CN113015557A - 抗alpha-突触核蛋白抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗alpha‑突触核蛋白抗体及其用于治疗疾病如帕金森氏病的用途。

Description

抗alpha-突触核蛋白抗体及其用途
本发明属于医学领域。更具体地，本发明涉及结合至alpha-突触核蛋白的抗体、包含此类alpha-突触核蛋白抗体的组合物和使用此类alpha-突触核蛋白抗体治疗突触核蛋白病的方法，所述突触核蛋白病如帕金森氏病、多系统萎缩症和阿尔茨海默氏病。
alpha-突触核蛋白(本文中也称为α-突触核蛋白)为140个氨基酸的突触前神经元蛋白质，其在神经系统中大量表达且在生理条件下优先定位至突触前末端。alpha-突触核蛋白已与称为“突触核蛋白病”的多种神经退行性疾病的发病机理有关。这些疾病在神经元(例如帕金森氏病(PD)、路易体痴呆(DLB))中或胶质(例如多系统萎缩症(MSA))中共享由聚集α-突触核蛋白构成的细胞内内含物的病理性标志。在PD中，在细胞体(即“路易体”)和神经元突起(neuronal process)(即“路易神经突”)两者中均观察到这些α-突触核蛋白内含物。在阿尔茨海默氏病中，约一半患者具有α-突触核蛋白与淀粉状蛋白和tau的共病理学。
除此病理学联系以外，已在家族性PD中发现编码α-突触核蛋白的基因(SNCA)中的突变，其通常使得α-突触核蛋白具有更高聚集倾向。此外，SNCA的双倍复制和三倍复制与家族性PD相关，表明α-突触核蛋白的过表达可导致神经退行性缺陷。
α-突触核蛋白的时间和区域扩散已与PD中的疾病症状进展相关。另外，已报告由钙蛋白酶和/或胱天蛋白酶切割产生的α-突触核蛋白的蛋白水解N端和C端片段在PD和DLB患者两者的路易体提取物中上调。此外，体外研究已显示，α-突触核蛋白的C端末端的逐步截短赋予形成原纤化病原性聚集体的更高固有能力(参见例如Wang等人,(2016)Proc.Nat.Acad.Sci.113(34):9587-9592)。综合而言，这些观测结果表明片段化α-突触核蛋白具有助于疾病进展的速率提高和患者预后较差的可能性。因此，结合至α-突触核蛋白的抗体可在治疗突触核蛋白病中具有治疗功效。
alpha-突触核蛋白抗体是本领域中已知的。例如，美国专利第8,609,820号公开人源化抗α-突触核蛋白抗体9E4和治疗或实现预防患有此类疾病或处于此类疾病的风险的患者的突触核蛋白病或路易体病的方法。然而，与α-突触核蛋白免疫疗法相关的当前策略主要采用靶向表位的抗体，使得预期抗体不结合和/或识别钙蛋白酶和/或胱天蛋白酶片段化物质，从而可能提供次佳功效。
因此，本领域中非常需要结合人α-突触核蛋白的钙蛋白酶和/或胱天蛋白酶产生的物质的抗alpha-突触核蛋白抗体。由本发明的抗体识别的独特alpha-突触核蛋白表位能够使抗体结合全长和片段化α-突触核蛋白聚集物质两者，且可能在突触核蛋白病(如PD和DLB)中赋予更大程度的疾病控制。
另外，本发明的抗体为高亲和力抗体，其具有可接受的特性(如体内PK和免疫原性)且平衡表面静电势、增加热稳定性、减少pI和/或降低与非抗原蛋白质结合。
因此，本发明提供包含重链(HC)和轻链(LC)的抗alpha-突触核蛋白抗体，其中所述HC包含重链可变区(HCVR)且所述LC包含轻链可变区(LCVR)，并且其中所述HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1(AASGFTFSSYAMS)给出，所述HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2(AISGSGGDTYYADSVXG；其中位置16处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺)给出，所述HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3(ARGYGMDV)给出，所述LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4(RSSQXLVHSDGNTYLM；其中位置5处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸)给出，所述LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5(YKVSXRNS；其中位置5处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸)给出，且所述LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6(MQGTKQYPT)给出。在一个实施方案中，SEQ ID NO:2的位置16处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。在一个实施方案中，SEQ ID NO:4的位置5处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸。在一个实施方案中，SEQ ID NO:5的位置5处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:2的位置16处的Xaa为赖氨酸，SEQ ID NO:4的位置5处的Xaa为丝氨酸，且SEQ ID NO:5的位置5处的Xaa为天冬酰胺。在另一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:2的位置16处的Xaa为谷氨酰胺，SEQ ID NO:4的位置5处的Xaa为天冬氨酸，且SEQ ID NO:5的位置5处的Xaa为天冬氨酸。
本发明还提供包含HC和LC的抗alpha-突触核蛋白抗体，其中所述HC包含HCVR且所述LC包含LCVR，并且其中所述HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:7(XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSS；其中位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸，且其中位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺)给出，并且其中所述LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:8(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRPGQSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTKQYPTFGQGTKLEIK；其中位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸，且其中位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸)给出。在一个实施方案中，SEQ ID NO:7的位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸。在一个实施方案中，SEQ ID NO:7的位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。在一个实施方案中，SEQ ID NO:8的位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸。在一个实施方案中，SEQ ID NO:8的位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。在一个具体的实施方案中，SEQ IDNO:7的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:7的位置65处的Xaa为赖氨酸，SEQ ID NO:8的位置28处的Xaa为丝氨酸，且SEQ ID NO:8的位置58处的Xaa为天冬酰胺。在另一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:7的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:7的位置65处的Xaa为谷氨酰胺，SEQ ID NO:8的位置28处的Xaa为天冬氨酸，且SEQ ID NO:8的位置58处的Xaa为天冬氨酸。
