CN105916880B - 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体 - Google Patents

具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体 Download PDF

Info

Publication number
CN105916880B
CN105916880B CN201580004548.6A CN201580004548A CN105916880B CN 105916880 B CN105916880 B CN 105916880B CN 201580004548 A CN201580004548 A CN 201580004548A CN 105916880 B CN105916880 B CN 105916880B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
antibody
mutations
region
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580004548.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105916880A (zh
Inventor
T·施洛特豪尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Priority to CN201911344011.0A priority Critical patent/CN110981957A/zh
Publication of CN105916880A publication Critical patent/CN105916880A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105916880B publication Critical patent/CN105916880B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本文中报道了包含第一多肽和第二多肽的多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，其中第一多肽、第二多肽或者第一和第二多肽包含突变Y436A(根据EU索引编号)。

Description

具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体
本文中报道了已经就其纯化特性方面修饰的IgG Fc区。
发明背景
需要有成本效率的生产过程已经导致优化下游纯化过程(包括一个或多个亲和色谱步骤)的必要性。较大的待加工体积和更严格的就地清洗(CIP)方案要求了需要解决的某些特征(Hober,S.,J.Chrom.B.848(2007)40-47)。
借助选择性Fc区亲和配体纯化单克隆抗体是大规模生产治疗性单克隆抗体的最有前景方法学。实际上，这种方法不需要建立与抗体的抗原特异性部分，即Fab结构域的任何相互作用，所述抗原特异性部分因此完整并且可以保留其特性(参见Salvalaglio,M.等人,J.Chrom.A 1216(2009)8678-8686)。
归因于其选择性，在纯化链中早期使用亲和力-纯化步骤并且因而能减少连续单元操作的数目(参见Hober上文；MacLennan,J.,Biotechnol.13(1995)1180；Harakas,N.K.,Bioprocess Technol.18(1994)259)。
采用最多以选择性结合IgG的配体是葡萄球菌蛋白A和蛋白G，它们能够建立与大部分IgG的Fc区在称作"共有结合位点(CBS)”的区域高度选择性相互作用(DeLano,W.L.等人,Science 287(2000)1279)，所述共有结合位点位于Fc区的CH2结构域和CH3结构域之间的铰链区处。
葡萄球菌蛋白A(SPA)是暴露于革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)表面上的细胞壁缔合的蛋白质结构域。SPA对来自多种物种的IgG例如人、兔和豚鼠IgG具有高亲和力，但是仅与牛IgG和小鼠IgG微弱相互作用(参见下表)(参见Hober上文；Duhamel,R.C.等人,J.Immunol.Methods 31(1979)211；
Figure BDA0001049029040000011
L.和Kronvall,G.,Immunol.J.133(1984)969；Richman,D.D.等人,J.Immunol.128(1982)2300；AmershamPharmacia Biotech,Handbook,Antibody Purification(2000))。
++：强结合/+：中等结合/-：弱或无相互作用
IgG的CH2结构域和CH3结构域之间的重链铰链区能够结合除蛋白A之外的几种蛋白质，如新生儿Fc受体(FcRn)(参见DeLano和Salvalaglio，上文)。
SPA CBS包括抗体表面上的疏水性口袋。组成IgG CBS的残基是Ile253、Ser254、Met252、Met423、Tyr326、His435、Asn434、His433、Arg255和Glu380(根据Kabat EU索引编号体系对IgG重链残基编号)。带电荷氨基酸(Arg255、Glu380)位于Ile253和Ser254形成的疏水性结周围。这(能)导致建立极性和亲水性相互作用(参见Salvalaglio上文)。
通常而言，蛋白A-IgG相互作用可以使用两个主要结合位点来描述：第一个位点位于重链CH2结构域中并且以(蛋白A的)Phe132、Leu136、Ile150与Ile253和Ser254构成的IgG疏水性结之间的疏水相互作用为特征并且以Lys154(蛋白A)和Thr256(IgG)之间的一个静电相互作用为特征。第二个位点位于重链CH3结构域中并且特征是Gln129和Tyr133(蛋白A)与His433、Asn434和His435(IgG)之间的静电相互作用(参见Salvalaglio上文)。
Lindhofer,H.等人(J.Immunol.155(1995)219-225)报道了大鼠/小鼠四合瘤(quadroma)中物种限制的优选性重链/轻链配对。
Jedenberg,L.等人(J.Immunol.Meth.201(1997)25-34)报道，两个Fc变体(Fc13和Fc31，各自含有来自另一个相应同种型的同种型二肽置换)的SPA结合作用分析显示Fc1和Fc31与SPA相互作用，而Fc3和Fc13缺少可检测的SPA结合作用。得出以下结论：Fc区变体Fc31所致SPA结合作用因引入的二肽置换R435H和F436Y所致。
如今，关于治疗性单克隆抗体的重点在于产生和使用与两种或更多种靶(抗原)特异性结合的双特异性抗体或甚至多特异性抗体。
在一个表达细胞系中从四条抗体链(两条不同的重链和两条不同的轻链)产生多特异性异二聚体IgG抗体的基础挑战是所谓的链缔合问题(参见Klein,C.等人,mAbs 4(2012)653-663)。要求使用不同链作为多特异性抗体的左臂和右臂导致在一个细胞中表达时抗体混合物：两条重链能够(理论上)按四种不同的组合方式缔合(其中两种相同)，并且这些重链中每一者均可以按随机方式与轻链缔合，产生24(＝总计16)种理论上可能的链组合。16种理论上可能的组合当中，发现存在10种组合，但其中仅一种组合对应于所需功能性双特异性抗体(De Lau,W.B.,等人,J.Immunol.146(1991)906-914)。难以从复杂混合物分离出这种所需的双特异性抗体和理论上最大12.5％的内在不良产率致使在一个表达细胞系中产生双特异性抗体极端富有挑战性。
为了克服链缔合问题并且迫使两条不同的重链正确缔合，二十世纪九十年代后期，来自Genentech的Carter等人发明了一项方案，称作"结入扣”(KiH)法(参见Carter,P.,J.Immunol.Meth.248(2001)7-15；Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；Zhu,Z.等人,Prot.Sci.6(1997)781-788；Ridgway,J.B.等人,Prot.Eng.9(1996)617-621；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35；和US 7,183,076)。基本上，这个构思依赖于修饰抗体两条重链的两个CH3结构域之间其中发生大部分相互作用的界面。将大体积残基引入一条抗体重链的CH3结构域中并且它类似地充当钥匙("结”)。在另一条重链中，形成能够容纳这个大体积残基的"扣”，从而模拟锁。所得到的异二聚Fc区可以通过引入/形成人工二硫键进一步稳定化。值得注意地，全部KiH突变均埋入CH3结构域内部并且是免疫系统不"可见”的。此外，具有KiH突变的抗体的特性如(热)稳定性、FcγR结合作用和效应子功能(例如，ADCC、FcRn结合作用)和药代动力学(PK)行为不受影响。
可以通过引入以下六个突变实现正确的重链缔合，同时异二聚化产率高于97％："结”重链中的S354C、T366W和"扣”重链中的Y349C、T366S、L368A、Y407V(参见Carter上文；根据Kabat EU索引编号体系对残基编号)。尽管可能存在扣-扣同型二聚体，但一般观察不到结-结同型二聚体。扣-扣二聚体可以因选择性纯化程序或因如下概述的程序耗尽。
尽管已经解决随机重链缔合问题，然而还必需确保正确的轻链缔合。类似于KiHCH3结构域法，已经作出努力以研究可能最终导致完整双特异性IgG的非对称轻链-重链相互作用。
作为一种可能，Roche最近开发了CrossMab方案在用KiH技术组合轻链时迫使轻链在双特异性异二聚IgG抗体中正确配对(参见Klein上文；Schaefer.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11187-11192；Cain,C.,SciBX 4(2011)1-4)。这允许以类属方式产生双特异性抗体或甚至多特异性抗体。在这种样式中，想要的双特异性抗体的一条臂保持不变。在第二条臂中，完整Fab区或VH-VL结构域或CH1-CL结构域在重链和轻链之间通过结构域交叉互换来交换。作为结果，新形成的"交叉”轻链不再与双特异性抗体的另一条臂的(正常，即不交叉的)重链Fab区缔合。因此，可以通过结构域搭配的这种最小变化迫使正确的"轻链”缔合(参见Schaefer上文)。
Zhu等人在双体抗体(diabody)变体的两个VL/VH界面中引入几个空间上互补的突变以及二硫键。向抗p185HER2VL/VH界面中引入突变VL Y87A/F98M和VH V37F/L45W时，与亲本双体抗体相比，异二聚双体抗体以>90％产率回收，同时维持总产率和亲和力(参见Zhu上文)。
来自Chugai的研究者已经类似地通过向VH-VL界面中引入强化轻链缔合的突变(主要将VH中的Q39和VL中的Q38转化成带电荷残基)，设计双特异性双体抗体(WO 2006/106905；Igawa,T.等人,Prot.Eng.Des.Sel.23(2010)667-677)。
在WO 2011097603中，报道了常见轻链小鼠。
在WO 2010151792中，提供了引起易于分离的双特异性抗体样式，其包含在CH3结构域中差异性修饰(即异二聚)的免疫球蛋白重链可变结构域，其中差异性修饰相对于CH3修饰是无免疫原性或基本上无免疫原性，并且至少一种修饰导致双特异性抗体对亲和试剂如蛋白A的差异性亲和力，并且双特异性抗体基于其对蛋白A的亲和力，从破碎的细胞、从培养基或从抗体的混合物可分离。
新生儿Fc-受体(FcRn)对IgG类抗体体内的代谢命运重要。FcRn起到利用来自溶酶体降解途径的IgG的作用，导致清除率降低和半寿期增加。它是由两条多肽：50kDa主要组织相容性复合体样蛋白I类(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)组成的异二聚体蛋白。FcRn以高亲和力与IgG类抗体的Fc区的CH2-CH3部分结合。在IgG类抗体和FcRn之间的相互作用依赖pH并且以1:2化学计量发生，即一个IgG抗体分子可以通过其两条重链Fc区多肽与两个FcRn分子相互作用(参见，例如Huber,A.H.等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。
因此，IgG体外FcRn结合特性/特征指示其在血液循环中的体内药代动力学特性。
重链CH2结构域和CH3结构域的不同氨基酸残基参与FcRn和IgG类抗体Fc区之间的相互作用。
影响FcRn结合并且影响血液循环中半寿期的不同突变是已知的。已经通过位点定向诱变鉴定了对小鼠Fc区-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua,W.F.等人,J.Immunol 169(2002)5171-5180)。残基I253、H310、H433、N434和H435(根据KabatEU索引编号体系编号)参与这种相互作用(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542-548)。发现残基I253、H310和H435对人Fc区与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2885)。
已经通过突变Fc区中多个氨基酸残基：Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr307、Glu 380、Met 428、His 433和Asn 434，实施增加Fc区(并且同样地增加IgG)与FcRn结合的方法(参见Kuo,T.T.等人,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789；Ropeenian,D.C.等人,Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725)。
通过蛋白质-蛋白质相互作用研究，Dall’Acqua等人已经描述组合M252Y、S254T、T256E的突变改善FcRn结合(Dall'Acqua,W.F.等人,J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。人Fc区-人FcRn复合物的研究已经显示残基I253、S254、H435和Y436对这种相互作用至关重要(Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung，Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中，已经报道并研究了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。
在WO 2014/006217中，报道了具有三重突变的二聚体蛋白。关于pH依赖性结合作用机理的FcRn/异二聚Fc复合物2.8埃晶体结构由Martin,W.等人,(Mol.Cell.7(2001)867-877报告。在US 6,277,375中，WO 2013/004842报道了半寿期增加的免疫球蛋白样结构域。Shields，R.L.等人报道了人IgG1上FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点的高分辨定位及FcγR结合作用改善的IgG1变体的设计(Biochem.Mol.Biol.276(2001)6591-6604)。Medesan,C.等人(J.Immunol.158(1997)2211-2217)阐释了参与转胞吞作用和分解代谢的小鼠IgG1氨基酸残基。在US 2010/0272720中，报道了FcRn结合位点修饰的抗体融合蛋白。在WO 2013/060867中报道了异二聚体蛋白的产生。Qiao,S.-W.等人报道了抗体介导的抗原呈递依赖FcRn(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(2008)9337-9342)。
发明概述
本文中报道了与葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A特异性结合且不与人FcRn结合的变体Fc区。这些变体Fc区在CH2结构域和CH3结构域中含有特定氨基酸突变。已经发现在异二聚Fc区的扣链或结链中使用时，这些突变允许纯化异二聚Fc区，即异二聚Fc区与同型二聚Fc区分离。
如本文中报道的一个方面是使用突变Y436A增加(二聚体)Fc区多肽与蛋白A的结合。
如本文中报道的一个方面是一种(二聚体)多肽，其包含
第一多肽和第二多肽，所述第一多肽按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，所述第二多肽按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，
其中第一多肽、第二多肽或者第一和第二多肽包含突变Y436A(根据Kabat EU索引编号体系编号)，和
其中第一多肽和第二多肽由免疫球蛋白铰链区的至少一部分中的一个或多个二硫键连接。
在一个实施方案中，第一和第二多肽包含突变Y436A。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽不与人FcRn特异性结合并且与葡萄球菌蛋白A特异性结合。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是同型二聚多肽。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是异二聚多肽。
在一个实施方案中，第一多肽还包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V("扣")并且第二多肽包含突变S354C和T366W("结")。
在一个实施方案中，第一多肽还包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V("扣")并且第二多肽包含突变Y349C和T366W("结")。
在一个实施方案中
i)第一和第二多肽各自包含突变H310A,H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽各自还包含突变L251D,L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽各自还包含突变L251S,L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A,H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A,H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A,H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D,L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A,H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S,L314S和L432S。
在一个实施方案中，第一和第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG1亚类。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变L234A和L235A。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变P329G。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变L234A、L235A和P329G。
在一个实施方案中，第一和第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG2亚类。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变H268Q、V309L、A330S和P331S。
在一个实施方案中，第一和第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG2亚类。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S。
在一个实施方案中，第一和第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG4亚类。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变S228P和L235EA。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变P329G。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变S228P、L235E和P329G。
在一个实施方案中，第一和第二多肽的免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG4亚类。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变S228P、L234A和L235A。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变P329G。在一个实施方案中，第一多肽和第二多肽各自还包含突变S228P、L234A、L235A和P329G。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是Fc区融合多肽。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是(全长)抗体。
在一个实施方案中，(全长)抗体是单特异性抗体。在一个实施方案中，单特异性抗体是单价单特异性抗体。在一个实施方案中，单特异性抗体是双价单特异性抗体。
在一个实施方案中，(全长)抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是双价双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是四价双特异性抗体。
在一个实施方案中，(全长)抗体是三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是三价三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是四价三特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是通过以下方式治疗患有眼血管疾病的患者的方法：向需要这种治疗的患者施用如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是用于玻璃体内施加的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是用作药物的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是用于治疗眼血管疾病的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是包含如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体和任选地可药用载体的药物制剂。
为了使用靶向在眼中和身体其余部分中存在的抗原/与之结合的抗体，从眼通过血-眼屏障后进入血液的全身性半寿期短是有益的，旨在避免全身性副作用。
另外，如果从眼移出抗体-抗原复合物，则与受体的配体特异性结合的抗体仅在治疗眼疾病时有效，即抗体作为受体配体的转运载体在眼外部发挥作用并且因而抑制受体信号传导。
本发明人已经发现，包含不与人新生儿Fc-受体结合的Fc区的抗体(即，如本文中报道的(二聚体)多肽)跨血-眼屏障转运。这令人惊讶，因为抗体不与人FcRn结合，尽管认为跨血-眼屏障转运需要与FcRn结合。
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中的用途。
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体从眼移除一种或多种可溶性受体配体的用途。
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体治疗眼病、尤其眼血管疾病的用途。
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循环的用途。
如本文中报道的一个方面是用于治疗眼病的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是用于从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是用于从眼移除一种或多种可溶性受体配体的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是用于治疗眼病、尤其眼血管疾病的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是用于从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循中的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是一种治疗患有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体。
如本文中报道的一个方面是一种在个体中从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体以从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中。
如本文中报道的一个方面是一种在个体中从眼移除一种或多种可溶性受体配体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体以从眼移除一种或多种可溶性受体配体。
如本文中报道的一个方面是一种在个体中从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循环中的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体以从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循环中。
如本文中报道的一个方面是一种在个体中从玻璃体内腔或眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的(二聚体)多肽或抗体以从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是双价双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体是四价双特异性抗体。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是三价三特异性抗体。在一个实施方案中，三特异性抗体是四价三特异性抗体。
在一个实施方案中，第一多肽还包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽还包含突变S354C和T366W。
在一个实施方案中，第一多肽还包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽还包含突变Y349C和T366W。
在一个实施方案中
i)第一和第二多肽包含突变H310A,H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽还包含突变L251D,L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽还包含突变L251S,L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A,H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A,H433A和Y436A，或
v)第一多肽还包含突变I253A,H310A和H435A并且第二多肽还包含突变L251D,L314D和L432D，或
vi)第一多肽还包含突变I253A,H310A和H435A并且第二多肽还包含突变L251S,L314S和L432S。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是CrossMab。
在一个实施方案中，(二聚体)多肽是Fc区融合多肽。
在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽属于亚类IgG1。在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽还包含突变L234A和L235A。在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽还包含突变P329G。
在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽属于亚类IgG2。在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽还包含突变V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S。
在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽属于亚类IgG4。在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽还包含突变S228P和L235E。在一个实施方案中，抗体或Fc区融合多肽还包含突变P329G。
附图简述
图1：具有IHH-AAA突变(突变I253A、H310A和H435A的组合(根据Kabat EU索引编号体系编号))的IgG1或IgG4亚类抗VEGF/ANG2抗体的构思示意图和优点。
图2：基于小规模DLS的粘度测量：在150mg/mL的外推粘度在200mM精氨酸/琥珀酸盐缓冲液，pH 5.5中(抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)与参考抗体VEGF/ANG2-0015(没有这类IHH-AAA突变)比较)在150mg/mL的外推粘度。
图3：在20mM组氨酸缓冲液，140mM NaCl，pH 6.0中取决于温度的DLS聚集(包括DLS聚集起始温度)(比较如本文中报道的抗VEGF/ANG2抗体-VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)与参考抗体VEGF/ANG2-0015(没有这类IHH-AAA突变))。
图4：在100mg/mL在40℃储存7日(主峰下降和高分子量(HMW)增加)(比较显示较少聚集的如本文中报道的抗VEGF/ANG2抗体-VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)与参考抗体VEGF/ANG2-0015(没有这类IHH-AAA突变))。
图5A和图5B：FcRn稳态亲和力A：VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)和B：VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)。
图6：没有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0015和具有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0016的FcγRIIIa相互作用测量(二者均是具有P329G LALA突变的IgG1亚类；作为对照，使用IgG1亚类的抗洋地黄毒苷抗体(抗Dig抗体)和基于IgG4的抗体)。
图7A：用于测定血清和全眼裂解物中抗VEGF/ANG2抗体浓度的示意性药代动力学(PK)ELISA分析原理。
图7B：静脉内(i.v.)施加后的血清浓度：没有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0015和具有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0016的比较。
图7C：玻璃体内施加后的血清浓度：没有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0015和具有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0016的比较。
图7D：VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)在右眼和左眼中的眼裂解物浓度(与静脉内施加相比，仅玻璃体内施加入右眼后)：仅可以在玻璃体内施加后于右眼中检测到明显浓度；在静脉内施加后不能在眼裂解物中检出浓度，原因在于VEGF/ANG2-0016((具有IHH-AAA突变)的血清半寿期低。
图7E：可以检测到在右眼和左眼中(与静脉内施加相比，仅玻璃体内施加入右眼后)VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)的眼裂解物浓度：在玻璃体内施加后在右眼中(和一定程度在左眼中)检测到VEGF/ANG2-0015的浓度；这显示从右眼扩散至血清中并从这里扩散至左眼中，这可以由VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)的长半寿期解释；在静脉内施加后还可以在双眼的眼裂解物中检测到明显浓度，原因在于血清稳定的VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)扩散至眼中。
图8：与参考野生型(wt)抗体相比，在其与FcRn结合的能力方面工程化的抗体在SPR分析中显示长体内半寿期(YTE突变)或缩短的体内半寿期(IHH-AAA突变)、增强(YTE突变)或减弱的结合作用(IHH-AAA突变)以及在FcRn柱色谱中显示增强或缩减的保留时间；a)在单次静脉内浓注施加10mg/kg至huFcRn转基因雄性C57BL/6J小鼠+/-276中后的PK数据：野生型IgG以及YTE和IHH-AAA Fc区修饰的IgG的AUC数据；b)BIAcore传感图；c)FcRn亲和柱洗脱；野生型抗IGF-1R抗体(参考)，抗IGF-1R抗体的YTE-突变体、抗IGF-1R抗体的IHH-AAA-突变体。
图9：取决于引入Fc区的突变的数目，FcRn亲和色谱中保留时间的变化。
图10：取决于引入Fc区的突变的非对称分布，FcRn结合作用的变化。
图11：来自两次连续蛋白A亲和色谱柱的在两条重链中具有突变H310A、H433A和Y436A的组合的双特异性抗VEGF/ANG2抗体(VEGF/ANG2-0121)的洗脱色谱图。
图12：来自蛋白A亲和色谱柱的在两条重链中具有突变H310A、H433A和Y436A的抗IGF-1R抗体(IGF-1R-0045)的洗脱色谱图。
图13：IgG Fc区修饰的抗VEGF/ANG-2抗体与CM5芯片上的固定化蛋白A的结合作用。
图14：FcRn亲和柱上不同抗VEGF/ANG2抗体的洗脱色谱图。
图15：不同融合多肽对葡萄球菌蛋白A(SPR)的结合作用。
图16：不同抗VEGF/ANG2抗体和抗IGF-1R抗体突变体与固定化蛋白A(SPR)的结合。
图17：静脉内施加抗体IGF-1R 0033、0035和0045后血清浓度的比较。
图18：玻璃体内和静脉内施加抗体IGF-1R 0033后眼裂解物浓度的比较。
图19：玻璃体内和静脉内施加抗体IGF-1R 0035后眼裂解物浓度的比较。
图20：玻璃体内和静脉内施加抗体IGF-1R 0045后眼裂解物浓度的比较。
本发明实施方案的详细描述
I.定义
术语“约”指下文数值的+/-20％范围。在一个实施方案中，术语“约”指下文数值的+/-10％范围。在一个实施方案中，术语“约”指下文数值的+/-5％范围。
出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架或如下文定义的人共有构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“改变”指亲本抗体或融合多肽(例如至少包含Fc区的FcRn结合部分的融合多肽)中突变(置换)、插入(添加)或缺失一个或多个氨基酸残基以获得修饰的抗体或融合多肽。术语“突变”指特定的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基。例如，突变L234A指抗体Fc区(多肽)中第234位置处的氨基酸残基赖氨酸置换为氨基酸残基丙氨酸(赖氨酸用丙氨酸置换)(根据Kabat EU索引编号体系编号)。
如本文所用，重链和轻链的全部恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))中描述的Kabat编号系统编号并且在本文中称作“根据Kabat编号”。具体而言，Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号体系(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL并且Kabat EU索引编号体系(参见第661-723页)用于(CH1、铰合部、CH2和CH3)的恒定重链结构域。
“天然存在的氨基酸残基”指来自以下的氨基酸残基：丙氨酸(三字母代码：Ala，单字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、和缬氨酸(Val，V)。
术语“氨基酸突变”指至少一个现有的氨基酸残基置换为另一个不同的氨基酸残基(＝替换性氨基酸残基)。替换性氨基酸残基可以是“天然存在氨基酸残基”并且选自丙氨酸(三字母代码：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D-半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。替换性氨基酸残基可以是“非天然存在的氨基酸残基”。参见例如US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO2005/74524，Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.和Schultz,P.G.,ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin,J.W.等人,PICAS United States ofAmerica 99(2002)11020-11024；以及Wang,L.和Schultz,P.G.,Chem.(2002)1-10(全部文献均通过引用的方式完整并入本文)。
