JP5596559B2 - 安定化アンジオポエチン２抗体とその用途 - Google Patents

安定化アンジオポエチン２抗体とその用途 Download PDF

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Description

本発明はアンジオポエチン-2（Ang-2）に対する安定化モノクローナル抗体およびかかる抗体の用途に関する。本発明の態様はまた、かかる抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株に関する。記載した抗体は、Ang-2および／またはAng-1の活性に関係する疾患の診断薬としておよび治療用に有用である。
血管新生は、既存の血管から新たな毛細血管を形成するプロセスであり、かつ胚形成、正常な生理学的成長、修復、および腫瘍拡大における必須の構成要素である。様々な因子がin vitroの内皮細胞（EC）応答およびin vivoの血管成長をモジュレーションしうるが、血管内皮成長因子（VEGF）ファミリーメンバーおよびアンジオポエチンだけはほとんど排他的に血管ECに対して作用すると考えられる（Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000)）。
アンジオポエチンは、血管内皮内に選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーであるTieに対するリガンドとして発見された（Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000)）。現在、4つの確定したアンジオポエチンのファミリーメンバーが存在し：アンジオポエチン-3および-4（Ang-3およびAng-4）はマウスおよびヒトにおける同じ遺伝子座の広範に分岐した対応物を表しうる（Kim et al., FEBS Let, 443:353-56 (1999); Kim et al., J Biol Chem 274:26523-28 (1999)）。Ang-1およびAng-2は最初に、組織培養実験においてそれぞれアゴニストおよびアンタゴニストとして同定された（Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996)；Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)）。公知の全てのアンジオポエチンは主にTie2に結合し、そしてAng-1とAng-2の双方は3nM(Kd)の親和性でTie2に結合する（Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)）。Ang-1はECの生存を支持し、内皮の完全性を促進することが示された（Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996)；Kwak et al., FEBS Lett 448:249-53 (1999)；Suri et al., Science 282:468-71 (1998)；Thurston et al., Science 286: 2511-14 (1999)；Thurston et al., Nat. Med. 6:460-63 (2000)）一方、Ang-2は反対の効果を有し、生存因子VEGFまたは塩基性線維芽細胞成長因子の非存在下で血管の不安定化および退行を促進した（Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)）。しかし、Ang-2機能の多数の研究はさらに複雑な状況を示唆している。Ang-2は血管出芽と血管退行の両方である役割を果たす血管再造形の複雑な制御因子でありうる。Ang-2のかかる役割を支持して、発現分析は、Ang-2は血管新生出芽の成熟環境においてVEGFと一緒に速やかに誘導されるが、Ang-2は血管退行の環境においてVEGFの非存在下で誘導されることを明らかにした（Holash et al., Science 284:1994-98 (1999); Holash et al., Oncogene 18:5356-62 (1999)）。環境に応じた役割と一致して、Ang-2は、Ang-1によって活性化される同じ内皮特異的受容体Tie-2と結合するが、その活性化に対して環境に応じた効果を有する（Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)）。
角膜の血管形成アッセイは、Ang-1とAng-2の双方が類似の作用を有し、VEGFとの相乗作用によって新血管の成長を促進する類似の効果を有したことを示している（Asahara et al., Circ. Res. 83:233-40 (1998)）。in vitroで高濃度においてAng-2は血管形成前駆体でありうるという観察により、用量依存性の内皮応答が存在した可能性が生じた（Kim ら, Oncogene 19:4549-52 (2000)）。Ang-2は高濃度において、PI-3キナーゼおよびAkt経由のTie2の活性化を介する血清欠乏アポトーシスの間、内皮細胞にとってアポトーシスの生存因子として作用する（Kim et al., Oncogene 19:4549-52 (2000)）。
他のin vitro実験は、持続的暴露の間、Ang-2の作用がTie2に対するアンタゴニストからアゴニストへと次第にシフトし、その後の時点で血管形成および新血管の安定化に直接寄与しうることを示唆した（Teichert-Kuliszewska ら, Cardiovasc. Res. 49:659-70 (2001)）。さらに、もしECをフィブリンゲル上で培養すれば、Ang-2によるTie2の活性化も観察されたが、これはおそらくはAng-2の活性がECの分化状態に依存しうることを示唆した（Teichert-Kuliszewska ら, Cardiovasc. Res. 49:659-70 (2001)）。三次元コラーゲンゲル内で培養したミクロ血管ECにおいてAng-2はまた、Tie2活性化を誘導しかつ毛細管様構造の形成を促進することができる（Mochizuki et al., J. Cell. Sci. 115:175-83 (2002)）。血管成熟のin vitroモデルとして3次元球状共培養を使用して、ECと間葉細胞の間の直接接触はVEGFへの応答を抑止するが、VEGFとAng-2の存在は出芽を誘導することが示された（Korff et al., Faseb J. 15:447-57 (2001)）。Etohらは、Tie2を構成的に発現するECにおいて、MMP-1、MMP-9およびu-PAの発現がVEGFの存在下でAng-2によって強力にアップレギュレーションされることを示した（Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001)）。in vivo瞳孔膜モデルを用いて、Lobovらは、Ang-2が内因性VEGFの存在下で、毛細管直径の急速な拡大、基底層の再造形、内皮細胞の増殖および遊走を促進し、かつ新血管の出芽を刺激することを示した（Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11205-10 (2002)）。対照的に、Ang-2は内因性VEGFが存在しないと、内皮細胞死と血管退行を促進する（Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11205-10 (2002)）。同様に、in vivo腫瘍モデルを用いて、Vajkoczyらは、多細胞集合体が、宿主および腫瘍内皮細胞によるVEGFR-2とAng-2との同時発現を介する血管新生出芽によって血管成長を開始することを示した（Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109:777-85 (2002)）。このモデルは、成長する腫瘍の確立されたミクロ血管系が、推定として、VEGFおよびAng-2の発現が介在する連続的な再造形を特徴とすることを明らかにした（Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109:777-85 (2002)）。
Tie-2とアンジオポエチン-1のノックアウトマウス研究は類似の表現型を示し、アンジオポエチン-1刺激性のTie2リン酸化は発生する血管の再造形と安定化に介在し、血管新生中の血管成熟および内皮細胞−支持細胞の接着維持を促進することを示唆する（Dumont et al., Genes ＆ Development, 8:1897-1909 (1994)；Sato, Nature, 376:70-74 (1995)；(Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460-463)）。
アンジオポエチン-1の役割は、これが広範かつ構成的に発現される成人において保持されていると考えられる（Hanahan, Science, 277:48-50 (1997); Zagzag, et al., Exp Neurology, 159:391-400 (1999)）。対照的に、アンジオポエチン-2の発現は、主に、アンジオポエチン-1の構成的な安定化または成熟機能を遮断すると考えられる血管再造形部位に限定され、それにより血管が出芽シグナルに対してより高い応答性の形成状態に戻りかつそれを維持することを可能にしている（Hanahan, 1997；Holash et al., Oncogene 18:5356-62 (1999)；Maisonpierre, 1997）。病理学的血管新生におけるアンジオポエチン-2の発現に関する研究では、多数の腫瘍型が血管におけるアンジオポエチン-2の発現を示すことが見出されている（Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)）。機能研究は、アンジオポエチン-2が腫瘍血管新生に関わり、マウス異種移植モデルにおいてアンジオポエチン-2の過剰発現が腫瘍成長の増大と関係付けられることを示唆している（Ahmad, et al., Cancer Res., 61:1255-1259 (2001)）。他の研究は、アンジオポエチン-2の過剰発現と腫瘍の血管分布過多を関連づけている（Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001)；Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002)）。
近年、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-2および/またはTie-2が有望な抗癌治療の標的として提案されている（例えば米国特許番号6,166,185、5,650,490および5,814,464、米国特許公開番号2006/0018909号ならびにPCT国際公開番号WO2006/068953およびWO2007/068895を参照されたい）。
Ang-2は、血管再造形が生じている部位で発達段階に発現される（Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)）。成体個体では、Ang-2の発現は、血管再造形の部位、ならびに高度に血管発生した腫瘍内に制限されており、前記腫瘍には神経膠腫（Osada et al., Int. J. Oncol. 18:305-09 (2001)；Koga et al., Cancer Res. 61:6248-54 (2001)）、肝細胞癌（Tanaka et al., J. Clin. Invest. 103:341-45 (1999)）、胃癌（Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001)；Lee et al., Int. J. Oncol. 18:355-61 (2001)）、甲状腺腫瘍（Bunone et al., Am J Pathol 155:1967-76 (1999)）、非小細胞肺癌（Wong et al., Lung Cancer 29:11-22 (2000)）、結腸癌（Ahmad et al., Cancer 92:1138-43 (2001)）、および前立腺癌（Wurmbach et al., Anticancer Res. 20:5217-20 (2000)）が含まれる。いくつかの腫瘍細胞はAng-2を発現することが見出された。例えば、Tanakaら（1999）はヒト肝細胞癌（HCC）の12例の標本のうち10例においてAng-2 mRNAを検出した。EllisのグループはAng-2が腫瘍上皮において遍在的に発現されると報じた。（Ahmad et al., Cancer 92:1138-43 (2001)）。
他の研究者らが類似の発見を報じている（Chen et al., J. Tongji Med. Univ. 21:228-30, 235 (2001)）。記録保管されたヒト乳癌標本におけるAng-2 mRNAレベルの検出により、Sfilogoiら（Int. J. Cancer 103:466-74 (2003)）は、Ang-2 mRNAが側副リンパ節浸潤、短い無病期間および劣る全生存率と有意に関連すると報じた。Tanakaら（Cancer Res. 62:7124-29 (2002)）は、病理段階IからIIIAの非小細胞肺癌(NSCLC)の合計236例の患者をそれぞれ再調査した。彼らは免疫組織化学を用いて、16.9%のNSCLC患者がAng-2陽性であることを見出した。Ang-2陽性腫瘍におけるミクロ血管密度は、Ang-2陰性の場合より有意に高い。かかるAng-2の血管新生効果は、VEGFの発現が高い場合にだけ見られた。さらに、Ang-2の陽性発現は、術後生存の劣ることを予測する重要な因子であった。しかし、彼らは、Ang-1発現とミクロ血管密度の間に有意な相関を見出さなかった（Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002)）。これらの結果は、Ang-2がいくつかの型の癌を有する予後の劣る患者の指標であることを示唆する。
疾患を治療するための抗体治療の開発は複雑なプロセスであって、候補分子はそのプロセスにおいて、全ての適用における適性を保証する多数の試験に合格しなければならない。ほとんどの場合、最初の候補は予め定めた所望の特徴の群、例えば抗原親和性、抗体フォーマットなどに基づいて開発される。いったん候補分子が選ばれると、大規模生産および安定性に対する適性を考慮する。しばしば、候補分子は、最初の所望の特徴に基づいて高度に適用可能であるが、市販の治療薬としての実施可能性に必要である長期安定性と高い生産効率を保証するために仕上げる必要がある。
タンパク質におけるジスルフィド結合形成は、環境の酸化還元ポテンシャルおよび特殊なチオール-ジスルフィド交換酵素により決定される複雑なプロセスである（Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984；Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44, 2002）。ジスルフィドは、細胞内で新生鎖の小胞体中への分泌中にまたはその直後に形成される。同じタンパク質の、しかし異なるジスルフィド構造をもついくつかのコンフォメーションアイソタイプが、哺乳動物細胞における組換えタンパク質生産の間に作製されることがあり、これはジスルフィド形成プロセスの失敗、タンパク質構造におけるシステイン残基のごく近接部、または不対システイン残基の表面曝露によるものである。
一般的に、タンパク質（例えば、Ang-2に特異的な抗体）中のシステイン残基は、システイン-システインジスルフィド結合に関わるかまたは、フォールディングしたタンパク質領域の一部である場合、立体的にジスルフィド結合形成から保護されている。システイン残基がタンパク質構造中に対を持たず、かつフォールディングにより立体的に保護されてない場合、そのシステイン残基は、ジスルフィドシャッフリングとして知られるプロセスで、溶液からの未結合システインとジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィドスクランブルとして知られる他のプロセスでは、未結合のシステインはまた、天然のジスルフィド結合（例えば、抗体構造に存在するもの）と干渉し、結合の低下、生物学的活性の低下および／または安定性の低下をもたらしうる。
免疫グロブリンのグリコシル化はまた、その結合特性、エフェクター機能、構造安定性、および抗体生産細胞からの分泌速度に有意な効果を有することが示されている（Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)）。特に、抗体の可変域のグリコシル化は抗体のそのコグネイト抗原との相互作用に影響を与えうる。可変域のグリコシル化は、おそらく立体障害に因って、抗体結合親和性に悪い影響を与えうることが示されている（Co, M. S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367）。グリコシル化プロセスの不均一性はまた、改変された結合特性をもついくつもの抗体種をもたらしうる。このようなわけで、干渉するグリコシル化部位を除去または改変して、一致した抗原結合プロファイルを保証することが所望される。
従って、様々な治療および診断応用のための、非常に安定なAng-2特異的抗体を開発する必要がある。
本明細書に記載の参考文献の引用または考察は、それが本発明の先行技術であることの承認と解釈してはならない。
米国特許番号6,166,185 米国特許番号5,650,490 米国特許番号5,814,464 米国特許公開番号2006/0018909号 WO2006/06895 WO2007/068895
Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000) Kim et al., FEBS Let, 443:353-56 (1999) Kim et al., J Biol Chem 274:26523-28 (1999) Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996) Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997) Kwak et al., FEBS Lett 448:249-53 (1999) Suri et al., Science 282:468-71 (1998) Thurston et al., Science 286: 2511-14 (1999) Thurston et al., Nat. Med. 6:460-63 (2000) Holash et al., Science 284:1994-98 (1999) Holash et al., Oncogene 18:5356-62 (1999) Asahara et al., Circ. Res. 83:233-40 (1998) Kim ら, Oncogene 19:4549-52 (2000) Teichert-Kuliszewska ら, Cardiovasc. Res. 49:659-70 (2001) Mochizuki et al., J. Cell. Sci. 115:175-83 (2002) Korff et al., Faseb J. 15:447-57 (2001) Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001) Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11205-10 (2002) Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109:777-85 (2002) Dumont et al., Genes ＆ Development, 8:1897-1909 (1994) Sato, Nature, 376:70-74 (1995) Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460-463 Hanahan, Science, 277:48-50 (1997) Zagzag, et al., Exp Neurology, 159:391-400 (1999) Ahmad, et al., Cancer Res., 61:1255-1259 (2001) Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002) Osada et al., Int. J. Oncol. 18:305-09 (2001) Koga et al., Cancer Res. 61:6248-54 (2001) Tanaka et al., J. Clin. Invest. 103:341-45 (1999) Lee et al., Int. J. Oncol. 18:355-61 (2001) Bunone et al., Am J Pathol 155:1967-76 (1999) Wong et al., Lung Cancer 29:11-22 (2000) Ahmad et al., Cancer 92:1138-43 (2001) Wurmbach et al., Anticancer Res. 20:5217-20 (2000) Chen et al., J. Tongji Med. Univ. 21:228-30, 235 (2001) Sfilogoi et al., Int. J. Cancer 103:466-74 (2003) Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984 Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44, 2002 Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985) Co, M. S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367
本発明の一態様はアンジオポエチン-2に対するある特定の抗体（本明細書では以後「本発明の抗体」と呼ぶ）であって、安定でありかつある特定の医薬製剤において容易に凝集しない前記抗体を提供する。
一実施形態においては、MEDI1、MEDI2、MEDI3、MEDI6またはMEDI4に示した軽鎖および／またはMEDI5に示した重鎖を含むものであるAng-2抗体を提供する。
本発明の抗体は、特異的にAng-2と結合し、腫瘍血管新生を阻害しかつ腫瘍成長を低下させる能力を有する。これを達成できる機構には、限定されるものでないが、Ang-2および／またはAng1のその受容体Tie2との結合の阻害、Ang-2および／またはAng-1誘導性Tie2シグナル伝達の阻害、Ang-2および／またはAng-1誘導性Tie2リン酸化の阻害、Ang-2および／またはAng1のクリアランスの増加、その結果、Ang-2および／またはAng-1の有効濃度の低下が含まれる。
一実施形態において、本発明の抗体は、対照Ang-2特異的抗体3.19.3と比較して安定性の向上を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、対照Ang-2特異的抗体と比較して生産収率の向上を示す。一実施形態において、本発明の抗体は、EU番号系（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3）により定義される重鎖位置37におけるVal置換、およびKabat番号系に基づく軽鎖位置49におけるAsp、Thr、Asn、またはAlaの置換を含むヒトAng-2抗体である。
他の実施形態において、本発明の抗体はMEDI1（配列番号3）、MEDI2（配列番号4）、MEDI3（配列番号5）、MEDI6（配列番号8）およびMEDI4（配列番号6）からなる群より選択される可変軽鎖アミノ酸配列を含んでもよい。他の実施形態において、本発明の抗体は重鎖可変アミノ酸配列MEDI5（配列番号7）を含んでもよい。他の実施形態において、本発明の抗体はMEDI1（配列番号3）、MEDI2（配列番号4）、MEDI3（配列番号5）、MEDI6（配列番号8）およびMEDI4（配列番号6）からなる群より選択される可変軽鎖アミノ酸配列ならびにMEDI5（配列番号7）で定義された重鎖可変配列を含んでもよい。
他の態様において、本発明はまた、本発明の抗体を発現する核酸配列、ベクターおよび細胞株を提供する。
本発明はさらに、患者サンプル中のアンジオポエチン-2（Ang-2）のレベルを分析する方法であって、抗Ang-2抗体を患者からの生体サンプルと接触させるステップおよび前記サンプル中の前記抗体とAng-2の間の結合のレベルを検出するステップを含むものである前記方法を提供する。さらに具体的な実施形態において、生体サンプルは血液である。
他の実施形態において、本発明は、抗体またはその機能性断片、および製薬上許容される担体を含む組成物を提供する。
さらなる実施形態には、血管新生に関係する疾患を患う動物を効果的に治療する方法であって、新生物または非新生物疾患の治療を必要とする動物を選択するステップ、および前記動物に本発明のモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与するステップを含むものである前記方法が含まれる。
治療可能な血管新生に関係する疾患は、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭部および頚部癌、中皮腫、肉腫、胆（胆管）癌、小腸腺癌、小児科悪性疾患および類表皮癌を含みうる。
さらなる実施形態は、動物におけるアンジオポエチン-2（Ang-2）誘導性血管新生を阻害する方法を含む。これらの方法は、Ang-2誘導性の血管新生に対する治療を必要とする動物を選択するステップ、および本発明の抗体の治療上有効な用量を前記動物に投与するステップを含む。
さらなる実施形態は、動物における血管新生に関係する疾患の治療のための医薬の調製における、アンジオポエチン-2（Ang-2）に特異的に結合する本発明の抗体の使用を含む。治療可能な血管新生に関係する疾患は、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および類表皮癌などの新生物疾患を含みうる。
本明細書に記載の本発明の実施形態は、Ang-2と結合し、Ang-2および／またはAng-1機能に影響を与えるモノクローナル抗体に関する。他の実施形態は、Ang-2との高い結合親和性、Ang-2および／またはAng-1をin vitroおよびin vivoで中和する能力、およびAng-2および／またはAng-1誘導性血管新生を阻害する能力を含む、治療の見込みから所望される特性をもつ完全ヒト抗Ang-2抗体および抗Ang-2抗体調製物に関する。
本発明の他の実施形態は、限定されるものでないが、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-3およびアンジオポエチン-4を含む他のアンジオポエチン-2ファミリーメンバーと結合する完全ヒト抗体である。本明細書のさらなる実施形態はTie2との結合についてAng-2と交差競合する抗体であって、本発明の完全ヒト抗体である。本発明の一実施形態では、抗体は、アンジオポエチン-2と結合して中和し、かつアンジオポエチン-1とも結合して中和する。
本発明の実施形態が抗体の任意の特定の形態または作製もしくは生産の方法に限定されないことは理解されるであろう。例えば、抗Ang-2抗体は、完全長抗体（例えば、無傷のヒトFc域を有する）または抗体断片（例えば、Fab、Fab'もしくはF(ab')2）であってもよい。さらに抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、あるいは抗体をコードする1以上の遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされて組み換えで生産された細胞から作製されてもよい。
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードする単離された核酸分子もしくはその部分、抗Ang-2抗体をコードする単離された核酸分子を有するベクターまたはかかる核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞を含む。さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子を発現して抗Ang-2抗体を生産するという条件下で宿主細胞を培養した後に抗体を回収することによって、抗体を生産する方法である。本発明の実施形態はまた、抗体生産のために宿主細胞にトランスフェクトされると、抗体またはその断片の収率を増加するように最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体断片をコードする任意の核酸分子を含むことは認識されるべきである。
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載のように調製した抗体を患者サンプル中のAng-2レベルを検出するために利用する、疾患または症状を診断する方法を含む。一実施形態において、患者サンプルは血液または血清である。さらなる実施形態においては、抗Ang-2抗体を用いるAng-2の過剰発現の同定に関わる、リスク因子の同定、疾患の診断および疾患の段階付けの方法が示される。
本発明の他の実施形態は、血清または細胞を抗Ang-2抗体と接触させ、その後にAng-2の存在を検出することによる、細胞内のAng-2の発現に関連した症状を診断する方法を含む。選択される症状は、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない血管新生に関係する疾患を含む。
他の実施形態において、本発明は、哺乳動物組織、細胞、または体液中のアンジオポエチン-2およびアンジオポエチンファミリーメンバーを検出し、血管新生に関係する疾患をスクリーニングするためのアッセイキットを含む。キットは、アンジオポエチン-2と結合する抗体、および抗体とアンジオポエチン-2（もし存在する場合）との反応を示す手段を含む。一実施形態では、Ang-2と結合する抗体は標識されている。他の実施形態では、抗体は無標識の一次抗体であり、キットはさらに一次抗体を検出するための手段を含む。一実施形態において、前記手段は抗免疫グロブリンである標識した第2の抗体を含む。他の実施形態においては、抗体を蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識する。
さらに他の実施形態は、患者におけるAng-2の発現に関連した疾患または症状を、患者に本発明の抗体の有効量を投与することによって治療する方法を含む。本発明の抗体を単独投与してもよいし、または化学療法薬または放射線療法、ホルモン療法、または外科と組合わせて投与してもよい。例えば、血管新生を遮断するAng-2抗体のモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナル混合物を、腫瘍細胞増殖を直接阻害することを示す薬物と併用して投与してもよい。その方法はin vivoで実施することができ、患者は、いくつかの実施形態において、ヒト患者である。一実施形態において、その方法は血管新生に関係する疾患の治療に関するものであって、前記疾患には、限定されるものでないが、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌が含まれる。
他の実施形態において、本発明は、容器を含む製造物品を提供する。容器は本発明の抗体を含有する組成物および添付文書またはラベルを含み、前記文書またはラベルにはAng-2の過剰発現により特徴づけられる血管新生に関係する疾患を治療するために本組成物の使用が可能であることが示されている。
いくつかの実施形態においては、抗Ang-2抗体の患者への投与後、浄化剤を投与して、過剰な循環中の抗体を血液から除去する。
さらに他の実施形態は、疾患、例えば血管新生に関係する疾患を治療するための医薬品の調製における本発明の抗体の使用である。一実施形態において、血管新生に関係する疾患は癌、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌を含む。他の実施形態において、血管新生に関係する疾患は、限定されるものでないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、肉腫、頭頚部癌、中皮腫、胆道癌（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および神経膠芽細胞腫を含む。他の実施形態において、血管新生に関係する疾患は、限定されるものでないが、非新生物疾患、例えば、乾癬、（リウマチ様、骨などの）関節炎、黄斑変性症、再狭窄などを含む。
Ang-2は血管新生の重要な「入（ON）」のスイッチである。したがって、この分子に対するアンタゴニスト作用は、病態生理学的な進行を阻害し、それにより様々な血管新生依存性疾患に対する強力な療法として作用することが期待される。固形腫瘍とそれらの転移に加え、血液悪性腫瘍、例えば白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫は血管新生に依存する。過剰な血管成長は数多くの非新生物障害に寄与する。これらの非新生物性の血管新生依存性疾患は、アテローム硬化症、血管腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管奇形（例えば遺伝性出血性毛細血管拡張症（HHT）、またはオスラー・ウェーバー症候群）、いぼ、化膿性肉芽腫、多毛症、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、乾癬、不正子宮出血、濾胞性嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、呼吸困難、腹水、透析患者における腹膜硬化症、腹部手術に起因する接着形成、肥満、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨髄炎、パンヌス成長、骨棘、血友病関節、炎症および感染プロセス（例えば肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、肝再生、肺高血圧、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、白質軟化、血管新生緑内障、角膜移植片血管新生、トラコーマ、甲状腺炎、甲状腺腫脹、ならびにリンパ増殖性疾患を含む。
他の実施形態においては、哺乳動物における疾患および／または症状を治療するために、本発明の抗体を他の薬剤、例えば抗血管新生薬または抗炎症薬と組合わせて使用する方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、抗Ang-2抗体と、疾患を治療するのに有用なコロニー刺激因子1（CSF1）および／またはCSF1受容体（CSF1R）の生物学的活性のアンタゴニストとの組合わせを含むものである。
他の実施形態において、本発明は患者の癌を治療する方法を提供する。さらに具体的には、本発明の方法は、アンジオポエチン-2および／またはTie2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬の組合わせての投与；アンジオポエチン-2および／またはTie2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬を含む医薬組成物；患者の治療方法に使用するためのアンジオポエチン-2および／またはTie2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬を含む組合わせ製品；アンジオポエチン-2および／またはTie2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬を含むキット；
患者における抗癌効果の生産に使用する医薬品の製造におけるアンジオポエチン-2、および／またはTie2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬の使用を含むものである。かかる組合わせはまた、アンジオポエチン-2および／またはTie-2の活性に関連する他の疾患の治療にも有用である。
