi encontrada incorporada no vírus capsídico. A proteína vpu está localizada no citoplasma de células e pode estar associada a organelos subcelulares. Podem preparar-se anticorpos para estas proteínas pela metodologia descrita aqui. Suplementarmente, estas proteínas podem ser abordadas mais especificamente pelo técnico experimentado, com base nesta revelação, por selecção de sequências de localização apropriadas.

Assim, utilizando a metodologia descrita acima, podem tratar-se mamíferos, preferivelmente humanos, que sofrem de um padecimento causado pela expressão ou super-expressão de 56 proteínas específicas. Pode utilizar-se este método para tratar doenças virais e metabólicas. Podem tratar-se indivíduos infectados com doenças virais, como HIV, HTLV-1, HTLV-2, herpes. De modo semelhante, podem tratar-se indivíduos com tumores malignos ou susceptíveis de sofrerem transformação celular maligna causada por um nível elevado de uma proteína ou proteínas, uma proteína ou proteínas alteradas ou uma combinação destes. Por exemplo, é possível abordar selectivamente pelo menos um dos antigenes com um anticorpo que se irá ligar especificamente a esse antigene. Distribui-se uma quantidade eficaz de um gene capaz de expressar o anticorpo em condições que permitirão a sua expressão intracelular em células susceptíveis à expressão do antigene-alvo indesejado. Este método pode ser utilizado como tratamento profiláctico, para prevenir ou tornar mais difícil que essas células sejam adversamente afectadas pelo antigene indesejado, por exemplo, prevenindo o processamento da proteína, interacção da proteína indesejada com outras proteínas, integração pelo vírus na célula-hospedeiro, etc. Quando existirem alguns alvos, um alvo preferido consiste em proteínas que são processadas pelo retículo endoplasmático. Pode proceder-se à distribuição intracelular de qualquer um dos genes de anticorpos utilizando técnicas de terapia genética, como descrito acima. 0 anticorpo pode ser qualquer um dos anticorpos discutidos acima. Discutimos aqui a utilização deste sistema para distribuir genes de anticorpos num mamífero infectado de forma virai, por exemplo, um humano infectado com o vírus HIV, mas deve entender-se que, com base na presente revelação, é possível adaptar facilmente essa abordagem a outros sistemas, por exemplo, um indivíduo com células transformadas de forma maligna. 57 0 HIV infecta linfócitos humanos positivos para CD4 e outras células imunológicas. Ao abordar selectivamente essas células com um anticorpo que se irá ligar a pelo menos uma molécula-alvo codificada pelo HIV, por exemplo, uma proteina, é possivel tratar um indivíduo infectado com o virus, abrandar e/ou retardar a disseminação da infecção ou tratar profilacticamente essas células para tornar mais dificil a sua infecção. É possivel utilizar qualquer uma das formas conhecidas de terapia genética para distribuir genes em linfócitos positivos para CD4. Por exemplo, utilizando um mecanismo de transferência de genes especifico para células, que utiliza endocitose mediada por receptores para transportar moléculas de RNA ou DNA para o interior de células (ver, por exemplo, Wu & Wu, J. Biol. Chem. 2 62: 4429-4432 (1987)). Uma proteína que actua como ligando é acoplada a uma poli-L-lisina, que depois se combina com RNA ou DNA (o gene) para formar complexos solúveis por interacção electrostática forte, de modo que é possível distribuir os genes (isto é, o RNA ou DNA) nas células de interesse, como células CD4. Por exemplo, utilizando um anticorpo contra a gpl20 ou CD4 como ligando, é possível abordar especificamente essas células. De facto, esse método de transferência de genes in vivo, para além de servir como vector para distribuir um gene terapêutico em células infectadas com o HIV ou células susceptíveis a infecção pelo HIV, também mantém a sua actividade neutralizadora. Descobrimos que a interiorização de anticorpos, após ligação a gpl20 ou CD4 expressa na superfície da célula, é altamente eficiente. 58

Os anticorpos utilizados para abordar selectivamente as células podem ser acoplados à polilisina, para formarem um conjugado anticorpo-polilisina por ligação através de ligações dissulfureto, após modificação com um reagente como 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP) . Os complexos anticorpo-polilisina-gene são produzidos por mistura dos conjugados anticorpo-polilisina com uma fracção contendo a cassete do anticorpo, isto é, a sequência de DNA que contém o anticorpo operativamente acoplado a um promotor, como um plasmídeo ou vector (Fig. 14). Preferivelmente, utilizar-se-ão polilisinas com um comprimento médio da cadeia de cerca de 60 até 500 monómeros de lisina. Mais preferivelmente, a polilisina tem um comprimento médio da cadeia de cerca de 90 até 450 monómeros de lisina.

Como mencionado acima, pode obter-se ligação aos anticorpos utilizando SPDP. Em primeiro lugar, grupos ditiopiridina serão introduzidos no anticorpo ou polilisina através de SPDP e depois os grupos presentes na polilisina podem ser reduzidos para dar origem a compostos sulfidrilo livres que, por mistura com os anticorpos modificados como descrito acima, reagem para dar origem aos conjugados desejados com ligações dissulfureto. Estes conjugados podem ser purificados por técnicas convencionais, tais como utilizando cromatografia de permuta catiónica. Por exemplo, uma coluna Pharmacia Mono S, HR 10/10. Ver, por exemplo, a Figura 15. Em seguida, estes conjugados são misturados com a cassete do anticorpo em condições que permitirão a ligação. Por exemplo, por incubação durante uma hora a 25 °C e depois diálise durante 24 horas, contra solução salina 0,15 M, através de uma membrana com um limite de pesos moleculares consoante o desejado. Essas membranas podem ser 59 obtidas, por exemplo, da Spectrum Medicai Industries, Los Angeles, Califórnia.

Para tratar as células abordadas selectivamente, estes vectores podem ser introduzidos nas células in vitro, sendo as células transduzidas injectadas no hospedeiro mamífero, ou o vector pode ser injectado num hospedeiro mamífero, como um humano, onde irá ligar-se à célula CD4 e depois será recolhido. Para aumentar a eficiência da expressão genética in vivo, a cassete do anticorpo pode fazer parte de um vector de expressão de mamífero epissomal. Por exemplo, um vector que contém a origem da replicação de Papovavírus (BK) e o antigene T grande BK para replicação extra-cromossómica em células de mamífero, um vector que contém a origem da replicação do vírus de Epstein-Barr (EB) e antigene nuclear (EBNA-1) para permitir a replicação epissomal com elevado número de cópias. Também podem utilizar-se outros vectores de expressão de mamífero, como vectores de expressão do vírus herpes ou vectores de expressão do vírus da varíola. Esses vectores são disponibilizados por um grande número de fontes, incluindo a Invitrogen Corp. A cassete do anticorpo é inserida nos vectores de expressão por técnicas comuns, por exemplo, utilizando uma endonuclease de restrição e inserindo-a num sítio específico desse vector de expressão de mamífero. Estes vectores de expressão podem ser misturados com os conjugados anticorpo-polilisina, e os complexos resultantes da cassete do anticorpo contendo anticorpo-polilisina-vector de expressão podem ser facilmente preparados com base na revelação contida aqui. Injecta-se uma quantidade suficiente destes vectores para obter uma concentração no soro que varia entre cerca de 0,05 μρ/ιηΐ e 20 μρ/ιηΐ de conjugado de anticorpo. Mais preferivelmente, entre cerca 60 de 0,1 μg/ml e 10 μg/ml. Ainda mais preferivelmente, entre cerca de 0,5 μg/ml e 10 μg/ml.

Estes vectores podem ser administrados por qualquer um de uma variedade de meios, por exemplo, injecçao parentérica (intramuscular (I.M.), intraperitoneal (I.P.), intravenosa (I.V.), intracraniana (I.C.) ou subcutânea (S.C.)), via oral ou outras vias de administração conhecidas. É tipicamente preferida a injecçao parentérica.

Os materiais podem ser administrados de qualquer modo conveniente, por exemplo, podem ser misturados com um transportador inerte, como sucrose, lactose ou amido. Podem tomar a forma de pastilhas, cápsulas e comprimidos. Para administração parentérica, serão tipicamente injectados numa solução, suspensão ou emulsão aquosa ou não aquosa esterilizada em associação com um transportador parentérico farmaceuticamente aceitável, como soro fisiológico. A presente invenção é suplementarmente ilustrada pelos exemplos seguintes. Fornecem-se estes exemplos para ajudar a compreender a invenção, não devendo ser considerados uma limitação desta.

EXEMPLOS

A. CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE UM ANTICORPO AMPLAMENTE NEUTRALIZADOR PARA A GLICOPROTEÍNA DO ENVELOPE 1. Síntese de cDNA e Amplificação por PCR de Genes de Imunoglobulina F105 O hibridoma F105 foi derivado por fusão de transformantes de EBV com a linha de células HMMA2.11TG/0, um análogo de mieloma humano-ratinho não secretor [Posner 61 et al., J. Immunol. 146: 4325-4332 (1991)]. Sintetizou-se o primeiro filamento de cDNA numa reacção de 25 μΐ, partindo de 5 μρ de RNA total utilizando iniciação com oligo(dT) e a transcriptase reversa do virus da leucemia murina de Moloney, de acordo com protocolos publicados [Gusler et ai., Gene 2_5: 263-269 (1983)]. Utilizou-se cinco até dez por cento do primeiro filamento de cDNA para efectuar as reacções de PCR. As temperaturas utilizadas para PCR são: fusão 94 °C, 1 minuto; hibridização de "primers" 52 °C, 2 minutos; extensão de "primers" 72 °C, 2 minutos. Utilizaram-se tempos de rampa de um minuto, com a excepção de se ter utilizado um tempo de rampa de 2 minutos entre a hibridização e a extensão. Realizaram-se 25-30 ciclos térmicos. Utilizaram-se géis de agarose 2% corados com brometo de etidio para separar os fragmentos de PCR. A banda apropriada foi excisada, foi limpa de genes (Bio 101, La Jolla, CA), reparada com Klenow, digerida com enzimas de restrição e utilizada para clonagem. Sequenciaram-se pelo menos três transformantes separados de cada fragmento de PCR utilizando "primers" de sequenciação directos e reversos. A análise de sequências de DNA foi efectuada pelo método de Sanger [Sanger et al., J. Mol. Biol. 183: 161-178 (1980)].

