JP5587975B2 - 二重特異的抗−ErbB−3/抗−c−Met抗体 - Google Patents
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Description
ErbBタンパク質ファミリーは、4種のメンバー、すなわちErbB-1(また、上皮成長因子受容体(EGFR)とも呼ばれる)、ErbB-2(また、ヒトにおいてHER2又は齧歯動物においてneuとも呼ばれる)、ErbB-3(HER3とも呼ばれる)、及びErbB-4(また、HER4とも呼ばれる)から成る。
ErbB-3(V-erb-b2赤芽球性白血病ウィルス腫瘍遺伝子相同体3(鳥類)、ERBB3、HER3;配列番号:46としても知られている)は、ニューレグリン結合ドメインを有するが、しかし活性キナーゼドメインは有さない膜−結合タンパク質である(Kraus, M.H, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989) 9193-7; Plowman, G.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1999) 4905-9; Katoh, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1993) 1189-97)。従って、それはこのリガンドを結合することができるが、しかしタンパク質リン酸化を通して細胞中にシグナルを運ばない。しかしながら、それは、キナーゼ活性を有する他のEGF受容体ファミリーメンバーと共にヘテロダイマーを形成する。ヘテロダイマー化は、細胞増殖又は分化を導く経路の活性化を導く。
抗癌治療への使用のための抗−ErbB−3抗体は、例えばWO 97/35885号、WO 2007/077028号又はWO 2008/100624号から知られている。
MET(間葉−上皮移行因子)は、タンパク質METをコードするプロト−オンコジーン(c−Met;肝細胞増殖因子受容体HGFR;HGF受容体;分散因子受容体;SF受容体;配列番号:45としても知られている)である(Dean, M., et al., Nature 318 (1985) 385-8 (1985); Chan, A.M., et al., Oncogene 1 (1987) 229- 33; Bottaro, D.P., et al., Science 251 (1991) 802-4; Naldini, L., et al., EMBO J. 10 (1991) 2867-78; Maulik, G., et al, Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2002) 41-59)。METは、胚成長及び創傷治療のために必須である膜受容体である。肝細胞増殖因子(HGF)はMET受容体の唯一の知られているリガンドである。
抗−c-Met抗体は、例えばUS 5686292号、US 7476724号、WO 2004072117号、WO 2004108766号、WO 2005016382号、WO 2005063816号、WO 2006015371号、WO 2006104911号、WO 2007126799号又はWO 2009007427から知られている。
c-Met結合ペプチドは、例えばMatzke, A., et al, Cancer Res 2005; 65: (14) 及びTarn, E.M, et al., J. MoI. Biol. 385 (2009) 79-90から知られている。
広範囲の種類の組換え抗体形、例えばIgG抗体形及び単鎖ドメインの融合による四価の二重特異的抗体が最近、開発されて来た(例えば、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; 及び Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233- 1234を参照のこと)。
WO2008/100624号は、高められたErbB-3受容体インターナリゼーションを有する抗−ErbB-3抗体、及び中でも、第2抗原としてのc-Metを有する二重特異的抗源へのそれらの使用に関する。
i) 前記第1抗原−結合部位は、H鎖可変ドメインに、配列番号:53のCDR3H領域、配列番号:54のCDR2H領域及び配列番号:55のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:56のCDR3L領域、配列番号:57のCDR2L領域、及び配列番号:58のCDR1L領域又は配列番号:59のCDR1L領域を含んで成り;そして
前記第2抗原−結合部位は、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域を含んで成り;
前記第2抗原−結合部位は、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域を含んで成ることを特徴とする。
前記二重特異的抗体は好ましくは、
i)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:47、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:48を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
ii)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:50を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
iii)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:51を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
iv)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:52を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;又は
v)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:1、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:2を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成ることを特徴とする。
1つの態様においては、本発明の前記二重特異的抗体は、前記抗体がAsn297で糖鎖によりグリコシル化され、それにより前記糖鎖内のフコースの量が65%又はそれ以下であることを特徴とする。
本発明のさらなる観点は、本発明の二重特異的抗体を含んで成る、癌の処理のための医薬組成物、癌の処理のための薬剤の製造のためへの前記二重特異的抗体の使用、及び癌の処理の必要な患者に前記二重特異的抗体を投与することにより、そのような癌を有する患者の処理方法である。
本発明の第1の観点は、抗体の不在下でのErbB-3のインターナリゼーションに比較して、A431細胞に対する流動細胞計測アッセイにおいて、2時間後に測定される場合、15%以下のErbB-3のインターナリゼーションを示すことを特徴とする、ヒトErbB-3に対して特異的に結合する第1抗原−結合部位、及びヒトc-Metに対して特異的に結合する第2抗原−結合部位を含んで成る、ヒトErbB-3及びヒトc-Metに対して特異的に結合する二重特異的抗体である。
a)抗体の不在下でのErbB-3のインターナリゼーションに比較して、流動細胞測定アッセイ(FACS)において、2時間後、二重特異的抗−ErbB-3/抗−c-Met抗体により誘発されたA431細胞(ATTCC No. CRL-1555)に対するErbB-3のインターナリゼーションを測定し、
b)抗体の不在下で流動細胞決定アッセイ(FACS)においてA431細胞(ATCC No. CRL-1555)に対するErbB-3のインターナリゼーションを測定し、
c)抗体の不在下でのErbB-3のインターナリゼーションに比較して、2時間の抗体暴露の後、A431細胞に対して15%以下のErbB-3のインターナリゼーションを示す二重特異的抗体を選択する段階を含んで成る、本発明の二重特異的抗体の選択方法である。
a)抗体の不在下でのErbB-3のインターナリゼーションに比較して、流動細胞測定アッセイ(FACS)において、2時間後、二重特異的抗−ErbB-3/抗−c-Met抗体により誘発されたA431細胞(ATTCC No. CRL-1555)に対するErbB-3のインターナリゼーションを測定し、
b)流動細胞測定アッセイ(FACS)において2時間後、その対応する単一特異的抗−ErbB-3抗体により誘発されたA431細胞(ATCC No. CRL-1555)に対するErbB-3のインターナリゼーションを測定し、
c)前記対応する単一特異的親ErbB-3抗体により誘発されたErbB-3のインターナリゼーションに比較して、ErbB-3のインターナリゼーションを、50%又はそれ以上(2時間後、A431細部に対して)低める二重特異的抗体を選択する段階を含んで成る、本発明の二重特異的抗体の選択方法である。
i) 前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:53のCDR3H領域、配列番号:54のCDR2H領域及び配列番号55のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:56のCDR3L領域、配列番号:57のCDR2L領域、及び配列番号:58のCDR1L領域又は配列番号:59のCDR1L領域を含んで成り;そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域又は配列を含んで成り;
