KR20200132919A - 이중특이적 egfr/cd16 항원-결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

NK-세포를 EGFR-양성 세포에 관여하게 하기 위한 4가, 이중특이적 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질이 기술된다. 상이한 약물동력학(PK) 특성을 갖는 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질이 기술된다. EGFR-양성 종양과 같은, EGFR-양성 악성 종양의 치료를 위한 이중특이적 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질의 용도가 추가로 기술된다.

Description

이중특이적 EGFR/CD16 항원-결합 단백질
본 발명은 NK-세포를 EGFR-양성 세포에 관여하게 하기 위한 4가, 이중특이적 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질 및 EGFR-양성 종양과 같은, EGFR-양성 악성 종양의 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
표피생장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)는 몇몇의 고형암 치료를 위한 검증된 표적이다. 현재 EGFR-표적화 단일 클론 항체(mAbs) 및 티로신 키나아제 저해제(tyrosine kinase inhibitors, TKI)는 주로 신호-전달의 차단을 통해 기능한다. 더욱이, 이러한 제제들의 치료 효능은 티로신 키나아제 도메인 내의 T790M 문지기 돌연변이 또는 신호 전달 캐스캐이드의 돌연변이 하류(예를 들어, RAS 또는 RAF)와 같은 수용체 또는 신호전달 경로의 돌연변이 상태에 의존하며, 이는 많은 환자에서 치료 내재성 또는 후천적 내성을 유발할 수 있다. 또한, EGFR 표적 요법은 처방 비율에 영향을 미치는 것으로 간주되는 부작용과 관련 있다.
상기 표피생장인자 수용체(EGFR)는 수용체 티로신 키나아제의 HER 패밀리의 구성원으로서, EGFR (ErbB1/HER1), HER2/neu (ErbB2), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4)의 네 가지 구성원으로 구성된다. 리간드 결합 [예를 들어, EGF, TGFa, HB-EGF, 뉴레귤린(neuregulin), 베타셀률린(betacellulin), 암 피레귤린(amphiregulin)]을 통한 수용체의 자극은 티로신 인산화를 통해 고유 수용체 티로신 키나아제를 활성화하고 HER 패밀리 구성원과의 수용체 동종 또는 이종-이량체화를 촉진한다. 이러한 인산화-티로신은 MAPK 및 PI(3)K/Akt를 포함한 다양한 어댑터 단백질 또는 효소에 대한 도킹 사이트 역할을 하며, 동시에 세포 증식, 혈관 신생, 세포 자멸사 저항성, 침입 및 전이에 영향을 미치는 많은 신호 전달 캐스케이드를 시작한다.
수용체 티로신 키나아제의 표피생장인자 수용체 패밀리는 악성 종양과 같은 광범위한 병리생리 학적 상태의 발생 및 성장에 추진 인자로 설명되었으며, EGFR의 비정상적인 발현 또는 활성은 많은 인간 상피 암에서 확인된다. 구체적으로, EGFR 유전자는 많은 암에서 증폭되는 것으로 설명되었으며 EGFR에서 수많은 키나아제-활성화 돌연변이가 설명되고 잘 특성화되었다. EGFRvIII는 EGFR 코딩 서열의 엑손 2-7에 걸친 염기쌍의 인-프레임 결실로 인한 EGFR의 세포 외 도메인 돌연변이체이며 상기 돌연변이체가 리간드에 결합할 수 없게 만든다. EGFRvIII 돌연변이 종양에서 EGFR 신호 전달은 구성적으로 활성화되어 종양 진행을 유도하는 것으로 보고되었다. 또한, EGFR을 포함하는 HER 패밀리 구성원에 결합하고 활성화하는 리간드는 자기분비(autocrine) 자극 루프서 과발현되거나 연관된 것으로 보고되었다. 또한, HER2는 많은 암에서 유전자-증폭되어 자가 인산화된 HER2 수용체 (동종이량체화) 또는 구성적으로 활성화된 이종이량체 (예를 들어, EGFR/HER2)를 생성하는 것으로 설명되었다.
EGFR에 특이적인 TKI가 개발되어 여러 암을 대상으로 판매되고 있지만, 다른 항암제와 유사하게 심각한 부작용이 나타냈다. 이러한 부작용의 이유는 EGFR 활성 및 정상 기능을 위해 EGFR 신호에 의존하는 조직에서 MAPK와 같은 하류 분자의 동시 억제 때문이다. 이러한 약물의 영향을 받는 가장 일반적인 조직은 피부이다. 상기 부작용으로는 여드름과 같은 발진, 건성 피부, 가려움증, 손톱 변화 및 모발 변화를 포함한다. 피부에서 EGFR 신호 전달의 중요성 때문에, 피부과적 독성이 TKI로 자주 설명되었다. 그 결과 심각한 신체적 및 심리사회적 불편함은 항암제의 중단 또는 용량 조절로 이어질 수 있다.
보다 상세하게는, 이들 부위에서 EGFR 활성의 억제는 각질세포와 같은 정상 EGFR 양성 세포의 비정상적인 증식, 이동 및/또는 분화를 초래하고 염증 세포의 동원으로 피부의 완전성을 파괴할 수 있다. EGFR 신호 전달의 약리학적 또는 치료학적으로 매개된 차단은 생존을 위해 EGFR에 의존하는 정상 세포의 성장 정지 및 세포 자멸사를 초래한다. 피부는 3개의 층으로 구성된다: 표피는 가장 표층으로, 진피(dermis) (지지 및 인장 강도 제공) 및 하피(hypodermis) (지방 조직) 위에 있다. 표피는 주로 각질 세포(세포의 약 90%)로 구성되며, 기저층과 초기저층에서 가장 많은 수의 EGFR (epidermal growth factor receptor)을 발현한다. 기저층과 모낭의 돌출부는 증식하는 줄기 세포를 포함하고 있으며, 이 세포는 바깥쪽으로 이동하여 각질층을 형성하는 말단 분화 각질 세포를 생성하며, 여기서 무핵 세포가 보호 장벽을 형성합니다. 모낭의 외근초는 기저층과 인접하여, 생화학적 특성과 높은 EGFR 발현을 공유한다.
TKI가 기저 각질 세포에 영향을 주어 피부 부작용이 발생한다는 것은 널리 알려져 있다. EGFR-표적화 억제제로 치료하는 동안, EGFR의 인산화 수준은 표피 세포에서 감소 또는 억제되는 것으로 나타났으며 이러한 탈인산화 수준은 피부 독성의 정도와 관련이 있다. 기저 각질 세포에서 EGFR의 억제는 성장 정지 및 조기 분화로 이어진다. 결과적으로, EGFR 신호 전달의 억제는 성장 정지 및 세포 자며을 유도하고, 세포 이동을 감소시키고, 세포 부착 및 분화를 증가시키고, 염증을 자극함으로써 각질세포와 같은 EGFR-발현 세포에 영향을 미치며, 이 모두는 심각한 피부 발진과 같은 독특한 피부 증상을 초래한다. 염증은 발진과 관련된 많은 징후와 증상의 원인이 되지만, 일차적인 사건은 약물 유발, 항체 유발 또는 TKI 유도-변경된 EGFR 신호 전달인 것으로 보인다.
임상 연구에서, 효능은 주로 발진의 형태로 피부 독성과 관련이 있다. 이는 세툭시맙(cetuximab) 및 파니투부맙(panitumumab)과 같은 EGFR 표적 mAb와 TKI 모두에 적용된다. 전반적으로, EGFR- 표적제를 사용한 많은 2 상 및 3 상 임상 시험은 발진 발생률, 중증도 및 생존 사이의 연관성을 보여준다.
세툭시맙은 원숭이를 대상으로 한 중추 반복 투여 독성 연구에서 초기 고용량 투여 후 매주 7.5, 24 및 75mg/kg이 투여되었다. 세툭시맙에 대한 피부 독성의 발병은 고용량, 중용량 및 저용량 그룹에서 각각 15일, 22일 및 64일 후에 관찰되었다. 파니투무맙 투여 후 7-14 일 이내에 (즉, 2 ~ 3 회 투여 후) 피부 독성이 관찰되었다.
단클론 항체 니모투주맙(nimotuzumab)에 대한 임상 경험은 낮은 독성 프로파일을 동반한 임상 효능이 있음을 시사한다. 다른 EGFR-표적화 단일 클론 항체와 관련된 전형적인 중증 피부 독성은 니모투주맙에서 관찰되지 않았으며 중등도에서 높은 수준의 EGFR을 발현하는 세포로 제한되는 결합 때문일 수 있다.
EGFR+ 종양 세포를 제거하기 위한 대안적인 접근법은 Lutterb
Figure pct00001
se et al.에서 설명된 BiTE 구축물과 같은 이중특이적 T 세포 참여자의 사용이었다.(PNAS 2010, 107 (28), p12605). 그러나, 이러한 유형의 접근 방식은 수용체 차단에서 면역 세포 모집을 통한 표적 세포 제거로의 간단한 작용 방식 변화를 보여주었고, 시노몰구스 원숭이에 대한 상대적으로 낮은 용량의 μg/kg/d 범위의 투여 후에 이미 심각한 간 및 신장 독성의 관찰로 인해 종료되어야 했기 때문에 표적 세포를 죽이는 것은 심각한 부작용을 피하는 데 성공하지 못했다.
따라서, 본 발명의 문제는 종양 특이적 사멸 능력을 갖고 인산화에 대한 영향이 감소되거나 전혀 없는 EGFR-표적화 치료제를 제공하여 피부 독성이 경미하거나 전혀 없는 것을 제공하는 것이다.
상기 문제점은 청구범위에 정의된 주제에 의해 해결된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원이 참조로 통합되도록 구체적이고 개별적으로 명시된 것과 동일한 수준으로 본원에 참조로 포함된다.
EGF-유도된 EGFR 인산화에 대한 억제 효과가 없거나 거의 나타나지 않는 자연 살해(NK) 세포 기반 EGFR-표적화 접근을 위한 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질이 제공된다 (실시예 6). 이는 본원에서 제공된 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질이 조직 항상성에 대한 EGFR 신호 전달에 의존하는 조직, 예를 들어 피부에서 감소된 독성을 나타낸다는 것을 시사한다.
EGFR의 EGF 매개된-인산화에 대한 영향은 항원-결합 단백질의 특정 3D 구조의 내재적 특성과 연관되어야 한다.
또한, 본원에 기재된 EGFR에 대한 항원-결합 부위도 EGFRvIII에 결합한다 (실시예 3). 따라서, EGFR/CD16A 항원-결합 단백질은 EGFR-발현 및 EGFRvIII-발현 암 둘 다의 치료에 사용될 수 있다. EGFR과 달리 EGFRvIII는 암세포에서만 발현되고 건강한 조직에는 발현되지 않는다. 따라서, 보다 광범위한 EGFR- 및/또는 EGFRvIII- 양성 종양 및 보다 광범위한 환자 집단이 본원에 기재된 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질에 표적화 될 수 있다.
본 발명은 EGFR 양성 및/또는 EGFRvIII 양성 종양에 대해 NK-세포-매개 사멸을 전용하도록 설계된 상이한 다중특이적, 특히 이중특이적, NK-세포가 관여하는 상이한 약물동력학(PK) 특성을 갖는 항원-결합 단백질을 제공한다. 인간 및 시노몰구스(cynomolgus) EGFR 및 CD16A를 표적으로 하는 상이한 이중특이적 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질은 Fv 항체 결합 도메인 및 다양한 항체 또는 항체 단편 융합 형식을 사용하여 설계되었다.
증가된 혈청 반감기는 생체 내 적용에 유리하다. EGFR/CD16A 항원-결합 단백질은 IgG-기반 항체에 비교할만한 투여를 허용하는 약물동력학 (PK) 프로파일을 갖는 항체를 포함하여, 다양한 혈청 반감기를 갖는다. 혈청 반감기를 연장함에도 불구하고, 본원에 기재된 Fc-융합 항원-결합 단백질은 선택된 Bi-scFv-Fc 및 scFv-IgAb 항원-결합 단백질의 특정 3D 형태에 의해 제공되는 다른 EGFR-표적화 요법과 비교하여, 예를 들어 감소된 피부 독성과 같은 개선된 안전성 프로파일에 원인이 된다. 따라서, 본 발명은 단일 클론 항체와 유사한 약물동력학적 프로파일을 갖지만, 개선된 안전성 프로파일을 갖는 항원-결합 단백질을 제공한다.
이의 CD16A 수용체를 통한 NK-세포가 다중특이적 항원-결합 단백질에 의해 EGFR-양성 종양 세포에 관여될 때(EGFR 항원을 통해), 강력한 활성화 신호를 생성하는 면역 학적 시냅스를 형성한다. CD16A 수용체를 통한 NK 세포 및 EGFR을 통한 종양 세포에 대한 다중특이적 항원-결합 단백질의 동시 관여는 CD16A-매개 NK-세포 활성화 및 면역학적 시냅스의 형성을 유도하여, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzymes)을 포함하는 용해 미립의 분극화된 세포외이입을 유발할 뿐만 아니라, FasL, TRAIL 및 TNF-α의 세포 표면 발현은 일련의 추가 효소 활동 (카스파제 캐스케이드)을 시작하여 종양 세포 사멸을 유도하여, 종양 세포 세포자멸사 (프로그래밍된 세포 사멸)를 유발한다.
따라서, 이러한 다중특이적 항원-결합 단백질은 EGFR 양성 암 세포의 NK-세포 용해를 선택적으로 전용할 수 있다. 대조적으로, IgG 동형(isotype)의 전장 항체는 이들의 Fc 영역을 통해서 CD16A, CD16B (FcgRIIIB), CD32A (FcgRIIA), CD32B (FcgRIIB) 및 CD64 (FcgRI)을 포함하는 활성화 및 억제성 Fcγ 수용체에 결합한다. 그러나, CD16A에 대해 특이성을 갖는 항원-결합 단백질은 NK-세포 및 대식세포 상에서 발견되고 호중구 상에서는 발견되지 않는, 활성화 아형 CD16A을 선택적으로 표적화한다. 더욱이, 항원-결합 단백질이 관여하는 NK-세포는 CD16A와 2가 상호작용하여 일반 항체와 비교하여 약 1000배 높은 친화성을 나타낸다.
CD16A는 NK-세포의 세포 독성 활성을 유발하는 활성화 수용체이다. CD16A에 대한 항체의 친화성은 NK-세포 활성화를 유발하는 능력과 직접적으로 관련이 있다. 항원 결합 단백질은 CD16A에 2가 결합, 즉 2개의 항원 결합 부위와 결합하여 제공되어, CD16A에 대한 더 높은 결합력으로 인해 친화성을 증가시킨다. 이러한 항원-결합 단백질을 투여하면 다음과 같은 작용 기작에 따라 없거나 경미한 (피부) 독성을 나타낸다:
한 실시 양태에서 다중특이적 항원-결합 단백질은 EGFR/CD16A 이중특이적 탠덤(tandem) 디아바디(diabody)이다. 이 구조에서 탠덤 디아바디는 EGFR 및 CD16A 항원-결합 부위의 가변 Fv 도메인만 포함하고 Fc-부분은 포함하지 않는다. Fc 부분이 없기 때문에, 그들은 FcRn에 의해 혈관 공간에서 정상 조직의 간질(interstitium)로 수송되지 않고 주로 혈관계에 남는다. 종양에서는, 종양 혈관의 탠덤 디아바디와 같은 거대 단백질에 대한 선택적이고 높은 투과성으로 인해 적절한 수준의 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디가 도달된다 (향상된 투과성 및 유지 효과 [enhanced permeability and retention effect, EPR]).
시노몰구스 원숭이에서 격일로 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디를 투여해도 피부 독성이 유발되지 않았다. 탠덤 디아바디에서 Fc 부분의 부재는 IgG 또는 다른 Fc-함유 항체 단편과 비교하여, FcRn에 의한 정상 조직으로의 전이가 없거나 적어도 상당히 감소된 원인 일 수 있다.
또 다른 실시 양태에서 다중특이적 항원 결합 단백질은 Fc 부분을 포함하는 이중특이적 EGFR/ CD16A 항원-결합 단백질이다. Fc 부분의 존재로 인해, 이것은 FcRn에 의해 정상 조직으로 운반될 수 있다. 그러나 정상 조직은 간질 공간 내에서 NK 세포에 의해 침투되지 않아 정상 EGFR 양성 세포의 NK 세포-매개 사멸 가능성이 낮다. 종양에서 NK 세포는 훨씬 더 많은 수로 존재하며 Fc 부분을 포함하는 항원-결합 단백질은 탠덤 디아바디에 대해 전술한 EPR 효과로 인해 적절한 수준으로 도달할 것이다.
또한, 상세히 설명된 바와 같이, EGFR/CD16A 항원-결합 단백질을 포함하는 Fc-부분에 의한 EGFR 신호 전달의 억제는 시험관내 세툭시맙(cetuximab)에 비해 현저하게 감소된다.
더욱이, 본원에 기술된 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질은 세포 독성 분석으로 검사했을 때 이전에 공지된 단일 클론 항체(mAb) 또는 다른 Fc=강화 항체에 비해 우수한 효능 및 효과를 나타냈다. 선택된 항체의 생체 내 효능은 인간화된 마우스의 A-431 종양 모델에서 입증되었다. 따라서, EGFR/CD16A 항원-결합 단백질은 EGFR-발현 암의 치료에 적합한 약물 후보이며 잠재적으로 개선된 안전성 프로파일을 제공한다.
도 1은 인간 IgG1 CH1, CH2 및 CH3 중쇄 불변 도메인을 갖는 IgG-유사 항원-결합 단백질을 보여준다. 항-CD16A 가변 도메인은 IgG의 N-말단 Fab-부분에 항원-결합 부위로 통합되고, 항-EGFR scFv는 CH2-CH3 동종이량체의 각 폴리펩티드에 C-말단에 융합된다 (H: 가변 중쇄 도메인; L: 가변 경쇄 도메인, C: C- 말단, λ: Clambda 경쇄 불변 도메인, 1: CD16A 항원 결합 부위, 2: EGFR 항원 결합 부위).
도 2는 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드의 동종이량체를 갖는 scFv-Fc 융합 항원-결합 단백질을 보여준다. 각각의 폴리펩티드에서 CD16A scFv 단위는 힌지 영역에 의해 CH2에 N-말단으로 융합되고 항-EGFR scFv는 CH2-CH3 동종이량체의 C-말단에 융합된다 (H: 가변 중쇄 도메인; L: 가변 경쇄 도메인, C: C- 말단, 1: CD16A 항원 결합 부위, 2: EGFR 항원 결합 부위).
도 3은 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 이중특이적 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디를 보여주고, 각 폴리펩티드 사슬에서 경쇄(L) 및 중쇄(H) 가변 도메인은 펩티드 링커에 의해 차례로 연결되고 이들 폴리펩티드 중 2개는 서로 비공유적으로 관련되어 4가 항원-결합 단백질을 형성한다 (N: N- 말단; H6: 헥사히스티딘 태그, 1: CD16A 항원 결합 부위, 2: EGFR 항원 결합 부위).
도 4는 N-말단으로 항-CD16A 디아바디-유닛에 융합된 항-EGFR scFv-유닛 및 C-말단으로 CD16A 디아바디-유닛에 융합된 항-HSA scFv-유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드로 구성된 삼중특이적 EGFR/CD16A/HSA aTriFlex 항원-결합 단백질을 보여준다 (H: 가변 중쇄 도메인; L: 가변 경쇄 도메인; N: N- 말단; H6: 헥사 히스티딘 태그, 1: CD16A 항원 결합 부위, 2: EGFR 항원 결합 부위, 3: HSA 항원 결합 부위).
도 5는 정제 후 scFv-IgAb_02 및 Bi-scFv-Fc_02의 얼룩 없는 이미징 기술(Stain-free Imaging technology, Bio-Rad)로 시각화된 SDS PAGE 겔 이미지를 보여준다.
도 6은 (A) EGFR- 또는 (B) CD16A- 항원에 대한 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디의 농도 의존적 결합을 보여준다.
도 7은 (A) 단량체 EGFR-mFc에 대한 EGFR/CD16A scFv, 또는 (B) EGFR / CD16A scFv-IgAb에 대한 CD16A- 또는 CD16B- 항원의 농도 의존적 결합을 보여준다.
도 8은 (A) 단량체 EGFR-mFc에 대한 EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc, 또는 (B) EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc에 대한 CD16A- 또는 CD16B- 항원의 농도 의존적 결합을 보여준다.
도 9는 (A) EGFR- 또는 (B) CD16A- 항원에 대한 EGFR/CD16A aTriFlex의 농도 의존적 결합을 보여준다.
도 10은 1차 인간 NK 세포에서 10mg/mL 인간 다클론 IgG (Gammanorm)의 존재 및 부재 하에 여러 이중특이적 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질의 결합 친화도의 평가를 보여준다. 증가하는 농도에서 평균 형광 강도.
도 11은 EGFR-발현 종양 A-431 세포에 대한 여러 이중특이적 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질의 결합 친화도의 평가를 보여준다.
도 12는 E:T 비율 5:1에서 작동 세포로서 풍부한 인간 NK 세포를 갖는 A-431 및 HCT-116 표적 세포에 대한 4시간 칼세인-방출 분석에서 이중특이적 EGFR/CD16A 항원-결합 단백질의 세포 독성 활성을 보여준다.
도 13은 A-431 세포 상의 다양한 항-EGFR 항체 구축물 및 대조군 항체에 의한 EGF-유도 EGFR 인산화의 억제를 보여준다. 인산화된 EGFR은 인산화 ELISA로 측정되었고 450 nm의 흡광도로 그래프화하였다.
도 14는 A-431 세포 상의 다양한 항-EGFR 항체 구축물 및 대조군 항체에 의한 EGF-유도 EGFR 인산화의 억제를 보여준다. 인산화된 EGFR은 인산화 ELISA로 측정되었고 450 nm의 흡광도로 그래프화하였다.
도 15는 A-431 세포 (도 15a) 및 A-549 세포 (도 15b)에서 EGF-자극 EGFR 인산화의 억제를 보여준다. 인산화된 EGFR은 인산화 ELISA로 측정되었고 450 nm의 흡광도로 그래프화하였다.
도 16은 EGF로 5분 동안 자극된 샘플의 웨스턴 블롯 막을 보여준다. 인단백질 (블롯의 왼쪽 패널) 및 전체 단백질 (블롯의 오른쪽 패널)이 각각 표시된다.
도 17은 EGF로 15분 동안 자극된 샘플의 웨스턴 블롯 막을 보여준다. 인단백질 (블롯의 왼쪽 패널) 및 전체 단백질 (블롯의 오른쪽 패널)이 각각 표시된다.