野生型抗体3.19.3(WT)ならびにMEDI1に対応するVLとMEDI5に対応するVHをIgG1とIgG2フォーマットの両方に含む抗体の示差走査熱量測定実験から得た結果を表す。図は2つのMEDI1/5抗体の融点のWT対照抗体に対する相対的増加を描いている。 Ang-2抗体の様々な調製物のクロマトグラフを表す。(A)において3.19.3抗体は、抗体と形成した様々なアダクツに対応するサイズの不均一性を示す。(B)と(C)は、IgG1(B)とIgG2(C)フォーマットにおけるAng-2特異的抗体MEDI1/5を表す。これらの抗体は、野生型3.19.3抗体が示したサイズの不均一性を示さない。 野生型3.19.3抗体ならびにIgG1またはIgG2フォーマットのMEDI1/5抗体で実施した競合ELISAに基づくAng-2結合アッセイからの結果を表す。図は、固定したTie2を用いた競合アッセイにより測定して、MEDI1/5抗体が3.19.3抗体と比較して、Ang-2に対して類似の結合プロファイルを表すことを描く。 MCF7異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3およびAZD6495での治療後の組合わせ効力を示す。y軸は治療日数に対する腫瘍体積（mm3）を示し、ここで正方形の点はビヒクルを表し；円の点はmAb 3.19.3を表し；三角の点はAZD6495を表し；菱形の点はmAb 3.19.3とAZD6495の組合わせを表す。 MCF7異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とAZD6495の組合わせ治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。y軸は治療日数に対する体重（g）を示し、ここで正方形の点はビヒクルを表し；円の点はmAb 3.19.3を表し；三角の点はAZD6495を表し；菱形の点はmAb 3.19.3とAZD6495の組合わせを表す。 MDA-MB-231異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とAZD6495の治療後の組合わせ効力を示す。y軸は治療の日数に対する腫瘍 体積（mm3）を示し、ここで正方形の点はビヒクルを表し；円の点はmAb 3.19.3を表し；三角の点はAZD6495を表し；菱形の点はmAb 3.19.3とAZD6495の組合わせを表す。 MDA-MB-231異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3およびAZD6495での組合わせ治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。y軸は治療の日数に対する体重（g）を示し、ここで正方形の点はビヒクルを表し；円の点はmAb 3.19.3を表し；三角の点はAZD6495を表し；菱形の点はmAb 3.19.3とAZD6495の組合わせを表す。 LoVo異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3と5-フルオウラシルでの治療後の組合わせ効力を示す。 LoVo異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3と5-フルオウラシルでの治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。 HT-29異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とイリノテカンでの治療後の組合わせ効力を示す。 HT29異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とイリノテカンでの治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。 Colo205異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とゲムシタビンでの治療後の組合わせ効力を示す。 Colo205異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とゲムシタビンでの治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。 Calu6異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とドセタキセルでの治療後の組合わせ効力を示す。 Calu6異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とドセタキセルでの治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。 H460異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とオキサリプラチンでの治療後の組合わせ効力を示す。 H460異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とオキサリプラチンでの治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。 H460異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とAZD4877での治療後の組合わせ効力を示す。 H460異種移植腫瘍を保持するマウスにおけるmAb 3.19.3とAZD4877での治療後の宿主体重変化に与える影響を示す。 コラーゲン誘導関節炎疾患モデルの臨床疾患進行に与える3.19.3治療の効果を示す。治療として試験治療薬を投与した雄DBA/1マウスおよび動物にコラーゲン誘導関節炎を誘導させた。図12aは、疾患発症からの日数（すなわち治療日数）に対する関節炎のスコア平均（平均の＋/-標準誤差）を示す。黒四角はPBSビヒクルで治療した動物（n＝15）、白三角はヒトIgGアイソタイプ対照で治療した動物（n＝15）、黒丸は3.19.3の10mg/kgで治療した動物（n＝15）、そして白四角はプレドニソロンの3mg/kgで治療した動物（n＝10）を表す。 平均動物体重に与える影響を示す。図12bは、各治療グループ間でコラーゲン誘導関節炎の全時間コースに平均体重（g）の有意な変化が観察されなかったことを示し、3.19.3 療法によく耐えたことを示唆する。図12bは、疾患発症からの日数（すなわち治療日数）に対する体重（g）を示す。黒四角はPBSビヒクルで治療した動物（n＝15）、白三角はヒトIgGアイソタイプ対照で治療した動物（n＝15）、黒丸は3.19.3の10 mg/kgで治療した動物（n＝15）、そして白四角はプレドニソロンの3mg/kgで治療した動物 （n＝10）を表す。 抗Ang-2抗体は網膜血管新生を阻害する。図13は、対照子マウス(a)ならびに0.3mg/kgのMEDI1/5(b)、1.0mg/kgのMEDI1/5(c)、および10mg/kgのMEDI1/5(d)で治療した子マウスにおけるマウス網膜の血管新生の変化を表す。これらのパネルは、マウス網膜血管新生が、対照抗体で治療した動物と比較して、MEDI1/5抗Ang-2抗体によって用量に依存する様式で阻害されることを実証する。 抗Ang-2抗体は網膜血管新生を阻害する。図13は、対照子マウス(a)ならびに0.3mg/kgのMEDI1/5(b)、1.0mg/kgのMEDI1/5(c)、および10mg/kgのMEDI1/5(d)で治療した子マウスにおけるマウス網膜の血管新生の変化を表す。これらのパネルは、マウス網膜血管新生が、対照抗体で治療した動物と比較して、MEDI1/5抗Ang-2抗体によって用量に依存する様式で阻害されることを実証する。 抗Ang-2抗体は網膜血管新生を阻害する。図13は、対照子マウス(a)ならびに0.3mg/kgのMEDI1/5(b)、1.0mg/kgのMEDI1/5(c)、および10mg/kgのMEDI1/5(d)で治療した子マウスにおけるマウス網膜の血管新生の変化を表す。これらのパネルは、マウス網膜血管新生が、対照抗体で治療した動物と比較して、MEDI1/5抗Ang-2抗体によって用量に依存する様式で阻害されることを実証する。 抗Ang-2抗体は網膜血管新生を阻害する。図13は、対照子マウス(a)ならびに0.3mg/kgのMEDI1/5(b)、1.0mg/kgのMEDI1/5(c)、および10mg/kgのMEDI1/5(d)で治療した子マウスにおけるマウス網膜の血管新生の変化を表す。これらのパネルは、マウス網膜血管新生が、対照抗体で治療した動物と比較して、MEDI1/5抗Ang-2抗体によって用量に依存する様式で阻害されることを実証する。 抗Ang-2抗体はFGF2介在性血管新生を阻害する。 図14は抗Ang-2抗体、MEDI1/5の投与による、マウスにおけるFGF2介在性血管新生の阻害を実証する結果を表す。手短に言えば、Matrigel(登録商標)をFGF2と混合し、胸腺欠損のヌードマウス中に皮下移植した。MEDI1/5を腹腔内に1、10または20mg/kgだけ、移植後第1日、第4日および第8日に投薬した。移植後第11日に、マウスの静脈内にFITC-デキストランを投薬し、Matrigel(登録商標)プラグを収穫した。プラグをFITC-デキストラン含量（a）について定量した。MEDI1/5の全3用量は血管新生の有意な低下（*p<0.05）をもたらした。プラグをまたヘマトキシリンおよびエオシン染色（b）で調製した。これは対照FGF2治療したサンプルと比較して血管発生のレベルが低いことを示した。 抗Ang-2抗体はFGF2介在性血管新生を阻害する。 図14は抗Ang-2抗体、MEDI1/5の投与による、マウスにおけるFGF2介在性血管新生の阻害を実証する結果を表す。手短に言えば、Matrigel(登録商標)をFGF2と混合し、胸腺欠損のヌードマウス中に皮下移植した。MEDI1/5を腹腔内に1、10または20mg/kgだけ、移植後第1日、第4日および第8日に投薬した。移植後第11日に、マウスの静脈内にFITC-デキストランを投薬し、Matrigel(登録商標)プラグを収穫した。プラグをFITC-デキストラン含量（a）について定量した。MEDI1/5の全3用量は血管新生の有意な低下（*p<0.05）をもたらした。プラグをまたヘマトキシリンおよびエオシン染色（b）で調製した。これは対照FGF2治療したサンプルと比較して血管発生のレベルが低いことを示した。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2抗体は関節炎疾患進行を阻害する。図15Aは、抗Ang-2抗体3.19.3およびプレドニソロンを含む様々な薬剤で治療した、関節炎誘導動物の全関節炎スコアを表す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。3.19.3の1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算し、図15Bに提示した。図 15C〜Hはさらに、抗Ang-2 抗体 3.19.3による治療の改善効果を実証する。CIA モデルの組織病理学的評価は、3.19.3投与後の、滑膜過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）を含む評価した全てのパラメーターに与える用量依存性の抗関節炎効果の確証を示した。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループの間に有意差は存在しなかった（図15C〜G）。さらに、CD31染色を用いるミクロ血管密度の研究は、1および10mg/kgの用量においてならびにプレドニソロンによって滑膜におけるミクロ血管の存在の有意な低下を示した。0.1mg/kgの3.19.3治療（図15H）は無効であった。 抗Ang-2と抗TNFα薬の組合わせは、関節炎の予防治療において効力を示す。図16Aと図16Bは、MEDI1/5＋エタネルセプトの組合わせを用いて予防治療した関節炎誘導動物の関節炎スコアを表す（黒丸＝アイソタイプ対照、黒菱形＝10mg/kg MEDI1/5、白菱形＝1mg/kgエタネルセプト、灰色菱形＝10mg/kg MEDI1/5と1mg/kgエタネルセプトの組合わせ、白四角＝4mg/kgエンブレル、灰色四角＝10mg/kg MEDI1/5と4mg/kgエタネルセプトの組合わせ）。低下は、エタネルセプトまたはMEDI1/5治療のいずれでも観察された。MEDI1/5を低用量のエタネルセプトと組合わせて投与した時に、臨床スコアのさらなる低下が存在した。滑膜炎および関節破壊の組織学的評価（図16C）は、骨無機質密度の損失から保護することを示した臨床スコア結果（図16D）を支持した。 抗Ang-2と抗TNFα薬の組合わせは、関節炎の予防治療において効力を示す。図16Aと図16Bは、MEDI1/5＋エタネルセプトの組合わせを用いて予防治療した関節炎誘導動物の関節炎スコアを表す（黒丸＝アイソタイプ対照、黒菱形＝10mg/kg MEDI1/5、白菱形＝1mg/kgエタネルセプト、灰色菱形＝10mg/kg MEDI1/5と1mg/kgエタネルセプトの組合わせ、白四角＝4mg/kgエンブレル、灰色四角＝10mg/kg MEDI1/5と4mg/kgエタネルセプトの組合わせ）。低下は、エタネルセプトまたはMEDI1/5治療のいずれでも観察された。MEDI1/5を低用量のエタネルセプトと組合わせて投与した時に、臨床スコアのさらなる低下が存在した。滑膜炎および関節破壊の組織学的評価（図16C）は、骨無機質密度の損失から保護することを示した臨床スコア結果（図16D）を支持した。 抗Ang-2と抗TNFα薬の組合わせは、関節炎の予防治療において効力を示す。図16Aと図16Bは、MEDI1/5＋エタネルセプトの組合わせを用いて予防治療した関節炎誘導動物の関節炎スコアを表す（黒丸＝アイソタイプ対照、黒菱形＝10mg/kg MEDI1/5、白菱形＝1mg/kgエタネルセプト、灰色菱形＝10mg/kg MEDI1/5と1mg/kgエタネルセプトの組合わせ、白四角＝4mg/kgエンブレル、灰色四角＝10mg/kg MEDI1/5と4mg/kgエタネルセプトの組合わせ）。低下は、エタネルセプトまたはMEDI1/5治療のいずれでも観察された。MEDI1/5を低用量のエタネルセプトと組合わせて投与した時に、臨床スコアのさらなる低下が存在した。滑膜炎および関節破壊の組織学的評価（図16C）は、骨無機質密度の損失から保護することを示した臨床スコア結果（図16D）を支持した。 抗Ang-2と抗TNFα薬の組合わせは、関節炎の予防治療において効力を示す。図16Aと図16Bは、MEDI1/5＋エタネルセプトの組合わせを用いて予防治療した関節炎誘導動物の関節炎スコアを表す（黒丸＝アイソタイプ対照、黒菱形＝10mg/kg MEDI1/5、白菱形＝1mg/kgエタネルセプト、灰色菱形＝10mg/kg MEDI1/5と1mg/kgエタネルセプトの組合わせ、白四角＝4mg/kgエンブレル、灰色四角＝10mg/kg MEDI1/5と4mg/kgエタネルセプトの組合わせ）。低下は、エタネルセプトまたはMEDI1/5治療のいずれでも観察された。MEDI1/5を低用量のエタネルセプトと組合わせて投与した時に、臨床スコアのさらなる低下が存在した。滑膜炎および関節破壊の組織学的評価（図16C）は、骨無機質密度の損失から保護することを示した臨床スコア結果（図16D）を支持した。 抗Ang-2と抗TNFα薬の組合わせは、関節炎の治療における効力を実証する。臨床疾患発症後の治療手法で投与すると、疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）の穏やかな低下がMEDI1/5治療で観察される一方、試験した両方の用量のエタネルセプトは疾患進行に効果がなかった。MEDI1/5（10mg/kg）を高用量のエタネルセプト（4mg/kg）と組合わせて投与すると、疾患進行のより劇的な阻害が観察された。（黒丸＝アイソタイプ対照、黒菱形＝MEDI1/5、白菱形＝1mg/kgエタネルセプト、灰色菱形＝MEDI1/5と1mg/kgエタネルセプトの組合わせ、白四角＝4mg/kgエンブレル、灰色四角＝MEDI1/5と4mg/kgエタネルセプトの組合わせ）。
本発明者らは、ある特定の改変を特定のAng-2抗体に行って、ある特定の条件下でその抗体をより安定化できることを見出した。特に、軽鎖の残基49の変更により凝集の発生が遥かに少なくなる。さらに重鎖の残基37を変えると、凝集の発生が遥かに少なくなる。
従って、一実施形態において、本発明は対照抗体3.19.3を超える1以上の改善された特徴を有するAng-2抗体に関する。かかる特徴には、安定性の増加、凝集の減少および生産効率の増加が含まれる。一実施形態において、本発明の抗体はTie2受容体を介するAng-2および／またはAng-1シグナル伝達を効率的に阻害して血管新生および腫瘍成長などのプロセスをモジュレートする。
本明細書に記載した実施形態は、Ang-2に特異的なモノクローナル抗体であって、抗体3.19.3から誘導することができかつ安定性および／または生産効率の増加を表す前記抗体に関する。いくつかの実施形態において、本抗体はAng-2と結合し、Ang-2とその受容体、Tie2の結合を阻害する。本発明の他の実施形態には、治療上有用である完全ヒト抗Ang-2抗体、および抗体調製物が含まれる。かかる抗Ang-2抗体調製物は所望される治療特性を有し、その特性にはAng-2との強い結合親和性、in vitroでAng-2を中和する能力、およびAng-2誘導血管新生をin vivoで抑制する能力が含まれる。本発明の抗体は特異的にAng-2と結合しかつ腫瘍血管新生を阻害しかつ腫瘍成長を低下する能力を含むものである。これを達成することができる機構には、限定されるものでないが、Ang-2のその受容体Tie2との結合の阻害、Ang-2誘導性Tie2シグナル伝達の阻害、またはAng-2のクリアランスの増加、ひいてはAng-2の有効濃度の低下のいずれかを含んでもよい。
他の実施形態において、抗体はAng-2およびAng-1の両方と結合するおよび／またはAng-1およびAng-2の両方の1以上の機能的活性をモジュレートすることができる。
本発明の一態様は、Kabat番号系（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3）により定義される位置49におけるアミノ酸の置換（Ang-2抗体3.19.3の軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号1を参照）と比較して）を含む安定した抗体を提供する。一実施形態において、位置49におけるアミノ酸置換は任意のアミノ酸であってもよい。具体的な実施形態において、位置49のアミノ酸置換はAsp、Thr、Asn、およびAlaからなる群より選択される。
他の実施形態において、本発明の抗体はさらに、EU番号系（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3）により定義される重鎖の位置37におけるVal置換（Ang-2抗体3.19.3の重鎖可変アミノ酸配列（配列番号2を参照）と比較して）を含む。
一実施形態において、本発明の抗体は抗体 3.19.3と比較して高い安定性を表す。他の実施形態において、本発明の抗体は3.19.3と比較して高い生産収率を表す。
他の実施形態において、本発明の抗体はMEDI1（配列番号：3）、MEDI2（配列番号：4）、MEDI3（配列番号：5）、MEDI6（配列番号8）、およびMEDI4（配列番号：6）からなる群より選択される可変軽鎖酸配列を含みうる。他の実施形態において、本発明の抗体はMEDI5（配列番号：7）の重鎖可変配列を含みうる。他の実施形態において、本発明の抗体はMEDI1（配列番号：3）、MEDI2（配列番号：4）、MEDI3（配列番号：5）、MEDI6（配列番号：8）、およびMEDI4（配列番号：6）からなる群より選択される可変軽鎖配列を含みかつMEDI5（配列番号：7）の重鎖可変配列をさらに含みうる。本明細書で使用される、1つの軽鎖および1つの重鎖を含む本発明の抗体はMEDIX/MEDIY（式中、Xは軽鎖配列を表しかつYは重鎖配列を表す）と呼ぶことができる。
他の実施形態において、本発明の抗体はMEDI1（配列番号：3）、MEDI2（配列番号：4）、MEDI3（配列番号：5）、MEDI6（配列番号8）、およびMEDI4（配列番号：6）からなる群より選択されるが、位置49に異なるアミノ酸置換を有する可変軽鎖酸配列を含みうる。他の実施形態において、本発明の抗体はさらにMEDI5（配列番号：7）の重鎖可変配列を含みうる。他の実施形態において、本発明の抗体はMEDI1（配列番号：3）、MEDI2（配列番号：4）、MEDI3（配列番号：5）、MEDI6（配列番号8）、およびMEDI4（配列番号：6）からなる群より選択されるが、位置49に異なるアミノ酸置換を有し、かつさらにMEDI5（配列番号：7）の重鎖可変配列を含みうる。
不対システイン残基のモジュレーション：
タンパク質におけるジスルフィド結合形成は複雑なプロセスであり、環境の酸化還元ポテンシャルおよび特殊なチオール-ジスルフィド交換酵素により決定される（Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984；Houee-Levin, Methods Enzymol. 353, 35-44, 2002）。一般的に、タンパク質（例えば、Ang-2に特異的な抗体）中のシステイン残基は、システイン-システインジスルフィド結合に関わるかまたは、フォールディングしたタンパク質領域の一部である場合、立体的にジスルフィド結合形成から保護されている。システイン残基がタンパク質構造中に対を持たず、かつフォールディングにより立体的に保護されてない場合、そのシステイン残基は、ジスルフィドシャッフリングとして知られるプロセスで、溶液からの未結合システインとジスルフィド結合を形成しうる。ジスルフィドスクランブルとして知られる他のプロセスでは、未結合のシステインはまた、天然のジスルフィド結合（例えば、抗体構造に存在するもの）と干渉し、結合の低下、生物学的活性の低下および／または安定性の低下をもたらしうる。
グリコシル化部位のモジュレーション：
可変域のグリコシル化は、おそらく立体障害に因って、抗体結合親和性に悪い影響を与えうることが示されている（Co, M. S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367）。グリコシル化プロセスの不均一性はまた、改変された結合特性を持ついくつもの抗体種をもたらしうる。このようなわけで、干渉するグリコシル化部位を除去または改変して、一致した抗原結合プロファイルを保証することが所望される。可能性のあるまたは観察されるグリコシル化部位を除去する1つの方法は、部位特異的突然変異誘発を行い、少なくとも1つの可能性のあるグリコシル化部位（例えばアスパラギン、トレオニンまたはセリンアミノ酸）を、グリコシル化部位を果たすことができない他のアミノ酸で置換することである。従って、一実施形態において、本発明の抗体はグリコシル化部位を果たさない置換されたアミノ酸を含む。一実施形態において、改変すべきグリコシル化部位は可変域に存在する。他の実施形態において、改変すべきグリコシル化部位は抗体の相補性決定域（CDR）に存在する。他の実施形態において、改変すべきグリコシル化部位は第2軽鎖CDRである。他の実施形態においては、グリコシル化部位周りの配列が改変される。他の実施形態において、改変すべきグリコシル化部位は定常域に存在する。他の実施形態において、本発明の抗体は少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つまたはそれ以上の改変されたグリコシル化部位を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は少なくとも1つのO-グリコシル化部位が遺伝子操作で除去されている軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はMEDI1（配列番号：3）、MEDI2（配列番号：4）、MEDI3（配列番号：5）、およびMEDI4（配列番号：6）からなる群より選択される軽鎖を含み、ここで前記軽鎖はさらにKabat位置59にてプロリンでないアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体はMEDI6（配列番号8）に対応する配列を有する軽鎖を含む。
選択された抗体重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は生殖系列重鎖および軽鎖アミノ酸配列と比較しうるものである。選択されたVLおよび／またはVH鎖のある特定のフレームワーク残基が生殖系列コンフィギュレーションと異なる（例えば、ファージライブラリーを調製するのに用いた免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異の結果として）場合、選択された抗体の改変されたフレームワーク残基を「戻し変異」する（すなわち、選択された抗体のフレームワークアミノ酸配列を変えてこれらを生殖系列アミノ酸配列と同じにする）ことが所望されうる。かかるフレームワーク残基の「戻し変異」（または「生殖系列化」）は、特定の突然変異を導入する標準の分子生物学的方法（例えば、部位特異的突然変異誘発；PCR介在突然変異誘発など）により達成することができる。一実施形態においては、可変軽鎖および／または重鎖フレームワーク残基を戻し変異する。他の実施形態においては、本発明の抗体の可変重鎖を戻し変異する。他の実施形態において、本発明の抗体の可変重鎖は少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つまたはそれ以上の戻し変異を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体の可変重鎖は位置37を占めるグリシン残基の戻し変異を含む。他の実施形態において、本発明の抗体の可変重鎖はグリシンからバリンへの置換に対応する位置37の戻し変異を含む。
Fc域のモジュレーション
本発明はまた、改変されたFc域（本明細書では「変異Fc域」とも呼ぶ）をもつ抗体を提供する。従って、本発明の一実施形態において、本発明の抗体は変異Fc域（すなわち、以下に考察するように改変されているFc域）を含む。変異Fc域を含む本発明の抗体は、本明細書において「Fc変異タンパク質」とも呼ぶ。
変異Fc域の説明において、本発明の抗体のFc域はKabatら（1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA）のEU指数による番号付けスキームが使われることは理解されよう。
Fc域の変異体（例えば、アミノ酸置換および／または付加および／または欠失）はエフェクター機能を増大または減少することは公知である（Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30：487-490；米国特許番号5,624,821、5,885,573およびPCT国際公開番号WO 00/42072、WO 99/58572およびWO 04/029207を参照）。従って、一実施形態において、本発明の抗体は変異Fc域を含む。一実施形態において、抗体の変異Fc域は生来のFcと比較して類似のレベルのエフェクター機能を誘導する。他の実施形態において、変異Fc域は生来のFcと比較してエフェクター機能のより高い誘導を示す。他の実施形態において、変異Fc域は生来のFcと比較してエフェクター機能のより低い誘導を示す。他の実施形態において、変異Fc域は生来のFcと比較してADCCのより高い誘導を示す。他の実施形態において、変異Fc域は生来のFcと比較してADCCのより低い誘導を示す。他の実施形態において、変異Fc域は生来のFcと比較してCDCのより高い誘導を示す。他の実施形態において、変異Fc域は生来のFcと比較してCDCのより低い誘導を示す。変異Fc域の具体的な実施形態を本明細書で以下に詳しく説明する。
当技術分野ではまた、Fc域のグリコシル化を改変してエフェクター機能を増加または減少できることが公知である（例えば、Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473）；米国特許番号6,602,684；米国出願番号10/277,370；10/113,929；PCT国際公開番号WO 00/61739A1；WO 01/292246A1；WO 02/311140A1；WO 02/30954A1；Potillegent(登録商標)技法（Biowa, Inc. Princeton, N.J.）；GlycoMAb(登録商標)グリコシル化技法（GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerlandを参照）。従って、一実施形態において、本発明の抗体のFc域はアミノ酸残基の改変されたグリコシル化を含む。他の実施形態においては、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化はより低いエフェクター機能をもたらす。他の実施形態においては、アミノ酸残基の改変されたグリコシル化はより高いエフェクター機能をもたらす。特定の実施形態において、Fc域はフコシル化が低下している。他の実施形態においては、Fc域はフコシル化されてない（例えば、米国特許出願公開番号2005/0226867を参照）
最近の研究は、シアル酸をIgG分子上のオリゴ糖へ付加すると、その抗炎症性活性を増進しその細胞障害性を変えることを示唆している（Keneko et al., Science 313, 670-673(2006)；Scallon et al., Mol. Immuno. 2007 Mar;44(7):1524-34）。従って、抗体治療薬の効力は、意図する応用に最も好適な糖型の選択により最適化することができる。抗体の2つのCH2ドメインの間に挿入される2つのオリゴ糖鎖はFc域とその受容体との結合に関わる。上記の研究は、シアリル化の増加したIgG分子は抗炎症特性を有するが、シアリル化の低下したIgG分子は高い免疫刺激特性を有することを示す。それ故に、抗体治療薬を適当なシアリル化プロファイルによって特定の応用に対して「仕立てる」ことができる。抗体のシアリル化状態をモジュレートする方法は、WO2007/005786：件名「増大した治療活性をもつ方法と組成物（Methods And Compositions With Enhanced Therapeutic Activity）」、およびWO2007/117505：件名「増大した抗炎症性と減少した細胞傷害性特性をもつポリペプチドと関係する方法（Polypeptides With Enhanced Anti-Inflammatory And Decreased Cytotoxic Properties And Related Methods）」に開示されており、それぞれ、本明細書に参照によりその全てが全ての目的のために組み入れられる。
一実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して改変されたシアリル化プロファイルを含む。一実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して増加したシアリル化プロファイルを含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約125%、約150%またはそれ以上のシアリル化の増加を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍またはそれ以上のシアリル化の増加を含む。
他の実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して減少したシアリル化プロファイルを含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約125%、約150%またはそれ以上のシアリル化の減少を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍またはそれ以上のシアリル化の減少を含む。
当技術分野ではまた、Fc域を改変してタンパク質の半減期を増加できることが公知である。半減期の増加は、患者に与えられる薬物の量の低下ならびに投与頻度の低下を可能にする。従って、増加した半減期をもつ本発明の抗体は、FcとFcRn受容体の間の相互作用に関わると同定されたアミノ酸残基を改変（例えば、置換、欠失、または付加）することにより作製することができる（例えば、それぞれ、参照によりその全てが組み入れられるPCT公開番号97/34631および第02/060919を参照）。さらに、本発明の抗体の半減期は、当技術分野で広く利用される技法によるPEGまたはアルブミンとのコンジュゲーションにより増加することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約125%、約150%またはそれ以上の半減期の増加を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体のFc域は、参照の非改変Fc域と比較して約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍またはそれ以上の半減期の増加を含む。
本発明は、比較しうる分子（例えば、野生型Fc域を有することを除いて同じアミノ酸配列を有するタンパク質）と比較して、Fcリガンド（例えば、Fc受容体、C1q）に対する改変された結合特性を有するFc変異タンパク質を包含する。結合特性の例には、限定されるものでないが、結合特異性、平衡解離定数（KD）、解離および結合速度（それぞれkoffおよびkon）、結合親和性および／または結合活性が含まれる。一般に、低いKDをもつ結合分子（例えば、抗体などのFc変異タンパク質）は高いKDをもつ結合分子より所望されうることは理解されている。しかし、いくつかの例においては、konまたはkoffの値がKDの値より一層関係がありうる。当業者はどの動力学パラメーターが所与の抗体応用にとって最も重要であるかを決定することができる。
リガンドに対するFc域の親和性および結合特性は、当技術分野で公知のFc-FcγR相互作用、すなわち、Fc域のFcγRとの特異的結合を決定するための、様々なin vitroアッセイ方法（生化学または免疫学に基づくアッセイ）により決定することができ、それらの方法には、限定されるものでないが、平衡論的方法（例えば、酵素-結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、またはラジオイムノアッセイ（RIA））、または動力学的方法（例えば、BIACORE(登録商標)分析）、および他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィ（例えば、ゲル濾過）が含まれる。これらおよび他の方法は、1以上の試験する成分上の標識を利用することおよび／または、限定されるものでないが、色素生産性、蛍光性、発光性、または同位体標識を含む様々な検出法を使うことができる。結合親和性および動力学の詳しい説明は、Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見出すことができ、この文献は抗体-免疫源相互作用に重点をおいている。
一実施形態において、Fc変異タンパク質は1以上のFcリガンドと、比較しうる分子と比較して増強された結合を有する。他の実施形態において、Fc変異タンパク質はFcリガンドに対して、比較しうる分子の親和性より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍大きい親和性を有する。特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体に対して増強された結合を有する。他の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体FcγRIIIAに対して増強された結合を有する。さらなる実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体であるFcγRIIBに対して増強された結合を有する。なおさらなる実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体であるFcRnに対して増強された結合を有する。さらに他の実施形態において、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較して、Fc受容体であるC1qに対して増強された結合を有する。
Fc域を含むタンパク質の血清半減期は、Fc域のFcRnに対する結合親和性を増加することにより増加することができる。一実施形態において、Fc変異タンパク質は、比較しうる分子と比較して増強された血清半減期を有する。
任意の特定のFc変異タンパク質が標的細胞の溶解に介在する能力を、ADCCにより分析することができる。ADCC活性を評価するために、目的のFc変異タンパク質を、抗原抗体複合体により活性化して標的細胞の細胞溶解をもたらすことができる免疫エフェクター細胞と組合わせて標的細胞に加える。細胞溶解は一般に、溶解した細胞からの標識（例えば放射性基質、蛍光染料または自然の細胞内タンパク質）の放出により検出する。
かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢の血液単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。in vitro ADCCアッセイの具体的な例は、Wisecarver et al., 1985 79:277-282；Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351-1361；Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183-191；Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38に記載されている。目的のFc変異体タンパク質のADCC活性はまた、例えば、Clynes et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656に開示されたような動物モデルにおいてin vivoで評価することができる。
一実施形態においては、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較して増強されたADCC活性を有する。特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は、比較しうる分子のADCC活性より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍または少なくとも10倍または少なくとも50倍または少なくとも100倍大きいADCC活性を有する。他の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較して、Fc受容体FcγRIIIAに対して増強された結合を有しかつ増強されたADCC活性を有する。他の実施形態において、Fc変異タンパク質は、比較しうる分子と比較して、増強されたADCC活性と延長された血清半減期の両方を有する。
一実施形態において、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較して、低下したADCC活性を有する。特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は、比較しうる分子のADCC活性より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍または少なくとも10倍または少なくとも50倍または少なくとも100倍低いADCC活性を有する。他の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較して、Fc受容体FcγRIIIAに対して低下した結合を有しかつ低下したADCC活性を有する。他の実施形態において、Fc変異タンパク質は、比較しうる分子と比較して、低下したADCC活性と延長された血清半減期の両方を有する。
一実施形態において、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較して、増強されたCDC活性を有する。特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は、比較しうる分子のCDC活性より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍または少なくとも10倍または少なくとも50倍または少なくとも100倍大きいCDC活性を有する。他の実施形態において、Fc変異タンパク質は、比較しうる分子と比較して、増強されたCDC活性と延長された血清半減期の両方を有する。一実施形態において、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較して、1以上のFcリガンドと低下した結合を有する。他の実施形態において、Fc変異タンパク質はFcリガンドに対して、比較しうる分子の親和性より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍低い親和性を有する。特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体に対して低下した結合を有する。他の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体FcγRIIIAに対して低下した結合を有する。さらなる特定の実施形態において、本明細書に記載のFc変異体はFc受容体FcγRIIIAに対して比較しうる分子の親和性より少なくとも5倍低い親和性を有し、ここで前記Fc変異体はFc受容体FcγRIIBに対して比較しうる分子の親和性の約2倍以内である親和性を有する。さらに他の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質はFc受容体FcRnに対して低下した結合を有する。なお他の特定の実施形態において、Fc変異タンパク質は比較しうる分子と比較してC1qに対して低下した結合を有する。
一実施形態において、本発明はFc域が、Kabatに記述されたEU指数による番号で、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、440および443からなる群より選択される1以上の位置において非天然のアミノ酸残基を含むFc変異体を提供する。任意にFc域は、当技術分野で公知のさらなるおよび／または代わりの位置において非天然アミノ酸残基を含んでもよい（例えば、米国特許番号5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT国際公開番号WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752；WO 04/074455；WO 04/099249；WO 04/063351；WO 05/070963；WO 05/040217、WO 05/092925およびWO 06/020114を参照）。