2. Concepção de "Primers" de PCR

O par de "primers" da cadeia pesada consiste num "primer" VH directo e num "primer" JH reverso, cada um contendo sitios de restrição convenientes para clonagem. Utilizou-se a base de dados de Kabat de imunoglobulinas para analisar a distribuição de aminoácidos e codões encontrada nas seis famílias distintas de VH humana [Kabat et al., supra]. Com base nesta análise concebeu-se o "primer" 5' VH universal de 35 pares de bases TTTGCGGCCGCTCAGGTGCA(G/A)CTG 62 CTCGAGTC (T/C) GG (ID SEQ NO: 9), que é degenerado para dois nucleótidos diferentes em duas posições e que irá hibridizar para a extremidade 5' de sequências FR1. Introduziu-se um sitio 5' Not I (sublinhado à esquerda) para clonagem do DNA amplificado, que está localizado a 5' do primeiro codão do gene VH. Também se introduziu um sitio Xho I interno (sublinhado à direita).

De modo semelhante, concebeu-se um oligonucleótido para a região JH de 66 pares de bases para iniciação reversa na extremidade 3' do gene da cadeia pesada variável, AGATCCGCCGCCACCGCTCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGAGGTGACCGTGA CC(A/G)(G/T)GGT (ID SEQ NO: 10). Este "primer" contém adicionalmente uma sequência de 45 nucleótidos que codifica o agente de ligação inter-cadeias (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (ID SEQ NO: 1). Com base na sequência de nucleótidos dos seis minigenes da região JH humana, este "primer" tem duas posições degeneradas, com dois nucleótidos em cada posição.

Introduziu-se um sítio BspE I (sublinhado à esquerda) no agente de ligação inter-cadeias para ligação de extremidades coesivas com 0 "primer" Vkappa com sobreposição. Também se introduziu um sitio BstEII interno (sublinhado à direita), para futuras experiências de permuta de agentes de ligação.

Uma estratégia semelhante, utilizando o agente de ligação inter-cadeias de 45 nucleótidos, foi incorporada na concepção do "primer" Vkappa humano de 69 nucleótidos. Há quatro famílias de genes Vkappa humanos. O "primer" 5' Vkappa GGTGGCGGTGGCTCCGGAGGTGGTGGGAGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTC(G/C)(T/ A) G (A/C) TGACCCAGTCTCCA (ID SEQ NO: 11), que irá hibridizar para 5' das sequências FR1, é degenerado em três posições (dois nucleótidos cada). A porção do agente de ligação 63 inter-cadeias tem um sítio BspE I para clonagem de extremidades coesivas com o "primer" JH reverso. Também foi introduzido um sítio Sac I interno (sublinhado à direita), para futuras experiências de permuta de agentes de ligação. 0 "primer" Ckappa reverso de 47 nucleótidos (posições de Kabat 109-113) GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTAACGCGTTGGTGCAGC-CACAGT (ID SEQ NO: 12) foi concebido de modo a ser complementar à região constante de cadeias kapa (posições de Kabat 109-113) (Kabat). Este "primer" irá hibridizar para a extremidade mais a 5' da região constante kapa. O "primer" contém um sítio Mlu I interno (sublinhado à direita) que precede dois codões de terminação. Adicionalmente, introduziram-se sítios de restrição múltipla (Bam HI/XhoI/XbaI) (sublinhado à esquerda) após os codões de terminação em série. Também foi concebido um "primer" Ckappa reverso semelhante de 59 nucleótidos que contém um sinal de retenção no retículo endoplasmático carboxi-terminal Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (ID SEQ NO: 13) (SEKDEL) GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTTGGT-GCAGCCACAGT (ID SEQ NO: 14) . Introduziram-se sítios de restrição múltipla semelhantes (Bam HI/XhoI/XbaI) após os codões de terminação em série.

Depois de determinada a sequência de nucleótidos primária para os genes da cadeia pesada e kapa de F105 e de terem sido identificados os genes da linha genética, concebeu-se um "primer" de PCR com base nas sequências líder do gene da linha germinativa VH 71-4 (Lee et ai., J. Mol. Biol. 195: 761-768 (1987)). O "primer" líder de VH 71-4 TTTACCATGGAACATCTGTGGTTC (ID SEQ NO: 15) tem um sítio 5' Nco I (sublinhado). Este "primer" líder foi utilizado em conjunção com um segundo "primer" JH para experiências de 64 amplificação por PCR. 0 oligonucleótido da região JH de 35 pares de bases foi concebido de modo a conter a mesma sequência para iniciação reversa na extremidade 3' do gene da cadeia pesada variável, TTAGCGCGCTGAGGTGACCGTGACC-(A/G) (G/T)GGT (ID SEQ NO: 16). Este "primer" tem duas posições degeneradas, com dois nucleótidos em cada posição. Um sitio BssH II (sublinhado à esquerda), a 3' e imediatamente adjacente ao codão que determina o último aminoácido da região J, permite a clonagem conveniente na extremidade 3' do gene VH. Também se introduziu um sítio BstEII interno (sublinhado à direita). 3. Construção e Expressão Bacteriana de Anticorpos de Cadeia Única F105

Para a construção do sFv F105 inicial para expressão bacteriana, os fragmentos de PCR Vh/Jh-ICL e ICLVkappa/Ckappa foram digeridos com NotI/BspEI e BspEI/Xbal, respectivamente, e foram clonados no plasmideo pSL1180 (Pharmacia LKB, Biotech. Inc., Piscataway, N.J.), utilizando como hospedeiros bactérias SURE (Stratagenem, La Jolla, Ca) . 0 sFv F105 resultante foi digerido com enzimas de restrição, e o fragmento NotI/BglII foi clonado no sitio NotI/BamHI que está localizado a 3' do péptido de sinal pel B num vector de expressão pET. 0 plasmideo pETpelB F105sFv resultante foi transformado em hospedeiros BL21 (DE3). A proteína sFv 105 é reconhecida por anti-soro para ambas as cadeias kapa pesada e leve humanas. A proteína liga-se à gpl20 purificada, o que foi determinado utilizando um ensaio ELISA no qual a gpl20 é fixada a uma superfície de plástico. Obtiveram-se fracções do periplasma 2-4 horas após indução a 24 °C com IPTG 0,2 mM, tendo sido testadas quanto à actividade de ligação de gpl20 por ELISA utilizando placas de ELISA (Dynatech Labs, Inc., Chantilly, 65 VA) revestidas com gpl20 (American Biotechnology, Inc.) e detecção com anticorpo de cabra anti-cadeia kapa humana purificado numa coluna de afinidade acoplada a fosfatase alcalina (Fisher Scientific). A gpl20 ligada a sFv F105 foi bloqueada por CD4 solúvel, desse modo mostrando que o CD4 compete e foi absorvido e eluiu de uma coluna de afinidade de gpl20 (Affi-Gel, BioRad, Inc.).

4. Construção e Expressão Eucariótica de Anticorpos de Cadeia Única F105 Com e Sem o Sinal de Retenção no Retículo Endoplasmático SEKDEL

Os "primers" líder VH 71-4 e Jh/BssHII foram utilizados para amplificar por PCR um fragmento sem intrões contendo o péptido líder e gene da cadeia pesada rearranjado. 0 fragmento foi clonado com extremidades planas, na direcção directa, num sítio EcoRV em pSL1180. Subsequentemente, obteve-se um fragmento NcoI/BstEII, tendo sido combinado com o fragmento BstEII/Sphl de sFv F105 de pSL1180, numa ligação em três porções, com pSL1180 digerido com NcoI/SpHI, para produzir VH 71-4/SCA. Para a construção do VH 71-4 SCA contendo a sequência SEKDEL carboxi-terminal, um produto de PCR ICL-Vkappa-SEKDEL foi clonado com extremidades planas, na direcção directa, num sítio EcoRV em pSL1180. 0 fragmento foi removido por digestão com BspEI/Xbal e foi combinado com o fragmento NcoI/BspEI de VH 71-4/SCA, numa ligação em três porções, com pSL1180 digerido com Ncol/Xbal, para produzir VH 71-4/KDEL. Antes da clonagem em pRC/CMV (Invitrogen), introduziu-se um agente de ligação para conversão de EcoRI em HindIII em pSL1180 digerido com EcoRI contendo os dois anticorpos de cadeia única. Subsequentemente, obteve-se um fragmento HindIII/Xbal de ambos os anticorpos de cadeia única, tendo 66 sido clonados em pRC/CMV digerido com HindIII/Xbal, para produzir pRC/SCA e pRC/KDEL.

Ver a Figura 2, que é um diagrama das estruturas de Fv, sFv e sFv-KDEL. As três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cada cadeia estão sombreadas. 5. Construção e Expressão de Outros Anticorpos para o Envelope

Produziram-se mais dois anticorpos de cadeia única amplamente neutralizadores para a glicoproteína do envelope, que foram expressos utilizando o mesmo procedimento básico. Estes "primers" de PCR são directos para VH e reversos para V-kappa; em resultado, é amplificado um agente de ligação de cadeias interno que agora tem 24 aminoácidos de JH, 24 nucleótidos e 24 pares de bases de V-kappa.

Um desses anticorpos consistiu num anticorpo de cadeia única derivado do anticorpo monoclonal humano 1.7b que é dirigido contra um epitopo da gpl20 intensificador de CD4. Pela nossa análise genética determinámos que a cadeia pesada rearranjada do anticorpo monoclonal 1.7b derivava do gene da linha germinativa VH 1263. Utilizou-se um "primer" da cadeia pesada dirigido contra a sequência lider do péptido lider VH1263. Este "primer", TTT-AAG-CTT-ACC-ATGGAC-TGG-ACC-TGG-AGG (ID SEQ NO: 59), foi utilizado em conjunção com um "primer" JH da cadeia pesada de extremidades planas para a extremidade 3', TGA-GGT-GAC-CGT-GAC-CAG-GGT (ID SEQ NO: 60), para amplificar a cadeia pesada rearranjada, incluindo a sua sequência lider. A cadeia kapa foi amplificada de modo semelhante. Utilizando o método de extensão com sobreposição ("overlap extension") 67 descrito acima, montámos um anticorpo de cadeia única dirigido contra o sitio intensificador de CD4 em gpl20.