도 18은 pEGFR의 밴드 강도의 정량화를 보여준다. 각 레인의 GAPDH 신호 강도는 아무 처리하지 않은 대조군의 GAPDH 신호 강도로 정규화되었습니다. pEGFR의 강도는 아무 처리하지 않은 대조군의 pEGFR로 정규화되었습니다. 표시된 상대적 밴드 강도는 정규화된 GAPDH-신호에 비례한 정규화된 pEGFR-신호에 해당한다. 흰색 막대: 5분 자극, 검은색 막대: 15분 자극.
도 19는 pAkt의 밴드 강도의 정량화를 보여준다. 각 레인의 GAPDH 신호 강도는 아무 처리하지 않은 대조군의 GAPDH 신호 강도로 정규화되었습니다. pAkt의 강도는 아무 처리하지 않은 대조군의 pAkt로 정규화되었습니다. 표시된 상대적 밴드 강도는 정규화된 GAPDH-신호에 비례한 정규화된 pAkt-신호에 해당한다. 흰색 막대: 5분 자극, 검은색 막대: 15분 자극.
도 20은 pErk의 밴드 강도의 정량화를 보여준다. 각 레인의 GAPDH 신호 강도는 아무 처리하지 않은 대조군의 GAPDH 신호 강도로 정규화되었습니다. pErk의 강도는 아무 처리하지 않은 대조군의 pErk로 정규화되었습니다. 표시된 상대적 밴드 강도는 정규화된 GAPDH-신호에 비례한 정규화된 pErk-신호에 해당한다. 흰색 막대: 5분 자극, 검은색 막대: 15분 자극.
도 21은 EGFR+ A-431 세포와의 공동 배양 시 PBMC에 의한 scFv-IgAb_02-유도 IL-6의 방출을 보여준다. 증가하는 농도의 scFv_IgAb_02의 존재 또는 부재 하에 공동 배양의 배양 시간이 표시된다. A-431 표적 세포가 없을 때의 IL-6 방출의 배경 수준은 그래프 아래에 표시된다.
도 22는 EGFR+ A-431 세포와의 공동 배양 시 PBMC에 의한 scFv-IgAb_02-유도 TNF-α의 방출을 보여준다. 증가하는 농도의 scFv_IgAb_02의 존재 또는 부재 하에 공동 배양의 배양 시간이 표시된다. A-431 표적 세포가 없을 때의 TNF-α 방출의 배경 수준은 그래프 아래에 표시된다.
도 23은 EGFR+ A-431 세포와의 공동 배양 시 4시간 공동배양 후 PBMC에 의한 scFv-IgAb_02-유도 IFN-γ의 방출을 보여준다. A-431 표적 세포가 없을 때의 IFN-γ 방출의 배경 수준은 그래프 아래에 표시된다.
도 24는 EGFR+ A-431의 존재 또는 부재 하에 scFv-IgAb_02와 PBMC의 24시간 공동 배양 후 활성화된 NK 세포를 보여준다. ScFv-IgAb_02는 PBMC (A) 및 PBMC+ A-431 세포 (B)의 배양에서 CD69 및 CD25를 발현하는 활성화된 CD56+ NK 세포의 증가를 유도했다.
도 25는 EGFR+ A-431의 존재 또는 부재 하에 scFv-IgAb_02와 PBMC의 48시간 공동 배양 후 활성화된 NK 세포를 보여준다. ScFv-IgAb_02는 PBMC (A) 및 PBMC+ A-431 세포 (B)의 배양에서 CD69 및 CD25를 발현하는 활성화된 CD56+ NK 세포의 증가를 유도했다.
도 26은 트랜스큐어 예방 연구(Transcure prophylactic study)에서 7일부터 35일까지 종양 성장을 보여준다.
도 27은 트랜스큐어 예방 연구에서 종양 성장을 보여준다.
도 28: 예방적 (A) 및 치료적 (B) 설정에서 A431 종양 성장에 대한 RSV-EGFR 및 상이한 scFv-IgAB_02 농도의 효과.
범례: 종양 성장의 평균 ± 표준편차는 각 그룹에 대해 표시된다. 치료 그룹 당 N=7-8, 예방 그룹당 N=12.
도 29는 트랜스큐어 연구의 예방적 부문을 보여준다. 종양 성장 연구에서 scFv-IgAb_02 및 대조군 항체 구축물 RSV/EGFR을 첨부된 실시예 11에 기재된 바와 같이 투여하였다.
도 30은 트랜스큐어 연구의 치료 부문을 보여준다. 10 mg/kg scFv-IgAb_02 및 대조군 항체 구축물 RSV/EGFR을 처리로 유의한 종양 성장 감소가 관찰되었다.
도 31은 실시예 13에 기술된 바와 같은 scFv-IgAb_02의 조직 분포 결과를 보여준다. 125I-scFv-IgAB_02를 A431 이종이식 마우스에 IV 주사한 후 수집된 혈액 및 기관/조직에서 회수된 ID의 백분율 (% ID/g).
도 32는 실시예 13에 기술된 바와 같이 A431 이종이식 마우스에 125I-scFv-IgAB_02의 IV 주사 후 종양/기관 비율을 보여준다.
도 33은 첨부된 실시예 13에 상세히 기재된 바와 같이 125I-scFv-IgAB_02의 IV 주사 후 336 시간 (14일)에 희생된 마우스의 전신 자기방사선 사진을 보여준다.
도 34는 첨부된 실시예 14에 기재된 독성학 연구에서 관찰된 개별 동물의 혈청 IL-6 수준을 보여준다.
본 발명은 EGFR 및 CD16A에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 다중특이적, 예를 들어 이중특이 적 항원-결합 단백질에 관한 것이다.
용어 "다중특이적(multispecific)"은 적어도 2개의 별개의 표적, 즉 별개의 항원들에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항원-결합 단백질을 나타낸다. "다중특이적"은 이중특이적, 삼중특이적 및 사중특이적을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 항원-결합 단백질은 적어도 항원 EGFR 및 CD16A에 특이적으로 결합하고, 따라서 적어도 이중특이적이다. 특정 실시 양태에서 항원-결합 분자는 제3 항원에 대한 제3 특이성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제3 특이성은 혈청 알부민, 특히 인간 혈청 알부민(HSA)에 특이적인 항원-결합 측면일 수 있다. 삼중특이적 항원 결합 단백질의 예는 EGFR에 특이적인 항원 결합 부위, CD16A에 특이적인 2개의 항원 결합 부위 및 HSA에 특이적인 1개의 항원 결합 부위를 포함하는 하기에 기재된 4가 aTriFlex이다. 다른 실시 양태에서 제3 특이성은 이중 종양-표적화 항원-결합 단백질을 만들기 위한 제2 종양 항원일 수 있고, 예를 들어 상기 항원-결합 단백질은 제2 종양 항원, 예를 들어 HER2, HER3, HER4, c-MET, AXL, FGFR4, VEGF-A, HGF에 대한 적어도 하나의 추가 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.
용어 "항원-결합 단백질(antigen-binding protein)"은 항원-결합 특성을 갖는 면역 글로불린 (Ig) 유도체를 의미한다. 바람직하게는, 상기 항원-결합 단백질은 인간 또는 인간화 단백질이다. 즉, 항원-결합 단백질은 주로 생식 계열 Ig의 인간 서열로 구성된다. 상기 항원-결합 단백질이 인간이거나 인간화된 경우, 예를 들어 CDR, 링커 또는 돌연변이에 의해 통합된 단일 비인간 잔기 또는 비인간 부분을 포함할 수 있다. Ig는 공유 사슬간 이황화 결합에 의해 복합체로 연결된 2개의 동일한 경쇄 (L) 폴리펩티드 및 2개의 동일한 중쇄 (H) 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질이다. N-말단 부분에서 경쇄 가변 도메인(VL)은 중쇄 (H)의 가변 도메인 (VH)과 연결하여 Ig인, Fv의 항원-결합 부위를 형성한다. 또한, 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)는 각각 불변 영역을 가진다. 따라서, 경쇄 (L)는 하나의 가변 도메인 (VL) 및 하나의 불변 도메인(CL)을 가지고(예를 들어, 람다 또는 카파) 중쇄 (H)는 CH1, CH2 및 CH3으로 지정된 3개의 불변 도메인을 가진다. 따라서 중쇄 (H)는 하나의 가변 도메인(VH)과 3의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3)을 가진다. 중쇄 (H)는 또한 3개의 기능 단위, 즉 VH 및 CH1을 포함하는 Fd 영역, 힌지 영역 및 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬을 포함하는 Fc 부분으로 나눌 수 있다. Fc 부분은 항체-의존성 세포 매개 세포 독성 (antibody-dependent-cell-mediated cytotoxicity, ADCC), 보체-의존성 세포 독성 (complement-dependent-cytotoxicity, CDC), 항체-의존성 세포 식균 작용 (antibody-dependent cell phagocytosis, ADCP) 및 Fc 수용체에 대한 결합과 같은 작동 기능을 담당하고, Fc-부분이 결여된 폴리펩티드에 비해 생체 내 (신생아 Fc (FcRn) 수용체에 대한 결합을 통해) 연장된 반감기를 부여한다. 또한, IgG에서 서로 연결된 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬의 동종체는 항체의 Fc-영역을 형성한다. 항원-결합 단백질은 표적 항원에 결합할 수 있는 면역학적 기능성 면역글로불린 부분을 포함한다. 면역학적 기능성 면역글로불린 부분은 면역글로불린 부분 (예를 들어, Fv, Fab), 면역글로불린 부분으로부터 유래된 융합 펩티드 또는 항원-결합 부위를 형성하는 면역글로불린 부분을 결합한 접합체를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서 항원-결합 부위는 부분적으로 또는 완전히 인간이거나 인간화된 것이다. 결합 단백질은 표적 항원에 결합하는 결합 단백질의 영역, 부분 또는 도메인인 항원-결합 부위를 포함한다. 각각의 항원-결합 부위는 적어도 항원-결합 부위가 유래된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 CDR을 포함한다. 용어 "항원-결합 단백질"은 일부 실시 양태에서 예를 들어, 적어도 CH2, 일부 실시 양태에서 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬, 특히 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬의 동종이량체를 포함하는, 임의의 Ig 클래스, 특히 IgG1과 같은 IgG 서브클래스로부터의 Fc-부분에 융합된 항원-결합 부위에 기반한 IgG-유사 또는 비-IgG-유사 융합 펩티드를 포함하고, 그들의 항원에 대한 특이성 및 친화도를 보유하는 항체 유도체 또는 항체-유사 결합 단백질을 의미한다. 상기 불변 영역은 완전한 Ig 불변 영역(즉, CH1-힌지-CH2-CH3) 또는 오직 Fc-부분(즉, CH2-CH3 도메인), 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 scFv-IgAb, Bi-scFv-Fc 또는 Fc-scFv을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서 항원-결합 단백질은 추가적인 불변 도메인이 없거나 또는 있는 Fv 도메인에 기초한 항체 유도체, 예를 들어, Fv 단편, 단쇄 Fv, 탠덤 단쇄 Fv ((scFv)2), 이중 특이적 NK-세포 관여자 (Bi-specific NK-cell engagers, BiKE), 이중 친화도 재표적 항체 (dual affinity retargeting antibodies, DARTTM), 디아바디(diabody), 단쇄 디아바디 및 탠덤 디아바디 (TandAb®); aTriFlex, 트리아바디(triabody), 트리바디(tribody) 또는 삼중 특이적 NK-세포 관여자 (Tri-specific NK-cell engagers, TriKE)를 의미한다. 다양한 항원-결합 단백질 스캐폴드는 Brinkmann and Kontermann, mAbs, 2017, 9 (2):182-192 또는 Spiess et al., 2015, Molecular Immunology, 67 : 95-106에서 검토된다.
용어 "항원-결합 부위(antigen-binding site)"는 항체-항원 결합 부위 또는 특히 항원의 항원 결정인자(에피토프)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 파라토프를 의미한다. 상기 항원-결합 부위는 인간 또는 인간화된 것일 수 있다. 상기 항원-결합 부위는 항원을 인식할 수 있고 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질의 결합 부분이다. 상기 항원-결합 부위는 항원과 결합하는, 즉 항원의 에피토프에 결합하는 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 둘 다의 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시 양태에서 상기 항원-결합 부위는 단일 도메인 (sdAb) 일 수 있으며, 예를 들어 낙타과(camelids) 또는 연골 어류의 VHH 단편일 수 있다.
각 항원-결합 부위는 항체, 즉 면역 글로불린, 가변 중쇄 도메인 (VH) 및 동일한 에피토프에 결합하는 항체 가변 경쇄 도메인 (VL)에 의해 형성되며, 가변 중쇄 도메인 (VH)은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고; 가변 경쇄 도메인 (VL)은 3개의 경쇄 상보적 결정 영역(CDR): LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 상기 항원-결합 부위의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인은 Fv 항원-결합 부위를 형성하기 위해 서로 공유적으로 연결되거나(예를 들어, 펩티드 링커에 의해), 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다.
"단쇄 가변 항체 단편(single-chain variable antibody fragment)"또는 "scFv"는 펩티드 링커를 통해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)으로 구성된 항원-결합 부위를 포함한다. 상기 scFv는 폴리펩티드 사슬일 수 있다: 폴리펩티드 사슬의 N-말단에서 C-말단까지 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85 : 5879-83).
"항원-결합 (Fab) 단편(antigen-binding (Fab) fragment)" 또는 "Fab"은 중쇄 (H) 및 경쇄 (L) 각각의 하나의 불변 도메인(CH1, CL) 및 하나의 가변 도메인 (VH, VL)을 포함하며, 여기서 가변 도메인 VH 및 VL은 항원 결합 부위와 관련 있다. 2개의 Fab '단편은 F(ab')2 단편으로서 힌지 영역을 통해 Fc 부분에 N-말단으로 연결된다.
'링커'는 다른 펩티드를 연결하는 펩티드이다. 전형적으로 펩티드 링커는 1에서 약 50개 아미노산으로 이루어지는데, 약 30개가 바람직하고 약 20개가 가장 바람직하다. 링커의 길이는 폴리펩티드 사슬의 유연성에 영향을 미친다. 원하는 유연성은 표적 항원 밀도와 표적 항원의 접근성에 따라 달라진다. 링커가 길수록 항원 결합 부위가 더 민첩해진다. VH 및 VL 도메인을 연결하는 링커가 약 12개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 경우, 폴리펩티드는 머리에서 꼬리까지 접혀 scFv를 형성할 수 있다. 특정 양태에서는, scFv에서 VH와 VL의 링커가 약 15에서 약 25개 아미노산으로 이루어지는데, 약 15에서 약 20개 사이인 18 개가 바람직하다. 링커를 약 12*?*개 이하의 아미노산 잔기로 단축하면 일반적으로 동일한 폴리펩티드 사슬의 인접 도메인이 서로 상호 작용하는 것을 방지한다. 하지만, 그러한 링커는 scFv를 Fc 부분에 융합시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서 scFv는 펩티드 결합에 의해 Fc 부분에 직접 융합된다. 링커의 아미노산 조성과 관련해 일부 양태에서는 항원 결합 부위의 조립을 방해하지 않는 펩티드가 선택된다. 예를 들어, 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 링커는 일반적으로 유연성과 프로테아제 내성을 제공한다. 일부 양태에서 링커는 아미노산 서열 (GaSb)c를 포함하고, 여기서 a=1-5, b=1-3, c=1-8이다. 특정 양태에서 링커는 아미노산 서열 (GGS)x(여기서 x=1-8 혹은 (GGGGS)y, y=1-5)를 포함할 수 있다.
'폴리펩티드' 또는 '폴리펩티드 사슬'이라는 용어는 아미드(amide) 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드 사슬은 바람직하게는 갈라지지 않은 단일 사슬 융합 단백질이다. 항원 결합 단백질은 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 이러한 항원 결합 단백질은 이량체, 삼량체, 사량체와 같은 다량체(multimer)이다. 탠덤 디아바디 또는 Bi-scFv-Fc와 같은 특정 양태에서 항원 결합 단백질은 호모다이머이고 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 다른 양태에서 항원 결합 단백질은 아트리플렉스(aTriFlex)와 같은 헤테로다이머(heterodimer) 혹은 scFv-IgAb와 같은 이형4양체(hetero-tetramer)이다.
항원 결합 부위는 특별히 EGFR 또는 CD16A에 결합한다.
'EGFR'은 활성화 돌연변이로 기술되고 병태 생리학적 과정에 연루된 모든 동형단백질(isoform) 또는 변이체를 포함하는 인간의 표피 성장인자 수용체(EGFR; ErbB-1; HER1)를 지칭한다. EGFR 항원 결합 부위는 세포 외 도메인에서 에피토프를 인식한다. 특정 양태에서 항원 결합 부위는 인간과 게먹이원숭이(cynomolgus, 시노몰구스) EGFR에 특이적으로 결합한다.
'EGFRvIII'은 EGFR 코딩 서열의 엑손(exon) 2-7에 걸친 염기쌍의 프레임 내 삭제(in-frame deletion)로부터 생성된 EGFR의 세포 외 도메인 돌연변이체를 지칭한다(Gan HK et al., FEBS 2013, 280 : 5350-5370).
특정 양태에서 EGFR에 대한 항원 결합 부위는 EGFR에 특이적인 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 구성되고, 여기서 (i) EGFR에 특이적인 중쇄 가변 도메인(VH)은 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하고, EGFR에 특이적인 경쇄 가변 도메인(VH)은 서열 번호 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하고, 또는 (ii) EGFR에 특이적인 중쇄 가변 도메인(VH)은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖고 및/또는 (iii) EGFR에 특이적인 경쇄 가변 도메인(VH)은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
이 EGFR 항원 결합 부위는 EGFRvIII에도 결합한다(실시예 3). 그래서 치료법에서 이 항원 결합 부위를 사용하면 EGFR 발현 및 EGFRvIII 발현 암 모두를 치료할 수 있다. EGFR과 달리 EGFRvIII는 암세포에서만 발현되고 건강한 조직에서는 발현되지 않는다. 다른 EGFR 표적화 요법은 EGFRvIII 양성 암에서 덜 효과적일 수 있다. EGFRvIII에 의한 EGFR 신호전달 경로에서 종양형성과 구조 활성화가 강화되기 때문이다.
'CD16A'는 활성화 수용체 CD16A를 일컫는데, NK 세포의 세포 표면에서 발현되는 FcγRIIIA로도 알려져 있다. CD16A는 NK 세포의 세포 독성 활성을 유발하는 활성화 수용체이다. CD16A에 대한 항체 친화성은 NK 세포 활성화를 촉발하는 능력과 직접적으로 관련이 있으므로 CD16A에 대한 높은 친화성은 활성화에 필요한 항체 용량을 감소시킨다. 항원 결합 단백질의 항원 결합 부위는 CD16A에는 결합하지만 CD16B에는 결합하지 않는다. 예를 들어, CD16A에 결합하지만 CD16B에 결합하지 않는 중쇄(VH) 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 항원 결합 부위는 CD16A의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위에 의해 제공될 수 있는데, CD16B에 존재하지 않는 C 말단 서열 SFFPPGYQ(서열번호 3)의 아미노산 잔기 및/또는 CD16A(서열번호 4)의 잔기 G130 및/또는 Y141을 포함하고 있다.
일부 양태에서 CD16A 항체 결합 부위는 CD16A 특이적인 중쇄와 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있는데, 여기에는 (i) CD16A 특이적인 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열번호 6 또는 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하고, CD16A 특이적인 경쇄 가변 도메인(VL)은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3를 포함하고 있고, 또는 (ii) CD16A 특이적인 중쇄 가변 도메인(VH)은 이 서열번호 12 또는 14에 제시된 아미노산 서열을 갖고 및/또는 (iii) CD16A 특이적인 경쇄 가변 도메인(VH)은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 갖고 있다.
CD16A에 대한 이 항원 결합 부위는 CD16B에 결합하지 않으며 유사한 친화도로 알려진 CD16A 동종형(allotype) F158와 V158에 결합한다. IgG의 힌지 영역과의 상호 작용에 중요한 위치 158의 아미노산을 변경하는 대립형질의 단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphisms) 두 개가 인간 CD16A에서 확인되었다. 동형의 158 F/F와 이형의 158 V/F 대립형질의 대립형질 빈도는 백인집단 내에서 각각 35~52% 또는 38~50% 범위에서 유사했으며, 반면 동형의 158 V/V 대립형질은 10-15%에서만 발견되었다(Lopez-Escamez JA et al.; BMC Med Genet 2011;12:2). 따라서 유사한 친화성 때문에 모든 환자에서 이러한 항CD16A 도메인에 의한 NK 세포의 활성화가 유리하다. CD16A에는 결합하지만 CD16B에는 결합하지 않는 중쇄 및 경쇄 가변 사슬 도메인으로 구성되는 추가 CD16A 항원 결합 부위는 WO 2006/125668에 기재되어 있다.
대안적 양태에서, 중쇄 및 경쇄 도메인은 여기에 기재된 CDR 또는 프레임워크 서열의 면역학적으로 활성화된 상동체 또는 변이체를 포함한다. 따라서 일부 양태에서 CD16A 또는 EGFR에 결합하는 중쇄 또는 경쇄 도메인의 CDR 서열은 서열번호 5-11 또는 21-26에 묘사된 아미노산 서열과 유사하지만 동일하지는 않다. 특정 예에서, CDR 변이체 서열은 면역학적으로 활성화된 5-11 또는 21-26의 서열과 비교했을 때 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 예에서, CDR 변이체 서열은 비임계 영역에서 비임계 잔기 또는 잔기를 변경하도록 변형된다. 중요하지 않은 아미노산은 친화성 성숙, CDR 워킹 돌연변이 유발, 부위 지정 돌연변이 유발, 결정화(crystallization), 핵 자기공명, 광친화성(photoaffinity) 라벨링, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유도(alanine-scanning mutagenesis)처럼 알려진 방법으로 식별할 수 있다.
항원 결합 단백질은 다가적(multivalent)이다. '다가'는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상 즉 존재하는 2개 이상의 항원 결합 부위를 지칭한다. 천연 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 가지며 2가이다. 다중 특이적 항원 결합 단백질은 적어도 4개의 항원 결합 부위를 갖고 적어도 4가이다. 특정 양태에서 항원 결합 단백질은 EGFR에 대한 2개의 항원 결합 부위 및 CD16A에 대한 2개의 항원 결합 부위를 갖는다. 즉, 항원 결합 단백질은 EGFR에 2가 및 CD16A에 2가로 결합한다.
