BR112021010990A2

BR112021010990A2 - Anticorpos anti-alfa-sinucleína e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021010990A2
Application number: BR112021010990-0A
Authority: BR
Inventors: Johnny Eugene Croy; Mansuo Lu Hayashi; Jirong Lu; Bo Ma; Ying Tang
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2021-08-31
Also published as: JP7254931B2; AU2019395325A1; MA54455A; TW202039560A; AU2019395325B2; JP2022513481A; KR20210091256A; MX2021006865A; IL283926A; CN113015557A; CA3122690A1; WO2020123330A3; CN113015557B; US20220048982A1; TWI734279B; AU2023204008A1; EP3894001A2; WO2020123330A2

Abstract

anticorpos anti-alfa-sinucleína e usos dos mesmos. a presente invenção refere-se a anticorpos anti-alfa-sinucleína e seus usos para o tratamento de doenças como o mal de parkinson.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-ALFA-SINUCLEÍNA E USOS DOS MESMOS".

[001] A presente invenção está no campo da medicina. Mais par- ticularmente, a presente invenção se refere a anticorpos que se ligam a alfa-sinucleína, composições que compreendem tais anticorpos alfa- sinucleína e métodos de uso de tais anticorpos alfa-sinucleína para o tratamento de sinucleinopatias, como mal de Parkinson, atrofia de múl- tiplos sistemas e mal de Alzheimer.

[002] A alfa-sinucleína (aqui também chamada de α-sinucleína) é uma proteína neuronal pré-sináptica de 140 aminoácidos que é ex- pressa abundantemente no sistema nervoso e, em condições fisiológi- cas, localiza-se preferencialmente nos terminais pré-sinápticos. A alfa- sinucleína tem sido associada à patogênese de várias doenças neuro- degenerativas chamadas "sinucleinopatias". Essas doenças comparti- lham marcas patológicas de inclusões intracelulares compostas de α- sinucleína agregada, seja em neurônios (por exemplo, mal de Parkin- son (PD), demência com corpos de Lewy (DLB)) ou na glia (por exem- plo, atrofia de múltiplos sistemas (MSA)). No PD, essas inclusões de α-sinucleína são observadas tanto no corpo celular (a saber, "corpos de Lewy") quanto em processos neuronais (a saber, "neurites de Lewy"). No mal de Alzheimer, cerca de metade dos pacientes tem co- patologia de α-sinucleína com amiloide e tau.

[003] Além desta ligação patológica, mutações no gene que codi- fica a α-sinucleína (SNCA) foram encontradas na PD familiar, o que geralmente faz a α-sinucleína ter uma maior propensão para agrega- ção. Além disso, duplicações e triplicações de SNCA foram associadas ao PD familiar, sugerindo que a superexpressão de α-sinucleína pode levar a déficits neurodegenerativos.

[004] A propagação temporal e regional da α-sinucleína foi corre- lacionada com a progressão dos sintomas da doença em relação ao

PD. Além disso, fragmentos proteolíticos N-terminal e C-terminal de α- sinucleína que são gerados pela clivagem da calpaína e/ou caspase foram relatados como sendo regulados positivamente em extratos de corpo de Lewy de pacientes com PD e DLB. Além disso, estudos in vitro mostraram que o truncamento progressivo da extremidade C- terminal da α-sinucleína confere uma capacidade intrínseca superior para formar agregados patogênicos fibrilados (ver, por exemplo, Wang et al, (2016) Proc. Nat. Acad. Sci. 113 (34): 9.587 a 9.592). Tomadas em conjunto, essas observações sugerem que a α-sinucleína fragmen- tada tem o potencial de contribuir para o aumento das taxas de pro- gressão da doença e prognóstico ruim do paciente. Portanto, um anti- corpo que se liga a α-sinucleína pode ter eficácia terapêutica no trata- mento de sinucleinopatias.

[005] Os anticorpos alfa-sinucleína são conhecidos na técnica. Por exemplo, a patente dos Estados Unidos número 8.609.820 divulga o anticorpo anti-α-sinucleína 9E4 humanizado e métodos de tratamen- to ou efetivação da profilaxia de sinucleopatias ou doença de corpos de Lewy em pacientes que sofrem ou estão em risco de tais doenças. No entanto, as estratégias atuais associadas à imunoterapia com α- sinucleína empregam, principalmente, anticorpos que alvejam epíto- pos, de modo que não se espera que os anticorpos se liguem e/ou re- conheçam espécies fragmentadas de calpaína e/ou caspase, prova- velmente proporcionando eficácia subótima.

[006] Consequentemente, existe uma grande necessidade na técnica de anticorpos anti-alfa-sinucleína que se liguem a espécies ge- radas por calpaína e/ou caspase de α-sinucleína humana. O epítopo único de alfa-sinucleína, reconhecido pelos anticorpos da presente in- venção, permite que os anticorpos se liguem a espécies agregadas de α-sinucleína tanto de comprimento total quanto fragmentadas, e pro- vavelmente confere um maior grau de controle da doença em sinu-

cleinopatias, como PD e DLB.

[007] Além disso, os anticorpos da presente invenção são anti- corpos de alta afinidade que têm propriedades aceitáveis, como PK e imunogenicidade in vivo, e potencial eletrostático de superfície de equilíbrio, aumentam a estabilidade térmica, diminuem o pI e/ou redu- zem a ligação a proteínas não antigênicas.

[008] Por conseguinte, a presente invenção fornece um anticorpo anti-alfa-sinucleína que compreende uma cadeia pesada (HC) e uma cadeia leve (LC), em que a HC compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e a LC compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR), e em que a HCVR compreende uma HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e a LCVR compreende uma LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a sequência de aminoácidos da HCDR1 é dada pela SEQ ID NO: 1 (AASGFTFSSYAMS), a sequência de aminoácidos da HCDR2 é dada pela SEQ ID NO: 2 (AISGSGGDTYYADSVXG; em que Xaa na posição 16 é lisina ou glutamina), a sequência de aminoácidos da HCDR3 é dada pela SEQ ID NO: 3 (ARGYGMDV), a sequência de aminoácidos da LCDR1 é fornecido pela SEQ ID NO: 4 RSSQXLVHS- DGNTYLM; em que Xaa na posição 5 é serina ou ácido aspártico), a sequência de aminoácidos da LCDR2 é dada pela SEQ ID NO: 5 (YKVSXRNS; em que Xaa na posição 5 é asparagina ou ácido aspárti- co) e a sequência de aminoácidos da LCDR3 é dada pela SEQ ID NO: 6 (MQGTKQYPT). Em uma modalidade, Xaa na posição 16 da SEQ ID NO: 2 é lisina ou glutamina. Em uma modalidade, Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 4 é serina ou ácido aspártico. Em uma modalidade, Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 5 é asparagina ou ácido aspártico. Em uma modalidade particular, Xaa na posição 16 da SEQ ID NO: 2 é lisi- na, Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 4 é serina e Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 5 é asparagina. Em outra modalidade particular, Xaa na posição 16 da SEQ ID NO: 2 é glutamina, Xaa na posição 5 da SEQ ID

NO: 4 é ácido aspártico e Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 5 é ácido aspártico.

[009] A presente invenção também fornece um anticorpo anti- alfa-sinucleína que compreende uma HC e uma LC, em que a HC compreende uma HCVR e a LC compreende uma LCVR, e em que a sequência de aminoácidos da HCVR é dada pela SEQ ID NO: 7 (XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL

EWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSS; em que Xaa na posição 1 é ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico, e em que Xaa na posição 65 é lisina ou glutamina), e em que a sequên- cia de aminoácidos da LCVR é dada pela SEQ ID NO: 8 (DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRP

GQSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQGTKQYPTFGQGTKLEIK; em que Xaa na posição 28 é serina ou ácido aspártico, e em que Xaa na posição 58 é asparagina ou ácido aspártico). Em uma modalidade, Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 7 é ácido glutâmico ou ácido piro- glutâmico. Em uma modalidade, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 7 é lisina ou glutamina. Em uma modalidade, Xaa na posição 28 da SEQ ID NO: 8 é serina ou ácido aspártico. Em uma modalidade, Xaa na po- sição 58 da SEQ ID NO: 8 é asparagina ou ácido aspártico. Em uma modalidade particular, Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 7 é ácido glu- tâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 7 é lisina, Xaa na posição 28 da SEQ ID NO: 8 é serina e Xaa na posição 58 da SEQ ID NO: 8 é asparagina. Em outra modalidade particular, Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 7 é ácido glutâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 7 é glu- tamina, Xaa na posição 28 da SEQ ID NO: 8 é ácido aspártico e Xaa na posição 58 da SEQ ID NO: 8 é ácido aspártico.

