CN113912715A

CN113912715A - 一种抗α-突触核蛋白抗体及其相关产品和应用

Info

Publication number: CN113912715A
Application number: CN202111526696.8A
Authority: CN
Inventors: 马咏翔; 庞晓静
Original assignee: Beijing Kaixiang Hongkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Kaixiang Hongkang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN113912715B

Abstract

本发明公开了一种抗α‑突触核蛋白抗体及其相关产品和应用，所述抗体由杂交瘤细胞株34E10D8分泌，包含SEQ ID NO. 1、2、3所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，与SEQ ID NO. 11、12、13所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，该单克隆抗体具有较高的亲和力以及特异性。

Description

一种抗α-突触核蛋白抗体及其相关产品和应用

技术领域

本发明属于细胞生物技术、免疫学领域，涉及一种抗α-突触核蛋白抗体及其相关产品和应用。

背景技术

α-突触核蛋白（-synuclein，α-syn）由 140个氨基酸组成。其结构包括3部分，即N-端结构域、可变中央非β淀粉样成分（non-Aβ-component，NAC）结构域及C-端结构域。α-Syn是一种广泛分布于健康人脑组织中的可溶性蛋白，可以多种不同的形式存在（Ascherio A,Schwarzschild MA.The epidemiology of Parkinson's disease:risk factors andprevention [J] .Lancet Neurol, 2016, 15(12): 1257-1272.）。α-Syn具有伴侣蛋白的功能，能够维护突触、参与调节多巴胺(Dopamine，DA)的生物合成以及保护细胞免受损伤，抗异常蛋白聚集并促进其降解（Longhena F, Faustini G, Spillantini MG, et al.Living in Promiscuity:Multiple Partners of Alpha-Synuclein at the Synapse inPhysiology Pathology [J] .Int J Mol Sci, 2019, 20(1): 141.）。病理情况下，α-Syn首先寡聚化成为可溶性原纤维，后再形成不溶性的纤维，进而聚集形成不溶性的纤维结构和包涵体，最终形成路易小体（Jones DR, Delenclos M, Baine AT, et al.Transmission of Soluble and Insoluble a-Synuclein to Mice [J] .J NeuropatholExp Neurol, 2015, 74(12):1158-1169.）。

α-突触核蛋白构成的病理性包涵体常见于帕金森病（Parkinson s disease，PD）、路易体痴呆（dementia with Lewy bodies，DLB）、多系统萎缩（multiple systematrophy，MSA）以及一些罕见疾病，由于这些疾病中突触核蛋白的异常聚集，因此它们统称为α-突触核蛋白病。

α -突触核蛋白是开发α -突触核蛋白病(例如帕金森病)的治疗剂的靶标。主要的开发策略包括抑制聚集体形成、基因沉默和去除聚集体。目前针对α-syn的抗体有针对不同聚集状态的α-syn的抗体(抗单体，抗寡聚体，抗纤维化抗体)；α-syn分为三个结构域，N端，NAC区及C端，所以也有针对识别α-syn不同区域的抗体(抗N端，抗C端，抗NAC区抗体)，但是目前均没有应用到临床上。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌抗α-突触核蛋白的杂交瘤细胞株和抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。

本发明的第一方面提供了一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：

SEQ ID NO. 1的HCDR1、SEQ ID NO. 2的HCDR2和SEQ ID NO. 3的HCDR3，与SEQ IDNO. 11的LCDR1、SEQ ID NO. 12的LCDR2和SEQ ID NO. 13的LCDR3。

进一步，所述单克隆抗体还包含具有与SEQ ID NO.4、5、6、7所示氨基酸序列至少90%序列一致性的重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4；以及具有与SEQ ID NO.14、15、16、17所示氨基酸序列至少90%序列一致性的轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。

进一步，所述单克隆抗体重链可变区具有与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列至少90%序列一致性，优选95%序列一致性的VH，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列至少90%序列一致性，优选95%序列一致性的VL。

进一步，所述单克隆抗体的VH具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的VL具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列。