한 양태에서 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 스캐폴드는 탠덤 디아바디에 의해 제공된다(도 3). '탠덤 디아바디(tandem diabody)'라는 용어는 또 다른 동일한 폴리펩티드가 항원 결합 호모다이머에 결합된 단일 폴리펩티드에서 4개 이상의 가변 도메인(2개의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 2개의 경쇄 가변 도메인(VL))을 연결하여 구축된 항원 결합 단백질을 의미한다. 이러한 탠덤 디아바디에서 링커 길이는 가변 도메인의 분자 내 페어링(pairing)을 방지하여, 폴리펩티드 사슬이 자체적으로 접혀 단량체 단일 사슬 단백질을 형성할 수 없고 오히려 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 강제하는 쪽으로 이뤄진다. 또한 가변 도메인은 이합체화(dimerization) 동안 상응하는 가변 도메인 쌍이 되도록 배열된다(Weichel et al., 2015, European Pharmaceutical Review, 20(1):27-32). 따라서, 탠덤 디아바디는 항원 결합 단백질이며, 각 폴리펩티드 사슬에서 가변 도메인은 펩티드 링커 L1, L2, L3에 의해 차례로 연결되고 N 말단에서 C까지 두 폴리펩티드 사슬 내에 각각 다음과 같은 순서대로 위치한다.
(i) VH-L1-VL-L2-VH-L3-VL, 또는
(ii) VL vl-L1-VH-L2-VL-L3-VH,
특정 양태에서, 링커 L2에 의해 연결된 폴리펩티드 사슬의 중심에 있는 가변 도메인은 CD16A에 대해 특이적이고 N 및 C 말단의 말초 도메인은 각각 EGFR에 특이적이다. 이러한 양태에서 가변 도메인은 N 말단에서 C 말단까지의 다음의 순서로 각 폴리펩티드 사슬 내에 위치한다.
(i) VH(EGFR)-L1-VL(CD16A)-L2-VH(CD16A)-L3-VL(EGFR), 또는
(ii) VL(EGFR)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L3-VH(EGFR),
바람직한 양태에서 가변 도메인은 다음의 순서로 위치한다:
(i) VH(EGFR)-L1-VL(CD16A)-L2-VH(CD16A)-L3-VL(EGFR)
보고된 연구에 따르면 링커의 길이는 이러한 다중 특이적 항원 결합 단백질의 유연성에 영향을 미친다. 탠덤 디아바디에서 펩티드 링커 L1, L2, L3의 길이는 '짧아서', 즉 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 아미노산 잔기로 구성되는데, 폴리펩티드 사슬의 가변 도메인이 다른 폴리펩티드의 도메인과 분자간 결합하여 탠덤 디아바디를 형성한다. 따라서, 특정 경우에 링커는 약 12개 이하의 아미노산 잔기, 예를 들어 3-12, 3-10 또는 3-9 아미노산 잔기로 구성된다.
단일 유전자 구축물로부터 발현된 후, 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬이 머리에서 꼬리까지 접혀 대략 105kDa의 기능적 비공유 호모다이머(non-covalent homodimer)를 형성한다. 분자간 공유 결합이 없었지만 일단 형성되면 호모다이머는 매우 안정적이며 손상되지 않고 단량체 형태로 되돌아가지 않는다. 탠덤 디아바디는 항체 가변 도메인만 포함하고 불변 도메인이 없다. 탠덤 디아바디는 CD16A에 대한 2가 결합 및 EGFR에 대한 2가 결합을 허용한다. 약 105kDa의 탠덤 디아바디의 크기는 IgG의 크기보다 작지만 1차 통과 신장 청정(renal clearance)에 대한 임계값보다 훨씬 높아서 항체 결합 도메인 또는 비항체 스캐폴드를 기반한 더 작은 이중특이 구성에 비해 약동학적 이점을 제공한다. 게다가 탠덤 디아바디는 이러한 약동학 및 결합 특성을 기반으로 하는 BiTE® 또는 DARTTM 분자와 같은 다른 이중 특이적 결합 단백질보다 유리하여 더 긴 고유 반감기와 향상된 세포 독성을 제공한다. 탠덤 디아바디는 숙주 세포, 예를 들어 포유류 CHO 세포에서 잘 발현된다. 탠덤 디아바디에 대해 견고한 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream) 제조 공정이 가능하다고 생각한다.
또 다른 양태에서 항원 결합 단백질은 WO 2017/064221에 개시된 바와 같은 비대칭, 삼중 특이적 플렉시바디(trispecific flexibody, aTriFlex)이다. 이러한 아트리플렉스(aTriFlex)는 적어도 6개의 가변 도메인을 포함하는 첫번째 폴리펩티드와, 적어도 2개의 가변 도메인을 포함하는 두번째 폴리펩티드의 이량체(dimer)이다(도 4). 이러한 양태에서, 두 번째 폴리펩티드는 디아바디 유닛의 일부이고, 바람직하게는 첫 번째 폴리펩티드에 통합된 2개의 병치된 가변 도메인의 다른 쌍과 비공유적으로 결합된다. 첫 폴리펩티드 사슬이 6개의 가변 도메인으로 구성되고 두 번째 폴리펩티드가 2개의 가변 도메인으로 구성되는 양태에서 가변 도메인은 예를 들어, 다음 배향으로 폴리펩티드의 N 말단에서 C 말단으로 배열될 수 있다: VH-VL-VH-VH-VL-VH(첫 번째 폴리펩티드) 및 VL-VL(두 번째 폴리펩티드); VL-VH-VH-VH-VH-VL(첫 번째 폴리펩티드) 및 VL-VL(두 번째 폴리펩티드); VH-VL-VL-VL-VH-VL(첫 번째 폴리펩티드) 및 VH-VH(두 번째 폴리펩티드); VL-VH-VL-VL-VH-VL(첫 번째 폴리펩티드) 및 VH-VH(두 번째 폴리펩티드); VH-VL-VL-VL-VL-VH(첫 번째 폴리펩티드) 및 VH-VH(두 번째 폴리펩티드). VH-VH 방향의 2개의 가변 도메인 쌍을 갖는 디아바디 단위와 VL-VL 방향의 2개의 가변 도메인 쌍을 갖는 디아바디 단위는 삼중 특이적인 항체 분자처럼 다중 특이적인 올바른 폴딩(correct folding)을 선호한다. 바람직한 양태에서 CD16A 특이적인 가변 도메인은 6개의 가변 도메인으로 구성된 첫 폴리펩티드 사슬의 중심에 위치하고 두 번째 폴리펩티드는 CD16A에 특이적인 상보적 가변 도메인으로 구성된다. 그러한 아트리플렉스(aTriFlex)는 4가 및 이중 특이적 또는 삼중 특이적이다. 한 실시 양태에서 아트리플렉스는 삼중 특이적이고 EGFR에 대한 1개의 항원 결합 부위, CD16A에 대한 2개의 항원 결합 부위, HSA(인간 혈청 알부민)에 대한 1개의 항원 결합 부위로 구성된다. 특정 실시 양태에서 아트리플렉스는 (i) VH(EGFR)-VL(EGFR)-VL(CD16A)-VL(CD16A)-VH(HSA)-VL(HSA) 순서로 위치하는 가변 도메인을 갖는 첫 폴리펩티드 사슬과 VH(CD16A)-VH(CD16A) 또는 (ii) VH(EGFR)-VL(EGFR)-VH(CD16A)-VH(CD16A)-VH(HSA)-VL(HSA)을 갖는 두 번째 폴리펩티드 사슬과 VL(CD16A)-VL(CD16A) 순서로 위치하는 가변 도메인을 갖는 두 번째 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 이러한 아트리플렉스 항원 결합 단백질의 생성 및 생산은 WO 2017/064221에 기술되어 있다.
추가 양태에서 항원 결합 단백질은 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE의 부류로부터 선택된 면역 글로불린의 면역 글로불린 불변 도메인 및 그에 부착된 항원 결합 부위를 포함하는 scFv를 포함하는 Fc 융합 단백질이다. IgG의 불변 도메인, 특히 IgG1이 바람직하다. 따라서, 일부 실시 양태에서 Fc 융합 항원 결합 단백질은 Fc 부분을 포함한다. Fc 부분이 FcRn에 결합하기 때문에 Fc 융합 항원 결합 단백질의 혈청 반감기가 Fv 도메인 기반 항원 결합 단백질(예. 탠덤 디아바디 혹은 아트리플렉스)에 비해 상당히 증가한다.
'Fc 융합 항원-결합 단백질'은 면역 글로불린의 Fc 부분과 Fc 부분에 N 말단 및/또는 C 말단에 융합된 적어도 하나의 항원결합 부위의 조합을 포함하는 항원결합 단백질을 지칭한다. 본 발명은 N 말단에 부착된 2개의 항원 결합 부위 및 Fc 부분의 C 말단에 부착된 2개의 항원 결합 부위를 갖는 다중 특이적 및 적어도 4가의 Fc 융합 항원 결합 단백질을 제공한다. N 말단에 부착된 2개의 항원 결합 부위는 Fc 부분의 CH2의 N 말단에 힌지 도메인을 통해 결합된 항원 결합Fab 또는 scFv일 수 있다. C 말단에 배치된 2개의 항원 결합 부위 각각은 펩티드 링커에 의해 Fc 부분의 CH3의 C 말단에 융합된 scFv이다. 일부 양태에서 Fc 부분의 N 말단에 배치된 2개의 항원 결합 부위는 첫 항원에 대해 특이적이고 C 말단에 배치된 2개의 항원 결합 부위는 두 번째 항원에 대해 특이적이다. 따라서, 4가 항원 결합 분자는 첫 항원에 2가, 두 번째 항원에 2가 결합하는 반면, 이 2가 결합은 두 항원 각각에 대한 결합력을 증가시켜 결합력을 증가시킨다. 특정 양태에서 Fc 부분의 N 말단에 위치한 항원 결합 부위는 CD16A에 특이적이고 Fc 부분의 C 말단에 위치한 항원 결합 부위는 EGFR에 특이적이다.
'Fc 부분'은 불변 Ig 영역에서 적어도 Fc 영역의 한 개의 기능, 특히 FcRn에 대한 결합 기능을 보유하는 폴리펩티드를 지칭하는데, 적어도 CH2 도메인, 바람직하게는 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬로 구성된다. CH2-CH3 폴리펩티드 사슬은 또 다른 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬과 함께 서로 결합된 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드의 호모다이머에 조립되며, 여기서 이량체화(dimerization)는 힌지 영역 C 말단에 의해 CH2 도메인으로 촉진된다. 따라서 일부 양태에서 Fc 부분은 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬 및 힌지 영역의 호모다이머로 구성된다. Fc 부분이 IgG 부류의 불변 도메인, 특히 IgG1 불변 도메인을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, '힌지 도메인'은 Fc 부분에 N 말단으로 연결될 수 있다. 힌지 도메인은 Fc 부분과 같거나 다른 IgG 클래스이거나 자연적으로 발생하지 않는 가공된 힌지 도메인일 수 있다.
이러한 Fc 융합 항원 결합 단백질은 CD16A 및 EGFR에 대한 항원 결합 부위를 바람직하게는 IgG1 Fc 부분과 모듈식으로 조합하여 생성될 수 있어서, 2 개의 항원 결합 부위가 Fab 단편 또는 scFv로서 힌지 도메인을 통해 N 말단으로 Fc 부분에 융합되어 이중 특이적이고 4가인 항원 결합 단백질을 제공한다.
일부 양태에서 Fc 융합 항원 결합 단백질은 scFv-IgAb(도 1) 또는 Bi-scFv-Fc(도 2)이다.
따라서, 추가 양태에서 다중 특이적 항원 결합 단백질은 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드의 호모다이머를 포함하는 4가 및 이중 특이적 Fc 융합 단백질(Bi-scFv-Fc)이며 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드는 각각 N 말단과 C 말단을 통해서 가변 중쇄(VH) 도메인과 가변 경쇄(VL) 공유결합적으로 유동적인 링커에 의해 연결되어 ScFv의 항원 결합 부위를 형성한다. 그래서 이 같은 Bi-scFv-Fc 항원 결합 단백질은 두 개의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있고, 각 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 첫 항원 결합 사이트의 VH로 연결된 VL로 구성된 첫 번째 단일 사슬형(single-chain) Fv(scFV(1))(힌지 영역에 의해 CH2 도메인에 N 말단으로 CH2-CH2의 CH3 도메인에 융합되어 있음)와 펩티드 링커에 의해 항원 결합 사이트의 VH로 연결된 VL로 구성된 두 번째 단일 사슬형 Fv(scFv(2))(펩티드 링커에 의해 N 말단으로 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인에 C 말단으로 융합되어 있음)을 포함하고 있다. 그래서 이 같은 Bi-scFv-Fc 항원 결합 단백질은 N에서 C 말단까지의 구조를 지닌 두 개의 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다: scFv(1)-Hinge-CH2-CH3-scFv(2). 특히, (i) scFv(1)은 CD16A에 대한 항원 결합 부위이고 scFv(2)는 EGFR에 대한 항원 결합 부위이며 혹은 (ii) scFv(1)이 EGFR에 대한 항원 결합 부위이고 scFv(2)가 CD16A에 대한 항원 결합 부위이다. CH2-CH3 호모다이머로 구성된 Fc 부분은 침묵 되는 게 바람직한데 즉, 본질적으로 Fc 감마 수용체에 결합하지 않지만 FcRn에 대한 결합을 유지한다. 특정 양태에서 항원 결합 단백질은 서열번호 20에 묘사된 아미노산 서열을 갖는 CH2-CH3 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
추가 양태에서 다중 특이적 Fc 융합 항원 결합 분자는 4가 및 이중 특이적 scFv-Ig 항원 결합 단백질(scFv-IgAb; 도 1)이다. 이러한 scFv-IgAb는 IgG, 바람직하게는 IgG1, 스캐폴드(scaffold), C 말단에 융합된 2개의 scFv로 구성된다. 따라서 이러한 scFv-IgAb는 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)로 조립된다. 중쇄(H) 사슬은 CH2-CH3 폴리펩티드 사슬에 C 말단으로 힌지 영역에 의해 연결된 CH1 도메인에 C 말단으로 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인으로 구성되며, 그 CH3 도메인은 가변 경쇄(VH) 도메인에 유연한 링커로 연결된 가변 경쇄(VL) 도메인을 지닌 항원 결합 사이트로 구성된 scFv에 융합된다. 경쇄(L)는 람다(lambda) 또는 카파(kappa) 경쇄 불변 도메인과 같은 경쇄 불변 도메인(CL)에 연결된 가변 경쇄(VL) 도메인으로 구성된다. scFv-IgAb 항원 결합 단백질은 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로부터 조립되며, 여기서 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인은 결합하여 Fab의 2개의 N 말단 Fv 항원을 형성한다. 한 양태에서 Fab 의 N 말단 Fv 항원 결합 부위는 CD16A에 특이적이고 C 말단 scFv 항원 결합 부위는 EGFR에 특이적이다. 또 다른 양태에서 Fab의 N 말단 Fv 항원 결합 부위는 EGFR에 특이적이고 C 말단 scFv 항원 결합 부위는 CD16A에 특이적이다.
특히, 다중 특이적 항원 결합 단백질은 중쇄(H) 및 경쇄(L)을 포함하며, 여기서 (i) 중쇄(H)는 VH(CD16A)-CH1-Hinge-CH2-CH3-VH(EGFR)-VL(EGFR) 구조를 갖고 경쇄(L)는 VL(CD16A)-CL 구조를 갖거나 혹은 (ii) 중쇄는 VH(EGFR)-CH1-Hinge-CH2-CH3-VH(CD16A)-VL(CD16A) 구조를 갖고 경쇄는 VL(EGFR)-CL 구조를 갖거나 (ii) 중쇄는 VH(EGFR)-CH1-Hinge-CH2-CH3-VH(CD16A)-VL(CD16A) 구조를 갖고 경쇄는 VL(EGFR)-CL 구조를 가질 수 있으며, 혹은 (iii) 중쇄가 VH(EGFR)-CH1-CH2-CH3-VL(CD16A)-VH(CD16A) 구조를 갖고 경쇄가 VL(EGFR)-CL 구조를 갖는다. 일부 양태에서 CH2-CH3 호모다이머로 구성된 Fc 부분은 침묵되는데 즉, 본질적으로 FcγR에 결합하지는 않지만 FcRn에 대한 결합을 유지한다.
일부 양태에서 항원 결합 단백질은 침묵된 Fc 부분을 포함한다. 그러한 Fc 부분은 IgG에 비해 FcγR에 대한 결합에서 침묵된다. 특정 양태에서 항원 결합 단백질은 서열번호 15에 나타난 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 도메인 및/또는 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 람다(lambda) 경쇄 도메인을 포함한다.
'침묵된 Fc 부분'은 Fc 감마 수용체(FcγR)에 결합하지는 않지만 연장된 반감기와 긴 혈청 지속성을 위해 신생 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 유지하는 변형된 Fc 부분을 의미한다. 항원 결합 단백질은 CD16A 항원을 통해 특이적으로 NK 세포와 결합하도록 설계되었으므로, 바람직한 양태에서 Fc 감마 수용체에 대한 Fc 결합은 방지되어 한다. 또한, FcRn은 IgG를 분해로부터 보호하고 상피 장벽을 통한 IgG의 수송을 담당하는 것으로 보고되었다. 따라서, FcRn 결합을 유지하거나 향상시키는 Fc 융합 항원 결합 단백질의 Fc 부분에서의 변형이 바람직하다.
Fc 감마 수용체에 대한 결합이 감소되거나 없는 IgG1을 생성하기 위한 여러 종류의 돌연변이 또는 변화가 설명되어 왔는데, 이들은 C220S, C229S, E233P, L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S, D265A, N297A, N297Q, P331S로 구성되는 군의 돌연변이로부터 선택되었다. 또한 Fc 감마 수용체에 대한 결합이 감소된 IgG2를 생성하기 위한 돌연변이 종류를 설명하기 위해 H268Q, V309L, A330S, A331S로 구성되는 군으로부터 돌연변이가 선택되었고, Fc 감마 수용체에 대한 결합이 감소된 IgG4를 생성하기 위한 돌연변이 종류를 설명하기 위해 L235A, G237A, E318A로 구성된 군으로부터 돌연변이가 선택되었다(Strohl W., Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:1-7; Kaneko E and Niwa R, Biodrugs 2011, 25(1):1-11; Baudino L., J. Immunology 2008, 181:6664-6669).
또한, Fc 부분은 혈청 반감기를 연장하도록 조작될 수 있다. 항원 결합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 IgG1 Fc 부분의 돌연변이가 다음과 같다 - T250Q, M252Y, S254T, T256E, T307A, E380A, M428L, H433K, N434A, N434Y (Srohl W., Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:1-7; Borrok MJ, et al., J. Pharmaceutical Sciences 2017, 106(4):1008-1017).
일부 양태에서 IgG1 Fc 부분은 카바트(Kabat) 넘버링에 따라 위치 234, 235, 및 265에서 돌연변이 세트를 포함하고 있으며, 특히 돌연변이 세트는 L234F/V/A, L235A/E, D265A에서 선택된다. 특히 돌연변이 L234F, L235E, 및 D265A(서열번호 20)의 세트를 포함하는 IgG1 Fc 부분이 바람직하다. 따라서, 일부 양태에서 Fc 융합 항원 결합 분자, 예컨대 Bi-scFv-Fc 또는 scFv-IgAb는 일련의 돌연변이 L234F, L235E, 및 D265A를 갖는 침묵된 IgG1 Fc- 부분을 포함한다. 언급된 모든 돌연변이는 카바트 넘버링 시스템에 해당한다(Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689 (1991).
대안적인 양태에서 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 혈청 반감기는 (i) 인간 혈청 알부민(HSA)에 대한 항원 결합 부위를 적어도 하나 이상 항원 결합 단백질에 융합하거나 또는 (ii) 인간 혈청 알부민(HSA)을 항원 결합 단백질에 융합 또는 결합하면서 길어질 수 있다.
본원에 기재된 양태들에서 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질을 형성하는 개별 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 발현함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 양태는 상기에서 설명된 것처럼 DNA나 RNA와 같이 항원 결합 단백질의 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드는 숙련 기술자에게 알려진 방법들로 구성될 수 있다. 가령 펩티드 링커에 의해 분리되거나 폴리펩티드 사슬의 펩티드 결합에 의해 직접 연결된 가변 도메인 및 불변 도메인을 코딩하는 유전자를 적합한 프로모터(promotor) 및 선택적으로 적합한 전사 종결인자(transcription terminator)에 작동 가능하게 연결된 유전적 구성물로 조합하고, 이를 박테리아 또는 다른 적절한 발현 시스템(예를 들어 CHO 세포)로 발현시킨다(실시예 1).
본 발명은 추가로 다중 특이적 항원 결합 단백질, 특히 여기에 기재된 다중 특이적 항원 결합 분자 및 적어도 하나의 추가 성분을 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서 본 발명의 다중 특이적 항원 결합 단백질은 치료 화합물로서 사용하기 위한 목적이 있다. 본 발명에 따른 다중 특이적 항원 결합 단백질은 EGFR 양성 또는 EGFRvIII 양성 세포를 특징으로 하는 암의 치료에 사용하기 위한 것이 바람직하다.
또 다른 양태에서 증식성 질환 또는 종양성 질환의 치료 또는 개선 방법이 제공되며, 이 방법은 본 발명에 따른 다중 특이적 항원 결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료 대상은 인간일 수 있다. 특정 양태에서 증식성 질환 또는 종양성 질환은 EGFR 양성 또는 EGFRvIII 양성 세포를 특징으로 한다.
치료 화합물로서 사용하거나 EGFR 양성 질환 또는 EGFR 양성 및/또는 EGFRvIII 양성 암을 치료하기 위해서는 다중 특이적 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물이 적합한 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)와 조합되는 것이 바람직하다. '약제학적으로 허용되는 담체'라는 용어는 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않고 투여되는 환자에게 독성이 없는 임의의 담체를 아우르는 것을 의미한다. 적합한 약제학적 담체의 예는 당 기술분야에서 잘 알려져 있으며 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체는 통상적인 방법으로 만들 수 있으며, 적절한 용량으로 피험자에게 투여된다. 조성물은 무균이 바람직하다. 이들 조성물은 역시 보존제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항균제와 항진균제를 포함시킴으로써 방지할 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 정맥 내, 복강 내, 피하 내, 근육 내, 국소 또는 피내 투여 등의 상이한 방식으로 수행 될 수 있다. 물론 투여 경로는 약제학적 조성물에 포함된 치료법의 종류와 화합물의 종류에 따라 다르다. 투여 요법은 주치의 및 기타 임상 요인에 의해 결정된다.
본 발명의 항원 결합 단백질을 사용하여 치료할 수 있는 EGFR 양성 및/또는 EGFRvIII 양성 암은 대장암, 두경부암, 폐암, 교아세포종(glioblastoma) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다
다음 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 설명된 양태를 추가로 설명하고 있다. 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 NK 세포 매개 세포독성을 유도할 수 있는 반면, EGF 유도 EGFR 인산화에 대한 억제 효과가 없거나 거의 없음이 입증되었다.