[0010] A presente invenção também proporciona um anticorpo an-

ti-alfa-sinucleína que compreende uma HC e uma LC, em que a se- quência de aminoácidos da HC é dada pela SEQ ID NO: 9 (XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL

EWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLX; em que Xaa na posição 1 é ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico, em que Xaa na posição 65 é lisina ou glutamina, e em que Xaa na po- sição 441 é glicina ou ausente), e a sequência de aminoácidos da LC é dada pela SEQ ID NO: 10 (DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRP

GQSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQGTKQYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC

LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; em que Xaa na posição 28 é serina ou ácido aspártico e em que Xaa na posição 58 é asparagina ou ácido aspártico). Em uma modalidade, Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 9 é ácido glutâmico ou ácido piro- glutâmico. Em uma modalidade, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 9 é lisina ou glutamina. Em uma modalidade, Xaa na posição 441 da SEQ ID NO: 9 é glicina ou ausente. Em uma modalidade, Xaa na posi- ção 28 da SEQ ID NO: 10 é serina ou ácido aspártico, e Xaa na posi- ção 58 da SEQ ID NO: 10 é asparagina ou ácido aspártico. Em uma modalidade particular, Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 9 é ácido glu-

tâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 9 é lisina, Xaa na posição 441 da SEQ ID NO: 9 é glicina, Xaa na posição 28 de SEQ ID NO: 10 é serina e Xaa na posição 58 da SEQ ID NO: 10 é asparagina. Em ou- tra modalidade particular, Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 9 é ácido glutâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 9 é glutamina, Xaa na posição 441 da SEQ ID NO: 9 é glicina, Xaa na posição 28 de SEQ ID NO: 10 é ácido aspártico e Xaa na posição 58 da SEQ ID NO: 10 é ácido aspártico.

[0011] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente invenção e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente acei- táveis.

[0012] A presente invenção fornece um método de tratamento de um paciente com sinocleinopatia, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente in- venção. Em uma modalidade, a sinocleinopatia é PD, MSA ou AD. Em uma modalidade particular, a sinocleinopatia é DLB. Em outra modali- dade particular, a sinocleinopatia é PD.

[0013] A presente invenção também fornece um anticorpo da pre- sente invenção para uso em terapia. Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é para uso no tratamento de uma sinocleinopa- tia. Em uma modalidade, a sinocleinopatia é PD, MSA ou AD. Em uma modalidade particular, a sinocleinopatia é DLB. Em outra modalidade particular, a sinocleinopatia é PD.

[0014] A presente invenção fornece o uso de um anticorpo da pre- sente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma sinocleinopatia. Em uma modalidade, a sinocleinopatia é mal de Parkinson (PD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA), mal de Al- zheimer (AD) ou demência com corpo de Lewy (DLB).

[0015] A presente invenção também fornece uma molécula de

DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo HC, cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, a molécula de DNA tem a sequência polinucleotídica da- da pela SEQ ID NO: 11.

[0016] A presente invenção também fornece uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo LC, cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a molécula de DNA tem a sequência polinucleotídica da- da pela SEQ ID NO: 12.

[0017] A presente invenção fornece uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica a HC cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 9, e compreende um polinucleo- tídeo que codifica a LC cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a sequência do polinucleotídeo que codifica a HC é dada pela SEQ ID NO: 11, e a sequência do poli- nucleotídeo que codifica a LC é dada pela SEQ ID NO: 12.

[0018] A presente invenção também fornece uma célula de mamí- fero transformada com uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo HC cuja sequência de amino- ácidos é dada pela SEQ ID NO: 9 e uma molécula de DNA que com- preende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo LC cuja sequên- cia de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 10, tal célula de mamífero transformada é capaz de expressar um anticorpo que compreende du- as HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10.

[0019] A presente invenção também fornece uma célula de mamí- fero transformada com uma molécula de DNA que compreende 1) um polinucleotídeo que codifica a HC, cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 9, e 2) um polinucleotídeo que codifica a LC cuja sequência de aminoácidos é fornecida pela SEQ ID NO: 10, tal célula de mamífero transformada é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de ami- noácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10.

[0020] A presente invenção fornece um processo para a produção de um anticorpo, em que o anticorpo compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10, e cujo processo compreende o cultivo de uma célula de mamífero transformada com uma molécula de DNA que compreen- de um polinucleotídeo que codifica o anticorpo HC cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 9 e uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo LC cuja se- quência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 10, cuja célula de mamífero transformada é capaz de expressar um anticorpo que com- preende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácido de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10, em condições tais que o anti- corpo seja expresso e recupere o anticorpo expresso. Em uma moda- lidade, a presente invenção fornece um anticorpo que pode ser obtido pelo processo de produção de um anticorpo.

[0021] A presente invenção fornece um processo para a produção de um anticorpo, cujo anticorpo compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10, e cujo processo compreende o cultivo de uma célula de mamí- fero transformada com uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica a HC, em que tal sequência de aminoáci- dos é dada pela SEQ ID NO: 9 e compreende um polinucleotídeo que codifica o LC cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 10, cuja célula de mamífero transformada é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10, sob condi- ções tais que o anticorpo é expresso e recupera o anticorpo expresso. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo que pode ser obtido pelo processo de produção de um anticorpo.

[0022] A presente invenção também fornece um anticorpo alfa- sinucleína que se liga a alfa-sinucleína humana em um ou mais dos resíduos de ácido aspártico na posição 115, metionina na posição 116, ácido aspártico na posição 119, ácido glutâmico na posição 126 e pro- lina na posição 128 da SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, o anti- corpo se liga a pelo menos dois aminoácidos de resíduos de ácido as- pártico na posição 115, metionina na posição 116, ácido aspártico na posição 119, ácido glutâmico na posição 126 e prolina na posição 128 da SEQ ID NO: 13. Em outra modalidade, o anticorpo se liga a pelo menos três aminoácidos de resíduos de ácido aspártico na posição 115, metionina na posição 116, ácido aspártico na posição 119, ácido glutâmico na posição 126 e prolina na posição 128 da SEQ ID NO: 13. Em outra modalidade, o anticorpo se liga a pelo menos quatro amino- ácidos de resíduos de ácido aspártico na posição 115, metionina na posição 116, ácido aspártico na posição 119, ácido glutâmico na posi- ção 126 e prolina na posição 128 da SEQ ID NO: 13. Em outra moda- lidade, o anticorpo se liga aos resíduos de ácido aspártico na posição 115, metionina na posição 116, ácido aspártico na posição 119, ácido glutâmico na posição 126 e prolina na posição 128 da SEQ ID NO: 13. Em algumas dessas modalidades, a ligação é determinada por varre- dura de alanina. Acredita-se que estes anticorpos podem ser mais efi- cazes na remoção da alfa-sinucleína clivada além da alfa-sinucleína de comprimento completo.

[0023] A presente invenção fornece um anticorpo que inibe a ab- sorção de um fragmento de alfa-sinucleína compreendendo os resí- duos 1-121 de SEQ ID NO: 13. A presente invenção também fornece um anticorpo que inibe a absorção de um fragmento de alfa-sinucleína que compreende os resíduos 120-140 da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o anticorpo inibe a absorção de fragmentos 1-121 e 120-

140. A presente invenção também fornece um anticorpo que se liga a um fragmento de alfa-sinucleína que compreende os resíduos 1-120 de SEQ ID NO: 13. A presente invenção também fornece um anticorpo que se liga a um fragmento de alfa-sinucleína que compreende os re- síduos 120-140 da SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a fragmentos de alfa-sinucleína 1-120 e 120-140.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] Figura 1a. Inibição da internalização do fragmento de alfa- sinucleína 1-121.

[0025] Figura 1b. Inibição da internalização da alfa-sinucleína.

[0026] Figura 2. Ligação de anticorpo a fragmentos de alfa- sinucleína e alfa-sinucleína de comprimento total.