进一步，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。

本发明的第二方面提供了如下任一项所述的物质：

1）核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段；

2）重组表达载体，所述重组表达载体包含1）中所述的核酸分子；

3）宿主细胞，所述宿主细胞包含2）中所述的重组表达载体。

进一步，编码HCDR1、HCDR2、HCDR3的核酸分子具有与SEQ ID NO.21、22、23所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列；编码LCDR1、LCDR2、LCDR3的核酸分子具有与SEQ ID NO.31、32、33所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列。

进一步，编码HCDR1、HCDR2、HCDR3的核酸分子具有SEQ ID NO.21、22、23所示的核苷酸序列；编码LCDR1、LCDR2、LCDR3的核酸分子具有SEQ ID NO.31、32、33所示的核苷酸序列。

进一步，编码重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的核酸分子具有与SEQ IDNO.24、25、26、27所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列；编码轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的核酸分子具有与SEQ ID NO.34、35、36、37所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列。

进一步，编码VH的核酸分子具有与SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列同一性的序列；编码VL的核酸分子具有与SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列同一性的序列。

进一步，编码VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，编码VL的核苷酸序列如SEQID NO.39所示。

进一步，所述重组表达载体具有与抗体VH在所述VH的N端处可操作地连接的第一信号肽，和与所述抗体VL在所述VL所述N端处可操作地连接的第二信号肽。

进一步，所述第一信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述第二信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

进一步，编码所述第一信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，编码所述第二信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。

进一步，所述重组表达载体进一步包含转录调控元件。

本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的物质；和/或药学上可接受的载体。

本发明的第四方面提供了如下任一项所述的应用：

1）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在检测ɑ-突触核蛋白中的应用；

2）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质在制备诊断ɑ-突触核蛋白病的产品中的应用；

3）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质或本发明第三方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗与α-突触核蛋白病的药物中的应用。

进一步，所述产品包括试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)、荧光免疫试剂盒和微流体芯片。

进一步，所述α-突触核蛋白病为神经退行性疾病。

进一步，所述神经退行性疾病包括帕金森病、路易体痴呆、弥漫性路易体疾病、阿兹海默氏病的路易体变型、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多系统萎缩、具有I型脑铁积聚的神经退化。

进一步，所述神经退行性疾病为帕金森病。

附图说明

图1是western检测免疫小鼠抗血清对重组抗原识别能力图；

图2是western检测34E10D8单克隆抗体培养上清对重组抗原识别能力图；

图3是纯化抗体53A2G6和34E10D8联合与抗原结合的特异性检测图。

具体实施方式

为了制备特异性强，亲和力高的抗α-突触核蛋白的抗体，本发明通过制备α-突触核重组蛋白来免疫动物，从而获得分泌阳性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而纯化得到特异性高的单克隆抗体。

定义

如本文所用，术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然完整抗体包含两条重（H）链和两条轻（L）链。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区（VH）以及第一、第二、第三和任选存在的第四恒定区（分别为CH1、CH2、CH3、CH4）组成；哺乳动物轻链分类为λ或κ，而每条轻链由可变区（VL）和恒定区组成。抗体呈“Y”形，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区（complementaritydetermining region；CDR）（轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、 HCDR3）。本文中所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、IMGT、Chothia或Al- Lazikani的约定来限定或鉴定三个CDR插在被称为构架区（frameworkregion；FR）（轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括 HFR1、HFR2、HFR3和HFR4）的侧翼链段（stretch）之间，所述侧翼链段比CDR更高度保守且形成支撑高度可变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但呈现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。抗体的五种主要类别或同型为大免疫球蛋白A（IgA）、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于α、δ、ε、γ和μ重链的存在。若干主要抗体类别分为亚类，如IgG1（γ1重链）、IgG2（γ2重链）、IgG3（γ3重链）、IgG4（γ4重链）、IgA1（α 1重链）或IgA2（α2重链）。