실시예 1 : EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 생성 및 생산
물질
[표 1]
Figure pct00002
EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 생성
탠덤 디아바디(Tandem diabody)
탠덤 디아바디(도 3)는 관련 자료(Reusch et al., 2014, mAbs 6 : 3, 728-739)에 설명된 대로 구성된다. 탠덤 디아바디를 구성하기 위해 항EGFR Fv 도메인(서열번호 1,2)은 항CD16A Fv 도메인(서열번호 12,13)과 조합된다. 탠덤 디아바디를 위한 발현 카세트(expression cassette)는 항EGFR 도메인 및 항CD16A 도메인이 VH_EGFR-L1-VL_CD16A-L2-VH_CD16A-L3-VL_EGFR 순서로 위치하도록 클로닝된다. 링커 L1 및 L3에는 9개 아미노산 링커 (G2S)3(서열번호: 36)이 사용되고, 링커 L2에는 6개 아미노산 링커 (G2S)2(서열번호: 35)가 사용된다. 획득된 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디는 서열번호 27에 나타난 아미노산 서열을 가진 두 개의 폴리펩티드로 구성된다.
아트리플렉스(aTriFlex)
아트리플렉스(도 4)는 WO 2017/064221에 설명된 대로 구성된다. 아트리플렉스를 구성하기 위해 항EGFR Fv 도메인(서열번호 1,2)은 항CD16A Fv 도메인(서열번호 12,13) 및 항HSA Fv 도메인(서열번호 31,32)과 결합된다. 아트리플렉스에 대한 발현 카세트는 항EGFR 도메인 및 항CD16A 도메인이 첫 번째 폴리펩티드에 위치하도록 VH_EGFR-L1-VL_EGFR-L2-VL_CD16A-L2-VL_CD16A-L2-VH_HSA-L1-VL_HSA 순서로 클로닝되고 두 번째 폴리펩티드에서는 VH(CD16A)-L2-VH(CD16A) 순서로 클로닝되며, 18개 아미노산 링커 (G2S)6(서열번호 18)은 링커 L1에 사용되고, 9개 아미노산 링커 (G2S)3(서열번호 36)은 L2에 사용된다.
Bi-scFv-Fc
CHO 세포에서 Bi-scFv-Fc 항원 결합 단백질(도 2)을 발현하기 위해서 분자의 코딩 서열을 포유류 발현 벡터 시스템에 클로닝했다. 간단히 말해, 펩티드 링커로 연결된 항EGFR Fv 도메인(서열번호 1,2) 및 항CD16A Fv 도메인(서열번호 12,13)을 인코딩하는 유전자 서열은 Thermo Fisher Scientific GeneArt(독일 레겐스부르크)에 의해 합성되었다. 서로 다른 가변 도메인의 PCR 앰플리콘(amplicon) 및 침묵한(silencing) 점 돌연변이(서열번호 20)를 포함하는 Fc 부분의 PCR 앰플리콘을 상응하는 프라이머(primer)로 생성하였다. 그 후 서로 다른 중복의 DNA 단편과 선형화된 백본 벡터(linearized backbone vector)가 하나의 등온(isothermal) 반응으로 함께 결합된다. Bi-scFv-Fc 발현 구축물은 각각 항체 분비 및 정제를 용이하게 하기 위해 N 말단 신호 펩티드 및 Fc 부분에 대한 코딩 서열을 포함하도록 설계되었다. 구축물의 서열은 프라이머쌍 5´-TAATACGACTCACTATAGGG-3´(서열번호 33) 및 5´-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3´(서열번호 34)를 사용하여 GATC(독일 쾰른)에서 DNA 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인되었다. Bi-scFv-Fc에 대한 발현 카세트는 항EGFR 도메인 및 항CD16A 도메인이 VL_CD16A-L1-VH_CD16A-Hinge-CH2-CH3-L2-VH_EGFR-L3-VL_EGFR 순서로 위치하고, (G2S)7은 링커 L1에 사용되며 (G4S)2는 링커 L2에 사용되며 (G2S)6은 링커 L3에 사용된다. 획득된 Bi-scFv-Fc-_02는 서열번호 30에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드로 구성된다.
scFv-IgAb(도 1):
scFv-IgAb를 인코딩하는 DNA 발현구조는 항CD16A Fv 도메인(서열번호 12,13)의 인코딩 서열을 CMV 제어 발현 카세트(CMV-controlled expression cassettes)를 갖는 변형된 포유류 발현 벡터로 클로닝하면서 생성된다. 이들 CMV 제어 발현 카세트는 같은 벡터에서 공동 발현을 위해 Fc 침묵된 점 돌연변이(서열번호 15,16)를 지닌 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함하고 있다. 그 후, PCR 앰플리콘은 상응하는 프라이머를 지닌 서열번호 18(VH-(G2S)6-VL)에 나타난 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커에 의해 분리된 항EGFR Fv 도메인(서열번호 1,2)을 암호화하는 유전자 서열로부터 생성된다. 결과적으로 중복되는 DNA 단편은 적절한 위치에서 공동 발현 벡터에 삽입된다. 가변 도메인 및 Fc 침묵하는 점 돌연변이를 포함하는 불변 도메인을 인코딩하는 모든 필요한 유전자 서열은 (Thermo Fisher Scientific GeneArt(독일 레겐스부르크)에 의해 합성되었다. scFv-IgAb 발현 구축물은 각각 항체 분비 및 정제를 촉진하기 위해 N 말단 신호 펩티드 및 Fc 부분에 대한 코딩 서열을 포함하도록 설계되었다. 모든 구축물의 서열은 맞춤 제작된 프라이머를 사용하여 GATC(독일 쾰른)에서 DNA 시퀀싱으로 확인되었다. scFv-IgAb에 대한 발현 카세트는 항EGFR 도메인, 항CD16A 도메인, 불변 도메인이 첫 번째 폴리펩티드에 VH_CD16A-CH1-Hinge-CH2-CH3-L1-VH_EGFR-L2-VL_EGFR로 위치하도록, 두 번째 폴리펩티드에 VL_CD16A-CLambda로 위치하도록 클로닝된다. (G4S)2(서열번호 35)는 링커 L1에 사용되고 (G2S)6(서열번호 18)은 링커 L2에 사용된다. 획득된 scFv-IgAb_02는 서열번호 29에 나타난 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 조립된 서열번호 28에 나타난 아미노산 서열을 갖는 중쇄로 구성된다.
호스트 세포 배양
CHO-K1 중국 햄스터 난소 세포의 유도체(ATCC, CCL-61)(Kao and Puck, 1968)인 Flp-In CHO 세포(Life Technologies)를 L 글루타민, 10% FCS, 100 μg/ml 제오신(Zeocin)이 보충된 햄스터의 F-12 영양소 믹스에서 배양했다. 부착 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 분리하고 Life Technologies에서 제공하는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 계대배양(subculture)했다.
현탁액에서의 성장에 적응시키기 위해, 세포를 조직 배양 플라스크에서 분리하고 후속 배양을 위해 37℃, 5% CO2, 120rpm의 쉐이크 플라스크에서 무혈청(serum-free) HyClone CDM4 CHO 배양액에 배치했다. 현탁액에 적응된 Flp-In CHO 숙주 세포의 배양을 위한 표준 배양액은 L 글루타민, HT 보충제, 페니실린/스트렙토마이신, 100μg/mL 제오신이 보충된 HyClone CDM4 CHO였다. 현탁액에 적응된 세포를 10% DMSO가 있는 배양액에서 냉동 보존하고 마이코알러트 마이코플라스마 검사 키트(MycoAlert Mycoplasma Detection Kit)(Lonza)를 사용하여 마이코플라스마에 대해 음성으로 테스트했다.
안정적으로 형질 감염된 세포 풀 생성
분비된 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 재조합 Flp-In CHO 세포주, Fc 융합 작제물 또는 비교 항체뿐만 아니라 막 고정 항원은 현탁액 적응 숙주 세포의 형질 감염에 의해 생성되었다. 이를 위해, 관심 있는 단백질(pcDNA5-FRT) 및 Flp 재조합 효소(pOG44, Life Technologies)를 코딩하는 발현 플라스미드(2.5 μg)를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 공동 형질 감염하기 하루 전에 제오신 없이 표준 배양액에 세포를 배치했다. 간단히 말해서, 벡터 DNA와 형질 감염 시약은 총 100μL OptiMEM I 배양액에서 DNA:PEI를 1:3(μg/μg) 비율로 혼합하고, 1ml의 CHO-S-SFMII 배양액에 현탁한 2E+6 Flp-In CHO 세포에 추가하기 전에 10분 동안 배양했다(Life Technologies). 24-48시간 인큐베이션 후, CHO-S-SFMII 배양액에서 0.1E+6 생존 세포/mL의 밀도로 배양조직을 물을 희석 한 후 6-7μg/mL 퓨로마이드 중염산염(Puromycin Dihydrochloride)을 첨가하여 안정적으로 형질 감염된 세포에 대한 선택을 시작했다. Flp 재조합효소(recombinase)는 부위 특이적 DNA 재조합을 통해 통합된 FRT 부위의 게놈에 Flp-In 발현 구조의 삽입을 매개한다(O'Gorman et al 1991). 선택이 이뤄지는 동안 생존 세포 밀도를 일주일에 두 번 측정하고, 세포를 원심분리하며 0.1E+6 생존 세포/mL의 최대 밀도로 신선한 선택 배양액에 재현탁했다. 재조합 단백질 산물을 안정적으로 발현하는 세포 풀(pool)은 2-3주간의 선택과정 후 회수되었고, 이때 세포는 쉐이크 플라스크에서 표준 배양액으로 옮겨졌다. 분비된 재조합체 또는 막 고정 단백질(membrane-anchored proteins)의 발현은 각각 무얼룩기준(Criterion Stain-Free)(Bio-Rad) 기술(아래 참조) 또는 유세포측정(Flow Cytometry)을 이용한 세포배양 상층액의 단백질 겔 전기영동법으로 확인되었다. 안정적인 세포 풀은 7.5% DMSO를 포함하는 배지에서 냉동 보존되었다. 안정적인 세포 풀은 7.5% DMSO를 포함한 배양액에 저온보존되었다.
유가배양(Fed-batch) 방식의 CHO 세포 현탁액 배양에서의 재조합 단백질 생산
재조합 단백질은 세포배양 상청액(supernatant)으로의 분비를 통해 10-11일간 안정적으로 형질 감염된 CHO 세포의 유가배양에서 생산되었다. 이를 위해 재조합 항체, Fc 융합 항원 또는 대조 항체(comparator antibodies)를 안정적으로 발현하는 세포를 산소투과캡(Corning)이 있는 폴리카보네이트 삼각 플라스크의 표준 배양액에 6E+5 세포/mL의 시작 밀도로 넣고 37℃ 및 5% CO2에서 140rpm으로 흔들어 배양했다. 유가배양 동안 배양액은 0일(시작일)에 40mL/L ActiCHO Feed A(GE Healthcare) 및 4mL/L ActiCHO Feed B(GE Healthcare)로 보충되었고, 3일, 5일, 7일에는 두 배로 양을 늘였다. 세포 배양 상청액은 일반적으로 >7 %의 배양 생존력에서 10일 또는 11일 후에 채취했다. 샘플은 영양공급 전 격일로 생산 배양물에서 수집했고 세포 밀도 및 생존력을 평가했다. 채취 당일에는 세포배양 상청액이 추가 사용 전 Millipore Express PLUS Membrane Filters(Millipore)를 사용하여 원심 분리 및 진공 여과(0.22 μm)로 제거되었다.
발현 역가 정량(expression titer quantification):
세포배양 상청액(cell culture supernatants, CSS)의 단백질 발현 역가 및 생성물 무결성은 생산 배양의 5일, 7일, 10일 혹은 11 일에 SDS-PAGE를 통해 분석된다. 4-20% Criterion TGX Precast SDS PAGE Gels(Biorad)에 로딩하기 전에 SDS PAGE 샘플 버퍼와 혼합된다. 총 단백질은 Criterion Stain-free Molecular Imaging System(Biorad)을 사용하여 겔에서 시각화된다. 생성물 역가는 알려진 농도의 참조 항체와의 비교를 통해 반정량적(semi-quantitatively)으로 결정된다.
항EGFR 항체의 정제
항EGFR 항원 결합 단백질은 단백질 A와 제조용 SEC로 구성된 2 단계 절차로 정화된 CHO 세포 배양 상청액으로부터 정제되었다. 단백질 A의 경우, 정화된 상청액을 HiTrap MabSelectSuRe 열에 로드했다. 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS) pH 7.4와 10mM 인산나트륨 pH 7.0으로 세척 한 후 50mM 아세트산나트륨 pH 3.5과 10mM 글리신/HCL pH 2.0을 사용하여 2단계 경사도(gradient)로 단백질을 녹여 분리하였다. SE-HPLC와 SDS-PAGE를 사용하여 일부의 순도를 분석하였다. 허용 가능한 순도를 나타내는 일부를 모으고 Superdex 200의 예비등급 열을 사용하여 예비 겔 여과에 적용했다. 정제된 항EGFR 항원 결합 단백질을 포함한 용출액 일부를 모으고, 10mM 아세트산나트륨, 4.5% 소르비톨 pH 5.0 대비 Sephadex G-25 열(column)을 이용한 완충액 교환(buffer exchange)을 실시하고, 한외 여과(ultrafiltration)를 통해 약 1mg/mL의 일반적인 농도로 농축했다. 최종 샘플(scFv-IgAb_2 약 79%와 Bi-scFv-Fc_2 약 85%)의 균질성은 환원(reducing) 및 비환원(non-reducing) 조건에서 SDS-PAGE에 의해 평가되었다(그림 5 참조). 환원제로서 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 함유하는 비환원 2x SDS-PAGE 샘플 버퍼 또는 환원 2x SDS-PAGE 샘플 버퍼와 이들 샘플을 혼합하였다. 모든 샘플은 4-20% Criterion TGX Precast SDS Page Gel. 2μg에 로딩하기 전에 95℃에서 5분간 가열되었다. 레인 당 2㎍의 정제 된 단백질 샘플을 사용하였다. 겔(gel)에서 단백질을 분리하기 위해 SDS-PAGE를 1x Tris/Glycine/SDS 버퍼에서 300V에서 약 22분간 실행했다. 총 단백질은 Criterion Stain-free Molecular Imaging System(BioradBio-Rad)을 사용하여 겔에서 시각화되었다. Page Ruler Unstained Protein 래더(ladder)는 분자량 마커(molecular weight marker)로 사용되었다. 순도(scFv-IgAb_2 약 99% 및 Bi-scFv-Fc_2 약 97%)는 Superdex 200 Increase 10/300GL 열을 사용하는 분석적 SE-HPLC로 평가되었다. 정제된 단백질은 추가 사용 전까지 -80℃에서 알리코트(aliquots)로 보관되었다.
ELISA에서 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 결합분석
ELISA에서의 결합 분석
96-웰 ELISA 플레이트(96-well ELISA plates)(Immuno MaxiSorp; Nunc)를 밤새 100mM 탄산염-중탄산염 완충액에서 재조합 항원 또는 항체로 4℃에서 코팅했다. EGFR-mFc 항원은 2.5μg/mL의 농도로, EGFR-Fc는 3μg/mL로, CD16A-Fc는 1.5μg/ml로, EGFR/CD16A scFv-IgAb는 3.8 μg/ml, 또는 EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc는 3μg/mL로 코팅되었다. PBS에 용해된 3% (w/v) 탈지분유 (Merck)를 사용한 차단 단계 후, 0.3% (w/v) 탈지분유를 포함하는 PBS에서 서로 다른 항체 또는 가용성 항원의 연속 희석액을 상온에서 1.5시간 동안 플레이트에서 인큐베이션했다. His-태그된 분석물의 검출을 위해 Penta-HIS-HRP(Qiagen)를 1:3000비율로 희석해서 사용했다. EGFR-mFc 항원에 결합된 EGFR/CD16A scFv-IgAb 또는 EGFR/CD16A Bi-scFv-Fc의 검출을 위해 비오틴화된(biotinylated) CD16-Fc를 상온에서 1시간 동안 플레이트에서 배양한 후 세척하고 Streptavidin-HRP 접합체(Roche)와 1:10000 희석으로 실온에서 1시간 동안 세척 및 배양을 했다. 0.1%(v/v) Tween 20을 포함하는 PBS의 웰(well)당 300μL로 3회 세척한 후, 플레이트를 발색이 명확하게 보일 때까지 테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB) 기질(Seramun)과 함께 배양했다. 0.5 M H2SO4의 웰당 100μL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 흡광도(absorbance)는 다중 라벨 플레이트 판독기(multilabel plate reader)(Victor, Perkin Elmer)를 사용하여 450nm에서 측정되었다. 흡광도 값은 GraphPad Prism 버전 6.07에 맞는 비선형 회귀, S자형 용량반응(dose-response)(가변 기울기), 최소 제곱(평상시)을 사용하여 플롯되고 분석되었다(GraphPad Software, La Jolla California USA).
FcRn 및 다양한 Fcγ 수용체에 결합
EGFR/CD16A 항원 결합 단백질에서 침묵된 Fc의 특성화를 위해 표면 플라스몬 공명 분광법(Surface Plasmon Resonance Spectroscopy, SPR)을 사용하여 다양한 Fcγ 수용체 및 FcRn (pH 6.0)에 대한 결합을 측정했다.
재료 및 방법:
리간드 분자(Ligand molecules)
모노Fc(mono Fc, mFc) 및 Avi-Tag에 융합된 다양한 Fcγ 수용체(인간, 개과, 게먹이원숭이, 쥐과)를 CHO에서 발현하고 Protein A 및 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC)를 통해 정제했다. 분자는 Biotin-Protein Ligase/BirA Kit(GeneCopoeia)를 사용하여 Avi-Tag에서 비오틴화되었다.
CD64 인간 FcγRI-mFc-Avi
CD32A 인간 FcγRIIa-mFc-Avi
CD32B 인간 FcγRIIb-mFc-Avi
CD32C 인간 FcγRIIc-mFc-Avi
CD16A 인간 FcγRIIIa (48R-158V)-mFc-Avi
CD16B 인간 FcγRIIIb (NA1)-mFc-Avi
CD64 쥐과 FcγRI-mFc-Avi
CD32 쥐과 FcγRIIb-mFc-Avi
CD16 쥐과 FcγRIII-mFc-Avi
CD16-2 쥐과 FcγRIV-mFc-Avi
CD16 개과 FcγRIII-mFc-Avi
CD32A 게먹이원숭이 FcγRIIa-mFc-Avi
CD32B/C 게먹이원숭이 FcγRIIb/c-mFc-Avi
CD16 게먹이원숭이 FcγRIII-mFc-Avi
비오틴화된 FcRn 분자(인간, 마우스, 게먹이원숭이)는 구입했다.
FcRn (FCGRT/B2M), His-Tag, Biotin-Labeled, (Human) HiPTM Cat# 71283
FcRn (FCGRT/B2M), His-Avi-Tag, Biotin-Labeled, (mouse) HiPTM Cat# 71286
FcRn (FCGRT/B2M), Avi-Tag, Biotin-Labeled, (Cynomolgus) AcroTM Cat# FCM-C82W5
SPR 방법
다양한 Fcγ 수용체에 결합
다양한 Fcγ 수용체에 대한 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 결합은 HBS-P+를 사용하여 25℃에서 Biacore T200 기기에서 측정되었다.
b) FcRn에 대한 결합
EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 FcRn(인간, 게먹이원숭이, 쥐과)에 대한 결합은 PBS-T 버퍼 pH 6.0을 러닝 버퍼로 희석(4　M HCl을 사용해 pH 6.0에 적정된 1x Gibco PBS, 0.005% Tween20)을 위해 사용하여 25℃에서 Biacore T200 Instrument에서 측정했다. 이 목적을 위해 Biotin CAPture Kit(GE Healthcare)를 사용해 Multi Cycle Kinetic 실험을 수행했다. 센서 표면의 활성화를 위해 Biotin CAPture 시약(GE Healthcare)을 Flow Cells Fc 1-4(100초, 5μL/분)에 주입하여 2100RU - 2800RU의 반응을 얻었다. 다른 종들의 비오틴화된 FcRn을 Flow Cell Fc 2(5 μL / min)에 주입하여 약 8-15 RU의 반응을 얻었다. 일련에 희석된 EGFR/D16A 항원 결합 단백질은 러닝 버퍼 및 희석을 위해 (pH 7.4)에 있었다. 이 목적을 위해 Biotin CAPture Kit(GE Healthcare)를 사용하여 단일주기 운동실험(Single Cycle Kinetic Experiment)을 수행했다. 센서 표면의 활성화를 위해 Biotin CAPture 시약(GE Healthcare)을 Flow Cells Fc 1-4(100 초, 5μL/분)에 주입하여 2100RU - 2800RU의 반응을 얻었다. 비오틴화된 Fcγ 수용체는 Flow Cells Fc 2, Fc 3, Fc 4에서 잡혔다(35 RU-55 RU). 일련의 항EGFR 항체 구축물은 단일 사이클 운동 모드(Single Cycle Kinetic mode)(30μL/분, 결합 180초, 분리 240초, 6000 nM-1.47 nM 희석 1:4)로 Flow Cells Fc 1-4에 주입했다. 재생 용액(GE Healthcare)(10μL/min, Flow Cells 1-4, 120초)을 사용하여 조각(chip)을 재생했다. 센서그램(Sensorgrams)은 농도 0 주기를 빼고 참조채널(reference channel) Fc 1(Fc 2-1, Fc 3-1, Fc 4-1)에서 신호를 빼서 참조한다. Flow Cells Fc 1, 2(30μL/min, 결합 240초, 분리 100초, 3000 nM - 12.5 희석 1:3)에 맞춘 바이어코어 T200 평가(Biacore T200 Evaluation) 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합모델(Binding Model)(RI 상수를 0으로)에 데이터를 맞추어서 결합 역학을 평가했다. 재생 용액(GE Healthcare)10　μL/min, Flow cells 1-4, 120초)을 사용하여 조각을 재생했다. 센서그램은 0 농도주기를 빼고 참조 채널 Fc 1(Fc 2-1)에서 신호를 빼서 참조한다. 결합 역학은 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델(국부적으로 맞춘 Rmax와 RI)에 데이터를 맞추어서 평가되었다.
