KR20230129449A - 개선된 Aβ 프로토피브릴 결합 항체 - Google Patents

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샬롯 네렐리우스
한나 로든
제시카 시그바드슨
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바이오악틱 에이비
에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 관한 것으로 더욱 구체적으로는 Aβ 프로토피브릴에 결합하는 항체 및 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상의 치료 및/또는 예방적 처리에서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 사용에 의한 이런 질환의 진단뿐만 아니라 질환 진행의 관찰에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 수의학적 사용에 관한 것이다.

Description

개선된 Aβ 프로토피브릴 결합 항체{Improved Aβ Protofibril Binding Antibodies}
본 발명은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 관한 것으로 더욱 구체적으로는 Aβ 프로토피브릴에 결합하는 항체 및 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상의 치료 및/또는 예방적 처리에서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 사용에 의한 이런 질환의 진단뿐만 아니라 질환 진행의 관찰에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 수의학적 사용에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 신경퇴행성 장애의 그룹에 속하며 인지, 기억 및 행동 장애를 유발한다. 알츠하이머병의 특징은 세포외 아밀로이드 플라크, 신경내 신경 원섬유 엉킴, 신경세포 기능장애 및 궁극적으로 뇌 위축을 포함한다. AD 발생 위험은 고령 인구의 삶의 질에 대한 영향이 증가하는 조건인 고령 인구의 나이 및 증가하는 숫자와 함께 증가한다. 또한, 사회는 비용이 상승하는 상황에 직면한다.
상기 질환이 수년 동안 알려져 왔고 치료를 위한 여러 제안이 있었다는 사실에도 불구하고, 오늘날에도, 현재 이용가능한 이런 유효한 질환 조절 치료는 없고 단지 대증요법을 제공할 수 있는 약물이 존재한다. 상기 질환에 숨겨져 있는 기전은 많은 연구를 필요로 한다. 간단히 말해, 어떤 이유로 Aβ는 응집되기 시작하고 여러 중간 형태를 통해, 마침내 뇌에 불용성 피브릴/플라크 퇴적물을 생성한다. 플라크는 뉴런과 뉴런에 의해 전달되는 신호에 영향을 미친다는 것이 초기에 믿어졌지만, 오늘날 광범위한 연구의 결과는 용해성이고, 응집된 중간 형태의 Aβ가 환자에서 관찰된 질환과 증상의 주요 원인이라는 것을 나타낸다.
Aβ 단량체로부터 불용성 Aβ 프로토피브릴까지 응집 형태의 케스케이드에서 하나의 중간 형태는 The Journal of Biological Chemistry(Vol.272 (35) p. 22364-72)에 1997년 왈쉬에 의해 처음 기술된 용해성, 고 분자량 Aβ 프로토피브릴이다. AD의 발생에 대한 Aβ 프로토피브릴의 중요성은 Aβ 프로토피 브릴의 형성 증가를 일으키는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 E693G 돌연변이인 북극 돌연변이 연구에서, Uphsala 대학의 Lars Lannfelt가 이끄는 과학자 그룹에 의해 밝혀졌다. 이 돌연변이를 가지고 있는 스웨덴 북부의 한 가족이 일찍이 심한 알츠하이머병을 일으키는 것으로 발견되었고 이 조합의 발견은 새로운 치료법에 대한 기본 아이디어를 제공했다. 따라서, Aβ 프로토피브릴은 질병 및 치료의 중요한 목표와 밀접한 관련이 있음이 확인되었다. 란펠트 등은 북극 변이를 포함하는 Aβ 펩타이드에 대한 연구에 기초하여, Aβ 프로토피브릴에 대한 높은 친 화성을 갖는 항체의 면역화 및 후속 선택에 충분한 양으로, 북극뿐만 아니라 야생형의 Aβ 프로토피브릴을 생체외로 생산할 수 있었다. Aβ 시스템의 다른 종. Aβ 프로토피브릴 및 이들에 결합하는 항체의 생산 방법의 예는 WO02 / 03911 및 WO 2005 / 123775에 개시되어 있다.
