KR20210143858A - 피로글루타메이트 아밀로이드-β에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3pE Aβ에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법 및 사용 방법을 제공하며, 이러한 방법에는 제형, 투여 및 키트에 있어서의 사용이 포함된다. 상기 항체 및 이의 항원-결합 단편 및 개시된 방법은 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 또는 다른 β-아밀로이드-관련 질병의 진단, 예후 및 치료에 유용하다.

Description

피로글루타메이트 아밀로이드-β에 대한 항체 및 이의 용도

본 발명은 아밀로이드-베타(Aβ) 펩티드에 대해 유도되는 항체 및 상기 항체를 사용하는 치료적 방법의 분야에 관한 것이다. 구체적으로는, 항체는 아밀로이드-관련 장애를 확인하고 치료하는 데 사용될 수 있다.

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원은 파일명이 "JAB7013USPSP Sequence Listing"이고, 작성일이 2019년 3월 11일이며, 크기가 76 kb인 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

임상적으로 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)은 기억, 인지, 사고, 판단, 및 감정적 안정성의 점진적인 상실로 인하여 점진적으로 극심한 정신 황폐(mental deterioration) 및 궁극적으로 사망에까지 이르게 하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌 장애이다. 알츠하이머병은 노령자에서의 진행성 정신 부전(치매)의 일반적인 원인이다. 알츠하이머병은 전세계적으로 관찰되어 왔으며 주요 공중 보건 문제를 나타낸다. 이 질병은 미국에서만 500만명 초과의 개인이 이환된 것으로 현재 추정된다. 현재, 그것은 불치성이며, 어떠한 치료도 AD를 효과적으로 예방하거나 그의 증상 또는 경과를 역전시키지 못한다.

AD를 가진 개체의 뇌에는 아밀로이드 플라크, 아밀로이드 혈관병증(혈관 내 아밀로이드 침착) 및 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangle)로 명명되는 특징적인 병변이 나타난다. 다수의 이들 병변, 특히 신경섬유 농축체 및 아밀로이드 플라크가 기억 및 인지 기능에 중요한 뇌의 몇몇 영역에서 일반적으로 발견된다. 아밀로이드 플라크 및 아밀로이드 혈관병증이 또한 삼염색체성(Trisomy) 21(다운증후군), 미만성 루이소체병, 및 네덜란드형의 아밀로이드증을 동반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)을 갖는 개체의 뇌의 특징이 된다.

아밀로이드 플라크의 주 성분은 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 절단에 의해 생성되는 다양한 아밀로이드-베타(Aβ) 펩티드이다. 뇌에서의 Aβ 펩티드의 침착은 AD로 이어지는 질병 캐스케이드에서 조기에 필요한 단계인 것으로 가설화된다. 변경된 Aβ 생성을 가져오고 가족성 조발성 AD를 야기하는 아밀로이드 전구체 단백질 및 프레세닐린 유전자에서의 돌연변이의 확인은 변경된 아밀로이드 대사가 이 질병의 기저가 되는 병원성 과정에서 중요한 사건이라는 강력한 증거를 제공한다.

제3 잔기에 피로글루타메이트를 갖는 아밀로이드-β 펩티드(3pE Aβ)가 AD 환자의 뇌에 침착되는 주요 종이다. 3pE Aβ는 AD에서 거의 모든 확산 및 성숙 플라크에 존재하고, 대사적으로 안정하며, 플라크 시딩(seeding) 및 안정화 둘 모두에서 역할을 할 수 있다(문헌[Cynis et al., Molecular Neurodegeneration, 2016; 11:48]). CSF 또는 혈장에서는 검출가능한 양의 3pE Aβ가 보고되지 않았는데, 이로써 표적 펩티드가 병리학으로 특이적임을 시사한다(문헌[DeMattos et al., Neuron, 2012; 76:1-13]). 3pE Aβ에 선택적으로 결합하는 항체가 면역요법에 유용할 수 있다.

구체화되고 완전히 설명된 바와 같이, 본 발명은 제3 잔기에 피로글루타메이트를 갖는 아밀로이드-β(3pE Aβ)에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편, 3pE Aβ에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법, 그러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 검정 방법, 및 알츠하이머병 및 다른 β-아밀로이드-관련 질병의 적어도 하나의 병리 또는 증상의 치료, 발병의 지연, 또는 역전을 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서의 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 3pE를 함유하지 않는 Aβ 펩티드에 비하여 3pE를 함유하는 Aβ 펩티드에 우선적으로 결합한다.

특히, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본 명세서에 기재되며, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며:

a. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6;

b. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5, 및 6;

c. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 8, 5, 및 6;

d. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 8, 5, 및 6;

e. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 8, 5, 및 6;

f. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6;

g. 각각 서열 번호 56, 58, 3, 4, 5, 및 6;

h. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 8, 5, 및 6;

i. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5, 및 6;

j. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6;

k. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 4, 5, 및 6;

l. 각각 서열 번호 1, 58, 3, 4, 5, 및 6; 또는

m. 각각 서열 번호 56, 2, 3, 4, 5, 및 6;

상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 3pE Aβ, 바람직하게는 인간 3pE Aβ에 특이적으로 결합한다.

소정 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 또는 21과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 서열 번호 10, 12, 14, 18, 22, 53, 또는 55와 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

소정 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은

a. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 22의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

b. 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

c. 서열 번호 11의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

d. 서열 번호 13의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

e. 서열 번호 15의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

f. 서열 번호 16의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

g. 서열 번호 20의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

h. 서열 번호 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

i. 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

j. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 53의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는

k. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 55의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

소정 실시 형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 형태이다. 소정 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화 형태이다.

소정 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체는

a. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;

b. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;

c. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 52를 포함하는 경쇄 아미노산 서열; 또는

d. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 54를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

소정 실시 형태에서, 항원-결합 단편은 Fv, F(ab'), F(ab')2 및 scFv로 이루어진 단편들의 군으로부터 선택된다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다른 Aβ 펩티드 또는 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 대한 교차-반응성이 거의 없거나 전혀 없이, 3pE Aβ 펩티드(예를 들어, Aβ3pE-40 및 Aβ3pE-42)에 선택적으로 결합한다.

본 명세서에 개시된 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산이 또한 제공된다.

본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 또한 제공된다.

본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 하이브리도마가 또한 제공된다.

소정 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성과 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정 실시 형태에서, 질환은 알츠하이머병이다. 소정 실시 형태에서, 질환은 삼염색체성 21(다운증후군)과 관련된 치매, 미만성 루이소체병, 봉입체 근염, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 및 네덜란드형의 아밀로이드증을 동반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

알츠하이머병과 관련된 플라크의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 플라크를 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

3pE Aβ의 시딩 활성(seeding activity)의 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 시딩 활성을 예방하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에서 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물을 생성하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 약제학적 조성물을 얻는 단계를 포함한다.

일 실시 형태는 전술된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트 및 장치를 포함한다.

본 발명의 추가의 목적, 특징, 및 이점이 하기의 바람직한 실시 형태의 상세한 고려로부터 당업자에게 명백할 것이다.

도 1은 인간 Aβ(3pE-40) 펩티드에 대한 BAMB31_2a(mIgG2a)의 친화성 결합 상호작용의 표면 플라즈몬 공명 무표지 검출로부터의 센서그램(단회 사이클 속도론)이다. 회색 트레이스는 이중-참조 공제된 데이터를 나타내는 반면, 흑색 트레이스는 적합화된 값을 나타낸다.
도 2는 인간 Aβ(3pE-40) 펩티드에 대한 mE8c mIgG2a의 친화성 결합 상호작용의 표면 플라즈몬 공명 무표지 검출로부터의 센서그램(단회 사이클 속도론)이다. 회색 트레이스는 이중-참조 공제된 데이터를 나타내는 반면, 흑색 트레이스는 적합화된 값을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3i는 비교기준물 HFA 분자와 대비하여 BAMB674 및 BAMB675에 대하여, 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 유전자도입 마우스 뇌 조직에서 면역조직화학에 의해 분석된 바와 같은 플라크에 대한 반응성을 나타낸다. 1차 항체 농도 0.05 ㎍/mL에 대한 결과가 나타나 있다. 화살표는 BAMB674 및 BAMB675에 대한 플라크 표지화의 영역을 나타낸다. (A) BAMB674; (B) BAM675; (C) 항체 I; (D) 항체 II; (E) B12L; (F) CI-C7; (G) hE8L; (H) R17L; (I) R17.
도 4a 및 도 4b는 샌드위치 ELISA에서 합성 인간 Aβ 펩티드의 검출에 의해 밝혀진 바와 같이 BAMB1_1 선택성을 입증하는 그래프를 나타낸다. (A) Aβ1-40, (B) AβpE11-40.
도 5a 내지 도 5f는 (도 5a 및 도 5b) BAMB246(huIgG1 키메라), (도 5c 및 도 5d) BAMB674 및 (도 5e 및 도 5f) BAMB675에 대하여, 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 유전자도입 마우스 뇌 조직에서의 면역조직화학에 의한 플라크에 대한 반응성을 나타낸다. 작은 삽입 패널은 염색된 전체 뇌 절편 및 확대된 영역을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 2개의 상이한 배율의 (도 6a, 도 6c) 4G8 및 (도 6b, 도 6d) BAMB31_2a(mIgG2a)에 대하여, 동결보존된 AD 뇌 조직에서의 면역조직화학에 의한 플라크에 대한 반응성을 나타낸다.
도 7은 유전자도입 마우스에서의 단회 20 mg/㎏ 복막내(i.p.) 용량 후의 상이한 시점에서의 혈청 항체 농도를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 8은 페를스(Perls) 양성 세포의 수의 평가에 의해, PDAPP 마우스에서의 동종형 대조군 및 BAMB31_2a(mIgG2a) 항체에 의한 만성 처리 후의 미세출혈을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 9는 Aβ1-x를 검출하는 면역검정에 의해 측정된, PDAPP 마우스의 해마에서의 동종형 대조군 및 BAMB31_2a(mIgG2a) 항체에 의한 만성 처리 후의 아밀로이드 부하를 보여주는 그래프를 나타낸다. 회색으로 나타낸 값은 이 검정의 검출 한계 미만의 데이터 포인트를 나타낸다.
도 10은 BAMB674 및 BAMB675 원숭이 PK 특성화에 대한 2-구획 모델의 개략도를 도시한다.
도 11은 BAMB674 및 BAMB675에 대한 PK vs. 관찰된 데이터를 보여주는 그래프를 나타낸다. 사이노몰거스 원숭이에서의 25 mg/㎏의 정맥내(i.v.) 볼루스 투여 후의 야생형 IgG1(WT 혈청) 및 +YTE IgG1(YTE 혈청) 동종형으로서의 BAM31 HFA mAb의 혈청 수준. 항-Aβ 3pE 항체(3pE-AB) ㎍/ml 농도가 X-축 상의 일 단위로의 시간 경과에 따라 Y-축 상에 로그 척도로 나타나 있다. 각각의 mAb에 대한 계산된 반감기(t1/2)가 삽입된 텍스트 상에 나타나 있다.
도 12는 BAMB674 및 BAMB675에 대해 관찰된 뇌 농도를 보여주는 그래프를 나타낸다. 사이노몰거스 원숭이에서의 25 mg/㎏의 i.v. 볼루스 투여 후의 야생형 IgG1(WT 뇌) 및 +YTE IgG1(YTE 뇌) 동종형으로서의 BAMB31 HFA mAb의 일수 7 및 일수 42 뇌 용해물 수준. 항-Aβ 3pE 항체(3pE-AB) ㎍/ml 농도가 X-축 상의 일 단위로의 시간 경과에 따라 Y-축 상에 로그 척도로 나타나 있다.

다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술의 일부를 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.

본 발명은 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 한정되지 않으며, 이는 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 사용되는 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태(부정 관사 및 정관사)는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.

달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 일련 내의 각각의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일반적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 구체적인 실시 형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명에 의해 포함되도록 의도된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "구비하다", "구비하는", "갖는다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는", 또는 이들의 임의의 다른 변형은 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군의 배제를 내포하지 않는 것으로 이해될 것이며, 비배타적 또는 개방형(open-ended)인 것으로 의도된다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소들만으로 제한되지는 않고, 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 고유하거나 명시적으로 열거되어 있지 않은 다른 요소들을 포함할 수 있다. 또한, 명시적으로 반대로 기재되어 있지 않는 한, "또는"은 배타적 '또는'이 아니라 포괄적 '또는'을 지칭한다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A가 참(또는 존재함)이고 B가 거짓(또는 존재하지 않음)임, A가 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B가 참(또는 존재함)임, A 및 B 둘 모두가 참(또는 존재함)임.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 선택지 및 조합된 선택지 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 제1 선택지는 제2 요소 없이 제1 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제2 선택지는 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제3 선택지는 제1 요소와 제2 요소가 함께 적용가능함을 지칭한다. 이들 선택지 중 어느 것이든 하나는 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 선택지 중 하나 초과의 동시 적용가능성 또한 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~로 이루어진다", 또는 변형, 예컨대 "~로 이루어지다" 또는 "~로 이루어진"은, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 임의의 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 나타내지만, 추가의 정수 또는 정수들의 군이 명시된 방법, 구조, 또는 조성물에 추가될 수 없다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~로 본질적으로 이루어진다", 또는 변형, 예컨대 "~로 본질적으로 이루어지다" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"은, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 임의의 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함, 및 명시된 방법, 구조 또는 조성물의 기본적 또는 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 언급된 정수 또는 정수들의 군의 선택적인 포함을 나타낸다. 문헌[M.P.E.P. § 2111.03]을 참조한다.