결과:
Fcγ 수용체 결합 분석에서, scFv-IgAb_02는 인간 CD16A FcγRIIIa (48R-158V)-mFc-Avi (KD　12.5　nM)과 게먹이원숭이 CD16 FcγRIII-mFc-Avi (KD 19.9　nM)에 대한 결합을 보였지만, 다른 모든 시험된 Fcγ 수용체에 대해 결합 상호 작용은 검출되지 않았다(표 2). Bi-scFv-Fc_02는 CD16A FcγRIIIa (48R-158V)-mFc-Avi (KD　12.2　nM)과 게먹이원숭이 CD16 FcγRIII-mFc-Avi (KD 25.2　nM)에 대한 결합만 보였다. 대조군 분자 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디는 인간 CD16A FcγRIIIa (48R-158V)-mFc-Avi (KD　4.4　nM)과 게먹이원숭이 CD16 FcγRIII-mFc-Avi (KD 8.9　nM)에 대한 결합을 보였다. 모든 시험된 Fcγ 수용체의 기능은 상이한 IgG1 대조군 분자에 의해 나타났다(데이터는 표시되지 않음).
scFv-IgAb_02와 Bi-scFv-Fc_02에서의 Fc 침묵(silencing)은 시험된 Fcγ 수용체에 대한 결합 상호작용의 부재로 확인할 수 있다(항CD16A 도메인을 통한 인간 CD16A 및 게먹이원숭이 CD16에 대한 특이적 결합은 제외).
pH 6.0에서 scFv-IgAb_02 및 Bi-scFv-Fc-02의 FcRn 결합은 인간 FcRn(scFv-IgAb_2 KD　430　nM, Bi-scFv-Fc_02 KD　410　nM), 쥐과 FcRn(scFv-IgAb_02 KD　180　nM, Bi-scFv-Fc_02 KD　121　nM), 및 게먹이원숭이 FcRn(scFv-IgAb_02 KD　842　nM, Bi-scFv-Fc_02 KD　268　nM)에 대해 보였다. 대조군 분자 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디에 대한 결합 상호작용은 측정되지 않았다. scFv-IgAb_02와 Bi-scFv-Fc_02의 침묵된 Fc에서 FcRn 결합능력의 보존을 확인할 수 있다.
[표 2]
표 2. EGFR/CD16A 항원 결합 단백질을 사용한 Fcγ 수용체 결합 분석의 표 요약
Figure pct00003
[표 3]
표 3. pH 6.0에서 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 FcRn 결합 표 요약
Figure pct00004
실시예 2:
10mg/mL 다클론성(polyclonal) 인간 IgG의 존재 또는 부재 하에서의 일차적 인간 NK 세포에 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 결합
방법:
연막(buffy coats)에서의 PBMC 분리 및 인간 NK 세포의 농축
PBMC는 밀도기울기원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 연막(독일 만하임, 독일 적십자)에서 분리되었다. 연막 샘플을 PBS 2~3배 부피로 희석하여(Invitrogen, cat.: 14190-169) 림포프렙(Lymphoprep)(Stem Cell Technologies, cat.: 07861) 층에 쌓았고 실온에서 휴식 없이 25분간 800 x g에서 원심분리했다. 경계면에 위치한 PBMC를 수집하고 PBS로 3회 세척한 후 10% FCS가 보충된 완전한 RPMI 1640 배양액에서 하룻밤 동안 자극 없이 배양했다. NK 세포의 농축과 Big Easy EasySep?? Magnet(Stem Cell Technologies, cat.: 18001)을 위해서 제조사의 지침에 따라 PBMC를 하룻밤 동안의 배양액에서 채취하여, 손대지 않은 인간 NK 면역 자기 분리를 위해 EasySep?? Human NK-Cell Enrichment Kit(Stem Cell Technologies, cat.: 19955)를 이용해 한차례 음성 선택(negative selection)에 사용했다(Stem Cell Technologies, cat.: 18001).
세포 결합 분석 및 유동세포(flow cytometric) 분석
표시된 세포 유형의 분액을 2% 열-비활성화된(heat-inactivated) FCS(Invitrogen, cat.: 10270-106), 0.1% 아지드화 나트륨(Roth, Karlsruhe, Germany, cat.: A1430.0100)을 37℃에서 45분간 함유한 FACS 완충액(PBS, Invitrogen, cat. :)에서 10mg/mL 다클론성 인간 IgG(Gammanorm, Octapharma)를 포함하거나 포함하지 않는 다양한 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 100μL 일련의 희석액과 함께 배양했다. FACS 완충액으로 반복 세척한 후, 세포결합 항체를 10mg/mL 항EGFR mAb(clone 62-1-1 Biogenes)와 이후 15μg/mL FITC 접합 된 염소 항-마우스 IgG(Dianova, cat.: 115-095-062)로 검출했다. 비오틴화된 세툭시맙 및 비오틴화된 항EGFR IgG 항체(IgAb_wtFc, IgAb_enhFc)는 AlexaFluor 488-접합된스트렙타아비딘(Dianova 016-540-084)에 의해 검출되었다. 마지막 착색 단계 후, 세포를 다시 세척하고 죽은 세포를 배제하기 위해 2㎍/mL 프로피디윰 요오드화물(PI)(Sigma, cat.: P4170)이 포함된 0.2mL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 2-5 x 103의 살아있는 세포의 형광을 Millipore Guava EasyCyte 유세포 분석기(flow cytometer)(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 사용하여 측정했다. 세포 샘플의 평균 형광강도는 Incyte 소프트웨어(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 이용하여 계산되었다. 2차 및 3차 시약만으로 착색한 세포의 형광 강도 값을 뺀 후 GraphPad Prism 소프트웨어(Windows 용 GraphPad Prism 버전 6.00, 미국 캘리포니아 La Jolla에있는 GraphPad Software)를 이용하여 비선형 회귀 분석에 값을 사용했다. KD 계산을 위해 단일 사이트 바인딩(one-site-binding)(hyperbola) 방정식을 사용했다.
결과
인간 IgG의 생리학적 농도가 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 결합 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 일차적 인간 NK 세포에 여러 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질을 사용한 결합 분석을 수행하였는데 도 10에서 예시적으로 보이는 것처럼 10mg/mL 다클론성 인간 IgG이 존재 또는 부재 하에서 이루어졌다. 표 4는 두 조건 하에 표시된 이중 특이적 항원 결합 단백질의 결합 친화성을 요약하고 있다. 일차적 인간 NK 세포에 대한 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디의 명백한 친화성은 10mg/mL 다클론성 인간 IgG의 존재 하에서 많이 변하지는 않는다. 하지만 IgG를 추가하면 Bi-scFv-Fc_02의 친화도가 5-20nM까지 대략 4배 감소한다.
Figure pct00005
표 4: 10mg/mL 다클론성 인간 IgG의 존재 또는 부재 하에 일차적(primary) 인간 NK- 세포에 대한 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 명백한 친화성은 2개의 독립적인 결합 분석에서 결정되었다. 독립적인 실험의 평균 KD와 SD 값이 표시된다. SD, 표준 편차; n, 독립적인 실험의 수; no, 결합 없음; n.a., 해당 사항 없음
실시예 3:
재조합 인간 EGFR 또는 EGFRvIII를 발현하는 CHO 세포에 대한 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디의 결합
세포 결합 분석 및 유세포(flow cytometric) 분석
표시된 세포 유형의 분액(Aliquots)을 2% 열-비활성화된 FCS(Invitrogen, cat.: 10270-106)와 0.1% 아지드화 나트륨(Roth, Karlsruhe, Germany, cat.: A1430.0100)을 포함한 FACS 버퍼(PBS, Invitrogen, cat.: 14190-169)에서 37℃에서 45분간 His 태그된 탠덤 디아바디의 100μL 일련의 희석액과 함께 배양했다. FACS 완충액으로 반복 세척한 후, 세포 결합 항체를 10μg/mL 항His mAb 13/45/31-2(Dianova, Hamburg, Germany, cat.: DIA910-1MG)와 이후 15μg/mL FITC 접합된 염소 항 마우스(goat anti-mouse) IgG(Dianova, cat.: 115-095-062)로 검출했다. 마지막 착색 단계 후, 세포를 다시 세척하고 죽은 세포를 배제하기 위해 2㎍/mL 프로피디윰 요오드화물(PI)(Sigma, cat.: P4170)이 포함된 0.2mL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 2-5 x 103의 살아있는 세포의 형광을 MXP 소프트웨어(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany) 혹은 Millipore Guava EasyCyte 유세포분석기(flow cytometer)를 이용한 Beckman-Coulter FC500 MPL 유세포분석기(flow cytometer)를 사용하여 측정했다. 세포 샘플의 평균 형광강도는 CXP 소프트웨어(Beckman-Coulter) 혹은 Incyte 소프트웨어(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 이용하여 계산되었다. 2차 및 3차 시약만으로 착색한 세포의 형광 강도 값을 뺀 후 GraphPad Prism 소프트웨어(Windows 용 GraphPad Prism 버전 6.00, 미국 캘리포니아 La Jolla에 있는 GraphPad Software)를 이용하여 비선형 회귀 분석에 값을 사용했다. KD 계산을 위해 단일 사이트 바인딩(one-site-binding)(hyperbola) 방정식을 사용했다.
결과
EGFR/CD16A 탠덤 디아바디는 37℃에서 인간 EGFR 또는 EGFRvIII를 발현하는 세포와 유사한 명백한 친화성을 가지고 있다(표 5).
따라서, EGFR/CD16A 항원 결합 단백질은 EGFR 발현 및 EGFRvIII 발현 암 모두의 치료에 사용될 수 있다. EGFR과 달리 EGFRvIII는 암세포에서만 발현되고 건강한 조직에서는 발현되지 않는다.
[표 5]
표 5: 재조합 인간 EGFR 또는 EGFRvIII를 37℃에서 발현하는 CHO 세포상에 EGFR/CD16A 탠덤 디아바디의 명백한 친화성
Figure pct00006
실시예 4 :
EGFR/CD16A 구축물을 EGFR + A-431과 HCT-116 세포에 결합
방법:
세포주의 배양
A-431(ATCC, cat.: CRL-1555, RAS wt)은 10% 열-비활성화된 FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양액에서 표준조건 하에서 배양되었다(모든 성분은 Invitrogen 제품).
HCT-116(ATCC, cat.: CCL-247, RAS mut)은 10% 열-비활성화된 FCS, 2mM L- 글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg 스트렙토마이신 황산염이 보충된 RPMI 1640 배양액에서 표준조건 하에서 배양되었다(모든 성분은 Invitrogen 제품, 여기서는 완전한 RPMI 1640 배양액으로 일컬음). 모든 세포주는 5% CO2로 습도가 있는 장소에서 37℃에서 배양되었다.
세포 결합 분석 및 유세포(flow cytometric) 분석
표시된 세포유형의 분액(Aliquots)을 2% 열-비활성화된FCS(Invitrogen, cat.: 10270-106)와 0.1% 아지드화 나트륨(Roth, Karlsruhe, Germany, cat.: A1430.0100)을 포함한 FACS 완충재(PBS, Invitrogen, cat.: 14190-169)에서 37℃에서 45분간 표시된 이중특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 일련의 희석액 100μL과 함께 배양했다. FACS 완충액으로 반복 세척한 후, 세포 결합 항체를 10μg/mL 항EGFR mAb(clone 4-1-1 (Biogenes))와 이후 FITC 접합된 염소 항-마우스 (goat anti-mouse) IgG min X(Dianova; cat. 115-095-062)로 검출했다. wtFc(IgAb_wtFc; IgAb_49) 항EGFR과 강화된 Fc(IgAb_enhFc, IgAb_53) 세포 표면 결합 세툭시맙은 FITC 접합된 염소 항-인간 IgG(Dianova; cat. 109-095-08)에 의해 검출되었다. 마지막 염색 단계 후, 세포를 다시 세척하고 죽은 세포를 배제하기 위해 2㎍/mL 프로피듐 요오드화물(PI)(Sigma, cat.: P4170)이 포함된 0.2mL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 2-5 x 103의 살아있는 세포의 형광을 Millipore Guava EasyCyte 유세포 분석기(flow cytometer)(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 사용하여 측정했다. Incyte 소프트웨어(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 사용하여 세포 샘플의 평균 형광 강도를 계산했다. 2차 및 3차 시약만으로 염색한 세포의 형광 강도 값을 뺀 후 GraphPad Prism 소프트웨어(Windows 용 GraphPad Prism 버전 6.00, 미국 캘리포니아 La Jolla에 있는 GraphPad Software)를 사용하여 비선형 회귀 분석에 값을 사용했다. KD 계산을 위해 단일 사이트 바인딩(one-site-binding)(hyperbola) 방정식을 사용했다.
결과
EGFR+ 종양 세포주에 대한 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 명백한 친화성은 독립적인 결합 실험에서 결정되었고 표 6에 요약되어 있다.
[표 6]
Figure pct00007
표 6: EGFR+ 종양 세포주에 대한 독립적 결합 분석에서 결정된 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 명백한 친화도. 독립적인 실험의 평균 KD 및 SD 값이 표시된다. SD, 표준 편차; n, 독립적인 실험의 수; n.a., 해당 사항 없음
실시예 5:
EGFR + 종양 세포주에 대한 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 세포 독성 활성
방법:
세포주 배양
A-431(ATCC, cat.: CRL-1555)은 10% 열-비활성화된FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨 및 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양액에서 표준조건 하에서 배양되었다(모든 성분은 Invitrogen 제품). HCT-116(ATCC, cat.: CCL-247)은 10% 열-비활성화된FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨 및 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 RPMI 1640 배양액에서 표준조건 하에서 배양되었다(모든 성분은 Invitrogen 제품, 여기서는 완전한 RPMI 1640 배양액으로 일컬음). 모든 세포주는 5% CO2로 습도가 있는 장소에서 37℃에서 배양되었다.
연막(buffy coats)에서의 PBMC 분리 및 인간 NK 세포의 농축
밀도기울기원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 연막(독일 만하임, 독일 적십자)에서 분리되었다. 연막 샘플을 2~3배 부피의 PBS(Invitrogen, cat.: 14190-169)로 희석하여, 림포프렙(Lymphoprep)(Stem Cell Technologies, cat.: 07861) 층에 쌓았고 실온에서 휴식 없이 25분간 800xg에서 원심분리했다. 경계면에 위치한 PBMC를 수집하고 PBS로 3회 세척한 후 10% FCS가 보충된 완전한 RPMI 1640 배양액에서 하룻밤 동안 자극 없이 배양했다. NK 세포의 농축과 Big Easy EasySep?? Magnet(Stem Cell Technologies, cat.: 18001)을 위해서 제조사의 지침에 따라 PBMC를 하룻밤 동안의 배양액에서 채취하여, 손대지 않은 인간 NK 면역 자기 분리를 위해 EasySep?? Human NK-Cell Enrichment Kit(Stem Cell Technologies, cat.: 19955)를 이용해 한차례 음성 선택(negative selection)에 사용했다(Stem Cell Technologies, cat.: 18001).
4시간 칼세인 방출(calcein-release) 세포 독성 분석
칼세인 방출 세포 독성 분석을 위해 표시된 표적 세포를 배양조직에서 채취하고, FCS가 없는 RPMI 1640 배양액으로 세척하고, FCS가 없는 RPMI 배양액에서 37℃에서 30분 동안 10μM 칼세인 AM(Invitrogen/Molecular Probes, cat.: C3100MP)으로 라벨링했다. 부드럽게 세척한 후 라벨링된 세포를 완전한 RPMI 배양액(10% 발열성 FCS, 4mM L- 글루타민, 100U/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 RPMI 1640 배양액)에 1x105/mL 밀도로 재현탁했다. 그 후 1x104 표적 세포를 E:T의 비율 5:1로 농축된 일차적 인간 NK 세포와 표시된 항체와 함께 둥근 바닥 96-웰(well) 마이크로 플레이트의 개별 웰에서 12개의 연속 희석으로 총 200　μL/well 부피로 시딩(seeding)했다. 항체의 부재 하에 이펙터(effector)에 의한 자발적 방출, 최대 방출, 표적의 사멸을 각 플레이트에서 4반복으로 확정했다.
200g에서 2분 동안 원심분리를 한 후, 분석은 5% CO2로 습기가 있는 상태에서 37℃에서 4 시간 동안 배양되었다. 배양종료 15분 전에 RPMI 배양액에서 20μL의 10% Triton X-100을 표적 세포를 담은 웰에 첨가했다. 20μL RPMI 배양액을 다른 모든 웰에 첨가했다. 500g에서 5분간 추가 원심 분리한 후 100μL 세포 배양 상청액을 각 웰에서 채취하고 방출된 칼세인의 형광을 형광 플레이트 판독기(EnSight Multimode Plate Reader, Perkin Elmer)를 이용하여 520nm에서 측정했다. 측정된 수치를 기반으로 특정 세포 용해는 다음 공식-[형광(샘플) - 형광(자발)] / [형광(최대) - 형광(자발)] x 100%-에 따라 계산되었다. 형광(자발)은 이펙터 세포와 항체가 없는 상태에서의 표적 세포 형광 수치를 나타내고 형광(최대)은 Triton X-100 첨가에 의해 유도된 총 세포 용해를 나타낸다. S자형 선량반응곡선과 EC50 값은 GraphPad Prism 소프트웨어(Windows 용 GraphPad Prism 버전 6.00, 미국 캘리포니아 La Jolla, GraphPad Software)를 사용하여 비선형 회귀/ 4파라미터 로지스틱 적합에 의해 계산되었다.
결과:
다양한 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질을 EGFR+ A-431와 HCT-116 표적 세포에 대한 4시간 칼세인 방출 세포 독성 분석에서 대조군 구축물과 함께 시험했다. 항원 결합 단백질은 표적 외 세포 독성을 나타내지 않았다. 도 12는 한 가지 예시적인 실험의 결과를 보여준다. 3개의 독립적 실험의 결과는 표 7(A-431 표적 세포) 및 표 8(HCT-116 표적 세포)에 요약되어 있다.
Figure pct00008
표 7: A-431 표적 세포에 대한 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 세포 독성
5:1의 E:T 비율로 농축된 인간 NK 세포를 이펙터 세포로서 풍부한 인간 NK 세포를 지닌 EGFR+ A-431 종양 표적 세포에 대한 3개의 독립적인 4시간 칼세인 방출 세포 독성 분석에서 결정된 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질에 대한 EC50 값[pM]의 평균 및 SD. SD, 표준 편차; no, 세포용해 없음; n.a., 해당 사항 없음.
[표 8]
Figure pct00009
표 8: HCT-116 표적 세포에 대한 이중 특이적 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 세포 독성
5:1의 E:T 비율로 농축된 인간 NK 세포를 이펙터 세포로서 풍부한 인간 NK 세포를 지닌 EGFR+ HCT-116 종양 표적 세포에 대한 3개의 독립적인 4시간 칼세인 방출 세포 독성 분석에서 결정된 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질에 대한 EC50 값[pM]의 평균 및 SD. SD, 표준 편차; no, 세포용해 없음; n.a., 해당 사항 없음
실시예 6:
EGFR 인산화(phosphorylation)의 억제
EGF 유도 EGFR 신호 전달에 대한 상이한 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 억제 효과를 비교하기 위해 A-431 세포를 사용한 인산화 분석을 수행했다.
재료와 방법:
세포주 배양
A-431(ATCC, cat.: CRL-1555)은 10% 열-비활성화된FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양액에서 표준조건 하에서 5%　CO2로 습기가 많은 장소에서 37℃ 배양되었다(모든 성분은 Invitrogen 제품).
인산화 분석
간단히 말해서, 5x104 A-431 세포의 분액(ATCC, cat.: CRL-1555)를 10% 열-비활성화된FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양지에서 96-웰 플레이트의 개별 웰에 5% CO2가 있는 가습 대기에서 37℃에서 20시간 동안 시딩했다(모든 성분은 Invitrogen 제품). 그런 다음 표시된 항체 구조물의 연속 희석액을 첨가하기 전에 세포를 혈청이 없는 배양액에서 4시간 동안 굶주리게 했다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후 EGF(Sigma, cat.: 10605-HNAE-250)를 최종 농도 100ng/mL로 첨가하고 배양조직을 37℃에서 10분 동안 추가로 배양한 후 세포를 얼음처럼 차가운 PBS(Invitrogen, cat.: 14190-169)로 용해하고 제조업체의 지침에 따라 Phospho-EGFR ELISA Kit(RayBiotech, cat.: PEL-EGFR-Y)를 사용하여 인산화된 EGFR의 상대적 정량화에 사용했다. 흡광도는 멀티 플레이트 판독기(Victor 3, Perkin Elmer)로 450nm에서 측정되었다. 흡광도 값은 GraphPad Prism 소프트웨어(Windows 용 GraphPad Prism 버전 6.00, GraphPad Software, La Jolla California USA)를 사용하여 분석 및 플롯되었다.
세포 결합 분석 및 유세포(flow cytometric) 분석
표시된 세포의 분액(aliquots)을 2% 열-비활성화된 FCS(Invitrogen, cat.: 10270-106)와 0.1% 아지드화 나트륨(Roth, Karlsruhe, Germany, cat.: A1430.0100)을 포함한 FACS 완충재(PBS, Invitrogen, cat.: 14190-169)에서 37℃에서 45분간 표시된 항체의 연속 희석액 100μL와 함께 배양했다. FACS 완충액으로 반복 세척한 후, 세포 결합 탠덤 디아바디는 10μg/mL 항His mAb 13/45/31-2(Dianova, Hamburg, Germany, cat.: DIA910-1MG) 후 15μg/mL FITC 접합된 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG(Dianova, cat.: 115-095-062)를 사용하거나 또는 항CD16A Fv 도메인(서열번호: 12, 13)에 대해 생성된 mAb 4-1-1 후 15μg/mL FITC 접합된 염소 항-마우스(goat anti-mouse) 를 사용해 검출되었다. 세포 표면 결합 Bi-scFv-Fc_02(서열번호: 30), scFv-IgAb_01 및 scFv-IgAb_02(서열번호: 28,29)는 FITC-접합된 염소 항-인간 IgG (Dianova, cat.: 109-095-088) 또는 mAb 4-1-1 후 15μg/mL FITC 접합된 염소 항-마우스(goat anti-mouse) 를 사용해 검출되었다.세포 표면 결합 세툭시맙과 IgAb_wtFc(IgAb_049)는 FITC 접합된 염소 항-인간(goat anti-human) IgG(Dianova, cat.: 109-095-088)에 의해 검출되었다. 마지막 염색 단계 후, 세포를 다시 세척하고 죽은 세포를 배제하기 위해 2㎍/mL 프로피듐 요오드화물(PI)(Sigma, cat.: P4170)이 포함된 0.2mL의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 2-5　x　103의 살아있는 세포의 형광을 MXP software(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany)를 사용한 Beckman-Coulter FC500 MPL 유세포 분석기(flow cytometer)를 사용하거나 혹은 Millipore Guava EasyCyte 유세포 분석기(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 사용해서 측정했다. 2차 및 3차 시약만으로 염색한 세포의 형광 강도 값을 뺀 후 GraphPad Prism 소프트웨어(Windows 용 GraphPad Prism 버전 6.00, 미국 캘리포니아 La Jolla에 있는 GraphPad Software)를 사용하여 비선형 회귀 분석에 값을 사용했다. KD 계산을 위해 단일 사이트 바인딩(one-site-binding)(hyperbola) 방정식을 사용했다.