특히 중요한 것은 다음의 CDR 서열을 포함하는 EP2004688에 개시된 Aβ 프로토피브릴에 결합하는 항체인 생쥐 단클론 항체 mAb158의 개발이었다:
VH-CDR1: SFGMH SEQ ID NO: 1
VH-CDR2: YISSGSSTIYYGDTVKG SEQ ID NO: 2
VH-CDR3: EGGYYYGRSYYTMDY SEQ ID NO: 3
VL-CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 4
VL-CDR2: KVSNRFS SEQ ID NO: 5
VL-CDR3: FQGSHVPPT SEQ ID NO: 6
mAb158의 인간화 버전인, BAN2401의 높은 친화성 및 선택성은 이를 특히 알츠하이머 병의 치료 및/또는 예방에 사용하기에 매우 중요한 후보 물질로 만들며, 현재 의약품으로 사용하기 위한 제제로 임상 시험을 받고 있다. BAN2401의 특성은 EP2004688에 기술되어 있다.
항체의 효능은 여러 약물동력학 및 약물역학 요인에 의해 결정되며, 예를 들어, Deng et al, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol 8(2) (2012): p. 141-160; Boswell et al, Bioconjugate Chem. 21(2010): p. 2153-2163; Konterman, Current Opinion in Biotechnology 22 (2011): p. 1-9 and Igawa et al, mAbs 3:3 (2011): p. 243-252를 참조한다. 이들 중에서, 증가된 전신 노출을 가진 연장된 혈청 반감기는 종종 상당한 치료 가치의 현저한 개선 가능성을 제공한다. 이는 또한 전신이며, 중요한 영향을 가지는 복용량 감소 기회를 제공한다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 Aβ 프로토피브릴에 결합하는 항체 및 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 질환의 치료 및/또는 예방적 처리에서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이런 질환의 진단에 유용한 항체뿐만 아니라 상기 질환의 진행의 관찰에서 이의 용도 및 상기 항체의 수의학적 사용에 관한 것이다. 놀랍게도, mAb158에 기초한 인간화 항체, 즉 BAN2401의 반감기뿐만 아니라 노출은 주로, BAN2401 항체(Kabat 위치 17, 74 및 77)의 가변 경쇄의 특정 위치, 즉 17, 79 및/또는 82에 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 상당히, 예를 들어, 약 2배 이상, 강화되었고, 이들 위치가 x1, x2 및 x3으로 언급된 도 9를 추가로 참조한다. BAN2401에서 위치 17(Kabat 위치 17)의 아미노산은 A이고, 위치 79의 아미노산(Kabat 위치 74)은 R이고 위치 82(Kabat 위치 77)의 아미노산은 R이다. 카밧 번호 매김은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991 (NIH Publications No. 91-3242)에 따라 제공된다.
선택적으로, 본 발명에 따른 항체의 추가 개선은 면역학적 중요성, 즉 낮은 면역원성의 추가 개선을 위해, 증가된 반감기를 제공하는 각각의 돌연변이를 하나 이상의 이웃 돌연변이, 즉 항체(Kabat 위치 13, 21, 76 및 79)의 가변 경쇄의 13, 21, 81 및/또는 84, 이들 위치가 y1-4로 언급된 도 9 추가 참조, 항체(Kabat 위치 37, 38 및 40)의 가변 중쇄의 37, 38 및/또는 40, 이들 위치가 z1-3으로 언급된 도 10 추가 참조, 와 조합함으로써 성취될 수 있다. BAN2401 서열과 비교하여, x1이 돌연변이 되면, 돌연변이 y1 및/또는 y2가 도입될 수 있고, x2 및/또는 x3이 돌연변이 될 때, 돌연변이 y3 및/또는 y4가 도입될 수 있다. 또한, 돌연변이 z1-3이 도입될 수 있다.
본 발명은 다음과 같다 :
[1] Aβ 프로토피브릴에 대해 친화성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 8에 따른 가변성 경쇄, 여기서
x1은 A, D, E 및 Q, 또는 이의 기능적 유사체로부터 선택되며;
x2는 R, T, K, A 및 G, 또는 이의 기능적 유사체로부터 선택되며;
x3는 R, S, C, G 및 N, 또는 이의 기능적 유사체로부터 선택되며;
y1은 V 및 A로부터 선택되며;
y2는 I 및 V로부터 선택되며;
y3는 S 및 Q로부터 선택되며;
y4는 E 및 D로부터 선택되며; 및 선택적으로
SEQ ID NO: 14에 따른 가변성 중쇄를 가지며, 여기서
z1은 V 및 I로부터 선택되며;
z2는 R 및 Q로부터 선택되며;
z3는 A, N 및 T로부터 선택되며
조합 x1=A, x2=R 및 x3=R은 예외로 한다.