DEFINIÇÕES

[0027] Tal como aqui utilizado, salvo indicação em contrário, alfa- sinucleína refere-se a uma alfa-sinucleína de tipo selvagem e, de pre- ferência, a uma alfa-sinucleína humana de tipo selvagem que tem a sequência de aminoácidos dada pela SEQ ID NO: 13. Um "anticorpo anti-alfa-sinucleína" ou "anticorpo alfa-sinucleína" refere-se a um anti- corpo que se liga, preferencialmente, a formas dimerizadas de alfa- sinucleína e, quando administrado in vitro ou in vivo, resulta em uma resposta alcançada, tal como pelo menos um atividade desejada signi- ficativamente diminuída, como agregação de alfa-sinucleína e preven- ção da absorção de agregado de alfa-sinucleína nas células.

[0028] O termo "agregado" ou "agregação", tal como aqui utilizado, refere-se a conjuntos compostos por mais de um monômero de alfa- sinucleína.

[0029] "Semeadura" refere-se à indução de agregação intracelular. Especificamente, a semeadura refere-se à absorção de alfa-sinucleína extracelular nas células e à indução de poças monoméricas de alfa- sinucleína para formar agregados.

[0030] O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, refere-se a um complexo polipeptídico geneticamente modificado de ocorrência não natural com duas cadeias pesadas (HC) e duas cadeias leves (LC), de modo que as cadeias pesadas e as cadeias leves sejam interconecta- das por ligações dissulfeto, em que o anticorpo é um anticorpo de isó- tipo de IgG. Cada cadeia pesada é composta por uma HCVR N- terminal e uma região constante da cadeia pesada. Cada cadeia leve é composta por uma LCVR N-terminal e uma região constante da cadeia leve. Quando expressos em certos sistemas biológicos, os anticorpos são glicosilados na região Fc. Normalmente, a glicosilação ocorre na região Fc do anticorpo em um sítio de N-glicosilação altamente con- servado. N-glicanos normalmente se ligam à asparagina. Os anticor- pos também podem ser glicosilados em outras posições.

[0031] Os anticorpos da presente invenção não têm função efeto- ra. De preferência, os anticorpos da presente invenção são anticorpos IgG4PAA. Um anticorpo IgG4PAA é um anticorpo IgG4 com uma subs- tituição de serina por prolina e duas substituições de leucina por alani- na nas posições (de acordo com a numeração da UE) 228, 234, 235, respectivamente (S228P, F234A, L235A). A mutação S228P elimina a formação de semianticorpo. As duas mutações de alanina são conhe- cidas por interromper as interações hidrofóbicas com FcRs para eli- minar a função efetora residual.

[0032] A região constante das cadeias pesadas contém os domí-

nios CH1, CH2 e CH3. CH1 vem depois da HCVR; a CH1 e a HCVR formam a porção da cadeia pesada de um fragmento de ligação ao antígeno (Fab), que é a parte de um anticorpo que se liga ao(s) antí- geno(s). CH2 vem depois da região de dobradiça e antes de CH3. CH3 vem depois de CH2 e está na extremidade do terminal carboxi da cadeia pesada. A região constante das cadeias leves contém um do- mínio, CL. CL vem depois da LCVR; CL e LCVR formam a porção da cadeia leve de um Fab.

[0033] As regiões HCVR e LCVR de um anticorpo da presente in- venção podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, de- nominadas regiões determinantes de complementaridade ("CDRs"), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais ("FR"). Cada HCVR e LCVR é composta por três CDRs e quatro FRs, ordenadas a partir do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Aqui, as três CDRs da cadeia pesada são chamadas de "HCDR1, HCDR2 e HCDR3" e as três CDRs da cadeia leve são cha- madas de "LCDR1, LCDR2 e LCDR3". As CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno. A defini- ção de Kabat para CDR (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190: 382 a 393 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, quinta edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, publicação NIH nº 91-3242 (1991)) baseia-se na vari- abilidade da sequência do anticorpo. A definição de Chothia para CDR (Chothia et al., "Canonical structure for the hypervariable region of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901 a 917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structure of immunoglobulins ", Journal of Molecular Biology, 273, 927 a 948 (1997)) é baseada em estruturas tridimensionais de anticorpos e topologias dos laços de CDR. As definições de Chothia para CDR são idênticas às definições de Kabat para CDR, com exceção de HCDR1 e HCDR2. A definição de North para CDR (North et al., "A New Cluste- ring of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Bio- logy, 406, 228 a 256 (2011)) é baseada no agrupamento da propaga- ção de afinidade com um grande número de estruturas cristalinas. Pa- ra os fins da presente invenção, a atribuição de aminoácidos a domí- nios CDR nas regiões LCVR e HCVR dos anticorpos da presente in- venção é baseada na bem conhecida convenção de numeração de Kabat e convenção de numeração de North. No caso das CDRs de cadeia leve dos anticorpos da presente invenção, são utilizadas as de- finições de North para CDR. Na cadeia pesada, HCDR1 e HCDR3 também usam a definição de North. A HCDR2 usa um híbrido de defi- nições de North e Kabat. A definição de North é usada para identificar o sítio N-terminal inicial, enquanto Kabat é usado para definir a última posição.

[0034] A presente invenção contempla que os anticorpos da pre- sente invenção sejam anticorpos humanizados ou humanos. No con- texto de anticorpos monoclonais, os termos "humano" e "humanizado" são bem conhecidos pelos versados na técnica (Weiner LJ, J. Immu- nother. 2006; 29: 1 a 9; Mallbris L, et al., J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2016; 9: 13 a 15).

[0035] Uma molécula de DNA da presente invenção é uma molé- cula de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica de ocor- rência não natural que codifica um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de pelo menos um dos polipeptídeos em um anticorpo da presente invenção (por exemplo, cadeia pesada, cadeia leve, cadeia pesada variável e cadeia leve variável).

[0036] Um DNA isolado que codifica uma região HCVR pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligan- do operacionalmente o DNA que codifica HCVR a outra molécula de

DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada. As sequên- cias de genes de região constante da cadeia pesada de humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Fragmen- tos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos, por exemplo, por amplificação de PCR padrão.

[0037] Um DNA isolado que codifica uma região LCVR pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total, ligando operacionalmente o DNA que codifica LCVR a outra molécula de DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. As sequências de genes de região constante da cadeia leve de humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda. De preferência, para os anticorpos da presente invenção, a região constante da cadeia leve é uma região constante kappa.

[0038] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser ex- pressos em uma célula hospedeira após as sequências terem sido operativamente ligadas a uma sequência de controle de expressão. Os vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integrante do DNA cro- mossômico do hospedeiro. Comumente, os vetores de expressão con- terão marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina, neomicina e di-hidrofolato redutase, para permitir a detecção das células transfor- madas com as sequências de DNA desejadas.

[0039] Os anticorpos da presente invenção podem ser facilmente produzidos em células de mamífero, exemplos não limitativos das quais incluem células CHO, NS0, HEK293 ou COS. As células hospe- deiras são cultivadas usando-se métodos bem conhecidos na técnica.

[0040] Os vetores que contêm as sequências polinucleotídicas de interesse (por exemplo, os polinucleotídeos que codificam os polipep- tídeos do anticorpo e as sequências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem conheci- dos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular.

[0041] Vários métodos de purificação de proteínas podem ser em- pregados para se purificar proteínas, incluindo, mas não se limitando a, anticorpos e tais métodos são conhecidos na técnica.

[0042] Um anticorpo da presente invenção, ou uma composição farmacêutica que compreende o mesmo, pode ser administrado por vias parentéricas, exemplos não limitantes das quais são a administra- ção subcutânea e a administração intravenosa. Um anticorpo da pre- sente invenção pode ser administrado a um paciente com veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis em doses úni- cas ou múltiplas. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas por métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22ª ed. (2012), A. Loyd et al., Pharmaceutical Press) e compreendem um anti- corpo, como aqui divulgado, e um ou mais veículos, diluentes ou exci- pientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0043] O termo "tratar" (ou "tratando" ou "tratamento") refere-se a retardar, interromper, cessar, aliviar, parar, reduzir ou reverter a pro- gressão ou gravidade de um sintoma, distúrbio, condição ou doença existente.