결과:
양성 대조군으로 사용된 항EGFR IgG 세툭시맙(cetuximab)과, 임가투주맙 (imgatuzumab)(IgAb_065)의 항EGFR Fab 도메인이 있는 인간 IgG1은 7μg/mL-9μg/mL 범위의 EC50 값으로 용량 의존적인 방식으로 EGF 유도 EGFR 인산화를 억제했다.
EGFR/CD16A 탠덤 디아바디, EGFR/CD16A scFv-IgAb_01, Fc 침묵된 IgG1(IgAb_047), wt IgG1(IgAb_049)은 서열번호 1, 및 2에 기술된 것처럼 모두 가변 도메인을 포함하는 항EGFR Fab 도메인을 포함하고 있는데, 100μg/mL보다 높은 EC50 값의 상당히 낮은 효능으로 EGFR 인산화를 억제했다.
특히, Fc의 C 말단에 융합된 scFv로서 서열번호 1, 2로 표현한 항EGFR 도메인을 함유하는 scFv-IgAb_02는 EGF 유도된 EGFR 인산화에 대한 억제효과를 전혀 혹은 거의 나타내지 않았다.
이러한 데이터는 scFv-IgAb_02가 세툭시맙(cetuximab)과 임가투주맙(imgatuzumab)과 비교해 감소된 수용체 길항작용(antagonism)을 나타내는데, 그래서 조직 항상성(homeostasis)을 위해 EGFR 신호 전달에 의존하는 조직(예. 피부)에서 독성이 감소한 것이 보인다.
음성 대조군으로 사용된 CD19/CD16A 탠덤 디아바디는 EGFR 인산화의 억제를 보이지 않았다. 도 13과 14에 묘사된 실험 결과는 표 9에 요약되어 있다.
표 9: A-431 세포를 사용한 EGFR 인산화 분석의 표 요약
Figure pct00010
n.t., 테스트 안됨
A-431 세포로의 명백한 친화성(KD 값)이 EGF 유도된 EGFR 인산화를 억제하는 효능과 상관 관계가 없기 때문에, 테스트된 항체 구조물과 포맷 간 EGF 인산화 억제효과에서의 차이가 EGFR과의 친화성의 차이에서 기인한 것은 아니다(표 10; 도 14).
예를 들어, EGFR/CD16A 탠덤 디아바디는 scFv-IgAb_02 또는 Bi-scFv-Fc_02와 비교할 때 A-431 세포에 대해 약간 더 낮거나 유사한 결합 친화성을 나타내지만 scFv-IgAb_02 또는 Bi-scFv-Fc_02보다 실질적으로 더 강한 인산화 억제효과를 나타낸다. 또는 scFv-IgAb_01 또는 Bi-scFv-Fc_02의 A-431에 대한 EGFR에 대한 명백한 친화성은 세툭시맙과 동일한 범위에 있지만 scFv-IgAb_01 또는 Bi-scFv-Fc_02의 EGFR 인산화에 대한 억제효과는 실질적으로 세툭시맙보다 낮다.
테스트된 모든 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질은 EGFR와 CD16A에 대해 동일한 결합 도메인을 포함하기 때문에 EGFR의 EGF 매개 인산화에 대한 영향은 항원 결합 단백질의 3D 구조의 고유 특성과 관련 있을 것이다. C 말단 위치에 EGFR 결합 도메인을 포함하는 scFv-IgAb_02와 Bi-scFv-Fc_02만이 이러한 특이적 특성을 나타낸다(인산화에 대한 억제 효과가 없거나 미미함).
따라서 이 고유한 속성은 가령 세툭시맙에 비해 향상된 부작용 프로파일(side effect profile)로 바뀔 것으로 예측된다. 이 가정의 이유는 EGFR 억제제로 보이는 피부 독성이 이전에 설명한 바처럼 피부 각질세포가 EGFR 신호전달에 미치는 원치 않는 억제효과 때문에 생기기 때문이다.
표 10: 37℃에서 A-431 세포에 대한 세포 결합 실험에서 결정된 다양한 항EGFR 항원 결합 단백질의 명백한 친화도
Figure pct00011
n, 독립적 실험의 수; 평균, n 실험의 평균 KD 값; SD, 표준편차, n.t., 테스트 안됨, n.a., 적용불가
실시예 7 :
약동학(PK) 특징의 평가:
각각의 항체를 단일 정맥주입 후 CD1 쥐들에서 scFv-IgAb_02와 Bi-scFv-Fc_02의 혈청 농도 측정:
EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 PK 평가는 CD1 쥐들에서 단일 용량 PK 연구로 수행되었다. CD1 쥐들에서 명목적 표적(nominal target)에 대한 결합이 없으며 표적 매개효과(target mediated effects)를 이 모델에서 조사할 수 없다는 점을 주목해야 한다. 하지만 해당 테스트 아이템은 쥐과의 FcRn 수용체에 대해 완전히 교차 반응(cross reactive)을 일으킬 수 있어서 반감기 상의 FcRn 효과가 완전히 반영되어야 한다. 마우스 혈청에서 PK 분석으로 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질을 평가하기 위해 두 가지 테스트가 실행되었다. 첫 번째 테스트 시스템은 ELISA 형식으로 설정되었고 이후 이 플랫폼은 MSD 판독기 플랫폼으로 이전되었다. 두 분석에서 일관된 혈청 농도와 PK 데이터가 나타났다.
300μg/쥐 용량을 정맥 내에 느리게 주입시키기 위해 scFv-IgAb_02와 Bi-scFv-Fc_02 적용 용액은 최종 농도 300μg/ 250μL를 얻는 방식으로 준비되었다.
두 가지 PK 연구가 수행되었다:
채혈(샘플수집은 치료 전(투약 전), 치료 후 최대 168시간(연구 1)까지, 그리고 치료 후 최대 504시간(연구 2)까지 수행되었다.)
출혈/동물의 수: 3
시점(time point) 당 동물의 수: 4
혈액은 이소푸루란(Isoflurane) 마취 하에 연수후부의 망상조직 정맥(retrobulbar venous plexus)을 찔러 수집했다. 혈액량은 100-150μL(약 30μL 혈청)이었다.
3차 최종 출혈 직후 동물을 희생시켰다.
전혈을 혈청으로 처리하고 모든 샘플을 즉시 냉동하여 -65℃ 이하에서 보관했다.
첫 번째 연구에서 168시간(7일)의 기간에 걸친 혈청 약동학 평가는 MSD와 ELISA에 의해 수행되었다. 반감기는 다음과 같다:
scFv-IgAb_02: 79시간;
Bi-scFv-Fc_02: 96시간.
채혈 기간이 너무 짧고 최종 제거 시간을 적절하게 계산할 수 없었기 때문에 후속 연구가 수행되었다. 따라서 두 번째 연구에서는 scFv-IgAb_02(혈청 농도의 ELISA 결정)에 대해서만 504시간(21일)에 걸쳐 혈청 약동학 평가를 수행했다. 관찰시간은 충분했으며 제거단계에서 명확하게 신뢰할 수 있는 반감기 계산을 수행할 수 있었다. scFv-IgAb_02의 반감기는 다음과 같다:
329.2시간.
생쥐의 반감기 결정:
약동학적 매개 변수는 Summit Research Services(68911 Open Field Dr., Montrose, Colorado 81401 USA)의 프로그램 PK Solutions(버전 2.0)를 사용하여 비구획(non-compartmental)에 의해 결정되었다.
실시예 8:
A-431와 A-549 세포에서 EGF로 자극된 EGFR 인산화의 억제
EGF 유도 EGFR 신호전달에 대해 서로 다른 EGFR/CD16A 항원 결합 단백질의 억제 효과를 비교하기 위해, A-431와 A-549 세포를 사용한 인산화 분석을 수행하였다.
재료와 방법:
세포주 배양
A-431(ATCC, cat.: CRL-1555)과 A-549(DSMZ, cat.: ACC 107)는 10% 열-비활성화된 FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양액에서 표준조건 하에서 5%　CO2로 습기가 많은 장소에서 37℃ 배양되었다(모든 성분은 Invitrogen 제품).
인산화 분석
간단히 말해서, 5x104 A-431 또는 A-549 세포의 분액을 10% 열-비활성화된 FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양지에서 96-웰 플레이트의 개별 웰에 5% CO2가 있는 가습 대기에서 37℃에서 20-22시간 동안 시딩했다(모든 성분은 Invitrogen 제품). 그런 다음 표시된 항체 구조물의 연속 희석액을 첨가하기 전에 세포를 혈청이 없는 배양액에서 4시간 동안 굶주리게 했다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후 EGF(Sigma, cat.: 10605-HNAE-250)를 최종 농도 100ng/mL로 첨가하고 배양조직을 37℃에서 10분 동안 추가로 배양한 후 세포를 얼음처럼 차가운 PBS(Invitrogen, cat.: 14190-169)로 용해하고 제조업체의 지침에 따라 Phospho-EGFR ELISA Kit(RayBiotech, cat.: PEL-EGFR-Y)를 사용하여 인산화된 EGFR의 상대적 정량화에 사용했다. 흡광도는 멀티 플레이트 판독기(Victor 3, Perkin Elmer)로 450nm에서 측정되었다. 흡광도 값은 GraphPad Prism 소프트웨어(Windows 용 GraphPad Prism 버전 6.00, GraphPad Software, La Jolla California USA)를 사용하여 분석 및 플롯되었다.
결과:
EGF를 이용해 자극을 주었을 때 EGFR/CD16A scFv-IgAb(scFv-IgAb_02), 참고를 위한 항EGFR IgG 세툭시맙과 파니투무맙, 그리고 다양한 대조군 항체가 EGFR 인산화에 대한 억제 효과를 A-431 세포(도 15a)와 A-549 세포(도 15b)를 이용해 평가했다. 항체에 대한 설명과 EGFR 인산화의 용량 의존적 억제에 대해 결정된 EC50 값의 요약이 표 11에 제시된다.
항EGFR IgG 세툭시맙과 파니투무맙이 참고를 위한 항체(reference antibodies)로 사용되었고 이들은 A-431 세포에서 EC50 값 7.7μg/mL와 8.2μg/mL로, A-549 세포에서 0.1μg/mL와 0.3μg/mL로 각각 용량 의존적 방식으로 EGF 유도 EGFR 인산화를 억제했다. RSV/CD16A scFv-IgAb(scFv-IgAb_44)는 음성 대조군으로 사용되었고 EGF 자극 EGFR 인산화에 대한 억제 효과를 나타내지 않았다.
Wt IgG1(IgAb_49)와 Fc 강화 IgG1(IgAb_53)은 모두 서열번호 1, 2에서 설명된 가변 도메인을 포함하는 항EGFR Fab 도메인을 갖고 있는데, A-431 세포에서 5-6배 높고, A-549 세포에서 75-300배 높은 EC50 값을 갖으며, 세툭시맙 또는 파니투무맙보다 실질적으로 낮은 효능으로 EGFR 인산화를 억제했다.
특히, scFv-IgAb_02 및 scFv-IgAb_45는 Fc의 C 말단에 융합된 scFv로서 서열번호 1, 2에서 나타낸 항EGFR 도메인을 갖고 있고 Fab 도메인에서만 상이한데, EC50 값이 A-431 세포에서 1.1mg/mL ~ 1.5mg/mL이고 A-549 세포에서 478μg/mL ~ 643μg/mL의 범위로서 고농도에서만 EGF 유도 EGFR 인산화의 억제효과를 보였다.
이러한 데이터는 scFv-IgAb_02가 동일한 항EGFR Fv 도메인(IgAb_49 및 IgAb_53)을 포함하는 IgG1 항체에 비해 감소된 수용체 길항작용을 나타낸다는 점을 시사한다. 세툭시맙 매개 억제와 비교할 때 그 차이는 훨씬 더 컸고, A-431 세포에서 ~200배 낮은 효능 및, A-549 세포에서의 ~5000배 낮은 효능은 EGFR/CD16A scFv-IgAb_02에서 관찰할 수 있었다. 이러한 데이터에서 scFv-IgAb_02의 감소된 EGFR 신호 전달억제는 개선된 부작용 프로필(side effect profile)과 관련이 있고, 세툭시맙 및 파니투무맙과 같은 강한 수용체 길항 특성(receptor antagonistic properties)을 지닌 항EGFR 항체에서 주로 나타나는 피부독성이 적은것으로 설명할 수 있다는 결론을 이들 데이터에서 내릴 수 있다.
표 11: A-431 및 A-549 세포를 사용한 EGFR 인산화 분석의 표 요약
Figure pct00012
§, 비선형 회귀 분석과 EC50 값 계산을 위해 하단이 0.25로 제한됨. $, 비선형 회귀 분석과 EC50 값 계산을 위해 하단이 0.1로 제한됨.
실시예 9:
scFv-IgAb_02에 의한 EGF 처리시 EGFR 신호 단백질의 인산화 억제 평가
방법:
세포주 배양
A-431(ATCC, cat.: CRL-1555)과 A-549(DSMZ, cat.: ACC 107)는 10% 열-비활성화된 FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양액에서 표준조건 하에서(모든 성분은 Invitrogen 제품) 배양되었다. 세포는 실험에 사용하기 전 1시간 동안 영양공급이 안된 배양지(1% FCS를 지닌 RPMI 1640 배양액(Invitrogen))에서 배양했다.
항체를 지닌 EGFR 신호의 억제
표시된 경우에 3x106 세포는 습기가 많은 장소에서 37℃에서 1시간 동안 각각의 항체 20㎍/mL와 함께 배양되었다. 그 후, 습한 환경에서 37℃에서 5분 또는 15분 동안 100ng/mL 농도의 재조합된 인간 EGF(ThermoFisher, # 10605HNAE250)를 첨가하여 세포를 자극했다. 이어 세포를 세척하고, 150mM NaCl(AppliChem, # 131659.1211), 1% Triton X 100(Roth, # 30512), 0.05% 소듐 디옥시콜레이트(Sodium deoxycholate)(Sigma, # D6750), 0.1% SDS(Roth, #CN30.1), 50mM Tris(Biomol, # 08003.1), 프로테아제 억제제(protease inhibitors)(Roche, #11697498001), 포스파타제 억제제(phosphatase inhibitors)(Roche, #4906845001)를 함유하는 방사선 면역침전 분석버퍼(Radioimmuneprecipitation-assay buffer(RIPA))로 얼음에서 45분간 용해했다. 300xg 및 4℃에서 15분 동안 원심분리를 한 후, 상청액을 62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 글리세린(Applichem, # A2926,055), 200mM Bromphenolblue(Roth, # A512.1), 0.1M DTT(Roth, # 6908.2)를 포함하는 줄어드는 샘플 버퍼와 1:1로 섞은 후 10분 동안 95℃로 가열한 후 4-20% Criterion TGX Precast SDS-PAGE Gel(Bio-Rad, # 5678095) 1x Tris/Glycine/SDS 버퍼(Bio-Rad, # 1610732)에서 300V로 22분 동안 SDS-PAGE를 겪게 했다. 면역 블롯팅(immunoblotting)을 위해 단백질은 제조업체의 지침에 따라 Trans-Blot Turbo Transfer System(Bio-Rad)을 사용하여 PVDF 막(BioRad, # 1704157)으로 전달되었다. 그 후 막을 TBS의 5% 탈지유(Sigma, # 70166)에서 실온에서 1시간 동안 차단하고, TBS로 3회 세척한 다음, 공급 업체가 권장한 대로 TBS에 5% BSA(Sigma, # A3059), 0.05NaN3(Roth, #K305.1)로 일차로 항체를 실온에 1시간 혹은 4℃로 밤새 희석했다. 희석된 일차 항체를 배양했다. 이어 막을 TBS로 3회 세척하고 TBS와 5% 탈지유에서 HRP 접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. TBS로 세척 후 ECL 용액(ThermoFisher, # 32209)을 첨가한 후 화학 발광을 ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)을 사용해 측정하고 Image Lab Software(BioRad)를 사용해 분석했다. 시험된 항체 목록은 표 12에, 단백질 검출에 사용된 항체 목록은 표 13에 기술되었다.
표 12: 테스트한 항체
Figure pct00013
표 13: 신호전달 단백질 탐지에 사용된 항체
Figure pct00014
결과
EGFR/CD16A scFv_IgAb_02가 EGF 유도 EGFR 신호 억제에 미치는 영향을 평가하기 위해 A-431 세포를 scFv-IgAb_02와 함께 배양하고 대조군으로 EGFR/RSV scFv-IgAb_45 또는 항EGFR IgG1 세툭시맙을 사용해서 배양했다. 자극은 각각 5분과 15분 동안 수행했고 인산화 유도는 웨스턴 블랏을 통해 평가했다.
블롯 이미지는 도 16과 17에 묘사되어 있다. 각각의 인단백질(phosphoproteins)에 대한 상대적 밴드 강도(band intensities)의 정량화는 도 18, 19, 20에 설명되었다.
상기 실시예에서 제시된 결과로서 EGF로 A-431 세포를 자극했을 때의 EGFR, Akt, Erk의 인산화를 알 수 있다. EGFR의 인산화와 그 억제는 EGF로 5분과 15분 자극 후에 측정할 수 있었지만(도 18), pAkt와 pErk의 차이는 각각 5분(도 19) 또는 15분(도 20) 후에 가장 두드러졌다.
세툭시맙을 사용한 세포의 사전 인큐베이션은 EGFR, Akt, Erk의 EGF 자극을 차단하는 반면, EGFR/CD16A scFv-IgAb_02 또는 EGFR/RSV scFv-IgAb_45를 사용한 사전 인큐베이션은 EGF, Akt, Erk의 EGF 자극된 인산화에 대한 억제효과가 없거나 미미할 뿐이었다. EGF 자극 및 항체 처리는 EGFR, Akt, Erk의 전체 단백질 수준에 영향을 미치지 않았다.
실시예 10:
scFv-IgAb_02에 의해 유도된 PBMC의 사이토카인(cytokine) 방출
연막(buffy coats)에서의 PBMC 분리
PBMC는 밀도기울기원심분리(density gradient centrifugation)에 의해 연막(buffy coats)(German Red Cross, Mannheim, Germany)에서 분리되었다. 연막 샘플을 2 ~ 3배 부피의 PBS(Invitrogen, cat.: 14190-169)로 희석하고, 림포프렙(Lymphoprep)(Stem Cell Technologies, cat.: 07861) 층에 쌓았고, 실온에서 휴식 없이 25분간 800xg에서 원심분리했다. 경계면에 위치한 PBMC를 수집하고 PBS로 3회 세척한 후 10% FCS가 보충된 완전한 RPMI 1640 배양액에서 하룻밤 동안 자극 없이 배양했다.
세포주의 배양
A-431(ATCC, cat.: CRL-1555)은 10% 열-비활성화된 FCS, 2mM L-글루타민과 100IU/mL 페니실린 G 나트륨, 100μg/mL 스트렙토마이신 황산염이 보충된 DMEM 배양액에서(모든 성분은 Invitrogen 제품) 5% CO2 있는 가습 대기에서 37℃에서 표준조건 하에서 배양되었다.
EGFR+ 표적 세포의 존재 또는 부재에서 scFv-IgAb_02에 의해 자극된 PBMC로부터 방출된 사이토카인의 정량화
5x105의 일차적 인간 PBMC를 EGFR+ A-431 표적 세포와 이펙터(effector)에서 50:1의 목표 비율로 공동배양하였다. 공동배양은 총 부피 200μL에서 증가하는 농도의 scFv-IgAb_02 존재 또는 부재 하에 10% FCS가 보충된 완전한 RPMI 1640 배양액에서 하룻밤 동안 자극 없이 배양했다. 배양조직에서 배경인 사이토카인 수준은 scFv-IgAb_02의 존재 또는 부재 하에서 PBMC 또는 A-431 세포의 배양만을 포함하여 평가되었다. 양성 대조군으로써, 공동 배양조직을 DynaBeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco, cat. 11132D)과 함께 배양하여 PBMC 집단 내 T 세포에서 테스트된 모든 사이토카인의 방출을 자극했다. 모든 배양조직은 가습 인큐베이터에서 4시간, 24시간, 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양한 후 실온에서 2분 동안 70xg에서 원심분리했다. 세포배양 상청액(70μL)을 각 웰에서 수확하고, BD?? Cytometric Bead Array (CBA) Human Th1/Th2 Cytokine Kit II (BD Bioscience)를 사용하여 Bioassay GmbH(독일 하이델베르그)에서 비드(bead)기반의 멀티플렉스 방법으로 사이토카인을 정량화할 때까지 80℃에서 보관하기 위해 둥근 바닥의 96 웰 마이크로 플레이트로 옮겼다. Windows용 GraphPad Prism(V6.00/7.03, GraphPad Software, La Jolla, California, USA)을 사용하여 결과를 분석하고 플로팅했다.
표적 세포와 scFv-IgAb_02의 존재 또는 부재 하에서 PBMC 공동배양 시 NK 활성화 상태의 결정
NK 세포 활성화는 사이토카인 정량화를 위해 상청액을 수확한 후 세포 펠렛(cell pellets)의 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 평가되었다. 이를 위해 세포를 세척하고 CD56-PC7(5μL/test; Beckman Coulter, A21692), CD25-PE(10μL/test; Beckman Coulter, A07774), CD69-PC5(5μL/test; Beckman Coulter, IM2656)에서 100μL FACS 완충액의 총 염색 부피(2% 열-비활성화된 FCS 및 0.1% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS)로 재현탁했다. 어둠 조건에서 얼음에서 15분 동안 배양한 후, 세포를 세척하고 FACS 완충액에 재현탁하고 유세포 분석으로 분석했다.
결과
6가지 사이토카인, 즉 인터루킨-2(Interleukin-2, IL-2), 인터루킨-4(Interleukin-4, IL-4), 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6), 인터루킨-10(Interleukin-10, IL-10), 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor, TNF), 인터페론- γ (Interferon-γ, IFN-γ)의 방출은 scFv-IgAb_02의 농도를 증가 혹은 유지하는 환경에서 PBMC와 A-431을 4시간, 24시간, 48시간 공동배양 후 세포배양 상청액에서 평가되었다.
PBMC의 단독배양 및 A-431을 추가한 상태에서의 배양은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α 또는 IFN-γ에서 감지할 만한 증가를 초래하지 않았지만 CD3/CD28 활성물(activator) 비드(bead)를 이용한 자극은 모든 테스트된 사이토카인의 현저한 방출을 유도했다(데이터는 표시되지 않음). 증가하는 scFv-IgAb_02 농도에 PBMC를 노출시키니 모든 사이토카인에서 미미한 방출을 초래했다. scFv-IgAb_02만으로 유도한 PBMC로부터의 최대 사이토카인 방출은 각각의 사이토카인 의 배경 수준으로 간주되었다(표 14).