[2] [1]에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 여기서
x1은 A, D, E 및 Q로부터 선택되며;
x2는 R, T, K, A 및 G로부터 선택되며;
x3는 R, S, C, G 및 N으로부터 선택되며;
y1은 V 및 A로부터 선택되며;
y2는 I 및 V로부터 선택되며;
y3는 S 및 Q로부터 선택되며;
y4는 E 및 D로부터 선택되며; 및
SEQ ID NO: 14에 따른 가변성 중쇄, 여기서
z1은 V 및 I로부터 선택되며;
z2는 R 및 Q로부터 선택되며;
z3는 A, N 및 T로부터 선택되며;
조합 x1=A, x2=R 및 x3=R은 예외로 한다.
[3] [1] 또는 [2]에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 경쇄는 다음으로부터 선택된 돌연변이의 조합을 포함한다:
x1 및 (y1 및/또는 y2);
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x2 및 (y3 및/또는 y4);
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x2 및 x3 및 (y3 및/또는 y4);
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x3 및 (y3 및/또는 y4);
x2 및 (y3 및/또는 y4);
x2 및 x3 및 (y3 및/또는 y4); 및
x3 및 (y3 및/또는 y4);
조합 x1=A, x2=R 및 x3=R은 예외로 한다.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 가변 경쇄는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다:
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며;
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며, x2는 T 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며, x2는 T이며, x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며 x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x2는 T 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x2는 T이며 x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
y1은 V 또는 A이며 y2는 V 또는 I이며, 조합 y1=V 및 y2=I는 예외로 하며; y3는 S 또는 Q이며 y4는 E 또는 D이며 조합 y3=S 및 y4=E는 예외로 한다.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 V 및 A로부터 선택되며;
y2는 V 및 I로부터 선택되며;
y3는 Q 및 S로부터 선택되며;
y4는 D 및 E로부터 선택되며;
z1는 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 N, T 및 A로부터 선택되며;`
y1이 V이며, y2가 I이며, y3가 S이며, y4가 E이며, z1이 V이며, z2가 R이고 z3가 A인 조합을 예외로 한다.
[6] SEQ ID NO: 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[7] SEQ ID NO: 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[8] SEQ ID NO: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[9] SEQ ID NO: 11로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[10] SEQ ID NO: 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[11] SEQ ID NO: 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[12] SEQ ID NO: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[13] SEQ ID NO: 11로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 [1]에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG 중쇄 불변 영역을 포함한다.
[15] 치료에 사용하기 위한 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 항체.
[16] 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 항체.
[17] 이상의 치료에 사용하기 위한 [16]에 따른 항체, Aβ 단백질 응집과 관련된 이런 다른 이상은 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택된다.
[18] 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상의 치료 및/또는 예방에 유용한 약물의 제조에서 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 따른 항체의 용도.
[19] [18]에 따른 용도, Aβ 단백질 응집과 관련된 이런 다른 이상은 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택된다.
[20] [1] 내지 [14]에 따른 치료적 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편을 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상에서 Aβ 프로토피브릴의 양을 감소시키는 방법.
[21] [1] 내지 [14]에 따른 치료적 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편을 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 알츠하이머병에 걸린 또는 걸릴 위험에 있는 대상의 상기 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
[22] [1] 내지 [14]에 따른 치료적 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편을 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상의 상기 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
[23] 사람의 조직 또는 체액을 생체내 또는 생체외로 [1] 내지 [14]에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 Aβ 프로토피브릴 및/또는 응집된 Aβ 단백질에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 사람의 Aβ 프로토피브릴 및/또는 응집된 Aβ 단백질의 양을 측정하는 방법.
[24] 사람의 조직 또는 체액을 생체내 또는 생체외로 [1] 내지 [14]에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계 및 응집된 Aβ 단백질에 결합된 상기 항체의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 알츠하이머 질환에 걸린 또는 걸릴 위험에 있는 사람의 상기 질환을 진단하는 방법.