Adicionalmente, utilizámos um "primer" lider dirigido contra a sequência lider do gene da linha germinativa DP-35. Este gene da linha germinativa rearranjado é utilizado pelo anticorpo monoclonal 21 H, que também é dirigido contra o sitio de ligação de CD4 em gpl20. 0 "primer" lider 21 H foi utilizado em conjunção com o "primer" JH. 0 "primer" de extremidades planas JH TTT-AAG-CTTACC-ATG-GAG-TTT-GGG-CTG-AGC-TGG (ID SEQ NO: 61) foi utilizado para amplificar a cadeia pesada rearranjada do anticorpo monoclonal 21 H. Adicionalmente, utilizaram-se "primers" da cadeia leve lambda apropriadamente concebidos para amplificar a cadeia leve rearranjada do anticorpo monoclonal 21 H. Os dois produtos de PCR purificados foram utilizados para extensão com sobreposição com um agente de ligação de cadeias interno apropriado, que foi modificado de modo a conter a sequência lambda para a montagem do anticorpo de cadeia única 21 H a ser expresso em células eucarióticas. CTG-CGT-CAA-CAC-AGA-CTG-AGA-TCC-GCC (ID SEQ NO: 62) é o "primer" directo que foi utilizado para a amplificação da cadeia lambda 21 H. CGA-GGG-GGY-RGC-CTT-GGG-CTG (ID SEQ NO: 63) é o "primer" reverso dirigido contra a região lambda constante mais próxima, isto é, o "primer" 3' para a cadeia lambda do 21 H. TTT-TCT-AGA-TCY-TMT-GAA-CTG-ACT-CAG (ID SEQ NO: 64) é o "primer" utilizado para amplificar novamente o agente de ligação de cadeias interno de F105, para lhe atribuir uma região variável lambda em vez da região variável kapa. 68

Nomeadamente, como mostrado no exemplo anterior, colocámos um péptido líder, um "primer" líder e um "primer" JH de extremidades planas para amplificar as cadeias pesadas rearranjadas que têm o péptido líder numa extremidade e o segmento de extremidades planas JH na outra extremidade. 0 péptido líder tinha um sítio HindIII. A cadeia pesada rearranjada juntamente com o agente de ligação de cadeias interno foi criada utilizando os "primers" GGA-ACC-CTGGTC-ACG-GTC-ACC-TCA (ID SEQ NO: 65) na extremidade 5' e TGG-AGA-CTG-CGT-CAT-CTC-GAG-TTC (ID SEQ NO: 66) na extremidade 3'. Esta cadeia pesada rearranjada foi utilizada em conjunção com a cadeia kapa no caso do 1.7b para produzir o anticorpo de cadeia única com a sequência líder. Os "primers" utilizados para o 1.7 b são GAA-CTC-GAG-WTGACG-CAG-TCT-CCA (ID SEQ NO: 67), que hibridiza para a região Vkappa, e GG-GTC-TAG-ACT-CGA-GGA-TCCTTA-TTA-ACG-CGT-TGG-TGC-AGC-CAC-AGT (ID SEQ NO: 68), que irá hibridizar para a porção mais constante da cadeia kapa.

Depois das três porções serem adicionadas e montadas por extensão com sobreposição, os anticorpos de cadeia única têm, na extremidade 5', um sítio de clonagem HindIII e, na extremidade 3', o sítio de clonagem Xbal. 0 fragmento montado por PCR é digerido utilizando enzimas de restrição apropriadas, de acordo com as instruções dos fabricantes, e depois é clonado directamente no plasmídeo, como pRC/CMV. 6. Construção e Expressão de Anticorpos Mutantes

Utilizando qualquer um destes anticorpos amplamente neutralizadores podem gerar-se anticorpos mutantes. Podem utilizar-se técnicas comuns de mutagénese para dar origem a 69 cDNA que codifica para diferentes aminoácidos nas regiões variáveis da cadeia pesada, como a região CDR3. 0 anticorpo de cadeia única F105, que continha o péptido lider da cadeia pesada de imunoglobulina, foi inicialmente clonado no vector de clonagem pSL1180 como descrito acima. Para preparar este anticorpo para a substituição de CDR3 implementou-se a seguinte metodologia. Uma vez que o anticorpo tinha sido clonado num sitio Ncol/Sphl, foi necessário remover algum DNA de enchimento. Assim, o vector foi digerido com Spel e Nhel, para remover o sitio Not I. Após auto-ligação, seleccionaram-se por rastreio colónias nas quais este DNA de enchimento tinha sido removido. 0 plasmídeo resultante continha o anticorpo de cadeia única F105 com o péptido lider em orientação reversa, com dois sitios de restrição única flanqueando a região CDR3 da cadeia pesada. Na extremidade 5' de CDR3 existe um sitio único EagI ACG-GCC-GTG-TAT-TAC-TGT-GCG-CGA (ID SEQ NO: 69) e na extremidade 3' da CDR3 da cadeia pesada está presente um sitio Bst Eli TGG GGC CAG GGA ACC-CYG-GTC ACS GTN WCC (ID SEQ NO: 70). O vector foi digerido com Eag I e Bst Eli, tendo sido ai clonada uma biblioteca de regiões CDR3. Os transformantes resultantes foram digeridos com PVU2, e os anticorpos mutantes foram distinguidos dos de tipo selvagem pela alteração do padrão após digestão com PVU2. Existe um sitio único PVU2 na CDR3 da cadeia pesada; em consequência, nos anticorpos mutantes, esse sitio foi destruído. Assim, o padrão será diferente do de tipo selvagem, que continha a CDR3 de tipo selvagem com o sitio PVU2.

Para a construção da CDR3 sintética utilizaram-se 3 "primers". O "primer" 5' contém um sitio Eag I CGCACA-GTA- 70 ATA-CAC (ID SEQ NO: 71). O "primer" 3' contém um sítio Bst Eli GT-GAC-CGT-GAC-CGG-GGT (ID SEQ NO: 72). A CDR3 envolve a sequência degenerada NNS x 15, em que N é qualquer nucleótido e S é C ou G. Isto minimiza o número de codões de terminação e permite a expressão dos 20 aminoácidos em cada uma das 15 posições G-GCCGTG-TAT-TAC-TGT-GCG-CGA-NNS-TGG-GGC-CAG-GGA-ACC-CCG-GTC (ID SEQ NO: 73). Após tratamento destes três péptidos com quinase, bem como hibridização pela metodologia descrita acima, o péptido resultante tinha filamentação dupla nos nucleótidos do arcabouço flanqueando a CDR3 e continha sítios de restrição aberta. A própria CDR3 permaneceu com filamentação simples. Permitiu-se que polimerase bacteriana enchesse os hiatos. Ver Cwirla, S.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 6378-6382 (1990).

Um método alternativo para obter este resultado consistiria em amplificar por PCR este mesmo oliqo que criámos utilizando os dois polímeros pequenos como polímeros de hibridização para o oligonucleótido longo que abrange a CDR3 após amplificação; o oligonucleótido grande seria digerido com EAGI e BstEII e depois seria ligado utilizando técnicas comuns de biologia molecular.

Os mutantes únicos de CDR3 foram estabelecidos por digestão com PUV2. Em seguida, a cassete do anticorpo completa foi removida por digestão com HindIII-Xba I, que remove a cassete do anticorpo completa juntamente com sítios de clonagem. Depois, estes anticorpos mutantes foram purificados em gel, limpos de genes e clonados em pRC/CMV que tinha sido digerido com HindIII e Xbal. Em seguida, estes plasmídeos resultantes foram transfectados por lipofecção em células COS, como previamente descrito. 71

Depois rastrearam-se mutantes com afinidades de ligação diferentes para a glicoproteina do envelope.

Utilizando a técnica descrita acima produziram-se seis anticorpos sFvl05 mutantes nos quais os aminoácidos da região CDR3 da cadeia pesada tinham sido substituídos por aminoácidos aleatórios.

Um dos seis mutantes, designado R, tinha uma região CDR3 que codifica para (ID SEQ NO: 74) Leu-Thr-Leu-Ile-Ser-Ser-Arg-Leu-Arg-Leu-Ile-Ala-Val-Arg-Met.

Estes seis mutantes não se ligaram à proteina do envelope do HIV-1. 7. Construção do Anticorpo Neutralizador Fab para a Glicoproteina do Envelope

Também foi preparado um vector de expressão eucariótico que é capaz de produzir títulos elevados de fragmentos Fab humanos em células COS-1. Este vector baseia-se no vector pRC/CMV descrito acima; no entanto, a cadeia pesada Fd e a cadeia leve são clonadas em série, e cada cadeia está sob o controlo de um promotor do CMV separado. 0 vector também contém um gene de neomicina, para transfecção estável. A Figura 3 mostra impulso-perseguição de células COS-1 transfectadas com um plasmídeo que expressa fragmentos Fab das cadeias pesada (H) e leve (L) de F105. Na Figura 3, as primeiras três vias consistem no lisato celular e o segundo conjunto de três vias provém do meio celular. As vias para cada conjunto correspondem a 2, 3 e 4 horas de incubação.

Após 30 minutos de etiquetagem com 35S-Met, os lisatos (1) e meio (M) celulares foram recolhidos após os tempos de incubação indicados, tendo-se obtido imunoprecipitados 72 radioactivos com uma mistura de anticorpos anti-IgGi humana e anti-cadeia kapa humana. A experiência de impulso-perseguição apresentada na Figura 3 mostra que niveis elevados de fragmentos Fab de F105 estão presentes em ambos intracelularmente e, além disso, os fragmentos Fab são activamente segregados para o meio. Os lisatos celulares e sobrenadantes de cultura destas células COS-1 transfectadas com Fab F105 ligam-se à gpl20 num ensaio ELISA e ambas as cadeias pesada e leve podem ser facilmente imunoprecipitadas com anticorpo anti-cadeia pesada de IgGi (Fab H na Fig. 3) ou anti-cadeia kapa (Fab K na Fig. 3).

B. CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE ANTICORPOS DE CADEIA ÚNICA ΑΝΤΙ—TAT

Utilizou-se a mesma metodologia geral para expressar anticorpos de cadeia única para outros antigenes. Um anticorpo de cadeia única para a proteína tat do HIV-1 foi gerado do modo seguinte. 1. "Primer" da Cadeia Pesada 0 "primer" 5' VH directo consistiu num oligonucleótido de 55 pares de bases com a sequência seguinte: CCC TCT AGA CAT ATG TGA ATT CCA CCA TGG CCC AGG T C/G A/C A A/G CTG CAG C/G AGTC A/T GG (ID SEQ NO: 49). 0 "primer" JH murino reverso, começando na extremidade 5', tinha a sequência seguinte: GGGGCGCGCTG A/C GGAGACGGTGACC A/G A/T GGT CCC T G/T C/G GCC CCAG (ID SEQ NO: 50). 2. "Primers" da Cadeia Kapa Murina 73

Para a amplificação por PCR da cadeia kapa murina, contendo o agente de ligação intra-cadeias para a produção de um anticorpo de cadeia única, produziu-se o seguinte "primer" Vkappa. TTTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCG GATCT G/C A A/C/T ATTCAGCTGAC C/A CA G/A T/A CTCCA (ID SEQ NO: 51).