在某些实施例中，本文提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包含一或多个CDR或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab '、F(ab ')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段（dsFv）、(dsFv)2、双特异性dsFv （dsFv-dsFv '）、二硫键稳定的双功能抗体（ds双功能抗体）、单链抗体分子（scFv）、scFv二聚体（二价双功能抗体）、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。

如本文所用，疾病、病症或病状的“预防和/或治疗”包括预防或缓解疾病、病症或病状；减缓疾病、病症或病状的发作或发展速率；降低发展疾病、病症或病状的风险；降低或终止与疾病、病症或病状有关的症状；产生疾病、病症或病状的完全或部分消退；治愈疾病、病症或病状；或其一些组合。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个所关注的生物序列在存在或不存在间隔子或连接子的情况下的并接，使得它们处于允许它们以预期方式起作用的关系中。当关于多肽使用时，其意指多肽序列以允许连接的产物具有预期的生物学功能的方式连接。关于多核苷酸也可以使用所述术语。举例来说，当编码多肽的多核苷酸与调控序列（例如启动子、增强子、沉默子序列等）可操作地连接时，其意指所述多核苷酸序列以允许调控由多核苷酸表达多肽的方式连接。在一个实施例中，可操作地连接的核苷酸序列是相邻的（例如在信号序列的情况下）。替代地，可操作地连接的核苷酸序列可以不相邻（例如在增强子的情况下）。

针对α-突触核蛋白的抗体

本发明提供了针对α-突触核蛋白的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO. 1的HCDR1、SEQ ID NO. 2的HCDR2和SEQ ID NO. 3的HCDR3，与SEQ ID NO. 11的LCDR1、SEQ ID NO. 12的LCDR2和SEQ ID NO. 13的LCDR3。

在一实施方式中，所述单克隆抗体还包含具有与SEQ ID NO.4、5、6、7所示氨基酸序列至少90%序列一致性的重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4；以及具有与SEQ IDNO.14、15、16、17所示氨基酸序列至少90%序列一致性的轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。

在又一实施方式中，所述单克隆抗体重链可变区具有与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列至少90%序列一致性，优选95%序列一致性的VH，所述轻链可变区具有与SEQ IDNO.19所示的氨基酸序列至少90%序列一致性，优选95%序列一致性的VL。

作为优选地实施方式，所述单克隆抗体的VH具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的VL具有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段是由本文提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。

在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白（Ig）恒定区，其任选地进一步包含重链和/或轻链恒定区。在某些实施例中，重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区（或任选地CH2-CH3-CH4区）。在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM的重链恒定区。在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG1的重链恒定区。在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含人IgG4的重链恒定区。在某些实施例中，轻链恒定区包含Ckappa（Cκ）或Clambda（Cλ）。本文提供的抗体和其抗原结合片段的恒定区可与野生型恒定区序列一致或相差一或多个突变。在某些实施例中，重链恒定区来自人IgG1。在某些实施例中，轻链恒定区来自人λ轻链。

本文提供的抗体和其抗原结合片段也涵盖本文提供的抗体序列的各种变体。

在某些实施例中，抗体变体在本发明提供的一或多个CDR序列中提供的重链可变区或轻链可变区的一或多个非CDR序列中和/或恒定区（例如Fc区）中，包含一或多个突变。这类变体保留其亲本抗体对于α-突触核蛋白的结合特异性，但具有由突变赋予的一或多种期望特性。举例来说，抗体变体可具有改进的抗原结合亲和力、改进的糖基化模式、降低的糖基化风险、降低的脱氨基作用、降低或耗竭的效应功能、改进的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH灵敏性和/或与结合的相容性。

在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段在CDR序列中的一或多个和/或FR序列中的一或多个中包含一或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。

在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含与本发明列出的那种（或那些）CDR序列具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性但仍保持以类似于或甚至高于其亲本抗体的水平与α-突触核蛋白特异性结合的1、2或3个CDR序列。