[25] 사람의 조직 또는 체액을 생체내 또는 생체외로 [1] 내지 [14]에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계 및 응집된 Aβ 단백질에 결합된 상기 항체의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상의 상기 질환을 진단하는 방법.
[26] 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제와 함께, [1] 내지 [14] 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물.
[27] 수의학적 사용을 위한 [1] 내지 [14] 중 어느 한 항에 따른 항체.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 BAN2401(대조군)과 비교된 A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S에 대한 Aβ 단량체와 비교된 Aβ 프로토피브릴의 결합성 및 선택성의 분석을 제공한다. 용액 중의 Aβ1-42 프로토피브릴에 의한 결합 저해는 개방 원 및 개방 사각형으로 도시되고 용액 중 Aβ1-40 단량체에 의한 결합 저해는 폐쇄 원 및 폐쇄 정사각형으로 도시된다.
도 2는 시간 대 농도 그래프로서 제시된 생쥐에서 BAN2401 및 본 발명의 항체의 혈장 약물 노출을 제공한다. 투여 후 0.5시간, 2일, 7일, 15일 및 29일 시점에서 수집된 BAN2401, A17D, A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S의 단일 i.v. 주사 및 투여 후 0.5시간, 2일, 7일, 14일 및 28일 시점에서 수집된 시점에서 A17D/R82S의 단일 i.v. 주사 후 혈장 수준이 그래프에 도시된다. A17D/R82S는 여기에 표시된 다른 항체와 동일한 PK 연구에는 포함되지 않았지만, 개별 경우에 제공되었다. 그러나 두 개의 혈장 샘플링 시점을 제외하고, 두 개별 연구에 동일한 연구 설계가 사용되었다. 모든 혈장 샘플을 동일한 경우에 ELISA로 분석하여 분석 간 편차를 피하였다. μg/ml의 혈장 약물 농도는 y-축(로그 스케일)에 표시되고, 투여 후 시간(h)은 x-축에 표시된다. 평균 그룹 값은 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 도시된다. 평균 AUC0-inf 값 및 말단 반감기는 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 계산하였고 표 1에 도시된다.
도 3은 시간 대 농도 그래프로서 제시된 쥐에서 BAN2401 및 본 발명의 항체의 혈장 약물 노출을 제공한다. 투여 후 0.5시간, 2시간, 7시간, 24시간, 2일, 4일, 7일, 14일 및 29일 시점에서 수집된 BAN2401, A17D, A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S의 단일 i.v. 주사 후 혈장 수준이 그래프에 도시된다. μg/ml의 혈장 약물 농도는 y-축(로그 스케일)에 표시되고, 투여 후 시간(h)은 x-축에 표시된다. 평균 그룹 값은 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 도시된다. 평균 AUC0-inf 값 및 말단 반감기는 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 계산하였고 표 2에 도시된다.
도 4는 BAN2401과 비교된 A17D/R79T(A17D/R79T_DI1-8)의 탈면역화된 변이체에 대한 Aβ 모노머와 비교된 Aβ 프로토피브릴의 결합성 및 선택성의 분석 데이터를 제공한다. 용액 중 Aβ1-42 원형 세포질에 의한 결합 저해는 개방 원 및 개방 사각형으로 도시되고, 용액 중 Aβ1-40 단량체에 의한 결합 저해는 폐쇄 원 및 폐쇄 사각형으로 도시된다. A) A17D/R79T_DI1, B) A17D/R79T_DI2, C) A17D/R79T_DI3, D) A17D/R79T_DI4, E) A17D/R79T_DI5, F) A17D/R79T_DI6, G) A17D/R79T_DI7, H) A17D/R79T_DI8.
도 5는 시간 대 농도 그래프로서 제시된 생쥐에서 BAN2401 및 본 발명의 항체의 혈장 약물 노출을 제공한다. 투여 후 0.5시간, 2일, 7일, 14일 및 28일 시점에서 수집된 BAN2401, A17D/R79T 및 A17D/R79T(A17D/R79T_DI1-8)의 8개 탈면역화된 변이체의 단일 i.v. 주사 후 혈장 수준. μg/ml의 혈장 약물 농도는 y-축(로그 스케일)에 표시되고, 투여 후 시간(h)은 x-축에 표시된다. 평균 그룹 값은 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 도시된다. 평균 AUC0-inf 값 및 말단 반감기는 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 계산하였고 표 6에 도시된다.