术语“氨基酸插入”指在氨基酸序列中预定的位置处(额外)并入至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，插入将是插入一个或两个氨基酸残基。插入的氨基酸残基可以是任何天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。
术语“氨基酸缺失”指在氨基酸序列中的预定位置处移除至少一个氨基酸残基。
如本文所用，术语“ANG-2”指人血管生成素-2(ANG-2)(备选地缩写为：ANGPT2或ANG2)(SEQ ID NO:31)，其例如在Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60和Cheung,A.H.等人,Genomics 48(1998)389-91中描述。发现血管生成素-1(SEQ ID NO:32)和-2作为血管内皮内部选择性表达的酪氨酸激酶家族Tie的配体(Yancopoulos,G.D.等人,Nature 407(2000)242-248)。目前存在4种确定的血管生成素家族成员。血管生成素-3和-4(ANG-3和ANG-4)可以广泛地代表小鼠和人类中相同基因座的多样的对应物(Kim,I.等人,FEBS Let,443(1999)353-356；Kim,I.等人,J.Biol.Chem.274(1999)26523-26528)。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别被鉴定为激动剂和拮抗剂(关于ANG-1，参见：Davis,S.等人,Cell 87(1996)1161-1169；并且关于ANG-2，参见：Maisonpierre,P.C.等人,Science277(1997)55-60)。全部已知的血管生成素主要与Tie2(SEQ ID NO:33)结合，并且ANG-1和-2均以3nM(Kd)亲和力与Tie2结合(Maisonpierre,P.C.等人,Science 277(1997)55-60)。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原-和/或蛋白A和/或FcRn-结合活性。
术语“非对称Fc区”指在根据Kabat EU索引编号体系的相应位置处具有不同氨基酸残基的一对Fc区多肽。
术语“关于FcRn结合作用的非对称Fc区”指由相应位置处具有不同氨基酸残基的两条多肽链组成的Fc区，其中位置根据Kabat EU索引编号体系确定，因而不同位置影响Fc区与人新生儿Fc-受体(FcRn)的结合。出于本文目的，在“关于FcRn结合作用的非对称Fc区”中Fc区的两条多肽链之间的差异不包括已经引入以促进形成异二聚Fc区(例如用于产生双特异性抗体)的差异。这些区别也可以是非对称的，即两条链在根据Kabat EU索引编号体系的非相应氨基酸残基处具有差异。这些差异促进异二聚化并且减少同型二聚化。这类差异的例子是所谓的“结入扣”置换(参见，例如，US7 695 936和US 2003/0078385)。已经发现IgG1亚类的IgG抗体Fc区的单条多肽链中的以下结和扣置换增加异二聚体形成：1)一条链中的Y407T及另一条链中的T366Y；2)一条链中的Y407A及另一条链中的T366W；3)一条链中的F405A及另一条链中的T394W；4)一条链中的F405W及另一条链中的T394S；5)一条链中的Y407T及另一条链中的T366Y；6)一条链中的T366Y和F405A及另一条链中的T394W和Y407T；7)一条链中的T366W和F405W及另一条链中的T394S和Y407A；8)一条链中的F405W和Y407A及另一条链中的T366W和T394S；和9)一条链中的T366W及另一条链中的T366S、L368A和Y407V，其中最后列出的特别合适。此外，在两条个Fc区多肽链之间产生新二硫键的变化促进异二聚体形成(参见，例如，US 2003/0078385)。已经发现产生适当间隔的半胱氨酸残基用于IgG1亚类的IgG抗体Fc区的单条多肽链中形成新链内二硫键的以下置换以增加异二聚体形成：一条链中的Y349C及另一条链中的S354C；一条链中的Y349C及另一条链中的E356C；一条链中的Y349C及另一条链中的E357C；一条链中的L351C及另一条链中的S354C；一条链中的T394C及另一条链中的E397C；或一条链中的D399C及另一条链中的K392C。促进异二聚化的氨基酸变化的其他例子是所谓的“电荷对置换”(参见，例如，WO 2009/089004)。已经发现IgG1亚类的IgG抗体Fc区的单条多肽链中的以下电荷对置换增加异二聚体形成：1)一条链中的K409D或K409E及另一条链中的D399K或D399R；2)一条链中的K392D或K392E及另一条链中的D399K或D399R；3)一条链中的K439D或K439E及另一条链中的E356K或E356R；4)一条链中的K370D或K370E及另一条链中的E357K或E357R；5)一条链中的K409D和K360D加另一条链中的D399K和E356K；6)一条链中的K409D和K370D加另一条链中D399K和E357K；7)一条链中的K409D和K392D加D399K、E356K及另一条链中的E357K；8)一条链中的K409D和K392D及另一条链中的D399K；9)一条链中的K409D和K392D及另一条链中的D399K和E356K；10)一条链中的K409D和K392D及另一条链中的D399K和D357K；11)一条链中的K409D和K370D及另一条链中的D399K和D357K；12)一条链中的D399K及另一条链中的K409D和K360D；和13)一条链中的K409D和K439D及另一条链上的D399K和E356K。
术语“(与抗原)结合”指在体外测定法中、在一个实施方案中在其中抗体与表面结合并通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原与抗体结合的结合测定法中抗体与其抗原的结合。结合意指结合10-8M或更小、在一些实施方案中10-13至10-8M、在一些实施方案中10-13至10-9M的亲和力(KD)。
可以通过BIAcore测定法(GE Healthcare Biosensor AB，乌普萨拉，瑞典)研究结合作用。结合作用的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。
术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
术语“CH2结构域”指抗体重链多肽的从EU位置231延伸至EU位置340的部分(根据Kabat的EU编号体系)。在一个实施方案中，CH2结构域具有SEQ ID NO:09的氨基酸序列：APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ ESTYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK。
术语“CH3结构域”指抗体重链多肽的从EU位置341延伸至EU位置446的部分。在一个实施方案中，CH3结构域具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列：GQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPG。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“可比较长度”指两种多肽包含相同数目的氨基酸残基或可以在长度上因一个或多个和直至最多10个氨基酸残基而不同。在一个实施方案中，(Fc区)多肽包含相同数目的氨基酸残基或可以因1至10个氨基酸残基而不同。在一个实施方案中，(Fc区)多肽包含相同数目的氨基酸残基或可以因1至5个氨基酸残基而不同。在一个实施方案中，(Fc区)多肽包含相同数目的氨基酸残基或可以因1至3个氨基酸残基而不同。
“效应子功能”指随抗体类别变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；和B-细胞活化。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和持续实现前述结果所需要的时间段。
术语“Fc-融合多肽”指结合结构域(例如抗原结合结构域如单链抗体，或多肽如受体的配体)与显示所需靶结合活性、蛋白A结合活性和FcRn-结合活性的抗体Fc区的融合物。
术语“人源Fc区”指人源免疫球蛋白的C端区域重链，其至少含有一部分的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。在一个实施方案中，Fc区具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。
术语“FcRn”指人新生儿Fc-受体。FcRn起到挽救来自溶酶体降解途径的IgG的作用，导致清除率减少和半寿期增加。FcRn是由两条多肽：50kDa主要组织相容性复合体样蛋白I类(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)组成的异二聚体蛋白。FcRn以高亲和力与IgG的Fc区的CH2-CH3部分结合。在IgG和FcRn之间的相互作用严格依赖pH并且以1:2化学计量发生，即一个IgG通过其两条重链与两个FcRn分子结合(Huber,A.H.等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn结合作用在内体中酸性pH(pH<6.5)发生并且IgG在中性细胞表面(pH约7.4)释放。这种相互作用的pH敏感性质促进FcRn介导保护胞饮入细胞的IgG通过在内体酸性环境内部与受体结合而免遭胞内降解。FcRn随后促进IgG再循环到细胞表面并随后在FcRn-IgG复合物暴露于细胞外部中性pH环境时释放入血流。
术语“Fc区的FcRn结合部分”指抗体重链多肽的部分，所述部分从大约EU位置243延伸至EU位置261，并且从大约EU位置275延伸至EU位置293，并且从大约EU位置302延伸至EU位置319，并且从大约EU位置336延伸至EU位置348，并且从大约EU位置367延伸至EU位置393及EU位置408，并且从大约EU位置424延伸至EU位置440。在一个实施方案中，改变根据Kabat EU编号的以下一个或多个氨基酸残基F243,P244,P245P,K246,P247,K248,D249,T250,L251,M252,I253,S254,R255,T256,P257,E258,V259,T260,C261,F275,N276,W277,Y278,V279,D280,V282,E283,V284,H285,N286,A287,K288,T289,K290,P291,R292,E293,V302,V303,S304,V305,L306,T307,V308,L309,H310,Q311,D312,W313,L314,N315,G316,K317,E318,Y319,I336,S337,K338,A339,K340,G341,Q342,P343,R344,E345,P346,Q347,V348,C367,V369,F372,Y373,P374,S375,D376,I377,A378,V379,E380,W381,E382,S383,N384,G385,Q386,P387,E388,N389,Y391,T393,S408,S424,C425,S426,V427,M428,H429,E430,A431,L432,H433,N434,H435,Y436,T437,Q438,K439和S440(EU编号)。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”指这样的抗体，所述抗体具有基本上与包含四条多肽的天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。全长抗体可以包含其他结构域，例如与全长抗体的一个条或多条链缀合的scFv或scFab。这些缀合物也由术语全长抗体涵盖。
术语“二聚体多肽”指包含共价结合的至少两条多肽的复合物。该复合物可以包含其他多肽，所述其他多肽也与其余多肽共价或非共价结合。在一个实施方案中，二聚体多肽包含两条或四条多肽。
术语“异二聚体”或“异二聚的”指包含两条多肽的分子(例如具有可比较长度)，其中这两条多肽具有这样的氨基酸序列，其在相应位置具有至少一个不同的氨基酸残基，其中相应位置根据Kabat EU索引编号体系确定。
术语“同型二聚体”和“同型二聚的”指包含具有可比较长度的两条多肽的分子，其中这两条多肽具有在相应位置相同的氨基酸序列，其中根据Kabat EU索引编号体系确定。
如本文中报道的二聚体多肽可以是同型二聚的或异二聚的，这相对于关注的突变或特性而决定。例如，相对于FcRn和/或蛋白A结合作用(即关注特性)，二聚体多肽就突变H310A、H433A和Y436A而言是同型二聚的(即二聚体多肽的两条多肽均包含这些突变)(就二聚体多肽的FcRn和/或蛋白A结合特性而言关注这些突变)，但同时分别就突变Y349C、T366S、L368A和Y407V而言(不关注这些突变，因为这些突变涉及二聚体多肽异二聚化而不涉及FcRn/蛋白A结合特性)以及就突变S354C和T366W而言(第一组仅含于第一多肽中，而第二组仅含于第二多肽中)是异二聚的。进一步例如，如本文中报道的二聚体多肽可以就突变I253A、H310A、H433A、H435A和Y436A而言是异二聚的(即这些突变均涉及二聚体多肽的FcRn和/或蛋白A结合特性)，即一条多肽包含突变I253A，H310A和H435A，而另一条多肽包含突变H310A、H433A和Y436A。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物活性。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
术语“衍生自”指氨基酸序列通过在至少一个位置改变引入衍生自母氨基酸序列。因此，衍生的氨基酸序列在至少一个相应位置(根据抗体Fc区的Kabat EU索引)处与相应的母氨基酸序列不同。在一个实施方案中，衍生自母氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至15个氨基酸残基。在一个实施方案中，衍生自母氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至10个氨基酸残基。在一个实施方案中，衍生自母氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至6个氨基酸残基。同样地，衍生的氨基酸序列与其母氨基酸序列具有高氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自母氨基酸序列的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自母氨基酸序列的氨基酸序列具有90％或更大的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自母氨基酸序列的氨基酸序列具有95％或更大的氨基酸序列同一性。
术语“人Fc区多肽”指与“天然”或“野生型”人Fc区多肽相同的氨基酸序列。术语“变异(人)Fc区多肽”指因至少一个“氨基酸改变”而衍生自“天然”或“野生型”Fc区氨基酸序列的氨基酸序列。“人Fc区”由两条人Fc区多肽组成。“变异(人)Fc区”由两条Fc区多肽组成，因而二者可以均是变异(人)Fc区多肽或一个是人Fc区多肽并且另一个是变异(人)Fc区多肽。
在一个实施方案中，人Fc区多肽具有SEQ ID NO:60的人IgG1 Fc区多肽的氨基酸序列、或SEQ ID NO:61的人IgG2Fc区多肽的氨基酸序列或SEQ ID NO:63的人IgG4 Fc区的多肽氨基酸序列，所述氨基酸序列具有如本文中报道的突变。在一个实施方案中，变异(人)Fc区多肽衍生自SEQ ID NO:60、或61、或63的Fc区多肽并且与SEQ ID NO:60、或61、或63的Fc区多肽相比具有至少一个氨基酸突变。在一个实施方案中，变异(人)Fc区多肽包含/具有从约1个至约10个氨基酸突变，并在一个实施方案中具有约1个至约5个氨基酸突变。在一个实施方案中，变异(人)Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:60、或62、或63具有至少约80％同源性。在一个实施方案中，变异(人)Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:60、或61、或63具有至少约90％同源性。在一个实施方案中，变异(人)Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:60、或62、或63具有至少约95％同源性。
从SEQ ID NO:60、或61、或63的人Fc区多肽衍生的变异(人)Fc区多肽由所含的氨基酸改变限定。因此，例如，术语P329G指从相对于SEQ ID NO:60、或61、或63的人Fc区多肽在氨基酸位置329具有脯氨酸至甘氨酸突变的人Fc区多肽衍生的变异(人)Fc区多肽。
本发明中讨论的全部位置，根据Kabat EU索引编号体系编号。
人IgG1 Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:60)。
人IgG1 Fc区衍生的具有突变L234A、L235A的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:64)。
人IgG1 Fc区衍生的具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:65)。
人IgG1 Fc区衍生的具有S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:66)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:67)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:68)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:69)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A突变和P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:70)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P239G突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:71)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:72)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:73)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A、P329G突变和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:74)。
人IgG4 Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:63)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P和L235E突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:75)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E突变和P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:76)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:77)。
人IgG4 Fc区衍生的具有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:78)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:79)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:80)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:81)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P239G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:82)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:83)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:84)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E、P329G和S354C、T366W突变的Fc区多肽具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:85)。
下文显示不同人Fc区的比对结果(Kabat EU索引编号体系)：
Figure BDA0001049029040000291
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)并且形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。如本文中提到的HVR包括
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat EU索引编号体系(Kabat等人,上文)编号。
如本文所用，术语“IGF-1R”指来自任何脊椎动物来源的任何天然IGF-1R，其中除非另外说明，否则所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如，人类)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。术语涵盖“全长”、未加工的IGF-1R以及因细胞中加工而产生的任何形式的IGF-1R。本术语还涵盖天然存在的IGF-1R变体，例如，剪接变体或等位变体。人IGF-1R的氨基酸序列在SEQ ID NO:11显示。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，大小排阻层析、离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗IGF-1R抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或分别的载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”指具有不定结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用的术语“肽接头”指具有氨基酸序列的肽，所述肽在一个实施方案中是合成来源的。肽接头在一个实施方案中是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，在一个实施方案中是具有32至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，肽接头是具有32至40个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，肽接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10)或(x＝4并且n＝6、7或8)，在一个实施方案中，其中x＝4，n＝6或7，在一个实施方案中，x＝4，n＝7。在一个实施方案中，肽接头是(G4S)6G2。
如本文所用，术语“重组抗体”指通过重组手段制备、表达、产生或分离的全部抗体(嵌合、人源化和人抗体)。这包括从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从相对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或使用转染至宿主细胞中的重组表达载体所表达的抗体。此类重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。重组抗体可以经历体内体细胞超变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管源自人种系VH和VL序列并且与之相关，但可以是不天然存在于体内人抗体种系库内部的序列。
如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，如本文中报道的抗体或Fc区融合多肽用来延缓疾病的形成或用来减慢疾病的进展。
如本申请中所用，术语“价态”指(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。就这一点而论，术语“双价”、“四价”和“六价”指(抗体)分子中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。在一个优选的实施方案中，如本文中报道的双特异性抗体是“双价的”。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与使抗体结合其抗原的结构域。抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如Kindt,T.J.等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库(参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。
术语“眼血管疾病”包括但不限于眼内新生血管综合征如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、视网膜静脉闭塞、视网膜中央静脉闭塞、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张症、缺血性视网膜病变、虹膜新血管化、眼内新血管化、角膜血管新生、视网膜血管新生、脉络膜血管新生和视网膜变性(参见例如Garner,A.,Vascular diseases,引自：Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.和Klintworth,G.K.,(编著),第2版,Marcel Dekker,New York(1994),第1625-1710页)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
如本文所用的术语“VEGF”指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)，165氨基酸人血管内皮细胞生长因子(人VEGF165的前体序列的氨基酸27-191：SEQ ID NO:30；氨基酸1-26代表信号肽)，和相关121、189和206血管内皮细胞生长因子同工型，如Leung,D.W.等人,Science 246(1989)1306-1309；Houck等人,Mol.Endocrin.5(1991)1806-1814；Keck,P.J.等人,Science 246(1989)1309-1312和Connolly,D.T.等人,J.Biol.Chem.264(1989)20017-20024所描述；连同这些生长因子的天然存在的等位和加工形式。VEGF参与调节与肿瘤和眼内病症相关的正常和异常血管生成及新血管化(Ferrara,N.等人,Endocrin.Rev.18(1997)4-25；Berkman,R.A.等人,J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown,L.F.等人,Human Pathol.26(1995)86-91；Brown,L.F.等人,Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern,J.等人,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；和Dvorak,H.F.等人,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是已经从几种来源分离并且包括几种同工型的同型二聚的糖蛋白。VEGF对内皮细胞显示高度特异的促有丝分裂活性。
如本文所用的术语“具有突变IHH-AAA”指IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中突变I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)和H435A(His435Ala)的组合，并且如本文所用的术语“具有突变HHY-AAA”指IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中突变H310A(His310Ala)、H433A(His433Ala)和Y436A(Tyr436Ala)的组合，并且如本文所用的术语“具有突变YTE”指IgG1或IgG4亚类的恒定重链区中突变M252Y(Met252Tyr)、S254T(Ser254Thr)和T256E(Thr256Glu)的组合，其中根据Kabat EU索引编号体系编号。
如本文所用的术语“具有突变P329G LALA”指IgG1亚类的恒定重链区中突变L234A(Leu235Ala)、L235A(Leu234Ala)和P329G(Pro329Gly)的组合，其中根据Kabat EU索引编号体系编号。如本文所用的术语“具有突变SPLE”指IgG4亚类的恒定重链区中突变S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)的组合，其中根据Kabat EU索引编号体系编号。如本文所用的术语“具有突变SPLE和P329G”指IgG4亚类的恒定重链区中突变S228P(Ser228Pro)、L235E(Leu235Glu)和P329G(Pro329Gly)的组合，其中根据Kabat EU索引编号体系编号。
II.组合物和方法
在一个方面，本发明部分地基于以下发现：在Fc区的一条或二条Fc区多肽中引入突变Y436A可以增加Fc区与葡萄球菌蛋白A的结合。
在一个方面，本发明部分地基于以下发现：影响免疫球蛋白Fc区与新生儿Fc-受体(FcRn)结合(即减少或甚至消除Fc区与FcRn结合)的特定突变或突变组合并未同时消除Fc区与葡萄球菌蛋白A的结合。这对可以使用的纯化过程产生深远影响，因为例如要求非特异性和种类限制性亲和色谱材料，例如，仅与包含κ轻链的抗体结合的KappaSelect。因此，采用如本文中报道的突变组合，可能同时减少或甚至消除与FcRn结合，同时维持与葡萄球菌蛋白A的结合。
在一个方面，本发明部分地基于以下发现：通过在异二聚体分子(例如双特异性抗体)的每条重链的Fc区中使用不同突变，可以在一方面提供减少或甚至消除与FcRn的结合，但是在另一方面维持与葡萄球菌蛋白A结合的能力。与葡萄球菌蛋白A的这种结合作用可以用来分离异二聚体分子与同型二聚体副产物。例如通过使用结入扣法，将一个重链Fc区中的突变I253A、H310A和H435A与另一个重链Fc区中的突变H310A、H433A和Y436A组合，可以获得异二聚Fc区，所述异二聚Fc区在一方面不与FcRn结合(两组突变相对于人FcRn是沉默的)，但是维持与葡萄球菌蛋白A的结合(具有突变I253A、H310A和H435A的重链Fc区不与FcRn结合并且不与葡萄球菌蛋白A结合，而具有突变H310A、H433A和Y436A的重链Fc区不与FcRn结合，但是仍然与葡萄球菌蛋白A结合)。因此，标准蛋白A亲和色谱可以用来除去同型二聚扣-扣副产物，因为这种副产物不再与葡萄球菌蛋白A结合。因此，通过结入扣法将扣链中的突变I253A、H310A和H435A和结链中的突变H310A、H433A和Y436A组合，可以促进异二聚结入扣产物与同型二聚扣-扣副产物的纯化/分离。
在一个方面，本发明部分地基于以下发现：无FcRn结合作用的玻璃体内施加用抗体是有益的，因为这些抗体可以跨过血-视网膜屏障，在眼中没有大幅度延长或缩短的半寿期并且从血液循环快速清除，导致在眼以外无全身性副作用或全身性副作用非常有限。本发明的抗体例如可用于诊断或治疗眼血管疾病。
本发明至少部分地基于以下发现：通过在异二聚体分子(例如双特异性抗体)的Fc区的每条Fc区多肽中使用不同突变，可以提供具有定制的FcRn结合作用并且因而可以提供具有定制全身性半寿期的抗体。
突变I253A、H310A、H435A、或L251D、L314D、L432D、或L251S、L314S、L432S的组合导致蛋白A结合作用丧失，而突变I253A、H310A、H435A、或H310A、H433A、Y436A、或L251D、L314D、L432D的组合导致人新生儿Fc受体的结合作用丧失。
以下表展示存在Fc区中参与相互作用或已经被改变以调节相互作用的氨基酸残基的示例性概览。
Figure BDA0001049029040000391
Figure BDA0001049029040000401
Figure BDA0001049029040000411
可以与突变Y436A组合使用的如本文中报道的修饰改变对一种或多种Fc受体如人FcRn的结合特异性。同时，改变与人FcRn结合的一些突变还改变与葡萄球菌蛋白A的结合。可以通过使用额外的突变Y436A，减弱或甚至克服与葡萄球菌蛋白A结合作用的这种减少。
在一个实施方案中，与缺少这种突变组合的相应二聚体多肽相比，如本文中报道的突变组合改变或基本上改变二聚体多肽的血清半寿期。在一个实施方案中，与缺少这种突变组合的相应二聚体多肽相比，这突变组合还未改变或基本上未改变二聚体多肽与葡萄球菌蛋白A的结合作用。
A.新生儿Fc-受体(FcRn)
新生儿Fc-受体(FcRn)对IgG类抗体体内的代谢命运重要。FcRn起到挽救来自溶酶体降解途径的野生型IgG的作用，导致清除率减少和半寿期增加。它是由两条多肽：50kDa主要组织相容性复合体样蛋白I类(α-FcRn)和15kDaβ2-微球蛋白(β2m)组成的异二聚体蛋白。FcRn以高亲和力与IgG类抗体的Fc区的CH2-CH3部分结合。IgG类抗体和FcRn之间的相互作用依赖pH并且以1:2化学计量发生，即一个IgG抗体分子可以通过其两条重链Fc区多肽与两个FcRn分子相互作用(参见，例如Huber,A.H.等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。
因此，IgG体外FcRn结合特性/特征指示其在血液循环中的体内药代动力学特性。
重链CH2结构域和CH3结构域的不同氨基酸残基参与FcRn和IgG类抗体Fc区之间的相互作用。与FcRn相互作用的氨基酸残基位于大约EU位置243和EU位置261之间、大约EU位置275和EU位置293之间、大约EU位置302和EU位置319之间、大约EU位置336和EU位置348之间、大约EU位置367和EU位置393、位于EU位置408处以及大约EU位置424和EU位置440之间。更具体地，根据Kabat EU编号的以下氨基酸残基参与Fc区和FcRn之间的相互作用：F243,P244,P245P,K246,P247,K248,D249,T250,L251,M252,I253,S254,R255,T256,P257,E258,V259,T260,C261,F275,N276,W277,Y278,V279,D280,V282,E283,V284,H285,N286,A287,K288,T289,K290,P291,R292,E293,V302,V303,S304,V305,L306,T307,V308,L309,H310,Q311,D312,W313,L314,N315,G316,K317,E318,Y319,I336,S337,K338,A339,K340,G341,Q342,P343,R344,E345,P346,Q347,V348,C367,V369,F372,Y373,P374,S375,D376,I377,A378,V379,E380,W381,E382,S383,N384,G385,Q386,P387,E388,N389,Y391,T393,S408,S424,C425,S426,V427,M428,H429,E430,A431,L432,H433,N434,H435,Y436,T437,Q438,K439和S440。
位点定向诱变研究已经证明IgG的Fc区中FcRn的关键结合位点是组氨酸310、组氨酸435和异亮氨酸253并且程度更低地是组氨酸433和酪氨酸436(参见例如Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825；Raghavan,M.等人,Biochem.34(1995)14649-14657；Medesan,C.等人,J.Immunol.158(1997)2211-2217)。
增加IgG与FcRn结合的方法已经通过在以下各种氨基酸残基处突变IgG来实施：苏氨酸250、甲硫氨酸252、丝氨酸254、苏氨酸256、苏氨酸307、谷氨酸380、甲硫氨酸428、组氨酸433和天冬酰胺434(参见Kuo,T.T.等人,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789)。
在一些情况下需要在血液循环中半寿期降低的抗体。例如，玻璃体内施加的药物应当在眼部中具有长半寿期并且在患者血液循环中具有短半寿期。这类抗体还具有疾病部位如眼中暴露增加的优点。
影响FcRn结合并且影响血液循环中半寿期的不同突变是已知的。已经通过位点定向诱变鉴定了对小鼠Fc区-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua,W.F.等人,J.Immunol 169(2002)5171-5180)。残基I253、H310、H433、N434和H435(根据Kabat的EU编号)参与这种相互作用(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542-548))。发现残基I253、H310和H435对人Fc与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2855)。通过蛋白质-蛋白质相互作用研究，Dall’Acqua等人已经描述残基M252Y、S254T、T256E改善FcRn结合(Dall'Acqua,W.F.等人,J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。人Fc-人FcRn复合物的研究已经显示残基I253、S254、H435和Y436对这种相互作用至关重要(Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung，Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中，已经报道并研究了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。下表中列出示例性突变和它们对FcRn结合作用的影响。