[0044] "Quantidade eficaz" significa a quantidade de um anticorpo anti-alfa-sinucleína da presente invenção ou composição farmacêutica que compreende um tal anticorpo que desencadeará a resposta bioló- gica ou médica ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que está sendo procurado pelo pesqui- sador, médico ou outro clínico. Uma quantidade eficaz do anticorpo pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade,

sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Esse benefício inclui, mas não está limitado a propagação reduzida de corpos de Lewy patológicos, função motora melhorada e/ou melhorias na cognição. Uma quantida- de eficaz pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica, pelo uso de técnicas conhecidas e pela observação dos resul- tados obtidos em circunstâncias análogas. Ao se determinar a quanti- dade eficaz para um paciente, uma série de fatores são considerados pelo diagnosticador assistente, incluindo, mas não se limitando a: o tamanho, idade e saúde geral do paciente; a doença ou distúrbio es- pecífico envolvido; o grau ou envolvimento ou a gravidade da doença ou distúrbio; a resposta de cada paciente; o composto particular admi- nistrado; o modo de administração; as características de biodisponibi- lidade da preparação administrada; o regime de dosagem selecionado; o uso de medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes.

[0045] Tal como aqui utilizado, o termo "sinucleinopatia" refere-se a uma doença neurodegenerativa ou família de doença neurodegene- rativa caracterizada pelo acúmulo anormal de agregados da proteína α-sinucleína em neurônios. Condições exemplificativas incluem mal de Alzheimer (DA), mal de Parkinson (PD), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de múltiplos sistemas (MSA).

EXEMPLOS EXEMPLO: EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO

[0046] Os anticorpos anti-alfa-sinucleína da presente invenção po- dem ser expressos e purificados essencialmente como se segue. Uma célula hospedeira apropriada, tal como HEK 293 ou CHO, pode ser transitoriamente ou estavelmente transfectada com um sistema de ex- pressão para secretar anticorpos usando uma razão de vetor HC:LC predeterminada ideal (tal como 1:3 ou 1:2) ou um único sistema de ve- tor que codifica tanto a HC e quanto a LC. Os meios clarificados, nos quais o anticorpo foi secretado, podem ser purificados usando-se qualquer uma das muitas técnicas comumente usadas. Por exemplo, o meio pode ser aplicado a uma coluna MabSelect® (GE Healthcare) ou coluna KappaSelect (GE Healthcare) para fragmento Fab, que foi equi- librado com um tampão compatível, como solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). A coluna pode ser lavada para se remover com- ponentes de ligação não específicos.

[0047] O anticorpo ligado pode ser eluído, por exemplo, por gradi- ente de pH (tal como tampão Tris a 20 mM, pH 7,0 de tampão de citra- to de sódio a 10 mM, pH 3,0 ou solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4 para tampão de glicina a 100 mM, pH 3,0). As frações de an- ticorpo podem ser detectadas, como por SDS-PAGE, e então, podem ser juntadas. A purificação adicional é opcional, dependendo do uso pretendido. O anticorpo pode ser concentrado e/ou esterilizado por fil- tração usando-se técnicas comuns. O agregado solúvel e os multíme- ros podem ser efetivamente removidos por técnicas comuns, incluindo exclusão de tamanho, interação hidrofóbica, troca iônica, cromatogra- fia multimodal ou de hidroxiapatita. A pureza do anticorpo após estas etapas de cromatografia está entre cerca de 95% e cerca de 99%.

[0048] Espera-se que uma baixa porcentagem (cerca de 1%) do ácido glutâmico no N-terminal da cadeia pesada do anticorpo possa ser convertida em ácido piroglutâmico. Além disso, uma baixa porcen- tagem (cerca de menos de 1%) da glicina no C-terminal da cadeia pe- sada do anticorpo pode ser truncada (cortada) pós-tradução.

[0049] O produto pode ser mantido refrigerado, imediatamente congelado a -70ºC ou pode ser liofilizado. As SEQ ID NOs de aminoá- cidos para anticorpos humanos exemplificados da presente invenção são mostrados abaixo, na Tabela 1.

TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DO ANTICORPO 1 E DO ANTICORPO 2. SEQ ID NOs de anticorpo Anticorpo HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Anticorpo SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID 1 NO: 1 NO: 2 NO: 3 4 5 NO: 6

Xaa na Xaa na posi- Xaa na posi- posição 16 ção 5 é seri- ção 5 é aspa- é lisina na ragina Anticorpo SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID 2 NO: 1 NO: 2 NO: 3 4 5 NO: 6

Xaa na Xaa na posi- Xaa na posi- posição 16 ção 5 é ácido ção 5 é ácido é glutamina aspártico aspártico

SEQ ID Nos de anticorpo Anticorpo HCVR* LCVR HC** LC Anticorpo SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 1 10 Xaa na posi- Xaa na posi- Xaa na posi- Xaa na posi- ção 65 é lisina ção 28 é seri- ção 65 é lisina ção 28 é seri- na; Xaa na na; Xaa na posição 58 é posição 58 é asparagina asparagina Anticorpo SEQ ID NO: SEQ ID Nº: 8; SEQ ID Nº: 9; SEQ ID Nº: 2 7; Xaa na po- Xaa na posi- Xaa na posi- 10; Xaa na sição 65 é ção 28 é áci- ção 65 é glu- posição 28 é glutamina do aspártico; tamina ácido aspárti- Xaa na posi- co; Xaa na ção 58 é áci- posição 58 é do aspártico ácido aspárti- co * Xaa na posição 1 é ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico. ** Xaa na posição 1 é ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico e Xaa na posição 441 é glicina ou ausente.

EXEMPLO: AFINIDADE DE ANTICORPO PARA FIBRILA DE α-

SINUCLEÍNA HUMANA RECOMBINANTE

[0050] Um Ensaio Imunoabsorvente Enzimático (ELISA) é realiza- do para se determinar quantitativamente a afinidade do anticorpo para com a fibrila de α-sinucleína humana recombinante.Fibrilas de α- sinucleína humana são geradas agitando-se monômeros de α- sinucleína recombinantes continuamente por duas semanas antes da sonicação (Polinski et al, J. Parkinson's Disease 8 (2018) 303-322).

[0051] Uma placa de ELISA é revestida com fibrila de α-sinucleína humana recombinante a 1 µg/ml em PBS durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, a placa é incubada com caseína a 1% durante 1 hora à temperatura ambiente para bloquear sítios de ligação não específicos na placa. A placa é então lavada três vezes com PBST a 0,1% e incu- bada com 3x séries de anticorpos diluídos (Anticorpo 1, Anticorpo 2 ou anticorpo comparador 1) durante 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo comparador 1 ("CA 1") é descrito como um anticorpo que tem HCDRs 1-3 (Hu9E4VHv3) e LCDRs 1-3 (Hu9E4VLv3), como mos- trado e descrito na patente dos Estados Unidos nº 8.609.820 (por exemplo, Figura 1 e Figura 2). Após a incubação, a placa é lavada três vezes com PBST a 0,1% para se remover o anticorpo não ligado e in- cubada com um agente de detecção (Kappa-AP de cabra anti-humano diluído 1:1.000) em PBST a 0,1% durante 1 hora à temperatura ambi- ente. A placa é lavada três vezes com PBST a 0,1% para se remover o agente de detecção não ligado e incubada com um substrato durante 15 minutos à temperatura ambiente. O OD é, então, lido em um leitor de placas ELISA a 560 nm. A curva de ligação é obtida com base na concentração de anticorpo e leitura OD560. A afinidade do anticorpo é determinada como a concentração que dá 50% de sinal de ligação máxima (EC50).

[0052] Seguindo-se os procedimentos essencialmente conforme descrito acima, os seguintes dados foram obtidos. TABELA 2. AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS À FIBRILA DE α-SINUCLEÍNA HUMANA CONFORME DETERMINADO POR ELISA. Anticorpo 1 Anticorpo 2 C.A. 1 OD560 de linha de base 0,05464 0,05099 0,05127 OD560 máximo 0,9143 0,8881 0,9715 EC50 (pg/ml) 193,30 160,60 185,60

[0053] Estes dados demonstram que os anticorpos da presente invenção se ligam à fibrila de alfa-sinucleína humana com alta afinida- de. EXEMPLO: LIGAÇÃO DO ANTICORPO 1 E ANTICORPO 2 À ALFA-

SINUCLEÍNA MONOMÉRICA

[0054] Avalia-se as afinidades de ligação do Anticorpo 1 e do Anti- corpo 2 à α-sinucleína humana monomérica (SNCA, UniProtKB P37840; SEQ ID NO: 13). As afinidades de ligação do Anticorpo 1 e do Anticorpo 2 também são determinadas para várias espécies, incluindo alfa-sinucleína de humano, macaco cinomolgo, coelho, rato e camun- dongo.