ii) 前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:60のCDR3H領域、配列番号:61のCDR2H領域及び配列番号62のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:63のCDR3L領域、配列番号:64のCDR2L領域、及び配列番号:65のCDR1L領域又は配列番号:66のCDR1L領域を含んで成り;そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域を含んで成ることを特徴とする、ヒトErbB-3に対して特異的に結合する第1抗原−結合部位、及びヒトc-Metに対して特異的に結合する第2抗原−結合部位を含んで成る、ヒトErbB-3及びヒトc-Metに対して特異的に結合する二重特異的抗体である。
前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:53のCDR3H領域、配列番号:54のCDR2H領域及び配列番号55のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:56のCDR3L領域、配列番号:57のCDR2L領域、及び配列番号:58のCDR1L領域又は配列番号:59のCDR1L領域を含んで成り;そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域を含んで成ることを特徴とする、ヒトErbB-3に対して特異的に結合する第1抗原−結合部位、及びヒトc-Metに対して特異的に結合する第2抗原−結合部位を含んで成る、ヒトErbB-3及びヒトc-Metに対して特異的に結合する二重特異的抗体である。
前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:60のCDR3H領域、配列番号:61のCDR2H領域及び配列番号62のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:63のCDR3L領域、配列番号:64のCDR2L領域、及び配列番号:65のCDR1L領域又は配列番号:66のCDR1L領域を含んで成り;そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域を含んで成ることを特徴とする、ヒトErbB-3に対して特異的に結合する第1抗原−結合部位、及びヒトc-Metに対して特異的に結合する第2抗原−結合部位を含んで成る、ヒトErbB-3及びヒトc-Metに対して特異的に結合する二重特異的抗体である。
i)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:47、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:48を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
ii)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:50を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
iii)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:51を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
iv)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:52を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;又は
v)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:1、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:2を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成ることを特徴とする。
前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:51を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成ることを特徴とする。
用語“価”とは、本出願内で使用される場合、抗体分子における特定数の結合部位の存在を示す。用語、“二価”、“四価”及び“六価”は、抗体分子において、それぞれ2個の結合部位、4個の結合部位及び6個の結合部位の存在を示す。本発明の二重特異的抗体は、少なくとも“二価”であり、そして“三価”又は“多価”(例えば、“四価”又は“六価”)であり得る。
用語“モノクローナル抗体”又は“モノクローナル抗体組成物”とは、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を言及する。
ある態様においては、抗体は、それがタンパク質及び/又は高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原を特異的に結合するといわれる。
1つの態様においては、本発明の抗体は、1μg/mlの濃度で(例3に記載されるような)、少なくとも70%(対照としてのHRGに比較して)、MCF7細胞におけるHRG(Herregulin)−誘発されたHer3受容体リン酸化を阻害する。
1つの態様においては、本発明の抗体は、12.5μg/mlの濃度で(例4に記載されるような)、少なくとも40%(対照としてのHGFに比較して)、HUVEC細胞のHGF−誘発された増殖を阻害する。
本発明の抗体は、2又はそれ以上の結合部位を有し、そして二重特異性である。すなわち、この抗体は、2つ以上の結合部位(すなわち、抗体は三価又は多価である)が存在する場合でさえ、二重特異的であり得る。本発明の二重特異的抗体は例えば、多価の単鎖抗体、ジアボディー及びトリアボディー、並びにさらなる抗原結合部位(例えば、単鎖Fv, VHドメイン及び/又はVLドメイン、Fab, 又は(Fab)2)が1又は複数のペプチド−リンカーを通して結合されている、十分な長さの抗体の不変ドメインを有する抗体を包含する。抗体は、単一の種からの十分な長さであり得、又はキメラ化か又はヒト適合され得る。2つ以上の抗原結合部位を有する抗体に関して、いくつかの結合部位は、タンパク質が2つの異なった抗原のための結合部位を有する限り、同一であり得る。すなわち、第1の結合部位はVEGFに対して特異的であり、第2の結合部位はANG-2に対して特異的であり、そして逆もまた同様である。
免疫グロブリン不変領域を含んで成る、ヒトErbB-3及びヒトc-Metに対する二重特異的二価抗体は、例えばWO 2009/080251号、WO 2009/080252号、WO 2009/080253 又は Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; WO 96/027011号; Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. MoI. Biol. 270 (1997) 26-35 及び EP 1 870 459Alに記載のようにして使用され得る。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合する十分な長さの抗体のL鎖及びH鎖;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する十分な長さの抗体のL鎖及びH鎖を含んで成る、二価の二重特異的抗体であり、ここで不変ドメインCL及びCH1、及び/又は可変ドメインVL及びVHがお互い置換されている。
a)ヒトc-Metに対して特異的に結合する十分な長さの抗体のL鎖及びH鎖;及び
b)ヒトErbB-3に対して特異的に結合する十分な長さの抗体のL鎖及びH鎖を含んで成る、二価の二重特異的抗体であり、ここで不変ドメインCL及びCH1、及び/又は可変ドメインVL及びVHがお互い置換されている。
下記に記載のような“ノブ−イントゥ−ホールズ(kneb-into-holes)”技法による典型的な図解構造に関しては、図2a-cを参照のこと。
1つのH鎖のCH3ドメイン及び他のH鎖のCH3ドメインが、抗体CH3ドメイン間にオリジナル界面を含んで成る表面でそれぞれ対合することを特徴とし;
ここで前記界面は、前記二価の二重特異的抗体の形成を促進するために変更され、ここで前記変更が、
a)1つのH鎖のCH3ドメインが変更され、
その結果、二価の二重特異的抗体内の他のH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面と対合する、1つのH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、他のH鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置することができる1つのH鎖のCH3ドメインの界面内に突起が生成され;そして
b)他のH鎖のCH3ドメインが変更され、
その結果、二価の二重特異的抗体内の第1CH3ドメインのオリジナル界面と対合する、第2CH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第1CH3ドメインの界面内の突起が位置することができる第2CH3ドメインの界面内に腔が生成される;ことを特徴とする。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)から成る群から選択される。
三価の二重特異的型:
本発明のもう1つの好ましい観点は、
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして2つの抗体H鎖及び2つの抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する1つの単鎖Fabフラグメントを含んで成る三価の二重特異的抗体であり、ここでb)下での前記単鎖Fabフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端でペプチドコネクターを通して、a)下での前記十分な長さの抗体に融合される。
本発明のもう1つの好ましい観点は、
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして2つの抗体H鎖及び2つの抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する1つの単鎖Fvフラグメントを含んで成る三価の二重特異的抗体であり、ここでb)下での前記単鎖Fvフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端でペプチドコネクターを通して、a)下での前記十分な長さの抗体に融合される。