表
Figure BDA0001049029040000431
Figure BDA0001049029040000441
Figure BDA0001049029040000451
Figure BDA0001049029040000471
Figure BDA0001049029040000481
已经发现在一条Fc区多肽中一侧的一个突变足以显著削弱结合作用。Fc区中引入更多突变，则与FcRn的结合作用变得越弱。但是单侧非对称突变不足以完全抑制FcRn结合作用。在双侧上的突变是完全抑制FcRn结合作用必需的。
下表中显示IgG1 Fc区的对称工程化影响FcRn结合作用的结果(突变和FcRn-亲和色谱柱上保留时间的对比)。
表
Figure BDA0001049029040000491
低于3分钟的保留时间对应于不结合，因为物质处于通流中(空隙峰)。
单突变H310A是消除任何FcRn结合作用的最沉默对称突变。
对称单突变I253A和H435A导致保留时间相对偏移0.3-0.4分钟。这可以通常视为不可检测的结合作用。
单突变Y436A导致可检测的与FcRn亲和柱的相互作用强度。在不受这个理论约束的情况下，这种突变可能在体外影响FcRn介导的半寿期，这一点可以与零相互作用如I253A、H310A和H435A突变组合(IHH-AAA突变)不同。
下表中展示用对称修饰的抗HER2抗体获得的结果(关于参考，参见WO2006/031370)。
表
突变 保留时间[分钟]
I253H 不结合
M252D 不结合
S254D 不结合
R255D 41.4
M252H 43.6
K288E 45.2
L309H 45.5
E258H 45.6
T256H 46.0
K290H 46.2
D98E 46.2
野生型 46.3
K317H 46.3
Q311H 46.3
E430H 46.4
T307H 47.0
N434H 52.0
在Fc区中引入影响FcRn结合作用的非对称突变的作用已经用双特异性抗体例举，其中所述抗体使用结入扣技术装配(参见例如US7,695,936、US2003/0078385；"扣链”突变：S354C/T366W，"结链”突变：Y349C/T366S/L368A/Y407V)。非对称引入的突变对FcRn结合作用的影响可以使用FcRn亲和层析法容易地确定(参见图9和下表)。从FcRn亲和柱洗脱稍晚，即在FcRn亲和柱上具有较长保留时间的抗体具有较长的体内半寿期，并且反之亦然。
表
Figure BDA0001049029040000511
在Fc区中引入影响FcRn结合作用的非对称突变的作用已经进一步用单特异性抗IGF-1R抗体例举，其中所述抗体使用结入扣技术装配以允许非对称突变的引入(参见例如US7,695,936，US2003/0078385；"扣链”突变：S354C/T366W，"结链”突变：Y349C/T366S/L368A/Y407V)。非对称引入的突变对FcRn结合作用的影响可以使用FcRn亲和色谱法容易地确定(参见下表)。从FcRn亲和柱洗脱稍晚，即在FcRn亲和柱上具有较长保留时间的抗体具有较长的体内半寿期，并且反之亦然。
表
Figure BDA0001049029040000512
Figure BDA0001049029040000521
非对称IHH-AAA-和LLL-DDD突变(LLL-DDD突变＝突变L251D、L314D和L432D的组合)显示比相应亲本或野生型抗体更弱的结合作用。
对称HHY-AAA突变(＝突变H310A、H433A和Y436A的组合)产生不再与人FcRn结合，同时蛋白A结合作用维持的Fc区(参见图11、12、13和14)。
在Fc区中引入影响FcRn结合作用的非对称突变的作用已经用单特异性抗IGF-1R抗体(IGF-1R)、双特异性抗VEGF/ANG2抗体(VEGF/ANG2)和与两条重链的C末端融合的全长抗体(融合物)例举，其中所述抗体使用结入扣技术装配以允许引入非对称突变(参见例如US7,695,936、US2003/0078385；"扣链”突变：S354C/T366W，"结链”突变：Y349C/T366S/L368A/Y407V)。引入的突变对FcRn结合作用和蛋白A结合作用的影响可以使用FcRn亲和色谱法、蛋白A亲和色谱法和基于SPR的方法容易地确定(参见下表)。
Figure BDA0001049029040000522
Figure BDA0001049029040000531
Figure BDA0001049029040000541
Figure BDA0001049029040000551
如本文中报道的一个方面是如本文中报道的包含变异人IgG类Fc区的抗体或Fc区融合多肽。
当在Fc区融合多肽或全长抗体中包含时，如本文中报道的Fc区(二聚体多肽)赋予分子上述特征。融合配偶体可以是具有生物活性的任何分子，其中应当减少或增加所述分子的体内半寿期，即应当针对所述分子的预期应用明确限定或定制其体内半寿期。
Fc区融合多肽可以例如包含如本文中报道的变异(人)IgG类Fc区和与靶(包括配体)结合的受体蛋白，如，例如TNFR-Fc区融合多肽(TNFR＝人肿瘤坏死因子受体)、或IL-1R-Fc区融合多肽(IL-1R＝人白介素-1受体)、或VEGFR-Fc区融合多肽(VEGFR＝人血管内皮生长因子受体)、或ANG2R-Fc区融合多肽(ANG2R＝人血管生成素2受体)。
Fc区融合多肽可以包含例如本文中报道的变异(人)IgG类Fc区和与靶结合的抗体片段，包括例如抗体Fab片段，scFv(参见例如Nat.Biotechnol.23(2005)1126-1136)，或结构域抗体(dAb)(参见例如WO 2004/058821、WO 2003/002609)。
Fc区融合多肽可以例如包含如本文中报道的变异(人)人IgG类Fc区和(天然存在或人工的)受体配体。
抗体，例如全长抗体或CrossMabs，可以包含如本文中报道的变异(人)人IgG类Fc区。
B.眼血管疾病
眼血管疾病是以新血管向眼组织结构(如视网膜或角膜)内改变或失调的增殖和侵入为特征的任何病理状况。
在一个实施方案中，眼血管疾病是选自湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、囊样黄斑水肿(CME)、非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)、增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)、囊样黄斑水肿、血管炎(例如视网膜中央静脉闭塞)、视盘水肿、视网膜炎、结膜炎、葡萄膜炎、脉络膜炎、多灶性脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、眼睑炎、干眼(Sjogren’s疾病)和其中眼疾病或病症与眼部血管新生、血管泄漏、和/或视网膜水肿相关的其他眼科疾病。
包含如本文中报道的二聚体多肽的抗体可用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、CME、DME、NPDR、PDR、眼睑炎、干眼和葡萄膜炎，在一个优选的实施方案中可用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、眼睑炎和干眼，并且在一个优选的实施方案中还可用于预防和治疗CME、DME、NPDR和PDR，并且在一个优选的实施方案中还可用于预防和治疗眼睑炎和干眼、尤其湿性AMD和干性AMD、以及还特别地可用于预防和治疗湿性AMD。
在一些实施方案中，眼血管疾病选自湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。
与角膜血管新生相关的其他疾病包括但不限于流行性角结膜炎、维生素A缺乏症、隐形眼镜过度疲劳、异位性角膜炎、上方角膜缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、Sjogren’s疾病、酒渣鼻性痤疮、小泡性角膜炎(phylectenulosis)、梅毒、分枝杆菌(Mycobacteria)感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波齐肉瘤、Mooren溃疡、边缘性角膜变性、边缘性角质层分离(mariginalkeratolysis)、类风湿性关节炎、全身性狼疮、多动脉炎、创伤、Wegener肉样瘤病、巩膜炎、Steven's Johnson疾病、放射状角膜切开术和角膜移植物排异。
与视网膜/脉络膜血管新生相关的疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰状细胞性贫血、结节病、梅毒、弹性假黄色瘤、Paget病、静脉闭塞、动脉闭塞、颈动脉的阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、结核分枝杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、视网膜色素变性、视网膜水肿(包含ing黄斑水肿)、Eale病、Bechet病、造成视网膜炎或脉络膜炎的感染、眼假组织胞浆菌病、Best病、近视、视盘凹(optic pits)、Stargart病、扁平部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综合征、弓形虫病、创伤和激光后并发症。
其他疾病包括但不限于与虹膜红变(角部新血管化(neovascularization of theangle))相关的疾病和由纤维血管组织或纤维组织异常增殖(包括全部形式的增生性玻璃体视网膜病变)引起的疾病。
早产儿视网膜病变(ROP)是侵袭早产婴儿的眼疾病。认为它由可以导致瘢痕化和视网膜脱离的视网膜血管杂乱生长引起。ROP可以是轻微的并且可以自发地消散，但是在严重病例中可以导致失明。因而，全部早产婴儿均面临ROP风险，并且出生体重极低是额外的风险因素。氧毒性和相对缺氧均可以促成ROP形成。
黄斑变性是主要存在于老年成人中的医学疾病，其中眼内衬的中心(称作视网膜黄斑区域)出现变薄、萎缩和在一些情况下出血。这可以导致中心视力减退，这导致不能看到精细细节、不能阅读或不能识别面部。根据美国眼科学学会，它是如今美国年逾50岁人群内中心视力减退(失明)的主导原因。虽然侵袭更年轻个体的一些黄斑营养障碍有时称作黄斑变性，但是本术语通常指年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)。
年龄相关性黄斑变性始于视网膜色素上皮和下部脉络膜之间黄斑(提供精细中心视力的视网膜中心区域，称作中心凹)中的特征性黄色沉积物，称作玻璃膜疣。出现这些早期变化(称作年龄相关性黄斑病变)的大部分人具有良好视力。具有玻璃膜疣的人可以继续发展成晚期AMD。当玻璃膜疣大和数量多并且与黄斑下色素细胞层中的紊乱相关时，风险明显较高。大而软的玻璃膜疣与增多的胆固醇沉积物有关并且可以响应于降胆固醇药物或Rheo手术。
晚期AMD，造成重大视力减退，具有两个形式：干性和湿性。中心地图样萎缩，晚期AMD的干性形式，因视网膜下方视网膜色素上皮层萎缩所致，所述萎缩因眼中心部分的光受体(视杆细胞和视锥细胞)损失造成视力丧失。尽管无治疗可用于这种病状，美国国家眼科研究所和其他机构已经显示，维生素补充物联用大剂量抗氧化剂、叶黄素和玉米黄素减缓干性黄斑变性进展和在一些患者中改善视力。
视网膜色素变性(RP)是一组遗传性眼病。在RP的症状进展时，夜盲通常先于管状视达数年或甚至数十年。许多患有RP的人直至40岁阶段或50岁阶段才变成法律上的失明并且终生保留一些视力。其他人因RP完全失明，在一些情况下早至儿童期失明。RP的进展在每个病例中均不同。RP是一种类型的遗传性视网膜营养不良，这是一组光受体(视杆细胞和视锥细胞)或视网膜色素上皮(RPE)的异常导致进行性视力减退的遗传疾病。受累个体首先出现缺陷性暗适应或夜盲(夜盲)，随后外周视野收缩(称作管状视)和有时在病程后出现中心视力减退。
当体液和蛋白质沉积物聚集在眼黄斑(视网膜的黄色中心区域)上或其下，造成它增厚和肿胀时，黄斑水肿出现。肿胀可以扭曲人的中心视力，因为黄斑接近眼球背部处视网膜的中心。这个区域容纳紧密堆积的视锥细胞，所述视锥细胞提供锐利、清晰中心视力以使得人看到与视线完全对齐的形式、颜色和细节。囊样黄斑水肿是包括囊肿形成的一个黄斑水肿类型。
C.用葡萄球菌蛋白A亲和色谱柱纯化抗体
在一个方面，提供包含以下多肽的二聚体多肽
第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，
其中第一多肽、第二多肽或者第一和第二多肽包含突变Y436A(根据Kabat EU索引编号体系编号)。
这种二聚体多肽具有因突变所致的特性：改进的葡萄球菌蛋白A结合作用。
因此，可以通过使用常规的蛋白A亲和材料，如MabSelectSure，纯化这些抗体，即与不想要的副产物分离。不要求使用高度复杂的但种类限制性亲和材料，如例如仅可用于包含κ亚类轻链的抗体的KappaSelect。另外，如果修饰/交换轻链亚类，则不要求采用纯化方法(分别参见图11和图12)。
如本文中报道的一个方面是一种用于产生如本文中报道的二聚体多肽的方法，所述方法包括以下步骤
a)培育哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含编码如本文中报道的二聚体多肽的一种或多种核酸，
b)从培养基回收二聚体多肽，和
c)用蛋白A亲和色谱纯化二聚体多肽并且因而产生二聚体多肽。
如本文中报道的一个方面是使用突变Y436A增加二聚体Fc区多肽与蛋白A的结合。
已经发现通过引入突变Y436A，可以增加可以与葡萄球菌蛋白A(SPA)的结合。如果引入减少与SPA结合的额外突变，例如I253A和H310A或H310A和H435A，则这是有利的(参见图15)。
通过重组手段产生如本文中报道的二聚体多肽。因此，本发明的一个方面是编码如本文中报道的二聚体多肽的核酸并且又一个方面是包含核酸的细胞，所述核酸编码如本文中报道的二聚体多肽。用于重组产生的方法是本领域广泛已知并且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白质表达，以及后续分离二聚体多肽并通常纯化至可药用的纯度。为了在宿主细胞中表达如前述的二聚体多肽，通过标准方法，将编码相应第一和第二多肽的核酸插入表达载体中。表达在适宜的原核或真核宿主细胞中进行，如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞，并且从细胞(培养上清液或裂解后的细胞)回收二聚体多肽。
用于重组产生抗体的一般方法是现有技术中熟知的并且例如在以下综述文章中描述：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人,ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
因此如本文中报道的一个方面是一种用于产生如本文中报道的二聚体多肽的方法，所述方法包括步骤
a)用一种或多种载体转化宿主细胞，所述载体包含编码如本文中报道的二聚体多肽的核酸分子，
b)在允许合成二聚体多肽的条件下培养宿主细胞，和
c)从培养物回收二聚体多肽并且因而产生二聚体多肽。
在一个实施方案中，c)下的回收步骤包括使用免疫球蛋白Fc区特异性捕获试剂。在一个实施方案中，这种Fc区特异性捕获试剂以结合-洗脱模式使用。这类Fc区特异性捕获试剂的例子例如是基于葡萄球菌蛋白A的亲和色谱柱，所述亲和色谱柱基于大规模时允许高流速和低回压的高刚性琼脂糖基础基质。它们的特征是与二聚体多肽即其Fc区结合的配体。配体借助亲水性长间隔臂与基质连接以使它轻易可用于与靶分子结合。
通过常规的免疫球蛋白纯化方法例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳法、透析法或亲和层析，将如本文中报道的二聚体多肽与培养基恰当地分离。B细胞或杂交瘤细胞可以充当编码二聚体多肽的DNA和RNA源。使用常规方法，将编码单克隆抗体的DNA和RNA轻易地分离并测序。一旦分离，可以将这种DNA插入表达载体，随后将所述表达载体转染至不产生二聚体多肽的宿主细胞(如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞)中，以实现重组单克隆二聚体多肽在宿主细胞中的合成。
通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl区带法、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳)和本领域熟知的其他技术进行抗体纯化，目的在于消除细胞组分或其他杂质(例如，其他细胞性核酸或蛋白质)(参见Ausubel,F.等人,编著，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987))。充分建立了不同的方法并且它们广泛用于蛋白质纯化，如使用微生物蛋白的亲和色谱(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱)、离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附作用(例如采用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附色谱(例如采用苯基-琼脂糖凝胶、亲氮杂-芳烃树脂(aza-arenophilic resin)或间氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和色谱(例如采用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻色谱和电泳法(如凝胶电泳法、毛细管电泳法)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
本发明的一个方面是包含如本文中报道的二聚体多肽或抗体的药物制剂。本发明的另一个方面是如本文中报道的二聚体多肽或抗体用于制造药物制剂的用途。本发明的又一个方面是一种用于制造药物制剂的方法，所述药物制剂包含如本文中报道的二聚体多肽或抗体。在另一个方面，本发明提供制剂，例如药物制剂，所述制剂含有与药用载体一起配制的如本文中报道的二聚体多肽或抗体。
可以通过本领域已知的多种方法施用如本文中报道的制剂。熟练技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变。为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能需要将混合物用防止其失活的材料包衣或随这种材料共施用。例如，该化合物可以在适宜的载体例如脂质体或稀释剂中施用至受试者。可药用的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于现场制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。用于药学活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域已知的。
可以使用许多可能的递送模式，包括但不限于眼内施加或局部施加。在一个实施方案中，施加是眼内施加并且包括，但不限于，结膜下注射、颅内注射、通过颞侧缘注射入前房、基质内注射，角膜内注射、视网膜下注射、眼房水注射、筋膜下注射或持久递送装置、玻璃体内注射(例如，玻璃体前部、中部或后部注射)。在一个实施方案中，施加是局部的并且包括但不限于滴至角膜上的眼滴。
在一个实施方案中，通过玻璃体内施加，例如通过玻璃体内注射，施用如本文中报道的二聚体多肽或如本文中报道的药物制剂。这可以根据本领域已知的标准方法进行(参见，例如，Ritter等人,J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276；Russelakis-Carneiro等人,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206和Wray等人,Arch.Neurol.33(1976)183-185)。
在一些实施方案中，本发明的治疗性试剂盒可以含有一个或多个剂量的在如本文所述的药物制剂中存在的如本文中报道的二聚体多肽、用于玻璃体内注射该药物制剂的合适装置和详述适用受试者及用于实施注射的方案的说明书。在这些实施方案中，一般将制剂通过玻璃体内注射施用至需要治疗的受试者。这可以根据本领域已知的标准程序进行。参见，例如，Ritter等人,J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276；Russelakis-Carneiro等人,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206和Wray等人,Arch.Neurol.33(1976)183-185。
所述制剂也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的消毒方法和通过纳入多种抗菌剂和抗真菌剂例如，尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止存在微生物。还可能想要将等渗剂如糖、氯化钠等纳入制剂中。此外，可以通过纳入延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶引起可注射药物形式的延长吸收。
无论选择何种施用途径，均将如本文中报道的化合物(其可以按适宜的水合形式使用)和/或如本文中报道的药物制剂，通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型。
可以改变如本文报道的药物制剂中有效成分的实际剂量水平，以获得有效成分的下述量，所述量就具体患者、组成和施用方式而言可以有效实现想要的治疗反应，并同时对患者无毒性。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、正在使用的化合物的排泄速率、治疗的持续期、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康和既往医史等医学领域熟知的因素。
制剂必须是无菌并如此程度地流动，从而通过注射器可输送制剂。除了水之外，载体在一个优选的实施方案中还优选地是等渗缓冲盐水溶液。
可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇和氯化钠。
制剂可以包含用于结膜下给药的包含活性物质的眼科用贮库制剂。眼科用贮库制剂包含基本上纯的活性物质(例如，如本文中报道的二聚体多肽)的微粒子。包含如本文中报道的二聚体多肽的微粒子可以包埋入生物相容性可药用聚合物或脂质包囊剂中。贮库制剂可以适应于历经延长的时间段释放全部或基本上全部的活性物质。如果存在的话，聚合物或脂质基质可以适应于充分地降解，以便在释放全部或基本上全部活性物质后从施用部位转运出来。贮库制剂可以是液态制剂，包含可药用聚合物和溶解或分散的活性物质。一旦注射，则聚合物在注射部位形成储库，例如通过胶化或沉淀过程形成。
本发明的另一个方面是用于治疗眼血管疾病的如本文中报道的二聚体多肽或抗体。
本发明的一个实施方案是用于治疗眼血管疾病的如本文中报道的二聚体多肽或抗体。
本发明的另一个方面是用于治疗眼血管疾病的药物制剂。
本发明的另一个方面是如本文中报道的二聚体多肽或抗体用于制造用于治疗眼血管疾病的药物的用途。
本发明的另一个方面是通过以下方式治疗患有眼血管疾病的患者的方法：向需要这种治疗的患者施用如本文中报道的二聚体多肽或抗体。
这里明确地说明，如本文所用的术语“包含”包括术语“由……组成”。因此，含有术语“包含”的全部方面和实施方案同样地用术语“由……组成”公开。
D.修饰
在又一个方面，根据任一个以上实施方案的二聚体多肽可以单独或以组合方式合并如下文1-6部分中所述的任一特征：
1.抗体亲和力
在一个实施方案中，使用表面等离子体共振测定法测量Kd。例如，使用
Figure BDA0001049029040000632
或
Figure BDA0001049029040000633
(GE Healthcare Inc.,Piscataway,NJ)的测定法在25℃采用固定化结合配偶体CM5芯片以约10个响应单位(RU)进行。在一个实施方案中，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，GE Healthcare Inc.)。结合配偶体用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/mL(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联的结合配偶体的大约10个响应单位(RU)。注射结合配偶体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μL/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中含有融合多肽或抗体的二聚体多肽的2倍连续稀释物(0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0001049029040000641
评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比(参见，例如，Chen,Y.等人,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流法(stop-flow)的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述荧光猝灭技术在25℃测量在PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。
2.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，如本文中报道的二聚体多肽是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在US 4,816,567；和Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合其片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人类抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法例如在Almagro，JAlmagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且例如在Riechmann,I.等人,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods 36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua,W.F.等人,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；Osbourn,J.等人,Methods36(2005)61-68；以及Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中进一步描述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”方法选择的构架区(例如，见Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从特定亚组的人抗体的轻链可变区或重链可变区的共有序列衍生的构架区(例如，见Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(例如，见Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库衍生的构架区(例如，见Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
3.人抗体
在某些实施方案中，如本文中报道的二聚体多肽是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374以及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中描述。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。例如，还参见描述XENOMOUSETM技术的US 6,075,181和US 6,150,584；描述
Figure BDA0001049029040000661
技术的US5,770,429；描述K-M
Figure BDA0001049029040000662
技术的US 7,041,870和描述Veloci
Figure BDA0001049029040000663
技术的US2007/0061900。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(例如，参见Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人,Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),第51-63页；和Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。还在Li,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中描述了借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。额外的方法包括例如在US7,189,826(其描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(其描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。在Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Histology和Histopathology 20(2005)927-937和Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191中也描述了人杂交瘤技术(三体瘤技术)。
也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变结构域序列随后可以与所需的人恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。
4.文库衍生的抗体
在某些实施方案中，如本文中报道的二聚体多肽是文库衍生的抗体。可以通过对组合文库筛选具有所需一种活性或多种活性的抗体，分离文库衍生的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如在Hoogenboom,H.R.等人,Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37中综述并且例如在McCafferty,J.等人,Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472和Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132中进一步描述。
在某些噬菌体展示法中，VH基因库和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合性噬菌体，如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自免疫源的文库在不要求构建杂交瘤的情况下提供针对免疫原的高亲和力抗体。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以便在不作任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原和另外针对广泛类型自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths,A.D.等人,EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排，合成地产生天然文库，如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：US 5,750,373和S 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US2007/0237764、US 2007/0292936及US 2009/0002360。
将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。
5.多特异性抗体
在某些实施方案中，如本文中报道的二聚体多肽是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性针对第一抗原并且另一种结合特异性针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与相同抗原的两个不同表位结合。双特异性抗体也可以用来使细胞毒性剂局限至表达至少一种抗原的细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO93/08829和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“结入扣”工程化(例如，见US5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，见US 4,676,980和Brennan,M.等人,Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，参见Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，见Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(scFv)二聚体(例如，参见Gruber,M.等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69)中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(Octopus antibody)”(见，例如US 2006/0025576)。
本文的抗体或片段还包括“双重功能Fab”或“DAF”(例如参见，US2008/0069820)。
本文中的抗体或片段也包括在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2010/145793中描述的多特异性抗体。
6.抗体变体
在某些实施方案中，如本文中报道的二聚体多肽是抗体。在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
a)置换变体、插入变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。下表中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。下表中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表
Figure BDA0001049029040000691
Figure BDA0001049029040000701
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(见，例如，Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或接触抗原的残基中做出这类改变，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom,H.R.等人,引自Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以例如是在HVR中的抗原接触残基外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，可以利用抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体产生或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助N联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH15(1997)26-32。低聚糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内部Asn297处岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约第297位置处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于第297位置的上游或下游±3个氨基酸附近，即，第294和300位置之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖化”或“缺乏岩藻糖的”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；和WO 2004/056312，特别在实施例11处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(例如，见Yamane-Ohnukii,N等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。
还可以对抗体变体提供双分低聚糖，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO 2003/011878；US6,602,684；和US 2005/0123546中描述。也提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO1999/22764中描述。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个其他氨基酸修饰引入如本文中报道的二聚体多肽中，因而产生Fc区变体。该Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换/突变)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的二聚体多肽，这使所述二聚体多肽成为下述应用的有利候选物，其中二聚体多肽的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保二聚体多肽抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞-NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在US5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0001049029040000731