Para utilização em conjunção com o "primer" Vkappa directo acima produziram-se dois "primers" Ckappa reversos diferentes. Um consistiu num "primer" de 44 nucleótidos com a sequência seguinte: GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGT TGGTGCAGCATC (ID SEQ NO: 52). Este "primer" irá hibridizar para as posições de Kabat desde 110 até 115. O segundo "primer" Ckappa reverso foi utilizado para amplificação da cadeia Ckappa que contém um sinal de localização nuclear do SV40 na sua extremidade 3'. O "primer" tinha a sequência seguinte. GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTAAACCTTACGTTTCTTCTTCGGCGGAGTTACAGT TGGTGCAGCATC (ID SEQ NO: 53).

Este "primer" irá hibridizar para as posições de Kabat desde 110 até 115 e depois é seguido do sinal de localização nuclear do SV40 com a sequência de aminoácidos seguinte:

Thr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (ID SEQ NO: 54). AMPLIFICAÇÃO POR PCR 74

Utilizaram-se 2-3 μg de RNA total isolado de hibridomas anti-tat-III para produzir cDNA preparado por hibridização com "primers" aleatórios numa reacção de 25 μρ. Cinco até dez por cento do cDNA de filamentação simples foram combinados com o "primer" VH e "primer" Vj e efectuou-se PCR como descrito no Exemplo 1. A temperatura de hibridização para a reacção de PCR foi 56 °C.

Para amplificação por PCR da cadeia leve, o "primer" Vkappa contendo o agente de ligação inter-cadeias foi combinado com o "primer" Ckappa isoladamente ou com o "primer" Ckappa contendo o sinal de localização nuclear do SV40. A temperatura de hibridização para esta reacção foi 56 °C.

Para a amplificação das cadeias leve e pesada utilizaram-se 30 rondas de PCR. Estes produtos de PCR foram purificados por gel, num gel de agarose 2% de baixo ponto de fusão. Uma vez que a análise de sequências prévia da cadeia kapa revelou um sitio BstE-II interno, foi necessário um procedimento de clonagem em múltiplos passos. Em primeiro lugar, o produto de PCR da cadeia pesada foi tratado com quinase Klenow, para reparar as extremidades e assegurar a produção de extremidades planas. Em seguida, o fragmento da cadeia pesada foi digerido com Xbal. Da mesma forma, as duas construções de cadeia kapa diferentes, com e sem o sinal de localização nuclear do SV40, foram tratadas com quinase Klenow, seguido de digestão com Xhol. Quantidades equimolares destes dois fragmentos foram misturadas com o vector PSK+, que tinha sido digerido com Xbal e Xhol. Isto permitiu a clonagem com extremidades coesivas na parte mais afastada das extremidades 5' e 3' e 75 clonagem com extremidades planas entre os dois produtos de PCR.

Após a clonagem com êxito das cadeias pesada e leve, o DNA plasmidico foi digerido com BstE-II; o fragmento BstE-II com aproximadamente 120 pares de bases foi recuperado e clonado novamente no mesmo vector. Este procedimento foi necessário para remover nucleótidos estranhos no sitio de extremidades planas. Obtiveram-se vários clones e confirmou-se a orientação do fragmento BstE-II por amplificação por PCR, utilizando os "primers" VH, Vkappa ou os "primers" Vkappa, Ckappa apresentados acima.

Para clonagem no vector de expressão eucariótico pRc/CMV (Invitrogen), um fragmento Xball/Apal foi obtido do vector PSK + e clonado no vector PRC-CMV que tinha sido digerido com as mesmas enzimas de restrição. Para confirmar a actividade biológica do anticorpo de cadeia única anti-tat obtido desta construção, o anticorpo de cadeia única foi novamente amplificado com um novo "primer" 3' para clonagem no vector de fagemideo P-10-1. Juntamente com o "primer" VH original utilizou-se um novo "primer" Ckappa reverso (ATT AGC GGC CGC TAC AGT TGG TGC AGC ATC) (ID SEQ NO: 55). O anticorpo de cadeia única anti-tat em PRC-CMV foi transfectado para células COS utilizando lipofecção. Obteve-se expressão do anticorpo de cadeia única.

Um segundo sFv anti-tat, que é semelhante ao anticorpo para a tat descrito acima com a excepção de ter uma sequência lider de localização no ER, foi construído do modo seguinte. 76

Os genes dos domínios VH e VL de uma linha de células de hibridoma anti-tat do HIV-1 murino foram clonados e o DNA foi sequenciado como descrito. Um "primer" líder da cadeia pesada (P-L) com o sítio de enzima de restrição adicional, 5' -TTTAAGCTTACCATGAACTTCGGGCTC-3' (ID SEQ NO: 75), e o "primer" reverso (P-J) correspondente à extremidade 3' da região variável da cadeia pesada, 5'-TG(A/C) GGAGACGGTGACC(A/G)(A/T) GGTCCCT-3' (ID SEQ NO: 76), foram utilizados para amplificar a sequência líder e sequências da cadeia pesada rearranjadas por reacção em cadeia de polimerase como descrito acima. Utilizaram-se para amplificar a sequência VL um "primer" VL (P-K), correspondente à sequência da extremidade 5' da VL, 5'-GAGCTCGTGCTCAC(C/A)CA(G/A)(T/A)CTCCA-3' (ID SEQ NO: 77), e um "primer" Ck reverso (P-Ck) , correspondente ao inicio da região constante da cadeia kapa com um codão de terminação, 5'-GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGTTGGTGCAGCATC-3' (ID SEQ NO: 78) ou sem 5'-GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGTTGGTGCAGC ATC-3' (ID SEQ NO: 53), o sinal de localização nuclear do SV4 0 .

Um agente de ligação inter-cadeias de 93 pares de bases foi amplificado utilizando "primers" perfeitamente complementares aos "primers" (P-J) e (P-K) e contendo a sequência do agente de ligação inter-cadeias interno (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 (ID SEQ NO: 1). Os três fragmentos foram purificados por gel e o sFv anti-tat foi produzido por extensão com sobreposição pela metodologia de Clackson, T., et al. [Nature 352: 624 (1991)]. A sequência de sinal do sFv anti-tat montado foi clonada em pRC/CMV, tendo-se confirmado a sequência de DNA [Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 5463 (1977)]. Em seguida, os anticorpos de cadeia única foram novamente amplificados 77 utilizando um "primer" único de arcabouço directo com sitio 5' HindIII 5'-TTTAAGCTTACCATGGACGTGAAGCTGGTGGAGTCT-3' (ID SEQ NO: 79).

C. INIBIÇÃO DA FUNÇÃO POR ANTICORPO INTRACELULAR 1. Capacidade de Anticorpos Para Serem Expressos em Células de Mamífero

Determinou-se a capacidade destas proteínas para serem expressas em células de mamifero por transfecção transitória de células COS-1 e de uma linha de células HeLa que expressam a proteina CD4 de forma constitutiva, HeLa-CD4 [Madden, P.J., et al., Cell 47: 333-348 (1986); McDougal, J.S., et al., J. Immunol. 137: 2937-2944 (1986)], como apresentado abaixo. Verificou-se que, enquanto quantidades abundantes da proteina sFvl05 são precipitadas por anticorpos anti-cadeias pesada e leve humanas, muito pouca proteina sFvl05-KDEL é detectada no ensaio de expressão transitória.

Prepararam-se células que expressam constitutivamente as proteínas sFvl05 e sFvl05-KDEL (COS sFvl05 e COS sFvl05-KDEL) por transfecção de células COS-1 com os dois plasmideos, seguido de selecção quanto à resistência à neomicina. Células COS-1 em placas de 35 mm foram transfectadas com 10 μρ de pCMV-sFv ou pCMV-sFv-KDEL ou DNAs plasmidicos vectoriais que contêm o gene de resistência à neomicina utilizando lipofectina (BRL Corp), como descrito por Chen, S.Y., et al., J. Virol. _65_: 5902-5909 (1991). Duas horas após a transfecção, adicionaram-se às células 1,5 ml de Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado 78 com soro fetal de bovino 10% e incubou-se o sistema durante 48 horas. As células transformadas foram seleccionadas em DMEM com soro fetal de bovino 10% contendo 500 μg/ml de G418 (BRL). Em seguida, as células transformadas cresceram em placas de 6 cavidades e foram etiquetadas metabolicamente por incubação durante 30 minutos em 0,5 ml sem cisteina contendo 100 μ<3ί de 35S-cisteína. Depois, as células foram lavadas e incubadas em DMEM contendo cisteina não etiquetada 10 mM. As proteínas foram imunoprecipitadas dos lisatos ou meio celulares e foram analisadas por electroforese. Ver a Figura 4. Estas células foram etiquetadas por impulsos durante 30 minutos, foram perseguidas e imunoprecipitadas com anticorpo anti-cadeia K de imunoglobulina humana do lisato ou cultura celular. As proteínas foram resolvidas por electroforese num gel de SDS-poliacrilamida 12,5% e foram visualizadas por autorradiografia (Laemmli, U.K., Nature 227: 680-684 (1970)). Mostra-se na figura a posição dos marcadores de proteínas. Via 1, células CMV-COS-1, perseguição de 60 minutos. Vias 2-5, amostras imunoprecipitadas de lisatos celulares de COS sFv 105. Vias 6-9, precipitadas do meio de sFvl05-COS. Vias 2 e 6, perseguição de 30 minutos. Vias 3 e 7, perseguição de 60 minutos. Vias 4 e 8, perseguição de 120 minutos. Vias 5 e 7, perseguição de 360 minutos. A coloração imunofluorescente de células transformadas com sFv ou vector foi feita em lamelas de cobertura de 15 mM de diâmetro, que foram fixadas em solução contendo 95% de etanol e 5% de ácido acético a -20 °C durante 5 minutos. Ver Figuras 5A-D. As células transformadas com sFv 105 isoladamente (A) ou vector isoladamente (D) ou células transformadas com sFv-KDEL (B) co-transfectadas com 10 μg 79 do plasmídeo que expressa a glicoproteína do HIV-1 pSVIII env, descrito por Helseth, E.M., et al., J. Virol. 64: 2416-2420 (1990), foram coradas com anticorpo anti-cadeia κ humana, seguido de incubação com IgG anti-coelho conjugado com fluoresceina (FITC). Para a coloração do ER, as células transformadas com vector foram incubadas com anticorpo anti-BIP, seguido de IgG-FITC anti-ratinho (C). As células transformadas com vector foram incubadas com anticorpo anti-Bip a 37 °C durante 30 minutos, seguido de IgG-FITC anti-coelho ou IgG-FITC anti-ratinho após lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após uma lavagem final, as células foram montadas e observadas num Microscópio Nikkon com óptica de fluorescência, a uma ampliação de 1100 vezes.

