CN104736174B - 具有三重突变的二聚体蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及二聚体蛋白质，其在3个不同位置包含与在人IgG1中存在的氨基酸不同的氨基酸。6个所述二聚体蛋白质能在溶液中形成六聚体结构。

Description

具有三重突变的二聚体蛋白质
发明领域
本发明涉及二聚体蛋白质例如抗体，其包含相比于亲本二聚体蛋白质的至少3个突变。更具体地，本发明涉及能在溶液中形成寡聚体例如六聚体结构的这类二聚体蛋白质。本发明还涉及这类二聚体蛋白质和包含这类二聚体蛋白质的组合物的用途。
发明背景
由抗体的Fc区介导的效应器功能允许破坏外来实体，如杀死病原体和清除及降解抗原。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)由Fc区对携带Fc受体(FcR)的细胞的结合启动，而补体依赖性细胞毒性(CDC)由Fc区对C1q的结合启动，其启动经典补体激活途径。
每个IgG抗体含有两个针对C1q的结合位点，在每个重链恒定(Fc)区中各一个。然而，溶液中的单一IgG分子不激活补体，因为单体IgG对C1q的亲和力相当弱(Kd～10-4M)(Sledge等,1973J.Biol.Chem.248,2818-13；Hughes-Jones等,1979Mol.Immunol.16,697-701)。抗原驱动的IgG的联合可导致紧密得多的对多价C1q分子的结合(Kd～10-8M)和补体激活(Burton等,1990Mol.Immunol.22,161-206)。相比之下，IgM以共价结合的五聚体或六聚体天然存在，并在结合细胞表达或固定化的抗原时，IgM五聚体和六聚体能有效引发CDC。抗原结合是诱导IgM中的构象变化以暴露C1q结合位点的要求(Feinstein等,1986,Immunology Today,169-174)。
已提出IgG也可通过经由Fc区的CH2/CH3域的相互作用形成六聚体环结构来实现补体激活(Burton等,1990Trends in Biochem.Sci.15,64-69)。已在二维(Reidler等,1986I Handbook of Experimental Immunology 4th edit.(Weir,D.M.ed.),pp17.1-17.5.Blackwell,Edinburgh；Pinteric等,1971Immunochem.8,1041-5)和三维晶体中，以及对于溶液中的IgG1,IgG2a和IgG4和人Fc(Kuznetsov等,2000J Struct.Biol.131,108-115)发现了支持这类六聚体IgG结构存在的证据。在针对HIV-1gp120的b12人IgG1κ抗体的晶体结构(PDB中的1HZH)中也观察到六聚体环形成(Saphire等,Science 2001 Aug10；293(5532),1155-9)。在b12六聚体环中，6个可接近的C1q结合位点呈现在六聚体表面处(来自6个抗体中每个的1个)，而其他6个结合位点面朝下。
C1q类似于具有与六个胶原柄栓系的六个球状头部的郁金香束，所述球状头部包含抗体结合区[Perkins等,1985Biochem J.228,13-26；Poon等,1983J Mol Biol.168,563-77；Reid等,1983Biochem Soc Trans 11,1-12；Weiss等,1986J.Mol.Biol.189,573-81]。发现C1q适合到1HZH晶体结构的b12六聚体装配物上，从而使得6个球状头部的每个与6个C1q结合位点之一接触(Parren,FASEB Summer Research Conference,Snowmass,Co.,5-10July 2010；“Crystal Structure of an intact human IgG:implications for HIV-1neutralization and effector Function”,Erica Ollmann Saphire的论文，在ScrippsResearch Institute,La Jolla,California.November 2000)。观察到晶体结构中的对称相关b12抗体之间观察到的Fc界面中的选定氨基酸中的突变降低C1q的结合亲合力，指示这些氨基酸对分子间Fc:Fc相互作用的贡献。
Mekhaiel DNA等,Nature Scientific Reports,1:124，2011年10月19日披露了具有改良的效应器功能的聚合人Fc-融合蛋白。
WO0042072披露了具有改变的效应器功能的多肽变体。
US20080089892披露了Fc区变体。
WO2006105062披露了改变的抗体Fc区及其用途。
本发明涉及包含特定氨基酸残基的二聚体蛋白质，其中6个所述二聚体蛋白质能在溶液中形成非共价六聚体形式。
发明概述
在一个方面，本发明涉及包含第一和第二多肽的二聚体蛋白质，每个多肽至少包含免疫球蛋白重链的CH2和CH3区，其中在所述第一和/或第二多肽中：
在对应于人IgG1重链中E345和E430的位置处的氨基酸不是E；且
在选自由S440，Y436，D/E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y，K，R或W；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。
在另一方面，本发明涉及一种寡聚体，其包含至少两个非共价联合的本发明的二聚体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及一种六聚体，其包含6个非共价联合的本发明的二聚体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含本发明的二聚体蛋白质、一种或多种抗体、和药学可接受的载体。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含依照本发明的第一个二聚体蛋白质、依照本发明的第二个二聚体蛋白质、和任选地药学可接受的载体。
在另一方面，本发明涉及一种增加包含第一和第二多肽的二聚体蛋白质在溶液中的寡聚化和/或效应器功能的方法，所述多肽各自至少包含免疫球蛋白重链的CH2和CH3区，该方法包括在所述第一和/或第二多肽中在至少对应于人IgG1重链中的E345、E430的位置和选自下组的位置中引入氨基酸取代：S440，Y436，D/E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254。
在另一方面，本发明涉及通过本发明方法制备的变体二聚体蛋白质。
在另一方面，本发明涉及一种组件试剂盒(kit-of-parts)，其包含依照本发明的第一个二聚体蛋白质和依照本发明的第二个二聚体蛋白质，用于成像、诊断学或治疗中的同时、分开或序贯使用。
在另一方面，本发明涉及一种用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像的方法，包括施用依照本发明的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗细菌性、病毒性或寄生性感染，用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像，或用于调控从人或其他哺乳动物的身体清除靶分子的方法，包括施用依照本发明的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗疾病如癌症、自身免疫性疾病、器官移植排斥、和体液系统中的C1q消耗(depletion)的方法，包括施用依照本发明的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、组件试剂盒。
附图简述
图1：(A)六聚体形成中IgG分子的示意图。
图2：使用Clustal 2.1软件，对应于IgG1重链中残基P247至K447的人IgG1,IgG1f,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgD,IgE和IgM Fc区段的序列比对，如由Kabat中所述的Eu索引编号的。显示的IgG1的序列(SEQ ID NO:6)代表人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:1；UniProt登录号P01857)的残基130至330而显示的IgG1m(f)的序列(SEQ ID NO:7)代表同种异型变体IgG1m(f)(SEQ ID NO:5)的残基130至330；显示的IgG2的序列(SEQ ID NO:8)代表IgG2重链恒定区(SEQ ID NO:2；UniProt登录号P01859)的残基126至326；而显示的IgG3的序列(SEQ ID NO:9)代表IgG3重链恒定区(SEQ ID NO:3；UniProt登录号P01860)的残基177至377；而显示的IgG4的序列(SEQ ID NO:10)代表IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:4；UniProt登录号P01861)的残基127至327；而显示的IgE的序列(SEQ ID NO:11)代表IgE恒定区(Uniprot登录号P01854)的残基225-428；而显示的IgA1的序列(SEQ ID NO:12)代表IgA1恒定区(Uniprot登录号P01876)的残基133-353；而显示的IgA2的序列(SEQ ID NO:13)代表IgA2恒定区(SEQ ID NO:8；Uniprot登录号P01877)的残基120-340；而显示的IgM的序列(SEQ ID NO:14)代表IgM恒定区(Uniprot登录号P01871)的残基230-452；而显示的IgD的序列(SEQ ID NO:15)代表IgD恒定区(Uniprot登录号P01880)的残基176-384。
图3A和B：IgG1(SEQ ID NO:3),IgG4(SEQ ID NO:5)和(部分)IgG3(SEQ ID NO:6)骨架的抗EGFr抗体2F8的序列比对。描绘依照Kabat和依照Eu索引的氨基酸编号(两者记载于Kabat等,Seqences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。
图4：寡聚体(例如六聚体)排列中临近分子的Fc之间(分别为Fc和Fc’)的K439/S440相互作用的详细示图，例示了野生型、未经修饰的Fc和Fc’分子之间的相互作用。
图5：CD38阳性细胞上的由CD38抗体HuMAb 005的突变体介导的CDC。(A)通过005突变体的浓度系列在Daudi细胞上的CDC功效。(B)通过HuMAb 005突变体的浓度系列在Raji细胞上的CDC功效。(C)HuMAb 005的E345R突变体和20％或50％NHS在Wien133细胞上的CDC功效。(D)HuMAb 005和7D8的E345R突变体和20％或50％NHS在Raji细胞上的CDC功效。测试了自瞬时转染分离的未纯化的抗体样品。作为阴性对照，使用模拟转染的细胞的上清液。
图6：CD38抗体HuMAb 005的野生型和E345R突变体在与Fc结合肽的竞争实验中的CDC。在CDC后在与一定浓度系列的Fc结合性DCAWHLGELVWCT肽(SEQ ID NO:7)温育的、经抗体调理的Daudi细胞上测量细胞裂解。测试了自瞬时转染分离的未纯化的抗体样品。作为阴性对照，使用模拟转染的细胞的上清液。
图7：通过CD20抗体7D8突变体(A),CD38抗体005突变体(B)、CD38抗体005突变体和CD20抗体7D8突变体的混合物(C)和(D)在CD20和CD38阳性Wien133细胞上的CDC。
图8A和B：在具有Raji-luc#2D1细胞的皮下异种移植物模型中对IgG1-005-E345R体内功效的评估。
图9：通过具有E345R突变的CD38/EGFR双特异性抗体在CD38阳性、EGFR阴性Wien133细胞上的CDC。
图10A和B：通过有和无E345R突变的CD20/CD38双特异性抗体在CD20阳性,CD38阴性Wien133细胞或Raji细胞上的CDC。
图11：通过有E345R突变的EGFR抗体2F8在EGFR阳性A431细胞上的CDC。
图12A和B：E345R突变体抗体介导的CDC。
图13：使用溶酶体标志物LAMP1(APC)对TF抗体(FITC)的共定位分析。
图14A-D：引入E345R导致与在不同B细胞系上测试的野生型利妥昔单抗相比，增强的CDC介导的杀伤。
图14E：引入E345R导致与野生型利妥昔单抗相比，增加的最大CDC介导的杀伤，其不依赖于具有相当的CD20表达水平的不同B细胞系中补体调节蛋白CD46(A),CD55(B)或CD59(C)的表达水平。
图15：CDC动力学。E345R抗体相比于野生型抗体导致通过CDC的更快速和更多的实质性靶细胞裂解。
图16：CDC动力学。在双特异性CD38xCD20抗体中引入E345R突变导致更快速和更多的CDC介导的靶细胞裂解。
图17：CDC动力学。在单价结合EGFR阴性Raji细胞的双特异性抗体EGFRxCD38中引入E345R突变导致比没有E345R突变的双特异性EGFRxCD38更快速和更多的实质性CDC介导的靶细胞裂解。
图18A-F：通过野生型抗体与含有(A-C)E345R和Q386K或(D-F)E345R,E430G和Q386K的突变体抗体的组合在Wien133细胞上的CDC。IgG1-b12突变体不结合Wien133细胞并被用作阴性对照抗体。
图19:含有E345R突变的IgG1,IgG2,IgG3和IgG4同种型抗体的CDC功效。
图20：在野生型CD38抗体005中引入Fc-Fc稳定性E345R突变导致在离体CDC测定中增强的对原发性CLL细胞的杀伤(平均值±均值的标准误差)。
图21:抗体变体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的PAGE分析。左图：SDS-PAGE，非还原性条件。中图：SDS-PAGE，还原性条件。右图：阴性PAGE。注意：第1道：IgG1-b12对照抗体。第2道：IgG1-005-E345R/E430G。第3道：IgG1-005-E345R/E430G/S440Y。
图22：野生型IgG1-005抗体的HP-SEC分析。估测分数单体(即单一抗体)为>99％。
图23：抗体变体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的HP-SEC分析。估测分数寡聚体为约79％。
图24:野生型IgG1-005抗体(虚线)和IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(实线)的HP-SEC概况(profile)的叠加图。
图25：使用IgG1-005,IgG1-005-E345R/E430G/S440Y和IgG1-005-E345R的C1q结合ELISA。将指定抗体的浓度系列包被到孔上并与固定浓度C1q温育。
图26：通过一定浓度系列的IgG1-005-WT,IgG1-005-E345R/E430G/S440Y和IgG1-005-E345R在CD38阳性Ramos细胞上的CDC功效。
图27：使用CD38阳性Raji细胞和一定浓度系列的IgG1-005-WT,IgG1-005-E345R/E430G/S440Y和IgG1-005-E345R的ADCC报告子测定法。
图28：SCID小鼠中随时间的血浆人IgG浓度，如通过总人IgG ELISA测定的。黑圆形：野生型IgG1-005；黑三角形：IgG1-005-E345R/E430G/S440Y。
图29：施用的人IgG在SCID小鼠中的清除率，如通过抗CD38ELISA测定的。黑圆形：野生型IgG1-005；黑三角形：IgG1-005-E345R/E430G/S440Y。
图30：0.1M Na2SO4/0.1M磷酸钠pH 6.8中的IgG1-005的HP-SEC概况。
图31：0.1M Na2SO4/0.1M磷酸钠pH 6.8中的IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的HP-SEC概况。
图32：0.15M NaCl/0.1M柠檬酸盐pH 6.8(虚线)和pH 5.0(实线)中的IgG1-005的HP-SEC概况的叠加图。
图33：0.15M NaCl/0.1M柠檬酸盐pH 6.8(虚线)和pH 5.0(实线)中的IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的HP-SEC概况。
图34:三重突变体抗体IgG1-005-RGY,IgG-7D8-RGY,IgG1-ritux-RGY,IgG1-2F8-RGY和IgG1-M1-RGY的HP-SEC分析。
图35：E345R/E430G/S440Y三重突变体CD20抗体在使用7D8衍生的抗体(A)和利妥昔单抗衍生的抗体(B)的离体测定法中显示增强的对原发性CD20阳性CLL细胞的杀伤。
图36：IgG1-005-RGY(A),IgG2-005-RGY(B),IgG3-005-RGY(C)和IgG4-005-RGY(D)的HP-SEC分析。百分数以占总峰面积的分数指示总多聚体。
图37：通过不同IgG同种型骨架的005抗体变体的一定浓度系列在CD38阳性Daudi(A)和Wien133(B)细胞上的CDC功效。
图38：IgG1-005-KGY(A),IgG1-005-RSY(B),IgG1-005-RGW(C)和IgG1-005-RGI(D)的HP-SEC分析。
图39：通过IgG1-005-RGY,IgG1-005-KGY,IgG1-005-RSY,IgG1-005-RGW,和IgG1-005-RGI的一定浓度系列在CD38阳性Wien133(A)和Ramos(B)细胞上的CDC功效。
图40：IGG1-005-RGE,IgG1-005-RGK以及IgG1-005-RGE+IgG1-005-RGK的混合物的HP-SEC分析(AU指示“绝对单位”)。
图41：IgG1-005-RGE,IgG1-005-RGIK以及IgG1-005-RGE+IgG1-005-RGIK的混合物的HP-SEC分析(AU指示“绝对单位”)。
图42：混合物IgG1-005-RGE+IgG1-005-RGK和混合物IgG1-005-RGE+IgG1-005-RGIK的HP-SEC迹线的叠加图(AU指示“绝对单位”)。
图43：三重突变体Fc片段(Fc-RGY)的HP-SEC分析。
图44：与Fc-RGY-647和全长IgG1-RGY抗体的混合物温育的A431(A)和Daudi(B)细胞的FACS分析。
图45A和B:在不同pH水平的IgG1-005-RGY的HP-SEC分析。百分数以占总峰面积的分数指示总寡聚体。
图46：通过引入三重突变RGY，在IgG抗体的不同同种型变体中诱导的程序化细胞死亡。
图47：IgG1-005-RGY(实线)和六聚体IgM-005(虚线)的HP-SEC分析。
图48：通过一定浓度系列的IgG1-005,IgG1-005-RGY,IgM-005在CD38阳性Daudi(A)和Wien133(B)细胞上的CDC功效。
图49：使用IgG1-2F8-RGY在实体瘤细胞系A431细胞(A)和Difi(B)上的体外CDC测定。
图50：通过抗体在正常人血清中产生的C4d，作为对溶液中补体激活的量度。
发明详述
定义
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链构成，一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链，所有四条链通过二硫键交互连接。免疫球蛋白的结构是已经确立的。见例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简而言之，每条重链通常包含重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区通常包含三个域：CH1,CH2,和CH3。重链经由二硫键在所谓的“铰链区”交互连接。每条轻链通常包含轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个域CL。VH和VL区可以进一步再分成高可变区(或超变区，其在序列上和/或结构上限定的环的形式中高度可变)，也称作互补决定区(CDR)，中间被称作框架区(FR)的更保守的区域隔开。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，以如下的次序从氨基端向羧基端排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4(亦见Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196,901 917(1987))。除非另外指示或与上下文相冲突，恒定区序列的氨基酸在本文中根据EU-索引或编号方式编号(记载于Kabat,E.A.等,Sequences of proteins of immunological interest.5th Edition-US Department of Health and Human Services,NIH公开No.91-3242,pp 662,680,689(1991))。
术语“铰链区”用于本文意图指免疫球蛋白重链的铰链区。如此，例如人IgG1抗体的铰链区对应于氨基酸216-230，其依照如Kabat所述的Eu编号。
术语“CH2区”或“CH2域”用于本文意图指免疫球蛋白重链的CH2区。如此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于氨基酸231-340，其依照如Kabat所述的Eu编号。然而，CH2区还可以是如本文中描述的其他亚型的任一种。
术语“CH3区”或“CH3域”用于本文意图指免疫球蛋白重链的CH3区。如此，例如人IgG1抗体的CH 3区对应于氨基酸341-447，其依照Eu编号系统。然而，CH 3区还可以是如本文中描述的其他亚型的任一种。
可在本文中交换使用的“Fc区”,“Fc片段”或“Fc域”指从N端至C端方向包含至少铰链区、CH2域和CH3域的抗体区域。例如，IgG1抗体的Fc区可通过用木瓜蛋白酶消化IgG1抗体生成。
术语“Fab片段”在本发明的背景中指免疫球蛋白分子的片段，其包含重链和轻链的可变区以及轻链的恒定区和免疫球蛋白的CH1区。“CH1区”指例如对应于依照Eu编号系统的氨基酸118-215的人IgG1抗体区。如此，Fab片段包含免疫球蛋白的结合区。
术语“抗体”(Ab)在本发明的背景中指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其任一者的衍生物，所述抗体具有在典型生理学条件下以具有较长时间段的半衰期特异性结合抗原的能力，所述时间段如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更长、约48小时或更长、约3、4、5、6、7天或更长等，或任何其他相关的功能限定的时段(如足以诱导、促进、增强、和/或调控抗体对抗原结合有关的生理学应答的时间和/或足以使抗体招募效应器活性的时间)。本发明的抗体包含免疫球蛋白的Fc域和抗原结合区。抗体一般含有两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区，例如至少Fc域。如此，本发明的抗体可以包含Fc区和抗原结合区。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定或“Fc”区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(如效应器细胞)和补体系统的组分如C1q(补体激活的经典途径中的第一组分)的结合。抗体还可以是多特异性抗体，如双特异性抗体或类似的分子。术语“双特异性抗体”指对至少两种不同的、通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这类表位可以在相同或不同的靶物上。如果表位在不同的靶物上，这类靶物可以在相同细胞或不同细胞或细胞类型中。如上文指示的，除非另外说明或与上下文清楚地冲突，术语抗体在本文中包括抗体的片段，其包含Fc区的至少一部分且其保留特异性结合抗原的能力。这类片段可以通过任何已知的技术提供，如酶促分裂、肽合成和重组表达技术。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段实施。涵盖在术语“Ab”或“抗体”中的结合片段实例包括，不限于，单价抗体(在WO2007059782中由Genmab描述)；重链抗体，其仅由两条重链组成并在例如骆驼中天然存在(例如，Hamers-Casterman(1993)Nature 363:446)；ThioMabs(Roche，WO2011069104)，链交换工程域(SEED或Seed体)，其是不对称的和双特异性的抗体样分子(Merck，WO2007110205)；Triomab(Fresenius,Lindhofer等(1995JImmunol 155:219))；FcΔAdp(Regeneron，WO2010151792)，Azymetric Scaffold(Zymeworks/Merck，WO2012/058768)，mAb-FV(Xencor，WO2011/028952)，双可变域免疫球蛋白(Abbott,DVD-Ig，美国专利7,612,181)；双域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis，WO20100226923)，二双抗体(ImClone/Eli Lilly)，钮-入-孔(knob-into-holes)抗体形式(Genentech，WO9850431)；DuoBody(Genmab，WO2011/131746)；静电驾驭抗体形式(Amgen，EP1870459和WO 2009089004；Chugai，US201000155133；Oncomed，WO2010129304A2)；双特异性IgG1和IgG2(Rinat neurosciences Corporation，WO11143545)，CrossMAbs(Roche，WO2011117329)，LUZ-Y(Genentech)，Biclonic(Merus)，双靶向域抗体(GSK/Domantis)，识别两个靶标的二合一抗体(Genentech，Novlmmune)，交联MAbs(Karmanos Cancer Center)，CovX体(CovX/Pfizer)，IgG样双特异性(ImClone/Eli Lilly,Shen,J.,等J ImmunolMethods,2007.318(1-2):p.65-74)，和DIG体和PIG体(Pharmabcine)，以及双亲和性再靶向分子(Macrogenics的Fc-DART或Ig-DART，WO/2008/157379，WO/2010/080538)，Zybodies(Zyngenia)，普通轻链(Crucell/Merus，US7262028)或普通重链(Novlmmune的κλ体)的方法，以及融合蛋白，其包含多肽序列，所述多肽序列融合于含Fc域的抗体片段，像scFv融合体，像ZymoGenetics/BMS的BsAb，Biogen Idec的HERCULES(US007951918)，EmergentBioSolutions/Trubion的SCORPIONS，Ts2Ab(Medlmmune/AZ Dimasi,N.,等J Mol Biol,2009.393(3):p.672-92)，Novartis的scFv融合体，Changzhou Adam Biotech Inc的scFv融合体(CN102250246)，Roche的TvAb(WO2012025525,WO2012025530)，f-Star的mAb2(WO2008/003116)和双scFv-融合体。还应当理解，术语抗体，除另有指明外，也包括多克隆抗体、单克隆抗体(如人单克隆抗体)、抗体混合物(重组多克隆)例如，通过Symphogen和Merus(Oligoclonics)开发的技术生成的，和抗体样多肽，如嵌合抗体和人源化抗体。生成的抗体可潜在地具有任何同种型。
术语“全长抗体”是指含有对应于在该同种型的野生型抗体中通常发现的那些的全部重链和轻链恒定域和可变域的抗体(例如亲本或变体抗体)。
术语“人抗体”用于本文意图包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或者通过体内的体细胞突变引入的突变、插入或缺失)。然而，术语“人抗体”用于本文并不意图包括如下的抗体：其中衍生自另一哺乳动物物种的种系(例如小鼠)的CDR序列被嫁接到人框架序列上。
术语“单克隆抗体”、“单克隆Ab”、“单克隆抗体组合物”、“mAb”等用于本文是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，其包括从转基因或转染色体非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，该B细胞具有包含人重链转基因和轻链转基因库的基因组(经重排以产生功能性人抗体)，并与永生化细胞融合。
如本文中使用的，"同种型"指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgD,IgA1,IgGA2,IgE,或IgM或其任何同种异型如IgG1m(za)和IgG1m(f))。此外，每个重链同种型可与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。
术语“单价抗体”在本发明的背景中意指仅能使抗体的一个结合域与抗原结合，例如具有单个抗原-抗体相互作用，如此不能使抗原交联的抗体分子。
“结合区”用于本文可以是能结合与细胞、细菌、病毒体等关联的靶物的多肽序列，如蛋白质、蛋白质配体、受体、抗原结合区或配体结合区。结合区可以例如包含受体、受体配体的一部分或免疫球蛋白或抗体的抗原结合区。
本发明中所用的术语“靶物”在本发明上下文中应理解为包含CH2、CH3、和任选地铰链区、和结合区的多肽的结合区结合到的分子。当用于抗体结合的上下文中时包括所提出抗体针对的任何抗原。术语“抗原”和“靶物”关于抗体时可以互换使用，并对本发明任何方面或实施方案构成相同的含义或目的。
本发明中所用的术语“结合”在抗体结合到预定抗原的上下文中通常是结合，当使用抗原作为配体和抗体作为分析物，通过例如表面等离子共振(SPR)技术在BIAcore3000仪器中测定时，结合有对应约10-6M或更小，例如10-7M或更小，如10-8M或更小，如10-9M或更小，约10-10M或更小，或约10-11M或甚至更小的KD的亲和力，并且以对应于与结合到非预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)时其亲和力相比为至多1/10(at leastten-fold lower)，如至多1/100，例如至多1/1000，如至多1/10000，例如至多1/100000的KD的亲和力与预定抗原结合。亲和力较低时的量取决于抗体的KD，这样当抗体的KD非常低(即抗体高度特异)时，则对抗原亲和力相比对非特异性抗原亲和力较低的量可以是至少10000倍。本发明中所用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
本发明的“变体”指相比于“亲本分子”，例如“亲本二聚体蛋白质”如“亲本抗体”包含一个或多个突变的分子，例如二聚体蛋白质。对于抗体变体，示例性的亲本抗体形式包括，不限于，野生型抗体，全长抗体或含Fc的抗体片段，双特异性抗体，人抗体，或其任意组合。示例性的突变包括亲本氨基酸序列中的氨基酸缺失、插入或氨基酸取代。氨基酸取代可将天然氨基酸替换为另一种天然存在的氨基酸，或者非天然存在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守或非保守的。在本发明上下文中，保守取代由下面三个表的一个或多个中反映的氨基酸类型之间的取代所定义：
用于保守替换的氨基酸类别
备选的保守氨基酸残基替换类别
1 A S T
2 D E
3 N Q
4 R K
5 I L M
6 F Y W
备选的氨基酸残基的物理和功能分类
本发明上下文中，变体中的取代表示为：
原氨基酸-位置-取代的氨基酸
根据公认的氨基酸命名法，使用三字母码或单字母码，包括编码Xaa和X来表示氨基酸残基。因此，标记“E345R”或“Glu345Arg”意为，在对应亲本抗体345位置氨基酸的变体氨基酸位置包含以精氨酸取代谷氨酸的取代的变体。当两者如下所示比对时，
当位置本身不存在于抗体中，但变体包含氨基酸插入时，例如：
位置-取代的氨基酸；使用标记，例如“448E”。
这样的标记与同源多肽或抗体系列中的修饰特别相关联。
类似的，当取代氨基酸残基的种类不重要时：
原氨基酸-位置；或“E345”。
对于原氨基酸和/或取代的氨基酸可以包含多于1个，但非全部氨基酸的修饰，位置345处谷氨酸取代为精氨酸、赖氨酸或色氨酸：
“Glu345Arg，Lys，Trp”或“E345R，K，W”或“E345R/K/W”，或“E345至R，K或W”可以在本发明上下文中互换使用。
此外，术语“取代”包括取代为其他19个天然氨基酸的任一个，或取代为其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如，345位置处氨基酸E的取代包括下面取代的每一个：345A，345C，345D，345G，345H，345F，345I，345K，345L，345M，345N，345Q，345R，345S，345T，345V，345W，345P和345Y。顺便说一下，这相当于名称345X，其中X指除初始氨基酸以外的任意氨基酸。这些取代也可以被称为E345A，E345C等，或E345A，C等或E345A/C/等。同样的情况通过类比适用于本发明中涉及的每一个位置，本发明中具体地包括这样取代的任一个。
术语“氨基酸”和“氨基酸残基”可以交换使用。
对“D/E356”的提述在本发明背景中指人IgG1序列中的同种异型变体。在人IgG1的IgG1m(za)同种异型中，位置356处的氨基酸是D，而在人IgG1的IgG1m(f)同种异型中，位置356处的氨基酸是E。
除非另外说明或与上下文冲突，对氨基酸位置编号的提述指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。
“对应于”另一个序列中的氨基酸或片段的一个序列中的氨基酸或片段是(i)使用标准序列比对程序如ALIGN，ClustalW或类似的，通常以默认设置与另一氨基酸或片段比对，和(ii)具有与SEQ ID NO:1至少50％，至少80％，至少90％，或至少95％的序列同一性的，氨基酸或片段。例如可以使用图2和3中所显示的序列比对以鉴定显示的免疫球蛋白Fc序列中对应于IgG1Fc序列中特定氨基酸的任意氨基酸。
为了本发明的目的，可通过两条序列的比对来确定氨基酸序列中某位置处(其对应于另一个参照氨基酸序列中的特定位置)的氨基酸以及两条氨基酸或核苷酸序列之间的同一性程度。在本文中，除非另外指示或与上下文冲突，参照氨基酸序列是人IgG1重链的氨基酸序列。通过Needleman-Wunsch比对(即全局比对)的程序“比对”可用于多肽以及核苷酸序列的比对。默认得分矩阵BLOSUM50或BLOSUM62可被用于多肽比对，而默认同一性矩阵被用于核苷酸比对，缺口的第一个残基罚分对于多肽是-12和对于核苷酸是-16。缺口的其他残基的罚分对于多肽是-2和对于核苷酸是-4。“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),"Improved Tools for Biological SequenceAnalysis",PNAS 85:2444-2448,以及W.R.Pearson(1990)"Rapid and SensitiveSequence Comparaison with FASTP and FASTA",Methods in Enzymology 183:63-98)。FASTA蛋白比对使用Smith-Waterman算法，对缺口大小无限制(见"Smith-Watermanalgorithm",T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biolo.147:195-197)。免疫球蛋白重链的Fc区之间的代表性比对显示于图2和3。
术语“载体”用于本文意图指一种核酸分子，其能够诱导连接到该载体中的核酸区段的转录。一种类型的载体是“质粒”，其是一种环形双链DNA环的形式。另一种类型的载体是病毒载体，其中核酸区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所进入的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体型哺乳动物载体)可以在被引入到宿主细胞内后整合到宿主细胞的基因组中，借此与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与之可操作连接的基因的表达。这类载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般地，在重组DNA技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包含表达载体的这类其它形式，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其发挥同等的功能。
术语“重组细胞”(或简称作“宿主细胞”)用于本文意图指其中引入了表达载体的细胞。应当理解，这类术语意图不仅指特定的受试者细胞，还指这类细胞的后代。因为在连续传代过程中由于突变或环境影响可能发生某些修饰，所以这类后代可能实际上与亲本细胞不相同，但是仍然包含本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括，例如，转染瘤，例如CHO细胞，HEK-293细胞，PER.C6，NS0细胞和淋巴细胞，以及原核细胞如大肠杆菌(E.coli)和其他真核宿主如植物细胞和真菌。
术语“转染瘤”(transtoma)用于本文包括表达Ab或靶抗原的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、PER.C6、NS0细胞、HEK-293细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。
如本文中使用的，术语“效应器细胞”是指如下的免疫细胞，其参与免疫应答的效应器阶段，而不是免疫应答的认知期或活化阶段。例示性免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(如B细胞和T细胞，包括细胞毒性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜曙红细胞、多形核细胞，如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞。一些效应器细胞表达Fc受体(FcR)或补体受体并实施特定的免疫功能。在一些实施方案中，效应器细胞如例如自然杀伤细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞和Kupffer细胞参与特异杀伤靶细胞，和向免疫系统的其它组分呈递抗原或结合呈递抗原的细胞。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体激活可以进一步增强ADCC，从而引起激活的C3片段在靶细胞上的沉积。C3分裂产物是表达在骨髓细胞上的补体受体(CR)如CR3的配体。效应器细胞上CR的补体片段识别可以促进增强的Fc受体介导的ADCC。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体激活导致靶细胞上的C3片段。这些C3分裂产物可以促进直接补体依赖性细胞细胞毒性(CDCC)。在一些实施方案中，效应器细胞可以吞噬靶抗原，靶颗粒或靶细胞。特定FcR或补体受体在效应器细胞上的表达可能受体液因子如细胞因子调节。例如，已经发现FcγRI的表达被干扰素γ(IFNγ)或G-CSF上调。这种增强的表达提高了带有FcγRI的细胞对靶物的细胞毒性活性。效应器细胞可以吞噬靶标抗原或吞噬或裂解靶细胞。在一些实施方案中，抗体驱动的经典补体激活导致靶细胞上的C3片段。这些C3裂解产物可以通过效应器细胞促进直接吞噬或者通过增强抗体介导的吞噬作用间接促进吞噬。
如本文中使用的，术语“效应器功能”指作为二聚体蛋白质如抗体对其靶物如抗原(任选地在细胞上、在细胞膜上、在病毒粒体上、或在另一颗粒上)的结合的结果的功能。效应器功能的例子包括(i)C1q结合，(ii)补体激活，(iii)补体依赖性细胞毒性(CDC)，(iv)寡聚体形成，(v)寡聚体稳定性，(vi)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(vii)FcRn结合，(viii)Fc-γ受体结合，(ix)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，(x)补体依赖性细胞细胞毒性(CDCC)，(xi)补体增强的细胞毒性，(xii)由抗体介导的经调理抗体对补体受体的结合，(xiii)内在化，(xiv)下调，(xv)诱导细胞凋亡，(xvi)调理作用，(xvii)增殖调控，如增殖减少、抑制或刺激，和(xii)(i)至(xvi)的任意组合。
本发明中所用的术语“亲和力(affinity)”是一个分子，例如抗体，与另一个，例如靶标或抗原，在单个位点，如抗体与抗原的个体抗原结合位点的单价结合，的结合强度。
本发明中所用的术语“亲合力(avidity)”是两个结构之间，如同时与靶标相互作用的抗体的多个抗原结合位点之间，或例如抗体与C1q之间的多个结合位点的结合强度。当存在多于一种结合相互作用时，仅当所有结合位点解离时两个结构才会解离，并因此，解离速率将会低于单个结合位点，并由此相比单个结合位点结合的强度(亲和力(affinity))提供了更有效的总结合强度(亲合力(avidity))。
本文中所用的术语“寡聚体”是指，相比至少原则上是由不限数目的单元组成的聚合物，由多于一个但有限数目的特定类型的分子单元(如例如依照本发明的抗体或其他二聚体蛋白质分子)组成的结构。如此，依照本发明的寡聚体由有限数目的依照本发明任意方面或实施方案的二聚体蛋白质组成。示例性的寡聚体是二聚体，三聚体，四聚体，五聚体，六聚体和十二聚体。希腊语前缀经常用于表示寡聚体中的单体单元数目，例如由四个单元组成的四聚体和由六个单元组成的六聚体。类似地，术语“寡聚化”用于本文意图指将分子转化成有限聚合程度的过程。在本文中，观察到依照本发明的抗体和/或其他二聚体蛋白质可经由Fc域的非共价联合在特定pH条件下(如实施例31中描述的)在溶液中，或者在包含靶物结合区的二聚体蛋白质的情况中，在例如于细胞表面处靶物结合后形成寡聚体如六聚体。溶液中的寡聚化可例如如记载于实施例20的进行评估。在一个具体的实施方案中，溶液中的寡聚化可通过实施HP-SEC(高压大小排阻层析)分级来测定，其使用连接于吸光度检测器、孔径能够分离范围为50kDa至1000kDa的分子的适宜的大小排阻层析树脂；以1mL/min在于pH 6.8缓冲的0.1M Na2SO4/0.1M磷酸钠中分离含有1.25μg/mL蛋白质的50μL样品；使用合适的软件来处理结果；并按峰表示为总峰面积的百分数。可评估抗原结合后的抗体寡聚化(例如利用如实施例3,6,和21中记载的补体依赖性细胞毒性)。在一个具体的实施方案中，CDC可通过将浓度为1x 106细胞/mL的悬液细胞在圆底96孔板中与总体积100μL中终浓度为0.0003至30.0μg/mL的抗体在室温在振荡器上预温育15min；以20％、30％或50％的终浓度添加正常人血清；在37℃温育45min；将板置于冰上；添加10μL碘化丙啶；并通过FACS分析测定细胞裂解。
术语“C1q结合”用于本文意指在C1q结合的上下文中，C1q结合到连接了其抗原的抗体上。连接到其抗原的抗体应理解为在本发明所描述的上下文中在体内和体外发生。C1q结合可以，例如通过使用人造表面上固定的抗体(例如，如实施例21所描述的ELISA用塑料板)来评价。在一个具体的实施方案中，C1q结合可通过将96孔ELISA板用PBS中浓度范围为0.007至25.0μg/mL的抗体在4℃过夜包被来测定；清洗板；用0.5x PBS/0.025％Tween 20/0.1％明胶封闭；将板与3％合并的人血清、家兔抗人C1q、猪抗家兔IgG-HRP在37℃温育1h进行连续温育，伴随温育之间的清洗；将板用1mg/mL 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸显色约30min；添加100μL 2％草酸；和在微板读数器中405nm处测量吸光度。C1q对抗体寡聚体的结合在本文中应理解为引起高亲合力结合的多价相互作用。
本发明中所用的术语“补体激活”是指经典补体途径的激活，其是被补体组分C1q与连接了其抗原的抗体的结合所激活。C1q是经典补体级联早期事件中的第一个蛋白，经典补体级联包含最终导致称为C3转化酶的酶活性形成的一系列裂解反应，C3转化酶将补体组分C3裂解为C3b和C3a。C3b与膜上的C5共价结合以形成C5b，其顺次激活补体激活的晚期事件，其中末期补体组分C5b，C6，C7，C8和C9组装成膜攻击复合物(MAC)。补体级联导致孔的形成，由于孔的形成引起细胞裂解，也被称为CDC。补体激活可以通过使用CDC动力学(如实施例14，15和16中所述)，CDC检测(如实施例3和21中所述)，或者通过Beurskens等2012年4月1日vol.188no.7 3532-3541中描述的C3b和C4b细胞沉积方法来评价。