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实二聚体多肽不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(参见，例如，Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
效应子功能减少的二聚体多肽包括置换一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(US 6,737,056)的那些。这类Fc区变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc区，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc区突变体(US 7,332,581)。
描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体(参见，例如，US 6,737,056；WO2004/056312，和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，二聚体多肽变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的第298、333和/或334位置处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
在US 2005/0014934中描述了半寿期增加和新生儿Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生儿Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc区变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些(US 7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的二聚体多肽，例如，类似于“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在二聚体多肽的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在二聚体多肽的可及位点处并且可以用来使二聚体多肽缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以例如US 7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的二聚体多肽。
e)衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰如本文中报道的二聚体多肽以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于二聚体多肽衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三
Figure BDA0001049029040000751
烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与二聚体多肽连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的二聚体多肽的特定特性或功能、二聚体多肽衍生物是否将用于定义情况下的疗法中等等。
在另一个实施方案中，提供了如本文中报道的二聚体多肽体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部加热至杀伤临近于二聚体多肽-非蛋白质部分的细胞的温度。
f)异二聚化
存在几种修饰CH3以增强异二聚化的方案，这些方案例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中充分描述。一般地，在全部这类方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域均以互补方式工程化，从而每个CH3结构域(或包含它的重链)不能与自身同型二聚化，而是被迫与另一个工程化的互补性CH3结构域异二聚化(从而第一和第二CH3结构域异二聚化并且在两个第一CH3结构域之间或两个第二CH3结构域之间不形成同型二聚体)。构思用于改善重链异二聚化的这些不同方案作为本发明的多特异性抗体中与重链–轻链修饰组合的不同替代方案(在一个结合臂中VH和VL交换/替换并且在CH1/CL界面中引入带相反电荷的带电荷氨基酸置换)以减少轻链错误配对的Bence-Jones型副产物。
在本发明的一个优选实施方案中(这种情况下，多特异性抗体在重链中包含CH3结构域)，可以通过“结入扣”技术改变本发明的所述多特异性抗体的CH3结构域，所述技术以例如WO 96/027011；Ridgway,J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO 98/050431中的几个例子详述。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的一者可以是“结”，而另一者是“扣”。二硫键的引入进一步稳定异二聚体(Merchant,A.M等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。
因此在本发明的一个实施方案中，所述多特异性抗体(在每条重链中包含CH3结构域以及)其特征在于
在a)下的抗体的第一重链的第一CH3结构域和在b)下的抗体的第二重链的第二CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处会合。
其中改变所述界面以促进多特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于
i)如此改变一条重链的CH3结构域，
从而在多特异性抗体内部，一条重链的CH3结构域的初始界面内部会合另一条重链的CH3结构域的初始界面，
将氨基酸残基替换为具有更大侧链体积的氨基酸残基，因而在一个重链的CH3结构域的界面内部产生突出部分，所述突出部分可布置在另一个重链的CH3结构域的界面内部的空穴中。
并且
ii)如此改变另一条重链的CH3结构域，
从而在多特异性抗体内部，第二CH3结构域的初始界面内部会合第一CH3结构域的初始界面，
将氨基酸残基替换为具有更小侧链体积的氨基酸残基，因而在第二CH3结构域的界面内部产生空穴，在所述空穴内部可布置第一CH3结构域界面内部的突出部分。
优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。
在本发明的一个方面，通过以下方式进一步改变两个CH3结构域：如此引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域的相应位置中的氨基酸，从而能形成两个CH3结构域之间的二硫键。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体在“结链”的第一CH3结构域中包含氨基酸T366W突变并且在“扣链”的第二CH3结构域中包含氨基酸T366S、L368A、Y407V突变。也可以使用CH3结构域之间的额外链间二硫键(Merchant,A.M等人,Nature Biotech 16(1998)677-681)，例如通过向“扣链”的CH3结构域引入氨基酸Y349C突变并向“结链”的CH3结构域引入氨基酸E356C突变或氨基酸S354C突变。
在一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体(其在每条重链中包含CH3结构域)在两个CH3结构域之一中包含氨基酸S354C、T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个结构域中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3域中的额外氨基酸S354C突变和另一个CH3域中的额外氨基酸Y349C突变形成链间二硫键)(根据Kabat编号)。
构思用于修饰CH3以增强异二聚化的其他技术作为本发明的替代并且它们例如在WO 96/27011、WO 98/050431，EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中描述。
在一个实施方案中，可以备选地使用EP 1 870 459A1中描述的异二聚化方案。这种方法基于在两条重链之间的CH3/CH3结构域界面中特定氨基酸位置处引入带相反电荷的带电荷氨基酸置换/突变。所述多特异性抗体的一个优选实施方案是在(多特异性抗体的)第一CH3结构域中的氨基酸R409D、K370E突变和在多特异性抗体的第二CH3结构域中的氨基酸D399K、E357K突变(根据Kabat编号)。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体在“结链”的CH3结构域中包含氨基酸T366W突变并且在“扣链”的CH3结构域中包含氨基酸T366S、L368A、Y407V突变以及额外地在“结链”的CH3结构域中包含氨基酸R409D、K370E突变及在“扣链”的CH3结构域中包含氨基酸D399K、E357K突变。
在另一个实施方案中，所述多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含氨基酸S354C、T366W突变及在两个CH3结构域的另一结构域中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述多特异性抗体在两个CH3结构域之一中包含氨基酸Y349C、T366W突变及在两个CH3结构域的另一结构域中包含氨基酸S354C、T366S、L368A、Y407V突变以及额外地在“结链”的CH3结构域中包含氨基酸R409D、K370E突变及在“扣链”的CH3结构域中包含氨基酸D399K、E357K突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 2013/157953中描述的异二聚化方案。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366K突变并且第二CH3结构域多肽包含氨基酸L351D突变。在又一个实施方案中，第一CH3结构域包含又一个氨基酸L351K突变。在又一个实施方案中，第二CH3结构域包含选自Y349E、Y349D和L368E(优选地L368E)的其他氨基酸突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 2012/058768中描述的异二聚化方案。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在又一个实施方案中，第二CH3结构域在位置T411、D399、S400、F405、N390或K392处包含又一个氨基酸突变，所述氨基酸突变例如选自a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c)S400E、S400D、S400R或S400K、F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W、N390R、N390K或N390D、K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。在又一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变并且第二CH3结构域包含氨基酸T366V、K409F突变。在又一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸Y407A突变并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在又一个实施方案中，第二CH3结构域包含又一个氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 2011/143545中描述的异二聚化方案，例如在选自368和409的位置具有氨基酸修饰。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 2011/090762中描述的异二聚化方案，所述方案也使用上文所述的结入扣技术。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366W突变并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407A突变。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366Y突变并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407T突变。
在一个实施方案中，多特异性抗体属于IgG2同种型并且可以备选地使用WO 2010/129304中描述的异二聚化方案。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 2009/089004中描述的异二聚化方案。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含带负电荷氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选地K392D或N392D)对K392或N392的氨基酸置换并且第二CH3结构域包含带正电荷氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选地D399K、E356K、D356K或E357K和更优选地D399K和E356K)对D399、E356、D356或E357的氨基酸置换。在又一个实施方案中，第一CH3结构域还包含带负电荷氨基酸(例如谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)，优选地K409D或R409D)对K409或R409的氨基酸置换。在又一个实施方案中，第一CH3结构域进一步或另外地包含带负电荷氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸置换。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 2007/147901中描述的异二聚化方案。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸K253E、D282K和K322D突变并且第二CH3结构域包含氨基酸D239K、E240K和K292D突变。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 2007/110205中描述的异二聚化方案。
E.重组方法和组合物
可以例如使用重组方法和组合物产生抗体，如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码如本文中报道的二聚体多肽的分离核酸。这种核酸可以编码构成二聚体多肽的第一多肽的氨基酸序列和/或构成二聚体多肽的第二多肽的氨基酸序列。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下述载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码构成二聚体多肽的第一多肽的氨基酸序列和构成二聚体多肽的第二多肽的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码构成二聚体多肽的第一多肽的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码构成二聚体多肽的第二多肽的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生如本文中报道的二聚体多肽的方法，其中所述方法包括在适于表达二聚体多肽的条件下培养如上文提供的包含编码二聚体多肽的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
为了重组产生如本文中报道的二聚体多肽，将编码二聚体多肽的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码变异Fc区多肽和抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。
克隆或表达编码二聚体多肽的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生二聚体多肽，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于细菌中表达抗体片段和多肽，例如，参见US 5,648,237、U S5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.，引自Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编著)，Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以将二聚体多肽从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化多肽。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码二聚体多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的二聚体多肽。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化二聚体多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548,US 7,125,978和US 6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的HEK293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562)；如在例如Mather,J.P.等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，例如，见Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。
F.联合治疗
在某些实施方案中，单独施用(无额外治疗药)如本文中报道的二聚体多肽或如本文中报道的药物制剂以治疗本文所述的一种或多种眼血管疾病。
在其他实施方案中，如本文中报道的二聚体多肽抗体或药物制剂与一种或多种额外治疗药和方法组合施用以治疗本文所述的一种或多种眼血管疾病。
在其他实施方案中，如本文中报道的二聚体多肽或药物制剂与一种或多种额外治疗药组合配制并且施用以治疗本文所述的一种或多种眼血管疾病。
在某些实施方案中，本文提供的联合治疗包括，将如本文中报道的二聚体多肽或药物制剂与一种或多种额外治疗药依次施用以治疗本文所述的一种或多种眼血管疾病。
额外的治疗药包括但不限于，色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)，EyeOOl(抗VEGF聚乙二醇化适配体)、司夸胺、RETAANE(TM)(储库混悬用醋酸阿奈可他；Alcon,Inc.)，康普瑞汀A4前药(CA4P)，MACUGEN(TM)、MIFEPREX(TM)(米非司酮-ru486)、筋膜下曲安奈德、玻璃体内晶态曲安奈德、普啉司他(AG3340-合成性基质金属蛋白酶抑制剂，Pfizer)、氟氯奈德(包括氟轻松眼内植入物，Bausch&Lomb/Control Delivery Systems)、VEGFR抑制剂(Sugen)、VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)和SU11248(舒尼替尼)、利诺胺和整联蛋白vβ3功能的抑制剂及血管抑制素。
可以与如本文中报道的二聚体多肽或药物制剂组合使用的其他药物治疗包括但不限于VISUDYNE(TM)联用非热激光、PKC412、Endovion(NeuroSearch A/S)、神经营养因子，以举例方式包括神经胶质衍生的神经营养因子和睫状神经营养因子、diatazem，多佐胺、Phototrop、9-顺-视黄醛，包括依可碘酯(phospholine iodide)或依可酯或碳酸酐酶抑制剂的眼用药物(包括Echo疗法)、AE-941(AEterna Laboratories,Inc.)、Sirna-027(SimaTherapeutics,Inc.)、哌加他尼(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、神经营养因子(仅以举例方式包括NT-4/5，Genentech)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整联蛋白拮抗剂(包括来自Jerini AG和AbbottLaboratories的那些)、EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、沙立度胺(例如，由EntreMed,Inc.使用)、心脏营养素-1(Genentech)、2-甲氧雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫钼酸盐(密歇根大学)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany,Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪氨酸激酶抑制剂(Allergan,SUGEN,Pfizer)、NX-278-L(NeXstarPharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、视网膜细胞神经节神经保护药(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、环孢菌素A、有限视网膜转位术、光动力疗法(仅以举例方式，包括受体靶向性PDT，Bristol-Myers Squibb,Co.；注射用卟菲尔钠联用PDT；维替泊芬，QLT Inc.；罗他泊芬联用PDT，Miravent Medical Technologies；他拉泊芬钠联用PDT，Nippon Petroleum；莫特沙芬镥，Pharmacyclics,Inc.)、反义寡核苷酸(以举例方式，包括由Novagali Pharma SA测试的产品和ISIS-13650，Isis Pharmaceuticals)、激光光凝术、隐结激光术、黄斑裂孔术、黄斑转位术、可植入式微型窥镜、Phi-Motion血管造影术(也称作显微激光疗法(Micro-Laser Therapy)和滋养血管治疗(Feeder VesselTreatment))、质子束疗法、微刺激疗法、视网膜脱离和玻璃体手术、巩膜扣带术、黄斑下手术、经瞳孔热疗法、光系统I疗法、使用RNA干扰(RNAi)、体外净化疗法(也称作膜差异性过滤和流变疗法(Rheotherapy))、微芯片植入法、干细胞疗法、基因替代疗法、核酶基因疗法(包括针对低氧反应元件的基因疗法，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；PDEF基因疗法，GenVec)、光受体/视网膜细胞移植术(包括可移植性视网膜上皮细胞，Diacrin,Inc.；视网膜细胞移植，Cell Genesys,Inc.)和针刺。
可以与如本文中报道的二聚体多肽或药物制剂组合使用任何抗血管生成药，包括但不限于，Carmeliet和Jain(Nature 407(2000)249-257)列出的那些。在某些实施方案中，抗血管生成药是另一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂如VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR、中和抗VEGFR抗体的适配体、VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制剂及其任意组合并且这些包括抗VEGF适配体(例如哌加他尼)、可溶性重组诱饵受体(例如VEGFTrap)。在某些实施方案中，抗血管生成药包括皮质类固醇类、血管抑制性类固醇、醋酸阿奈可他、血管抑制素、内皮抑素、减少VEGFR或VEGF配体表达的小干扰性RNA、VEGFR后用酪氨酸激酶抑制剂阻断、MMP抑制剂、IGFBP3、SDF-1封闭剂、PEDF、γ-分泌酶、δ-样配体4、整联蛋白拮抗剂、HIF-1α阻断、蛋白激酶肌酸激酶2阻断、和使用血管内皮钙黏着蛋白(CD-144)抑制干细胞(即内皮祖先细胞)归巢至新血管化部位及间质衍生因子(SDF)-I抗体。也可以使用靶向VEGF受体的小分子RTK抑制剂，包括PTK787。也可以使用针对新血管化具有活性的并不必然是VEGF化合物的药物并且它们包括抗炎药、m-Tor抑制剂、雷帕霉素、依维莫司(everolismus)、坦罗莫司(temsirolismus)、环孢菌素(cyclospohne)、抗TNF药、抗补体药和非甾体抗炎药。也可以使用具有神经保护作用并且可以潜在减少干性黄斑变性进展的药物，如称作“神经类固醇”的药物类别。这些包括药物如脱氢表雄酮(DHEA)(商品名：Prastera(R)和Fidelin(R))、硫酸脱氢表雄酮和硫酸孕烯醇酮。可以与如本文中报道的二聚体多肽或药物制剂组合使用任何AMD(年龄相关性黄斑变性)治疗药，包括但不限于维替泊芬与PDT、哌加他尼钠、锌或抗氧化剂单独组合或以任何组合来组合。
G药物制剂
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文中报道的二聚体多肽的药物制剂：将具有所需纯度的这种二聚体多与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(
Figure BDA0001049029040000851
Baxter International,Inc.)。在US2005/0260186和US 2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
在美国专利号US 6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水质抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些有效成分。这种有效成分以有效用于预期目的的量适当存在。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌。
H.治疗方法和组合物
如本文中报道的任何二聚体多肽均可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供了作为药物使用的如本文中报道的二聚体多肽。在其他方面，提供用于治疗眼血管疾病的二聚体多肽。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的二聚体多肽。在某些实施方案中，本发明提供二聚体多肽用于治疗患有眼血管疾病的个体的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的如本文中报道的二聚体多肽。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗药，例如，如上文D部分中描述的治疗药。在其他实施方案中，本发明提供一种用于抑制眼中血管生成的二聚体多肽。在某些实施方案中，本发明提供一种在抑制个体中血管生成的方法中使用的二聚体多肽，所述方法包括向该个体施用有效量的二聚体多肽以抑制血管生成。根据任一个以上实施方案的“个体”在一个优选的实施方案中是人。
在又一个方面，本发明提供二聚体多肽在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗眼血管疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗眼血管疾病的方法中，所述方法包括向患有眼血管疾病的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗药，例如，如上文描述的治疗药。在又一个实施方案中，药物用于抑制血管生成。在又一个实施方案中，药物用于抑制个体内血管生成的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的抑制血管生成的药物。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗眼血管疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种眼血管疾病的个体施用有效量的如本文中报道的二聚体多肽。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如下文描述的至少一种额外治疗药。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于抑制个体的眼中血管生成的方法。在一个实施方案中，该方法包括向该个体施用有效量的如本文中报道的二聚体多肽以抑制血管生成。在一个实施方案中，“个体”是人。
在又一个方面，本发明提供了包含如本文中报道的任何二聚体多肽的药物制剂，例如，用于前述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含如本文中报道的任何二聚体多肽和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含如本文中报道的任何二聚体多肽和至少一种额外的治疗药，例如，如下文描述。
如本文中报道的二聚体多肽可以在疗法中单独使用或与其他药物组合使用。例如，如本文中报道的二聚体多肽可以与至少一种额外治疗药共施用。
如本文中报道的二聚体多肽(和任何额外的治疗药)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。
如本文中报道的二聚体多肽将以符合良好医学实践的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该二聚体多肽不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药物一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的二聚体多肽的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，如本文中报道的二聚体多肽的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、二聚体多肽的类型、疾病的严重性和过程，二聚体多肽是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对二聚体多肽的反应以及主治医师的决定。将二聚体多肽适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)二聚体多肽可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。二聚体多肽的一个示例性剂量将处于约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每3周(例如，患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的二聚体多肽)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
III.制造物
在本发明的另一个方面，提供一种制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。至少一种活性物质在中的组合物是如本文中报道的二聚体多肽。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。另外，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含如本文中报道的二聚体多肽；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗药。在本发明的这个实施方案中制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选地或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，前述任一者制造物可以包含替代如本文中报道的二聚体多肽或除此之外的如本文中报道的免疫缀合物。
IV.具体实施方案
1.二聚体多肽，包含
第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，
其中
i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
2.根据项1的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽不与人FcRn特异性结合并且与葡萄球菌蛋白A特异性结合。
3.根据项1至2中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是同型二聚多肽。
4.根据项1至2中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是异二聚多肽。
5.根据项1至4中任一项的二聚体多肽，特征在于i)第一多肽还包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽还包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W。
6.根据项1至5中任一项的二聚体多肽，特征在于免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG1亚类。
7.根据项1至6中任一项的二聚体多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变L234A和L235A。
8.根据项1至5中任一项的二聚体多肽，特征在于免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG2亚类，其任选地具有突变V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S。
9.根据项1至5中任一项的二聚体多肽，特征在于免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG4亚类。
10.根据项1至5和9中任一项的二聚体多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变S228P和L235E。
11.根据项1至10中任一项的二聚体多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变P329G。
12.根据项1至11中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是Fc区融合多肽。
13.根据项1至11中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是(全长)抗体。
14.根据项1至11和13中任一项的二聚体多肽，特征在于(全长)抗体是单特异性抗体。
15.根据项1至11和13至14中任一项的二聚体多肽，特征在于单特异性抗体是单价单特异性抗体。
16.根据项1至11和13至15中任一项的二聚体多肽，特征在于单特异性抗体是双价单特异性抗体。
17.根据项1至11和13中任一项的二聚体多肽，特征在于(全长)抗体是双特异性抗体。
18.根据项1至11和13和17中任一项的二聚体多肽，特征在于双特异性抗体是双价双特异性抗体。
19.根据项1至11和13和17至18中任一项的二聚体多肽，特征在于双特异性抗体是四价双特异性抗体。
20.根据项1至11和13中任一项的二聚体多肽，特征在于(全长)抗体是三特异性抗体。
21.根据项1至11和13和20中任一项的二聚体多肽，特征在于三特异性抗体是三价三特异性抗体。
22.根据项1至11和13和20至21中任一项的二聚体多肽，特征在于三特异性抗体是四价三特异性抗体。
23.二聚体多肽，包含
第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，
其中第一多肽、第二多肽或者第一和第二多肽包含突变Y436A(根据EU索引编号)。
24.根据项23的二聚体多肽，特征在于第一和第二多肽包含突变Y436A。
25.根据项23至24中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽不与人FcRn特异性结合并且与葡萄球菌蛋白A特异性结合。
26.根据项23至25中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是同型二聚多肽。
27.根据项23至25中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是异二聚多肽。
28.根据项23至27中任一项的二聚体多肽，特征在于
a)第一多肽还包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或第一多肽还包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W，和/或
b)i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
29.根据项23至28中任一项的二聚体多肽，特征在于免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG1亚类。