従って、表1におけるscFv-Ab−命名法によるその対応する三価の二重特異的抗体が発現され、そして精製された(下記例を参照のこと)。
1つの好ましい態様においては、ヒトc-Metを結合する前記単鎖Fab又はFvフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH鎖のC-末端でペプチドコネクターを通して前記十分な長さの抗体に融合される。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして2つの抗体H鎖及び2つの抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;
b)ba)抗体H鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体H鎖可変ドメイン(VH)及び抗体不変ドメイン1(CH1)から成るポリペプチド、ここで前記ポリペプチドは前記十分な長さの抗体の2つのH鎖の1つのC−末端にペプチドコネクターを通してVHドメインのN−末端により融合され;
c)ca) 抗体L鎖可変ドメイン(VL);又は
cb)抗体L鎖可変ドメイン(Vl)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)から成るポリペプチド、ここで前記ポリペプチドは前記十分な長さの抗体の2つのH鎖の他の1つのC−末端にペプチドコネクターを通してVLドメインのN−末端により融合される;を含んで成る三価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下でのポリペプチドの抗体H鎖可変ドメイン(VH)及びc)下でのポリペプチドの抗体L鎖可変ドメイン(VL)は、ヒトc-Metに対して特異的に結合する抗原−結合部位を一緒に形成する。
典型的な図解構造については、図3a-cを参照のこと。
従って、表4におけるVHVL−Ab−命名法によるその対応する三価の二重特異的抗体が発現され、そして精製された(下記例及び図3cを参照のこと)。
i)H鎖ドメイン位置44〜L鎖可変ドメイン位置100、
ii)H鎖可変ドメイン位置105〜L鎖可変ドメイン位置43、又は
iii)H鎖可変ドメイン位置101〜L鎖可変ドメイン位置100(番号付けは、KabatのEU指標に常に従う)。
十分な長さの抗体の1つのH鎖のCH3ドメイン及び十分な長さの抗体の他のH鎖のCH3ドメインが、抗体CH3ドメイン間にオリジナル界面を含んで成る表面でそれぞれ対合することを特徴とし;
ここで前記界面は、前記二価の二重特異的抗体の形成を促進するために変更され、ここで前記変更が、
a)1つのH鎖のCH3ドメインが変更され、
その結果、二価の二重特異的抗体内の他のH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面と対合する、1つのH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、他のH鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置することができる1つのH鎖のCH3ドメインの界面内に突起が生成され;そして
b)他のH鎖のCH3ドメインが変更され、
その結果、三価の二重特異的抗体内の第1CH3ドメインのオリジナル界面と対合する、第2CH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第1CH3ドメインの界面内の突起が位置することができる第2CH3ドメインの界面内に腔が生成される;ことを特徴とする。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)から成る群から選択される。
本発明の1つの観点においては、両CH3ドメインはさらに、それらの両CH3ドメイン間にジスルフィド橋が形成され得るよう、個々のCH3ドメインのその対応する位置においてアミノ酸としてのシステイン(C)の導入により変更される。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして
aa) N−末端からC−末端方向にある、抗体H鎖可変ドメイン(VH)、抗体不変H鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体H鎖ドメイン2(CH2)、及び抗体H鎖不変ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体H鎖から成る2つの抗体H鎖;及び
ab) N−末端からC−末端方向にある、抗体L鎖可変ドメイン(VL)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)(VL-CL)から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する1つの単鎖Fabフラグメントを含んで成る三価の二重特異的抗体であり、
ここで前記単鎖Fabフラグメントは抗体H鎖可変ドメイン(VH)及び抗体不変ドメイン1(CH1)、抗体L鎖可変ドメイン(VL)、抗体L鎖不変ドメイン(CL)及びリンカーから成り、そして前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、N−末端からC−末端方向にある次の順序の1つを有し:
ba) VH-CH1−リンカー−VL-CL、又はbb)VL-CL−リンカー−VH-CH1;
ここで前記リンカーは少なくとも30個のアミノ酸、好ましくは32〜50個のアミノ酸のペプチドであり;そして
b)下での前記単鎖Fabフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端で(好ましくは、H鎖のC−末端で)、ペプチドコネクターを通してa)下での前記十分な長さの抗体に融合され;
ここで前記ペプチドコネクターは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは10〜50個のアミノ酸のペプチドである。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして
aa) N−末端からC−末端方向にある、抗体H鎖可変ドメイン(VH)、抗体不変H鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体H鎖ドメイン2(CH2)、及び抗体H鎖不変ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体H鎖から成る2つの抗体H鎖;及び
ab) N−末端からC−末端方向にある、抗体L鎖可変ドメイン(VL)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)(VL-CL)から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する1つの単鎖Fvフラグメントを含んで成る三価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下での前記単鎖Fvフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端で(好ましくは、H鎖のC−末端で)ペプチドコネクターを通してa)下での前記十分な長さの抗体に融合され;そして
前記ペプチドコネクターは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは10〜50個のアミノ酸のペプチドである。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして
aa) N−末端からC−末端方向にある、抗体H鎖可変ドメイン(VH)、抗体不変H鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体H鎖ドメイン2(CH2)、及び抗体H鎖不変ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体H鎖から成る2つの抗体H鎖;及び
ab) N−末端からC−末端方向にある、抗体L鎖可変ドメイン(VL)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)(VL-CL)から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する1つの単鎖Fvフラグメントを含んで成る三価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下での前記単鎖Fvフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH鎖のC−末端でペプチドコネクターを通してa)下での前記十分な長さの抗体に融合され(2つの抗体H鎖-単鎖Fv融合ペプチドをもたらす);そして
前記ペプチドコネクターは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは10〜50個のアミノ酸のペプチドである。
好ましい態様においては、前記三価の二重特異的抗体は、第1抗体H鎖−単鎖Fv融合ペプチドとして、配列番号:29のポリペプチド、及び第2抗体H鎖−単鎖Fv融合ペプチドとして、配列番号:30のペプチド、及び配列番号:31の2つの抗体L鎖を含んで成る。
好ましい態様においては、前記三価の二重特異的抗体は、第1抗体H鎖−単鎖Fv融合ペプチドとして、配列番号:35のポリペプチド、及び第2抗体H鎖−単鎖Fv融合ペプチドとして、配列番号:36のペプチド、及び配列番号:37の2つの抗体L鎖を含んで成る。
本発明のもう1つの態様は、
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして
aa) N−末端からC−末端方向にある、抗体H鎖可変ドメイン(VH)、抗体不変H鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体H鎖ドメイン2(CH2)、及び抗体H鎖不変ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体H鎖から成る2つの抗体H鎖;及び