本发明还提供包含HC和LC的抗alpha-突触核蛋白抗体，其中所述HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9(XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLX；其中位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸，其中位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺，且其中位置441处的Xaa为甘氨酸或不存在)给出，且所述LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRPGQSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTKQYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；其中位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸，且其中位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸)给出。在一个实施方案中，SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸。在一个实施方案中，SEQ IDNO:9的位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。在一个实施方案中，SEQ ID NO:9的位置441处的Xaa为甘氨酸或不存在。在一个实施方案中，SEQ ID NO:10的位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸，且SEQ ID NO:10的位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:9的位置65处的Xaa为赖氨酸，SEQID NO:9的位置441处的Xaa为甘氨酸，SEQ ID NO:10的位置28处的Xaa为丝氨酸，且SEQ IDNO:10的位置58处的Xaa为天冬酰胺。在另一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:9的位置65处的Xaa为谷氨酰胺，SEQ ID NO:9的位置441处的Xaa为甘氨酸，SEQ ID NO:10的位置28处的Xaa为天冬氨酸，且SEQ ID NO:10的位置58处的Xaa为天冬氨酸。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明提供一种治疗患有突触核蛋白病的患者的方法，其包括向患者施用有效量的本发明的抗体。在一个实施方案中，突触核蛋白病为PD、MSA或AD。在一个具体的实施方案中，突触核蛋白病为DLB。在另一个具体的实施方案中，突触核蛋白病为PD。
本发明还提供用于疗法的本发明的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体用于治疗突触核蛋白病。在一个实施方案中，突触核蛋白病为PD、MSA或AD。在一个具体的实施方案中，突触核蛋白病为DLB。在另一个具体的实施方案中，突触核蛋白病为PD。
本发明提供本发明的抗体在制备用于治疗突触核蛋白病的药物中的用途。在一个实施方案中，突触核蛋白病为帕金森氏病(PD)、多系统萎缩症(MSA)、阿尔茨海默氏病(AD)或路易体痴呆(DLB)。
本发明还提供包含编码抗体HC的多核苷酸的DNA分子，所述抗体HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出。在一个实施方案中，DNA分子具有由SEQ ID NO:11给出的多核苷酸序列。
本发明还提供包含编码抗体LC的多核苷酸的DNA分子，所述抗体LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出。在一个实施方案中，DNA分子具有由SEQ ID NO:12给出的多核苷酸序列。
本发明提供一种DNA分子，其包含编码其氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出的HC的多核苷酸，且包含编码其氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出的LC的多核苷酸。在一个实施方案中，编码HC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:11给出，且编码LC的多核苷酸的序列由SEQ IDNO:12给出。
本发明还提供一种用包含编码抗体HC的多核苷酸的DNA分子和包含编码抗体LC的多核苷酸的DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述抗体HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，所述抗体LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，所述经转化的哺乳动物细胞能够表达包含两条HC和两条LC的抗体，其中各HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且各LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出。
本发明还提供一种用DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含1)编码HC的多核苷酸，所述HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，和2)编码LC的多核苷酸，所述LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，所述经转化的哺乳动物细胞能够表达包含两条HC和两条LC的抗体，其中各HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且各LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出。
本发明提供一种用于产生抗体的方法，所述抗体包含两条HC和两条LC，其中各HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且各LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，并且所述方法包括在使得抗体表达的条件下培养用包含编码抗体HC的多核苷酸的DNA分子和包含编码抗体LC的多核苷酸的DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述抗体HC的氨基酸序列由SEQ IDNO:9给出，且所述抗体LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，所述经转化的哺乳动物细胞能够表达包含两条HC和两条LC的抗体，其中各HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且各LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，以及回收表达的抗体。在一个实施方案中，本发明提供一种抗体，其可通过用于产生抗体的方法获得。
本发明提供一种用于产生抗体的方法，所述抗体包含两条HC和两条LC，其中各HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出且各LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，且所述方法包括在使得抗体表达的条件下培养用DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含编码HC的多核苷酸，所述HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且包含编码LC的多核苷酸，所述LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，所述经转化的哺乳动物细胞能够表达包含两条HC和两条LC的抗体，其中各HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且各LC的氨基酸序列由SEQ IDNO:10给出，以及回收表达的抗体。在一个实施方案中，本发明提供一种抗体，其可通过用于产生抗体的方法获得。