30.根据项23至29中任一项的二聚体多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变L234A和L235A。
31.根据项23至28中任一项的二聚体多肽，特征在于免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG2亚类，其任选地具有突变V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S。
32.根据项23至28中任一项的二聚体多肽，特征在于免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG4亚类。
33.根据项23至28和32中任一项的二聚体多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变S228P和L235E。
34.根据项23至33中任一项的二聚体多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变P329G。
35.根据项23至34中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是Fc区融合多肽。
36.根据项23至34中任一项的二聚体多肽，特征在于二聚体多肽是(全长)抗体。
37.根据项23至34和36中任一项的二聚体多肽，特征在于(全长)抗体是单特异性抗体。
38.根据项23至34和36至37中任一项的二聚体多肽，特征在于单特异性抗体是单价单特异性抗体。
39.根据项23至34和36至38中任一项的二聚体多肽，特征在于单特异性抗体是双价单特异性抗体。
40.根据项23至34和36中任一项的二聚体多肽，特征在于(全长)抗体是双特异性抗体。
41.根据项23至34和36和40中任一项的二聚体多肽，特征在于双特异性抗体是双价双特异性抗体。
42.根据项23至34和36和40至41中任一项的二聚体多肽，特征在于双特异性抗体是四价双特异性抗体。
43.根据项23至34和36中任一项的二聚体多肽，特征在于(全长)抗体是三特异性抗体。
44.根据项23至34和36和43中任一项的二聚体多肽，特征在于三特异性抗体是三价三特异性抗体。
45.根据项23至34和36和43至44中任一项的二聚体多肽，特征在于三特异性抗体是四价三特异性抗体。
46.二聚体多肽，包含
第一多肽按N末端至C端方向包含第一重链可变结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第二多肽按N末端至C端方向包含第二重链可变结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第三多肽按N末端至C端方向包含第一轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
第四多肽按N末端至C端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第一结合位点，
其中第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成与第二抗原特异性结合的第二结合位点，
其中i)第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W、
其中第一和第二多肽还包含突变L234A、L235A和P329G，并且
其中
i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
47.二聚体多肽，包含
第一多肽按N末端至C端方向包含第一重链可变结构域、免疫球蛋白轻链恒定结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第二多肽按N末端至C端方向包含第二重链可变结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第三多肽按N末端至C端方向包含IgG1亚类的第一轻链可变结构域和免疫球蛋白CH1结构域，
第四多肽按N末端至C端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第一结合位点，
其中第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成与第二抗原特异性结合的第二结合位点，
其中i)第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W、
其中第一和第二多肽还包含突变L234A、L235A和P329G，并且
其中
i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
48.二聚体多肽，包含
第一多肽按N末端至C端方向包含第一重链可变结构域、IgG4亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG4亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG4亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG4亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第二多肽按N末端至C端方向包含第二重链可变结构域、IgG4亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG4亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG4亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG4亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第三多肽按N末端至C端方向包含第一轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
第四多肽按N末端至C端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第一结合位点，
其中第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成与第二抗原特异性结合的第二结合位点，
其中i)第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W、
其中第一和第二多肽还包含突变S228P、L235E和P329G，并且
其中
i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
49.二聚体多肽，包含
第一多肽按N末端至C端方向包含第一重链可变结构域、免疫球蛋白轻链恒定结构域、IgG4亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG4亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG4亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第二多肽按N末端至C端方向包含第二重链可变结构域、IgG4亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG4亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG4亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG4亚类的免疫球蛋白CH3结构域，
第三多肽按N末端至C端方向包含第一轻链可变结构域和IgG4亚类的免疫球蛋白CH1结构域，
第四多肽按N末端至C端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第一结合位点，
其中第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成与第二抗原特异性结合的第二结合位点，
其中i)第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W、
其中第一和第二多肽还包含突变S228P、L235E和P329G，并且
其中
i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
50.二聚体多肽，包含
第一多肽按N末端至C端方向包含第一重链可变结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域、肽接头和第一scFv，
第二多肽按N末端至C端方向包含第二重链可变结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域、肽接头和第二scFv，
第三多肽按N末端至C端方向包含第一轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
第四多肽按N末端至C端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第一结合位点，第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第二结合位点，第一和第二scFv与第二抗原特异性结合，
其中i)第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W、
其中第一和第二多肽还包含突变L234A、L235A和P329G，并且
其中
i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
51.二聚体多肽，包含
第一多肽按N末端至C端方向包含第一重链可变结构域、免疫球蛋白轻链恒定结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域、肽接头和第一scFv，
第二多肽按N末端至C端方向包含第二重链可变结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域、IgG1亚类的免疫球蛋白铰链区、IgG1亚类的免疫球蛋白CH2结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH3结构域、肽接头和第二scFv，
第三多肽按N末端至C端方向包含第一轻链可变结构域和IgG1亚类的免疫球蛋白CH1结构域，
第四多肽按N末端至C端方向包含第二轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第一结合位点，第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成与第一抗原特异性结合的第二结合位点，并且第一和第二scFv与第二抗原特异性结合，
其中i)第一多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W、
其中第一和第二多肽还包含突变L234A、L235A和P329G，并且
其中
i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。
52.一种用于产生根据项1至51中任一项的二聚体多肽的方法，包括以下步骤：
a)培育哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含编码根据项1至51中任一项的二聚体多肽的一种或多种核酸，
b)从培养基回收二聚体多肽，并且
c)用蛋白A亲和色谱纯化二聚体多肽。
53.突变Y436A增加二聚体多肽与蛋白A结合的用途。
54.突变H310A，H433A和Y436A分离异二聚多肽与同型二聚多肽的用途。
55.突变L251D、L314D、L432D或突变L251S、L314S、L432S分离异二聚多肽与同型二聚多肽的用途。
56.第一多肽中的突变I253A、H310A和H435A与第二多肽中的突变H310A、H433A和Y436A组合用于分离包含第一和第二多肽的异二聚多肽与同型二聚多肽的用途。
57.第一多肽中的突变I253A、H310A和H435A与第二多肽中的突变L251D、L314D、L432D或突变L251S、L314S、L432S组合用于分离包含第一和第二多肽的异二聚多肽与同型二聚多肽的用途。
58.根据项53至57中任一项的用途，特征在于i)第一多肽还包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽还包含突变S354C和T366W，或ii)第一多肽包含突变S354C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变Y349C和T366W。
59.治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法向需要这种治疗的患者施用根据项1至51中任一项的二聚体多肽。
60.根据项1至51中任一项的二聚体多肽，用于玻璃体内施加。
61.根据项1至51中任一项的二聚体多肽，用于治疗眼血管疾病.
62.药物制剂，包含根据项1至51中任一项的二聚体多肽和任选地可药用载体。
63.根据项1至51中任一项的二聚体多肽的用途，用于从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中。
64.根据项1至51中任一项的二聚体多肽的用途，用于从眼移除一种或多种可溶性受体配体。
65.根据项1至51中任一项的二聚体多肽的用途，用于治疗眼病、尤其眼血管疾病。
66.根据项1至51中任一项的二聚体多肽的用途，用于从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循环中。
67.根据项1至51中任一项的二聚体多肽，用于治疗眼病。
68.根据项1至51中任一项的二聚体多肽，用于从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中。
69.根据项1至51中任一项的二聚体多肽，用于从眼移除一种或多种可溶性受体配体。
70.根据项1至51中任一项的二聚体多肽，用于治疗眼病、尤其眼血管疾病。
71.根据项1至51中任一项的二聚体多肽，用于从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循环中。
72.治疗患有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的根据项1至51中任一项的二聚体多肽。
73.在个体中从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的根据项1至51中任一项的二聚体多肽以从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中。
74.在个体中从眼移除一种或多种可溶性受体配体的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的根据项1至51中任一项的二聚体多肽以从眼移除一种或多种可溶性受体配体。
75.在个体中从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循环中的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的根据项1至51中任一项的二聚体多肽以从玻璃体内腔转运一种或多种可溶性受体配体至血液循环中。
76.在个体中从玻璃体内腔或眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的根据项1至51中任一项的二聚体多肽以从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中。
V.实施例
以下是本发明方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。
方法
电喷雾电离质谱法(ESI-MS)
通过添加0.5μL N-聚糖酶plus(Roche)和磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.1)以获得最终样品体积115μL，使蛋白质等分试样(50μg)去糖基化。将混合物在37℃温育18小时。此后为了还原和变性，添加60μL在4M胍*HCl(Pierce)中的0.5M TCEP(Pierce)和50μL 8M胍*HCl。将混合物在37℃温育30分钟。通过大小排阻色谱(琼脂糖凝胶G-25，等强度，40％乙腈，含2％甲酸)，将样品脱盐。在配备纳米ESI源(TriVersa NanoMate,Advion)的Q-TOF仪(maXis，Bruker)上记录ESI质谱(+ve)。MS参数设置如下：转移：漏斗RF，400Vpp；ISCID能量，0eV；多极RF，400Vpp；四极：离子能，4.0eV；低质量，600m/z；源头：干气，8L/分钟；干气温度，160℃；碰撞室：碰撞能，10eV；碰撞RF：2000Vpp；离子冷却器：离子冷却器RF，300Vpp；转移时间：120μs；脉冲前储存，10μs；扫描范围m/z 600至2000。对于数据评价，使用自有开发软件(MassAnalyzer)。
FcRn表面等离子体共振(SPR)分析
使用BIAcore T100仪(BIAcore AB，乌普萨拉，瑞典)，通过表面等离子体共振(SPR)技术分析野生型抗体和突变体对FcRn的结合特性。该体系经充分建立用于研究分子相互作用。它允许连续实时监测配体/分析物结合作用，并且因此在多种分析设置下测定动力学参数。SPR-技术基于测量靠近镀金生物传感器芯片表面的折射率。折射率的变化表示该表面上固定化配体与溶液中注射的分析物相互作用所引起的质量变化。如果分子与表面上的固定化配体结合，则质量增加，在解离的情况下，则质量减少。在当前测定法中，借助胺偶联法，将FcRn受体固定在BIAcore CM5-生物传感器芯片(GE HealthcareBioscience，乌普萨拉，瑞典)到400响应单位(RU)水平。该测定法在室温实施，以PBS，0.05％Tween20pH 6,0(GE Healthcare Bioscience)作为运行缓冲液和稀释缓冲液。将200nM抗体样品在室温以流速50μL/分钟注射。结合时间是180秒，解离相耗时360秒。通过短暂注射HBS-P，pH 8.0，实现芯片表面是再生。通过比较注射后180秒和注射后300秒的生物学反应信号高度，进行SPR-数据的评价。相应参数是RU最高水平(注射后180秒)和晚期稳定性(注射结束后300秒)。
蛋白A表面等离子体共振(SPR)分析
该测定法基于表面等离子体共振光谱法。蛋白A固定在SPR生物传感器的表面上。一旦将样品注射入SPR分光计的流动小室中，它与固定化蛋白A形成复合物，导致传感芯片表面上质量增加，并且因此导致更高的响应(如1RU定义为1pg/mm2)。此后，通过溶解样品-蛋白A复合物，再生传感芯片。随后对获得的响应按响应单位(RU)评价信号高度和评价解离行为。
通过使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒，将约3500响应单位(RU)的蛋白A(20μg/ml)在pH 4.0偶联到CM5芯片(GE Healthcare)上。
样品和系统缓冲液是HBS-P+(0.01M HEPES，0.15M NaCl，无菌过滤的0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)。将流动小室温度设定至25℃并且将样品区室温度设定至12℃。该系统用运行缓冲液填装。随后，将5nM样品构建体溶液以流速30μL/分钟注射120秒，随后是300秒解离相。随后，通过两次30秒以流速30μL/分钟长时间注射甘氨酸-HCl pH 1.5，再生传感芯片表面。一式三份测量每份样品。
双特异性抗体和它们的相应的序列
Figure BDA0001049029040001031
Figure BDA0001049029040001041
如本文所用的术语“具有突变IHH-AAA”指在IgG1或IgG4亚类的恒定重链区(根据Kabat EU索引编号体系编号)中突变I253A(Ile253Ala)、H310A(His310Ala)和H435A(His435Ala)的组合，如本文所用的术语“具有突变HHY-AAA”指在IgG1或IgG4亚类的恒定重链区(根据Kabat EU索引编号体系编号)中突变H310A(His310Ala)、H433A(His433Ala)和Y436A(Tyr436Ala)的组合，如本文所用的术语“具有突变P329G LALA”指在IgG1亚类的恒定重链区(根据Kabat EU索引编号体系编号)中突变L234A(Leu234Ala)，L235A(Leu235Ala)和P329G(Pro329Gly)的组合，并且如本文所用的术语“具有突变SPLE”指在IgG4亚类的恒定重链区(根据Kabat EU索引编号体系编号)中突变S228P(Ser228Pro)和L235E(Leu235Glu)的组合。
Figure BDA0001049029040001042
Figure BDA0001049029040001051
概述
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。根据EU编号编号并提及抗体链的氨基酸残基(Edelman,G.M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
重组DNA技术
如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成
根据给出的说明书在Geneart(雷根斯堡，德国)订购目的基因区段。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried,德国)或SequiServe GmbH(Vaterstetten,德国)进行的双链测序法测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
GCG(遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，Madison，Wisconsin)的软件包第10.2版和Infomax的Vector NTI Advance套装8.0版用于序列生成、作图、分析、注释和图示。
表达载体
为了表达所描述的抗体，使用基于采用或不采用CMV-内含子A启动子的cDNA组织化或基于采用CMV启动子的基因组组织化的表达载体以瞬时表达(例如在HEK293-F细胞中)。
除了抗体表达盒之外，载体还含有：
允许该载体在大肠杆菌中复制的复制起点，
在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，和
作为真核细胞中选择标记的来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因。
抗体基因的转录单位包含以下元件：
在5'末端的独特限制性位点，
来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
在cDNA组织化的情况下，后续内含子A序列，
人免疫球蛋白基因的5'非翻译区，
编码免疫球蛋白重链信号序列的核酸，
编码人抗体链(野生型或具有结构域交换)的核酸，所述核酸作为cDNA或在基因组组织化中具有免疫球蛋白外显子-内含子组织化，
具有多聚腺苷化信号序列的3’非翻译区，和
在3'末端的独特限制性位点。
编码抗体链的核酸通过PCR和/或基因合成法生成并通过连接相应的核酸区段，例如利用相应载体中的独特限制性位点连接，通过已知的重组方法和技术装配。通过DNA测序验证亚克隆核酸序列。为了瞬时转染，从转化的大肠杆菌培养物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)制备载体，制得量较大的载体。
细胞培养物技术
使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编著),John Wiley&Sons,Inc.中所述的标准细胞培养物技术。
如下文描述，通过在按照悬浮方式生长的HEK29-F细胞中瞬时共转染相应的表达载体，表达双特异性抗体。
实施例1
表达和纯化
HEK293-F系统中的瞬时转染
使用HEK293-F系统(Invitrogen)，根据制造商的说明书，通过用相应载体(例如编码重链和修饰的重链以及相应轻链和修饰的轻链的质粒)瞬时转染，产生单特异性和双特异性抗体。简而言之，将摇瓶中或搅拌式发酵器中无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)内以悬浮方式生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)用相应表达载体和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以密度1*106个细胞/mL接种在600mL中并且以120转/分钟，8％CO2温育。该日之后，将约1.5*106个细胞/mL细胞密度的细胞用大约42mL以下混合物转染：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)与600μg以等摩尔比率分别编码重链或修饰重链及相应轻链的总载体DNA(1μg/mL)的混合物以及B)20ml Opti-MEM与1.2mL 293fectin或fectin(2μL/mL)的混合物。在发酵过程期间根据葡萄糖消耗量，添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌型抗体的上清液并且将抗体直接从上清液纯化或将上清液冷冻并存储。
纯化
通过使用MabSelectSure-SepharoseTM(用于非IHH-AAA突变体)(GE Healthcare，瑞典)或KappaSelect-琼脂糖(用于IHH-AAA突变体)(GE Healthcare，瑞典)的亲和色谱、使用丁基-琼脂糖凝胶(GE Healthcare，瑞典)的疏水相互作用色谱和Superdex 200大小排阻(GE Healthcare，瑞典)色谱，从细胞培养上清液纯化双特异性抗体。
简而言之，在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂(非IHH-AAA突变和野生型抗体)上捕获无菌过滤的细胞培养上清液，用平衡缓冲液洗涤并且用25mM pH 3.0柠檬酸钠洗脱。在用25mM Tris，50mMNaCl，pH 7.2平衡的KappaSelect树脂上捕获IHH-AAA突变体，用平衡缓冲液洗涤并且用25mM pH 2.9柠檬酸钠洗脱。将洗脱的抗体级分汇集并用2M Tris，pH 9.0中和。通过添加1.6M硫酸铵溶液至终浓度0.8M硫酸铵并使用乙酸调节pH至pH 5.0，将抗体汇集物准备好用于疏水相互作用色谱。用35mM乙酸钠，0.8M硫酸铵，pH 5.0平衡丁基-琼脂糖凝胶树脂后，将抗体施加至树脂，用平衡缓冲液洗涤并且用线性梯度洗脱至35mM乙酸钠pH 5.0。将含有(单特异性或双特异性)抗体的级分汇集并且使用以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex200 26/60GL(GE Healthcare，瑞典)柱，进一步通过大小排阻色谱纯化。将含有(单特异性或双特异性)抗体的级分汇集，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius StedimBiotechS.A.，法国)浓缩至要求的浓度并贮存在-80℃。
表:双特异性抗<VEGF-ANG-2>抗体的产率
Figure BDA0001049029040001091
每种纯化步骤后使用微流体Labchip技术(Caliper Life Science，美国)通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。根据制造商的说明书，使用HT蛋白质表达试剂盒，制备5μL用于CE-SDS分析的蛋白质溶液，并使用HT蛋白质表达芯片，在Labchip GXII系统上分析。使用Labchip GX软件分析数据。
表:通过CE-SDS确定借助不同顺序的纯化步骤移除常见副产物
Figure BDA0001049029040001092
在25℃使用Superdex 200分析性大小排阻柱(GE Healthcare，瑞典)在2x PBS(20mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，274mM NaCl和5.4mM KCl，pH 7.4)运行缓冲液中，通过高性能SEC分析抗体样品的聚集物含量。将25μg蛋白质以流速0.75mL/分钟注射到柱上并经50分钟等强度洗脱。
类似地，制备抗VEGF-ANG2抗体VEGF/ANG2-0012和VEGF/ANG2-0201并以如下产率纯化：
另外，可以类似地制备并纯化具有IHH-AAA突变并具有SPLE突变的抗VEGF/ANG2双特异性抗体抗VEGF/ANG2CrossMAb IgG4(SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45)、具有IHH-AAA突变的抗VEGF/ANG2OAscFab IgG1(SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48)、具有IHH-AAA突变并具有SPLE突变的抗VEGF/ANG2OAscFab IgG4(SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51)、具有HHY-AAA突变和P329G LALA突变的抗VEGF/ANG2CrossMab IgG1(SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41)、具有HHY-AAA突变和SPLE突变的抗VEGF/ANG2CrossMab IgG4(SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45)、具有HHY-AAA突变的抗VEGF/ANG2OAscFab IgG1(SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:48)和具有HHY-AAA突变和SPLE突变的抗VEGF/ANG2OAscFabIgG4(SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:51)并且还可以类似地制备并纯化抗IGF-1R单特异性抗体抗IGF-1R野生型(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89)、具有IHH-AAA突变的抗IGF-1R IgG1(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90)、具有YTE突变的抗IGF-1R IgG1(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91)、具有KiH突变的抗IGF-1R IgG1野生型(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93)、在扣链中具有KiH突变和IHH-AAA突变的抗IGF-1R IgG1(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95)、在扣链中具有KiH突变和HHY-AAA突变的抗IGF-1R IgG1(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97)、具有KiH突变和YTE突变的抗IGF-1R IgG1(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99)、具有KiH突变和DDD突变的抗IGF-1R IgG1(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101)，和具有HHY-AAA突变的抗IGF-1R IgG1(SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:112)。
实施例2
分析学和可发展性
基于小规模DLS的粘度测量：
粘度测量基本上如(He,F.等人,Analytical Biochemistry 399(2009)141-143)中所述进行。简而言之，将样品在200mM精氨酸琥珀酸盐，pH 5.5中浓缩到多种蛋白质浓度，之后添加聚苯乙烯乳胶珠(300nm直径)和聚山梨醇酯20(0.02％v/v)。将样品通过离心经0.4μm滤板转移入光学384孔平板并用石蜡油覆盖。在25℃通过动态光散射法测定乳胶珠的表观直径。溶液的粘度可以计算为η＝η0(rh/rh，0)(η：粘度；η0：水的粘度；rh：乳胶珠的表观流体动力学半径；rh,0：乳胶珠在水中的流体动力学半径)。
为了允许在相同浓度比较各种样品，粘度-浓度数据用Mooney等式(等式1)(Mooney,M.,Colloid.Sci.,6(1951)162-170；Monkos,K.,Biochem.Biophys.Acta 304(1997)1339)拟合并据此内插数据。
Figure BDA0001049029040001121
(S：蛋白质的流体动力学相互作用参数；K：自集因子；Φ：溶解的蛋白质的体积分数)
图2中显示结果：与Fc区中没有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0015相比，在Fc区中具有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0016在全部测量温度均显示较低的粘度。
DLS聚集起始温度
将样品以1mg/mL的浓度在20mM组氨酸/组氨酸盐酸盐，140mM NaCl，pH 6.0中制备，通过离心经0.4μm滤板转移入光学384孔平板并用石蜡油覆盖。将样品以0.05℃/分钟的速率从25℃加热至80℃的同时，通过动态光散射法重复测量流体动力学半径。聚集起始温度定义为流体动力学半径开始增加的温度。图3中显示结果。在图3中，显示了Fc区中没有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0015和具有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0016的聚集。VEGF/ANG2-0016显示61℃的聚集起始温度，而没有IHH-AAA突变的VEGF/ANG2-0015显示60℃的起始温度。
DLS时程
将样品以1mg/mL的浓度在20mM组氨酸/组氨酸盐酸盐，140mM NaCl，pH 6.0中制备，通过离心经0.4μm滤板转移入光学384孔平板并用石蜡油覆盖。将样品维持在50℃恒定温度直至145小时的同时，通过动态光散射法重复测量流体动力学半径。在这个实验中，天然的解折叠蛋白质在升高温度下的聚集倾向将导致平均粒径随时间推移增加。这种基于DLS的方法对聚集物非常敏感，因为这些聚集物以超比例方式对散射光强度作出贡献。甚至在50℃(接近于聚集起始温度的温度，见上文)145小时后，仅观察到VEGF/ANG2-0015和VEGF/ANG2-0016的平均粒径增加小于0.5nm。
在40℃以100mg/mL储存7日
将样品在200mM精氨酸琥珀酸盐pH 5.5中浓缩至终浓度100mg/mL，无菌过滤并在40℃静止储存7日。在储存之前和之后，通过大小排阻色谱法测定高分子量种类和低分子量种类(分别是HMW和LMW)的含量。存储样品和制备后立即测量的样品之间HMW含量和LMW含量的差异分别报告为“HMW增长”和“LMW增长”。下表和图4中显示结果，这些结果显示，与VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)相比，VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)显示更大的主峰下降并且更高的HMW增长。令人惊讶地，与VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)相比，VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)显示较低的聚集倾向性。
表:在40℃时7天后Δ主峰、HMW峰和LMW峰
Figure BDA0001049029040001131
在25℃使用
Figure BDA0001049029040001132
T100或T200仪(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振(SPR)评估抗VEGF/ANG2双特异性抗体的功能性分析。
Figure BDA0001049029040001133
系统经充分建立用于研究分子相互作用。SPR-技术基于测量靠近镀金生物传感器芯片表面的折射率。折射率的变化表示该表面上固定化配体与溶液中注射的分析物相互作用所引起的质量变化。如果分子与表面上的固定化配体结合，则质量增加，反之在分析物从固定化配体解离(反映复合物解离)的情况下，则质量减少。SPR允许连续实时监测配体/分析物结合作用并且因此确定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。
实施例3
与VEGF、ANG2、FcγR和FcRn的结合
VEGF同工型动力学亲和力，包括评定物种交叉反应性
通过使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒在pH 5.0，在CM5芯片(GEHealthcare BR-1005-30)上偶联约12,000共振单位(RU)捕获系统(10μg/mL山羊抗人F(ab)’2；订单代码：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典)。样品和系统缓冲液是PBS-T(包含0.05％Tween 20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH 7.4。将流动小室设定至25℃-并且将样品块设定至12℃-并用运行缓冲液填装2次。通过在溶液中以流速5μL/分钟注射50nM溶液30秒，捕获双特异性抗体。通过在溶液中以流速30μL/分钟注射多种浓度(始于300nM，1:3稀释)的人hVEGF121、小鼠mVEGF120或大鼠rVEGF164持续300秒，测量结合作用。监测解离相达1200秒并通过将样品溶液转换成运行缓冲液启动。通过用甘氨酸pH 2.1溶液以流速30μL/分钟洗涤60秒，使表面再生。通过扣减从山羊抗人F(Ab’)2表面获得的响应值，修正本体折射率差异。还扣减空白注射(＝双参考)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用朗格缪尔1:1模型。下文显示结果。
ANG2溶液亲和力，包括评定物种交叉反应性