ab) N−末端からC−末端方向にある、抗体L鎖可変ドメイン(VL)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)から成る十分な長さの抗体;及び
b)ba)抗体H鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体H鎖可変ドメイン(VH)及び抗体不変ドメイン1(CH1)から成るポリペプチド、
ここで前記ポリペプチドは、前記十分な長さの抗体の2つのH鎖の1つのC−末端にペプチドコネクターを通して、VHドメインのN−末端により融合され(抗体H鎖−VH融合ペプチドをもたらし)、ここで前記ペプチドコネクターは少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは25〜50個のアミノ酸のペプチドであり;
c)ca) 抗体L鎖可変ドメイン(VL)、又は
cb)抗体L鎖可変ドメイン(VL)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)から成るポリペプチド、
ここで前記ポリペプチドは、前記十分な長さの抗体の2つのH鎖の他の1つのC−末端にペプチドコネクターを通して、VLドメインのN−末端により融合され(抗体H鎖−VL融合ペプチドをもたらし)、ここで前記ペプチドコネクターはb)下でのペプチドコネクターと同一である;を含んで成る三価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下でのポリペプチドの抗体H鎖可変ドメイン(VH)及びc)下でのポリペプチドの抗体L鎖可変ドメイン(VL)は、ヒトc-Metに対して特異的に結合する抗原−結合部位を一緒に形成する。
好ましい態様においては、前記三価の二重特異的抗体は、抗体H鎖−VH融合ペプチドとして配列番号:14のポリペプチド、抗体H鎖−VL融合ペプチドとして配列番号:15のポリペプチド、及び配列番号:16の2種の抗体L鎖を含んで成る。
好ましい態様においては、前記三価の二重特異的抗体は、抗体H鎖−VH融合ペプチドとして配列番号:20のポリペプチド、抗体H鎖−VL融合ペプチドとして配列番号:21のポリペプチド、及び配列番号:22の2種の抗体L鎖を含んで成る。
a)2つの抗体H鎖VH-CH1-HR-CH2-CH3及び2つの抗体L鎖VL-CLから成るヒトErbB-3に対して結合する十分な長さの抗体、
(ここで、好ましくは、2つのCH3ドメインの1つはY349C、T366W突然変異を含んで成り、そして2つのCH3ドメインの他の1つはS354C (又は E356C)、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んで成る);
b)ba)抗体H鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体H鎖可変ドメイン(VH)及び抗体不変ドメイン1(CH1)から成るポリペプチド、
ここで前記ポリペプチドは、前記十分な長さの抗体の2つのH鎖の1つのC−末端にペプチドコネクターを通して、VHドメインのN−末端により融合され;
c)ca) 抗体L鎖可変ドメイン(VL)、又は
cb)抗体L鎖可変ドメイン(VL)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)から成るポリペプチド;
ここで前記ポリペプチドは、前記十分な長さの抗体の2つのH鎖の他の1つのC−末端にペプチドコネクターを通して、VLドメインのN−末端により融合される;を含んで成る三価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下でのポリペプチドの抗体H鎖可変ドメイン(VH)及びc)下でのポリペプチドの抗体L鎖可変ドメイン(VL)は、ヒトc-Metに対して特異的に結合する抗原−結合部位を一緒に形成する。
1つの態様においては、本発明の二重特異的抗体は四価であり、ここでヒトc-Metに対して特異的に結合する抗原−結合部位がc-Metダイマー化を阻害する(例えば、WO2009/007427号に記載のように)。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして2つの抗体H鎖及び2つの抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する、2つの同一の単鎖Fabフラグメントを含んで成る四価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下の前記単鎖Fabフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端でペプチドコネクターを通して前記十分な長さの抗体に融合される。
従って、本発明のもう1つの観点は、
a)ヒトc-Metに対して特異的に結合し、そして2つの抗体H鎖及び2つの抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトErbB-3に対して特異的に結合する、2つの同一の単鎖Fabフラグメントを含んで成る四価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下の前記単鎖Fabフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端でペプチドコネクターを通して前記十分な長さの抗体に融合される。
典型的な図解構造に関しては、図6aを参照のこと。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして2つの抗体H鎖及び2つの抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する、2つの同一の単鎖Fvフラグメントを含んで成る四価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下の前記単鎖Fvフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端でペプチドコネクターを通して前記十分な長さの抗体に融合される。
従って、本発明のもう1つの観点は、
a)ヒトc-Metに対して特異的に結合し、そして2つの抗体H鎖及び2つの抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトErbB-3に対して特異的に結合する、2つの同一の単鎖Fvフラグメントを含んで成る四価の二重特異的抗体であり、
ここでb)下の前記単鎖Fvフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端でペプチドコネクターを通して前記十分な長さの抗体に融合される。
典型的な図解構造に関しては、図6bを参照のこと。
1つの好ましい態様においては、ヒトc-Met又はヒトErbB-3を結合する前記単鎖Fab又はFvフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH鎖のC−末端でペプチドコネクターを通して前記十分な長さの抗体に融合される。
a)ヒトErbB-3に対して特異的に結合し、そして
aa) N−末端からC−末端方向にある、抗体H鎖可変ドメイン(VH)、抗体不変H鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ領域(HR)、抗体H鎖ドメイン2(CH2)、及び抗体H鎖不変ドメイン3(CH3)から成る2つの同一の抗体H鎖;及び
ab) N−末端からC−末端方向にある、抗体L鎖可変ドメイン(VL)及び抗体L鎖不変ドメイン(CL)(VL-CL)から成る2つの同一の抗体L鎖から成る十分な長さの抗体;及び
b)ヒトc-Metに対して特異的に結合する1つの単鎖Fabフラグメントを含んで成る四価の二重特異的抗体であり、
ここで前記単鎖Fabフラグメントは抗体H鎖可変ドメイン(VH)及び抗体不変ドメイン1(CH1)、抗体L鎖可変ドメイン(VL)、抗体L鎖不変ドメイン(CL)及びリンカーから成り、そして前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、N−末端からC−末端方向にある次の順序の1つを有し:
ba) VH-CH1−リンカー−VL-CL、又はbb)VL-CL−リンカー−VH-CH1;
ここで前記リンカーは少なくとも30個のアミノ酸、好ましくは32〜50個のアミノ酸のペプチドであり;そして
b)下での前記単鎖Fabフラグメントは、前記十分な長さの抗体のH又はL鎖のC−又はN−末端で、ペプチドコネクターを通してa)下での前記十分な長さの抗体に融合され;
ここで前記ペプチドコネクターは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは10〜50個のアミノ酸のペプチドである。
a)VH-CH1−リンカー−VL-CL、又はb)VL-CL−リンカー−VH-CH1、より好ましくはVL-CL−リンカー−VH-CH1。
もう1つの好ましい態様においては、前記単鎖Fabフラグメントにおける前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、N−末端からC−末端方向に、次のオーダーの1つを有する:
a)VH-CH−リンカー−VL-CH1又はb)VL-CH1−リンカー−VH-CL。
i)H鎖可変ドメイン位置44〜L鎖可変ドメイン位置100、
ii)H鎖可変ドメイン位置105〜L鎖可変ドメイン位置43、又は
iii)H鎖可変ドメイン位置101〜L鎖可変ドメイン位置100(番号付けは、KabatのEUインデックスに常に従う)。
i)H鎖可変ドメイン位置44〜L鎖可変ドメイン位置100、
ii)H鎖可変ドメイン位置105〜L鎖可変ドメイン位置43、又は
iii)H鎖可変ドメイン位置101〜L鎖可変ドメイン位置100。
本発明の1つの観点は、本発明の抗体を含んで成る医薬組成物である。本発明のもう1つの観点は、医薬組成物の製造のためへの本発明の抗体の使用である。本発明のさらなる観点は、本発明の抗体を含んで成る医薬組成物の製造方法である。もう1つの観点においては、本発明は、医薬キャリヤーと一緒に配合される、本発明の抗体を含む、組成物、例えば医薬組成物を供給する。