特定の実施形態において、本発明はそのFc域が、Kabatに記述されたEU指数により番号を付して234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T、255L、256E、256M、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、305I、313F、316D、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、331I、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Yおよび434Wからなる群より選択される少なくとも1つの非天然アミノ酸残基を含む前記Fc変異体を提供する。任意に、そのFc域は、当技術分野で公知のさらなるおよび／または代わりの非天然アミノ酸残基を含んでもよい（例えば、米国特許番号5,624,821；6,277,375；6,737,056；PCT国際特許公開WO 01/58957；WO 02/06919；WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752およびWO 05/040217を参照）
抗体親和性
本発明の一実施形態においては、アンジオポエチン-1と結合しかつアンジオポエチン-1とTie2の結合を阻止する抗体を提供する。本発明のなお他の実施形態は、アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2と結合しかつアンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2誘導性Tie2リン酸化を阻害するモノクローナル抗体である。一実施形態において、本抗体はアンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2と1ナノモル（nM）未満のKdで結合する。他の実施形態において、本抗体は500ピコモル（pM）未満のKdで結合する。他の実施形態において、本抗体は100ピコモル（pM）未満のKdで結合する。なお他の実施形態において、本抗体は30ピコモル（pM）未満のKdで結合する。さらなる実施形態において、本抗体は20ピコモル（pM）未満のKdで結合する。なおさらなる実施形態において、本抗体は10または5ピコモル（pM）未満のKdで結合する。
本発明の抗体はAng-1および／またはAng-2と高い結合親和性を有しうる。例えば、本明細書に記載の抗体は少なくとも2 X 105M-1s-1、少なくとも5 X 105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5 X 106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5 X 107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1の結合速度定数またはkon速度（抗体(Ab)＋抗原→Ab-Ag）を有しうる。
他の実施形態において、抗体は5 x 10-1s-1より低い、10-1s-1より低い、5 x 10-2s-1より低い、10-2s-1より低い、5 x 10-3s-1より低い、10-3s-1より低い、5 x 10-4s-1より低い、または10-4s-1より低いkoff速度（Ab-Ag→Ab＋Ag）を有しうる。他の実施形態において、本発明の抗体は5 x 10-5 s-1より低い、10-5 s-1より低い、5 x 10-6 s-1より低い、10-6 s-1より低い、5 x 10-7 s-1より低い、10-7 s-1より低い、5 x 10-8 s-1より低い、10-8 s-1より低い、5 x 10-9 s-1より低い、10-9 s-1より低い、または 10-10 s-1より低いkoff速度（Ab-Ag→Ab＋Ag）を有しうる。
他の実施形態において、抗体は少なくとも102M-1、少なくとも5 X 102M-1、少なくともl03M-1、少なくとも5 X 103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5 X 104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5 X 105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5 X 106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5 X 107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5 X 108M-1、少なくともl09M-1、少なくとも5 X l09M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5 X 1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5 X 1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5 X 1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5 X l013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5 X 1014M-1、少なくともl015M-1、または少なくとも5 X l015M-1の親和性定数またはKa（kon/koff）を有しうる。さらに他の実施形態において、抗体は5 x 10-2Mより低い、10-2Mより低い、5 x l0-3Mより低い、l0-3Mより低い、5 x 10-4Mより低い、10-4Mより低い、5 x 10-5Mより低い、10-5Mより低い、5 x 10-6Mより低い、10-6Mより低い、5 x 10-7Mより低い、10-7Mより低い、5 x 10-8Mより低い、10-8Mより低い、5 x l0-9Mより低い、l0-9Mより低い、5 x 10-10Mより低い、10-10Mより低い、5 x 10-11Mより低い、10-11Mより低い、5 x 10-12Mより低い、10-12Mより低い、5 x 10-13Mより低い、l0-13Mより低い、5 x 10-14Mより低い、10-14Mより低い、5 x l0-15Mより低い、またはl0-15Mより低い解離定数またはKd（koff/kon）を有しうる。
本明細書に記載の方法によって使用する抗体は、本明細書に記載のまたは当業者に公知の方法（例えば、BIAcoreアッセイ、ELISA）（Biacore International AB、Uppsala、Sweden）を用いて評価して、3000pMより低い、2500pMより低い、2000pMより低い、1500pMより低い、1000pMより低い、750pMより低い、500pMより低い、250pMより低い、200pMより低い、150pMより低い、100pMより低い、75pMより低い解離定数（Kd）を有しうる。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法によって使用する抗体は、本明細書に記載のまたは当業者に公知の方法（例えば、BIAcoreアッセイ、ELISA）を用いて評価して、25〜3400pM、25〜3000pM、25〜2500pM、25〜2000pM、25〜1500pM、25〜1000pM、25〜750pM、25〜500pM、25〜250pM、25〜100pM、25〜75pM、または25〜50pMの解離定数（Kd）を有しうる。他の実施形態において、本明細書に記載の方法によって使用する抗体は、本明細書に記載のまたは当業者に公知の方法（例えば、BIAcoreアッセイ、ELISA）を用いて評価して、500pM、100pM、75pMまたは50pMの解離定数（Kd）を有しうる。
本発明の一実施形態には、Ang-2と結合しかつ中和するが、Ang-1と結合しない抗体が含まれる。他の実施形態において、本抗体はAng-2とAng-1の両方と結合するが、Ang-2だけを中和する。他の実施形態において、本抗体はAng-2とAng-1の両方と結合し、かつAng-2とAng-1の両方とTie2との結合を中和する。
一実施形態において、本発明の抗体は優先的にAng-2と、Ang-1を超えて結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はAng-2と、Ang-1を超えて少なくとも2:1、少なくとも3:1、少なくとも4:1、少なくとも5:1、少なくとも6:1、少なくとも7:1、少なくとも8:1、少なくとも9:1、少なくとも10:1、少なくとも15:1、少なくとも20：1、少なくとも25：1、少なくとも50：1、少なくとも100：1、少なくとも250：1、少なくとも500：1、少なくとも1000：1または少なくとも10,000：1またはそれ以上の比で結合する。
一実施形態において、本発明の抗体は優先的にAng-1と、Ang-2を超えて結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はAng-1と、Ang-2を超えて少なくとも2:1、少なくとも3:1、少なくとも4:1、少なくとも5:1、少なくとも6:1、少なくとも7:1、少なくとも8:1、少なくとも9:1、少なくとも10:1、少なくとも15:1、少なくとも20：1、少なくとも25：1、少なくとも50：1、少なくとも100：1、少なくとも250：1、少なくとも500：1、少なくとも1000：1または少なくとも10,000：1またはそれ以上の比で結合する。
本発明の実施形態はまた、単離された抗Ang-2抗体の結合断片を含む。一実施形態において、その結合断片は完全ヒト抗Ang-2抗体から誘導される。例示の断片は、以下に詳しく記載したFv、Fab'または他の周知の抗体断片を含む。本発明の実施形態はまた、Ang-2に対する完全ヒト抗体を発現する細胞を含む。細胞の例には、Ang-2に対する抗体を生産するハイブリドーマ、または組換えで作製した細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、CHO細胞の変異体（例えばDG44）、293細胞およびNS0細胞が含まれる。CHO細胞の変異体についてのさらなる情報は、本明細書にその全てが参照により組み入れられる、Andersen and Reilly （2004） Current Opinion in Biotechnology 15、456-462に見出すことができる。
抗体の調製
本発明の抗体をコードする核酸
本発明はまた、本発明の抗体をコードする単離された核酸分子を包含する。他の実施形態において、本抗体は完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3から誘導される。一実施形態においては、完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3と同じ1以上のエピトープと結合する抗体が提供される。
一実施形態において、単離された核酸はMEDI1（配列番号：3）、MEDI2（配列番号：4）、MEDI3（配列番号：5）、MEDI6（配列番号8）、およびMEDI4（配列番号：6）からなる群より選択されるアミノ酸配列に対応する抗体可変軽鎖をコードする。他の実施形態において、単離された核酸はアミノ酸配列MEDI5（配列番号7）に対応する可変重鎖をさらに含む抗体をコードする。特定の実施形態において、本発明の核酸は、MEDI1（配列番号：3）、MEDI2（配列番号：4）、MEDI3（配列番号：5）、MEDI6（配列番号8）、およびMEDI4（配列番号：6）からなる群より選択されるアミノ酸配列に対応する可変軽鎖を含み、さらにアミノ酸配列MEDI5（配列番号：7）を含む可変重鎖を含む抗体をコードする。
組換え発現系
本発明の抗体の組換え発現は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。いったん本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体を生産するベクターは当技術分野で周知の技法を用いて組換えDNA技法により生産することができる（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる米国特許番号6,331,415）。従って、コードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現するタンパク質を調製する方法を本明細書に記載する。本発明の抗体は多くの異なる発現系で生産することができる。一実施形態において、本発明の抗体は哺乳動物細胞により生産されかつ分泌される。他の実施形態において、本発明の抗体はヒト細胞で生産されかつ分泌される。特定の実施形態において、本発明の抗体は293F、CHO、またはNS0細胞株の細胞で生産される。
当業者に公知である方法を用いて、タンパク質をコードする配列および適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技法、合成技法、およびin vivo遺伝子組換えが含まれる。本発明は、従って、プロモーターと機能しうる形で連結された抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
いったん発現ベクターが好都合な技法により宿主細胞に導入されると、次いでトランスフェクトされた細胞を通常の技法により培養して抗体を生産する。従って、本発明には、異種プロモーターと機能しうる形で連結された本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が含まれる。
様々な宿主発現ベクター系を利用して、米国特許番号5,807,715に記載のように、本発明の抗体またはその部分を発現することができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと連携した抗体にとって有効な発現系である（Foecking et al., Gene, 45:101 (1986)；およびCockett et al., Bio/Technology, 8:2 (1990)）。さらに、挿入された配列の発現をモジュレートするか、または遺伝子産物を所望の特定の様式で改変しかつプロセシングする宿主細胞株を選ぶことができる。タンパク質産物のかかる改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能にとって重要でありうる。色々な宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングと改変に対して特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系を選んで、本発明のタンパク質の正しい改変とプロセシングを確実にすることができる。このために、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適当なプロセシングのための細胞機構を持つ真核生物の宿主細胞を用いることができる。かかる哺乳動物の宿主細胞には、限定されるものでないが、CHO,VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293F、293T、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NS0、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞が含まれる。
細菌系において、発現するタンパク質分子の意図する使用に応じて、いくつもの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、本発明の抗体を含む医薬組成物の作製のために、大量のかかる抗体を生産する場合、精製が容易である融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが所望されうる。かかるベクターには、限定されるものでないが、大腸菌発現ベクターpUR278（Ruther et al., EMBO, 12:1791 (1983)；この場合、コード配列を個々にlacZコード領域とインフレームでベクター中にライゲートして、融合タンパク質を生産することができる）；pINベクター（Inouye & Inouye、1985、Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985)；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24:5503-5509 (1989)）などが含まれる。pGEXベクターも、外来ポリペプチドをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現するために用いることができる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞からグルタチオン-アガロース親和性マトリックスへの吸着および結合と次いで遊離グルタチオンの存在のもとでの溶出により容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンおよび／または因子Xaプロテアーゼ切断部位を導入して、クローニングした標的遺伝子産物をGST部分で放出できるように設計する。
昆虫系においては、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）を外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウイルスはSpodoptera frugiperda細胞内で増殖する。タンパク質コード配列を個々に、ウイルスの非必須領域（例えば、多角体遺伝子）にクローニングし、AcNPVプロモーター（例えば、多角体プロモーター）の制御下に置く。
哺乳動物宿主細胞においては、いくつものウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のコード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列とライゲートすることができる。このキメラ遺伝子を次いでアデノウイルスゲノムに、in vitroまたはin vivo組換えにより挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域ElまたはE3）中に挿入すると、生存可能でかつ感染した宿主において抗体分子を発現することができる組換えウイルスを得るであろう（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)を参照）。特定の開始シグナルも、挿入した抗体コード配列を効率的に翻訳するために必要であろう。これらのシグナルには、ATG開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは一般的に、全インサートの翻訳を保証するための所望のコード配列の読み枠とインフレームでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源、天然および合成の両方であってよい。発現の効率は適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの封入により増強することができる（例えば、Bittner et al., Methods in Enzymol., 153:51-544(1987)を参照）。
安定な発現を利用して組換えタンパク質を長期間、高収率生産することができる。例えば、安定してタンパク質分子を発現する細胞株を作成することができる。宿主細胞を、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカー遺伝子を含む適当に遺伝子操作で作ったベクターを用いて形質転換することができる。外来DNAの導入後、細胞を濃縮培地中で1〜2日間増殖させ、次いで選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を与え、プラスミドをその染色体中に安定して組み込んだ細胞が増殖しかつ細胞巣を形成し、次いでクローニングされ、細胞株中に拡大することを可能にする。本発明の抗体をコードするプラスミドを用いて、その遺伝子／cDNAを培養で生産するのに好適な任意の細胞株中に導入することができる。
いくつもの選択系を用いることができて、それには、限定されるものでないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシル・トランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202 (1992)）およびアデニンホスホリボシル・トランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell, 22:8-17 (1980)）が含まれ、それらの遺伝子はそれぞれtk-、hgprt-またはaprT-細胞において利用することができる。また、代謝拮抗薬耐性を、次の遺伝子の選択の基礎として用いることができる：メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr（Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980)；O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)）；アミノグリコシド G-418に対する耐性を与えるneo（Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；およびMay, TIB TECH 11(5):l55-2 15 (1993)）；ならびにハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro（Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)）。当技術分野で公知の組換えDNA技法の方法を日常的手法に応用して所望の組換えクローンを選択することができ、かかる方法は例えば、参照により本明細書にその全てが組み入れられる、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)の第12および13章；ならびにColberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150:1に記載されている。
いったん本発明の抗体が組換え発現により生産されると、それを任意の当技術分野で公知の免疫グロブリン分子を精製する方法、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、特に特異的抗原プロテインAまたはプロテインGに対するアフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差溶解度により、またはタンパク質を精製する任意の他の標準技法により精製することができる。さらに、本発明のタンパク質またはその断片を、本明細書に記載のまたはさもなくば当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合して精製を容易にすることができる。
抗体のスケーラブル生産
大量生産するために、本発明の抗体をスケーラブルプロセス（scalable process）（生産可能な規模のプロセスを意味し、本明細書では以後「本発明のスケーラブルプロセス」と呼ぶ）により生産することができる。いくつかの実施形態においては、抗体を本発明のスケーラブルプロセスにより研究室で生産して、本発明の抗体を分析規模バイオリアクター（例えば、限定されるものでないが、5L、10L、15L、30L、または50Lバイオリアクター）で生産することができる。他の実施形態においては、本抗体を本発明のスケーラブルプロセスにより研究室で生産して、本発明の抗体を生産規模バイオリアクター（例えば、限定されるものでないが、75L、100L、150L、300L、または500Lバイオリアクター）で生産することができる。いくつかの実施形態において、本発明のスケーラブルプロセスは、研究室で行う生産プロセスと比較して、少ししかまたは全く生産効率の低下をもたらさない。他の実施形態において、本発明のスケーラブルプロセスは約10mg/L、約20m/L、約30mg/L、約50mg/L、約75mg/L、約100mg/L、約125mg/L、約150mg/L、約175mg/L、約200mg/L、約250mg/L、または約300mg/Lまたはそれ以上の生産効率で抗体を生産する。
他の実施形態において、本発明のスケーラブルプロセスは少なくとも約10mg/L、少なくとも約20m/L、少なくとも約30mg/L、少なくとも約50mg/L、少なくとも約75mg/L、少なくとも約100mg/L、少なくとも約125mg/L、少なくとも約150mg/L、少なくとも約175mg/L、少なくとも約200mg/L、少なくとも約250mg/L、または少なくとも約300mg/Lまたはそれ以上の生産効率で抗体を生産する。
他の実施形態において、本発明のスケーラブルプロセスは生産効率10mg/L〜300mg/L、10mg/L〜250mg/L、10mg/L〜200mg/L、10mg/L〜175mg/L、10mg/L〜150mg/L、10mg/L〜100mg/L、20mg/L〜300mg/L、20mg/L〜250mg/L、20mg/L〜200mg/L、from20mg/Lto約175mg/L、20mg/L〜150mg/L、20mg/L〜125mg/L、20mg/L〜100mg/L、30mg/L〜300mg/L、30mg/L〜250mg/L、30mg/L〜200mg/L、30mg/L〜175mg/L、30mg/L〜150mg/L、30mg/L〜125mg/L、30mg/L〜100mg/L、50mg/L〜300mg/L、50mg/L〜250mg/L、50mg/L〜200mg/L、from50mg/Lto約175mg/L、50mg/L〜150mg/L、50mg/L〜125mg/L、または50mg/L〜100mg/Lで抗体を生産する。
一実施形態において、本発明の抗体は安定性の増加および／または生産効率の増強を表す。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体3.19.3が表す生産効率の少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍の生産効率を表す。
抗体精製と単離
組換え技法を用いる場合、本発明の抗体を細胞内で生産し、周辺質に、または直接培地中に分泌することができる。もし細胞内で生産すれば、第1ステップとして、宿主細胞または溶解断片のいずれかである微粒子デブリスを、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)は、大腸菌の周辺質空間中に分泌された抗体を単離する手順を記載している。簡単に説明すると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（pH3.5）、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）の存在のもとで約30分間にわたって解凍する。細胞デブリスは遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、かかる発現系からの上清を一般的には、最初に市販タンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼインヒビターを先行するステップのいずれかで含ませてタンパク質分解を阻害してもよいし、また抗生物質を含ませて外来汚染物の増殖を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、および／またはアフィニティクロマトグラフィを単独でまたは他の精製ステップとの組み合わせて使用し、精製することができる。プロテインAのアフィニティリガンドとしての適性は、抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンFcの種およびアイソタイプに依存する。プロテインAを用いて、ヒトγ1、γ2、またはγ4の重鎖に基づく抗体を精製することができる（Lindmark et al., J. Immunol. Methods, 62:1-13 (1983)）。プロテインGは全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ3に対して推奨されている（Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)）。アフィニティリガンドを結合させるマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、制御された細孔ガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンは、アガロースで達成しうるものより、速い流速と短いプロセシング時間を可能にする。本発明のタンパク質がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABX樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製にとって有用である。タンパク質を精製する他の技法、例えばイオン交換カラム上の分取、エタノール沈降、逆相HPLC、シリカ上のクロマトグラフィ、ヘパリン上のクロマトグラフィ、アニオンまたはカチオン交換樹脂上のセファロースクロマトグラフィ（例えばポリアスパラギン酸カラム）、等電点電気泳動、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈降も、回収する抗体に応じて利用可能である。
いずれかの予備精製ステップの後、目的の抗体と汚染物を含む混合物を、溶出バッファーを用いて、pH約2.5〜4.5、および低塩濃度（例えば、約0〜0.25M塩）にて行う低pH疎水性相互作用クロマトグラフィで処理してもよい。
組換えタンパク質単離と精製は、目的のタンパク質の物理的特徴、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親和性などを利用する多数の当技術分野で容認された技法により実施することができる。一実施形態においては、本発明のタンパク質を当技術分野で公知の単離／精製法、例えばサイズ排除クロマトグラフィ、イオン-交換クロマトグラフィ、およびアフィニティクロマトグラフィで処理する。他の実施形態においては、本発明のタンパク質をプロテインAアフィニティクロマトグラフィを通して精製する。
他の実施形態においては、本発明のタンパク質を、タンパク質内の1以上の結合特異性を利用してアフィニティクロマトグラフィを通して精製する。
本発明の抗体の安定性を保証するために、好適ないくつかのアッセイが開発されている。一実施形態において、本発明のタンパク質の安定性は当技術分野で公知の技法により特徴付けられる。他の実施形態において、本発明のタンパク質の安定性を凝集および／または断片化速度またはプロファイルにより評価することができる。凝集または断片化のレベルを決定するために、多数の技法を用いることができる。一実施形態においては、凝集および／または断片化プロファイルを、分析用超遠心分離（AUC）、サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）、高性能サイズ排除クロマトグラフィ（HPSEC）、融点（Tm）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、キャピラリーゲル電気泳動（CGE）、光散乱（SLS）、フーリエ変換赤外分光計（FTIR）、円二色性（CD）、尿素で誘導するタンパク質アンフォールディング技法、内因性トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定、または1-アニリノ-8-ナフタレンスルホン酸（ANS）タンパク質結合技法の使用により評価することができる。他の実施形態においては、本発明のタンパク質の安定性をポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）分析により特徴付ける。他の実施形態においては、本発明のタンパク質の安定性をサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）プロファイル分析により特徴付ける。
安定性の他の尺度はタンパク質が表すプロテアーゼ分解に対する相対的耐性である。一実施形態においては、本発明のタンパク質の安定性をプロテアーゼ耐性アッセイにより特徴付ける。一実施形態において、プロテアーゼ耐性アッセイに利用するプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタルプロテアーゼ、またはグルタミン酸プロテアーゼである。一実施形態においては、本発明のタンパク質をプロテアーゼ耐性アッセイで処理し、この場合、プロテアーゼはトリプシン、キモトリプシン、カテプシンB、D、L、またはG、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、HIV-1プロテアーゼ、キモシン、レニン、プラスメプシン、プラスミン、カルボキシペプチダーゼE、カスパーゼ1-10、またはカルパインである。他の実施形態において、本発明のタンパク質は低いレベルのプロテアーゼ分解を表す。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、選択したプロテアーゼに対する標準条件下のプロテアーゼによるインキュベーションの後に、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%またはそれ以上のタンパク質が残存するプロテアーゼ耐性を表す。
本発明はまた、本発明の抗体の結合を試験する方法を提供する。抗体の結合特異性は、多数の色々な当技術分野で容認された技法、例えばファージディスプレイおよび他のELISAに基づく技法により評価することができる。一実施形態において、本発明の抗体の結合特異性は、任意の当技術分野で周知の技法により試験することができる。他の実施形態において、本発明の抗体は本明細書に提示した任意の技法により分析することができる。他の実施形態において、本発明の抗体の結合特異性は、ELISAに基づくアッセイにより試験することができる。
抗体製剤の安定性と凝集をモニタリングする方法
タンパク質製剤の安定性を評価するために利用できる様々な方法があり、それらはタンパク質の物理的および化学的構造ならびに生物学的活性に基づく。例えば、タンパク質の変性を研究するためには、電荷移動吸収、熱分析、蛍光分光測定、円二色性、NMR、rCGE（還元キャピラリーゲル電気泳動）およびHPSEC（高性能サイズ排除クロマトグラフィ）などの方法を利用することができる（例えば、Wang et al., 1988, J. of Parenteral Science & Technology 42(Suppl):S4-S26を参照）。
rCGEとHPSECはタンパク質凝集物の形成、タンパク質分解、およびタンパク質断片化を評価するための最も通常のかつ最も簡単な方法である。従って、本発明の液製剤の安定性をこれらの方法により評価することができる。
本発明の液製剤は本発明の抗体を含み、HPSECまたはrCGEで測定して低ないし不検出レベルの凝集、すなわち、重量タンパク質基準で5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、または 0.5%以下の凝集を示し、かつ低ないし不検出レベルの断片化、すなわち、無傷の抗体を表すピークが80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、または99％以上、または99.5％以上の合計ピーク面積を示す。抗体製剤はしばしば約1〜100mg/mlの濃度の抗体を含み、適当な賦形剤を伴う。これらの抗体製剤を、製剤後1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、または45日またはそれ以上に凝集レベルを分析してもよい。また、安定性研究においては、しばしば抗体製剤を2〜4℃、10〜15℃、22〜27℃、30〜37℃、または40〜42℃でインキュベートして凝集速度を評価する。SDS-PAGEの場合、染色したまたは放射性同位体で標識した各バンドの密度または放射能を測定してもよいし、また非分解の本発明の抗体を表すバンドの％密度または％放射能を求めてもよい。
一実施形態において、本発明の抗体は抗体3.19.3より低い凝集速度を示す。
一実施形態において、本発明の抗体は、類似の実験条件下で評価した抗体3.19.3が示す凝集速度より少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％低い凝集速度を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、実施例2で概説した実験条件により測定して、少なくとも25％、少なくとも20％、少なくとも15％、少なくとも10％、少なくとも5％、少なくとも2％、少なくとも1％、または少なくとも0.5％の凝集速度を示す。
本発明の液製剤の安定性はまた、製剤中の抗体の生物学的活性を測定する任意のアッセイにより評価することができる。抗体の生物学的活性には、限定されるものでないが、抗原結合活性、補体活性化活性、Fc-受容体結合活性、受容体／リガンド中和化活性、受容体アゴニスト機能またはアンタゴニスト機能などが含まれる。抗体の抗原結合活性は、当技術分野で公知の任意の方法により測定することができ、かかる方法には、限定されるものでないが、ELISA、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットなど（また、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、2nd ed. 1988（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）も参照）が含まれる。本発明の液体抗体製剤の純度は当業者に周知の任意の方法、例えばHPSECにより測定することができる。液体抗体製剤の滅菌性は以下の通り評価することができる：試験液体抗体製剤を、滅菌大豆カゼイン消化培地および液体チオグリコレート培地に公称孔径0.45μmの滅菌フィルターで液体製剤を濾過することにより接種する。Sterisure(登録商標)またはSteritest(商標)の方法を用いる場合、各フィルターデバイスを滅菌大豆カゼイン消化培地または液体チオグリコレート培地の100mlで無菌的に満たす。通常の方法を用いる場合、チャレンジしたフィルターを大豆カゼイン消化培地または液体チオグリコレート培地100mlに無菌的に移す。該培地を適当な温度でインキュベートし、14日間にわたって3回観察し、細菌または真菌の増殖の確証を調べる。
抗体を使用する方法
さらに、本発明の実施形態は、疾患を治療するためにこれらの抗体を使用する方法を含む。抗Ang-2抗体は、Ang-2介在性Tie2シグナル伝達を防止し、それにより血管新生を阻害するために有用である。
この阻害の作用機構は、Ang-2/Ang-1の受容体Tie2との結合の阻害；Ang-2/Ang-1誘導性Tie2シグナル伝達；Ang-2/Ang1が介在するTie-2のリン酸化の阻害；またはAng-2のクリアランスの増強、それによるAng-2のTie2と結合する有効濃度の低下を含みうる。
他の実施形態において、本発明の抗体は循環中のAng-2/Ang-1レベルの低下を介して作用しうる。
この阻害機構を介して治療可能である疾患には、限定されるものでないが、新生物疾患、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽細胞腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌および腫瘍が含まれる。