本发明还提供alpha-突触核蛋白抗体，其在以下残基的一个或多个处结合人alpha-突触核蛋白：SEQ ID NO:13的位置115处的天冬氨酸、位置116处的甲硫氨酸、位置119处的天冬氨酸、位置126处的谷氨酸和位置128处的脯氨酸。在一个实施方案中，抗体结合以下残基的至少两个氨基酸：SEQ ID NO:13的位置115处的天冬氨酸、位置116处的甲硫氨酸、位置119处的天冬氨酸、位置126处的谷氨酸和位置128处的脯氨酸。在另一个实施方案中，抗体结合以下残基的至少三个氨基酸：SEQ ID NO:13的位置115处的天冬氨酸、位置116处的甲硫氨酸、位置119处的天冬氨酸、位置126处的谷氨酸和位置128处的脯氨酸。在另一个实施方案中，抗体结合以下残基的至少四个氨基酸：SEQ ID NO:13的位置115处的天冬氨酸、位置116处的甲硫氨酸、位置119处的天冬氨酸、位置126处的谷氨酸和位置128处的脯氨酸。在另一个实施方案中，抗体结合以下残基：SEQ ID NO:13的位置115处的天冬氨酸、位置116处的甲硫氨酸、位置119处的天冬氨酸、位置126处的谷氨酸和位置128处的脯氨酸。在一些此类实施方案中，通过丙氨酸扫描测定结合。据信除全长alpha-突触核蛋白以外，这些抗体可更有效去除切割的alpha-突触核蛋白。
本发明提供抑制摄取包含SEQ ID NO:13的残基1-121的alpha-突触核蛋白片段的抗体。本发明还提供抑制摄取包含SEQ ID NO:13的残基120-140的alpha-突触核蛋白片段的抗体。在一些实施方案中，抗体抑制摄取1-121和120-140片段两者。本发明还提供结合包含SEQ ID NO:13的残基1-120的alpha-突触核蛋白片段的抗体。本发明还提供结合包含SEQID NO:13的残基120-140的alpha-突触核蛋白片段的抗体。在一个实施方案中，抗体结合1-120和120-140alpha-突触核蛋白片段两者。
附图简述
图1a.对alpha-突触核蛋白1-121片段内化的抑制。
图1b.对alpha-突触核蛋白内化的抑制。
图2.抗体与全长和alpha-突触核蛋白片段的结合。
定义
如本文所用，除非另外说明，否则alpha-突触核蛋白是指野生型alpha-突触核蛋白，且优选指具有由SEQ ID NO:13给出的氨基酸序列的野生型人alpha-突触核蛋白。“抗alpha-突触核蛋白抗体”或“alpha-突触核蛋白抗体”是指优先结合至alpha-突触核蛋白的二聚化形式的抗体，且当体外或体内施用时，导致达成的反应如至少一种显著减少的所期望的活性(如alpha-突触核蛋白的聚集和防止alpha-突触核蛋白聚集体摄取至细胞中)。
如本文所用，术语“聚集的”或“聚集”是指由大于一个alpha-突触核蛋白单体构成的装配体。
“接种”是指诱导细胞内聚集。具体地，接种是指将细胞外alpha-突触核蛋白摄取至细胞中且诱导alpha-突触核蛋白的单体池以形成聚集体。
如本文所用，术语“抗体”是指具有两条重链(HC)和两条轻链(LC)使得重链和轻链通过二硫键相互连接的经工程化改造的非天然存在的多肽复合物，其中抗体为IgG同种型抗体。各重链由N端HCVR和重链恒定区构成。各轻链由N端LCVR和轻链恒定区构成。当在某些生物系统中表达时，抗体在Fc区中糖基化。典型地，在抗体Fc区中，在高度保守的N-糖基化位点处发生糖基化。N-聚糖典型地附着于天冬酰胺。抗体同样可在其他位置处糖基化。
本发明的抗体缺乏效应器功能。优选地，本发明的抗体为IgG4PAA抗体。IgG4PAA抗体为分别在位置(根据EU编号)228、234、235处具有丝氨酸至脯氨酸取代和两个亮氨酸至丙氨酸取代(S228P、F234A、L235A)的IgG4抗体。S228P突变消除半抗体形成。已知两种丙氨酸突变破坏与FcγR的疏水相互作用以消除残余效应器功能。
重链的恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。CH1出现在HCVR之后；CH1和HCVR形成抗原结合(Fab)片段的重链部分，其为结合一个或多个抗原的抗体的部分。CH2出现在铰链区之后和CH3之前。CH3出现在CH2之后且处于重链的羧基末端。轻链的恒定区含有一个结构域CL。CL出现在LCVR之后；CL和LCVR形成Fab的轻链部分。
本发明抗体的HCVR和LCVR区可进一步细分成高度可变区，称为互补决定区(“CDR”)，散布有更保守的区域，称为框架区(“FR”)。各HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR组成，其自氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中，重链的三个CDR称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”且轻链的三个CDR称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。Kabat CDR定义(Kabat等人,Ann.NYAcad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health和HumanServices),NIH公开号91-3242(1991))基于抗体序列变异性。Chothia CDR定义(Chothia等人,“Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987)；Al-Lazikani等人,“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal ofMolecular Biology,273,927-948(1997))基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑结构。除HCDR1和HCDR2之外，Chothia CDR定义与Kabat CDR定义相同。North CDR定义(North等人，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”，Journal of MolecularBiology，406,228-256(2011))基于具有大量晶体结构的亲和力传播聚类。出于本发明的目的，氨基酸向本发明的抗体的LCVR和HCVR区内的CDR结构域的分配基于众所周知的Kabat编号惯例和North编号惯例。就本发明的抗体的轻链CDR而言，使用North CDR定义。在重链中，HCDR1和HCDR3两者也使用North定义。HCDR2使用North和Kabat定义的混合体。当Kabat用以定义最终位置时，North定义用以鉴别初始N端位点。
本发明预期本发明的抗体为人源化或人抗体。在单克隆抗体的情况下，术语“人”和“人源化”为本领域普通技术人员所众所周知的(Weiner LJ,J.Immunother.2006；29:1-9；Mallbris L等人,J.Clin.Aesthet.Dermatol.2016；9:13-15)。
本发明的DNA分子为包含编码具有本发明抗体中至少一种多肽(例如重链、轻链、可变重链和可变轻链)的氨基酸序列的多肽的非天然存在的多核苷酸序列的DNA分子。
编码HCVR区的分离的DNA可通过将编码HCVR的DNA可操作连接至编码重链恒定区的另一DNA分子转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的。涵盖这些区域的DNA片段可例如通过标准PCR扩增获得。
编码LCVR区的分离的DNA可通过将编码LCVR的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区的另一DNA分子而转化成全长轻链基因。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的。涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为kappa或lambda恒定区。优选地，对于本发明的抗体，轻链恒定区为kappa恒定区。
在已将序列可操作地连接至表达控制序列之后，本发明的多核苷酸可在宿主细胞中表达。表达载体在宿主生物体中通常可作为附加体或宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体将含有选择标志物，例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以允许检测用所期望的DNA序列转化的那些细胞。