[0055] A afinidade de ligação monomérica de α-sinucleína é medi- da a 37 °C usando-se um Ensaio de Exclusão Cinética (Kinexa) (Dar- ling, R e Brault, P.A. (2004) Assay Drug Dev. Technol., 2 (6): 647 a 657). O ensaio Kinexa é particularmente relevante fisiologicamente devido à sua capacidade de avaliar a afinidade da α-sinucleína em so- lução, em contraste com a natureza agrupada da α-sinucleína em en- saios ELISA baseados em placas.

[0056] Recipientes separados de concentração de anticorpo fixa a 200 pM são misturados com diluições em série de alfa-sinucleína mo- nomérica variando de 50 µM a 847 pM. Essas amostras são incubadas por 24 a 48 horas a 37 °C para permitir que o equilíbrio em estado es- tacionário seja alcançado. Durante este tempo, os grânulos de sepha-

rose são conjugados com alfa-sinucleína humana monomérica e blo- queados com uma proteína de ligação não específica adequada (tipi- camente BSA ou caseína). Uma vez que o estado estacionário é al- cançado, um pequeno capilar é preenchido com grânulos revestidos e amostras de cada monômero de anticorpo/alfa-sinucleína fixo são inje- tadas sobre a coluna. Durante esta etapa, o anticorpo livre não associ- ado é capturado seletivamente a partir do anticorpo complexado e, subsequentemente, detectado por meio de um anticorpo anti-humano secundário marcado com fluorescência. Essa etapa é repetida para cada concentração de monômero de alfa-sinucleína e sinal fluorescen- te resultante (proporcional à porcentagem de anticorpo livre) e, em se- guida, plotada como uma função de sinal fluorescente versus concen- tração de α-sinucleína monomérica e globalmente ajustada a um mo- delo de ligação 1:1 para se obter KD. Execuções independentes (n = 3) executadas com duplicatas técnicas (intervalos de confiança de 95%) são relatadas.

[0057] Em experimentos conduzidos essencialmente como des- crito acima, os seguintes dados foram obtidos para as seguintes espé- cies de α-sinucleína: humano (acesso uniprot P37840), macaco cino- molgo (acesso uniprot P61142), rato (acesso uniprot P37377), coelho (acesso uniprot G1U0V2) e camundongo (acesso uniprot O55042). TABELA 3: AFINIDADES DE LIGAÇÃO A ALFA-SINUCLEÍNA MO- NOMÉRICA CONFORME MEDIDO POR KINEXA EM 37°C. Anticorpo Espécie de alfa-sinucleína KD (nM) IC de 95% (nM) Humano 19 12,2 a 28,5 Macaco cinomolgo 19,9 13,4 a 25,8 Anticorpo 1 Coelho 553,9 267,6 a 1.080 Rato 89 60,3 a 127,3 Camundongo 49,7 31,6 a 76,1 Humano 65,6 48,1 a 82,1 Anticorpo 2 Macaco cinomolgo 34,3 27,3 a 42,4

Anticorpo Espécie de alfa-sinucleína KD (nM) IC de 95% (nM) Coelho 1.020 677,5 a 1.500 Rato 140,5 109,9 a 176,4 Camundongo 99,3 67,2 a 134,9

[0058] Estes dados demonstram que o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2 se ligam à alfa-sinucleína humana, de macaco cinomolgo, de rato e de camundongo e, em menor extensão, à alfa-sinucleína de coelho. EXEMPLO: LIGAÇÃO DO ANTICORPO 1 E ANTICORPO 2 À ALFA-

SINUCLEÍNA DIMÉRICA

[0059] Avalia-se as afinidades de ligação do Anticorpo 1 e do Anti- corpo 2 a uma apresentação dimérica de avidez substituta de um fra- gmento C-terminal de α-sinucleína humana contendo os resíduos 100- 140 em um Fc de camundongo (mIgG1-hAsyn100-140). Afinidades de ligação são determinadas usando-se um método de captura de placa baseado nos princípios de Kinexa, denominado MSD-SET (Estrep, et al. (2013) MAbs, 5 (2): 270 a 278). Uma apresentação dimérica sintéti- ca da alfa-sinucleína humana que compreende os últimos 40 aminoá- cidos da SEQ ID NO: 13 fundidos na extremidade C-terminal de um fragmento Fc de camundongo, separada por um elemento ligante não estruturado curto é geneticamente modificada (mIgG1-hAsyn100-140). Esta molécula substituta sintética fornece uma apresentação relativa- mente estável e homogênea de um substituto de agregado de α- sinucleína humana de avidez competente para esforços de caracteri- zação bioquímica.

[0060] O anticorpo (100 fM) é misturado com concentrações cres- centes de mIgG1-hAsyn100-140 variando de 3,67 fM a 7,69 nM em uma série de diluição de duas vezes e permitiu atingir o equilíbrio de estado estacionário a 25 °C ou 37 °C. Durante este tempo de incuba- ção, uma placa de setor MSD é revestida com alfa-sinucleína humana monomérica e bloqueada com um reagente de bloqueio (isto é, BSA, caseína). Após os tempos de incubação de equilíbrio de estado esta-

cionário, as misturas de anticorpo individual/mIgG1-hAsyn 100-140 são adicionadas simultaneamente à placa e incubadas por 10 minutos para capturar o anticorpo livre e minimizar a troca com o anticorpo no complexo com mIgG1-hAsyn100-140. Após esta curta incubação, as placas são subsequentemente lavadas e incubadas com um anticorpo secundário anti-humano biotinilado, seguido pela detecção usando-se estreptavidina-S-tag no instrumento MSD. O sinal MSD resultante (proporcional à % de anticorpo livre) é então representado graficamen- te como uma função da concentração de mIgG1-hAsyn100-140 e ajus- tado globalmente a um ajuste de quatro parâmetros para se obter IC50 (KD). Os intervalos de confiança de 95% relatados representam o ajus- te de N = 3 execuções independentes, cada uma com duplicatas técni- cas. O fator de avidez é a diferença raciométrica entre a afinidade do monômero e a afinidade do dímero, e representa a seletividade na li- gação entre α-sinucleína monomérica e dimérica para o anticorpo. Os valores de afinidade são relatados na Tabela 4. TABELA 4: AFINIDADES DE LIGAÇÃO DE ALFA-SINUCLEÍNA HU- MANA DIMÉRICA A 25 °C E 37 °C. 25 °C 37 °C Artigo de Teste KD (pM) IC de 95% KD (pM) IC de 95% (pM) (pM) Anticorpo 1 0,12 0,11 a 0,14 0,97 0,85 a 1,11 Anticorpo 2 3,2 2,4 a 4,2 Não testado Não testado C.A. 1 1,5 1,1 a 2,1 6,5 5,5 a 7,7

[0061] Conforme mostrado na Tabela 4, os dados de 25 °C de- monstraram maior afinidade do Anticorpo 1 em relação ao Anticorpo 2 e C.A. 1 para α-sinucleína dimérica. A 37 °C, a afinidade do Anticorpo 1 é 6,7 vezes maior (em média) em relação ao C.A. 1 para α- sinucleína dimérica. Os dados de 37 °C para o Anticorpo 1 indicam que o fator de avidez (indicador de seletividade) entre a α-sinucleína humana monomérica (KD a 19 nM, ver Tabela 3) e a α-sinucleína hu-

mana dimérica (substituto agregado; KD a 0,97 pM, ver Tabela 4) é de aproximadamente 20.000 vezes. EXEMPLO: QUANTIFICAÇÃO IN VITRO DA ABSORÇÃO DE FIBRILA Α-SINUCLEÍNA HUMANA EM CÉLULAS SH-SY5Y

[0062] Para investigar o mecanismo pelo qual o Anticorpo 1 inibe a formação de agregado de α-sinucleína humana, determina-se a capa- cidade do Anticorpo 1 de bloquear a internalização (absorção) de fibri- las de α-sinucleína.

[0063] Fibrilas de α-sinucleína humana são geradas agitando-se monômeros de α-sinucleína recombinantes (marcados com corante sensível ao pH reativo a amina pHAb (Promega, G9841)) continua- mente por duas semanas antes da sonicação (Polinski et al, J. Parkin- son's Disease 8 (2018) 303 a 322). As fibrilas de α-sinucleína humana marcadas com corante pHAb (2 µg/ml) são adicionadas a anticorpos diluídos em série, variando de 100 µg/ml a 0,097 µg/ml. Essa mistura é então adicionada a uma média de 25.000 células SH-SY5Y/poço e in- cubada durante a noite a 37 °C.