Assim, foi possivel determinar a localização da proteina sFvl05 na célula. Este anticorpo cora uma rede tubular em todo o citoplasma, típico de uma proteína residente no ER (Figura 5A). Este padrão é igual ao obtido utilizando um anticorpo para a proteína residente no ER proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulinas, BiP

[Wu, G.E., et al. Cell 33: 77-83 (1983); Bole, D . G. f θ t al., J. Cell Biol . 102: 1558-1566 (1986); Dul, J .L., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 8135-8139 (1990); Knittler, M.R., et al., The EMBO J. 11: 1573-1581 (1992)] na célula paterna (Fig. 5c). 2. Capacidade de Anticorpos Para a Glicoproteína do Envelope Para Inibirem a Biossíntese e Actividade da Proteína do Envelope

Determinou-se a capacidade de linhas celulares que expressam constitutivamente as proteínas sFvl05 ou sFvl05-KDEL para inibir a biossíntese e actividade da proteína do 80 envelope do HIV-1 por transfecção das células COS sFvl05 e COS sFvl05-KDEL com um vector que expressa níveis elevados da proteína do envelope. A análise de impulso-perseguição seguida de imunoprecipitação da proteína do envelope mostra que uma fracção significativa da gpl60 é clivada em gpl20 na linha celular paterna durante a perseguição de quatro horas (Figura 6) . Apesar de quantidades semelhantes de gpl60 serem produzidas nas células paternas e COS sFvl05, muito pouca gpl20 é evidente após a perseguição de quatro horas (Figura 6). A proteína gpl60 presente nas células COS sFvl05 pode ser co-precipitada utilizando um anticorpo anti-cadeia kapa humana. Este anticorpo não precipita a proteína gpl60 produzida na linha de células COS-1 paterna. Um anticorpo para a glicoproteína do envelope do HIV-1 também co-precipita a proteína sFvl05 em células que expressam a gpl60 (Figura 6).

As células transformadas foram transfectadas com 10 μg de DNA do plasma de pSVIII env e 2 μq de pSVIII tat que expressa a tat (ver Helseth, E.M., J. Virol., supra), o c etiquetadas com impulsos com S-cisteína durante 30 minutos e perseguidas durante 4 horas. Os lisatos celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-K ou soro policlonal anti-gp 120 de ovelha ou coelho (AIDS Research and Reference Program). Como descrito acima, as proteínas foram resolvidas por electrof orese em géis de SDS-poliacrilamida 11% e foram visualizadas por autorradiografia como descrito acima. Ver a Figura 6. A Fig. 6A mostra lisatos celulares imunoprecipitados com soro policlonal de ovelha anti-gpl20 e a Fig. 6B mostra lisatos celulares imunoprecipitados com soro de coelho anti-gpl20. Fig. 6A: Via 1, sFvl05-COS-l pseudo-transfectadas 81 utilizando anti-κ e anti-gp 120 imunoprecipitado do HIV-1. Vias 2-4, precipitado de sFvl05-COS-l transfectadas de envelope. Via 2, precipitado por anti-gpl20. Via 3, precipitado por anticorpo de cadeia anti-κ. Via 4, precipitado por anticorpos anti-κ e anti-gpl20 (AIDS Research and Reference Program) . Fig. 6B, Via 1, imunoprecipitado de COS-1 pseudo-transfectadas utilizando anticorpos anti-cadeia κ2 e anti-proteína gpl20. Vias 2-3, precipitado de sFvl05-KDEL transfectadas de envelope. Via 2, precipitado por anticorpo anti-gpl20. Via 3, precipitado por anticorpo anti-cadeia k. Via 4, precipitado de células sFvl05-KDEL utilizando anticorpos anti-cadeia κ e anti-gp 12 0 .

Nas células COS sFvl05-KDEL, o processamento de gpl60 em gpl20 é parcialmente inibido (Figura 8) . A Figura 8 mostra a ligação especifica de SFV105-KDEL à glicoproteína do HIV-1 em células por autorradiogramas de géis de poliacrilamida, mostrando gue a proteína sFvl05-KDEL é co-precipitada com a glicoproteína do HIV-1. A via 1 mostra lisatos de células COS-1 pseudo-transfectadas precipitados com uma mistura de anti-soros anti-gpl20 e anti-cadeia kapa. As vias 2-3 mostram lisatos de células COS sFvl05-KDEL transfectadas com o plasmídeo de expressão do envelope pSVIIIENV. A via 2 foi precipitada com um anti-soro anti-gpl20. A via 3 foi precipitada com um anti-soro anti-cadeia kapa. A via 4 mostra lisato de células COS sFvl05-KDEL precipitado com uma mistura de anti-soros anti-gpl20 e anti-cadeia kapa . A guantidade de proteína sFvl05-KDEL precipitada por um anticorpo anti-cadeia kapa humana aumenta na presença de gpl60. A proteína gpl60 presente nas células COS sFvl05-KDEL também é precipitada por um 82 anticorpo anti-cadeia kapa. Anti-soro que expressa a gpl60 é semelhante à distribuição da proteina sFvl05 em células COS sFvl05 (Figura 5B). Evidentemente, a proteina sFvl05-KDEL é estabilizada por ligação de gpl60.

Realizaram-se experiências de co-imunoprecipitação com anti-soro para a proteina "chaperone" do ER, BiP. A proteina sFvl05 é precipitada utilizando um anti-soro para a proteina BiP. Apesar de ser conhecido que as cadeias pesadas e cadeias leves de imunoglobulinas se ligam à BiP (Wu, G.E., et al., Cell 33: 77-83 (1983); Bole, D.G., et al., J. Cell Biol. 102: 1558-1566 (1986); Dul, J.L., et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 8_7: 8135-8139 (1990); Knittler, M.R., et al., The EMBO J. 11: 1573-1581 (1992)), realizaram-se várias experiências adicionais para excluir a possibilidade da inibição do processamento da gpl60 se dever a actividade inespecifica do anticorpo sFvl05.

Examinou-se a capacidade de células que expressam um anticorpo de cadeia única capaz de se ligar a sFvl05 para inibir o processamento de um mutante da proteina env. Para esta finalidade, as células COS sFvl05 foram transfectadas com um plasmideo que expressa um mutante da proteina do envelope no qual o ácido glutâmico foi substituído por glutamina na posição 370. Foi previamente mostrado que esta mutação elimina a ligação detectável à proteina do envelope do anticorpo paterno sFvl05 [Thali, M.C., et al., J. Virol. 66: 5635-5641 (1992)]. Também se examinou a especificidade da ligação do sFvl05 à proteina do envelope do HIV-1 por transfecção das células COS sFvl05 com uma proteina do envelope do virus Punta Toro, um Bunyavírus, ou com a hemaglutinina da estirpe WSN do virus influenza A, um Ortomixovirus. Foi previamente mostrado que estas duas 83 proteínas virais são processadas no ER e no aparato de Golgi (Chen, S.Y., et al., J. Virol. _65_: 5902-5909 (1991); Hughey, P.G., et al., J. Virol. 6_6: 5542-5552 (1992)). Nenhuma das proteínas dos vírus Punta Toro e influenza precipitou com anticorpos anti-cadeia kapa humana que se verifica co-precipitarem o complexo sFvl05 gpl60 do HIV-1. Na Figura 9, as vias 1 e 2 mostram que, em contraste com o bloqueio do processamento da proteína do envelope paterna em células COS sFvl05, a proteína do envelope gpl60 mutante é processada normalmente em gpl20. Assim, a Figura 9 mostra que a sFvl05 não é co-precipitada com proteínas não relacionadas. As células COS sFv foram transfectadas com 10 μρ de 370E/D que expressa a glicoproteína do HIV-1 mutante, ao qual não se liga F105 [Thali, M.C., et al., J. Virol., supra], foram etiquetadas com impulsos com 35S-cisteína durante 30 minutos e depois foram perseguidas durante 4 horas. As proteínas foram imunoprecipitadas com anticorpo anti-glicoproteína do HIV-1 (via 1) ou anti-cadeia kapa (via 2). As células COS-sFv foram infectadas com 5 M.O.I. de vírus vacínia que codifica a polimerase de T7 durante 2 horas e depois foram transfectadas com 10 μρ de DNAs plasmídicos PTV-G1-G2, que contém os genes das glicoproteínas G1 e G2 do vírus Punta Toro sob o controlo do promotor de T7 (Chen, S.Y., et al., J. Virol., supra), ou T7-HA plasmídico, que contém o gene HA da estirpe WSN do vírus influenza A sob o controlo do promotor de T7 [Chen, supra]. Em seguida, as células foram etiquetadas com impulsos com 35S-cisteína durante 30 minutos e depois foram perseguidas durante 4 horas. Vias 3 e 4: os lisatos de células transfectadas com PTV G1-G2 imunoprecipitaram com anti-glicoproteína do PTV (Chen, supra) (Via 3) ou anti-cadeia kapa (Via 4) . A Figura 9 também mostra que o 84 processamento da proteína do envelope de Punta Toro não é afectado pela expressão do anticorpo sFvl05 (vias 3-6).

Examinou-se a capacidade de outros anticorpos de cadeia única que não se ligam à gpl60 para interferir no processamento da proteína do envelope. Utilizaram-se dois anticorpos de cadeia única diferentes. Um desses anticorpos é o anticorpo de cadeia única derivado de um anticorpo monoclonal murino que reconhece a proteína tat do HIV-1. Este anticorpo de cadeia única anti-tat foi alterado a partir do alvo intracelular normal do anticorpo para a tat de modo a ter uma sequência líder que irá abordar selectivamente o ER. Este anticorpo também é retido intracelularmente de forma estável em células COS e não é segregado para o meio num ensaio de expressão transitória. 0 processamento da gpl60 em gpl20 em células COS não foi afectado por co-transfecção de um plasmídeo que expressou a glicoproteína do HIV-1 com o plasmídeo que expressou o sFv anti-tat. Além disso, um anti-soro anti-imunoglobulina que precipita a sFv anti-tat não co-precipita a proteína do envelope do HIV-1 (ver Figura 10) . A Figura 10 mostra que um sFv anti-tat retido intracelularmente não se liga à glicoproteína do HIV-1. As células COS foram co-

transf ectadas com 10 μg de pSVIIIenv e 10 μg de DNA plasmídico de pRC/CMV-sFvtat, foram etiquetadas com impulsos com 35S-cisteína durante 30 minutos e perseguidas durante quatro horas. As proteínas foram imunoprecipitadas com anti-soros anti-imunoglobulina de ratinho (Via 1) ou anti-gpl20 de ovelha (Via 2) e foram analisadas por SDS-PAGE. Também se utilizaram os seis mutantes de sFvl05 produzidos, nos quais todos os aminoácidos da região CDR3 da cadeia pesada foram substituídos por aminoácidos aleatórios, e que não se ligam à proteína. O processamento 85 da gpl60 em gpl20 em células COS não foi afectado por co-transfecção dos plasmídeos que expressam estas proteínas mutantes. Os anti-soros anti-imunoglobulina não co-precipitaram a proteína do envelope do HIV-1.

Determinou-se a capacidade das proteínas sFvl05 e sFvl05-KDEL para inibir a função da proteína do envelope medindo a capacidade de células transfectadas com o gene do envelope para induzir formação de sincícios de células CD4+. Num conjunto de experiências, as células vectoriais COS paternas bem como as células COS sFvl05 e COS sFvl05-KDEL foram transfectadas com um plasmídeo que expressa uma glicoproteína do envelope funcional. Aos dois dias pós-transfecção, as células foram misturadas, numa razão de cerca de 1 para 10, com uma linha de células T CD4+ humana, SupTl, que é susceptível a fusão mediada pelo envelope. A extensão da formação de sincícios mediada pelo envelope foi reduzida em 80-90% em células que expressam a proteína sFvl05 ou sFvl05-KDEL (Figura 7). Foram produzidas quantidades semelhantes de gpl60 nas três linhas, o que foi determinado por etiquetagem metabólica e precipitação das culturas transfectadas. Também se observou redução da formação de sincícios por co-transfecção da linha de células CD4 + HeLa com um plasmídeo que expressa uma glicoproteína funcional do envelope juntamente com um segundo plasmídeo que expressa a proteína sFvl05 ou sFvl05-KDEL (Figura 7) . Em contraste, não ocorreu redução significativa da formação de sincícios quando se utilizou o segundo plasmídeo que expressa o sFv anti-tat (Figura 7). Células HeLa CD4+ foram co-transf ectadas com 3 μg de pSFIIIenv e 15 μg de vector ou pCMV-sFv ou pCMV-sFv-KDEL. Contaram-se os sincícios às 30 horas pós-transfecção. As 86 células transformadas foram transfectadas com 3 μg de pSVIIIenv que foram incubados durante 48 horas, depois foram enxaguadas em PBS e incubadas com EDTA 50 mM a 37 °C durante 40 minutos. As células foram removidas da placa, lavadas com PBS e novamente suspensas em 2 ml de DMEM suplementado com soro fetal de vitelo 10 O o · Em seguida, adicionaram-se às células cerca de 2 X 10 6 linfócitos

SupTl, as células foram incubadas a 37 °C durante 12 horas e pontuaram-se os sincícios. Para examinar a produção de HIV-1 infeccioso pelas células transformadas, células COS, COS sFvl05 e COS sFvl05-KDEL foram transfectadas com 5 μρ de DNA de pSVIIIB infeccioso. Os sobrenadantes das células foram recolhidos no dia 4 da transfecção e, em seguida, 1 ml de cada um dos sobrenadantes foi inoculado com cerca de 2 x 108 células SupTl durante 12 horas. As células SupTl foram então lavadas duas vezes com DMEM e, passadas 12 horas, foram colocadas no meio RPMI suplementado com soro fetal de bovino 10%. Recolheram-se os sobrenadantes das células SupTl e mediu-se a produção de partículas virais utilizando um soro de radioimunoensaio sensivel para a proteina do antigene capsidico p24 do HIV-1 (DuPont-NEN Inc.), seguindo as instruções do fabricante. A Figura 7 mostra uma redução significativa da formação de sincicios nas células HeLa CD4+ e nas células COS transformadas que expressam sFv ou sFv-KDEL. Mostram-se as percentagens dos valores de sincicios observados nas células HeLa CD4+ ou nas células transformadas com vector transfectadas com pSVIII env.

Para examinar a capacidade das proteínas sFvl05 para inibirem a produção de virus infeccioso, células vectoriais COS, COS sFvl05 e COS sFvl05-KDEL foram transfectadas com um plasmideo que contém uma cópia do genoma virai completo 87 [Fisher, A.G., et al., Nature 316: 262-265 (1985); Helseth, E.M., et al., J. Virol. _64: 2416-2420 (1990)]. Aos quatro dias pós-transfecção, o vírus presente nos fluidos sobrenadantes da cultura foi utilizado para iniciar a infecção da linha celular indicadora sensível SupTl. Verificou-se que os sobrenadantes das três linhas de células transfectadas contêm quantidades semelhantes da proteína capsídica virai, p24. Foi previamente mostrado que a libertação de proteínas capsídicas para o sobrenadante celular ocorre na ausência de síntese da glicoproteína do envelope, bem como na presença de glicoproteínas do envelope que têm defeitos de processamento e que, em consequência, são retidas no ER [McCune, J.M., et al., Cell 53: 55-67 (1988); Ratner, L.N., et al., AIDS Research and Human Retrovlruses T_: 287-294 (1991)]. A Figura 11 mostra que a replicação do vírus em células SupTl, iniciada por sobrenadantes das células COS sFvl05 ou COS sFvl05-KDEL transfectadas, é retardada em cerca de 5 dias relativamente à iniciada por vírus produzido por uma linha de células COS-1 de controlo que contém o vector mas não as sequências sFvl05. A Figura 11 mostra vírus produzido pelas células SupTl infectadas. O DNA de pSVIIIB infeccioso é um DNA pró-viral do HIV-1 infeccioso da estirpe HXBc2 [Fisher, A.G., et al., Nature 315: 262-265 (1985)]. As células transformadas com sFvl05 ou sFvl05-KDEL ou vector foram transfectadas com 5 μρ de DNA plasmídico de pSVIIIB contendo um DNA pró-viral do HIV-1 infeccioso da estirpe HXBc2. Após 4 dias de transfecção, os sobrenadantes das células transfectadas foram inoculados com células SupTl durante 16 horas e depois foram lavados, colocados em meio fresco e monitorizados quanto à concentração da proteína p24 capsídica virai através da actividade da gag 88 p24 no meio de cultura. As quantidades no meio detectadas a partir dos sobrenadantes de células transfectadas foram 1,2 ng/ml (vector-COS) , 1,0 ng/ml (COS sFvl05) e 1,4 ng (COS sFvl05-KDEL), respectivamente. Os símbolos da Figura 11 representam os resultados obtidos utilizando sobrenadantes recolhidos da linha de células COS de controlo que contém o vector isoladamente (0) , uma linha de células COS que expressa constitutivamente a proteína sFvl05 (□) e uma linha de células COS que expressa a proteína sFvl05-KDEL (Δ) .

Quando se utilizou diluição em série dos sobrenadantes para infectar células SupTl, ocorreu uma redução superior a 103 vezes da formação de sincícios (Figura 12). A Figura 12 mostra o título do vírus por formação de sincícios em células SupTl. As células vectoriais COS e COS sFvl05 transformadas foram transfectadas com 4 μρ de DNA plasmídico de pSVIIIB contendo um DNA pró-viral do HIV-1 infeccioso da estirpe HXBc2 [Ratner, supra]. Após 48 horas de transfecção, os sobrenadantes das células transfectadas foram recolhidos e utilizados em diluições em série para infectar células SupTl durante 16 horas e depois foram lavados. Passados 8 dias contaram-se os sincícios. Os dados apresentados consistem no número de cavidades positivas para sincícios/número de cavidades contadas. Contaram-se em cada cavidade cinco campos de grande aumento (HPF). Um ou mais sincícios em cinco HPF conta como (+) para a diluição. O retardamento da replicação de vírus produzido por células COS sFvl05 e a diminuição do título infeccioso são atribuídos à baixa infectividade do vírus relativamente à do vírus produzido pela linha de células de controlo. Os resultados destas experiências demonstram que células podem produzir anticorpos que funcionam intracelularmente. O 89 anticorpo é expresso de forma estável, é retido no retículo endoplasmático e não é tóxico para as células. 0 anticorpo liga-se à proteína do envelope dentro da célula e inibe a maturação e função desta proteína do vírus crítica. A infectividade das partículas de HIV-1 produzidas pelas células que expressam o anticorpo de cadeia única é substancialmente reduzida.

Utilizou-se um ensaio de transcomplementação que utiliza dois plasmídeos, um que codifica as proteínas rev e do envelope (pSVIIIenv) sob o controlo da LTR do HIV-1 e o outro contendo um provírus do HIV-1 com uma deleção no gene env (pHXBenvCAT) e um gene da cloranfenicol-acetiltransferase (CAT) que substitui o gene nef [Helseth, J. Virol. _6_4: 2416 (1990)]. Ambos os plasmídeos foram transfectados em células COS-1 e os sobrenadantes das células, que continham partículas de vírus com infectividade numa única ronda, foram utilizados para infectar células SupT paternas, vectoriais SupT ou SupT sFvl05. Determinou-se a actividade da CAT a partir dos lisatos das células infectadas, que reflecte a infectividade numa única ronda das partículas do vírus. Nestas experiências observaram-se quantidades comparáveis de actividade da CAT a partir das células SupT paternas, vectoriais SupT e SupT sFvl05 infectadas com os sobrenadantes das células COS co-transfectadas, ao passo que não se observou actividade detectável da CAT a partir das células SupT paternas, vectoriais SupT e SupT sFvl05 infectadas com os sobrenadantes das células COS transfectadas com qualquer um dos plasmídeos pSVIIIenv ou pHXBenvCAT isoladamente. Estes resultados experimentais indicam que as células SupT sFvl05 são susceptíveis a infecção pelo HIV-1 e que o bloqueio observado dos efeitos 90 citopáticos e da produção de vírus infeccioso se deve a um acontecimento tardio no ciclo de vida do vírus (reunião de viriões infecciosos). Esta experiência confirma que a capacidade enfraquecida para suportar a replicação do HIV-1 nas células SupT sFvl05 não se deveu à perda da função do receptor CD4 ou outras alterações não observadas que tenham ocorrido em resultado da produção de anticorpo intracelular. A expressão do sFvl05 não interfere na expressão de várias moléculas da superfície celular. Mostrámos que a expressão de CD4 de superfície é normalizada após infecção com HIV-1 de células SupT produtoras de sFvl05. Efectuámos uma análise de FACS em marcadores de superfície adicionais, incluindo CD3, CD5, CD7, CD8, β2Μ, CD20 e HLA-DR. Não se observaram diferenças na intensidade da fluorescência entre células vectoriais SupT e células SupT sFvl05, quando se compararam os níveis de superfície de CD3, CD5, CD7, CD8 e β2Μ. Não ocorreu expressão de superfície de CD20 ou HLA-DR em nenhuma das linhas de células. Estes marcadores estão de acordo com o fenótipo publicado de células SupT.