在某些实施例中，本文提供的抗体和其抗原结合片段包含与本发明中列出的那种（或那些）可变区序列具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性但仍保持在类似于或甚至高于其亲本抗体对于α-突触核蛋白的特异性结合亲和力的水平的一或多个可变区序列。在一些实施例中，突变发生在CDR外的区域（例如在FR中）。

重组表达载体

如本文所用，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒和人工染色体，如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1衍生的人工染色体（PAC）；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒（例如SV40）。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。术语“复制起点”是指当在载体中存在时其起始复制的序列。复制起点可被复制起始因子或替代地被DNA解螺旋酶识别。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。

载体可以是重组表达载体或克隆载体。本公开提供了载体（例如表达载体），其含有编码抗α-突触核蛋白中和抗体的本文提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒（例如SV40）、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3 .3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2 .2、pCMV-SCRIPT .RTM .、pCDM8、pCDNA1 .1/amp、 pcDNA3 .1、pRc/RSV、PCR 2 .1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

“重组表达载体”是编码基因的核酸分子，其在宿主细胞中表达且此外含有控制所述基因的表达的必需元件。通常，表达载体包含转录启动子、所关注基因和转录终止子。

在某些实施例中，重组表达载体是基于病毒的载体。在某些实施例中，重组表达载体是慢病毒载体。在某些实施例中，重组表达载体是腺相关病毒（AAV）载体。

在某些实施例中，编码本文提供的抗α-突触核蛋白中和抗体或其抗原结合片段的核酸序列进行了密码子优化。如本文所用，术语“密码子优化”是指通过，用在所关注的脊椎动物（例如人）的基因中较频繁或最频繁使用的密码子置换至少一个、超过一个或大量天然序列的密码子，来改变核酸序列以增强在所述脊椎动物细胞中的表达，但核酸序列的改变不改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。各种物种对特定氨基酸的某些密码子呈现出特定的偏好。

在某些实施例中，编码抗α-突触核蛋白中和抗体的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗α-突触核蛋白中和抗体的重链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗α-突触核蛋白中和抗体的轻链可变区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗α-突触核蛋白中和抗体的重链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。在某些实施例中，编码抗α-突触核蛋白中和抗体的轻链恒定区的核酸序列进行了密码子优化。

宿主细胞

可将包含编码抗体的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。用于此目的的适合原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性（Gram-negative）或革兰氏阳性（G ra m-pos i ti ve）生物体，例如肠内菌科（E n te ro ba c te ria cea e），如埃希氏菌属（Escherichia），例如大肠杆菌；肠杆菌属（Enterobacter）；欧文氏菌属（Erwinia）；克雷伯氏菌属（Klebsiella）；变形杆菌属（Proteus）；沙门氏菌属（Salmonella），例如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）；沙雷氏菌属（Serratia），例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）；和志贺杆菌属（Shigella），以及芽孢杆菌属（Bacilli），如枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）；假单胞菌属（Pseudomonas），如绿脓杆菌（P . aeruginosa）；和链霉菌属（Streptomyces）。

除原核生物外，真核微生物，如丝状真菌或酵母，是适用于表达抗α-突触核蛋白中和抗体的克隆或表达宿主。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或常见的烘焙酵母是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，多种其它属、种和菌株通常可用且适用于本文中。

适合表达本文提供的糖基化抗体或抗原片段的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出多种杆状病毒株和变体以及来自如下宿主的对应容许的昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）（毛虫）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）（蚊子）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）（蚊子）、黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）（果蝇）和家蚕（Bombyx mori）。多种用于转染的病毒株公开可用，例如苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5病毒株，并且所述病毒可以根据本公开用作本文中的病毒，特定来说用于转染草地贪夜蛾细胞。

然而，脊椎动物细胞也已引起极大关注，且在培养物（组织培养物）中繁殖脊椎动物细胞已变成常规方法。适用的哺乳动物宿主细胞系的实例是经SV40转化的猴肾CV1株系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胚肾系(经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的293或293细胞；幼小仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL 10）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR；小鼠支持细胞（TM4）；猴肾细胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬科动物肾细胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法罗大鼠（buffalo rat）肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺细胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝细胞（Hep G2， HB8065）；小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝肿瘤系（Hep G2）。