[0064] No dia seguinte, as células são lavadas, incubadas com corante NucBlue Hoechst (Thermo Fisher, R37605) por 20 minutos, lavadas novamente e, em seguida, fotografadas por imageamento de alto conteúdo em um instrumento Cytation 5 (BioTek). O corante pHAb apresenta fluorescência apenas em pH ácido (ou seja, quando o co- rante entra na via endocítica/lisossomal após a internalização). Portan- to, para se calcular a intensidade de internalização por célula, a inten- sidade fluorescente total do corante pHAb é dividida pelo número de núcleos por poço. Pelo menos 20.000 células são contadas por ponto de dados em duplicata. A intensidade da fluorescência celular se cor- relaciona com a internalização de fibrilas de α-sinucleína humana, permitindo uma célula viva e a leitura quantitativa da absorção de α- sinucleína humana marcada com pHAb.

[0065] Seguindo-se os procedimentos essencialmente conforme descrito acima, os seguintes dados foram obtidos. TABELA 5: INIBIÇÃO DA INTERNALIZAÇÃO DE FIBRILAS APÓS TRATAMENTO COM ANTICORPOS. Anticorpo/artigo de IC50 médio (µg/ml) Desvio padrão de IC50 teste (µg/ml) Anticorpo 1 0,45 0,017 Anticorpo 2 0,56 0,026 C.A. 1 0,44 N/D

[0066] Como mostrado na Tabela 5, o Anticorpo 1 inibiu a interna- lização de fibrila de α-sinucleína humana com um IC50 médio de 0,45 µg/ml. O Anticorpo 2 inibiu a internalização da fibrila de α-sinucleína humana com um IC50 médio de 0,56 µg/ml. Em um estudo semelhante, CA 1 teve um IC50 de 0,44 µg/ml e o anticorpo de controle hIgG1 não teve efeito na internalização de fibrila de α-sinucleína humana marca- da com pHAb. Estes dados demonstram que os anticorpos testados são capazes de inibir a absorção de α-sinucleína. EXEMPLO: AVALIAÇÃO IN VITRO DA INIBIÇÃO DO ANTICORPO 1 DA AGREGAÇÃO MEDIADA POR Α-SINUCLEÍNA HUMANA EM CÉ- LULAS SHSY-5Y-A53T-myc

[0067] A53T é uma variante natural da α-sinucleína, encontrada em certos indivíduos com uma forte pré-disposição para PD de início precoce. Vários estudos mostraram que o A53T confere um fenótipo de agregação mais rápido à α-sinucleína humana. A inibição da forma- ção do agregado de α-sinucleína humana é determinada usando-se células humanas que expressam SH-SY5Y-A53T-myc, que são induzi- das por tetraciclina para superexpressar a forma A53T mutante da a- sinucleína humana.

[0068] Para se medir a agregação de α-sinucleína humana, as cé- lulas SH-SY5Y-A53T-myc são semeadas em placas CellBIND pretas (Corning) a 40.000 células por poço em meio de crescimento mais 1 µg/ml de tetraciclina. No dia seguinte, o meio é removido e substituído por meio fresco contendo uma curva de diluição de oito pontos de an- ticorpo anti-α-sinucleína que varia de 60 µg/ml a 0,027 µg/ml com uma concentração fixa de 3 µg/ml de fibrilas pré-formadas de α-sinucleína humana sonicadas (PFFs) e 1 µg/ml de tetraciclina. Tetraciclina sozi- nha e PFF sozinha são incluídas como controles de agregação. Exis- tem três réplicas técnicas para cada concentração na série de dilui- ções.

[0069] As placas são incubadas por cinco dias a 37 °C, 95% de umidade e, em seguida, fixadas com o fixador 1X Prefer (Anatech) por uma hora. As placas são lavadas duas vezes com 1X DPBS e uma vez com solução salina tamponada com Tris + Tween-20 (TBST). As células são bloqueadas em leite integral (Difco) em TBST por uma ho- ra e imunomarcadas com os anticorpos primários anti-pS129 de ca- mundongo a 1 µg/ml e anti-myc de ovelha (Fisher, PA3-981) em dilui- ção de 1:1.000 em leite integral/TBST durante a noite a 4 °C.

[0070] As placas são então lavadas três vezes com TBST e, em seguida, incubadas por > 2 horas à temperatura ambiente com anti- corpos secundários de cabra anti-camundongo AlexaFluor647 (Invitro- gen, A32728) e de burro anti-ovelha AlexaFluor555 (Invitrogen, A21436), cada um diluído 1:1.000 em TBST. As placas são lavadas duas vezes com TBST, depois, duas vezes com DPBS e, em seguida, seladas. As placas são carregadas no Insight Instrument para imagens e análises de alto conteúdo usando-se o algoritmo Spot Detector v4.0. Os dados gerados pelo algoritmo são processados para cálculo de IC50 com o software Graph Pad Prism v7.0.

[0071] Em experimentos realizados essencialmente como descrito acima, foram obtidos os seguintes dados.

TABELA 6: INIBIÇÃO DA AGREGAÇÃO DE ALFA-SINUCLEÍNA EM CÉLULAS SHSY-5Y-A53T-myc APÓS TRATAMENTO COM ANTI- CORPOS. Anticorpo/artigo de IC50 médio (µg/ml) Desvio padrão de IC50 teste (µg/ml) Anticorpo 1 0,41 0,06 Anticorpo 2 0,40 0,15 C.A. 1 0,38 0,13

[0072] Estes dados demonstram que os anticorpos da presente invenção são capazes de inibir a agregação de alfa-sinucleína em cé- lulas SHSY-5Y-A53T-myc. Em comparação com os dados de inibição de internalização de Phab mostrados na Tabela 5, não há uma sobre- posição das curvas de CRC com valores de IC50 muito semelhantes (IC50 0,45 µg/ml na Tabela 5 em comparação com 0,41 µg/ml na Tabe- la 6). Estes resultados sugerem que a inibição da agregação induzida por fibrilas de α-sinucleína humana e semeadura pelo Anticorpo 1 po- de ser causada diretamente pela inibição da internalização de fibrilas de α-sinucleína humana nas células. EXEMPLO: AVALIAÇÃO IN VITRO DO ANTICORPO 1 E INIBIÇÃO DE CA 1 DE ABSORÇÃO DE FIBRILA α-SINUCLEÍNA 1-121 E 1-140 MARCADA COM pHAb EM CÉLULAS SHSY-5Y-A53T-myc

[0073] São geradas fibrilas de α-sinucleína marcadas com pHAb de 1-121 (aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 13) e 1-140 (SEQ ID NO: 13) de comprimento. Monômeros de alfa-sinucleína são marcados com corante pHAb, têm tampão trocado e, em seguida, são agitados por duas semanas a 1.400 RPM. No final de duas semanas, as fibrilas são sonicadas por 120 segundos antes da experimentação.

[0074] O anticorpo 1 e C.A. 1 são diluídos em série, de 100 µg/ml para 0,1 µg/ml. Os anticorpos são combinados com o fragmento de α- sinucleína 1-121 marcado com pHAb e a alfa-sinucleína de compri- mento total a 2 µg/ml. Esta solução é então aplicada às células

SHSY5Y e incubada durante a noite. As células são então fotografa- das em Cytation 5, limiar 2000.

[0075] Com base em procedimentos essencialmente conforme descrito acima, os resultados demonstraram a absorção de fibrilas de α-sinucleína 1-121 e de α-sinucleína com pHAb de comprimento total. O Anticorpo 1 bloqueou a absorção de fibrilas de α-sinucleína 1-121, enquanto CA 1 mostrou efeito mínimo, se algum, na absorção de fibri- las de α-sinucleína 1-121 (Figura 1a). O Anticorpo 1 e CA 1 mostraram atividade semelhante na inibição da absorção de α-sinucleína de com- primento total (Figura 1b).

[0076] Estes dados demonstram que o Anticorpo 1 e CA 1 têm di- ferentes efeitos no bloqueio da internalização de fibrilas de α- sinucleína. O Anticorpo 1 foi capaz de bloquear a absorção celular de forma dependente da dose com fibrilas de comprimento total e 1-121, enquanto o CA 1 só foi capaz de bloquear as fibrilas 1-140. Isso suge- re que o Anticorpo 1 será mais eficaz por sua capacidade de se ligar e bloquear a internalização da alfa-sinucleína fragmentada. EXEMPLO: DETERMINAÇÃO DE EPÍTOPO DO ANTICORPO 1 E ANTICORPO 2.