本発明の他の実施形態は、生体サンプル中のAng-2の量を具体的に決定する診断アッセイを含む。アッセイキットは、抗Ang-2抗体ならびにかかる抗体を検出するために必要な標識を含む。これらの診断アッセイは血管新生に関係する疾患をスクリーニングするのに有用であり、前記疾患には、限定されるものでないが、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽細胞腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、および膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌腫が含まれる。
本発明の他の態様によれば、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストであって、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2と結合する前記アンタゴニストが提供される。
本発明の他の態様によれば、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストであって、化合物でない前記アンタゴニストが提供される。
一実施形態においては、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストであって、アンジオポエチン-1アンタゴニスト活性とアンジオポエチン-2アンタゴニスト活性が1つの分子内に含まれる前記アンタゴニストが提供される。代わりの実施形態においては、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストであって、アンジオポエチン-1アンタゴニスト活性およびアンジオポエチン-2アンタゴニスト活性が1以上の分子内に含まれる前記アンタゴニストが提供される。
一実施形態においては、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストであって、
I Tie-2受容体；
II アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2；
III Tie-2受容体-アンジオポエチン-1複合体；または
IV Tie-2受容体-アンジオポエチン-2複合体、
V またはこれらの任意の組合わせ
と結合することができる前記アンタゴニストが提供される。
一実施形態においては、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストは、アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2および／またはTie-2と結合し、それによりアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2介在性Tie-2シグナル伝達を阻止し、それにより血管新生を阻害することができる。この阻害作用の機構は、
I. アンタゴニストのアンジオポエチン-1との結合およびアンジオポエチン-1のその受容体Tie-2との結合の阻害、および／または
II. アンタゴニストのアンジオポエチン-2との結合およびアンジオポエチン-2のその受容体Tie-2との結合の阻害、および／または
III. アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2のクリアランスの増強、それによりTie2と結合するために利用可能なアンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2の有効濃度の低下、
IV. または、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たすために十分な、これらの項の任意の組合わせ
を含みうる。
理論的考察により束縛されるのを欲することなく、アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす機構には、限定されるものでないが、アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2の受容体Tie-2との結合の阻害、アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2誘導性Tie-2シグナル伝達の阻害、アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2介在性Tie-2リン酸化の低下、またはアンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2のクリアランスの増加、それによるアンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2の有効濃度の低下が含まれる。
本発明の他の態様によれば、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす方法であって、本明細書の上記アンタゴニストを投与するステップを含むものである前記方法が提供される。本方法は、疾患に関係する血管新生を治療する必要のある動物を選択するステップ、および前記動物にアンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストの治療上有効な量を投与するステップを含みうる。
本発明の他の態様によれば、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす方法であって、本明細書の上記抗体を投与するステップを含むものである前記方法が提供される。本方法は、疾患に関係する血管新生を治療する必要のある被験者を選択するステップ、および前記被験者にアンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす抗体の治療上有効な量を投与するステップを含みうる。
本発明の他の態様によれば、哺乳動物の疾患に関係する血管新生を治療する方法であって、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストの治療上有効な量を投与するステップを含むものである前記方法が提供される。本方法は、疾患に関係する血管新生を治療する必要のある被験者を選択するステップ、および前記被験者にアンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストの治療上有効な量を投与するステップを含みうる。
本発明の他の態様によれば、被験者の疾患に関係する血管新生を治療する方法であって、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす抗体の治療上有効な量を投与するステップを含むものである前記方法が提供される。本方法は、疾患に関係する血管新生を治療する必要のある被験者を選択するステップ、および前記被験者にアンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす抗体の治療上有効な量を投与するステップを含みうる。
抗体は単独で投与してもよいし、または、さらなる抗体または化学療法、生物学的療法／免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または外科と組合わせて投与してもよい。
他の態様によれば、哺乳動物の癌を治療する方法であって、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストの治療上有効な量を投与するステップを含むものである前記方法が提供される。前記方法は、癌を治療する必要のある動物を選択するステップ、および前記動物にアンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たすアンタゴニストの治療上有効な量を投与するステップを含みうる。アンタゴニストは単独で投与してもよいし、または、さらなる抗体または化学療法、生物学的療法／免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または外科と組合わせて投与してもよい。
本発明の他の態様によれば、疾患に関係する血管新生の治療用医薬品を製造するための本発明の抗体の使用が提供される。
本発明の他の態様によれば、疾患に関係する血管新生の治療用医薬品を製造するための、アンジオポエチン-1とアンジオポエチン-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす抗体の使用が提供される。
一実施形態において、単独でまたは部分的にTie2受容体に依存する腫瘍を患う患者において、本発明はアンジオポエチン-1またはアンジオポエチン-2にアンタゴニスト作用を果たす上での使用に特に好適である。
本発明はまた、抗体を用いて、癌またはその症候群を改善し、治療し、または予防する方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、頭部、頚部、眼、口、咽頭、食道、胸部、皮膚、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、胃、脾臓、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性黒色腫、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳、または中枢神経系の癌を治療する上で有用である。本発明の方法によって予防、管理、治療または改善することができる癌の例には、限定されるものでないが、頭部、頚部、眼、口、咽頭、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌が含まれる。さらなる癌には、特に限定されないが以下がある：白血病、例えば特に限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば、骨髄芽球性、前骨髄芽球性、骨髄性単球性、単球性、赤血白血病、骨髄異形成症候群、慢性白血病、例えば、限定されないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞性白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫、例えば限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば特に限定されないが、スモルダリング多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫；ワルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明のモノクローナル免疫グロブリン異常症；良性モノクローナル免疫グロブリン異常症；重鎖病；骨癌および結合組織肉腫、例えば特に限定されないが、骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、コレステリン腫に誘導される骨肉腫、骨のパジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨大細胞腫瘍、骨の繊維肉腫、脊索腫、骨膜性肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（血管内皮腫）、繊維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫；脳腫瘍、例えば特に限定されないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起神経膠芽細胞腫、非神経膠腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、および原発性脳リンパ腫；乳癌、例えば、特に限定されないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、分泌管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭乳癌、ページェット病（若年性ページェット病を含む）、および炎症性乳癌；副腎癌、例えば特に限定されないが、クロム親和性細胞腫、副腎皮質癌；甲状腺癌、例えば、特に限定されないが、乳頭状または瀘胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌；膵臓癌、例えば特に限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍；下垂体癌、例えば特に限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症および尿崩症；眼の癌、例えば特に限定されないが、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫および毛様体黒色腫などの眼球黒色腫、ならびに網膜芽細胞腫；膣癌、例えば扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫；外陰癌、例えば扁平上皮細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびページェット病；子宮頚癌、例えば特に限定されないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌；子宮癌、例えば特に限定されないが、子宮内膜癌および子宮肉腫；卵巣癌、例えば特に限定されないが、卵巣上皮癌、境界腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質性腫瘍；食道癌、例えば特に限定されないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、例えば特に限定されないが、腺癌、腫瘤形成性（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、びまん拡散性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、繊維肉腫、および癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、例えば特に限定されないが、肝細胞癌、および肝芽細胞腫、胆嚢癌、例えば腺癌；胆管癌、例えば特に限定されないが、乳頭状、結節性、およびびまん性；肺癌、例えば非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌、および小細胞肺癌；精巣癌、例えば特に限定されないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞、非精上皮腫、胎児性癌、奇形癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌、例えば特に限定されないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫；陰茎癌；口腔癌、例えば特に限定されないが、扁平上皮細胞癌；基底癌；唾液腺癌、例えば特に限定されないが、腺癌、粘液性類表皮癌、および腺様嚢胞癌；咽頭癌、例えば特に限定されないが扁平上皮細胞癌、およびいぼ状癌；皮膚癌、例えば特に限定されないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌および黒色腫、表在拡大型、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端性ほくろ性黒色腫；腎臓癌、例えば特に限定されないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂および/または子宮）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、例えば特に限定されないが、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫。さらに癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌および乳頭状腺癌が含まれる(このような障害の総説については、Fishman et al., Medicine, 2d Ed, 1985, J.B. Lippincott Co., Philadelphia、およびMurphy et al., Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, 1997年, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照)。またアポトーシスの異常により引き起こされる癌も、本発明の方法および組成物により治療できると考えられる。かかる癌としては、特に限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、p53変異を有する癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに前癌病変、例えば、家族性腺腫様ポリープおよび骨髄異形成症候群がある。
本発明はまた、抗体を使用して細胞集団を枯渇する方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、次の細胞型の枯渇に有用である：好酸球、好塩基球、好中球、T細胞、B細胞、肥満細胞、単球、内皮細胞および腫瘍細胞。腫瘍細胞は本明細書に記載の癌障害のいずれかから誘導される細胞であってもよい。
前記を含む本発明の抗体および組成物は、多くの目的にとって、例えば、広範囲の慢性および急性疾患および障害に対する治療薬として有用であり、前記疾患および障害には、限定されるものでないが、自己免疫性および／または炎症性障害、すなわち、シェーグレン症候、慢性関節リウマチ、狼蒼乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢に関係する黄斑変性症、新生血管緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーヴズ病）、角膜および他の組織移植、および慢性炎症、敗血症、慢性関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流傷害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、器官虚血、再灌流傷害、脊椎損傷および同種移植片拒絶が含まれる。自己免疫性および／または炎症性障害の他の例には、限定されるものでないが、限局性脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候、自己免疫性アジソン病、副腎腺の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および睾丸炎、シェーグレン症候、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢に関係する黄斑変性症、新生血管緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーヴズ病を含む）、角膜および他の組織移植、および慢性炎症、敗血症、慢性関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流傷害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、器官虚血、再灌流傷害、脊椎損傷および同種移植片拒絶、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ‐ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素疾患、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛−繊維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ疾患、ギヤン‐バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少症紫斑病（ITP）、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエル病、混合結合組織疾患、多発性硬化症、1型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候、多発性リウマチ性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば皮膚炎ヘルペス状血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症が含まれる。炎症性障害の例には、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化の脊椎関節症、未分化の関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が含まれる。
一実施形態において、疾患に関係する血管新生は骨および関節疾患、例えば、限定されるものでないが、原発性または二次性両方の骨関節炎/骨関節症、例えば、先天性臀部異形成；頚部および腰椎脊椎炎、および腰部および頚部疼痛；慢性関節リウマチおよびスティル病；血清陰性脊髄関節症（強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎および未分化の脊髄関節症を含む）；敗血性関節炎および他の感染が関係する関節症および骨障害、例えば結核（ポッツ病およびポンセ（Poncet's）症候を含む）；急性および慢性結晶誘導性滑膜炎（尿酸痛風、ピロリン酸カルシウム堆積病、およびカルシウムアパタイトに関係する腱、嚢および滑膜炎症を含む）；ベーチェット病；原発性および二次シェーグレン症候；全身硬化症および限定した強皮症；全身性エリテマトーデス、混合結合性組織疾患、および未分化の結合組織疾患；皮膚筋炎および多発性筋炎を含む炎症性筋障害；リウマチ性多発筋痛症；若年性関節炎（関節分布および関連症候を問わない特発性炎症性関節炎およびリウマチ熱を含む）、およびその全身性複合症；血管炎（巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、チャーグ‐ストラウス症候群、結節性多発性動脈炎、顕微的多発性動脈炎、およびウイルス感染、過敏性反応、クリオグロブリン、およびパラプロテインに関連する血管炎を含む）；腰部疼痛；家族性地中海熱、マックル‐ウェルズ症候群、および家族性ヒベルニアン熱、菊池病；薬物誘導性関節痛、腱炎、および筋障害；傷害［例えばスポーツ傷害］または疾患による疼痛および筋骨格の障害の結合組織再造形：例えば関節痛（例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、痛風または結晶関節症）、他の関節疾患（例えば、椎間板変性または側頭下顎の関節変性）、骨再造形疾患（例えば骨粗鬆症、パジェット疾患または骨壊死）、多発性軟骨炎、強皮症、反応性関節炎、多発性軟骨炎、混合結合組織障害、脊髄関節症または歯周疾患（例えば、歯周病）であってもよい。
一実施形態において、疾患に関係する血管新生は炎症性関節炎グループの疾患の1つから選択されてもよく、前記疾患には血清陰性関節炎、血清陽性関節炎、他の関節症に関係する関節炎、骨関節炎または全身性エリテマトーデス（SLE）が含まれる。他の実施形態において、疾患に関係する血管新生は慢性関節リウマチ、血清陰性脊椎関節症、他の関節症に関係する関節炎またはSLEであってもよい。一実施形態において、血清陰性脊椎関節症は強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎または炎症性腸障害に関係する関節症から選択される。特定の実施形態において、疾患に関係する血管新生は慢性関節リウマチである。他の特定の実施形態において、疾患に関係する血管新生は骨関節炎である。
いくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて疾患に関係する血管新生を低減または阻害することができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、疾患に関係する血管新生を、元来の疾患に関係する血管新生の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％だけ低減または阻害する。他の実施形態において、本発明の方法は、疾患に関係する血管新生を、治療前の疾患に関係する血管新生の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％だけ低減または阻害する。いくつかの実施形態において、血管新生の低下は本明細書の実施例で提示した方法により、または当技術分野で公知の他の方法により測定することができる。
特定の実施形態において、血管新生の低下は生検サンプルの染色によりまたは組織中のFITC-デキストラン蓄積により測定することができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の方法を用いて血管新生因子が介在する血管新生を低減または阻害することができる。かかる因子には、限定されるものでないが、FGF、FGF2、VEGF（および様々なそれらのアイソタイプ）、PDGF、TGF-β、エンドグリン、MCP-1、およびエフリンが含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は血管新生因子介在性血管新生を、治療が存在しない場合の介在性血管新生のレベルの少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％だけ低減または阻害する。特定の実施形態において、本発明の方法はFGF、FGF2、VEGF（およびそれらの様々なアイソタイプ）、PDGF、TGF-β、エンドグリン、MCP-1、およびエフリンからなる群より選択される1以上の血管新生因子により誘導される血管新生を低減する。
特定の実施形態においては、本発明の方法を用いてFGF2介在性血管新生を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、本発明の方法はFGF2介在性血管新生を、対照FGF2介在性血管新生サンプルのレベルの少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％だけ低減または阻害する。
いくつかの実施形態において、本発明の方法を用いて、疾患に関係する血管新生に関連する症候群を低減または阻害することができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は疾患に関係する血管新生に関連する症候群を、元来の疾患に関係する血管新生に関連する症候群の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％だけ低減または阻害する。他の実施形態において、本発明の方法は疾患に関係する血管新生を、治療前の疾患に関係する血管新生に関連する症候群の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％だけ低減または阻害する。かかる症候群には、腫脹、炎症、熱、疼痛、浮腫、胸膜 浸出、貧血、倦怠感、朝の硬直、低い体重、乏しい循環、肢の知覚麻痺などが含まれる。
他の実施形態においては、本発明の方法を用いて疾患に関係する血管新生を維持することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の方法を用いて疾患に関係する血管新生を予防することができる。
本発明の組成物および方法を、上記疾患を予防、管理または治療するために用いる1以上の慣用の療法と共に用いることができる。
一実施形態において、本発明は、動物の前癌状態からの癌の発達を防止する方法を提供する。前癌状態はin situ（癌の場所における）異形成、過形成または癌であってもよい。
他の実施形態において、本発明は動物の癌の症候群を治療、予防、改善または管理する方法を提供する。癌の症候群は癌の性質および進行状態に応じて大きく変わる。いくつかの癌の型に関連する症候群には、次が含まれうる：膀胱癌：尿中血、排尿時の疼痛または灼熱痛；頻尿；または濁尿；骨癌：患部周囲の骨または腫脹の疼痛；骨折；脱力感、疲労；体重減少；感染の繰り返し；吐気、嘔吐、便秘、排尿に伴う問題；脚の脱力感または知覚麻痺；持続するこぶおよび挫傷；脳癌：めまい；眠気；異常な眼運動または視力の変化；脱力感、腕または脚の感覚喪失または歩行の困難；発作または痙攣；性格、記憶または話しぶりの変化；朝に悪くなり日中は楽になりがちな吐気または嘔吐を伴う頭痛；乳癌：乳房の塊または肥厚；乳頭からの漏出；乳房の皮膚の変化；熱の感覚；または腕下のリンパ節の拡大；結腸直腸癌：直腸出血（糞便中の赤血または黒い糞便）；腹部痙攣；交互の便秘と下痢；体重減少；食欲不振；脱力感；青ざめた顔付き；腎臓癌：尿中の血；背および横腹の鈍痛または疼痛；時々高血圧また赤血球数の異常を伴う、腎領域の塊；白血病：虚弱、蒼白；熱およびインフルエンザ様症候群；打撲と出血の持続；リンパ節、脾臓、肝臓の肥大；骨および関節の疼痛；頻繁な感染；体重減少；寝汗；肺癌：ゼーゼーと息を切らすこと、数か月持続する咳；血痰；胸部の持続痛；肺の鬱血；頚部のリンパ節肥大；黒色腫；皮膚上の母斑または他のこぶの変化（出血またはサイズ、形状、色、または生地の変化を含む）；非-ホジキンリンパ腫：頚部、腋下、または鼠径部のリンパ節の痛みの無い腫脹；持続する発熱；疲労感；原因不明の体重減少；かゆい皮膚および発疹；皮膚の小塊；骨疼痛；腹部の腫脹；肝臓または脾臓肥大；口腔癌：2週間以内に治癒しない口腔内の塊、唇、舌または口腔内部の潰瘍形成；適合しなくなった義歯； 口腔疼痛、出血、臭い口臭、緩んだ歯、および話しぶりの変化；卵巣癌：腹部腫脹；稀な場合として異常な膣出血；消化の不快感；膵臓癌：上腹部の疼痛および原因不明の体重減少；背中心部の疼痛；脂肪食に耐えられないこと；皮膚の黄色化；腹部の膨らみ；肝臓および脾臓の肥大；前立腺癌：尿道遮断による排尿困難；頻度の高い、とりわけ夜間に排尿必要感を生じる残尿膀胱；完全に空にならない膀胱；灼熱または疼痛を伴う排尿；血尿；膀胱全体の圧痛；および骨盤または背の鈍痛；胃癌：消化不良または胸焼け；腹部の不快感または疼痛；吐き気および嘔吐；下痢または便秘；食後の膨大感；食欲不振；脱力感および疲労；出血-嘔吐血液または糞便中の血液；子宮癌：異常な膣出血、閉経後の女性における水様排血；痛みのある排尿；性交中の疼痛；骨盤領域の疼痛。
他の実施形態において、本発明は癌の腫瘍退行を促進する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、元来の腫瘍サイズの少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％だけの腫瘍の退行に関わる。特定の実施形態において、本方法は血管新生の阻害による腫瘍の排除を含むものである。
細胞増殖速度は、当技術分野で公知の多数の手段、例えばチミジン組込み、DNA含量または細胞計数により分析することができる。他の実施形態において、本発明は腫瘍細胞増殖を阻害する方法を提供する。一実施形態において、本方法は腫瘍細胞増殖の低減を含む。他の実施形態において、本方法は、元来の腫瘍細胞増殖速度の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％だけの腫瘍細胞増殖の低減を含む。
他の実施形態において、本発明は悪性腫瘍細胞を枯渇する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本方法は原発性腫瘍に常在する腫瘍細胞を枯渇することを含む。他の実施形態において、本方法は循環中の腫瘍細胞を枯渇することを含む。
他の実施形態において、本方法は続発性部位における腫瘍細胞を枯渇することを含む。
他の実施形態において、本発明は癌腫瘍の血管新生を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は原発性腫瘍部位の血管新生の阻害を含む。他の実施形態において、本方法は続発性腫瘍部位の血管新生の阻害を含む。
本発明は、被験者における炎症性障害もしくは自己免疫性障害またはその1以上の症候群を予防、治療、管理または改善する方法であって、前記被験者に本発明の抗体を投与するステップを含むものである前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、被験者における炎症性障害もしくは炎症に関連する自己免疫性障害またはその1以上の症候群を予防、治療、管理または改善する方法であって、前記被験者に本発明の抗体および1以上のTNFαアンタゴニストを投与するステップを含むものである前記方法を提供する。さらなる実施形態において、少なくとも1つのTNF-αアンタゴニストは可溶性TNF-α受容体、例えばエタネルセプト（ENBREL(登録商標)；Immunex）またはその断片、誘導体または類似体、またはTNF-αと免疫特異的に結合する抗体、例えばインフリキシマブ（REMICADE(登録商標)；Centocor）またはアダリムマブ（HUMIRA(登録商標)；Abbott）またはそれらの誘導体、類似体または抗原-結合断片である。特定の実施形態においては、本発明の方法を予防または治療として実施する。
いくつかの実施形態において、本発明は、炎症性または自己免疫性障害に関連する少なくとも1つの症候を予防、治療、管理または改善する方法を提供する。かかる症候群には、貧血、腫脹、炎症、浮腫、発疹、関節の腫脹、骨滑膜過形成、滑膜炎、滑膜線維症、骨膜炎、または骨無機質密度（減少）が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明は炎症性または自己免疫性障害に関連する個体における少なくとも1つの症候を治療または管理する方法であって、治療しない個体における少なくとも1つの症候の重症度の、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％を超える症候の重症度の低下をもたらす前記方法を提供する。
組合わせ
本明細書に定義した抗血管新生治療は、単独療法として応用してもよいしまたは本発明の化合物に加えて、慣用の外科または放射線療法または化学療法を含んでもよい。かかる化学療法は、次のカテゴリーの1以上の抗腫瘍薬を含んでもよい：
(i)細胞分裂停止薬、例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよびシプロテロン酢酸塩）、LHRHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、プロゲストーゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼインヒビター（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエグゼメスタン）およびフィナステリドなどの5'レダクターゼのインヒビター；
(ii)癌細胞浸潤を阻害する薬剤（例えば、マリマスタットの様なメタロプロテイナーゼインヒビターおよびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能のインヒビター）；
(iii)成長因子機能のインヒビター、例えば、かかるインヒビターには成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば、抗ErbB2抗体トラスツズマブ［Herceptin(登録商標)］および抗ErbB1抗体セツキシマブ［C225］）、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビターおよびセリン／トレオニンキナーゼインヒビター、例えば上皮成長因子ファミリーのインヒビター（例えば、EGFRファミリーチロシンキナーゼインヒビター、例えば、N(3-クロロ4-フルオロフェニル)7-メトキシ6(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン4-アミン（ゲフィチニブ、AZD1839）、N(3-エチニルフェニル)6,7ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン4-アミン（エルロチニブ、OSI774）および6-アクリルアミドN(3-クロロ4-フルオロフェニル)7(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン4-アミン（CI1033））、例えば血小板由来の成長因子ファミリーのインヒビターおよび例えば肝細胞成長因子ファミリーのインヒビターが含まれる。
(iv)抗血管新生薬、例えば、血管内皮成長因子の効果を阻害するもの、（例えば抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（Avastin(登録商標)）、抗血管内皮成長因子受容体抗体、例えば、抗KDR抗体および抗flt1抗体、化合物、例えば、国際公開番号WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/3285、WO 98/13354、WO 00/47212およびWO 01/32651）に開示されているものおよび他の機構で作用する化合物（例えばリノマイド、インテグリンαvβ3機能およびアンジオスタチンのインヒビター）；
(v)血管障害薬、例えば、コンブレタスタチンA4および国際公開番号WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434 および WO 02/08213に開示されている化合物；
(vi)アンチセンス療法、例えば上に掲げた標的に関するもの、例えばISIS 2503、抗rasアンチセンス；
(vii)遺伝子治療手法：例えば、異常な遺伝子、例えば、異常なp53または異常なBRCA1またはBRCA2を置換える手法、GDEPT（遺伝子に依存する酵素プロ薬物療法）手法、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌のニトロレダクターゼ酵素を用いるもの、および化学療法または放射線療法に対する患者耐性を増加する手法、例えば、多剤耐性遺伝子治療；ならびに
(viii)免疫療法手法（例えば、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加するためのex vivoおよびin vivo手法を含む）、例えばサイトカイン、例えば、インターロイキン-2、インターロイキン-4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるトランスフェクション、T細胞アネルギーを減少する手法、トランスフェクトした免疫細胞、例えばサイトカイントランスフェクトした樹状細胞を用いる手法、サイトカイントランスフェクトした腫瘍細胞株を用いる手法、および抗イディオタイプの抗体を用いる手法。
本発明の一実施形態においては、本発明の抗血管新生治療を血管内皮成長因子（VEGF）の効果を阻害する薬剤（例えば抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（Avastin(登録商標)）、抗血管内皮成長因子受容体抗体、例えば抗KDR抗体および抗flt1抗体、化合物、例えば、国際公開番号WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/3285、WO 98/13354、WO 00/47212およびWO 01/32651）に開示されているものおよび他の機構で作用する化合物（例えばリノマイド、インテグリンαvβ3機能のインヒビターおよびアンジオスタチン）。本発明の他の実施形態においては、本発明の抗血管新生治療を、血管内皮成長因子受容体であるKDRのチロシンキナーゼ活性を阻害する薬剤（例えばAZD2171またはAZD6474）と組合わせる。AZD2171についてのさらなる詳細は、Wedge et al (2005) Cancer Research. 65(10):4389-400に見出すことができる。AZD6474についてのさらなる詳細は、Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cancer 92 Suppl 1：S6-13に見出すことができる。両開示物は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。本発明の他の実施形態においては、完全ヒト抗体3.19.3、3.3.2または5.88.3を単独でまたはAvastin(登録商標)、AZD2171またはAZD6474と組合わせる。