本发明的抗体可容易地在哺乳动物细胞中产生，哺乳动物细胞的非限制性实例包括CHO、NS0、HEK293或COS细胞。可使用本领域中众所周知的技术培养宿主细胞。
含有感兴趣的多核苷酸序列(例如编码抗体的多肽的多核苷酸和表达控制序列)的载体可通过众所周知的方法转移至宿主细胞中，所述方法视细胞宿主类型而异。
多种蛋白质纯化方法可用于纯化蛋白质，包括但不限于抗体，且此类方法在本领域中是已知的。
本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径施用，肠胃外途径的非限制性实例为皮下施用和静脉内施用。本发明的抗体可利用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，以单次或多次剂量施用于患者。本发明的药物组合物可通过本领域中众所周知的方法(例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版.(2012)，A.Loyd等人，Pharmaceutical Press)制备且包含如本文所公开的抗体，和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
术语“治疗”是指减缓、中断、遏制、缓解、中止、减少或逆转现有症状、病症、病状或疾病的进展或严重程度。
“有效量”意指本发明的抗alpha-突触核蛋白抗体或包含此类抗体的药物组合物将引发由研究人员、医生或其他临床医师正寻求的针对组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物学或医学反应或所期望的治疗作用的量。抗体的有效量可根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体引发个体中所期望的反应的能力而变化。此类益处包括但不限于病理性路易体的扩散减少、运动功能改善和/或认知改善。有效量可容易地由本领域技术人员通过使用已知技术且通过观察在类似情况下获得的结果来确定。在确定用于患者的有效量时，主治诊断医师考虑多个因素，包括但不限于：患者体型、年龄和一般健康状况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的程度，或受累程度或严重程度；个别患者的反应；所施用的具体化合物；施用模式；所施用的制剂的生物利用度特征；所选择的给药方案；伴随药物的使用；及其他相关情况。
如本文所用，术语“突触核蛋白病”是指神经退行性疾病或神经退行性疾病家族，其特征在于神经元中α-突触核蛋白蛋白质聚集体异常积累。例示性病况包括阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩症(MSA)。
实施例
实施例：抗体表达和纯化
本发明的抗alpha-突触核蛋白抗体可基本上如下表达和纯化。可利用用于分泌抗体的表达系统使用最佳预定的HC:LC载体比率(诸如1:3或1:2)或编码HC和LC两者的单一载体系统短暂或稳定地转染合适的宿主细胞(诸如HEK 293或CHO)。利用多种常用技术的任一种纯化其中分泌有抗体的澄清培养基。例如，可将培养基施加至针对Fab片段的
Figure BDA0003065810370000112
柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)上，所述柱已利用兼容性缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡。可洗涤柱以去除非特异性结合组分。
所结合的抗体可例如通过pH梯度(诸如20mM Tris缓冲液(pH 7.0)至10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)，或磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)至100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0))洗脱。可诸如通过SDS-PAGE检测抗体级分且然后可进行合并。进一步纯化根据预期用途是可选的。可使用常见技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可通过常见技术，包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模式或羟磷灰石层析，有效去除可溶性聚集体和多聚体。这些层析步骤之后的抗体的纯度在约95％至约99％之间。
预期在抗体重链的N端处低百分比(约1％)的谷氨酸可转化成焦谷氨酸。另外，抗体重链的C端处低百分比(约小于1％)的甘氨酸可在翻译后被截短(剪断)。
产物可冷藏保存，在-70℃下立即冷冻或者可以冷冻干燥。本发明的例示性人抗体的氨基酸SEQ ID NO示于下表1中。
表1.抗体1和抗体2的氨基酸序列。
Figure BDA0003065810370000111
Figure BDA0003065810370000121
*位置1的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸。
**位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸，且位置441处的Xaa为甘氨酸或不存在。
实施例：对重组人α-突触核蛋白原纤维的抗体亲和力
进行酶联免疫吸附测定法(ELISA)以用于定量测定对重组人类α-突触核蛋白原纤维的抗体亲和力。通过持续两周振荡重组α-突触核蛋白单体，随后超声处理，来生成人α-突触核蛋白原纤维(Polinski等人,J.Parkinson's disease8(2018)303-322)。
在4℃下用PBS中1μg/ml的重组人α-突触核蛋白原纤维包被ELISA板过夜。第二天，在室温下将板与1％酪蛋白一起温育1小时以封闭板上的非特异性结合位点。接着用0.1％PBST洗涤板三次并在室温下与经3×连续稀释的抗体(抗体1、抗体2或比较抗体1)一起温育1小时。比较抗体1“(C.A.1”)描述为具有HCDR 1-3(Hu9E4VHv3)和LCDR 1-3(Hu9E4VLv3)的抗体，如美国专利第8,609,820号中所示和所描述(例如图1和图2)。温育之后，用0.1％PBST洗涤板三次以去除未结合的抗体并与0.1％PBST中的检测剂(1:1000稀释的山羊-抗人Kappa-AP)一起在室温下温育1小时。用0.1％PBST洗涤板三次以去除未结合的检测剂并与底物一起在室温下温育15分钟。接着在ELISA板读取器中560nm处读取OD。基于抗体浓度和OD560读出获得结合曲线。抗体亲和力测定为得出50％最大结合信号的浓度(EC50)。
随后程序基本上如上文所述，获得以下数据。
表2.如通过ELISA所测定的抗体对人α-突触核蛋白原纤维的结合亲和力。
抗体1 抗体2 C.A.1
基线OD<sub>560</sub> 0.05464 0.05099 0.05127
最大OD<sub>560</sub> 0.9143 0.8881 0.9715
EC<sub>50</sub>(pg/ml) 193.30 160.60 185.60
这些数据表明本发明的抗体以高亲和力结合人alpha-突触核蛋白原纤维。
实施例：抗体1和抗体2与单体alpha-突触核蛋白的结合
评估抗体1和抗体2对单体人α-突触核蛋白(SNCA，UniProtKB P37840；SEQ ID NO:13)的结合亲和力。也针对各种物种(包括人类、食蟹猴、兔、大鼠和小鼠alpha-突触核蛋白)测定抗体1和抗体2的结合亲和力。
在37℃下使用动力学排除测定法(Kinexa)(Darling,R,and Brault,P.A.(2004)Assay Drug Dev.Technol.,2(6):647-657)测量单体α-突触核蛋白结合亲和力。相比于基于板的ELISA测定法中的α-突触核蛋白的聚簇性质，Kinexa测定法由于其评估溶液中的α-突触核蛋白的亲和力的能力而特别地生理学相关。
将处于200pM的固定抗体浓度的独立容器与50μM至847pM范围内的单体alpha-突触核蛋白的连续稀释液混合。在37℃下温育这些样品24至48小时以允许达成稳定状态平衡。在此时间期间，Sepharose珠与单体人alpha-突触核蛋白缀合并用适合的非特异性结合蛋白(通常BSA或酪蛋白)封闭。一旦达成稳定状态，用经包被的珠装填小毛细管并在柱上注射各固定抗体/alpha-突触核蛋白单体的样品。在此步骤期间，自复合抗体选择性捕获游离的未缔合抗体，并随后经由荧光标记的抗人二抗进行检测。对于各浓度的alpha-突触核蛋白单体和所得荧光信号(与游离抗体百分比成比例)重复此步骤，然后将其绘制作为荧光信号相对于单体α-突触核蛋白浓度的函数且整体拟合至1:1结合模型以获得KD。报告具有技术重复(95％置信区间)的独立运行(n＝3)。