用上文所描述的表达或克隆载体转化宿主细胞以制造抗α-突触核蛋白中和抗体，且在适当时在改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。在另一实施例中，抗体可通过所属领域中已知的同源重组来制造。

药物组合物和给药方法

本公开进一步提供药物组合物，其包含表达本文提供的针对α-突触核蛋白的中和抗体或其抗原结合片段的重组表达载体和一或多种药学上可接受的载体。

术语“药学上可接受的”指示，指定载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐一般在化学上和/或物理上与构成调配物的其它成分相容，且在生理上与其接受者相容。

用于本公开的药物组合物中的药学上可接受的载体可包括但不限于例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性媒剂（例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或林格氏葡萄糖和乳酸盐注射液）、非水性媒剂（例如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油）、抗微生物剂、等渗剂（如氯化钠或右旋糖）、缓冲液（如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液）、抗氧化剂（如硫酸氢钠）、麻醉剂（如盐酸普鲁卡因）、悬浮/分散剂（如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮）、螯合剂（如EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二醇四乙酸））、乳化剂（如聚山梨醇酯80（Tween-80））、稀释剂、佐剂、赋形剂、或无毒辅助物质、所属领域中已知的其它组分，或其各种组合。适合的组分可包括例如填充剂、结合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。

在某些实施例中，药物组合物是口服调配物。口服调配物包括但不限于胶囊、扁囊剂、丸剂、锭剂、糖衣锭（对于味道基质，通常蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍）、粉末、粒剂、或水性或非水性溶液或悬浮液、或油包水或水包油乳液、或酏剂或糖浆、或糖果口含锭（对于惰性基料，如明胶和甘油、或蔗糖或阿拉伯胶）和/或漱口水和其类似物。

在某些实施例中，药物组合物可以是可注射调配物，包括无菌水性溶液或分散液、悬浮液或乳液。在所有情况下，可注射调配物应是无菌且应是液体以便于注射。其在制备和存储条件下应是稳定的，且应对微生物（如细菌和真菌）感染具有抗性。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）和其适合的混合物和/或植物油。可注射调配物应维持适当流动性，所述流动性可通过多种方式维持，例如使用包衣（如卵磷脂）、使用表面活性剂等。可通过添加多种抗细菌和抗真菌药剂（例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等），来实现抗微生物污染。

在某些实施例中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针注射器中。供肠胃外给药的所有制剂均应当是无菌且无热原质的，正如所属领域中所知和实践的那样。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 抗α-突触核蛋白抗体的制备

1、免疫原处理：免疫原为重组α-突触核蛋白，经SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和分子量，经过ImmunoPlus技术处理，增强免疫原性。

2、动物免疫：选取BALB/c小鼠，常规方法免疫。经三次免疫后，用间接ELISA方法测试抗血清效价，选取效价高的小鼠进行后续实验，使用western测试抗血清对重组抗原的识别。

3、脾细胞制备：引颈处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于已消毒的90~100目不锈钢网中。用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液，反复抽吸数次获取细胞，再制成细胞悬液。把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中静置5分钟。离心（800~1000转/分）计数，备用。

4、细胞融合：将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞按1：5比例混合，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。将1ml 40%的PEG溶液60秒内逐滴加入到细胞团中，同时并不断轻微转动离心管。在不断转动的离心管中，60秒内逐滴加入1ml无血清培养液。而后于5 分钟内缓慢加完20ml无血清培养基。离心（800 转/分，8 分钟），去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀。将细胞悬液加入96孔板内，每孔50微升。37℃ CO₂培养箱中培养24小时后更换成HAT选择性培养液。