通过确定平衡混合物中游离相互作用配偶体的浓度，溶液亲和力度量相互作用的亲和力。溶液亲和力测定法涉及将保持处于恒定浓度的抗VEGF/ANG2抗体与浓度变动的配体(＝ANG2)混合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒在pH 5.0测定固定在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)表面上的抗体的最大可能共振单位(例如17,000共振单位(RU))。样品和系统缓冲液是HBS-P pH7.4。将流动小室设定至25℃并且将样品块设定至12℃并用运行缓冲液填装2次。为了产生校正曲线，将渐增浓度的ANG2注入含有固定化抗VEGF/ANG2抗体的BIAcore流动小室。将结合型ANG2的量作为共振单位(RU)测定并对浓度作图。将每种配体的溶液(11种浓度，对于抗VEGF/ANG2抗体，从0至200nM)与10nM ANG2温育并且使其在室温达到平衡。从校正曲线测定游离ANG2浓度，所述校正曲线测定在测量具有已知量的ANG2的溶液的响应值之前和之后生成。使用模型201，使用游离ANG2浓度作为y-轴并使用用于抑制的抗体浓度作为x-轴，用XLfit4(IDBS Software)建立一个4参数拟合。通过确定这条曲线的拐点计算亲和力。通过用0.85％H3PO4溶液以流速30μL/分钟洗涤1次30秒，使表面再生。通过扣减从空白偶联的表面获得的响应值，修正本体折射率差异。下文显示结果。
FcRn稳态亲和力
对于FcRn测量，稳态亲和力用来相互比较双特异性抗体。将人FcRn稀释于偶联缓冲液(10μg/mL，乙酸钠pH 5.0)中并通过定向固定法，使用BIAcore wizard，固定在C1芯片(GE Healthcare BR-1005-35)至最终响应值200RU。将流动小室设定至25℃并且将样品块设定至12℃并用运行缓冲液填装2次。样品和系统缓冲液是PBS-T(包含0.05％Tween 20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH6.0。为了评估每种抗体的不同IgG浓度，制备浓度62.5nM、125nM、250nM和500nM。流速设定至30μL/分钟并选择180秒结合时间情况下，将不同样品连续注射到芯片表面上。通过以流速30μL/分钟注射PBS-T pH 8持续60秒，使表面再生。通过扣减从空白表面获得的响应值，修正本体折射率差异。还扣减缓冲液注射(＝双参考)。为了计算稳态亲和力，使用来自BIA-评价软件的方法。简而言之，将RU值对分析的浓度作图，产生剂量-反应曲线。基于一个2参数拟合，计算一条上渐近线，从而允许确定最大半数RU值并因此测定亲和力。图5和下表中显示结果。类似地，可以确定对食蟹猴、小鼠和兔FcRn的亲和力。
FcγRIIIa测量
对于FcγRIIIa测量，使用直接结合测定法。通过使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒在pH 5.0，在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联约3,000共振单位(RU)捕获系统(1μg/ml Penta-His；Qiagen)。样品和系统缓冲液是HBS-P+pH 7.4。将流动小室设定至25℃-并且将样品块设定至12℃-并用运行缓冲液填装2次。通过以流速5μL/分钟注射100nM溶液60秒，捕获FcγRIIIa-His-受体。通过以流速30μL/分钟注射100nM双特异性抗体或单特异性对照抗体(对于IgG1亚类和IgG4亚类抗体，抗洋地黄毒苷抗体)180秒，测量结合作用。通过用甘氨酸pH 2.5溶液以流速30μL/分钟洗涤120秒，使表面再生。因为FcγRIIIa结合作用与朗格缪尔1:1模型不同，用这种测定法仅确定结合/不结合。以相似方式，可以确定FcγRIa结合作用和FcγRIIa结合作用。图6中显示结果，当后续是通过引入突变P329GLALA，未能检测到更多的FcγRIII结合作用。
评定抗VEGF/ANG2抗体的独立VEGF结合作用和ANG-2结合作用
通过使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒在pH 5.0，在CM4芯片(GEHealthcare BR-1005-34)上偶联约3,500共振单位(RU)捕获系统(10μg/mL山羊抗人IgG；GEHealthcare Bio-Sciences AB，瑞典)。样品和系统缓冲液是PBS-T(包含0.05％Tween 20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH 7.4。将流动小室的温度设定至25℃并且将样品块的温度设定至12℃。在捕获之前，将流动小室用运行缓冲液填装2次。
通过以流速5μL/分钟注射10nM溶液60秒，捕获双特异性抗体。通过确定依次或同时添加(流速30μL/分钟)的每种配体的有效结合能力，分析每配体与双特异性抗体的独立结合作用：
1.以浓度200nM注射人VEGF持续180秒(鉴定抗原的单一结合作用)。
2.以浓度100nM注射人ANG2持续180秒(鉴定抗原的单一结合作用)。
3.以浓度200nM注射人VEGF持续180秒，随后额外以浓度100nM注射人ANG2持续180秒(鉴定在VEGF存在下的ANG2结合作用)。
4.以浓度100nM注射人ANG2持续180秒，随后额外以浓度200nM注射人VEGF(鉴定在ANG2存在下的VEGF结合作用)。
5.共注射浓度200nM的人VEGF和浓度100nM的人ANG2持续180秒(鉴定在相同时间VEGF的结合作用和ANG2的结合作用)。
通过用3M MgCl2溶液以流速30μL/分钟洗涤60秒，使表面再生。通过扣减从山羊抗人IgG表面获得的响应值，修正本体折射率差异。
如果方案3、4和5的最终所得信号等于或类似于方案1和2的各最终信号的总和，则双特异性抗体能够相互独立地结合两种抗原。下表中显示结果，其中两种抗体VEGF/ANG2-0016、VEGF/ANG2-0012均显示能够相互独立地与VEGF和ANG2结合。
评定抗VEGF/ANG2抗体的同时VEGF结合作用和ANG-2结合作用
首先，通过使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒在pH 5.0，在CM4芯片(GEHealthcare BR-1005-34)上偶联约1,600共振单位(RU)的VEGF(20μg/mL)。样品和系统缓冲液是PBS-T(包含0.05％Tween 20的10mM磷酸盐缓冲盐水)pH 7.4。将流动小室设定至25℃并且将样品块设定至12℃并用运行缓冲液填装2次。其次，将50nM的双特异性抗体溶液以流速30μL/分钟注射180秒。第三，将hANG2以流速30μL/分钟注射180秒。hANG2的结合响应取决于与VEGF结合的双特异性抗体的量并且显示同时结合作用。通过用0.85％H3PO4溶液以流速30μL/分钟洗涤60秒，使表面再生。同时结合作用由hANG2对先前VEGF结合的抗VEGF/ANG2抗体的额外特异性结合信号显示。对二种双特异性抗体VEGF/ANG2-0015和VEGF/ANG2-0016而言，可以检测到抗VEGF/ANG2抗体与VEGF及与ANG-2的同时结合作用(数据未显示)。
表:结果：对来自不同物种的VEGF同工型的动力学亲和力
Figure BDA0001049029040001171
表:结果：对ANG2的溶液亲和力
Figure BDA0001049029040001172
表:结果：抗VEGF/ANG2抗体对FcRn的亲和力
Figure BDA0001049029040001173
Figure BDA0001049029040001181
表:与FcγRI–IIIa的结合结果
VEGF/ANG2-0015 VEGF/ANG2-0016 VEGF/ANG2-0012 VEGF/ANG2-0201
FcγRIa 不结合 不结合 结合 结合
FcγRIIa 不结合 不结合 不结合 结合
FcγRIIIa 不结合 不结合 不结合 结合
表:结果：抗VEGF/ANG2抗体对VEGF和ANG2的独立结合作用
Figure BDA0001049029040001182
实施例4
质谱法
这个章节描述抗VEGF/ANG2抗体的表征，重点在于正确装配。通过去糖基化以及完整或IdeS消化(化脓性链球菌(S.pyogenes)的IgG降解酶)的抗VEGF/ANG2抗体的电喷雾电离质谱法(ESI-MS)，证实预期的一级结构。用100μg纯化抗体进行IdeS-消化，所述抗体与2μg IdeS蛋白酶(Fabricator)在100mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH 7.1中在37℃温育5小时。随后，将抗体以蛋白质浓度1mg/mL在100mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH 7.1中用N-糖苷酶F、神经氨酸酶和O-糖苷酶(Roche)在37℃去糖基化达16小时并且随后在Sephade x G25柱(GEHealthcare)上通过HPLC脱盐。在配备TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上，通过ESI-MS测定总质量。
对IdeS消化的去糖基化(下表)或完整的去糖基化(下表)的分子获得的质量对应于预测质量，所述预测质量从由两条不同轻链LCANG-2和LCLucentis和两条不同重链HCANG-2和HCLucentis组成的抗VEGF/ANG2抗体的氨基酸序列推断。
表:去糖基化和IdeS消化的双特异性抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0201(没有IHH-AAA突变)和VEGF/ANG2-0012(具有IHH-AAA突变)的质量
Figure BDA0001049029040001191
表:去糖基化的抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)和VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)的质量
Figure BDA0001049029040001192
实施例5
FcRn色谱
偶联于链霉亲和素琼脂糖凝胶：
将1克链霉亲和素琼脂糖凝胶(GE Healthcare)添加至生物素酰化和透析的受体并温育两个小时伴以振摇。将受体衍生化的琼脂糖凝胶填充于1mL XK柱(GE Healthcare)中。
使用FcRn亲和柱的色谱：
条件：
柱尺寸：50mm x 5mm
床高度：5cm
载量：50μg样品
平衡缓冲液：20mM MES，含150mM NaCl，调节至pH 5.5
洗脱缓冲液：20mM Tris/HCl，含150mM NaCl，调节至pH 8.8
洗脱：7.5CV平衡缓冲液，在30CV内至100％洗脱缓冲液，10CV洗脱缓冲液
人FcRn亲和柱色谱
在下表中，给出抗VEGF-ANG2抗体在包含人FcRn的亲和柱上的保留时间。使用上述条件，获得数据。
表:结果：抗VEGF/ANG2抗体的保留时间
抗体 保留时间[分钟]
VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变) 78.5
VEGF/ANG2-0201(没有IHH-AAA突变) 78.9
VEGF/ANG2-0012(具有IHH-AAA突变) 2.7(空隙峰)
VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变) 2.7(空隙峰)
实施例6
具有IHH-AAA突变的抗体的药代动力学(PK)特性
人FcRn转基因的FcRn小鼠的PK数据
在生活阶段：
该研究包括雌性C57BL/6J小鼠(背景)；FcRn缺陷型，但呈人FcRn半合子转基因的小鼠(huFcRn，品系276-/tg)
第1部分：
以适宜溶液的2μL/动物，以玻璃体内方式向右眼中注射全部小鼠一次(即21μg化合物/动物(VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变))或23.6μg化合物/动物(VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变))。
将小鼠分配至2个组，每组6只动物。血液样品在给药后2、24和96小时取自组1并且在给药后7、48和168小时取自组2。
通过利用德国柏林World Precision Instruments,Inc.的用于纳升注射的NanoFil微量注射器系统，向小鼠右眼的玻璃体中注射。将小鼠用2.5％异氟烷麻醉，并且为了观察小鼠眼，使用放大率为40倍和具有Leica KL 2500LCD闪光的环形灯的Leica MZFL3显微镜。随后，使用35号针注射2μL化合物。
通过对侧眼的眼球后静脉丛，从每只动物采集血液以测定血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9300x g)3分钟从血液获得至少50μL血清样品。血清样品在离心后随即冷冻并在-80℃冷冻贮藏直至分析。处理后96小时，分离组1的动物的处理眼，并且处理后168小时，分离组2的动物的处理眼。样品在-80℃冷冻贮藏直至分析。
第2部分：
以适宜溶液的200μL/动物，以静脉内方式经尾静脉注射全部小鼠一次(即21μg化合物/动物(VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变))或23.6μg化合物/动物(VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变))。
将小鼠分配至2个组，每组5只动物。血液样品在给药后1、24和96小时取自组1并且在给药后7、48和168小时取自组2。通过眼球后静脉丛，从每只动物采集血液以测定血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9300x g)3分钟从血液获得至少50μL血清样品。血清样品在离心后随即冷冻并在-80℃冷冻贮藏直至分析。
全眼裂解物(小鼠)的制备
通过物理-化学瓦解来自实验室动物的全眼，获得眼裂解物。为了机械破裂，将每只眼转移至一个1.5mL圆锥底微量小瓶。在冷冻和解冻后，将眼用1mL细胞洗涤缓冲液洗涤一次(Bio-Rad，Bio-Plex细胞溶解试剂盒，目录号171-304011)。在后续步骤中，添加500μL新鲜制备的细胞溶解缓冲液并且使用1.5mL组织碾磨研杵(Kimble Chase，1.5mL研杵，产品编号749521-1500)，研磨该眼。随后将混合物冷冻并融化5次并再次研磨。为了将裂解物与剩余组织分离，将样品以4,500g离心4分钟。在离心后，将上清液收集并贮存在-20℃直至在定量ELISA中进一步分析。
分析
用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定小鼠血清和眼裂解物中抗VEGF/ANG2抗体的浓度。
为了定量小鼠血清样品和眼裂解物中的抗VEGF/ANG2抗体，进行标准固相系列夹心免疫测定，使用生物素酰化的和洋地黄毒苷化的单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体。为了验证分析物的双特异性的完整性，生物素酰化的捕获抗体识别VEGF-结合位点，而洋地黄毒苷化的检测抗体将与分析物的ANG2结合位点结合。随后用与抗洋地黄毒苷抗体偶联的辣根过氧化物酶检测在链霉亲和素包被的微量滴定平板(SA-MTP)的固相上的捕获抗体、分析物和检测抗体的结合型免疫复合物。在从SA-MTP洗去未结合的物质并添加ABTS-底物后，获得的信号与SA-MTP固相上结合的分析物的量成正比。随后通过参考同时分析的校准物将样品的测量信号换算成浓度，进行定量。
在第一步骤中，将SA-MTP在MTP摇板机上以500转/分钟用浓度1μg/mL的100μL/孔生物素酰化捕获抗体溶液(mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS)，抗独特型抗体)包被1小时。同时，制备校准物、QC样品和样品。将校准物和QC样品稀释至2％血清基质；将样品稀释直至信号处于校准物的线性范围内。
在SA-MTP用捕获抗体包被后，将平板用洗涤缓冲液和300μL/孔洗涤3次。随后，将100μL/孔校准物、QC样品和样品吸到SA-MTP上并以500转/分钟再次温育1小时。分析物现在借助其VEGF结合位点通过捕获抗体与SA-MTP的固相结合。在温育并通过洗涤平板移除未结合的分析物后，将浓度250ng/mL的100μL/孔第一检测抗体(mAb<Id-<ANG2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu)，抗独特型抗体)添加至SA-MTP。再次，将平板在摇床上以500转/分钟温育1小时。在洗涤后，将浓度50mU/mL的100μL/孔第二检测抗体(pAb<洋地黄毒苷>S-Fab-POD(多聚))添加至SA-MTP各孔并且将平板以500转/分钟再次温育1小时。在移除过量检测抗体的最终洗涤步骤后，添加100μL/孔底物(ABTS)。抗体-酶缀合物催化
Figure BDA0001049029040001221
底物的颜色反应。随后通过ELISA读数仪在405nm波长(参考波长：490nm([405/490]nm))测量信号。
药代动力学评价
使用药代动力学评价程序WinNonlinTM(Pharsight)第5.2.1版，通过非房室分析计算药代动力学参数。
结果：
A)血清浓度
下表和图7B至图7C中显示血清浓度的结果。
表:VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)：玻璃体内施加和静脉内施加后血清浓度的比较
玻璃体内施加后的血清浓度 静脉内施加后的血清浓度
ID 平均浓度[μg/mL] 平均浓度[μg/mL]
1小时 17.7
2小时 9.8
7小时 10.4 12.1
24小时 6.4 8.3
48小时 6.5 6.9
96小时 3.4 4.1
168小时 2.9 2.7
表:VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)：玻璃体内施加和静脉内施加后血清浓度的比较
Figure BDA0001049029040001231
Figure BDA0001049029040001241
表:VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)和VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)：玻璃体内施加后各血清浓度的比较
Figure BDA0001049029040001242
表:VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)和VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)：静脉内施加后各血清浓度的比较
结果：
B)在左眼和右眼的眼裂解物中的浓度
下表和图7D至图7E中显示眼裂解物中浓度的结果。
表:玻璃体内施加至右眼后VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)在眼裂解物中的浓度
表:静脉内施加后VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)在眼裂解物中的浓度
Figure BDA0001049029040001252
表:玻璃体内施加至右眼后VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)在眼裂解物中的浓度
Figure BDA0001049029040001253
表:静脉内施加后VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)在眼裂解物中的浓度
Figure BDA0001049029040001254
Figure BDA0001049029040001261
结果总结：
在玻璃体内施加后，与没有IHH-AAA突变的双特异性抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0015相比，如本文中报道的双特异性VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)在眼裂解物中显示相似的浓度(96小时和168小时后)。
另外，在玻璃体内施加后，与没有IHH-AAA突变的双特异性VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0015相比，如本文中报道的双特异性VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0016(具有IHH-AAA突变)额外显示在血清中更快的清除作用和较短的半寿期。
实施例7
小鼠角膜微囊袋血管生成测定法
为了测试具有SEQ ID NO:20和21的相应VEGF结合性VH和VL以及SEQ ID NO:28和29的ANG2结合性VH和VL的双特异抗VEGF/ANG2抗体在体内对VEGF所致血管生成过程的抗血管生成作用，实施小鼠角膜血管生成测定法。在这个测定法中，将浸透VEGF的Nylaflo圆片以相对于角膜缘血管而言固定的距离植入无血管的角膜囊袋中。血管立即生长至角膜中指向正在形成的VEGF梯度。8至10周龄雌性BALB/c小鼠购自Charles River，Sulzfeld，德国。研究方案根据Rogers,M.S.等人,Nat.Protoc.2(2007)2545-2550描述的方法调整。简而言之，在麻醉小鼠中使用手术刀片和尖头镊，在显微镜下按照从角膜缘至角膜顶部的大约1mm制备宽度约500μm的微囊袋。植入直径0.6mm的圆片(
Figure BDA0001049029040001262
Pall Corporation，Michigan)并且平整植入区域的表面。将圆片在相应的生长因子中或在载体中温育至少30分钟。在3、5和7日(或备选地仅在3，5或7日)后，将眼照相并测量血管反应。通过计算新血管面积/角膜总面积的百分数，将该测定法定量。
将圆片用300ng VEGF或PBS加载作为对照并植入7日。随时间推移在第3、5和/或7日监测血管从角膜缘至圆片的生长晕。在圆片植入之前一日，将抗体以剂量10mg/kg静脉内施用(归因于静脉内施加，使用仅因IHH-AAA突变与VEGF/ANG2-0016不同并具有相同的结合VEGF和ANG-2的VH和VL以介导效力的血清稳定的VEGF/ANG2-0015(没有IHH-AAA突变)作为代用品)以在体内测试对VEGF所致血管生成的抗血管生成作用。对照组中的动物接受溶媒。施加体积是10mL/kg。
实施例8
具有HHY-AAA突变的抗体的药代动力学(PK)特性
人FcRn转基因的FcRn小鼠的PK数据
在生活阶段：
该研究包括雌性C57BL/6J小鼠(背景)；小鼠FcRn缺陷型，但呈人FcRn半合子转基因的小鼠(huFcRn，品系276-/tg)
第1部分：
用适宜的IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045溶液(即22.2μg化合物/动物的IGF-1R 0033、24.4μg化合物/动物的IGF-1R 0035、32.0μg化合物/动物的IGF-1R和32.0μg化合物/动物的IGF-1R 0045)，向全部小鼠的右眼中按玻璃体内方式注射至一次。
将13只小鼠分配至2个组，每个组分别有6只和7只动物。血液样品在给药后2、24和96小时取自组1并且在给药后7、48和168小时取自组2。
通过利用德国柏林World Precision Instruments,Inc.的用于纳升注射的NanoFil微量注射器系统，向小鼠右眼的玻璃体中注射。将小鼠用2.5％异氟烷麻醉，并且为了观察小鼠眼，使用放大率为40倍和具有Leica KL 2500LCD闪光的环形灯的Leica MZFL3显微镜。随后，使用35号针注射2μL化合物。
通过对侧眼的眼球后静脉丛，从每只动物采集血液以测定血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9300x g)3分钟从血液获得至少50μL血清样品。血清样品在离心后随即冷冻并在-80℃冷冻贮藏直至分析。处理后96小时，分离组1动物的处理眼，并且处理后168小时，分离组2动物的处理眼。样品在-80℃冷冻贮藏直至分析。
第2部分：
用适宜的IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045溶液(即22.2μg化合物/动物的IGF-1R 0033、24.4μg化合物/动物的IGF-1R 0035、32.0μg化合物/动物的IGF-1R和32.0μg化合物/动物的IGF-1R 0045)，按静脉内方式经尾静脉注射全部小鼠一次。
将12只小鼠分配至2个组，每组6只动物。血液样品在给药后1、24和96小时取自组1并且在给药后7、48和168小时取自组2。通过眼球后静脉丛，从每只动物采集血液以测定血清中的化合物水平。
在室温1小时后，通过在4℃离心(9300x g)3分钟从血液获得至少50μL血清样品。血清样品在离心后随即冷冻并在-80℃冷冻贮藏直至分析。
细胞溶解缓冲液的制备
小心混合100μL因子1、50μL因子2和24.73mL细胞溶解缓冲液(全部来自Bio-Rad，Bio-Plex细胞溶解试剂盒，目录号：171-304011)并且添加125μL PMSF-溶液(稀释于2.0mLDMSO中的174.4mg苯甲基磺酰氟)。
全眼裂解物(小鼠)的制备
通过物理-化学瓦解来自实验室动物的全眼，获得眼裂解物。为了机械破裂，将每只眼转移至一个1.5mL圆锥底微量小瓶。在解冻后，将眼用1mL细胞洗涤缓冲液洗涤一次(Bio-Rad，Bio-Plex细胞溶解试剂盒，目录号171-304011)。在后续步骤中，添加500μL新鲜制备的细胞溶解缓冲液并且使用1.5mL组织碾磨研杵(VWR Int.，产品编号431-0098)，研磨该眼。随后将混合物冷冻并融化5次并再次研磨。为了将裂解物与剩余组织分离，将样品以4500x g离心4分钟。在离心后，将上清液收集并贮存在-20℃直至在定量ELISA中进一步分析。
分析(血清)
为了定量小鼠血清样品中的抗体，进行标准固相系列夹心免疫测定，使用生物素酰化的和洋地黄毒苷化的单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体。血清占据整个血液样品体积的约50％。
更详细地，通过人IgG(Fab)特异性酶联免疫吸附测定法确定小鼠血清样品中抗体的浓度。将链霉亲和素包被的微量滴定板在室温与作为捕获抗体稀释于分析缓冲液中的生物素酰化抗人Fab(kappa)单克隆抗体M-1.7.10-IgG温育1小时伴以搅拌。用磷酸盐缓冲盐水-聚山梨醇酯20(Tween 20)洗涤3次后，将血清样品按多个稀释度添加，随后在室温第二次温育1小时。在三次反复洗涤后，通过后续与缀合于洋地黄毒苷的抗人Fab(CH1)单克隆抗体M-1.19.31-IgG温育，随后与缀合于辣根过氧化物酶(HRP)的抗洋地黄毒苷抗体温育，检测结合的抗体。使用ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-6-磺酸)；RocheDiagnostics GmbH，曼海姆，德国)作为HRP底物以形成有色反应产物。在405nm读取所产生的反应产物的吸光度(ABTS；参考波长：490nm)。
将全部样品、阳性对照样品和阴性对照样品一式两份分析并且针对提供的抗体标准校准。
分析(眼裂解物)
基于
Figure BDA0001049029040001291
仪平台(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国)在非GLP条件下，使用合格的电化学发光免疫测定法(ECLIA)方法测定小鼠眼裂解物样品中分析物的浓度。
将未稀释的上清液(眼裂解物)与捕获分子和检测分子在37℃温育9分钟。使用生物素酰化的抗人-Fab(kappa)单克隆抗体M-1.7.10-IgG作为捕获分子并且将钌(II)三(双吡啶基)3 2+标记的抗人-Fab(CH1)单克隆抗体M-1.19.31-IgG用于检测。添加链霉亲和素包被的磁性的微粒子并且在37℃温育额外9分钟，以允许预先形成的免疫复合物因生物素-链霉亲和素相互作用而结合。以磁性方式在电极上捕获微粒子并且使用共反应物三丙胺(TPA)生成化学发光信号。通过光电倍增探测器测量获得的信号。
表：标准表IGF-1R 0033
表：标准表IGF-1R 0035
表：标准表IGF-1R 0045
Figure BDA0001049029040001311
结果：
A)血清浓度
下表和图17中显示血清浓度的结果。
表：IGF-1R 0033(没有HHY-AAA突变)：玻璃体内施加和静脉内施加后血清浓度的比较(n.d.＝未测定)
玻璃体内施加后的血清浓度 静脉内施加后的血清浓度
ID 平均浓度[μg/mL] 平均浓度[μg/mL]
1小时 n.d. 34.7
2小时 5.9 n.d.
7小时 11.1 24.7
24小时 4.4 13.6
48小时 7.8 12.6
96小时 2.1 8.9
168小时 2.9 6.2
表：IGF-1R 0035(在一条Fc区多肽中具有HHY-AAA突变)：玻璃体内施加和静脉内施加后血清浓度的比较
Figure BDA0001049029040001321
表：IGF-1R 0045(在两条Fc区多肽中具有HHY-AAA突变)：玻璃体内施加和静脉内施加后血清浓度的比较(BLQ＝定量限以下)
玻璃体内施加后的血清浓度 静脉内施加后的血清浓度
ID 平均浓度[μg/mL] 平均浓度[μg/mL]
1小时 n.d. 40.5
2小时 13.2 n.d.
7小时 9.6 21.7
24小时 2.2 5.1
48小时 0.9 0.7
96小时 0.05 0.03
168小时 0.01 BLQ
表：静脉内施加抗体IGF-1R 0033、0035和0045后对1μg施加的抗体归一化的血清浓度的比较
Figure BDA0001049029040001322
Figure BDA0001049029040001331
结果：
B)在左眼和右眼的眼裂解物中的浓度
下表和图18至20中显示眼裂解物中浓度的结果。
表：在玻璃体内施加入右眼后眼裂解物中IGF-1R 0033(没有HHY-AAA突变)的浓度
Figure BDA0001049029040001332
表：在静脉内施加后眼裂解物中IGF-1R 0033(没有HHY-AAA突变)的浓度(BLQ＝定量限以下)
Figure BDA0001049029040001333
表：在玻璃体内施加入右眼后眼裂解物中IGF-1R 0035(在一条Fc区多肽中具有HHY-AAA突变)的浓度
Figure BDA0001049029040001334
Figure BDA0001049029040001341
表：在静脉内施加后眼裂解物中IGF-1R 0035(在一条Fc区多肽中具有HHY-AAA突变)的浓度(BLQ＝定量限以下)
Figure BDA0001049029040001342
表：在玻璃体内施加入右眼后眼裂解物中IGF-1R 0045(在两条Fc区多肽中均具有HHY-AAA突变)的浓度
Figure BDA0001049029040001343
表：在静脉内施加后眼裂解物中IGF-1R 0045(在两条Fc区多肽中均具有HHY-AAA突变)的浓度(BLQ＝定量限以下)
表：在玻璃体内施加入右眼后眼裂解物中对1μg施加的抗体归一化的IGF-1R0033、0035和0045浓度
Figure BDA0001049029040001351
结果总结：
在玻璃体内施加后，与没有HHY-AAA突变的抗IGF-1R抗体(IGF-1R 0033)相比，如本文中报道的抗IGF-1R抗体0035和0045(具有一侧或两侧HHY-AAA突变)在眼裂解物中显示(96小时和168小时后)相似的浓度。
另外，在玻璃体内施加后，与没有HHY-AAA突变的抗IGF-1R抗体(IGF-1R0033)相比，如本文中报道的抗IGF-1R抗体0035和0045(具有一侧或两侧HHY-AAA突变)在血清中额外地显示更快的清除和较短的半寿期。
虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述了前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。
Figure IDA0001049029100000011
Figure IDA0001049029100000021
Figure IDA0001049029100000031
Figure IDA0001049029100000041
Figure IDA0001049029100000051
Figure IDA0001049029100000061
Figure IDA0001049029100000071
Figure IDA0001049029100000081
Figure IDA0001049029100000091
Figure IDA0001049029100000101
Figure IDA0001049029100000111
Figure IDA0001049029100000121
Figure IDA0001049029100000131
Figure IDA0001049029100000141
Figure IDA0001049029100000151
Figure IDA0001049029100000161
Figure IDA0001049029100000171
Figure IDA0001049029100000181
Figure IDA0001049029100000191
Figure IDA0001049029100000201
Figure IDA0001049029100000211
Figure IDA0001049029100000231
Figure IDA0001049029100000241
Figure IDA0001049029100000251
Figure IDA0001049029100000261
Figure IDA0001049029100000271
Figure IDA0001049029100000281
Figure IDA0001049029100000301
Figure IDA0001049029100000311
Figure IDA0001049029100000321
Figure IDA0001049029100000331
Figure IDA0001049029100000341
Figure IDA0001049029100000351
Figure IDA0001049029100000361
Figure IDA0001049029100000371
Figure IDA0001049029100000381
Figure IDA0001049029100000391
Figure IDA0001049029100000401
Figure IDA0001049029100000411
Figure IDA0001049029100000421
Figure IDA0001049029100000431
Figure IDA0001049029100000441
Figure IDA0001049029100000451
Figure IDA0001049029100000461
Figure IDA0001049029100000471
Figure IDA0001049029100000481
Figure IDA0001049029100000491
Figure IDA0001049029100000501
Figure IDA0001049029100000511
Figure IDA0001049029100000521
Figure IDA0001049029100000531
Figure IDA0001049029100000551
Figure IDA0001049029100000561
Figure IDA0001049029100000571
Figure IDA0001049029100000581
Figure IDA0001049029100000591
Figure IDA0001049029100000601
Figure IDA0001049029100000621
Figure IDA0001049029100000631
Figure IDA0001049029100000641
Figure IDA0001049029100000661
Figure IDA0001049029100000681
Figure IDA0001049029100000691
Figure IDA0001049029100000701
Figure IDA0001049029100000711
Figure IDA0001049029100000731
Figure IDA0001049029100000741
Figure IDA0001049029100000751
Figure IDA0001049029100000761
Figure IDA0001049029100000771
Figure IDA0001049029100000781
Figure IDA0001049029100000791
Figure IDA0001049029100000801
Figure IDA0001049029100000811
Figure IDA0001049029100000821
Figure IDA0001049029100000831
Figure IDA0001049029100000841
Figure IDA0001049029100000851
Figure IDA0001049029100000861
Figure IDA0001049029100000871
Figure IDA0001049029100000891
Figure IDA0001049029100000901
Figure IDA0001049029100000921
Figure IDA0001049029100000931
Figure IDA0001049029100000961
Figure IDA0001049029100000971
Figure IDA0001049029100000991
Figure IDA0001049029100001001
Figure IDA0001049029100001011
Figure IDA0001049029100001021
Figure IDA0001049029100001031
Figure IDA0001049029100001051
Figure IDA0001049029100001061
Figure IDA0001049029100001071
Figure IDA0001049029100001091
Figure IDA0001049029100001101
Figure IDA0001049029100001111
Figure IDA0001049029100001131
Figure IDA0001049029100001141
Figure IDA0001049029100001151
Figure IDA0001049029100001161
Figure IDA0001049029100001171
Figure IDA0001049029100001181