5x 배경수준 이상으로 증가한 PBMC과 A-431 표적의 세포 배양 상청액에서 사이토카인 수준은 양성 신호로 간주되었고 표 14에 요약되어 있다. 이들 분석은 PBMC와 EGFR+의 공동배양에서 지정된 시점(time-point)까지 IL-6, TNF-α, IFN-γ의 scFv-IgAb_02 유도된, 용량 의존적인 방출을 보여주었다. 배경 수준 이상의 다른 모든 시험된 사이토카인의 scFv-IgAb_02- 유도 방출은 검출되지 않았다.
표 14. 인간 PBMC와 EGFR+ A-431 표적 세포의 공동배양에서의 방출된 사이토카인과 증가하는 scFv-IgAb_02 농도의 요약. scFv-IgAb_02 유도된 사이토카인 방출의 효능(EC 50 )과 최대 반응(E max )은 다음과 같다.
Figure pct00015
IL-6의 ScFv-IgAb_02 유도된 용량 의존적 방출은 각각 3.7pM와 7.1pM의 효능(EC50)으로 PBMC 및 A-431의 24시간 및 48시간 공동배양 후에 검출되었다(표 14; 도 21).
TNF-α의 ScFv-IgAb_02 유도된 분비는 각각 4시간과 24시간 후에 평가할 수 있는 반면(표 14; 도 22), IFN-γ의 상승된 수준은 4시간 후에 독점적으로 측정할 수 있었다(표 14; 도 23).
CD69+ NK 세포의 항체 용량 의존적 증가는 적용된 분석 환경에서 NK 세포 활성화를 지원하는 최대 44%로 PBMC와 A-431 세포의 24시간, 48시간 후 검출될 수 있었다(도 24B, 도 25B). CD69+ NK 세포의 증가된 수준도 A-431 세포 부재 하에 scFv-IgAb_02의 높은 농도에서 독점적으로 24시간 배양 후 검출될 수 있었다. 늦은 NK 세포 활성화 표지 CD25에서는 A-431 세포가 존재하는 환경에서 PBMC를 24시간과 48시간 동안 각각 공동배양했을 시 scFv-IgAb_02 유도된 증가는 분명히 검출되지 않았다.
실시예 11:
약력학적(Pharmacodynamic) 생체 내 연구(POC)
scFv-IgAb_02의 여러 생체 내 POC 연구는 이종 이식된 인간 EGFR 종양을 갖는 인간화된 마우스 모델에서 예방 및 치료적 투여 요법으로 수행되었다. 모델은 제대혈 유래 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포로 이전에 이식된, 유체 역학적으로 IL-15가 증가한 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull 생쥐들(NOG)로 구성되었다. 종양을 0일(D0)에 1x106 A-431 세포의 피하 접종을 통해 생착시켰다. 이 모델은 프랑스 TransCure BioServices SAS에서 제공했다. 인간면역 이펙터(effector) 세포(인간 NK 세포 포함)와 일관된 A-431 종양 수용 및 성장으로 신뢰할 수 있는 재구성을 할 수 있는 점은 사전 연구에서 입증되었다. 이 모델은 현재 인간 NK 세포 재구성과 관련하여 최고의 인간화 마우스 모델인 것으로 보인다(말초 혈액 mL 당 1-2 x 104 인간 NK 세포의 순서로 산출).
위의 쥐과 모델에서 scFv-IgAB_02를 이용한 네 가지 연구는 아래에 더 자세히 소개되었다.
예방적 치료 환경(즉, 종양 접종 시점에서 시작되는 치료)에서 scFv-IgAB_02 치료로 인해 종양 성장이 5mg/kg에서 감소되는 경향이 관찰되었으며 10mg/kg 이후부터는 종양 성장이 현저하게 억제되었다. 치료 환경(즉, 종양이 50-100mm3 사이 부피에 도달했을 때 시작되는 치료)에서 scFv-IgAB_02 치료에 의한 종양 성장의 현저한 억제가 10mg/kg 이후의 투여량 수준에서도 나타났고, 이는 쥐과 모델에서 scFv-IgAB_02의 항 종양 효능을 보여준다.
시험군 수준의 (in vitro)연구를 보여주는 위에서 설명한 실시예에 따르면, scFv-IgAB_02는 이중 항종양 작용 기전은 아래를 구성한다는 결론이 나온다.
A) CD16A+ NK 세포 및/또는 대식세포(macrophages)와의 상호 작용을 강제함으로써 EGFR+ 종양 세포에 대한 ADCC 및/또는 ADCP 유도
B) EGFR 수용체 차단에 의한 EGFR+ 종양 세포에 대한 직접적인 성장 억제 효과,
ADCC (및 / 또는 ADCP)의 유도는 scFv-IgAB_02에 의해 발휘되는 지배적인 항 종양 효과이다.
(EGFR 인산화 차단에 의한 직접적인 성장제해가 우세한 세툭시맙과는 대조적으로)
두 가지의 쥐과 POC 연구는 RSV/EGFR을 참조항목으로 포함하여 직접 성장 억제로부터 ADCC를 기술하려는 의도로 수행되었다. 이 경우 RSV/EGFR은 scFv-IgAB_02의 동일한 EGFR 결합 영역과 Fc 부분을 포함하는 분자이지만, 관련 없는 RSV 결합 도메인(Respiratory-Syncytial-Virus)으로 대체된 CD16A 결합 일부가 결여되어 있어 ADCC를 유도할 수 없다.
두 개의 RSV/EGFR 연구 중 첫 번째 연구는 RSV/EGFR보다 scFv-IgAB_02의 항종양 효과가 약간 더 우수하다는 것을 보여주었다(따라서 쥐과 A-431 종양 모델에서 전체 항종양 효능에 대한 ADCC의 기여를 말해준다). 그러나 두 번째 연구에서는 예방 및 치료 치료군에서 scFv-IgAB_02와 RSV/EGFR의 여러 다른 용량 수준을 비교한 결과 쥐과 A-431 종양 모델에서 동일한 효능이 두 변이에서 나타났다. 따라서 scFv-IgAB_02의 중복되는 약력학적 효과는 재구성된 쥐과 모델에서 인산화 억제에서 지배되는 것으로 추정되는데, 이는 어쩌면 인간과 비교할 때 이 모델에 존재하는 NK 세포의 수가 적기 때문이다.
따라서 인간화 쥐과 모델은 생체 내에서 scFv-IgAB_02의 항종양 효능에 대해 일반적인 POC를 제공하지만, scFv-IgAB_02의 우세한 이펙터(effector) 메커니즘으로 EGFR+ 종양에 대한 ADCC의 유도를 묘사하는 데 적합하지 않다.
초기 연구에서 상이한 이중 특이적 EGFR/CD16 항원 결합 단백질(scFv-IgAB_02와 구조적 변이체/대조군)을 A431 종양을 갖고 있는 eHIS-IL15-huNOG 쥐의 예방 설정에서 비교하였다. 제대혈 파생 CD34+ 조혈 줄기세포(HuNOG)가 이식된 IL-15 강화 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull 쥐(NOG)에 0일(D0)에 1x106 A431 세포를 피하 접종 하였다. 동물은 1일부터 4주 동안(q7d x 4) scFv-IgAB_02와 Bi-scFv_Fc_02를 5mg/kg 및 10mg/kg으로 매주 정맥 내 주입했다. 세툭시맙은 동일한 투여 간격을 사용하여 5및 0.5mg/kg에서 양성 대조군으로 사용되었다.
세툭시맙(5mg/kg), scFv-IgAB_02(15mg/kg), Bi-scFv_Fc_02(15mg/kg)는 종양 세포 생착(engraftment) 12일 후 모든 처리된 동물에서 비히클(vehicle)과 비교하여 종양 성장에 상당한 지연을 유도했다(도 26). scFv-IgAB_02와 Bi-scFv_Fc_02의 저용량(5mg/kg)은 종양 성장을 늦추는 경향이 있는 반면(크지 않음) 세툭시맙(0.5mg/kg)은 효과가 없었다.
후속 효능연구에서 scFv-IgAB_02는 예방적 설정에서 다양한 용량 수준으로 테스트되었다. 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 세포(HuNOG)가 이식된 IL15 강화 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull 쥐(NOG)에 0일(D0)에 1x106 A431 세포를 피하 접종하였다. 인간화 속도와 인간 백혈구에서 NK 세포의 백분율을 기반으로 HuNOG 쥐를 치료그룹으로 무작위로 분류했다(n = 7). 동물은 D1부터 시작해 매주 5, 15, 45mg/kg; (q7d x 4)으로 scFv-IgAB_02를 정맥 내 투여 되었다.
종양 세포 생착 11일 후, 비히클 그룹과 scFv-IgAB_02(15mg/kg)와 scFv-IgAB_02(45mg/kg)로 치료된 그룹 사이에서 상당한 종양 부피감소가 관찰되었다. 종양 세포 생착 41일 후(희생 시) 매주 scFv-IgAB_02(5mg/kg)를 주사하니 매개체에 비해 종양 부피를 70%까지 감소시켰다. scFv-IgAB_02(15, 45mg/kg)는 비히클과 비교해 종양 부피를 9% 감소시켰다(도 27).
요약하면, scFv-IgAB_02 처리로 인해 종양 성장이 감소하는 경향이 5mg/kg에서 관찰되었다. 15mg/kg 및 45mg/kg에서 상당한 억제가 관찰되어 용량 의존성을 나타낸다.
또 다른 트랜스큐어(Transcure) 연구에서 효능평가는 치료환경에서 수행되었다.
동시에 동일한 연구에서 예방적 환경에서 대조군 구조물 RSV-EGFR과 scFv-IgAB_02를 비교했다. RSV-EGFR은 scFv-IgAB_02의 EGFR 결합 영역과 동일한 Fc 부분을 포함하는 분자이지만, 상관없는 RSV 결합 도메인으로 대체된 CD16A 결합 일부가 결여되어 있다.
제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기세포(HuNOG)가 이식된 IL15-강화 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull 쥐(NOG)를 0일(D0)에 1x106 A431 세포로 피하 접종했다. 인간화 속도와 인간 백혈구에서 NK 세포의 백분율을 기반으로 HuNOG 쥐를 치료그룹으로 무작위로 분류했다(n = 7).
치료적 치료(Therapeutic treatment ):
A-431 종양이 D17 동물에서 50-100mm3의 크기에 도달했을 때, 5, 15, 45mg/kg의 scFv-IgAB_02를 매주 정맥 내 주입했다; (q7d x 4).
scFv-IgAB_02의 두 가지 최고 용량(15mg/kg과 45mg/kg)은 A431 종양 성장을 각각 70%, 90% 감소시켰다. scFv-IgAB_02는 5mg/kg에서 종양 성장에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 28A).
예방적 치료(Prophylactic treatment):
동물들은 D1(q7d x 4)부터 시작하여 매주 scFv-IgAB_02 또는 RSV-EGFR을 45mg/kg으로 정맥 내 주입 받았다.
scFv-IgAB_02(45mg/kg)과 RSV-EGFR(45mg/kg)의 처리는 종양 세포 생착 후 첫 24일 동안 종양성장을 완전히 방지했다. D24부터, RSV-EGFR 그룹의 종양성장은 scFv-IgAB_02 그룹보다 더 빠르다. 희생 시, 평균 종양 부피는 RSV-EGFR 그룹에서 837mm3에 도달했지만 scFv-IgAB_02 그룹에서는 449mm3에 불과했다(도 28B). 이 차이는 두 구성체로 EGFR 인산화를 차단하여 EGFR+ 종양 세포의 성장을 직접적으로 억제시키는 효과에 대해 scFv-IgAB_02의 ADCC가 끼치는 추가적인 약력학적 효과를 나타내어 통계적으로 중요한 차이이다.
hu-쥐의 A431 종양 모델에서의 작용 기전으로서 ADCC의 존재에 대한 영향/증거를 조사하기 위해, 예방적 치료는 scFv-IgAB_02와 RSV-EGFR이 낮은 용량 범위에서 테스트되었다. 또한, scFv-IgAB_02와 RSV-EGFR을 사용한 치료적 치료는 단일 용량 수준에서 비교되었다.
90개의 IL15-강화 인간화 마우스를 인간화 속도와 NK 세포(CD56+ 세포)의 양을 기준으로 두 팔에서 무작위로 추출했다.
예방군(prophylactic arm): 예방그룹(그룹당 6마리 쥐)은 오른쪽 옆구리에 1x106 A431 세포가 이식되었다. 종양세포 접종 1일 후, 쥐들은 치료를 받았다(정맥주사, 4주 동안 매주 1회 및 희생 전 3일 마지막 주사). 0일은 종양 세포 접종일로 정의된다. 다음 치료가 수행되었다.
- 그룹 1: IL15-huNOG + A431 + 비히클(Vehicle) (매주, IV)
- 그룹 2: IL15-huNOG + A431 + scFv-IgAB_02 (1,25mg/kg, 매주, IV)
- 그룹 3: IL15-huNOG + A431 + scFv-IgAB_02 (2,5mg/kg, 매주, IV)
- 그룹 4: IL15-huNOG + A431 + scFv-IgAB_02 (5mg/kg, 매주, IV)
- 그룹 5: IL15-huNOG + A431 + scFv-IgAB_02 (10mg/kg, 매주, IV)
- 그룹 6: IL15-huNOG + A431 + RSV/EGFR (1,25mg/kg, 매주, IV)
- 그룹 7: IL15-huNOG + A431 + RSV/EGFR (2,5mg/kg, 매주, IV)
- 그룹 8: IL15-huNOG + A431 + RSV/EGFR (5mg/kg, 매주, IV)
- 그룹 9: IL15-huNOG + A431 + RSV/EGFR (10mg/kg, 매주, IV)
모든 쥐들은 종양세포 생착 35일 후 희생되었다. 유동세포 분석은 말초혈액 및 종양 침윤세포에 대해 수행되었다.
치료군(Therapeutic arm): 치료 그룹은 오른쪽 옆구리에 1x106 A431 세포로 생착되었다. 종양이 50-100mm3의 부피에 도달하면, 쥐들은 종양 부피, 인간화 속도, NK 세포 수를 기반으로 무작위화되어 치료가 시작되었다. 0일은 첫 번째 치료일로 정의된다. 그룹 10의 동물들과 그룹 11과 12의 6마리 추가 동물들은 유세포 분석을 위한 위성동물(satellite animal)로 사용되었다.
다음 치료가 수행되었다(정맥주사, 4주 동안 주 1회, 희생 전 3일 마지막 주사).
- 그룹 10: IL15-huNOG + A431 + 비히클 (매주, IV) n=6
- 그룹 11: IL15-huNOG + A431 + scFv-IgAB_02 (10mg/kg, 매주, IV) n=15
- 그룹 12: IL15-huNOG + A431 + RSV/EGFR (10mg/kg, 매주, IV) n=15
위성 쥐들은 치료 개시 3일과 10일 후에 희생되었다. 각 시점에서 그룹 11의 3마리와 그룹 12의 3마리의 쥐를 희생시켰다. 치료시작 24일 후, 각 그룹에서 가장 높은 종양 부피를 가진 3마리의 쥐를 희생시켰다. 치료 그룹에서 남은 모든 쥐들은 치료시작 30일 후에 희생되었다. 유동세포 분석은 위성 쥐들의 말초혈액 및 종양 침윤세포에 대해 수행되었다. 치료 개시 30일 후, 림프구도 유동세포 분석에 의해 표현형화(phenotyped)되었다.
scFv-IgAB_02와 RSV/EGFR을 사용한 인간 표피 암종 A431 인간화 마우스 종양 모델에서의 예방적 치료는 10mg/kg의 용량에서 종양 부피를 유의하게 감소시켰다. 더 낮은 용량(1.25, 2.5, 5mg/kg)은 종양 성장을 매개체에 비해 유의하게 억제하지 않았다. RSV/EGFR을 이용한 처리와 scFv-IgAB_02를 이용한 처리는 시험된 모든 용량에서 유사한 종양억제 효과를 보였다(도 29). 이 인간화 쥐 모델의 NK 세포 수는 종양세포에 효과적인 ADCC로 완전히 시작하기에는 너무 낮을 수 있다.
위성(satellite) 동물의 말초혈액 유세포 분석은 혈액 세포 수가 시간이 지남에 따라 일정하게 유지되었지만 NK 세포의 활성화 마커(CD69 및 NKp44)가 종양세포 생착 후에 유의하게 증가했음을 보여주었다.
종양 침윤 면역세포의 표현형(Phenotype)도 조사되었다. 세포 수에서 CD45, T 세포 및, NK 세포에 대해 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 주목할만한 점은 scFv-IgAB_02, RSV/EGFR을 최고 용량을 사용했을 때 비히클 그룹과 비교하여 NK 세포 표면에서 CD69와 NKp44의 발현을 크게 증가시켰다.
scFv-IgAB_02와 RSV/EGFR을 사용한 치료적 치료는 10mg/kg의 용량에서 매개체와 비교하여 종양 부피를 현저히 감소시켰다(도 30). RSV/EGFR과 scFv-IgAB_02 처리 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
말초혈액에 대한 유세포 분석 결과, CD45, NK 세포, T 세포, 및 CD14 양성 세포의 수가 시간이 지남에 따라 일정하게 유지되는 것으로 나타났다. 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
종양에서 scFv-IgAB_02로 치료 개시 30일 후에 CD45, NK 및 T 세포, CD14 양성 세포의 전체적인 증가가 관찰되었다. 활성화 마커의 발현은 매개체 및 RSV/EGFR 처리군에 비해 scFv-IgAB_02로 처리된 쥐에서 더 높은 경향이 있다. 비장에서는 그룹 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 12:
약동학(Pharmacokinetics)
scFv-IgAB_02의 약동학 프로그램은 다음을 포함한다.
게먹이원숭이 혈청 매트릭스에서 민감한 분석 어세이의 개발
게먹이원숭이를 대상으로 한 정맥 내 단일 용량 PK 연구(3 가지 용량 수준)
게먹이원숭이를 대상으로 한 용량 범위검색연구(range finding study)에서 PK/TK 평가(데이터 보류 중)
게먹이원숭이를 대상으로 중심이 되는 28일 독성연구에서 PK/TK 평가(데이터는 아직 보류 중)
게먹이원숭이의 약동학 샘플의 생체분석
게먹이원숭이로부터 채취한 약동학 샘플의 생물학적 분석을 위해 MSD® 플랫폼을 기반으로 한 전기 화학-노화 면역분석이 수행되었다. MSD® 플랫폼은 ELISA와 유사한 설정을 사용하지만, 주요 차이점은 판독이 고전적인 ELISA와 같이 효소 기질변환을 기반으로 하지 않고 전기화학발광반응을 기반으로 한다는 점이다. 따라서 포획 항체(capture antibody)를 흡착하는 전극 표면에 특수 마이크로 플레이트(microplates)가 사용되었다. 또한 SULFO-TAGTM(NHS 에스테르로 결합된 루테늄(II) 트리스-바이피리딘 (Ruthenium(II)tris-bipyridine))라고 하는 전기화학발광 라벨이 부착된 검출기가 필요하다. MSD 판독 버퍼(TPA 포함)가 있는 경우 전기화학발광을 위한 적절한 화학적 환경이 제공된다. MSD® 영상기(imager)는 플레이트 전극에 전압을 적용하여 플레이트 바닥에 근접한 SULFO-Tag가 일련의 환원 및 산화 반응을 통해 빛을 방출하도록 만든다. 방출된 빛의 강도가 감지될 것이다. 신호는 빛의 수준을 높이고 민감도를 증대하기 위해 각 라벨의 다중 자극(multiple excitation) 순환으로 증폭될 수 있다. 자극 메커니즘(전기)이 신호(빛)에서 분리되기 때문에 최소한의 배경 신호와 높은 신호 대 배경 비율이 가능하다. 분석은 LLOQ에서 탁월한 선택성(selectivity)을 보이면서 5ng/ml의 LLOQ를 갖고 있다. 14/14 개인은 RE% <20을 나타낸다.
이 방법은 중추 독성연구에서 TK 평가를 지원하기 위해 GLP에서 완전히 검증될 것이다.
게먹이원숭이에서의 단일 용량 PK
시톡스랩(Citoxlab) 연구에서 총 9마리의 수컷 게먹이원숭이가 등록되었다. 아래의 표에 따라 동물을 8mg/kg(수컷 3마리), 25mg/kg(수컷 3마리), 75mg/kg(수컷 3마리)의 용량 수준으로 scFv-IgAB_02를 투여받은 3개 그룹으로 할당했다. 투여는 5mL/kg/h의 속도로 2시간 주입하여 수행했다.
[표 15]
Figure pct00016
연구기간 동안 각 동물의 사망률 및 병적상태를 하루에 두 번 확인했다. 임상 징후를 기록하기 위해서는 하루에 두 번 이상 관찰되었다. 투여부위의 국소 반응을 기록하기 위해 특별한 주의를 기울였다.
체중은 치료 이전 기간 동안 두 번, 그 이후 -1일에, 그리고 연구가 끝날 때까지 적어도 일주일에 한 번은 기록되었다.
투여 당일(제 1 일) 투여 전 및 주입 종료 직후에 5분, 0.5, 1, 4, 8, 12, 24, 48시간째에, 그리고 주입중지 후5일(96h), 8일(168h), 11일(240h), 15일(336h), 22일(504h)에 혈액을 수집했다. 각 동물은 PK 샘플과 동일하게 처리하기 전에 면역원성(immunogenicity)을 위해 샘플링되었고, 8일, 15일, 22일에 샘플링되었다.
바이오 분석 및 면역원성 분석은 Chimera Biotec에서 수행되었다. 이 문서를 편집할 때 면역원성 결과는 여전히 보류 중이었다. 약동학 분석은 WinNonlin® 소프트웨어 v6.4로 비구획 분석을 사용하여 Citoxlab France에서 수행되었다. 매개변수, Cmax, Tmax, AUC0-last 및 AUC0-inf, t1 / 2, VZ, CL, MRT, AUMC는 분석된 샘플에서 측정된 농도를 통해 결정되었다.
27일째 관찰기간이 완료되면 모든 동물은 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride)의 근육 내 주사로 진정시키고, 펜토바르비탈 나트륨((pentobarbital sodium)의 정맥 주사로 마취시키고, 출혈로 안락사시켰다.
PK 결과와 관련하여 정량화 가능한 양의 scFv-IgAB_02는 투여 전 샘플에서 전혀 발견되지 않았다.
획득한 데이터를 바탕으로 다음과 같은 결론을 내릴 수 있다(표 16 참조).
시험항목에 대한 전신노출이 모든 동물에서 달성되었다.
예상대로 scFv-IgAB_02 주입이 끝날 때 Tmax에 도달했다.
최종 반감기는 33.4 ~ 154시간 범위였다.