5、融合后细胞培养：融合后7~10天用HAT培养液半量换液，以后每隔2~3天半量换液一次。2~3周后出现杂交细胞集落。待集落增殖生长至1/3孔时，取培养上清用ELISA方法进行抗体检测。以重组蛋白作为抗原包被酶标板，包被抗原浓度为1μg/ml, 100μl/孔。包被缓冲液为PBS（PH=7.4）。4℃放置过夜。次日PBS洗涤3次，每次5分钟。以1% BSA封闭，每孔加入200μl。37℃恒温箱孵育2小时。弃去BSA，加入含有单克隆抗体的细胞培养上清，每孔100μl。以小鼠的阳性抗血清作为阳性对照，以空白培养上清作为阴性对照。37℃恒温箱孵育2小时。弃去一抗，洗涤液洗5次，加Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG，37℃恒温箱孵育1小时。加入底物显色后，以酶标仪测定吸光值。

将检测的阳性细胞进行再一轮的克隆化培养，经验证后确定阳性细胞株，增殖后进行冻存和体外培养。

6、结果

经过三次免疫后，用间接ELISA方法对六只免疫小鼠（#4142~#4147）抗血清识别重组抗原的效价检测的结果如表1所示，结果表明重组α-突触核蛋白具有较好的免疫原性，免疫小鼠后能产生较强的免疫应答反应。

表1 小鼠血清效价测定

使用western检测免疫小鼠抗血清对重组抗原的识别，结果如图1所示，结果表明免疫小鼠抗血清对重组抗原具有较好的识别能力。

阳性细胞株经亚克隆后，得到多株稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株：53A2G6、22B5G6、25F5C5、34E10D8、3D4H7。杂交瘤细胞株34E10D8培养上清的ELISA检测结果如表2所示，说明杂交瘤细胞株34E10D8产生了针对重组α-突触核蛋白的抗体。

表2 杂交瘤细胞株的ELISA测定

实施例2 单克隆抗体的纯化及测序

首先将产生单克隆抗体的培养液，应用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；再用亲和层析法进一步纯化。

1、硫酸铵溶液初步沉淀

用饱和硫酸铵溶液进行盐析。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8；将产生抗体的培养液移入烧杯中，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液5ml，继续缓慢搅拌30分钟；10000rpm/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于PBS（0.01mol/L PH7.2）缓冲液中。

用透析法对盐析样本进行脱盐。将透析袋于2% NaHCO₃，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

2、亲和层析法进行抗体纯化

将初步纯化的抗体溶液经过protein A/G亲和层析柱过滤，经过结合、洗脱、收集，得到高纯度的抗体。利用分光光度计测定抗体浓度。将纯化的抗体分装后在-80℃保存。

3、单克隆抗体序列的测定

取对数生长期的杂交瘤细胞34E10D8，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入载体，测序、进行序列分析。

4、结果

序列检测结果如表3所示，重链的CDR1-3以及轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3和SEQ ID NO.11-13所示；重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.19所示。

实施例3 单克隆抗体的鉴定

1、以临床样本中的α-突触核蛋白作为抗原，以小鼠杂交瘤细胞34E10D8的单克隆培养上清进行检测，使用间接ELISA方法检测抗体识别抗原的能力。

2、以临床样本中的α-突触核蛋白作为抗原，以含有单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞34E10D8培养上清进行检测，使用western blot检测抗体抗原的结合能力。

3、应用双抗体夹心ELISA方法，以53A2G6为包被抗体，以如下抗体作为检测抗体：3D4H7-biotin、22B5G6-biotin、25F5C5-biotin、34E10D8-biotin、49B2G9-biotin、53A2G6-biotin、63E12C2-biotin、68E6D6-biotin、71G2F7-biotin、75G12C8-biotin、77G9C11-biotin，检测抗体对抗原的识别和捕获作用。

以2.5μg/ml的纯化抗体包被酶标板，包被液为PBS（pH=7.4），4℃放置过夜。洗涤液洗涤3次，加入重组蛋白作为抗原，抗原浓度分别为0、1、10、100ng/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次，加入生物素标记的检测抗体，浓度为1μg/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次，加入HRP标记的链酶亲和素，与检测抗体结合，浓度为1mg/ml，1:10,000稀释，每孔加入100μl。37℃孵育30分钟。加底物显色，酶标仪测定吸光值。