在基本上如上文所描述进行的实验中，获得以下物种的α-突触核蛋白的数据：人类(uniprot寄存编号P37840)、食蟹猴(uniprot登录P61142)、大鼠(uniprot登录P37377)、兔(uniprot登录G1U0V2)和小鼠(uniprot登录O55042)。
表3：如在37℃下通过Kinexa所测量的对单体alpha-突触核蛋白的结合亲和力。
Figure BDA0003065810370000141
这些数据表明抗体1和抗体2结合人类、食蟹猴、大鼠和小鼠alpha-突触核蛋白，且在更小程度上结合兔alpha-突触核蛋白。
实施例：抗体1和抗体2与二聚alpha-突触核蛋白的结合
评估抗体1和抗体2对小鼠Fc上含有残基100-140的人α-突触核蛋白的C端片段(mIgG1-hAsyn100-140)的亲合力-替代二聚表示的结合亲和力。使用板捕获方法基于Kinexa的原理(称为MSD-SET(Estrep等人(2013)MAbs,5(2):270-278))测定结合亲和力。工程化改造包含SEQ ID NO:13的最后40个氨基酸的人alpha-突触核蛋白融合至小鼠Fc片段的C段末端上(由短的非结构化接头元件分离)(mIgG1-hAsyn100-140)的合成二聚表示。该合成替代分子为生物化学表征成果提供亲合力能力(avidity-competent)人α-突触核蛋白聚集体替代的相对稳定且均质的表示。
将抗体(100fM)与浓度递增的两倍连续稀释的mIgG1-hAsyn100-140(范围为3.67fM至7.69nM)混合并允许其在25℃或37℃下达到稳定状态平衡。在此温育时间期间，MSD Sector板用单体人alpha-突触核蛋白包被并用封闭试剂(即BSA、酪蛋白)封闭。在稳定状态平衡温育时间之后，向板中同时添加个别抗体/mIgG1-hAsyn 100-140混合物并允许其温育10分钟以捕获游离抗体并最小化与复合于mIgG1-hAsyn100-140的抗体的交换。在此短暂温育之后，随后洗涤板并与生物素化的抗人二抗一起温育，随后在MSD仪器上使用链霉抗生物素蛋白-S-标签检测。接着将所得MSD信号(与％游离抗体成比例)绘制为mIgG1-hAsyn100-140浓度的函数并将其整体拟合至四参数拟合以获得IC50(KD)。报告的95％置信区间表示各自具有技术重复的N＝3个独立运行的拟合。亲合力-因子为单体亲和力与二聚体亲和力之间的比率计差，并表示抗体的单体和二聚α-突触核蛋白之间的结合选择性。亲和力值报告于表4中。
表4：二聚人alpha-突触核蛋白在25℃或37℃下的结合亲和力。
Figure BDA0003065810370000151
如表4中所示，25℃数据表明抗体1相对于抗体2和C.A.1对于二聚α-突触核蛋白的更高亲和力。在37℃下，相对于C.A.1，抗体1对二聚α-突触核蛋白的亲和力高6.7倍(平均)。抗体1的37℃数据表明单体人α-突触核蛋白(KD 19nM，参见表3)与二聚人α-突触核蛋白(聚集体替代；KD 0.97pM，参见表4)之间的亲合力因子(选择性指标)为大致20,000倍。
实施例：摄取至SH-SY5Y细胞中的人α-突触核蛋白原纤维的体外定量
为研究抗体1抑制人α-突触核蛋白聚集体形成的机制，测定抗体1阻断α-突触核蛋白原纤维的内化(摄取)的能力。
通过持续两周振荡重组α-突触核蛋白单体(用胺反应性pH敏感性染料pHAb(Promega，G9841)标记)，随后超声处理，来生成人α-突触核蛋白原纤维(Polinski等人,J.Parkinson’s Disease 8(2018)303-322)。将pHAb染料标记的人α-突触核蛋白原纤维(2μg/ml)添加至100μg/ml至0.097μg/ml范围内的连续稀释的抗体中。接着将该混合物添加至平均25,000个SH-SY5Y细胞/孔中且在37℃下温育过夜。
第二天，洗涤细胞，与NucBlue Hoechst染料(Thermo Fisher，R37605)一起温育20分钟，再次洗涤，然后通过在Cytation 5仪器(BioTek)上的高内涵成像来成像。pHAb染料仅在酸性pH下发荧光(即当内化后染料进入内吞/溶酶体途径中时)。因此，为计算每细胞的内化强度，将来自pHAb染料的总荧光强度除以每孔的核数目。每数据点重复计数至少20,000个细胞。细胞荧光的强度与人类α-突触核蛋白原纤维的内化(允许用于活细胞)和pHAb标记的人α-突触核蛋白摄取的定量读出相关。
随后程序基本上如上文所述，获得以下数据。
表5：用抗体处理之后原纤维内化的抑制。
抗体/测试物品 平均IC<sub>50</sub>(μg/mL) IC<sub>50</sub>标准偏差(μg/mL)
抗体1 0.45 0.017
抗体2 0.56 0.026
C.A.1 0.44 N/A
如表5中所示，抗体1以0.45μg/ml的平均IC50抑制人α-突触核蛋白原纤维内化。抗体2以0.56μg/ml的平均IC50抑制人α-突触核蛋白原纤维内化。在类似研究中，C.A.1的IC50为0.44μg/ml且对照hIgG1抗体对pHAb标记的人α-突触核蛋白原纤维内化无影响。这些数据表明所测试的抗体能够抑制α-突触核蛋白摄取。
实施例：抗体1抑制SHSY-5Y-A53T-myc细胞中人α-突触核蛋白介导的聚集体的体外评估
A53T为在具有早期发作PD的强倾向性的某些个体中发现的α-突触核蛋白的天然存在的变体。若干研究已显示，A53T赋予人α-突触核蛋白更快速的聚集表型。使用可四环素诱导以过表达人α-突触核蛋白的突变体A53T形式的人SH-SY5Y-A53T-myc表达细胞来测定人α-突触核蛋白聚集体形成的抑制。
为测量人α-突触核蛋白聚集体，在生长培养基加1μg/ml四环素中以40,000细胞/孔将SH-SY5Y-A53T-myc细胞铺板至黑色CellBIND板(Corning)中。第二天，去除培养基并用新鲜培养基替换，所述新鲜培养基含有在60μg/ml至0.027μg/ml范围内的抗α-突触核蛋白抗体的八点稀释曲线，其具有固定浓度为3μg/ml的经超声处理的人α-突触核蛋白预成型原纤维(PFF)和1μg/ml四环素。包括单独的四环素和单独的PFF作为聚集对照。在稀释系列中各浓度存在三个技术重复。
将板在37℃、95％湿度下温育五天，然后用1×Prefer固定剂(Anatech)固定一小时。用1×DPBS洗涤板两次且用Tris缓冲盐水+Tween-20(TBST)洗涤一次。细胞在TBST中的5％乳(Difco)中封闭一小时并在4℃下在5％乳/TBST中与处于1μg/mL的一抗小鼠抗pS129和处于1:1000稀释度的绵羊抗myc(Fisher,PA3-981)免疫染色过夜。
接着用TBST洗涤板三次，然后在室温下与二抗山羊抗小鼠AlexaFluor647(Invitrogen，A32728)和驴抗绵羊AlexaFluor555(Invitrogen，A21436)(各在TBST中以1:1000稀释)一起温育>2小时。用TBST洗涤板两次，接着用DPBS洗涤两次，然后密封。将板装载至Insight Instrument上以用于高内涵成像和使用Spot Detector v4.0算法进行分析。处理通过算法产生的数据以用于用Graph Pad软件v7.0计算IC50。
在基本上如上文所述进行的实验中，获得以下数据。
表6：在用抗体处理之后SHSY-5Y-A53T-myc细胞中的α-突触核蛋白聚集的抑制。
Figure BDA0003065810370000171
这些数据表明，本发明的抗体能够抑制SHSY-5Y-A53T-myc细胞中的alpha-突触核蛋白聚集。与表5中显示的pHAb内化抑制数据相比，存在IC50值非常类似的CRC曲线重叠(与表6中的0.41μg/ml相比，表5中IC50为0.45μg/ml)。这些结果表明抗体1对人α-突触核蛋白原纤维诱导的聚集和接种的抑制可通过抑制人α-突触核蛋白原纤维内化至细胞中来直接引起。
实施例：抗体1和C.A.1抑制SHSY-5Y-A53T-myc细胞上pHAb标记的1-121和1-140α-突触核蛋白原纤维摄取的体外评估
产生pHAb标记的长度为1-121(SEQ ID NO:13的氨基酸1-121)和1-140(SEQ IDNO:13)的α-突触核蛋白原纤维。用pHAb染料标记alpha-突触核蛋白单体，更换缓冲液，然后在1400RPM下振荡两周。在两周结束时，超声处理原纤维120秒，然后进行实验。
将抗体1和C.A.1自100μg/mL连续稀释至0.1μg/mL。以2μg/mL将抗体与pHAb标记的α-突触核蛋白1-121片段和全长alpha-突触核蛋白组合。然后将该溶液施加至SHSY5Y细胞并温育过夜。接着将细胞于Cytation 5上成像，阈值2000。