术语“补体依赖性细胞毒性”(“CDC”)用于本文意指抗体介导的补体激活过程，当抗体结合其在细胞或病毒粒体上的靶物时，由于MAC组装所产生的膜中的孔，该过程导致所述细胞或病毒粒体的裂解。CDC可以通过体外测定法，如上文所述的，例如在实施例3和21所述的其中正常人血清被用作补体源的CDC测定法中评价。
术语“抗体依赖性细胞介导细胞毒性”(“ADCC”)用于本文意指通过表达能识别所连接抗体恒定区的Fc受体的细胞，来进行的抗体包被的靶细胞或病毒粒子杀伤机制。ADCC可以使用方法，如实施例21中描述的ADCC检测来确定。在一个具体的实施方案中，ADCC可通过将细胞与浓度范围为0.5至250ng/mL的抗体温育；并使用ADCC生物发光报告物测定试剂盒量化ADCC活性来测定。
术语“抗体依赖性细胞吞噬”(“ADCP”)用于本文意指通过吞噬细胞内化来进行的抗体包被的靶细胞或病毒粒子消除机制。内化的抗体包被的靶细胞或病毒粒子被包含在称为吞噬体的囊泡中，其随后与一个或多个溶酶体融合，以形成吞噬溶酶体。ADCP可以通过使用van Bij等Journal of Hepatology Volume 53,Issue 4,2010年10月,677-685页中描述的，使用巨噬细胞作为效应细胞和视觉显微术的体外细胞毒性检测，或者实施例24中所述的例如通过PMN的金黄色葡萄球菌吞噬来评价。
术语“补体依赖性细胞细胞毒性”(“CDCC”)用于本文意指通过表达能识别补体3(C3)裂解产物的补体受体的细胞，来进行的靶细胞或病毒粒子杀伤机制，其中作为抗体介导补体激活的结果，补体3(C3)裂解产物共价连接到靶细胞或病毒粒子上。CDCC可以用与对ADCC所描述的类似的方式来评价，但是是在补体C5消耗的正常人血清存在的情况下。
如本文所用的术语“下调”意指例如通过抗体与受体的结合来减少分子，如细胞表面的抗原或受体数目的过程。
术语“内化”用于本文意指本发明的二聚体蛋白质例如抗体或含Fc的多肽被从细胞表面和/或从周围介质中，例如通过内吞，内化入靶标表达细胞中的任何机制。抗体的内化可以使用测量内化抗体量的直接检测法(如，例如实施例12中所述的溶酶体共定位检测)来评价。
术语“程序化细胞死亡”或“PCD”用于本文指由胞内信号传导介导的任意形式的细胞死亡。发现3种形式的PCD；细胞凋亡、自体吞噬和坏死/胀死(oncosis)。在一个具体的实施方案中，可通过以下测定3种形式的程序化细胞死亡中的任一种：将1.0×105细胞在96孔U形底板中在存在浓度范围为0.0025至10μg/mL的抗体的情况下培养24小时；使用合适的膜联蛋白结合测定试剂盒依照制造商说明书将死亡细胞用膜联蛋白V-FITC染色；和通过FACS分析测定膜联蛋白V-FITC阳性细胞的量。
术语“凋亡”用于本文指研究最多的程序化细胞死亡类型，原因是其在发育和内稳态中，以及在不同疾病(如癌症)的发病机制中的重要性。凋亡的细胞应答多种外在或内在信号(例如肿瘤坏死因子(TNF)受体、DNA损伤、线粒体途径)以受控方式死亡。生化事件导致特征性的细胞变化(形态学)和死亡。凋亡细胞死亡的特点包括起泡(blebbing)、在质膜的胞外面上暴露磷脂酰丝氨酸、半胱天冬酶的激活、线粒体膜位势的破坏、细胞收缩、染色质缩合、DNA片段化和DNA缩合。抗体对特定受体的结合可能诱导细胞凋亡。
术语“自体吞噬”用于本文指胞内分子或结构，如错误折叠的蛋白质和受损的细胞器的选择性降解，而且是一种重要的内稳态功能。自体吞噬协同泛素-蛋白酶体系统(UPS)进行以降解泛素化的聚集/错误折叠的蛋白质，将其标记用于通过自体吞噬降解。将泛素化的货物运载到吞噬泡(phagophore)并环绕其货物形成双层膜囊泡，即自体吞噬体。溶酶体融合至自体吞噬体且货物在自体溶酶体内降解。
术语“坏死”或“胀死”用于本文指由细胞膨胀以及质膜和亚细胞细胞器的破坏、没有核片段化和缩合所表征的不受控的细胞死亡。坏死细胞死亡被视为包括程序化和意外细胞死亡两者在内的异质现象。
术语“增殖”用于本文指作为细胞生长和细胞分裂结果的细胞数目的增加。
术语“抗体-药物缀合物”用于本文是指具有对至少一类型恶性细胞特异性的本发明的二聚体蛋白质例如抗体或含Fc的多肽，药物，和将药物连接到例如抗体上的连接物。在恶性细胞存在时连接物是可裂解或不可裂解的；其中抗体-药物缀合物杀伤恶性细胞。
本发明中所用的术语“抗体-药物缀合物摄取”是指抗体-药物缀合物被连接到细胞的靶标上，后被细胞膜摄取/吞入，并由此吸入细胞的过程。如WO 2011/157741所述抗体-药物缀合物摄取可以被评价为“抗体介导的内化和体外杀伤检测中抗TF ADC的细胞杀伤”。
如本文中所用的术语“FcRn”意指为Fc受体的新生Fc受体。其首先在啮齿类动物中被发现，为能够将IgG从母乳中通过新生啮齿动物肠道上皮细胞输送到新生动物血流中的独特受体。进一步的研究揭示了了人中的类似受体。然而，在人中，其被发现在胎盘中以帮助促进母体IgG向生长的胎儿中输送，其也已经显示在检测IgG周转中发挥作用。FcRn在6.0-6.5的pH，但不在中性或更高的pH结合IgG。因此，FcRn可以从微酸性pH的肠腔(肠的内部)中结合IgG，并确保向pH中性到碱性(pH7.0-7.5)的基底侧有效单向输送。该受体在IgG成人救助中也通过其在内皮细胞内吞途径中的发生起作用。酸性内涵体中的FcRn受体结合通过胞饮作用内化的IgG，将其再循环到细胞表面，将其释放到碱性pH的血液中，由此防止其经历溶酶体降解。该机制也对血液中相比其他同种型较高的IgG半衰期提供了解释。
如本文中所用的术语“蛋白A”意指最初在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的细胞壁上发现的56kDa MSCRAMM表面蛋白。其由spa基因编码，而其调节受DNA拓扑结构，细胞渗透压，和称为ArlS-ArlR的双组分系统控制。由于其结合免疫球蛋白的能力，也已发现了其在生物化学研究中的用途。其由折叠入三螺旋束中的5个同源Ig结合域组成。每个域能结合来自许多哺乳动物种类的蛋白，最显著的是IgGs。其结合大多数免疫球蛋白的重链Fc区(重叠FcRn受体的保守结合位点)，并也与人VH3家族的Fab区域相互作用。通过血清中的这些相互作用，IgG分子通过其Fc区而不是单纯通过其Fab区域结合细菌，由此细菌破坏调理，补体激活和吞噬作用。
本发明中所用的术语“蛋白G”意指在组C和G链球菌细菌中表达的免疫球蛋白结合蛋白，其很类似蛋白A但有不同的特异性。其是65kDa(G148蛋白G)和58kDa(C40蛋白G)细胞表面蛋白，并已经发现其通过其结合到Fc区在纯化抗体中的应用。
二聚体蛋白质
本发明在一个方面涉及一种二聚体蛋白质，包含第一和第二多肽，每种多肽至少包含免疫球蛋白重链的CH2和CH3区，其中在所述第一和/或第二多肽中：
在对应于人IgG1重链中E345和E430的位置处的氨基酸不是E；且
在选自由S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y,K,R或W；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。每个位置S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254对应于人IgG1重链中的位置。
在一个实施方案中，在所述第一和第二多肽的每一个中：
在对应于人IgG1重链中E345和E430的位置处的氨基酸不是E；且
在选自由S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y,K,R或W；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。每个位置S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254对应于人IgG1重链中的位置。
依照本发明的二聚体蛋白质的第一和第二多肽通过形成共价或非共价相互作用二聚化。这类相互作用可见于多肽的任意区域。共价相互作用的例子是任意CxxC肽相互作用，其中“x”代表任意氨基酸且“C”代表半胱氨酸残基。另一个例子是TCRalpha链恒定域和TCRbeta链恒定域。非共价相互作用的例子可以是亮氨酸拉链，如记载于Moll et al,Prot.Science,2001,10:649-655的。在一个实施方案中，所述第一和/或第二多肽还可包含能在所述第一和第二多肽之间共价结合的区域。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二多肽还包含铰链区。
对于本发明的特定目的而言，铰链区的一部分如对应于226-230的氨基酸位置即是充足的。如此，在一个实施方案中，所述第一和/或第二多肽还可包含在对应于人IgG1重链中位置226-230的位置处的氨基酸。
在一个实施方案中，在所述第一和第二多肽中，在对应于人IgG1重链中E345和E430的位置处的氨基酸不是E，且在选自由S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y或W；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。
在一个实施方案中，在所述第一和第二多肽中，在对应于人IgG1重链中E345和E430的位置处的氨基酸不是E，且在选自由S440,Y436,E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y,K,R或W；不是Y；不是E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。
如此，本发明的一个实施方案涉及一种二聚体蛋白质，包含第一和第二多肽，每种多肽至少包含免疫球蛋白重链的CH2,CH3和铰链区，其中：
在对应于人IgG1重链中E345和E430的位置处的氨基酸不是E；且
在选自由S440,Y436,E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y或W；不是Y；不是E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。
在一个实施方案中，第一和第二多肽经由铰链区二硫键互连。
除非另外说明或与上下文冲突，提及的氨基酸位置在本发明任意方面或实施方案中指人IgG1重链中的氨基酸位置。
此外，除非另外说明或与上下文冲突，氨基酸编号依照如Kabat中所述的Eu编号，如上文描述的。
所述二聚体蛋白质可通过在对应于人IgG1重链中E345和E430的位置和至少一个选自下组的位置引入突变从亲本二聚体蛋白质制备，由此视为变体二聚体蛋白质：对应于人IgG1重链的S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254，其中在对应于S440的位置处引入的氨基酸是Y,K,R或W。在其他氨基酸位置处可引入任意氨基酸，例如任何天然存在的氨基酸。
在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E345的位置处的氨基酸选自(例如分别选自)下组：R,Q,N,K,Y,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V和W，如选自下组：R,Q,N,K和Y。
在再一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E345的位置处的氨基酸选自(例如分别选自)下组：R,Q,K和Y。
在再一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E345的位置处的氨基酸是R。
在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E430的位置处的氨基酸选自(例如分别选自)下组：G,T,S,F,H,A,C,D,I,K,L,M,N,P,Q,R,V,W和Y，如选自下组：G,T,S,F和H。
在再一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E430的位置处的氨基酸选自(例如分别选自)下组：G,T,S和F。
在再一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E430的位置处的氨基酸是G。
在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于S440的位置处的氨基酸选自(例如分别选自)下组：Y或W。
在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于S440的位置处的氨基酸是W。
在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于S440的位置处的氨基酸是Y。
在一个实施方案中，其中在二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)中，在选自由Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的位置处的氨基酸对于每个位置分别为：
(a)I,N,Q,S,T,R,A,E,F,H,K,L,M或V,如I,N,Q或S；
(b)R,G,T,I,L,M,K,H,S,V,Y,Q,N,W,F,A,或C；
(c)R；
(d)V,L,M,D,Q,K,R,N,H,S,T,W或Y,如V,L或M；
(e)W,H,K,Q,R,D,E,S,T,或Y,如W,H,K,Q或R；
(f)N,S,T,A,E,G,H,K,Q,R,W或Y,如N,S或T；
(g)V,L,N,Q,E,S或T,如V,L,N或Q；
(h)L,G,I或V。
在对应于人IgG1重链的E345和E430位置处，和在对应于选自由S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的位置处的氨基酸在一个实施方案中在第一和第二多肽中可以是相同的；或者它们可以不同。在所述位置处的氨基酸可以是不同的，例如如果所述二聚体蛋白质是异二聚体蛋白质，如本文中描述的双特异性抗体。
对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸可以为以下非限制性例子之一：
在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽之一或两者(如每个)，在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,G和Y。
在一个备选的实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽，在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为K,G,和Y。
在一个备选的实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽，在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,S,和Y。
在一个备选的实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽，在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,G,和W。
在一个备选的实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽，在对应于E345,E430和Y436的位置处的氨基酸分别为R,G,和I。
在一个备选的实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽，在对应于E345,E430,Y436和S440的位置处的氨基酸分别为R,G,I,和K。
在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽，在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,G,和K。
如本文中描述的，本发明涉及在三个位置处包含不同于中人IgG1重链CH2/CH3区中天然存在的氨基酸的氨基酸的二聚体蛋白质等。
在一个实施方案中，二聚体蛋白质的所述第一和第二多肽经由铰链区二硫键交互连接。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白重链的同种型选自下组：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgD,IgE和IgM。第一和第二多肽的同种型可以不同，但在一个具体的实施方案中，它们是相同的。在一个实施方案中，第一和第二多肽的同种型不同，如所述第一多肽的同种型可以是IgG1免疫球蛋白重链，而所述第二多肽的同种型可以是IgG4免疫球蛋白重链。该例子不应理解为限制性的，如此其他同种型的组合被视为包括在本发明中。
本文中描述为对应于人IgG1重链中的氨基酸位置的任何氨基酸位置，或氨基酸位置中的突变都可以被鉴定出来，或者引入其在IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE,IgD和IgM中的等同位置处(如通过图2中的比对限定的)以获得依照本发明的二聚体蛋白质。
在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白重链的同种型选自下组：IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4,如IgG1。
在另一个实施方案中，免疫球蛋白重链的同种型选自下组：IgA1和IgA2。
在另一个实施方案中，免疫球蛋白重链的同种型选自下组：IgE,IgD和IgM。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白重链是哺乳动物起源的。
在一个实施方案中，所述免疫球蛋白重链是灵长类或鼠起源的，如人起源的。
在一个实施方案中，二聚体蛋白质的至少一种多肽包含特异性结合靶物的结合区。
在再一个实施方案中，第一和第二多肽两者均包含特异性结合靶物的结合区如抗原结合区。第一和第二多肽的结合区如抗原结合区可以结合相同靶物，任选地结合相同靶物的不同表位，或者它们可以结合不同靶物。
所述第一和/或第二多肽的结合区可以是抗原结合区。
所述结合区可以结合任意靶物，其中所述靶物可以例如是存在于细胞、细菌、寄生物或病毒粒体上的分子。
在一个具体的实施方案中，所述靶物可以是抗原。
在一个进一步的实施方案中，所述抗原可以在细胞如人肿瘤细胞的表面上表达。
在一个实施方案中，所述抗原与细胞膜联合。
在另一个实施方案中，所述抗原与病毒粒体联合，任选地其中所述抗原包含在病毒粒体的蛋白外壳或脂质包膜中。
在再一个实施方案中，结合区结合的靶物可以是在细菌细胞或病毒粒体的表面上表达的抗原。
在另一个实施方案中，所述细菌细胞选自下组：金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、耶尔森氏菌(Yersinia)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
靶物或抗原的例子包括但不限于：5T4；ADAM-10；ADAM-12；ADAM17；AFP；alpha/beta T细胞受体(TCR)；AXL；ANGPT2炭疽抗原；抗药物抗体(ADA)BSG；CAIX；CAXII；CA 72-4；癌相关抗原CTAA16.88；CCL11；CCL2；CCR4；CCR5；CCR6；CD2；CD3E；CD4；CD5；CD6；CD15；CD18；CD19；CD20；CD22；CD24；CD25；CD29；CD30；CD32B；CD33；CD37；CD38；CD40；CD40LG；CD44；CD47；CD52；CD55SC1；CD56；CD66E；CD72；CD74；CD79a；CD79b；CD80；CD86；CD98；CD137；CD147；CD138；CD168；CD200；CD248；CD254；CD257；CDH3；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CEACAM8；Claudin4；CS-1；CSF2RA；CSPG-4；CTLA4；CRF-1；Cripto；DLL4；Death受体4；Death受体5；ED-B；EFNA2；EGFR；Endothelin B受体；ENPP3；EPCAM；ERBB2；ERBB3；FAP alpha；FAS(aka APO-1,CD95)；Fc gamma RI；FCER2；FGFR3；血纤蛋白II beta链；FLT1；FOLH1；FOLR1；FRP-1；G-28糖脂；GD1a；GD-2；GM-1；GD3神经节苷脂；GM3；GDF2；GLP1R；Glypican-3；GPNMB；GRP78；流感嗜血杆菌；HBV(乙肝病毒)；HCMV(人巨细胞病毒)；热休克蛋白90同源物[白色念珠菌]；单纯疱疹病毒的gD糖蛋白；HGF；HIV-1；HIV-1IIIB gp120V3loop；HLA-DRB(HLA-DR beta)；人抗人抗体(HAHA)；人抗鼠抗体(HAMA)；人类呼吸道合胞病毒；糖蛋白F；ICAM1；IFNA1；IFNA1；IFNB1双特异性；IgE,IgE Fc；IGF1R；IGHE连接区；IL12B；IL13；IL15；IL17A；IL1A；IL1B；IL2RA；IL4；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL9；白细胞介素2受体β亚基；ITGA2；ITGA2B ITGB3；ITGA4ITGB7；ITGA5；ITGAL；ITGAV_ITGB3；ITGB2；KDR；L1CAM；Lewis-x；Lewis-y；脂质A，脂多糖LPS域；LTA；脂质A；甘露聚糖(白色念珠菌)；MET；微生物蛋白酶如金黄色葡萄球菌gluV8和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)IdeS；MMP14；MMp15；MST1R；MSTN；MUC1；MUC4；MUC16；MUC5AC；髓磷脂；NCA-90粒细胞细胞抗原；Nectin 4；Neisseria meningitides,NGF；不含POU域的八聚体结合蛋白(NONO)；NRP；NY-ESO-1；O-多糖；OX40L；PLAC-1；PLGF；PDGFRA；PD1；PDL1；PSCA；磷脂酰丝氨酸；PTK-7；铜绿假单胞菌血清型IATS O11；RSV(人类呼吸道合胞病毒，糖蛋白F)；ROR1；RTN4；SELL；SELP；STEAP1；志贺样毒素II B亚基[大肠杆菌]；SLAM7；SLC44A4；SOST；表皮葡萄球菌的脂磷壁酸；肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)；TAF-15；T细胞受体alpha_beta；组织因子(TF)；TGFB1；TGFB2；TMEFF2；TNC；TNF；TNFRSF10A；TNFRSF10B；TNFRSF12A；TNFSF13；TNFSF14；TNFSF2；TNFSF7；TRAILR2；TROP2；TYRP1；VAP-1；波形蛋白；erbB1(EGFR)；erbB2(HER2)；erbB3；erbB4；MUC-1；CXCR5；c-Met；HERV-包膜蛋白；骨膜蛋白(periostin)；Bigh3；SPARC；BCR；和MRP3。
在再一个实施方案中，所述抗原可以选自CD20,EGFr和CD38，任选地本发明的二聚体蛋白质可以选自如本文中描述的7D8,2F8,003和005，其包含如由本发明限定的氨基酸位置。如此，7D8,2F8,003,和005可以用作依照本发明的亲本二聚体蛋白质。
在一个实施方案中，所述二聚体蛋白质的至少一个多肽包含免疫球蛋白重链可变区。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质是抗体。
在再一个实施方案中，其中所述二聚体蛋白质是抗体，第一和第二多肽之一或两者(如每个)包含免疫球蛋白重链和轻链可变区以形成第一和第二抗原结合区，任选地结合相同抗原。
在另一个实施方案中，其中所述二聚体蛋白质是抗体，第一和第二多肽之一或两者(如每个)包含免疫球蛋白重链，其与包含轻链可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链序列联合以形成第一和第二抗原结合区，任选地结合相同抗原。在这类实施方案中，理解包含免疫球蛋白重链可变区和恒定区的所述第一和第二多肽与包含轻链可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链序列通过所述重链和所述轻链的恒定域之间的链间二硫键联合，由此形成第一和第二抗原结合区，任选地结合相同抗原。
在再一个实施方案中，其中所述二聚体蛋白质是抗体，一个或两个多肽包含全长重链恒定区，如全长人IgG1重链恒定区。
除了本发明限定的氨基酸位置以外，所述第一和/或第二多肽的CH2和CH3区可分别包含SEQ ID NO:1的氨基酸114-223和224-330；分别包含SEQ ID NO:2的氨基酸111-219和220-326；分别包含SEQ ID NO:3的氨基酸161-270和271-377；分别包含SEQ ID NO:4的氨基酸111-220和221-327,；或分别包含SEQ ID NO:5的氨基酸114-223和224-330。
所述第一和/或第二多肽还可以包含铰链区，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:1的氨基酸99-113；SEQ ID NO:2的氨基酸99-110；SEQ ID NO:3的氨基酸99-160；SEQ ID NO:4的氨基酸99-110；或SEQ ID NO:5的氨基酸99-113。
除了本发明限定的氨基酸位置以外，所述第一和/或第二多肽还可包含根据SEQID NOs:1,2,3,4,和5中任一个的序列。
在如上文所述的一个具体的实施方案中，本发明的二聚体蛋白质可以是抗体。此外，所述二聚体蛋白质(例如抗体)还可以通过将突变引入亲本二聚体蛋白质(例如亲本抗体)中对应于人IgG1重链E345和E430的位置处的氨基酸中和选自下组的至少一个位置处的氨基酸中来制备：S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254。如此，抗体的例子可以指“本发明的抗体”或“本发明的变体抗体”和“亲本抗体”。
适宜抗体的例子包括但不限于单价抗体重链抗体，其仅由两条重链组成并在例如骆驼中天然存在(例如Hamers-Casterman(1993)Nature 363:446)；ThioMabs(Roche,WO2011069104)，链交换工程域(SEED或Seed体)，其是不对称的和双特异性的抗体样分子(Merck,WO2007110205)；Triomab(Fresenius,Lindhofer等(1995J Immunol 155:219)；FcΔAdp(Regeneron,WO2010151792),Azymetric Scaffold(Zymeworks/Merck,WO2012/058768),mAb-Fv(Xencor,WO2011/028952),双可变域免疫球蛋白(Abbott,DVD-Ig，美国专利No.7,612,181)；双域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis,WO20100226923)，二双抗体(ImClone/Eli Lilly)，钮-入-孔(knob-into-holes)抗体形式(Genentech,WO9850431)；DuoBody(Genmab,WO 2011/131746)；静电驾驭抗体形式(Amgen,EP1870459和WO2009089004；Chugai,US201000155133；Oncomed,WO2010129304A2)；双特异性IgG1和IgG2(Rinat neurosciences Corporation,WO11143545),CrossMAbs(Roche,WO2011117329),LUZ-Y(Genentech),Biclonic(Merus),双靶向域抗体(GSK/Domantis),识别两个靶物的二合一抗体(Genentech,NovImmune),交联Mabs(Karmanos Cancer Center),CovX体(CovX/Pfizer),IgG样双特异性(ImClone/Eli Lilly,Shen,J.,等J Immunol Methods,2007.318(1-2):p.65-74)，和DIG体和PIG体(Pharmabcine),以及双亲和性再靶向分子(Macrogenics的Fc-DART或Ig-DART，WO/2008/157379,WO/2010/080538),Zybodies(Zyngenia),普通轻链(Crucell/Merus，US7262028)或普通重链(Novlmmune的κλ体)的方法，以及融合蛋白，其包含多肽序列，所述多肽序列融合于含Fc域的抗体片段，像scFv融合体，像ZymoGenetics/BMS的BsAb),Biogen Idec的HERCULES(US007951918),Emergent BioSolutions/Trubion的SCORPIONS，Ts2Ab(MedImmune/AZ(Dimasi,N.,等J Mol Biol,2009.393(3):p.672-92),Novartis的scFv融合体，Changzhou Adam Biotech Inc的scFv融合体(CN 102250246),Roche的TvAb(WO 2012025525,WO 2012025530),f-Star的mAb2(WO2008/003116)和双scFv-融合体，微型抗体和双靶向性(DT)-Ig抗体。还应当理解，术语抗体，除另有指明外，也包括多克隆抗体、单克隆抗体(如人单克隆抗体)、抗体混合物(重组多克隆)例如，通过Symphogen和Merus(Oligoclonics)开发的技术生成的，和抗体样多肽，如嵌合抗体和人源化抗体。生成的抗体可潜在地具有任何同种型。
本发明的亲本抗体或抗体可从野生型抗体或非天然存在的抗体形式(如本文描述的那些的任一种)，例如异二聚体蛋白质制备，其被用作起始材料以引入依照本发明的相关修饰。本发明的抗体可以例如通过Kohler等,Nature256,495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或通过重组DNA方法产生。使用描述于例如Clackson等,Nature 352,624 628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222,581 597(1991)的技术，也可以从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。单克隆抗体可以获自任意合适的来源。因此，例如，单克隆抗体可以获自从鼠脾B细胞制备的杂交瘤，所述鼠脾B细胞获自用感兴趣的抗原免疫的小鼠，所述感兴趣的抗原例如采用以下形式：在表面表达抗原的细胞，或编码感兴趣抗原的核酸。单克隆抗体也可以获自来源于免疫的人或非人哺乳动物(例如兔，大鼠，狗，灵长类动物，等等)的抗体表达细胞的杂交瘤。
抗体可以是例如嵌合或人源化抗体。在另一个实施方案中，抗体是人抗体。可以利用转基因或转染色体小鼠(例如HuMAb小鼠，携带部分人免疫系统而不是小鼠系统)来产生人单克隆抗体。HuMAb小鼠包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小位点(minilocus)，以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(Lonberg,N.等,Nature 368,856859(1994))。因此，小鼠显示降低的小鼠IgM或κ表达，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因，经历类型转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG,K单克隆抗体(Lonberg,N.等(1994),上文；综述于Lonberg,N.Handbook of ExperimentalPharmacology 113,49 101(1994),Lonberg,N.和Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.Vol.1365 93(1995)以及Harding,F.和Lonberg,N.Ann.N.Y.Acad.Sci 764 536 546(1995))。HuMAb小鼠的制备详述于Taylor,L.等,Nucleic Acids Research 20,6287 6295(1992),Chen,J.等,International Immunology 5,647 656(1993),Tuaillon等,J.Immunol.152,2912 2920(1994),Taylor,L.等,International Immunology 6,579 591(1994),Fishwild,D.等,Nature Biotechnology 14,845 851(1996)。还可参见US 5,545,806,US5,569,825,US 5,625,126,US 5,633,425,US 5,789,650,US 5,877,397,US 5,661,016,US5,814,318,US 5,874,299,US 5,770,429,US 5,545,807,WO 98/24884,WO 94/25585,WO93/1227,WO 92/22645,WO 92/03918和WO 01/09187。根据公知技术，可以使用来自这些转基因小鼠的脾细胞产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。
此外，本发明的人抗体或本发明来自其他种属的抗体可以通过展示类技术来鉴定，包括，但不限于，噬菌体展示，逆转录病毒展示，核糖体展示，哺乳动物展示，酵母展示和本领域已知的其他技术，并且所获分子可以进行附加的成熟，例如亲和力成熟，因为这类技术是本领域公知的。
抗体不限于具有天然的例如人Fc域的抗体，但是它还可以是具有除本发明那些之外的其他突变的抗体，例如例如影响糖基化、C1q结合、Fc受体结合或使抗体成为双特异性抗体的突变。术语“自然抗体”表示不包括任何遗传导入突变的任意抗体。包括天然发生的变异(例如不同的同种异型)的抗体因此就本发明来说被理解为“天然抗体”。这种抗体可以充当模板或起始材料(例如亲本抗体)用于引入根据本发明的突变，从而提供本发明的抗体。包括除本发明那些之外的其他突变的抗体的实例是描述于WO2011/131746(Genmab)的双特异性抗体，利用还原条件以促进包括IgG4样匹配的CH3区域的两种抗体的半分子替换，从而形成双特异性抗体而无聚集体的伴发形成。抗体的其他实例包括但不限于双特异性抗体例如异二聚体双特异性∶Triomabs(Fresenius)；双特异性IgG1和IgG2(RinatNeurosciences Corporation)；Fc△Adp(Regeneron)；钮-入-孔(Genentech)；静电驾驭(Amgen,Chugai,Oncomed)；SEED体(Merck)；Azymetric scaffold(Zymeworks)；mAb-Fv(Xencor)；和LUZ-Y(Genentch)。其他示例性抗体形式包括，但不限于，野生型抗体，全长抗体或包含Fc的抗体片段，人抗体，或其任意组合。
用于本发明的单克隆抗体可以例如通过Kohler等,Nature 256,495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或通过重组DNA方法产生。使用描述于例如Clackson等,Nature 352,624 628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222,581 597(1991)的技术，也可以从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。单克隆抗体可以获自任意合适的来源。因此，例如，单克隆抗体可以获自从鼠脾B细胞制备的杂交瘤，所述鼠脾B细胞获自用感兴趣的抗原免疫的小鼠，所述感兴趣的抗原例如采用以下形式：在表面表达抗原的细胞，或编码感兴趣抗原的核酸。单克隆抗体也可以获自来源于免疫的人或非人哺乳动物(例如兔，大鼠，狗，灵长类动物，等等)的抗体表达细胞的杂交瘤。
在一个实施方案中，抗体是人抗体。可以利用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生针对任意抗原的人单克隆抗体。这种转基因和转染色体小鼠分别包括在本发明中被称为小鼠和KM小鼠的小鼠，在本发明中统称为“转基因小鼠”。
小鼠包含编码未重排人重链(μ和γ)和κ免疫球蛋白轻链序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(Lonberg,N.等,Nature368,856-859(1994))。因此，小鼠显示小鼠IgM或κ表达的降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因，经历类型转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG,κ单克隆抗体(Lonberg,N.等(1994),上文；综述于Lonberg,N.Handbook of ExperimentalPharmacology 113,49-101(1994),Lonberg,N.和Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93(1995)以及Harding,F.和Lonberg,N.Ann.N.Y.Acad.Sci 764 536-546(1995))。小鼠的制备详细描述于Taylor,L.等,Nucleic Acids Research 20,6287-6295(1992),Chen,J.等,International Immunology 5,647-656(1993),Tuaillon等,J.Immunol.152,2912-2920(1994),Taylor,L.等,International Immunology 6,579-591(1994),Fishwild,D.等,Nature Biotechnology 14,845-851(1996)。还可参见US 5,545,806,US 5,569,825,US 5,625,126,US 5,633,425,US 5,789,650,US 5,877,397,US 5,661,016,US 5,814,318,US 5,874,299,US 5,770,429,US 5,545,807,WO 98/24884,WO94/25585,WO 93/1227,WO 92/22645,WO 92/03918和WO 01/09187。
HCo7、Hco12、Hco17和HCo20小鼠在其内源轻链(κ)基因具有JKD破坏(描述于Chen等,EMBO J.12,821-830(1993))，在其内源重链基因(描述于WO 01/14424的实施例1)和KCo5人κ轻链转基因(描述于Fishwild等,Nature Biotechnology 14,845-851(1996))具有CMD破坏。此外，Hco7小鼠具有HCo7人重链转基因(描述于US 5,770,429)，HCo12小鼠具有HCo12人重链转基因(描述于WO 01/14424的实施例2)，HCo17小鼠具有HCo17人重链转基因(描述于WO 01/09187的实施例2)和HCo20小鼠具有HCo20人重链转基因。所获小鼠在纯合的用于破坏内源小鼠重链和κ轻链基因座的背景下表达人免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。
在KM小鼠品系中，如Chen等,EMBO J.12,811-820(1993)所描述，内源小鼠κ轻链基因已经被纯合破坏，并且如WO 01/09187的实施例1所描述，内源小鼠重链基因已经被纯合破坏。如Fishwild等,Nature Biotechnology 14,845-851(1996)所描述，这种小鼠品系携带有人κ轻链转基因KCo5。如WO 02/4347814所描述，这种小鼠品系还携带由14号染色体片段hCF(SC20)组成的人重链转染色体。如WO/2009/097006所述，通过将HCo12与KCo5[J/K](Balb)杂交，产生HCo12-Balb/C小鼠。根据公知技术，可以使用来自这些转基因小鼠的脾细胞产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。
此外，利用本领域公知的技术，通过展示类技术(包括但不限于，噬菌体展示，逆转录病毒展示，核糖体展示和其他技术)鉴定，可以从人抗体或其他种属的抗体获得本发明的任意抗原结合区，并且所获分子可以经历附加的成熟，例如亲和力成熟，这类技术是本领域公知的(参见例如Hoogenboom等,J.Mol.Biol.227,381(1991)(噬菌体展示),Vaughan等,Nature Biotech 14,309(1996)(噬菌体展示),Hanes和Plucthau,PNAS USA 94,4937-4942(1997)(核糖体展示),Parmley和Smith,Gene 73,305-318(1988)(噬菌体展示),ScottTIBS 17,241-245(1992),Cwirla等,PNAS USA 87,6378-6382(1990),Russel等,Nucl.Acids Research 21,1081-1085(1993),Hogenboom等,Immunol.Reviews 130,43-68(1992),Chiswell和McCafferty TIBTECH 10,80-84(1992),和US 5,733,743)。如果展示技术用于产生非人抗体，则这种抗体可以被人源化。
本发明的二聚体蛋白质(例如抗体)可包含人IgG1重链，该人IgG1重链除了本文中描述的突变外包含SEQ ID NO:1(UniProt登录号P01857)的序列，如包含对应于人IgG1重链恒定区的划线残基136至330(例如130至330)的相关区段I253至K447(例如P247至K447)；SEQ ID NO:1：
1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv
51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep
101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs
151 hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk
201 eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsrde ltknqvsltc
251 lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw
301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
上文提述的IgG1的同种异型是IgG1m(za)。SEQ ID NO:1中的CH1域,铰链区,CH2域和CH3域分别针对本发明的氨基酸1-98,99-113,114-223和224-330。当依照如Kabat所列的Eu编号系统来编号时，CH1域,铰链区,CH2域和CH3域分别被编号为氨基酸118-215,216-230,231-340,和340-447。
本发明的二聚体蛋白质(例如抗体)可包含人IgG2重链，该人IgG2重链除了本文中描述的突变外包含SEQ ID NO:2的序列。IgG1重链的氨基酸残基I253至K447(例如P247至K447)对应于IgG2重链恒定区(登录号P01859；SEQ ID NO:2)的划线残基132至326(例如126至326)
1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv
51 htfpavlqss glyslssvvt vpssnfgtqt ytcnvdhkps ntkvdktver
101 kccvecppcp appvagpsvf lfppkpkdtl misrtpevtc vvvdvshedp
151 evqfnwyvdg vevhnaktkp reeqfnstfr vvsvltvvhq dwlngkeykc
201 kvsnkglpap iektisktkg qprepqvytl ppsreemtkn qvsltclvkg
251 fypsdiavew esngqpenny kttppmldsd gsfflysklt vdksrwqqgn
301 vfscsvmhea lhnhytqksl slspgk
SEQ ID NO:2中的CH1域,铰链区,CH2域,和CH3域分别针对本发明的氨基酸1-98,99-110,111-219和220-326。
本发明的二聚体蛋白质(例如抗体)可包含人IgG3重链，该人IgG3重链除了本文中描述的突变外包含SEQ ID NO:3的序列。IgG1重链的氨基酸残基I253至K447(例如P247至K447)对应于IgG3重链恒定区(UniProt登录号P01860,SEQ ID NO:3)的如下划线残基183至377(例如177至377)：
1 astkgpsvfp lapcsrstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv
51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt ytcnvnhkps ntkvdkrvel