かかる併用治療は、個々の治療成分の同時、連続または別々の投与によって達成してもよい。かかる組合わせ製品は、本明細書で先に記載した用量範囲内の本発明の化合物または製薬上許容される塩および容認された用量範囲内のその他の製薬上の活性薬を使用する。
Ang2アンタゴニストと化学療法薬の組合わせ
本発明者らは、アンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニスト（限定されるものでないが、モノクローナル抗体3.19.3を含む）と化学治療薬のある特定の組合わせは、アンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストまたは化学治療薬の単独使用と比較して、腫瘍に対して有意に優れた効果をもたらすことを見出した。
従って、本発明の実施形態は、患者に抗癌効果を生じる方法であって、前記患者にアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストの治療上有効な量を、化学治療薬の有効量の前に、後にまたは同時に投与するステップを含むものである前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、抗癌効果を必要とする患者を選択するステップ、ならびにその患者にアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬の組合わせの治療上有効な用量を投与するステップを含むものである。
他の実施形態において、本発明の方法は患者における抗血管新生および／または血管透過性を低減する効果を生じる方法であって、前記患者にアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストの治療上有効な量を、化学治療薬の有効量の前に、後にまたは同時に投与するステップを含むものである。いくつかの実施形態において、本方法は、抗血管新生および／または血管透過性を低減する効果を必要とする患者を選択するステップ、ならびにその患者にアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬の組合わせの治療上有効な用量を投与するステップを含むものである。
他の実施形態において、本発明は患者の疾患に関係する血管新生を治療する方法であって、前記患者にアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびに化学治療薬の組合わせの治療上有効な用量を投与するステップを含むものである前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は疾患に関係する血管新生の治療を必要とする患者を選択するステップ、ならびにその患者にアンジオポエチン-2および／またはTie-2ののアンタゴニスト、ならびに化学治療薬の組合わせの治療上有効な用量を投与するステップを含むものである。
他の実施形態において、本発明は患者におけるアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす方法であって、それを必要とする前記患者にアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストの治療上有効な量を、化学治療薬の有効量の前に、後にまたは同時に投与するステップを含むものである。
本発明のさらなる態様によれば、かかる治療処理を必要とする患者に、アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニスト、またはその製薬上許容される塩の有効量の、任意に製薬上許容される賦形剤または担体と一緒の投与、ならびに化学治療薬またはその製薬上許容される塩の有効量との同時、連続または別々の投与を含む治療の方法であって、後者は任意に任意に製薬上許容される賦形剤または担体と一緒に投与してもよい前記方法が提供される。
一実施形態においてはアンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストは抗体である。さらなる実施形態において、アンジオポエチン-2のアンタゴニストはモノクローナル抗体である。なおさらなる実施形態において、アンジオポエチン-2のアンタゴニストは完全ヒトモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、完全ヒトモノクローナル抗体は、3.31.2、または5.16.3、または5.86.1、または5.88.3、または3.3.2、または5.103.1、または5.101.1、または3.19.3、または5.28.1、または5.78.3、MEDI1/5、MEDI2/5、MEDI3/5、MEDI6/5、またはMEDI4/5のいずれか1つから選択される。さらなる実施形態において、完全ヒトモノクローナル抗体は完全ヒトモノクローナル抗体：国際公開番号WO2006/068953に開示されている3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3またはAMG386（Amgen、国際公開番号WO200330833）のいずれか1つと同じエピトープと結合する。
他の実施形態において、アンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストはペプチボディ、例えば国際公開番号WO2003057134に開示されているペプチボディ（AMG386）である。
他の実施形態において、Tie-2の生物学的活性のアンタゴニストは抗体である。
さらなる実施形態において、Tie-2抗体はモノクローナル、ヒト化、または完全ヒト抗体である。
一実施形態において、化学治療薬は、アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファンおよびニトロソウレア）；抗代謝物（例えば葉酸代謝拮抗薬、例えば、5-フルオロウラシルの様なフルオロピリミジンおよびテガフール、ラルチトレキセド、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド（Alimta）、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシウレア、または、例えば、欧州特許出願番号562734に開示された抗代謝物の1つ、例えば、(2S)-2-{o-フルオロ-p-[N-(2,7-ジメチル-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-6-イルメチル)-N-(プロパ-2-イニル)アミノ]ベンズアミド}-4-(テトラゾール-5-イル)酪酸）；アルキル化剤と代謝拮抗薬を含む医薬組合わせ（例えばFolfox（フルオロウラシル（5FU）、ロイコボリンおよびオキサリプラチンの組合わせ））；抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン-C、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンなど）；抗有糸分裂薬（例えば、タキソイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンの様なビンカアルカロイドおよびタキソールおよびタキソテールなど）；トポイソメラーゼインヒビター（例えば、エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド、イリノテカン、アムサクリン、トポテカンおよびカンプトテシン）；またはプロテアソームインヒビター（例えば、ボルテゾミブ）を含む。一実施形態においては、さらにFolfocを含む本発明の組合わせを提供する。
他の実施形態において、化学治療薬はドセタキセル、および他の抗有糸分裂薬（例えば、ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンおよびタキソイド、例えばタキソールおよびタキソテール）；5-フルオロウラシル、ゲムシタビンおよび他の抗代謝物（例えば葉酸代謝拮抗薬、例えば、フルオロピリミジン、テガフール、ラルチトレキセド、カペシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド（Alimta）、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシウレア）；イリノテカンおよび他のトポイソメラーゼインヒビター（例えばエトポシドトポテカン、カンプトテシンテニポシド、およびアムサクリン）；オキサリプラチンおよび他のアルキル化剤またはDNA結合剤 （例えばシスプラチン、およびカルボプラチン）を含む。
一実施形態においては、さらにFolfocを含む本発明の組合わせを提供する。
他の実施形態において、化学治療薬はEg5インヒビター、例えばAZD4877を含む。
Ang2アンタゴニストとCSF1/CSFR1アンタゴニストの組合わせ
本発明はまた、アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストとCSF1Rおよび／またはCSF1の生物学的活性のアンタゴニストとを含む医薬品組合わせ、ならびにかかる組合わせの使用を提供する。
本発明の一態様によれば、アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストならびにCSF1Rおよび／またはCSF1の生物学的活性のアンタゴニストを含む医薬品組合わせが提供される。
一実施形態において、アンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストは抗体である。さらなる実施形態において、アンジオポエチン-2のアンタゴニストはモノクローナル抗体である。なおさらなる実施形態において、アンジオポエチン-2のアンタゴニストは完全ヒトモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、完全ヒトモノクローナル抗体は、3.31.2、または5.16.3、または5.86.1、または5.88.3、または3.3.2、または5.103.1、または5.101.1、または3.19.3、または5.28.1、または5.78.3、MEDI1/5、MEDI2/5、MEDI3/5、MEDI6/5、またはMEDI4/5のいずれか1つから選択される。さらなる実施形態において、完全ヒトモノクローナル抗体は完全ヒトモノクローナル抗体：国際公開番号WO2006/068953に開示されている3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3またはAMG386（Amgen、国際公開番号WO200330833）のいずれか1つと同じエピトープと結合する。
他の実施形態においては、Tie-2の生物学的活性のアンタゴニストが抗体である上記の医薬品組合わせを提供する。一実施形態において、アンタゴニストはモノクローナル抗体である。一実施形態において、アンタゴニストは完全ヒトモノクローナル抗体である。
他の実施形態においては、CSF1Rの生物学的活性のアンタゴニストが抗体である上記の医薬品組合わせを提供する。一実施形態において、アンタゴニストはモノクローナル抗体である。一実施形態において、アンタゴニストは完全ヒトモノクローナル抗体である。
他の実施形態においては、CSF1の生物学的活性のアンタゴニストが抗体である上記の医薬品組合わせを提供する。一実施形態において、アンタゴニストはモノクローナル抗体である。一実施形態において、アンタゴニストは完全ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態において、アンタゴニストはモノクローナル抗体PD-360324（Pfizer）である。一実施形態において、アンタゴニストは完全ヒトモノクローナル抗体である。
他の実施形態においては、CSFIRの生物学的活性のアンタゴニストが化合物またはその製薬上許容される塩である、上記の医薬組合わせを提供する。一実施形態において、アンタゴニストはチロシンキナーゼインヒビター、またはその製薬上許容される塩である。一実施形態において、チロシンキナーゼインヒビター、またはその製薬上許容される塩は、国際公開番号WO2004/004985、WO2007/119046、WO2008/056148またはWO2008/090353、ABT-869（Abbott）、Sutent（Pfizer）、KI-20227（Kirin Brewery）、CYC-10268（Cytopia）、YM-359445（Astellas Pharma）、PLX-647（Phenomix Corp./Plexxikon）、JNJ-27301937（Johnson & Johnson）、GW-2580（GlaxoSmithKline）に開示された化合物、または米国特許予備出願番号US05/0131022、US05/0113566、国際公開番号WO2004/096795、WO2005/009967、WO2006/047277、WO2006/047504またはWO2003/093238に開示された化合物のいずれかから選択される。
一実施形態において、チロシンキナーゼインヒビター、またはその製薬上許容される塩は、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる国際公開番号WO 2004/004985、WO 2007/119046、WO 2008/090353、WO 2008/056148、WO 2007/119046、WO 2007/071955に開示された化合物から選択される。
他の実施形態において、CSF1Rの生物学的活性のアンタゴニストは次のいずれか1つから選択される：
2-クロロ-N-ピリジン-3-イル-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-N-(5-フルオロピリジン-3-イル)-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-N-(5-フルオロピリジン-3-イル)-5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-ベンズアミド；
2-メチル-N-ピリジン-3-イル-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-シクロプロピルベンゾイル)アミノ]-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-[(3-クロロ-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-[(3-シクロプロピル-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-{[3-(1-シアノ-1-メチルエチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-クロロ-N-1,3-チアゾール-5-イル-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-N-1,3-チアゾール-5-イルベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3,5-ジメチルベンゾイル)アミノ]-N-1,3-チアゾール-5-イルベンズアミド；
5-{[3-(1-シアノ-1-メチルエチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-1,3-チアゾール-5-イルベンズアミド；
2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3,5-ジメチルベンゾイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-クロロ-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(5-{[3-(1-シアノ-1-メチルエチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチルベンゾイル)アミノ]-N-メチル-1,3-チアゾール-2-カルボキサミド；
5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-クロロ-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-シクロプロピル-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[3,4-ジクロロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-シクロプロピルベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3,5-ジメチルベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-メチル-5-[(3-メチルベンゾイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2,6-ジクロロ-N-(4-メチル-3-{[(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)アミノ]カルボニル}フェニル)イソニコチンアミド
2-メチル-5-{[(3-メチルシクロヘキシル)カルボニル]アミノ}-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)-5-(ペンタノイルアミノ)ベンズアミド；
2-メチル-5-[(4-メチルヘキサノイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,3-ジクロロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-5-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-イソプロピルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-5-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-(2-メトキシエトキシ)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-7-(2-メトキシエトキシ)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-5-メチルフェニル)アミノ]-7-(2-メトキシエトキシ)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-イソプロピルピペラジン-1-イル)-7-(2-メトキシエトキシ)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシキノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシキノリン-3-カルボキサミド；および
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシキノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチル-フェニル)アミノ]-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)シンノリン-3-カルボキサミド；
4-(2-フルオロ-4-メチルフェニルアミノ)-7-メトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)シンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)シンノリン-3-カルボキサミド；
6-[(3R,5S)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル]-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]シンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-6-[(3R,5S)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド塩酸塩；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-[1-(2-ヒドロキシエチル)ピペリジン-4-イル]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；および
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-{4-[(2R)-2-ヒドロキシプロパノイル]ピペラジン-1-イル}-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド
またはその製薬上許容される塩。
他の実施形態においては、CSF1の生物学的活性のアンタゴニストが化合物、またはその製薬上許容される塩である、上記の医薬品組合わせを提供する。
他の実施形態においては、アンジオポエチン-2の生物学的活性のアンタゴニストが化合物、またはその製薬上許容される塩である、上記の医薬品組合わせを提供する。
他の実施形態においては、Tie-2の生物学的活性のアンタゴニストが化合物、またはその製薬上許容される塩である、上記の医薬品組合わせを提供する。一実施形態において、アンタゴニストはチロシンキナーゼインヒビター、またはその製薬上許容される塩である。一実施形態において、チロシンキナーゼインヒビター、またはその製薬上許容される塩は、国際公開番号WO2004/013141、WO2004/058776、WO2005/060970またはWO2005/060969に開示された化合物のいずれかから選択されるか、またはGW697465X（GSK）、CP-547632（Pfizer）、CE-245677（Pfizer）もしくはCGI1631（Cellular Genomics）である。
本発明の他の態様においては、医薬品として使用する本発明の医薬品組合わせであって、同時に、連続してまたは別々に使用するためのアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニスト、ならびにCSF1Rおよび／またはCSF1の生物学的活性のアンタゴニストを含むものである前記医薬品組合わせを提供する。
本発明の他の態様においては、患者においてアンジオポエチン-2および／またはTie-2にアンタゴニスト作用を果たし、かつCSF1Rおよび／またはCSF1にアンタゴニスト作用を果たす方法であって、患者に本発明の医薬品組合わせまたは他の組成物の治療上有効な量を投与するステップを含むものである前記方法を提供する。一実施形態において、本方法はさらに、アンジオポエチン-2および／またはTie-2の阻害およびCSF1Rおよび／またはCSF1を必要とする患者を選択するステップ、ならびに患者に本明細書に記載の医薬品組合わせまたは他の医薬組成物の治療上有効な用量を投与するステップを含むものである。
一実施形態において本発明は、アンジオポエチン-2および／またはTie-2、およびCSF1Rおよび／またはCSF1に単独でまたは部分的に依存する腫瘍を患う患者において、アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性ならびにCSF1Rおよび／またはCSF1の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす上での使用に特に好適である。
一実施形態においては、本発明の方法または使用を、次の1以上の薬剤と共に、同時、連続または別々の投与方法により投与することができる：アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニスト、サイトカイン機能のアンタゴニスト（例えばサイトカインシグナル伝達経路に作用する薬剤、例えば、SOCS系のモジュレーター）、例えば、α-、β-、および／またはγ-インターフェロン；インスリン様成長因子I型（IGF-1）のモジュレーター、その受容体および関連する結合タンパク質；インターロイキン（IL）、例えば1種以上のIL-1〜33、および／またはインターロイキンアンタゴニストまたはインヒビター、例えばアナキンラ；インターロイキンファミリーメンバーの受容体のインヒビターまたはそのような受容体の特定サブユニットのインヒビター；腫瘍壊死因子α（TNF-α）インヒビター、例えば抗TNFモノクローナル抗体（例えばインフリキシマブ、アダリムマブおよび／またはCDP-870）および／またはTNF受容体アンタゴニスト、例えば免疫グロブリン分子（例えばエタネルセプト）および／または低分子量物質、例えばペントキシフィリン；B細胞のモジュレーター、例えばBリンパ球を標的にするモノクローナル抗体（例えばCD20（リツキシマブ）またはMRA-aILl6R）またはTリンパ球を標的にするもの（例えばCTLA4-Ig、HuMax Il-15またはアバタセプト）；破骨細胞活性を阻害するモジュレーター、例えばRANKLに対する抗体；ケモカインまたはケモカイン受容体機能のモジュレーター、例えばCCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10およびCCR11（C-Cファミリー）；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4およびCXCR5およびCXCR6（C-X-Cファミリー）およびCX3CR1（C-X3-Cファミリー）のアンタゴニスト；抗血管新生薬、例えば、血管内皮成長因子の効果を阻害するもの［例えば抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（Avastin(登録商標)）およびVEGF受容体チロシンキナーゼインヒビター、例えば、4-(4-ブロモ-2-フルオロアニリノ)-6-メトキシ-7-(1-メチルピペリジン-4-イルメトキシ)キナゾリン（ZD6474；WO 01/32651の実施例2）、4-(4-フルオロ-2-メチルインドール-5-イルオキシ)-6-メトキシ-7-(3-ピロリジン-1-イルプロポキシ)キナゾリン（AZD2171；WO 00/47212の実施例240）、バタラニブ （PTK787；WO 98/35985）およびSU11248（スニチニブ；WO 01/60814）、化合物、例えば、国際特許出願WO97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856、WO 98/13354、WO00/47212およびWO01/32651に開示されたもの、ならびに他の機構で作用する化合物（例えばリノマイド、インテグリンαvβ3機能およびアンジオスタチンのインヒビター）］またはコロニー刺激因子1（CSF1）またはCSF1受容体；マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のインヒビター、すなわち1以上のストロメライシン、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼならびにアグレカナーゼ、特にコラゲナーゼ-1（MMP-1）、コラゲナーゼ-2（MMP-8）、コラゲナーゼ-3（MMP-13）、ストロメライシン-1（MMP-3）、ストロメライシン-2（MMP-10）および／またはストロメライシン-3（MMP-11）および／またはMMP-9および／またはMMP-12のインヒビター、例えばドキシサイクリン等の薬剤；
ロイコトリエン生合成インヒビター、5-リポキシゲナーゼ（5-LO）インヒビターまたは5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（FLAP）アンタゴニスト、例えばジロイトン；ABT-761；フェンレウトン；テポキサリン；Abbott-79175；Abbott-85761；N-(5-置換)-チオフェン-2-アルキルスルホンアミド；2,6-ジ-tert-ブチルフェノールヒドラゾン；メトキシテトラヒドロピラン、例えばZeneca ZD-2138；化合物SB-210661；ピリジニル置換2-シアノナフタレン化合物、例えばL-739,010；2-シアノキノリン化合物、例えばL-746,530；インドールおよび／またはキノリン化合物、例えばMK-591、MK-886および／またはBAY x 1005；ロイコトリエン（LT）B4、LTC4、LTD4、およびLTE4の受容体アンタゴニストであって、フェノチアジン-3-1類、例えばL-651,392；アミジノ化合物、例えばCGS-25019c；ベンゾキサラミン、例えばオンタゾラスト；ベンゼンカルボキシミドアミド、例えばBIIL 284/260；および化合物、例えばザフィルルカスト、アブルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、ベルルカスト（MK-679）、RG-12525、Ro-245913、イラルカスト（CGP 45715A）およびBAY x 7195からなる群から選択されるもの；
ホスホジエステラーゼ（PDE）インヒビター、例えばメチルキサンタニン、例えばテオフィリンおよび／またはアミノフィリン；および／または選択的PDEアイソザイム阻害剤、例えばPDE4インヒビターおよび／またはアイソタイプPDE4Dのインヒビターおよび／またはPDE5のインヒビター；ヒスタミン1型受容体アンタゴニスト、例えばセチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、アクリバスチン、テルフェナジン、アステミゾール、アゼラスチン、レボカバスチン、クロルフェニラミン、プロメタジン、シクリジン、および／またはミゾラスチン（一般的に経口、局所または非経口で投与される）；プロトンポンプインヒビター（例えばオメプラゾール）または胃保護性ヒスタミン2型受容体アンタゴニスト；ヒスタミン4型受容体のアンタゴニスト；α-1/α-2アドレナリン受容体アゴニスト血管収縮性交感神経模倣薬、例えばプロピルヘキセドリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、シュードエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリンおよび塩酸エチルノルエピネフリン；抗コリン作動薬、例えばムスカリン受容体（M1、M2、およびM3）アンタゴニスト、例えばアトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウムブロミド、チオトロピウムブロミド、ピレンゼピンおよびテレンゼピン；β-アドレナリン受容体アゴニスト（β受容体サブタイプ1-4を含む）、例えばイソプレナリン、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、ビトルテロールメシレートおよび／またはピルブテロール、例えばそのキラルエナンチオマー；クロモン、例えばクロモグリク酸ナトリウムおよび／またはネドクロミルナトリウム；糖質コルチコイド、例えばフルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニド、および／またはフランカルボン酸モメタゾン；核ホルモン受容体、例えばPPARをモジュレートする物質；免疫グロブリン（Ig）またはIg調製物またはIg機能をモジュレートするアンタゴニストもしくは抗体、例えば抗IgE（例えばオマリズマブ）；他の全身または局所適用の抗炎症剤、例えばサリドマイドまたはその誘導体、レチノイド、ジトラノールおよび／またはカルシポトリオール；アミノサリチル酸およびスルファピリジンの組み合わせ、例えばスルファサラジン、メサラジン、バルサラジド、およびオルサラジン；および免疫調節剤、例えばチオプリン；およびコルチコステロイド、例えばブデソニド；抗菌剤、例えばペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、β-ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾールおよび／または吸入アミノグリコシド；および／または抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル；アマンタジン、リマンタジン；リバビリン；ザナマビルおよび／またはオセルタマビル；プロテアーゼインヒビター、例えばインジナビル、ネルフィナビル、リトナビルおよび／またはサキナビル；ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン；非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばネビラピン、エファビレンツ；心血管作動薬、例えばカルシウムチャネルブロッカー、β-アドレナリン受容体ブロッカー、アンジオテンシン変換酵素（ACE）インヒビター、アンジオテンシン-2受容体アンタゴニスト；脂質低下剤、例えばスタチンおよび／またはフィブラート；血球形態のモジュレーター、例えばペントキシフィリン；血栓溶解剤および／または抗凝血剤、例えば血小板凝集インヒビター；中枢神経系作用薬、例えば抗うつ剤（例えばセルトラリン）、抗パーキンソン薬（例えばデプレニル、L-ドーパ、ロピニロール、プラミペキソール；MAOBインヒビター、例えばセレギンおよびラサギリン；comPインヒビター、例えばタスマル；A-2インヒビター、ドーパミン再摂取インヒビター、NMDAアンタゴニスト、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニストおよび／またはニューロン一酸化窒素シンターゼのインヒビター）および抗アルツハイマー薬、例えばドネペジル、リバスティグミン、タクリン、COX-2インヒビター、プロペントフィリンまたはメトリホナート；急性および慢性痛を治療するための薬剤、例えば中枢または末梢作用鎮痛剤、例えばオピオイド類似体または誘導体、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、アミトリプチリンまたは他の抗うつ剤、パラセタモール、または非ステロイド性抗炎症剤；非経口または局所適用（吸入を含む）局所麻酔剤、例えばリグノカインまたはその類似体；抗骨粗鬆症薬、例えばホルモン剤、例えばラロキシフェン、またはビホスホナート、例えばアレンドロナート；次の(i)〜(xxvi)の作用薬：(i)トリプターゼインヒビター；(ii)血小板活性化因子（PAF）アンタゴニスト(iii)インターロイキン変換酵素（ICE）インヒビター；(iv)IMPDHインヒビター；(v)接着分子インヒビター、例えばVLA-4アンタゴニスト；(vi)カテプシン；(vii)キナーゼインヒビター、例えばチロシンキナーゼ（例えばBtk、Itk、Jak3 MAP、インヒビターの例にはゲフィチニブ、メシル酸イマチニブが含まれる）、セリン／スレオニンキナーゼ（例えばMAPキナーゼ、例えばp38、JNK、プロテインキナーゼA、BおよびCおよびIKKのインヒビター）、または細胞周期調節に関与するキナーゼ（例えばサイクリン依存性キナーゼ）のインヒビター；(viii)グルコース-6リン酸デヒドロゲナーゼインヒビター；(ix)キニン-B.sub1.および／またはB.sub2.受容体アンタゴニスト；(x)抗痛風剤、例えばコルヒチン；(xi)キサンチンオキシダーゼインヒビター、例えばアロプリノール；(xii)尿酸排泄剤、例えばプロベネシド、スルフィンピラゾン、および／またはベンズブロマロン；(xiii)成長ホルモン分泌促進剤；(xiv)トランスフォーミング成長因子（TGFβ）；(xv)血小板由来成長因子（PDGF）；(xvi)線維芽細胞成長因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）；(xvii)顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）；(xviii)カプサイシンクリーム；(xix)タキキニンNK.sub1.および／またはNK.sub3.受容体アンタゴニスト、例えばNKP-608C、SB-233412（タルネタント）および／またはD-4418；(xx)エラスターゼインヒビター、例えばUT-77および／またはZD-0892；(xxi)TNF-α変換酵素インヒビター（TACE）；(xxii)誘導性一酸化窒素シンターゼ（iNOS）インヒビターまたは(xxiii)TH2細胞上で発現される化学誘引物質受容体相同分子（例えばCRTH2アンタゴニスト）；(xxiv)P38のインヒビター(xxv)Toll様受容体（TLR）の機能をモジュレートする物質および(xxvi)プリン受容体の活性をモジュレートする物質、例えばP2X7；(xxvii)転写因子、例えばNFkB、APIおよび／またはSTATS活性化のインヒビター；局所適用または全身適用に関わらず、非選択的シクロオキシゲナーゼ（COX）-1／COX-2インヒビターを含む非ステロイド性抗炎症剤（以後、NSAIDと呼ぶ）（例えばピロキシカム、ジクロフェナク、プロピオン酸、例えばナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェンおよびイブプロフェン、フェナマート、例えばメフェナム酸、インドメタシン、スリンダク、アザプロパゾン、ピラゾロン、例えばフェニルブタゾン、サリチラート、例えばアスピリン）；選択的COX-2インヒビター（例えばメロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルマロコキシブ、パレコキシブおよびエトリコキシブ）；シクロオキシゲナーゼ阻害性一酸化窒素ドナー（CINOD）；グルココルチコステロイド（局所、経口、筋肉内、静脈内または関節内経路による投与のいずれでもよい）；メトトレキセート、レフルノミド；ヒドロキシクロロキン、d-ペニシラミン、オーラノフィンまたは他の非経口もしくは経口金製剤；鎮痛剤；ジアセレイン；関節内治療薬、例えばヒアルロン酸誘導体；および栄養補助食品、例えばグルコサミン。
いくつかの実施形態において、本発明の方法または使用は、TNF-αにアンタゴニスト作用を果たす薬剤の投与を含んでもよい。当業者に周知の任意のTNF-αアンタゴニストを、本発明の組成物および方法に使用することができる。TNF-αアンタゴニストの例には、限定されるものでないが、TNF-αの機能、活性および／または発現を遮断、低減、阻害または中和するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Fv、ScFv、Fab断片、F(ab)2断片、およびその抗原-結合断片）、例えばTNF-αと免疫特異的に結合する抗体、核酸分子（例えば、アンチセンス分子または三重らせん体）、有機分子、無機分子、および小分子が含まれる。様々な実施形態において、TNF-αアンタゴニストは、TNF-αの機能、活性および／または発現を、対照、例えば、リン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも99％だけ低減する。