Claims (11)

1.一种多肽，包含
第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含属于人IgG1亚类的含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，
其中第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A(根据EU索引编号)，且
其中第一多肽还包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W。
2.根据权利要求1所述的多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变L234A和L235A。
3.根据权利要求1所述的多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变P329G。
4.根据权利要求2所述的多肽，特征在于第一多肽和第二多肽还包含突变P329G。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，特征在于多肽是双特异性抗体。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，用于玻璃体内施用。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，用于治疗眼血管病。
8.药物制剂，包含根据权利要求1至5中任一项所述的多肽和任选地可药用载体。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，用于治疗眼病。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，用于从眼转运可溶性受体配体经血-眼屏障至血液循环中。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，用于从眼移除一种或多种可溶性受体配体。
CN201580004548.6A 2014-01-15 2015-01-12 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体 Active CN105916880B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911344011.0A CN110981957A (zh) 2014-01-15 2015-01-12 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14151322 2014-01-15
EP14151322.6 2014-01-15
EP14165924 2014-04-25
EP14165924.3 2014-04-25
PCT/EP2015/050389 WO2015107015A1 (en) 2014-01-15 2015-01-12 Fc-region variants with improved protein a-binding

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911344011.0A Division CN110981957A (zh) 2014-01-15 2015-01-12 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105916880A CN105916880A (zh) 2016-08-31
CN105916880B true CN105916880B (zh) 2020-01-17