101 ktplgdttht cprcpepksc dtpppcprcp epkscdtppp cprcpepksc
151 dtpppcprcp apellggpsv flfppkpkdt lmisrtpevt cvvvdvshed
201 pevqfkwyvd gvevhnaktk preeqynstf rvvsvltvlh qdwlngkeyk
251 ckvsnkalpa piektisktk gqprepqvyt lppsreemtk nqvsltclvk
301 gfypsdiave wessgqpenn ynttppmlds dgsfflyskl tvdksrwqqg
351 nifscsvmhe alhnrftqks lslspgk
SEQ ID NO:3中的CH1域,铰链区,CH2域,和CH3域分别针对本发明的氨基酸1-98,99-160,161-270和271-377。
本发明的二聚体蛋白质(例如抗体)可包含人IgG4重链，该人IgG4重链除了本文中描述的突变外包含SEQ ID NO:4的序列。IgG1重链的氨基酸残基I253至K447(例如P247至K447)对应于IgG4重链恒定区(登录号P01859,SEQ ID NO:4)的划线残基133至327(例如127至327)：
1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv
51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtkt ytcnvdhkps ntkvdkrves
101 kygppcpscp apeflggpsv flfppkpkdt lmisrtpevt cvvvdvsqed
151 pevqfnwyvd gvevhnaktk preeqfnsty rvvsvltvlh qdwlngkeyk
201 ckvsnkglps siektiskak gqprepqvyt lppsqeemtk nqvsltclvk
251 gfypsdiave wesngqpenn ykttppvlds dgsfflysrl tvdksrwqeg
301 nvfscsvmhe alhnhytqks lslslgk
SEQ ID NO:4中的CH1域,铰链区,CH2域,和CH3域分别针对本发明的氨基酸1-98,99-110,111-220和221-327。
本发明的二聚体蛋白质(例如抗体)还可包含人IgG1m(f)同种异型重链，该人IgG1m(f)同种异型重链除了本文中描述的突变外包含SEQ ID NO:5的序列。人IgG1m(f)同种异型重链的氨基酸残基I253至K447对应于SEQ ID NO:5的划线残基136-330：
1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv
51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep
101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs
151 hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk
201 eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree mtknqvsltc
251 lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw
301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
SEQ ID NO:5中的CH1域,铰链区,CH2域,和CH3域分别针对本发明的氨基酸1-98,99-113,114-223和224-330。
本发明的二聚体蛋白质可以具有人IgG1免疫球蛋白的另一同种异型，如IgG1m(a),IgG1m(z),和IgG1m(x)。这类同种异型已被描述为在对应于依照如Kabat所述Eu编号系统的位置214,356,358,和431中的一个或多个位置处含有不同的氨基酸。
IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgG1m(f),IgA1,IgA2,IgE,IgD和IgM恒定区相应区段的比对显示于图2。因此，本文中描述为对应于人IgG1重链中的氨基酸位置的任意氨基酸位置，或氨基酸位置中的突变都可以被鉴定出来，或者引入其在IgG2,IgG3,IgG4,IgG1m(f),IgA1,IgA2,IgE,IgD和IgM中的等同位置处(如通过图2中的比对限定的)以获得依照本发明的二聚体蛋白质。
在本发明的二聚体蛋白质的任意方面或实施方案中，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽可以包含SEQ ID NO:1的残基130至330，SEQ ID NO:2的残基126至326，SEQID NO:3的残基177至377，SEQ ID NO:4的残基127至327，或SEQ ID NO:5的残基130至330的序列。
在一个实施方案中，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽包含选自SEQ IDNo.:1-5的序列，如SEQ ID No.:1,SEQ ID No.:2,SEQ ID No.:3,SEQ ID No.:4,或SEQ IDNo.:5。
在一个实施方案中，所述抗体是人全长抗体，如人全长IgG1抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是人IgG1抗体，例如IgG1m(za)或IgG1m(f)同种异型，任选地其中所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)除了本文中描述的突变外包含SEQID NO:1或5，在一个实施方案中，所述抗体是人抗体，其可以是在该同种型内已知的任意同种异型。
在一个实施方案中，所述抗体是人IgG2抗体，任选地其中所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)包含SEQ ID NO:2。
在一个实施方案中，所述抗体是人IgG3抗体，任选地其中所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)包含SEQ ID NO:3。
在一个实施方案中，所述抗体是人IgG4抗体，任选地其中所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)包含SEQ ID NO:4。
在本发明的任意二聚体蛋白质的具体实施方案中，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)除了本发明限定的氨基酸位置外，包含与SEQ ID Nos:1,2,3,4,和5的氨基酸P247至K447(例如I253至K447)具有至少70％,72％,74％,76％,78％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或至少约99％的同一性程度的氨基酸序列。
如此，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)除了本发明和本文中限定的任意氨基酸残基外，可以包含依照SEQ ID No:1,SEQ ID No:2,SEQ ID No:3,SEQ ID No:4,或SEQ ID No:5的序列。
本发明的发明人发现，其中在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸E,E和S已被氨基酸R,G和Y分别取代的6个抗体能在溶液中形成非共价六聚体结构。
如此，在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质在pH为约6.8的磷酸盐缓冲液中主要为寡聚体形式(如六聚体形式)。
如此，在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质在记载于实施例20或23的条件下，例如在12.6mM磷酸钠、140mM NaCl，pH 7.4的溶液中，或在0.1M Na2SO4、0.1M磷酸钠，pH6.8的溶液中，或在0.15M NaCl、0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 6.8的溶液中，能够形成非共价六聚体结构。在本发明的上下文中，术语“能形成非共价六聚体结构”意指超过30％，如超过40％,或超过50％,或超过60％,或超过70％,或超过80％,或超过85％,或超过90％,或超过95％的二聚体蛋白质(例如抗体)当如实施例20中记载的测定时处于非共价六聚体结构。在一个进一步的实施方案中，本发明的二聚体蛋白质在0.15M NaCl、0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH5.0的溶液中不能形成非共价结构。术语“不能形成非共价六聚体结构”在本发明的上下文中意指低于10％，如低于8％，或低于7％，或低于6％，或低于5％，或低于4％，或低于3％，或低于2％，或低于1％，或低于0.5％的二聚体蛋白质(例如抗体)当如实施例20中记载的测定时处于非共价六聚体结构。如此，在一个实施方案中，所述六聚体结构可通过实施HP-SEC(高压大小排阻层析)分级来测定，其使用连接于吸光度检测器、孔径能够分离范围为50kDa至1000kDa的分子的适宜的大小排阻层析树脂；以1mL/min在于pH 6.8缓冲的0.1M Na2SO4/0.1M磷酸钠中分离含有1.25μg/mL蛋白质的50μL样品；使用合适的软件来处理结果；并按峰表示为总峰面积的百分数。
本发明的二聚体蛋白质形成寡聚体(例如六聚体)结构的能力使得所述二聚体蛋白质适于结合不仅是存在于细胞上的靶物而且还有可溶性靶物。如此，本发明的二聚体蛋白质可以例如用于从血流除去可溶性因子，例如细菌毒素，或其他不想要的因子，如补体成分例如C1q。
红细胞的表型分析，如测定Rhesus D状态，在输血和确定新生儿溶血病的风险的情况下是重要的。对于红细胞的表型分析，目前单克隆人IgG抗体用于实验室测试，例如Coombs测试中。然而，在这些测定法中使用的许多IgG诱导较差的凝集。代替IgG的是，本发明的二聚体蛋白质的寡聚体结构(例如六聚体结构)可用作表型分析测定法中的试剂。将本发明二聚体蛋白质的稳定的寡聚体(如六聚体)结构用于红细胞表型分析可具有几个优势，如寡聚体结构本身能诱导细胞的交联从而避免了对二抗的需要，能改进测定法的灵敏性，而且具有不同结合区的两种或更多种二聚体蛋白质可用于同时对多种红细胞抗原进行表型分析。如此，在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质可用于红细胞表型分析。在一个实施方案中，可将具有不同结合区的两种或更多种，如3、4、5或6种本发明的二聚体蛋白质用于对多种红细胞抗原进行表型分析。
在另一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质具有相比于亲本二聚体蛋白质增加的效应器功能。本发明的二聚体蛋白质可视为亲本二聚体蛋白质的变体，其中所述变体相比于亲本二聚体蛋白质包含位置345,430处的氨基酸突变，和在选自下组的至少一个位置处的氨基酸突变：S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254。在此上下文中，亲本二聚体蛋白质是如下的二聚体蛋白质，其中所述第一和/或第二多肽中的氨基酸对应于人IgG1重链E345、E430的位置处的氨基酸和至少一个选自下组的位置处的氨基酸：S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254，其中选自由S440,Y436,E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的氨基酸位置对应于人IgG1重链在该位置处的氨基酸。如上文描述的，所述亲本二聚体蛋白质可以是任意同种型。
对于抗体，通常抗体的功效可由EC50值表示，其为获得50％的最大效应所需的抗体浓度。这类似地适用于本发明的二聚体蛋白质。
最大效应是使用饱和量的抗体时获得的效应，其中饱和意图指抗体的所有抗原均被抗体结合时抗体的量。这类似地适用于本发明的二聚体蛋白质。
术语“提高效应器功能”或“改进效应器功能”在本发明上下文中指相比亲本二聚体蛋白质，本发明的二聚体蛋白质的EC50值有降低。EC50值的降低可以是例如至多或约1/2，如至多或约1/3，或至多或约1/5，或至多或约1/10。可选的，“提高效应器功能”或“改进效应器功能”意为在亲本二聚体蛋白质裂解少于所有细胞100％的条件下，裂解的细胞最大量增加(其中细胞总量被设为100％)例如从所有细胞的10％到100％，如约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，和约100％。
可通过将IgG1-005或IgG1-7D8重链可变域克隆入二聚体蛋白质并在CDC测定法中测试其功效，来检测二聚体蛋白质提高或改进效应器功能，如对Daudi(实施例3)和Wien(实施例6)所描述的。在一个实施方案中，可通过将浓度为1x 106细胞/mL的悬液细胞在圆底96孔板中与总体积100μL中终浓度范围为0.0003至30.0μg/mL的抗体在室温在振荡器上预温育15min，添加浓度为20％,30％或50％终浓度的正常人血清，在37℃温育45min，将板置于冰上，添加10μL碘化丙啶，并通过FACS分析测定细胞裂解来测定CDC功效。
使用IgG1-7D8HC可变域和Daudi细胞，提高被限定为与在研究条件下IgG1-7D8的EC50相比小于1/2的EC50，如约1/2，约1/3，约1/5，约1/10或小于1/10的EC50值，EC50为观察到最大裂解半数的浓度。使用IgG1-005HC可变域和Daudi细胞，提高被限定为与在研究条件下IgG-005的EC50相比小于1/2的EC50，如约1/2，约1/3，约1/5，约1/10或小于1/10的EC50值，EC50为观察到最大裂解半数的浓度。使用IgG1-7D8HC可变域和Wien133细胞，提高被限定为与在研究条件下IgG1-7D8的EC50相比小于1/2的EC50，如约1/2，约1/3，约1/5，约1/10或小于1/10的EC50值，EC50为观察到最大裂解半数的浓度。使用IgG1-005HC可变域和Wien133细胞，提高被限定为最大裂解的提高从所有细胞的10％到100％，如提高约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，和约100％。CDC效力的提高也可以被限定为与在研究条件下IgG-005的EC50相比，小于1/2的EC50，如约1/2，约1/3，约1/5，约1/10或小于1/10的EC50值，EC50为在Wien133细胞的裂解可以检测到的条件下，观察到最大裂解半数的浓度。
本发明的发明人发现，其中在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别不是E,E和S的抗体，与其中在所述位置处的氨基酸分别为E,E和S的同样的抗体相比，对于C1q结合具有较低的EC50值且对于CDC具有较低的EC50值(见实施例21)。
在再一个实施方案中，当二聚体蛋白质与其在细胞或病毒粒体上的靶物(其中靶物呈递在病毒粒体或细胞膜上)结合时，相比于亲本二聚体蛋白质，本发明的二聚体蛋白质的效应器功能(如CDC)可得到提高。
其他氨基酸位置
本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽在指定的位置还可以包含其他特定的氨基酸。如本文中描述的，本发明的二聚体蛋白质(例如抗体)可通过将突变引入如本发明指定的氨基酸位置处来制备。
这类其他氨基酸位置或突变的例子包括其中特定氨基酸影响二聚体蛋白质的一种或多种效应器功能的氨基酸位置。这类氨基酸的例子包括能增强CDC、C1q结合、Fc-γ受体结合或FcRn结合和/或改善Fc-γ受体介导的效应器功能的氨基酸残基。
效应器功能的例子包括例如当结合其在细胞上、在细胞膜上、在病毒粒体上或在另一颗粒上的抗原时，二聚体蛋白质如抗体的(i)C1q结合，(ii)补体激活，(iii)CDC，(iv)寡聚体形成，(v)寡聚体稳定性，(vi)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(vii)FcRn结合，(viii)Fc-γ受体结合，(ix)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，(x)补体依赖性细胞细胞毒性(CDCC)，(xi)补体增强的细胞毒性，(xii)由抗体介导的经调理抗体对补体受体的结合，(xiii)内在化，(xiv)下调，(xv)诱导细胞凋亡，(xvi)调理作用，(xvii)增殖调控，如增殖减少、抑制或刺激，和(xii)(i)至(xvi)的任意组合。
在一个实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质还包含已知增强CDC的氨基酸残基或氨基酸残基修饰，例如，IgG同种型之间的区段交换以产生嵌合IgG分子(Natsume等,2008Cancer Res 68(10),3863-72)；铰链区的一个或更多个氨基酸取代(Dall'Acqua等,2006J Immunol 177,1129-1138)，和/或围绕残基D270、K322、P329和P331，在CH2域的C1q结合位点中或附近的一个或多个氨基酸取代(Idusogie等,2001J Immunol 166,2571–2575；Michaelsen等,2009Scand J Immunol 70,553–564；WO 99/51642；Moore等,2010mAbs 2(2),181-189)。例如，在一个实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质还包含氨基酸取代S267E,H268F,S324T,S239D,G236A和I332E中任一项的组合，通过CDC或ADCC提供增强的效应器功能(Moore等,2010mAbs 2(2),181-189和WO 2011/091078 A2)。影响与Fc受体结合(描述于WO 2006/105062,WO 00/42072,美国专利US6,737,056和美国专利US7,083,784)或抗体物理特性(描述于WO 2007/005612 A1)的其他Fc突变也可用于本发明的变体。
因此，在一个实施方案中，在对应于S267,H268,S324,S239,G236和I332的至少一个位置处的氨基酸可以分别为E,F,T,D,A和E。
在一个实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质还可以包含增强Fc-γ受体结合和/或Fc-γ受体介导的效应器功能的修饰。这类修饰包括(i)降低CH2附接的糖基化中岩藻糖的量(糖工程改造)(Umana P,等,Nat Biotechnol 1999；17:176-80；Niwa R,等,ClinCancer Res 2004；10:6248-55.))，和(ii)抗体铰链或CH2区域中氨基酸的定点诱变(蛋白工程改造)(Lazar GA,等,Proc Natl Acad Sci U S A 2006；103:4005-10)。
在另一个实施方案中，这类别的突变可以是抑制或降低二聚体蛋白质的效应器功能的突变。在不需要免疫系统残余且甚至可能导致不想要的副作用的临床应用中，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽还可以在CH2域中进一步突变以消除C1q和/或Fc-γ受体相互作用。
已鉴定出在Fc域中的一些氨基酸残基，其在与C1q和Fc-γ受体的相互作用中起着主导作用。显示位置234和235在人Fc对人CD64(Canfield&Morrison,1991；Chappel等,1991；Hezareh等,2001),CD32A(Hezareh等,2001；Armour等,2003),CD16(Hezareh等,2001)和C1q(Xu等,2000；Hezareh等,2001)的结合上具有较强的调控效果。显示CH2位置331是人IgG对人CD64(Canfield&Morrison,1991,J Exp Med.；173:1483-91)和C1q(Tao等,1993；Idusogie等,2000)结合的主要决定物且三重突变L234F/L235E/P331S导致对人CD64,CD32A,CD16和C1q结合中的大量降低。
基于该知识，几种变体已描述为使得Fc域对于与Fc-γ受体和C1q相互作用无活性以用于治疗抗体开发。
对于IgG1突变，描述了L234A和L235A和P331S(Hezareh M,等,.J Virol 2001,75:12161-12168,Xu D等Cell Immunol 2000,200:16-26,Shields RL,等J Biol Chem 2001,276:6591-6604)，而且L234A与L235A组合被用在临床中(Herold KC,等.Diabetes 2005,54:1763-1769)。因此，在一个实施方案中，在对应于L234,L235和P331的至少一个位置处的氨基酸可以分别为A,A和S。
还有，将这些同样的位置突变为L234F和L235E被描述为产生具有消除与Fc-γ受体和C1q相互作用的Fc域(Oganesyan Acta Cryst.(2008).D64,700–704,Canfield&Morrison,1991J Exp Med.；173:1483-91.,Duncan,1988Nature 332:738-40)。因此，在一个实施方案中，在对应于L234和L235的位置处的氨基酸可以分别为F和E。
突变位置D265A显示对所有Fcγ受体的降低的结合和阻止ADCC(Shields RL等JBiol Chem 2001,276:6591-6604)。因此，在一个实施方案中，在对应于D265的位置处的氨基酸可以是A。
可以通过突变位置D270,K322,P329,和P331来消除对C1q的结合(Idusogie等,JImmunol 2000,164:4178-4184)。将这些位置突变为D270A或K322A或P329A或P331A使得抗体在CDC活性中有缺陷。因此，在一个实施方案中，在对应于D270,K322,P329和P331的至少一个位置处的氨基酸可以分别为A,A,A,和A。
最小化Fc域与Fcγ受体和C1q相互作用的一种备选的办法是通过除去抗体上的糖基化位点。将位置N297突变为例如Q,A,和E除去了对于IgG-Fcγ受体相互作用关键性的糖基化位点(Tao和Morrison,J Immunol.1989Oct 15；143(8):2595-601,Bolt S等,Eur JImmunol 1993,23:403-411)。因此，在一个实施方案中，对应于N297的位置处的氨基酸可以是Q,A或E。
或者，人IgG2和IgG4亚类在其与C1q和Fcγ受体的相互作用中是天然受损的。然而，已描述了与Fcγ受体(Fcgamma受体)的残余相互作用(Parren等,J Clin Invest 1992,90:1537-1546.)。已对两种同种型描述了消除这些残余相互作用的突变，且导致与FcR结合有关的不想要的副作用的减少。对于IgG2突变，描述了L234A和G237A(Cole MS等J Immunol1997,159:3613-3621)且对于IgG4，描述了L235E(Reddy MP等,J Immunol 2000,164:1925-1933)。因此，在一个实施方案中，在对应于人IgG2重链L234和G237的位置处的氨基酸可以分别为A和A。在一个实施方案中，在对应于人IgG4重链L235位置处的氨基酸可以是E。
进一步消除与Fcγ受体和C1q IgG2抗体的相互作用的其他办法记载于WO 2011/066501 A1(PCT/US2010/058188)和Lightle,S.,等；Protein Science(19):753-62(2010)。
或者，抗体的铰链区就与Fcγ受体和补体的相互作用而言具备重要性。铰链区中的突变已被描述为影响抗体的效应器功能(Brekke等,J Immunol 2006,177:1129-1138,Dall’Acqua WF,等J Immunol 2006,177:1129-1138。突变或删除铰链区将影响抗体的Fc效应器功能。
因此，在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽还可以包含上文提述的任一种突变，其抑制或降低二聚体蛋白质的一种或多种效应器功能。
将上文描述的突变集组合可能产生甚至更惰性的Fc域，例如在IgG1Fc域中组合突变L234F,L235E,D265A；或L234F,L235E,N297Q和D265A或通过上文描述的信息生成的其他变异。因此，在一个实施方案中，对应于L234,L235,D265；或L234,L235,N297和D265的至少一个位置或位置组合中的氨基酸可以分别为F,E,A,F,E,Q和A。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)还可以包含上述突变的任意组合，其抑制或降低二聚体蛋白质的一种或多种效应器功能。
典型地，可通过EC50值来测量抗体对效应器功能的影响，其为获得一半的最大裂解值所需的抗体浓度。这类似地适用于本发明的二聚体蛋白质。
最大裂解是使用饱和量的抗体时获得的效应，其中饱和意图指抗体的所有抗原均被抗体结合时抗体的量。这类似地适用于本发明的二聚体蛋白质。
如此，在一个实施方案中，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽还可以在对应于人IgG1重链L234,L235和D265的氨基酸位置处包含氨基酸取代，其分别为F,E,和A。
术语“降低效应器功能”在本发明的上下文中指相比于亲本二聚体蛋白质，二聚体蛋白质的EC50值有提高，其中所述亲本二聚体蛋白质具有如上文所述的含义。EC50值的提高可以是例如至少或约2倍，如至少或约3倍，至少或约5倍，至少或约10倍。可选的，“降低效应器功能”意为在亲本二聚体蛋白质裂解少于所有细胞100％的条件下，裂解的细胞最大量有降低，降低例如从所有细胞的10％到100％，如约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，和约100％。
可以通过将IgG1-005或IgG1-7D8重链可变域克隆入二聚体蛋白质并在CDC测定法中测试其效力，来检测二聚体蛋白质的降低的效应器功能，如对Daudi(实施例3)和Wien(实施例6)所描述的。使用IgG1-7D8HC可变域和Daudi细胞，降低被定义为与在研究条件下IgG1-7D8的EC50相比高超过2倍的EC50，如高约2倍，约3倍，约5倍，约10倍或超过10倍的EC50值，EC50为观察到最大裂解半数的浓度。使用IgG1-005HC可变域和Daudi细胞，降低被定义为与在研究条件下IgG-005的EC50相比高超过2倍的EC50，如高约2倍，约3倍，约5倍，约10倍或超过10倍的EC50值，EC50为观察到最大裂解半数的浓度。使用IgG1-7D8HC可变域和Wien133细胞，降低被定义为与在研究条件下IgG1-7D8的EC50相比高超过2倍的EC50，如高约2倍，约3倍，约5倍，约10倍或超过10倍的EC50值，EC50为观察到最大裂解半数的浓度。使用IgG1-005HC可变域和Wien133细胞，降低被定义为最大裂解的降低从所有细胞的10％到100％，如降低约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，和约100％。CDC效力的降低也可以被定义为与在研究条件下IgG-005的EC50相比高超过2倍的EC50，如高约2倍，约3倍，约5倍，约10倍或超过10倍的EC50值，EC50为在Wien133细胞的裂解可以检测到的条件下，观察到最大裂解半数的浓度。
FcRn是一种主要组织相容性I类复合物相关受体，且通过保护IgG免于胞内降解在免疫球蛋白(Ig)G从母体到幼儿的被动投递中和血清IgG水平的调节中起作用(Ghetie V等,Annu Rev Immunol.18,739-66(2000))。由于FcRn对IgG和其他Fc缀合的蛋白质在血清中的延长的持久性负责，调控FcRn–Fc相互作用将允许有意地控制这些物质在循环中到各终端的半衰期。
在一个实施方案中，所述二聚体蛋白质可以包含其他氨基酸残基，或者进一步的如氨基酸取代，其例如通过影响对FcRn的结合来影响药动学概况。
在一个实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质的六聚体形式的血浆清除率被降低，例如以允许更低的给药和最小化由高剂量导致的不良反应、降低注射频率、使到特定组织部位的胞转作用最大化、增强经胎盘投递的效率、或降低生产成本。
在再一个实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)已经过例如在CH2和/或CH3区中的进一步修饰，例如以改进药动学概况，例如经由改进对FcRn的结合，例如在pH 6.0。这些修饰包括但不限于，在Fc区的以下一个或多个氨基酸位置处的突变：P238,T250,M252,I253,S254,R255,T256,D265,E272,N286,K288,V303,V305,T307,L309,H310,Q311,D312,K317,K340,D356,K360,Q362,D376,A378,E380,E382,Q386,E388,S400,D413,S415,S424,M428,H433,N434,H435,Y436,K439或K447，其中Fc区中的残基编号是如Kabat中的EU索引所述(Shields,R.L.等,J Biol Chem.9,6591-604(2001),Dall’Acqua,W.F.等,J Immunol.9,5171-80(2002),Hinton,P.等,J Biol Chem.8,6213-6(2004),Dall’Acqua,W.F.等,J Biol Chem.33,23514-24(2006),Petkova,S.B.等,Int Immunol.12,1759-69(2006),Datta-Mannan,A.等,J Biol Chem.3,1709-17(2007),Yeung,Y.A.,J Immunol.12,7663-71(2009),Kabat,E.A.于US Department of Health andHuman Services,NIH publication n°91-3242,5th edition 662,680,689(1991))。因此，在一个实施方案中，二聚体蛋白质的第一和/或第二(如两个)多肽中，在对应于选自由P238、T250、M252、I253、S254、R255、T256、D265、E272、N286、K288、V303、V305、T307、L309、H310、Q311、D312、K317、K340、D356、K360、Q362、D376、A378、E380、E382、Q386、E388、S400、D413、S415、S424、M428、H433、N434、H435、Y436、K439或K447组成的组的位置的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：不是P,不是T,不是M,不是I,不是S,不是R,不是T,不是D,不是E,不是N,不是K,不是V,不是V,不是T,不是L,不是H,不是Q,不是D,不是K,不是K,不是D,不是K,不是Q,不是D,不是A,不是E,不是E,不是Q,不是E,不是S,不是D,不是S,不是S,不是M,不是H,不是N,不是H,不是Y,不是K或不是K。
在一个甚至进一步的实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)已经过进一步修饰以改进药动学概况，其通过特定突变N434A(Shields,R.L.等,J Biol Chem.9,6591-604(2001)),T307A/E380A/N434A(Shields,R.L.等,J Biol Chem.9,6591-604(2001)),T250Q/M428L(Hinton,P.等,J Biol Chem.8,6213-6(2004))或M252Y/S254T/T256E(Dall’Acqua,W.F.等,J Immunol.9,5171-80(2002))来改进对FcRn的结合，其中Fc区中残基的编号是如Kabat中EU索引的编号(Kabat,E.A.in USDepartment of Health and Human Services,NIH publication n°91-3242,5th edition662,680,689(1991)。因此，在一个实施方案中，对应于N434的位置处的氨基酸可以是A。在另一个实施方案中，对应于T307,E380和N434的位置处的氨基酸可以分别是A,A和A。在另一个实施方案中，对应于位置T250和M428的位置处的氨基酸可以分别是Q和L。在另一个实施方案中，对应于M252,S254和T256的位置处的氨基酸可以分别是Y,T和E。如此，在一个实施方案中，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽可在对应于人IgG1重链E345,E430,N434,和S440的氨基酸位置处包含分别为以下的氨基酸取代：不是E；不是E；A；和Y或W。
在一个实施方案中，所述二聚体蛋白质可包含P238,T256,T307,Q311,D312,E380,E382,和N434中的一个或多个到丙氨酸残基的取代，其改进FcRn结合(Shields RL,等J.Biol.Chem.2001；276:6591)；或选自IgG1中M252Y/S254T/T256E,M252W,M252Y,M252Y/T256Q,M252F/T256D,V308T/L309P/Q311S,G385D/Q386P/N389S,G385R/Q386T/P387R/N389P,H433K/N434F/Y436H,N434F/Y436H,H433R/N434Y/Y436H,M252Y/S254T/T256E-H433K/N434F/Y436H或M252Y/S254T/T256E-G385R/Q386T/P387R/N389P的氨基酸取代或氨基酸取代的组合，从而改进对FcRn的亲和力(Dall’Acqua等,supra)。因此，在一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的每个多肽，在对应于选自下组的那些位置的位置处的一个或多个氨基酸对于每个位置可以分别为A：P238,T256,T307,Q311,D312,E380,E382和N434。在另一个实施方案中，在对应于M252,S254和T256的位置处的氨基酸可以分别为Y,T和E；或在对应于M252的位置处可以为W；或在对应于M252的位置处可以为Y；或在对应于M252和T256的位置处可以分别为Y和Q；或在对应于M252和T2566的位置处可以分别为F和D；或在对应于V308,L309和Q3116的位置处可以分别为T,P和S；或在对应于G385,Q386和N3896的位置处可以分别为D,P和S；或在对应于G385,Q386,P387和N3896的位置处可以分别为R,T,R和P；或在对应于H433,N434和Y4366的位置处可以分别为K,F和H；或在对应于N434和Y4366的位置处可以分别为F和H；或在对应于H433,N434和Y4366的位置处可以分别为R,Y和H；或在对应于M252,S254,T256,H433,N434和Y4366的位置处可以分别为Y,T,E,K,F和H；或在对应于M252,S254,T256,G385,Q386,P387和N3896的位置处可以分别为Y,T,E,R,T,R和P。
在一个实施方案中，依照本方面的二聚体蛋白质的六聚体形式的半衰期被缩短，例如以确保用于成像和/或放射免疫疗法的二聚体蛋白质的快速清除，或促进病原性靶分子的清除。
在再一个实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)已经过例如CH2和/或CH3区中的进一步修饰，例如以调控药动学概况，例如经由降低或消除对FcRn的结合。这些修饰包括但不限于，在Fc区的氨基酸位置P238,T250,M252,I253,S254,R255,T256,D265,E272,N286,K288,V303,V305,T307,L309,H310,Q311,D312,K317,K340,D356,K360,Q362,D376,A378,E380,E382,Q386,E388,S400,D413,S415,S424,M428,H433,N434,H435,Y436,K439或K447的一个或多个处的突变，其中Fc区中残基的编号是如Kabat中EU索引的编号(Shields,R.L.等,J Biol Chem.9,6591-604(2001),Dall’Acqua,W.F.等,J Immunol.9,5171-80(2002),Hinton,P.等,J Biol Chem.8,6213-6(2004),Dall’Acqua,W.F.等,J Biol Chem.33,23514-24(2006),Petkova,S.B.等,IntImmunol.12,1759-69(2006),Datta-Mannan,A.等,J Biol Chem.3,1709-17(2007),Yeung,Y.A.,J Immunol.12,7663-71(2009),Kabat,E.A.in US Department of Health andHuman Services,NIH publication n°91-3242,5th edition 662,680,689(1991))。因此，在一个实施方案中，在对应于选自由P238,T250,M252,I253,S254,R255,T256,D265,E272,N286,K288,V303,V305,T307,L309,H310,Q311,D312,K317,K340,D356,K360,Q362,D376,A378,E380,E382,Q386,E388,S400,D413,S415,S424,M428,H433,N434,H435,Y436,K439或K447组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：不是P；不是T；不是M；不是I；不是S；不是R；不是T；不是D；不是E；不是N；不是K；不是V；不是V；不是T；不是L；不是H；不是Q；不是D；不是K；不是K；不是D；不是K；不是Q；不是D；不是A；不是E；不是E；不是Q；不是E；不是S；不是D；不是S；不是S；不是M；不是H；不是N；不是H；不是Y；不是K或不是K。
在一个甚至进一步的实施方案中，依照本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽(例如两个多肽)已经过进一步修饰以改进药动学概况，其通过特定突变I253A,H310A,H433A,H435A,Y436A、突变I253A/H310A/H435A(Kim,J.K.等Eur.J.Immunol.29,2819–2825(1999),Shields,R.L.等,J Biol Chem.9,6591-604(2001))降低或消除对FcRn的结合，其中Fc区中残基的编号是如Kabat中EU索引的编号(Kabat,E.A.in US Departmentof Health and Human Services,NIH publication n°91-3242,5th edition 662,680,689(1991))。因此，在一个实施方案中，在对应于选自由I253,H310,H433,H435和Y436组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置可以分别为A。在另一个实施方案中，在对应于I253,H310A和H435A的位置处的氨基酸可以各为A。
其中特定的氨基酸可能相关的其他氨基酸位置(例如其中亲本二聚体蛋白质经突变以改变该氨基酸)的另一个例子可以是影响二聚体蛋白质(例如抗体)之间Fc区中相互作用的氨基酸。可将这类突变用于最小化治疗性二聚体蛋白质(例如治疗性抗体)与天然存在于施用该治疗性二聚体蛋白质(例如治疗性抗体)的患者中的抗体的相互作用。
这类氨基酸残基或突变先前已记载于PCT/EP12/063339，且包括以下两个氨基酸残基或突变的组合：其各自降低效应器功能但一起使用时(例如通过组合各包含所述氨基酸残基或突变之一的两个二聚体蛋白质)，效应器功能类似于所述氨基酸残基未突变而对应于人IgG1重链的亲本二聚体蛋白质。当一起使用各自包含这类突变对之一的两个这种二聚体蛋白质时，所述两个二聚体蛋白质之间的相互作用的特异性相比于仅包含这类突变对的一个突变的两个这种二聚体蛋白质之间的相互作用可以增加。类似地，各自包含这类突变对之一的两个二聚体蛋白质之间的相互作用也可以强于仅包含这类突变对的一个突变的二聚体蛋白质与不包含该突变对的突变的二聚体蛋白质之间的相互作用。
因此，在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽还可以包含依照该方面的突变或氨基酸残基。
如此，不受任何理论束缚地，预见通过在治疗性二聚体蛋白质中纳入这类两突变，将患者中C1q结合的诱导限定为含有治疗性二聚体蛋白质(例如抗体)的寡聚体复合物，所述二聚体蛋白质包含这类氨基酸组合或氨基酸对。这可以允许减少由治疗性二聚体蛋白质与不包含这类突变的患者自身抗体的相互作用所导致的任何潜在的副作用。
在一个具体的实施方案中，二聚体蛋白质可与另一种二聚体蛋白质组合使用，其中每种二聚体蛋白质包含这类氨基酸“对”的一个氨基酸。如此，在一个实施方案中，本发明涉及在所述第一和/或第二多肽中包含这类“对”的一个氨基酸的二聚体蛋白质。包含这类“对”的一个氨基酸的这类二聚体蛋白质(例如第一二聚体蛋白质),可与在所述第一和/或第二多肽中包含这类“对”的另一个氨基酸的第二二聚体蛋白质一起使用。这类氨基酸的例子包括表1的那些。如此，在再一个实施方案中，对于本发明的二聚体蛋白质的每个多肽，在对应于K439,S440,K447,448和449的位置处的氨基酸可以如表1中描述的。
表1
包含这类氨基酸的二聚体蛋白质的特定组合可以是如本文中描述的。
如此，在本发明的再一个方面，对于二聚体蛋白质的一个或两个(如每个)多肽，在对应于K439的位置处的氨基酸不是K。
在另一个实施方案中，在对应于K439的位置处的氨基酸是E或D。
在另一个实施方案中，在对应于K439的位置处的氨基酸是E。
在另一个实施方案中，在对应于K439的位置处的氨基酸是D。
在一个实施方案中，在所述二聚体蛋白质的第一或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,K439,和S440的位置处的氨基酸分别是R,K,Q,N或Y；G,S,T,F,或H；E或D；和Y或W。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,K439,和S440的位置处的氨基酸分别是R；G；E；和Y。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链S440的位置处的氨基酸是K或R。
在一个实施方案中，在对应于S440的位置处的氨基酸是K。
在一个实施方案中，在对应于S440的位置处的氨基酸是R。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,和S440的位置处的氨基酸分别是R；G；和K。
在本发明的另一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的一个或两个(如每个)多肽，在选自由Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的位置处的至少一个氨基酸分别为：不是Y；D或E；T；E；N；Q；I；和S，且在对应于S440的位置处的氨基酸是K或R。
在再一个实施方案中，在对应于Y436的位置处的氨基酸是I，且对应于S440的氨基酸是K。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,Y436和S440的位置处的氨基酸分别为R；G；I；和K。
在一个实施方案中，使用K439D/E/R和S440D/E/K/R取代的对。如此，在一个实施方案中，第一多肽包含K439D/E/R，而第二多肽包含S440D/E/K/R，或反之，且其中在所述第一和/或第二多肽中，对应于位置E345和E430处的氨基酸不是E。在另一个实施方案中，在包含S440D/E/K/R的多肽中，在对应于选自由Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的位置处的氨基酸之一对于每个位置分别为：不是Y；D或E；T；E；N；Q；I；和S。如此，在本发明的另一方面，对于二聚体蛋白质的一个或两个(如每个)多肽，在选自由Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的位置处的至少一个氨基酸对于每个位置分别为：不是Y；D或E；T；E；N；Q；I；和S，且在对应S440于的位置处的氨基酸不是S,Y或W。
在另一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的一个或两个(如每个)多肽，在对应于K447的位置处的氨基酸为D或E。
在再一个实施方案中，在对应于K447的位置处的氨基酸为D。
在再一个实施方案中，在对应于K447的位置处的氨基酸为E。
在另一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的一个或两个(如每个)多肽，在对应于K447的位置处的氨基酸为K,R或H，且所述多肽包含：