基于基本上如上所述的程序，结果表明摄取1-121α-突触核蛋白和全长α-突触核蛋白pHAb原纤维。抗体1阻断1-121α-突触核蛋白原纤维的摄取，而C.A.1显示对1-121α-突触核蛋白原纤维摄取的极小(若有的话)作用(图1a)。抗体1和C.A.1在抑制全长α-突触核蛋白摄取方面显示类似活性(图1b)。
这些数据表明抗体1和C.A.1对阻断α-突触核蛋白原纤维内化具有不同作用。抗体1能够剂量依赖性地阻断细胞摄取全长和1-121原纤维两者，而C.A.1仅能够阻断1-140原纤维。这表明抗体1通过其结合和阻断片段化alpha-突触核蛋白的内化的能力将更有效。
实施例：抗体1和抗体2的表位测定。
表位的生物化学测定
抗体1和抗体2的表位通过肽丙氨酸扫描测定。通过OctetRed384(ForteBio)上的生物层干涉术来测量结合。链霉抗生物素蛋白生物传感器(ForteBio)装载有0.1％BSA、0.05％PBST测定缓冲液中的SEQ ID NO:13的人α-突触核蛋白残基110-133的生物素化丙氨酸突变肽中的每一个，在相同缓冲液中洗涤，然后转移至含有浓度为15μg/mL的抗体溶液的孔中。使用Octet软件用1:1拟合模型获得响应信号和解离速率。相较于野生型肽，对丙氨酸突变肽的响应信号的损失或解离速率(Koff)的变化表明表位残基。
在遵循基本上如上文所描述的程序进行的实验中，抗体1和抗体2的关键残基经测定在两个独立区(D115，M116和D119，和E126和P128)中。用C.A.1进行类似实验。测定C.A.1的表位残基为N122和Y125，其对应于美国专利第10,081,674号中所报告的表位(参见例如图6)。
与两个独立表位的结合
由于关键表位残基在两个区域(如上文所述)中，为了解抗体1和抗体2是否可独立地结合至两个区域，使用截短的人α-突触核蛋白片段1-120(SEQ ID NO:13的残基1-120)和生物素化的人α-突触核蛋白肽120-140(SEQ ID NO:13的残基120-140)进行ELISA。还测定了结合全长(1-140)α-突触核蛋白。对于α-突触核蛋白原纤维结合，程序基本上如上文所述。遵循基本上如上文所述的程序，结合曲线显示于图2中。
这些数据表明抗体1和抗体2以在皮摩尔范围内的结合亲和力结合至α-突触核蛋白片段1-120和120-140两者。抗体1对于两个α-突触核蛋白片段中的每一个具有类似的亲和力。抗体2对于α-突触核蛋白片段1-120具有与抗体1类似的亲和力，但对于α-突触核蛋白片段120-140具有更弱的亲和力。对于两个α-突触核蛋白片段，结果显示C.A.1缺乏定义明确的上和下渐近线。抗体1、抗体2和C.A.1以类似亲和力结合α-突触核蛋白单体(1-140)。这些数据表明抗体1和抗体2可结合经切割的和全长的alpha-突触核蛋白两者。
alpha-突触核蛋白片段分析
为测定抗体1结合是否受已报告在帕金森氏病中上调(Duffy等人,(2007)Am.J.Pathol.170(5):1725-1738和Wang等人,(2016)Proc.Nat.Acad.Sci.113(34):9587-9592)的α-突触核蛋白的钙蛋白酶I和胱天蛋白酶切割(分别为残基122/123和121/122)影响，使用上文针对全长单体人alpha-突触核蛋白先前所描述的相同Kinexa方法和程序评估抗体1与单体人α-突触核蛋白的进行性C端截短的结合。所测试的alpha-突触核蛋白片段为SEQ ID NO:13的氨基酸1-140、1-121和1-115。
随后程序基本上如上文所述，获得以下数据。
表7.抗体1和C.A.1对单体人alpha-突触核蛋白的进行性c端截短的结合亲和力， 如在37℃下通过Kinexa所测定的。
Figure BDA0003065810370000201
这些数据表明抗体1与α-突触核蛋白的结合不受已在帕金森氏病患者中观察到的人α-突触核蛋白的钙蛋白酶和胱天蛋白酶切割的物质影响，而C.A.1不能与这些片段化的物质接合。
实施例：体内功效
为评估本发明的抗体在体内的药理学功效，在接种的A53T小鼠模型中进行中和及外周长期研究两者。
对于中和研究，使重组α-突触核蛋白原纤维与本发明的抗体或C.A.1以接近的摩尔当量(抗体略微摩尔过量)预混合，允许离体复合30分钟，然后将混合物注射至小鼠中。在输注后90天对动物实施安乐死。
外周长期研究检查抗体在经由腹膜内注射长期给药时的功效。简言之，将重组α-突触核蛋白原纤维输注至脑中并在原纤维输注后16小时注射本发明的抗体或C.A.1。每两周施用抗体，持续共120天。
在两个研究中，以生物化学的方式并通过免疫组织化学通过量化α-突触核蛋白病理学的发展中的变化来评估抗体的药理学功效。生物化学监测来自SDS不可溶级分的从组织提取的寡聚α-突触核蛋白以及修饰的phospho129(P129；在丝氨酸129处磷酸化的α-突触核蛋白)，其为路易体形成的公认的标志物。免疫组织化学研究评估这些小鼠中的P129染色负荷。还收集研究结束时血清和CSF中的药物浓度的PK参数，以理解稳定状态水平的化合物。
用本发明的抗体处理可导致寡聚alpha-突触核蛋白减少和P129染色减少。
序列
抗体1和抗体2HCDR1(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0003065810370000211
抗体1和抗体2HCDR2(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0003065810370000212
其中位置16处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。
抗体1和抗体2HCDR3(SEQ ID NO:3)
Figure BDA0003065810370000213
抗体1和抗体2LCDR1(SEQ ID NO:4)
Figure BDA0003065810370000214
其中位置5处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸。
抗体1和抗体2LCDR2(SEQ ID NO:5)
Figure BDA0003065810370000215
其中位置5处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。
抗体1和抗体2LCDR3(SEQ ID NO:6)
Figure BDA0003065810370000216
抗体1和抗体2HCVR(SEQ ID NO:7)
Figure BDA0003065810370000217
其中位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸，且其中位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。
抗体1和抗体2LCVR(SEQ ID NO:8)
Figure BDA0003065810370000218
其中位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸，且其中位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。
抗体1和抗体2HC(SEQ ID NO:9)
Figure BDA0003065810370000221
其中位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸，其中位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺，且其中位置441处的Xaa为甘氨酸或不存在。
抗体1和抗体2LC(SEQ ID NO:10)
Figure BDA0003065810370000222
其中位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸，且其中位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。
DNA编码抗体1HC(SEQ ID NO:11)
Figure BDA0003065810370000223
Figure BDA0003065810370000231
DNA编码抗体1LC(SEQ ID NO:12)
Figure BDA0003065810370000232
人alpha-突触核蛋白(SEQ ID NO:13)
Figure BDA0003065810370000233
序列表
<110> 礼来公司
<120> 抗alpha-突触核蛋白抗体及其用途