本発明のもう1つの観点は、癌の処理のための前記医薬組成物である。
本発明のもう1つの観点は、癌の処理のための薬剤の製造のためへの本発明の抗体の使用である。
本発明のもう1つの観点は、癌を有する患者に、本発明の抗体と投与することによる、そのような処理の必要な患者の処理方法である。
本発明の1つの態様は、血管疾患の処理のための本発明の二重特異的抗体である。
本発明のもう1つの観点は、血管疾患を有する患者への本発明の抗体の投与による、そのような処理の必要な患者の処理方法である。
適切な流動性が、被膜、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。
配列番号:1 :H鎖可変ドメイン <ErbB3 > HER3 クローン 29
配列番号:2 :L鎖可変ドメイン < ErbB3> HER3 クローン 29
配列番号:3 :H鎖可変ドメイン <c-Met> Mab 5D5
配列番号:4 :L鎖可変ドメイン <c-Met> Mab 5D5
配列番号:5 :H鎖 <ErbB3> HER3 クローン 29
配列番号:6 :L鎖 <ErbB3> HER3 クローン 29
配列番号:7 :H鎖 <c-Met> Mab 5D5
配列番号:8 :L鎖 <c-Met> Mab 5D5
配列番号:9 :H鎖 <c-Met> Fab 5D5
配列番号:1O :L鎖 <c-Met> Fab 5D5
配列番号:11 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_KHSS
配列番号:12 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_KHSS
配列番号:13 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_KHSS
配列番号:14 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_SSKH
配列番号:15 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_SSKH
配列番号:16 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_SSKH
配列番号:17 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_SSKHSS
配列番号:18 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_SSKHSS
配列番号:19 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_SSKHSS
配列番号:20 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_lC
配列番号:22 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_l C
配列番号:23 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_6C
配列番号:24 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_6C
配列番号:25 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_6C
配列番号:26 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_scFvSSKHSS
配列番号:27 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_scFvSSKHSS
配列番号:28 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_scFvSSKHSS
配列番号:29 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvSSKH
配列番号:30 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvSSKH
配列番号:31 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvSSKH
配列番号:32 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKH
配列番号:33 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKH
配列番号:34 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKH
配列番号:35 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKHSB
配列番号:36 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKHSB
配列番号:37 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKHSB
配列番号:38 :H鎖 1 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_scFvKHSBSS
配列番号:39 :H鎖 2 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_scFvKHSBSS
配列番号:40 :L鎖 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_scFvKHSBSS
配列番号:42 :ヒト IgG3のH鎖不変領域
配列番号:43 ヒト :L鎖 κ 不変領域
配列番号:44 ヒト :L鎖 λ不変領域
配列番号:45 ヒト c-Met
配列番号:46 ヒト ErbB-3
配列番号:47 :H鎖可変ドメイン VH, <ErbB3 > Mab 205 (ネズミ)
配列番号:48 :L鎖可変ドメイン VL, <ErbB3 >Mab 205 (ネズミ)
配列番号:49 :H鎖可変ドメイン VH, <ErbB3 > Mab 205.10 (ヒト型化)
配列番号:50 :L鎖可変ドメイン VL, <ErbB3 > Mab 205.10.1 (ヒト型化)
配列番号:51 :L鎖可変ドメイン VL, <ErbB3 > Mab 205.10.2 (ヒト型化)
配列番号:52 :L鎖可変ドメイン VL, <ErbB3 > Mab 205.10.3 (ヒト型化)
配列番号:53 :H鎖 CDR3H, <ErbB3 > Mab 205.10
配列番号:54 :H鎖 CDR2H, <ErbB3 > Mab 205.10
配列番号:55 :H鎖 CDRlH, <ErbB3 > Mab 205.10
配列番号:56 :L鎖 CDR3L, <ErbB3 > Mab 205.10
配列番号:57 :L鎖 CDR2L, <ErbB3 > Mab 205.10
配列番号:58 :L鎖 CDRlL (変異体 1), <ErbB3 > Mab 205.10
配列番号:59 :L鎖 CDRlL (変異体 2), <ErbB3 > Mab 205.10
配列番号:60 :H鎖 CDR3H, < ErbB3 > HER3 クローン 29
配列番号:62 :H鎖 CDRlH, < ErbB3 > HER3 クローン 29
配列番号:63 :L鎖 CDR3L, < ErbB3 > HER3 クローン 29
配列番号:64 :L鎖 CDR2L, <ErbB3> HER3 クローン 29
配列番号:65 :L鎖 CDRlL <ErbB3> HER3 クローン 29
配列番号:66 :H鎖 CDR3H, <c-Met> Mab 5D5
配列番号:67 :H鎖 CDR2H, <c-Met> Mab 5D5
配列番号:68 :H鎖 CDRlH, <c-Met> Mab 5D5
配列番号:69 :L鎖 CDR3L, <c-Met> Mab 5D5
配列番号:70 :L鎖 CDR2L, <c-Met> Mab 5D5
配列番号:71 :L鎖 CDRlL <c-Met> Mab 5D5。
組換えDNA技法:
標準方法が、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるように、DNAを操作するために使用された。分子生物学的試薬が、その製造業者の指示に従って使用された。
ヒト免疫グロブリンL及びH鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。抗体鎖のアミノ酸はEU番号付けに従って、番号付けされる(Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242)。GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)ソフトウェアパッケージバージョン10.2及びInfomax's Vector NTl Advance suiteバージョン8.0を、配列創造、マッピング、分析、注釈及び例解のために使用した。
DNA配列を、Sequiserve (Vaterstetten, Germany)及びGeneart AG (Regensburg, Germany)で実施される二本鎖配列決定により決定した。
所望する遺伝子セグメントを、自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR生成物からGeneart AG (Regensburg, Germany)により調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を端に有する遺伝子セグメントを、pGA18(ampR)プラスミド中にクローン化した。プラスミドDNAを、形質転換された細菌から精製し、そして濃度をUV分光計により決定した。サブクローン化された遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNA配列決定により確かめた。(G4S)nペプチドコネクターにより結合されるC−末端5D5 VH領域と共にCH3ドメインにT366W突然変異を担持する“ノブ−イントゥ−ホール”Her3(クローン29)抗体H鎖、及び(G4S)nペプチドコネクターにより結合されるC−末端5D5 VL領域と共にT366S、 L368A及びY407V突然変異を担持する“ノブ−イントゥ−ホール”Her3 (クローン29)抗体H鎖をコードする遺伝子セグメント(5’−BamHI及び3’−XbaI制限部位を有する)を合成した。