(a)位置448处为P的氨基酸残基；或
(b)位置448处为K,R或H的氨基酸残基和在位置449处为P的氨基酸残基。
在再一个实施方案中，在对应于K447的位置处的氨基酸是K。
在再一个实施方案中，在对应于K447的位置处的氨基酸是R。
在再一个实施方案中，在对应于K447的位置处的氨基酸是H。
在再一个实施方案中，在对应于448的位置处的氨基酸是K。
在再一个实施方案中，在对应于448的位置处的氨基酸是R。
在再一个实施方案中，在对应于448的位置处的氨基酸是H。
在再一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的一个或两个(如每个)多肽，在对应于Q386的位置处的氨基酸是K。
如实施例3-5中记载的，仅包含K439E和S440K突变之一的抗体变体具有对C1q的急剧降低的KD，从而反映了降低的补体激活和/或CDC能力。令人惊讶地，发现包含两个突变的HuMAb 7D8或005的抗体变体具有恢复或增加的C1q结合或CDC。不受任何特定理论束缚地，根本性机制也许能通过如图4中例示的空间上彼此补偿的分别的突变来解释。
在再一个实施方案中，对于二聚体蛋白质的一个或两个(如每个)多肽，在对应于L234,L235,G236,G237,S239,P238,T250,M252,I253,S254,R255,T256,D265,S267,H268,D270,E272,N286,K288,N297,V303,V305,T307,V308,L309,H310,Q311,D312,K317,K322,S324,P329,P331,I332K340,D356,K360,Q362,D376,A378,E380,E382,G385,Q386,P387,E388,N389,S400,D413,S415,S424,M428,H433,N434,H435,Y436,K439或K447的至少一个位置处的氨基酸分别为不是L；不是L；不是G；不是G；不是S；不是P；不是T；不是M；不是I；不是S；不是R；不是T；不是D；不是S；不是H；不是D；不是E；不是N；不是K；不是N；不是V；不是V；不是T；不是V；不是L；不是H；不是Q；不是D；不是K；不是K；不是S；不是P；不是P；不是I；不是K；不是D；不是K；不是Q；不是D；不是A；不是E；不是E；不是G；不是Q；不是P；不是E；不是N；不是S；不是D；不是S；不是S；不是M；不是H；不是N；不是H；不是Y；不是K和不是K。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质是同型二聚体。如此，在一个实施方案中，二聚体蛋白质的第一和第二多肽两者均包含依照本发明任意方面或实施方案的相同或等同的氨基酸取代。
异型二聚体形式
在另一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质是异型二聚体。
在再一个实施方案中，至少一个所述多肽包含特异性结合靶物的结合区。在再一个实施方案中，异二聚体蛋白质的每个多肽包含特异性结合靶物(任选为相同靶物)的结合区。
所述靶物可以是本文中描述的那些中的任一种。
在另一个实施方案中，异二聚体蛋白质的第一和第二多肽的结合区可以结合相同靶物上的不同表位。在另一个实施方案中，异二聚体蛋白质的第一和第二多肽的结合区可以结合不同靶物。
在另一个实施方案中，异二聚体蛋白质的第一和第二多肽的结合区可以结合不同细胞上的不同靶物。
在一个具体的实施方案中，所述异二聚体蛋白质可以是双特异性抗体。
在另一个实施方案中，所述异二聚体抗体的第一和第二多肽的结合区可以结合相同靶物上的不同表位。在另一个实施方案中，所述异二聚体抗体的第一和第二多肽的结合区可以结合不同靶物。
在另一个实施方案中，异二聚体蛋白质的第一和第二多肽的结合区可以结合不同细胞上的不同靶物。
如果二聚体蛋白质是异二聚体蛋白质，在对应于E345,E430的位置处和选自由人IgG1重链S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的至少一个位置处的氨基酸可以在一个实施方案中，在第一和第二多肽中不同，然而，在另一个实施方案中，它们也可以相同。
如果异二聚体蛋白质如WO2011/131746中描述的产生的话，所述氨基酸可以例如是不同的。
本发明的双特异性抗体不限于特定形式且它可以是本文中描述的那些中的任一种。
可用于本发明的例示性双特异性抗体分子包含(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单个抗体，(ii)对两个不同表位具有特异性的单链抗体，例如经由通过另外的肽接头串联连接的两个scFv；(iii)双可变域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有经由短肽连接串联的两个可变域(Wu等,Generation and Characterization of a dual VariableDomain Immunoglobulin (DVD-IgTM)Molecule,In:Antibody Engineering,SpringerBerlin Heidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)Tandab，其为两个单链双抗体的融合物，从而产生对于每个靶抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vi)flexibody，其为scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(vii)基于蛋白激酶A中的“二聚和对接域”的所谓的“对接和锁定(dock and lock)”分子，其在应用于Fab时，可得到由连接于不同Fab片段的的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的Scorpion分子，包含例如融合于人Fab臂的两末端的两个scFv；和(ix)双抗体。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是双抗体、交叉抗体(cross-body)、或如本发明中所描述的通过那些受控的Fab臂交换(如记载于WO 11/131746)所获得的双特异性抗体。
不同种类的双特异性抗体的实例包括但不限于
●带有迫使异二聚化的互补性CH3域的IgG样分子；
●重组IgG样双靶向性分子，其中所述分子的两面每个都包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；
●IgG融合分子，其中将全长IgG抗体融合至另外的Fab片段或Fab片段的部分；
●Fc融合分子，其中将单链Fv分子或稳定化(stabilized)的双抗体融合至重链恒定域、Fc区或其部分；
●Fab融合分子，其中不同Fab片段融合至一起、融合于重链恒定域、Fc区或其部分；
●基于scFv和双抗体和重链抗体(例如，域抗体、纳米抗体)，其中将不同的单链Fv分子或不同双抗体或不同重链抗体(例如，域抗体、纳米抗体)彼此融合或融合至另一个蛋白质或载体分子、融合于重链恒定域、Fc区或其部分。
带有互补性CH3域分子的IgG样分子的实例包括但不限于Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knobs-into-Holes(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对的(the electrostatically-matched)(Amgen,Chugai,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、Strand Exchange Engineered Domain body(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonics(Merus)、FcΔAdp(Regeneron)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat)、Azymetric支架(Zymeworks),mAb-Fv(Xencor)、二价双特异性抗体(Roche)和DuoBody(Genmab A/S)。
重组IgG样双靶向性分子的实例包括但不限于Dual Targeting(DT)-Ig(GSK/Domantis)、Two-in-one Antibody(Genentech)、Cross-linked Mabs(Karmanos CancerCenter)、mAb2(F-Star)、和CovX-body(CovX/Pfizer)。
IgG融合分子的实例包括但不限于Dual Variable Domain(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样Bispecific(ImClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)、和TvAb(Roche)。
Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc Fusions(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、Dual AffinityRetargeting Technology(Fc-DART)(MacroGenics)、和Dual(ScFv)2-Fab(抗体药物国家工程研究中心，中国)。
Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、BivalentBispecific(Biotecnol)、和Fab-Fv(UCB-Celltech)。
scFv抗体、基于双抗体的抗体、和域抗体的实例包括但不限于Bispecific T CellEngager(BiTE)(Micromet,Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、Dual AffinityRetargeting Technology(DART)(MacroGenics)、Single-chain Diabody(Academic)、TCR样抗体(AIT,ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向性纳米抗体(dual targeting nanobodies)(Ablynx)、双靶向性仅重链域抗体(dual targeting heavy chain only domain antibodies)。
在一个具体的实施方案中，所述双特异性抗体具有WO 2011/131746中描述的形式。
如此，在一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的异二聚体蛋白质，其中：
在第一多肽中，选自K409,T366,L368,K370,D399,F405,和Y407的位置处的氨基酸分别为不是K,T,L,K,D,F和Y，和
在第二多肽中，选自F405,T366,L368,K370,D399,Y407,和K409的位置处的氨基酸分别为不是F,T,L,K,D,Y和K。
在异二聚体蛋白质的一个具体的实施方案中，位置K409处的氨基酸在第一多肽中是R，且位置F405处的氨基酸在第二多肽中是L。
因此，在一个实施方案中，所述第一和第二多肽的序列含有不对称的氨基酸残基或突变，即氨基酸残基或突变在第一和第二多肽中的不同位置处，例如在一个多肽中特定的氨基酸或突变位于位置405，而在另一多肽中特定的氨基酸或突变位于位置409。从该角度对第一和第二多肽的提述不应理解为限制性的，因为氨基酸残基或突变可以类似地存在于相对的多肽上。如此，例如在所述第一多肽中位置F405处的氨基酸是L，而在所述第二多肽中位置K409处的氨基酸是R；或反过来，在所述第一多肽中位置K409处的氨基酸是R，而在所述第二多肽中位置F405处的氨基酸是L。
在一个实施方案中，第一多肽在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在选自由366、368、370、399、405和407组成的组的位置处具有以下氨基酸，其中所述氨基酸不是T、L、K、D、F、和Y。在一个这类实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置405处具有除Phe以外的氨基酸，例如Lys、Leu、Met、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Tyr、Trp或Cys。在由此的另一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置405处具有除Phe、Arg或Gly以外的氨基酸，例如Lys、Leu、Met、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala、Val、Ile、Tyr、Trp或Cys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置405处包含Phe且在位置409处包含除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置405处包含除Phe以外的氨基酸，例如Lys、Leu、Met、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Tyr、Trp或Cys，且在位置409处包含Lys。在由此的另一个实施方案中，所述第一多肽在位置405处包含Phe且在位置409处包含除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置405处包含除Phe、Arg或Gly以外的氨基酸，例如Lys、Leu、Met、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala、Val、Ile、Tyr、Trp或Cys且在位置409处包含Lys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置405处包含Phe且在位置409处包含除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置405处包含Leu且在位置409处包含Lys。在由此的另一个实施方案中，所述第一多肽在位置405处包含Phe且在位置409处包含Arg，而所述第二多肽在位置405处包含除Phe、Arg或Gly以外的氨基酸，例如Lys、Leu、Met、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Pro、Ala、Val、Ile、Tyr、Trp或Cys，且在位置409处包含Lys。在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置405处包含Phe且在位置409处包含Arg，而所述第二多肽在位置405处包含Leu且在位置409处包含Lys。
在再一个实施方案中，所述第一多肽且在位置409处包含除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置409处包含Lys、在位置370处包含Thr且在位置405处包含Leu。在再一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处包含Arg，而所述第二多肽在位置409处包含Lys、在位置370处包含Thr和在位置405处包含Leu。
在一个甚至进一步的实施方案中，所述第一多肽在位置370处包含Lys、在位置405处包含Phe且在位置409处包含Arg，而所述第二多肽在位置409处包含Lys、在位置370处包含Thr和在位置405处包含Leu。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处包含除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置409处包含Lys，和：a)在位置350处包含Ile及在位置405处包含Leu，或b)在位置370处包含Thr及在位置405处包含Leu。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处包含Arg，而所述第二多肽在位置409处包含Lys，和a)在位置350处包含Ile及在位置405处包含Leu，或b)在位置370处包含Thr及在位置405处包含Leu。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置350处包含Thr、在位置370处包含Lys、在位置405处包含Phe和在位置409处包含Arg，而所述第二多肽在位置409处包含Lys，和：a)在位置350处包含Ile及在位置405处包含Leu，或b)在位置370处包含Thr及在位置405处包含Leu。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置350处包含Thr、在位置370处包含Lys、在位置405处包含Phe和在位置409处包含Arg，，而所述第二多肽在位置350处包含Ile、在位置370处包含Thr、在位置405处包含Leu和在位置409处包含Lys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置407处具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr以外的氨基酸，例如His、Asn、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Trp、Leu、Met或Cys。在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置407处具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val或Trp。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置407处具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置407处具有Tyr且在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置407处具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr以外的氨基酸，例如His、Asn、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Trp、Leu、Met或Cys，在位置409处具有Lys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置407处具有Tyr且在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置407处具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val或Trp且在位置409处具有Lys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置407处具有Tyr且在位置409处具有除Lys、Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp或Cys，而所述第二多肽在位置407处具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp且在位置409处具有Lys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置407处具有Tyr且在位置409处具有Arg，而所述第二多肽在位置407处具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr以外的氨基酸，例如His、Asn、Gly、Pro、Ala、Val、Ile、Trp、Leu、Met或Cys且在位置409处具有Lys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置407处具有Tyr且在位置409处具有Arg，而所述第二多肽在位置407处具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val或Trp且在位置409处具有Lys。
在另一个实施方案中，所述第一多肽在位置407处具有Tyr且在位置409处具有Arg，而所述第二多肽在位置407处具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp且在位置409处具有Lys。
在一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Arg,His,Asp,Glu,Ser,Thr,Asn,Gln,Gly,Pro,Ala,Val,Ile,Phe,Tyr,Trp或Cys，而所述第二多肽具有：
(i)位置368处除Phe,Leu和Met以外的氨基酸，例如Arg,His,Asp,Glu,Ser,Thr,Asn,Gln,Gly,Pro,Ala,Val,Ile,Lys,Tyr,Trp或Cys，或
(ii)位置370处的Trp，或
(iii)位置399处除Asp,Cys,Pro,Glu或Gln以外的氨基酸，例如Arg,His,Ser,Thr,Asn,Gly,Ala,Val,Ile,Phe,Tyr,Trp,Lys,Leu,或Met,或
(iv)位置366处除Lys,Arg,Ser,Thr,或Trp以外的氨基酸，例如Leu,Met,His,Asp,Glu,Asn,Glu,Gly,Pro,Ala,Val,Ile,Phe,Tyr或Cys。
在一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有Arg,Ala,His或Gly，而所述第二多肽具有
(i)位置368处的Lys,Gln,Ala,Asp,Glu,Gly,His,Ile,Asn,Arg,Ser,Thr,Val,或Trp,或
(ii)位置370处的Trp,或
(iii)位置399处的Ala,Gly,Ile,Leu,Met,Asn,Ser,Thr,Trp,Phe,His,Lys,Arg或Tyr，或
(iv)位置366处的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gln,Phe,Gly,Ile,Leu,Met,或Tyr。
在一个实施方案中，所述第一多肽在位置409处具有Arg，而所述第二多肽具有
(i)位置368处的Asp,Glu,Gly,Asn,Arg,Ser,Thr,Val,或Trp,或
(ii)位置370处的Trp,或
(iii)位置399处的Phe,His,Lys,Arg或Tyr,或
(iv)位置366处的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gln。
除了上文指定的氨基酸取代以外，所述第一和第二多肽可以相对于野生型Fc序列含有另外的氨基酸取代、缺失或插入。
依照本发明的这类双特异性抗体可如实施例8中描述的生成。此外，生成的异二聚体蛋白质对CDC杀伤的影响可通过使用如实施例9中使用的测定法来测试。如此，在一个具体的实施方案中，通过如下测定CDC杀伤，将浓度为1x 106细胞/mL的悬液细胞在圆底96孔板中与总体积100μL中终浓度范围为0.0003至30.0μg/mL的抗体在室温在振荡器上预温育15min；以20％,30％或50％的终浓度添加正常人血清；在37℃温育45min；将板置于冰上；添加10μL碘化丙啶；并通过FACS分析测定细胞裂解。
在异二聚体蛋白质的一个具体的实施方案中，第一多肽中在对应于K409的位置处的氨基酸为R，而在第二多肽中在对应于F405的位置处的氨基酸为L，且其中所述第一和第二多肽的每一种在对应于人IgG1重链E345和E430处的氨基酸不是E，且在选自由S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y或W,不是Y,不是E,不是T,不是E,不是N,不是Q,不是I和不是S。
在异二聚体蛋白质的另一个具体的实施方案中，第一多肽中在对应于K409的位置处的氨基酸为R，而在第二多肽中在对应于F405的位置处的氨基酸为L，或反之亦然；且其中第一和第二多肽在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,G和Y。
在异二聚体蛋白质的又一个具体的实施方案中，第一多肽中在对应于K409的位置处的氨基酸为R，而在第二多肽中在对应于F405的位置处的氨基酸为L，或反之亦然；且其中所述第一和/或第二多肽在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为K,G和Y。
在异二聚体蛋白质的再一个具体的实施方案中，第一多肽中在对应于K409的位置处的氨基酸为R，而在第二多肽中在对应于F405的位置处的氨基酸为L，或反之亦然；且其中所述第一和/或第二多肽在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,S和Y。
在异二聚体蛋白质的再一个具体的实施方案中，第一多肽中在对应于K409的位置处的氨基酸为R，而在第二多肽中在对应于F405的位置处的氨基酸为L，或反之亦然；且其中所述第一和/或第二多肽在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,G和W。
在异二聚体蛋白质的又一个具体的实施方案中，第一多肽中在对应于K409的位置处的氨基酸为R，而在第二多肽中在对应于F405的位置处的氨基酸为L，或反之亦然；且其中所述第一和/或第二多肽在对应于E345,E430和Y436的位置处的氨基酸分别为R,G和I。
在再一个实施方案中，所述异二聚体蛋白质中的任意其他氨基酸可以如“其他氨基酸位置”部分中另外描述的。
实施例11显示将E345R突变引入双特异性CD20xEGFR抗体增强CDC功效。如此，在一个实施方案中，通过如下测定CDC功效，将浓度为1x 106细胞/mL的悬液细胞在圆底96孔板中与总体积100μL中终浓度范围为0.0003至30.0μg/mL的抗体在室温在振荡器上预温育15min；以20％,30％或50％的终浓度添加正常人血清；在37℃温育45min；将板置于冰上；添加10μL碘化丙啶；并通过FACS分析测定细胞裂解。
实施例9,15和16也描述了一些不同的双特异性抗体。
所述双特异性抗体可以例如包含CD20抗体的抗原结合区和CD38抗体的抗原结合区，以及依照本发明的氨基酸。例示性CD20-结合区包括记载于WO2004/035607(通过提述完整并入本文)的ofatumumab(2F2),7D8和11B8和rituximab(WO 2005/103081)的那些。例示性CD38-结合区包括记载于WO2006/099875(通过提述完整并入本文)的003和daratumumab(005)的那些。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体集合相同或不同靶物上的不同表位。如此，第一和第二多肽的结合区在一个实施方案中可以结合相同靶物上的不同表位。在另一个实施方案中，第一和第二多肽的第一和第二多肽的结合区可以结合不同靶物。
在另一个实施方案中，第一和第二多肽的结合区可以结合不同细胞上的不同靶物。
在一个实施方案中，第一和第二多肽中在对应于E345,E430的位置和对应于选自由人IgG1重链S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的位置处的氨基酸分别为不是D或E；E；S；Y；E；T；E；N；Q；I；和S，可以是相同或不同的。
在再一个实施方案中，一个或多个别的氨基酸可以是如本文中描述的。在一个具体的实施方案中，在异二聚体蛋白质的每个多肽中，在对应于K439的位置处的氨基酸为D或E。在另一个具体的实施方案中，在对应于S440的位置处的氨基酸为K或R。如此，在一个具体的实施方案中，在所述第一多肽中，在对应于人IgG1重链E345和E430的位置处的氨基酸不是E，在对应于选自由人IgG1重链S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254组成的组的位置的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：是Y,K,R,或W；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S，且在对应于人IgG1重链K439的位置处的氨基酸是D或E，而在所述第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345和E430的位置处的氨基酸不是E，在对应于人IgG1重链位置S440处的氨基酸是K或R。
Fc融合蛋白
在本发明的一个方面，依照本发明任意方面或实施方案的二聚体蛋白质是融合蛋白的一部分。依照本发明的融合蛋白可以指由两个或更多个共价连接的蛋白质片段组成的蛋白质，所述蛋白质片段不天然表达为单个蛋白质。融合蛋白可以例如通过本领域中普遍已知的重组克隆和表达技术产生，或者创建融合蛋白的方法可以在产生后进行。这类方法的例子是intein、蛋白连接酶、或其他本领域中普遍已知的酶方法。如此，依照本发明的融合蛋白理解为包含第一和第二多肽的所述二聚体蛋白质，所述第一和第二多肽各自至少包含免疫球蛋白重链的CH2和CH3区，其中所述第一和/或第二多肽还可以包含结合区。
如此，依照本发明的二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽还可以包含结合区。依照本发明的结合区理解为能结合靶物的多肽序列。如此，所述结合区可以是蛋白质、蛋白质配体、受体、抗原结合区、或配体-结合区，其能够结合与细胞、细菌、病毒粒体等关联的靶物。结合区可以例如包含受体、受体配体、配体、细胞因子、激素、或免疫球蛋白或抗体的抗原结合区的部分。
在一个实施方案中，所述结合区是选自下组的细胞因子：IL-2,IL-4,IL-6,IL-7,IL-10,IL-12,IL-13,IL-15,IL-18,IL-23,IL-24,IL-27,IL-28a,IL-28b,IL-29,KGF,IFNα,IFNβ,IFNγ,GM-CSF,CD40L,Flt3配体、干细胞因子、ancestim和TNFα。
在一个实施方案中，所述结合区是抗原结合区。在一些实施方案中，所述二聚体蛋白质的第一和/或第二多肽除Fc区以外还包含一个或多个或所有的抗体其他区域，即CH1区、VH区、CL区和/或VL区。如此，在一个实施方案中，所述第一多肽是全长抗体。在另一个实施方案中，所述第二多肽是全长抗体。
在另一个实施方案中，所述结合区是毒素，如天然存在的毒素。
缀合物
在一个方面，本发明的二聚体蛋白质还包含药物、毒素、放射性标记物、射线不透性试剂、顺磁剂、荧光剂、磷光剂、超声增强剂、唾液酸化或聚乙二醇(PEG)，任选地经由接头与至少一种所述多肽缀合。
在一个实施方案中，所述二聚体蛋白质是融合蛋白的一部分。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包含放射性标记物。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包含射线不透性试剂。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包含顺磁剂。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包含荧光剂。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包含磷光剂。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包含超声增强剂。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包含聚乙二醇(PEG)。
在另一个方面，本发明的二聚体蛋白质不在C端与另一分子(例如毒素或标记)缀合。在一个实施方案中，二聚体蛋白质与另一分子在另一位点(通常在不干扰寡聚体形成的位点)缀合。例如，二聚体蛋白质可以在其他位点与选自毒素(包括放射性同位素)、前药或药物的化合物连接。这种化合物可以使靶细胞的杀伤更有效，例如在癌症治疗中。因此所获二聚体蛋白质是免疫缀合物。
因此，在进一步的方面，本发明提供一种与一种或更多种治疗部分(例如细胞毒素，化疗药物，细胞因子，免疫抑制剂和/或放射性同位素)连接或缀合的二聚体蛋白质例如抗体。这种缀合物在本发明中被称为“免疫缀合物”或“药物缀合物”。包括一种或更多种细胞毒素的免疫缀合物被称作“免疫毒素”。
细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的(例如，杀伤)的任意药剂。用于形成本发明免疫缀合物的合适治疗剂包括红豆杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴乙锭，吐根碱，丝裂霉素，鬼臼亚乙苷，替尼泊甙，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，多柔比星，道诺红菌素，二羟基炭疽菌素二酮，美登素或其类似物或衍生物，enediyene抗肿瘤抗生素包括新制癌菌素在内，刺孢霉素，埃斯波霉素，蒽环类抗生素，lidamycin，kedarcidin或其类似物或衍生物，anthracyclins，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，和嘌呤霉素，抗代谢物(例如氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，fludarabin，5-氟尿嘧啶，氨烯咪胺，羟基脲，天冬酰胺酶，吉西他滨，克拉屈滨)，烷化剂(例如氮芥，thioepa，苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，亚硝脲氮芥(BSNU)，环己亚硝脲(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲霉素，氮烯唑胺(DTIC)，甲基苄肼，丝裂霉素C，顺铂和其他铂衍生物，例如卡铂；以及多卡米星A，多卡米星SA，CC-1065(亦称为rachelmycin)，或CC-1065的类似物或衍生物，多拉司他汀，吡咯并[2,1-c][1,4]benzodiazepins(PDBs)或其类似物，抗生素(例如更生霉素(从前的放线菌素)，博来霉素，道诺红菌素(从前的柔红霉素)，多柔比星，伊达比星，光辉霉素，丝裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素，氨茴霉素(AMC))，抗有丝分裂的药剂(例如，微管蛋白抑制剂)例如一甲基auristatinE，一甲基auristatin F，或多拉司他汀10的其他类似物或衍生物；组蛋白去乙酰化酶抑制剂例如异羟肟酸曲古抑菌素A，伏力诺他(SAHA)，贝林司他，LAQ824，和帕比司他以及苯甲酰胺，恩替司他，CI994，莫西司他和脂肪族酸化合物例如丁酸苯酯和丙戊酸，蛋白酶体抑制剂例如Danoprevir，硼替佐米，毒伞肽例如α-amantin，白喉毒素和相关分子(例如白喉A链及其活性片段和杂交分子)；蓖麻毒毒素(例如蓖麻毒A或去糖基化蓖麻毒A链毒素)，霍乱毒素，志贺样毒素(SLT-I，SLT-II，SLT-IIV)，LT毒素，C3毒素，志贺毒素，百日咳毒素，破伤风毒素，大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂，假单胞菌属外毒素，alorin，皂草素，蒴莲根毒素，gelanin，相思豆毒素A链，蒴莲根毒素A链，α-sarcin，油桐蛋白，石竹素蛋白，美国商陆蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜抑制剂，泻果素，巴豆毒素，sapaonaria officinalis抑制剂，白树毒素，mitogellin，局限曲菌素，酚霉素，和伊诺霉素毒素。其他合适的缀合分子包括抗菌/裂解肽例如CLIP，爪蟾抗菌肽2，蜂毒素，杀菌肽，和P18；核糖核酸酶(RNase)，DNase I，葡萄球菌肠毒素-A种，美洲商陆抗病毒蛋白，白喉毒素，和假单胞菌属内毒素。参见，例如，Pastan等,Cell 47,641(1986)和Goldenberg,Calif.A Cancer Journal for Clinicians44,43(1994)。可以与本发明别处描述的本发明的二聚体蛋白质组合施用的治疗剂(如，例如，抗癌细胞因子或趋化因子)也可以是可用于缀合本发明二聚体蛋白质的治疗性部分的候选物。
在一个实施方案中，本发明的药物缀合物包括与auristatins或auristatin肽类似物和衍生物缀合的如本文公开的二聚体蛋白质(US5635483；US5780588)。已经显示Auristatins干扰微管动力学，GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents和Chemother.45(12):3580-3584)并具有抗癌(US5663149)和抗霉菌活性(Pettit等,(1998)Antimicrob.Agents和Chemother.42:2961-2965。Auristatin药物部分可以经由接头，通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端粘附到二聚体蛋白质。
示例性auristatin实施方案包括N端连接的一甲基auristatin药物部分DE和DF，公开于Senter等.,Proceedings of the American Association for CancerResearch.45卷,摘要编号623,2004年3月28出版并描述于US 2005/0238649。
示例性的auristatin实施方案是MMAE(一甲基auristatin E)。另一个示例性的auristatin实施方案是MMAF(一甲基auristatin F)。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质包括缀合的核酸或核酸结合分子。在这种实施方案中，缀合的核酸是细胞毒核糖核酸酶，反义核酸，抑制性RNA分子(例如，siRNAs分子)或免疫刺激性核酸(例如，包含免疫刺激性CpG模体的DNA分子)。在另一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质与适体或核酶缀合。
在一个实施方案中，提供包括一种或更多种放射性标记的氨基酸的二聚体蛋白质。放射性标记的二聚体蛋白质可用于诊断和治疗两种目的(与放射性标记分子的缀合是另一个可能的特征)。用于多肽的标记的非限制性实例包括3H,14C,15N,35S,90Y,99Tc和125I,131I,和186Re。用于制备放射性标记的氨基酸和相关肽衍生物的方法是本领域已知的(参见，例如，Junghans等,Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第二版.,Chafner和Longo,eds.,Lippincott Raven(1996))和U.S.4,681,581,U.S.4,735,210,U.S.5,101,827,U.S.5,102,990(US RE35,500),U.S.5,648,471和U.S.5,697,902。例如，可以通过氯胺T法缀合放射性同位素。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质与放射性同位素或包含放射性同位素的螯合物缀合。例如，二聚体蛋白质可以与螯合剂接头例如DOTA、DTPA或tiuxetan缀合，这其允许二聚体蛋白质与放射性同位素形成复合物。二聚体蛋白质也可以或可选的包括一种或更多种放射性标记的氨基酸或其他放射性标记的分子，或与一种或更多种放射性标记的氨基酸或其他放射性标记的分子缀合。放射性标记的二聚体蛋白质可用于诊断和治疗两种目的。在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质与α发射体缀合。放射性同位素的非限制性实例包括3H,14C,15N,35S,90Y,99Tc,125I,111In,131I,186Re,213Bs,225Ac和227Th。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质可以与选自以下组的细胞因子缀合：IL-2,IL-4,IL-6,IL-7,IL-10,IL-12,IL-13,IL-15,IL-18,IL-23,IL-24,IL-27,IL-28a,IL-28b,IL-29,KGF,IFNa,IFN,IFNy,GM-CSF,CD40L,Flt3配体,干细胞因子,安塞司亭和TNFα。
本发明的二聚体蛋白质也可以通过共价缀合到多聚体进行化学修饰以例如增加它们的循环半衰期。示例性的多聚体，以及将它们粘附到肽的方法，显示于例如US 4,766,106，US 4,179,337，US 4,495,285和US 4,609,546。其他的多聚体包括聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量为约1,000-约40,000，例如约2,000-约20,000的PEG)。
可以使用将本发明的二聚体蛋白质缀合到缀合分子的本领域已知的任何方法，例如如上所述的那些，包括以下描述的方法：Hunter等,Nature 144,945(1962),David等,Biochemistry 13,1014(1974),Pain等,J.Immunol.Meth.40,219(1981)和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30,407(1982)。可以通过将其他部分化学缀合到二聚体蛋白质或其片段的N端侧面或C端侧面(例如，抗体H或L链)来产生这种二聚体蛋白质(参见，例如，Antibody Engineering Handbook,Osamu Kanemitsu编辑,Chijin Shokan出版(1994))。合适情况下，通过在内部残基或糖进行缀合也可以产生这种缀合的二聚体蛋白质衍生物。
药剂可以直接或间接缀合到本发明的二聚体蛋白质。第二药剂的间接缀合的实例是通过间隔物或接头部分缀合到双特异性抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基。在一个实施方案中，将二聚体蛋白质通过间隔物或接头缀合到前药分子，所述前药分子可以在体内被活化为治疗药物。在一些实施方案中，接头在胞内条件下是可切割的，这样的话接头的切割在胞内环境中从二聚体蛋白质释放药物单位。在一些实施方案中，接头是通过可切割药剂来切割的，所述可切割药剂存在于胞内环境(例如，在溶酶体或内体或小窝内)。例如，间隔物或接头是通过肿瘤细胞相关酶或其他肿瘤特定条件来切割的，借此形成活性药物。这种前药技术和接头的实例描述于Syntarga BV等的WO02083180,WO2004043493,WO2007018431,WO2007089149,WO2009017394和WO201062171。合适的抗体前药技术和多卡米星类似物还可以见于美国专利号6,989,452(Medarex)，此处引入作为参考。接头还可以或可选的是，例如肽基接头，其被胞内肽酶或蛋白酶切割，包括但不限于，溶酶体或胞内体蛋白酶。在一些实施方案中，肽基接头的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。切割药剂可以包括组织蛋白酶B和D以及胞浆素，已知其都能水解二肽药物衍生物，导致靶细胞内活性药物的释放(参见例如Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。在一个具体实施方案中，可被胞内蛋白酶切割的肽基接头是Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)接头或Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)接头(参见例如US6214345，其描述了具有Val-Cit接头的多柔比星的合成以及Phe-Lys接头的不同实例)。Val-Cit和Phe-Lys接头结构的实例包括但不限于下文描述的MC-vc-PAB，MC-vc-GABA,MC-Phe-Lys-PAB或MC-Phe-Lys-GABA，其中MC是马来酰亚胺基己酰基的缩写，vc是Val-Cit的缩写，PAB是p-氨基苄基氨基甲酸叔丁酯和GABA是γ-氨基丁酸的缩写。使用胞内蛋白水解释放治疗剂的优点是，药剂在缀合时通常是毒性降低的并且缀合物的血清稳定性通常较高。
仍在另一个实施方案中，接头单位是不可切割的，并且药物通过二聚体蛋白质或抗体降解来释放(参见US 2005/0238649)。通常，这种接头实质上不对胞外环境敏感。在接头的背景下，如本发明使用的“实质上不对胞外环境敏感”表示当二聚体蛋白质药物缀合化合物存在于胞外环境(例如血浆)时，二聚体蛋白质药物缀合化合物的样品中不超过20％，通常不超过约15％，更通常不超过约10％，和甚至更通常不超过约5％，不超过约3％，或不超过约1％的接头被切割。通过将二聚体蛋白质药物缀合化合物与血浆温育预定时间段(例如2，4，8，16或24小时)然后定量血浆中存在的游离药物量，可以确定接头是否实质上对胞外环境敏感。包括MMAE或MMAF和各种接头组分的示例性实施方案具有下列结构(其中Ab表示抗体，和p表示药物载量(或每个抗体分子的细胞生长抑制或细胞毒药物的平均数)是1到约8，例如p可为4-6，如3-5，或p可为1，2，3，4，5，6，7或8)。