항체

본 발명은 3pE를 함유하지 않는 Aβ 펩티드에 비하여 특히 우선적으로 3pE Aβ 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 3pE Aβ 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법, 및 3pE Aβ 펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 하이브리도마를 생성하는 방법이 추가로 제공된다. 본 발명은 또한 개체에서 알츠하이머병 및 다른 β-아밀로이드-관련 질병을 치료하는 방법, 알츠하이머병 또는 다른 β-아밀로이드-관련 질병과 관련된 플라크를 제거하는 방법, 및 3pE Aβ의 플라크 시딩 활성을 예방하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 기재된 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트 및 장치를 제공한다.

특정 태양에 따르면, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며:

a. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6;

b. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5, 및 6;

c. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 8, 5, 및 6;

d. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 8, 5, 및 6;

e. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 8, 5, 및 6;

f. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6;

g. 각각 서열 번호 56, 58, 3, 4, 5, 및 6;

h. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 8, 5, 및 6;

i. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5, 및 6;

j. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6;

k. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 4, 5, 및 6;

l. 각각 서열 번호 1, 58, 3, 4, 5, 및 6; 또는

m. 각각 서열 번호 56, 2, 3, 4, 5, 및 6;

상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 3pE Aβ, 바람직하게는 인간 3pE Aβ에 특이적으로 결합한다.

다른 특정 태양에 따르면, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 또는 21과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 서열 번호 10, 12, 14, 18, 22, 53, 또는 55와 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 특정 태양에 따르면, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은

l. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 22의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

m. 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

n. 서열 번호 11의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

o. 서열 번호 13의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

p. 서열 번호 15의 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 14의 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역;

q. 서열 번호 16의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

r. 서열 번호 20의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

s. 서열 번호 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

t. 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

u. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 53의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는

v. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 55의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 58, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 2, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 58, 3, 4, 5 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 21과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 22 또는 53 또는 55와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 22 또는 53 또는 55의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 58, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 2, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 58, 3, 4, 5 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 20과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 20의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 19와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 17과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 16과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 16의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 15와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 15의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 13과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 13의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 7, 3, 8, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 57, 3, 8, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 7, 3, 8, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5, 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 11과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 11의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 1, 7, 3, 8, 5 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 57, 3, 8, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 56, 7, 3, 8, 5, 및 6, 또는 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5, 및 6의 폴리펩티드 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 9와 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상, 예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 10의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 특정 태양에서, 단리된 단일클론 항체는

a. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;

b. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;

c. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 52를 포함하는 경쇄 아미노산 서열; 또는

d. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 55를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

다른 특정 태양에 따르면, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 형태이다.

다른 특정 태양에 따르면, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화 형태이다.

다른 특정 태양에 따르면, 본 발명은 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항원-결합 단편은 Fv, F(ab'), F(ab')2 및 scFv로 이루어진 단편들의 군으로부터 선택된다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다른 Aβ 펩티드 또는 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 대한 교차-반응성이 거의 없거나 전혀 없이, 3pE Aβ 펩티드(예를 들어, Aβ3pE-40 및 Aβ3pE-42)에 선택적으로 결합한다.

다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 단백질의 코딩 서열을 변화시킬(예를 들어, 대체, 결실, 삽입 등을 할) 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 변경시킬 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터, 또는 바이러스 벡터와 같은, 본 발명을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 재조합 발현 벡터, 예컨대 플라스미드이다. 벡터는 발현 벡터의 통상적인 기능을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 요소, 종결자, 인핸서, 선택 마커, 및 복제 기점을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 세포에 핵산을 전달할 수 있는 다수의 발현 벡터가 당업계에 알려져 있으며, 세포에서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성을 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 통상적인 클로닝 기법 또는 인공 유전자 합성이 본 발명의 실시 형태에 따른 재조합 발현 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다.

다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 숙주 세포가 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 재조합 발현에 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 E. 콜라이(E. Coli) TG1 또는 BL21 세포(예를 들어, scFv 또는 Fab 항체의 발현용), CHO-DG44 또는 CHO-K1 세포 또는 HEK293 세포(예를 들어, 전장 IgG 항체의 발현용)이다. 특정 실시 형태에 따르면, 재조합 발현 벡터는 통상적인 방법, 예컨대 화학적 형질감염, 열 충격, 또는 전기천공에 의해 숙주 세포 내로 형질전환되며, 여기서 그것은 재조합 핵산이 효과적으로 발현되도록 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합된다.

다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에서 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 (예를 들어, 상층액으로부터의) 상기 세포 또는 세포 배양물로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다. 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포로부터 수집되고, 당업계에 알려져 있고 본 명세서에 기재된 바와 같은 통상적인 기법에 따라 정제될 수 있다.

본 발명은 3pE Aβ에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 명세서에서, 용어 "항체"는 항원 또는 이의 일부분에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질, 특히 3pE Aβ에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 지칭한다. 항원에 대한 항체 결합은 당업자에게 알려진 방법에 의해 측정될 수 있으며, 한 예는 BIAcore™ 기기의 사용이다. 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 해리 상수가 1 μM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하, 그리고 가장 바람직하게는 10 nM 이하일 때 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 되어 있다.

항체의 항원-결합 단편은, 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합할 수 있고 항원 결합을 위하여 온전한 항체와 경쟁하는, 항체의 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 항원 결합을 가능하게 하는 온전한 항체의 일부분(즉, 온전한 항체의 가변 영역)이다. 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFV-dsFv'), 단일쇄 항체 분자(예를 들어, scFV), 다이아바디(diabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody), 선형 항체, 단일 도메인 항체(sdab), 낙타화(camelized) 단일 도메인 항체, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체, 및 항원에 결합하지만 완전 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.

항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 도메인 또는 영역(V_H), 뒤이어 불변 도메인 또는 영역(C_H1), 힌지 영역, 및 2개의 추가의 불변 도메인 또는 영역(C_H2 및 C_H3)을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 가변 도메인 또는 영역(V_L) 및 하나의 불변 도메인 또는 영역(C_L)을 갖는다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 또는 영역은 항체의 파라토프(자물쇠와 유사한 구조)를 형성하는데, 이는 특정 에피토프(열쇠와 비슷하게 유사함)에 특이적이어서, 파라토프와 에피토프가 정밀하게 함께 결합될 수 있게 한다. 가변 도메인 내에서, 3개 각각이 경쇄 및 중쇄 상에 있는 β-가닥의 가변 루프들은 항원에 대한 결합을 담당한다. 이들 루프는 상보성 결정 영역(CDR, 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로 지칭된다.

CDR은 항체의 상보성 결정 영역으로서 정의된다. 이들은 항체 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로서, 이러한 초가변 영역은 항원에 대한 결합을 주로 담당한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각에 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)이 존재한다. 경쇄 가변 상보성 결정 영역은 대안적으로 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로 지칭되며, 중쇄 가변 상보성 결정 영역은 대안적으로 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3으로 지칭된다. 항체의 CDR은 다수의 방식으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 가변 영역 내의 CDR은 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), IMGT 및/또는 당업계에 잘 알려진 입체형태 정의 또는 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인될 수 있다. 항체 CDR은 카바트에 의해 최초로 정의된 초가변 영역(문헌[Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]), 초티아에 의해 최초로 기재된 구조적 루프 구조(문헌[Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)]), 또는 IMGT의 특유의 넘버링 체계(문헌[Lefranc, The Immunologist 7:132-136 (1999)]; 문헌[Lefranc, et al., Nucleic Acids Res. 27:209-212 (1999)]; 문헌[Scaviner et al., Exp. Clin. Immunogenet. 16:234-240 (1999)]; 문헌[Lefranc, et al., Nucleic Acids Res. 43:D413-422 (2015)])로서 확인될 수 있다.

항체와 관련하여 사용될 때 "단리된"은 임의의 천연 상태로부터 "사람의 손에 의해" 변경된 것을 의미하며; 즉, 그것이 천연에서 발생한다면, 그것은 그의 원래 환경으로부터 변화 또는 제거되었거나, 또는 이들 둘 모두가 행해진 것이다. 예를 들어, 천연 상태에서 살아있는 동물 내에 천연적으로 존재하는 천연 발생 항체는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 분리된 동일한 항체는 "단리된" 것으로, 이는 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같으며, 예를 들어, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭할 수 있다(즉, 3pE Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 3pE Aβ에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없다). 항체는 천연 발생 조성물이 아닌 조성물, 예컨대 면역검정 시약 내에 존재할 수 있으며, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 그 용어의 의미 내에서 단리된 항체로 그 안에 남아 있다.

항체의 생성 방법은 숙주에 원하는 면역원을 접종하는 단계를 포함한다. 적합한 숙주는 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 닭, 당나귀, 말, 원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 고릴라, 인간, 및 성숙한 면역 반응을 갖출 수 있는 임의의 종을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 면역화 절차는 당업계에 잘 확립되어 있으며, 문헌["The Immunoassay Handbook," 2nd Edition, edited by David Wild (Nature Publishing Group, 2000)]을 비롯한 다수의 논문 및 간행물에 기술되어 있다.

바람직하게는, 본 발명의 특징을 구현하는 면역원이 애쥬번트(adjuvant)와 배합하여 숙주 대상체, 예를 들어 동물 또는 인간에게 투여된다. 적합한 애쥬번트는 프로인트(Freund) 애쥬번트, 분말형 수산화알루미늄(명반), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)와 함께 수산화 알루미늄, 및 모노포스포릴 지질 A-합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트(MPL-TDM)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

전형적으로, 면역원 또는 면역원과 애쥬번트의 배합물이 1회 또는 다회의 피하 또는 복막내 주사에 의해 포유류 숙주 내로 주사된다. 바람직하게는, 면역화 프로그램은 적어도 1주에 걸쳐, 그리고 더 바람직하게는 2주 이상에 걸쳐 수행된다. 이러한 방식으로 생성된 다중클론 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 단리되고 정제될 수 있다.

단일클론 항체는 코흘러 및 밀스테인(Kohler and Milstein)(예를 들어, 문헌[Nature 256:495-497 (1975)])의 잘 확립된 하이브리도마 방법에 의해 생성될 수 있다. 하이브리도마 방법은 전형적으로 숙주 또는 숙주 유래 림프구를 면역화하는 단계, 림프구를 분비하거나 그것을 분비할 잠재성을 갖는 단일클론 항체를 수확하는 단계, 림프구를 면역화된 세포에 융합시키는 단계; 및 원하는 단일클론 항체를 분비하는 세포를 선택하는 단계를 수반한다.

숙주는 면역원에 특이적인 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하도록 면역화될 수 있다. 대안적으로, 림프구는 시험관내(in vitro)에서 면역화될 수 있다. 인간 세포가 요구되는 경우, 말초 혈액 림프구가 사용될 수 있지만, 다른 포유류 공급원 유래 림프구 또는 비장 세포가 바람직하다.

림프구는 불멸화된 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성할 수 있으며, 이 과정은 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜의 사용에 의해 용이해질 수 있다. 예시로서, 형질전환에 의해 불멸화된 돌연변이 설치류, 소, 또는 인간 골수종 세포가 사용될 수 있다. 융합되지 않은 불멸화 세포와 대립되는 것으로서, 하이브리도마 세포의 실질적으로 순수한 집단이 바람직하다. 따라서, 융합 후, 세포는, 예를 들어 효소 하이포잔탄 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT)가 결여된 돌연변이 골수종 세포를 사용함으로써, 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 적합한 배지 중에서 성장될 수 있다. 그러한 경우에, 하이브리도마가 성장될 수 있게 하면서 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하기 위하여, 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘이 배지(HAT 배지)에 첨가될 수 있다.

바람직하게는, 효율적으로 융합되는 불멸화 세포는 융합 후에 항체의 안정한 고수준 발현을 지지하는 HAT와 같은 배지 중에서 선택함으로써 혼합 집단으로부터 단리될 수 있다. 바람직한 불멸화 세포주는 미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수가능한 골수종 세포주를 포함한다.

본 발명의 일 태양은 아밀로이드 베타 펩티드에 결합하는 단일클론 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포주를 생성하는 방법이다. 그러한 방법은 당업자에게 일반적으로 알려져 있으며, 일반적으로 (i) 항체 생성을 위한 숙주를 선택하는 단계; (ii) 상기 숙주에 원하는 면역원을 접종하는 단계; (iii) 접종된 숙주 유래 세포주를 연속 분할 세포와 융합하여, 상기 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 생성할 수 있는 융합된 세포를 생성하는 단계; 및 (iv) 상기 융합된 세포를 클로닝하여 하이브리도마 세포주를 얻는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 3pE Aβ 펩티드에 결합하는 단일클론 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포주를 생성하는 단계를 포함한다. 하이브리도마는 프로인트 애쥬번트 중의 원하는 면역원, 예컨대 피로글루타메이트를 갖는 Aβ 펩티드의 초기 복막내 주사에 이어서, 예를 들어 매 1주 내지 2주마다의 부스터 주사에 의해 하이브리도마가 생성될 수 있는 동물, 예컨대 Balb/c 마우스를 면역화함으로써 생성될 수 있다. 단리된 비장의 후속 융합은 당업자에게 일반적으로 알려진 임의의 기법을 사용하여, 바람직하게는 코흘러 및 밀스테인(문헌[Eur. J. Immunol., 1976; 6:292-295])의 변형된 절차에 의해 SP2/0 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 3pE Aβ 펩티드에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마를 결정하기 위해 하이브리도마는 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 표준 검정, 예컨대 ELISA 또는 RIA 검정으로 행해질 수 있다. 본 발명의 일 태양은 단일클론 항체 BAMB31_1 또는 이의 인간화 버전을 생성하는 하이브리도마 세포주를 생성하는 방법이다.

단일클론 항체는 또한, 예를 들어 미국 특허 제4,166,452호에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA를 통상적인 절차를 사용하여, 예를 들어, 바람직하게는 피로글루타메이트를 갖는 Aβ에 특이적인 항체를 분비하는 단일클론 항체 하이브리도마 세포주로부터 단리된 DNA를 프로브하기 위한, 뮤린 중쇄 및 경쇄 항체 사슬 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 단리하고 서열분석할 수 있다.

아밀로이드 베타 펩티드에 대한 특이적 결합 부위를 함유하는 항체 단편이 또한 생성될 수 있다. 그러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편, 및 F(ab')₂ 단편의 이황화물 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 대안적으로, 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 하도록 Fab 발현 라이브러리가 구축될 수 있다(문헌[Huse et al., Science 256:1270-1281 (1989)]). Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현되고 그로부터 분비되어, 다량의 이들 단편의 생성을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편이 E. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다(문헌[Carter et al., BioTechnology 10:163-167 (1992)]). 항체 단편의 생성을 위한 다른 기법이 당업자에게 알려져 있다. 단일쇄 Fv 단편(scFv)이 또한 고려된다(예를 들어, 미국 특허 제5,761,894호 및 제5,587,458호 참조). Fv 및 sFv 단편은 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 갖는 유일한 종이며; 따라서, 이들은 감소된 비특이적 결합을 나타낼 가능성이 높다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 제5,642,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 언급된 하이브리도마 세포에 의해 발현되는 단리된 단일클론 항체를 제공하는 것이며, 상기 항체는 3pE Aβ를 특이적으로 인식할 수 있다. 단리된 단일클론 항체는 하이브리도마 세포에 의해 발현되거나 재조합적으로 발현될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 3pE를 갖지 않는 다른 Aβ, 또는 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 대한 교차-반응성이 거의 없거나 전혀 없이, 3pE Aβ에 선택적으로 결합한다. 특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다른 3pE 비함유 Aβ 펩티드 또는APP에 대한 교차-반응성이 거의 없거나 전혀 없이, Aβ 3pE-40(서열 번호 40 또는 서열 번호 45) 및 Aβ 3pE-42(서열 번호 51) 펩티드에 선택적으로 결합한다.

표 1은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 제공한다. 카바트, 초티아 및 IMGT에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR은 별개의 서열로서 기재되어 있다.

[표 1]

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 항-3pE Aβ 항체 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 3pE Aβ 폴리펩티드 및 이를 인코딩하는 3pE Aβ 폴리뉴클레오티드)과 관련하여, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 시각적 검사에 의해, 또는 하기 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이, 최대 일치도(maximum correspondence)에 대해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.

서열 비교를 위하여, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열의 비교 대상이 되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열과 대비하여 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 스미스 및 워터만 (문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)])의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 니들만 및 분쉬 (문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)])의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨 및 립만 (문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)])의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산화 구현 (미국 위스콘신주 매디슨, 575 사이언스 드라이브 소재의 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 시각적 검사(전반적으로, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양성-값의 임계치 점수 T와 일치하거나 이를 만족하는, 질의 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 식별함으로써 높은 점수의 서열 쌍(HSP: high scoring sequence pair)을 식별하는 단계를 수반한다. T는 이웃 단어 점수 임계치(상기 문헌[Altschul et al])로 지칭된다. 이들 초기 이웃 단어 히트는 검색을 개시하여 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 종자로서 작용한다. 이어서, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양 방향으로 단어 히트를 연장한다.

뉴클레오티드 서열의 경우, 누적 점수를 파라미터 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(일치하지 않는 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 점수 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향으로의 단어 히트의 연장은, 누적 정렬 점수가 이의 달성된 최대 값으로부터 X의 양만큼 떨어질 때; 누적 점수가 하나 이상의 음성-점수 잔기 정렬의 집적으로 인해 0 또는 그 아래가 될 때; 또는 서열의 말단에 도달할 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로 3의 단어 길이(W), 10의 예상치(E) 및 BLOSUM62 점수 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조)를 사용한다.

퍼센트 서열 동일성을 계산하는 단계에 더하여, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 일 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가의 지표는, 하기에 기재된 바와 같이, 제1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드가 전형적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 경우는, 예를 들어 이들 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우뿐이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 지표는 2개의 분자가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화되는 것이다.

시험관내 방법

항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 모든 면역검정 방식이 본 바람직한 실시 형태에 따른 사용에 있어서 고려됨이 이해되어야 하며, 이러한 면역검정에는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 고체상(solid phase)에 결합되어 있는 검정 및 항체가 액체 배지 중에 존재하는 검정이 포함된다. 본 발명의 특징을 구현하는 항체를 사용하여 분석물을 검출하는 데 사용될 수 있는 면역검정 방법은 표지된 분석물(분석물 유사체)과 샘플 내의 분석물이 항체에 대해 경쟁하는 경쟁적(시약 제한된) 검정 및 항체가 표지된 단일-부위 면역측정 검정 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 β-아밀로이드-관련 질병을 모니터링하기 위한 생물학적 샘플 및 APP의 세포내 처리를 모니터링하기 위한 세포 배양물로부터의 컨디셔닝된 배지를 포함한, Aβ3pE가 발생될 수 있는 곳은 어디든지 Aβ3pE의 검출을 위한 통상적인 면역학적 기법에서 사용될 수 있다. 적합한 면역학적 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석, 경쟁적 또는 샌드위치 면역검정 등을 포함하며, 달리 잘 알려져 있는 바와 같이, 이들은 모두 항원-항체 면역 복합체의 형성에 의존하는데, 여기서는 이 검정의 목적상, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들어 방사성, 효소, 발광 또는 형광 표지로 검출가능하게 표지될 수 있거나, 또는 그것은 불용성 담체 상에 고정화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 샘플에서 Aβ3pE 또는 이의 단편의 결정 또는 검출을 위한 면역검정을 제공하는 것으로, 상기 방법은 상기 샘플을 본 발명에 따른 Aβ3pE 또는 이의 단편에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및 면역 복합체가 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 상기 Aβ3pE 또는 이의 단편 사이에 형성되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 조직 샘플 또는 체액 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 일반적으로 대상체의 신체로부터 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플을 본 발명에 따른 검출가능하게 표지된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 이미징 유효량과 접촉시키는 단계; 및 상기 표지를 검출하여 상기 샘플에서 Aβ3pE 또는 이의 단편의 존재를 확립하는 단계를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 측정 방법은 특별히 제한되지 않는다. 측정되는 용액 중의 항원의 양, 특히 Aβ3pE 또는 이의 단편의 양에 상응하는 항체, 항원, 또는 항원-항체 복합체의 양이 화학적 또는 물리적 수단에 의해 검출되고, 기지량의 항원을 함유하는 표준 용액의 사용에 의해 작성된 표준 곡선으로부터 계산되는 한 임의의 측정 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 네펠로메트리(nephelometry), 경쟁적 방법, 면역측정 방법 및 샌드위치 방법이 적합하게 사용된다. 감도 및 특이성에 관해서는, 샌드위치 방법을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

샌드위치 방법에서는, 시험 용액을 불용화된 항체, 예컨대 불용화된 항-Aβ3pE 항체와 반응시키고(제1 반응), 추가로, 표지된 2차 항체를 반응시키고(제2 반응); 이어서, 불용화된 담체 상의 표지제(labeling agent)의 활성을 검정하여, 시험 용액 중의 Aβ3pE 또는 이의 단편의 양을 결정할 수 있다. 제1 반응과 제2 반응은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

측정 방법에서는, 표지 물질, 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 표지제로서 사용된다. 방사성 동위원소의 예에는 ¹²⁵1, ¹³¹I, ³H 및 ¹⁴C가 포함된다. 효소는 적절한 기질의 컨쥬게이션에 의해 통상 검출가능하며, 기질은 다시, 검출가능한 반응을 촉매한다. 이의 예에는, 예를 들어 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 및 말레이트 데하이드로게나제, 바람직하게는 서양고추냉이 퍼옥시다제가 포함된다. 발광 물질은, 예를 들어 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 에쿼린 및 루시퍼라제를 포함한다. 또한, 아비딘-비오틴 시스템이 또한 본 발명의 항체 및 면역원을 표지하는 데 사용될 수 있다. 면역원 또는 항체가 불용화될 때, 단백질 또는 효소의 불용화 또는 고정을 위해 통상 사용되는 물리적 흡착 또는 화학적 결합이 사용될 수 있다. 담체의 예에는 불용성 다당, 예컨대 아가로스, 덱스트란, 및 셀룰로스, 합성 수지, 예컨대 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 및 실리콘 중합체, 및 유리가 포함된다.

β-아밀로이드-관련 질병을 검출 또는 진단하기 위한 추가의 실시 형태에서, 조직, 체액, 예컨대 뇌척수액(CSF), 혈액, 혈장, 혈청, 소변 등을 포함한 생물학적 샘플이 함유되고 적합한 양의 제1 항체와 접촉되어 면역 복합체를 생성한다. 접촉은 전형적으로 제1 항체로 코팅된 고체 매트릭스에 샘플을 첨가하는 것을 수반한다. 샘플을 제1 항체와 접촉시키는 것으로부터 생성되는 복합체는 용리에 의해 샘플로부터 분리된다. 그러나, 다른 회수 방법이 사용될 수 있다. 회수된 복합체는, 항원 상의 항원 결정기에 대해 유도되고 복합체 내의 항원에 결합할 수 있는 적어도 하나의 제2 항체와 접촉된다. 제2 항체의 유도 대상인 항원 결정기는 항원 실체의 다중에피토프 성질로 인해 제1 항체의 유도 대상과 동일할 수 있다. 제1 항체 또는 제2 항체 어느 것도 전술된 표지들 중 임의의 것을 사용하여 검출가능하게 할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 제2 항체는 검출가능하게 한다. 제1 항체 및 제2 항체에 결합된 항원으로 이루어진 복합체에 결합된 검출가능한 항체의 존재는 당업계에 알려진 기법을 사용하여 용이하게 검출될 수 있다. 생물학적 샘플에서 얻어진 결과를 대조군 샘플에 대해 얻어진 결과와 비교함으로써, 변경된 Aβ3pE 또는 이의 단편의 존재 또는 수준이 결정될 수 있다.

생체내( in vivo ) 방법

본 발명의 태양은 아밀로이드-베타 관련 질환에서 아밀로이드-베타 침착을 예방, 개선, 치료 및/또는 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 추가의 태양은 아밀로이드-베타 관련 질환에서 아밀로이드 침착을 예방, 개선, 치료 및/또는 감소시키기 위한 약제학적 조성물을 포함하며, 상기 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 방법은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일 태양에서, 본 발명은 인간에서 베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성을 특징으로 하는 질환에서 아밀로이드-베타 침착을 예방, 개선, 치료 및/또는 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 면역학적으로 반응성인 단편의 치료적 또는 예방적 유료량을 그러한 치료를 필요로 하는 인간에게, 바람직하게는 말초적으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체는 인간 Aβ3pE에 특이적으로 결합한다. 다른 태양에서, 본 발명은 인간에서 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하는 방법 및/또는 아밀로이드 플라크를 제거하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 항체의 유효량을 그러한 억제 또는 제거를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체는 뇌에서 Aβ3pE 펩티드를 격리시키고 뇌에서 변경된 Aβ3pE 클리어런스를 유도한다. 추가의 태양에서, 본 발명은 그러한 인간화 항체 - 이의 면역학적으로 효과적인 부분을 포함함 -, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

이를 필요로 하는 대상체는 베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성을 특징으로 하는 질환을 앓고 있거나 그러한 질환을 앓게 될 소인을 갖는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 질환은 알츠하이머병이다. 다른 실시 형태에서, 질환은 삼염색체성 21(다운증후군)과 관련된 치매, 미만성 루이소체병, 봉입체 근염, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 또는 네덜란드형의 아밀로이드증을 동반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)이다.

인간화 항체는, 인간에서 자연적으로 생성되는 항체 변이체와의 유사성을 증가시키도록 단백질 서열을 변형시킨 비인간 종으로부터의 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체의 단백질 서열은 항체가 그의 표적 항원에 결합하는 능력을 담당하는 상보성 결정 영역(CDR) 세그먼트의 일부 또는 전부가 비인간 기원인 것을 제외하고는, 인간 변이체의 단백질 서열과 본질적으로 동일하다. 가변 영역의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 프레임워크 영역으로 치환되어, 비인간 CDR은 실질적으로 온전하게 남겨진다. 일부 경우에, 인간화 항체는 비인간 항체의 결합 친화도 및/또는 해리 상수를 유지하기 위하여 비인간 CDR 영역의 하나 이상에서 소수의 치환을 갖는다.

인간화 항체는 인간 프레임워크, 비인간 항체 유래의 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 존재하는 임의의 불변 영역은 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일하며, 즉, 적어도 약 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 95% 동일하거나 98% 동일한 항체를 역시 지칭한다. 따라서, 하나 이상의 CDR을 제외한 인간화 항체의 모든 부분은 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 인간화 면역글로불린은 전형적으로 키메라 마우스 가변 영역/인간 불변 영역 항체를 포함하지 않을 것이다.

인간화 항체는 인간 요법에서 사용하기 위한 비인간 항체 및 키메라 항체에 비해 적어도 3가지의 잠재적인 이점을 갖는다: 1) 이펙터 부분이 인간이기 때문에, 그것은 인간 면역 시스템의 다른 부분과 더 잘 상호작용할 수 있으며(예를 들어, 미세교세포를 활성화시켜 플라크를 제거함); 2) 인간 면역 시스템은 인간화 항체의 프레임워크 또는 C 영역을 외래물로서 인식하지 않을 것이며, 이에 따라 그러한 투여된 항체에 대한 항체 반응은 전체적으로 외래물인 비인간 항체 또는 부분적으로 외래물인 키메라 항체에 대한 것보다 더 적을 것이며; 3) 투여된 비인간 항체는 인간 순환에서 인간 항체의 반감기보다 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 보고되어 있다.

베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성을 특징으로 하는 질환을 치료 및 예방하는 방법에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(면역학적으로 반응성인 단편을 포함함)이, 표준 투여 기법을 사용하여, 임상적 또는 전임상적 알츠하이머병, 다운증후군과 관련된 치매, 또는 임상적 또는 전임상적 아밀로이드 맥관병증과 같은 아밀로이드 베타-관련 증상 또는 병리에 대한 위험이 있거나 이를 나타내는 대상체에게 투여된다. 바람직하게는, 투여는 정맥내, 복막내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하, 또는 좌제 투여에 의한 말초 투여된다(즉, 중추 신경계 내로의 투여에 의하지 않는다). 항체 또는 이의 결합 단편이 심실계, 척수액, 또는 뇌 실질 내로 직접 투여될 수 있고, 이들 위치를 다루기 위한 기법이 당업계에 잘 알려져 있지만, 이들 더 어려운 절차를 이용할 필요는 없다. 본 발명의 항체 또는 이의 결합 단편은 말초 순환계에 의존하는 더 간단한 기법에 의해 투여될 때 효과적이다. 본 발명의 이점은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 중추 신경계 그 자체에 직접 제공되지는 않더라도 그의 유익한 효과를 발휘하는 능력을 포함한다.

투여를 위한 약제학적 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 설계되며, 약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 분산제, 완충제, 계면활성제, 방부제, 가용화제, 등장제, 안정제 등이 필요에 따라 사용된다. 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., latest edition]은 실무자에게 일반적으로 알려진 바와 같은 제형 기법의 개요를 제공한다.

본 발명의 항체의 용해도 특성을 변경시켜, 예를 들어 리포좀 내에 그들을 캡슐화함으로써 또는 극성 기를 블로킹함으로써 이들을 더 친유성으로 만드는 것이 특히 유용할 수 있다.

정맥내, 복막내, 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달이 바람직하다. 그러한 주사에 적합한 비히클은 간단하다. 그러나, 게다가, 투여는 또한 비강 에어로졸 또는 좌제에 의해 점막을 통해 달성될 수 있다. 그러한 투여 방식에 적합한 제형은 잘 알려져 있으며, 전형적으로 막횡단 전달(cross-membrane transfer)을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 그러한 계면활성제는 종종 스테로이드로부터 유도되거나, 양이온성 지질, 예컨대 N-[1-(2,3-다이올레오일)프로필-N,N,N-트라이메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 또는 다양한 화합물, 예컨대 콜레스테롤 헤미석시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등이다.

낮게는 약 0.1 중량% 정도부터 많게는 약 15 또는 20 중량% 정도까지의 제형 중의 인간화 항체의 농도는 선택된 특정 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점도 등에 기초하여 선택된다. 따라서, 주사를 위한 전형적인 약제학적 조성물은 인산염 완충 식염수의 멸균 완충수 1 mL 및 본 발명의 인간화 항체 1 내지 100 mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 제형은 제형을 제조한 후에 멸균 여과될 수 있거나, 아니면 미생물학적으로 허용가능하게 제조될 수 있다. 정맥내 주입을 위한 전형적인 조성물은 250 mL 정도로 많은 부피의 유체, 예컨대 멸균 링거액, 및 1 내지 100 mg/mL 이상의 항체 농도를 가질 수 있다.

항체 투여의 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/㎏, 그리고 더 바람직하게는 0.01 내지 75 mg/㎏ 숙주 체중의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.02 mg/㎏, 0.25 mg/㎏, 0.5 mg/㎏, 0.75 mg/㎏, 1 mg/㎏, 2 mg/㎏, 3 mg/㎏, 4 mg/㎏, 5 mg/㎏, 10 mg/㎏, 15 mg/㎏, 20 mg/㎏, 25 mg/㎏, 20 mg/㎏, 35 mg/㎏, 40 mg/㎏, 45 mg/㎏, 50 mg/㎏, 55 mg/㎏, 60 mg/㎏, 65 mg/㎏, 70 mg/㎏, 또는 75 mg/㎏ 숙주 체중일 수 있다. 실시 형태에서, 투여량은 0.01 내지 10 mg/㎏의 범위 이내, 또는 0.1 내지 15 mg/㎏의 범위 이내, 또는 0.1 내지 20 mg/㎏의 범위 이내, 또는 0.1 내지 30 mg/㎏의 범위 이내, 또는 0.1 내지 40 mg/㎏의 범위 이내, 또는 0.1 내지 50 mg/㎏의 범위 이내, 또는 0.1 내지 60 mg/㎏의 범위 이내, 바람직하게는 적어도 1 mg/㎏, 적어도 5 mg/㎏, 적어도 10 mg/㎏, 적어도 20 mg/㎏, 적어도 30 mg/㎏, 적어도 40 mg/㎏, 적어도 50 mg/㎏ 또는 적어도 60 mg/㎏이다. 바람직한 예에서, 투여량은 약 10 ㎏/mg, 약 20 ㎏/mg, 약 30 ㎏/mg, 약 40 mg/㎏, 약 50 mg/㎏, 약 60 mg/㎏ 또는 약 70 mg/㎏일 수 있다. 특히 바람직한 예에서, 항체는 약 0.3 mg/㎏ 내지 약 60 mg/㎏의 용량 범위에서 복막내 투여된다. 예시적인 치료 계획(treatment regime)에서, 항체는 약 10 ㎏/mg, 약 20 ㎏/mg, 약 30 ㎏/mg, 약 40 mg/㎏, 약 50 mg/㎏ 또는 약 60 mg/㎏의 투여량으로 복막내 투여된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예컨대 양을 지칭할 때 용어 "약"은 명시된 값의 ± 20% 내지 ± 0.1%, 바람직하게는 ± 15% 또는 ± 10%, 더 바람직하게는 ± 5%, 더욱 더 바람직하게는 ± 1%, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05% 또는 ±0.01%의 변동을 포함하는 것으로 의미되는데, 이는, 그러한 변동이 적절하기 때문이다.

예시적인 치료 계획은 매 2주마다 1회 또는 1개월에 1회 또는 매 3개월 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 단일클론 항체가 동시에 투여되며, 이 경우에 투여된 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 이내에 속한다. 항체는 통상 다회 횟수로 투여된다. 단회 투여량간의 간격은 매주, 매달 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 대상체에서 Aβ에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우에는 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 변동된다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 뒤이어서 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체의 순서로 긴 반감기를 나타낸다.

투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적 어느 것인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 응용에서는, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 대상체는 그들의 남은 생애 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 응용에서는, 질병 진행이 감소 또는 종결될 때까지, 그리고 바람직하게는 대상체가 질병의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량이 요구될 수 있다. 이후에, 예방적 계획이 투여될 수 있다.

일부 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 ㎍/ml, 그리고 일부 방법에서는 25 내지 300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 투여된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우에는 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 대상체에서 항체의 반감기에 따라 변동된다.

본 발명의 항체에 의한 치료는 독립형(stand-alone) 치료일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체에 의한 치료는 하나 이상의 추가의 치료제가 또한 개체를 치료하는 데 사용되는 병용 요법 계획의 하나의 성분 또는 상(phase)일 수 있다.

생체내 요법에 사용될 때, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 치료적 유효량, 예를 들어 β-아밀로이드 플라크를 감소, 제거 또는 방지하거나, AD 또는 다른 β-아밀로이드-관련 질병을 가진 대상체에서 인지적 기능을 개선하는 양으로 개체에게 투여된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 알려진 방법에 따라, 예컨대 정맥내 투여에 따라, 예를 들어, 볼루스(bolus)로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 수강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 작용제는 선택적으로, 아밀로이드성 질병(amyloidogenic disease)의 치료에 적어도 부분적으로 효과적인 다른 작용제와 병용하여 투여될 수 있다. 아밀로이드 침착이 뇌에서 일어나는 알츠하이머병 및 관련 질환의 경우에, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 본 발명의 작용제의 통과를 증가시키는 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 플라크 침착물 내의 3pE Aβ에 결합한다. 플라크 침착물 내의 3pE Aβ에 결합함으로써, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 플라크 제거를 유도할 수 있다. 플라크 제거의 유도는 플라크 주위의 미세교세포의 활성화에 의해 그리고 안정한 Aβ 형태를 제거함으로써 플라크를 불안정화함으로써 이루어질 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 3pE Aβ의 플라크 시딩 활성을 방지할 수 있다. 혈관 아밀로이드와 대비하여 플라크 내의 3pE Aβ의 가능한 풍부화는 면역요법을 위한 치료적 안전성 창을 증가시킬 수 있다.

키트 및 장치

본 발명은 상기 언급된 방법에서 사용될 수 있는 키트 및 장치를 제공한다. 바람직하게는, 키트 및 장치는 3pE Aβ에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 게다가, 키트는 시약 및 설명용 자료를 포함할 수 있다. 설명서는, 예를 들어 종이에 인쇄될 수 있고/있거나 전자적으로 판독가능한 매체에 공급될 수 있다. 대안적으로, 설명서는, 예를 들어 키트의 제조업체 또는 유통업체에 의해 명시된, 인터넷 웹사이트로 사용자를 안내함으로써 제공될 수 있다.

본 발명의 키트 내에 포함된 시약들은 상이한 성분들 그 자체가 용기의 재료에 의해 실질적으로 흡착되거나 변경되지 않으면서 상이한 성분들의 활성이 실질적으로 보존되도록 하는 용기들의 모든 방식으로 공급될 수 있다.

일 실시 형태에서, 키트 또는 장치는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 바람직하게는 정제된 항체, 더 바람직하게는 단일클론 항체, 더욱 더 바람직하게는 3pE Aβ 펩티드에 결합하는 단리된 단일클론 항체를 포함한다. 실시 형태에서, 항체는 하이브리도마 세포에 의해 발현된다.

실시 형태

실시 형태 1은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며:

a. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6;

b. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5, 및 6;

c. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 8, 5, 및 6;

d. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 8, 5, 및 6;

e. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 8, 5, 및 6;

f. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6;

g. 각각 서열 번호 56, 58, 3, 4, 5, 및 6;

h. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 8, 5, 및 6;

i. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5, 및 6;

j. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6;

k. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 4, 5, 및 6;

l. 각각 서열 번호 1, 58, 3, 4, 5, 및 6; 또는

m. 각각 서열 번호 56, 2, 3, 4, 5, 및 6;

상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 3pE Aβ, 바람직하게는 인간 3pE Aβ에 특이적으로 결합한다.

실시 형태 2는, 실시 형태 1에 있어서, 서열 번호 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 또는 21과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 서열 번호 10, 12, 14, 18, 22, 53, 또는 55와 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

실시 형태 3은, 실시 형태 1에 있어서,

a. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 22의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

b. 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

c. 서열 번호 11의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

d. 서열 번호 13의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

e. 서열 번호 15의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

f. 서열 번호 16의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

g. 서열 번호 20의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

h. 서열 번호 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

i. 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;

j. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 53의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는

k. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 55의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

실시 형태 4는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 형태인, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

실시 형태 5는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화 형태인, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

실시 형태 6은 단리된 단일클론 항체로서, 상기 단리된 단일클론 항체는

a. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;

b. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;

c. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 52를 포함하는 경쇄 아미노산 서열; 또는

d. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 54를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

실시 형태 7은 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산이다.

실시 형태 8은 실시 형태 7의 단리된 핵산을 포함하는 벡터이다.

실시 형태 9는 실시 형태 8의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

실시 형태 10은 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

실시 형태 11은 베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성과 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 실시 형태 10의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

실시 형태 12는, 실시 형태 11에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병인, 방법이다.

실시 형태 13은, 실시 형태 11에 있어서, 상기 질환은 삼염색체성 21(다운증후군)과 관련된 치매, 미만성 루이소체병, 봉입체 근염, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 및 네덜란드형의 아밀로이드증을 동반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다.

실시 형태 14는 알츠하이머병과 관련된 플라크의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 플라크를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 실시 형태 10의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

실시 형태 15는 3pE Aβ의 시딩 활성의 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 시딩 활성을 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 실시 형태 10의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

실시 형태 16은 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에서 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.

실시 형태 17은 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 상기 약제학적 조성물을 얻는 단계를 포함한다.

실시예

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 고려하여 더 이해될 수 있다.

실시예 1: 단일클론 항체의 생성 및 인간화 과정

3개의 Balb/c 마우스(Janvier Labs)를 완전 프로인트 애쥬번트(Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 중의 H2N-pEFRHDSGC-COOH(Eurogentec)(서열 번호 47)로 프라이밍하였다. 제조업체의 설명서에 따라 Imject Maleimide Activated BSA 키트(Pierce; 미국 일리노이주 록포드 소재)와 같은 구매가능한 키트를 사용하여 펩티드를 COOH-말단 시스테인 잔기를 통해 말레이미드 활성화된 소혈청 알부민(Life Technologies; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 커플링함으로써 펩티드를 제조하였다. 마우스를, 먼저 완전 프로인트 애쥬번트 중의, 그리고 후속으로 불완전 프로인트 애쥬번트 중의(Sigma) 100 ㎍ 또는 200 ㎍의 BSA-커플링된 펩티드로 매 2주마다 부스팅하였다.

하이브리도마 및 항체 생성: 최고 혈청 역가를 보여준 마우스를 융합을 위하여 선택하였으며, 한편 나머지 다른 마우스의 비장을 단리하고 액체 질소 중에 동결시켰다. 일수 4에서, 융합 또는 비장 적출 전에, 모든 마우스를 식염수 중의 BSA(Merck; 미국 뉴저지주 케닐워스 소재)에 커플링된 100 ㎍의 H2N-pEFRHDSGC-COOH(서열 번호 47)를 복막내로 부스팅하였다. 마우스 비장 세포를 코흘러 및 밀스테인의 변형된 절차(문헌[Euro. J. Immunol., 1976; 292-295])에 의해 SP2/0 세포(ATCC; 미국 버지니아주 머내서스 소재)와 융합하였다. 하이브리도마를 30 × 96웰 플레이트 내에 시딩하고, 0.5 ㎍/웰의 커플링되지 않은 Aβ 3pE-40 펩티드(AnaSpec; 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)에 대해 직접 ELISA에서 10일 후에 스크리닝하였다. 양성 세포를 0.5 ㎍/ml의 코팅된 Aβ1-40 펩티드(AnaSpec)에 대해 교차-반응성(의 결여)에 대해 시험하고, 즉시 하위클로닝하였다.

융합 후, 17개의 클론은 인간 Aβ3pE-40 합성 펩티드(서열 번호 40)와, 직접 코팅된 ELISA 스크리닝에서 양성으로서 반응하였으며, 이들을 액체 질소 중에서 냉동시켰다.

모든 하이브리도마를 10% 태아 송아지 혈청(Hyclone, 유럽 소재), 하이브리도마 융합 클로닝 보충제(Hybridoma Fusion Cloning Supplement)(2%)(Roche; 벨기에 브뤼셀 소재), 2% HT(Sigma), 1 mM 소듐 피루베이트, 2 mM L-글루타민 및 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신(50 mg/ml)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 중에서 성장시켰다. 모든 제품은 구매가능하였으며, Life Technologies로부터 구매하였다. 세포를 가습된 8% CO₂ 공기 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다.

항체 선택을 위한 직접 ELISA: 상기 Aβ 3pE-40 항체의 검출에 사용된 스크리닝 ELISA는 직접 ELISA였는데, 여기서는 0.5 ㎍/ml의 유리 인간 Aβ 3pE-40 펩티드(서열 번호 40)를 NUNC Maxisorp(Life Technologies) 편평바닥 고결합 96웰 미세적정 플레이트 내의 50 μl/웰의 코팅 완충액(10 mM Tris, 10 mM NaCl, 및 10 mM NaN₃, pH 8.5) 중에서 4℃에서 하룻밤 코팅하였다.

다음날, 플레이트를 실온에서 60분 동안 PBS 중 0.1% 카세인(Merck) 75 μl/웰로 블로킹하여 비특이적 결합을 감소시켰다. 다음으로, 50 μl의 하이브리도마 상층액을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, 결합된 단일클론 항체를 37℃에서 1시간 동안 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 양-항-마우스 IgG(Amersham-Pharmacia Biotech; 영국 리틀 챌폰트 소재) 50 μl/웰을 사용하여 검출하였다. 두 시약 모두 0.1% 카세인/PBS 중에 희석시켰다. 플레이트를 세척하고, 0.42 mM 3,5,3',5'-테트라메틸-벤지딘(Biorad), 100 mM 시트르산(Biorad; 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재) 중 0.003% (vol/vol) H₂O₂(Biorad); 100 mM 인산수소이나트륨(pH 4.3)(Biorad)의 용액 50 μl를 기질로서 첨가하였다. 반응을 실온에서 플레이트 진탕기 상에서 최대 15분 동안 진행되게 하였으며, 이후에 2 N H₂SO₄(Merck) 50 μl/웰을 사용하여 발색을 정지시키고, 플레이트를 450 nm에서 미세적정 플레이트 판독기(Thermomax, Molecular Devices) 상에서 판독하였다. 선택된 단일클론 항체와 전체 크기의 인간 유리 Aβ 1-40의 교차-반응성을 스크리닝 검정과 동일한 직접 ELISA에서 시험하였다.

17개의 Aβ3pE-40-반응성 클론으로부터, BAMB31_1을 친화성 및 선택성에 기초하여 추가의 특성화를 위해 선택하였다(참조: 실시예 2 및 실시예 3). 이 항체는 뮤린 IgG1 동종형 중쇄 및 뮤린 카파 경쇄를 갖는 것으로 결정되었다. 뮤린 IgG1 Fc가 뮤린 IgG2a Fc와 단지 70%의 서열 동일성 및 76%의 서열 유사성을 갖지만, 이들 동종형은 상이한 활성 및 단백질 프로파일을 갖는다. 뮤린 IgG2a와 비교하여, 뮤린 IgG1은 뮤린 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV 수용체 및 뮤린 C1q에 대한 더 약한 결합으로 인해 더 적은 뮤린 Fc 이펙터 및 보체 기능을 갖는다. 인간 IgG1 활성에 가장 가까운 동종형임을 고려할 때, 뮤린 IgG2a는 뮤린 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV 수용체 및 뮤린 C1q에 결합하며, 그럼으로써 보체 활성, 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 활성, 및 항체-의존성 세포성 식세포작용(ADCP) 활성을 가지며, 이러한 활성은 Aβ 플라크의 클리어런스에 기여할 수 있다.

BAMB31 중쇄의 서열을 뮤린 IgG1로부터 뮤린 IgG2a로 변경시켜 BAMB31_2a를 생성하였다. V-영역 클로닝 후의 반응성의 보존이 하기에 기재된 SPR 방법으로 확인되었다.

인간화 과정: 모 항체 BAMB31_2a(mIgG2a)를 CDR-H2를 제외하고는 문헌[Singh, et. al. (MAbs 2015; 7(4): 778-91)]과 유사한 절차를 사용하여 인간화하였는데, 이때 CDR-H2는 이 작업을 위하여 AbM 정의(문헌[Martin, A.C., PNAS 86: 9268-9277, 1989])에 따라 기재된다. 간략하게 말하면, 상보성 결정 영역(CDR)은 마우스 모 서열(parental sequence)에서 확인되었다. 이들 서열을 인간 생식세포계열과 비교하였으며, 뮤린 CDR을 이식할 4개의 인간 생식세포계열 중쇄 및 2개의 인간 생식세포계열 경쇄 프레임워크를 선택하였다. 각각의 모 항체의 VL 및 VH에 대한 인간 J 세그먼트를, 뮤린 J 세그먼트 서열과 인간 J 세그먼트 서열을 비교함으로써, 서열 동일성을 최대화하도록 선택하였다. 모 mAb의 Fv 영역의 분자 모델을 디폴트 파라미터를 사용하여 MOE(CCG; 캐나다 몬트리올 소재)에서 생성하였다. 생성된 모델을 그래프로 조사하여 결합 및/또는 항체 안정성에 잠재적으로 중요한 프레임워크 위치를 확인하였다. 이식된 CDR에 더하여, 이들 위치가 인간/마우스 바이너리 조합을 갖는 항체 라이브러리를 생성하였다. 이 라이브러리에서, 이식된 뮤린 CDR을 갖는 각각의 사슬은 대향하는 뮤린 모 사슬과 쌍을 형성한다. 이러한 방식으로, 단지 하나의 사슬만이 인간 프레임워크에 적응화되었으며, 항원 결합에 기초하여 복귀 돌연변이를 결정하였다. 이어서, 인간화 VH와 VL을 조합하여 최종 후보 항체에 도달하였다.

라이브러리 클론을 E. 콜라이에서 Fab로서 발현시키고, ELISA를 통해 펩티드에 대한 결합에 대해 시험하고, 신호를 완전 뮤린 모 분자에 대해 비교하였다. 뮤린 모체의 80% 초과의 결합을 나타내는 분자 신호를 서열분석을 위해 선택하였다. 서열을 분석하고, 인간 적응화 중쇄 및 인간 적응화 경쇄를, 단일클론 인간 IgG1 항체로서 조합되고 발현되도록 선택하였다. 각각의 항체의 모든 VH/VL 인간화 쌍을 발현시키고, 정제하고, 항원 결합, Epivax 컴퓨터 모의실험(in silico) 면역원성 위험, 마우스 서열로 복귀된 잔기의 수, 및 생물물리학적 특성에 대해 평가하였다.

결과: 일부 잔기는 모체의 결합을 유지하기 위해 마우스 서열로 복귀될 필요가 있었다. 결합의 유지, Epivax 컴퓨터 모의실험 면역원성 위험, 및 생물물리학적 특성은 마우스 서열로의 복귀의 수에 의존하지 않고, 어느 위치가 마우스 서열로 복귀되었는지에 의존하였다. 이러한 분석으로부터의 대표적인 HFA mAb 특성화 결과가 표 2 및 표 3에 나타나 있다.

[표 2]

BAMB246 모 인간 IgG1 키메라

원하는 범위 밖의 값은 볼드체로 개략적으로 기재되어 있다: 마우스 서열로 복귀된 총 잔기 수 ≥ 5; Hc 및 Lc Epivax 위험 점수 > -10; V 영역 합계 Epivax 위험 점수 > -20; SEC % 단량체 값 <95% kd(1/s) 값 > 1.00E-04; KD(M) 값 > 2.50E-11; Tonset (℃) < 60; Tm1 (℃) < 65; Tagg (℃) < 65

번역후 변형 위험의 완화: 모 항체 및 인간 프레임워크 적응화 변이체는 HCDR2 내에 NG 번역후 탈아미드화 변형 모티프를 함유하였다. 이러한 잠재적인 문제를 해결하기 위하여, 축퇴된 올리고를 사용하여 N 및 G 잔기 둘 모두에 대해 개별 라이브러리를 생성하였다. 이들은 각각의 위치에 대해 모든 20개의 아미노산을 무작위로 도입시킨 새로운 서열을 생성하였다. 각각의 라이브러리를 유지된 결합에 대해 스크리닝하였다. 뮤린 모체와 유사한 결합을 나타내는 변이체 항체를 서열분석을 위해 선택하였다.

결과: 서열분석 후, N에서 S로의 돌연변이체 및 N에서 G로의 돌연변이체 둘 모두는 모체에 비견되는 결합을 가졌다. 선도(lead) HFA 변이체를 클로닝하고 야생형 IgG1(BAMAB674)로서 발현시켰으며, Fc 영역 내에 M37Y, S39T, 및 T41E 점 돌연변이를 갖는 IgG(넘버링은 Hc 불변 영역 Fc IgG1 중쇄 불변 영역 서열 GenBank 수탁 번호 AEV43323에 기초함)를 +YTE IgG1(BAMB675)로서 설계하였다. 이들 돌연변이는 FcRn에 대한 친화성을 증가시키고 순환 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다(문헌[Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn), Dall'Acqua WF., JBC, 2006)]). BAMB674 및 BAMB675의 특성화가 표 3에 나타나 있다.

[표 3]

[표 3a]

실시예 2: 열안정성 시험

BAMB31 인간 프레임워크 적응화 변이체에 대하여, 그들의 열안정성을 나노 시차 주사 형광측정법(nano differential scanning fluorimetry, NanoDSF)을 사용하여 용융 개시 온도(Tonset), 제1 용융 전이 온도(Tm1), 및 초기 응집 검출 온도(Tagg)를 측정하여 평가하였다. 변이체들 중 일부에 대한 데이터가 표 2(제6열 내지 제8열) 및 표 3(제10행 내지 제12행), 그리고 표 3a에 나타나 있다.

재료 및 방법: 샘플의 열안정성은 자동화 Prometheus 기기를 사용하여 결정된다. 384웰 샘플 플레이트로부터 24웰 모세관 내로 샘플을 로딩함으로써 측정을 수행한다. 각각의 샘플에 대해 2회 반복을 수행한다. Prometheus NanoDSF 사용자 인터페이스(Melting Scan 탭)를 사용하여 상기 실시에 대한 실험 파라미터를 설정한다. 전형적인 IgG 샘플에 대한 열 스캔은 1.0℃/분의 속도로 20℃부터 95℃까지에 걸쳐 있다. 샘플의 전형적인 농도는 0.3 내지 1 mg/mL의 범위이다. 330 및 350 nm에서의 분자의 고유 형광을 사용하여 온도 램프(ramp) 동안 풀림(unfolding)을 모니터링하고 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화로서 기록한다. 이것을 열 스캔 결과(Tm)라고 칭한다. 동시에, 후방-반사 기술을 사용하여, 기기는 열적 램프 동안 응집의 개시(Tagg)를 계산한다. 따라서, NanoDSF 방법은 다양한 조건 하에서의 장기간 샘플 안정성에 대한 지표로서 종종 모니터링되는 유력 후보의 입체형태 안정성과 콜로이드 안정정의 동시 측정을 가능하게 한다.

실시예 3: Epivax 컴퓨터 모의실험 면역원성 위험 평가

MHC 클래스 II 결합을 예측하기 위한 EpiMatrix 소프트웨어(EpiVax Inc.)를 사용하여 항-Aβ3pE mab V 영역의 컴퓨터 모의실험 분석을 수행하였다. 이 소프트웨어는 구성적 아미노산 9량체를 조사하여 잠재적인 HLA 클래스 II 결합 서열을 확인한다. 데이터베이스는 인간 집단의 대략 95%에 해당되는 가장 일반적인 HLA 유형을 포함한다. 항원 제시 세포의 HLA 수용체가 펩티드 아그레토프(agretope)에 결합하는 경우, 그러한 펩티드의 다른 한쪽 면(에피토프)은 T 이펙터 또는 T 조절성 세포에 결합할 수 있으며, 이는 다시, 그러한 에피토프를 보유하는 단백질에 대한 면역 반응의 자극 또는 억제로 이어질 수 있다. 이 소프트웨어는 아그레토프 결합 점수를 생성하며, 이 점수는 예측된 T 조절성 세포 결합에 대해 조정될 수 있다. 점수는 단백질의 크기 및 결합 사건의 수에 대해 정규화되어, 단백질의 예측된 면역원성을 나타내는 출력으로 이어진다.

실시예 4: 정제된 mAb의 분석 특성화

각각의 정제된 mAb에 대한 단백질 농도를 NanoDrop1000 분광광도계 또는 Trinean DropSense96 멀티채널 분광광도계 상에서 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하고, 아미노산 서열에 기초하여 소광 계수를 사용하여 계산하였다.

정제된 항체의 SE HPLC를, 20분 동안 Waters Alliance HPLC 상에서 1 mL/분으로 0.2 M 인산나트륨(pH 6.8) 중의 것으로, TOSOH TSKgel BioAssist G3SWxl 컬럼 상에서 샘플을 전개시킴으로써 수행하였다. 컬럼 유출물을 280 nm에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. 결과가 표 2 및 표 3에 나타나 있다.

실시예 5: 결합 속도론적 특성(binding kinetis) 및 친화도 측정

표면 플라즈몬 공명(SPR)은 생체분자 상호작용을 조사하는 데 사용되는 무표지 검출 방법이다. 센서 표면 상의 질량의 작은 변화를 모니터링하는 이러한 직접 실시간 결합 검정은 생체분자들 사이의 상호작용에 대한 정성적 및 정량적 데이터를 제공한다: 즉, 평형 결합 상수(친화도, K _D) 및 속도론적 속도 상수(k _a/k _d; 복합체 회합 속도 k _a, 및 복합체 해리 속도 k _d)의 결정. 이 방법은 단백질-단백질 및 단백질-핵산 상호작용뿐만 아니라 단백질과 소분자 사이의 상호작용의 연구에도 유용하다. 여기서는, 3pE-특이적 항체와 인간 Aβ3pE-40(서열 번호 40) 또는 Aβ3pE-28(서열 번호 42), 인간 Aβ1-40(서열 번호 41) 또는 Aβ1-28(서열 번호 43), 및 설치류 Aβ3pE-28 펩티드(서열 번호 45 및 46) 사이의 상호작용을 조사하였다.

재료 및 방법

SPR: GE Healthcare로부터의 마우스 항체 포획 키트를 Aβ-3pE-40 펩티드(서열 번호 40)에 대한 BAMB31_2a (mIgG2a)의 친화도 연구에 사용하였다. J&JPRD/Aβ/pE3/1 mIgG2a(미국 특허 출원 공개 제2018/0142011호에 기재됨) 및 mE8c mIgG2a(US9944696호 및 US8679498호에 기재됨)를 대조 항체로서 포함하였다. 항-마우스 항체의 고정화를 제조업체의 프로토콜에 따라 CM5 센서 칩 상에서의 아민 커플링을 통해 수행하였다. 후속으로, 관심 항체(1 ㎍/ml)를 항-마우스 항체에 의해 300 RU의 수준으로 포획한 후, 전개 완충액(2.7 mM KCl, 137 mM NaCl 및 0.05% 계면활성제 P20(Tween™ 20)을 함유하는 20 mM 인산염 완충액) 중에 희석된 다양한 농도(3.125 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM 및 50 nM)의 인간 Aβ 3pE-40 펩티드(서열 번호 40)를 주사하였다. 표면을 적어도 180초 및 추가 60초 동안 10 mM 글리신 HCl(pH 1.7)로 재생시켰다. 인간 Aβ(1-40) 펩티드(서열 번호 41)를 음성 대조군으로서 사용하였다.

광학 바이오센서 T200(Biacore^®)을 사용하여 친화도 측정을 수행하였다. Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 2.0)를 사용하여 1:1 결합 적합화 모델에 따라 속도론적 분석을 수행하였다.

일부 경우에는, 항-Aβ 3pE mAb의 결합 친화도 및 특이성을 항-인간 또는 항-마우스 면역글로불린 바이오센서 표면 및 상이한 기기(Biacore T200, Biacore 8K 또는 MASS-2(Biacore, Inc.))를 사용하여 수행되는 SPR에 의해 측정하였다. 항-인간 또는 항-마우스 면역글로불린 항체를 아민-커플링 화학에 대한 제조업체 설명서를 사용하여 CM4 또는 CM5 센서 칩(GE Healthcare)의 표면에 공유적으로 커플링시켰다. 관심 항체를 항-인간 또는 마우스 면역글로불린 센서 칩 상에 300 내지 400 RU의 수준으로 포획한 후, 0.005% 계면활성제 P20(Tween™ 20)을 함유하는 HEPES 완충 식염수 중의 다양한 농도의 Aβ 펩티드 또는 단백질(예: 인간 Aβ 3pE-40(서열 번호 40), Aβ 3pE-28(서열 번호 42), 스크램블 Aβ 3pE-28(서열 번호 44), Aβ 1-28(서열 번호 43), 마우스 Aβ 3pE-28(서열 번호 46), 또는 피브로넥틴)을 주사하였다. 표면을 10 μL/분으로의 30 μL의 10 mM Gly(pH 1.5)의 2회 펄스 주입으로 재생시켰다. 기록된 데이터는 포획된 항체를 함유하는 유동 세포와 포획된 항체를 함유하지 않는 참조 세포 사이의 SPR 신호의 차이이다. 신호에 대한 추가의 기기상의 기여를 참조-공제된 신호로부터 블랭크 주입으로부터의 데이터를 뺌으로써 제거하였다. 적용가능한 경우, Biaevaluation 소프트웨어(Biacore, Inc.)를 사용하여 1:1 결합 모델을 통해 모든 농도에서의 회합 및 해리 단계를 적합화함으로써(전체 적합도)) 데이터를 분석하였다. 그렇지 않으면, 데이터를 예/아니오(YES/NO) 결합에 대해 정성적으로 평가하였다.

포르말린 고정되고 파라핀 포매된 뇌에 대한 면역조직화학: 면역조직화학 분석을 위하여, 절편의 탈파라핀 및 재수화 후에, 유전자도입 마우스 뇌 슬라이드를 포름산(증류수 중 70%) 중에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 항원 회복을 수행하고, 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% 과산화수소(DAKO; 덴마크 글로스트럽 소재, S2023)로 블로킹하였다. 절편을 백그라운드 감소 성분(DAKO, S3022)을 갖는 항체 희석제 중의 상이한 농도(작업 농도: 2, 0.1 - 0.05 - 0.025 ㎍/ml)의 BAMB674, BAMB675, hE8L, R17L, R17, CI-C7, B12L, 항체 I 또는 항체 II(후자의 7개의 항체는 US9944696B2호 및 US8679498B2호에 이미 기재됨)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후에, HRP-표지 항-인간 2차 항체(PI-3000, Vector labs; 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재 - 항체 희석제(DAKO, S0809) 중 1/500)를 1시간 동안 슬라이드에 적용한 후, 3,3-다이아미노벤지딘(DAB)(DAKO, K3468)으로 발색성 표지화를 수행하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색하고, 탈수시키고, Vectamount(H-5000, Vector Labs)로 영구적으로 마운팅하였다.

결과: 단일클론 항체 BAMB31_2a(mIgG2a)의 속도론적 분석은 Aβ3pE-40 펩티드(서열 번호 40)에 대한 친화성 결합을 확인시켜 주었다. 최대 50 nM까지의 농도로 인간 Aβ1-40 펩티드(서열 번호 41)를 적용하였을 때 결합이 검출되지 않았다. 인간 Aβ3pE-40 펩티드(서열 번호 40)에 대한 BAMB31_2a(mIgG2a)의 결합 상호작용을 입증하는 센서그램(단회 사이클 속도론)이 도 1에 예시되어 있다. 비교기준물 분자로서, J&JPRD/Aβ/pE3/1 mIgG2a 및 mE8c mIgG2a(도 2)를 동일한 검정에서 평가하였으며, mE8c 및 J&JPRD/Aβ/pE3/1과 대비하여 BAMB31의 더 높은 친화도를 보여주었다. 평형 결합 상수(친화도, K _D) 및 속도론적 속도 상수(k _a/k _d)가 표 4에 나타나 있다.

[표 4]

Hc CDR2 NG 탈아미드화 위험이 완화된 BAMB31 HFA mAb(BAMB674 및 BAMB675)의 속도론적 분석은 BAMB31_2a(mIgG2a) 모체 및 BAMB246(인간 IgG1 키메라) 모체에 비하여 Aβ3pE-28 펩티드(서열 번호 42)에 대해 유지된 결합 친화도를 보여주었다. 평형 결합 상수(친화도, K _D) 및 속도론적 속도 상수(k _a/k _d)가 표 5에 나타나 있다.

앞서 기재된 인간화 3pE-특이적 항체 hE8L, R17L, R17, CI-C7, B12L, 항체 I 및 항체 II(이전에 US9944696B2호 및 US8679498B2호에 기재됨)와 대비하여, 현재의 BAMB31 HFA 분자의 친화도가 더 높은데, 이는 표 5에 나타낸 바와 같다.

[표 5]

[표 5a]

SPR에 의해 측정된 바와 같은 더 높은 친화도는 또한 개선된 플라크 결합으로 해석되었다. 유전자도입 마우스 뇌의 뇌 절편에 대한 면역조직화학에 의한 1차 항체의 연속 희석을 수행하였다. 모든 항체는 2 ㎍/mL에서 가시적인 플라크 표지화를 제공하지만, 상이한 정도로 이루어진다. 0.1 ㎍/mL의 농도에서, 항체 CI-C7 및 R17L은, SPR에 의해 측정되는 바와 같이 낮은 친화도에 따라, 가시적인 플라크 표지화를 생성하지 않았다. 0.05 ㎍/mL의 농도에서, BAMB674 및 BAMB675는 플라크 표지화를 보여주는 반면, 비교기준물 분자에 대해서는 이 농도에서 플라크 표지화가 시각적으로 부재한다(도 3). 0.025 ㎍/mL의 농도에서는, 가시적인 플라크 표지화가 시험된 모든 분자에 대해 (거의 완전히) 부재한다.

결론적으로, 면역조직화학 데이터는 비교기준물 분자와 대비하여 BAMB674 및 BAMB675의 더 높은 친화도를 입증하는 SPR 데이터를 확인시켜 준다.

BAMB246(인간 IgG1 키메라) 및 현재의 BAMB31 HFA mAb(BAMB674 및 BAMB675)는 고도로 상동성인 마우스 Aβ 3pE-28 펩티드(서열 번호 46)에 걸쳐 3 로그 초과의 선택성, 그리고 피브로넥틴, Aβ 1-28 펩티드(서열 번호 43), 및 아미노산 3 내지 9가 스크램블된 Aβ 3pE-28 펩티드(스크램블 3pE-28)(서열 번호 44)에 걸쳐 5 로그 초과의 선택성을 가졌다. 관련 펩티드 및 단백질에 대한 선택성 결과 및 평형 결합 상수(친화도, K _D) 및 속도론적 속도 상수(k _a 및 k _d)가 표 6에 나타나 있다.

[표 6]

스크램블 3pE-28은 아미노산 3 내지 9가 스크램블된 인간 Aβ 3pE-28 펩티드이다.

표 4의 KD를 표 3의 KD로 나눔으로써 배수 선택성을 결정하였다.

≥ 1.20E-06 K_D (M)에서는 시험된 농도가 최대 1.2 μM에 이르기까지 검출된 항원 결합이 없었다.

BAMB31 HFA 항체에 대하여 야생형 IgG1(BAMB674) 및 +YTE IgG1 동종형(BAMB675) 상에의 FcRn 결합 친화도가 표 7에 나타나 있다. +YTE mAb(BAMB675)는 인간 및 사이노몰거스 FcRn에 대한 친화도에 있어서 wt IgG1(BAMB674)과 비교하여 약 3배 더 높은데, 이는 사이노몰거스 원숭이 약동학적 연구에서의 +YTE 항체의 더 긴 순환 반감기로 해석된다(도 11).

[표 7]

실시예 6: 교차-반응성 시험을 위한 샌드위치 ELISA

선택된 Aβ3pE 단일클론 항체 BAMB31에 대하여, 설치류 Aβ3pE-40(서열 번호 45) 및 인간 Aβ1-40(서열 번호 41), Aβ1-42(서열 번호 48), Aβ11pE-40(서열 번호 49) 및 Aβ11pE-42(서열 번호 50)와의 교차-반응성을 합성 펩티드를 사용하여 평가하였다. BAMB31 + JRF/cAβ40/28-HRPO의 조합을 사용하여 Aβ1-40(서열 번호 41), Aβ11pE-40(서열 번호 49) 및 설치류 Aβ3pE-40(서열 번호 45)과의 교차-반응성 조사하고, BAMB31 + JRF/cAβ42/26-HRPO의 조합을 사용하여 Aβ1-42(서열 번호 48) 및 Aβ11pE-42(서열 번호 50)와의 교차-반응성을 조사하였다. 최대 10,000 pg/mL까지의 농도를 시험하였다.

재료 및 방법: 표준물을 0.1 mg/mL로 다이메틸설폭사이드(DMSO)(Sigma) 중에 용해시키고, -80℃에서 저장하였다. ELISA에서 사용하기 위하여, 펩티드를 1 pg/mL까지 낮추어서 PBS 중 0.1% 카제인 중에 추가로 희석시켰다. 96웰 플레이트(Maxisorb ELISA 플레이트; NUNC)를 코팅 완충액 중 1.5 ㎍/mL 농도의, BAMB31_1로부터의 단일클론 항체로 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 세척하고, 실온에서 1 내지 4시간 동안 PBS 중 0.1% 카세인으로 블로킹하였다. 표준물을 HRPO-표지 2차 항체(JRF/cAβ40/28-HRPO 또는 JRF/cAβ42/26-HRPO)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 제조업체의 권고사항에 따라 TMB 퍼옥사이드 EIA 기질 키트(Biorad)를 사용하여 검정을 전개하였다.

결과: BAMB31은, Aβ3pE-40(서열 번호 40) 및 Aβ3pE-42(서열 번호 51)에 대해서는 선택적 결합을 가지며, 인간 Aβ1-40(서열 번호 41), 인간 Aβ1-42(서열 번호 48) 및 설치류 Aβ3pE-40(서열 번호 45) 및 인간 AβpE11-40(서열 번호 49) 및 AβpE11-42(서열 번호 50)와는 최대 10 ng/mL까지의 농도에서 검출가능한 교차-반응성을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다(도 4).

실시예 7: 유전자도입 마우스 및 인간 AD 뇌 조직에서 플라크에 대한 항체 반응성을 시험하기 위한 면역조직화학

플라크에 대한 항체의 반응성을 포르말린 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 것뿐만 아니라 동결보존된 뇌 조직 둘 모두에서 조사하였다.

재료 및 방법

포르말린 고정되고 파라핀 포매된 뇌: 면역조직화학 분석을 위하여, 절편의 탈파라핀 및 재수화 후에, 유전자도입 마우스 뇌 슬라이드를 포름산(증류수 중 70%) 중에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 항원 회복을 수행하고, 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% 과산화수소(DAKO; 덴마크 글로스트럽 소재, S2023)로 블로킹하였다. 절편을 BAMB246(huIgG1 키메라), BAMB674 또는 BAMB675(작업 농도: 백그라운드 감소 성분(DAKO, S3022)을 갖는 항체 희석제 중 4 ㎍/ml)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후에, HRP-표지 항-인간 2차 항체(PI-3000, Vector labs - 항체 희석제(DAKO, S0809) 중 1/500)를 1시간 동안 슬라이드에 적용한 후, 3,3-다이아미노벤지딘(DAB)(DAKO, K3468)으로 발색성 표지화를 수행하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색하고, 탈수시키고, Vectamount(H-5000, Vector Labs)로 영구적으로 마운팅하였다.

동결보존된 뇌: 인간 뇌 샘플을 급속-냉동시키고(snap-frozen), 크라이오스탯(cryostat)(20 μm 두께)을 사용하여 슬라이싱하고, 사용 전까지 -80℃에서 저장하였다. 절편을 실온에서 건조시킨 후, 포르말린 고정, 3% 과산화수소(DAKO, 덴마크 글로스트럽 소재, S2023)에 의한 내인성 퍼옥시다제의 블로킹, 및 PBS1x + 0.3% Triton X-100 및 10% 정상 염소 혈청(DAKO, X0907) 중에서의 1시간 블로킹을 수행하였다. 1차 항체 pE3/16(백그라운드 감소 성분(DAKO, S3022)을 갖는 항체 희석제 중 2 ㎍/ml)을 1시간 동안 절편에 적용하였다. 광범위한 세척 후에, 슬라이드를 HRP-접합된 항-마우스 2차 항체(Envision, DAKO, K4000)와 함께 인큐베이션한 후, 발색성 DAB 표지화(DAKO, K3468)를 행하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색하고, 탈수시키고, 유기 마운팅 배지(Vectamount, Vector labs)로 마운팅하였다. Hamamatsu Nanozoomer(Hamamatsu Photonics; 일본 시즈오카 소재)를 사용하여 이미징을 수행하였다.

결과: 유전자도입 마우스의 FFPE 조직에 대해 BAMB264(인간 IgG1 키메라)뿐만 아니라 BAMB674 및 BAMB675의 반응성이 입증되었다(도 5a 내지 도 5f). 더욱이, BAMB31_2a(mIgG2a)는 동결보존된 AD 뇌 조직에서 실질적인 플라크 표지화를 보여주었다(도 6). 항체 4G8에 의해 검출된 플라크의 실질적인 분획이 또한 인간 뇌의 동결절편에서 BAMB31로 표지된다(도 5a 내지 도 5f). ++

실시예 8: 유전자도입 마우스에서의 투여 후의 혈청 항체 수준

BAMB31 및 비교기준물 분자 mE8c로 처리한 후의 혈청 항체 수준을 조사하였다.

재료 및 방법: 인간 Aβ42 및 Aβ40 펩티드의 상승된 수준을 발현하는 노령 유전자도입 마우스(22 내지 23개월령)는 20 mg/㎏의 mE8c mIgG2a, BAMB31_2a(mIgG2a) 또는 동종형 대조 항체 mIgG2a(처리군당 마리수 n = 5)의 단회 복막내(i.p.) 주사를 제공받았다. 항체 투여 후, 희생 시점(주사 후 일수 4)에서 대복제 정맥을 통해 그리고 안와 천자를 통해 중간 시점(주사 후 24시간 및 48시간)에서 전혈을 MICROVETTE® 수집 튜브(각각 100Z 및 300Z; Sarstedt; 독일 뉨브레흐트 소재) 내에 수집하였다. 수집된 전혈을 실온에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하고, 후속으로 4℃에서 10분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하여 혈병으로부터 혈청을 단리하였다. 동종이인자형-특이적 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 혈청 항체 수준을 결정하였다. 이를 위하여, Nunc MaxiSorp™ 편평바닥 플레이트(Thermo Scientific; 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 1.5 ㎍/ml의 마우스 단일클론 항-IgG2a(a)(BD Biosciences; 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)로 실온에서 하룻밤 코팅하였다. 항체 표준물 mE8c mIgG2a, BAMB31_2a(mIgG2a), 및 동종형 대조군 mIgG2a를 블로킹 완충액(PBS 완충액 중 1% BSA + 0.05% Tween-20) 중에 1 ㎍/ml로 개별적으로 제조하고, 블로킹 완충액 중에 0.1 ng/ml까지 낮추어서 추가로 희석시켰다. 세척(PBS 완충액 + 0.05% Tween-20) 후에, 샘플을 실온에서 1시간 동안 블로킹 완충액으로 블로킹하였다. 다음으로, 표준물 및 사전희석된 혈청 샘플을 코팅된 MAXISORP™ 플레이트에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 퍼옥시다제-AffiniPure 염소 항-마우스 IgG(Fcy 하위클래스 2a 특이적) 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, TMB 퍼옥시다제 EIA 기질 키트(1-단계, Pierce)를 웰에 첨가함으로써 발현시켰다. 웰 및 플레이트에 2 N H₂SO₄를 첨가하여 2분 후에 발색을 정지시키고, 플레이트를 EnVision 다중모드 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 450 nm에서 판독하였다.

결과: 혈청 항체 수준을 20 mg/㎏의 항체의 복막내 주사 후 24시간째, 48시간째, 그리고 4일째에 측정하였다. 혈청 중의 평균 항체 농도는 조사된 모든 항체에 대해 24시간 후에 유사하였다. BAMB31_2a 및 동종형 대조 항체의 경우, 항체 농도의 감소가 시간 경과에 따라 점진적으로 일어난 반면(일수 4에서 최대 대략 30%까지 감소), mE8c에 대해서는 시간 경과에 따른 명확히 더 높은 감소가 관찰될 수 있었는데, 이때 일수 4에서 대략 97%의 감소가 있었다(도 7).

결론적으로, 플라크-침착(plaque-depositing) 마우스 모델에서 BAMB31_2a와 mE8c의 i.p. 주사 후의 약동학적 프로파일에서 차이가 나타났는데, 이는 mE8c와 대비하여 BAMB31_2a 항체에 의한 처리 후의 더 느린 클리어런스를 나타낸다.

실시예 9: 유전자도입 마우스 모델에서의 만성 효능 연구

BAMB31_2a mIgG2a에 의한 만성 처리 후의 감소하는 아밀로이드 부하에 대한 효능뿐만 아니라 미세출혈에 대한 효과를 유전자도입 마우스 모델에서 조사하였다.

재료 및 방법: PDAPP(V717F) 유전자도입 마우스(연구 시작 시점에서 평균 18.3개월령)를 12주 동안 매주 30 mg/㎏의 i.p. 용량의 BAMB31_2a 항체(mIgG2a)로 처리하였다. mIgG2a 동종형 대조 항체 주사를 제공받은 대조군을 이 실험에 포함시켰다. 동물을 최종 i.p. 주사 후 일수 7에서 안락사시켰다(연구 종료 시점에서 평균 21.1개월령). 마우스는 조직 수집 전에 PBS에 의한 관류를 제공받았다. 좌측 반구(분획 1: 해마, 분획 2: 해마/소뇌/뇌간이 없는 나머지 뇌)는 추가의 생화학적 분석을 위해 동결보존한 반면, 우측 반구는 포르말린-기반 고정제 중에서 하룻밤 고정시킨 후, 파라핀 포매 및 마이크로톰(microtome)에 의한 슬라이싱(5 μm)을 수행하였다.

만성 치료 후 아밀로이드 부하에 대한 효과를 평가하기 위하여, 생화학적 분석 및 면역조직화학적 분석 둘 모두를 수행하였다. 생화학적 분석을 위하여, Tallprep D 용해 매트릭스 튜브(MP Bio)를 이용하여, 빙랭된 5 M 구아니딘-HCl 및 50 mM Tris/HCl 추출 완충액(100 mg 조직/ml 추출 완충액) 중에서 뇌를 균질화하였다. 균질화 후에, 샘플을 실온에서 3시간 동안 엔드-오버-엔드(end-over-end) 회전 휠에 넣어두었다. 생성된 균질액을 MSD 샌드위치 면역검정에 의한 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.

합성 Aβ 펩티드 표준물을 0.1 mg/mL로 다이메틸설폭사이드(DMSO)(Sigma) 중에 용해시키고, -80℃에서 저장하였다. MSD 면역검정에서 사용하기 위하여, 펩티드를 0.5 M GuHCl + 5 mM Tris-HCl(pH 8.0) 중에서 추가로 희석시켰다(PBS 중 0.1% 카세인 중의 추출 완충액의 10배 희석). GuHCl 추출물을 해동시키고, 빙랭된 PBS 중 0.1% 카제인 중에 1:10으로 희석시키고, 4℃에서 20분 동안 20,000 g로 원심분리하였다. 상층액을 샌드위치 MSD 검정에서의 사용을 위해 회수하고, 0.5 M GuHCl + 5 mM Tris-HCl(pH 8.0) 중에서 추가의 샘플 희석(PBS 중 0.1% 카세인 중의 추출 완충액의 10배 희석)을 수행하였다.

96웰 섹터 플레이트 표준물(Meso Scale Discovery; 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 PBS 중 1.5 ㎍/mL 농도의 단일클론 항체로 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 세척하고, 실온에서 2시간 동안 PBS 중 0.1% 카세인으로 블로킹하였다. 표준물 및 샘플들을 비오틴-표지 2차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 2차 검출 시약(Streptavidin-SULFO-TAG™ 표지됨)과 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 2X 판독 완충액(Read Buffer) T를 첨가하고, 이후에 플레이트를 제조업체의 권고사항에 따라 판독하였다. 1/Y² 가중 함수를 갖는 4-파라미터 로지스틱 모델과 함께 표준 곡선을 사용하여 Aβ 농도를 결정하였다.

JRF/AβN/25 + 4G8-비오틴 항체 병용물을 사용하여 뇌 균질액 중의 Aβ1-x 농도를 조사하였다.

면역조직화학 분석을 위하여, 절편의 탈파라핀 및 재수화 후에, 슬라이드를 포름산(증류수 중 70%) 중에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 항원 회복을 수행하고, 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% 과산화수소(DAKO; 덴마크 글로스트럽 소재, S2023)로 블로킹하였다. 절편을 백그라운드 감소 성분(DAKO, S3022)을 갖는 항체 희석제 중에 1/2000으로 희석된 비오티닐화 4G8 항체(Biolegend; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)와 함께 하룻밤 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후에, 스트렙타비딘-HRP(PK6100 Elite, Vector labs)를 30분 동안 슬라이드에 적용한 후, 3,3-다이아미노벤지딘(DAB)(DAKO, K3468)으로 발색성 표지화를 수행하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색하고, 탈수시키고, Vectamount(H-5000, Vector Labs)로 영구적으로 마운팅하였다. NanoZoomer 슬라이드 스캐너(Hamamatsu Photonics)를 사용하여 이미지(20x)를 생성하고, Matlab/Phaedra로 분석하였다. 관심 영역(ROI)을 프랭클린 및 팍시노스 도해서(Franklin and Paxinos atlas)(문헌[Franklin KB, Paxinos G. Mouse brain in stereotaxic coordinates. Waltham: Academic Press; 1997])에 따라 수작업으로 묘사하고, 각각의 ROI에 대해 총 면적당 DAB-표지 면적의 백분율을 계산하였다.

미세출혈에 대한 효과를 평가하기 위하여, 페를스 염색(Perls' staining)을 수행하였다. 간략하게 말하면, 파라핀 포매된 조직 절편을 하기에 기재된 프로토콜에 따라 산성 페로시아나이드 용액으로 처리하였다. 미세출혈액 내에 존재하는 제2철 이온(Fe³⁺)은 페로시아나이드와 조합하여 프러시안 블루로 불리는 청색 안료의 형성을 가져올 것이다. 탈파라핀 및 재수화 후에, 절편을 2% 페로시안화칼륨(Sigma-Aldrich) 및 2% 빙염산(glacial hydrochloric acid)(Sigma-Aldrich)의 1/1 혼합물 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 증류수 중에서 3회 헹군 후에, 뉴클리어 패스트 레드(nuclear fast red)에 의한 대비염색을 수행한 후, 증류수 중에서 헹구고, 탈수시키고, 마운팅하였다(Vectamount, Vector Labs). NanoZoomer 슬라이드 스캐너(Hamamatsu Photonics)를 사용하여 이미징을 행하였다. 수막 부근의 페를스 양성 세포의 수를 수동으로 계수하였다.

결과: 전반적으로, 기저선, 동종형 대조군 및 BAMB31 처리군에서는 소수의 미세출혈이 관찰되었다(도 8). 생화학적 분석은 해마에서의 Aβ1-x 농도에 대하여 동종형 대조 항체와 대비하여 BAMB31_2a에 대해 34%(p < 0.0001) 감소를 보여주었다(도 9). 추가적으로, 항체 4G8에 대한 면역조직화학은 해마 및 피질에 대하여 동종형 대조 항체와 대비하여 각각 23%(p < 0.0001) 및 37%(p < 0.001) 감소를 보여주었다.

결론적으로, 플라크-침착 마우스 모델에서 BAMB31의 만성 i.p. 주사 후에 미세출혈 발생의 증가를 야기하지 않고서 아밀로이드 부하의 감소에 대한 효능이 입증되었는데, 이는 BAMB31 항체에 의한 처리 후의 효능 vs. 독성의 유리한 비를 나타낸다.

실시예 10: BAMB31 HFA mAb의 약동학적 특성

야생형 IgG1(BAMB674) 및 +YTE IgG1(BAMB675) 동종형으로서의 BAMB31 HFA mAb의 약동학적 특성을 말초 순환 및 뇌에서의 특성들의 직접 비교를 위하여 사이노몰거스 원숭이에서 평가하였다.

재료 및 방법: 군당 3 마리의 동물에게 각각의 mAb의 25 mg/㎏ 정맥내(i.v.) 볼루스 주사를 투여하고, 혈청 샘플을 5주의 기간에 걸쳐 수집하였다. 3 마리의 추가의 원숭이에게 주수 6에서 각각의 mAb의 25 mg/㎏ i.v. 볼루스 주사를 투여하고, 투여 후 일수 7 및 일수 42에서 각각의 군으로부터 뇌 조직을 수집하였다. 총합하면, 각각의 분자에 대해 일수 7 및 42에서 3 마리의 사이노몰거스 원숭이로부터 뇌 샘플을 수집하였다.

생체내 사이노몰거스 원숭이 혈청 및 뇌 조직 샘플로부터의 BAMB674 및 BAMB675에 대한 약물 노출 분석을 Meso Scale Discovery(MSD) Sector Imager S600 상에서의 종점 결정과 함께 개별적인 목적 적합적(fit-for-purpose) 전기화학발광 면역검정(electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA) 방법을 사용함으로써 수행하였다. 하나의 검정 포맷을 각각의 화합물 및 매트릭스에 적용하였으며, 이는 노출을 측정하기 위한 4가지의 독립적인 방법을 생성하였다. 이 포맷은 하기와 같이 설명된다: mAb 화합물을 포획하고, 항-인간 Fc 특이적(CH2 도메인) 마우스 mAb로 검출하였다. 뇌 조직 준비를 위하여, 급속 냉동된 조직을 동결-분쇄하고 완충액 중에 희석시킴으로써 균질액을 제조하였다. 조직의 단백질 농도를 BCA 검정을 사용하여 검증 및 정규화하여 이 방법에 사용된 최종 단백질 농도를 산출하였다. 1/Y2 표준 곡선 가중화와 함께 5-파라미터 로지스틱(자가-추정) 적합을 사용하여 Watson LIMS 소프트웨어에서 원시 데이터 회귀를 수행하였다.

중추 구획 내로의 정맥내(i.v.) 투여(Admin), 구획간 클리어런스(Q) 및 선형 클리어런스(CL)를 갖는 2-구획(중추(V_C) 및 조직(V_T) 구획) 약동학적(PK) 모델을 사용하여 사이노몰거스 원숭이에서 BAMB674 및 BAMB675의 PK를 특성화하였다. 도 10은 모델 개략도를 나타낸다.

결과: 각각의 항체에 대한 최종 반감기를 계산하였으며, 사이노몰구스 원숭이 데이터 및 2-구획 모델 적합과 함께 도 11에 나타나 있다. +YTE IgG1 동종형(BAMB675)은 야생형 IgG1 동종형(BAMB674)과 대비하여 반감기가 약 1.6배 증가하였다. 이는 표 5에 나타낸 야생형 IgG1 mAb(BAMB674)에 비하여 +YTE 동종형(BAMB675)의 FcRn 친화도가 약 3배 증가된 것과 상관된다.

영역들에 걸친 그리고 mAb간의 뇌 용해물 수준이 일수 7에서는 유사하지만, 일수 42에서는 단지 YTE mAb만이 뇌 영역들 및 동물들에 걸쳐 일관되게 검출된다. 이의 결과가 도 12에 나타나 있다. 이는 이후의 시점에서의 +YTE mAb의 증가된 노출과 일치한다.

본 발명 및 그의 다양한 실시 형태를 기술함에 있어서, 명확함을 위해 특정 용어가 사용된다. 그러나, 본 발명은 그렇게 선택되는 특정 용어에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 다른 등가의 구성요소가 사용될 수 있고 다른 방법이 본 발명의 광범위한 개념을 벗어나지 않고서 개발될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서의 어디에서든 인용된 모든 참고 문헌은 마치 각각이 개별적으로 포함된 것처럼 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Phamaceutica NV <120> Antibodies to Pyroglutamate Amyloid-B and Uses Thereof <130> JAB7013WOPCT1 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 1 Ser Tyr Asp Met Tyr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 2 Tyr Ile Asp Ser Asp Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 3 Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Arg Ala Lys Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 5 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 6 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 7 Tyr Ile Asp Ser Asp Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 8 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 9 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 9 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Val Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Ser Asp Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Tyr Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro 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Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 43 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human A(beta)1-28 <400> 43 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 44 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human A(beta)3pE-28 scrambled <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate residue <400> 44 Glu Gly Phe Asp Ser Arg His Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 45 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse A(beta)3pE-40 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate residue <400> 45 Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val 35 <210> 46 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse A(beta)3pE-28 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate residue <400> 46 Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide boost <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate residue <400> 47 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Cys 1 5 <210> 48 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A(beta)1-42 <400> 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 49 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A(beta)11pE-40 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate residue <400> 49 Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser 1 5 10 15 Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 20 25 30 <210> 50 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A(beta)11pE-42 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate residue <400> 50 Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser 1 5 10 15 Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 20 25 30 <210> 51 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A(beta)3pE-42 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate residue <400> 51 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 1 5 10 15 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30 Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 52 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 52 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Arg Ala Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 53 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 53 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Arg Ala Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 54 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Arg Ala Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 55 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Arg Ala Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 56 Gly His Val Phe Thr Ser Tyr Asp Met Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 57 Asp Ser Asp Asn Gly Asp Thr Ser 1 5 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 58 Tyr Ile Asp Ser Asp Ser Gly Asp Thr Ser 1 5 10

Claims (17)

1. 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
   하기의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며:
   a. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6;
   b. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 4, 5, 및 6;
   c. 각각 서열 번호 1, 7, 3, 8, 5, 및 6;
   d. 각각 서열 번호 1, 2, 3, 8, 5, 및 6;
   e. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 8, 5, 및 6;
   f. 각각 서열 번호 56, 57, 3, 4, 5, 및 6;
   g. 각각 서열 번호 56, 58, 3, 4, 5, 및 6;
   h. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 8, 5, 및 6;
   i. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 8, 5, 및 6;
   j. 각각 서열 번호 56, 7, 3, 4, 5, 및 6;
   k. 각각 서열 번호 1, 57, 3, 4, 5, 및 6;
   l. 각각 서열 번호 1, 58, 3, 4, 5, 및 6; 또는
   m. 각각 서열 번호 56, 2, 3, 4, 5, 및 6;
   상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 3pE Ab, 바람직하게는 인간 3pE Ab에 특이적으로 결합하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 또는 21과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 또는 서열 번호 10, 12, 14, 18, 22, 53, 또는 55와 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 제1항에 있어서,
   a. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 22의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   b. 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   c. 서열 번호 11의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   d. 서열 번호 13의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   e. 서열 번호 15의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   f. 서열 번호 16의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   g. 서열 번호 20의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   h. 서열 번호 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   i. 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역;
   j. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 53의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 또는
   k. 서열 번호 21의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 55의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 키메라 형태인, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 인간화 형태인, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
6. 단리된 단일클론 항체로서,
   a. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;
   b. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 38을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;
   c. 서열 번호 37을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 52를 포함하는 경쇄 아미노산 서열; 또는
   d. 서열 번호 39를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 54를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단일클론 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
8. 제7항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
9. 제8항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
11. 베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성과 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제10항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)인, 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 질환은 삼염색체성(Trisomy) 21(다운증후군)과 관련된 치매, 미만성 루이소체병, 봉입체 근염, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 및 네덜란드형의 아밀로이드증을 동반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
14. 알츠하이머병과 관련된 플라크의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 플라크를 감소시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제10항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
15. 3pE Aβ의 시딩 활성(seeding activity)의 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 시딩 활성을 예방하는 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제10항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법으로서,
    상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에서 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 방법으로서,
    상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 상기 약제학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는, 방법.
    

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