용량-정규화된(dose-normalized) AUC0-t 값을 기반으로 혈청 테스트 항목 노출의 용량비례(dose-proportional) 이상의 증가가 투여된 용량수준의 범위에 걸쳐 관찰되었으며, 용량-정규화된 Cmax를 고려할 때 대략 용량-비례 증가가 관찰되었다.
용량수준이 증가함에 따라 말기 반감기 값에서 약간의 증가가 관찰되었으므로 관찰된 scFv-IgAB_02의 전신 CL에서 용량관련 변화를 확인했다.
분포 VZ의 최종 부피는 원숭이의 총 혈장 부피에 근접하여 scFv-IgAB_02가 주로 혈장 부피에 위치함을 나타낸다.
용량증가에 따라 분포값의 최종 부피의 감소가 관찰되었고, 이는 시험항목의 조직 분포/내재화에서 가능한 포화 메커니즘을 시사한다.
표 16: 시톡스랩(Citoxlab) 연구에서 개별 동물의 약동학적 매개 변수
Figure pct00017
실시예 13:
EGFR + 종양을 갖고 있는 쥐에서의 scFv-IgAB_02 조직 분포
scFv-IgAB_02의 조직 분포 평가는 A431 세포를 지닌 이종 이식 모델 쥐에 125I-scFv-IgAB_02 정맥 내 투여를 하여 수행했다.
scFv-IgAB_02는 2 mCi/mg의 최종 특이활성에 대한 산화제로서 요오드겐(Iodogen)을 사용하여 방사성요오드화에 의해 방사성 표지되었다. 표지된 분자의 완전성은 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 및 SDS-PAGE로 확인되었다.
생물학적 활성은 각각의 KD 값을 결정하기 위해 huCD16A에 대한 RIA 분석 및 A-431 세포에 대한 포화결합 분석에 의해 확인되었다(KD: 각각 0.729 nM과 6.982; 데이터는 여기에 표시되지 않았음). 쥐혈장의 안정성은 7일 동안 확인되었다.
38마리의 쥐를 5 x 106개의 A-431 세포로 오른쪽 옆구리에 피하 이종이식시켰다. 125I-scFv-IgAB_02 주사일에 평균 종양부피는 약 289 ± 83mm3이고 접종 후 2주의 성장 기간에 해당한다.
조직 분포(종양 표적화 포함)는 8개의 최종 시점 - 30분, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 336시간에서 평가되었다. 또한, 소변 및 대변 수집을 위해 3마리의 동물을 최대 168시간까지 대사 케이지에 수용하여 배설 경로와 질량 균형을 결정할 수 있었다. 동시에, 투여 후 48시간 및 336시간에 정량적 전신 방사선촬영 연구가 수행되었다.
종양에서 가장 높은 방사능 농도가 8시간과 48시간 사이에 관찰되었고 125I-scFv-IgAB_02의 최대 종양 흡수가 투여 후 24시간에 발생하여 8.56%ID/g에 도달했다. 이후 시점에서 종양의 방사능은 점차 감소하고 96시간에서 5.62%ID/g를 차지했다. 방사능은 336시간(1.21%ID/g)에서 종양에서 완전히 제거되지 않았으며, 이는 종양 조직에서 scFv-IgAB_02의 머무름을 나타낸다(도 31).
대부분의 장기(위 및 자궁 경부 제외)에서 종양 대 장기 비율은 30분에서 24 ~ 48시간 사이에 증가하였는데, 이는 종양에 축적된 방사능이 장기에서 측정한 것보다 더 느리게 제거됨을 시사하며 즉 종양 조직에서 scFv-IgAB_02를 보유하고 있음을 나타낸다(도 32).
최대 방사능 흡수는 거의 모든 정상 조직에 125I-scFv-IgAB_02를 주사한 후 처음 30분 이내에 관찰되었다(피부, 자궁 경부, 근육, 소화관 제외. 8시간 및 24시간에 최대 농도가 관찰됨). 그런 다음 이들 조직의 방사능 수준은 시간이 지남에 따라 현저한 정체 없이 감소했고 이는 풀(pool) 혈액의 활동감소와 일치한다.
관찰기간 동안 가장 정상인 방사능 농축이 단백질 신진대사와 관련된 장기에서 발견되었고 간, 비장, 신장과 같은 전신 순환에서는 %ID/g가 각각 7.25, 8.37, 14.75로 제거되었다. 또한 위처럼 자유로운 요오드가 선택적 축적에 관여하는 기관에서(8시간에 4.14%ID/g) 발견되었다. 게다가 폐에서 30분에 10.02%ID/g로 높은 수준의 방사능이 발견되었다. 아마도 난소 및 자궁 경부에서(각각 30분에 11.22%ID/g, 24시간에 6.54%ID/g)뿐만 아니라 투여용액(SE-HPLC 분석에 따르면 약 3%)에서 총액이 존재하기 때문일 것이다.
125I-scFv-IgAB_02의 IV 투여 후, 주사한 활성의 약 절반이 각각 43.27% 및 7.40%의 누적소변 및 대변배설로 168시간 만에 배설물에서 회복되었다. 신장을 통해 제거된 방사능은 scFv-IgAB_02와 관련이 없을 것 같지만 탈할로겐화(dehalogenation) 과정에서 방출되는 유리(free) 요오드-125와 일치해야 한다.
방사능 사진촬영을 위해 쥐는 투여 후 48시간 및 336시간에 희생되었다. 전신 방사능 사진촬영 결과는 조직 해부기법으로 얻은 결과와 비교해 예상되는 생체 분포패턴을 보여주었다. 실제로 방사능은 투여 후 48시간에 종양, 폐, 그리고 대사 및 배설 메커니즘에 관여하는 간, 신장, 비장에서 주로 발견되었다. 336시간의 사진은 모든 장기/조직에서 방사능이 거의 완전히 감소했음을 보여준 반면 나머지 대부분의 활동은 종양에서 발견되었다(도 33).
실시예 14:
독성학(Toxicology)
말기 종양 환자에서 FIM 연구를 뒷받침하는 이중 특이성 EGFR/CD16 항원 결합 단백질의 독성학 연구는 관련 종으로서 게먹이원숭이에서 수행되었다. 다른 종에 대한 독성 연구는 수행되지 않았다.
지금까지 수행된 scFv-IgAB_02의 독성 프로그램은 다음을 포함한다.
게먹이원숭이(비GLP)에서 28일 동안의 정맥 내 반복용량범위 찾기 연구
게먹이원숭이(GLP)에서 28일 동안의 중추적 정맥 내 반복투여 독성 연구
scFv-IgAB_02의 경우 구조적 유사성과 부분적으로 유사한 작용 메커니즘으로 인해 세툭시맙과 유사한 독성 프로필을 예상할 수 있다. 그러나 EGFR 인산화를 억제하는 scFv-IgAB_02의 잠재력이 감소됨에 따라 부작용 프로필(피부 독성 없음 또는 감소)이 개선되는 것을 예상할 수 있다는 점을 언급해야겠다. 그럼에도 불구하고, 게먹이원숭이에서 정맥으로 세툭시맙을 투입하는 39주 연구에서 용량 수준은 조정되었다(연구 070-087, EMEA2004; Erbitux 승인을 위한 과학적 논의).
정맥 내 반복용량범위 찾기 연구에서 scFv-IgAB_02는 전신 또는 국소 독성을 유도하지 않았다. scFv-IgAB_02는 최대 75mg/kg(q7d x 5)의 시험된 용량 수준까지 임상적 관찰, 체중, 체온, 또는 임상 혹은 해부학적 병리학에 영향을 미치지 않았다. 주목할만한 유일한 효과는 모든 용량 수준에서(6 h p.i. 이내) 첫 번째 투여 후 순환하는 IL-6 수준이 일시적으로 상승했다는 점이다. IL-6 수치는 첫 번째 투여 후 24시간 이내에 정상으로 돌아왔다. scFv-IgAB_02는 첫 번째 투여 후 IL-2, IFN-γ, TNF-α 수준에 영향을 미치지 않았다. 또한 scFv-IgAB_02는 첫 번째 투여 7일 후 24mg/kg 이상의 투여량에서 말초 혈액에서 절대 NK 세포 수(CD3-CD20-CD159 + 양성) 및 CD69+ 활성화 NK 세포의 일시적인 감소를 유발했다.
scFv-IgAB_02에 대한 중요한 28일 정맥 내 독성 연구에서 시험항목은 최대 용량 수준인 75mg/kg(q7d x 5)까지 잘 견뎌냈다. 지금까지 확인된 유일한 시험항목과 관련된 결과는 두 마리 동물에서 1일째에 75mg/kg를 투여했을 때 구토가 난 것과 1일째에 투여 후 4시간에 WBC 및 특히 호중구(neutrophils)가 증가한 경우가 있었다. 호중구 수의 일시적인 증가는 혈청 IL-6 수준의 일시적인 증가에 의해 유발되었을 것이다(적어도 문헌 데이터에 제시됨). 중추적 연구가 본 문서를 취합할 때 아직 종료가 보류된 상태이다.
게먹이원숭이를 대상으로 한 반복 용량 정맥 내 용량 범위 발견 연구
연구의 목적은 4주 동안(총 5회 주입) 매주 한 번씩 게먹이원숭이에 반복적으로 주입한 후(2시간 의자 주입) 5주의 회복단계를 거친 후 시험 항목의 최대 허용 용량을 결정하는 것이다. 모리셔스 기원의 게먹이원숭이 10마리(수컷 5마리와 암컷 5마리)를 다음의 투여군에 할당했다.
[표 17]
Figure pct00018
구조적 및 기능적 유사성으로 인해 용량 수준 및 투여 요법은 세툭시맙 독성평가(EMA 2004 Scientific Discussion: WC5000291131)에 따라 선택되었다.
독성평가는 임상적 관찰, 체중, 체온, 임상 및 해부학적 병리를 기반으로 했다.
IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α, INF-γ의 사이토카인(cytokine) 수준은 멀티플렉스(Multiplex) 기술에 의해 결정되었고, 각 투여 수준(CD45, CD3, CD4, CD8, CD20, CD16, CD159a) 림프구 아형(lymphocyte subsets)의 유세포 분석 평가(flow cytometric assessment)가 포함되었다.
모든 조직에 대한 거시적 이상(abnormalities)을 기록하여 모든 동물에 대해 완전한 검시가 시행되었다. 장기 무게와 현미경 검사가 수행되었다.
scFv-IgAB_02와 항약물 항체의 독성역학평가를 위해 혈액을 수집했다. 독성역학 시료의 생물학적 분석과 항약물 항체 분석은 보류 중이다.
scFv-IgAB_02는 임상적 관찰, 체중, 체온, 임상 및 해부학적 병리에 영향을 미치지 않았다.
scFv-IgAB_02의 약리학적 작용은 첫 번째 투여 후 2-4시간에 모든 투여량 수준에서 순환 IL-6 수준의 일시적인 상승으로 나타났으며, 4시간 후 IL-6 수준의 급격한 감소는 24시간 후의 기준선으로 되돌아갔다(도34).
본 연구에서 NK 세포 항상성의 동적 특성과 낮은 그룹 크기를 감안할 때 NK 세포 수 및 활성화 상태에 대한 scFv-IgAB_02의 효과에 대해 명확한 평가를 할 수 없다. 거의 모든 데이터가 투여 전 데이터 세트의 가변성 내에 있었다. 24mg/kg 이상의 용량에서 절대 NK 세포 수(CD3-CD20-CD159+) 및 CD69+ 활성화된 NK 세포의 일시적인 감소 경향이 8일째에 나타났으며, 이는 대조군이 영향을 받지 않았기 때문에 scFv-IgAB_02와 관련이 있는 것으로 간주된다.
요약하면, scFv-IgAB_02는 전신 또는 국소 독성을 유발하지 않았다. scFv-IgAB_02는 게먹이원숭이에게 28일 동안 매주 1회 주입 의자에서 2시간에 걸쳐 IV 주입을 시켰을 때 최고 용량(75mg/kg)까지 잘 견디었다.
게먹이원숭이를 대상으로 한 중추적인 28일 정맥 내 독성 연구
게먹이원숭이를 대상으로 4주 동안 중추적인 GLP준수의 반복투여 독성연구를 수행했다(CRO: Covance). 이 문서작성 시점에 연구의 생애(in-life phase)단계가 완료되었으며 초기 또는 부분 결과를 사용할 수 있었다. 그러나 이 연구의 특정 최종 분석(예: 조직 병리학, 독성역학)은 아직 보류 중이었다.
이 연구의 목적은 28일 동안(총 5회 주입) 게먹이원숭이에게 반복적 정맥주입(주 1회 2시간 주입) 후 28일의 회복단계 중 scFv-IgAB_02의 독성을 결정하고 관찰된 효과의 가역성을 평가하는 것이었다. 정맥 내 투여 경로는 의도된 인간 치료 경로이기 때문에 선택되었다.
scFv-IgAB_02의 투여 된 용량 수준은 0, 8, 24, 75mg/kg이었다. 연구는 비히클(vehicle), 중용량, 고용량의 회복 동물을 포함해 아래 표에 따라 4개의 최종 사멸 그룹으로 구성되었다.
[표 18]
Figure pct00019
투여기간 동안 원숭이는 ECG, 혈압, 검안경 검사뿐만 아니라 임상적 징후, 체온, 체중, 혈액학 및 혈액 화학, 소변 검사에 대해 관찰되었다. 또한 IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α, INF-γ의 사이토카인 수준은 멀티플렉스 기술에 의해 결정되었고 각 투여 수준(CD45, CD3, CD4, CD8, CD20, CD16, CD159a, CD14) 후 림프구 하위 집합의 유세포 분석 평가가 수행되었다.
피부가 세툭시맙의 주요 표적이기 때문에 피부독성(특히 지연 독성)에 특히 초점을 두었다. 세툭시맙에서 발견된 가장 두드러진 피부는 표재성 화농성 피부 병변이었다.
연구종료 후 조직의 전체 EMA 목록을 수집하고, 내부 장기의 침범과 함께 침식성 및 궤양성 피부염으로 인한 2차 중복감염(superinfections)에 추가 초점을 맞춘 조직 병리학을 적용했다.
이 연구에는 통합 TK 평가 및 ADA 평가가 포함된다.
조기 사망은 발생하지 않았으며 테스트 항목과 관련해 수의사 치료가 필요하지 않았다.
연구 기간 동안 명백한 용량 의존성이 없는 그룹 1-4의 단일 동물에서 일부 피부 변화(skin alterations)가 발생했다. 이러한 결과는 우발적인 것으로 간주되었고 테스트 항목의 투여와 관련이 없었다.
임상적 관찰과 관련하여 높은 복용량의 두 마리 수컷(동물 P0301 및 P0305)이 첫 번째 투여 동안 구토를 했다(액체 및/또는 점액 구토). 이는 고용량에서만 나타났기 때문에 해당 발견은 시험 항목과 관련이 있는 것으로 간주된다.
부기 및 연변과 같은 추가 임상적 관찰은 드물게 일어나거나 용량 반응이 없거나 혹은 이 실험 동물 종에서 일반적으로 관찰된 내용과 비교해보니 우연한 것으로 간주되었다.
최대 75mg/kg의 scFv-IgAB_02 치료는 체중 발달에 영향을 미치지 않았다. 체중 발달은 투약 및 회복 단계 동안 대조군과 비슷했다.
최대 75mg/kg의 scFv-IgAB_02 치료는 체온에 영향을 미치지 않았다. 실험 항목을 투여한 동물과 대조군 사이에서 그룹 평균체온에는 상당한 차이가 있었지만 용량반응이 없었기 때문에 우연한 것으로 간주되었다.
안과적 소견과 관련한 검사 항목은 발견되지 않았다. 출혈, 밝은 부위, 폐색(compaction), 드루젠(drusen), 유두막, 병변, 불투명, 색소 침착, 흉터와 같은 소견은 치료 및 대조군 동물에서 산발적으로 보였고/또는 투약 전 단계에서도 발생했으며 게먹이원숭이에서 일반적으로 나타난 관찰내용과 비슷했다.
최대 75mg/kg의 scFv-IgAB_02 치료는 혈압과 호흡률에 영향을 미치지 않았다.
혈액학과 관련해
모든 그룹의 동물에서 투여 단계 8일부터 망상 적혈구수가 증가했다. 이는 빈번한 혈액 샘플링의 생리적 보상효과로 간주된다.
WBC 수와 확실히 호중구 수는 투여 단계의 1일에 투여 4시간 후 그룹 2부터 4까지의 동물에서 증가되었다. 그 차이는 용량 의존적이지 않았다.
중간용량 그룹(24mg/kg)의 두 동물에서는 증가가 투여 후 24시간 동안 완전히 가역적(reversible)이었다. 다른 동물 및 그룹의 경우는 24시간에 샘플을 수집하지 않았다. 8일째에 모든 다른 그룹에서 회복이 나타났다. 그러나 24시간이 지나야 모든 그룹이 완전히 회복할 것으로 예상된다.
최대 75mg/kg의 scFv-IgAB_02 치료는 임상적 화학, 응고, 소변 매개 변수에 영향을 미치지 않았다.
당분간 조직 병리학, TK, ADA 평가는 물론 ECG 분석, 면역 표현형 분석, 사이토카인 분석과 같은 일부 다른 종료점은 여전히 보류 중이다. 모든 예비 거시적 관찰내용이 해당 종에서 흔히 발견되는 자발적인 배경 변화와 일치했다. 그러나 연구 병리학자의 최종 평가는 보류 중이다. 장기 무게도 마찬가지다.
요약하면 지금까지 확인된 테스트 항목 관련 결과는 다음과 같다.
- 1일차에 75mg/kg으로 두 마리의 동물이 구토
- 1일째 투여 후 4시간째에 WBC 및 특히 ANEU 증가
[표 19] 서열 리스트
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
<110> Affimed GmbH <120> BISPECIFIC EGFR/CD16 ANTIGEN-BINDING PROTEIN <130> IP20200120DE <150> EP 18161871.1 <151> 2018-03-14 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vh domain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asn Pro Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> vl domain <400> 2 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile 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Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln 450 455 460 Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr 465 470 475 480 Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser 485 490 495 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile 500 505 510 Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val 515 520 525 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser 530 535 540 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Pro 545 550 555 560 Ile Ser Ile Pro Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 565 570 575 Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Ser Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser 595 600 605 Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile 610 615 620 Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 625 630 635 640 Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu 645 650 655 Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser 660 665 670 Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp 675 680 685 Thr Ser Ser Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 690 695 700 Leu 705 <210> 44 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 44 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn 115 120 125 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val 130 135 140 Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu 145 150 155 160 Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser 180 185 190 Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro 195 200 205 Thr Glu Cys Ser 210 <210> 45 <211> 734 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 45 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 145 150 155 160 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Ala Ile Glu Pro Met Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 180 185 190 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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 610 615 620 Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro 625 630 635 640 Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys 645 650 655 Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val 660 665 670 Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser 675 680 685 Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu 690 695 700 Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Ser 705 710 715 720 Asp His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 725 730

Claims (16)

  1. EGFR 및 CD16A에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 다중특이적 항원-결합 단백질로서,
    상기 항원-결합 부위는 중쇄 불변 도메인 CH2 및 CH3을 포함하는 폴리펩티드에 융합되고, 상기 EGFR에 대한 항원 결합 부위는 하기의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는, 다중특이적 항원-결합 단백질:
    여기서, (i) VH는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하고, VL은 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3를 포함하고; 또는
    (ii) VH는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 VL은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가짐.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CD16A에 대한 항원-결합 부위는,
    (i) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열번호 6 또는 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 도메인(VH), 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 도메인(VL); 또는
    (ii) 서열번호 12 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 단백질은 EGFR에 대한 적어도 2개의 항원-결합 부위 및 CD16A에 대한 적어도 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항원-결합 단백질은 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되고 각각의 폴리펩티드 사슬은 펩티드 링커에 의해 제1 항원-결합 부위의 VH에 연결된 VL을 포함하는 제1 단쇄 Fv 단위(scFv1) 및 펩티드 링커에 의해 제2 항원-결합 부위의 VH에 연결된 VL을 포함하는 제2 단쇄 Fv 단위(scFv2)를 포함하고,
    상기 제1 단쇄 Fv 단위(scFv1)는 힌지 영역에 의해 CH2-CH3 폴리펩티드의 CH2 도메인에 N-말단으로 융합되고,
    상기 제2 단쇄 Fv 단위(scFv2)는 힌지 영역에 의해 CH2-CH3 폴리펩티드의 CH3 도메인에 C-말단으로 융합된 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 scFv1는 CD16A에 대한 항원-결합 부위고,
    상기 scFv2는 EGFR에 대한 항원-결합 부위인 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 항체는 하기의 F(ab´)2 단편 및 Fc-부분을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단백질:
    여기서, (i) 상기 F(ab´)2 단편은 CD16A에 대한 2개의 Fv 항원-결합 부위를 포함하고, EGFR에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 2개의 단쇄 Fv(scFv)는 상기 Fc-부분에 융합되고, 상기 각각의 scFv는 Fc- 부분의 CH3 도메인에 C-말단으로 융합되고; 또는
    (ii) 상기 F(ab´)2 단편은 EGFR에 대한 2개의 Fv 항원-결합 부위를 포함하고, CD16A에 대한 항원-결합 부위를 포함하는 2개의 단쇄 Fv(scFv)는 상기 Fc-부분에 융합되고, 상기 각각의 scFv는 Fc- 부분의 CH3 도메인에 C-말단으로 융합됨.
  7. 제6항에 있어서,
    하기의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질:
    여기서, (i) 상기 중쇄는 VH(CD16A)-CH1-CH2-CH3-VH(EGFR)-VL(EGFR) 구조를 갖고 경쇄는 VL(CD16A)-CL 구조를 갖거나; 또는
    (ii) 상기 중쇄는 VH(EGFR)-CH1-CH2-CH3-VL(CD16A)-VH(CD16A) 구조를 갖고 경쇄는 VL(EGFR)-CL 구조를 가짐.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 단백질은 Fc-감마 수용체에는 결합하지 않고, 신생아의(neonatal) Fc-수용체에는 결합하는 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질은 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 경쇄을 포함하는 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 혈청 알부민에 대한 항원-결합 부위, 또는
    (ii) 항원-결합 단백질에 융합된 혈청 알부민
    을 추가로 포함하는 것인, 다중특이적 항원-결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 단백질의 치료학적 화합물로서의 용도.
  12. 제11항에 있어서,
    EGFR-양성 또는 EGFRvIII-양성 세포를 특징으로 하는, 암 치료 용도.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 두경부암, 폐암 및 교아세포종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 암 치료 용도.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 단백질을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 질환 또는 종양성 질환의 치료 또는 개선 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 증식성 질환 또는 종양성 질환은 EGFR-양성 또는 EGFRvIII-양성 세포를 특징으로 하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 증식성 질환 또는 종양성 질환은 대장암, 두경부암, 폐암 및 교아세포종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
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