DETERMINAÇÃO BIOQUÍMICA DO EPÍTOPO

[0077] Os epítopos do Anticorpo 1 e do Anticorpo 2 são determi- nados por varredura de alanina de peptídeo. A ligação é medida por interferometria de biocamada em um OctetRed384 (ForteBio). Bios- sensores de estreptavidina (ForteBio) são carregados com cada um dos peptídeos de mutação com alanina biotinilada dos resíduos de α- sinucleína humana 110-133 da SEQ ID NO: 13 em BSA a 0,1%, tam- pão de ensaio PBST a 0,05%, lavados no mesmo tampão e, em se- guida, transferidos para poços contendo soluções de anticorpos a uma concentração de 15 µg/ml. O sinal de resposta e a taxa de dissociação são obtidos com um modelo de ajuste 1:1 usando-se o software Octet.

A perda do sinal de resposta ou mudança da taxa de dissociação (Koff) para os peptídeos de mutação com alanina em comparação com o peptídeo de tipo selvagem indica os resíduos de epítopo.

[0078] Em experimentos realizados seguindo-se procedimentos essencialmente conforme descrito acima, os resíduos-chave para o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2 são determinados como estando em duas regiões separadas - D115, M116 e D119, e E126 e P128. Um experi- mento semelhante foi realizado com CA 1. Os resíduos de epítopo de CA 1 foram determinados como sendo N122 e Y125, o que correspon- de ao epítopo relatado na patente dos Estados Unidos Número

10.081.674 (ver, por exemplo, a Figura 6).

LIGAÇÃO A DOIS EPÍTOPOS INDEPENDENTES

[0079] Como os resíduos do epítopo-chave estão em duas regiões (como descrito acima), para se entender se o Anticorpo 1 e o Anticor- po 2 podem se ligar às duas regiões independentemente, um ELISA é realizado usando-se fragmento de α-sinucleína humana truncado 1- 120 (resíduos 1-120 da SEQ ID NO: 13) e peptídeo de α-sinucleína humana biotinilado 120-140 (resíduos 120-140 da SEQ ID NO: 13). A ligação de α-sinucleína de comprimento total (1-140) também é deter- minada. O procedimento é essencialmente conforme descrito acima para a ligação da fibrila α-sinucleína. Seguindo-se os procedimentos essencialmente conforme descrito acima, as curvas de ligação são mostradas na Figura 2.

[0080] Estes dados demonstram que o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2 se ligam a ambos os fragmentos de α-sinucleína 1-120 e 120-140 com afinidades de ligação na faixa picomolar. O Anticorpo 1 tem afinidade semelhante para cada um dos dois fragmentos de α-sinucleína. O An- ticorpo 2 tem uma afinidade semelhante à do Anticorpo 1 para o frag- mento 1-120 da α-sinucleína, mas tem uma afinidade mais fraca para o fragmento 120-140 da α-sinucleína. O resultado mostrou falta de as-

síntotas superiores e inferiores bem definidas para CA 1 para ambos os fragmentos de α-sinucleína. O Anticorpo 1, o Anticorpo 2 e CA 1 ligam-se ao monômero de α-sinucleína (1-140) com afinidades seme- lhantes. Estes dados sugerem que o Anticorpo 1 e o Anticorpo 2 po- dem se ligar tanto a alfa-sinucleína clivada quanto de comprimento to- tal. ANÁLISE DE FRAGMENTO DE ALFA-SINUCLEÍNA

[0081] Para se determinar se a ligação do Anticorpo 1 é impactada pela clivagem da calpaína I e da caspase (resíduos 122/123 e 121/122, respectivamente) da α-sinucleína que foi relatada como sen- do regulada positivamente no mal de Parkinson (Duffy et al, (2007) Am. J. Pathol. 170 (5): 1725-1738 e Wang et al, (2016) Proc. Nat. Acad. Sci. 113 (34): 9587-9592), a ligação do Anticorpo 1 a trunca- mentos C-terminais progressivos de α-sinucleína humana monomérica são avaliados usando-se os mesmos métodos Kinexa e procedimentos descritos anteriormente para alfa-sinucleína monomérica humana de comprimento total acima. Os fragmentos de alfa-sinucleína testados são os aminoácidos 1-140, 1-121 e 1-115 de SEQ ID NO: 13.

[0082] Seguindo-se os procedimentos essencialmente conforme descrito acima, os seguintes dados foram obtidos. TABELA 7. AFINIDADES DE LIGAÇÃO DO ANTICORPO 1 E CA 1 PARA TRUNCAMENTOS C-TERMINAIS PROGRESSIVOS DE ALFA- SINUCLEÍNA HUMANA MONOMÉRICA, CONFORME DETERMINA- DO POR KINEXA A 37 ° C. Anticorpo 1 C.A. 1 Fragmento de KD (nM) IC de 95% (nM) KD (nM) IC de 95% (nM) alfa-sinucleína 1-140 19 12,2 a 28,5 87,2 60,7 a 105,9 1-121 11,8 7,9 a 16,0 > 20.000 Não calculado 1-115 675 418,4 a 1.060 Não medido Não medido

[0083] Estes dados sugerem que a ligação do Anticorpo 1 à α-

sinucleína não é afetada pelas espécies clivadas de calpaína e cas- pase de α-sinucleína humana que foram observadas em pacientes de Parkinson, enquanto CA 1 é incapaz de se envolver com essas espé- cies fragmentadas. EXEMPLO: EFICÁCIA IN VIVO

[0084] Para se avaliar a eficácia farmacológica de um anticorpo da presente invenção in vivo, tanto uma neutralização quanto um estudo crônico periférico são realizados no modelo de camundongo A53T se- meado.

[0085] Para o estudo de neutralização, fibrila de α-sinucleína re- combinante é pré-misturada com um anticorpo da presente invenção ou CA 1 em equivalentes molares próximos (anticorpo em leve exces- so molar), deixa-se complexar por 30 minutos ex vivo, e então, a mis- tura é injetada em um camundongo. Os animais são sacrificados 90 dias após a infusão.

[0086] O estudo crônico periférico examina a eficácia do anticorpo quando administrado cronicamente por meio de injeção intraperitoneal. Resumidamente, fibrila de α-sinucleína recombinante é infundida no cérebro e um anticorpo da presente invenção ou CA 1 é injetado 16 horas após a infusão de fibrila. O anticorpo é administrado duas vezes por semana durante um total de 120 dias.

[0087] Em ambos os estudos, a eficácia farmacológica do anticor- po é avaliada bioquimicamente e por imuno-histoquímica, quantifican- do-se as alterações no desenvolvimento da patologia da α-sinucleína. A bioquímica monitora a α-sinucleína oligomérica extraída de tecidos da fração insolúvel de SDS, bem como a fosfo129 modificada (P129; α-sinucleína fosforilada na serina 129), que é um marcador bem aceito para a formação de corpos de Lewy. Estudos de imuno-histoquímica avaliam a carga de coloração de P129 nesses camundongos. Os pa- râmetros PK para as concentrações do medicamento no soro e no

LCR no final do estudo também são coletados para se compreender os níveis de estado estacionário do composto.

[0088] O tratamento com os anticorpos da presente invenção pode resultar em redução da alfa-sinucleína oligomérica e redução da colo- ração de P129.

SEQUÊNCIAS Anticorpo 1 e Anticorpo 2 HCDR1 (SEQ ID NO: 1)

AASGFTFSSYAMS Anticorpo 1 e Anticorpo 2 HCDR2 (SEQ ID NO: 2)

AISGSGGDTYYADSVXG em que Xaa na posição 16 é lisina ou glutamina.

Anticorpo 1 e Anticorpo 2 HCDR3 (SEQ ID NO: 3)

ARGYGMDV Anticorpo 1 e Anticorpo 2 LCDR1 (SEQ ID NO: 4)

RSSQXLVHSDGNTYLM em que Xaa na posição 5 é serina ou ácido aspártico.

Anticorpo 1 e Anticorpo 2 LCDR2 (SEQ ID NO: 5)

YKVSXRNS em que Xaa na posição 5 é asparagina ou ácido aspártico.

Anticorpo 1 e Anticorpo 2 LCDR3 (SEQ ID NO: 6)

MQGTKQYPT Anticorpo 1 e Anticorpo 2 HCVR (SEQ ID NO: 7)

XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSS em que Xaa na posição 1 é ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico, e em que Xaa na posição 65 é lisina ou glutamina.