<130> X22009
<150> US 62/779505
<151> 2018-12-14
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> 位置16处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。
<400> 2
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Ala Arg Gly Tyr Gly Met Asp Val
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸。
<400> 4
Arg Ser Ser Gln Xaa Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Met
1 5 10 15
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。
<400> 5
Tyr Lys Val Ser Xaa Arg Asn Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Met Gln Gly Thr Lys Gln Tyr Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> 位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。
<400> 7
Xaa Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> 位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Xaa Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Met Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Xaa Arg Asn Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr Lys Gln Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> 位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (441)..(441)
<223> 位置441处的Xaa为甘氨酸或不存在。
<400> 9
Xaa Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Xaa Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Xaa
435 440
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> 位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Xaa Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Met Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Xaa Arg Asn Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr Lys Gln Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 1323
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggcga cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaggggctac 300
ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360
ccatcggtct tcccgctagc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta 600
gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccccca 660
tgcccaccct gcccagcacc tgaggccgcc gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 720
aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 780
gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 840
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960
aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 1020
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1080
acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga aagcaatggg 1140
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200
ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 1260
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 1320
ggt 1323
<210> 12
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgatgtgg 120
tttcagcaga ggccaggtca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccggaac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac aaagcagtac 300
cccacttttg gccaagggac caagctggag atcaaacgga ccgtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgc 657
<210> 13
<211> 140
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140

Claims (32)

1.抗alpha-突触核蛋白抗体，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中所述HC包含重链可变区(HCVR)且所述LC包含轻链可变区(LCVR)，并且其中所述HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出，所述HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2给出(AISGSGGDTYYADSVXG；其中位置16处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺)，所述HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3给出，所述LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出(RSSQXLVHSDGNTYLM；其中位置5处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸)，所述LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5给出(YKVSXRNS；其中位置5处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸)，且所述LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6给出。