其中可切割接头与auristatin组合的实例包括MC-vc-PAB-MMAF(也称为vcMMAF)和MC-vc-PAB-MMAE(也称为vcMMAE)，其中MC是马来酰亚胺基己酰基的缩写，vc是基于Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)接头的缩写，和PAB是对-氨基苄基氨基甲酸叔丁酯的缩写。
其他实例包括与不可切割接头组合的auristatins，例如mcMMAF(mc(MC与本上下文的mc相同)是马来酰亚胺基己酰基的缩写。
Ab-MC-vc-PAB-MMAF(vcMMAF)
Ab-MC-vc-PAB-MMAE(vcMMAE)
在一个实施方案中，药物接头部分是vcMMAE。vcMMAE药物接头部分和缀合方法公开于WO2004010957,US7659241,US7829531,US7851437和US11/833,028(SeattleGenetics,Inc.)，(其在此引入作为参考)，和使用类似于其中公开的方法的方法将vcMMAE药物接头部分与二聚体蛋白质在半胱氨酸处结合。
在一个实施方案中，药物接头部分是mcMMAF。mcMMAF药物接头部分和缀合方法公开于US7498298,US 11/833,954和WO2005081711(Seattle Genetics,Inc.)，(其在此引入作为参考)，和使用类似于其中公开的方法将mcMMAF药物接头部分与二聚体蛋白质在半胱氨酸处结合。
在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质连接到螯合剂接头，例如tiuxetan，其允许例如双特异性抗体缀合到放射性同位素。
在一个实施方案中，二聚体蛋白质缀合于毒素或有效负载(payload)如药物，其在比中性pH更低的pH具有最佳功能。
在一个实施方案中，二聚体蛋白质的第一和第二多肽两者与相同的一种或更多种治疗部分直接或间接偶联。
在一个实施方案中，仅二聚体蛋白质的第一或第二多肽与一种或更多种治疗部分直接或间接偶联。
在一个实施方案中，二聚体蛋白质的第一和第二多肽与不同的治疗部分直接或间接偶联。例如，在二聚体蛋白质是双特异性抗体并通过两种不同单特异性抗体(例如第一和第二抗体)的受控Fab-臂交换来制备的实施方案中，可以通过使用与不同治疗部分缀合或联合的单特异性抗体来获得这种双特异性抗体。
寡聚体
本发明部分基于以下发现，包含至少免疫球蛋白重链的CH2和CH3区以及任选地铰链区的二聚体蛋白质不仅在结合靶分子时而且在溶液中能形成寡聚体如六聚体。该寡聚化经由临近Fc区的非共价联合发生，且尤其已对于具有E345,E430和S440中突变的抗体观察到，如实施例中记载的。
在一个方面，本发明涉及包含至少两个非共价联合的二聚体蛋白质的寡聚体，每个二聚体蛋白质均依照本文中描述的任意方面或实施方案。
在一个实施方案中，本发明提供包含6个非共价联合的二聚体蛋白质的六聚体，每个二聚体蛋白质均依照前述方面或实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述六聚体的至少1个，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个二聚体蛋白质是抗体。
在一个实施方案中，本发明提供包含6个非共价联合的二聚体蛋白质的寡聚体，至少1个是依照本发明的任一方面或实施方案的二聚体蛋白质，且至少一个二聚体蛋白质是包含Fc域(包含至少CH2和CH3区以及任选地铰链区)的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供包含6个非共价联合分子(如二聚体蛋白质)的六聚体，至少1个是依照任意前述方面或实施方案的二聚体蛋白质，且至少一个二聚体蛋白质是包含Fc域(包含至少CH2、CH3区和铰链区)的抗体，其中对应于人IgG1重链E345,E430和S440的至少一个位置分别为E,E和S。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆或多克隆抗体，所述单克隆抗体任选地选自在以下部分称为“第二抗体”的已知抗体。
组合物
本发明还涉及包含本发明的一种或多种二聚体蛋白质的组合物，任选地以依照任意前述方法或实施方案的寡聚体如六聚体的形式。本发明的组合物可以是包含本发明的二聚体蛋白质和药学可接受的载体的药物组合物。所述药物组合物可以与药学可接受的载体或稀释剂以及任意其他依照常规技术的已知佐剂和赋形剂(如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,19th Edition,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995中披露的那些)一起配制。
本发明的组合物可以是包含依照本发明任意方面或实施方案的二聚体蛋白质、一种或多种抗体和药学可接受的载体的药物组合物。
在一个具体的实施方案中，所述组合物包含依照本发明任意方面或实施方案的第一二聚体蛋白质，和依照本发明任意方面或实施方案的第二二聚体蛋白质，以及药学可接受的载体。药学可接受的载体或稀释剂以及任意其他已知的佐剂和赋形剂应适用于本发明的二聚体蛋白质和选定的施用模式。基于对本发明的二聚体蛋白质或药物组合物在抗原结合上的期望生物学特性缺少显著不利影响(例如低于实质性影响(10％或更低的相对抑制、5％或更低的相对抑制等))来测定载体和药物组合物的其他成分的适宜性。
本发明的药物组合物还可以包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去污剂(例如非离子型去污剂，如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如糖、糖醇如山梨糖醇和甘露糖醇，或无蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂、和/或适用于包含在药物组合物中的其他材料。
药学可接受的载体包括任意和所有适宜的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等，其与本发明的二聚体蛋白质生理性相容。
本发明药物组合物可以采用的合适的水性和非水性载体实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、和芝麻油，羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯，例如油酸乙酯，和/或各种缓冲液。其它的载体是药物领域众所周知的。
药学可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和无菌粉末，用于即时制备无菌可注射溶液或分散体。这些介质和试剂在药物活性物质上的使用是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与二聚体蛋白质不相容，本文涵盖了它们在本发明药物组合物中的使用。
通过使用包衣材料，例如卵磷脂，在分散体情况下通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动性。
本发明的药物组合物还可以包括药学可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠和类似物；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、等等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。
本发明的药物组合物还可以在组合物中包括等渗剂，例如组合物中的糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。
本发明的药物组合物还可以含有一种或多种适合于所选给药途径的佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可以提高药物组合物的保存寿命或有效性。本发明的二聚体蛋白质可以用保护化合物免于快速释放的载体制备，这样的载体例如缓释剂型，包括植入体、经皮贴片和微胶囊化地输送系统。这样的载体可以包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙烯乙酸共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸，单独地或者与蜡一起，或者其它本领域众所周知的材料。用于制备这类制剂的方法是本领域技术人员一般知道的。见例如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在一个实施方案中，可以配制本发明的二聚体蛋白质以确保在体内适当的分布。用于胃肠外给药的药学可接受载体包括无菌含水溶液或分散体用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和试剂用于药物活性物质的使用是本领域已知的。任何常规介质或试剂，只要其不与二聚体蛋白质不相容，本文涵盖了它们在本发明药物组合物中的使用。组合物中还可以纳入补充活性化合物。
用于注射的药物组合物典型地必须是无菌的，并且在制造和储存条件下稳定。组合物可以配制成溶液、微乳剂、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。，可以例如通过下述手段来保持合适的流动性：通过使用包衣，例如卵磷脂；在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小；以及通过使用表面活性剂。在许多情况下，优选地在组合物中含有等渗剂，例如糖、多元醇如甘油、甘露醇、山梨醇、或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含可延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，而实现。可以这样制备无菌可注射溶液：将所需量的二聚体蛋白质纳入根据需要含有一种成分或多种成分的组合(例如上面所列举的)的合适溶剂中，随后通过无菌微过滤。一般地，分散体是通过将二聚体蛋白质纳入含有基础分散介质和所需的其它成分(例如来自上面列举的)的无菌媒介中而制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些过程可以从先经过了无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的的粉末。
无菌可注射溶液的制备可以通过按照需要，将所需量的二聚体蛋白质加入到具有一种或多种上文所列举成分的组合的合适溶剂中，随后进行无菌微过滤。一般地，分散体的制备是通过将二聚体蛋白质加入到含有基础分散介质和必需的其它来自上面列举的成分的无菌介质内。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些过程从先前经过无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的期望成分的粉末。
pH
本发明的组合物可以包含适宜的缓冲系统以控制pH及由此存在的二聚体蛋白质的寡聚化状态。例如在6.4或更低的pH，如pH 5.0，依照本发明的二聚体蛋白质通常主要以单体形式，即单个二聚体蛋白质存在，而在高于pH 6.4如pH 6.8时，二聚体蛋白质主要以寡聚体形式如六聚体形式存在。二聚体蛋白质的六聚体形式由6个二聚体蛋白质构成，其彼此非共价联合以形成六聚体形式。术语“单体形式”在依照本发明的二聚体蛋白质的背景中指单一的个体二聚体蛋白质，其由彼此不非共价联合的二聚体蛋白质构成。实施例31描述了如何通过调节pH来观察这一点。
在一个实施方案中，所述组合物包含药学可接受的载体，其为水性缓冲溶液。
在一个实施方案中，水性缓冲溶液的pH为至少约6.5，如6.5至约9.0，如约7.0至约8.0，如约7.4。适合将pH维持在该范围内和/或接近生理学pH的缓冲系统包括磷酸盐缓冲系统。如此，在一个实施方案中，所述水性缓冲溶液是磷酸盐缓冲系统。在一个实施方案中，所述二聚体蛋白质在pH为约6.8的磷酸盐缓冲液中主要为寡聚体形式，如六聚体形式。
在一个实施方案中，水性缓冲溶液的pH为低于pH 6.5，如约4.0至6.4，如约5.0至约6.0。适合将pH维持在该范围内的缓冲系统包括基于柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸和/或甘氨酸的缓冲系统。如此，在一个实施方案中，所述缓冲系统是基于乙酸盐、组氨酸、甘氨酸、柠檬酸盐、盐酸盐、乳酸盐和/或琥珀酸盐的缓冲系统。这类缓冲系统还可以是缓冲系统的组合。在一个实施方案中，所述二聚体蛋白质在低于6.0的pH(如约5.0)主要为单体形式，即单个二聚体蛋白质。
如实施例31中显示的，依照本发明的二聚体蛋白质的寡聚化是一种可由pH控制的可逆过程。这对于应用于制备二聚体蛋白质期间的加工如纯化步骤可能有用，其中可以通过降低pH来避免例如纯化柱、跨层流动过滤、闭合端过滤和/或纳米过滤装置的堵塞而不损害终产物如抗体的功效。此外，在纯化期间将pH降至低于6.8(例如5.0和5.5)能改进纯化产率，因为二聚体蛋白质主要为单体形式，由此不太可能像二聚体蛋白质的六聚体形式那样堵塞(clot)，如实施例32显示的。此外，在纯化期间将pH降至低于6.8能实现通过层析对非特异性聚集物的除去，如使用弱阳离子交换树脂。如此，一旦在低于6.8的pH纯化二聚体蛋白质，即可通过将溶液的pH增加至6.8的pH来恢复寡聚体例如六聚体形式。
混合物
在一些方面，本发明提供包含二聚体蛋白质和第二分子的组合物，其中所述第二分子也包含第一和第二多肽，其各自至少包含免疫球蛋白重链的CH2,CH3和铰链区。如此，所述二聚体蛋白质应理解为依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质，如亲本二聚体蛋白质的二聚体蛋白质，如亲本二聚体蛋白质的变体二聚体蛋白质。
可以有利地调整组合物中二聚体蛋白质和第二分子的相对量来调控形成的寡聚体/六聚体中每种不同的二聚体蛋白质的平均单元数。这相应地提供了一种在一种或多种所述二聚体蛋白质和第二分子结合靶物时优化效应器功能和/或靶物结合特性的手段。
下文描述了包含二聚体蛋白质和第二分子的混合物的组合物的具体方面和实施方案。尽管适用于依照本发明的所有类型的二聚体蛋白质和所有类型的含有Fc的第二分子(包括例如具有配体结合区的Fc融合蛋白)，对于两种组分尤其涵盖抗体分子。
在一个方面，本发明的组合物包含依照本发明任一方面或实施方案的第一二聚体蛋白质，依照本发明任一方面或实施方案的第二二聚体蛋白质，和药学可接受的载体。
在一个方面，所述第二分子中在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的至少一个氨基酸是天然IgG1重链中在该位置处正常存在的氨基酸。例如，第二分子的重链多肽在对应于E345,E430和S440的每个位置处可分别包含E,E和S。依照该方面，第二分子如此可包含，例如人IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体的天然Fc区序列，或特别是至少在所有3个E345,E430和S440中无氨基酸取代的IgG1,IgG2,IgG3,或IgG4Fc序列。
在一个实施方案中，所述第二分子时抗体，特别是公知的已在临床或预临床中使用的抗体，如具有适宜的安全性概况的抗体。在再一个实施方案中，所述第二抗体可能具有适宜的安全性概况但可能不充分有效。
在一个实施方案中，所述二聚体蛋白质也是抗体，从而所述组合物包含第一抗体和第二抗体，其中仅第一抗体是本发明的二聚体蛋白质。包含能增加效应器功能的突变的第一抗体和不包含这类突变的第二抗体的组合可以提供增加的效应器功能，如实施例17中显示的。如此，不受理论束缚地，认为例如该方法可用于将对于特定应用已证实为安全但自身不足够有效的治疗性抗体作为第二抗体与依照本发明的二聚体蛋白质组合，由此产生有效的组合。
适宜的第二抗体的例子包括但不限于选自下组的任一种：(90Y)clivatuzumabtetraxetan；(90Y)tacatuzumab tetraxetan；(99mTc)fanolesomab；(99mTc)nofetumomabMerpentan；(99mTc)pintumomab；3F8；8H9；abagovomab；阿巴西普；阿昔单抗；Actoxumab；阿达木单抗；adecatumumab；阿非莫单抗；aflibercept；Afutuzumab；alacizumab pegol；albiglutide；ALD518；阿法赛特；阿仑单抗；Alirocumab；altumomab；Altumomabpentetate；alvircept sudotox；amatuximab；AMG714/HuMax-IL15；anatumomabmafenatox；Anrukinzumab(＝IMA-638)；apolizumab；arcitumomab；aselizumab；atacicept；atinumab；Atlizumab(＝托珠单抗)；atorolimumab；baminercept；Bapineuzumab；巴利昔单抗；bavituximab；bectumomab；belatacept；belimumab；benralizumab；bertilimumab；besilesomab；贝伐单抗；Bezlotoxumab；biciromab；bifarcept；bivatuzumab；Bivatuzumab mertansine；blinatumomab；blosozumab；brentuximab vedotin；briakinumab；briobacept；brodalumab；canakinumab；cantuzumabmertansine；cantuzumab ravtansine；caplacizumab；capromab；Capromab pendetide；carlumab；catumaxomab；CC49；cedelizumab；certolizumab pegol；西妥昔单抗；Ch.14.18；citatuzumab bogatox；cixutumumab；Clazakizumab；clenoliximab；Clivatuzumabtetraxetan；conatumumab；conbercept；CR6261；crenezumab；dacetuzumab；达利珠单抗；dalantercept；dalotuzumab；daratumumab；Demcizumab；地诺单抗；Detumomab；Dorlimomabaritox；drozitumab；dulaglutide；ecromeximab；依库珠单抗；edobacomab；依决洛单抗；依法利珠单抗；efungumab；elotuzumab；elsilimomab；enavatuzumab；enlimomab；enlimomabpegol；enokizumab；ensituximab；epitumomab；epitumomab cituxetan；依帕珠单抗；erlizumab；ertumaxomab；依那西普；etaracizumab；etrolizumab；exbivirumab；Fanolesomab；faralimomab；farletuzumab；Fasinumab；FBTA05；felvizumab；Fezakinumab；ficlatuzumab；figitumumab；flanvolumab；fontolizumab；foralumab；foravirumab；fresolimumab；fulranumab；galiximab；ganitumab；gantenerumab；gavilimomab；吉妥珠单抗；吉妥珠单抗奥唑米；gevokizumab；girentuximab；glembatumumab；Glembatumumabvedotin；戈利木单抗；Gomiliximab；GS6624；抗-CD74抗体；如WO2011/110642公开的抗cMet抗体；如WO2011/147986或WO2011/147982公开的抗Her2抗体；如WO2004/058797公开的抗IL-8抗体；如WO2004/045512公开的抗TAC抗体；如WO2010/066803或WO 2011/157741公开的抗组织因子(TF)抗体；ibalizumab；替伊莫单抗；icrucumab；igovomab；Imciromab；inclacumab；indatuximab ravtansine；英夫利昔单抗；inolimomab；inotuzumabozogamcin；intetumumab；碘(I241)girentuximab；匹伊单抗；iratumumab；itolizumab；ixekizumab；keliximab；labetuzumab；lebrikizumab；lemalesomab；lenercept；lerdelimumab；lexatumumab；libivirumab；林妥珠单抗；lorvotuzumab mertansine；lucatumumab；lumiliximab；mapatumumab；maslimoma；马妥珠单抗；mavrilimumab；美泊利单抗；metelimumab；milatuzumab；minretumomab；mirococept；米妥莫单抗；mogamulizumab；morolimumab；motavizumab；moxetumomab；pasudotox；莫罗单抗-CD3；nacolomab tafenatox；namilumab；naptumomab estafenatox；narnatumab；那他珠单抗；nebacumab；necitumumab；nerelimomab；尼妥珠单抗；Nivolumab；Nofetumomab；merpentan；obinutuzumab；Ocaratuzumab；ocrelizumab；odulimomab；奥法木单抗；olaratumab；olokizumab；奥马珠单抗；onartuzumab；奥那西普；oportuzumab monatox；oregovomab；otelixizumab；oxelumab；ozoralizumab；pagibaximab；帕利珠单抗；帕尼单抗；panobacumab；pascolizumab；pateclizumab；patritumab；pegsunercept；Pemtumomab；帕妥珠单抗；pexelizumab；Pintumomab；Placulumab；ponezumab；priliximab；pritumumab；PRO140；quilizumab；racotumomab；radretumab；rafivirumab；ramucirumab；兰尼单抗；raxibacumab；regavirumab；reslizumab；RG1507/HuMax-IGFlR；RG1512/HuMax-pSelectin；rilonacept；rilotumumab；利妥昔单抗；robatumumab；roledumab；romosozumab；rontalizumab；rovelizumab；ruplizumab；samalizumab；sarilumab；satumomab；Satumomabpendetide；secukinumab；sevirumab；sibrotuzumab；sifalimumab；siltuximab；siplizumab；sirukumab；solanezumab；solitomab；Sonepcizumab；sontuzumab；sotatercept；stamulumab；sulesomab；suvizumab；tabalumab；Tacatuzumab tetraxetan；tadocizumab；talizumab；tanezumab；taplitumomab paptox；tefibazumab；telimomabaritox；tenatumomab；teneliximab；teplizumab；teprotumumab；TGN1412；Ticilimumab(＝tremelimumab)；tigatuzumab；TNX-650；托珠单抗(＝atlizumab)；toralizumab；torapsel；托西莫单抗；tralokinumab；曲妥珠单抗；曲妥珠单抗emtansine；TRBS07；trebananib；tregalizumab；tremelimumab；tucotuzumab celmoleukin；tuvirumab；ublituximab；urelumab；urtoxazumab；ustekinumab；vapaliximab；vatelizumab；vedolizumab；veltuzumab；vepalimomab；vesencumab；visilizumab；volociximab；Vorsetuzumabmafodotin；votumumab；扎妥木单抗；zanolimumab；ziralimumab；和zolimomab aritox。
在一个方面，所述第二分子是依照本发明的二聚体蛋白质。依照该方面的组合物如此包含两种或更多种不同二聚体蛋白质的混合物，每种均依照本发明的任一方面或实施方案，如上文描述的。通常，在正确的pH和/或靶物结合条件，包含两种或更多种不同二聚体蛋白质的六聚体可以在该组合物中形式，尤其在水性溶液或缓冲液中。本发明的第一和第二二聚体蛋白质相比于任何野生型或天然存在的二聚体蛋白质将对于彼此寡聚化具有偏好，如实施例3中显示的。
在一个实施方案中，所述组合物包含第一二聚体蛋白质和第二二聚体蛋白质，任选地还包含药学可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明可以设计包含第一和第二二聚体蛋白质的组合物，其中第一和第二二聚体蛋白质两者均包含第一和第二多肽，其中在所述第一和第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二(如两种)多肽中，在对应于人IgG1重链E345和E430的位置处的氨基酸不是E，而在选自由对应于人IgG1重链S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253,和S254位置组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：Y,W,K或R；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。所述第一和第二二聚体蛋白质可以是依照本发明的任意二聚体蛋白质。
在一个实施方案中，第一和第二二聚体蛋白质之一或两者包含重链多肽，其中对于一种或两种(如每种)多肽，从例如由R,Q,N,K,Y,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V和W组成的组，如由R,Q,N,K和Y组成的组分别选择在对应于E345位置处的氨基酸。
在一个实施方案中，第一和第二二聚体蛋白质之一或两者包含重链多肽，其中对于一种或两种(如每种)多肽，从例如由G,T,S,F,H,A,C,D,I,K,L,M,N,P,Q,R,V,W和Y组成的组，如由G,T,S,F和H组成的组分别选择在对应于E430位置处的氨基酸。
在一个实施方案中，第一和第二二聚体蛋白质之一或两者包含重链多肽，其中对于一种或两种(如每种)多肽，在选自由对应于人IgG1重链中位置S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253,和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为Y,R,K,或W；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二种(如两者)二聚体蛋白质包含重链多肽，其中对于一种或两种(如每种)多肽，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,G和Y。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为K,G和Y。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,S和Y。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R,G和W。
在一个实施方案中，在所述第一和/或第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430和Y436的位置处的氨基酸分别为R,G和I。
在另一个实施方案中，第一和第二二聚体蛋白质之一或两者包含重链多肽，其中在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别为R；G；和Y或W，且其中Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254的一个或至少一个为不是Y；D或E；T；E；N；Q；I；和S。
在一个实施方案中，所述第一或第二二聚体蛋白质在所述第一和第二多肽两者中包含指定的氨基酸，而另一种二聚体蛋白质仅在所述第一或第二多肽中包含指定的氨基酸。
在一个实施方案中，所述第一和第二二聚体蛋白质两者均在所述第一和第二多肽两者中包含指定的氨基酸。
在一些实施方案中，重链多肽特定位置处的氨基酸在第一和第二二聚体蛋白质之间不同以调解两种二聚体蛋白质的非共价联合的强度或特异性。这可以例如通过使用如上文描述的在对应于K439,S440,K447,K448、和/或K449的位置处具有特定氨基酸的第一和/或第二二聚体蛋白质来实现。
在一个实施方案中，第一二聚体蛋白质的多肽在对应于K439的位置处包含不是K的氨基酸，且第二二聚体蛋白质的多肽在对应于S440的位置处包含不是S的氨基酸，条件是S440中的氨基酸不是Y或W。例如，在第一二聚体蛋白质中，在对应于K439的位置处的氨基酸可以是D或E，且在第二二聚体蛋白质中，在对应于S440的位置处的氨基酸可以是K,H或R,如K或R。可将类似策略用于对应于K447,448和449位置处的氨基酸的组合。表2显示要一起使用的第一二聚体蛋白质和第二二聚体蛋白质中的这些位置处的例示性氨基酸，由“+”标识分开。在这些方面和实施方案的任一种中，所述第一和第二二聚体蛋白质之一或两者可以是抗体(例如分别为Ab1和Ab2)。
表2：可另外存在于两种二聚体蛋白质(例如Ab1+Ab2)中的例示性位置和氨基酸
在再一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链K439的位置处的氨基酸是E或D，任选地E，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链S440的位置处的氨基酸是K或R，任选地K。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,K439,和S440的位置处的氨基酸分别是R,K,Q,N,或Y；G,S,T,F或H；D或E；和Y或W，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别是R,K,Q,N,或Y；G,S,T,F或H；和K或R。在再一个实施方案中，在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链Y436的位置处的氨基酸是I。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链K439的位置处的氨基酸是E或D，任选地E，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链S440的位置处的氨基酸是K或R，任选地K，且在选自由对应于人IgG1重链中位置Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253,和S254组成的组的位置中的至少一个氨基酸分别为不是Y；D或E；T；E；N；Q；I；和S。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链E345,E430,K439,和S440的位置处的氨基酸分别是R,G,E,和Y，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链E345,E430,K439,和S440的位置处的氨基酸分别是R,G,K,和K。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链E345,E430,K439,和S440的位置处的氨基酸分别是R,G,E,和Y，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,和S440的位置处的氨基酸分别是R,G,和K。
在一个备选的实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链E345,E430,和S440的位置处的氨基酸分别是K,G,和Y；或者分别为R,G和W；或者分别为R,G,和K，或者在对应于人IgG1重链E345,E430和Y436的位置处的氨基酸分别为R,G,和I。此外，在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸分别是K,G,和K；或者分别为R,S,和K；或者分别为R,G,和R；或者分别为R,S,和R。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链E345,E430,K439,和S440的位置处的氨基酸分别是R,G,E,和Y，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,Y436,和S440的位置处的氨基酸分别是R,G,I,和K。
在再一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链K447的位置处的氨基酸是D或E，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链K447的位置处的氨基酸是K,R,或H，且在对应于人IgG1重链448的位置处的氨基酸是P。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链K447的位置处的氨基酸是D或E，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链K447的位置处的氨基酸是K,R,或H，且在对应于人IgG1重链448的位置处的氨基酸是K,R,或H，且在对应于人IgG1重链449的位置处的氨基酸是P。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链K439和K447的位置处的氨基酸分别是D或E；和D或E，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链S440,K447,和448的位置处的氨基酸分别是K或R；K,R,或H；和P。
在一个实施方案中，所述第一或第二二聚体蛋白质的任一个在所述第一和第二多肽两者中包含指定的氨基酸，而另一种二聚体蛋白质仅在所述第一或第二多肽中包含指定的氨基酸。
在一个实施方案中，所述第一和第二二聚体蛋白质两者均在所述第一和第二多肽两者中包含指定的氨基酸。在再一个实施方案中，所述第一或第二二聚体蛋白质可以是抗体，而另一种二聚体蛋白质可以是如本文中描述的融合蛋白或缀合物。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链E345,E430,S440,和K447的位置处的氨基酸分别是R,G,Y,和D/E，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,S440,K447和448的位置处的氨基酸分别是R,G,Y,K/R/H和P，或反之亦然。
在一个实施方案中，在所述第一二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，对应于人IgG1重链E345,E430,S440,和K447的位置处的氨基酸分别是R,G,Y,和D/E，且在所述第二二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345,E430,S440,K447,448,和449的位置处的氨基酸分别是R,G,Y,K/R/H,K/R/H,和P，或反之亦然。
在一个包含第一和第二二聚体蛋白质的组合物的具体的实施方案中，所述第一和第二二聚体蛋白质的第一和第二多肽两者均在特定位置包含指定的氨基酸。
在一个实施方案中，至少一个所述第一和第二二聚体蛋白质是抗体。
在一个实施方案中，所述第一和第二二聚体蛋白质两者均为抗体。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二种，如至少一种所述二聚体蛋白质是异二聚体蛋白质，如双特异性抗体。它可以是本文描述的任意异二聚体蛋白质。
在一个实施方案中，所述第一和第二抗体结合相同抗原的相同表位。
在一个实施方案中，所述第一和第二抗体包含相同的可变重链和轻链区序列。
在一个实施方案中，所述第一和第二抗体结合不同抗原或相同抗原上的不同表位。
在另一个实施方案中，所述第一和/或第二种，如至少一种所述二聚体蛋白质是融合蛋白。
前述方面或实施方案的组合物的二聚体蛋白质可以含有结合特定靶物的结合区。
在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种另外的依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质，如3或6个，或如4、5、7、8、9或更多个二聚体蛋白质。
在另一个实施方案中，所述第一和/或第二个，如至少一个所述二聚体蛋白质是Fc片段。
在一个实施方案中，所述组合物包含超过两种不同的，如3、4、5或6种不同的依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质。
在一个具体的实施方案中，所述组合物包含一种或多种二聚体蛋白质和Fc片段，其中所述一种或多种二聚体蛋白质包含第一和第二多肽，且其中在所述第一和第二多肽中，在对应于人IgG1重链E345和E430的位置处的氨基酸不是E，且在选自由对应于人IgG1重链位置S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253,和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：Y,W,K或R；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S；且其中所述Fc片段包含第一和第二多肽，其中在所述第一和第二多肽两者中，在对应于人IgG1重链E345和E430的位置处的氨基酸不是E，且在选自由对应于人IgG1重链位置S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253,和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：Y,W,K或R；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。在再一个实施方案中，所述一种或多种二聚体蛋白质和/或Fc片段可以是融合蛋白或缀合物。
在一个实施方案中，组合物包含依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质，其中所述第一二聚体蛋白质连接于第一前药，而所述第二二聚体蛋白质连接于第二前药。例如，第一和第二前药中的一种可以能够激活另一前药。
在一个实施方案中，所述第一和第二二聚体蛋白质仅一种包含靶物结合区。这可用于例如药物组合物，其中“仅Fc”二聚体蛋白质缀合于治疗物，或诊断性化合物与具有对靶物结合特异性的二聚体蛋白质混合。
在一个实施方案中，所述第一和第二二聚体蛋白质两者均包含靶物结合区。如果第一和第二二聚体蛋白质是异二聚体蛋白质，那么它们可以结合相同靶物上的不同表位或结合不同靶物。涵盖关于这类结合的任意组合。通过对于每种二聚体蛋白质选择不同表位和/或靶物，可以将六聚体形成优化未主要发生于表达两种表位或靶物的细胞、细菌或病毒粒体上。这提供了指引针对特定细胞类型的免疫应答的机制。另外，结合相同靶物分子上的不同表位的二聚体蛋白质的混合物可提供与多克隆抗体类似的效果。
在一些实施方案中，第一和第二二聚体蛋白质的至少一种是如本文中限定的抗体。
在一个实施方案中，第一和第二二聚体蛋白质两者均为抗体，代表第一和第二抗体。在一个实施方案中，所述抗体结合相同抗原上的相同表位。任选地，两种抗体的抗原结合区是相同的，即包含相同的可变重链和轻链区序列。
在另一个实施方案中，第一和第二种抗体结合不同抗原或相同抗原上的不同表位。
在另一个实施方案中，第一和第二种抗体结合不同细胞上的不同抗原。
在一个实施方案中，第一和第二种抗体可以各自选自不限于单特异性、双特异性和多特异性抗体。另外，在前述任意方面或实施方案中，所述第一和第二二聚体蛋白质的至少一种可以是包含在临床或预临床使用中的已知抗体(例如选自上文所列的“第二抗体”)的抗原结合区的抗体。
组合物的非限制性例子包含：
a)包含结合区的第一二聚体蛋白质；
b)第一和第二二聚体蛋白质，其中所述第一和第二二聚体蛋白质结合相同靶物上的不同抗原或结合不同靶物；
c)本发明的第一二聚体蛋白质，其中所述第一二聚体蛋白质包含对应于人IgG1重链K439位置处的不是K的氨基酸，且本发明的第二二聚体蛋白质，其在对应于人IgG1重链S440的位置处包含不是S,Y,或W的氨基酸；任选地位置K439处的氨基酸在第一二聚体蛋白质中是E，而位置S440处的氨基酸在第二二聚体蛋白质中是K。
d)本发明的第一二聚体蛋白质和第二二聚体蛋白质，其中在第二二聚体蛋白质中对应于人IgG1重链E345和E430的位置处的氨基酸不是E
e)本发明的第一二聚体蛋白质和第二二聚体蛋白质，例如第二种抗体，其中在第二二聚体蛋白质中对应于人IgG1重链E345或E430的位置处的氨基酸不是E。
f)第一二聚体蛋白质和第二二聚体蛋白质，其中第一和第二二聚体蛋白质的任一种包含调控一种或多种效应器功能和/或所述第一或第二二聚体蛋白质的药动学概况的氨基酸突变。
所述第一和第二二聚体蛋白质还可以包含记载于a)至e)的方面的组合。例如，所述第一和第二二聚体蛋白质可具体包含记载于b)和c)的两种特征。
在一个实施方案中，当第一和第二二聚体蛋白质的组合结合其在表达靶物的细胞或病毒粒体上的靶物时，特异性增加。
在上述任意方面或实施方案中，所述组合物可包含至少一种另外的依照本发明的二聚体蛋白质。例如，组合物可以包含3、4、5、6、7、8、9或更多种二聚体蛋白质，每种均依照本发明的方面或实施方案。可以调整每种二聚体蛋白质的相对量以优化形成的六聚体的期望特性，例如靶细胞特异性、效应器功能、六聚体亲合力和/或稳定性。另外，包含结合相同靶物上不同表位的二聚体蛋白质的组合物可以类似于或如同多克隆抗体组合物那样发挥功能。
或者，在上述每种组合物中包含的二聚体蛋白质和第二分子可以以组件试剂盒提供，用于在例如成像或治疗中同时、分开或序贯使用。
方法
本发明还涉及一种提高包含第一和第二多肽的亲本二聚体蛋白质在溶液中的寡聚化和/或效应器功能的方法，每个多肽至少包含免疫球蛋白重链的CH2和CH3，上述方法包括引入所述第一和/或第二多肽在至少对应于E345,E430的位置处和选自下组的人IgG1重链位置处的氨基酸取代：S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254。
在一个实施方案中，所述效应器功能是补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二多肽还可以包含能在所述第一和第二多肽之间共价结合的区域。
在一个实施方案中，所述第一和/或第二多肽还可以包含铰链区。
在一个实施方案中，所述方法包括引入所述第一和第二多肽中在至少对应于E345,E430的位置处和选自下组的人IgG1重链的至少一个位置处的氨基酸取代：S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254。
在一个实施方案中，所述方法包括引入所述第一和第二多肽中在至少对应于E345,E430的位置处和选自下组的人IgG1重链的至少一个位置处的氨基酸取代：S440,Y436,E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254。
如此，在一个实施方案中，本发明还涉及一种增加包含第一和第二多肽的亲本二聚体蛋白质的效应器功能或溶液中的寡聚化中的一种或两者的方法，每个多肽包含至少免疫球蛋白重链的CH2,CH3,和铰链区，该方法包括至少在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处将氨基酸取代引入每个多肽。
在一个实施方案中，氨基酸取代位于至少对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处。
在一个实施方案中，对于每个多肽，在对应于E345的位置处的氨基酸取代选自下组：345R,345Q,345N,345K,345Y,345A,345C,345D,345F,345G,345H,345I,345L,345M,345P,345S,345T,345V和345W，如选自下组：345R,345Q,345N,345K和345Y。
在一个实施方案中，对于每个多肽，在对应于E430的位置处的氨基酸取代选自下组：430G,430T,430S,430F,430H,430A,430C,430D,430I,430K,430L,430M,430N,430P,430Q,430R,430V,430W和430Y，如选自下组：430G,430T,430S,430F和430H。
在一个实施方案中，对于每个多肽，在对应于S440的位置处的氨基酸取代为440Y或440W。
在一个实施方案中，在对应于E345,E430和S440的位置处的氨基酸取代分别为345R,430G和440Y。
在一个实施方案中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸取代分别为345K,430G和440Y。
在一个实施方案中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸取代分别为345R,430S和440Y。
在一个实施方案中，在对应于人IgG1重链E345,E430和S440的位置处的氨基酸取代分别为345R,430G和440W。
在一个实施方案中，在对应于人IgG1重链E345,E430和Y436的位置处的氨基酸取代分别为345R,430G和436I。
在一个实施方案中，在对应于人IgG1重链E345,E430,Y436,和S440的位置处的氨基酸取代分别为345R,430G,436I,和440Y。
在前述任一个实施方案中，所述重链序列的同种型可选自下组：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgD,IgM和IgE。
在前述任一个实施方案中，所述重链可以是哺乳动物起源的。
在前述任一个实施方案中，所述重链可以是灵长类或鼠起源的，如人起源的。
在前述任一个实施方案中，每个多肽可包含免疫球蛋白重链可变区，其与包含轻链可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链序列联合以形成第一和第二抗原结合区，任选地结合相同抗原。
在前述实施方案中，二聚体蛋白质的每个多肽可包含全长重链恒定区，如全长人IgG1重链恒定区。
在前述任一个实施方案中，亲本二聚体蛋白质可以是抗体，如例如全长IgG1抗体。
本发明还提供通过前述任一个实施方案的方法制备的依照本文任一方面或实施方案的任意二聚体蛋白质。
本发明还提供变体二聚体蛋白质，如通过前述任一个实施方案的方法制备的变体抗体。具体地，根据本发明的方法在亲本二聚体蛋白质的指定位置引入突变能产生本发明的二聚体蛋白质。所述二聚体蛋白质随后可视为亲本二聚体蛋白质的变体，例如变体二聚体蛋白质。如此，可实施本发明的方法以提供如本文中描述的任意二聚体蛋白质。
本发明还涉及一种用于纯化依照本发明的二聚体蛋白质的方法，包括在低于6.8的pH，如5.0至6.5，例如5.0至6.0，例如5.0至5.5在蛋白A或蛋白G柱上纯化，随后将pH升至高于6.8或高于pH 7.0。用于调整pH的缓冲剂可以是本文中描述的任一种。
组件试剂盒
本发明还涉及一种组件试剂盒，其包含依照本文中所述任一方面或实施方案的第一二聚体蛋白质和依照本文中所述任一方面或实施方案的第二二聚体蛋白质，用于成像、诊断或治疗中的同时、分开或序贯使用。
用途
如本文中描述的，本发明的二聚体蛋白质在溶液中形成六聚体结构，由此类似IgM分子。此外，如上文描述的，涵盖本发明的第一和第二二聚体蛋白质，或任选地第二分子(不是依照本发明的二聚体蛋白质)的组合以创建类似多克隆抗体组合物的组合物，其中该组合的不同组分结合相同靶物上的不同表位。本发明的二聚体蛋白质的这些和其他特征使得其尤其适用于特定应用。
IgM样特征
●IgM在对感染生物的免疫应答中起主要作用。它是经典补体途径的有力激活物。
●针对糖类的抗体经常是IgM同种型。糖类是用于治疗细菌、真菌或病毒感染、癌症和自身免疫疾病的潜在靶物。
●IgM抗体被描述为具有免疫调节特性且在许多自身免疫疾病，如狼疮(SLE)和多发性硬化中是保护性的。IgM在动脉粥样硬化、心肌梗塞和中风、脑部小血管病和阿耳茨海默氏病中也会具有保护性作用(Groenwall等2012,Frontiers in Immunology 3,1-10)。
●天然存在的对癌细胞的抗体经常具有IgM同种型。
●IgM(和多聚体IgA)在粘膜表面的腔侧(luminal side)上的免疫排斥中具有功能。对于被动免疫，IgM(和多聚体IgA)的保护性水平可直接投递到粘膜表面。
●正针对自身免疫、癌症和感染适应证开发基于IgM的产品。
本发明的二聚体蛋白质在经pH调节(如pH 6.5至7.0)的溶液中能模拟上文所列的IgM样特征，因此涵盖本发明的二聚体蛋白质可用于治疗所述任一种适应证。
另外，通过调节溶液的pH，本发明的二聚体蛋白质可以是单体，即单个二聚体蛋白质，或六聚体形式(如记载于实施例32的)。术语“单体形式”在依照本发明的二聚体蛋白质的背景中指单一的个体二聚体蛋白质，其由彼此不非共价联合的二聚体蛋白质构成。当提及“六聚体形式”时，应理解为是6个非共价联合的单个二聚体蛋白质的复合物。涵盖用于IgG分子的标准生产和纯化方法可用于本发明的二聚体蛋白质(当其处于单体形式时)，如但不限于，使用蛋白A树脂和蛋白A变体树脂用于纯化，和使用基于蛋白A和蛋白A变体的免疫球蛋白域检测测定法例如用于过程控制，和使用阳离子交换层析用于蛋白质纯化期间的伴随聚集物除去，以及使用纳米过滤用于病毒清除，如此避免在产生或纯化IgM蛋白时经常遇到的问题。
快速清除
●除非与本文描述的阻止快速清除的技术组合，本发明二聚体蛋白质的六聚体形式均被快速清除。正在开发/使用也被快速清除的Fab片段产物来治疗中毒、毒物中毒、及消除过量或丰富的配体和/或可溶性因子。
●本发明的二聚体蛋白质可具有类似的应用。
●本发明的二聚体蛋白质还可用于消除将形成细胞靶向疗法的汇集点(sink)的膜蛋白的可溶性/脱落(shedded)形式。
多克隆方面
●多克隆抗体产品具有协同作用的潜力(更好的功效)，且能克服获得性治疗抗性。
●正在开发/使用多克隆抗体产品来治疗病毒或细菌感染、毒化(envenomation)、(免疫血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura))、洋地黄毒苷毒性、肾移植急性排斥和癌症。
如此，本发明的二聚体蛋白质具有类似的应用且因此适用于在治疗所述任一种适应证中使用。
如此，在一个实施方案中，本发明的二聚体蛋白质可用于治疗任一种以下适应证：自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化，视神经脊髓炎(Neuromyelitisoptica)，综合征，CREST综合征，视性眼阵挛(opsoclonus)，炎性肌病，混合型结缔组织病(Mixed connective tissue disease)，系统性硬化，原发性胆汁性肝硬变(Primary biliary cirrhosis)，腹部疾病(Coeliac disease)，Miller-Fisher综合征，急性运动轴突神经病(Acute motor axonal neuropathy)，多灶性运动神经病(Multifocalmotor neuropathy)MMN，类风湿性关节炎，骨关节炎，自身免疫性肝炎，抗磷脂综合征，韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)，显微镜下多血管炎(Microscopicpolyangiitis)，Churg-Strauss综合征，多肌炎，硬化性肌炎(Scleromyositis)，重症肌无力(Myasthenia gravis)，Lambert-Eaton肌无力综合征，Hashimoto甲状腺炎，Graves病，副肿瘤性脑综合征(Paraneoplastic cerebellar syndrome)，僵人(Stiff person)综合征，边缘系脑炎(Limbic encephalitis)，西德纳姆舞蹈(Sydenham’s chorea)，PANDAS，脑炎，边缘系脑炎(limbic encephalitis)，1型糖尿病，共济失调，持续性局限性癫痫(Epilepsiapartialis continua)，特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenicpurpura)，恶性贫血，Addison氏贫血，自身免疫性性腺衰竭，自身免疫性溶血病，如血液自身免疫性贫血和HIV相关血小板减少，天疱疮(Pemphigus)，大疱性类天疱疮(Bullouspemphigoid)，疱疹样皮炎(Dermatitis hepetiformis)，线性IgA皮肤病，白癜风，古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)，心肌炎，特发性扩张型心肌病(idiopathic dilatedcardiomyopathy)，克罗恩病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)，癌症，细菌感染，病毒和真菌感染，中毒和毒化，或血管或其他疾病。
癌症的例子包括但不限于，各种癌症类型如：中枢神经系统的肿瘤、头和颈癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、食道癌、胃癌、肝和胆癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肉瘤(若组织例如骨和肌肉)、具有未知原发性起源的肿瘤(即未知起源)、白血病、骨髓癌(如多发性骨髓瘤)、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴母细胞性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、皮肤癌、胶质瘤、脑癌、子宫和直肠。
如此，在一个方面，本发明涉及一种用于预防或治疗疾病如癌症、自身免疫性疾病、感染、糖尿病，器官移植排斥、眼科病和体液系统中的C1q消耗的方法，包括施用依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、组件试剂盒。
在一个实施方案中，所述癌症是肿瘤，如脑肿瘤。依照本发明的二聚体蛋白质可用于通过直接注射到肿瘤如脑肿瘤中来机械性阻碍脑瘤血管中的血液流动。依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质可尤其可用于诱导肿瘤中的机械性阻碍，这是由于其具有形成寡聚体，如二聚体、三聚体和六聚体的能力。当依照本发明的二聚体蛋白质(如抗体)被用于治疗癌症时，由于肿瘤微环境的低pH，它尤其可用于克服效应器机制的抑制。
在一个实施方案中，依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、或组件试剂盒被用于治疗肿瘤，其通过利用毒素或负载/药物的pH依赖性投递。在这类用途中，当本发明的二聚体蛋白质(如抗体)被融合于在肿瘤位点的较低pH具有最优功能的毒素或药物时，可利用肿瘤位点处的低pH。
在一个实施方案中，所述方法包括对血流施用连接于第一前药的、依照本发明任一方面或实施方案的第一二聚体蛋白质，和连接于第二前药的、依照本发明任一方面或实施方案的第二二聚体蛋白质的步骤。
在一个方面，本发明涉及一种诱导免疫调控性效应器功能(如经由CD32b和KIR介导)的方法，其中该方法包括施用依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、或组件试剂盒，任选地与二聚体蛋白质的唾液酸化作用组合。在这类方法中，本发明的二聚体蛋白质将诱导靶分子的聚集，由此诱导免疫调控性效应器功能。如此，依照本发明的二聚体蛋白质可用作静脉内免疫球蛋白(IVIG)的备选。
在一个实施方案中，依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质(如抗体或Fc融合蛋白)可用于增强靶分子从血流的清除，所述靶分子如配体、受体、毒素、C1q、IgE、抗移植抗体、人抗人抗体(HAHA)、抗药物抗体(ADA)、人抗鼠抗体(HAMA)、人抗嵌合抗体(HACA)、药物化合物和免疫调控性化合物。
依照本发明的二聚体蛋白质，如融合于抗原的Fc片段，在处于寡聚体形式(如六聚体分子)时可以具有改进的免疫刺激性效应，因为寡聚体提供例如刺激针对所述抗原的B细胞受体聚集的抗原复合物，并通过以多价形式呈递抗原促进初始低亲和力B细胞受体的亲和力成熟。当依照本发明的二聚体蛋白质在溶液中或呈递在细胞、病毒粒体、病毒样颗粒的表面上，包埋在脂质体中或以本领域中普遍已知的支持跨膜蛋白呈递的其他形式时可以同时实现这两者。如此，在一个实施方案中，依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质(如Fc片段)被用于疫苗接种、免疫和免疫应答刺激。如此，在一个实施方案中，本发明还涉及一种用于疫苗接种、免疫和免疫应答刺激的方法，包括施用如本文中描述的二聚体蛋白质。
依照本发明的二聚体蛋白质可用于创建任选可以在溶液中以及表面上以pH依赖性方式装配的超分子结构，所述表面如但不限于细胞、病毒粒体、病毒样颗粒、脂质体的表面、微芯片、固体表面、多孔支架、或其他本领域中普遍已知的用于蛋白质呈递的方法。
在一个实施方案中，二聚体蛋白质的所述第一和/或第二多肽可包含蛋白质结合域，如Fab域，其特异性地结合不同的含Fc域多肽中的Fab域。二聚体蛋白质及其靶分子可用于形成超分子结构，其任选地可以pH受控方式装配。
在一个实施方案中，依照本发明任一方面或实施方案的二聚体蛋白质被用于蛋白质结晶。所述二聚体蛋白质由于其能以pH受控方式形成寡聚体结构而尤其有用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种使用依照本文描述的任一方面或实施方案的二聚体蛋白质以用于诊断试剂盒中的免疫复合物形成的方法，如凝集测定法。凝集测定的例子是Coombs测试。
细菌感染的例子包括但不限于金黄色葡萄球菌感染(S.aureus)，例如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)，铜绿假单胞菌感染，由选自下组的细菌导致的感染：表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、耶尔森氏菌(Yersinia)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)和结核分支杆菌。病毒和真菌感染的例子包括但不限于，西尼罗河病毒，登革热病毒，丙肝病毒(HCV)，人免疫缺陷病毒(HIV),RVS，曲霉菌，白色念珠菌，隐球菌(Cryptococcus)，组织胞浆菌属(Histoplasma)，人巨细胞病毒(HCMV)，单纯疱疹病毒，人呼吸道合胞病毒，人乳头状瘤病毒，Epstein-Barr病毒，疱疹病毒，痘病毒和禽流感病毒。中毒和毒化的例子包括但不限于，洋地黄毒苷，秋水仙素，来自爬行类的毒液如蛇毒，来自昆虫的毒液如蜜蜂、黄蜂和毛虫毒液，蜘蛛毒液，微生物内毒素和外毒素，如肉毒菌神经毒素，破伤风毒素，葡萄球菌毒素，alpha毒素，炭疽毒素，白喉毒素，百日咳毒素，Shiga毒素，Shiga样毒素。
血管和其他疾病的例子可以是例如动脉粥样硬化、心肌梗塞和中风、脑部小血管病和阿耳茨海默氏病，以及高脂肪饮食诱导的肝胰岛素抗性和系统性葡萄糖耐受中的C1q消耗，以及在器官移植前或后的抗移植抗体的清除。
在一个方面，本发明涉及依照本文所述任一方面或实施方案的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、或组件试剂盒用于治疗疾病，如细菌、病毒或寄生性感染，自身免疫性疾病，癌症，炎症和/或降低由细菌感染导致的感染性休克的风险。
为了治疗细菌感染和/或降低感染性休克的风险，本发明的二聚体蛋白质可以例如包含特异性结合以下的结合区：脂多糖(LPS)、脂寡糖(LOS)、delta内毒素、肉毒菌毒素、棒状杆菌(Corynebacterium)白喉外毒素、细菌超抗原、热稳定性肠毒素、溶细胞素、通道形成毒素、酶活性毒素或真菌毒素。
在另一方面，本发明提供依照任一前述实施方案的二聚体蛋白质、六聚体、组合物、或组件试剂盒将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像的用途。在一个方面，本发明涉及一种用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像的方法，包括施用依照本文所述任一方面或实施方案的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、或组件试剂盒。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗细菌、病毒或寄生性感染，用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像，或用于调控从人或其他哺乳动物的身体清除靶分子的方法，包括施用依照本文所述任一方面或实施方案的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、或组件试剂盒。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗疾病如癌症、自身免疫性疾病、器官移植排斥、和体液系统中的C1q消耗的方法，包括施用依照本文所述任一方面或实施方案的二聚体蛋白质、寡聚体、六聚体、组合物、或组件试剂盒。
实施例
实施例1：CD38抗体005突变体的设计和生成
人单克隆抗体HuMab 005是记载于WO/2006/099875的全人IgG1，κ抗体，其针对人CD38。此处将其用作模式抗体来测试Fc突变增强CDC活性的能力。所测试的突变列于表3。
使用具有IgG1m(f)同种异型的HuMab 005的重链作为模板进行诱变反应，制备不同突变体的DNA构建体，并将其瞬时转染。简言之，使用Quikchange定点诱变试剂盒(Stratagene,US)来制备突变体。将编码期望突变的正向和反向引物用于复制编码具有IgG1m(f)同种异型的005重链的全长质粒DNA模板。将所得DNA混合物使用DpnI消化以除去源质粒DNA并用于转化大肠杆菌。通过DNA测序(Agowa,Germany)检查从所得菌落分离的突变体质粒DNA。基本如制造商描述地使用293fectin(Invitrogen,US)将编码抗体的重链和轻链两者的质粒DNA混合物瞬时转染至Freestyle HEK293F细胞(Invitrogen,US)。
为了测试寡聚体Fc-Fc相互作用在补体激活和CDC中的功能相关性，对位于Fc:Fc界面的疏水片(patch)中的氨基酸进行突变，以潜在地破坏005的Fc-Fc侧向相互作用和CDC功效。在基于1HZH晶体结构而被选择以及被描述为暴露在CH2-CH3域的疏水片中的位置上引入突变I253D和H433A以改变电荷(Burton Mol Immunol 19853月；22(3):161-206)。
1HZH晶体结构显示，I253和H433与配对抗体的相对Fc位置上的两个不同的凹陷(pocket)相结合。为了排除所观察到的对于CDC的影响是由于对C1q的直接结合位点的破坏的这种可能性，生成了突变体K439E和S440K。如图4中显示的，K439和S440在Fc:Fc界面的相对侧上彼此面对，从而将K439E和S440K设计为通过抑制Fc:Fc相互作用作为单一突变体诱导CDC的丧失，但预期在彼此相互作用(由于抗体混合物中恢复的Fc:Fc相互作用)时恢复CDC。
表3：引入005(HuMax-CD38)的CH2-CH3域中的突变集。
(＝)无电荷
(-)负电荷
(+)正电荷
(δ+)部分正电荷
实施例2：HuMab-005突变体在细胞上对CD38的结合
通过FACS分析来分析未纯化的抗体样本与CD38阳性Daudi和Raji细胞的结合。在聚苯乙烯96孔圆底平板中将105个细胞于4℃温育于具有系列稀释的抗体制剂(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg/ml)的100μl RPM1640/0.1％BSA中30分钟。在RPM1640/0.1％BSA中洗涤两次之后，将细胞与缀合有FITC的兔F(ab’)2抗人IgG(货号F0056；DAKO；1:150)于4℃温育于50μl中30分钟。接着，在PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物中洗涤细胞两次，重悬于100μl PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物中，并在FACS Cantoll(BD Biosciences)上进行分析。使用GraphPad Prism V5.01软件分析结合曲线。使用模拟转染细胞(mock-transfected cell)的悬浮液作为阴性对照。
HuMab 005对Daudi细胞的结合并没有太多地受到在CH2-CH3域中引入点突变的影响。所有测试的抗体以剂量-依赖性的方式与Daudi细胞结合。所有测试的抗体的结合与野生型HuMab-005相似，除了005-E345R，其显示出稍微降低的结合。然而，不受任何理论束缚，这种较低的结合可能是由于二抗结合的降低所造成的。005-E345的实际结合亲合力可能与005-WT相似或者甚至比005-WT还有所提高，然而由于缺少直接标记的抗体，我们无法对此进行证实。
HuMab-005对Raji细胞的结合也没有太多地受到在CH2-CH3域中引入点突变的影响。所有测试的抗体以剂量-依赖性的方式与Raji细胞结合。最大结合对于005-I253D和H433A突变体与野生型005的最大结合相似，并且对于005-E435R、K439E、S440K突变体以及005-K439E+005-S440K的组合更低。然而，不受任何理论束缚，这种较低的结合可能是由于二抗结合的降低所造成的(表位的遮蔽)。
实施例3：通过CD38抗体005突变体对CD38阳性细胞进行的CDC测定法
在圆底96孔板中将0.1×106个Daudi或Raji细胞与系列浓度的未纯化抗体(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg/ml)在总体积100μl中室温下在振荡器中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为C1q来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
在Wien133细胞上使用不同浓度的正常人血清(NHS)来进一步分析E435R突变对CDC的影响。在圆底96孔板中将0.1×106个Wien133细胞与系列浓度的未纯化抗体(0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg/ml)在总体积50μl中室温下在振荡器中预温育15分钟。接着，加入NHS作为C1q的来源以使其在100μl总体积中的终浓度达到20％或50％NHS。将反应混合物在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图5显示，005-I253D、H443A、K439E和S440K在Daudi(图5A)和Raji(图5B)细胞上都显示出CDC活性完全丢失，而005-E345R突变体则在两个细胞系上均显示出CDC活性强烈增强。与7D8的数据相当，005-K439E+005-S440K(它们作为单突变体都能导致CDC丢失)的组合导致CDC的恢复。令人吃惊的是，005-E435R甚至能强有力地诱导对Wien133细胞的CDC，而野生型005却不能够诱导CDC杀伤(图5C)。在20％和50％血清浓度下均观察到005-E345R对Wien133细胞的CDC杀伤(图5C)。在50％血清中，7D8-E345R和005-E345R两者在体外对Raji细胞显示增强的CDC，这与在20％血清中的功效相似(图5D)。
由于CH2-CH3区中的E345R突变导致所测试的CD20抗体7D8和CD38抗体005两者中增强的CDC活性，因此E345R突变可被认为是能够用于诱导或增强CDC的通用抗体修饰。
实施例4：含有CDC增强型突变E345R的IgG1抗体比野生型抗体对通过Fc结合肽DCAWHLGELVWCT对CDC的抑制的敏感性低
通过对IgG的Fc:Fc界面的疏水片中的氨基酸位点进行突变，发现CDC功效要么被破坏，要么被增强。进一步探究了CDC功效中涉及Fc-Fc界面处的相互作用，以及因此可能形成寡聚(例如，六聚体环)结构，如b12晶体结构中所观察到的。因此，使用了靶向在野生型IgG Fc表面的疏水片区域中的共有结合位点的13个残基的肽(DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:7))(Delano等，Science 2000Feb 18；287(5456)：1279-83)。确实，IgG Fc表面上的共有结合位点作为准备与大量不同分子相互作用的适应性区域的身份(Delano等，Science2000Feb 18；287(5456)：1279-83)，与IgG1b12晶体结构中参与Fc-Fc相互作用的疏水片中的核心氨基酸的身份相一致(Saphire等，Science 2001Aug 10；293(5532):1155-9)。在所有结合界面中存在的相互作用受到6个氨基酸的共享组(Met-252、Ile-253、Ser-254、Asn-434、His-435和Tyr-436)以及共享骨架触点(Delano等，Science 2000Feb 18；287(5456):1279-83)的介导。因此，可认为Fc结合肽能影响Fc-Fc相互作用并从而影响CDC功效。
在圆底96孔平板中，将0.1×106个Daudi细胞与1.0μg/ml未纯化抗体于75μl中在摇床中室温预温育10分钟。将25μl浓度系列(范围从0.06-60μg/ml终浓度)的Fc结合肽DCAWHLGELVWCT加入到经调理的细胞中，在摇床中室温温育10分钟。接着，加入25μl NHS作为补体来源(20％终浓度)，在培养箱中37℃温育45分钟。加入25μl冰冷RPMI培养基(补充有0.1％的BSA)以终止反应。加入15μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
发现野生型005(图6)介导的CDC被Fc结合肽DCAWHLGELVWCT以剂量依赖性的方式所抑制。这些竞争数据再次表明CDC功效中涉及位于IgG疏水片的Fc-Fc相互作用。相比起相应的野生型抗体，CDC增强性IgG1-005-E345R突变体对Fc结合肽的竞争较不敏感，这表明E345R突变导致Fc-Fc相互作用稳定性提高，并因此提高CDC。
实施例5：通过将E345R与互补的抑制性突变K439E和S440K组合在两种不同单克隆抗体的混合物中实现的增强型CDC的升高的特异性
如实施例3所述，CD38抗体005突变K439E和S440K作为单克隆抗体降低了CDC功效。混合含有这些突变的005抗体恢复CDC。因此有效CDC受限于同时结合有两个突变体抗体的细胞。类似地，发现了关于WO 2004/035607中描述的CD20抗体7D8的数据(数据未显示)。
可以有利的是，将CDC诱导的增强限于同时表达两种特定抗原的靶细胞，这利用了它们的组合表达来改善增强的CDC诱导的选择性。还可以有利的是，将CDC诱导的增强限于同时被至少两种不同抗体的混合物结合的靶细胞，所述抗体在两个不同的表位上同时，或在两个交叉竞争性、相似或相同的表位上结合相同的细胞表面抗原。
因此，为了将增强的CDC诱导限于同时被CD20和CD38抗体两者结合的细胞，将CDC增强性突变E345R与CDC抑制性突变组合在抗体7D8-E345R/K439E、7D8-E345R/S440K、005-E345R/S440K和005-E345R/K439E中。在CDC实验中如下单独加入或以1:1混合这些抗体。在圆底96孔平板中，将0.1×106个Wien133细胞(也可以使用其它的细胞类型，例如Daudi或Raji细胞)与系列浓度的未纯化抗体(对于7D8--E345R/K439E、7D8-E345R/S440K、005-E345R/S440K和005-E345R/K439E，终浓度0.056-10,000ng/ml，以3倍稀释)或抗体混合物(终浓度为0.01μg/ml CD20抗体与0-333ng/ml以3倍稀释的CD38抗体混合；或3.3μg/ml的CD38抗体与0.0056-1,000ng/ml以3倍稀释的CD20抗体混合)在总体积100μl中在室温在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
将系列浓度的005-E345R/K439E或005-E345R/S440K抗体与固定浓度为0.01μg/ml的7D8双突变体抗体混合(如从图7A中所确定，作为单一作用剂对Wien133细胞具有最小CDC的最大浓度)以制备互补性组合005-E345R/K439E+7D8-E345R/S440K或005-E345R/S440K+7D8-E345R/K439E。图7C显示，在分别存在固定浓度的互补性7D8-E345R/K439E或7D8-E345R/S440K CD20抗体时，005双重突变体CD38抗体以剂量依赖性诱导CDC。这些互补性组合的CDC功效(图7C)与作为单一作用剂的005-E345R单突变体(增强物)抗体相当(图7B)。相反，在存在无关抗体b12时，005-E345R/K439E或005-E345R/S440K两者在测试的系列浓度中几乎没有显示出任何CDC(与图7B中所示作为单一作用剂的005-E345R/K439E或005-E345R/S440K相当)。
将系列浓度的7D8-E345R/K439E或7D8-E345R/S440K抗体与固定浓度为3.3μg/ml的005双重突变体抗体混合(如从图7B中所确定，作为单一作用剂对Wien133细胞显示出少许但有限的CDC)以制备互补性组合7D8-E345R/K439E+005-E345R/S440K或7D8-E345R/S440K+005-E345R/K439E。图7D显示在分别存在互补性005-E345R/K439E或005-E345R/S440K CD38抗体的情况下，7D8双重突变体CD20抗体非常有效地诱导了CDC，甚至是在测试的最低浓度时，就像每个细胞只有几个7D8双重突变体抗体分子。为了消除细胞膜上Fc尾部密度的提高对于具有互补性K439E和S440K突变的7D8和005抗体混合物所观察到的增强的CDC的贡献，还测试了具有非互补性突变的抗体组合。图7D显示，非互补性组合显示出远低于互补性组合的CDC功效，这是由于比互补性组合效率更低的Fc-Fc相互作用。
这些数据表明，治疗性抗体的(增强的)CDC的诱导可限于同时结合两个互补性抗体的混合物的细胞，在这种情况下具有不同的抗原特异性，从而通过需要这两种抗原的共表达来提高靶细胞特异性。
如图7A和7B中所见，与单独的7D8-E345R相比，7D8-E345R/K439E、005-E345R/S440K、7D8-E345R/S440K和005-E345R/K439E展现出有限的CDC功效。可进一步见到的是，7D8-E345R/K439E和7D8-E345R/S440K与作为单一作用剂的野生型7D8抗体相比实现具有增强的功效的CDC。同样地，也观察到005-E345R/K439E和005-E345R/S440K的混合物与作为单一作用剂的野生型005抗体相比实现具有增强的功效的CDC(数据未显示)。
实施例6：使用突变体筛选方法鉴定能刺激通过CDC测定法检测的Fc:Fc相互作用介导的抗体寡聚化的突变
如实施例3所述，对于识别在表达各种水平的所述抗原的多个细胞系上的靶抗原(CD38)的抗体，鉴定了刺激CDC的氨基酸突变。令人惊奇的是，单点突变E345R证实足以将Wien133细胞的CDC依赖性细胞裂解赋予抗CD38抗体005，该抗体以野生型IgG1形式不能通过CDC来裂解这些细胞。
位于Fc:Fc界面上或在Fc:Fc界面周围的其他突变能够以类似的方式刺激寡聚化和CDC。或者，突变能够间接刺激寡聚化，例如通过变构性诱导Fc:Fc相互作用。
为了确定其他氨基酸突变是否能够刺激Fc介导的抗体寡聚化，使用CDC测定法对抗CD38IgG1-005突变体文库进行筛选，单独地及以成对的方式混合以选择例如在Fc:Fc界面间相互作用的氨基酸对。然而，可以将相同的策略用于其他的抗体，例如另一种IgG1或IgG3抗体。
产生了表4中所示位置的突变的集中文库。使用Quikchange定点诱变试剂盒(Stratagene，美国)将突变引入至IgG1-005Fc区中。简而言之，对于每个所期望的突变位置，使用在所期望位置上编码简并密码子的正向和反向引物来复制具有IgG1m(f)同种异型的005重链的全长质粒DNA模板。用DpnI消化所得到的DNA混合物以移除来源质粒DNA并用于转化大肠杆菌。汇集并培养所得到的菌落，从这些汇集物中分离质粒DNA并转化入大肠杆菌中以获得克隆菌落。通过DNA测序(LGC genomics，Berlin，德国)来检查从所得到的菌落中分离出来的突变体质粒DNA。通过PCR从质粒DNA中扩增表达盒，并使用293fectin(Invitrogen，美国)基本上如制造商所述将同时含有IgG1-005突变体重链和野生型轻链两者的DNA混合物瞬时转染至Freestyle HEK293F细胞(Invitrogen，美国)。收集含有抗体突变体的转染细胞的上清液。在CDC测定法中如下单独地以及在配对混合物中筛选突变体抗体上清液。
在圆底96孔板中，将0.1×106个Daudi或Wien-133细胞(也可使用其它的细胞类型，例如Raji细胞)与1.0μg/ml未纯化抗体在总体积100μl中在室温在摇床中预温育15分钟。接着，加入30μl正常人血清作为补体来源(30％终浓度)并在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
针对其增强寡聚化的能力(如通过CDC功效检测的)，无论是作为单个突变体还是与其他突变体(例如面向Fc:Fc界面间的突变)混合时，对描述于表4、表5和表6中的突变进行选择。针对其不会损坏FcRn、蛋白-A或蛋白-G结合、ADCC、ADCP或其他由Fc域介导的效应子功能的能力，任选可以进一步对突变进行筛选。将此类刺激点突变组合到一个Fc域中甚至能够更进一步地刺激寡聚化和CDC功效。
针对其抑制寡聚化的能力(如对于Daudi细胞通过CDC确定的)，对并入CD38抗体005中的CH2-CH3区中的突变进行测试。突变体抗体的裂解与野生型005(其裂解被设置为100％)相当。抑制的截断值(cut-off)被设定为≤66％裂解。用这种方式进行测量，大部分所测试的突变都抑制CDC(见表4)。
针对其增强寡聚化的能力(如对于Wien133细胞通过CDC确定的)，对并入CD38抗体005中的CH2-CH3区中的突变进行测试(表5)。野生型CD38抗体005不能够对Wien133细胞诱导CDC。将显示出≥39％细胞裂解的突变体评价为增强性。完全预料不到的是，几乎所有获得的氨基酸E345和E430取代都刺激通过CDC的细胞裂解。为了证实这个结果，通过定点诱变用每种可能的突变对氨基酸E345、E430和S440进行取代，并测试它们增强寡聚化的能力(如使用新鲜人血清批次通过Wien133细胞的CDC确定的)，产生略微更有效的裂解(表6)。再一次，所有的E345和E430取代都诱导了Wien133细胞的有效CDC。
下述优选的突变引起了Wien133细胞的≥39％的细胞裂解：P247G、I253V、S254L、Q311L、Q311W、E345A、E345C、E345D、E345F、E345G、E345H、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W、E345Y、D/E356G、D/E356R、T359R、E382L、E382V、Q386K、E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W、E430Y、Y436I、S440Y和S440W。
实施例7：皮下B细胞淋巴瘤异种移植物模型中IgG1-005-E345R的体内功效
在使用Raji-luc#2D1细胞的皮下模型中评估IgG1-7D8-E345R的体内抗肿瘤功效。这些细胞显示出每个细胞约150,000个CD38分子(由QIFIKIT分析确定，数据未显示)以及高的补体防御受体表达。肿瘤接种和测量的方案基本上与实施例20中所述的相同。在第0天时，将200μl PBS中的5×106个Raji-luc#2D1细胞皮下注射(s.c.)注射到SCID小鼠的右侧腹中。当平均肿瘤体积为100mm3时(第7天左右)，将小鼠分组(n＝7)并通过向每只小鼠注射(i.p.)单剂500μg抗体(25mg/kg)来进行处理。处理组示于表7中。测量肿瘤直至终点肿瘤体积为1500mm3或直到肿瘤显示出溃疡或直至观察到严重的临床征象以避免重大不适(majordiscomfort)。
图8A显示第21天的平均肿瘤生长，此时所有组仍然是完整的。野生型抗体IgG1-005轻微抑制肿瘤生长，尽管这在统计学上并不显著。在第21天，相比起无关抗体对照，只有IgG1-005-E345R显著地抑制了肿瘤生长(单因素ANOVA p＜0.05)。
图8B显示了肿瘤大小小于500mm3的小鼠百分比的Kaplan-Meier图。用IgG1-005-E345R抗体处理的小鼠中的肿瘤形成与用阴性对照抗体IgG1-b12处理的小鼠(Mantel-Cox分析，p＜0.001)或者用野生型IgG1-005处理的小鼠(p＜0.05)相比被显著延迟。
这些数据显示，在CD38抗体005中引入E345R突变导致增强的体内抗肿瘤活性。
表7治疗组和剂量给药
实施例8：单价靶物结合进一步增强E345R抗体的CDC功效
在b12晶体结构中观察到的IgG1六聚体环的分子表面表明，对于六聚体环中的每个IgG，两个C1q结合位点中的一个面朝环结构的上方而另外一个则面朝环结构的下方，并且每个抗体的一个Fab-臂也是方向朝上，一个方向朝下，这导致每个抗体只有一个Fab-臂参与到抗原结合，这暗示了六聚体抗体环中每个抗体分子的单价结合。单价性可能会使抗体的抗原结合以六聚化相容性方向进行。为了测试这个设想，在CD38阳性、EGFR-阴性的Wien133细胞上(对于该细胞，这个双特异性抗体仅能通过CD38而进行单价结合)测试具有E345R突变的双特异性CD38/EGRF抗体的CDC功效，并与同样具有E345R突变双价结合CD38的抗体的CDC功效进行比较。将人单克隆抗体HuMax-EGFr(2F8，描述于WO2004/056847中)用作本实施例中所述EGFR抗体的基础。
根据DuoBodyTM平台，即如WO2011/147986中所述的2-MEA-诱导的Fab-臂交换，体外产生双特异性抗体。该方法的基础是互补性CH3域(其在特定的测定条件下促进异二聚体的形成)的使用。为了通过这个方法来进行双特异性抗体的生产，产生了在CH3域中携带特定突变的IgG1分子：在亲本IgG1抗体之一上是F405L突变，而在另一个亲本IgG1抗体上是K409R突变。为了产生双特异性抗体，将这两个亲本抗体(每个抗体的终浓度为0.5mg/ml)与25mM的2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)在总体积100μl的TE中于37℃温育90分钟。当根据制造商规程使用离心柱(Microcon离心过滤器，30k，Millipore)移除还原剂2-MEA时，还原反应终止。
对于CDC测定，在圆底96孔板中，将0.1×106个Wien133细胞与系列浓度的抗体(0.01至10.0μg/ml)在总体积100μl中在室温在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图9显示，如预期的，不具有E345R突变的CD38抗体(野生型IgG1-005和IgG-b12-K409R×IgG1-005-F405L)并没有诱导Wien133细胞的杀伤。如预期的，EGFR抗体IgG1-2F8-E345R/F405L(其并不结合EGFR-阴性Wien133细胞(数据未显示))也没有诱导CDC。K408R突变的引入并没有影响IgG1-005-E345R抗体在Wien133细胞上诱导约60％杀伤的能力(描述于实施例10中)。有趣的是，双特异性CD38/EGFR抗体IgG1-005-E345R/K409R×IgG1-2F8-E345R/F405L(其只能单价地结合CD38阳性、EGFR-阴性Wien133细胞)显示出提高的最大CDC杀伤(从约60％至约100％杀伤)。
这些数据显示，单价靶向能够进一步增强含有CDC增强性E345R突变的抗体的最大杀伤能力。此外，这些数据显示，E345R寡聚化增强性突变(如通过增强CDC活性来测量)能够应用于其他抗体形式中，如DuoBody。
实施例9：寡聚化增强性E345R突变能够应用于其他抗体形式如DuoBodyTM
在DuoBody形式的双特异性抗体中测试E345R突变的效果。利用CD20/CD38双特异性抗体在CD20-阳性、CD38-阳性Wien133和Raji细胞上实施CDC测定。
如实施例8中所述产生双特异性抗体。对于CDC测定，在圆底96孔板中，将0.1×106个Wien133或Raji细胞与系列浓度的抗体(0.01至30.0μg/ml)在总体积100μl中在室温在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图10显示引入E345R突变增强了IgG1-005-F405L×IgG1-7D8-K409R抗体对Wien133(图10A)和Raji(图10B)细胞的CDC。这些数据显示，E345R寡聚化增强性突变能够应用于其他抗体形式以增强CDC活性。
实施例10：E345R拯救EGFR抗体2F8的CDC，其能够通过单价靶物结合进一步增强
如实施例3和12中所述，E345R增强或拯救了识别不同血液肿瘤靶物(CD20和CD38)的抗体的CDC。为了将该分析延伸至实体瘤抗原，在A431表皮样癌细胞(epidermoidcarcinoma)上测试E345R对EGFR抗体2F8的CDC能力的影响。此外，利用双特异性EGFR×CD20抗体(IgG1-2F8-E345R/F405L×IgG1-7D8-E345R/K409R)在EGFR-阳性、CD20阴性的A431细胞上测试单价性EGFR靶向对于E345R介导的CDC诱导的影响。
如实施例8所述产生双特异性抗体。对于CDC测定法，用100μCi 51Cr对5×106个A431细胞/ml在37℃标记1小时。用PBS洗涤细胞三次，并以1×105个细胞/ml的浓度重悬于培养基中。在圆底96孔板中，将25,000个标记细胞与系列浓度的未纯化抗体(0-30μg/ml以3倍稀释)在总体积100μl中在室温温育15分钟。接着，加入50μl正常人血清稀释物作为补体来源(25％终浓度)，在37℃的培养箱中温育1小时。将细胞旋转沉淀下来(300×g，3分钟)，并在96孔Optiplate(PerkinElmer)中向100μl Microscint加入25μl上清液以在摇床(750rpm)上温育15分钟。在闪烁计数器上以每分钟计数(cpm)来确定51Cr释放。通过在经Triton X-100处理细胞上清液中测量的51Cr水平来确定最大裂解(100％)。通过在未经抗体温育的细胞上清液中测量的51Cr水平来确定自发裂解。根据公式：比裂解(specifi lysis)＝100×(cpm样本-cpm自发)/(cpm最大-cpm自发)来计算比细胞裂解。
图11显示IgG1-2F8-E345R/F405L能够通过CDC裂解A431细胞，而野生型2F8却不能杀死A431细胞。这些数据显示，通过引入E345R突变能够拯救EGFR抗体2F8的CDC活性。这可能将CDC增强性E345R突变的应用扩展至靶向实体瘤抗原的抗体。
双特异性EGFR×CD20抗体IgG-2F8-E345R/F405L×IgG1-7D8-E345R/K409R，在EGFR-阳性、CD20阴性的A431细胞上显示CDC的进一步增强。
这些数据进一步支持了该设想，即单价性促进Fc-Fc相互作用的形成及随后的CDC诱导，如对于实施例8中所述的CD38结合抗体所提出的。
实施例11：E345R增强或拯救CD38抗体003以及CD20抗体11B8和利妥昔单抗的CDC
正如实施例3和12所述，E345R增强或诱导了具有不同靶物特异性(CD20、CD38和EGFR)的几个抗体的CDC活性，如在多个表达可变水平的所述抗原的细胞系上所测试的。因此，认为E345R突变的引入是对目前抗体进行增强或拯救CDC的普遍性机制。为了进一步支持这个，对更多的对Daudi和Wien133细胞具有不同的固有CDC功效的抗体测试E345R突变对CDC的影响：描述于WO 2006/099875的CD38抗体003以及描述于WO 2005/103081中的CD20抗体利妥昔单抗(I型)和11B8(II型)。CD20抗体可被分为两个亚群(Beers等Seminars inHematology 47,(2)2010,107-114)。I型CD20抗体展示出卓越的激活补体以及激发CDC的能力，其通过将质膜中的CD20分子重新分布于脂筏(其使抗体Fc区聚集)中，并实现改进的C1q结合进行。II型CD20抗体并没有可感知地改变CD20的分布，并且也没有伴随的聚集，它们在CDC方面是相对无效的。
在圆底96孔板中，将0.1×106个Daudi或Raji细胞与系列浓度的未纯化抗体(0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μg/ml)在总体积70μl中在室温在摇床中预温育15分钟。接着，加入30μl正常人血清作为C1q来源(30％终浓度)，并在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图12显示，E345R突变增强了所有测试的抗体对Daudi(A)和Wien133(B)细胞两者的CDC。有趣的是，在所使用的浓度，以野生型形式存在时没有诱导CDC的所有抗体，在引入E345R突变之后都有效地诱导了CDC：CD38mAb 003和CD20II型mAb 11B8对Daudi细胞，以及CD38mAbs 005和003以及CD20II型mAb11B8对Wien133细胞。这些数据表明抗体寡聚化的增强，更具体地通过E345R突变的引入而增强，是增强或拯救目前抗体的CDC的普遍性机制。
实施例12：E345R增强了组织因子抗体的内在化
为了测试增强的寡聚化能否诱导提高的抗体内在化，利用溶酶体标记物LAMP1通过共聚焦显微术来进行野生型和E345R突变型组织因子(TF)抗体的共定位研究。
SK-OV-3细胞在玻璃盖玻片上(厚度1.5微米，Thermo Fisher Scientific，Braunschweig，德国)于标准组织培养基中在37℃生长1天。将细胞与50μg/ml亮肽酶素(leupeptin)(Sigma)预温育1小时以封闭溶酶体活性，其后加入10μg/ml的组织因子(TF)抗体(WO2010/066803)。在37℃将细胞再温育1、3或16个小时。之后，用PBS洗涤细胞，并用4％甲醛(Klinipath)在室温下(RT)温育30分钟。用封闭缓冲液(补充有0.1％的皂苷[Roche]和2％BSA[Roche]的PBS)洗涤盖玻片，并与含有20mM NH4Cl的封闭缓冲液温育20分钟以淬灭甲醛。用封闭缓冲液再次洗涤盖玻片，将其与用于鉴定溶酶体LAMP1的鼠-抗-人CD107a-APC(BD Pharmingen)和用于鉴定TF抗体的山羊-抗-人IgG-FITC(Jackson)的混合物在室温下温育45分钟。用封闭缓冲液再次洗涤盖玻片并使用20μl封固介质(将6克甘油[Sigma]和2.4克Mowiol 4-88[Omnilabo]溶解于6ml蒸馏水中，向其中加入12mL 0.2M Tris[Sigma]pH8.5，随后在50-60℃温育10分钟；将封固培养基分装并储存于-20℃)封固在显微镜载物片上过夜。用配备63×1.32-0.6油浸物镜和LAS-AF软件的Leica SPE-II共聚焦显微镜(Leica Microsystems)对玻片成像。
使用软件(版本Meta Series 6.1，Molecular Devices Inc，Sunnyvale California，美国)对12-位灰度级的TIFF图像分析共定位。以层叠输入图像并扣除背景。对于所有的FITC图像和所有的APC图像都使用相同的阈值设定(手动设置)。将共定位描绘为感兴趣区域(ROI)中的FITC的像素强度，而ROI由所有的APC阳性区组成。为了对用不同TF抗体染色的不同玻片进行比较，用APC的像素强度对图像标准化。使用鼠抗人CD107a-APC对溶酶体标记LAMP1(CD107a)进行染色。LAMP1的像素强度在所成像的不同TF抗体之间不应当有不同。
FITC和APC共定位的标准化数值根据公式[(TPI FITC×共定位百分比)/100]×[1/TPI APC]表示为任意单位。
共定位百分比＝与APC像素共定位的TPI FITC/TPI APC
TPI：总像素强度
图13描绘了与APC标记的溶酶体标记物重叠的野生型和E345R突变型TF抗体的FITC像素强度的量。对于每个抗体或所测试的条件，分析来自含有约1、3或＞5个细胞的一个玻片的三张不同图像。在每个玻片中的不同图像之间观察到了差异。仍然明显的是当与野生型011和098相比时，抗体011和098的E345R突变在1小时的温育之后导致溶酶体共定位的提高。这些结果指示突变E345R诱导了更为迅速的内在化和溶酶体共定位，并因此能够增强抗体药物缀合物。
实施例13：在具有相似CD20表达但具有不同水平的膜结合补体调控蛋白的不同B细胞系中通过利妥昔单抗中的E345R突变实现的增强的CDC
实施例11和14显示，野生型利妥昔单抗对于Daudi和Wien133细胞的CDC功效通过引入E345R突变而被增强。这种增强的CDC功效是由于E345R介导的Fc-Fc相互作用稳定化造成的。在靶细胞膜上伴随形成的六聚体抗体环结构通过促进靠近细胞膜的激活的补体组分的捕获和浓缩能够促进膜攻击复合体的有效产生。由于这种有效的补体激活，能够部分地克服膜结合补体调控蛋白(mCRP)的抑制效果。mCRPs(如CD55、CD46和CD59)的过表达认为是利用单克隆抗肿瘤抗体成功进行免疫治疗的障碍(Jurianz等,Mol Immunol 199936:929-39；Fishelson等,Mol Immunol 200340:109-23,Gorter等,Immunol Today 1999 20:576-82,Zell等,Clin Exp Immunol.2007Dec 150(3):576-84)。因此，比较利妥昔单抗-E345R与野生型利妥昔单抗对一系列具有不同水平的mCRPs CD46、CD55和CD59但是具有相当的CD20靶物表达水平的B细胞系的功效。
B细胞系Daudi、WIL2-S、WSU-NHL、MEC-2和ARH-77表达了相当量的CD20分子(约250.000特异性抗体结合能力-sABC)，如通过QIFIKIT分析确定的(数据未显示)。为了比较这些细胞系之间补体调控蛋白的表达水平，实施QIFIKIT分析以确定CD46(小鼠抗人CD46、CBL488、克隆J4.48Chemicon)、CD55(小鼠抗人CD55、CBL511、克隆BRIC216、Chemicon)和CD59(小鼠抗人CD59、MCA1054x、克隆MEM-43、Serotec)的水平。
对于CDC测定，在圆底96孔板中，将0.1×106个细胞与饱和抗体系列浓度(0.002-40.0μg/ml以4倍稀释)在总体积100μl中室温下在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。在GraphPad PRISM 5中利用非线性拟合的最佳拟合值的顶点从两个独立实验中计算最大的CDC介导的杀伤。
图14A-D显示在野生型利妥昔单抗中引入E345R导致增强的CDC功效，如通过对所有测试的B细胞系的升高的最大裂解和降低的EC50观察到的。
图14E显示，由利妥昔单抗-E345R突变体诱导的最大CDC-介导的杀伤总是比野生型利妥昔单抗要高，其不依赖于膜结合补体调控蛋白的表达水平。这些数据指示E345R的引入增强了单克隆抗体的治疗潜能，这是由于肿瘤细胞在规避含有E345R的抗体的抗体介导的补体攻击方面较不有效。
实施例14：野生型和E345R抗体的CDC动力学的比较
已经显示引入Fc:Fc相互作用稳定性E345R突变增强或拯救CDC，如通过实施例3(CD38抗体005对Daudi、Raji和Wien133)和实施例11(CD38抗体003和CD20抗体利妥西单抗和11B8对Daudi和Wien133)中所述的不同抗体对不同细胞系的降低的EC50值以及提高的最大裂解所观察到的。接着，对CDC反应的动力学进行分析以进一步揭示野生型和E345R抗体之间的CDC功效的差别。
在圆底96孔板中，将0.1×106个Raji细胞与饱和浓度(10.0μg/ml)的抗体在总体积100μl中室温下在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育不同的时间段，0-60分钟变化。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图15A显示野生型CD20抗体IgG1-7D8显示CDC介导最大杀伤为80％的Raji细胞，这在测试的条件下5分钟后已经达到。然而，对于IgG-7D8-E345R，甚至更快(3分钟后)观察到Raji细胞的80％杀死。IgG-7D8-E345R的最大裂解(95％)也在5分钟之后达到。
图15B显示还有对于野生型CD20抗体利妥西单抗(该抗体针对所使用的Raji细胞诱导CDC的效力比7D8弱)，E345R突变的引入导致靶细胞的更快杀伤。野生型利妥西单抗显示出CDC介导的最大杀死为32％，这是在20分钟之后达到的。利妥西单抗-E345R则在大约3分钟之后就达到32％杀死并且显著地，在20分钟后也达到了利妥西单抗的最大裂解(85％)。
图15C+D显示能够通过引入E345R突变更快地杀死所使用的Raji细胞(该细胞对于野生型CD38抗体IgG1-003和IgG1-005的CDC介导的杀死具有抗性)。IgG1-003-E345R和IgG1-005-E345R在5分钟后已经显示出最大CDC(分别是50％和60％)。
总而言之，E345R抗体要比它们的野生型相对物更加有效力，这是由于更高功效(更低的EC50)、增加的最大裂解以及更快的CDC反应动力学的组合造成的。
实施例15：具有或不具有E345R突变的双特异性抗体的CDC动力学的比较
在实施例9中描述了可将E345R突变应用于由DuoBody平台所产生的CD38×CD20双特异性抗体IgG1-005-F405L×IgG1-7D8-K409R，导致增强的杀伤能力，如通过在CDC测定法中对于Raji和Wien133细胞的降低的EC50所观察到的。接着，对CDC反应的动力学进行分析以进一步揭示具有或不具有E345R突变的CD38×CD20双特异性抗体之间CDC功效的差异。
在圆底96孔板中，将0.1×106个Raji细胞与饱和浓度的抗体(10.0μg/ml)在总体积100μl中室温下在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育不同的时间段，0-60分钟变化。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图16显示，双特异性抗体IgG1-005-F405L×IgG1-7D8-K409R诱导了CDC介导的最大杀死为83％，这在10分钟之后达到。E345R突变的引入导致IgG1-005-F405L×IgG1-7D8-K409R的升高的最大杀伤(98％)，这在2分钟之后就已经达到。这些数据指示在双特异性抗体中引入Fc-Fc相互作用稳定性E345R突变导致CDC介导的靶细胞杀伤加速。
实施例16：具有或不具有E345R的单价结合抗体的CDC动力学的比较
实施例8显示，单价靶物结合进一步增强E345R抗体的CDC功效，如通过CD38×EGFR双特异性抗体对CD38阳性、EGFR阴性的Wien133细胞的最大裂解提高所观察到的。接着，对CDC反应的动力学进行分析以进一步揭示具有和不具有E345R突变的单价结合抗体之间CDC介导的杀伤能力的差异。
根据如实施例8所述的DuoBody平台体外产生具有或不具有E345R突变的双特异性CD38×EGFR和CD20×EGFR抗体。测试CD38×EGFR双特异性抗体针对CD38阳性、EGFR阴性Raji细胞(双特异性抗体只能通过CD38单价地结合该细胞)的CDC功效。在圆底96孔板中，将0.1×106个Raji细胞与饱和浓度的抗体(10.0μg/ml)在总体积100μl中室温下在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育不同的时间段，0-60分钟变化。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图17显示，双特异性抗体CD38×EGFR(IgG1-005-K409R×IgG1-2F8-F405L)诱导了CDC介导的最大杀伤为55％，这在大约10分钟后达到。E345R的引入导致最大杀死提高(96％)，这在5分钟之内就已经达到。
图17显示，双特异性抗体CD20×EGFR(IgG1-7D8-K409R×IgG1-2F8-F405L)诱导了CDC介导的最大杀伤为85％，这在大约5分钟后达到。然而，使用具有引入的E345R的CD20×EGFR抗体，观察到更快的85％裂解(2分钟后)。E345R CD20×EGFR抗体的最大裂解(97％)同样在5分钟后达到。
总而言之，在这些单价结合抗体中引入E345R突变导致更有效力的抗体，这是由于提高的最大裂解以及更快的CDC反应动力学所造成的。
实施例17：治疗性和E345R/Q386K抗体的组合的CDC
如实施例6中所述，衍生自IgG1-005的突变体CD38抗体当野生型抗体的E345位置被除谷氨酸(E)之外的任何氨基酸取代时能针对Wien133细胞诱导有效的CDC。这意味着，寡聚化(作为CDC的先决条件)由于抗体345位置处存在谷氨酸侧链而被阻碍。由于一条Fc上的E345紧邻着在六聚抗体环结构中对面的第二条Fc部分的Q386，因此有可能通过将第二个抗体的Q386位置进行取代而移除第一个抗体中E345-介导的寡聚化阻碍。在两个抗体组合的情况下这将使得第一个抗体的E345能够与第二个抗体的突变386位置更好地相互作用。为了测试这个假设，在Wien133上进行CDC测定法，其中将野生型抗体(IgG1-003、IgG1-005或IgG1-11B8)与IgG1-005-E345R/Q386K或IgG1-005-E345R/Q386K/E430G混合作为实例。
在圆底96孔板中，将0.1×106个Wien133细胞与系列浓度的未纯化的IgG1-005-E345R/Q386K、IgG1-005-E345R/Q386K/E430G或对照抗体(0.0001-20.0μg/ml以3.33倍稀释)在存在或不存在1.0或10.0μg/ml野生型IgG1-003、IgG1-005或IgG1-11B8的情况下在总体积100μl中室温下在摇床中预温育15分钟。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图18A/B/C显示CD38抗体IgG1-005-E345R/Q386K以剂量依赖的方式诱导Wien133细胞的CDC介导的裂解(虚线)。将IgG1-005-E345R/Q386K与1或10μg/ml野生型CD38抗体IgG1-003(图18A)或野生型CD20抗体IgG1-11B8(图18B)组合导致提高的最大细胞裂解。将IgG1-005-E345R/Q386K与野生型IgG1-005组合以剂量依赖的方式抑制CDC，可能是通过竞争结合位点实现(图18C)。
图18D/E/F显示了CD38抗体IgG1-005-E345R/Q386K/E430G的相似的结果。
这些数据指示，野生型抗体IgG1-003和IgG1-11B8当与IgG1-005-E345R/Q386K或IgG1-005-E345R/Q386K/E430G组合时参与了抗体的寡聚化和CDC激活。在这些组合中，存在于野生型抗体中的E345-位置造成的寡聚化阻碍能够至少部分被突变抗体中的Q386K取代所除去。本申请对改善使用E345位置为野生型的抗体(例如利妥西单抗、奥法木单抗、daratumumab或曲妥单抗)的治疗特别感兴趣。此外，这种寡聚化诱导抗体够促进与针对靶细胞(像肿瘤细胞或细菌)的患者自身抗体形成细胞结合复合体。
实施例6描述了除E345之外的多个氨基酸(其突变后增强CDC)，例如E430和S440，当将它们的特定突变在导入CD38抗体IgG1-005时诱导了针对Wien133细胞的有效CDC。除了I253和Y436突变体外，在六聚体环结构中所鉴定的寡聚化增强突变与对面第二Fc部分的未突变氨基酸相接触。因此，所鉴定的寡聚化增强性突变，无论是单独还是组合，预计都能够促进与未突变抗体的寡聚化，并且可通过与实施例6中所应用的相似的选择策略来完成这种突变体的进一步优化。
实施例18：E345R诱导IgG2、IgG3和IgG4抗体同种型的CDC
为了测试引入促进寡聚化的突变是否能够刺激非IgG1抗体同种型的CDC活性，通过本领域已知方法来产生具有人IgG2、IgG3或IgG4恒定区的CD38抗体IgG1-005同种型变体，生成IgG2-005、IgG3-005和IgG4-005。此外，将增强寡聚化的E345R突变引入所有这些抗体中，生成IgG2-005-E345R、IgG3-005-E345R和IgG4-005-E345R。从CD38抗体IgG1-003还以类似的方式产生IgG2-003和IgG2-003-E345R。在体外CDC测定中比较不同同种型的CDC功效。
在圆底96孔板中，将0.1×106个Wien133细胞与10μg/ml的未纯化抗体在总体积100μl中室温下在摇床中预温育15分钟。以3.0μg/ml加入IgG1-005-E345R。接着，加入25μl正常人血清作为补体来源(20％终浓度)，在37℃的培养箱中温育45分钟。将平板置于冰上以终止反应。加入10μl碘化丙啶并通过FACS确定细胞的裂解。
图19显示，IgG2-005、IgG2-003、IgG3-005和IgG4-005在所测试的条件下不能裂解(A)Daudi或(B)Wien133细胞(所观察的约20％的裂解被认为是背景)。E345R突变的引入使得所有所测试的IgG同种型的针对Daudi细胞的有力CDC。使用针对Wien133细胞的CDC证实了这些结果，尽管相对于其他的同种型变体，IgG3-005-E345R展示出有限的CDC活性。这些数据指示除了IgG1外，增强寡聚化的突变，如E345也能用于促进IgG2、IgG3和IgG4抗体的CDC活性。
实施例19：在离体CDC测定中IgG1-005和IgG1-005-E345R对患者来源的CD38阳性B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞的CDC
来自于CLL患者样本的冷冻保存的原代细胞获自CDB-IDIBAPS-临床医院(Dr.Elias Campo,血液科,病理部,临床医院，Institutd’Investigacions BiomediquesAugust Pi I Sunyer(IDIBAPS),巴塞罗那大学，巴塞罗那，西班牙)的血液病理生物库，或国家心、肺和血液研究所(NHLBI)的临床研究(Dr.Adrian Wiestner,NHLBI,国家健康研究所的血液学分支机构(Hematology Branch of the Naional Insitutes of Health(NIH)),Bethesda)。根据临床医院的机构伦理委员会(巴塞罗那，西班牙)或NIH的机构审查委员会和赫尔辛基公告，从所有患者处获得知情同意书。所有样本都进行遗传性和免疫表型表征。
如FACS所确定，将CLL样本根据它们的CD38表达分类成两组：5个样品包括于CD38高组(Daudi细胞上具有50％-98％的CD38表达)，4个样品包括于CD38低组(Daudi细胞上具有0.5％-3％的CD38表达)。
将荧光标记的CLL细胞(用5μM钙黄绿素(Calcein)AM标记)与系列浓度的抗体(0.01-10μg/ml以10倍稀释)一起温育。接着，将正常人类血清加入至抗体调理的细胞中(100,000个细胞/孔)以作为补体来源(10％终浓度)并在37℃温育45分钟。回收上清液，在SynergyTM HT荧光计数器上读取荧光作为细胞裂解的测量。如下计算细胞杀死：比裂解＝100×(样品-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)，其中最大裂解由用1％Triton处理的细胞样品确定，而自发裂解则由其中将细胞温育于不含抗体的10％NHS中的样品所确定。
图20显示，相比起野生型IgG1-005，IgG1-005-E345R强烈地增强了针对具有高CD38表达的CLL原代细胞以及具有低CD38表达的CLL原代细胞两者的CDC功效。
实施例20：IgG1-005-E345R/E430G/S440Y在溶液中形成非共价的六聚体复合物
使用Quikchange定点诱变试剂盒(Stratagene，美国)制备IgG1-005-E345R/E430G/S440Y三重突变体。简而言之，使用编码期望的突变E345R的正向和反向引物来复制编码具有IgG1m(f)同种异型的IgG1-005重链的全长质粒DNA模板。用DpnI消化所得到的DNA混合物以移除来源质粒DNA并用于转化大肠杆菌。通过DNA测序(Agowa,Germany)来检查从所得到的菌落中分离出来的突变体质粒DNA。使用相同策略将S440Y突变引入IgG1-005-E345R/E430G骨架中。使用293fectin(Invitrogen，美国)基本上如制造商所述将编码抗体重链和野生型轻链两者的质粒DNA混合物瞬时转染至Freestyle HEK293F细胞(Invitrogen，美国)。所得抗体是在两条重链中含有E345R/E430G/S440Y三重突变的同型二聚体。
通过蛋白A亲和层析来纯化IgG1-005和IgG1-005-E345R/E430G/S440Y抗体。将细胞培养上清液经由0.20μM死端滤器(dead-end filter)过滤，接着加载到5mL蛋白A柱(rProtein A FF,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上并用0.1M柠檬酸-NaOH,pH 3洗脱IgG。将洗脱液立即用2M Tris-HCl,pH 9中和，并对12.6mM磷酸钠、140mM NaCl,pH 7.4(B.Braun,Oss,The Netherlands)过夜透析。在透析后，将样品经由0.20μM死端滤器无菌过滤。通过SDS-PAGE、自然PAGE、HP-SEC、多角度光散射(MALS)和动态光散射(DLS)分析纯化的蛋白质。
在还原和非还原条件下在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen,Breda,TheNetherlands)上使用改良的Laemmli方法(Laemmli 1970Nature 227(5259):680-5)实施SDS-PAGE，其中使样品在中性pH运行。将SDS-PAGE凝胶用Coomassie染色并使用GeneGenius(Synoptics,Cambridge,UK)数字成像。图21显示IgG1-005-E345R/E430G/S440Y展现出具有二硫键连接的重链和轻链的IgG1抗体的典型行为。在非还原条件下可看到具有约150kDa表观MW的单个分子种类，而在还原条件下可看到具有50kDa表观MW的重链和26kDa表观MW的轻链。我们得出如下结论，在变性条件下形成一种单体分子，其展现出高度类似于野生型IgG1抗体的行为。
在非还原条件下使用Sebia Hydragel 15/30蛋白质凝胶(Westburg,Leusden,TheNetherlands)、酸性紫(acid violet)染色并在Hydrasys仪(Sebia,Vilvoorde,Belgium)上运行来实施自然PAGE。图21显示IgG1-005-E345R/E430G/S440Y以类似于无关的IgG1-b12对照抗体的高度运行，尽管稍更弥散。观察到的弥散染色可能是由不稳定复合物的形成所导致的，但在这些PAGE条件下，IgG1-005-E345R/E430G/S440Y行为主要类似于单体IgG1分子。
使用连接于TSK HP-SEC柱(G3000SWxl；Toso Biosciences,via Omnilabo,Breda,The Netherlands)、Waters 2487双重λ吸光度检测器(Waters)和Mini Dawn Treos MALS检测单元(Wyatt)的Waters Alliance 2975分离单元(Waters,Etten-Leur,TheNetherlands)来实施HP-SEC分级。含有1.25μg/mL蛋白质的50μL样品以1mL/min在于pH 6.8缓冲的0.1M Na2SO4/0.1M磷酸钠中分离。使用Empower软件版本2002处理结果，并按峰表示为总峰面积的百分数。图22显示>99％的野生型IgG1-005由完整单体IgG组成，实际上没有形成聚集物。
图23显示三重突变体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y展现有估测为79％的较大分数的寡聚体，而群体的21％在对于单体种类预期的洗脱时间处观察的峰中洗脱。
野生型IgG1-005和IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的HP-SEC概况的叠加图显示于图24，并进一步例示了这两种抗体之间的行为差异。IgG1-005-E345R/E430G/S440Y明显形成高MW复合物，尽管这些复合物似乎对HP-SEC分离敏感，如由在两个峰之间洗脱的大量蛋白质所指示的。HP-SEC分离引起的剪切力可能使通过IgG1-005-E345R/E430G/S440Y单体装配形成的非共价复合物去稳定。
为了评估IgG1-005-E345R/E430G/S440Y样品中观察到的寡聚体复合物的大小，通过多角度光散射(MALS)测定HP-SEC洗脱物的平均分子量。次要的单体峰以143kDa(预期145.4kDa)的表观平均MW洗脱，而多聚体峰以772kDa的表观平均MW或约5.4个单体亚单位洗脱。由于复合物在这些条件下的不稳定性，复合物的MW或许是低估的。例如，88％六聚体种类和12％单体种类的共洗脱混合物将导致观察的平均复合物大小为5.4个单体亚单位。
为了评估溶液中的表观分子量，在缺少可能由与HP-SEC基质的相互作用诱导的剪切力的情况下，实施动态光散射(DLS)分析。分析45μL经0.2μM过滤的PBS pH 7.4中IgG1-005(3.80mg/mL)或IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(2.86mg/mL)，其使用DynaPro-801仪(Protein Solutions Inc/Wyatt,Dernbach,Germany)在100μL石英小管中，每实验记录20次连续的测量，共有3个独立的实验。使用BSA的MW作为参照校正后，IgG1-005的表观MW为141.7kDa(预期145.4)，而IgG1-005-E345R/E430G/S440Y展现出约875.6kDa的MW或6.17个单体亚单位。对于IgG1-005抗体没有观察到寡聚化的迹象，而IgG1-005-E345R/E430G/S440Y表明高度有效的复合物形成。
总之，生物物理学数据指示突变体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y在变性条件下形成二硫键连接的IgG1样分子，其为单体(即单个二聚体蛋白质)，如通过SDS-PAGE观察到的，且在溶液中形成六聚体复合物，如通过DLS观察到的。通过自然PAGE施加的剪切力足以使复合物完全解离，而HP-SEC部分使占优势的六聚体复合物去稳定，如由单体的较小分数的存在指示的。
实施例21：使用IgG1-005、IgG1-005-E345R/E430G/S440Y和IgG1-005-E345R的功能性测定法
C1q结合ELISA
在ELISA中测试野生型IgG1-005、三重突变体IgG1-005-E345R-E430G-S440Y和IgG1-005-E345R的C1q结合，其中将纯化的抗体固定化在塑料表面上，引起随机抗体多聚化。将合并的人血清用作C1q的来源。
将96孔Microlon ELISA板(Greiner,Germany)在4℃用抗体在PBS中的稀释系列(范围0.007-25.0μg/mL，以2.5倍稀释)过夜包被。清洗板并用补充有0.025％Tween 20和0.1％胶质(gelatine)的200μL/孔0.5x PBS封闭。在温育之间的清洗，将板进行以下连续温育：与3％合并的人血清(Sanquin,product#M0008)在37℃温育1小时，与100μL/孔家兔抗人C1q(DAKO，产品#A0136,1/4.000)在RT温育1小时，和与100μL/孔的作为检测抗体的猪抗家兔IgG-HRP(DAKO,P0399,1:10.000)在RT温育1小时。使用1mg/mL 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS；Roche,Mannheim,Germany)实施约30min的显色。通过添加100μL2％草酸终止反应。在405nm在微板读数器(Biotek,Winooski,VT)中测量吸光度。通过使用GraphPad Prism软件拟合具有可变斜率的S形剂量-应答曲线来分析经对数转化的数据。从S形剂量-应答曲线计算EC50值。
图25和表8显示，IgG1-005-E345R/E430G/S440Y比WT IgG1-005和IgG1-005-E345R显示更有效的C1q结合，如通过ELISA测量的(更低的EC50值)。对3种抗体测试包被效果，发现其是相似的(未显示)。
表8：ELISA中C1q结合的EC50
在CD38阳性Ramos细胞上的CDC测定
将0.1x 106Ramos细胞在圆底96孔板中与总体积100μL中纯化抗体的浓度系列(10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.005,0.0025,0.0013,0.0006和0.0003μg/mL)在振荡器上于RT预温育15min。接着，添加25μL正常人血清作为补体源(20％终浓度)并在37℃培养箱中温育45min。通过将板置于冰上来终止反应。添加10μL碘化丙啶并通过FACS测定细胞裂解。
使用一种三阶段模型来拟合IgG1-005-E345R/E430G/S440Y数据并计算中间EC50值(表9)。IgG1-005-WT和IgG1-005-E345R可通过拟合具有可变斜率的S形剂量-应答曲线来拟合。从S形剂量-应答曲线来计算EC50值(表9)。使用GraphPad Prism软件来拟合数据(图26)。IgG1-005-E345R/E430G/S440Y相比于野生型IgG1-005和IgG1-005-E345R抗体在Ramos细胞上显示增强的CDC活性。IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的三阶段模型可通过以下事实来解释，在低浓度(从0.0003至0.03μg/mL)，稳定的六聚体内的抗体不需要全部结合靶物以诱导有效的CDC。细胞表面C1q结合位点由在低抗体浓度已经结合的IgG1-005-E345R/E430G/S440Y有效产生，因为对于抗体六聚化不需要抗原聚集。
表9：CDC的EC50
使用CD38阳性Raji细胞的ADCC报告物测定法
使用ADCC生物发光报告物测定(Promega Madison,WI,USA)测量对Raji靶细胞调理的抗CD38抗体的ADCC活性，其中对效应器细胞中的生物途径活化进行定量。
该报告物测定法使用用FcγRIIIa受体V158(高亲和力)变体的基因和在驱动萤光素酶表达的NFAT(活化T细胞的核因子)应答元件后克隆的萤火虫萤光素酶报告基因稳定转染的Jurkat细胞作为效应器细胞。结合效应器细胞上的FcγRIIIa受体的抗体诱导NFAT介导的基因转录和由此的萤光素酶表达，其通过发光读数量化。将Raji细胞与一定浓度系列的纯化抗体温育(250,71.4,20.4,5.8,1.7和0.5ng/mL)。对于材料和方法的进一步描述，参见由Promega提供的技术手册。在FcγRIIIa受体衔接后，IgG1-005-E345R/E430G/S440Y诱导NFAT途径活化。图27显示用IgG1-005-E345R/E430G/S440Y调理的Raji细胞诱导效应器细胞的FcgRIIIa介导的活化，如在报告测定法中测量的。IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的EC50值比对野生型IgG1-005和IgG1-005-E345R要高(表10)。然而，IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的最大信号比野生型IgG1-005和IgG1-005-E345R的高(表10)。
表10：ADCC报告物测定法的EC50和最大信号
实施例22：IgG1-005-E345R/E430G/S440Y相比于野生型IgG1-005的药动学(PK)分析
使本实验中的小鼠居住在中心实验室动物房(Central Laboratory AnimalFacility)(Utrecht,The Netherlands)的屏障单元(barrier unit)中并置于滤器定置式笼中，任意提供水和食物。所有实验均得到乌得勒支大学(Utrecht University)动物伦理委员会批准。将SCID小鼠(C.B-17/IcrCrl-scid-BR,Charles-River)用500μg抗体(野生型IgG1-005或IgG1-005-E345/E430G/S440Y)静脉注射，使用3只小鼠每组。
在抗体施用后10分钟、4小时、1天、2天、7天、14天和21天时从隐静脉收集50μL血液样品。将血液收集到含肝素的管形瓶中并以10,000g离心5分钟。将血浆保藏于–20℃直至测定抗体浓度。
使用总hIgG和CD38特异性夹心ELISA来测定具体的人IgG浓度。对于总hIgGELISA，将以2μg/mL的浓度包被到96孔Microlon ELISA板(Greiner,Germany)上的小鼠mAb抗人IgG-kappa克隆MH16(#M1268,CLB Sanquin,The Netherlands)用作捕捉抗体。在用补充有0.2％牛血清白蛋白的PBS封闭板后，添加样品、系列稀释的ELISA缓冲液(补充有0.05％Tween 20和0.2％牛血清白蛋白的PBS)，并在板振荡器上于室温(RT)温育1h。随后将板与山羊抗人IgG免疫球蛋白(#109-035-098,Jackson,West Grace,PA)温育并用2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS；Roche,Mannheim,Germany)显色。在微板读数器(Biotek,Winooski,VT)中在405nm测量吸光度。对于特异性CD38ELISA，将带His标签的CD38胞外域以2μg/mL的浓度包被至96孔Microlon ELISA板(Greiner,Germany)。在用ELISA缓冲液封闭板后，添加用ELISA缓冲液系列稀释的样品，并在板振荡器上在室温(RT)温育1h。随后将板与30ng/ml小鼠抗人IgG1-HRP(Sanquin M1328，克隆MH161-1)温育，并用2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS；Roche,Mannheim,Germany)显色。在微板读数器(Biotek,Winooski,VT)中在405nm测量吸光度。
图28显示在所有测试的时间点，血浆人IgG浓度对于突变体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y比对于IgG1-005野生型低得相当多。图29显示IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的清除速率比WT IgG1-005的清除速率高约50倍。
实施例23：可以通过缓冲液组成控制IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的寡聚状态
使用连接于TSK HP-SEC柱(G3000SWxl；Toso Biosciences,via Omnilabo,Breda,The Netherlands)、Waters 2487双重λ吸光度检测器(Waters)和Mini Dawn Treos MALS检测单元(Wyatt)的Waters Alliance 2975分离单元(Waters,Etten-Leur,TheNetherlands)来实施IgG1-005和IgG1-005-E345R/E430G/S440Y抗体的HP-SEC分级。50μL含有1.0μg/mL蛋白质的样品以1mL/min在不同缓冲条件下分离。使用Empower软件版本2002处理结果，并按峰表示为总峰面积的百分数。
图30显示在pH 6.8缓冲的0.1M Na2SO4/0.1M磷酸钠中记录的HP-SEC洗脱概况。在pH 6.8，>99％的野生型IgG1-005抗体作为单体种类洗脱。相比之下，显示于图31的IgG1-005-E345R/E430G/S440Y在该缓冲液中的HP-SEC概况显示77％的寡聚体分数，而群体中有23％作为单体种类洗脱。如记载于实施例19的，剩余的较小分数的单体可能是由柱诱导的解离所引起的，因为在这些条件下使用动态光散射的分批-模式分析中没有观察到IgG1-005-E345R/E430G/S440Y单体的踪迹。
图32显示在pH 6.8(虚线)和pH 5.0(实线)缓冲的0.15M NaCl/0.1M柠檬酸盐中记录的IgG1-005的HP-SEC洗脱概况的叠加图。IgG1-005在pH 6.8和pH 5.0的柠檬酸盐缓冲液中的HP-SEC概况与在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中的行为高度相当，其中>99％的蛋白质作为单体种类洗脱。
图33显示在pH 6.8(虚线)和pH 5.0(实线)缓冲的0.15M NaCl/0.1M柠檬酸盐中记录的IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的HP-SEC洗脱概况的叠加图。与在pH 6.8的磷酸盐中的行为一致，在柠檬酸盐pH 6.8中抗体展现出84％的寡聚化。形成鲜明对比的是，将pH降至5.0急剧地逆转了IgG1-005-E345R/E430G/S440Y的寡聚化。多聚体分数下降至低于1％，其中>99％的蛋白质作为单体种类洗脱。寡聚体的解装配是低pH条件特有的，且并非由使用柠檬酸盐作为缓冲液组分导致，如通过在pH 6.8缓冲的柠檬酸盐中的有效寡聚化显示的。
总之，将pH从6.8降低至5.0足以完全使溶液相抗体六聚体解装配，这种效应可由对六聚体抗体装配体至关重要的Fc:Fc界面处存在的组氨酸氨基酸的电荷修饰解释。另外，该行为是含有诱导Fc介导的自装配的突变的抗体变体如IgG1-005-E345R/E430G/S440Y所特有的，而野生型抗体在两种pH水平均保持为单体。
实施例24：引入Fc-Fc稳定的六聚体突变E345R/E430G/S440Y将导致IgG抗体对表达Fc结合表面蛋白的细菌的增加的杀细菌活性.
补体级联系统是重要的针对病原体的宿主防御机制，其可以被分为三种不同的激活途径以识别病原体：i)抗体介导的经典途径，其在C1q结合至与病原体结合的抗体时被激活，ii)凝集素和iii)替代途径，其中在没有抗体存在的情况下补体系统直接识别病原体并由病原体激发。这三条途径汇聚于C3切割和C3b沉积的步骤。微生物已经形成多种补体逃避机制，其中一种是由蛋白A介导的(Joiner Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:201-30；FosterNat Rev Microbiol(2005)Dec；3(12):948-58)。蛋白A是在金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的细胞壁中被首次鉴定出来，并因其与IgG的Fc区结合而被人所熟知(Deisenhofer等.,Biochem(1981)20,2361-70；Uhlen等.,J.Biol.Chem(1984)259,1695-1702)。迄今为止，蛋白A的抗噬菌作用及其在金黄色葡萄球菌发病机制中的作用可由蛋白A和IgG之间的相互作用来解释，所述相互作用产生要被嗜中性粒细胞Fc受体识别的不正确抗体方向(Foster Nat Rev Microbiol(2005)Dec；3(12):948-58)。在实施例4中显示，由B细胞特异性IgG1抗体所介导的CDC被竞争的Fc-结合肽DCAWHLGELVWCT所抑制。该肽靶向IgG Fc上与蛋白A、蛋白G和类风湿因子的结合位点相一致的共有结合位点(Delano等，Science 2000Feb 18；287(5456):1279-83)。基于这些数据，推测蛋白A介导的细菌补体逃逸机制可通过竞争Fc结合起作用，导致微生物特异性抗体的Fc-Fc相互作用去稳定，并因此抑制抗体介导的补体激活。而且，在实施例4中还显示，含有CDC-增强性E345R突变的B细胞特异性IgG1抗体对于通过竞争性Fc-结合肽DCAWHLGELVWCT抑制CDC要比亲本野生型抗体更不敏感。通过将这些结果外推至微生物表达的Fc结合蛋白，由E345R突变而提高的IgG1Fc-Fc相互作用稳定将使得微生物特异性抗体更不易于借助微生物表面蛋白(如蛋白A)通过Fc结合竞争的病原体逃逸策略的补体抑制。因此，与亲本野生型抗体相比，将E345R突变引入到针对细菌的IgG抗体将导致C3b在细菌上的沉积增加以及杀细菌活性的提高。预期在结合微生物靶物之前已经寡聚化的稳定化六聚体(IgG-E345R/E430G/S440Y)将比含有单E345R突变的IgG抗体对例如蛋白A甚至更具弹性(resilient)。因此，将E345R/E430G/S440Y突变引入针对微生物的IgG抗体中将导致与亲本野生型抗体相比，C3b在细菌上的沉积增加以及杀菌活性的提高。
为了测试IgG1-005-E345R/E430/S440Y寡聚化是否能抑制对蛋白A的结合，通过两种正交方法(orthogonal method)来分析IgG1-005和IgG1-005-E345R/E430/S440Y的纯化蛋白制备物：
1)通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Isogen Life Science,Maarssen,TheNetherlands)测量280nm波长处的吸光度进行IgG浓度测定。
2.使用Octet QK仪(Fortebio,Menlo Park,USA)，在Octet样品稀释剂(SampleDiluent)中并使用即用型蛋白A传感器尖端(sensortips)(Fortebio,Menlo Park,USA)，与IgG标准品(Siemens)参照曲线直接比较来进行IgG浓度测定。
通过确定由A280测定的浓度对使用Octet-蛋白A测定的浓度之间的比率，观察到IgG1-005-E345R/E430/S440Y确实比IgG1-005更不倾向于结合蛋白A(表11)。
表11：通过280nm处的吸光度和Octet-蛋白A得到的抗体浓度
作为对补体介导的细菌杀伤的体外测量，可确定嗜中性粒细胞的吞噬作用以及血浆中C3a的生成(其与C3b在细菌上的沉积一致)两者。实际上，已经描述了C3b在金黄色葡萄球菌上的沉积导致增强的吞噬作用并与细胞杀伤有关(Rooijakkers等,NatureImmunology 2005:6,920-927)。
通过将指数生长的细菌培养物与100μg/ml FITC在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中在37℃温育1小时来用FITC标记金黄色葡萄球菌。利用Ficoll梯度来分离人多形核细胞(PMN)。用系列浓度的具有或不具有突变E345R/E430G/S440Y的特异性抗体来调理FITC标记的细菌。通过使1×108个经过调理的FITC标记细菌与人PMN在存在25％IgG消耗的血清作为补体来源的情况下在总体积200μl中在37℃在强烈振荡的条件下温育25分钟来体外进行吞噬作用。固定细胞并通过在室温与BD FACS裂解溶液温育15分钟来进行红细胞溶解。洗涤之后，通过FACS来测量吞噬作用。通过正向和侧向散射门控来选择嗜中性粒细胞群体，而吞噬作用则以嗜中性粒细胞群体中的平均荧光表示。或者，通过ELISA作为补体激活和C3b沉积的测量来对样品中的C3a生成进行测量。
预期含有E345R/E430G/S440Y突变的金黄色葡萄球菌特异性抗体比起亲本野生型抗体将诱导更多的补体激活以及嗜中性粒细胞的吞噬作用。可用于此类实验的抗体的示例为嵌合单克隆IgG1帕吉昔单抗(pagibaximab)(BSYX-A110；Biosynexus)，其靶向嵌入葡萄球菌细胞壁之中的脂磷壁酸(Lipoteichoic acid)(LTA)(Baker,NatBiotechnol.2006Dec；24(12):1491-3；Weisman等,Int Immunopharmacol.2009May；9(5):639-44)。
实施例25：通过引入E345R/E430G/S440Y三重突变形成非共价六聚体IgG复合物的发生与Fab域无关.
对实施例20中的CD38抗体005证明了通过引入E345R/E430G/S440Y(RGY)三重突变得到的非共价结合的六聚体抗体复合物在溶液中的形成。在本实验中形成在其Fab域中不同的其他人IgG1抗体的非共价六聚体IgG复合物：CD20抗体7D8和利妥昔单抗(rituximab)、EGFR抗体2F8和白色念珠菌(C.albicans)甘露聚糖抗体M1g1。基本如实施例20记载的实施三重突变体抗体的生成和纯化以及HP-SEC分析。
图34显示，所有的三重突变体抗体均显示较大分数的寡聚体：IgG1-7D8-RGY(67.2％)(图34A)、IgG1-ritux-RGY(83.6％)(图34B)、IgG1-2F8-RGY(74.5％)(图34C)和IgG1-M1-RGY(74.5％)(图34D)。这些数据指示E345R/E430G/S440Y对于诱导抗体在溶液中自装配成六聚体的概念可一般性应用于IgG1序列，其与Fab域一级结构(primarystructure)无关。
实施例26：通过含有E345R/E430G/S440Y三重突变的CD20抗体在离体CDC测定中对于患者来源的CD20阳性CLL细胞的CDC.
从CLL外周血单核细胞分离的冷冻CLL PB CD19+/CD5+B细胞(复发/难治性)购自Allcells,Emeryville,CA。如记载于实施例21的那样实施CDC，只是使用每个96孔板20,000个细胞。通过QIFIKIT,Dako,Glostrup,Denmark将CD20表达测定为39,000特异性抗体结合能力(Specific Antibody-Binding Capacity,sABC)。图35显示含有E345R/E430G/S440Y三重突变的CD20抗体在CD20阳性原发性CLL细胞上显示功能性CDC活性。E345R/E430G/S440Y突变的引入导致7D8对原发性CLL细胞的更有效CDC介导的杀伤(更低的EC50)(图35A)并实现通过利妥昔单抗的有力的CDC，其在WT型式中未显示任何杀伤活性(图35B)。
实施例27：可对不同抗体同种型应用用于诱导六聚化和增加的CDC的E345R/E430G/S440Y三重突变的引入。
通过本领域中已知的方法生成具有人IgG2、IgG3或IgG4的恒定域的CD38抗体IgG1-005的同种型变体，从而得到IgG2-005、IgG3-005和IgG4-005。此外，将三重突变E345R/E430G/S440Y引入所有这些抗体中，从而得到IgG2-005-RGY、IgG3-005-RGY和IgG4-005-RGY.