Roche発現ベクターを、すべてのH及びL鎖scFv融合タンパク質コードの発現プラスミドの構成のために使用した。前記ベクターは、次の要素から構成される:
−選択マーカーとしてのヒグロマイシン耐性遺伝子、
−Epstein-Barrウィルス(EBV)の複製の起点、oriP、
−E.コリにおけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製の起点、
−E.コリにおいてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
−ヒトサイトメガロウィルス(HCMV)からの即時初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト1−免疫グロブリンポリアデニル化(“ポリA”)シグナル配列、及び
−ユニークBamHI及びXbaI制限部位。
組換え免疫グロブリン変異体を、FreeStyleTM 293 Expression Systemを用いて、その製造業者の説明書(Invitrogen, USA)に従って、ヒト胚腎臓293−F細胞の一過性トランスフェクションにより発現した。手短には、懸濁FreeStyleTM 293-F細胞を、FreeStyleTM 293-F発現培地において37℃/8%CO2下で培養し、そして細胞を、トランスフェクションの日、1〜2×106生存細胞/mlの密度で、新鮮培地に接種した。DNA-293 fectinTM複合体を、325mlの293fectinTM (Invitrogen, Germany)、及び250mlの最終トランスフェクション体積のために1:1のモル比での250μgのH鎖及びL鎖プラスミドDNAを用いて、Opti-MEM(商標)I 培地(Invitrogen, USA)において調製した。
二重特異的及び対照抗体を、Protein A-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden)を用いての親和性クロマトグラフィー及びSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーにより、細胞培養上清液から精製した。手短には、無菌濾過された細胞培養上清液を、PBS緩衝液(10 mMのNa2HPO4、1 mMのKH2PO4、137 mMのNaCl 及び2.7 mM KCl、pH 7.4)により平衡化されたHiTrap ProteinA HP(5ml)カラム上に通用した。未結合タンパク質を、平衡化緩衝液により洗浄した。抗体及び抗体変異体を、0.1Mのクエン酸緩衝液(pH2.8)により溶離し、そしてタンパク質含有画分を、0.1mlの1Mのトリス(pH8.5)により中和した。
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmで光学密度(OD)を測定することにより決定した。二重特異的及び対照抗体の純度及び分子量を還元剤(5mMの1,4−ジチオトレイトールの存在及び不在下のSDS-PAGE、及びクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析した(二重特異的Her3/c-Met 抗体Her3/MetscFvSS_KH (左側) 及び Her3/MetscFv_KH (右側)については、典型的な図21、SDS-PAGEを参照このこと)。NuPAGE(商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen, USA)を、その製造業者の説明書に従って使用した(4〜20%のトリス−グリシンゲル)。
5×105個のA549細胞を、0.5%FCS(ウシ胎児血清)を含むRPMIにおけるHGF刺激の前日、6−ウェルプレートのウェルに接種した。次の日、増殖培地を、0.2%のBSA(ウシ血清アルブミン)を含むRPMIにより1時間にわたって交換した。次に、5μg/mlの二重特異的抗体を前記培地に添加し、そして細胞を10分間インキュベートし、その後、HGFを、50ng/mlの最終濃度で、さらに10分間にわたって添加した。細胞を、1mMのバナジウム酸ナトリウムを含む氷冷却PBSにより1度洗浄し、その後、それらを氷上に置き、そして100μlの溶菌緩衝液(50 mMのトリス-Cl pH7.5、150 mMのNaCl、1 % NP40、0.5 % DOC、 アプロチニン、0.5 mM のPMSF、1 mMのバナジウム酸ナトリウム)を含む細胞培養プレートに溶解した。
2×105個のMCF7細胞を、完全増殖培地(RPMI1640、10%FCS)において、12ウェルプレートのウェル当たりに接種した。細胞は、2日以内に90%集密性まで増殖した。次に、培地を、0.5%FCSを含む飢餓培地により交換した。次の日、それぞれの抗体を、500ng/mlのHeregulin (R&D)の添加の1時間前、示される濃度で供給した。Heregulinの添加の後、細胞をさらに10分間、培養し、その後、細胞を収穫し、そして溶解した。タンパク質濃度を、BCA方法(Pierce)を用いて決定した。30〜50μgの溶解物を、4-12 % Bis-Tris NuPage ゲル(Invitrogen)上で分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を5%BSAを含むTBS-Tにより1時間ブロックし、そしてTyrl289 (4791, Cell Signaling)を特異的に認識するリン酸化部位−特異的Her3/ErbB3抗体により進行せしめた。
A549(ウェル当たり4000個の細胞)又はA431(ウェル当たり8000個の細胞)を、0.5%FCSを有するRPMIを含む96−ウェルE−プレート(Roche, 05232368001)において、200μlの合計体積で、化合物処理の前日、接種した。付着及び細胞増殖を、インピーダンスをモニターしながら、15分ごとのスイープを伴って、即時細胞分析機械により一晩モニターした。次の日、細胞を、5分ごとのスイープを伴って、PBS中、5μlのそれぞれの抗体希釈溶液と共にプレインキュベートした。30分後、20ng/mlの最終濃度を生成するHGF溶液2.5μlを添加し、そして実験をさらに72時間、進めた。即時の変化を、180分間、1分ごとのスイープ、続いて残りの時間、15分ごとのスイープを伴って、モニターした。
移動アッセイを、即時細胞分析機技法(Roche)に基づいて実施した。このために、8μmlの孔を有するCIM装置の下方チャンバーを、160μlのHGF−ならし培地(50ng/ml)により満たした。その装置をアセンブルし、そして150μlの合計体積での100000個のA431細胞を、上方チャンバーに接種した。これに、二重特異的抗体又は対照抗体を添加した。移動を、15分ごとの規則的スイープを伴って、24時間、進行せしめた。データをエキスポートし、そして24時間後、エンドポイント読み取りとして表す。
a)細胞表面受容体状態の相対的定量化:
細胞を対数増殖期に維持した。亜集密性細胞をアキュターゼ(Sigma)により分離し、回転沈降し(1500rpm, 4℃、5分)、そして続いて、2%FCSを含むPBSにより1度、洗浄した。他の細胞系に比較しての相対的受容体状態を決定するために、1×105個の細胞を、5μg/mlのHer3又はc-Met特異的一次抗体と共に30分間、氷上でインキュベートした。特異性対照として、非特異的IgG(イソタイプ対照)を使用した。
A431を分離し、そして数えた。1.5×105個の細胞を、円錐状96−ウェルプレートの個々のウェルに接種した。細胞を回転沈降し(1500rpm、4℃、5分)、そして2%FCS(ウシ胎児血清)を有するPBS中、それぞれの二重特異的抗体の一連の希釈溶液50μlにおいて、氷上で30分間インキュベートした。細胞を再び回転沈降し、そして2%FCSを含むPBS200μlにより1度、洗浄し、続いて、2%FCSを含むPBSに希釈されたヒトFcに対して向けられたフィコリエリトリン−カップリングされた抗体と共に30分間、2回目のインキュベーションを行った(Jackson Immunoresearch, 109116098)。
細胞を分離し、そして数えた。5×105個の細胞を、エッペンドルフ管における50μlの完全培地に配置し、そして5μg/mlのそれぞれの二重特異的抗体と共に37℃でインキュベートした。示される時点の後、細胞を、その時間が完結するまで、氷上で貯蔵した。その後、細胞をFACS管に移し、回転沈降し(1500rpm, 4℃、5分)、PBS+2%FCSにより洗浄し、そして2%FCSを含むPBSに希釈されたヒトFcに対して向けられたフィコエリトリン−カップリングされた二次抗体50μlにおいて30分間インキュベートした(Jackson Immunoresearch, 109116098)。細胞を再び回転沈降し、PBS+2%FCSにより洗浄し、そして蛍光強度を流動細胞計測器(FACS Canto, BD)により決定した。
HT29細胞を分離計数し、そしてPKH26及びPKH67(Sigma)により、その製造業者の説明書に従って、個々に染色された2種の集団に分けた。染色された個々の集団のうち、5×105個の細胞を取り、組合し、そして完全培地において、10μg/mlのそれぞれの二重特異的抗体と共に30及び60分間インキュベートした。示される時点の後、細胞を、その時間の完結されるまで、氷上で貯蔵した。細胞を回転沈降し(1500rpm, 4℃、5分)、PBS+2%FCSにより洗浄し、そして蛍光強度を流動細胞計測器(FACS Canto, BD)により決定した。
細胞生存性及び増殖性を、細胞力価成長アッセイ(Promega)を用いて定量化した。このアッセイは、その製造業者の説明書に従って実施された。手短には、細胞を、100μlの合計体積で96−ウェルプレートにおいて所望する期間、培養した。増殖アッセイに関しては、細胞をインキュベーターから除き、そして室温で30分間、静置した。100μlの細胞力価成長試薬を添加し、そして多−ウェルプレートをオービタルシェーカー上に2分間、置いた。発光を、マイクロプレートリーダー(Tecan)上で15分後、定量化した。
Wst-1生存性及び細胞増殖アッセイを、エンドポイント分析として実施し、代謝性活性細胞の数を検出した。手短には、20μlのWst-1試薬(Roche, 11644807001)を、200μlの培養培地に添加した。さらに、96−ウェルプレートを、色素の強い進行まで、30分〜1時間インキュベートした。染色強度を、450nmの波長で、マイクロプレートリーダー(Tecan)上で定量化した。
結合親和性を、25℃で標準の結合アッセイ、例えば表面プラスモン共鳴技法(BIAcore(商標), GE-Healthcare Uppsala, Sweden)により決定した。親和性測定のために、30μg/mlの抗Fcγ抗体(ヤギからの、Jackson Immuno Research)を、SPR測定器(Biacore T100)上での標準のアミン−カップリング及びブロッキング化学によりCM-5センサーチップの表面にカップリングした。接合の後、単一又は二重特異的Her3/c-Met抗体を、5μl/分の流速で25℃で注入し、続いて30μl/分でヒトHER3又はc-Met ECDの一連の希釈溶液(OnM〜1000nM)を添加した。結合実験のためのランニング緩衝液として、PBS/0.1%BSAを使用した。次に、チップを、10mMのグリシン-HCl(pH2.0)の溶液の60秒のパルスにより再生した。
次の発現され、そして精製された二重特異的<ErbB3-c-Met>抗体のすべては、不変領域、又は少なくともIgG1サブクラスのFc部分(配列番号:11のヒト不変IgG1領域)(結果的に、下記に示されるように修飾される)を含んで成る。
表1:免疫化(ヒトHER3-ECDにより免疫化されたNMRIマウス)を通して得られる十分な長さのErbB-3抗体(HER3 クローン29)、及び表1に示されるそれぞれの特徴を有するc-Met抗体(cMet-5D5)からの1つの単鎖Fvフラグメント(基本的構造のスキームについては、図5を参照のこと;結果的に、表に言及されるすべての特徴がその図に含まれるものではないが)に基づく三価の二重特異的<ErbB3-c-Met>抗体を、上記一般方法に従って発現し、そして精製した。HER3 クローン29及びcMet 5D5のその対応するVH及びVLは配列の列挙に与えられる。
二重特異的抗体の細胞表面上のそれらのそれぞれの受容体への結合性質を、流動細胞計測法に基づかれるアッセイにより、A431癌細胞に対して分析した。細胞を、単一又は二重特異的一次抗体と共にインキュベートし、そしてそれらの抗体のそれらの同起源の受容体への結合を、一次抗体のFcに対して特異的に結合する蛍光体にカップリングされる二次抗体により検出した。一次抗体の一連の希釈溶液の平均蛍光強度を、抗体の濃度に対してプロットし、S状結合曲線を得た。c-Met及びHer3の細胞表面発現を、二価の5D5及びHer3クローン29抗体のみとのインキュベーションにより実証した。Her3/c-Met_KHSS抗体は、A431の細胞表面に容易に結合する。それらの実験設定下で、抗体はそのHer3部分を通して結合することができ、そして従って、その平均蛍光強度はHer3クローン29のみについての染色を越えない。
二重特異的抗体におけるc-Met部分の官能性を確かめるために、c-Metリン酸化アッセイを実施した。この実験においては、A549肺癌細胞又はHT29結腸直腸癌細胞を、HGFへの暴露の前、二重特異的抗体又は対照抗体により処理した。次に、細胞を溶解し、c-Met受容体のリン酸化を試験した。両細胞系を、イムノブロットにおけるリン−c-Met特異的バンドの発生により観察され得るように、HGFにより刺激することができる。scHv抗体又は5D5 Fabフラグメントの添加が、c-Met ScFv成分の官能性を示す受容体リン酸化を阻害する。
二重特異的抗体におけるHer3部分の官能性を確かめるために、Her3リン酸化アッセイを実施した。この実験においては、MCF7細胞を、HRG(Heregulin)への暴露の前、二重特異的抗体又は対照抗体により処理した。次に、細胞を溶解し、Her3受容体のリン酸化を試験した。Her3/c-Met_scFV_SSKH 及び Her3/c-Met_KHSSは、親Her3クローン29と同じ程度にHer3受容体リン酸化を阻害し、このことは、抗体のHer3結合及び官能性が三価の抗体型により処理されないことを示唆する。
HUVEC増殖アッセイを実施し、HGFのミトーゲン効果を示した。HUVECへのHGFの添加は、増殖における2倍の上昇を導く。二重特異的抗体と同じ濃度範囲でのヒトIgG対照抗体の添加は、細胞増殖に対して影響を有さず、ところが5D5 Fabフラグメントは、HGF−誘発された増殖を阻害する。同じ濃度で使用される場合、Her3/c-Met_scFv_SSKH抗体は、Fabフラグメントと同じほど増殖を阻害する(図11)。
A431が血清を低められた培地に接種される場合、HGFの添加は、弱いミトーゲン効果を、拡散は別として誘発する。これは、HGF処理されたA431増殖に対するHer3/c-Met_scFv_SSKH 及びHer3/c-Met_KHSSの効果を分析するために利用された。実際、二重特異的抗体は、増殖のHGF−誘発された上昇を非常に阻害できる(15%)。Her3/c-Met_scFv_SSKHは5D5 Fabフラグメントと同じほど良好であり、そしてHer3/c-Met_KHSSは類似する効果を得るために、より高い用量を必要とする(6.25μg/mlに比較して12.5μg/ml)。対照ヒトIgG1抗体は、HGFにより促進されたA431細胞増殖に対して影響を有さない。
HGF−誘発された拡散は、細胞の丸み化、糸状偽足のような突起、紡錘体のような構造及び細胞の一定の運動性をもたらす、細胞の形態学的変化を包含する。即時細胞分析器(Roche)は、所定の細胞培養物のインピーダンスを測定し、そして従って、細胞型態学及び増殖における変化を間接的にモニターすることができる。A431及びA549細胞へのHGFの添加は、時間の関数としてモニターされ得るインピーダンスの変化をもたらす。
異なった比率の細胞表面Her3及びc-Metを有する細胞系を同定するために、FACSに基づくアッセイを行った。T47Dは、この細胞系においてmRNAレベルに従って存在する、c-Met細胞表面発現を示さなかった(データは示されていない)。A431及びA549は類似するレベルのc-Metを示し、そしてH441、すなわちc-Metを過剰発現する細胞系は非常に高いc-Metレベルを有する。逆もまた同様であり、すなわちT47Dは高いレベルのHer3を有し、そしてA549は単に低い細胞表面発現を示す。
Her3又はc-Metに対して特異的に結合する抗体と細胞のインキュベーションは、受容体のインターナリゼーションを誘発することが示されている。二重特異的抗体のインターナリゼーション能力を評価するために、実験設定を企画し、抗体−誘発された受容体インターナリゼーションを研究した。このために、細胞を、37℃でそれぞれの一次抗体と共に、異なった期間(0, 30, 60及び120分間(=0時、1/2時、1時及び2時間))インキュベートした。
活性c-Metシグナル化の1つの重要な観点は、移動性及び侵襲性プログラムの誘発である。c-Met阻害抗体の効能を、HGF−誘発された細胞移動の阻害を測定することにより決定することができる。このために、HGF−誘発性癌細胞系A431を、二重特異的抗体又はIgG対照抗体の不在又は存在下でHGFにより処理し、そして8μmの孔を通して移動する細胞の数を、インピーダンス読み取りを備えたCIM−プレートを用いて、Acea Real Time細胞分析器上で時間−依存性態様で測定した。独立して、細胞の移動を、その移動した細胞を染色することにより定量的に可視化した(データは示されていない)。例は、HGF−誘発された細胞移動の用量−依存性阻害を示す。
Her3及びc-Metに結合する二重特異的抗体の作用の態様を、より理解するために、受容体結合状態を、表面プラスモン共鳴測定(Biacore)の助けにより決定した。異なった実験設定を用いて、組換えHer3又は組換えc-Met外部ドメイン(ECD)のいずれかへの又は同時に両者への二重特異的抗体の結合を評価した。試験された二重特異的抗体のすべては、Her3及びc-Met ECDに同時に結合することができた。さらに、抗体:Her3:cMet-ECDの複合体への組換えFcgamma III タンパク質の結合を決定した。抗体のすべては、NK−依存性エフェクター機能を増強するために二重特異的抗体の糖構築のために強い理論的基礎を提供する両外部ドメインの存在下でさえFcgamma III 受容体に結合できた。
二重特異的抗体型の多価性のために、細胞−細胞架橋は、低められた受容体インターナリゼーションをまた説明する可能性ある作用の態様である。この現象をより詳細に研究するために、この問題を取り組み実験設定を企画した。このためには、それらの細胞表面上でHer3及びc-Metを発現するHT29細胞を、2種の集団に分けた。1つは、PKH26(SIGMA)により染色され、他はPKH67(Sigma)により染色され、2種の膜色素に関しては、前者が緑色、後者が赤色である。染色された細胞を混合し、そしてHer3/c-Met_scFv_SSKHと共にインキュベートした。流動細胞計測に基づくアッセイにおいては、細胞の集中的架橋が上方右側の四分区画において二重陽性(緑+/赤+)細胞の集団の上昇を導く。この実験に基づけば、細胞−細胞架橋の上昇は所定の設定下で観察されなかった。
二重特異的Her3/c-Met抗体MH_TvAbl8、MH_TvAb21 MH_TvAb 22及びMH_TvAb 30のDNA配列を、MPSVプロモーターの制御下での及び合成ポリA部位の上流の哺乳類発現ベクター(EBV Orip配列をそれぞれ担持する)中にサブクローン化した。
