ES2274537T5 - Anticuerpos ErbB3 - Google Patents

Description

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mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press, 1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPM1-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de ningún modo producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de estudios sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo se incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol Revs., 130:151-188 (1992).

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de bibliotecas de fagos-anticuerpos generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las posteriores publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (rango de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Biol. Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas convencionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también se puede modificar, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera en lugar de secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina.

Habitualmente, dichos polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

(iii) Anticuerpos humanizados y humanos

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos “importados”, que habitualmente se sacan de un dominio variable “importado”. La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de CDRs de roedores o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligero como pesado, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la anteginicidad. Según el método denominado “mejorajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. A continuación, la secuencia humana que está más próxima a la del roedor se acepta como marco de la región humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método utiliza un marco de región particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco de región se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).

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Es también importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales humanizados utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles normalmente y son familiares para los expertos en la materia. Hay programas informáticos que muestran y visualizan probables estructuras conformaciones tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar del receptor e importar secuencias, de manera que se consigue la característica del anticuerpo deseado, tal como una mayor afinidad para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.

Alternativamente, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal da lugar a una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes humanos de inmunoglobulinas de la línea germinal en dichos ratones mutantes en la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la inducción de los antígenos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al. Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos también se pueden derivar de bibliotecas de expresión de fagos (Hoogenboom et al. J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)).

(iv) Fragmentos de anticuerpos

Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Habitualmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir actualmente directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las bibliotecas de fagos-anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab’-SH se pueden recuperar directamente de E coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otra aproximación, los fragmentos F(Ab’)2 se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el técnico de la materia.

(v) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tiene especificidades de unión con por lo menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína ErbB3. Otros de dichos anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a ErbB3 con sitio o sitios de unión para EGFR, ErbB2 y/o ErbB4. Alternativamente, un brazo anti-ErbB3 puede combinarse con un brazo que se une a una molécula inductora en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3) o receptores Fc para IgG (FCγR), tal como FCγRI (CD64), FCγRII (CD32) y FCγRIII (CD16) con el fin de centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa ErbB3. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos en células que expresan ErbB3. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a ErbB3 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-α, alcaloide vinca, cadena A de ricina, metotrexato o isótopo radioactivo de hapteno). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab’)2).

Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción habitual de anticuerpos específicos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tiene diferentes especificidades (Milstein et al., Nature, 305:537539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda y los rendimientos de producto son bajos. En WO 93/08829 y en Truanecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) se describen procesos similares.

Según una aproximación diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se produce preferiblemente con una dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones flexibles CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena

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Las enzimas se pueden unir covalentemente a los anticuerpos anti-ErbB3 mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tal como la utilización de los reactivos de reticulación heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención unida a por lo menos una parte funcionalmente activa de una enzima se pueden construir utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).

(xi) Fusiones de epítopo de unión de receptor salvaje-anticuerpo

En ciertas realizaciones de la presente invención, puede ser deseable utilizar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración en el tumor, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo con el fin de aumentar su vida media en suero. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante la incorporación de una un epítopo de unión de receptor salvaje al anticuerpo, fragmento (por ejemplo, mediante la mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o mediante la incorporación del epítopo en un péptido etiqueta que a continuación se fusiona al fragmento de anticuerpo en el extremo o en el centro, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o péptidos).

Un procedimiento sistemático para preparar dicha variante de anticuerpo que tiene una vida media in vivo comprende varias etapas. La primera implica la identificación de la secuencia y la conformación de un epítopo de unión de receptor salvaje de una región Fc de una molécula de IgG. Una vez se identifica este epítopo, la secuencia del anticuerpo de interés se modifica para incluir la secuencia y la conformación del epítopo de unión identificado. Después de mutar la secuencia, se estudia la variante del anticuerpo para ver si tiene una mayor vida media in vivo que la del anticuerpo original. Si la variante del anticuerpo no tiene una mayor vida media in vivo tras el estudio, su secuencia se altera adicionalmente para incluir la secuencia y la conformación del epítopo de unión identificado. Se estudia el anticuerpo alterado para una vida media in vivo más larga, y se continúa este proceso hasta que se obtiene una molécula que muestra una vida media in vivo más larga.

El epítopo de unión de receptor salvaje incorporado de esta manera al anticuerpo de interés es cualquiera de los epítopos tal y como se han definido anteriormente, y su naturaleza dependerá, por ejemplo, del tipo de anticuerpo que se modifica. La transferencia se realiza de manera que el anticuerpo de interés aún posee las actividades biológicas descritas en el presente documento.

El epítopo generalmente constituye una región en la que cualquier residuo o residuos de aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Incluso más preferiblemente, se transfieren tres o más residuos de uno o más bucles del dominio Fc. Aún más preferiblemente, el epítopo se extrae del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o VH, o más de una de dichas regiones del anticuerpo. Alternativamente, el epítopo se extrae del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o la región VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

El epítopo de unión de receptor salvaje comprende preferiblemente la secuencia (5’ a 3’): PKNSSMISNTP (SEC ID No: 1), y opcionalmente comprende además una secuencia seleccionada del grupo que consiste en HQSLGTQ (SEC ID No: 2), HQNLSDGK (SEC ID No: 3), HQNISDGK (SEC ID No: 4) o VISSHLGQ (SEC ID No: 5), particularmente cuando el fragmento de anticuerpo es Fab o F(ab’)2 o el epítopo de unión de receptor salvaje es un polipéptido que contiene la secuencia(s) (5’ a 3’): HQNLSDGK (SEC ID No: 3), HQNISDGK (SEC ID No: 4) o VISSHLGQ (SEC ID No: 5), y la secuencia PKNSSMISNTP (SEC ID No: 1).

B. Vectores, células huésped y procedimientos recombinantes

Se prevén el ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo tal y como se describe en el presente documento, vectores y células huésped que comprende el ácido nucleico; y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Muchos vectores son útiles. Entre los componentes del vector se incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción.

(i) Componente secuencia señal

El anticuerpo anti-ErbB3 de la presente invención se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específica en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduros. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es la que es reconocida y procesada (es

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