TNF-αと免疫特異的に結合する抗体の例には、限定されるものでないが、インフリキシマブ（REMICADE(登録商標)；Centocor）、アダリムマブ（HUMIRA(登録商標)；Abbott Laboratories）、D2E7 （Abbott Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co.、Mt. Olive、N.J.）、CDP571（HUMICADE(登録商標)としても知られる）およびCDP-870（両方ともCelltech/Pharmacia, Slough, U.K.の製品）、およびTN3-19.12（Williams et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91： 2762-2766； Thorbecke et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7375-7379）が含まれる。本発明はまた、次の米国特許に開示されたTNF-αと免疫特異的に結合する抗体の使用を包含する：5,136,021；5,147,638；5,223,395；5,231,024；5,334,380；5,360,716；5,426,181；5,436,154；5,610,279；5,644,034；5,656,272；5,658,746；5,698,195；5,736,138；5,741,488；5,808,029；5,919,452；5,958,412；5,959,087；5,968,741；5,994,510；6,036,978；6,114,517；および6,171,787；これらの特許はそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。可溶性TNF-α受容体の例には、限定されるものでないが、sTNF-R1（Amgen）、エタネルセプト（ENBREL(登録商標)；Immunex）およびそのラット同族体RENBREL(登録商標)、TNFrI、TNFrII由来のTNF-αの可溶性インヒビター（Kohno et al., 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：8331-8335）、および TNF-α Inh (Seckinger et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：5188-5192)が含まれる。
一実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるTNF-αアンタゴニストは可溶性TNF-α受容体である。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるTNF-αアンタゴニストはエタネルセプト（ENBREL(登録商標)；Immunex）またはその断片、誘導体または類似体である。他の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるTNF-αアンタゴニストはTNF-αと免疫特異的に結合する抗体である。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるTNF-αアンタゴニストはインフリキシマブ（REMICADE(登録商標)；Centocor）またはその誘導体、類似体または抗原-結合断片である。他の特定の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用されるTNF-αアンタゴニストはアダリムマブ（HUMIRA(登録商標)；Abbott Laboratories）、その誘導体、類似体または抗原-結合断片である。
本発明に包含されるその他のTNF-αアンタゴニストには、限定されるものでないが、IL-10（インターフェロンγ-活性化マクロファージを介するTNF-α生産を遮断することが公知である）（Oswald et al., 1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：8676-8680）、TNFR-IgG（Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：10535-10539）、マウス産物TBP-1（Serono/Yeda）、ワクチンCytoTAb（Protherics）、アンチセンス分子104838（ISIS）、ペプチドRDP-58（SangStat）、サリドマイド（Celgene）、CDC-801（Celgene）、DPC-333（Dupont）、VX-745（Vertex）、AGIX-4207（AtheroGenics）、ITF-2357（Italfarmaco）、NPI-13021-31（Nereus）、SCIO-469（Scios）、TACE標的化剤（Immunix/AHP）、CLX-120500（Calyx）、チアゾロプリム（Dynavax）、オーラノフィン（Ridaura）（SmithKline Beecham Pharmaceuticals）、キナクリン（メパクリンジクロロハイドレート）、テニダップ（Enablex）、メラニン（Large Scale Biological）、および抗p38MAPK剤（Uriach）が含まれる。
TNF-αアンタゴニスト活性をもつタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする核酸分子、またはTNF-αアンタゴニスト活性をもつタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを、炎症性または自己免疫性疾患を患う被験者に、本発明の方法によって投与することができる。さらに、TNF-αアンタゴニスト活性をもつタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの誘導体、類似体、断片または変異体をコードする核酸分子、またはTNF-αアンタゴニスト活性をもつタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの誘導体、類似体、断片または変異体を、炎症性または自己免疫性疾患を患う被験者に、本発明の方法によって投与することができる。かかる誘導体、類似体、変異体および断片は全長野生型タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのTNF-αアンタゴニスト活性を保持する。
TNF-αアンタゴニストとして使用することができるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは当技術分野で周知のまたは本明細書に記載の任意の技法により生産することができる。TNF-αアンタゴニスト活性をもつタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、当技術分野で周知のまたは本明細書に記載の技法を利用して作製し、かかるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのin vivo半減期を増加することができる。好ましくは、市販されかつTNF-αアンタゴニストとして機能することが公知である薬剤を本発明の組成物および方法で使用する。薬剤のTNF-αアンタゴニスト活性は、当業者に周知の技法によりin vitroおよび／またはin vivoで決定することができる。
一実施形態において、本発明の方法または使用はアンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストである抗体の投与であって、前記抗体の先に掲げた薬剤の任意の1つとの免疫複合体としての投与を含むものであってもよい。
医薬組成物
他の態様において本発明は、組成物、例えば、限定されるものでないが、製薬上許容される担体と一緒に製剤化した1以上の本発明の抗体を含有する医薬組成物を提供する。
かかる組成物は、1つのまたは、例えば、限定されるものでないが、2つ以上の異なる本発明の抗体の組合わせを含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するまたは補体活性を有する抗体の組合わせを含んでもよい。
本発明の医薬組成物はまた、組合わせ療法で、例えば、他の薬剤と組合わせて投与することができる。例えば、組合わせ療法は、少なくとも1つの他の療法と組合わせて本発明の抗体を含んでもよく、前記他の療法は外科、免疫療法、化学療法、照射治療、または薬物療法であってもよい。
本発明の医薬化合物は、1以上の製薬上許容される塩を含んでもよい。かかる塩の例とには、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などから、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから誘導されたものが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどから、ならびに無毒性の有機アミン類、例えば、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導されたものが含まれる。
本発明の医薬組成物はまた、製薬上許容される抗酸化剤を含んでもよい。製薬上許容される抗酸化剤の例には、(1)水可溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；(2)油可溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなど；および(3)金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
本発明の医薬組成物に使用できる好適な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびなど）、および好適なそれらの混合物、植物油、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。適当な流動性は、例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には所要粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
これらの組成物はまた、アジュバント、例えば、保存剤、湿潤剤、乳濁化剤および分散剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌操作と様々な抗細菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入の両方により確実にすることができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどの組成物中に含むことも望ましいであろう。さらに、注射可能な医薬剤形の吸収の持続は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの封入によりもたらすことができる。
医薬組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロ乳剤、リポソーム、またはその他の高い薬物濃度に好適な秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適当な流動性を、例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には所要粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好適でありうる。注射可能な組成物の吸収の持続は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンの封入によりもたらすことができる。
無菌の注射可能な溶液は、所要量の活性化合物を上記成分の1つまたは組合わせと共に適当な溶媒に組み入れることにより、必要に応じて、次いで滅菌精密濾過することにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を基礎分散媒質および上記からの所要他成分を含有する無菌ビヒクル中に組み入れることにより調製することができる。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、選択される調製の方法は真空乾燥および凍結乾燥であって、活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末は、その予め滅菌濾過した溶液から得られる。
一実施形態では、本発明の組成物は、内毒素及び/又は関連発熱物質を実質的に含有しない、発熱原非含有製剤である。内毒素は、微生物内部に局在し、微生物が破壊され、又は死滅した際にだけ放出される毒素を包含する。発熱物質は、細菌及び他微生物の外膜由来の発熱誘導性の耐熱性物質（糖タンパク質）も包含する。これらの両方の物質、ヒトに投与されると、発熱、低血圧及びショックを起こす可能性がある。潜在的な有害効果があるので、少量の内毒素でも、静脈内投与される医薬溶液から除去する必要がある。米国食品医薬品局（"FDA"）は、静脈内薬物投与に対して1時間の単一期間に体重1kg、1用量当たり5内毒素単位（EU）の上限を設定している（The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)）。治療タンパク質が体重1kg当たり数百又は数千mgの量で投与される場合、有害で危険な内毒素は、微量であっても除去する必要がある。一実施形態においては、組成物中の内毒素及び発熱原の量は、10EU/mg未満、又は5EU/mg未満、又は1EU/mg未満、又は0.1EU/mg未満、又は0.01EU/mg未満、又は0.001EU/mg未満である。他の実施形態においては、組成物中の内毒素及び発熱原の量は、約10EU/mg未満、又は約5EU/mg未満、又は約1EU/mg未満、又は約0.1EU/mg未満、又は約0.01EU/mg未満、又は約0.001EU/mg未満である。
一実施形態において、本発明は組成物を投与するステップを含み、前記投与は経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、膣、直腸、舌、舌下、頬側、頬内、静脈内、皮膚、皮下または経皮に行われる。
他の実施形態において、本発明はさらに他の療法と組合わせて組成物を投与するステップを含み、前記他の療法は例えば、外科、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法または放射線療法である。
他の実施形態において、本発明は、CSF1Rおよび／またはCSF1の生物学的活性のアンタゴニストと組合わせて、同時に、連続してまたは別々に、組成物を投与するステップを含む。
他の実施形態において、本発明はVEGFおよび／またはVEGFRの生物学的活性のアンタゴニストと組合わせて、同時に、連続してまたは別々に、組成物を投与するステップを含む。
他の実施形態において、本発明はTNF-αの生物学的活性のアンタゴニストと組合わせて、同時に、連続してまたは別々に、本発明の抗体を投与するステップを含むものである。
用量/投与
本発明の抗体を含む医薬品または無菌組成物を調製するためには、抗体を製薬上許容される担体または賦形剤と混合する。治療薬および診断薬の製剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、または懸濁液の剤形で混合することにより調製することができる（例えば、Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.；Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.；Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY；Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY；Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY；Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.を参照）。
治療のための投与レジメンの選択はいくつかの因子に依存し、前記因子には、対象の血清または組織代謝回転速度、症候群のレベル、対象の免疫原性、および生体基質中の標的細胞の進入可能性が含まれる。ある特定の実施形態において、投与レジメンは患者に送達する治療薬の量を副作用の許容可能なレベルに合わせて最大化する。従って、生体に送達される量は、部分的に、治療する特定の対象および症状の重症度に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の適当な用量を選択する手引きを利用することができる（例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK；Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.；Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.；Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608；Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973；Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792；Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619；Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32；Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602を参照）。
適当な用量の決定は臨床医により行なわれ、例えば、治療に影響を及ぼすまたは治療に影響を及ぼすと考えられる当技術分野で公知のまたは考えられるパラメーターまたは因子を用いて行われる。一般に、その用量は最適用量より若干少ない量で開始し、その後、いずれかの否定的な副作用と比較して所望されるまたは最適の効果が得られるまで、少しづつ増加する。重要な診断尺度には、例えば、炎症の症候群の尺度または生じる炎症性サイトカインのレベルが含まれる。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを変えて、特定の患者、組成物、および投与様式に対して、患者に毒性がなく、所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得ることができる。選択される用量レベルは、様々な薬物動態学的因子に依存しうるのであって、前記因子には、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時点、使用する特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用する特定の組成物と組合わせて使用する他の薬物、化合物および／または材料、治療する患者の年齢、性別、体重、症状、一般的健康および既往医療歴、および当技術分野で周知の因子などが含まれる。
本発明の抗体を含む組成物は、連続注入により、または、例えば、1日、1週、または毎週1〜7回の間隔の用量により提供することができる。用量は、静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔、直腸、筋肉内、脳内、または吸入により提供することができる。具体的な用量プロトコルは、有意な望ましくない副作用を避ける最大用量または用量頻度に関わるプロトコルである。合計週間用量は、体重当たり、少なくとも0.05μg/kg、少なくとも0.2μg/kg、少なくとも0.5μg/kg、少なくとも1μg/kg、少なくとも10μg/kg、少なくとも100μg/kg、少なくとも0.2mg/kg、少なくとも1.0mg/kg、少なくとも2.0mg/kg、少なくとも10mg/kg、少なくとも25mg/kg、または少なくとも50mg/kgであってもよい（例えば、Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434；Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698；Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456；Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144)を参照）。用量は少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、または少なくとも100μgであってもよい。被験者に投与する用量の回数は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12、またはそれ以上であってもよい。
本発明の抗体については、患者に投与する用量は、患者の体重当たり、0.0001mg/kg〜100mg/kgであってもよい。用量は、患者の体重の0.0001mg/kg〜20mg/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、0.0001〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001〜0.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kgまたは0.01〜0.10mg/kgであってもよい。
本発明の抗体の用量は、患者体重（kg）に投与すべき用量（mg/kg）を乗じた値を用いて計算することができる。
本発明の抗体の用量は、患者体重の150μg/kg以下、125μg/kg以下、100μg/kg以下、95μg/kg以下、90μg/kg以下、85μg/kg以下、80μg/kg以下、75μg/kg以下、70μg/kg以下、65μg/kg以下、60μg/kg以下、55μg/kg以下、50μg/kg以下、45μg/kg以下、40μg/kg以下、35μg/kg以下、30μg/kg以下、25μg/kg以下、20μg/kg以下、15μg/kg以下、10μg/kg以下、5μg/kg以下、2.5μg/kg以下、2μg/kg以下、1.5μg/kg以下、1μg/kg以下、0.5μg/kg以下、または0.5μg/kg以下であってもよい。
本発明の抗体の単位用量は、0.1mg〜20mg、0.1mg〜15mg、0.1mg〜12mg、0.1mg〜10mg、0.1mg〜8mg、0.1mg〜7mg、0.1mg〜5mg、0.1〜2.5mg、0.25mg〜20mg、0.25〜15mg、0.25〜12mg、0.25〜10mg、0.25〜8mg、0.25mg〜7mg、0.25mg〜5mg、0.5mg〜2.5mg、1mg〜20mg、1mg〜15mg、1mg〜12mg、1mg〜10mg、1mg〜8mg、1mg〜7mg、1mg〜5mg、または1mg〜2.5mgであってもよい。
本発明の抗体の用量は、ある被験者における少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成することができる。あるいは、本発明の抗体の用量は、その被験者における少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成することができる。
本発明の抗体の用量は繰返してもよいし、そしてその投与は少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヶ月、75日、3ヶ月、または少なくとも6ヶ月だけ離してもよい。
特定の患者に対する有効量は、諸因子、例えば治療すべき症状、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重症度に応じて変わりうる（例えば、Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.；Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UKを参照）。
投与の経路は、例えば、局所または皮膚への適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内の注射または注入、または持続放出系または移植片によることができる（例えば、Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547-556；Langer, et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277；Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105；Epstein, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692；Hwang, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034；米国特許番号6,350466および6,316,024を参照）。
必要があれば、組成物はまた、溶解剤および注射部位の疼痛を和らげるための局所麻酔薬、例えば、リドカインを含んでもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエーロゾル化剤を伴う製剤の使用による肺投与も利用することができる。例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、米国特許番号6,019,968、5,985、320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、および 4,880,078；およびPCT国際公開番号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、および WO 99/66903を参照されたい。一実施形態においては、本発明の抗体、組合わせ療法、または組成物は、AlkermesAIR(登録商標)肺の薬物送達技法（Alkermes、Inc.、Cambridge、Mass.）を用いて投与する。
本発明の組成物はまた、当技術分野で公知の1以上の様々な方法を用いて1以上の経路を介して投与することができる。当業者は理解しうるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変わりうる。本発明の抗体に対して選択される投与経路には、例えば、注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路が含まれる。非経口投与は経腸および局所投与以外の、通常、注射による投与様式を表しうるのであって、限定されるものでないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨下注射および注入が含まれる。あるいは、本発明の組成物を、非経口でない経路、例えば、局所、上皮または粘膜の投与経路を介して、例えば、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸、舌下または局所に投与してもよい。
本発明の抗体を制御放出または持続放出系で投与する場合、ポンプを用いて制御放出または持続放出を達成することができる（Langer, 前掲；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。ポリマー材料を用いて本発明の療法の制御放出または持続放出を達成することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照；また、Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照)；米国特許番号5,679,377；米国特許番号5,916,597；米国特許番号5,912,015；米国特許番号5,989,463；米国特許番号5,128,326；PCT国際公開番号WO 99/15154；ならびにPCT国際公開番号WO 99/20253を参照）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例には、限定されるものでないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ乳酸（PLA）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）、およびポリオルトエステルが含まれる。一実施形態において、持続放出製剤で使用されるポリマーは不活性であり、浸出可能な不純物を含有せず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、かつ生物分解性である。制御放出または持続放出系を予防または治療標的の近位に置いて、全身用量のある分率しか要しないようにすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照）。
制御放出系はLanger（1990, Science 249:1527-1533）の総括に考察されている。当業者にとって公知の任意の技法を用いて、1以上の本発明の抗体を含む持続放出製剤を作成することができる。例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる米国特許番号4,526,938、PCT国際公開番号WO 91/05548、PCT国際公開番号WO 96/20698、Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel（持続放出ゲルを用いるヒト大腸がん異種移植の腫瘍内放射線療法）" Radiotherapy & Oncology 39:179-189、Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions（抗体が介在する、長期循環エマルジョンの肺標的化）" PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397、Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application（心血管に適用するための、bFGF抗体用の生物分解性ポリマー担体）" Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854、およびLam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery（局所送達のための、組換えヒト化モノクローナル抗体のミクロカプセル化）" Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。
本発明の抗体を局所に投与する場合、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、噴霧、エーロゾル、溶液、乳濁液、または当技術分野で周知の他の剤形で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。非スプレー用の局所投与剤形については、局所適用に適合しうる担体または1以上の賦形剤を含み、いくつかの場合には、水より高い動粘度を有する粘稠性ないし半固体または固体の剤形が典型的に使用される。好適な製剤には、限定されるものでないが、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏剤、粉末、リニメント剤、軟膏などが含まれ、これらは、所望であれば、滅菌されるかまたは、様々な特性、例えば浸透圧などに影響を与える補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、バッファー、または塩）と混合される。他の好適な局所投与剤形にはスプレー可能なエーロゾル調製物が含まれ、その場合、本活性成分は、いくつかの事例では、固体または液体の不活性な担体と組合わせて、加圧された揮発分（例えばガス噴霧剤、例えばフレオン）との混合物でまたはスクイズボトルに詰められる。
加湿剤または保湿剤を、所望であれば、医薬組成物および投与剤形に加えることもできる。かかる追加の成分は当技術分野では周知である。
もし抗体を含む組成物を鼻腔内に投与するのであれば、これをエーロゾル剤形、スプレー、ミストまたは液滴の剤形で製剤化することができる。特に、本発明による使用のための予防または治療薬は、加圧パックまたは噴霧器から好適な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス）を使用してエーロゾルスプレー提示の剤形で好都合に送達することができる。加圧エーロゾルの場合、用量単位は一定量を送達するバルブを備えることにより決定することができる。吸入器または吹送器で使用するカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから成る）は、本化合物と好適な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有するように製剤化することができる。
第2の治療薬、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学治療薬、抗生物質、または照射と同時投与または治療する方法は当技術分野で周知である（例えば、Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.；Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.；Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照）。治療薬の有効量は、症候群を少なくとも10％；少なくとも20％；少なくとも約30％；少なくとも40％、または少なくとも50％だけ減少することができる。
本発明の抗体と組合わせて投与することができるさらなる療法（例えば、予防のまたは治療薬）を、本発明の抗体から5分間未満離れて、30分間未満離れて、1時間離れて、約1時間離れて、約1〜約2時間離れて、約2時間〜約3時間離れて、約3時間〜約4時間離れて、約4時間〜約5時間離れて、約5時間〜約6時間離れて、約6時間〜約7時間離れて、約7時間〜約8時間離れて、約8時間〜約9時間離れて、約9時間〜約10時間離れて、約10時間〜約11時間離れて、約11時間〜約12時間離れて、約12時間〜18時間離れて、18時間〜24時間離れて、24時間〜36時間離れて、36時間〜48時間離れて、48時間〜52時間離れて、52時間〜60時間離れて、60時間〜72時間離れて、72時間〜84時間離れて、84時間〜96時間離れて、または96時間〜120時間離れて投与してもよい。2以上の療法を1回の同じ患者来訪時に投与してもよい。
本発明の抗体と他の療法をサイクリングで投与してもよい。サイクリング療法は、ある期間、第1の療法（例えば、第1の予防または治療薬）の投与、次いである期間、第2の療法（例えば、第2の予防または治療薬）の投与、任意に、次いである期間、第3の療法（例えば、予防または治療薬）の投与を続け、この連続投与、すなわち、このサイクルを繰り返して、療法の1つに対する耐性の発生を低減し、その療法の1つの副作用を回避または低減しおよび／またはその療法の効力を改善することに関わる。
ある特定の実施形態においては、in vivoで適当な分布を保証するように本発明の抗体を製剤化することができる。例えば、血液脳関門（BBB）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がBBBを横切ることを保証するために（所望の場合）、これらをリポソームで製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許番号4,522,811；5,374,548；および5,399,331を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官中に選択的に輸送され、従って、標的化した薬物送達を促進する1以上の部分を含んでもよい（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照）。例示の標的化部分には、葉酸またはビオチン（例えば、Lowerらに与えられた米国特許番号5,416,016を参照）；マンノシド類（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140；M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤プロテインA受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233：134）；p120（Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269：9090）が含まれ；また、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123；J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
本発明は、本発明の抗体を単独でまたは他の療法と組合わせて含む医薬組成物の、それを必要とする被験者への投与に対するプロトコルを提供する。本発明の組合わせ療法の療法（例えば、予防または治療薬）は、同時にまたは連続して被験者に投与してもよい。本発明の組合わせ療法の療法（例えば、予防または治療薬）はまた、サイクリングで投与してもよい。サイクリング療法は、ある期間、第1の療法（例えば、第1の予防または治療薬）の投与、次いである期間、第2の療法（例えば、第2の予防または治療薬）の投与、そしてこの連続投与、すなわち、このサイクルを繰り返して、療法（例えば薬剤）の1つに対する耐性の発生を低減し、その療法（例えば薬剤）の1つの副作用を回避または低減しおよび／またはその療法の効力を改善することに関わる。
本発明の組合わせ療法の療法（例えば、予防または治療薬）は被験者に同時に投与することができる。用語「同時に」は、療法（例えば、予防または治療薬）の正確に同じ時間における投与に限定されるものでなく、むしろ、本発明の抗体を含む医薬組成物を被験者に連続して或る時間間隔内に投与し、本発明の抗体が他の療法と一緒に作用して、それらがそうでなく投与されるより増加した利益を与えるようにすることを意味する。例えば、各療法を、被験者に同じ時間にまたは連続して任意の順で異なる時点に投与してもよい；しかし、もし同じ時間に投与しない場合、これらは十分近い時間に投与して所望の治療または予防効果を与えるようにしなければならない。各療法は、被験者に任意の適当な剤形でかつ任意の好適な経路により別々に投与してもよい。様々な実施形態においては、療法（例えば、予防または治療薬）を被験者に、15分間未満、30分間未満、1時間未満離れて、約1時間離れて、約1時間〜約2時間離れて、約2時間〜約3時間離れて、約3時間〜約4時間離れて、約4時間〜約5時間離れて、約5時間〜約6時間離れて、約6時間〜約7時間離れて、約7時間〜約8時間離れて、約8時間〜約9時間離れて、約9時間〜約10時間離れて、約10時間〜約11時間離れて、約11時間〜約12時間離れて、24時間離れて、48時間離れて、72時間離れて、または1週間離れて投与する。他の実施形態においては、2以上の療法（例えば、予防または治療薬）を同じ患者来訪時に投与する。
組合わせ療法の予防または治療薬を被験者に同じ医薬組成物で投与することができる。あるいは、組合わせ療法の予防または治療薬を被験者に別々の医薬組成物で同時に投与することができる。予防または治療薬を被験者に同じまたは異なる投与経路で投与してもよい。