Family

ID=52358762

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580004548.6A Active CN105916880B (zh) 2014-01-15 2015-01-12 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体
CN201911344011.0A Pending CN110981957A (zh) 2014-01-15 2015-01-12 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911344011.0A Pending CN110981957A (zh) 2014-01-15 2015-01-12 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体

Country Status (10)

Country Link
US (3) US20170044246A1 (zh)
EP (2) EP3094648A1 (zh)
JP (2) JP6778110B2 (zh)
KR (1) KR20160104636A (zh)
CN (2) CN105916880B (zh)
BR (1) BR112016014969A2 (zh)
CA (1) CA2932364A1 (zh)
MX (1) MX2016008782A (zh)
RU (1) RU2698969C2 (zh)
WO (1) WO2015107015A1 (zh)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
JP5768147B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一価抗原結合タンパク質
MX2016003593A (es) * 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
EP3411404B1 (en) 2016-02-03 2022-11-09 Amgen Research (Munich) GmbH Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
AU2017238172A1 (en) 2016-03-21 2018-09-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
MA54052A (fr) * 2018-10-29 2022-02-09 Hoffmann La Roche Formulation d'anticorps
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
CA3130628A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
CN114126714A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
CN114026122A (zh) 2019-02-21 2022-02-08 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
JP2022521937A (ja) 2019-02-21 2022-04-13 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ＮＫｐ３０に結合する抗体分子およびその使用
MA56467A (fr) * 2019-07-02 2022-05-11 Telix Int Pty Ltd Anticorps dirigés contre caix avec une affinité réduite pour le récepteur fc néonatal
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
AU2021331075A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
PE20230986A1 (es) 2020-09-04 2023-06-21 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a y ang2, y metodos de uso
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
CA3231335A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Sergei Aleksandrovich LEGOTSKII Bispecific antibody comprising a heterodimer based on mhc proteins
CN115873127A (zh) * 2021-11-26 2023-03-31 深圳科兴药业有限公司 重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途
US20230250133A1 (en) * 2022-02-10 2023-08-10 Kodiak Sciences Inc. Methods of purifying a product
CN117467025B (zh) * 2023-12-28 2024-04-16 上海鼎新基因科技有限公司 一种抗vegf和补体双功能融合蛋白及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013004842A2 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Antibody variants and uses thereof

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
CA2502904C (en) 2002-10-15 2013-05-28 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US6736056B1 (en) 2002-11-15 2004-05-18 A Marek Ken Company Manual ink applicator
US7579157B2 (en) 2003-07-10 2009-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody selection method against IGF-IR
MXPA06001634A (es) 2003-08-13 2006-04-28 Pfizer Prod Inc Anticuerpos humanos modificados igf-1r.
JP2007507237A (ja) 2003-10-03 2007-03-29 ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファウンデイション インコーポレイテッド 植物における香味および芳香性の揮発性物質の合成のための材料および方法
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
JP2008504002A (ja) 2003-11-12 2008-02-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
WO2005058967A2 (en) 2003-12-16 2005-06-30 Pierre Fabre Medicament Novel anti-insulin/igf-i hybrid receptor or anti-insulin/igf-i hybrid receptor and igf-ir antibodies and uses thereof
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
US20060067930A1 (en) 2004-08-19 2006-03-30 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20080070675A1 (en) 2004-10-01 2008-03-20 Gagner Mark B Method and Apparatus for Serverless Storage of Information
EP2325207B1 (en) 2004-11-12 2017-03-15 Xencor, Inc. FC variants with altered binding to FCRN
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
JP4937138B2 (ja) * 2005-01-05 2012-05-23 エフ−シュタール・ビオテヒノロギシェ・フォルシュングス−ウント・エントヴィックルングスゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 相補性決定領域とは異なる分子の領域に設計された結合性を持つ合成免疫グロブリンドメイン
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP2009531371A (ja) 2006-03-28 2009-09-03 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｉｇｆ−１ｒヒト・モノクローナル抗体製剤
US20080112961A1 (en) * 2006-10-09 2008-05-15 Macrogenics, Inc. Identification and Engineering of Antibodies with Variant Fc Regions and Methods of Using Same
EP2407548A1 (en) 2006-10-16 2012-01-18 MedImmune, LLC Molecules with reduced half-lives, compositions and uses thereof
PT2099823E (pt) 2006-12-01 2014-12-22 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP2087111A2 (en) 2007-03-19 2009-08-12 Medimmune Limited Polypeptide variants
DK2155789T3 (da) * 2007-05-01 2013-10-21 Res Dev Foundation Immunoglobulin-Fc-biblioteker
US8048621B2 (en) 2007-10-03 2011-11-01 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
US20090291088A1 (en) 2008-04-11 2009-11-26 Biogen Idec Ma Inc. Therapeutic combinations of anti-igf-1r antibodies and other compounds
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
EP2350317A4 (en) 2008-10-20 2012-06-27 Univ Colorado Regents BIOLOGICAL MARKERS FOR PREDICTING THE ANTICIPATE RESPONSE TO INSULINARY GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR KINASE INHIBITORS
UA105198C2 (ru) 2008-12-12 2014-04-25 Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитело против инсулиноподобных факторов роста
EP2373689A1 (en) 2008-12-12 2011-10-12 MedImmune, LLC Crystals and structure of a human igg fc variant with enhanced fcrn binding
JP2012519170A (ja) 2009-02-26 2012-08-23 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー 生体内の腫瘍細胞のｅｍｔステータスをモニターするためのｉｎｓｉｔｕ法
EP2414391B1 (en) 2009-04-02 2018-11-28 Roche Glycart AG Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
JP5587975B2 (ja) 2009-04-07 2014-09-10 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 二重特異的抗−ＥｒｂＢ−３／抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体
AU2010238858A1 (en) * 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
WO2010141329A1 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives and uses thereof
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
EP2451479B1 (en) 2009-07-06 2015-04-01 F.Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
CA2783665A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
AR080794A1 (es) * 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
EA201201435A1 (ru) 2010-04-20 2013-04-30 Генмаб А/С ГЕТЕРОДИМЕРНЫЕ АНТИТЕЛО-Fc-СОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
GB201009172D0 (en) 2010-06-01 2010-07-14 Novaucd Process
DE102010032050B4 (de) 2010-07-23 2017-12-21 Continental Automotive Gmbh Düsenkörper mit Sackloch
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
KR101941514B1 (ko) 2010-12-22 2019-01-23 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 개선된 반감기를 가지는 변형된 항체
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
JP5972915B2 (ja) 2011-03-16 2016-08-17 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｃ変異体
MX336740B (es) 2011-03-29 2016-01-29 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
EP3825325A3 (en) * 2011-03-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
PE20141521A1 (es) 2011-08-23 2014-10-25 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
CN104302668A (zh) 2011-09-23 2015-01-21 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性的抗-egfr/抗igf-1r抗体
LT2771364T (lt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab A/S Heterodimerinių baltymų gamyba
EP2825036B1 (en) 2012-03-16 2018-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
WO2014006217A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
WO2014036385A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor 1 (igf-1)
EP2900696A1 (en) * 2012-09-25 2015-08-05 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
RU2019108429A (ru) * 2013-04-29 2019-05-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифицированные асимметричные антитела, связывающие fc-рецептор, и способы их применения
ES2746136T3 (es) 2013-04-29 2020-03-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos modificados de unión a FcRn humano y procedimientos de uso
CN105164158A (zh) * 2013-04-29 2015-12-16 豪夫迈·罗氏有限公司 消除对FcRn-结合的抗-IGF-1R抗体及其在血管性眼病治疗中的用途
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013004842A2 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Antibody variants and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3094648A1 (en) 2016-11-23
US20190127457A1 (en) 2019-05-02
JP6778110B2 (ja) 2020-10-28
KR20160104636A (ko) 2016-09-05
US20230183330A1 (en) 2023-06-15
CN110981957A (zh) 2020-04-10
MX2016008782A (es) 2016-09-08
RU2016133347A3 (zh) 2018-08-09
CA2932364A1 (en) 2015-07-23
JP2021008508A (ja) 2021-01-28
RU2016133347A (ru) 2018-02-20
CN105916880A (zh) 2016-08-31
JP2017508726A (ja) 2017-03-30
JP7012800B2 (ja) 2022-02-14
WO2015107015A1 (en) 2015-07-23
US20170044246A1 (en) 2017-02-16
RU2698969C2 (ru) 2019-09-02
US11555067B2 (en) 2023-01-17
BR112016014969A2 (pt) 2018-01-23
EP3842455A1 (en) 2021-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105916880B (zh) 具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体
AU2019200635B2 (en) Human FcRn-binding modified antibodies and methods of use
CN105899534B (zh) 具有修饰的FCRN和保持的蛋白A结合性质的Fc区变体
CN105873948B (zh) 具有修饰的FCRN结合性质的Fc区变体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1228410

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant