ES2865112T3 - Anticuerpos de unión a protofibrillas A-beta mejorados - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende: (a) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16; (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15; (c) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15; (d) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15; (e) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15; (f) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16 (g) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16; o (h) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de unión a protofibrillas A-beta mejorados
Campo de la invención
La presente invención se refiere al péptido amiloide beta (Ap) y más específicamente a anticuerpos que se unen a protofibrillas Ap y a su uso en la terapia y/o el tratamiento profiláctico de enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap. La invención se puede referir además a un diagnóstico de tales enfermedades, así como a la monitorización de la evolución de la enfermedad por el uso de los anticuerpos de la invención. Además, la invención se puede referir al uso veterinario de los anticuerpos de la invención.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Alzheimer (EA) pertenece a un grupo de trastornos neurodegenerativos y causa alteraciones cognitivas, de la memoria y del comportamiento. Los distintivos de la enfermedad de Alzheimer incluyen placas de amiloide extracelular, ovillos neurofibrilares intraneuronales, disfunción neuronal y, por último lugar, atrofia cerebral. El riesgo de desarrollar EA aumenta con la edad y con el aumento del número de personas que alcanzan una alta edad, una afección con un impacto creciente sobre la calidad de vida de las personas ancianas. Además, la sociedad se enfrenta a una situación de aceleración de los costes.
A pesar del hecho de que la enfermedad se conoce desde hace muchos años y se han hecho varias sugerencias de tratamiento, incluso hoy en día, no está disponible dicha terapia eficiente modificadora de la enfermedad hoy en día, sino solo fármacos que en el mejor de los casos pueden proporcionar un tratamiento sintomático. El mecanismo detrás de la enfermedad ha sido objeto de muchos estudios. Brevemente, Ap se empieza a agregar por algún motivo y mediante varias formas intermedias, finalmente produce depósitos insolubles de fibrillas/placas en el cerebro. Anteriormente se creía que las placas, como tales, afectan a las neuronas y a las señales transmitidas por éstas, pero hoy en día los resultados de los amplios estudios indican que las formas intermedias agregadas solubles de Ap son lo más probablemente una causa importante de la enfermedad y de los síntomas observados en los pacientes.
Una forma intermedia tal en la cascada de las formas agregadas de los monómeros Ap a las fibrillas Ap insolubles es la protofibrilla Ap soluble de alto peso molecular, que fue descrita por primera vez por Walsh en 1997 en The Journal of Biological Chemistry (Vol. 272(35) p. 22364-72). La importancia de la protofibrilla Ap para el desarrollo de la EA se identificó por el grupo de científicos encabezado por Lars Lannfelt, Universidad de Uppsala, en sus estudios de la mutación del Ártico, que es una mutación E693G en la proteína precursora de amiloide (APP) que causa una elevada formación de protofibrillas Ap. Se encontró que una familia en el norte de Suecia que tenía esta mutación desarrollaba una intensa enfermedad de Alzheimer en los primeros años de vida y el resultado de esta combinación proporcionó las ideas básicas para una nueva terapia. Por consiguiente, se identificó que la protofibrilla Ap estaba fuertemente relacionada con la enfermedad y era una diana importante para la terapia. Según sus estudios con los péptidos Ap que comprenden la mutación del Ártico, Lannfelt et al. fueron capaces de producir protofibrillas Ap in vitro, Ártico así como naturales, en cantidades suficientes para la inmunización y la posterior selección de anticuerpos con alta afinidad por las protofibrillas Ap en comparación con otras especies en el sistema Ap. Los ejemplos de métodos para la producción de protofibrillas Ap y anticuerpos que se unen a estas se desvelan en los documentos de patente WO02/03911 y WO2005/123775.
Fue de especial importancia el desarrollo del anticuerpo monoclonal de ratón mAb158, un anticuerpo que se une a las protofibrillas Ap, que se desvela en el documento de patente EP2004688, que comprende las siguientes secuencias de CDR:
VH-CDR1: SFGMH SEQ ID NO: 1
VH-CDR2: YISSGSSTIYYGDTVKG SEQ ID NO: 2
VH-CDR3: EGGYYYGRSYYTMDY SEQ ID NO: 3
VL-CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 4
VL-CDR2: KVSNRFS SEQ ID NO: 5
VL-CDR3: FQGSHVPPT SEQ ID NO: 6
La alta afinidad y selectividad de la versión humanizada de mAb158, BAN2401, hace que sea un candidato importante para su uso en la terapia y/o la prevención de enfermedad de Alzheimer en particular, y actualmente es objeto de ensayos clínicos en preparación para su uso como un producto farmacéutico. Las características de BAN2401 se describen en el documento de patente EP2004688.
La eficacia de un anticuerpo depende de varios factores farmacocinéticos y farmacodinámicos, véanse, por ejemplo Deng et al, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol 8(2) (2012): p. 141-160; Boswell et al., Bioconjugate Chem. 21(2010): p.
2153-2163; Konterman, Current Opinión in Biotechnology 22 (2011): p. 1-9 e Igawa et al, mAbs 3:3 (2011): p. 243 252. Entre estos, la prolongada semivida en suero con la elevada exposición sistémica proporciona frecuentemente un potencial considerable de mejoras de valor terapéutico significativo. También proporciona la posibilidad de reducción de la dosis que tiene importantes implicaciones sistémicas.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a protofibrillas Ap y a su uso en la terapia y/o el tratamiento profiláctico de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap. La invención se puede referir además a anticuerpos útiles en el diagnóstico de dichas enfermedades, así como a su uso en la monitorización de la evolución de la enfermedad de dichas enfermedades, así como al uso veterinario de dichos anticuerpos. Se ha identificado que sorprendentemente la semivida, así como la exposición del anticuerpo humanizado basado en mAb158, es decir, BAN2401, se potencia considerablemente, por ejemplo aproximadamente dos veces o más, principalmente, introduciendo una o más mutaciones en ciertas posiciones, es decir, 17, 79 y/o 82, de la cadena ligera variable del anticuerpo BAN2401 (posiciones de Kabat 17, 74 y 77), respectivamente, véase la Figura 9 adicional donde estas posiciones se denominan X1, X2 y X3. En BAN2401, el aminoácido en la posición 17 (posición de Kabat 17) es A, el aminoácido en la posición 79 (posición de Kabat 74) es R y el aminoácido en la posición 82 (posición de Kabat 77) es R. La numeración de Kabat se da según Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991 (publicaciones de NIH N° 91-3242).
Opcionalmente, se pueden lograr aún más mejoras de un anticuerpo según la invención combinando cada una de las mutaciones que proporcionan una elevada semivida con una o más mutaciones vecinas, es decir, 13, 21, 81 y/o 84, de la cadena ligera variable del anticuerpo (posiciones de Kabat 13, 21, 76 y 79), respectivamente, véase además la Figura 9 donde estas posiciones se denominan y1-4, 37, 38 y/o 40, de la cadena pesada variable del anticuerpo (posiciones de Kabat 37, 38 y 40), respectivamente, véase además la Figura 10 donde estas posiciones se denominan Z1-3, para mejoras adicionales de la significancia inmunológica, es decir, baja inmunogenicidad. Cuando, en comparación con la secuencia de BAN2401, X1 se muta, se pueden introducir las mutaciones y1 y/o y2 y cuando X2 y/o X3 se mutan, se pueden introducir las mutaciones y3 y/o y4. Además, se pueden introducir las mutaciones Z1-3.
La presente invención es del siguiente modo:
[1] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
[2] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
[3] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
[4] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
[5] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
[6] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
[7] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
[8] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
[9] El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según uno cualquiera de [1] a [8], en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende una región constante de la cadena pesada de IgG.
[10] Un anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [9], para su uso en terapia.
[11] Un anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [9], para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap.
[12] Un anticuerpo para su uso según [11], en donde dichos otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap se seleccionan de lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP).
[13] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según uno cualquiera de [1]-[9] para su uso en un método de reducción de la cantidad de protofibrillas Ap en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según [1] a [9].
[14] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según uno cualquiera de [1]-[9] para su uso en un método de medición de la cantidad de protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada en una persona, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo o in vitro, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según [1] a [9] y medir la cantidad de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno unida a dichas protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada.
[15] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según uno cualquiera de [1]-[9] para su uso en un método de diagnóstico de enfermedad de Alzheimer en personas que tienen o están en riesgo de desarrollar la enfermedad, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo o in vitro, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según [1] a [9], o un fragmento del mismo, y medir la cantidad de dicho anticuerpo unido a la proteína Ap agregada.
[16] Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según uno cualquiera de [1]-[9] para su uso en un método de diagnóstico de lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP) en personas que tienen o están en riesgo de desarrollar cualquiera de dichas enfermedades, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo o in vitro, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según [1] a [9], o un fragmento del mismo, y medir la cantidad de dicho anticuerpo unido a la proteína Ap agregada.
[17] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según uno cualquiera de [1] a [9], junto con excipiente farmacéuticamente aceptable y/o diluyentes.
[18] Un anticuerpo según uno cualquiera de [1] a [9], para uso veterinario.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona el análisis de unión y selectividad de protofibrillas Ap en comparación con monómeros de Ap por A17D, A17D/R79T, A17D/R82S y A17D/R79T/R82S en comparación con BAN2401 (control). La inhibición de la unión por protofibrillas Ap1 -42 en disolución se muestra por círculos blancos y cuadrados blancos y la inhibición de la unión por monómeros Ap1-40 en disolución se muestra por círculos negros y cuadrados negros.
La Figura 2 proporciona la exposición a fármaco plasmático de BAN2401 y anticuerpos de la invención en ratones presentada como gráficos de tiempo frente a concentración. Los niveles en plasma después de una única inyección i.v. de BAN2401, A17D, A17D/R79T y A17D/R79T/R82S recogido en los momentos 0,5 h, 2 días, 7 días, 15 días y 29 días después de la administración, y de A17D/R82S recogido en los momentos 0,5 h, 2 días, 7 días, 14 días y 28 días después de la administración se muestran en el gráfico. A17D/R82S no se incluyó en el mismo estudio de FC que los otros anticuerpos mostrados aquí, sino que en su lugar se proporcionó en una ocasión separada. Sin embargo, con excepción de dos momentos de muestreo de plasma, se usó el mismo diseño del estudio para dos estudios separados. Todas las muestras de plasma se analizaron por ELISA en la misma ocasión para evitar la variación interanalítica. La concentración de fármaco plasmático en pg/ml se muestra en el eje y (escala logarítmica) y el tiempo después de la administración en horas (h) se muestra en el eje x. Los valores medios del grupo se muestran con barras de error que indican las desviaciones estándar. Se calcularon los valores medios de ABCü-inf y las semividas terminales por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se muestran en la Tabla 1
La Figura 3 proporciona la exposición a fármaco plasmático de BAN2401 y anticuerpos de la invención, en ratas, presentado como gráficos de tiempo frente a la concentración. Los niveles en plasma después de una única inyección i.v. de BAN2401, A17D, A17D/R79T y A17D/R79T/R82S recogido en los momentos 0,5 h, 2 h, 7 h, 24 h, 2 días, 4 días, 7 días, 14 días y 29 días después de la administración se muestran en el gráfico. La concentración de fármaco plasmático en pg/ml se muestra en el eje y (escala logarítmica) y el tiempo después de la administración en horas (h) se muestra en el eje x. Los valores medios del grupo se muestran con barras de error que indican las desviaciones estándar. Se calcularon los valores medios de ABC0-¡nf y las semividas
terminales medias por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se muestran en la Tabla 2.
La Figura 4 proporciona datos con análisis de unión y selectividad de protofibrillas Ap en comparación con monómeros de Ap por las variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1-8) en comparación con BAN2401. La inhibición de la unión por protofibrillas Ap1-42 en disolución se muestra por círculos blancos y cuadrados blancos, y la inhibición de la unión por monómeros de Ap1-40 en disolución se muestra por círculos negros y cuadrados negros. A) A17D/R79T_DI 1, B) A17D/R79T_DI 2, C) A17D/R79T_DI 3, D) A17D/R79T_DI 4, E) A17D/R79T_DI 5, F) A17D/R79T_DI 6, G) A17D/R79T_DI 7, H) A17D/R79T_DI8.
La Figura 5 proporciona la exposición a fármaco plasmático de BAN2401 y anticuerpos de la invención, en ratones, presentada como gráficos de tiempo frente a la concentración. Los niveles en plasma después de una única inyección i.v. de BAN2401, A17D/R79T y 8 variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1 8) se recogieron en los momentos 0,5 h, 2 días, 7 días, 14 días y 28 días después de la administración. La concentración de fármaco plasmático en pg/ml se muestra en el eje y (escala logarítmica) y el tiempo después de la administración en horas (h) se muestra en el eje x. Los valores medios del grupo se muestran con barras de error que indican desviaciones estándar. Se calcularon los valores medios de ABCü-inf y las semividas terminales medias por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se muestran en la Tabla 6.
La Figura 6 proporciona la exposición a fármaco plasmático de BAN2401 y mutantes en rata presentada como gráficos de tiempo frente a concentración. Los niveles en plasma después de una única inyección i.v. de BAN2401, A17D/R79T y 8 variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17d/R79T_DI 1-8) se recogieron en los momentos 0,5 h, 2 días, 7 días, 14 días y 28 días después de la administración. La concentración de fármaco plasmático en pg/ml se muestra en el eje y (escala logarítmica) y el tiempo después de la administración en horas (h) se muestra en el eje x. Los valores medios del grupo se muestran con barras de error que indican desviaciones estándar. Se calcularon los valores medios de ABC0-inf y las semividas terminales medias por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se muestran en la Tabla 7.
La Figura 7 proporciona la exposición a fármaco plasmático corregida con la dosis de BAN2401, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8 en macaco cangrejero presentada como gráficos de tiempo frente a la concentración. Los niveles plasmáticos de anticuerpo después de una única infusión i.v. de BAN2401 se recogieron en los momentos 5 min, 1 h, 2 h, 8 h, 24 h, 2 días, 4 días, 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la administración, y A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8 se recogieron en los momentos 5 min, 2 h, 8 h, 24 h, 3 días, 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la administración. Los anticuerpos de la invención se administraron al mono en un estudio diferente y en una dosis diferente (10 mg/kg) en comparación con BAN2401 (5 mg/kg). Por tanto, los gráficos de exposición plasmática se han ajustado con la dosis. La concentración de fármaco plasmático corregido con la dosis en pg/ml por mg/kg de dosis inyectada se muestra en el eje y (escala logarítmica) y el tiempo después de la administración en horas (h) se muestra en el eje x. Los valores medios del grupo se muestran con barras de error, que indican desviaciones estándar. Los valores de ABC0-¡nf medios ajustados con la dosis y las semividas terminales se calcularon por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se muestran en la Tabla 8.
La Figura 8 proporciona secuencias de aminoácidos en relación con la presente invención.
La Figura 9 proporciona una tabla, dividida en dos páginas, con la secuencia de aminoácidos de la cadena variable ligera con secuencias de VL-CDR1-3 en gris. BAN2401: SEQ ID NO: 7. Novedosos anticuerpos con cadena variable ligera según la invención: SEQ ID NO: 8. Ejemplos específicos de dichas cadenas variables ligeras: i): SEQ ID NO: 9; ii): SEQ ID NO: 10; iii): SEQ ID NO: 11; y iv): SEQ ID NO: 12.
La Figura 10 proporciona una tabla, dividida en dos páginas, con la secuencia de aminoácidos de la cadena variable pesada con las secuencias de VH-CDR1-3 en gris. BAN2401: SEQ ID NO: 13. Novedosos anticuerpos con cadena variable pesada según la invención SEQ ID NO: 14. Ejemplos específicos de dichas cadenas variables pesadas: i): SEQ ID NO: 15; ii): SEQ ID NO: 16; iii): SEQ ID NO: 17; y iv): SEQ ID NO: 18.
La Figura 11 proporciona una escala alométrica simple de la depuración central (CL) de BAN2401, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8 que incluye las especies preclínicas ratón, rata y macaco cangrejero. Se representan las CL de las diferentes especies frente a sus pesos (diamantes), respectivamente. La línea de regresión se ha extrapolado para indicar la CL en un hombre con un peso corporal de 70 kg. Para BAN2401, la CL central verdadera medida se indica por un cuadrado blanco, y se desvía de la línea de regresión lineal basada en CL de BAN2401 en ratón, rata y macaco cangrejero. BAN2401 mostró una mala correlación lineal de CL, que indica una predicción incierta de la semivida, a diferencia de la excelente correlación lineal de CL de los anticuerpos de la invención.
Las mutaciones A17D, R79T y R82S representan posiciones en el anticuerpo BAN2401, en donde los aminoácidos en las posiciones 17, 79 y 82 están mutados en la cadena ligera variable.
Con "BAN2401" se indica un anticuerpo monoclonal humanizado del anticuerpo de ratón mAbl 58 que comprende una cadena ligera variable con una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 7 y una cadena pesada variable como se expone en SEQ ID NO: 13. Tanto BAN2401 como mAb158 y sus características, que incluyen VL-CDR1-3 y VH-CDR1-3, se describen en el documento de patente EP2004688. BAN2401 se excluye de la presente invención.
Con las siguientes abreviaturas se indica:
BAN2401: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 7; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
A17D: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 19 y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
A17D/R79T: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
A17D/R79T/R82S: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 21 y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
A17D/R82S: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 13.
A17D/R79T_DI 1: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
A17D/R79T_DI 2: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
A17D/R79T_DI 3: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
A17D/R79T_DI 4: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
A17D/R79T_DI 5: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
A17D/R79T_DI 6: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
A17D/R79T_DI 7: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
A17D/R79T_DI 8: un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
Un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, según la presente invención, comprende, en la cadena variable ligera, en la posición 17 (la posición de Kabat 17) el aminoácido A, D, E, Q o un análogo funcional, en la posición 79 (la posición de Kabat 74) el aminoácido R, T, K, A, G o un análogo funcional y en la posición 82 (la posición de Kabat 77) el aminoácido R, S, C, G, N o un análogo funcional. Un análogo funcional es un aminoácido que proporciona un valor de pI más bajo del anticuerpo en comparación con A (posición 17) con respecto a R (posición 79 y 82) sin afectar negativamente la unión al antígeno.
Las secuencias de aminoácidos en la presente divulgación se representan del siguiente modo:
SEQ ID NO: 1: cadena pesada variable VH-CDR1 de BAN2401.
SEQ ID NO: 2: cadena pesada variable VH-CDR2 de BAN2401.
SEQ ID NO: 3: cadena pesada variable VH-CDR3 de BAN2401.
SEQ ID NO: 4: cadena ligera variable VL-CDR1 de BAN2401.
SEQ ID NO: 5: cadena ligera variable VL-CDR2 de BAN2401.
SEQ ID NO: 6: cadena ligera variable VL-CDR3 de BAN2401.
SEQ ID NO: 7: cadena ligera variable de BAN2401.
SEQ ID NO: 8: secuencia de la cadena ligera variable genérica en anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 9: secuencia de la cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 10: secuencia de 
cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención. SEQ ID NO: 11: secuencia de 
cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención. SEQ ID NO: 12: secuencia de 
cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención. SEQ ID NO: 13: cadena pesada variable de BAN2401.
SEQ ID NO: 14: secuencia de cadena pesada variable genérica en anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 15: secuencia de cadena pesada variable específica en anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 16: secuencia de cadena pesada variable específica en anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 17: secuencia de cadena pesada variable específica en anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 18: secuencia de cadena pesada variable específica en anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 19: secuencia de 
cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención. SEQ ID NO: 20: secuencia de 
cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención. SEQ ID NO: 21: secuencia de 
cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención. SEQ ID NO: 22: secuencia de 
cadena ligera variable específica en anticuerpos de la invención. SEQ ID NO: 23: secuencia de aminoácidos de la región constante de IgG1 humana comprendida en los anticuerpos de la invención.
SEQ ID NO: 24: secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena k humana comprendida en los anticuerpos de la invención.
La cadena ligera variable (SEQ ID NO: 7) de BAN2401 y los anticuerpos de la invención comprenden las tres secuencias CDR (VL-CDR1-3):
VL-CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 4
VL-CDR2: KVSNRFS SEQ ID NO: 5
VL-CDR3: FQGSHVPPT SEQ ID NO: 6
y la cadena pesada variable (SEQ ID NO: 13) de BAN2401 y los anticuerpos de la invención comprenden las tres secuencias CDR (VH-CDR1-3):
VH-CDR1: SFGMH SEQ ID NO: 1
VH-CDR2: YISSGSSTIYYGDTVKG SEQ ID NO: 2
VH-CDR3: EGGYYYGRSYYTMDY SEQ ID NO: 3
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable seleccionada de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NOS: 9-12.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena pesada variable seleccionada de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NOS: 15-16.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable seleccionada de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NOS: 9-12; y una cadena pesada variable seleccionada de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NOS: 15-16.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
En una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la presente invención comprende una región constante de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE o cualquier variación alélica de las mismas como se trata en Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación de NIH N° 91 -3242). Cualquiera de dichas secuencias se puede usar en la presente invención. En una realización más preferida, la cadena pesada de la región constante del anticuerpo es IgG1. La secuencia de aminoácidos de la región constante de IgG1 humana se conoce en la técnica y se expone en SEQ ID NO: 23.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la presente invención comprende una región constante de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en regiones constantes de la cadena k y A o cualquier variación alélica de las mismas como se trata en Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinto edición, U.S Department of Health and Human Services, publicación de NIH N° 91-3242). Cualquiera de dichas secuencias se puede usar en la presente invención. En una realización más
preferida, la cadena ligera de la región constante del anticuerpo es k. La secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena k humana se conoce en la técnica y se expone en SEQ ID: 24.
En una realización, el fragmento de unión al antígeno según la presente invención es un fragmento Fab, o un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv de una sola cadena.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno según la invención pueden comprender cualquier combinación de las cadenas ligeras y pesadas variables definidas anteriormente.
Según un aspecto de la invención, se proporcionan anticuerpos mejorados, o fragmentos de unión al antígeno con alta afinidad por protofibrillas Ap para su uso en terapia, por ejemplo, para la administración de uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno según la invención, a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap, tales como lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP). Una dosis adecuada puede variar dentro de amplios intervalos, por ejemplo desde 0,01 hasta 100 mg/kg/dosis, dependiendo de la indicación médica y del estado del paciente, la vía de administración, por ejemplo i.v., s.c., infusión o por administración local, además de la frecuencia elegida, por ejemplo dosis única, administración diaria, semanal, trimestral o incluso menos frecuente.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, para su uso en terapia.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap. Normalmente, dichos otros trastornos se pueden seleccionar de lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP).
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención para su uso en un método de reducción de la cantidad de protofibrillas Ap en personas, que comprende administrar a la persona una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención para su uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap en un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar la enfermedad, que comprende administrar a la persona una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, de la invención. Normalmente, dichos otros trastornos se pueden seleccionar de lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP).
Un "sujeto" es normalmente un mamífero, tal como un humano. Otros mamíferos representan dichos mamíferos, donde se aplicaría uso veterinario/tratamiento/profilaxis.
En un aspecto, se puede proporcionar un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención para su uso en un método de medición de la cantidad de protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada en una persona, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo o in vitro, con un anticuerpo marcado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, y medir la cantidad de anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno unido a dichas protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno se podrían marcar con un ligando radiactivo, tal como I131, C11, C14, H3, F18 o galio68, pero no se limitan a estos radioisótopos, para fines de detección.
En un aspecto, se puede proporcionar un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención para su uso en un método de diagnóstico de enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap, tales como lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP), en personas que tienen o están en riesgo de desarrollar la enfermedad que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo o in vitro, con el anticuerpo de la invención, o el fragmento de unión al antígeno del mismo, y medir la cantidad de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno unido a la proteína agregada. Normalmente, dichos otros trastornos que están asociados con la agregación de proteína Ap se pueden seleccionar de lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP). Normalmente, el líquido corporal o tejido de una persona se analizaría in vivo o in vitro (en una muestra tomada del paciente) por contacto con una preparación de uno o más anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la invención y se mediría la cantidad de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno unida a la protofibrillas Ap. La cuantificación de
protofibrillas se usaría en el diagnóstico de las enfermedades mencionadas anteriormente, seguimiento de diversos tratamientos, así como en el desarrollo de nuevas medicinas. Opcionalmente, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno del mismo, en dicha preparación, se marcarían con un agente, que se detectaría y mediría, por cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo análisis por ELISA, Biacore y/u obtención de imágenes con SPECT, TEP, IRM. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno se podrían marcar con un ligando radiactivo, tal como I131, C11, C14, H3, F18 o galio68, pero no se limita a estos radioisótopos, para fines de detección.
Según otro aspecto de la invención, se prepara una composición farmacéutica, que comprende una cantidad eficaz de uno o más de los anticuerpos o fragmento de unión al antígeno de los mismos según la invención. Una composición médica que comprende un anticuerpo según la invención puede comprender, además de una cantidad eficaz del anticuerpo, otros componentes conocidos para su uso en dichas preparaciones, por ejemplo tampones, componentes para la conservación y estabilidad.
En otro aspecto, se puede proporcionar un anticuerpo de la invención, para uso veterinario. Normalmente, dicho uso veterinario incluiría el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos asociados a la agregación de proteína Ap.
Según un aspecto adicional que no es parte de la invención, se puede proporcionar terapia que utiliza los anticuerpos según la invención en combinación con tratamientos sintomáticos, tales como inhibidores de la acetilcolinesterasa, antagonistas de NMDA e inhibidores de 5HT6.
La combinación con otros tratamientos modificadores de la enfermedad, tales como inhibidores de Y-secretasa (GSI), moduladores de Y-secretasa (GSM), inhibidores de p-secretasa (BACE), moduladores de BACE, vacunas, otros anticuerpos, fármacos que se dirigen a tau o procesos neuroinflamatorios, antihipertensores, etc., ofrece posibilidades adicionales para la eficiente terapia.
La combinación con productos de nutrición puede ofrecer posibilidades adicionales para la eficiente terapia.
En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención, junto con excipiente farmacéuticamente aceptable y/o diluyentes, dicha composición adicional puede comprender un agente terapéutico adicional. Normalmente, dicho agente terapéutico adicional se puede seleccionar de inhibidores de la acetilcolinesterasa, antagonistas de NMDA, inhibidores de 5HT6, GSI, GSM, inhibidores de BACE, moduladores de BACE, vacunas, otros anticuerpos, fármacos que se dirigen a tau o procesos neuroinflamatorios, antihipertensores y un producto de nutrición. La composición se puede proporcionar como una dosis única o secuencial.
La presente invención se ilustrará por varios ejemplos no limitantes:
Ejemplo 1. Producción de anticuerpos y métodos usados
Producción de anticuerpo de referencia
El anticuerpo de referencia BAN2401 se produjo según los métodos previamente descritos en el documento de patente EP2004688.
Producción de los anticuerpos de la invención
Los anticuerpos de la invención se produjeron por producción transitoria y/o estable en células de ovario de hámster chino (CHO) usando los sistemas de expresión CHOK1SV GS y CHOK1SV GS-KO Xceed™ (Lonza), respectivamente. Se produjeron los siguientes mutantes por transfección transitoria usando el sistema de expresión CHOK1SV GS-KO Xceed™: A17D, A17D/R79T y A17D/R79T/R82S. Se produjeron los siguientes mutantes por tanto transfección transitoria como estable usando el sistema de expresión CHOK1SV GS-KO Xceed™: A17D/R79T_DI 1, A17D/R79T_DI 2, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4, A17D/R79T_DI 5, A17D/R79T_DI 6, A17D/R79T_DI 7 y A17D/R79T_DI 8. Se produjo el mutante A17D/R82S por transfección estable usando el sistema de expresión CHOK1SV GS.
Se sintetizaron secuencias de las regiones que codifican la cadena ligera y pesada de los mutantes usando métodos convencionales.
Para las transfecciones transitorias en el sistema de expresión CHOK1SV GS-KO Xeed™, se subclonaron regiones que codifican la cadena ligera en el vector pXC-17.4 y regiones que codifican la cadena pesada en el vector pXC-18.4. Se recogieron cultivos de expresión 6 días después de la transfección y se aclararon por centrifugación y filtración estéril. Los sobrenadantes clarificados del cultivo celular se sometieron a purificación usando cromatografía en proteína A. Se proporcionó el anticuerpo eluido en PBS (pH 7,4). Los productos se purificaron aún más por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) preparativa para retirar los agregados. El pico de monómero recogido se analizó después por SEC analítica, y se determinó que los niveles de agregados eran inferiores al 2 % para todos los productos.
Se realizó la expresión estable en el sistema CHOK1SV GS-KO Xeed™ esencialmente según las recomendaciones del fabricante. En resumen, se ligaron los dos vectores que contenían las cadenas ligeras y pesadas (pXC-17.4 y pXC
-18.4) en un vector de doble gen que contenía ambos genes. Se transfectaron por electroporación las células CHOK1SV GS-KO como el vector de doble gen linealizado. Se analizaron por ELISA el cribado de clones y el cribado de productividad de los cultivos de muerte. Las producciones se realizaron con medio CD-CHO complementado con 15 % de Feed A y 15 % de Feed B (Life Technologies). Se recogieron los sobrenadantes por centrifugación y filtración estéril. Se purificaron los sobrenadantes clarificados de cultivo celular usando cromatografía en proteína G y el tampón se intercambió a PBS de Dulbecco (Gibco).
Para la transfección estable usando el sistema de expresión CHOK1 SV GS (Lonza), se ligó el gen de la cadena pesada en el vector pEE6.4 y el gen de la cadena ligera en el vector pEE12.4. Los dos vectores se ligaron para formar un vector de doble gen. Se transfectaron por electroporación las células CHOK1 SV en el vector de doble gen linealizado. En esencia, las transfecciones se realizaron según las recomendaciones del fabricante. Se analizaron por ELISA el cribado de clones y el cribado de productividad de los cultivos de muerte. Las producciones se realizaron con medio CD-CHO complementado con 15 % de Feed A y 15 % de Feed B (Life Technologies). Se recogieron los sobrenadantes por centrifugación y filtración estéril. Se purificaron los sobrenadantes clarificados de cultivo celular usando cromatografía en proteína G y el tampón se intercambió a PBS de Dulbecco (Gibco). Se llevaron a cabo análisis de calidad del producto por HPLC de exclusión por tamaño y SSD-PAGE usando material purificado de todos los mutantes producidos.
Análisis de inhibición de dianas por ELISA de inhibición
Se analizaron las características de unión hacia las protofibrillas Ap y monómeros Ap de los anticuerpos de la invención en comparación con BAN2401 usando un ELISA de inhibición en el que los anticuerpos se preincubaron en disolución con protofibrillas Ap o monómeros Ap y luego se transfirieron a placas de ELISA recubiertas con Ap, como se describe en Tucker et. al. J Alzheimers Dis. 2015; 43(2):575-88. doi: 10.3233/JAD-140741. PubMed PMID: 25096615, y referencias citadas en su interior.
Estudios farmacocinéticos en ratones naturales
Se agruparon ratones C57BL/6 hembra de 8-10 semanas de edad y se administraron con inyecciones intravenosas (i.v.) únicas de BAN2401 o anticuerpos de la invención a una dosis de 10 mg/kg. Se recogió el plasma de todos los animales en momentos de tiempo que variaron desde 30 minutos hasta 29 días después de la inyección y se usaron para las mediciones de concentraciones de anticuerpo y los cálculos posteriores de parámetros farmacocinéticos (FC). Los ratones se sacrificaron en el momento de recogida de plasma terminal.
Estudios farmacocinéticos en ratas
Se agruparon ratas Sprague Dawley hembra de 8 semanas de edad y se administraron con inyecciones i.v. únicas de BAN2401 o anticuerpos de la invención a una dosis de 10 mg/kg. Se recogió el plasma de todos los animales en momentos de tiempo que variaron desde 30 minutos hasta 29 días después de la inyección y se usaron para las mediciones de concentraciones de anticuerpo y los cálculos posteriores de parámetros FC. Las ratas se sacrificaron en el momento de recogida de plasma terminal.
Estudios farmacocinéticos en monos
Se agruparon macacos cangrejeros macho (N=3) y se sometieron a infusiones i.v. únicas de 5 mg/kg de BAN2401 o 10 mg/kg de los anticuerpos de la invención. Se recogió el suero de todos los animales en momentos de tiempo que variaron desde 5 minutos hasta 28 días después de la inyección y se usaron para las mediciones de concentraciones de anticuerpo. Se determinaron los niveles séricos de BAN2401 y los anticuerpos de la invención por ELISA. Se añadieron protofibrillas Ap1-42 biotiniladas a una microplaca inmovilizada con avidina para el recubrimiento. Después del bloqueo, se añadieron muestras de suero de mono a los pocillos. Después de lavar las sustancias no unidas, se añadió IgG de cabra anti-humana marcada con fosfatasa alcalina (AP) a los pocillos. Después de un lavado para retirar los reactivos no unidos, se añadió p-nitrofenilfosfato, un sustrato para AP, a los pocillos. La reacción se detuvo con disolución de hidróxido sódico y se midió la absorbancia a 405 nm y 492 nm. Se restó la absorbancia a 492 nm de la de 405 nm. Los valores se tradujeron en concentraciones por medio de una curva patrón y se usaron para los cálculos posteriores de parámetros FC.
ELISA directo para la medición de anticuerpos Ap
Se midieron los niveles de BAN2401 y los anticuerpos de la invención en medios de cultivo celular, producto de anticuerpo purificado y plasma recogido en los estudios FC de ratón y de rata por ELISA directo para la medición de anticuerpos anti-Ap. Las muestras se diluyeron sucesivamente y se incubaron en pocillos de placas de microtitulación recubiertos con Ap1-40 para permitir que se unieran BAN2401 y los anticuerpos de la invención. Se utilizó IgG de cabra anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) como anticuerpo de detección y se añadió TMB, un sustrato para HRP. La reacción se detuvo mediante la adición de H2SO42 M, que da como resultado un color amarillo que se mide a 450 nm. El método se empleó en un modo cuantitativo, donde los valores de DO450 se traducen en concentraciones por medio de una patrón curva.
Cálculos de parámetros FC por análisis no compartimentai
Se realizaron cálculos de semivida terminal individual usando un modelo no compartimentai con el software Phoenix WinNonLin 6.3 (Pharsight). Se realizaron cálculos del área bajo la curva (ABC0-inf) con Phoenix WinNonLin usando el método de lineal hacia arriba y logarítmica hacia abajo. Se calcularon las medias de los grupos y las desviaciones estándar de las ABC y las semividas terminales usando GraphPad Prism (v 6.04).
Análisis estadísticos
Se realizaron análisis estadísticos de las medias de grupos de semividas terminales individualmente determinadas y ABC usando el software GraphPad Prism (v. 6.04). Se usó ANOVA unilateral seguido por la prueba a posteriori de comparaciones múltiples de Bonferroni en los estudios. Las pruebas se realizaron a niveles de significancia *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 y ****P <0,0001.
Ejemplo 2. Caracterización de uniones diana
La unión a protofibrillas Afi se conservó en A17D, A17D/R79T, A17DIR82S y A17DIR79TIR82S en comparación con BAN2401
Se analizaron los perfiles de unión diana de los anticuerpos de la invención junto con BAN2401 (control) por ELISA de inhibición como se describe en el Ejemplo 1 (ELISA de inhibición). Los resultados se presentan en la Figura 1, donde se muestran los análisis de unión y la selectividad por protofibrillas Ap en comparación con monómeros Ap por A17D, A17DIR79T, A17DIR82S y A17DIR79TIR82S y BAN2401. Los resultados mostraron que la unión y la selectividad de la unión a las protofibrillas Ap en comparación con la unión al monómero Ap se conservó en los anticuerpos de la invención (A17D, A17DIR79T, A17DIR82S y A17DIR79TIR82S).
Ejemplo 3. Perfil farmacocinético de anticuerpos en ratones
Estudio farmacocinético de BAN2401, A17D, A17DIR79T, A17DIR82S, A17DIR79TIR82S en ratones naturales Para estudiar el perfil farmacocinético de los anticuerpos de la invención en ratones naturales, se administró ratones C57BLI6 hembra de 8-10 semanas de edad con inyecciones i.v. únicas de 10 mgIkg de BAN2401 (N=8), A17D (N=7), A17DIR79T (N=6), A17DIR82S (N=8) o A17DIR79TIR82S (N=7). Se extrajeron muestras de sangre de los animales después de 0,5 h, 2 días, 7 días, 14 o 15 días, y 28 o 29 días y se analizaron por ELISA los niveles de BAN2401 y los anticuerpos de la invención usando Ap1-40 para la captura e IgG de cabra anti-humana acoplada a HRP para la detección como se describe en el Ejemplo 1 (ELISA directo). A17DIR82S se administró en un estudio empezado en una ocasión separada en comparación con los otros anticuerpos. Sin embargo, las muestras de plasma de los dos estudios diferentes se analizaron por ELISA al mismo tiempo para evitar la variación interanalítica.
Como se muestra en los gráficos de tiempo frente a concentración en la Figura 2 y los parámetros FC calculados presentados en la Tabla 1, los perfiles FC de los anticuerpos de la invención (A17D, A17DIR79T, A17DIR82S y A17DIR79TIR82S) se diferencian sustancialmente de BAN2401, especialmente durante las primeras 48 horas después de la inyección. Aunque se observó un aumento de 6 veces en la exposición, medida como el área bajo la curva (ABCü-inf), para A17D en comparación con BAN2401, las ABC de A17DIR79T, A17DIR82S y A17DIR79TIR82S mejoraron en 10-11 veces (Tabla 1). Por tanto, las semividas en plasma terminales de los anticuerpos de la invención se prolongaron considerablemente en comparación con BAN2401 (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros FC en plasma de BAN2401, A17D, A17DIR79T, A17DIR82S y A17DIR79TIR82S en ratones. Se calcularon individualmente la semivida y el ABC0-¡nf de todos los anticuerpos para todos los animales por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se sometió a análisis estadístico por ANOVA unilateral seguido por comparaciones múltiples de Bonferroni después de la prueba. Se muestran los valores medios del ABC0-inf y las semividas terminales medias en la tabla. Se indican las diferencias estadísticas en la semivida terminal y ABC0-inf entre BAN2401 y los mutantes en la tabla, donde *** indica p<0,001, y **** p<0,0001.
Anticuerpo ABC 0 -inf (mg*h/mL) Semivida terminal (días) BAN2401 3,7 4,5
A17D 23,3**** 8,7***
A17DIR79T 402**** 10,7****
A17DIR82S 37,9**** 11 1****
A17DIR79TIR82S 41 0**** 10,9****
Ejemplo 4. Perfil farmacocinético de anticuerpos en rata
Estudio farmacocinético de BAN2401, A17D, A17DIR79Ty A17DIR79TIR82S en ratas
Para estudiar el perfil farmacocinético de los anticuerpos de la invención en ratas, ratas Sprague Dawley hembra de 8 semanas de edad se administraron con inyecciones i.v. únicas de 10 mgIkg de BAN2401 (N=3), A17D (N=4), A17DIR79T (N=6) o A17DIR79TIR82S (N=5). Se tomaron muestras de sangre después de 0,5 h, 2 h, 7 h, 24 h, 2 días, 4 días, 7 días, 14 días y 29 días después de la inyección. Los niveles de BAN2401 y anticuerpos de la invención se analizaron por ELISA usando Ap1-40 para captura e IgG de cabra anti-humana acoplada a HRP para la detección como se describe en el Ejemplo 1 (ELISA directo). No se observa en la rata la rápida reducción de los niveles de BAN2401 en plasma de ratones naturales durante las primeras 48 horas después de la administración que conduce a la baja exposición (Figura 2), y en su lugar BAN2401 y los anticuerpos de la invención muestran perfiles FC similares (Figura 3). El análisis estadístico de las semividas plasmáticas y los valores de ABCü-inf calculados individualmente para todas las ratas en el estudio no indicó diferencias importantes en ABC0-inf o la semivida terminal entre BAN2401 y A17D o A17DIR79TIR82S (Tabla 2). Aunque se indicó un aumento significativo en ABC0-¡nf para A17DIR79T en comparación con BAN2401, no hubo diferencia estadística en la semivida terminal entre dos de ellos (Tabla 2).
Tabla 2. Parámetros FC en plasma de BAN2401, A17D, A17DIR79T y A17DIR79TIR82S en ratas. Se calcularon individualmente las semividas y los valores de ABC0-inf para todos los anticuerpos para todos los animales por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se sometió a análisis estadístico por ANOVA unilateral seguido por comparaciones múltiples de Bonferroni después de la prueba. Se muestran en la tabla los valores medios de ABC0-inf y las semividas terminales medias de BAN2401, A17D, A17DIR79T y A17DIR79TIR82S calculadas. Se indican las diferencias estadísticas en la semivida terminal y ABC0-inf entre BAN2401 y los mutantes en la tabla, donde ** indica P<0,01.
Anticuerpo ABC
0
-inf (mg*h/mL) Semivida terminal (días)
BAN2401 31,1 10,2
A17D 38,0 10,9
A17D/R79T 47,6** 12,8
A17D/R79T/ 
36,6 11,2
Ejemplo 5. Desinmunización
Ensayo de linfocitos T de proteína completa ex vivo de BAN2401, A17D, A17DIR79Ty A17DIR79TIR82S
Para evaluar si las mutaciones introducidas en los anticuerpos de la invención condujeron a un riesgo elevado de una respuesta inmunogénica en seres humanos, se analizaron A17D, A17DIR79T y A17DIR79TIR82S junto con BAN2401 por un ensayo de activación de linfocitos T de proteína completa ex vivo. El ensayo de linfocitos T de evolución temporal EpiScreen™ mide la capacidad de un anticuerpo para inducir respuestas de linfocitos T CD4+ (Antitope Ltd, Cambridge, GB). Las muestras se probaron contra células mononucleares de sangre periférica (CMSP) agotadas en CD8+ de una cohorte de 25 donantes sanos (donante 1-25, Tabla 3) con una amplia diversidad de HLA. Se midió la capacidad de los anticuerpos para inducir respuestas de linfocitos T CD4+ por proliferación y secreción de IL-2.
Los resultados del estudio indicaron que el posible riesgo global de inmunogenicidad fue bajo para BAN2401 y bajo limítrofe para A17D, respondiendo positivamente el 8 % y el 12 % de donantes, respectivamente (Tabla 3). El análisis de A17DIR79T y A17DIR79TIR82S reveló inesperadamente riesgos de inmunogenicidad algo más altos, ya que la frecuencia de proliferación combinada y la secreción de IL-2 fue del 24 % y 20 % de la cohorte de estudio, respectivamente.
Tabla 3. Resumen de la proliferación de linfocitos T de donantes sanos y respuestas de ELISpot de IL-2 para BAN2401, A17D, A17DIR79T y A17DIR79TIR82S. Las respuestas de linfocitos T positivas para la proliferación se indican con una "P" y las respuestas de ELISpot positivas se indican con una "E". Las respuestas limítrofes se indican (*). La correlación se expresa como el porcentaje de respuestas de proliferación también positivas en el ensayo de ELISpot. Para considerar una respuesta en un donante, tanto los ensayos de proliferación como de ELISpot tienen que ser positivos. A33 humanizado (Welt S et al., Clin Cancer Res. 2003 Apr; 9(4): 1347-53., 2003), que es un control de anticuerpo terapéutico con una inmunogenicidad media conocida del 32 % en la clínica, estimula normalmente el 20 30 % de los donantes para que respondan positivamente en el ensayo de proliferación de linfocitos T. La fitohemaglutinina (PHA) y la hemocianina de lapa californiana (KLH) son potentes antígenos usados como controles positivos.
Cribado de epítopes de linfocitos T de BAN2401 mediante simulación computacional
Para tratar aún más el riesgo de inmunogenicidad deducido por las mutaciones y para encontrar posiciones relevantes a desinmunizar, se sometieron BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S y A17D/R79T/R82S a un cribado de epítopes de linfocitos T mediante simulación computacional. Se proporcionaron secuencias de la región variable de BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S y A17D/R79T/R82S a Antitope Ltd (Cambridge, GB) para el análisis por sus tecnologías patentadas mediante simulación computacional iTope™ y TCED™. Se identificaron secuencias de
unión de la clase II de MHC promiscuas no de estirpe germinal en tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras de los anticuerpos analizados. Los análisis de búsqueda de BLAST de TCED™ revelaron dos correspondencias parciales con los epítopes previamente identificados en la base de datos de péptidos con inmunogenicidad conocida ex vivo.
Mapeo de epítopes de linfocitos T ex vivo de BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S y A17D/R79T/R82S
Para verificar el riesgo de inmunogenicidad deducido por las nuevas mutaciones y para identificar posiciones a desinmunizar, se evaluaron 44 péptidos (15-meros) derivados de regiones variables de BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S y A17D/R79T/R82S para la presencia de epítopes de linfocitos T CD4+ usando la tecnología de mapeo de epítopes de linfocitos T EpiScreen™ (Antitope Ltd, Cambridge, GB). Los péptidos se eligieron para cubrir todos los posibles epítopes de linfocitos T identificados por el cribado mediante simulación computacional y también las dos regiones que cubren las áreas de la sustitución A17D y las sustituciones R79T y R82S (incluyendo péptidos con o sin mutaciones).
Los péptidos se probaron contra una cohorte de 11 donantes humanos seleccionados de los análisis de anticuerpos completos Episcreen™ descritos en la sección previa. Se midieron las respuestas de linfocitos T para cada donante contra cada péptido usando un ensayo de proliferación que mide la incorporación de 3[H]-timidina. Los resultados identificaron la presencia de tres posibles epítopes de linfocitos T en las secuencias (epítope 1, 5 y 8). El "epítope 1" presente en la cadena pesada se consideró débil. El "epítope 5" que incluye la mutación A17D fue débil y no se observaron respuestas del donante al péptido relacionado de la secuencia de BAN2401 natural. El "epítope 8" fue el epítope significativo basado en la frecuencia de respuestas de linfocitos T y se identificó en los péptidos de anticuerpos A17D/R79T, A17D/R82S y A17D/R79T/R82S, pero no en BAN2401 o A17D natural.
Los datos del mapeo de epítopes de linfocitos T ex vivo respaldó la conclusión del ensayo de linfocitos T en la evolución temporal de anticuerpos completos de que A17D/R79T y A17D/R79T/R82S están asociados con un aumento del riesgo total de inmunogenicidad. Además, también A17D/R82S (no incluido en el ensayo de linfocitos T de anticuerpo completo) pareció tener un riesgo elevado de inmunogenicidad debido a la mutación R82S en el "epítope 8".
Desinmunización de péptidos identificados como posibles epítopes de linfocitos Tpor mapeo de epítopes de linfocitos T ex vivo
En general, la desinmunización se logra cambiando un único aminoácido en una de las posiciones de anclaje importantes (p1, p4, p6, p7 y p9 de un 9-mero) del posible péptido de unión a la clase II de MHC. Se eligieron las mutaciones de desinmunización específicas en los tres epítopes identificados en el mapeo de péptidos ex vivo (epítope 1,5 y 8) descrito anteriormente. Las sustituciones se eligieron basándose en la afinidad de unión reducida anticipada del péptido por el sitio de unión de la molécula de clase II de MHC. Se probaron dos sustituciones desinmunizantes para cada péptido que se había indicado que era posiblemente inmunogénico, y estos péptidos se analizaron junto con los péptidos originales de BAN2401, A17D, A17d/R79T, A17D/R82S y A17D/R79T/R82S usando la tecnología de mapeo de péptidos Episcreen™.
Se midieron las respuestas de linfocitos T para cada donante contra cada péptido usando un ensayo de proliferación que mide la incorporación de 3[H]-timidina. Los resultados de este estudio confirmaron los resultados previos, pero todos los epítopes (epítope 1, 5 y 8) se consideraron débiles en este estudio (Tabla 4). Sin embargo, todas las sustituciones desinmunizantes redujeron satisfactoriamente el riesgo de inmunogenicidad para los péptidos que cubrían los tres epítopes en comparación con los péptidos originales, con ningún respondedor a linfocitos T o muy pocos (Tabla 4). Esto indica que las sustituciones elegidas fueron eficaces y que las desinmunizaciones fueron satisfactorias.
Tabla 4. Resultados de la desinmunización al nivel de péptido de epítopes identificados como inmunogénicos usando la tecnología de mapeo de epítopes de linfocitos T EpiScreen™. Se muestran los péptidos derivados de BAN2401 y los anticuerpos de la invención que se identificaron como inmunogénicos, y los mismos péptidos con sustituciones de desinmunización introducidos (subrayado). Las mutaciones que mejoran la semivida se muestran en negrita. Se probaron todos los péptidos desinmunizados en el ensayo de linfocitos T ex vivo y los resultados se muestran en la columna derecha (frecuencia de respuesta del donante).
Área de Anticuerpo de origen peptídico y sustituciones de Péptido Frecuencia de epítope desinmunización respuesta (%)
BAN2401 y anticuerpos de la invención* SFGMHWVRQAPGKGL 12
1. A ^N SFGMHWVRQNPGKGL 0
A ^ T SFGMHWVRQTPGKGL 4
Todos los anticuerpos de la invención (mutación A17D) PVTPG DPASISCRSS 16
5. I^ V PVTPG DPASVSCRSS 0
V ^ A PATPGDPASISCRSS 0
A17D/R79T (mutación R79T) SGSGTDFTL TISRVE 16
8. S ^ Q SGSGTDFTL TIQRVE 4
A17D/R79T (mutación R79T) GTDFTL TISRVEAED 20
8. S ^ Q GTDFTL TIQRVEAED 0
A17D/R79T/R82S (mutaciones R79T/R82S) SGSGTDFTL TISSVE 12
8. S ^ Q SGSGTDFTL TIQSVE 0
E ^D SGSGTDFTLTISSVD 0
A17D/R79T/R82S (mutaciones R79T/R82S) GTDFTL TISSVEAED 16
8. S ^ Q GTDFTL TIQSVEAED 0
E ^D GTDFTL TISSVDAED 0
A17D/R82S (mutación R82S) SGSGTDFTLRISSVE 12
8. S ^ Q SGSGTDFTLRIQSVE 0
E ^D SGSGTDFTLRISSVD 4
A17D/R82S (mutación R82S) GTDFTLRISSVEAED 16
8. S ^ Q GTDFTLRIQSVEAED 4
E ^D GTDFTLRISSVDAED 4
*) Anticuerpos no desinmunizados
Diseño y producción de variantes desinmunizadas de A17D/R79T
Se diseñaron ocho variantes desinmunizadas de A17D/R79T basándose en los resultados del mapeo de epítopes de linfocitos T y la desinmunización de péptido descrita anteriormente. En los tres epítopes identificados como posiblemente inmunogénicos, las mutaciones de desinmunización que se mostró que reducían la inmunogenicidad en el mapeo de epítopes de linfocitos T ex vivo se introdujeron en las combinaciones indicadas en la Tabla 5.
Tabla 5. Resumen de las ocho variantes desinmunizadas del doble mutante A17D/R79T. Las mutaciones de desinmunización para los epítopes 1,5 y 8, elegidas y funcionalmente verificadas en el ensayo de linfocitos T ex vivo al nivel de péptido, se indican para los anticuerpos específicos. Se ha usado la numeración del extremo N. VH = cadena pesada variable, VL= cadena ligera variable.
Variantes de Desinmunización en Desinmunización en Desinmunización en A17D/R79T el epítope 1 (VH) el epítope 5 (VL) el epítope 8 (VL)
Ejemplo 6. Caracterización de unión a diana de anticuerpos desinmunizados
La unión de protofibrillas Ap conservadas en ocho variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI1-8) en comparación con BAN2401
Se analizaron los perfiles de unión diana de las ocho variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1-8) junto con BAN2401 (control) por el método de inhibición descrito en el Ejemplo 1 (ELISA de inhibición). Los resultados se presentan en la Figura 4, donde se muestran el análisis de unión y la selectividad por protofibrillas Ap en comparación con monómeros Ap para A17D/R79T_DI 1-8 y BAN2401. Los resultados mostraron que la unión y la selectividad de la unión a protofibrillas Ap en comparación con la unión al monómero Ap se conservó en los anticuerpos de la invención (A17D/R79T_DI 1-8).
Ejemplo 7. Perfil farmacocinético de anticuerpos desinmunizados en ratones
Estudio farmacocinético de BAN2401, A17D/R79Ty ocho variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1-8) en ratones naturales
Para comparar los perfiles FC de las ocho variantes de A17D/R79T desinmunizado (A17D/R79T_DI 1-8) con el perfil FC de BAN2401 y A17D/R79T en ratones naturales, se agruparon ratones hembra C57BL/6 de 8-10 semanas de edad (N=5) y se sometieron a inyecciones i.v. únicas de 10 mg/kg de anticuerpo. Se extrajeron muestras de sangre de los animales después de 0,5 h, 2 días, 7 días, 14 días y 28 días y se analizaron los niveles de BAN2401 y los anticuerpos de la invención por ELISA usando Ap1-40 para la captura e IgG de cabra anti-humana acoplada a HRP para la detección como se describe en el Ejemplo 1 (ELISA directo). Como se muestra en el gráfico de tiempo frente a la concentración en la Figura 5, el perfil FC de los mutantes A17D/R79T desinmunizados (A17D/R79T_DI 1 -8) se parece al perfil FC de A17D/R79T y se diferencia de BAN2401. Los resultados indicaron que tanto ABCü-inf como la semivida terminal de A17D/R79T y las variantes desinmunizadas (A17D/R79T_DI 1-8) fueron potenciadas significativamente en comparación con BAN2401 (Tabla 6). Por tanto, todas las variantes desinmunizadas mostraron un perfil FC mejorado en comparación con BAN2401 y presentaron perfiles FC que fueron similares al perfil FC de A17D/R79T, con elevada exposición y prolongada semivida de depuración.
Tabla 6. Parámetros FC en plasma de BAN2401, A17D/R79T y variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1-8) en ratones. Se calcularon individualmente la semivida y el ABC0-¡nf para todos los anticuerpos para todos los animales por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se sometió a análisis estadístico por ANOVA unilateral seguido por prueba a posteriori de comparaciones múltiples de Bonferroni. Se muestran en la tabla los valores medios de ABC0-inf y las semividas terminales medias. Se indican las diferencias estadísticas en la semivida terminal y ABC0-inf entre BAN2401 y los mutantes en la tabla, donde * indica P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001 y ****P<0,0001.
BAN2401 3,6 3,5
A17D/R79T 38,0**** 10,7**
A17D/R79T_DI 1 42,3**** 13,0***
A17D/R79T_DI 2 40,4**** 10,5**
Anticuerpo ABC
0
-inf (mg* h/mL) Semivida terminal (días)
A17D/R79T_ 44 9**** 12,6***
A17D/R79T_ 43,7**** 127***
A17D/R79T_ 32,6**** 10,4*
A17D/R79T_ 33,4**** 122***
A17D/R79T_ 41 7**** 141****
A17D/R79T 
43,8**** 10,0*
Ejemplo 8. Perfil farmacocinético de anticuerpos desinmunizados en rata
Perfiles farmacocinéticos de BAN2401, A17D/R79Ty ocho variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T DI 1-8) en ratas
Para comparar los perfiles FC de las ocho variantes de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1-8) desinmunizado con el perfil FC de BAN2401 y A17D/R79T en ratas, se agruparon ratas Sprague Dawley hembra de 8 semanas de edad (N=5) y se sometieron a inyecciones i.v. únicas de 10 mg/kg de anticuerpo. Se extrajeron muestras de sangre de los animales después de 0,5 h, 2 días, 7 días, 14 días y 28 días y se analizaron por ELISA los niveles de BAN2401 y los anticuerpos de la invención usando Ap1 -40 para la captura e IgG de cabra anti-humana acoplada a HRP para la detección (Ejemplo 1, ELISA directo).
Como se muestra en la Figura 6, BAN2401, A17D/R79T y las variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1-8) presentaron perfiles FC bastantes similares en rata. Los resultados indicaron que A17D/R79T_DI 1 tuvo una semivida terminal significativamente más larga que BAN2401 en ratas (p<0,05), mientras que el ABC0-inf fue significativamente más grande para A17D/R79T, A17D/R79T_DI 1 y A17D/R79T_DI 4 en comparación con BAN2401 (p<0,01) (Tabla 7).
Tabla 7. Parámetros FC plasmáticos de BAN2401, A17D/R79T y las variantes desinmunizadas de A17D/R79T (A17D/R79T_DI 1-8) en ratas. Se calcularon individualmente la semivida y el ABCü-inf para todos los anticuerpos para todos los animales por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) y se sometió a análisis estadístico por ANOVA unilateral seguido por prueba a posteriori de comparaciones múltiples de Bonferroni. Se muestran en la tabla las ABC medias y las semividas terminales medias. Se indican en la tabla las diferencias estadísticas en la semivida terminal y el ABC entre BAN2401 y los anticuerpos de la invención, donde * indica P<0,05 y ** P<0,01.
Anticuerpo ABC
0
-inf (mg*h/mL) Semivida terminal (días)
BAN2401 35,1 10,2
A17D/R79T 48,6** 11,0
A17D/R79T_ 47,3** 13,3*
A17D/R79T_ 33,7 11,8
A17D/R79T_ 43,1 11,7
A17D/R79T_ 47,3** 11,7
A17D/R79T_ 44,1 11,6
A17D/R79T_ 39,6 11,3
A17D/R79T_ 35,6 11,8
A17D/R79T 
40,9 10,6
Ejemplo 9. Perfil farmacocinético de anticuerpos desinmunizados en mono
Perfiles farmacocinéticos de BAN2401, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8 en macacos cangrejeros.
Para comparar los perfiles FC de A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8 con el perfil FC de BAN2401 en monos, se agruparon macacos cangrejeros macho (N=3) y se sometieron a infusiones i.v. únicas de 5 mg/kg de BAN2401 o 10 mg/kg de los anticuerpos de la invención. Se extrajeron muestras de sangre de los monos inyectados con BAN2401 después de 5 min, 1 h, 2 h, 8 h, 24 h, 2 días, 4 días, 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la administración, mientras que se extrajeron muestras de sangre de los monos inyectados con los anticuerpos de la invención después de 5 min, 2 h, 8 h, 24 h, 3 días, 7 días, 14 días, 21 días y 28 días. Se analizó por ELISA la concentración plasmática de los anticuerpos administrados como se describe en el Ejemplo 1 (ELISA directo). Los perfiles FC se muestran como gráficos de tiempo frente a concentración en la Figura 7, mientras que la semivida y el ABCü-inf para todos los anticuerpos se calcularon por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight) (Tabla 8). Los parámetros FC de BAN2401 mostrados en la Tabla 8 son los resultados de un estudio separado en el que BAN2401 se administró por infusión i.v. a una dosis de 5 mg/kg de BAN2401.
Tabla 8. Parámetros FC en plasma de BAN2401, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8 en macacos cangrejeros. Se calcularon la semivida terminal y el ABC0-inf para todos los anticuerpos por análisis no compartimental usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight). Los parámetros FC de BAN2401 mostrados aquí es de un estudio separado en el que BAN2401 se administró por infusión i.v. a una dosis de 5 mg/kg de BAN2401. Para simplificar las comparaciones de ABC entre BAN2401 y los anticuerpos de la invención, se muestran en la tabla las ABC0-¡nf medias ajustadas a la dosis y los valores de semivida terminal media.
Anticuerpo ABC
0
-inf corregida con la dosis (mg*h/mL) por (mg/kg) Semivida terminal (días)
BAN2401 5,3 12,0
A17D/R79T_ 6,1 12,0
A17D/R79T_ 6,5 12,6
A17D/R79T_ 
7,1 17,2
Ejemplo 10. Escala alométrica simple - ratón, rata y mono con respecto al hombre
Para predecir la semivida humana de los anticuerpos de la invención (aquí mostrada para A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8), se realizaron modelado de 2 compartimentos y escala alométrica simple. Se aplicó un modelo de 2 compartimentos a los perfiles FC en plasma de BAN2401 y los anticuerpos de la invención usando Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight), para estimar los valores de depuración (CL) y el volumen (V) en ratón, rata y mono. Se representaron los valores de CL y V frente al peso corporal y se aplicó una escala alométrica simple (Deng et al. mAbs 2011: 3(1): p. 61-66. doi:10,4161/mabs.3.1.13799). Se calculó la semivida terminal siguiendo la ecuación:
ln( 2) * Volumen
1/2 Depuración
En la escala alométrica simple de volumen o depuración, se representan los valores de los parámetros estimados en especies preclínicas frente al peso corporal. Se usan la constante y el exponente de la línea de regresión para predecir V y CL en el hombre a un peso corporal de 70 kg. Tanto el exponente (que debe ser preferentemente aproximadamente 0,85 para la depuración y 1 para el volumen) como la adherencia a la línea de regresión son medidas de la confianza de la estimación de los parámetros específicos en el hombre.
Como se muestra en la Figura 11, BAN2401 tiene una mala correlación lineal de CL central entre las especies probadas, que da como resultado una escala alométrica simple incierta. La desviación del exponente (que debe ser próxima a 0,85) sugiere que la mala correlación es un efecto de la alta depuración de BAN2401 en ratones. Esto condujo a una subestimación de la CL esperada en el hombre y, por tanto, a una sobreestimación de la semivida terminal predicha. La semivida terminal de BAN2401 se estimó a los 41 días, que se desvió considerablemente de la semivida medida en la clínica (5-7 días). Se ha indicado la CL real de BAN2401 en la Figura 11 (cuadrado blanco). A diferencia de la mala correlación lineal entre ratón, rata y macaco cangrejero para BAN2401, los anticuerpos de la invención (A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/r 79T_DI 8) mostraron una excelente correlación (Figura 11). La semivida terminal calculada a partir de los parámetros FC predichos en el hombre indicó una semivida en seres humanos de 13, 15 y 20 días para A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 y A17D/R79T_DI 8, respectivamente. La escala alométrica simple de volumen (V) indicó una buena correlación lineal y un exponente de aproximadamente 1 para BAN2401 y los anticuerpos de la invención (no mostrados).
Claims (20)
1. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende:
(a) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16;
(b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15;
(c) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15;
(d) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15;
(e) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 15;
(f) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16
(g) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16; o
(h) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
2. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región constante de la cadena pesada de IgG.
3. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en terapia.
4. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedad de Alzheimer y otros trastornos asociados a la agregación de proteína Ap, tal como lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP).
5. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en un método de reducción de la cantidad de protofibrillas Ap en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
6. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en un método de medición de la cantidad de protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada en una persona, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y medir la cantidad de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo unido a dichas protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada.
7. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en un método de diagnóstico de enfermedad de Alzheimer en personas que tienen o están en riesgo de desarrollar la enfermedad, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o un fragmento del mismo, y medir la cantidad de dicho anticuerpo unido a la proteína Ap agregada.
8. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en un método de diagnóstico de lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica,
aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP) en personas que tienen o están en riesgo de desarrollar cualquiera de dichas enfermedades, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vivo, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y medir la cantidad de dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo unido a la proteína Ap agregada.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, junto con excipiente farmacéuticamente aceptable y/o diluyentes.
10. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para uso veterinario.
11. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene afinidad contra protofibrillas Ap, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12 y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16.
12. El anticuerpo según la reivindicación 11, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región constante de la cadena pesada de IgG.
13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o diluyente.
14. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 para su uso en un método de reducción de la cantidad de protofibrillas Ap en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
15. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 para su uso en un método para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer u otro trastorno asociado a la agregación de proteína Ap en un sujeto que tiene dicha enfermedad o trastorno, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
16. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 para su uso en un método para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer en un sujeto que tiene enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
17. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, para su uso en terapia.
18. Un método in vitro de medición de la cantidad de protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada en una persona, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vitro, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y medir la cantidad de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo unido a dichas protofibrillas Ap y/o proteína Ap agregada.
19. Un método in vitro de diagnóstico de enfermedad de Alzheimer en personas que tienen o están en riesgo de desarrollar la enfermedad, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vitro, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o un fragmento del mismo, y medir la cantidad de dicho anticuerpo unido a la proteína Ap agregada.
20. Un método in vitro de diagnóstico de lesión cerebral traumática (LCT), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), síndrome de Down (SD), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal, tauopatías, amiloidosis sistémica, aterosclerosis y demencia por enfermedad de Parkinson (DEP) en personas que tienen o están en riesgo de desarrollar cualquiera de dichas enfermedades, que comprende poner en contacto tejido o líquido corporal de la persona, in vitro, con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y medir la cantidad de dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo unido a la proteína Ap agregada.
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