フコース−及び非−フコース(a−フコース)含有オリゴ糖構造の相対的比率の決定のために、精製された抗体材料の開放されたグリカンを、MALDI-Tof−質量分光計により分析した。このためには、抗体のサンプル(約50μg)を、タンパク質主鎖からオリゴ糖を開放するために、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中、5mUのN−オリコシダーゼF(Prozyme # GKE-5010B)と共に37℃で一晩インキュベートした。続いて、開放されたグリカン構造体を単離し、そしてNuTip−炭素ピペット端(Glygenから入手される:NuTip1-10μl、カタログNr#NT1CAR)を用いて脱塩した。第1段階として、NuTip−炭素ピペット端を、それらを3μlの1MのNaOH、続いて20μlの純粋水(例えば、BakerからのHPLC−グラジエント級、#4218)、3μlの30%(v/v)酢酸及び再び20μlの純粋水により洗浄することにより、オリゴ糖の結合のために調製した。
エンド−グリコシダーゼHにより消化し、ここでN-グリコシダーゼFはタンパク質主鎖からすべてのN−結合されたグリカン構造体(複合体、ハイブリッド及びオリゴ−及び高−マンノース構造体)を開放し、そしてエンド−グリコシダーゼHはグリカンの還元端で2つのGleNAc-残基間のすべてのハイブリッド型グリカンを、さらに分解する。この消化物を、続いて、N−グリコシダーゼF消化されたサンプルについての上記と同じ手段で処理し、そしてMALDI-Tof質量分光計により分析する。N−グリコシダーゼF消化物及び組合わされたN−グリコシダーゼF/エンドH消化物からのパターンを比較することにより、特定の糖構造体のシグナルの低減の程度を用いて、ハイブリッド構造体の相対的含有率を評価する。
本発明のHer3/c-Met二重特異的抗体は、両受容体を発現する細胞に対する低められたインターナリゼーションを示す。低められたインターナリゼーションは、細胞表面上の抗体−受容体複合体の延長された暴露がNk細胞により一層有望に認識されるので、それらの抗体を糖構築するための原理を強く支持する。低められたインターナリゼーション及び糖構築は、親抗体に比較して、増強される抗体依存性細胞毒性(ADCC)に移行する。それらの効果を示すためにインビトロ実験設定を、細胞表面上でHer3及びc-Metの両者を発現する癌細胞、例えばA431、及びNk細胞系又はPBMCのようなエフェクター細胞を用いて企画することができる。腫瘍細胞を、親単一特異的抗体又は二重特異的抗体と共に24時間までインキュベートし、続いてエフェクター細胞系を添加する。細胞溶解を定量化し、そして単一及び二重特異的抗体の識別を可能にする。
皮下U87MG神経グリア芽細胞腫モデルは、オートクリンHGFループを有し、そして細胞表面上にHer3及びc-Metを表示する。両受容体は、溶解され、そしてイムノブロット分析にゆだねられる腫瘍外植片においてリン酸化される(データは示されていない)。U87MG細胞を、対数増殖期において標準の細胞培養条件下で維持した。1×107個の細胞を、SCID beigeマウスに移植した。腫瘍が確立され、そして100〜150mm3のサイズに達した後、処理を開始する。マウスを、20mg/kg(抗体/マウス)の用量により、及び次に、10mg/kg(抗体/マウス)の用量により週1度、処理する。腫瘍体積を週2度、測定し、そして動物重量を同時にモニターした。1回の処理及び単一抗体の組合せを、二重特異的抗体による治療に比較する。
Mrc-5細胞により同時注入される皮下BxPc-3モデルは、c-Metについてのパラクリン活性化ループを模倣する。BxPc-3は、細胞表面上にc-Met及びHer3を発現する。BxPc-3及びMrc-5細胞を、対数増殖期において標準の細胞培養条件下で維持する。BxPc-3及びMrc-5細胞に、1×107個のBxPc-3細胞及び1×106個のMrc-5(10:1の比)を注入する。細胞を、SCID beigeマウスに移植する。腫瘍が確立され、そして100〜150mm3のサイズに達した後、処理を開始する。マウスを、20mg/kg(抗体/マウス)の用量により、及び次に、10mg/kg(抗体/マウス)の用量により週1度、処理する。腫瘍体積を週2度、測定し、そして動物重量を同時にモニターした。1回の処理及び単一抗体の組合せを、二重特異的抗体による治療に比較する。
ヒトHGFに対してトランスゲニックの免疫無防備状態にされたマウスは、全身性HGFのための源として作用する。そのようなマウスは、文献に説明されており、そしてVan Andel Instituteから入手できる。細胞表面上で両受容体を発現する癌細胞系、例えばBxPc-3又はA549の皮下注入を用いて、Her3及びc-Metを標的化する二重特異的抗体の効能を研究することができる。細胞を、対数増殖期において標準細胞培養条件下で維持する。1×107個の細胞を、HGFのためのトランスジーンを維持するSCID beigeマウスに移植する。腫瘍が確立され、そして100〜150mm3のサイズに達した後、処理を開始する。マウスを、20mg/kg(抗体/マウス)の用量により、及び次に、10mg/kg(抗体/マウス)の用量により週1度、処理する。腫瘍体積を週2度、測定し、そして動物重量を同時にモニターした。1回の処理及び単一抗体の組合せを、二重特異的抗体による治療に比較する。
A549癌細胞は、細胞表面上でHer3及びc-Metを発現する。A549細胞を、対数増殖期において標準細胞培養条件下で維持する。1×107個の細胞を、SCID beigeマウスに移植する。腫瘍が確立され、そして100〜150mm3のサイズに達した後、処理を開始する。マウスを、20mg/kg(抗体/マウス)の用量により、及び次に、10mg/kg(抗体/マウス)の用量により週1度、処理する。腫瘍体積を週2度、測定し、そして動物重量を同時にモニターした。1回の処理及び単一抗体の組合せを、二重特異的抗体による治療に比較する。
Claims (10)
- ヒトErbB-3に対して特異的に結合する第1抗原−結合部位、及びヒトc-Metに対して特異的に結合する第2抗原−結合部位を含んで成る、ヒトErbB-3及びヒトc-Metに対して特異的に結合する二重特異的抗体であって、
i)前記第1抗原−結合部位は、H鎖可変ドメインに、配列番号:53のCDR3H領域、配列番号:54のCDR2H領域及び配列番号:55のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:56のCDR3L領域、配列番号:57のCDR2L領域、及び配列番号:58のCDR1L領域又は配列番号:59のCDR1L領域を含んで成り;そして
前記第2抗原−結合部位は、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域を含んで成り;或いは
ii)前記第1抗原−結合部位は、H鎖可変ドメインに、配列番号:60のCDR3H領域、配列番号:61のCDR2H領域及び配列番号:62のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:63のCDR3L領域、配列番号:64のCDR2L領域、及び配列番号:65のCDR1L領域を含んで成り;そして
前記第2抗原−結合部位は、H鎖可変ドメインに、配列番号:66のCDR3H領域、配列番号:67のCDR2H領域及び配列番号68のCDR1H領域、及びL鎖可変ドメインに、配列番号:69のCDR3L領域、配列番号:70のCDR2L領域、及び配列番号:71のCDR1L領域を含んで成ることを特徴とする二重特異的抗体。 - i)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:47、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:48を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
ii)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:50を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
iii)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:51を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;
iv)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:52を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成り;又は
v)前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:1、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:2を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成る、
ことを特徴とする、請求項1に記載の二重特異的抗体。 - 前記第1抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:49、及びL鎖可変ドメインとして配列番号:51を含んで成り、そして前記第2抗原−結合部位が、H鎖可変ドメインとして配列番号:3及びL鎖可変ドメインとして配列番号:4を含んで成ることを特徴とする、請求項1に記載の二重特異的抗体。
- IgG1又はIgG3サブクラスの不変領域を含んで成ることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二重特異的抗体。
- 前記抗体がAsn297で糖鎖によりグリコシル化され、それにより前記糖鎖内のフコースの量が65%又はそれ以下であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重特異的抗体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異的抗体をコードする核酸。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異的抗体を含んで成る医薬組成物。
- 癌の処理のための請求項7に記載の医薬組成物。
- 癌の処理のための請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異的抗体。
- 癌の処理のための薬物の製造のための請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異的抗体の使用。
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