JP4500541B2 - ウイルスコートタンパク質／受容体キメラおよび使用方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は広く受容体−リガンドの相互作用に関し、より具体的には、互いに結合し、ウイルスのタンパク質と受容体とがｉｎ ｖｉｖｏで相互作用する場合に自然に生じる構造的特性、機能的特性、および免疫原性特性を再現する、ウイルスコートポリペプチドおよび細胞受容体ポリペプチド配列を有するキメラポリペプチドに関する。

関連技術の説明
ＨＩＶ−１の一次感染後に生じる体液性免疫は、ＡＩＤＳへの進展を予防しえない（Ｒ．Ａ．Ｋｏｕｐら、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：４１６（１９９４）、Ｒ．Ａ．Ｋｏｕｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：４６５０−５（１９９４））。しかし、体液性免疫は、個人がウイルスへの曝露前に力価の高い中和抗体を有する場合には感染を予防しうる。この考えは、チンパンジーに、無細胞系のウイルスを用いた免疫性テスト前後に、中和抗Ｖ３モノクローナル抗体、またはプールされた高力価中和血清を輸注した受動免疫試験によって広く裏づけられている（Ｅ．Ａ．Ｅｍｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３５５：７２８−３０（１９９２）、Ｒ．Ｓｈｉｂａｔａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５：２０４−１０（１９９９））。両者の一連の試験において防御が得られ、体液性免疫が、適切な抗体が免疫性テスト時点またはその直後に十分な力価で存在する場合は防御となりうることを示した。

その他の研究も、体液性免疫がＨＩＶ−１に対して防御的でありうることを示している。例えば、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス系を用いた受動免疫は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合ドメインに対して特異的なヒトモノクローナル抗体が感染を防ぎうることを示した（Ｍ．Ｃ．Ｇａｕｄｕｉｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：１３８９−９３（１９９７））、Ｐ．Ｗ．Ｐａｒｒｅｎら、ＡＩＤＳ、９：Ｆ１−６（１９９５））。さらに、二価のＣＤ４−Ｉｇである免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）、即ちＣＤ４とヒトＩｇＧ２のＨ鎖との間で作られるキメラの受動的移行が、ＨＩＶ−１チンパンジーの免疫性テスト系において防御可能であることが示されている（Ｊ．Ｗ．Ｅｉｃｈｂｅｒｇら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、８：１５１５−９（１９９２））、Ｒ．Ｈ．Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：４３４−６（１９９１））。また、中和抗体は、ＳＩＶに対する防御免疫と強く相関する（Ｊ．Ｌ．Ｈｅｅｎｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９５：１０８０３−８（１９９８））。さらに、アカゲザルにおける受動的移行試験は、ＨＩＶ−１_ＤＨ１２単離株に対して特異的な高力価チンパンジー抗体が、十分な濃度の抗体を使用した場合には、ＳＨＩＶ_ＤＨ１２に対するアカゲザルの殺菌免疫を提供することを示した（Ｒ．Ｓｈｉｂａｔａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５：２０４−１０（１９９９））。また、ＨＩＶＩｇ、２Ｇ１２、および２Ｆ５を用いたアカゲザルにおける受動的移行実験は、ＳＨＩＶ−８９．６Ｐによる免疫性テストに対し、レシピエント群が、非レシピエントのコントロールに比較して５０％優れた防御を有することを示した（Ｍａｓｃｏｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：２００９−１８（１９９９））。したがって、これらの試験により、様々な特異性を持った、持続的かつ高力価（または高効率的）中和抗体反応を導く免疫法が、防御的でありうるという考えが裏づけられる。この目的に達するための有効な方法を見出すのは困難であった。試験に用いられた組換えモノマーまたはオリゴマーＨＩＶエンベロープのサブユニット調製物は、狭い範囲の分離株に対する中和反応を導く（Ｊ．Ｐ．Ｍｏｏｒｅら、ＡＩＤＳ、９：Ｓ１１７−１３６（１９９５））、Ｑ．Ｊ．Ｓａｔｔｅｎｔａｕ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：５４０−５（１９９６）、Ｒ．Ｗｙａｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１８８４−８（１９９８））。

発明の概要
本発明は、コートポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列がスペーサーによって連結されている、ウイルスコートポリペプチド配列およびウイルス受容体ポリペプチド配列を含むキメラポリペプチドに関する。キメラポリペプチドのコートポリペプチド配列およびウイルス受容体ポリペプチド配列は、互いに結合しうる。本発明のキメラポリペプチドは、免疫反応を誘発し、抗体を産生するために有用である。さらに、キメラポリペプチドは、対象に投与すれば、ウイルス感染に対する受動的防御、または免疫応答（すなわち、抗体若しくはＣＴＬ反応）の生起によって、ウイルス感染を予防し、阻害し、または改善するために有用である。

種々の実施形態において、キメラポリペプチドのウイルスコートポリペプチド配列は、エンベロープポリペプチド配列（例えば、完全長ｇｐ１２０、またはフラグメント）、コレセプターポリペプチドを結合するウイルス、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＰＶを含む免疫不全ウイルス、およびヘルペスウイルスである。種々の追加の実施形態において、ウイルス受容体ポリペプチド配列は、完全長ＣＤ４ポリペプチド配列またはそのフラグメントであり、例えば、Ｄ１、Ｄ２ドメインおよびそれらの変異が挙げられる。別のコレセプターを使用するウイルス由来のエンベロープ遺伝子を導入することにより、異なったコレセプターを発現する様々な細胞型のウイルス感染に対する防御を提供するこれらの一本鎖の分子の潜在能力を、さらに拡大しうる。

異種ドメインを有するキメラポリペプチドも提供される。かかる異種ドメインは明確な機能性を与え、標識、付着因子、および免疫増強剤を含む。例えば、異種ドメインは、ｃ−ｍｙｃポリペプチド配列または免疫グロブリンポリペプチド配列（例えば、重鎖ポリペプチド配列）などのアミノ酸配列を有しうる。

本発明によれば、キメラポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド配列が提供される。ポリヌクレオチドは発現ベクターに含めることができ、キメラポリペプチドの発現に有用である。

本発明によれば、本発明のキメラポリペプチドに結合する抗体、およびそれらの機能的フラグメントが提供される。これらの抗体は治療法および診断法において有用である。かかる抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで免疫不全ウイルスを中和することができ、例えば、受動的防御によって、免疫不全ウイルス感染の阻害においても有用でありうる。かかる抗体は、ウイルスコートポリペプチド配列とウイルス受容体ポリペプチド配列の結合によって生成されるエピトープに結合しうる。例えば、かかるエピトープは、エンベロープポリペプチド配列上に存在しうる。

本発明のキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体は、ウイルス感染の治療、または免疫反応の誘導に有用である。したがって、本発明によれば、薬学的に許容される担体に含有されたキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体が提供される。

抗体を産生するための方法は、対象がキメラポリペプチドに対する抗体を産生するのに十分な量、本発明のキメラポリペプチドを対象に投与する工程を含む。かかる方法は、例えば、抗体がレシピエント対象に投与される場合、対象におけるウイルス感染を阻害し、または改善するために、または受動的防御のためにも有用でありうる。

対象におけるウイルス感染を抑制するための方法は、本発明のキメラポリペプチド、またはこれをコードするポリヌクレオチドの有効量を投与し、細胞のウイルス感染を阻害する工程を含む。投与されたキメラポリペプチドは、対象の細胞上のウイルス・コレセプターに結合し、防御的免疫反応をもたらすことによってウイルス感染を防ぐことができる。キメラポリペプチドは、対象におけるウイルス感染を改善するのに十分な量で投与することができる。

免疫応答をもたらす方法は、抗体反応またはＣＴＬ反応を生じさせることができる。得られた抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫不全ウイルスを中和しうる。これらの抗体は、キメラポリペプチドの２つのポリペプチド配列の結合によって曝露されるエピトープにも結合しうる。

ウイルスとウイルス・コレセプター、およびウイルスとウイルス受容体との結合または相互作用を調節する物質を同定するための方法も提供される。１つの実施形態における方法は、被検物質の存在下および非存在下で、受容体に結合するウイルスのコートタンパク質を有するキメラポリペプチドとコレセプターポリペプチド（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４ポリペプチド配列）とを、キメラポリペプチドとコレセプターポリペプチドとが結合可能な条件で接触させ、被検物質の存在下および非存在下での結合を検出する工程を含む。被検物質の存在下で結合が減少すれば、ウイルスとウイルス・コレセプターポリペプチドとの結合を抑制する物質として同定する。

別の実施形態における方法は、被検物質の存在下および非存在下で、キメラポリペプチド内の分子内結合を可能にする条件でキメラポリペプチドを接触させ、キメラポリペプチド内の分子内結合または相互作用を検出する工程を含む。被検物質の存在下で結合が減少すれば、キメラにおけるウイルスとウイルス受容体のポリペプチドとの分子内の結合または相互作用を阻害する物質として同定する。該物質は、キメラポリペプチドとウイルス・コレセプターのポリペプチドの接触の前後に添加することができる。ウイルス・コレセプターまたは受容体のポリペプチドは、ヒト以外の霊長類などの動物において、無傷細胞（ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌ）の表面上に存在しうる。この方法は、ＨＩＶ、ＳＩＶなどの免疫不全ウイルスを用いて行うことができる。被検物質としては、ペプチド、有機分子、抗体およびそれらのフラグメント、抗ウイルス薬、ウイルス・コレセプター、それらの機能的フラグメント、およびそれらのペプチド模倣物などの物質のライブラリーが挙げられる。

細胞のウイルス感染を調節（抑制または刺激）するキメラポリペプチド配列を同定するための方法も提供される。１つの実施形態における方法は、本発明のキメラポリペプチド配列の存在および非存在下に、ウイルス感染しやすい細胞を感染性ウイルスと接触させ、キメラポリペプチドが（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで）細胞のウイルス感染を調節（抑制または刺激）するかどうかを測定する工程を含む。

発明の詳細な説明
本発明は、ＨＩＶエンベロープポリペプチドおよびＣＤ４受容体を含有するキメラポリペプチドが、コレセプターに結合する能力を有した、相互作用する複合体を形成しうるという知見に基づく。本発明のキメラポリペプチドにおいて、ＣＤ４に結合するＨＩＶ ｇｐ１２０は、ＨＩＶが細胞上に存在するＣＤ４に結合すると生じる、エンベロープタンパク質−ＣＤ４遷移状態を再現し、ｇｐ１２０は、複合体形成時に曝露され、かつコレセプターであるＣＣＲ５と直接相互作用する保存エピトープを示す。エンベロープ−ＣＤ４遷移状態の形成およびその後の細胞コレセプターへの結合は、細胞のＨＩＶ感染における重要な工程である。したがって、例えば、ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体形成時に曝露されたエピトープに結合することによって、コレセプターへのｇｐ１２０−ＣＤ４の結合を妨害または阻害する抗体または他の物質は、コレセプターとのウイルスの相互作用を抑制し、それによってＨＩＶ感染からの保護も仲介しうる。

したがって、本発明のキメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸は治療上、例えば、ウイルスコートタンパク質の受容体ポリペプチドへの結合時に形成される遷移状態の複合体に対する免疫反応を誘発することによって、ウイルス感染を治療、抑制、予防、または改善するために用いることができる。かかるキメラポリペプチドは、本明細書では「一本鎖」分子とも呼ばれ、キメラ配列内のポリペプチド受容体配列へのコートポリペプチド配列の結合、またはコレセプターポリペプチド配列へのキメラの結合を抑制し、阻害し、または妨害する物質の検査に使用し、それによって対応するウイルス性感染を治療するための潜在的な治療薬を同定することができる。例えば、ＣＣＲ５への免疫不全ウイルスのエンベロープポリペプチドＣＤ４複合体を抑制し、阻害し、または防止する物質が、ＨＩＶを有し、またはこれを有する危険な状態にある対象を治療するための治療薬でありうる。

キメラポリペプチドは、相互作用コートタンパク質−受容体複合体に対する特異的な抗体を産生するためにも有用である。かかる特異的抗体は、ウイルス感染または増殖に対する受動的防御、診断目的、および複合体形成時に曝露されるエピトープ（例えば、陰性エピトープ）を同定し特徴づけるために用いることができる。ウイルスコートタンパク質と受容体との分子内結合の非存在下でも、キメラポリペプチドは、ウイルスコートポリペプチド配列のみよりも免疫反応の誘導において有効でありうる。したがって、かかる非相互作用キメラポリペプチドも有用であり、本明細書に含まれる。

受容体およびコレセプターを結合するウイルスコートポリペプチドを含有するキメラポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで、ウイルスの細胞コレセプターへのアクセスを阻害することによってウイルス感染に対して受動的に防御する追加の利点を有する。さらに、かかるキメラポリペプチドは、該キメラポリペプチドがコレセプターに結合するのを抑制し、阻害し、または妨害する物質を同定することによって、治療薬のスクリーニングに用いることができる。例えば、ＣＣＲ５への免疫不全ウイルスのエンベロープポリペプチドＣＤ４複合体形成を抑制し、阻害し、または妨害する物質が、ＨＩＶを有し、またはこれを有する危険な状態にある対象を治療するための治療薬でありうる。任意の細胞のウイルス感染にはウイルスの細胞受容体への結合を要するため、任意のウイルスコートタンパク質のポリペプチド配列および対応する受容体を含有するキメラポリペプチドが、本発明の組成物および方法に含まれている。

本発明によれば、スペーサーによって結合されたウイルスコートポリペプチド配列とウイルス受容体ポリペプチド配列を含有するキメラポリペプチドが提供される。このキメラポリペプチドのコートポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列は、キメラポリペプチドの２つのポリペプチド配列が好ましくは結合または相互さようするように、十分な長さのアミノ酸を有するスペーサーによって結合される。１つの実施形態におけるコートポリペプチド配列は、免疫不全ウイルスのエンベロープポリペプチド配列である。別の実施形態におけるコートポリペプチド配列は、コレセプターポリペプチドを結合するウイルスからのものである。種々の他の実施形態におけるコートポリペプチド配列および受容体ポリペプチド配列は、対応する完全長ナイーブ配列の活性フラグメントである。

本明細書で用いられる「コート」なる用語は、細胞に結合しうるウイルス起源のポリペプチド配列を意味する。一般に、ウイルスコートタンパク質は、ウイルス粒子の外表面近くに存在し、結合およびその後の細胞膜への侵入を可能にする。しかし、コートポリペプチド配列は、受容体ポリペプチドに結合し、またはこれと相互作用する能力がある任意のウイルスタンパク質を含む。本明細書で定義されるコートポリペプチド配列は、糖質、脂肪酸、脂質など、他の分子構成要素と非共有または共有結合しうる。コートポリペプチド配列は、多数のウイルスポリペプチド配列を含有しうる。例えば、エンベロープポリペプチド配列とともに、ｇａｇポリペプチド配列もキメラポリペプチドに含まれ、受容体ポリペプチド配列に結合する構造のエンベロープポリペプチド配列を維持しうる。

本発明において有用なウイルスコートポリペプチド配列は、対応する細胞受容体が既知であるか、同定可能である限り、例えば、細菌、植物、および動物ウイルスを含む任意の起源とすることができる。特定のウイルスの例として挙げられるのは、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶなどのヒト免疫不全ウイルス）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カルシウイルス科（例えば、胃腸炎をひき起こす株）、トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）、アレナウイルス科（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス）、ビルナウイルス科、へパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポバウイルス科（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）２および２、水疱瘡ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）、および分類区分されていないウイルス（例えば、海綿状脳症の病因、デルタ型肝炎（Ｂ型肝炎の不完全な付随体と考えられる）の病因、非Ａ型、非Ｂ型肝炎（クラス１＝体内感染型、クラス２＝非経口感染型（すなわちＣ型肝炎）、ノーウォークおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）である。（表１も参照）。

本明細書で用いられる「受容体」なる用語は、細胞によって発現される、ウイルスが結合可能な任意のポリペプチドを意味する。一般に、かかる受容体は、細胞の表面上に自然に存在するが、人工的に作り出すことができる。受容体ポリペプチドは、糖質、脂肪酸、脂質等、他の分子構成要素と非共有または共有結合しうる。受容体ポリペプチドは、共有結合または非共有結合で連結された１つまたは複数の隣接ポリペプチドセグメントを含みうる。かかる分子構成要素または他のポリペプチド配列は、受容体構成、例えば、コートポリペプチド配列への結合に重要でありうる。したがって、受容体構成に重要な分子を含む追加の要素を、本発明のキメラポリペプチドに含みうる。受容体ポリペプチド配列は、起源が原核生物または真核生物のいずれかでありうる。

真核生物である場合は、植物と動物の両方の受容体が考えられる。好ましい動物の受容体は、例えば、ヒト、およびチンパンジー、類人猿、マカクザル、テナガザル、オランウータン等の霊長類を含む哺乳動物のほか、家畜を含む他の動物種である。ヒト受容体の例は、ＣＤ４である。受容体の他の例としては、グリコサミノグリカンおよびＣＤ２、ＣＲ１が挙げられる。受容体は他にも知られており、本発明の組成物および方法において応用できる（例えば、表１ Ｊ、および「動物ウイルスの細胞受容体（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ）」、エッカルト・ウィマー（Ｅｃｋａｒｄ Ｗｉｍｍｅｒ）編、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（１９９４年）も参照）。

本明細書で用いられる「コレセプター」なる用語は、受容体へのウイルスの結合後または結合と同時に結合されている任意の受容体を意味する。したがって、コレセプターには、ウイルスのポリペプチド受容体複合体に結合することによって、直接的または間接的にウイルス侵入を促進する細胞上に存在する任意のポリペプチドまたは分子構成要素が含まれる。細胞へのウイルス侵入を促進するコレセプターに加えて、ウイルス侵入を直接的または間接的に促進することなく、細胞の付着または親和性を仲介するコレセプターも含まれる。コレセプターの特定の例は、免疫不全ウイルスを結合しうるＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４など、ケモカイン受容体を含有する第７貫通膜ドメイン（７−ＴＭ）である。その他のコレセプターとしては、ＣＣＲ−２ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ８、Ｖ２８／ＣＸＣＲ１、ＵＳ２８、ＳＴＲＬ ３３／ＢＯＢ／ＴＹＭＳＴＲ、ＧＰＲ１５／Ｂｏｎｚｏ、およびＧＰＲ１が挙げられる。

本明細書で用いられる「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」なる用語は同じ意味で用いられ、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチン化、ユビキチン化）に関係なく、アミド結合によって共有結合されている少なくとも２個のアミノ酸の配列ポリマーを示す。Ｄ−およびＬ−アミノ酸、およびＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物も含まれる。

キメラポリペプチドは、一般に天然のアミノ酸配列ではいっしょに見出されることのない２つ以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。

本明細書に開示されているように、ＣＤ４ポリペプチド配列、およびＣＤ４を結合するＨＩＶエンベロープｇｐ１２０ポリペプチド配列を有するキメラポリペプチドは、アミノ酸スペーサー配列によって離されるとキメラ中で互いに結合する。ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラは、ＣＣＲ５などのコレセプターを結合する能力がある。したがって、別の実施形態におけるキメラポリペプチドは、コレセプターを結合するウイルスのコートポリペプチド配列を有する。

ＣＤ４は、免疫不全と関連した種々のウイルスの侵入のターゲットであると思われる。例えば、リンパ球およびマクロファージなど免疫系の細胞は、ＣＤ４を発現し、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ヘルペスウイルス７、および他の多くのウイルスによって感染しやすい。本明細書で用いられる「免疫不全」なる用語は、ウイルスに関して用いられると、そのウイルスが免疫源の細胞または免疫反応に関わる細胞を感染させる能力があることを意味し、一般にかかる感染は、感染した宿主の免疫機能を危うくしうる。したがって、本発明は、ＣＤ４を結合しうるウイルスまたはウイルス株のウイルスコートポリペプチドに適用可能である。

本発明によれば、免疫不全ウイルスのエンベロープポリペプチド配列を有するキメラポリペプチドが提供される。種々の態様において、エンベロープポリペプチド配列は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＳＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＰＶ、およびヘルペスウイルスのポリペプチド配列である。他の態様において、ウイルスは、マクロファージ刺激またはリンパ球刺激ＨＩＶである。別の態様において、ＨＩＶは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である。種々の他の態様において、エンベロープポリペプチド配列は、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、またはｇｐ４１である。

本発明のキメラポリペプチドの受容体およびウイルスコートポリペプチド配列は、例えば、２つのポリペプチド間に相互作用する複合体を形成するために、それらの間にスペーサー領域を必要とする。理論によって制約されることは望まないが、スペーサーは受容体とウイルスコートポリペプチド配列との間の移動または自由度を可能にし、相互作用複合体を形成する。

本明細書で用いられる「スペーサー」は、ウイルスコートポリペプチド配列を受容体ポリペプチド配列に接続すると同時に、相互作用複合体を形成するために必要な移動または自由度を与える任意のサイズまたは性質の物理的または化学的成分、あるいは共有または非共有結合を指す。本発明において、スペーサーは、「ｅｎｄ ｔｏ ｅｎｄ」の配向で２つのポリペプチド配列を結合することが好ましい。「ｅｎｄ ｔｏ ｅｎｄ」とは、コートポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端アミノ酸が受容体ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシル末端アミノ酸に接続していることを意味する。したがって、スペーサーは、例えば、本明細書ではＨＩＶ ｇｐ１２０およびＣＤ４で例示されているように、コートポリペプチド配列のカルボキシル末端アミノ酸を受容体ポリペプチド配列のアミノ末端アミノ酸に接続しうる。あるいは、スペーサーは、コートポリペプチドのアミノ末端アミノ酸を受容体ポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸、またはポリペプチド配列のカルボキシル末端アミノ酸、またはポリペプチド配列の２個のアミノ末端アミノ酸に接続することができる。

スペーサーの特定の例には、１個以上のアミノ酸またはペプチド類似体が含まれる。アミノ酸スペーサーは、例えば、実質的に任意の長さとすることができ、例えばわずか５個でもよいし、２００個以上ものアミノ酸でもよい。したがって、アミノ酸スペーサーは、約１０〜約１００個のアミノ酸を有することができ、または約１５〜約５０個のアミノ酸を有しうる。スペーサーは約２０〜約４０個のアミノ酸を有することが好ましい。スペーサーの他の例としては、ポリペプチド配列の末端間のジスルフィド結合が挙げられる。糖質スペーサーも意図されている。当業者は、ウイルスコートポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列との相互作用複合体の形成を可能にするように機能しうる他の成分を理解するであろうし、または容易に確認できる。

受容体およびコートポリペプチド配列は、任意のアミノ酸の長さでありうる。それらは、キメラポリペプチドにおける場合、ポリペプチド配列が互いに結合することを可能にする長さを有することが好ましい。したがって、受容体およびコートポリペプチド配列は、天然の完全長受容体および完全長コートポリペプチド配列、ならびにポリペプチド配列の一部を含む。例えば、受容体、およびコートポリペプチド配列のアミノ酸切断部位、内部欠失、またはサブユニットが含まれる。かかる改変形態は、相互に相互作用が可能であることが好ましい。例えば、切断型または欠失型コートポリペプチド配列は、受容体ポリペプチド配列との相互作用が可能であることが好ましい。切断型受容体ポリペプチド配列の例は、ＣＤ４ Ｄ１およびＤ２ドメインであり、これらはＨＩＶエンベロープポリペプチド配列と相互作用が可能である（図９）。切断型コートポリペプチド配列の例は、アミノ末端６０アミノ酸およびカルボキシ末端２０アミノ酸（例えば、ＴｃＳｃにおける）を欠く切断型ＨＩＶ ｇｐ１２０である。

したがって、本発明によれば、切断型または内部欠失型配列を含むキメラポリペプチドが提供される。ある実施形態においては、ウイルスポリペプチド配列または受容体ポリペプチド配列は、それらの対応する完全長ポリペプチド配列と比較して、１個以上のアミノ酸が除去されている。ある態様においては、切断型ウイルスコートポリペプチド配列は、ＨＩＶエンベロープポリペプチド配列であり、別の態様においては、切断型受容体ポリペプチド配列はＣＤ４配列である。本明細書で例示されているように、切断型ＨＩＶエンベロープポリペプチド配列は、アミノ末端６０アミノ酸またはカルボキシ末端２０アミノ酸を欠くｇｐ１２０であり、切断型ＣＤ４ポリペプチドはＤ１およびＤ２ドメインを含む。種々の他の態様において、キメラポリペプチドは内部欠失型ウイルスコートポリペプチド配列または内部欠失型ＣＤ４ポリペプチド配列である。

切断型、内部欠失型、およびサブユニットのポリペプチド配列に加えて、さらにポリペプチド配列の改変も含まれる。かかる改変は、改変キメラポリペプチドが実質的に未改変キメラポリペプチドと同じ活性または機能を有する限り、キメラポリペプチドを含むポリペプチド配列の１つまたは両方のアミノ酸配列の軽微な置換、変形、または誘導体化が含まれる。例えば、ウイルスコートまたは受容体ポリペプチド配列は、脂質、脂肪酸（パルミチン酸塩、ミリスチン酸塩）、脂質を有し、リン酸化され、または一般的にポリペプチド配列を伴う他の翻訳語修飾を有しうる。

改変の別の例は、２つのポリペプチドまたはキメラポリペプチドのいずれかに対して明確な機能性を与える異種ドメインの追加である。異種ドメインは、それが追加の機能を与える限り、任意の小有機分子または無機分子、あるいは高分子でありうる。異種ドメインは、ウイルスコートポリペプチドと受容体ポリペプチドとの間の相互作用または親和性に影響を及ぼすこともあり、及ぼさないこともある。明確な機能を与える異種ドメインの特定の例は、ターゲティング（例えば、受容体リガンド、抗体等）を与えるアミノ酸配列、免疫増強機能（例えば、免疫グロブリン、アジュバント）を与えるアミノ酸配列、精製、分離、または検出を可能にするアミノ酸配列（例えば、ｍｙｃ、Ｔ７標識、ポリヒスチジン、アビジン、ビオチン、レクチン等）を含む。

特定の異種ドメインは、ｃ−ｍｙｃポリペプチド配列および／またはＩｇＧ１重鎖ポリペプチド配列を含みうる。異種ドメインは、複数の機能を有しする。例えば、ＩｇＧ１は、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫増強剤として機能しうると同時に、調製され、分離され、または検出されうる（例えば、セイヨウワサビ過酸化酵素またはアルカリホスファターゼなど酵素活性を有する二次抗体との反応によって）付着分子として機能しうる。当業者は、他の異種ドメインについて知るとともに、それらを所望の用途および機能によって適切に選択することができる。

したがって、本発明によれば、１つ以上の異種ドメインを有するキメラポリペプチドが提供される。１つの実施形態において、異種ドメインは、ｃ−ｍｙｃポリペプチド配列ｇｌｕ−ｇｌｎ−ｌｙｓ−ｌｅｕ−ｉｌｅ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ｌｅｕ、（配列番号：１４）である。別の実施形態において、異種ドメインは、Ｈ鎖を含む免疫グロブリンポリペプチド配列（配列番号：３２）である。

受容体およびコートポリペプチド配列は、任意の長さのアミノ酸でありうる。それらは、キメラポリペプチドにおける場合、ポリペプチド配列が互いに結合することを可能にする長さを有することが好ましい。したがって、受容体およびコートポリペプチド配列は、天然の完全長受容体および完全長コートポリペプチド配列、ならびにポリペプチド配列の一部を含む。

ある態様では、本発明は、Ｄ１Ｄ２ドメインおよびｍｙｃペプチド「標識」（配列番号：２）、またはキメラポリペプチドをコードする配列番号：２と同一の少なくとも９５％の配列を含む、ＨＩＶ ｇｐ１２０（ＢａＬ株）、アミノ酸スペーサーポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド配列を含む完全長一本鎖（ＦＬＳＣ）キメラポリペプチドを含む。

別の態様において、本発明は、ＦＬＳＣポリペプチドのフューリン開裂部位における一本鎖変異を有するＦＬＳＣポリペプチドを含み、ここで、ｇｐ１２０（ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ）、またはキメラポリペプチドをコードする配列番号：２と同一の少なくとも９５％の配列の末端で、ＲはＴに変化する。具体的には、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔは、アミノ酸５０６（配列番号：４）でアルギニンからトレオニン変異を含有する。

本明細書に例示されているように、ポリペプチド配列は、改変キメラポリペプチドが実質的に未改変キメラポリペプチドと同じ活性または機能を有する限り、キメラポリペプチドを含むポリペプチド配列の１つまたは両方のアミノ酸配列の置換、変形、または誘導体化が含まれる。例えば、ウイルスコートまたは受容体ポリペプチド配列は、脂質、脂肪酸（パルミチン酸塩、ミリスチン酸塩）、脂質を有し、リン酸化され、または一般的にポリペプチド配列を伴う他の翻訳語修飾を有しうる。

さらに別の態様において、ウイルスコーまたは受容体ポリペプチド配列は、それらの対応する未改変ポリペプチド配列と比較して１つ以上のアミノ酸が置換されている。例えば、実質的に同じ活性または改善された免疫反応を示す受容体を再現するＣＤ４を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５）が提供される。具体的には、キメラポリペプチドＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ（配列番号：４）のＣＤ４ Ｄ１Ｄ２ドメインにおけるＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱＦＨＷのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、以下にＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９（配列番号：６）と呼ばれるＣＮＬＡＲＣＱＬＲＣＫＳＬＧＬＬＧＫＣＡＧＳＦＣＡＣＧＰのアミノ酸配列（アミノ酸５２８〜５５６（配列番号：２０））をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１９）で置換される。

本明細書で用いられる「実質的に同じ活性または機能」なる用語は、こうして改変されたキメラポリペプチドに関して用いられる場合、ポリペプチドが、本明細書に記載され、または当業界において周知のように、非改変ポリペプチドと関連した活性のほとんど、すべて、または多くを保持していることを意味する。同様に、コレセプターと相互作用するキメラポリペプチドの能力に影響を及ぼすことがない改変が本明細書に含まれる。同じく、ウイルスコートタンパク質のみの投与よりも強力な免疫反応を誘発する能力に影響を及ぼすことないキメラポリペプチドの改変が含まれる。

本明細書に含まれる「活性」または「機能的」である改変キメラポリペプチドは、ルーチンの機能的アッセイにより同定しうる。例えば、抗体結合アッセイ、コレセプター結合アッセイを用いることによって、または２つのポリペプチド配列が結合しない場合に通常、隠れている遷移状態の複合体中に曝露されるエピトープの誘導を測定することによって、改変キメラポリペプチドが活性を有するかどうかを容易に決定することができる。

強力な免疫反応を誘発するキメラポリペプチドは、例えば、対象へのキメラの投与後に抗体価を測定することによって同定しうる。ウイルスコートポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列との間の相互作用、またはより強力な免疫反応を誘発するように相互作用することがなく、対応する非改変キメラポリペプチドと、およびそのようものとして、実質的に同じ活性または機能を有することがない、ウイルスコートポリペプチド配列と受容体配列を有するキメラポリペプチドの能力を破壊する改変は含まれていない。

本明細書で用いられる、ポリペプチドに関して用いられる「相同」または「相同性」なる用語は、２つのポリペプチド間のアミノ酸配列の類似性を指す。両方のポリペプチドにおけるアミノ酸の位置が同一のアミノ酸によって占有している場合、それらはその位置で相同性である。したがって、「実質的に相同性」によって、完全ではないが大幅に相同性であり、それに対して相同性である配列として活性のほとんど、またはすべてを保持するアミノ酸配列が意味される。

改変キメラポリペプチドは非改変キメラポリペプチドに伴う活性または機能を保持するため、改変キメラポリペプチドは一般に、非改変ポリペプチドのアミノ酸配列と「実質的に同一」または「実質的に相同性」のアミノ酸配列を有することになる。本明細書で用いられる「実質的に同一」または「実質的に相同性」なる用語は、ポリペプチド配列に関して用いられる場合、ポリペプチドの配列が基準配列に対して少なくとも５０％同一であることを意味する。改変ポリペプチドおよび実質的に同一のポリペプチドは通常、基準ポリペプチドに対して少なくとも７０％、あるいは８５％、より多くは９０％、最も多くは９５％の相同性となる。ポリペプチドについて、配列間で上述した相同率を得る比較の長さは通常、少なくとも２５アミノ酸、あるいは少なくとも５０アミノ酸、より多くは少なくとも１００アミノ酸、および最も多くは２００アミノ酸以上となる。

本明細書に記載されている実質的に同一または相同性のポリペプチドとしては、キメラポリペプチドの機能を破壊することがない（機能的アッセイ、例えば、本明細書に記載されているように測定される）アミノ酸配列の位置に配置される付加、切断、内部欠失または挿入、同類または非同類置換、または他の改変が挙げられる。置換の特定の例は、１個以上のアミノ酸が別の化学的または生物学的に同様の残基によって置換されている場合である。本明細書で用いられる「同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」なる用語は、化学的または生物学的に同様の残基による１個の残基の置換を指す。同類置換の例としては、別のものに対するイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの疎水性残基の置換、リシンに対するアルギニン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、またはアスパラギンに対するグルタミン等など、別のものに対する極性残基の置換が挙げられる。当業者は、活性を実質的に変化させることなく、化学的に同様の他の残基で改変または置換されうる多くのアミノ酸を認識するであろう。

実質的に同一または相同性のポリペプチドとしては、さらに機能または活性を改善したり与えたりする改変を有するものも挙げられる。例えば、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔは、改変ＦＬＳＣの安定性を増大する変異フューリン部位を有する（例えば、図１３を参照）。

改変ポリペプチドは、それらの中のアミノ酸の１個以上が化学的に変化または誘導される側鎖を有する「化学的誘導体」をさらに含む。かかる誘導体化ポリペプチドとしては、例えば、遊離アミノ基が塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ（ｃａｒｏｂｅｎｚｏｘｙ）基を形成し、遊離カルボキシ基が塩、メチル、およびエチルエステルを形成し、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成する遊離ヒドロキシル基のほか、自然発生的アミノ酸誘導体、例えば、プロリンに対する４−ヒドロキシプロリン、リシンに対する５−ヒドロキシリシン、セリンに対するホモセリン、リシンに対するオルニチン等が挙げられる。共有結合、例えば、環化ポリペプチドを産生する２つのシステイン残基間を形成するジスルフィド結合を変化させうるＤ−アミノ酸およびアミノ酸誘導体も含まれる。

本明細書で用いられる「単離型」または「実質的に純粋」は、本発明のキメラポリペプチド、それらの配列フラグメント、およびポリヌクレオチドの修飾物質として用いられる場合、それらがヒトの介入によって産生され、それらの天然のｉｎ ｖｉｖｏ細胞環境から分離されることを意味する。一般に、こうして分離されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、他のタンパク質、核酸、脂質、糖質、またはそれらが自然に伴う他の材料を実質的に含まない。

通常、ポリペプチドは、少なくとも６０重量％タンパク質および自然に伴う他の分子を含まない場合に実質的に純粋である。調製物は、多くは少なくとも７５重量％、より多くは少なくとも９０重量％、最も多くは少なくとも９５重量％で純粋である。実質的に純粋なキメラポリペプチドは、例えば、細胞中のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、産生されるポリペプチドを分離することによって得ることができる。例えば、実施例に記載されているように、哺乳動物細胞中のｇｐ１２０−ＣＤ４ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの発現により、免疫親和性カラムを用いて培養基からのキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ）ポリペプチドの分離が可能である。あるいは、キメラポリペプチドは化学的に合成されうる。純度は、任意の適切な方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、およびその後のゲルの染色（例えば、銀染色）、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。

本発明のキメラポリペプチドおよびそれらの変形は、当業界で周知の方法によって調製することができる。ポリペプチドの変形は、例えば、エキソヌクレアーゼ欠失、化学的修飾、または異種ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の融合によって、部位特異的（例えば、ＰＣＲを利用する）またはランダム変異（例えば、ＥＭＳ）によって導入することができる。キメラポリペプチドは、細菌、酵母菌、または哺乳動物細胞などの宿主細胞中のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現、および一般的な生化学的方法（例えば、免疫親和性精製、ゲル精製、発現スクリーニング等）を用いた精製により発現キメラポリペプチドを精製することによって得ることができる。他の公知の方法は、ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）ら（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（タンパク質精製ガイド：酵素学における方法）、１９９０年、第１８２巻、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）において記載されている。これらの内容を本明細書に援用する。

本発明はさらに、キメラポリペプチド、それらのフラグメント、および相補配列をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態では、核酸は、本明細書に例示されるｇｐ１２０−ＣＤ４ポリペプチドをコードする。例えば、配列番号：１は、ｇｐ１２０（配列番号：２３）およびＣＤ４ Ｄ１Ｄ２（配列番号：２５）をコードするヌクレオチド配列を含む、上述したＦＬＳＣをコードする配列を規定する。配列番号：３はＦＬＳＣ Ｒ／Ｔをコードする配列を規定し、この配列では、ｇｐ１２０におけるフューリン開裂部位と推測されるｇｐ１２０のｃ末端において、アルギニンアミノ酸がトレオニンに置換され、それによってＦＬＳＣ上のＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔの安定性が改善されている。ＦＬＳＣ−ＲＴのヌクレオチド配列は、配列番号：２９およびＣＤ４Ｄ１Ｄ２（配列番号：２５）によってコードされる改変ｇｐ１２０を含む。さらに、本発明は、置換フューリン開裂部位を含むキメラポリペプチドＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９をコードするポリヌクレオチド配列番号：５を提供し、さらに、ＣＤ４受容体を再現するアミノ酸配列をコードする配列でＣＤ４ Ｄ１Ｄ２領域をコードする遺伝子配列の置換を提供し、それによって、ＦＬＳＣまたはＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔに対する免疫反応の改善および追加の安定性を提供する。ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９は、改変ｇｐ１２０をコードする配列番号：２９、およびＣＤ４Ｍ９をコードする配列番号：１９を含むヌクレオチド配列によってコードされる。ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９キメラポリペプチドは、配列番号：２３および１９を追加的に含みうる。

さらに別の実施形態では、ＴｃＳＣ（配列番号：１２）がｇｐ１２０−ＣＤ４ポリペプチド（配列番号：１３）をコードし、該配列においてはｇｐ１２０のアミノ末端およびカルボキシ末端からアミノ酸配列が切断されている。ＴｃＳＣのヌクレオチド配列は、切断型ｇｐ１２０をコードする配列（配列番号：２７）およびＣＤ４Ｄ１Ｄ２（配列番号：２５）を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１が、追加の標識（配列番号：３１）を有するヌクレオチド配列番号：１によってコードされる。

本明細書で用いられる「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「プライマー」は同じ意味で用いられ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、２本鎖または１本鎖、直鎖状または環状のいずれかを指す。ＲＮＡは、スプライスされていない、またはスプライスされたｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡｉでありうる。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、またはアンチセンスでありうる。具体的に挙げられるのは、本発明のキメラポリペプチドをコードするように機能しうる、ヌクレアーゼ変性に対して抵抗性であるものなど、ヌクレオチド類似体および誘導体である。ヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、本明細書に記載された本発明の核酸ワクチンに特に有用である。

「単離型」または「実質的に純粋な」ポリヌクレオチドは、核酸が、それが由来する生物の自然発生的ゲノムにおいて直接隣接している５’末端または３’末端を有するコード配列と直接隣接していないことを意味する。したがって、この用語は、例えば、組換えＤＮＡ（例えば、ＰＣＲによって、またはクローニング中に生成される制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）のほか、ベクターに組込まれる組換えＤＮＡ、独立して複製するプラスミドまたはウイルス、あるいは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡが含まれる。これは、例えば、キメラまたは融合の組換えＤＮＡの一部も含む。したがって、この用語は、ｃＤＮＡライブラリーにおける無数の配列中、またはゲル上に分画されたライブラリーの限定ダイジェスト中に存在するが、特徴づけられていない核酸を含むことはない。

本発明のポリヌクレオチドは、遺伝的暗号の結果として変性した核酸も含む。２０個の天然アミノ酸があり、そのほとんどは１以上のコドンによって特徴づけられる。すべての変性ポリヌクレオチド配列は、本発明のキメラポリペプチドをコードする配列に含まれる。

本発明のポリヌクレオチド配列は、当業界で周知の標準方法（例えば、分子クローニング法、化学的合成）を用いて得ることができ、純度は、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動、配列決定分析などによって測定することができる。ポリヌクレオチドも当業界で周知であるハイブリダイゼーション法またはコンピュータによる方法を用いて分離することができる。かかる方法としては、（１）プローブで相同性ヌクレオチド配列を検出するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション、（２）ＤＮＡ配列（例えば、発現ライブラリーを用いて）によって発現されるポリペプチドの抗体スクリーニング、（３）当該の核酸配列にアニーリングする能力があるプライマーを用いたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、（４）関連配列の配列データベースのコンピュータ検索、および（５）サブトラクション核酸ライブラリーのディファレンシャル・スクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、例えば、ＣＤ４をコードするものなど、ポリヌクレオチドをコードする他の受容体を得るために、相同性配列の存在についてライブラリーをスクリーニングすることができる。

本発明は、実質的に相同性のポリヌクレオチドも含む。本明細書で用いられる「相同性」なる用語は、核酸分子に関して用いられる場合、２つのヌクレオチド配列間の類似性を指す。両方の分子におけるヌクレオチドの位置が同一のヌクレオチドによって占有されている場合、それらはその位置で相同性である。「実質的に相同性」の核酸配列は、少なくとも５０％の相同性、より多くは少なくとも７５％の相同性、最も多くは９０％以上の相同性である。実質的に相同性の本発明のキメラポリペプチドと同様、キメラポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドと実質的に相同性のポリヌクレオチドは、それが相同性である配列と関連した活性または機能のほとんど、またはすべてを保持するポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドについては、配列間の比較の長さは、一般に少なくとも３０個のヌクレオチド、あるいは少なくとも５０個のヌクレオチド、より多くは少なくとも７５個のヌクレオチド、最も多くは１１０個以上のヌクレオチドとなる。ポリヌクレオチド配列ギャップおよびミスマッチオリゴヌクレオチドの原因である相同性配列を識別するためのアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴなど当業界で周知である（例えば、アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年（１５）、ｐ．４０３〜４１０を参照）。

さらに、ポリヌクレオチドは、キメラポリペプチド、例えば、ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの存在または量を確認するためにハイブリダイゼーションプローブとして有用である（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、分子クローニング法：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク）。通常、かかるプローブは、非関連配列へのハイブリダイゼーションの可能性を低下させるために所望の配列に対して特異的であるように設計されている。かかるプローブは、放射性核種、発光成分などを用いて検出可能であるために改変することができる。ハイブリダイゼーション条件も所望の特異性を得るために改変することができる。例えば、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、約３７℃または４２℃下に２× ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）、室温下に０．５× ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェントな洗浄）、約４２℃下に０．５× ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（適度に高ストリンジェントな洗浄）が挙げられる。適度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りである：約５２℃下に０．１× ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（適度に高ストリンジェントな洗浄）。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りである：約６５℃下に０．１× ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（高い厳重洗浄）。

本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて、裸であり、または細胞膜を通過するために適した担体（例えば、ポリヌクレオチド−リポソーム複合体またはコロイド分散系）中にあり、ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）中に収納され、不活性ビーズまたは他の異種ドメイン（例えば、抗体、リガンド、ビオチン、ストレプトアビジン、レクチンなど）、または本明細書に記載され、あるいは当業界で周知の他の適切な組成物に結合されることができる。したがって、ポリヌクレオチド送達のウイルスおよび非ウイルス手段が達成されうるとともに、意図されている。本発明のポリヌクレオチドは、それらに結合される、本明細書に記載された種々の異種ドメインなど、明確な機能性を有するポリペプチドをコードする追加の核酸配列も含有しうる。

本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼに対して抵抗性であるように改変され、医薬組成物におけるその安定性を増強することもできる。記載されたポリヌクレオチドは、特にかかるポリヌクレオチドが本明細書に開示され、または当業界で周知の発現系に組込まれている場合、本発明のキメラポリペプチドをコードするために有用である。したがって、発現ベクターを含むポリヌクレオチドも含まれている。

細胞中の増殖または発現のために、本明細書に記載されたポリヌクレオチドをベクターに挿入することができる。「ベクター」なる用語は、プラスミド、ウイルス、または核酸の挿入または組込みによって操作されうる当業界で周知の他の媒介体を指す。かかるベクターは、遺伝子操作（すなわち「クローニングベクター」）に用いることができ、または挿入ポリヌクレオチド（すなわち「発現ベクター」）を転写または翻訳するために用いることができる。ベクターは一般に、細胞およびプロモーター中の増殖のための少なくとも複製の起源を含有する。発現ベクター内に存在するプロモーターを含む対照要素が含まれ、適切な転写および翻訳を促進する（例えば、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡおよび停止コドンのイン・フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）翻訳を可能にする遺伝子の正確なリーディングフレームの維持）。本明細書に記載されたポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現は、核酸に操作可能に結合されるプロモーターによって得ることができる。「プロモーター」は、プロモーターが操作可能に結合される核酸の転写を導くに十分な最小限の核酸配列を指す（例えば、ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学における方法）、１９８７年（１５３）、ｐ．５１６〜５４４を参照）。プロモーターは構成的に転写を導くことができ、組織特異的であり、または誘導性あるいは抑制性の転写を与えることができ、かかる要素は一般にこうして調節される遺伝子の５’領域または３’領域に配置されている。

本発明においては、コレセプターを結合するウイルスのために、ウイルス感染しやすい細胞（例えば、コレセプターを発現する細胞）に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し、発現させることが有利である。このようにして、発現キメラポリペプチドは、コレセプターに近接した形質変換感受性細胞によって分泌され、それによってコレセプターへのウイルスのアクセスを抑制または予防し、次いで、細胞のウイルス感染を抑制し、予防する。このために、組織特異的プロモーターをポリヌクレオチド配列に操作可能に結合し、適切なターゲット細胞においてキメラポリペプチドの発現を与えることができる。

本明細書で用いられる「組織特異的プロモーター」なる語句は、特定の細胞、例えば、肝細胞、造血性細胞、または動物内の特定組織の細胞において操作可能に結合されたポリヌクレオチドの発現を与える、特定の細胞または組織において活性であるプロモーターを意味する。この用語は、１つの組織内の主に選択ＤＮＡの発現を調節するが、１つ以上の他の組織内でも発現をひき起こす、いわゆる「リーキー（ｌｅａｋｙ）」プロモーターもカバーする。

誘導性プロモーターを用いて、細胞内の発現を調節することもできる。「誘導性プロモーター」は、その活性レベルが外部シグナルまたは物質（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター）による処理に応じて増大するプロモーターを意味する。「抑制性プロモーター」または「条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）プロモーター」は、その活性レベルが抑制因子または同等の化合物に応じて低下するプロモーターを意味する。抑制因子がもはや存在しない場合、転写が活性化または抑制される。かかるプロモーターは、組み合わせて用いることができ、イントロンやエンハンサー配列など、転写および発現に必要である追加のＤＮＡ配列も含みうる。

本明細書で用いられる「操作可能に結合される」なる用語は、選択されたポリヌクレオチド（例えば、キメラポリペプチドをコードする）と調節配列が、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が調節配列に結合されている場合に転写を可能にするような方法で接続されていることを意味する。通常、プロモーターはポリヌクレオチドの５’末端に位置しており、プロモーターがポリヌクレオチドの発現を調節しうる転写開始部位の近接でもありうる。しかし、第１ベクター上のプロモーターがタンパク質の発現を制御し、次いで第２ベクター上のポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーターを調節する間接的な操作可能な結合も可能である。

細菌系におけるクローニングの場合、Ｔ７等などの構成プロモーターのほか、バクテリオファージγのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃなどの誘導プロモーターを用いることができる。哺乳動物系におけるクローニングの場合、ＳＶ４０、ＲＳＶ等などの構成プロモーター、または哺乳動物細胞のゲノム由来の誘導プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物由来の誘導プロモーター（例えば、マウス乳腺主要ウイルスの長い末端反復、アデノウイルス後期プロモーター）を用いることができる。組換えＤＮＡまたは合成法によって製造されるプロモーターを用いて、本発明の核酸配列の転写を得ることもできる。

組換えウイルスまたはウイルス要素を利用して発現を導く哺乳動物の発現系を人工的に作り出すことができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、核酸配列はアデノウイルス転写／翻訳対照複合体、例えば、後期プロモーターおよび三者間リーダー配列にライゲーションするすることができる。あるいは、ワクシナウイルス７．５Ｋプロモーターを用いることができる（例えば、マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８２年（７９）、ｐ．７４１５〜７４１９、マケットら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８４年（４９）、ｐ．８５７〜８６４、パニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８２年（７９）、ｐ．４９２７〜４９３１を参照）。

哺乳動物の発現系は、アデノウイルスベクター（米国特許第５，７００，４７０号および同第５，７３１，１７２号）、アデノ関連ベクター（米国特許第５，６０４，０９０号）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）、およびレトロウイルスベクター（米国特許第５，６２４，８２０号，同第５，６９３，５０８号、および同第５，６７４，７０３号、および国際公開第９２／０５２６６号および同第９２／１４８２９号）を含む、「遺伝子治療」法のために特別に設計されたベクターをさらに含む。弱毒化ワクチン（Ｍ．ジラード（Ｇｉｒａｒｄ）ら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＩＩＩ、１９９９年（３２２）、ｐ．９５９〜６６）、Ｂ．モス（Ｍｏｓｓ）ら、ＡＩＤＳ、補遺２、１９８８年（１）、ｐ．Ｓ１０３〜１０５）、セムリキ森林ウイルス（Ｍ．ジラード（Ｇｉｒａｒｄ）ら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＩＩＩ、１９９９年（３２２）、ｐ．９５９〜６６）、Ｓ．Ｐ．モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１９９６年（７０）、ｐ．１９．５３〜６０）、またはサルモネラ（Ｒ．ポウェル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら著、感染症の管理のための分子手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ）（ｐ．１８３〜１８７）所収、Ｆ．ブラン（Ｂｒａｎ）、Ｅ．ノルビィ（Ｎｏｒｒｂｙ）、Ｄ．バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）、およびＪ．メッカラノス（Ｍｅｃｋａｌａｎｏｓ）（編）、１９９６年、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）（ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ））、Ｍ．Ｔ．シャータ（Ｓｈａｔａ）ら、Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ、２０００年（６）、ｐ．６６〜７１）などのワクチン運搬体にキメラポリペプチドコード遺伝子を導入し、適切に結び付けられ、折り畳まれたウイルスコートタンパク質、および受容体配列、例えば、ｇｐ１２０およびＣＤ４の発現のための有効かつ信頼できる手段を提供することができる。ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）に基づくウイルスは、染色体外要素として複製する能力を有する（サーバー（Ｓａｒｖｅｒ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８１年（１）、ｐ．４８６）。マウス細胞への染色体外ベクターの侵入直後に、ベクターは細胞当り約１００〜２００のコピーを複製する。挿入ｃＤＮＡの転写には宿主染色体へのプラスミドの一体化を必要としないため、高レベルの発現が生じる。かかるベクターは遺伝子治療においても使用されている（米国特許第５，７１９，０５４号）。ＣＭＶに基づくベクターも含まれる（米国特許第５，５６１，０６３号）。

酵母菌の発現のために、構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含有する多くのベクターを使用することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新のプロトコル）、第２巻、第１３章、オーズベル（Ａｕｓｂｅｌ）ら編、１９８８年、グリーン・パブリッシュ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ）協会（Ａｓｓｏｃ）＆ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、グラント（Ｇｒａｎｔ）ら著「酵母菌の発現および分泌ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ）」、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１５３巻所収、ｐｐ．５１６〜５４４、１９８７年、ウー（Ｗｕ）アンド・グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）編（３）、１９８７年、アカデミック・プレス（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）著、ＤＮＡクローニング、第ＩＩ巻（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ）、第３章、１９８６年、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、ワシントンＤ．Ｃ．、ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）著「酵母菌における異種遺伝子発現（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ）」、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１５２巻、ｐｐ．６７３〜６８４、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）編、１９８７年、アカデミック・プレス（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、および酵母菌の分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ストラテム（Ｓｔｒａｔｈｅｍ）ら編、１９８２年、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、第１巻、第ＩＩ巻）。ＡＤＨまたはＬＥＵ２などの構成酵母プロモーター、またはＧＡＬなどの誘導プロモーターを用いてもよい（「酵母におけるクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ）」、Ｒ．ロスステイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、ＤＮＡクローニング。実践的方法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第１１巻、第３章所収、Ｄ．Ｍ．グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）編、１９８６年、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、ワシントンＤ．Ｃ．）。あるいは、例えば、相同性組換えによって、外来核酸配列の酵母染色体への一体化を促進するベクターが当業界で周知であり、これを用いることができる。挿入ポリヌクレオチドがより従来型の酵母発現ベクターに長すぎる場合（例えば、約１２ｋｂ超）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）が一般的に用いられる。ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現のために発現ベクターに挿入することができ（例えば、市販されているｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳キットを用いて）、または適切な核酸の適切なｉｎ ｖｉｖｏ細胞、器官、組織、または生物への転移によって原核生物または真核生物のいずれかにおける発現を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクターに挿入することができる。

本明細書で用いられる「組換え遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、人工的に宿主細胞に挿入されるポリヌクレオチドの一部であり、その細胞から発達する生物の一部となる。組換え遺伝子は、１つ以上のプロモーター、および選択されたＤＮＡに操作可能に結合される選択されたＤＮＡの発現に必要なイントロンなど他のＤＮＡを含むことができ、エンハンサー配列を含みうる。組換え遺伝子は、トランスジェニック生物と部分的または完全に異種（すなわち外来）であるポリヌクレオチドを含み、または生物の内在性遺伝子と相同性の遺伝子を示しうる。組換え遺伝子は、宿主細胞のゲノムに一体化し、自己複製プラスミドとして維持されうる。

本明細書で用いられる「宿主細胞」は、増殖し、転写し、コードポリペプチドを発現しうるポリヌクレオチドが挿入される細胞である。この用語は、対象宿主細胞の子孫をも含む。すべての子孫が親細胞と同一とはいえないと理解されるが、それは複製中に生じる変異がありうるためである。宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、組換えバクテリオファージポリヌクレオチド、プラスミド核酸、またはコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌、組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、または組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、または安定した発現のために人工的に作り出された形質転換動物細胞系が挙げられる。

本発明のポリペプチドを長期間発現させるために、安定した発現が好ましい。したがって、複製細胞のウイルス起源を含有する発現ベクターを用いて、適切な制御要素（例えば、プロモーター／エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御される核酸で形質転換することができる。特定の理論によって束縛されること、または限定されることは望まないが、哺乳動物細胞における発現ベクターの安定した維持は、宿主細胞の染色体へのベクターの一体化によって生じると考えられている。必要に応じて、発現ベクターは、選択的圧力に耐性を与える選択マーカーをコードする遺伝子や、遺伝子が細胞に導入されたことを示すレポーターをコードする遺伝子を含むことができ、それによってベクターを有する細胞が識別され、成長させられ、増殖される。本明細書で用いられる「レポーター遺伝子」は、その発現が分析されうる遺伝子を意味し、かかる遺伝子としては、限定されることなく、ｌａｃＺ、アミノ酸生合成遺伝子、例えば、酵母ＬＥＩ２遺伝子、ルシフェラーゼ、または哺乳動物クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子は、染色体に一体化することができ、または自己複製プラスミド（例えば、酵母２ミクロンプラスミド）に担持されうる。また、選択可能なマーカーは、本発明のポリヌクレオチドを含有する第１ベクターとともに宿主細胞に同時トランスフェクションされる第２ベクター上に存在してもよい。

アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を与えるネオマイシン遺伝子（コルベレ−ガラピン（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ）ら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８１年（１５０）、ｐ．１）、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるハイグロマイシン遺伝子（サンテレ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ）ら、Ｇｅｎｅ（遺伝子）、１９８４年（３０）、ｐ．１４７）を含むがこれに限定されない、多くの選択系を用いることができる。最近、別の選択可能な遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（ハルトマン（Ｈａｒｔｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８年（８５）、ｐ．８０４７）、およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する抵抗性を与えるＯＤＣ（オルチニンデカルボキシラーゼ）（マクコログ（ＭｃＣｏｌｏｇｕｅ）著、分子生物学におけるカレントコミュニケーション（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）所収、１９８７年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）編）が記載されている。

本明細書で用いられる「形質転換」なる用語は、細胞に対して外因性のポリヌクレオチド（例えば、組換え遺伝子）の取込み後の細胞における遺伝子変化を意味する。したがって、「形質転換細胞」は、組換え技術によってポリヌクレオチドが導入されている細胞、またはその子孫である。形質転換細胞は、人間全体を含むことはない。宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の方法によって行うことができる。宿主細胞が真核生物である場合、ＤＮＡ形質転換の方法は、例えば、リン酸カルシウム、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム、およびウイルスベクターを含む。真核生物細胞は、本発明のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメント、および本明細書に記載され、または当業界で周知の選択可能なマーカーをコードする第２ＤＮＡ分子との同時形質転換も可能である。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシ乳頭腫ウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用し、真核生物細胞を一時的に感染または形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（真核生物ウイルスベクター）、１９８２年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、グルッツマン（Ｇｌｕｔｚｍａｎ）編）。宿主が原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））である場合、対数増殖後に収穫された細胞からＤＮＡ取込み能力があるコンピテント細胞を調製し、その後に当業界で公知の方法を用いてＣａＣｌ_２によって処理することができる。原核生物の形質転換は、宿主細胞の原形質融合によっても行うことができる。

本発明と同一のものを含有するキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、および発現ベクターは、標準的な方法を用いてリポソーム内にカプセル化し、細胞または全生物に導入することができる。ポリヌクレオチドの送達には陽イオンリポソームが好ましい。タンパク質およびポリヌクレオチドを含めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの種々の組成物を導入するためのリポソームの使用は、当業者には周知である（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、同第５，０００，９５９号、同第４，８６３，７４０号、および同第４，９７５，２８２号）。

リポソームは、対応する細胞受容体が同定されているポリペプチドなどのリガンドを、リポソーム調製の際に添加することによって所定の細胞型または組織にターゲティングすることができる。例えば、ＣＤ４＋細胞に感染するウイルスの場合、ＣＤ４＋細胞は適切なターゲットであり、ＨＩＶ ｇｐ１２０は、本明細書に記載されたキメラポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有するリポソームの細胞内導入のための適切なリガンドでありうる。モノクローナル抗体もターゲティングのために用いることができ、多種多様の細胞表面に対して特異的な多くのかかる抗体が当業者には周知であり、入手可能である。選択されたリガンドは、プリフォームされたリポソーム中の脂質アンカーに共有結合されているか、またはリポソーム調製中に取込まれる（リー（Ｌｅｅ）とロー（Ｌｏｗ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４年（２６９）３、ｐ．１９８、
リーとロー、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔｕ、１９９５年（１２３３）、ｐ．１３４を参照）。

本発明と同一のものをコードするキメラポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、全生物に導入することができる。特に、コレセプターに結合するウイルスコートポリペプチドを含有するキメラポリペプチドについては、本発明のキメラポリペプチドを発現するトランスジェニック動物が、キメラ発現の長期効果の試験、および発現キメラポリペプチドは対応するウイルスによって感染を保護するか抑制するかの判定に有用であろう。

したがって、別の実施形態において、本発明は、キメラポリペプチドを発現するヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。好ましい動物は、対応する受容体ポリペプチド配列が周知であるウイルスに感染しやすい動物である。好ましい動物は、本明細書に記載された、ヒト以外の霊長類（例えば、マカクザル、チンパンジー、サル、テナガザル、オランウンターン等）、家畜類などの哺乳動物である。

「トランスジェニック動物」なる用語は、その体細胞または生殖細胞系が、組換えウイルスのマイクロインジェクションまたは感染によるなど、細胞より小さいレベルでの意図的な遺伝子操作によって、直接的または間接的に受け取られる遺伝子情報を有する動物を指す。「トランスジェニック」なる用語は、本明細書に記載されているように、遺伝子操作されたトランスジェニック動物から得られた細胞または組織（すなわち「トランスジェニック細胞」「トランスジェニック組織」）をさらに含む。本発明の文脈において、「トランスジェニック動物」は、伝統的な交配によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ授精で生成される動物を包含せず、１個以上の細胞が組換えＤＮＡを受容する動物を示す。トランスジェニック動物は、組換え遺伝子に関してヘテロ接合またはホモ接合のいずれかでありうる。トランスジェニック動物を生成するための方法は当業界で公知である（例えば、米国特許第５，７２１，３６７号、同第５，６９５，９７７号、同第５６５０，２９８号、および同第５６１４，３９６号を参照）。

本明細書に記載されたキメラポリペプチドを用いて、抗体などの別途の試薬を生成することができる。本発明の抗体は、本明細書に記載された種々の治療方法において有用である。例えば、免疫性を与えられた対象において生成された抗体は、ウイルス感染に対して対象を保護し、あるいは、レシピエント対象に転移され、感染に対して第２の対象を受動的に保護することができる。ウィルスコート・ポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列との間に複合体形成時に曝露されるエピトープに結合する抗体も生成することができる。さらに、本発明の抗体は、診断方法、精製方法、およびスクリーニング方法（例えば、隠れたエピトープ、コレセプター等の識別）において有用である。

したがって、本発明によれば、本明細書に記載された複合体形成時に曝露される隠れたエピトープに対して特異的な抗体を含めて、キメラポリペプチドに結合する抗体が提供される。１つの実施形態において、抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏでの異なる地理的分岐群からの多数のウイルス分離株およびウイルスを中和する（「広範中和」と呼ぶ）。別の実施形態において、抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでウイルス感染を抑制し、予防し、遮断する。これらの実施形態の種々の態様において、中和されるウイルスは、本明細書に記載されたＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２免疫不全ウイルスを含む免疫不全ウイルスである。ポリクローナル抗体、異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、および別個のモノクローナル抗体調製物を含む抗体も提供される。

キメラポリペプチドに対する抗体は、キメラポリペプチドを動物に投与することによって生成される。これらの抗体は、当業界で公知の方法を用いて生成、分離、および精製することができる。したがって、別の実施形態において、本発明は、キメラポリペプチドに対する抗体を生成する方法を提供する。本発明の方法は、キメラポリペプチドを対象に投与し、キメラポリペプチドに結合する抗体を分離する工程を含む。１つの実施形態において、生成された抗体は、ウィルスコート・ポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列との間の結合時に曝露される隠れたエピトープに結合する。

抗体は、ウィルスコート・ポリペプチド配列（例えば、エンベロープポリペプチド配列）と受容体ポリペプチド配列が互いに結合する場合に曝露される隠れたエピトープに結合することが好ましい。例えば、ＨＩＶエンベロープポリペプチド配列ｇｐ１２０は、ＣＤ４受容体ポリペプチド配列への結合時にエピトープを曝露し、曝露されたエピトープに対する抗体はＨＩＶの広範な中和に至りうる。かかるエピトープは、異なるウィルス分離株および地理的分岐群の中に共存し、これらのエピトープに方向づけられた抗体の広域中和活性の原因となりうる。

理論によって束縛されることは望まないが、ＣＤ４結合の非存在下に、隠れたエピトープは曝露されず、または抗原性ではない。本明細書で用いられる「エピトープ」なる用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上に抗原性決定因子を指す。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な３次元構造的特性、および特異的変化特性を有する。本明細書で用いられる「隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）」なる用語は、その特徴または特性が明らかになるために、構造的または配座の変化を必要とする特性または特徴を指し、変化がおこらなければ該特徴または特性は「隠されて」いる。隠れたエピトープは、ウイルスコートタンパク質または受容体ポリペプチド配列のいずれかに存在しうる。

「抗体」なる用語は、本明細書に記載されたキメラポリペプチド中に存在するエピトープ決定因子への結合能がある無傷分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖなど、そのフラグメントを含む。他の抗体フラグメントは、そのフラグメントがその抗原と選択的に結合する能力を保持している限り、含まれる。本発明の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ）は、抗体のタンパク質分解加水分解、例えば、全抗体のペプシン消化によって調製することができる。開示されたキメラポリペプチドに結合する抗体は、無傷キメラポリペプチドまたはそのフラグメントを免疫抗原として用いることによって調製することができる。キメラポリペプチドフラグメントの場合、ウイルスコートポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列は、互いに結合する能力を維持し、存在する隠れたエピトープが曝露されるようになることが好ましい。動物を免疫化するために用いられるキメラポリペプチドは、翻訳されたポリペプチド由来であり、または化学的に合成され、必要に応じて、担体に接合することができる。免疫化ペプチドに化学的に結合される一般的に使用されるかかる担体としては、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風トキソイドが挙げられる。

モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって製造される（参考によって本明細書に援用される、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年（２５６）、ｐ．４９５、およびハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体：実験マニュアル）、１９８８年、ｐ．７２６、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．）編）。簡単に言えば、抗体を含む組成物をマウスに注射し、血清サンプルを分析することによって抗体産生の存在を確認し、脾臓を除去してＢリンパ球を得、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、ハイブリドーマ培養から抗体を分離することによってモノクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含む種々の定着した方法によってハイブリドーマ培養から分離し、精製することができる（例えば、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら著「ウサギ、ラット、マウス、およびハムスターにおけるポリクローナル抗血清の生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ，Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ）」、免疫学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）所収、§§２．７．１〜２．７．１２および§§２．９．１〜２．９．３、およびバーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）ら著「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ））」、分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）所収、１９９２年、第１０巻、ｐｐ．７９〜１０４、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）を参照）。ポリクローナル抗体の調製は当業者に公知である（例えば、参考によって本明細書に援用される、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら著「ポリクローナル抗血清の生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ）」、免疫化学プロトコール（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）所収、１９９２年、ｐｐ．1〜５、マンソン（Ｍａｎｓｏｎ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ハーローら（１９９８年）、上掲書、およびコリガンら（１９９２年）、上掲書、§２．４．１を参照）。

治療目的のために、１つの種において生成されるキメラポリペプチドに対する抗体をヒト化し、その抗体が、例えば、受動免疫のために、宿主に投与される場合に免疫反応を誘発しないようにすることができる。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の一定領域をヒトの一定領域で置換することによって生成される。かかる抗体ヒト化法は当業界で周知であり、本発明の方法において特に有用である（モルシオン（Ｍｏｒｒｓｉｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４年（８１）、ｐ．６８５１、タケダ（Ｔａｋｅｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年（３１４）、ｐ．４５２、シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９３年（１５０）、ｐ．２８４４）。

キメラポリペプチドを結合する抗体、特に、隠れたエピトープを結合する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（すなわち、対象における）ウイルスを中和する。したがって、かかる抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでウイルス感染を予防または抑制することができ、感染に伴い症状の一部または全部を改善しうる。かかる抗体は、一対象において生成し、次いで別の対象に、すなわち、受動免疫療法のために導入することができる。あるいは、キメラポリペプチドを結合する抗体は、対象において生成される場合、その対象を感染から保護し、感染に伴う症状の一部または全部を改善することができる。

したがって、本発明によれば、対象におけるウイルス感染を抑制し、予防し、改善するたけの方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、キメラポリペプチドに結合する抗体の有効量を対象に投与し、それによって対象における感染を予防し、抑制する工程を含む。別の実施形態において、本発明の方法は、キメラポリペプチドの有効量を対象に投与し、それによって対象におけるウイルス感染を予防し、抑制するために十分な免疫反応を生成する工程を含む。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量を対象に投与する工程を含む。種々の態様において、キメラポリペプチドは、本明細書に記載された免疫不全ウィルスエンベロープポリペプチドを含有する。

キメラポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが投与される対象におけるウィルス感染を抑制し、予防し、改善するための方法において、免疫反応も生成することができる。免疫反応は、本質的に液性である可能性が高いが、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによりＣＴＬ反応を誘発しうる。本発明の方法は、必要に応じて、他のウイルス療法と併用することもできる。

「有効量」は、対象におけるウイルス感染を抑制し、予防し、または改善するのに十分となり、または対象における免疫反応を生成するのに十分な量である。したがって、キメラポリペプチドの有効量は、コートタンパク質がそれに基づくポリペプチドまたはウイルスに対する免疫反応を導き出す量でありうる。ウイルスにすでに感染した対象に投与される有効量も、ウイルス負荷を減少し、またはＣＤ４＋細胞の数を増加させる量でありうる。有効量は、感染した対象から別の（非感染または感染）対象へのウイルスの感染を抑制する量でありうる。

キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が対象に投与される本発明の方法において、キメラポリペプチドに対するＣＴＬ反応が、対応するコートポリペプチド配列を含有するウイルスに対して生成されうる。

本発明のキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体は、ヒトを含む対象に投与されるため、本発明は、開示されたキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を含む医薬組成物も提供される。したがって、対象に投与される組成物は、「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」製剤となる。

本明細書で用いられる「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」は、好ましくは過剰な有害な副作用（例えば、悪心、頭痛等）なしに、対象に投与されうる担体、希釈剤、賦形剤などを指す。投与のためのかかる製剤としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、および乳剤が挙げられる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、乳剤、または食塩水や緩衝溶剤を含む懸濁液が挙げられる。賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、塩化ナトリウム、乳酸化リンガーまたは不揮発性油が挙げられる。静脈内賦形剤としては、液体および栄養補充薬、電解補充薬（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等などの保存剤および他の添加剤も存在しうる。当業界で周知の対象に投与するために適した種々の医薬組成物が、本発明において適用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの医薬科学）、第１８版、１９９０年、マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ））、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、第１２版、１９９６年、メルク・パブリッシング・グループ（Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）（ニュージャージー州ホワイトハウス（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，ＮＪ））。

投与組成物の作用期間の管理または送達の制御により、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの粒子またはポリマー物質への組成物の組込みよって達成しうる。組成物の放出速度は、かかる高分子の濃度または組成を変更することによって制御されうる。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質系が挙げられる。

本発明の方法によって投与される組成物は、注射によって、ゆっくり時間をかけた灌流によって、ボーラス投与によって（例えば、針指し創傷から生じるＨＩＶ感染に対する受動保護の場合）、または微細加工植込み式装置によって非経口的に投与することができる。組成物は、吸入によって、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、腔内（例えば、膣または肛門）、経皮、局所、または血管内投与することができる。組成物は、複数回投与することができる。ウイルス感染または伝播を治療、抑制、または予防するために、または免疫反応を誘発するために必要な用量または「有効量」は、感染の症状の一部または全部を改善するのに十分となることが好ましいが、感染の進行または悪化を予防することも、ＨＩＶを含めて多くのウイルス感染には十分な成果である。有効量は、当業者によって容易に決定しうる（例えば、アンセル（Ａｎｓｅｌ）ら著、医薬的ドラッグ・デリバリー・システム（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５版（リー（Ｌｅａ）とフェビガー（Ｆｅｂｉｇｅｒ）（１９９０年）、ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編）を参照）。

本発明のキメラポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体は、診断目的にも有用である。例えば、感染のためにコレセプターを利用するウイルス由来のウイルスコートポリペプチド配列を有するキメラポリペプチドを用いて、キメラポリペプチドに対する低下した結合アフィニティーを有するコレセプターを発現する対象を識別することができる。低下した結合アフィニティーを有する対象は、ウイルスによる感染リスクの減少を示す可能性が高くなる。あるいは、キメラポリペプチドに対する増大した結合アフィニティーを有するコレセプターを発現する対象は、ウイルス感染のリスクが増大することになる。このようにして、ウイルス感染に対するリスクの減少または増大を示す対象を識別することができる。例えば、ＨＩＶｇｐ１２０−ＣＤ４からなるキメラポリペプチドに対するアフィニティーの増大または減少を示すＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を発現する対象はそれぞれ、ＨＩＶ感染のリスクが増大または減少することになる。したがって、かかる方法は、予後の評価に有用であり、高アフィニティーの結合コレセプターを発現する対象の予後は不良の可能性がある。

コレセプターを利用するウイルスのウイルスコートポリペプチド配列を有する本明細書に開示されたキメラポリペプチドの場合、かかるキメラポリペプチドは、ウイルスのコレセプターへの結合を調節する物質を同定するために有用である。かかるキメラポリペプチドは、キメラポリペプチド内の受容体配列へのウイルスコートポリペプチド配列の分子内相互作用／結合を調節する物質を同定するためにも有用である。したがって、コレセプターを利用しえないウイルスのコートポリペプチドを含有する記載されたキメラポリペプチドを用いて、キメラ分子内の受容体配列へのコート配列の結合を調節する物質を同定することができる。

したがって、本発明によれば、ウイルスとウイルスコレセプターとの結合を調節する物質を同定する方法、およびウイルスとウイルス受容体との結合を調節する物質を同定するための方法が提供される。

１つの実施形態において、本発明は、被検物質の存在下および非存在下で、キメラポリペプチドとコレセプターを結合させる条件下で、キメラポリペプチドをウイルスコレセプターと接触させる工程と、被検物質の存在下および非存在下の結合を検出する工程とを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、分子内複合体を形成するキメラポリペプチドを被検物質と接触させる工程と、キメラ内のウイルスコートポリペプチド配列と受容体ポリペプチド配列との結合を検出する工程とを含む。被検物質の存在下の結合の量の減少により、ウイルスとウイルスコレセプターまたは受容体との相互作用／結合を抑制する物質が同定される。被検物質の存在下の結合の増大により、ウイルスとウイルスコレセプターまたは受容体との相互作用／結合を刺激する物質が同定される。

接触は、溶液中、固相中、無傷細胞上、またはヒト以外の霊長類などの生物内で起こりうる。種々の実施形態において、ウイルスは、ＨＩＶなどの免疫不全ウイルスであり、コレセプターは、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４などのケモカインである。細胞侵入のためにコレセプターを利用するウイルスの結合は、その後の感染、ウイルス増殖、およびそれらから結果として生じる最終的な病理的症状にとって重要な工程である。したがって、別の実施形態では、ウイルスの細胞侵入、感染、および増殖を抑制する物質、およびウイルス感染に伴う症状を改善する物質を同定するための方法が提供される。かかる物質を同定するために本発明の方法において、被検物質は、キメラポリペプチドをコレセプターポリペプチドと接触させた後、あるいは、キメラポリペプチドをコレセプターポリペプチドと接触させる前に添加されうる。

候補の物質としては、抗体、抗ウイルス薬、コレセプターポリペプチド配列（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４由来）、ペプチド類似体、またはそれらの活性フラグメントが挙げられる。候補の物質は、分子量が５０ダルトンを超え、かつ約２，５００ダルトン未満である小有機化合物のような有機分子も包含する。候補の物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、通常、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは、機能的化学基の少なくとも２つを含む。候補の物質は多くの場合、環状カーボン（ｃｙｃｌｉｃａｌ ｃａｒｂｏｎ）構造または複素環構造、および／または１種以上の上記の官能基で置換される芳香族または多芳香族構造を含む。候補の物質はペプチド類、糖類、脂肪酸ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造的類似体、またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない生体分子の中にも見出される。

候補の物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含めて、多種多様の供給元から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含めて、多種多様の有機化合物および生体分子のランダムおよび自在合成のために多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形における天然化合物のライブラリーが入手可能または容易に生成される。さらに、天然または合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に改変され、これを用いて組合せライブラリーを生成することができる。周知の薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミジ化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等などの自在またはランダム化学的改変にかけ、構造的類似体を得ることができる。方法により結合が検出される場合、１つ以上の分子を標識に結合し、ここで標識は直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する。種々の標識としては、ラジオアイソトープ、蛍光、化学ルミネセンス、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁粉などが挙げられる。特異的結合分子としては、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジオキシン等などの対が挙げられる。特異的結合膜については、相補膜は通常、周知の方法に従って、検出を提供する分子で標識される。

種々の他の試薬をアッセイに含めることができる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、かつ／または非特異的またはバックグラウンド相互作用を削減するために用いられる塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤等などの試薬が含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌薬等など、アッセイの効率を改善する試薬を用いることができる。化合物の混合は、必要な結合が提供される順序で添加される。インキュベーションは、通常、４℃〜４０℃の適切な温度下に行われる。インキュベーション期間は最適な活性のために選択されるが、迅速な高処理量のスクリーニングを促進するように最適化することもできる。通常、０．１〜１時間で十分であろう。

種々の実施形態において、ウイルスは、本明細書に記載されているように、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＳＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＰＶ、またはヘルペスウイルスなどの免疫不全ウイルスである。追加の実施形態において、コレセプターは、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ−２ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ８、Ｖ２８／ＣＸ３ＣＲ１、ＵＳ２８（ヘルペスウイルスコードするケモカイン様受容体）、ＳＴＲＬ３３／ＢＯＢ／ＴＹＭＳＴＲ、ＧＰＲ１５／Ｂｏｎｚｏ、またはＧＰＲ１ポリペプチド配列である。

本明細書に記載された本発明の方法によって同定された物質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞のウイルスの結合または感染を抑制するその能力についてさらに試験することができる。したがって、本発明によれば、細胞のウイルス感染を抑制する物質を同定する方法が提供される。本発明の方法は、被検物質の存在および非存在下に、キメラポリペプチドとコレセプターを結合させる条件下に、ウイルス感染しやすい細胞を感染性ウイルスと接触させる工程と、被検物質が細胞のウイルス結合または感染を抑制するかどうかを判定する工程と、それによってウイルス感染を抑制する物質を同定する工程とを含む。種々の実施形態において、被検物質は、感染性ウイルス粒子との細胞の接触前後に添加される。この方法はまた、非ヒト霊長類などの任意の他の動物に行われうる。

本明細書に記載されたキメラポリペプチドは、新規なコレセプターを同定し、またはコレセプターとしてのタンパク質を特徴づけるためにも有用である。このようにして、ウイルスおよびその後のウイルスの病原性をよりよく理解することができ、それによって感染の治療の改善が可能となる。例えば、新規なコレセプターを同定し、またはコレセプター機能を特徴づけるための１つの方法がツーハイブリッド系であり、これにより、ポリペプチドを相互作用させることによって発現が誘導されるレポーターの活性化を通じて、タンパク質−タンパク質の相互作用を検出することができる。したがって、適切なキメラポリペプチドを酵母または哺乳動物のツーハイブリッド系におけるベイト配列として使用し、新規なコレセプターを含む相互作用タンパク質を同定する目的にライブラリーをスクリーニングすることができる。タンパク質−タンパク質相互作用を検出する十分に確立された生化学的方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、勾配クロマトグラフィー、共免疫沈澱分析等）も、コレセプターの同定または潜在的なコレセプター機能を有するタンパク質の特徴づけにおいて適用可能である。

コレセプターを結合するキメラポリペプチドは、コレセプター結合部位を同定するためにも有用である。例えば、コレセプターポリペプチドフラグメントを生成し、フラグメントを適切なキメラポリペプチドと接触させることによる。接触は、溶液中、（例えば、共沈殿）、固相中（例えば、アフィニティーカラム）、または無傷細胞上（例えば、細胞表面上のコレセプターフラグメントを接触させ、コレセプターフラグメントがキメラポリペプチドの細胞への結合を抑制するかどうを検出する）。コレセプター結合部位は、同定されると、これを抗ウイルス剤として、例えば、感染を治療するために用いることができる。

他に特に規定がなければ、本明細書で用いられた技術用語および学術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いることはできるが、適切な方法および材料は以下に記載されている。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、その全体が参考によって援用される。不一致の場合、定義を含めて本明細書は調整される。また、材料、方法、および実施例は例示されているだけであり、限定は意図されていない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかであろう。本発明はさらに以下の実施例において記載されているが、これらにより特許請求の範囲に記載された本発明の範囲が限定されることはない。

実施例Ｉ
本実施例では、一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドＦＬＳＣ、ＴｓＳＣ、ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ、およびＲＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９をコードするポリヌクレオチドの構成が記載される。一本鎖複合体を構築する方法は、２０〜３０個のアミノ酸リンカー配列のｇｐ１２０のＣ末端とＣＤ４のＮ末端との間への配置に基づく。スイス（Ｓｗｉｓｓ）ＰＤＢビュアーを用いた可溶性ＣＤ４および１７ｂに結合された改変ｇｐ１２０の結晶構造の分析（ドウォン（Ｄｗｏｎｇ），Ｐ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年（３９３）、ｐ．６４８〜５９）は、キメラ分子がｇｐ１２０−ＣＤ４複合体の形成をもたらす分子内相互作用の能力のあることを示した。以下の順序でそれぞれのコード配列を配置することによって、ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドをコードする一本鎖核酸（配列番号：１）を構成した：（１）５’末端で、マクロファージ刺激ＨＩＶ、ＢａＬのｇｐ１２０をコードする合成コドン、（２）グリシン、アラニン、およびセリンからなる２０アミノ酸リンカーをコードする配列、（３）可溶性ＣＤ４ドメイン１および２（Ｄ１Ｄ２）の配列、および（４）３’末端で、ＦＬＳＣ対するｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子由来の短いポリペプチドをコードする配列。ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔヌクレオチド配列（配列番号：３）は、アルギニンがトレオニンで置換されているｇｐ１２０のｃ末端で変異を有するタンパク質（配列番号：４）をコードする。ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９（配列番号：５）は、ＣＤ４ Ｄ１Ｄ２領域が、ＣＤ４ Ｄ１Ｄ２領域の機能的活性を再現するペプチドをコードするＣＤ４Ｍ９の配列コーディングで置換されている本発明のキメラポリペプチド（配列番号：６）のヌクレオチド配列の変化をさらに含む。ｒｅｖ独立的に高レベルの発現が可能であるため（ハース（Ｈａａｓ），Ｊ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年（６：３）、ｐ．１５〜２４）コドン最適化ｇｐ１２０配列を用いた。使用したヒトＣＤ４は、Ｔ４−ｐＭＶ７由来であった（マドン（Ｍａｄｄｏｎ），Ｐ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、１９８６年（４７）、ｐ．３３３〜４８）、メリーランド州ベテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬貯蔵部（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））。ｍｙｃポリペプチド配列によりキメラポリペプチドの便利な分析、精製、および他の操作が可能である。

３種類の配列を含む完全なポリペプチドをＰＣＲによって生成し、強力な伸長因子促進剤（ＥＦ １）を用いてｐＥＦ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、発現を推進した。制限酵素部位をこの構築物（ｐＥＦ６−ＳＣＢａｌで指定）に導入し、他の免疫不全ウイルスの他のエンベロープ遺伝子との便利な交換を可能にした。

簡単に言えば、プラスミドｐＭＲ１Ｗ１−９およびＴ４−ｐＭＶ７をテンプレートとして用いたＰＣＲによってＦＬＳＣを構成した。ｇｐ１２０順方向プライマーは、ＧＧＧ−ＧＧＴ−ＡＣＣ−ＡＴＧ−ＣＣＣ−ＡＴＧ−ＧＧＧ−ＴＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＣＣＧ−ＣＴＧ−ＧＣＣ（配列番号：７）であり、逆方向プライマーは、ＧＧＧ−ＴＣＣ−ＧＧＡ−ＧＣＣ−ＣＧＡ−ＧＣＣ−ＡＣＣ−ＧＣＣ−ＡＣＣ−ＡＧＡ−ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＡＣＧ−ＣＴＴ−ＣＴＣ−ＧＣＧ−ＣＴＧ−ＣＡＣ−ＣＡＣ−ＧＣＧ−ＧＣＧ−ＣＴＴ（配列番号：８）であった。ＣＤ４順方向プライマーは、ＧＧＧ−ＴＣＣ−ＧＧＡ−ＧＧＡ−ＧＧＴ−ＧＧＧ−ＴＣＧ−ＧＧＴ−ＧＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＧ−ＧＣＣ−ＧＣＴ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−ＧＴＧ−ＧＴＧ−ＣＴＧ−ＧＧＣ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＧＧＧ−ＧＡＴ（配列番号：９）であり、逆方向プライマーは、ＧＧＧ−ＧＴＴ−ＴＡＡ−ＡＣＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−ＡＧＡ−ＴＣＣ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−ＧＡＧ−ＡＴＧ−ＡＧＴ−ＴＴＴ−ＧＴＴ−ＣＡＧ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−ＣＧＡ−ＴＧＴ−ＣＴＡ−ＴＴＴ−ＴＧＡ−ＡＣＴ−Ｃ（配列番号：１０）であった。その結果得られるＰＣＲ生成物を、Ｋｐｎ１およびＰｍｅ１制限部位を用いてｐＥＦ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にサブクローン化した。

ｐＥＦ６−ＴｃＳＣプラスミドを構成するために、ｐＥＦ６−ＦＬＳＣにおける完全長ｇｐ１２０発現配列をｇｐ１２０配列の切断型の種類（ＤＣ１ＤＣ５ＤＶ１Ｖ２）に交換した。切断型ｇｐ１２０は、ＧＧＧ−ＧＧＴ−ＡＣＣ−ＡＴＧ−ＣＣＣ−ＡＴＧ−ＧＧＧ−ＴＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＣＣＧ−ＣＴＧ−ＧＣＣ−ＡＣＣ−ＴＴＧ−ＴＡＣ−ＣＴＧ−ＣＴＧ−ＧＧＧ−ＡＴＧ−ＣＴＧ−ＧＴＣ−ＧＣＴ−ＴＣＣ−ＴＧＣ−ＣＴＣ−ＧＧＡ−ＡＡＧ−ＡＡＣ−ＧＴＧ−ＡＣＣ−ＧＡＧ−ＡＡＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＴＧ−ＴＧＧ（配列番号：１５）を順方向プライマーとして、ＧＧＧ−ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＧＡＴ−ＣＴＴ−ＣＡＣ−ＣＡＣ−ＣＴＴ−ＧＡＴ−ＣＴＴ−ＧＴＡ−ＣＡＧ−ＣＴＣ（配列番号：１６）を逆方向プライマーとして用いて生成した。Ｖ１およびＶ２領域を、ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＴＧ−ＡＣＣ−ＣＴＧ−ＧＧＣ−ＧＣＧ−ＧＣＣ−ＧＡＧ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＡＡＣ−ＴＧＣ−ＡＧＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＴＣ−ＧＧＣ−ＧＣＧ−ＧＧＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＡＴＣ−ＡＧＣ−ＴＧＣ（配列番号：１７）を順方向プライマーとして、ＧＣＡ−ＧＣＴ−ＧＡＴ−ＣＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＣ−ＣＧＣ−ＧＣＣ−ＧＡＴ−ＧＴＴ−ＧＡＡ−ＧＣＴ−ＧＣＡ−ＧＴＴ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＣＴＣ−ＧＣＣ−ＣＧＣ−ＧＣＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＣＡＣ−ＧＣＡ−ＣＡＧ（配列番号：１８）を逆方向プライマーとして用いて除去した。

ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９にクローン化するために用いられるＣＤ４Ｍ９配列（配列番号：１９）は、５’〜３’プライマーＧＣＧ−ＧＣＣ−ＧＣＴ−ＴＧＣ−ＡＡＣ−ＣＴＧ−ＧＣＣ−ＣＧＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−ＣＴＧ−ＣＧＣ−ＴＧＣ−ＡＡＧ−ＡＧＣ−ＣＴＧ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＣＴＧ−ＧＧＣ−ＡＡＧ−ＴＧＣ−ＧＣＣ−ＧＧＣ−ＡＧＣ−ＴＴＣ−ＴＧＣ−ＧＣＣ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＣＣＣ−ＴＡＡ−ＧＡＡ−ＴＴＣ（配列番号：２１）を順方向プライマーとして、ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＧ−ＧＣＣ−ＧＣＡ−ＧＧＣ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＧＣＴ−ＧＣＣ−ＧＧＣ−ＧＣＡ−ＣＴＴ−ＧＣＣ−ＣＡＧ−ＣＡＧ−ＧＣＣ−ＣＡＧ−ＧＣＴ−ＣＴＴ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＣＡＧ−ＣＴＧ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−ＧＧＣ−ＣＡＧ−ＧＴＴ−ＧＣＡ−ＡＧＣ−ＧＧＣ−ＣＧＣ（配列番号：２２）を逆方向として用いて同時にアニーリングすることによって生成した。フラグメントをＮｏｔ１およびＢａｍＨ１で切断し、次いでＮｏｔ１およびＢａｍＨ１で切断することによって調製されていたｐＥＦ６−ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔにサブクローン化し、ゲルを精製し、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ配列からｈＤ１Ｄ２を軽減ｈＤ１Ｄ２を除去した。クローンは配列決定によって確認された。

組換え体構築物は、図１に示される。スペーサー領域（配列番号：１１）およびＣＤ４Ｄ１Ｄ２（配列番号：２６）を有するＢａＬｇｐ１２０（配列番号：２４）配列を含むキメラ組換え体を完全長一本鎖（ＦＬＳＣ）で表した。第２の構築物は、ｇｐ１２０結晶構造を溶解するために用いられる分子により近似した複合体を生成するように設計された。この構築物は、切断型一本鎖（ＴｃＳＣ）で表し、ΔＣ１ΔＣ５ΔＶ１Ｖ２ｇｐ１２０をコードする配列を完全長コード配列（配列番号：２８）の代わりに用いることを除き、ＦＬＳＣと同様に構成した。ＢａＬ ｇｐ１２０がアミノ酸５０６（配列番号：３０）で変異されているＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ、および配列配列番号：３０および２０を含有するＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９で表した構築物も示されている。本実施例に示されたスペーサーのアミノ酸配列は、ＧＳＳＧＧＧＧＳＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＡＡ（配列番号：１１）である。
実施例ＩＩ
本実施例ではｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによる細胞の形質変換、および発現された可溶性ポリペプチドのキャラクタライゼーションが記載される。組換え体ｐＥＦ６−ＦＬＳＣまたはｐＥＦ６−ＴｃＳＣを、メーカーのプロトコール（ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ））に従い、フューゲン（Ｆｕｇｅｎｅ）を用いて、２９３細胞にトランスフェクションした。５μｇ／ｍｌブラスチシジンによる選択によって安定したトランスフェクタントを得た。安定した細胞株（２９３−ＳＣ）を異なる条件下で培養し、抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体（Ｙ．Ｈ．アバチオグル（Ａｂａｃｉｏｇｌｕ）ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、１９９４年（１０）、ｐ．３７１〜８１）または抗ヒトＣＤ４ポリクローナル血清（Ｋ．Ｃ．ディーン（Ｄｅｅｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年（３３１）、ｐ．８２〜４、Ｒ．Ｌ．ウィリー（Ｗｉｌｌｅｙ）ら、Ｊ Ｖｉｒａｌ．、１９９２年（６６）、ｐ．２２６〜３４、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙの混合物を用いて免疫ブロット分析によってキメラポリペプチドの産生を評価した。

簡単に言えば、キメラポリペプチドを含有する細胞培養上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００１％ブロムフェノールブルー、ｐＨ８．３）中で沸騰させた。次に、試料を４〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲル中で電気泳動した。次いで、ゲル分画タンパク質をニトロセルロース膜に移した。次に、膜上の非特異的結合部位をｔｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ７中の２％脱脂粉乳で３０分間ブロックした。それから、抗−ＣＤ４ポリクローナルウサギ血清（Ｔ４−４、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（メリーランド州ベテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）））またはＨＩＶｇｐ１２０に対するマウスモノクローナル抗体の混合物のいずれかで膜を探索した。図２に示されているように、トランスフェクションされた細胞は、予想サイズ（１５０ｋＤ）の可溶性タンパク質を発現した。このポリペプチドは、抗−ｇｐ１２０抗体および抗−ＣＤ４抗体の両方と反応性であり、したがって、無傷キメラポリペプチドを示した。

他の試験では、抗−ｍｙｃ抗体との反応性は検出され、１５０ｋＤ種のキメラポリペプチドとして同一性がさらに確認された。このポリペプチドに加えて、ｇｐ１２０およびＣＤ４ Ｄ１Ｄ２／ｍｙｃ標識について予想サイズにマッチするバンドが確認され、キメラポリペプチドの一部がスペーサーで開裂していたことを示した。生物学的に適合性のプロテアーゼインヒビター（Ｐｅｆａｂｌｏｃ；メーリンガー−マンハイム）の添加により、実質的に開裂されていないキメラポリペプチド分子が得られた。これは、ｇｐ１２０−ＣＤ４の開裂がセリンプロテアーゼによって生じることを示す。２９３−ＳＣ細胞株によって生成されたｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドの量を、ヒツジ抗−ｇｐ１２０抗体Ｄ７３２４（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ｇｐ１２０Ｃ５領域における高保存エピトープに対するヒツジポリクローナルＩｇＧ（Ｊ．Ｐ．ムーア（Ｍｏｏｒｅ）、ＡＩＤＳ、１９９０年（４）、ｐ．２９７〜３０５、Ｊ．Ｐ．ムーアら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１９９２年（６７）、ｐ．８６３〜８７５、Ｊ．Ｐ．ムーアら、ＡＩＤＳ、１９９０年（４）、ｐ．３０７〜３１５）、およびｇｐ１２０標準曲線による抗−ｇｐ１２０捕捉ＥＬＩＳＡを用いて測定した。

簡単に言えば、リン酸緩衝食塩水中のＤ７３２４ ２μｇ／ｍｌをプラスチックプレートに吸収させた。非特異的結合部位を緩衝食塩水中２％脱脂粉乳でブロックした。次いで、２９３−ＳＣ株からの飽和濃度の細胞培養上清をプレートに添加した。ＨＩＶ感染患者からの不活化ヒト血清および西洋ワサビペルオキシダーゼに接合した抗ヒトＩｇＧを用いて捕捉キメラポリペプチドを検出した。２９３−ＳＣ細胞株は、推定約３μｇ／ｍｌのｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドを分泌する。２９３−ＳＣ細胞株は血清を含まない条件で増殖するように適合された。免疫ブロット法試験は、ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドの一部の開裂が存在することを示したため、精製一本鎖の試料を架橋し、架橋試料について、ｇｐ１２０およびＣＤ４分子が結合したままであるかどうかを判定した。簡単に言えば、２９３−ＳＣ細胞株によって生成された上清からの一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４を免疫親和性カラムを用いて精製した。抗−ｇｐ１２０ヒトモノクローナル抗体Ａ３２をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ）（ニュージャージー州ピスケイトウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）））に結合することによってカラムを構成した。Ａ３２は、ｇｐ１２０上の高不連続エピトープに対して特異的であり、ＣＤ４に結合したエンベロープを優先的に認識する。結合ｇｐ１２０−ＣＤ４を０．１Ｍ酢酸、ｐＨ２．５で溶離し、凍結乾燥し、ＰＢＳに対して透析した。メーカーのプロトコールを用いてＢＣＡアッセイ（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（カリフォルニア州ハーキュリューズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））によってタンパク質濃度を測定した。次いで、精製ｇｐ１２０−ＣＤ４の２０μｌアリコートをホモ二価性クロスリンカー、ＢＳ３の１ｍＭ溶液で架橋し、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルでの非架橋ｇｐ１２０−ＣＤ４とともに電気泳動した。分画タンパク質をニトロセルロースに移し、抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体の混合物の後、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧで免疫ブロッティングし、市販のＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ）の混合物で視覚化した。

図３は、これらの試験の結果を示し、非架橋ｇｐ１２０−ＣＤ４はレーン１にあり、架橋ｇｐ１２０−ＣＤ４はレーン２にある。レーン１は、免疫親和性カラムが開裂および非開裂一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４を精製することを示す。レーン２に示されているように、架橋により、１５０ｋＤａと３００ｋＤａでの２つの広いバンドが生成され、このパターンは、溶液中の一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４が関連１５０ｋＤａ分子として存在することを示している。ｇｐ１２０およびＣＤ４のサブユニットは、開裂イベント後でも結合したままである。３００ｋＤａバンドは、ｇｐ１２０−ＣＤ４の一部が溶液中で二量体であり、個別の分子上でエンベロープとＣＤ４ドメインとの分子間相互作用によって結合する一本鎖分子を表しうることを示している。一定の条件下での一本鎖分子のｇｐ１２０およびＣＤ４成分への明らかな開裂（図２）は、かかるプロセスが潜在的にｉｎ ｖｉｖｏで起こりうるため、ＤＮＡワクチンへの関心となりうる。しかし、これらの試験は、開裂にもかかわらず、一本鎖分子はｇｐ１２０−ＣＤ４複合体として結合したままであったことを示す（図３）。天然のＦＬＳＣの構造的特性をより詳細に検討するために、上記で検討した同じタンパク質の異なる濃度（１μＭ〜０．３μＭ）の調製物をＰＢＳ中で共有架橋し、溶液中に存在する多量体構造を固定した。次いで、架橋材料を抗−ＣＤ４抗体による免疫ブロット法によって分析した。図４に示されているように、１７２ｋＤの大タンパク質バンド（差し込み図；バンドＡ）が、高分子量の２つの小バンドとともに一貫して可視的であった。小バンド（差し込み図；バンドＢ）の一方は約３０２ｋＤの明らかなサイズを有したが、他方（差し込み図；バンドＣ）はゲルへ十分に移動せず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズの正確な評価はできなかった。異なるタンパク質バンドの外観および比率は、架橋前のＦＬＳＣ濃度に左右されなかった。したがって、濃度分析によって示されたように、バンドＡ、Ｂ、およびＣが一貫してそれぞれ、総タンパク質の約６５％、２５％、および１０％を示した。

ＦＬＳＣと比較すると、架橋ＴｃＳＣのクロマトグラフィーのプロフィールはより複雑であった。非変性条件下に、ＴｃＳＣは、１６６ｋＤ〜３５３ｋＤの範囲の広い一連のピークとして溶離した。かかるプロフィールは、短いＴｃＳＣポリペプチドが発現および／または精製時に複数の高順位の構造物を形成することを示した。この反応は、ＴｃＳＣが主に、個別の分子におけるｇｐ１２０配列とＣＤ４配列との相互作用によって結合された可変サイズの鎖のポリペプチドとして存在することを示す。ＴｃＳＣは、ｇｐ１２０から２０Ｃ−末端アミノ酸を除去することによって生成されたため、ｇｐ１２０のＣＤ４のコア構造とＣＤ４ｂｄとの距離は短縮したが、これがＴｃＳＣの分子間ｇｐ１２０−ＣＤ４相互作用を達成し、鎖間複合体の形成を有利にする能力を阻害しているとみられる。しかし、ＴｃＳＣは、ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体の抗原性および機能的特徴も示した。多数のＴｃＳＣ分子を含む分子間相互作用のため、より小さな比率の総タンパク質が、表面コレセプターと相互作用する能力のあるコレセプター結合部位を発現した。あるいは、ＴｃＳＣにおけるＶ１／Ｖ２領域の除去は、ＣＣＲ５に対するＢａＬエンベロープの相対親和性を低下させうる。さらに、ｇｐ１２０とＣＤ４成分とのリンカーを伸長するＴｃＳＣの改変により、高い比率の鎖間複合体の形成が可能となりうる。ＴｃＳＣの多量体の性質がこの分子をＦＬＳＣに対して不利な立場にするかどうかは不明のままであるが、それは他の多量体の試験により、それらが単量体の対応物よりも強力なイムノゲンであることを示しているためである（Ａ．Ｌ．デビコ（ＤｅＶｉｃｏ）ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．、１９９９年（Ｉ）、ｐ．４〜１４、Ｓ．Ａ．ジェフス（Ｊｅｆｆｓ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、１９９６年（７７）、ｐ．１４０３〜１４１０、Ｒ．Ａ．ラ・カッセ（ＬａＣａｓｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年（２８３）、ｐ．３５７〜３６２）。
実施例ＩＩＩ
本実施例では、ｇｐ１２０およびＣＤ４と反応性の数種類の抗体へのｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドの結合を示すデータが記載される。ｇｐ１２０のＣＤ４への結合は、分子における構造変化をもたらし、コレセプター結合ドメインの曝露につながった。したがって、このドメインにおけるエピトープに対して向けられた抗体は、適切に畳み込まれた一本鎖分子と強く反応するはずである。キメラ分子における曝露エピトープを測定するために、ＦＬＳＣ分子とＴｃＳＣ分子の抗原性を比較した。精製ＦＬＳＣおよびＴｃＳＣを抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって免疫化学分析にかけた。簡単に言えば、ＢａＬｇｐ１２０、ｇｐ１２０−ｒｓＣＤ４複合体または一本鎖キメラ分子を、ｇｐ１２０のＣ−末端１５アミノ酸、Ｄ７３２４（Ｊ．Ｐ．モーアら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、１９８Ｘ年（４）、ｐ.３６９〜３７９）由来のペプチドに対して生じた精製ポリクローナルヒツジ抗体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ（カリフォルニア州ファルブルック（Ｆａｌｌｂｒｏｏｋ，ＣＡ））を用いて捕捉し、基質に吸収させた。Ｄ７３２４をＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌに希釈し、室温下に一夜インキュベートすることによって、９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート、ＶＷＲサイエンティフィック（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）））に吸着させた。プレートをＢＬＯＴＴＯ（トリス緩衝食塩水中の５％脱脂粉乳）処理し、ウェルへの非特異的結合を予防した。ＴＢＳでプレートを洗浄した後、試料をＢＬＯＴＴＯ中に希釈し、２００μｌのアリコートを正副二通のＤ７３２４−コートウェル中に室温で１時間インキュベートした。ＢＬＯＴＴＯ中で１０００倍に希釈した不活化ＨＩＶ−Ｉ＋血清のプールを用いた後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＫＰＬ（メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）））を用いて結合抗原を検出した。

ＣＤ４の関与後のｇｐ１２０を優先的に結合することが以前に示されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ Ａ３２、１７ｂ、および４８ｄ）を用いた後（Ｍ．サリ（Ｔｈａｌｉ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３年（６７）、ｐ．３９７８〜３９８６）、適切に標識された二次抗体を用いることによって検出も行われた。抗体のうちの２つ、１７ｂおよび４８ｄは、ＣＤ４結合によって誘導されるコレセプター付着部位内で結合する（Ｎ．スリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９８年（７２）、ｐ．４６９４〜４７０３、Ａ．トルコラ（Ｔｒｋｏｌａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年（３８４）、ｐ．１８４〜１８６、Ｌ．ウー（Ｗｕ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年（３８４）、ｐ．１７９〜１８３）。フリーｇｐ１２０のＣ１〜Ｃ５領域における保存エピトープを認識する抗体Ｃ１１も試験した。抗体をＢＬＯＴＴＯ中に希釈し、室温で１時間インキュベートした。各インキュベーション工程間にＴＢＳで３回プレートを洗浄した。試料中に存在するｇｐ１２０配列の量を市販の組換えＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０（バートルズ（Ｂａｒｔｌｅｓ）（ワシントン州イサクアー）（Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ））で生成された標準曲線に基づき測定した。ＢａＬｇｐ１２０−ｒｓＣＤ４複合体を含む比較試験において、Ｄ７３２４コートプレートをｇｐ１２０の飽和濃度で試験した。ウェルの洗浄後、過剰濃度のｒｓＣＤ４（１μｇ／ｍｌ）をウェルに添加し、１時間インキュベートして複合体を形成した。Ｄ７３２４エピトープを欠くＴｃＳＣ抗原を評価するために、捕捉のために抗−ＣＤ４ ＭＡｂ４５（バートルズ（ワシントン州イサクアー）（Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ））を用いて代わりのＥＬＩＳＡフォーマットを作った。１μｇ／ｍｌで抗体をプラスチックに吸着させ、ウェルをＢＬＯＴＴＯでブロックした。次いで、上述したように、指定のヒト血清またはヒトモノクローナル抗体を用いてアッセイを行った。

図５Ａに示されているように、抗体のすべては、ＦＬＳＣと強く反応した。しかし、抗体１７ｂ、４８ｄ、およびＡ３２の半最大結合濃度は、ＦＬＳＣ対ｇｐ１２０のみで一貫して高く、可溶性、非共有ＢａＬｇｐ１２０−ｒｓＣＤ４複合体で確認されたものと同等であった。ＦＬＳＣの高い免疫活性は、ＣＤ４誘導エピトープに対して向けられた抗体に対して特異的であったが、ＦＬＳＣ対フリーｇｐ１２０での抗体Ｃ１１の半最大結合濃度における有意差は確認されなかった。

図５Ｂに示されているように、１７ｂおよび４８ｄのＴｃＳＣとの反応性レベルは、平行して分析されたＦＬＳＣで確認されたものと同等であった。予想されたように、抗体Ｃ１１およびＡ３２は、それらのぞれぞれのエピトープの大部分がＴｃＳＣ構造物から除去されたため、ＴｃＳＣと反応することはなかった。

一本鎖分子におけるｇｐ１２０とＣＤ４の結合も、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位におけるエピトープの曝露をブロックするはずである。かかる結合が起こったこと、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位がもはや結合のために利用できなかったことを確認するために、Ｍａｂ４５捕捉フォーマット、およびｇｐ１２０上のＣＤ４結合ドメイン（ＣＤ４ｂｄ）に対して向けられた一連のモノクローナル抗体（ＩｇＧｌｂ１２、Ｆ９１、および２０５〜４６９）を用いてＦＬＳＣおよびＴｃＳＣを評価した。

図５Ｃに示されているように、これらの抗体のうちＦＬＳＣまたはＴｃＳＣと反応したものはなかったが、平行して試験したプールＨＩＶ＋血清では陽性反応が確認された。このデータは、ＦＬＳＣおよびＴｃＳＣ分子内に存在するＣＤ４配列とｇｐ１２０ ＣＤ４結合ドメインとの相互作用を示す。

要約して言えば、これらの結果は、ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドの反応性が、可溶性のｇｐ１２０とＣＤ４を組合せる（非架橋）ことによって製造された複合体で確認されたものと同等であり、ｇｐ１２０のみでのものより高いことを示している。これらのデータは、一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４分子が、遷移状態のＨＩＶエンベロープ−ＣＤ４複合体と同様の相互作用複合体を形成したことを示す。捕捉ｇｐ１２０−ＣＤ４も、ウエスタンブロット分析と一致したように、他のＥＬＩＳＡ試験における抗−ＣＤ４抗血清および抗−ｍｙｃ抗体と反応した。総合すれば、これらのデータは、一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４分子の大多数が、適切に畳み込まれたｇｐ１２０−ＣＤ４複合体を表すことを示している。
実施例ＩＶ
本実施例では、ＣＣＲ５−特異的ＨＩＶエンベロープ配列を含有するｇｐ１２０−ＣＤ４キメラ分子のＣＣＲ５発現細胞への結合を示すデータが記載される。

ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体の形成は通常、適切なコレセプターと相互作用するエンベロープドメインを曝露する（Ｍ．サリら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３年（６７）、ｐ．３９７８〜３９８６）、Ｍ．Ａ．ボディカ（Ｖｏｄｉｃｋａ）ら、Ｖｉｒｏｌ．、１９９７年（２３３）、ｐ．１９３〜１９８）。したがって、適切に畳み込まれたｇｐ１２０−ＣＤ４複合体および細胞のウイルス感染を抑制するその能力の別の尺度は、ＣＣＲ５コレセプターに結合する能力である。

コレセプターに結合する一本鎖複合体の能力を評価するために、精製一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４分子を、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のいずれかを発現する細胞と相互作用させた。簡単に言えば、ｇｐ１２０−ＣＤ４一本鎖を含有する上清を、ｐＥＦ６−ＳＣで２９３細胞を一時的にトランスフェクションすることによって生成した。次いで、上清をＡ３２の免疫親和性カラムに添加し、精製された一本鎖を０．２Ｍ酢酸、ｐＨ２．５で溶離し、Ｄ７３２４−捕捉ＥＬＩＳＡ、および、記載されているように、免疫ブロットによって分析した。一本鎖を含有する画分を収集し、ｐＨ７に平衡させ、濃縮した。

結合のために、精製一本鎖調製物を、ＣＣＲ５を発現するＬ１．２細胞と反応させた（Ｌ．ウーら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年（３８４）、ｐ．１７９〜１８３、Ｌ．ウーら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７年（１８６）、ｐ．１３７３〜１３８１）。Ｌ１．２、Ｌ１．２／Ｘ４、およびＬ１．２／Ｒ５細胞、コレセプターを発現しないマウスＢ細胞株、ＣＸＣＲ４、またはＣＣＲ５を濃度を低下させた精製一本鎖タンパク質と混合した。３７℃下、１時間のインキュベーション後、細胞を洗浄した。結合一本鎖分子が、１μｇ／ｍｌのＭＡｂ Ｃ１１（Ｊ．Ｅ．ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９２年（１６Ｅ）、ｐ．７１、Ｍ．サリら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３年（６７）、ｐ．３９７８〜３９８６）、抗−ｇｐ１２０ＭＡｂの後、蛍光分子、フィコエリトリンで標識された抗−ヒトＩｇＧによって検出された。Ｃ１１は、Ｃ１−Ｃ４領域によって形成される構造決定因子を認識する。結合蛍光のレベルは、ＦＡＣＳキャリバー計器（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を備えた蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析によって測定した。各試料の平均蛍光強度をセルクエスト３．１．３プログラム（ベクトン・ディッキンソン）を用いて計算した。

図６に示されているように、両方の一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体（ＦＬＳＣおよびＴｃＳＣ）は、ＣＣＲ５発現には結合したが、ＣＸＣＲ４発現、Ｌ１．２細胞には結合しなかった。最大結合は、対照として試験された可溶性ＢａＬ ｇｐ１２０−ｒｓＣＤ４複合体で確認されたものと同等の濃度（１０μｇ／ｍｌ）でのＦＬＳＣで確認された。比較では、飽和結合に接近するには約１０倍高い濃度のＴｃＳＣが必要であった。したがって、ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドは、マクロファージ刺激ｇｐ１２０を含有する分子に対して予想されたように、ＣＣＲ５に対する機能的コレセプター結合部位を示す。

これらの試験においてＣＸＣＲ４への結合が認められないことは、ＣＤ４に対するｇｐ１２０−ＣＤ４キメラにおけるＨＩＶエンベロープポリペプチドの明らかな特異性に照らしてまったく予想外であったわけではない。したがって、ＣＸＣＲ４または他のコレセプターに結合するポリペプチドキメラを構成することによって、または、本明細書に記載されているように、別のコレセプターに結合するキメラポリペプチドを得るために、ウイルスコートポリペプチドを改変することによって、他のコレセプターに結合する他のウイルスコートポリペプチド受容体ポリペプチドキメラを得ることができる。

一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４がその受容体結合部位を通じてＣＣＲ５に結合していることを明らかにするために、ｇｐ１２０のコレセプター結合部位と相互作用することが示されており、コレセプター発現細胞との相互作用からｇｐ１２０／ｓＣＤ４を防ぐ、１７ｂ抗体と４８ｄ抗体の競合結合試験を行った。対照のために、別のｇｐ１２０抗体、Ｃ１１、およびｇｐ４１抗体Ｆ２４０を用いた。これらの抗体のすべては、ＨＩＶ−１感染患者由来である。各抗体を１０μｇ／ｍｌで使用し、３μｇ／ｍｌの精製一本鎖分子とともに、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のいずれかを発現するＬ１．２細胞に添加した。結合ｇｐ１２０−ＣＤ４は、Ｃ１１の後、ＰＥで標識された抗−ヒトＩｇＧによって検出された。ｇｐ１２０−ＣＤ４の量は、ＦＡＣＳによって測定し、競合抗体を含まない対照ウェルにおける総結合の百分率で表した。

図７に示されているように、１７ｂおよび４８ｄは、両方の一本鎖複合体の細胞への結合を強く抑制した。これらの抗体の存在下に、ＣＣＲ５発現細胞上の結合シグナルは、Ｌ１．２／ＣＸＣＲ４およびＬ１．２親細胞で確認されたバックグラウンド結合と同じであった。興味深いことに、強力な中和抗体である、２Ｇ１２も、ＣＣＲ５とのすべての複合体形態の相互作用を減少させた。比較では、コレセプター結合ドメインの外側でエピトープを認識する抗−ｇｐ１２０抗体、Ｃ１１、Ａ３２、および抗−ｇｐ４１抗体、Ｆ２４０はすべて、ＦＬＳＣまたはＴｃＳＣのＣＣＲＳ発現Ｌ１．２細胞への結合を減少させなかった。

これらの結果は、ｇｐ１２０コレセプター結合部位が、コレセプターへの結合に重要であることを示す。これらの結果は、ｇｐ１２０−ＣＤ４とコレセプターとの結合／相互作用を抑制する物質が、かかるアッセイを用いて同定しうることも示す。かかる物質は、治療薬として潜在的な価値を有しうる。

要約して言えば、データは、ウイルスコート受容体複合体の遷移状態構造を再現する可溶性、キメラポリペプチドの有効な発現を示している。この成果を考えると、ウイルスまたは同様のコートポリペプチドエピトープを有するウイルスに対する免疫反応を生成するように対象の免疫化のためにポリペプチドをコードするキメラポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用することが可能となる。生成される免疫反応は、抗体（液性）またはＣＴＬ反応でありうる。さらに、キメラポリペプチドが生細胞の表面上の適切なコレセプターに結合するという事実を考えると、ウイルス感染からコレセプターを発現する細胞を受動的に保護するために、免疫不全ウイルスに激しく曝露された対象にポリペプチドを投与することができる。
実施例Ｖ
本実施例では、ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラ分子が、同じコレセプターを用いてＨＩＶ株による感染を中和しうることを示すデータが記載される。一本鎖分子をさらに、Ｒ５およびＸ４ウイルスを中和するそれらの能力について検査した。ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のいずれかを発現する合計１０^４Ｕ３７３／ＣＤ４／ＭＡＧＵＩ細胞（Ｍ．Ａ．ボディカ（Ｖｏｄｉｃｋａ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９７年（２３３）、ｐ．１９３〜１９８）を一夜、平底組織培養ウェルに付着させた。次いで、培養基を除去し、種々の濃度のキメラタンパク質を含有する新鮮培地１００μｌで置換した。次いで、５０ＴＣＩＤ_５０のウィルスを含有する追加の培地１００μｌを培養に添加した。次いで、混合物全体を、合胞体が可視的になるまで、通常、３〜５日以内、３７℃でインキュベートした。次いで、培養ウェルを、メーカーのプロトコール従って、Ｐ−ガラクトシダーゼ化学ルミネセンス試薬、ガラトスター（Ｇａｌａｔｏｓｔａｒ）（トロピックス（Ｔｒｏｐｉｘ）（マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））で処理した。ウイルス感染を化学ルミネセンスの関数として測定し、Ｖｉｃｔｏｒ^２蛍光プレートリーダー（ＥＧ＆Ｇワラック（Ｗａｌｌａｃ）（メリーランド州ゲイサーズバーク（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を用いて定量化した。バックグラウンドシグナルをウイルスの非存在下に行ったアッセイにおいて測定した。次いで、試験アッセイで得られたシグナルを、バックグラウンド値を引くことによって補正した。細胞とウイルスのみを含有する対照ウェルの補正された光単位によって各実験ウェルの補正された相対光単位を割ることによって感染率を計算した。９０％抑制量（ＩＤ_９０）値を試験タンパク質濃度対感染抑制率のプロットから測定した。全試験条件を３とおり行った。

図８に示されているように、ＦＬＳＣとＴｃＳＣは両方ともＲ５ＨＩＶ−１ＢａＬ分離株を強く、かつ選択的に中和したが、２０４４分離株の抑制はわずか（ＩＤ_９０＞１０μｇ／ｍｌ）しか認められなかった。比較では、非複合体ＢａＬｇｐ１２０が、予想したように、そのＣＤ４との直接的な相互作用により、ＨＩＶ−１ＢａＬおよびＸ４（ＨＩＶ−１２０４４）の侵入を抑制した。したがって、データは、ウイルスコートポリペプチド受容体キメラ分子が細胞コレセプターに結合し、それによって結合または感染のためにコレセプターを利用するウィルスによる細胞の結合または感染をブロックすることができる。
実施例ＶＩ
本実施例では、免疫グロブリンポリペプチド配列、ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１を有する改変ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドの構造および発現が記載される。この典型的な異種ドメインは、接着および免疫増強機能を含む、機能性をｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドに付加し、安定性を延長し、循環半減期および胎盤関門を交差させる能力を増大させる。本実施例は、ｇｐ１２０−ＣＤ４ーＩｇＧ１キメラが無傷細胞の表面上に発現したコレセプターに結合そ、ＨＩＶウイルスを中和することを示す。ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質のサブユニットであるＧｐ１２０は、ＣＤ４に結合し、複合体がＣＣＲ５などのコレセプターと相互作用することを可能にする構造変化を受ける。この相互作用は、ＨＩＶ−１のターゲットＣＤ４＋細胞への感染を可能にする。ＨＩＶ−１のコレセプターとの相互作用を干渉する抗体または他の物質は、感染を予防することができる。

かかる物質を同定するために、ＩｇＧ１重鎖、ヒンジＣＨ２、およびＣＨ３を形成する一定の領域に融合することによって、一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４を改変した（図９）。ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１を用いて、ＨＩＶ−１のコレセプターとの相互作用をブロックし、抑制し、または崩壊させる物質を同定することができる。配列番号：２４、１１、２６、および３２を含有するｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１ポリペプチドも針刺し創傷などの急性曝露後のＨＩＶ感染を予防する受動免疫治療薬として用いることができよう。

少なくとも配列番号：２３、２５および３１をからなるｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１含有プラスミド２９３個の細胞を一時的にトランスフェクションし、発現タンパク質を培養上清の免疫ブロッティングによって特徴づけた。簡単に言えば、収集した上清試料を４〜２０％勾配ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。分画タンパク質をニトロセルロースに移し、抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体の混合物で検出した。図１０に示されているように、一時的にトランスフェクションされた細胞は、ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１を発現した（レーン１）。ＨＩＶ−１ＢａＬ由来の精製ｇｐ１２０を発現する細胞からの上清（レーン２）を相対サイズの比較のために電気泳動した。ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１ポリヌクレオチドは、ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１重鎖キメラの予測サイズを有するタンパク質をコードする。最初のｇｐ１２０−ＣＤ４と同様、ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１の一部分は開裂され、ｇｐ１２０（「開裂ｇｐ１２０」）である可能性が最も高い１２０ｋＤａのタンパク質フラグメントを生成する。このフラグメントのサイズは、ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１がスペーサー内で開裂していることを示す。ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１が結合コレセプターに対して許容状態の構造に折り畳まれることを確実にするために、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４コレセプターのずれかを発現するＬ１．２細胞に上清の希釈液を添加した。蛍光試薬であるユーロピウムで標識された抗−ヒトＩｇＧで結合ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１が検出された。蛍光の量は、結合材料の量に直接関連している。

図１１に示されているように、ｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１は、ＣＣＲ５を発現するＬ１．２細胞に特異的に結合する。また、このアッセイを用いて、ＣＸＣＲ４への結合はほとんど検出されなかったが、これはｇｐ１２０−ＣＤ４での結果と一致している。これらの試験は、追加の、または増強された機能性を与える異種ドメインが、細胞コレセプターに結合する複合体を形成するそれらの能力に影響を及ぼすことなく、キメラ分子に添加しうることを示している。ＣＣＲ５発現細胞へのキメラｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１重鎖の結合が、ｇｐ１２０のコレセプター結合部位によって仲介されたことを確認するために、ブロッキング抗体１７ｂの存在下に結合を試験した。簡単に言えば、ＭＡｂ／ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１競合試験のために、酪酸ナトリウム活性化Ｌ１．２細胞発現コレセプターを、Ｖ底プレートに１０^５／ウェルで添加した。１０μｇ／ｍｌ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１および１μｇ／ｍｌ ＭＡｂを細胞に添加した。細胞およびタンパク質をいっしょに３７℃で１時間インキュベートした。細胞をペレットにし、ＴＢＳで３回洗浄した。５μｇ／ｍｌのフェトエリセリン標識抗−ヒトＩｇＧで４℃下に１時間、結合物質を検出した。次いで、細胞を３回、ＴＢＳで洗浄し、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）で分析した。

図１２に示されているように、ｇｐ１２０上のＣＣＲ５結合ドメインを認識する抗体である１７ｂは、ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１のＬ１．２Ｒ．５との相互作用をブロックするが、対照抗体のＦ２４０はブロックしない。これらのデータは、ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１がご１２０上のＲ５結合ドメインによってＲ５コレセプターと相互作用することを示している。次いで、キメラｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１重鎖が細胞へのウイルス侵入をブロックしうるかを確認するために、中和アッセイを行った。簡単に言えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のいずれかを発現するＵ３７３／ＣＤ４／ＭＡＧＩ細胞を、１０^４細胞／ウェルで一夜、平底組織培養トレイに付着させた。培地を除去し、次いで異なる濃度のＭＡｂおよび免疫付着因子を培地１００μｌ中の細胞に添加した。次いで、ウイルス（培地１００μｌ中の５０ＴＣＩＤ_５０／ウェル）を添加し、合胞体が可視的になるまで、通常、３〜５日以内、３７℃でインキュベートした。メーカーのプロトコール従って、Ｐ−ガラクトシダーゼ化学ルミネセンス試薬、ガラトスターを用いてプレートを読み、生成された化学ルミネセンスを既述の通りＶｉｃｔｏｒ^２を用いて定量化した。ウイルス増殖率を相対光単位を用いることによって計算した（実験ウェル）−−ウイルスを含まないバックグラウンドウェル）／（ウイルスを含むがタンパク質を含まないウェル）−−（バックグラウンドウェル）（表２）。ＩＤ_５０とＩＤ_９０を図で測定した。

ＦＬＳＣ−ＩｇＧは、現在、受動免疫療法における治験で評価されている抗体、２Ｇ１２、２Ｆ５、およびＩｇＧｌｂ１２と同じく有効にウイルスを中和する。したがって、これらのデータは、特にＨＩＶ感染を抑制するｇｐ１２０−ＣＤ４キメラの有用性、および一般に結合または細胞侵入のためにコレセプターを利用する他のウイルスのインヒビターとしてのウイルスコートタンパク質−受容体の適用をさらに確約するものである。
実施例ＶＩＩ
本実施例では、フューリン開裂部位の変異がＦＬＳＣ複合体の安定性を改善することを示すデータが記載される。ＦＬＳＣフラグメントを分離する開裂部位の位置は、みじかいＴｃＳＣは変性を示さなかったため、おそらくＦＬＳＣにおいてのみ存在するＣ末端ｇｐ１２０配列内に位置している。特に、これらの配列は、フューリンプロテアーゼによって通常開裂されるｇｐ１２０ ｇｐ４１接合を包含する（Ｍ．ジラード（Ｇｉｒａｒｄ）ら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＩＩＩ、１９９９年（３２２）、ｐ．９５９〜９６６）。自然のフューリン部位でのＦＬＳＣの開裂は、ｇｐ１２０およびＣＤ４成分の構造、およびそれらの相互作用能力に対する最小の影響を有するＦＬＳＣフラグメントの反応と一致するであろう。

この推定上のフューリン部位が開裂、ＢａＬｇｐ１２０の原因であるかどうを判定するために、ＣＤ４、ＦＬＳＣ、およびＦＬＳＣ Ｒ／Ｔの最初の２つのドメイン（Ｖ１Ｖ２）からなるｓＣＤ４分子で複合体形成されたＢａＬｇｐ１２０を、ｇｐ１２０のＣ末端に対して特異的な抗体によってプラスチック上に捕捉した（抗体結合はＲ／Ｔ変異によって影響されなかった）。４つのドメインＶ１〜Ｖ４ｓＣＤ４を捕捉複合体上に３０μｇ／ｍｌで開始することで滴定した。４つのドメインｓＣＤ４は、２つのドメインＶ１Ｖ２よりもｇｐ１２０に対する高い親和性を有し、したがって、複合体からの小さい単位とは競合しないであろう。結合された４つのドメインＣＤ４は、抗体ＯＫＴ４で検出されたが、これは４つのドメインＣＤ４を結合するだけである。図１３の結果は、フューリン開裂部位の変異が、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔで見られるＶ１ Ｖ２が開裂ＦＬＳＣと同じく容易に分離することを防ぎ、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ複合体の安定性を改善する。ＲＴのＢａＬｇｐ１２０ｃ末端への変異の導入は、ＦＬＳＣで確認されるフューリン介在開裂を排除する。この開裂の削減により、リンカー配列の連続性が改善し、ｇｐ１２０およびＣＤ４成分の局所濃度を増大させることによってＦＬＳＣ構造の安定性が改善する（図１３を参照）。この増大の実験結果は、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔで見られる２つのドメインＣＤ４と競合する可溶性の４つのドメインＣＤ４の能力の削減である。
実施例ＶＩＩＩ
本実施例では、ｇｐ１２０−ＣＤ４改変キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクション、および発現された可溶性ポリペプチドの特徴づけが記載される。組換え体ｐＥＦ６−ＦＬＳＣ、ｐＥＦ６−ＲＬＳＣ−Ｒ／Ｔ、ｐＥＦ６−ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９、およびｐＥＦ６−ＢａＬｇｐ１２０を、メーカーのプロトコール（ベーリンガー−マンハイム）に従い、Ｆｕｇｅｎｅを用いて２９３個の細胞にトランスフェクションした。５μｇ／ｍｌブラスチシジンによる選択によって安定したトランスフェクタントを得た。簡単に言えば、キメラポリペプチドを含有する細胞培養上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００１％ブロムフェノールブルー、ｐＨ８．３）中で沸騰させた。次いで、試料を４〜２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配ゲル中で電気泳動した。次いで、ゲル分画タンパク質をニトロセルロース膜に移した。次いで、膜上の非特異的結合部位をｔｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ７中の２％脱脂粉乳で３０分間ブロックした。次いで、ＨＩＶ ｇｐ１２０に対するマウスモノクローナル抗体の混合物でプローブし、結合抗体をアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧで検出した。

図１４に示されているように、ＢａＬｇｐ１２０（レーン１）およびＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９（レーン４）は、約１２０ｋＤａの分子量で移動した。ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９は約１３０ｋＤａであることが予測されるが、１０ｋＤａの差はこのブロットで確認するのは困難である。ＦＬＳＣ（レーン２）は、タンパク質のｃ−末端のフューリン部位で開裂している１５０ｋＤａのタンパク質である。この開裂により、ＦＬＳＣのｇｐ１２０およびＣＤ４の成分は分離される。低い１２０ｋＤａバンドはこの開裂の結果である。放出されたＣＤ４成分は、タンパク質を検出するために使用された抗体がｇｐ１２０に対して特異的であったため、このブロットでは可視的ではない。一定の条件でのｇｐ１２０およびＣＤ４成分への一本鎖分子の明らかな開裂は、かかるプロセスが潜在的にｉｎ ｖｉｖｏで起こりうるため、ＤＮＡワクチンへの関心となりうる。

本実施例では、フューリン開裂部位がＦＬＳＣ複合体の安定性を改善することを示すデータが記載されている。開裂部位の位置は、ＦＬＳＣフラグメントを分離する開裂部位の位置は、おそらくＦＬＳＣにおいてのみ存在するＣ末端ｇｐ１２０配列内に位置している。特に、これらの配列は、フューリンプロテアーゼによって通常開裂されるｇｐ１２０ ｇｐ４１接合を包含する（Ｍ．ジラード（Ｇｉｒａｒｄ）ら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＩＩＩ、１９９９年（３２２）、ｐ．９５９〜９６６）。自然のフューリン部位でのＦＬＳＣの開裂は、ｇｐ１２０およびＣＤ４成分の構造、およびそれらの相互作用能力に対する最小の影響を有するＦＬＳＣフラグメントの反応と一致するであろう。結果は、フューリン開裂部位の変異が、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔで見られるＶ１ Ｖ２が開裂ＦＬＳＣと同じく容易に分離することを防ぎ、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ複合体の安定性を改善することを示す。結果として、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔを作成するために用いられるＲ／Ｔ変異は、この開裂を最小限に抑え、タンパク質を安定させる。
実施例ＩＸ
本実施例では、ｇｐ１２０およびＣＤ４０と反応性の抗体へのｇｐ１２０−ＣＤ４キメラポリペプチドの結合を示すデータが記載されている。ｇｐ１２０のＣＤ４０への結合は、分子における構造変化をもたらし、コレセプター結合ドメインの曝露につながる。したがって、このドメインにおけるエピトープに対して向けられた抗体は、適切に畳み込まれた一本鎖分子と強く反応するはずである。キメラ分子における曝露エピトープを測定するために、ＢａＬｇｐ１２０、ＦＬＳＣ、ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ、およびＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤＭ９分子の抗原性を比較した。検出は、ＣＤ４の関与後のｇｐ１２０を優先的に結合することが以前に示されたモノクローナル抗体１７ｂを用いた後（Ｍ．サリ（Ｔｈａｌｉ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３年（６７）、ｐ．３９７８〜３９８６）、適切に標識された二次抗体を用いることによって行われた。抗体１７ｂは、ｇｐ１２０がＣＤ４と相互作用するとますます曝露されることになるエピトープを認識し、コレセプター付着部位（ＣＣＲ５）内で結合するヒトモノクローナル抗体である。（Ｎ．スリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９８年（７２）、ｐ．４６９４〜４７０３、Ａ．トルコラ（Ｔｒｋｏｌａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年（３８４）、ｐ．１８４〜１８６、Ｌ．ウー（Ｗｕ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年（３８４）、ｐ．１７９〜１８３）。抗体をＢＬＯＴＴＯ中に希釈し、室温で１時間インキュベートした。各インキュベーション工程間にＴＢＳで３回プレートを洗浄した。試料中に存在するｇｐ１２０配列の量を市販の組換えＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０（バートルズ（Ｂａｒｔｌｅｓ）（ワシントン州イサクアー（Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）））で生成された標準曲線に基づき測定した。１μｇ／ｍｌで抗体をプラスチックに吸着させ、ウェルをＢＬＯＴＴＯでブロックした。次いで、上述したように、指定のヒト血清またはヒトモノクローナル抗体を用いてアッセイを行った。

図１６に示されているように、ＢａＬｇｐ１２０、ＦＬＳＣ、ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ、およびＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤＭ９分子による１７ｂの結合曲線は、その両方がいずれもｇｐ１２０とＣＤ４を含有するＦＬＳＣ−Ｒ／ＴまたはＦＬＳＣキメラタンパク質への１７ｂの結合によって増強された。１７ｂもＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９に結合し、効率はＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔのものと同等であり、１７ｂエピトープがＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９タンパク質中に曝露されることを示している。総合すれば、これらのデータは、一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４分子であるＦＬＳＣ、ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ、およびＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤＭ９が、適切に畳み込まれたｇｐ１２０−ＣＤ４複合体を表すことを示している。
実施例Ｘ
本実施例では、ＣＣＲ５−特異的ＨＩＶエンベロープ配列を含有するｇｐ１２０−ＣＤ４キメラ分子のＣＣＲ５発現細胞への結合を示すデータが記載される。ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体の形成は通常、適切なコレセプターと相互作用するエンベロープドメインを曝露する（Ｍ．サリら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９３年（６７）、ｐ．３９７８〜３９８６）、Ｍ．Ａ．ボディカ（Ｖｏｄｉｃｋａ）ら、Ｖｉｒｏｌ．、１９７７年（２３３）、ｐ．１９３〜１９８）。したがって、適切に畳み込まれたｇｐ１２０−ＣＤ４複合体および細胞のウイルス感染を抑制するその能力の別の尺度は、ＣＣＲ５コレセプターに結合する能力である。

コレセプターに結合する一本鎖複合体の能力を評価するために、精製一本鎖ｇｐ１２０−ＣＤ４分子を、ＣＣＲ５を発現するか、またはコレセプターを有さないずれかのイヌ胸腺細胞、Ｃｆ２Ｔｈと相互作用させた。簡単に言えば、ｇｐ１２０−ＣＤ４一本鎖キメラポリペプチドＦＬＳＣ−Ｒ／ＴおよびＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤＭ９分子を含有する上清を、ｐＥＦ６で２９３個の細胞の一時的なトランスフェクションによって生成した。

結合のために、精製一本鎖調製物を、ＣＣＲ５を発現するか、またはコレセプターを有さないイヌ胸腺細胞と相互作用させた。結合一本鎖分子を、抗−ｇｐ１２０ＭＡｂ、Ａ３２で検出した後、蛍光分子、フィコエリトリンで標識されたＰＥ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧによって検出した。結合蛍光のレベルは、ＦＡＣＳキャリバー計器（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を備えた蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析によって測定した。蛍光の量は結合物質の量と直接関連している。各試料の平均蛍光強度をセルクエスト３．１．３プログラム（ベクトン・ディッキンソン）を用いて計算した。図１５に示されている結果は、ＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９が、ＣＣＲ５発現細胞には結合するが、コレセプターを含まない細胞には結合せず、効率はＦＬＳＣ−Ｒ／Ｔのものと同等であることを示す。
実施例ＸＩ
本実施例では、ＦＬＳＣ接種マウスからの血清による一次Ｒ５ＨＩＶ−１（９２ＢＲ０２０）の中和が記載される。Ｃ５８７Ｂ１／６マウスに対し、コレラ毒素（ＣＴ）１０μｇと混合したマウス１匹当り２５μｇのＦＬＳＣを４回接種した。接種は２週間の間隔をおいて行った。最終接種の１４日後、個々のマウスから血清を採集し、一次Ｒ５ＨＩＶ−１分離株９２ＢＲ０２０に対する中和活性について分析した、開始時１：２の血清の連続希釈液を、５０ＴＣＩＤ_５０感染用量のウイルス／ウェルおよび１０^４Ｕ３７３／ＣＤ４／Ｒ５／ＭａＧＩ細胞／ウェルと混合した。２４時間後、血清、ウィルス、および培地を新鮮培地２００μｌと交換した。アッセイは、合胞体が可視的になるまでの５日間インキュベートした。ＨＩＶ−１の増殖は、メーカーのプロトコール従って、化学ルミネセンス試薬、ガラトスター（トロピックス（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて測定された細胞ライセート中のｂ−ガラクトシダーゼの産生によって示された。ウイルス感染を化学ルミネセンスの関数として測定し、Ｖｉｃｔｏｒ^２（ＥＧ＆Ｇワラック（Ｗａｌｌａｃ）（メリーランド州ゲイサーズバーク（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））蛍光プレートリーダーを用いて定量化した。バックグラウンドシグナルをウイルスおよび血清の非存在下に行ったアッセイで測定した。次いで、試験アッセイで得られたシグナルを、バックグラウンド値を引くことによって補正した。細胞とウイルスのみを含有する対照ウェルの補正された光単位によって各実験ウェルの補正された相対光単位を割ることによって感染率を計算した。ＦＬＳＣ接種マウスからの血清は、＃０、＃１、＃２、＃３、＃４で標識され、ナイーブマウスは「Ｃ」で標識されている。

図１７に示されているように、希釈係数の増大とともに、ウイルス感染の増大も認められる。さらに、対照マウスから分離された血清は、ウイルス感染に対する影響をしめさなかったが、マウス＃２からの血清の高濃度はウイルス感染の最小量を示した。

要約して言えば、データは、ウイルスコート受容体複合体の遷移状態構造を再現する可溶性、キメラポリペプチドの有効な発現を示している。この成果を考えると、ウイルスまたは同様のコートポリペプチドエピトープを有するウイルスに対する免疫反応を生成するように対象の免疫化のためにポリペプチドをコードするキメラポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用することが可能となる。生成される免疫反応は、抗体（液性）またはＣＴＬ反応でありうる。さらに、キメラポリペプチドが生細胞の表面上の適切なコレセプターに結合するという事実を考えると、ウイルス感染からコレセプターを発現する細胞を受動的に保護するために、免疫不全ウイルスに激しく曝露された対象にポリペプチドを投与することができる。
実施例ＸＩＩ
ＦＬＳＣ、およびＢａＬｇｐ１２０とｓＣＤ４の複合体をＤ７３２３コートＥＬＩＳＡプレート上に捕捉した。Ｄ７３２４は、ｇｐ１２０のＣ−末端領域に対して反応性であり、捕捉ＥＬＩＳＡによってＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の抗原性を検査するために一般的に用いられている抗体である。次いで、ＢａＬｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体を０．５ｍＭビス（スルホスシニミジル）スベリンン酸（ピアス）で３０分間架橋し、次いで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬで処理し、反応を停止した。次いで、ＢａＬｇｐ１２０／ｓＣＤ４とＦＬＳＣプレートをＴＢＳで洗浄した。Ｖ３ループ（３９Ｆ）、Ｃ１〜Ｃ５（Ｃ１１）、Ｃ１〜Ｃ４（Ａ３２）、コレセプター結合ドメイン（１７ｂ）、およびＢａＬｇｐ１２０のＣ３〜Ｖ４（２Ｇ１２）領域を捕捉抗原上に滴定した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧで結合抗体を検出した。

図１８は、架橋反応がＢａＬｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の構造を変化させ、３９Ｆ、Ｃ１１、Ａ３２、および１７ｂエピトープの抗原性を減少させることを示している。対照的に、これらのエピトープはＦＬＳＣで閉鎖されていない。この抗原性の変化はこれらのエピトープの機能に影響を及ぼすことになる。例えば、１７ｂによって認識さえたエピトープはＲ５コレセプターと相互作用する。クロスリンカーによるこのエピトープの閉鎖により架橋複合体のコレセプターとの相互作用能力が低下することになる。この所見は、架橋複合体がそのコレセプターによってＨＩＶ−１を潜在的にブロックしうる試薬の検査には用いられないことも示す。
実施例ＸＩＩＩ
調製Ｒ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１を０．５ｍＭビス（スルホスシニミジル）スベリンン酸（ピアス）で３０分間架橋し、次いで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬで処理し、反応を停止した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元条件および非還元条件で架橋物質を非架橋物質と比較した。図１９に示されているように、還元ゲル（中央レーン）での非架橋物質は、１８０ｋＤａで実行され、ＢａＬｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１キメラの予想サイズである。小さいバンドは、およそＣＤ４−ＩｇＧのサイズであり、キメラが分子のＢａＬｇｐ１２０とＣＤ４−ＩｇＧ部分との間で開裂していることを示す。この所見は、Ｒ／Ｔ変異はフューリンプロテアーゼによる開裂を除去するが、別のプロテアーゼはｇｐ１２０のｃ末端で作用しうることを示す。非還元条件（右レーン）の非架橋物質は、３６０ｋＤａで実行され、完全にアセンブルされた免疫付着因子である。この所見は、物質の一部分は開裂しているが（中央レーンを参照）、免疫付着因子は結合したままであることを示す。アセンブル構造を安定させる物質の架橋により、この所見が確認される（左レーン）。ここで物質は予想通り約３６０ｋＤａで実行されている。高分子量の形態は可視的でもあり、これは精製調製物の一部が凝集していることを示す。

２９３個の細胞をｐｃＤＮＡ−ヒトＣＣＲ５またはｐｃＤＮＡ−アカゲザルＣＣＲ５またはプラスミドなしのいずれかで使用２４時間前に一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞（１０^５／ウェル）を３７℃下に１時間、指定濃度のＲ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１とともにインキュベートした。結合Ｒ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１をフィコエリトリン接合抗−ヒトＩｇＧで検出し、ＦＡＣＳによって分析した。図２０は、Ｒ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１がヒトとアカゲザルのＣＣＲ５に結合することを示す。

ＣＣＲ５を発現するイヌ胸腺細胞を３μｇ／ｍＬ Ｒ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１および指定濃度のケモカインとともに３７℃下に１時間インキュベートした。フィコエリトリン接合抗−ヒトＩｇＧを用いて結合Ｒ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１を検出し、ＦＡＣＳによって分析した。ＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＲ５−特異的ケモカインであり、受容体に対してＲ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１と競合することが予想される。ＳＤＦは、ＣＸＣＲ４特異的ケモカインであり、これを対照として用いた。図２１は、Ｒ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１が、そのコレセプター、ＣＣＲ５によってＨＩＶ−１感染をブロックしうる試薬を規定するスクリーニング手段として用いることができるという証拠をさらに提供している。

本明細書のすべての引例は、それらが開示するすべてについて、またすべての目的について参考によって援用される。本発明は、その詳細な説明とともに記載され、添付の特許請求の範囲によって規定されているが、前記の説明は発明の例示を意図したものであり、発明の範囲の限定は意図されていないことを理解すべきである。

例示的なキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの構成を示す図である。完全長一本鎖（ＦＬＳＣ）キメラポリペプチドは、ＨＩＶｇｐ１２０（ＢａＬ株）、２０アミノ酸スペーサーポリペプチド、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメイン（Ｄ１ Ｄ２）を含むＣＤ４ポリペプチド配列、およびｍｙｃペプチド「標識」を含む。切断型一本鎖（ＴｓＳＣ）キメラは、Ｃ１（不変領域１）、Ｖ１（可変領域１）、Ｖ２、およびＣ５における欠失を含有する。ＴｃＳｃで示された欠失は、ＢａＬｇｐ１２０配列に従って番号付けされている。ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔキメラは、フューリン開裂部位における単一の変異を有し、ｇｐ１２０のｃ末端で、ＲがＴに変化している。ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９キメラは、ｇｐ１２０のフューリン開裂部位における単一変異、２１アミノ酸スペーサーポリペプチド、およびＣＤ４Ｍ９ペプチド配列を有する。 ２９３−ＳＣ細胞によって発現されたＦＬＳＣおよびＴｃＳＣ可溶性キメラポリペプチドを含有する細胞培養上清のウェスタンブロット分析を示す図である。ｇｐ１２０（レーン１〜４）およびＣＤ４（レーン５〜８）で免疫ブロット法を行ったが、矢印は、ゲル移動が減少する順序に、ｇｐ１２０−ＣＤ４一本鎖（一本鎖）、開裂ｇｐ１２０（ｇｐ１２０フラグメント）、および開裂ＣＤ４（ＣＤ４フラグメント）を示す。 ２９３−ＳＣ細胞によって発現されたｇｐ１２０−ＣＤ４の分析を示す図であり、非架橋ｇｐ１２０−ＣＤ４はレーン１にあり、架橋ｇｐ１２０−ＣＤ４はレーン２にある。 架橋後のＦＬＳＣの免疫ブロット分析を示す図である。異なるＦＬＳＣ濃度（１〜０．０３μＭ）のそれぞれの相対総タンパク質率（％）が棒グラフに示されている：（Ａ）、４５％１７２ｋＤ；（Ｂ）、２５％３０２ｋＤ；および（Ｃ）、１０％高位のオリゴマー。 ｇｐ１２０−ＣＤ４キメラの結合分析を示す図である。（Ａ）、架橋ｇｐ１２０／ｒｓＣＤ４および非複合体形成ｇｐ１２０と比較して、抗ｇｐ１２０抗体（１７ｂ、４８ｄ、Ａ３２、およびＣ１ １）でインキュベートした完全長一本鎖（ＦＬＳＣ）。１７ｂ、４８ｄ、およびＡ３２は、複合体形成ｇｐ１２０に対する優先的親和性を有する。バーは、標準誤差と共に示されている。（Ｂ）、ＦＬＳＣおよびＴｃＳＣにおけるヒト抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体の相互半最大結合濃度（ＥＬＩＳＡ）。（Ｃ）、ｇｐ１２０ ＣＤ４結合ドメインと反応するモノクローナル抗体ＩｇＧｌｂ１２、Ｆ９１、および２０５〜４６９の相互半最大結合。 ＣＣＲ５（Ｒ５）またはＣＸＣＲ４（Ｘ４）コレセプター発現Ｌ１．２細胞に結合するｇｐ１２０−ＣＤ４キメラ（ＦＬＳＣ、ＴｃＳＣ）の分析を示す図である。ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を発現しない対照細胞は、Ｌ１．２で示されている。５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４ Ｍａｂ４５を用いたフローサイトメトリーによって結合複合体を検出した。示されている値は、３回行った代表的なものである。 ｇｐ１２０結合抗体（１７ｂ、４８ｄ、Ａ３２、Ｃ１１、および２Ｇ１２）、およびｇｐ４１抗体（Ｆ２４０）の存在下にコレセプターに結合するｇｐ１２０−ＣＤ４（ＦＬＳＣ、ＴｃＳＣ）の分析を示す図である。Ｌ１．２細胞は、示されているように、コレセプターＣＣＲ５（Ｒ５）、ＣＸＣＲ４（Ｘ４）を発現し、またはコレセプターを示さなかった（Ｌ１．２）。抗体を含まない対照は、「＋」で示されている。未処理細胞で得られた参考測定値は、「−」で示されている。５μｇ／ｍｌのＭａｂ４５を用いたフローサイトメトリーによって結合複合体を検出した。結果は、マッチした対照アッセイにおいて得られた平均蛍光強度に対する結合率で示されている。３つの別個の試験から得られた平均値が示されている。標準誤差はバーで示されている。 ＦＬＳＣ、ＴｃＳＣ、ＢａＬｇｐ１２０、およびＢａＬｇｐ１２０−ｒｓＣＤ４複合体によるＨＩＶ−１_２０４４（Ｘ４特異的分離株）およびＨＩＶ−_Ｂａｌ（Ｒ５特異的分離株）ウイルス中和の分析を示す図である。Ｕ３７３細胞は、ＣＤ４、Ｒ５またはＸ４のいずれか、およびＨＩＶ−１ＬＴＲプロモーターによって制御されたＰガラクトシダーゼを発現した。ＨＩＶ−１_２０４４に対するＦＬＳＣおよびＴｃＳＣのＩＤ_９０は、試験した最大濃度では達成されず、したがって＞１０μｇ／ｍｌで示されている。 コードドメインを示すキメラｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１遺伝子を示す図である。実質的に最初のｇｐ１２０−ＣＤ４が、ＩｇＧ１重鎖ヒンジＣＨ２およびＣＨ３領域を有することによって、キメラｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１ポリペプチドの発現を可能にする、プラスミドにサブクローン化されている。 ２９３細胞において発現されたｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１キメラポリペプチドの免疫ブロット分析を示す図である。キメラｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１は、培養上清から分離され（レーン１）、精製ＨＩＶ株ＢａＬ ｇｐ１２０ポリペプチド（と比較して示されているレーン２）。開裂ｇｐ１２０は、矢印によって示され、精製ｇｐ１２０と同時移動する。 コレセプター発現Ｌ１．２細胞に結合するｇｐ１２０−ＣＤ４−ＩｇＧ１キメラポリペプチドの相互希釈分析を示す図である。ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４発現Ｌ１．２細胞が示されている。 ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１がｇｐ１２０上のＲ５結合ドメインによってＲ５コレセプターと相互作用することを示すＣＣＲ５発現細胞に結合するＦＬＳＣ−ＩｇＧ１上のブロッキングＭＡｂ（１７ｂ）の分析を示す図である。 フューリン開裂部位（Ｒ−Ｔ）の変異後のｇｐ１２０−ＣＤ４（ＦＬＳＣ）の安定性の改善を示す図である。 ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９をＢａＬｇｐ１２０、ＦＬＳＣ、およびＦＬＳＣ Ｒ／Ｔと比較する免疫ブロットを示す図である。ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９は、ＣＤ４Ｍ９遺伝子配列に対するＦＬＳＣ Ｒ／ＴにおけるＣＤ４ Ｄ１Ｄ２配列を転換することによって構成した。 ＣＣＲ５（Ｒ５）に結合するＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９の分析を示す図である。分析の結果は、平均蛍光強度で示されている。図は、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９が、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔのものと同等の効率でＲ５発現細胞に結合することを示す。 ｇｐ１２０がＣＤ４と相互作用するときに曝露が増大することになるエピトープの結合、および曝露される１７ｂエピトープがＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ ＣＤ４Ｍ９であり、ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔのものと同等であることを示す図である。 ＦＬＳＣ接種マウスの血清による一次Ｒ５ ＨＩＶ−１（９２ＢＲ０２０）の中和を示す図である。 ＢａＬｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の共有架橋が、ＦＬＳＣ上に曝露されたエピトープを塞ぐことを示す図である。 還元および非還元条件下に精製Ｒ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１を比較する免疫ブロットを示す図である。 ヒトおよびアカゲザルＣＣＲ５へのＲ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１の結合を示す図である。 ＣＣＲ５に結合するＲ／Ｔ ＦＬＳＣ−ＩｇＧ１を競合的に抑制するランテスを示す図である。

Claims (13)

1. ＨＩＶウイルスコートポリペプチド配列、および
   ウイルス受容体ポリペプチド配列
   を含むキメラポリペプチドであって、
   前記ウイルスコートポリペプチドが変異フューリン開裂部位を含むｇｐ１２０であり、
   前記ウイルスコートポリペプチド配列および前記受容体ポリペプチド配列が、該ウイルスコートポリペプチド配列と該ウイルス受容体ポリペプチド配列とを互いに結合させるのに十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されており、
   前記受容体ポリペプチド配列がＣＤ４模倣物であり、
   前記キメラポリペプチドが、配列番号：６のアミノ酸配列を含む、
   前記キメラポリペプチド。
2. 前記ウイルスコートポリペプチド配列が、配列番号：３０である、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
3. 前記受容体ポリペプチド配列が、配列番号：２０である、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
4. 前記ｇｐ１２０ポリペプチド配列が、アルギニンをトレオニンに置換することによって、フューリン開裂部位で変異している、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
5. 異種ドメインをさらに含み、前記異種ドメインが、標識、付着因子、および免疫増強剤からなる群から選択される、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
6. 前記異種ドメインが、配列番号：３２である、請求項５に記載のキメラポリペプチド。
7. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
8. 請求項１に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
9. 前記核酸配列が、配列番号：５である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
10. 前記ウイルスコートポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号：２９である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
11. 前記受容体ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号：１９である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
12. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する宿主細胞。
13. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する宿主細胞。