As células transduzidas são capazes de responder a estímulos apropriados com níveis acrescidos de proteínas indutíveis. Efectuaram-se várias experiências de estimulação com PHA, comparando os níveis de incorporação de 3H-timidina entre células vectoriais SupT e SupT sFvl05. Após 6 horas de incubação com ou sem PHA 8 mM e etiquetaqem com 3H-timidina, observou-se um aumento superior a 10 vezes da incorporação de timidina em ambas as linhas de células, ao passo que os níveis não estimulados foram equivalentes (vectoriais SupT - estimuladas 1485 cpm/não estimuladas 139 cpm; células SupT sFvl05 - estimuladas 3330 cpm/não 91 estimuladas 263 cpm) . Em consequência, estas células transduzidas aparentam responder à resposta mitogénica em niveis equivalentes. A partir destes dados adicionais concluímos que as células SupT sFvl05 mantêm o fenótipo paterno, conseguem responder apropriadamente a estímulos externos, são resistentes aos efeitos citopáticos da infecção com o HIV-1 e as células infectadas produzem partículas do vírus HIV-1 cuja infectividade está acentuadamente decrescida. Estes efeitos resultam da actividade de ligação intracelular das moléculas sFvl05 com gpl60. 4. Capacidade do Anticorpo para a Proteína Tat para Inibir a Transactivação A proteína tat do HIV-1 procede à transactivação de genes expressos da repetição terminal longa (LTR) do HIV-1. Desenvolveu-se um ensaio sensível para determinar a presença de tat na célula introduzindo tat em células que expressam um plasmídeo contendo o repórter LTR-CAT do HIV-1.

Ensaio de Cloranfenicol-Acetiltransferase (CAT) H3TI (NIAID Aids Reagent Program), uma linha de células HeLa contendo um plasmídeo LTR-CAT integrado, cresceu em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de vitelo (FCS) 10%. As células cresceram até 50% de confluência em placas de cultura de tecidos Nunc de 6 cavidades. Várias concentrações de SCA anti-tat com líder, SCA anti-tat sem SV40 (VK) e SCA anti-tat com SV40 (VKSV40) foram co-inf ectadas em H3TI com 0,1 microgramas de 92 pSVIIIenv, um plasmídeo que expressa a tat, utulizando lipofecção durante duas horas.

Mediu-se a actividade da CAT como descrito [Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051 (1982)] 72 horas após a transfecção. A transfecção de células HeLa contendo o plasmideo repórter LTR-CAT do HIV-1 exibe transactivação significativa (25X) com a transfecção de apenas 0,01 microgramas de plasmideo que expressa a tat (Figura 20) .

Inibição da Actividade da Tat

Determinou-se do modo seguinte o efeito sobre a transactivação da presença de anticorpos de cadeia única (SCA) anti-tat expressos intracelularmente. A quantidade de 10 microgramas de SCA anti-tat (VK) , SCA anti-tat com o sinal de localização nuclear do SV40 (VKSV40) e SCA anti-tat com uma sequência lider de imunoglobulina para dirigir o SCA para o retículo endoplasmático foi co-transfectada com 0,1 microgramas de plasmideo que expressa a tat pSVIIIenv em células HeLa contendo o plasmídeo LTR-CAT do HIV-1. Uma vez que a sequência líder dirige o anticorpo de cadeia única para o ER, não deve exercer nenhum efeito na tat, que está presente apenas no citoplasma e no núcleo. Os resultados, resumidos na Figura 21, mostram que a presença de SCA anti-tat VK e SCA anti-tat VKSV40 resulta num decréscimo da transactivação do LTR-CAT do HIV-1 pela tat em comparação com a actividade do mesmo anticorpo dirigido para um compartimento diferente da célula. O VK anti-tat exibe 93 apenas 4% da actividade do SCA anti-tat com líder, ao passo que o VKSV40 anti-tat exibe 18,4%.

Quando a quantidade de anticorpo adicionada às células passa a metade (Figura 22), a actividade da tat em células transfectadas com VK anti-tat perfaz 15% da actividade total, ao passo que o VKSV40 anti-tat exibe 28%. 5. Expressão Indutível do Anticorpo Intracelular

Clonámos o sFv F105 sob o controlo da 5' LTR do HIV-1 e estabelecemos linhas de células estáveis em células SupT. Como se pode observar na Figura 13, via 1, o sFv F105 é expresso após transfecção de células SupT LTR sFv F105 estáveis com o plasmídeo que expressa a tat pSVIIItat. A Figura 13 mostra células SupT transformadas de modo estável com pLTR sFv F105 (Via 1) ou pRC/CMV sFv F105 (Via 2) . As células SupT LTR sFv F105 foram adicionalmente transfectadas com pSVIIItat. Ambas as células foram etiquetadas com 35S-Cys durante 3 horas, tendo-se preparado lisatos celulares. A radioimunoprecipitação foi feita com anti-soros anti-cadeia kapa humana, seguido de SDS-PAGE 15%. Não se observa sFv F105 na ausência de expressão da proteína tat. A interdependência entre promotor e célula desta expressão está apresentada na via 2 da Fig. 13, onde se utiliza o promotor do CMV. Foram rastreados muitos clones e virtualmente nenhum produziu anticorpo detectável. Células Jurkat originaram resultados semelhantes.

As células SupT transformadas de modo estável descritas acima transformadas de modo estável com o sFv F105 sob o controlo da LTR do HIV-1 foram induzidas com concentrações variáveis de proteína tat. A Figura 16 mostra que o sFv F105 foi expresso de forma indutível com apenas 0,1 μρ de 94 proteína tat. A Via 1 mostra a administração de 10 pg de proteína tat; a Via 2 ilustra 1 pg de proteína tat; a Via 3 ilustra 0,5 pg de proteína; a Via 4 ilustra 0,1 pg de proteína, e a Via 5 ilustra 0 pg de proteína. Há um marcador para indicar a localização do sFv 105. As células SupT transformadas mantêm a morfologia e velocidades de replicação normais e podem ser transduzidas para expressarem níveis elevados do sFv F105. Células SupT foram infectadas com o HIV-1 como descrito acima. Em seguida, foram transduzidas de forma estável com pLTR sFv F105 como descrito acima. A Figura 17 é uma análise de FACS de células SupT. A Figura 17A é um controlo negativo mostrando uma célula SupTl que não está infectada. A Figura 17B é um controlo positivo das células SupT infectadas com HIV que não foram transduzidas. A Figura 17C é uma análise de FACS das células SupT infectadas com HIV e transduzidas com SupT HIV-LTR-sFv 105 e a Figura 17D ilustra células SupT infectadas com HIV pseudo-infectadas com um vector contendo a LTR do HIV mas não o gene do anticorpo sFv 105.

As Figuras 17B-D mostram a coloração de superfície de gpl20 utilizando FITC-anti-gpl20 (ABT Inc.) oito dias após infecção com 20 M.O.I. da estirpe HXB2 do HIV-1. Como pode observar-se da análise, a Figura 17D mostra o mesmo padrão geral de coloração das células SupT relativamente ao controlo positivo (Fig. 17B) . Em contraste, as células infectadas com o HIV transduzidas com o anticorpo de acordo com a presente invenção (Fig. 17C) exibem uma coloração de fundo semelhante ao controlo negativo (Fig. 17A), desse 95 modo demonstrando que a expressão da gpl20 de superfície está acentuadamente decrescida em células SupT sFv 105.

As Figuras 18A-D referem-se à expressão de CD4 de superfície nessas células. A Figura 18A mostra a coloração de fundo num controlo negativo, ao passo que a Fig. 18B mostra a coloração de superfície de CD4 utilizando FITC-anti-CD4 (ABT, Inc.) aos oito dias pós-infecção com 20 M.O.I. da estirpe HXB2 do HIV-1 (o controlo positivo). A Figura 18D mostra a regulação negativa acentuada da expressão de CD4 em células SupT infectadas com o HIV que são pseudo-inf ectadas com o vector LTR do HIV oito dias após essa infecção. Em contraste, a Figura 18C mostra que a expressão de CD4 de superfície nas células SupT infectadas com o HIV transduzidas com sFv 105, sob o controlo da LTR do HIV, foi quase normal oito dias após a infecção. Assim, estas experiências demonstram que a expressão de CD4 de superfície não foi regulada negativamente de modo significativo em células nas quais a proteína do HIV foi abordada selectivamente de acordo com a presente invenção. A experiência implica suplementarmente que os complexos intracelulares de CD4-gpl60, que se sabe formarem-se no ER, podem ser destruídos pelo presente método. A Figura 19 mostra os efeitos citopáticos da inibição do vírus HIV-1 em células SupT CD4 infectadas com o HIV que expressam o sFv F105. A linha (Θ) mostra uma célula SupT pseudo-transfectada. A linha (Δ) é um controlo positivo mostrando uma célula SupT que foi infectada com o HIV nas condições descritas acima. A linha (□) mostra a célula SupT que foi infectada nas condições descritas acima e transduzida com o anticorpo sFv 105 sob o controlo da LTR do HIV, como discutido acima. Esta figura mostra resultados 96 de formação de sincicios após infecção das células vectoriais SupT ou células SupT sFv 105 com 20 M.O.I. da estirpe HXBC2 do HIV-1, como descrito acima. Passados 11 dias pós-infecção, não se formaram virtualmente nenhuns sincicios nas células SupT sFv 105. Em contraste, nas células SupT, observa-se um pico de sincicios após 4-5 dias. Estas experiências são consistentes com a ausência de expressão de superfície da gpl20 discutida acima, sugerindo que os presentes anticorpos intercelulares conduzem a resistência aos efeitos citopáticos da gpl20.