4、将单克隆抗体53A2G6与抗体34E10D8-biotin配对组合，检测纯化抗体与抗原结合的特异性，将抗原进行倍比稀释，根据抗原浓度与吸光值进行绘图。

5、结果

间接ELISA法检测结果如表4所示，抗体的吸光值>3，远远大于阴性对照值0.154，说明抗体对α-突触核蛋白有很好的亲和力。

表4 单克隆抗体的ELISA检测

Western法检测结果如图2所示，在14KD左右的位置，出现强阳性条带，说明抗体对临床样本中的抗原有很强的结合力。

双抗夹心ELISA检测结果如表5所示，抗体53A2G6与34E10D8-biotin配对成功，随着抗体含量的增加，吸光值随之上升。抗原浓度为100ng/ml 时，吸光值>3，明显高于阴性对照。说明该抗体对抗原有很强的识别和捕获作用。

表5 纯化抗体对抗原的识别

单克隆抗体53A2G6与抗体34E10D8-biotin配对组合检测抗原抗体的特异性结合如图3所示，随着抗原浓度升高，吸光值也随之升高，说明抗体与抗原结合具有特异性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京凯祥弘康生物科技有限公司

<120> 一种抗α-突触核蛋白抗体及其相关产品和应用

<141> 2021-11-22

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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35 40 45

<210> 36

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly Gly Thr

1 5 10 15

Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys

20 25 30

Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala

35 40 45

Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly

50 55 60

Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Thr

65 70 75 80

Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Cys

85 90 95

<210> 37

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala

1 5 10 15

Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala

20 25 30

<210> 38

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Ala Thr Gly Ala Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Thr

1 5 10 15

Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Ala

35 40 45

Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr

50 55

<210> 39

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys

1 5 10 15

Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr

20 25 30

Gly Thr Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Gly Gly Ala

35 40 45

Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr

50 55 60

Cys Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Thr

85 90 95

Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr

100 105 110

Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala

115 120 125

Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr

130 135 140

Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Ala Ala Thr Cys Thr

145 150 155 160

Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr

165 170 175

Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr

180 185 190

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala

195 200 205

Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala

210 215 220

Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys

225 230 235 240

Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly

245 250 255

Ala Gly Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala

260 265 270

Thr Thr Ala Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr

275 280 285

Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala

290 295 300

Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys

305 310 315 320

Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala

325 330 335

Claims

1.一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含：

SEQ ID NO. 1的HCDR1、SEQ ID NO. 2的HCDR2和SEQ ID NO. 3的HCDR3，与SEQ ID NO.11的LCDR1、SEQ ID NO. 12的LCDR2和SEQ ID NO. 13的LCDR3。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包含具有与SEQID NO.4、5、6、7所示氨基酸序列至少90%序列一致性的重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4；以及具有与SEQ ID NO.14、15、16、17所示氨基酸序列至少90%序列一致性的轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区具有与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列至少90%序列一致性的VH，所述轻链可变区具有与SEQID NO.19所示的氨基酸序列至少90%序列一致性的VL。

4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。

5.如下任一项所述的物质：

1）核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或其功能片段；

6.根据权利要求5所述的物质，其特征在于，所述重组表达载体具有与抗体VH在所述VH的N端处可操作地连接的第一信号肽，和与所述抗体VL在所述VL所述N端处可操作地连接的第二信号肽。

7.根据权利要求6所述的物质，其特征在于，所述第一信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述第二信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

8.根据权利要求5所述的物质，其特征在于，所述重组表达载体进一步包含转录调控元件。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体或权利要求5-8任一项所述的物质；和/或药学上可接受的载体。

10.如下任一项所述的应用：

1）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5-8任一项所述的物质在检测α-突触核蛋白中的应用；

2）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5-8任一项所述的物质在制备诊断α-突触核蛋白病的产品中的应用；

3）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5-8任一项所述的物质或权利要求9所述的药物组合物在制备预防和/或治疗与α-突触核蛋白病的药物中的应用。