如记载于实施例20的那样实施对不同同种型的HP-SEC分析。
图36显示含有E345R/E430G/S440Y三重突变的测试同等型在溶液中形成六聚体复合物：IgG1-005-RGY(79.2％多聚体)(图36A)、IgG2-005-RGY(46.1％多聚体)(图36B)、IgG3-005-RGY(37.8％多聚体)(图36C)和IgG4-005-RGY(84.4％多聚体)(图36D)。
如记载于实施例18的，通过在体外CDC测定法中测试未纯化的抗体浓度系列(0.0003-10μg/mL，以2倍稀释)比较不同同种型的CDC功效。图37显示引入RGY三重突变实现了测试的所有IgG同种型在Daudi细胞上的有力的CDC(图37A)。在Wien133细胞上使用CDC确认了这些结果(图37B)，尽管IgG3-005-RGY相对于其他同种型变体展现出有限的CDC活性。对于RGY三重突变体的这些数据与对于E345R突变体在实施例18、图19中显示的数据类似。
实施例28：用于诱导在溶液中形成非共价寡聚体复合物的突变组合
实施例20描述了含有3个突变E345R、E430G和S440Y(RGY)的抗体IgG1-005在溶液中形成寡聚体复合物。测试了在这3个位置的任意一个中具有氨基酸取代的该三重突变变体的抗体在溶液中形成寡聚体复合物的能力。作为可能的E345R取代的类别(由E345到A/C/D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y组成)的一个例子，将E345K与E430G/S440Y组合进行了测试。作为可能的E430G取代的类别(由E430到A/C/D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y组成)的一个例子，将E430S与E345R/S440Y组合进行了测试。可能的S440Y取代的类别由具有在选自S440,Y436,D/E356,T359,E382,N434,Q438,I253和S254的至少一个位置处的以下氨基酸的蛋白质组成，所述氨基酸对于每个位置分别为：是Y或W；不是Y；不是D或E；不是T；不是E；不是N；不是Q；不是I；和不是S。作为S440Y取代的此类别的一个例子，将Y436I和S440W与E345R/E430G组合进行了测试。通过本领域中已知的方法将突变组合E345K/E430G/S440Y(表示为RGY)，E345R/E430S/S440Y(表示为RSY)，E345R/E430G/S440W(表示为RGW)，或E345R/E430G/Y436I(表示为RGI)引入CD38抗体IgG1-005中，从而分别得到IgG1-005-KGY，IgG1-005-RSY，IgG1-005-RGW和IgG1-005-RGI。
如记载于实施例20的那样实施HP-SEC分析。图38显示与IgG1-005-RGY(实施例20、图23)类似，IgG1-005-KGY(图38A)、IgG1-005-RSY(图38B)和IgG1-005-RGW(图38C)在溶液中均以不同效率形成了寡聚体复合物。对于突变体IgG1-005-KGY和IgG1-005-RGW，在寡聚体和单体峰之间观察到的A280信号移动表明HP-SEC方法可促进寡聚体复合物的去稳定，如实施例20中记载的。
如记载于实施例18的，通过在体外CDC测定法中测试未纯化的抗体浓度系列(0.0003-10μg/mL，以3倍稀释)比较抗体的CDC功效。图39A显示所有测试的三重突变组合均赋予IgG-005以在体外CDC测定法中杀伤Wien133细胞的能力，而野生型IgG-005不显示任何杀伤。图39B显示与野生型IgG1-005相比，Ramos细胞也被测试的三重突变体抗体更有效的杀伤。
这些数据显示溶液中的寡聚化和/或CDC的诱导可由IgG1-005-KGY、IgG1-005-RSY、IgG1-005-RGW和IgG1-005-RGI诱导，表明选自任何可能的天然存在的氨基酸E345R取代、任何可能的天然存在的氨基酸E430G取代的突变，或氨基酸色氨酸或酪氨酸可以是S440的可能氨基酸取代，可以分别取代E345R、E430G和S440Y。此外，HP-SEC数据表明这类取代能调控寡聚体复合物的含Fc的多肽亚基之间的相互作用强度。
实施例29：含有E345R/E430G/S440Y三重突变的抗体可装配成异寡聚体环
实施例5、图7显示含有两个互补突变K439E或S440K之一的抗体(例示于图4)在其CDC活性上受抑制，但它们在混合时可形成能CDC激活的复合物。实施例20描述了抗体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(此处称为IgG1-005-RGY)的构建，其在溶液中形成寡聚体(最可能是六聚体)复合物，该复合物相比于野生型IgG1-005也显示增强的CDC活性(实施例21,图26)。实施例28描述了IgG1-005-KGY、IgG1-005-RSY、IgG1-005-RGW和IgG-005-RGI相比于IgG1-005也显示增强的CDC。为了测试溶液相寡聚化是否能限于非自身相互作用的抗体的混合物，生成各含有抑制自身寡聚化的两个互补突变K439E或S440K之一的IgG1-005-RGY的抗体变体。
通过本领域中已知的方法将突变K439E引入IgG1-005-E345R/E430G/S440Y，得到IgG1-005-E345R/E430G/K439E/S440Y(IgG1-005-RGEY)。通过本领域中已知的方法将突变S440K引入到IgG1-005-E345R/E430G，得到IgG1-005-E345R/E430G/S440K(IgG1-005-RGK)。通过本领域中已知的方法将突变Y436I和S440K引入到IgG1-005-E345R/E430G，得到IgG1-005-E345R/E430G/Y436I/S440K(IgG1-005-RGIK)。将Y436I包括在IgG1-005-RGIK中的原理是补偿寡聚化增强性突变S440Y的缺乏。
如实施例20中记载的，实施对不同抗体变体和等摩尔抗体混合物的HP-SEC分析，不过使用PBS(12.6mM磷酸钠，140mM NaCl,pH 7.4；B.Braun,Oss,The Netherlands)作为流动相。图40显示将K439E引入IgG1-005-RGY抑制IgG1-005-RGEY的自身寡聚化(2.7％多聚体)。同样地，将IgG1-005-RGY中的S440Y用突变S440K取代抑制IgG1-005-RGK的自身寡聚化(2.2％多聚体)。突出地，溶液相单体(即单一的二聚体抗体)IgG1-005-RGEY加IgG1-005-RGK的混合物形成具有与IgG1-005-RGY等同的HP-SEC迁移率的寡聚体种类(65％多聚体)，尽管比IgG1-005-RGY(84％多聚体)的效率要低。
图41显示将Y436I加S440K引入IgG1-005-E345R/E430G抑制IgG1-005-RGIK的自身寡聚化(1.8％多聚体)。再次，溶液相单体IgG1-005-RGEY加IgG1-005-RGIK的混合物形成具有与IgG1-005-RGY等同的HP-SEC迁移率的寡聚体种类，但现在具有较高的效率(93％多聚体)。
图42显示混合物IgG1-005-RGEY加IgG1-005-RGK与混合物IgG1-005-RGEY加IgG1-005-RGIK的直接比较，证明IgG1-005-RGIK(65％多聚体)比IgG1-005-RGK(93％多聚体)能更有效地诱导与IgG1-005-RGEY的异聚体寡聚化。IgG1-005-RGIK中额外的寡聚化和CDC增强突变Y436I的存在明显稳定了与IgG1-005-E345R/E430G/K439E/S440Y的复合物形成。
总之，通过混合具有互补突变(一个中的K439E，另一个抗体中的S440K)的抗体分子，可将含有突变E345R/E430G和另外的自身寡聚化抑制性突变K439E/S440Y，或S440K，或Y436I/S440K的IgG1-005抗体再装配成多聚体复合物。
实施例30：可通过细胞结合抗体将Fc片段募集到细胞表面，如果两种组分均含有E345R/E430G/S440Y三重突变的话
通过本领域中已知的方法将3个突变E345R、E430G和S440Y引入IgG1m(f)Fc片段，从而创建了Fc-RGY。如记载于实施例20的那样表达和纯化蛋白质。如记载于实施例20的那样实施对Fc-RGY样品的HP-SEC分析。图43显示在使用的HP-SEC条件下，Fc-RGY显示约28％单体和72％寡聚体(以多种状态分布)，如通过峰面积对总面积的分数测量的。
接着，测试Fc-RGY片段在溶液中是否能在具有IgG1-RGY抗体的寡聚体复合物中募集。因此，将6μg/mL Alexa-647标记的Fc-RGY(Fc-RGY-A647)以1:1与EGFR特异性或CD20特异性抗体的浓度系列(0.001-3μg/mL，以3倍稀释)混合。在混合后立即将样品添加到0.1x106个EGFR阳性A431或CD20阳性Daudi细胞并在4℃温育45分钟。在将细胞用RPMI1640/0.1％BSA清洗两次(3分钟，1200rpm)后，将细胞重悬于PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物并在FACS Canto ll(BD Biosciences)上分析。
图44A显示将Fc-RGY-A647与EGFR特异性IgG1-2F8-RGY抗体混合产生在EGFR阳性A431细胞上的剂量依赖性荧光信号。相比之下，CD20特异性IgG1-7D8-RGY不能将Fc-RGY-A647募集至CD20阴性A431细胞。其他测试的Fc-RGY-A647与IgG1-2F8或IgG1-2F8-E345R混合的对照组合无一产生荧光信号。还有，与IgG1-2F8混合的CD20特异性IgG1-RTX-A647的对照组合或IgG1-2F8-RGY都不在A431细胞上诱导荧光信号。
这些数据指示，经标记的Fc-RGY片段通过掺入具有结合A431细胞上EGFR的IgG1-2F8-RGY抗体的寡聚体复合物而被特异性募集到A431细胞。
类似地，图44B显示CD20特异性抗体IgG1-7D8-RGY和IgG1-RTX-RGY能将Fc-RGY-A647片段募集至CD20阳性Daudi细胞。相比之下，EGFR特异性IgG1-2F8-RGY不能将Fc-RGY-A647募集至EGFR阴性Daudi细胞。单独的Fc-RGY-A647或与IgG1-7D8或IgG1-RTX混合的Fc-RGY-A647的阴性对照样品均未在Daudi细胞上产生荧光信号。
总之，这些数据显示Fc-RGY分子能在溶液中形成复合物，且通过特异性结合细胞的含RGY的抗体而可被募集至该细胞。
实施例31：可通过pH控制具有Fc-Fc相互作用增强性突变的的抗体分子的可逆寡聚化。
实施例23显示抗体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(此处缩写为IgG1-005-RGY)能在pH 6.8实现六聚化，而将pH降至5.0使六聚体复合物溶解成各个单体亚单元。为了详细表征该特性，将50mM柠檬酸和100mM Na2HPO4以不同比率混合以生成pH 5.0,5.5,6.0,6.5和7.0的流动相缓冲液。将IgG1-005-RGY样品交换到这些缓冲液中并使用匹配流动相通过HP-SEC进行分离。图45A显示降低pH导致多聚体复合物解装配成单体亚单元；需要约5.0的pH以从混合物中消除多聚体；在pH 6.0时，约一半的复合物已经解装配。
通过降低和提高pH以可逆方式控制抗体寡聚体状态的能力可以用于制备期间上游或下游加工的应用。为了测试pH介导的解装配是否可逆，使得具有抗体六聚体的样品为pH 5.0并分成两份样品，其中一份回复至pH 7.0。图45B显示暴露于pH 5.0，随后回复至pH7.0(pH 7.0rev)的样品以与保持在pH7.0的参照样品高度类似的效率形成抗体复合物。
实施例32：可通过选择缓冲液pH条件来控制IgG1-RGY蛋白纯化和下游处理效率
蛋白A纯化是抗体下游加工的基础且在大量抗体制备过程中执行。由于蛋白A结合位点与介导IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(此处缩写为IgG1-005-RGY)六聚化的Fc:Fc相互作用界面部分重叠，试图在pH 7.4(允许六聚化)和pH 5.0(如实施例23中显示的，其阻断六聚化)加载蛋白A柱。
在实施例20中，描述了抗体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(此处缩写为IgG1-005-RGY)的克隆。基本如制造商(Invitrogen)描述的，在EXPI293F细胞中表达IgG1-005-RGY，然后通过在300g离心10min来收集上清液。使用具有50kDa截留膜(SpectrumLabs,RanchoDominguez CA,USA)的MiniKros M15S-260-01P中空纤维切向流过滤装置将上清液浓缩4倍，得到蛋白质浓度为1.1g/L的上清液。将上清液分为两个部分，其中一个保持为初始pH7.5，而另一批次的pH调节为pH 5.0，其通过逐滴添加1.0M柠檬酸-NaOH pH 3.0。两个批次都经由0.20μM死端滤器过滤。
将保持为pH 7.5的上清液批次以109cm/h的低流速加载以模拟制造规模的下游加工条件，加载到1.0mL蛋白A柱(HiTrap MabSelectSuRe,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上，用PBS(12.6mM磷酸钠，140mM NaCl,pH 7.4；B.Braun,Oss,The Netherlands)连续清洗该柱，之后使用0.1M柠檬酸-NaOH,pH 3.0洗脱结合的IgG蛋白。将洗脱物立即用2M Tris-HCl,pH 9.0中和，并对PBS过夜透析。在透析后，将样品经由0.20μM死端滤器无菌过滤。
将回到pH 5.0的批次以109cm/h的流速加载到相同的1.0mL蛋白A柱(HiTrapMabSelectSuRe)上，用20mM柠檬酸/柠檬酸盐pH 5.0连续清洗该柱，之后使用0.1M柠檬酸-NaOH,pH 3.0洗脱结合的IgG蛋白。将洗脱物立即用2M Tris-HCl,pH 9.0中和，并对PBS过夜透析。在透析后，将样品经由0.20μM死端滤器无菌过滤。
收集两种蛋白质纯化的流过物(Flow-throughs)并使用5.0mL MabSelect SuRe柱纯化，得到约50mg蛋白质，显示1.0mL MabSelectSuRe柱已被有效饱和。
通过使用Nanodrop装置(ThermoScientific,Wilmington DE,USA)测量透析的洗脱样品的A280来测定IgG1-005-RGY的产量。在1.0mL规模在pH 7.0的蛋白A纯化得到21.45mg IgG1-005-RGY，而在pH 5.0的纯化得到29.14mg IgG1-005-RGY。总之，通过在保持IgG1-005-RGY为单体的条件下实施抗体对蛋白A的结合使蛋白质产量增加了约36％。
实施例33：通过稳定六聚体IgG2-005的程序化细胞死亡(PDC)
为了测试含有三重突变E345R/E430G/S440Y的IgG抗体的不同同种型变体是否能诱导程序化细胞死亡(PCD)，通过本领域中已知的方法生成抗体IgG2-005-E345R/E430G/S440Y(IgG2-005-RGY)。将1.0×105个表达CD38的Ramos细胞在96孔U形底板(NalgeneNunc)中在存在野生型IgG2-005、IgG2-005-RGY、六聚体IgM-005或人对照抗体IgG1-2F8和IgG1-2F8-RGY(识别不在Ramos细胞上表达的EGFR)的稀释系列(10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.005和0.0025μg/mL)的情况下培养24小时。在这24小时后通过依照制造商说明书用膜联蛋白V-FITC(Annexin binding assay；BD Biosciences,San Diego,California,USA)染色来量化PCD。使用FACS(BD)测定膜联蛋白V-FITC阳性细胞的量。
图46显示IgG2-005-RGY相比于野生型IgG2-005和对照抗体IgG1-2F8和IgG1-2F8-RGY展现出增强的程序化细胞死亡能力。六聚体IgM在测试的条件下不诱导PCD。
实施例34：在B细胞上的CDC测定中针对CD38的IgG-005-RGY优于六聚体IgM-005
为了比较IgG1-005-RGY的CDC功效与IgM的CDC功效，通过本领域已知的方法将IgG1-005的VH域克隆到IgM骨架中，并在缺乏J链的情况下表达以产生针对CD38的IgM六聚体。IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(此处称为IgG1-005-RGY)的构建记载于实施例20。
如实施例20中记载的那样实施对不同抗体的HP-SEC分析，不过使用PBS(12.6mM磷酸钠，140mM NaCl,pH 7.4；B.Braun,Oss,The Netherlands)作为流动相。图47显示在缺乏J链的情况下表达的IgM-005得到在HP-SEC中具有比IgG1-005-RGY稍高的迁移率的分子，如由于六聚体IgM相比于六聚体IgG1-005-RGY的更高的分子量可以预期到的。
将IgG1-005-RGY的CDC功效与野生型IgG1-005和六聚体IgM-005的相比较，其通过在如记载于实施例18的体外CDC测定法中测试抗体浓度系列(0.0003-10μg/mL，以2倍稀释)。图48显示IgG1-005-RGY比六聚体IgM-005在Daudi和Wien133细胞上显示更有力的CDC活性。野生型IgG1-005在Daudi细胞上显示比IgG1-005-RGY和IgM-005低的CDC功效，且在Wien133细胞上不显示杀伤活性。将IgG1-b12用作非细胞结合阴性对照抗体。单体(即单个二聚体蛋白质)IgG1-005、六聚体IgG1-005-RGY和六聚体IgM-005浓度表示为C1q结合相当量(equivalent)以实现具有不同分子量的非共价IgG和共价IgM复合物的比较。
总之，在结合等同量C1q的抗体浓度，IgG1-005-RGY比IgM-005能更有效地诱导补体介导的靶细胞的裂解。
实施例35：将三重突变E345R/E430G/S440Y引入抗EGFR抗体IgG1-2F8增强对EGFR阳性实体瘤细胞系的CDC介导的裂解的功效。
为了测试将三重突变E345R/E430G/S440Y引入实体瘤靶抗体中是否能导致补体介导的裂解的激活，通过本领域中已知的方法生成IgG1-2F8-E345R/E430G/S440Y(此处称为IgG1-2F8-RGY)。
在EGFR阳性A431和Difi肿瘤细胞系上测试通过IgG1-2F8-RGY的CDC功效，并与野生型IgG1-2F8和对照抗体IgG1-005和IgG1-005-RGY相比较。对照抗体识别不在A431或Difi细胞两者上表达的CD38。
在通过使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的胰蛋白酶-EDTA使实体瘤细胞脱离后，将细胞清洗和通过40μm尼龙细胞滤网(DB FalconTM)，并以1.0x106个细胞/mL的浓度重悬于PBS中。使用SYBR Green(SYBR Green 57563in DMSO,Invitrogen,25000倍稀释)将细胞在37℃染色30分钟。离心(1200rpm,RT 5分钟)后，将细胞以3.0x105个细胞/mL的浓度重悬于RPMI1640/0.1％BSA中。抗体系列稀释物(0.0003-10μg/mL)制备在补充有TOPRO-3(TOPRO-3碘化物T3605，稀释1600倍)的RPMI/0.1％BSA中。将细胞以30,000个细胞每孔接种到平底96孔板(黑色96孔ABITM4315480FMAT板)中；在添加抗体系列稀释物后，将板在振荡器(300rpm,RT)上温育15’。以20％终浓度添加正常人血清(NHS,Sanquin)。将板在37℃温育45分钟。使用成像细胞计数器(Brooks Life Science Systems)测定死亡细胞(TOPRO-3阳性)和总细胞(SYBR Green阳性)的量。使用GraphPad Prism 5.04分析结果。
图49显示诱导补体介导的EGFR阳性实体瘤细胞裂解的功效对于IgG1-2F8-RGY比对于野生型IgG1-2F8高得相当多。
实施例36：IgG1-005-RGY相对于野生型IgG1-005显示不依赖于靶物的补体激活。
在实施例20中，描述了抗体IgG1-005-E345R/E430G/S440Y(此处缩写为IgG1-005-RGY)的克隆。为了测试IgG1-005-RGY是否能在溶液中在靶细胞缺乏的情况下激活补体，分析了C4d(经典补体途径激活的标志物)的形成。通过在将90％正常人血清中的100μg/mL抗体在37℃在低蛋白结合96孔聚丙烯微板(U形且无菌；Greiner 650261)中温育1小时后测量C4d浓度来测定补体激活。依照制造商说明书在ELISA(MicroVue C4d EIA试剂盒，QuidelCorporation)中测量C4d浓度。将热聚集的IgG(HAG)样品用作溶液中补体激活的阳性对照。图50显示HAG诱导有效的C4d产生，而野生型IgG-005在这些条件下不显示补体激活。相比之下，IgG1-005-RGY诱导升高的C4d水平，指示溶液中的补体激活。
等同形式
只是利用常规的实验本领域技术人员将了解，或者能够确定本文所描述的特定实施方式的许多等同形式。此类等同形式旨在涵盖于所附权利要求中。从属权利要求中所公开的实施方案的任意和全部组合同样意欲在发明的范围之内。

Claims (91)

1.抗体，其包含第一和第二多肽，每个多肽至少包含人免疫球蛋白G重链的CH2和CH3区，其中在所述第一和第二多肽中：
在对应于E345的位置处的氨基酸选自下组：R,K,Q,N,Y,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V和W，和对应于E430的位置处的氨基酸选自下组：G,S,T,F,H,A,C,D,I,K,L,M,N,P,Q,R,V,W和Y；且
在选自由S440，Y436，D/E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：S440是Y，K，W；Y436是I，L，K，R，S，W；D/E356是G，I，L，R，T和V；T359是G，N，P，R；E382是L，M，V，P；N434是W，S；Q438是E，K；I253是A，D，R，V，K，M，N，S；并且S254是E，F，G，I，K，L，T，W，其中所述氨基酸位置根据kabat中的Eu-索引进行编号,
其中所述重链序列的同种型选自下组：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。
2.权利要求1的抗体，其中在两个多肽中，在选自由Y436，D/E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254组成的组的位置处的氨基酸对于每个位置分别为：
(a)I或R；
(b)R，G，T，I或L；
(c)R，P，N或G；
(d)V，L或M；
(e)W；
(f)E，K；
(g)V；
(h)L，G，I或E。
3.权利要求1的抗体，其中在这一个或两个多肽中，在对应于E345，E430和S440的位置处的氨基酸分别为R，G和Y；或者分别为K，G和Y；或者分别为R，S和Y；或者分别为R，G和W；或者分别为R，G和K；或者在对应于E345，E430和Y436的位置处的氨基酸分别为R，G和I。
4.权利要求1的抗体，其中所述第一和/或第二多肽还包含能在所述第一和第二多肽之间共价结合的区域。
5.权利要求1的抗体，其中所述第一和/或所述第二多肽还包含免疫球蛋白重链的铰链区。
6.权利要求1的抗体，其中所述第一和第二多肽经由铰链区二硫键交互连接。
7.权利要求1的抗体，其中至少一个所述多肽包含特异性结合靶物的结合区。
8.权利要求7的抗体，其中每个多肽包含特异性结合靶物，任选地为相同靶物的结合区。
9.权利要求8的抗体，其中所述靶物是存在于细胞、细菌或病毒粒体上的分子。
10.权利要求1的抗体，其中至少一个所述多肽包含免疫球蛋白重链可变区。
11.权利要求1的抗体，其中所述第一和第二多肽各自包含免疫球蛋白重链和轻链可变区以形成第一和第二抗原结合区，任选地其结合相同抗原。
12.权利要求1的抗体，其中所述第一和第二多肽各自包含联合的免疫球蛋白重链可变区和包含轻链可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链序列以形成第一和第二抗原结合区，任选地其结合相同抗原。
13.权利要求1的抗体，其中这一个或两个多肽包含全长重链恒定区。
14.权利要求13的抗体，其中所述全长重链恒定区是全长人IgG1重链恒定区。
15.权利要求1的抗体，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于K439的位置处的氨基酸不是K。
16.权利要求15的抗体，其中在对应于K439的位置处的氨基酸是E或D。
17.权利要求16的抗体，其中在对应于K439的位置处的氨基酸是E。
18.权利要求16的抗体，其中在这一个或两个多肽中，在对应于E345，E430，K439和S440的位置处的氨基酸分别为R，G，E和Y。
19.权利要求18的抗体，其中在每个多肽中，在对应于E345，E430，K439和S440的位置处的氨基酸分别为R，G，E和Y。
20.权利要求1的抗体，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于S440的位置处的氨基酸是K或R。
21.权利要求20的抗体，其中在这一个或两个多肽中，在对应于E345，E430和S440的位置处的氨基酸分别为R，G和K。
22.权利要求21的抗体，其中在每个多肽中，在对应于E345，E430和S440的位置处的氨基酸分别为R，G和K。
23.权利要求1的抗体，其中在所述第一和/或第二多肽中，在选自由Y436，E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254组成的组的位置处的至少一个氨基酸对于每个位置分别为：
(a)I或R；
(b)R，G，T，I或L；
(c)R，P，N或G；
(d)V，L或M；
(e)W；
(f)E，K；
(g)V，；
(h)L，G，I或E，并且在对应于S440的位置处的氨基酸是K或R。
24.权利要求23的抗体，其中在这一个或两个多肽中，在对应于E345，E430，Y436和S440的位置处的氨基酸分别为R，G，I和K。
25.权利要求24的抗体，其中在每个多肽中，在对应于E345，E430，Y436和S440的位置处的氨基酸分别为R，G，I和K。
26.权利要求1的抗体，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于K447的位置处的氨基酸残基为D或E。
27.权利要求1的抗体，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于K447的位置处的氨基酸残基为K，R或H，且所述多肽包含：
(a)在位置448处的为P的氨基酸残基；或
(b)在位置448处的为K，R或H的氨基酸残基和在位置449处的为P的氨基酸残基。
28.权利要求1的抗体，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于Q386的位置处的氨基酸为K。
29.权利要求1的抗体，其中在对应于人IgG1重链中L234，L235，G236，G237，S239，P238，T250，M252，I253，S254，R255，T256，D265，S267，H268，D270，E272，N286，K288，N297，V303，V305，T307，V308，L309，H310，Q311，D312，K317，K322，S324，P329，P331，I332K340，D356，K360，Q362，D376，A378，E380，E382，G385，Q386，P387，E388，N389，S400，D413，S415，S424，M428，H433，N434，H435，Y436，K439或K447的至少一个位置处的氨基酸分别为不是L；不是L；不是G；不是G；不是S；不是P；不是T；不是M；不是I；不是S；不是R；不是T；不是D；不是S；不是H；不是D；不是E；不是N；不是K；不是N；不是V；不是V；不是T；不是V；不是L；不是H；不是Q；不是D；不是K；不是K；不是S；不是P；不是P；不是I；不是K；不是D；不是K；不是Q；不是D；不是A；不是E；不是E；不是G；不是Q；不是P；不是E；不是N；不是S；不是D；不是S；不是S；不是M；不是H；不是N；不是H；不是Y；和不是K。
30.权利要求1的抗体，其包含药物、毒素、放射性标记物、射线不透性试剂、顺磁剂、荧光剂、磷光剂、超声增强剂或聚乙二醇(PEG)，任选地其经由接头与至少一个所述多肽缀合。
31.权利要求1的抗体，其为同型二聚体。
32.权利要求1的抗体，其为异型二聚体。
33.权利要求32的抗体，其中所述第一和第二多肽各自包含免疫球蛋白重链的CH2，CH3和铰链区，且其中
在所述第一多肽中，在选自K409，T366，L368，K370，D399，F405和Y407的位置处的氨基酸分别为：不是K，T，L，K，D，F和Y，和
在所述第二多肽中，在选自F405，T366，L368，K370，D399，Y407和K409的位置处的氨基酸分别为：不是F，T，L，K，D，Y和K。
34.权利要求33的抗体，其中
在所述第一多肽中位置K409处的氨基酸是R，和
在所述第二多肽中位置F405处的氨基酸是L。
35.权利要求1的抗体，其在pH为6.8的磷酸盐缓冲液中主要为寡聚体形式。
36.权利要求35的抗体，其中所述寡聚体形式为六聚体形式
37.权利要求1的抗体，其在pH低于6.0时主要为单体形式。
38.权利要求1的抗体，其在pH 5.0时主要为单体形式。
39.寡聚体，其包含至少两个非共价联合的各自依照前述权利要求中任一项的抗体。
40.六聚体，其包含6个非共价联合的各自依照权利要求1至38中任一项的抗体。
41.包含六个非共价联合的分子的六聚体，其中至少一个是依照权利要求1至38中任一项的抗体，且至少一个是包含Fc域的抗体，所述Fc域包含至少CH2，CH3和铰链区。
42.权利要求41的六聚体，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体。
43.一种组合物，其包含依照权利要求1至38中任一项的抗体和/或权利要求39的寡聚体和/或权利要求40至42中任一项的六聚体，以及药学可接受的载体。
44.一种组合物，其包含依照权利要求1至38中任一项的抗体、一种或多种抗体、和药学可接受的载体。
45.一种组合物，其包含依照权利要求1至38中任一项的第一个抗体、依照权利要求1至38中任一项的第二个抗体、和任选地药学可接受的载体。
46.权利要求45的组合物，其包含依照权利要求1至38中任一项的至少一个另外的抗体。
47.权利要求45的组合物，其包含依照权利要求1至38中任一项的3或6个另外的抗体。
48.权利要求45的组合物，其包含依照权利要求1至38中任一项的4、5、7、8、9或更多个另外的抗体。
49.权利要求45的组合物，其中所述第一和第二个抗体两者均包含第一和第二多肽，其中在所述第一和第二个抗体的所述第一和第二多肽中，在对应于E345的位置处的氨基酸选自下组：R,K,Q,N,Y,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V和W，和对应于E430的位置处的氨基酸选自下组：G,S,T,F,H,A,C,D,I,K,L,M,N,P,Q,R,V,W和Y，且在选自由S440，Y436，E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸对于每个位置分别为：S440是Y，K，W；Y436是I，L，K，R，S，W；E356是G，I，L，R，T，V；T359是G，N，P，R；E382是L，M，V，P，N434是W，S；Q438是E，K；I253是A，D，R，V，K，M，N，S；并且S254是E，F，G，I，K，L，T，W，其中所述氨基酸位置根据对应于人IgG1重链的kabat中的Eu-索引进行编号。
50.权利要求45的组合物，其中在所述第一和第二个抗体的所述第一和第二多肽之一或两者中，在对应于人IgG1重链中E345，E430和S440的位置处的氨基酸分别是R，G和Y。
51.权利要求45的组合物，其中：
所述第一个抗体包含第一和第二多肽，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于K439的位置处的氨基酸是E或D，和
所述第二个抗体包含第一和第二多肽，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于S440的位置处的氨基酸是K或R，任选地是K。
52.权利要求45的组合物，其中：
所述第一个抗体包含第一和第二多肽，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于K439的位置处的氨基酸是E或D，和
所述第二个抗体包含第一和第二多肽，其中在所述第一和/或第二多肽中，在对应于S440的位置处的氨基酸是K或R，任选地是K，且在选自由Y436，D/E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254组成的组的位置处的至少一个氨基酸分别为：Y436是I，L，K，R，S，W；D/E356是G，I，L，R，T，V；T359是G，N，P，R；E382是L，M，V，P；N434是W，S；Q438是E，K；I253是A，D，R，V，K，M，N，S；并且S254是E，F，G，I，K，L，T。
53.权利要求51的组合物，其中：
在所述第一个抗体的所述第一和/或第二多肽中，在对应于E345，E430，K439和S440的位置处的氨基酸分别为R，G，E和Y，和
在所述第二个抗体的所述第一和/或第二多肽中，在对应于E345，E430，K439和S440的位置处的氨基酸分别为R，G，K和K；或者在对应于E345，E430，Y436和S440的位置处的氨基酸分别为R，G，I和K。
54.权利要求45的组合物，其中：
在所述第一个抗体的所述第一和/或第二多肽中，在对应于K447的位置处的氨基酸为D或E，和
在所述第二个抗体的所述第一和/或第二多肽中，在对应于K447的位置处的氨基酸为K，R或H，和在对应于448的位置处的氨基酸为P。
55.权利要求45的组合物，其中：
在所述第一个抗体的所述第一和/或第二多肽中，在对应于K447的位置处的氨基酸为D或E，和
在所述第二个抗体的所述第一和/或第二多肽中，在对应于K447的位置处的氨基酸为K，R或H；在对应于448的位置处的氨基酸为K，R或H；和在对应于449的位置处的氨基酸为P。
56.权利要求45的组合物，其中所述第一和第二个抗体结合相同抗原的相同表位。
57.权利要求56的组合物，其中所述第一和第二个抗体包含相同的可变重链和轻链区序列。
58.权利要求45的组合物，其中所述第一和第二个抗体结合不同抗原或相同抗原上的不同表位。
59.权利要求45的组合物，其中所述药学可接受的载体是水性缓冲溶液。
60.权利要求59的组合物，其中所述水性缓冲溶液的pH是至少6.5。
61.权利要求60的组合物，其中所述水性缓冲溶液的pH是6.5至9.0。
62.权利要求60的组合物，其中所述水性缓冲溶液的pH是7.0至8.0。
63.权利要求60的组合物，其中所述水性缓冲溶液的pH是7.4。
64.权利要求60的组合物，其包含磷酸盐缓冲系统。
65.权利要求59的组合物，其中所述水性缓冲溶液的pH是低于pH 6.5。
66.权利要求59的组合物，其中所述水性缓冲溶液的pH是4.0至6.4。
67.权利要求59的组合物，其中所述水性缓冲溶液的pH是5.0至6.0。
68.权利要求65的组合物，其包含乙酸盐、组氨酸、甘氨酸、柠檬酸盐、烟酸盐、乳酸盐、和/或琥珀酸盐缓冲系统。
69.增加抗体在溶液中的寡聚化和/或效应器功能的方法，所述抗体包含第一和第二多肽，其各自至少包含人免疫球蛋白G重链的CH2和CH3区，该方法包括对所述第一和第二多肽引入以下氨基酸取代：至少在对应于E345的位置处的氨基酸取代选自下组：R,K,Q,N,Y,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V和W，和对应于E430的位置处的氨基酸取代选自下组：G,S,T,F,H,A,C,D,I,K,L,M,N,P,Q,R,V,W；且
在选自由S440，Y436，D/E356，T359，E382，N434，Q438，I253和S254组成的组的至少一个位置处的氨基酸取代为：S440是Y，K，W；Y436是I，L，K，R，S，W；D/E356是G，I，L，R，T，V；T359是G，N，P，R；E382是L，M，V，P，N434是W，S；Q438是E，K；I253是A，D，R，V，K，M，N，S；并且S254是E，F，G，I，K，L，T，W，其中所述氨基酸位置根据相应于人IgG1重链的kabat中的Eu-索引进行编号,
其中所述重链序列的同种型选自下组：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。
70.权利要求69的方法，其中所述效应器功能是补体依赖性细胞毒性(CDC)。
71.权利要求69的方法，其中所述氨基酸取代至少在对应于人IgG1重链中的E345，E430和S440的位置中。
72.权利要求69的方法，其中在对应于E345的位置处的氨基酸取代选自下组：345R，345Q，345N，345K，345Y，345A，345C，345D，345F，345G，345H，345I，345L，345M，345P，345S，345T，345V和345W。
73.权利要求72的方法，其中在对应于E345的位置处的氨基酸取代选自下组：345R，345Q，345N，345K和345Y。
74.权利要求69的方法，其中在对应于E430的位置处的氨基酸取代选自下组：430G，430T，430S，430F，430H，430A，430C，430D，430I，430K，430L，430M，430N，430P，430Q，430R，430V，430W和430Y。
75.权利要求74的方法，其中在对应于E430的位置处的氨基酸取代选自下组：430G，430T，430S，430F和430H。
76.权利要求69的方法，其中在对应于S440的位置处的氨基酸取代为440Y或440W。
77.权利要求69的方法，其中在对应于E345，E430和S440的位置处的氨基酸取代分别为345R，430G和440Y；或者分别为345K，430G和440Y；或者分别为345R，430S和440Y；或者分别为345R，430G和440W；或者分别为345R，430G和440K；或者在对应于E345，E430和Y436的位置处的氨基酸取代分别为345R，430G和436I。
78.权利要求69的方法，其中每个多肽包含联合的免疫球蛋白重链可变区和包含轻链可变区和恒定区的免疫球蛋白轻链序列以形成第一和第二抗原结合区，任选地其结合相同抗原。
79.权利要求78的方法，其中所述抗体的每个多肽包含全长重链恒定区。
80.权利要求79的方法，其中所述全长重链恒定区是全长人IgG1重链恒定区。
81.通过权利要求69至80中任一项的方法制备的变体抗体。
82.一种组件试剂盒，其包含依照权利要求1至38中任一项的第一抗体和依照权利要求1至38中任一项的第二抗体，其在成像、诊断学或治疗中同时、分开或序贯使用。
83.依照权利要求1至68，81-82中任一项的抗体、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒，其用于治疗疾病，和/或降低由细菌性感染导致的感染性休克的风险。
84.依照权利要求83的抗体、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒，其中所述疾病选自细菌性、病毒性或寄生性感染、自身免疫性疾病、癌症、炎症。
85.依照权利要求1至68，81-82中任一项的抗体、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒，其中所述抗体包含特异性结合以下的结合区：脂多糖(LPS)、脂寡糖(LOS)、delta内毒素、肉毒杆菌毒素、白喉棒杆菌外毒素、细菌超抗原、热稳定性肠毒素、溶细胞素、通道形成毒素、酶活性毒素或真菌毒素。
86.依照权利要求1至68，81-82中任一项的抗体、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒，其用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像。
87.用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像的方法，包括施用依照权利要求1至68，81-82中任一项的抗体、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒。
88.权利要求1至68，81-82中任一项的抗体、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒在制备药物组合物或组合中的用途，所述药物组合物或组合用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像。
89.权利要求1至68，81-82中任一项的抗体、寡聚体、六聚体、组合物或组件试剂盒在制备药物组合物或组合中的用途，所述药物组合物或组合用于治疗细菌性、病毒性或寄生性感染，用于将人或其他哺乳动物身体的至少一部分成像，或用于调控从人或其他哺乳动物的身体清除靶分子。
90.权利要求1至68，81-82中任一项的抗体、寡聚体、六聚体、组合物、组件试剂盒在制备药物组合物或组合中的用途，所述药物组合物或组合用于预防或治疗疾病和体液系统中的C1q消耗。
91.权利要求90的用途，其中所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病、器官移植排斥。
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