2.权利要求1的抗体，其中SEQ ID NO:2的位置16处的Xaa为赖氨酸，SEQ ID NO:4的位置5处的Xaa为丝氨酸，且SEQ ID NO:5的位置5处的Xaa为天冬酰胺。
3.权利要求1的抗体，其中SEQ ID NO:2的位置16处的Xaa为谷氨酰胺，SEQ ID NO:4的位置5处的Xaa为天冬氨酸，且SEQ ID NO:5的位置5处的Xaa为天冬氨酸。
4.权利要求1的抗体，其中所述HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:7给出(XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSS；其中位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸，且其中位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺)，且所述LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:8给出(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRPGQSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTKQYPTFGQGTKLEIK；其中位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸，且其中位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸)。
5.权利要求4的抗体，其中SEQ ID NO:7的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:7的位置65处的Xaa为赖氨酸，SEQ ID NO:8的位置28处的Xaa为丝氨酸且SEQ ID NO:8的位置58处的Xaa为天冬酰胺。
6.权利要求4的抗体，其中SEQ ID NO:7的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:7的位置65处的Xaa为谷氨酰胺，SEQ ID NO:8的位置28处的Xaa为天冬氨酸，且SEQ ID NO:8的位置58处的Xaa为天冬氨酸。
7.权利要求1或4的抗体，其中所述HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出且所述LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出；并且其中：
a.由SEQ ID NO:9给出的氨基酸序列为XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLX；且其中位置1处的Xaa为谷氨酸或焦谷氨酸，其中位置65处的Xaa为赖氨酸或谷氨酰胺，并且其中位置441处的Xaa为甘氨酸或不存在；且
b.由SEQ ID NO:10给出的氨基酸序列为DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRPGQSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTKQYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；且其中位置28处的Xaa为丝氨酸或天冬氨酸，且其中位置58处的Xaa为天冬酰胺或天冬氨酸。
8.权利要求7的抗体，其中SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:9的位置65处的Xaa为赖氨酸，SEQ ID NO:9的位置441处的Xaa为甘氨酸，SEQ ID NO:10的位置28处的Xaa为丝氨酸，且SEQ ID NO:10的位置58处的Xaa为天冬酰胺。
9.权利要求7的抗体，其中SEQ ID NO:9的位置1处的Xaa为谷氨酸，SEQ ID NO:9的位置65处的Xaa为谷氨酰胺，SEQ ID NO:9的位置441处的Xaa为甘氨酸，SEQ ID NO:10的位置28处的Xaa为天冬氨酸，且SEQ ID NO:10的位置58处的Xaa为天冬氨酸。
10.alpha-突触核蛋白抗体，其在以下残基处结合人类alpha-突触核蛋白：SEQ ID NO:13的位置115处的天冬氨酸、位置116处的甲硫氨酸、位置119处的天冬氨酸、位置126处的谷氨酸和位置128处的脯氨酸。
11.权利要求1至10中任一项的抗体，其中所述抗体结合包含SEQ ID NO:13的残基1-120的alpha-突触核蛋白片段。
12.权利要求1至11中任一项的抗体，其中所述抗体结合包含SEQ ID NO:13的残基120-140的alpha-突触核蛋白片段。
13.药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.治疗患有突触核蛋白病的患者的方法，其包括对所述患者施用有效量的权利要求1至12中任一项的抗体。
15.权利要求14的方法，其中所述突触核蛋白病为PD、MSA或AD。
16.权利要求14的方法，其中所述突触核蛋白病为DLB。
17.权利要求14或15的方法，其中所述突触核蛋白病为PD。
18.权利要求1-12中任一项的抗体，其用于疗法。
19.权利要求1-12中任一项的抗体，其用于治疗突触核蛋白病。
20.根据权利要求19使用的抗体，其中所述突触核蛋白病为PD、MSA或AD。
21.权利要求1至12中任一项的抗体在制备用于治疗突触核蛋白病的药物中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述突触核蛋白病为PD、MSA或AD。
23.DNA分子，其包含编码抗体HC的多核苷酸，所述抗体HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出。
24.DNA分子，其包含编码抗体LC的多核苷酸，所述抗体LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出。
25.权利要求23的DNA分子，其中编码所述HC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:11给出。
26.权利要求24的DNA分子，其中编码所述LC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:12给出。
27.DNA分子，其包含编码HC的多核苷酸，所述HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且包含编码LC的多核苷酸，所述LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出。
28.权利要求27的DNA分子，其中编码所述HC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:11给出，且编码所述LC的多核苷酸的序列由SEQ ID NO:12给出。
29.用权利要求23的DNA分子和权利要求24的DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述转化的哺乳动物细胞能够表达包含两条HC和两条LC的抗体，其中每条HC的氨基酸序列由SEQ IDNO:9给出，且每条LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出。
30.用权利要求27的DNA分子转化的哺乳动物细胞，所述转化的哺乳动物细胞能够表达包含两条HC和两条LC的抗体，其中每条HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且每条LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出。
31.用于产生抗体的方法，所述抗体包含两条HC和两条LC，其中每条HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:9给出，且每条LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:10给出，并且所述方法包括：
a.在使得所述抗体得以表达的条件下培养权利要求29的哺乳动物细胞或权利要求30的哺乳动物细胞，以及
b.回收表达的抗体。
32.抗体，其可通过权利要求31的方法获得。
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