Anticorpo 1 e Anticorpo 2 LCVR (SEQ ID NO: 8)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRPG QSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC

MQGTKQYPTFGQGTKLEIK em que Xaa na posição 28 é serina ou ácido aspártico e em que Xaa na posição 58 é asparagina ou ácido aspártico.

Anticorpo 1 e Anticorpo 2 HC (SEQ ID NO: 9)

XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLX em que Xaa na posição 1 é ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico, em que Xaa na posição 65 é lisina ou glutamina, e em que Xaa na po- sição 441 é glicina ou ausente.

Anticorpo 1 e Anticorpo 2 LC (SEQ ID NO: 10)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRPG QSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC MQGTKQYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS

KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC em que Xaa na posição 28 é serina ou ácido aspártico e em que Xaa na posição 58 é asparagina ou ácido aspártico.

DNA que codifica o Anticorpo 1 HC (SEQ ID NO: 11)

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGG GGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAG CAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGC TGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGCGACACATACT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATT CCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAG GACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGGGGCTACGGTATGGACGT CTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACC TCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCA GCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG CACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCC ACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCC TGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCC GAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAA TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAC GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTC CTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG AGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACC AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGG AGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA

ACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT DNA que codifica o anticorpo 1 LC (SEQ ID NO: 12)

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTT GGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTA CACAGTGATGGAAACACCTACTTGATGTGGTTTCAGCAGAGGCCA GGTCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACCGGAACT CTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGAT TTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTT TATTACTGCATGCAAGGTACAAAGCAGTACCCCACTTTTGGCCAA GGGACCAAGCTGGAGATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGT CTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGC CTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC

CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC Alfa-sinucleína humana (SEQ ID NO: 13)

MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKE GVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAAT GFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEP EA

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-alfa-sinucleína caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada (HC) e uma cadeia leve (LC), em que a HC compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e a LC compreende uma região variável da cadeia leve (LCVR), e em que a HCVR compreende uma HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e a LCVR compreende uma LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a sequência de aminoácidos da HCDR1 é dada pela SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácidos da HCDR2 é dada pela SEQ ID NO: 2 (AIS- GSGGDTYYADSVXG; em que Xaa na posição 16 é lisina ou glutami- na), a sequência de aminoácidos da HCDR3 é dada pela SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácidos da LCDR1 é dada pela SEQ ID NO: 4 (RSSQXLVHSDGNTYLM; em que Xaa na posição 5 é serina ou ácido aspártico), a sequência de aminoácidos da LCDR2 é dada pela SEQ ID NO: 5 (YKVSXRNS; em que Xaa na posição 5 é asparagina ou áci- do aspártico), e a sequência de aminoácidos da LCDR3 é dada pela SEQ ID NO: 6.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que Xaa na posição 16 da SEQ ID NO: 2 é lisina, Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 4 é serina e Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 5 é asparagina.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que Xaa na posição 16 da SEQ ID NO: 2 é glutami- na, Xaa na posição 5 da SEQ ID NO: 4 é ácido aspártico e Xaa na po- sição 5 da SEQ ID NO: 5 é ácido aspártico.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da HCVR é dada pela SEQ ID NO: 7 (XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL

EWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSS; em que Xaa na posição 1 é o ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico, e em que Xaa na posição 65 é lisina ou glutamina), e a sequência de aminoácidos da LCVR é dada pela SEQ ID NO: 8 (DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRP

GQSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CMQGTKQYPTFGQGTKLEIK; em que Xaa na posição 28 é serina ou ácido aspártico e em que Xaa na posição 58 é asparagina ou ácido aspártico).

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 7 é ácido glu- tâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 7 é lisina, Xaa na posição 28 da SEQ ID NO: 8 é serina e Xaa em a posição 58 da SEQ ID NO: 8 é asparagina.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 7 é ácido glu- tâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 7 é glutamina, Xaa na posi- ção 28 da SEQ ID NO: 8 é ácido aspártico e Xaa na posição 58 da SEQ ID NO: 8 é ácido aspártico.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, carac- terizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da HC é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos da LC é dada pela SEQ ID NO: 10; e em que: a. a sequência de aminoácidos dada pela ID SEQ NO: 9 é

XVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL

EWVSAISGSGGDTYYADSVXGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCARGYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA

ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT

VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL

PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLX; e em que Xaa na posição 1 é ácido glutâmico ou ácido piroglutâmico, em que Xaa na posição 65 é lisina ou glutamina, e em que Xaa na po- sição 441 é glicina ou ausente; e b. a sequência de aminoácidos dada pela ID SEQ NO: 10 é

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQXLVHSDGNTYLMWFQQRPG

QSPRRLIYKVSXRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC

MQGTKQYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC; e em que Xaa na posição 28 é serina ou ácido aspártico, e em que Xaa na posição 58 é asparagina ou ácido aspártico.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zado pelo fato de que Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 9 é ácido glu- tâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 9 é lisina, Xaa na posição 441 da SEQ ID NO: 9 é glicina, Xaa na posição 28 da SEQ ID NO: 10 é serina e Xaa na posição 58 da SEQ ID NO: 10 é asparagina.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zado pelo fato de que Xaa na posição 1 da SEQ ID NO: 9 é ácido glu- tâmico, Xaa na posição 65 da SEQ ID NO: 9 é glutamina, Xaa na posi- ção 441 da SEQ ID NO: 9 é glicina, Xaa na posição 28 da SEQ ID NO: 10 é ácido aspártico e Xaa na posição 58 da SEQ ID NO: 10 é ácido aspártico.

10. Anticorpo de alfa-sinucleína caracterizado pelo fato de que se liga a alfa-sinucleína humana nos resíduos de ácido aspártico na posição 115, metionina na posição 116, ácido aspártico na posição

119, ácido glutâmico na posição 126 e prolina na posição 128 da SEQ ID NO: 13.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que se liga a um fragmento de alfa-sinucleína que compreende os resíduos 1 a 120 da SEQ ID NO:

13.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que se liga a um fragmento de alfa-sinucleína que compreende os resíduos 120-140 da SEQ ID NO:

13.

13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

14. Método de tratamento de um paciente com sinocleino- patia, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a sinocleinopatia é PD, MSA ou AD.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a sinocleinopatia é DLB.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, carac- terizado pelo fato de que a sinocleinopatia é PD.

18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

19. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma sinocleinopatia.

20. Anticorpo para uso, de acordo com a reivindicação 19,

caracterizado pelo fato de que a sinocleinopatia é PD, MSA ou AD.

21. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma sinocleinopatia.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a sinocleinopatia é PD, MSA ou AD.

23. Molécula de DNA caracterizada pelo fato de que com- preende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo HC, cuja sequên- cia de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 9.

24. Molécula de DNA caracterizada pelo fato de que com- preende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo LC, cuja sequên- cia de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 10.

25. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a sequência do polinucleotídeo que co- difica a HC é dada pela SEQ ID NO: 11.

26. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a sequência do polinucleotídeo que co- difica a LC é dada pela SEQ ID NO: 12.

27. Molécula de DNA caracterizada pelo fato de que com- preende um polinucleotídeo que codifica a HC, cuja sequência de ami- noácidos é dada pela SEQ ID NO: 9, e que compreende um polinucle- otídeo que codifica a LC, cuja sequência de aminoácidos é dada pela SEQ ID NO: 10.

28. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a sequência do polinucleotídeo que co- difica a HC é dada pela SEQ ID NO: 11, e a sequência do polinucleotí- deo que codifica a LC é dada pela SEQ ID NO: 12.

29. Célula de mamífero transformada com a molécula de DNA, como definida na reivindicação 23, e a molécula de DNA, como definida na reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO:

10.

30. Célula de mamífero transformada com a molécula de DNA, como definida na reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que é capaz de expressar um anticorpo que compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10.

31. Processo para a produção de um anticorpo, em que o anticorpo compreende duas HCs e duas LCs, em que a sequência de aminoácidos de cada HC é dada pela SEQ ID NO: 9 e a sequência de aminoácidos de cada LC é dada pela SEQ ID NO: 10, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar a célula de mamífero, como definida na reivindi- cação 29, ou célula de mamífero, como definida na reivindicação 30, sob condições tais que o anticorpo seja expresso, e b. recuperar o anticorpo expresso.

32. Anticorpo caracterizado pelo fato de que pode ser obti- do pelo processo, como definido na reivindicação 31.