本発明の他の実施形態は、血管新生に関係する疾患をスクリーニングするための、哺乳動物の組織、細胞または体液中のアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2を検出するアッセイキットを含む。前記キットは、アンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2と結合する抗体および、もし存在すれば、抗体とアンジオポエチン-1および／またはアンジオポエチン-2との反応を示す手段を含む。抗体はモノクローナル抗体であってもよい。一実施形態においては、アンジオポエチン-2と結合する抗体を標識する。他の実施形態において、抗体は無標識の一次抗体であり、キットはさらに一次抗体を検出する手段を含む。一実施形態において、前記手段は抗免疫グロブリンである標識した第2の抗体を含む。いくつかの実施形態においては、抗体を蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透明材料からなる群より選択されるマーカーで標識する。
参照による組み入れ
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書で引用された全ての参考文献、およびそれに引用された参考文献は、それらが既に引用されていない限り、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。さらに、次の米国予備特許出願番号61/023,958（2008年1月28日出願）、61/100,063（2008年9月25日出願）、および 61/142,778（2009年1月6日出願）は本明細書に参照によりその全てが全ての目的のために組み入れられる。
均等物
前述の書面での明細書は、当業者が本発明を実施できるようにするのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らが考えた最良の様式を記載している。しかし、前述内容が本文中にいかに詳細に記載されていても、本発明は多数の方法で実行可能であり、かつ本発明は添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の均等物に従って解釈されるべきであることは理解されるであろう。
具体的な実施形態：
1. Ang-2と結合する単離された抗体であって、前記抗体が可変軽鎖を含み、前記軽鎖が配列番号3（MEDI1）；配列番号4（MEDI2）；配列番号5（MEDI3）；配列番号6（MEDI4）；および配列番号8（MEDI6）からなる群より選択される配列を含む前記抗体。
2. 前記抗体がIgG1またはIgG2アイソタイプ抗体である実施形態1の抗体。
3. 前記抗体が配列番号7（MEDI5）を含む可変重鎖領域を含む、実施形態1または2の抗体。
4. 前記抗体は、生産される時に、哺乳動物宿主細胞において、Ang-2抗体3.19.3の生産効率の2倍以上の生産効率を表す、実施形態 1〜3のいずれかの抗体。
5. 前記生産効率がAng-2抗体3.19.3の生産効率の3倍以上である、実施形態4の抗体。
6. 前記生産効率がAng-2抗体3.19.3の生産効率の5倍以上である、実施形態4の抗体。
7. 実施形態1〜6のいずれかの抗体をコードする核酸。
8. 実施形態7の核酸を含むベクター。
9. 実施形態8のベクターを含む宿主細胞。
10. 実施形態1〜6のいずれかの抗体および賦形剤を含む医薬組成物。
11. それを必要とする動物における癌を予防、治療、または管理する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
12. それを必要とする動物における癌の転移を防止する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
13. それを必要とする動物における癌の再発を防止する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
14. それを必要とする動物における癌の進行を防止する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
15. それを必要とする動物における前癌状態からの癌の発生を防止する方法であって、実施形態10の組成物の有効量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
16. それを必要とする動物における癌の症候群を防止する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
17. それを必要とする動物における癌の腫瘍退行を促進する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
18. それを必要とする動物における腫瘍細胞増殖を阻害する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
19. それを必要とする動物における悪性腫瘍細胞を枯渇する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
20. それを必要とする動物における癌腫瘍の血管新生を阻害する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量を前記動物に投与するステップを含むものである前記方法。
21. 前記動物に1以上の他の癌療法のさらなる投与をする、実施形態11〜20のいずれかの方法。
22. 前記1以上の他の癌療法が化学療法、生物学的療法／免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または外科である、実施形態21の方法。
23. 前記方法が癌治療薬でない他の治療薬の投与をさらに含む、実施形態11〜22のいずれかの方法。
24. 前記治療薬が抗催吐薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗炎症薬、免疫調節薬、抗ウイルス薬、または抗生物質である、実施形態23の方法。
25. 前記化学療法が5-フルオウラシル、カルボプラチン、およびパクリタキセルからなる群より選択される、実施形態21〜24のいずれかの方法。
26. 前記免疫療法がベバシズマブまたはベバシズマブと同じエピトープに対して競合する抗体の投与である、実施形態21〜25のいずれかの方法。
27. 前記癌または腫瘍が黒色腫、結腸癌、結腸直腸、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、直腸癌、胃癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、血液癌、腎臓癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵臓癌、脳癌、頚部癌、神経膠芽細胞腫、子宮内膜癌、および中枢神経系癌からなる群より選択される、実施形態21〜26のいずれかの方法。
28. 前記動物が先に1以上の癌療法の投与により治療されているが、実施形態10の組成物の投与により治療されてない、実施形態21〜27のいずれかの方法。
29. 前記動物が先に化学療法単独で、または1以上の放射線療法、生物学的療法／免疫療法、ホルモン療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態11〜27のいずれかの方法。
30. 前記動物が先に放射線療法単独で、または1以上の化学療法、生物学的療法／免疫療法、ホルモン療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態11〜27のいずれかの方法。
31. 前記動物が先に生物学的療法／免疫療法単独で、または1以上の化学療法、放射線療法、ホルモン療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態11〜27のいずれかの方法。
32. 前記動物が先にホルモン療法単独で、または1以上の化学療法、放射線療法、生物学的療法／免疫療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態11〜27のいずれかの方法。
33. 前記動物が先に外科単独で、または1以上の化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法／免疫療法との組合わせで治療されている、実施形態11〜27のいずれかの方法。
34. 前記癌が化学療法または放射線療法に耐性である、実施形態11〜33のいずれかの方法。
35. 前記投与が静脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、非経口、または経口である、実施形態11〜34のいずれかの方法。
36. 前記組成物および癌療法を同じ投与様式によって投与する、実施形態21〜35のいずれかの方法。
37. 前記組成物および癌療法を異なる投与様式によって投与する、実施形態21〜35のいずれかの方法。
38. 前記組成物および癌療法を同じ投与剤形で投与する、実施形態21〜35のいずれかの方法。
39. 前記組成物および癌療法を異なる投与剤形で投与する、実施形態21〜35のいずれかの方法。
40. 前記癌療法が放射線療法、生物学的療法／免疫療法、ホルモン療法および外科からなる群より選択される、実施形態21〜39のいずれかの方法。
41. それを必要とする動物において疾患に関係する血管新生を防止、治療または管理する方法であって、前記動物に実施形態10の組成物の有効量の用量を投与するステップを含むものである前記方法。
42. 疾患に関係する血管新生が血清陰性関節炎、血清陽性関節炎、他の関節症に関係する関節炎、骨関節炎またはSLEに関連する、実施形態41の方法。
43. 血清陽性関節炎が慢性関節リウマチである、実施形態42の方法。
44. それを必要とする動物において疾患に関係する血管新生の再発を防止する方法であって、前記動物に実施形態10の組成物の有効量の用量を投与するステップを含むものである前記方法。
45. それを必要とする動物において疾患に関係する血管新生の進行を防止する方法であって、前記動物に実施形態10の組成物の有効量の用量を投与するステップを含むものである前記方法。
46. それを必要とする動物において慢性関節リウマチを治療する方法であって、前記動物に実施形態10の組成物の有効量の用量を投与するステップを含むものである前記方法。
47. それを必要とする動物において疾患に関係する血管新生の症候群を防止する方法であって、前記動物に実施形態10の組成物の有効量の用量を投与するステップを含むものである前記方法。
48. 前記動物に1以上の他の抗炎症療法のさらなる投与を行うステップを含むものである実施形態41〜47のいずれかの方法。
49. 前記1以上の他の抗炎症療法が化学療法、生物学的療法／免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または外科である、実施形態48の方法。
50. 前記生物学的療法／免疫療法がTNF-αアンタゴニストである、実施形態49の方法。
51. 前記TNF-αアンタゴニストがエタネルセプト（ENBREL(登録商標)）、アダリムマブ（HUMIRA(登録商標)）、およびインフリキシマブ（REMICADE(登録商標)）から選択される、実施形態50の方法。
52. 前記方法がさらに抗炎症治療薬でない他の治療薬の投与を含むものである、実施形態41〜51のいずれかの方法。
53. 前記治療薬が抗催吐薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗癌薬、免疫調節薬、抗ウイルス薬、または抗生物質である、実施形態52の方法。
54. 前記動物が先に1以上の抗炎症療法の投与により治療されているが、実施形態10の組成物の投与により治療されてない、実施形態41〜53のいずれかの方法。
55. 前記動物が先に化学療法単独で、または1以上の放射線療法、生物学的療法／免疫療法、ホルモン療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態41〜53のいずれかの方法。
56. 前記動物が先に放射線療法単独で、または1以上の化学療法、生物学的療法／免疫療法、ホルモン療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態41〜53のいずれかの方法。
57. 前記動物が先に生物学的療法／免疫療法単独で、または1以上の化学療法、放射線療法、ホルモン療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態41〜53のいずれかの方法。
58. 前記動物が先にホルモン療法単独で、または1以上の化学療法、放射線療法、生物学的療法／免疫療法または外科との組合わせで治療されている、実施形態41〜53のいずれかの方法。
59. 前記動物が先に外科単独で、または1以上の化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法／免疫療法との組合わせで治療されている、実施形態41〜53のいずれかの方法。
60. 動物における内皮細胞増殖を低下させる方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量の投与を含むものである前記方法。
61. 動物におけるAng-2および／またはAng-1結合のTie-2との結合を阻害する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量の投与を含むものである前記方法。
62. 動物におけるTie-2リン酸化を阻害する方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量の投与を含むものである前記方法。
63. 動物における循環中のAng-2および／またはAng-1ポリペプチドのレベルを低下させる方法であって、実施形態10の組成物の有効量の用量の投与を含むものである前記方法。
64. i)アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストとii)CSF1Rおよび／またはCSF1の生物学的活性のアンタゴニストの組合わせを含む医薬組成物。
65. アンジオポエチン-2のアンタゴニストが抗体である、実施形態64に記載の組成物。
66. アンジオポエチン-2のアンタゴニストが完全ヒトモノクローナル抗体である、実施形態65に記載の組成物。
67. 抗体が3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3、MEDI1/5、MEDI2/5、MEDI3/5、MEDI6/5、およびMEDI4/5からなる群より選択される完全ヒトモノクローナル抗体のいずれか1つと同じエピトープと結合する、実施形態65または66に記載の組成物。
68. 抗体が3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3、MEDI1/5、MEDI2/5、MEDI3/5、MEDI6/5、およびMEDI4/5からなる群より選択される完全ヒトモノクローナル抗体である、実施形態65に記載の組成物。
69. CSF1Rの生物学的活性のアンタゴニストがチロシンキナーゼインヒビターである実施形態64〜68のいずれかに記載の組成物。
70. CSF1Rの生物学的活性のアンタゴニストが次の化合物：
2-クロロ-N-ピリジン-3-イル-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-N-(5-フルオロピリジン-3-イル)-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-N-(5-フルオロピリジン-3-イル)-5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-ベンズアミド；
2-メチル-N-ピリジン-3-イル-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-シクロプロピルベンゾイル)アミノ]-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-[(3-クロロ-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-[(3-シクロプロピル-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-ピリジン-3-イルベンズアミド；
5-{[3-(1-シアノ-1-メチルエチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-クロロ-N-1,3-チアゾール-5-イル-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-N-1,3-チアゾール-5-イルベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3,5-ジメチルベンゾイル)アミノ]-N-1,3-チアゾール-5-イルベンズアミド；
5-{[3-(1-シアノ-1-メチルエチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-1,3-チアゾール-5-イルベンズアミド；
2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-クロロ-5-[(3,5-ジメチルベンゾイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-クロロ-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)-5-{[3-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}ベンズアミド；
2-クロロ-5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(5-{[3-(1-シアノ-1-メチルエチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチルベンゾイル)アミノ]-N-メチル-1,3-チアゾール-2-カルボキサミド；
5-{[3-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]アミノ}-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-クロロ-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-シクロプロピル-5-フルオロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-クロロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[3,4-ジクロロベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3-シクロプロピルベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
5-[(3,5-ジメチルベンゾイル)アミノ]-2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-メチル-5-[(3-メチルベンゾイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2,6-ジクロロ-N-(4-メチル-3-{[(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)アミノ]カルボニル}フェニル)イソニコチンアミド
2-メチル-5-{[(3-メチルシクロヘキシル)カルボニル]アミノ}-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
2-メチル-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)-5-(ペンタノイルアミノ)ベンズアミド；
2-メチル-5-[(4-メチルヘキサノイル)アミノ]-N-(2-メチル-1,3-チアゾール-5-イル)ベンズアミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,3-ジクロロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-5-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-イソプロピルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-5-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-(2-メトキシエトキシ)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-7-(2-メトキシエトキシ)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-5-メチルフェニル)アミノ]-7-(2-メトキシエトキシ)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(4-イソプロピルピペラジン-1-イル)-7-(2-メトキシエトキシ)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(1-メチルピペリジン-4-イル)キノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシキノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシキノリン-3-カルボキサミド；および
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシキノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチル-フェニル)アミノ]-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)シンノリン-3-カルボキサミド；
4-(2-フルオロ-4-メチルフェニルアミノ)-7-メトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)シンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-メトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)シンノリン-3-カルボキサミド；
6-[(3R,5S)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル]-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；
7-エトキシ-4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]シンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(3-クロロ-2-フルオロフェニル)アミノ]-6-[(3R,5S)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-(1-イソプロピルピペリジン-4-イル)-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド塩酸塩；
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-[1-(2-ヒドロキシエチル)ピペリジン-4-イル]-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド；および
4-[(2-フルオロ-4-メチルフェニル)アミノ]-6-{4-[(2R)-2-ヒドロキシプロパノイル]ピペラジン-1-イル}-7-メトキシシンノリン-3-カルボキサミド、またはその製薬上許容される塩のいずれか1つから選択される、実施形態69に記載の組成物。
71. 製薬上許容される賦形剤または担体と結合した、実施形態62〜70のいずれか1つに記載の組合わせを含む医薬組成物。
72. 疾患に関係する血管新生または炎症の治療に使用するための、実施形態71に記載の医薬組成物。
73. 癌の治療に使用するための、実施形態71に記載の医薬組成物。
74. 実施形態62〜73のいずれか1つに記載の組合わせによる、それを必要とする動物における疾患に関係する血管新生または炎症を治療する方法。
75. 実施形態62〜73のいずれか1つに記載の組合わせによる、それを必要とする動物における癌を治療する方法。
76. アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性のアンタゴニストおよび化学治療薬を含む組成物。
77. アンジオポエチン-2のアンタゴニストが抗体である、実施形態76に記載の組成物。
78. アンジオポエチン-2のアンタゴニストが完全ヒトモノクローナル抗体である、実施形態77に記載の組成物。
79. 抗体が3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3、MEDI1/5、MEDI2/5、MEDI3/5、MEDI6/5、およびMEDI4/5からなる群より選択される抗体と同じエピトープと結合する、実施形態77または78のいずれか1つに記載の組成物。
80. 抗体が3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3、MEDI1/5、MEDI2/5、MEDI3/5、MEDI6/5、およびMEDI4/5からなる群より選択される完全ヒトモノクローナル抗体である、実施形態78に記載の組成物。
81. 化学治療薬がドセタキセル、AZD4877、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン、タキソール、タキソテール、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、フルオロピリミジン、テガフール、ラルチトレキセド、カペシタビン、メトトレキセート、ペメトレキセド、シトシン・アラビノシド、ヒドロキシウレア、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、カンプトテシン、テニポシド、アムサクリン、オキサリプラチン、シスプラチンオキサリプラチン、5-フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビンおよびカルボプラチンからなる群より選択される、実施形態76〜80のいずれか1つに記載の組成物。
82. 製薬上許容される 賦形剤または担体と結合した、実施形態76〜81のいずれかに記載の組成物。
83. 実施形態76〜82のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含むものである、アンジオポエチン-2および／またはTie-2の生物学的活性にアンタゴニスト作用を果たす方法。
84. 実施形態76〜82のいずれか1つに記載の組成物の治療上有効な量を投与するステップを含むものである、患者において抗癌効果を生じる方法。
85. 実施形態76〜82のいずれか1つに記載の組成物の治療上有効な量を投与するステップを含むものである、動物における腫瘍成長を低下させる方法。
VI 配列
3.19.3 軽鎖配列番号：1
Figure 0005596559

本配列中の箱に入った残基は、任意の他のアミノ酸へ変えることができる不対システイン（C49）を表す。かかる変更の例を以下の軽鎖配列において箱に入れて強調した。
3.19.3 重鎖配列番号2
Figure 0005596559

本配列中の箱に入った残基は、他の残基に「戻し変異」することができる残基の一例を表す。かかる「戻し変異」の一例をMEDI5重鎖配列に示した。
MEDI1 軽鎖配列番号3
Figure 0005596559

MEDI2 軽鎖配列番号4
Figure 0005596559

MEDI3 軽鎖配列番号5
Figure 0005596559

MEDI4 軽鎖配列番号6
Figure 0005596559

MEDI5 重鎖配列番号7
Figure 0005596559

MEDI6 軽鎖配列番号8
Figure 0005596559
実施例１ 改変されたAng-2抗体の効力
本実施例においては、Ang-2抗体3.19.3の軽鎖と重鎖を含むAng-2特異的抗体を改変して、軽鎖の位置49においてシステインのアミノ酸置換を導入した。得られる抗体の効力をAng-2：Tie-2効力アッセイで測定した。結果を以下の表1に示した。
表1：改変されたAng-2抗体の効力
Figure 0005596559
結果：
Ang-2：Tie-2効力アッセイにおいて、位置49の様々な改変は抗体において類似の効力をもたらした。例示の抗体は、限定されるものでないが、C49A、C49T、C49N、およびC49Dを含む。嵩ばった、疎水性置換を含む改変のいくつか、例えば、C49WはIC50値の増加により示される効力の低下をもたらした。様々な荷電残基を含む他の改変、例えば、C49KおよびC49HもIC50値の増加により示される効力の低下をもたらした。
実施例２ 改善された抗体生産効率
本実施例においては、Ang-2抗体3.19.3の軽鎖と重鎖を含むAng-2特異的抗体を改変して、軽鎖の位置49においてシステインのアミノ酸置換を導入した。得られる抗体の相対的発現を測定した。さらに、いくつかの抗体の重鎖の位置37も改変してVal残基（MEDI5）を導入した。
材料と方法：
3.19.3の重鎖と軽鎖（それぞれ配列番号2および1）、ならびにそれぞれ配列番号7および3と記述された重鎖と軽鎖（IgG1およびIgG2フォーマットの両方で）をコードするベクターを293F細胞にて、次のプロトコルによって発現させた：すなわち、生存細胞（＞95％）をFreestyle293(登録商標)培地（Invitrogen）中で1.0 x 106細胞/minの細胞密度にて希釈した。様々なDNA調製物を293Fectin(登録商標)（Invitrogen）に溶解し、細胞に、製造業者の指示書に従って加えた。形質転換の第6日に、培養上清を回収することにより発現した抗体を収穫した。抗体レベルをプロテインA結合により測定した後に精製した。
結果：
“MEDI1/5 IgG1”（配列番号7および3として記述した重鎖と軽鎖をIgGフォーマットで有する）、および“MEDI1/5 IgG2”（配列番号7および3として記述した重鎖と軽鎖をIgGフォーマットで有する）抗体の生産効率は3.19.3抗体の生産効率と比較して増加した。その結果を表2に総括した。
表2：改善されたAng-2抗体の生産効率
Figure 0005596559
これらの結果は、Ang-2特異的抗体の可変軽鎖の位置49におけるシステインのトレオニンへの置換と重鎖の位置37におけるグリシンのバリンへの置換が結合すると、生産効率（すなわち収率および／または回収）の大きい改善をもたらすことを実証する。
実施例３ Ang-2抗体の安定性の増加
システイン置換が行われたAng-2抗体の安定性増加を評価するために、安定性研究を実施した。IgG1およびIgG2フォーマットのWT3.19.3抗体ならびにMEDI1/5を、10mMヒスチジンpH 6.0中で10mg/mlに濃縮した。上記製剤のサンプルを25℃または40℃の両方で2週間インキュベートした。安定性の尺度として、凝集速度（％凝集/月）を2週間時点後に計算した。結果を表3に示した。
表3：Ang-2抗体の安定性
Figure 0005596559
表3に示したように、MEDI1/IgG1およびIgG2抗体はWT（3.19.3）抗体と比較して安定性の向上を示す。また、図2に示されるように、野生型抗体（3.19.3）が示す不均一性の多くがIgG1またはIgG2フォーマットのMEDI1/5抗体では消滅した。図2のクロマトグラフは、野生型抗体のC49の置換がサンプル中に存在する複数の抗体種を低減または排除することを示す。
実施例４ Ang-2抗体の安定性の増加
システイン置換が行われたAng-2抗体の安定性の増加を評価するために、WT（3.19.3）およびMEDI1/5 IgG1およびIgG2抗体の示差走査熱量測定（DSC）分析を実施した。この実施例においては、WT、MEDI1/5 IgG1およびMEDI1/5 IgG2抗体の製剤を、10mMヒスチジン、pH6.0中の抗体1g/Lにて調製し、DSC分析で処理した。結果を図1に示す。提示したように、WT抗体は約61℃の融点を示した。MEDI1/5 IgG1抗体はより高い約76℃の融点を示した。MEDI1/5 IgG2もより高い約76℃の融点を示したが、この場合、その後、2つの独立した試験で観察される食い違いを生じた（試験1と2）。
これらの結果は、MEDI1/5抗体が、融点により測定して、WT（3.19.3）抗体を超える安定性の増加を示すことを示唆する。
実施例５ Ang-2抗体の結合プロファイル
本実施例においては、Ang-2抗体の3.19.3、およびC49T（MEDI1/5）置換を含む改変された3.19.3抗体を、競合ELISAフォーマットアッセイにおけるAng-2結合について分析した。
材料および方法：
競合Tie-2 Fc/Ang2 ELISA：Maxisorp ELISAプレート（Nunc、Rochester、NY）を、100μlの4μg/ml Tie-2 Fc（R & D Systems、Minneapolis、MN）を含む0.1M炭酸塩バッファーpH 9.4（Pierce、Rockford、IL）でコートし、一晩4℃でインキュベートした。翌日、プレートを1時間室温で0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma, St. Louis, MO）および0.1％ Tween-20（Sigma, St. Louis、MO）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（Invitrogen、Carlsbad、CA）の200μlを用いてブロックした。プレートを洗浄バッファー（0.05％ Tween-20を含有するPBS）を用いて3回洗浄した。3.19.3または改変された抗Ang2抗体の11点連続三次希釈液（30μg/ml高濃度）50μlを、ネガティブ対照のPBSと共にプレーティングした。抗体捕獲については、200ng/mlビオチンAng2（R & D Systems, Minneapolis, MN）50μlを加え、プレートを2時間室温にてインキュベートした。プレートを3回洗浄バッファーによって洗浄した。洗浄後、1：5000ストレプトアビジンHRP（Pierce, Rockford, IL）の洗浄バッファー中の希釈液100μlを加え、1時間室温にてインキュベートした。プレートを3回洗浄バッファーによって洗浄した。プレートを、100 μlのTMBペルオキシダーゼ基質（KPL, Gaithersburg, MD）を加えることにより5分間現像した。反応を、100μl/wellの1Mリン酸を加えることにより停止した。光学密度を450nmにてマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて測定した。
結果：
図3に掲げたように、ELISA結果は、ELISAフォーマットでTie2に対する競合により測定すると、IgG1またはIgG2フォーマットのMEDI1/5抗体は3.19.3抗体と比較して、非常に類似したAng-2との結合プロファイルを表すことを示した。
実施例６ 組合わせ研究
小分子CSF1Rチロシンキナーゼインヒビターと組合わせた3.19.3のin vivo効力を評価した。
研究6.1 MCF7乳癌異種移植モデルにおける、mAb 3.19.3のCSF1RアンタゴニストAZD6495と組合わせた治療効力の決定
抗アンジオポエチン-2モノクローナル抗体3.19.3の、小分子CSF1RチロシンキナーゼインヒビターAZD6495（4-[(2,4-ジフルオロフェニル)アミノ]-7-エトキシ-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)キノリン-3-カルボキサミド）と組合わせた抗腫瘍活性を、ヒト乳癌の異種移植モデルでMCF7細胞株を用いて評価した（図4a）。
材料および方法：
乳癌MCF7細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。免疫不全の7〜10週齢雄NCr-ヌードマウスに、マトリゲル中に1：1で懸濁した8x106 MCF7細胞を右横腹に皮下移植した。17-B-エストラジオールのペレット（0.72mg/ペレット）も、標準の手順で移植し、このERポジティブ（エストロゲン要求性）細胞株の成長を支援した。
腫瘍がおよそ100mm3に達すると、次いでマウスを、15マウスを含有するコホートに無作為化した。マウスを、mAb 3.19.3（10mg/kg）による毎週2回その後3週間の腹腔内（IP）注射によって、またはCSF1RインヒビターA（AZD6495）（30mg/kg）の1日2回、18日間の経口投与によって治療した。全ての実験に対して、0.5％ HPMCを経口ビヒクル単独の対照として用いた。各動物の体重および各腫瘍の次元を毎週2回測定した。腫瘍の体積は、体積＝長さ x (幅)2 x 0.5 cm3として計算するか、または両側ノギス測定および腫瘍を横切る最大直径を長さに取りかつ対応する垂直長を幅に取って式(π/6) x (長さ x 幅) x √(長さ x 幅)を用いて計算した。治療の開始からの成長阻害は、対照と治療グループ間の腫瘍体積の差の比較により評価した。
研究設計の総括は次の通りであった：
表4：研究設計
Figure 0005596559
図4aに図解した通り、3.19.3およびAZD6495は単剤としてMCF7腫瘍の成長を遅延した。
しかし、3.19.3とAZD6495の組合わせは、図4aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2 x wk）＝62％阻害；（p<0.04）
AZD6495（30mg/kg bid）＝32％阻害；（p<0.42）
3.19.3＋AZD6495の組合わせ＝81％阻害（p<0.01）。
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図4b）。マクロファージ集団の変化をF4/80染色および蛍光活性化細胞ソーティングを介して測定し、腫瘍組織をCD31＋血管染色密度を介して分析し、腫瘍が関係する脈管構造に与える効果を試験した。CD31染色密度は閾値によりおよびマニュアル式グリッド計数法により測定することができる。3.19.3のCSF1Rチロシンキナーゼインヒビターとの組合わせは、腫瘍関連マクロファージ集団とCD31染色血管の両方に対して有意に大きい効果を生じることが期待される。
これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3と小分子CSF1RアンタゴニストAZD6495による組合わせ治療が乳癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを示す。
研究6.2 MDA-MB-231同所乳癌異種移植モデルにおける、mAb 3.19.3のCSF1RアンタゴニストAZD6495と組合わせた治療効力の決定
抗アンジオポエチン-2モノクローナル抗体3.19.3の、小分子CSF1RチロシンキナーゼインヒビターAZD6495と組合わせた抗腫瘍活性を、ヒト乳癌の異種移植モデルでMDA-MB-231細胞株を用いて評価した。