Esta invenção foi descrita em pormenor, incluindo as respectivas especificações preferidas. No entanto, será apreciado que os experimentados na área, ao considerarem esta revelação, podem fazer modificações e aperfeiçoamentos sem sair do âmbito da invenção tal como é apresentada nas reivindicações. (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:1: G!y Gly Gly Gíy Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gíy GJy Ser 1 5 10 15' (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:2: 97

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Lys Gtu Ser Gly Ser Vai Ser Ser Giu Gin Leu Ala Gin Phe Arg Ser 15 10 IS

Leu Asp (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:8: Gíu Ser Giy Ser Vai Ser Ser Gly Giu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp 1 S 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:9: TTTGCGGCCG CTCAGGTGCA RCTGCTCGAG 30 TCYGG 35 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 66 pares de bases 99 (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:10: AGATCCGCCG CCACCGCTCC CACCACCTCC 30 GGAGCCACCG CCACCTGAGG TGACCGTGAC 60 CRKGGT 66 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 69 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:11: GGTGGCGGTG GCTCCG6AGG TGGTGGGÀG 30 CGGTGGCGGC G6ATCTGAGC TCSWGMTGACC 60 CAGTCTCCA 69 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:12: GGGTCTAGAC TCGAGGATCC TTATTAACGC 30 GTT6GTGCAG CCACAGT 47 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:13:

Ser Glu Lys Asp Glu Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 14: GGGTCTAGAC TCGAGGATCC TTATTACAGC 30 TCGTCCTTTT CGCTTGGTGC AGCCACAGT 59 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:15: TTTACCATGG AACÂTCTGTG GTTC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:16:

TTAGCGCGCT GAGGTGÃCCG TGACCRKGGT (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:17:

Lys Aso Glu Leu 1 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:18

Asp Asp Giu Léu 1 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:19

Asp Glu Giu Leu 1 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:20

Gin Giu Asp Leu 1 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:21

Arg Asp Glu Leu 1 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 102 (A) COMPRIMENTO: 7 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:22:

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:23:

Pro Gin Lys Lys He Lys Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:24:

Gin Pro Lys Lys Lys Pro 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:25:

Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala Hís Gin 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases 103 (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:26:

Arg Gin Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gin Arg 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:27:

Met Pro teu Thr Arg Arg Arg Pro Ala Ala Ser Gin Ala Leu Ala Pro 1 5 10 15

Pro Thr Pro (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:28: lyiet Asp Asp Gin Arg Asp teu He Ser Asn Asn Glu Gin teu Pro 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:29: JVIet teu Phe Asn teu Arg Xaa Xaa teu Asn Asn Ala Ala Phe Arg His 15 10 15

Gly Hts Asn Phe Met Vai Arg Asn Phe Arg Cys Giy Gin Pro teu Xaa 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:30 G!y Cys Vai Cys Ser Ser Asn Pro 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:31

Giy Gin Thr Vai Thr Thr Pro Leu

1 S (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:32

Giy Gin Giu Leu Ser Gin Bis Giu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:33

Gly Asn Ser Pro Ser Tyr Am Pro 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:34

Gly Vai Ser Gly Ser Lys GiyGirt 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:35

Gly Gin Thr He Thr Thr Pro Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:36

Gly Gin Thr He Thr Thr Pro Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:37

Gly Gín lie Ph© Ser Arg Ser Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:38

Gty Gin He His Gíy Leu Ser Pro 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:39

Gty Aie Arg Ala Ser Vaí Leu Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:40

Gly Cys Thr Leu Ser Ala Giu Giu t 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:41 Gíy Gin Asn Leu Ser Thr Ser Asn 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:42

Giy Ata Ata teu Thr Ile Leu Vat 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:43

Giy Ata Ata Leu Thr Leu Leu Gíy 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:44 Gíy Ala Gfn Vat Ser Ser Gin Lys 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:45 Gíy Ata Gtn Leu Ser Arg Asn Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:46

Gly Asn Ala Ala Ala Ala Lys Lys 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:47

Gly Asn Gíu Ala Ser Tyr Pro Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:48

Gíy Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 55 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:49 CCCTCTAGAC ATATGTGAAT TCCACCATGG 30 CCCAGGTSMA RCTGCAGCAG TCA6G 55 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear 109 (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:50: GGGOCGCGCT GMGGAGACGG TGACCRWGGT 30 CCCTKSGCCC CA6 43 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 89 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:51: TTTGGTCACC GTCTCCCTCA GGTGGCGGTG 30 GCTCGGGCGG TGGTGGGTCG GGTGGCGGCG 60 GATCTSAHAT TCAGCTGACM CARWCTCCA 89 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:52: GGGTCTAGAC TCGAGGATCC TT ATT ATACA 30 GTTGGTGCAG CATC 44 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 71 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:53: GGGTCTAGAC TCGAGGATCC TTATTA AACC 30 TTACGTTTCT TCTTCGGCGG AGTTACAGTT g0 GGTGCAGCAT C 71 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:54: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:54:

Thr Pro Pro Lys Lys Lys Lys Arg Lys Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 55:

ATTAGCGGCC GCTACAGTTG GTGCAGCATC (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:56:

Arg Lys Lys Arg 1 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 57: TTTAAGCTTA CCATGGCCCA GGTGCAGCTG 30 CAGGAGTC6GG 41 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 111 (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:58:

Met Ata Gin Vai Gtn Leu Gin Giu Ser Giy 1 S 10 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:59: TTTAAGCTTA CCATGGACTG GACCTGGAGG 30 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:60: TGAGGTGACC GTGACCAGGG T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:61: TTTAAGCTTA CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 30 TGG 33 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples 112 (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:62: CTGCGTCAAC ACAGACTGAG ATCCGCC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:63: CGAGGGGGYR GCCTTGGGCT G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:64: TTTTCTAGAT CYTMTGAACT GACTCAG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 65: GGAACCCTGG TCACGGTCAC CTCA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 66: 24

TGGAGACTGC GTCATCTCGA GTTC 113 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 67: GAACTCGAGW TGACGCAGTC TCCA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 68: GGGTCTAGAC TCGAGGATCC TTATTAACGC 30 GTTGGTGCAG CCACAGT 47 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 69: ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:70: TGGGGCCAGG GAACCCYGGT CACSGTNWCC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 114 (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:71: CGCACAGTAA TACAC 15 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:72: GTGACCGTGA CCGGGGT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:73: GGCCGTGTAT TACTGTGCGC GANNSTGGGG 30 CCAGGGAACC CCGGTC ' 46 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15. aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:74:

Leu Thr Leu lie Ser Ser Arg Leu Arg Leu lie Ala Vat Arg Met 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27. aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (x) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:75: 27

TTTAAGCTTA CCATGAACTT CGGGCTC (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28. aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:76: TGMGGAGAC GGTGACCRWGGTCCCT 28 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27. aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:77: GAGCTCGTGC TCACMCAR WCTCCA 27 (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44. aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xiii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:78 30 44

GGGTCTAGAC TCGAGGATCC TTATTATACA GTTGGTGCAG CATC (2) INFORMAÇÃO PARA ID SEQ NO:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36. aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xiv) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO:79: 116 TTTAAGCTTA CCATGGACGT GAAGCTGGTG 30 GAGTCT 36

Lisboa, 12 de Fevereiro de 2007

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização, no fabrico de uma composição para gerar anticorpos que se ligam intracelularmente a um antigene-alvo numa célula de animal, pássaro ou planta, de um vector ou de um sistema vectorial para a expressão intracelular do anticorpo na célula de animal, pássaro ou planta, que compreende: uma sequência de nucleótidos contendo um promotor adequado para expressão na célula de animal, pássaro ou planta operativamente ligada a um gene do anticorpo que codifica o anticorpo, em que o anticorpo tem uma sequência líder que é funcional para que o anticorpo expresso seja segregado pela célula e o anticorpo também tem uma sequência de retenção intracelular.

2. Utilização da Reivindicação 1, em que o antigene-alvo é seleccionado do grupo de antigenes que consiste em metabolitos intermediários, açúcares, lípidos, autacóides, hormonas, hidratos de carbono complexos, fosfolípidos, ácidos nucleicos e proteínas.

3. Utilização da Reivindicação 1, em que o antigene-alvo está presente no retículo endoplasmático ou no aparato de Golgi.

4. Utilização da Reivindicação 1, em que o promotor operativamente ligado ao gene do anticorpo permite a expressão em células de mamífero.

5. Utilização das Reivindicações 1 ou 4, em que o antigene-alvo é uma proteína codificada de forma virai ou 2 uma proteína cuja expressão resulta em transformação celular maligna.

6. Utilização das Reivindicações 1 ou 4, em que o antigene-alvo é (i) uma proteína virai de um lentivírus, papilomavírus, vírus da Hepatite B, vírus de Epstein-Barr, HTLV-1 ou HTLV-2; (ii) codificado por sis, int-2, erb B, neu, fms, ros, kit, abl, src, ras, N-myc, fes, fps; raf, mos, erbA, c-myc, L-myc, fos, jun, myb, ets, ski, fgr, yes, lck, hck, fyn, lyn, thl, bcl-2, bcl-1, int-1, 2 ou retinoblastoma; (iii) um receptor de superfície ou uma proteína transmembranar, ou (iv) uma molécula de MHC de Classe I ou de MHC de Classe II.

7. Utilização da Reivindicação 1, em que a sequência de nucleótidos contém genes que codificam anticorpos para mais do que um antigene-alvo.

8. Utilização da Reivindicação 7, em que a proteína virai é seleccionada do grupo de proteínas virais compreendendo a sequência tat do HIV, rev do HIV, tax do HTLV-1, rex do HTLV-1, tax do HTLV-2 e rex do HTLV-2.

9. Utilização das Reivindicações 1 ou 4, em que o anticorpo codificado é um anticorpo de cadeia única, uma cadeia pesada de domínio único ou um Fab.

10. Utilização das Reivindicações 1 ou 4, em que o gene do anticorpo codifica uma sequência de retenção intracelular e (1) quando a sequência de retenção intracelular é específica para o retículo endoplasmático, essa sequência é seleccionada do grupo que consiste na ID SEQ NO: 17, ID SEQ NO: 18, ID SEQ NO: 19, ID SEQ NO: 21 e ID SEQ NO: 22; ou 3 (2) quando a sequência de retenção intracelular é especifica para uma membrana do plasma, essa sequência é seleccionada do grupo que consiste na ID SEQ NO: 30, ID SEQ NO: 31, ID SEQ NO: 32, ID SEQ NO: 33, ID SEQ NO: 34, ID SEQ NO: 35, ID SEQ NO: 36, ID SEQ NO: 37, ID SEQ NO: 38, ID SEQ NO: 39, ID SEQ NO: 40, ID SEQ NO: 41, ID SEQ NO: 42, ID SEQ NO: 43, ID SEQ NO: 44, ID SEQ NO: 45, ID SEQ NO: 46, ID SEQ NO: 47 e IE SEQ NO : 48

11. Anticorpo que contém um sinal secretor funcional e uma sequência de retenção intracelular para ligação a um antigene-alvo numa célula de animal ou pássaro e não contendo um agente químico citotóxico.

12. Anticorpo da Reivindicação 11, em que a sequência de retenção intracelular é uma sequência de localização no retículo endoplasmático.

13. Anticorpo da Reivindicação 12 que não danifica a célula.

14. Anticorpo da Reivindicação 11, em que o anticorpo é um Fab ou anticorpo de cadeia única.

15. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, em que a composição é uma composição farmacêutica que compreende o vector ou sistema vectorial como definido na referida reivindicação juntamente com um respectivo transportador farmaceuticamente aceitável, em que o referido anticorpo é expresso intracelularmente como um anticorpo funcional cuja função é determinada pela capacidade do anticorpo para se ligar intracelularmente ao referido antigene. 4 4 das um

16. Composição farmacêutica que compreende o anticorpo Reivindicações 11, 12, 13 ou 14 juntamente com respectivo transportador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 12 de Fevereiro de 2007