乳腺癌MDA-MB-231細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。免疫不全の7〜10週齢雌NCr-ヌードマウスに、マトリゲル中に1：1で懸濁した8x106 MDA-MB-231細胞を乳房脂肪パッド中に同所移植した。腫瘍がおよそ100mm3に達すると、次いでマウスを、10マウスを含有するコホートに無作為化した。マウスを、mAb 3.19.3（10mg/kg）を用いて腹腔内（IP）注射により毎週2回、その後3週間、またはAZD6495（30mg/kg）と次いで毎日2回、18日間の経口投与により治療した。全ての実験に対して、0.5％HPMCを経口ビヒクル単独の対照として用いた。各動物の体重および各腫瘍の次元を毎週2回測定した。腫瘍の体積は、体積＝長さ x (幅)2 x 0.5 cm3として計算するか、または両側ノギス測定および腫瘍を横切る最大直径を長さに取りかつ対応する垂直を幅に取って式(π/6) x (長さ x 幅) x √(長さ x 幅)を用いて計算した。
治療の開始からの成長阻害は、対照と治療グループ間の腫瘍体積の差の比較により評価した。
研究設計の総括は次の通りであった：
表5：研究設計
Figure 0005596559
図5aに図解した通り、3.19.3およびAZD6495は単剤としてMDA-MB-231腫瘍の成長を遅延した。しかし、3.19.3とAZD6495の組合わせは、図5aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2 x wk）＝17％阻害；（p<0.20）
AZD6495（30mg/kg bid）＝25％阻害；（p<0.04）
3.19.3＋AZD6495の組合わせ＝52％阻害（p<0.09）。
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図5b）。マクロファージ集団の変化をF4/80染色および蛍光活性化細胞ソーティングを介して測定し、腫瘍組織をCD31＋血管染色密度を介して分析し、腫瘍が関係する脈管構造に与える効果を試験した。CD31染色密度は閾値によりおよびマニュアルのグリッド計数法により測定することができる。3.19.3のCSF1Rチロシンキナーゼインヒビターとの組合わせは、腫瘍関連マクロファージ集団とCD31染色血管の両方に対して有意に大きい効果を生じることが期待される。
これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3と小分子CSF1RアンタゴニストAZD6495による組合わせ治療が乳癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを示す。
実施例７ 組合わせ研究
モノクローナル抗体3.19.3の活性を、化学治療薬との組合わせ研究で評価し、ヒト腫瘍異種移植モデルにおけるin vivo効力と耐性を決定した。
研究7.1. LoVo異種移植腫瘍における、モノクローナル抗体3.19.3の5-フルオウラシルと組合わせた治療効力の決定
3.19.3の、5-フルオウラシル（5FU）と組合わせた抗腫瘍活性を、結腸直腸癌のLoVo異種移植モデルで評価した。LoVo細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。雌Swissヌードマウスの横腹に、およそ3 x10E6細胞を含有する細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍体積が200mm3に達すると、マウスを8〜10マウスの治療グループに無作為化し、治療を開始した。3.19.3（10mg/kg）を含む生理食塩水を毎週2回、2週間、腹腔内に注射し、5-フルオウラシル（100mg/kg）を週スケジュールに従って腹腔内投与した。各腫瘍の次元と体重を、毎週少なくとも2回測定した。腫瘍の体積は、体積＝長さx(幅)2x0.5（cm3）として計算した。図6aに図解した通り、3.19.3と5FUは単剤としてLoVo腫瘍の成長を遅延した。しかし、3.19.3と5FUの組合わせは、図6aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2 x wk）＝59％阻害；（p<0.09）
5FU（100mg/kg/week）＝62％阻害；（p<0.02）
3.19.3＋5FUの組合わせ＝85％阻害（p<0.007）
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図6b）。これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3と5-フルオウラシルによる組合わせ治療が結腸癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを実証し、この組合わせのさらなる臨床研究のための根拠を提供する。
研究7.2. HT-29異種移植腫瘍における、モノクローナル抗体3.19.3のイリノテカンと組合わせた治療効力の決定
3.19.3の、イリノテカンと組合わせた抗腫瘍活性を、結腸直腸癌のHT-29異種移植モデルで評価した。HT-29細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。雌Swissヌードマウスの横腹に、およそ3 x10E6細胞を含有する細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍体積が200mm3に達すると、マウスを8〜10マウスの治療グループに無作為化し、治療を開始した。3.19.3（10mg/kg）を含む生理食塩水を毎週2回、2週間、腹腔内に注射した。イリノテカン（35mg/kg）を週スケジュールに従って静脈内投与した。各腫瘍の次元と体重を、少なくとも毎週2回測定した。腫瘍の体積は、体積＝長さx(幅)2x0.5（cm3）として計算した。図7aに図解した通り、3.19.3とイリノテカンは単剤としてHT29腫瘍の成長を遅延した。しかし、3.19.3とイリノテカンの組合わせは、図7aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2 x wk）＝44％ 阻害； （p<0.005）
イリノテカン（35mg/kg/week）＝56％阻害；（p<0.006）
3.19.3＋イリノテカンの組合わせ＝71％阻害（p<0.0001）
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図7b）。これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3とイリノテカンによる組合わせ治療が結腸癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを実証し、この組合わせのさらなる臨床研究のための根拠を提供する。
研究7.3. Colo205異種移植腫瘍における、モノクローナル抗体3.19.3のゲムシタビンと組合わせた治療効力の決定
3.19.3の、ゲムシタビンと組合わせた抗腫瘍活性を、結腸直腸癌のColo205異種移植モデルで評価した。Colo205細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。雌Swissヌードマウスの横腹に、およそ3 x 10E6細胞を含有する細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍体積が200mm3に達すると、マウスを8〜10マウスの治療グループに無作為化し、治療を開始した。3.19.3（10mg/kg）を含む生理食塩水を毎週2回、2週間、腹腔内に注射した。ゲムシタビン（50mg/kg）を毎3日1回のスケジュールに従って静脈内投与した。各腫瘍の次元と体重を、少なくとも毎週2回測定した。腫瘍の体積は、体積＝長さx(幅)2x0.5（cm3）として計算した。図8aに図解した通り、3.19.3は単剤としてColo205腫瘍の成長を遅延したが、Colo205腫瘍はゲムシタビン治療に対してかなり耐性がありおだやかな8％腫瘍成長遅延をもたらした。しかし、3.19.3とゲムシタビンの組合わせは、図8aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2 x wk）＝74％阻害；（p<0.001）
ゲムシタビン（50mg/kg q3d x 2）＝8％阻害；（p<0.2）
3.19.3＋ゲムシタビンの組合わせ＝88％阻害（p<0.0003）。
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図8b）。これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3とゲムシタビンによる組合わせ治療が結腸癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを実証し、この組合わせのさらなる臨床研究のための根拠を提供する。
研究7.4. Calu6異種移植腫瘍における、モノクローナル抗体3.19.3のドセタキセルと組合わせた治療効力の決定
3.19.3の、ドセタキセルと組合わせた抗腫瘍活性を、肺癌のCalu6異種移植モデルで評価した。Calu6細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。雌Swissヌードマウスの横腹に、およそ3 x 10E6細胞を含有する細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍体積が200mm3に達すると、マウスを8〜10マウスの治療グループに無作為化し、治療を開始した。3.19.3（10mg/kg）を含む生理食塩水を毎週2回、2週間、腹腔内に注射した。ドセタキセル（15mg/kg）を週スケジュールに従って静脈内投与した。各腫瘍の次元と体重を、少なくとも毎週2回測定した。各腫瘍の体積は、体積＝長さx(幅)2x0.5（cm3）として計算した。図9aに図解した通り、3.19.3とドセタキセルは単剤としてCalu6腫瘍の成長を遅延した。しかし、3.19.3とドセタキセルの組合わせは、図9aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。
達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2xwk）＝20％阻害；（p<0.12）
ドセタキセル（15mg/kg/week）＝43％阻害；（p<0.0007）
3.19.3＋ドセタキセルの組合わせ＝71％阻害（p<0.0001）。
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図9b）。これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3とドセタキセルによる組合わせ治療が肺癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを実証し、この組合わせのさらなる臨床研究のための根拠を提供する。
研究7.5. H460異種移植腫瘍における、モノクローナル抗体3.19.3のオキサリプラチンと組合わせた治療効力の決定
3.19.3の、オキサリプラチンと組合わせた抗腫瘍活性を、肺癌のH460異種移植モデルで評価した。H460細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。雌Swissヌードマウスの横腹に、およそ3 x 10E6細胞を含有する細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍体積が200mm3に達すると、マウスを8〜10マウスの治療グループに無作為化し、治療を開始した。3.19.3（10mg/kg）を含む生理食塩水を毎週2回、2週間、腹腔内に注射した。オキサリプラチン（5mg/kg）を週スケジュールに従って腹腔内投与した。各腫瘍の次元と体重を、少なくとも毎週2回測定した。各腫瘍の体積は、体積＝長さx(幅)2x0.5（cm3）として計算した。図10aに図解した通り、3.19.3とオキサリプラチンは単剤としてH460腫瘍の成長を遅延した。しかし、3.19.3とオキサリプラチンの組合わせは、図10aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2 x wk）＝67％阻害；（p<0.001）
オキサリプラチン（5mg/kg/week）＝35％阻害；（p<0.01）
3.19.3＋オキサリプラチンの組合わせ＝75％阻害（p<0.0001）。
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図10b）。これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3とオキサリプラチンによる組合わせ治療が肺癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを実証し、この組合わせのさらなる臨床研究のための根拠を提供する。
研究7.6. H460異種移植腫瘍における、モノクローナル抗体3.19.3の有糸分裂Eg5インヒビターAZD4877と組合わせた治療効力の決定
3.19.3の、AZD4877と組合わせた抗腫瘍活性を、肺癌のH460異種移植モデルで評価した。H460細胞を日常の方法でフラスコ内で培養して細胞をサブコンフルエンスに到達させた。雄NCr nu/nuマウスの右横腹に、およそ3 x 10E6細胞を含有する細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍体積が200mm3に達すると、マウスを8〜10マウスの治療グループに無作為化し、治療を開始した。3.19.3（10mg/kg）を含む生理食塩水を毎週2回、2週間、腹腔内に注射した。AZD4877（10mg/kg）を毎4日のスケジュールに従って腹腔内投与した。各腫瘍の次元と体重を、少なくとも毎週2回測定した。各腫瘍の体積は、体積＝長さx(幅)2x0.5（cm3）として計算した。図11aに図解した通り、3.19.3とAZD4877は単剤としてH460腫瘍の成長を遅延した。しかし、3.19.3とAZD4877の組合わせは、図11aに図解した通り、単剤だけより大きい効果を有した。達成された％腫瘍成長阻害は次の通りである：
3.19.3（10mg/kg 2 x wk）＝64％阻害；（p<0.001）
AZD4877（10mg/kg q4d x2）＝50％阻害；（p<0.001）
3.19.3＋AZD4877の組合わせ＝78％阻害（p<0.0001）
体重変化により測定して、単剤治療だけと比較して、組合わせによるさらなる毒性は観察されなかった（図11b）。これらの結果は、抗Ang2抗体3.19.3とAZD4877による組合わせ治療が肺癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを実証し、この組合わせのさらなる臨床研究のための根拠を提供する。
抗Ang-2抗体3.19.3の化学治療薬と組合わせた研究はドセタキセル、5-フルオウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン、またはゲムシタビンを包含し、体重変化により示されたように、組合わせによるさらなる毒性なしに少なくともさらなる活性を実証した。これらの結果は、モノクローナル抗体3.19.3と化学療法による組合わせ療法は癌の前臨床モデルにおいてさらなる毒性なしに効力の改善をもたらすことを実証した。
モノクローナル抗体3.19.3のVEGFインヒビターおよび化学治療薬との異種移植組合わせ研究の結果を以下に総括する。
表6：3.19.3のVEGFインヒビターおよび化学治療薬との総括
Figure 0005596559
実施例８ コラーゲン誘導関節炎のDBA/1マウスモデルin vivoにおける、Ang-2抗体3.19.3治療投与の疾患進行に与える効果
ラットコラーゲンII型乳濁液の調製： ウシコラーゲンII型（MD Biosciences, Cat # IMBII; Lot 090205）は4℃にて暗所で使用まで貯蔵した。動物を免疫感作する前に、ウシコラーゲンはストック溶液2mg/mLにて0.01M酢酸に溶解し、一晩暗所にて貯蔵した。免疫感作の当日、コラーゲンを等体積のフロイント完全アジュバント（FCA [Difco、Cat # 231131; Lot 850262/R1]）によって乳濁化し、1mg/mLの溶液を得た。
関節炎の誘導：
第0日に、雄DBA/1マウス（6〜8週齢、Harlan Sprague Dawley、UK）を3.5％イソフランを用いて軽く麻酔をかけ、そして尾根の直ぐ上の皮膚内に、FCA中に乳濁化したラットコラーゲンII型の100μg（1mg/mL；0.1mL/マウス）を用いて免疫感作した。ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）ブースター： 第21日、全てのマウスを前記の通り麻酔し、30μg SEB（注射用水［Toxin Technology, Cat # BT202; Lot 70903］中の600μg/mlを等体積のフロイント不完全アジュバント［Sigma, Cat # F5506; Lot 112K8930］中に乳濁化して最終濃度300μg/mlとしたもの）のブースター注射を行った。50μl x 2（30μg SEBと等価）を免疫感作部位に隣接した皮膚内に注射した。
関節炎の評価：
動物の健康状態の臨床観察を投薬時点から毎日行った。疾患の臨床徴候についての観察を、免疫感作後の第20日に行い、その際、動物をそのミクロ環境から取り出し、以下に概説したスコアリング系を用いてスコアを付けた。
表7 後足と前足に対するスコアリング系
Figure 0005596559
投薬：
動物を下記の通り、無作為に治療グループに割当てた。
表8 治療グループ
Figure 0005596559
治療グループ2の動物に治療として、腹腔内（i.p.）に3.19.3の10mL/kgを疾患発症（1以上の足における臨床スコア2と定義した）から毎3日、14日間投薬した。精製したヒトIgG（hIgG）を陰性アイソタイプ対照として用いた。治療グループ4の動物に治療として、経口（p.o.）でプレドニソロン3mg/kgを疾患発症（1以上の足における臨床スコア2と定義した）から、毎日、14日間投薬した。
終結：
動物を疾患発症後14日に高濃度の二酸化炭素に曝露して終結した。マウス足を死後切除し、10％緩衝化ホルマリンで固定し、脱灰した。脱灰した足を日常の方法で処理し、次いでパラフィンブロックに包埋した。連続切片（10μm）を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して組織学分析を行った。
データ分析：
臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、疾患発症後の各動物について計算した。
特に断らない限り、統計分析はビヒクル対照とのDunnettのpost-hoc比較を用いる一方向ANOVAによった。全研究を通じて、P<0.05を統計的有意であると考えた。
結果：
10mg/kgの用量での3.19.3（ビヒクル対照とのDunnettのpost-hoc比較を用いる一方向ANOVA）によって、疾患進行（関節炎のスコア）の臨床徴候と滑膜炎および関節破壊の組織学的評価の両方において、有意な低下が観察された。
表9： 3.19.3のCIA疾患進行に対する治療効果
Figure 0005596559
表9は、3.19.3の治療投与（10mg/kg i.p 毎3日）の、曲線下面積［AUC］により測定したコラーゲン誘導関節炎の時間経過全体にわたる臨床疾患進行に対する効果を示す（値は、平均±平均の標準誤差を表し、3.19.3、PBSビヒクルおよびhIgG治療グループについてはn＝15、プレドニソロン対照グループについてはn＝10である）。
CIAモデル治療グループの組織病理学的評価：
結果は、3.19.3の投与後の抗関節炎効果の明解な確証を示し、これは形態学的には滑膜の過形成および線維症について最も明らかであった。本研究においては、非定形細胞型は存在しなかったし、骨の非定形徴候も存在しなかった。本研究において、臨床スコアと組織学的測定の間には良い相関がある。
PBSビヒクル治療グループ：
PBSビヒクルで治療した動物の大部分において著しい関節症が認められた。その病理症状は広汎な（本質的に単核細胞）滑膜炎であって、脛骨-距骨空間に侵入しかつおよび踵骨の表面の小面に広がる。両方の接触滑膜炎からおよびパンヌス拡大から骨髄空洞および間質空洞中への骨（特に距骨および舟状骨）の広汎な溶解破壊が存在した。滑膜の線維症が共通し、時折、類線維素堆積、様々な程度の滑膜過形成を伴った。
3.19.3の10mg/kg治療グループ：
3.19.3治療グループは、全ての関節症病変の発生率および重症度において組織学的に有意な低下を示したが、最も顕著であったのは、滑膜の過形成および線維症の低下と共に関節空間および骨髄限局性パンヌスの両方の重症度の低下であった。
ヒトIgGアイソタイプ対照治療グループ：
組織学的に、このグループとPBSビヒクルグループとの間に有意差はなかった。
プレドニソロン3mg/kg： このグループは全ての関節症病変の発生率および重症度において顕著な低下を示した。
総括：
本研究は、アンジオポエチン-2の中和は、雄dba/1マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎を改善するのに有効であり（図12a）、疾患発症からの期間を通して各治療グループ間で平均体重の有意な変化が観察されず、3.19.3療法が十分に耐えられる（図12b）ことを示す。本研究は10mg/kgの用量における3.19.3の効力を評価し、かつ疾患進行の臨床徴候（関節炎のスコア）と滑膜炎および関節破壊の組織学的評価の両方の低下を実証した。
実施例９ 抗Ang-2抗体は網膜血管発生を阻害する
抗Ang-2抗体、MEDI1/5抗体の網膜血管発生に対する効果を、治療マウスと対照治療マウスを対比した網膜サンプルを比較することにより研究した。
方法：
CD1子マウスを無治療のまま置くかまたは腹腔内にMEDI1/5（1mg/kgまたは10mg/kg）を第1日、第3日および第5日（第1日は誕生日）に投薬した。第10日に、子マウスをイソフルランを用いて麻酔し、次いで12.5mg/ml FITC-デキストラン（Vector Labs）を潅流した。角膜に小さいスリットを作り、全眼を眼杯から取り出した後、10％中和緩衝化ホルマリン中に置いた。ホルマリンに1時間固定した後、眼を簡単にPBSでリンス洗浄し、次いでPBSの皿に移して解剖した。網膜を注意深く解剖し、クローバ葉型に切断し、その後、Vectashield（Vector Labs）を用いてガラススライド上に載せた。平滑なスライドの画像を検査し、蛍光顕微鏡（Nikon）を用いて付属デジタルカメラシステムにより撮影した。
結果：
無治療の子マウス（図13a）と0.3mg/kgのMEDI1/5で治療した子マウス（図13b）の網膜脈管構造は、白い矢で示した網膜の外端へ伸びている。MEDI1/5の用量を増加した治療をすると、本発明者らは、進行する網膜血管の阻害のレベルに用量応答があることを認めた（図13cおよび13d）。網膜の外縁の境界は点線で示され、両方の用量において硝子体血管（白い矢）は網膜の外縁に達するが、1mg/kg MEDI1/5（図13c）の網膜血管（白い矢頭）は10mg/kg MEDI1/5（図13d）治療グループと比較して網膜の外周により近い位置にある。これらの結果は、MEDI1/5抗Ang-2抗体の治療による網膜血管新生の用量依存性の阻害を示す。
実施例１０ 抗Ang-2抗体はFGF介在性血管新生を阻害する
抗Ang-2抗体MEDI1/5を、FGF2（塩基性FGF）誘導Matrigel(登録商標)プラグアッセイで抗血管新生効果について評価した。組換えマウスFGF2（rmFGF塩基性；R&D Systems）をMatrigel(登録商標)（成長因子含量が低く、フェノールレッドを含まないもの；Trevigen）と1μg/mlで予め混合した。それぞれ5〜6週齢の雌胸腺欠損マウスに500μlのFGF2/Matrigel(登録商標)混合物を皮下移植した。抗体MEDI1/5を投与して、10分間後に、FGF2/Matrigel(登録商標)移植をし、続いて3日毎に腹腔内に1、10、および20mg/kgにて合計3用量を投与した。血管新生の程度を10日後にデキストラン機能性血管を測定することにより評価した。マウスに、FITC-デキストラン（250,000MW；Sigma）25mg/mlを含む生理食塩水100μlを静脈注射した。FITC-デキストラン注射後20分に、マウスを人為的に安楽死させ、プラグを分析した。プラグを次いで、1mlのPBSを含有する溶解マトリックスチューブA（MP Biomedicals）中に置き、そしてFastPrepマシーン（MP Biomedicals）で60秒間、6.0M/Sにてホモジナイズした。サンプルを次いで10,000rpmにて5分間遠心分離し、上清を採集した。各サンプル（二重の）の200μlを次いで白色、透明底の96ウエルプレート中に置き、FITC出力をEnVision計器（Perkin Elmer）で読取った。
組織を研究するために、プラグを収穫し、10％中性緩衝化ホルマリン中に置いて処理し、次いでパラフィンに包埋した。パラフィン包埋した組織を次いで切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
結果：
およそ0.78μgのFITC-デキストランを1μg/mlのFGF2により誘導したプラグ中に検出することができた（図14a）。他方、これらのFGF2処理したプラグを、1、10、および20mg/kgの範囲の3用量のMEDI1/5に曝すと、収穫したプラグ中に存在するFITC-デキストランの量は0.05〜3μgであった。MEDI1/5治療した動物におけるFITC-デキストランのこの有意な低下は、MEDI1/5がMatrigel(登録商標)プラグ中のFGF2誘導性血管新生を阻害することを示唆する。プラグをヘマトキシリンおよびエオシンで染色すると（図14b）、FGF2＋MEDI1/5プラグはFGF2プラグ単独と比較して血管が少ないことを示し、従って、抗Ang-2抗体MEDI1/5はFGF-介在性血管新生を阻害するという確証をさらに提供した。
実施例１１ 抗Ang-2抗体は関節炎のマウスモデルにおける疾患進行を阻害する。
本実施例においては、抗Ang-2抗体3.19.3をコラーゲン誘導関節炎（CIA）マウスモデルに用いて治療効力を実証することを試みた。
材料および方法：
コラーゲン誘導関節炎（CIA）疾患モデルにおける臨床疾患進行に対する治療の効果を研究するために、 コラーゲン誘導関節炎を雄DBA/1マウスに誘導し、動物に治療として試験治療薬を投薬した。
ラットコラーゲンII型乳濁液の調製：
ウシコラーゲンII型（MD Biosciences）の調製物を使用まで4℃にて暗所に貯蔵した。動物の免疫感作に先立って、ウシコラーゲンを0.01M酢酸中に2mg/mLのストック溶液にて溶解し、一晩暗所で4℃にて貯蔵した。免疫感作の第1日、コラーゲンを等体積のフロイント完全アジュバント（FCA（Difco））を用いて乳濁化し、1mg/mLの溶液を得た。
関節炎の誘導：
第0日に、雄DBA/1マウス（6〜8週齢、Harlan Sprague Dawley、UK）を3.5％イソフランを用いて軽く麻酔をかけ、そして尾根の直ぐ上の皮膚内に、FCA中に乳濁化したラットコラーゲンII型の100μg（1mg/mL；0.1mL/マウス）を用いて免疫感作した。
ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）ブースター：
第21日、全てのマウスを前記の通り麻酔し、30μg SEB（注射用水（Toxin Technology）中の600μg/mlを等体積のフロイント不完全アジュバント（Sigma）中に乳濁化して最終濃度300μg/mlとしたもの）のブースター注射を行った。50μl x 2（30μgSEBと等価）を免疫感作部位に隣接した皮膚内に注射した。
関節炎の評価：
動物の健康状態の臨床観察を投薬時点から毎日行った。疾患の臨床徴候についての観察を、免疫感作後の第20日に行い、その際、動物をそのミクロ環境から取り出し、以下に概説したスコアリング系を用いてスコアを付けた。
表10 後足と前足に対するスコアリング系
Figure 0005596559
投薬：
動物を下記の表11に記載の通り、無作為に治療グループに割当てた。
表11 治療グループ
Figure 0005596559
治療グループ1〜5の動物に治療として、疾患発症（1以上の足における臨床スコア2で規定した）から、腹腔内（i.p.）に10mL/kgで3.19.3を毎3日、14日間投薬した。精製ヒトIgG（hIgG）を陰性アイソタイプ対照として用いた。治療グループ6の動物に治療として、経口（p.o.）でプレドニソロン3mg/kgを疾患発症（1以上の足における臨床スコア2で規定した）から、毎日、14日間投薬した。
終結：
動物を疾患発症後14日に高濃度の二酸化炭素に曝露して終結した。マウス足を死後切除し、10％緩衝化ホルマリンで固定し、脱灰した。脱灰した足を日常の方法で治療し、次いでパラフィンブロックで包埋した。連続切片（10μm）を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して組織学分析を行い、ならびにCD31染色して滑膜におけるミクロ血管密度を定量した。
結果：疾患の臨床徴候（関節炎スコア）
図15Aは疾患発症からの日数（すなわち治療日数）に対する関節炎のスコア平均（平均の＋/-標準誤差）を示す（白四角＝PBS、白三角＝アイソタイプ対照、黒四角＝0.1mg/kg 3.19.3、黒三角＝1mg/kg 3.19.3、黒丸＝10mg/kg 3.19.3および白円＝プレドニソロン）。疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）における用量依存性の低下が観察された。1および10mg/kg用量において有意な低下が存在した。臨床疾患進行に対する曲線下面積（AUC）を、各動物について疾患発症から計算した（図15Bおよび表12）。特に断らない限り、統計的分析はビヒクル対照に対するDunnettのpost-hoc比較を用いる一方向ANOVAによった。
全研究を通じて、P<0.05を統計的有意であると考えた。
表12 3.19.3で治療したCIAマウスの臨床スコアのAUC
Figure 0005596559
*＝P<0.05 一方向ANOVA、ビヒクル対照に対するDunnettのpost-hoc。
CIAモデル治療グループの組織病理学的評価：
結果は、評価した全てのパラメーターについて3.19.3の投与後の用量依存性の抗関節炎効果の確証を示し、前記パラメーターには、滑膜の過形成（図15C）、滑膜炎（図15D）、パンヌス（図15E）、滑膜の線維症（図15F）、および骨膜炎（図15G）が含まれる。組織学的に、アイソタイプ対照治療グループとPBSビヒクルグループとの間に有意差はなかった（図15C〜G）。
滑膜におけるCD31＋（ミクロ血管密度）の免疫組織学的評価：
結果は、用量1および10mg/kgにおいてならびにプレドニソロンを用いると滑膜におけるミクロ血管密度の有意な低下を示した。0.1mg/kgにおける3.19.3による治療は無効であった（図15H）。
全体的結論：
本研究は、アンジオポエチン-2の中和が雄DBA/1マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎を改善するのに有効であることを実証する。本研究は0.1、1、および10mg/kgの用量における3.19.3の効力を評価し、疾患進行（関節炎のスコア）の臨床徴候と、滑膜炎および関節破壊ならびに滑膜のミクロ血管密度の組織学的評価との両方において、用量依存性の低下を実証した。プレドニソロン治療グループは、全ての尺度の出現率および重症度において顕著な低下を示した。
実施例１２ 抗Ang-2抗体＋抗TNFα薬の組合わせは関節炎の予防モデルにおいて有効である
本実施例では、単剤または抗TNFα薬ENBREL(登録商標)との組合わせとしての抗Ang-2抗体MEDI1/5を、関節炎の予防モデルにおいて研究した。さらに具体的には、MEDI1/5抗体+/-ENBREL(登録商標)の、グルコース6リン酸イソメラーゼ（G6PI）関節炎疾患モデルにおける臨床疾患進行に対する効果を研究した。
材料および方法
G6PI乳濁液の調製：
免疫感作の日に、結核菌（M. tuberculosis（Difco））をIFA（Chondrex）中に粉砕することによりFCA（フロイント完全アジュバント）を調製して、1mg/mLストックを作った。ヒトG6PIをリン酸緩衝化生理食塩水（Gibco）中の3mg/mLの濃度に設定した。G6PIを超音波処理により等体積のFCAと共に乳濁化し、1.5mg/mLの乳濁液を得た。
関節炎の誘導：
第0日に、雄DBA/1Jマウス（9〜10週齢、Jackson Laboratories）に、0.2mL（300μgG6PI）を尾の基部の2つの部位にわたって皮下注射により投与した。
関節炎の評価：
疾患の臨床徴候についての観察を、免疫感作後第0日から毎日行い、その際、動物をそのミクロ環境から取り出し、下表13に概説したスコアリング系を用いてスコアを付けた。
表13 後足と前足に対するスコアリング系
Figure 0005596559
投薬： 動物を無作為に、下表14に概説した治療グループに割当てた。
表14：治療グループ
Figure 0005596559
エンブレル治療グループの動物には10mL/kgを毎日、第0〜9日の間投薬し、次いで毎3日、第16日の終結まで投薬した。全ての他の治療薬は毎3日投与した。
終結：
動物を免疫感作後16日に高濃度の二酸化炭素に曝露して終結した。マウス足を死後切除し、10％緩衝化ホルマリンで固定し、骨無機質密度を評価し、次いで脱灰した。脱灰した足を日常の方法で処理し、次いでパラフィンブロックで包埋した。連続切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して組織学分析を行った。組織学分析は次のスケジュールによりスコアを付けた：
・合計関節スコア
・後膝と足首関節の両方を次に対してスコアを付けた：
>炎症
>骨損傷
>パンヌス形成
>軟骨損傷
・0〜5のスコア
>0＝正常
>1＝最小
>2＝軽度
>3＝中度
>4＝顕著
>5＝重症
骨無機質密度
骨無機質密度は後肢の後膝関節においてDEXA法イメージング（GE Piximus）を用いて評価した。採集後、後肢を10％中和緩衝化生理食塩水中に4日間入れた。イメージングの直前、肢を70％エタノール中に入れ、次いで乾燥させた。
結果：
疾患進行（関節炎のスコア）の臨床徴候の低下がエタネルセプトまたはMEDI1/5治療によって観察された［図16A（黒丸＝アイソタイプ対照、黒菱形＝10mg/kg MEDI1/5、白菱形＝1mg/kg エタネルセプト、灰菱形＝10mg/kg MEDI1/5と1mg/kg エタネルセプトの組合わせ、白四角＝4mg/kg エンブレル、灰四角＝10mg/kg MEDI1/5と4mg/kg エタネルセプトの組合わせ）および16B］。MEDI1/5を低い用量のエタネルセプトを組合わせて投与すると、さらなる臨床スコアの低下が存在した（一方向ANOVA、アイソタイプ対照に対するDunnettのpost-hoc比較）。アイソタイプ対照抗体で治療した動物の全関節は疾患の確証を示したが、MEDI1/5または1mg/kgエタネルセプト治療は31％または22％の関節においてそれぞれ疾患の徴候を示さなかった。10mg/kg MEDI1/5と1mg/kgエタネルセプトを組合わせ投与した場合、このグループの動物の関節の50％は、疾患が無く、高用量（4mg/kg）のエンブレル（53％）により与えられた保護のレベルと比較し得た（表15）。滑膜炎および関節破壊の組織学的評価（図16C）は、骨無機質密度の損失から保護することを示した臨床スコア結果（図16D）を支持した。
表15：MEDI1/5で治療した関節炎マウスにおいて観察された無疾患の関節
Figure 0005596559
結論：
本研究は、アンジオポエチン-2の中和が、雄DBA/1JマウスにおけるG6PI誘導関節炎の発生を阻害する上で有効であり、抗TNF比較薬であるエタネルセプトと比較しうることを実証する。本研究はまた、MEDI1/5とエタネルセプトの組合わせ効力を評価し、疾患の発症に先立って投与すると、低い用量のエンブレルとの組合わせ治療は、疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）と滑膜炎および関節破壊の組織学評価、ならびに骨無機質密度の喪失との両方において、さらなる効力を提供することを実証した。
実施例１３ 抗Ang-2抗体＋抗TNFα薬の組み合わせは、関節炎の治療モデルにおいて有効である
MEDI1/5によるエタネルセプトを伴わないまたは伴う場合の治療効果を、グルコース6リン酸イソメラーゼ（G6PI）関節炎疾患モデルにおける臨床疾患の発症後に評価した。
G6PI誘導性関節炎を雄 DBA/1J マウスにおいて誘導し、動物に治療として試験治療薬を投薬した。
材料および方法：
本研究のマウスは実施例12に記載したのと同様に調製した。
投薬：
本研究はローリング投与研究であった：いったん動物が3.5〜5.0の臨床スコアに達すると、無作為に治療グループに割り当て（下記の通り）そして投薬を始めた。最初の投薬の日がこの動物に対する研究日0になった。治療グループは実施例12に記載したのと同様であった。
終結：
研究は治療開始後12日に終結した。これらの動物についてさらなる終点を評価しなかった。
結果：
臨床疾患の発症後に治療手法として投与した場合、疾患進行の臨床徴候（関節炎スコア）の軽度の低下が、MEDI1/5治療によって観察される一方、試験した両方の用量のエタネルセプトは疾患進行に効果がなかった。MEDI1/5（10mg/kg）を高用量のエタネルセプト（4mg/kg）と組合わせて投与した場合、さらに劇的な疾患進行の阻害が認められた（図17A（黒丸＝アイソタイプ対照、黒菱形＝MEDI1/5、白菱形＝1mg/kgエタネルセプト、灰菱形＝MEDI1/5と1mg/kgエタネルセプトの組合わせ、白四角＝4mg/kgエタネルセプト、灰四角＝MEDI1/5と4mg/kgエタネルセプトの組合わせ）。
結論：
本研究は、疾患の臨床徴候の発症後に投与した場合、アンジオポエチン-2の中和が、雄DBA/1JマウスにおけるG6PI誘導性関節炎の発生を改善する上で有効であり、抗TNF比較薬であるエタネルセプトと比較しうることを実証する。本研究はまた、MEDI1/5とエタネルセプトの組合わせた効力を評価し、組合わせ治療がいずれかの薬剤単独を超える高い効力を提供することを実証した。

Claims (7)

  1. アンジオポエチン-2（Ang-2）と結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号3（MEDI1）を含む軽鎖可変領域と配列番号7（MEDI5）を含む重鎖可変領域を含む、上記抗体。
  2. 前記抗体が配列番号1および配列番号2を含むAng-2抗体（3.19.3）の融点よりも高い融点を示す、請求項1記載の抗体。
  3. 配列番号3（MEDI1）および配列番号7（MEDI5）を含む軽鎖可変域および重鎖可変域を含む、Ang-2と結合する少なくとも1つの単離された抗体をコードしている、単離された核酸。
  4. ａ）Ang-2と結合する単離された抗体であって、配列番号3（MEDI1）を含む軽鎖可変域と配列番号7（MEDI5）を含む重鎖可変域を含む、上記抗体；および
    ｂ）賦形剤、を含む医薬組成物。
  5. それを必要とする動物における癌腫瘍の血管新生を阻害するために使用する組成物であって、
    ａ）Ang-2と結合する単離された抗体であって、配列番号3（MEDI1）を含む軽鎖可変域と配列番号7（MEDI5）を含む重鎖可変域を含む、上記抗体；および
    ｂ）賦形剤、を含む上記組成物。
  6. １以上の他の癌治療薬をさらに含む、請求項5記載の組成物。
  7. 前記癌が黒色腫、結腸癌、結腸直腸、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、直腸癌、胃癌、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵臓癌、脳癌、頚部癌、神経膠芽細胞腫、子宮内膜癌、および中枢神経系癌からなる群より選択される、請求項5記載の組成物。
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