도 6은 시간 대 농도 그래프로서 제시된 쥐에서 BAN2401 및 돌연변이체의 혈장 약물 노출을 제공한다. 투여 후 0.5시간, 2일, 7일, 14일 및 28일 시점에서 수집된 BAN2401, A17D/R79T 및 A17D/R79T(A17D/R79T_DI1-8)의 8개 탈면역화된 변이체의 단일 i.v. 주사 후 혈장 수준. μg/ml의 혈장 약물 농도는 y-축(로그 스케일)에 표시되고, 투여 후 시간(h)은 x-축에 표시된다. 평균 그룹 값은 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 도시된다. 평균 AUC0-inf 값 및 말단 반감기는 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 계산하였고 표 7에 도시된다.
도 7은 시간 대 농도 그래프로서 제시된 시노몰구스 원숭이(Cynomolgus monkey)의 BAN2401, A17D/R79T_DI3, A17D/R79T_DI4 및 A17D/R79T_DI8의 투여량 보정 혈장 약물 노출을 제공한다. 투여 후 5분, 1시간, 2시간, 8시간, 24시간, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일 및 28일 시점에서 수집된 BAN2401의 단일 i.v. 주사 및 투여 후 5분, 2시간, 8시간, 24시간, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일 시점에서 수집된 A17D/R79T_DI3, A17D/R79T_DI4 및 A17D/R79T_DI8의 단일 i.v. 주사 후 항체의 혈장 수준. 본 발명의 항체는 BAN2401(5 mg/kg)과 비교된 상이한 연구 및 상이한 투여량 (10 mg/kg)으로 원숭이에게 투여되었다. 따라서 혈장 노출 그래프는 투여량 조절되었다. mg/kg 주사된 투여량당 μg/ml의 투여량 보정 혈장 약물 농도는 y-축(로그 스케일)에 도시되고, 투여 후 시간(h)은 x-축에 도시된다. 평균 그룹 값은 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 도시된다. 투여량 조절 평균 AUC0-inf 값 및 말단 반감기는 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 계산하였고 표 8에 도시된다.
도 8은 본 발명에 관한 아미노산 서열을 제공한다.
도 9는 VL-CDR1-3 서열을 갖는 가변 경쇄의 아미노산 서열이 회색으로 표시된 두 페이지로 분할된 표를 제공한다. BAN2401 : SEQ ID NO : 7. 본 발명에 따른 가변 경쇄를 갖는 신규한 항체 : SEQ ID NO: 8. 이러한 가변 경쇄의 특정 예: i): SEQ ID NO: 9; ii): SEQ ID NO 10; iii): SEQ ID NO: 11; 및 iv) SEQ ID NO: 12.
도 10은 VH-CDR1-3 서열을 갖는 가변 중쇄의 아미노산 서열이 회색으로 표시된 세 페이지로 분할된 표를 제공한다. BAN2401 : SEQ ID NO : 13. 본 발명에 따른 가변 중쇄를 갖는 신규한 항체 : SEQ ID NO: 14. 이러한 가변 중쇄의 특정 예: i): SEQ ID NO: 15; ii): SEQ ID NO 16; iii): SEQ ID NO: 17; 및 iv) SEQ ID NO: 18.
도 11은 임상전 종 생쥐, 쥐 및 시노몰구스를 포함하는 BAN2401, A17D/R79T_DI3, A17D/R79T_DI4 및 A17D/R79T_DI8의 중앙 청소율(CL)의 간단한 알로메트릭 스케일링을 제공한다. 다른 종의 CL은 각각 체중(다이아몬드)에 대해 좌표로 나타내어진다. 회귀선은 체중 70kg의 남성에서 CL을 나타내기 위해 추정되었다. BAN2401의 경우, 측정된 실제 중앙 CL은 열린 정사각형으로 표시되며 생쥐, 쥐 및 시노몰구스 원숭이에서 BAN2401의 CL에 근거한 선형 회귀선에서 벗어난다. BAN2401은 본 발명의 항체의 CL의 우수한 선형 상관관계와 반대로, 반감기의 불확실한 예측을 나타내는 CL의 불량한 선형 상관관계를 보여주었다.
돌연변이 A17D, R79T 및 R82S는 BAN2401 항체에서 위치를 나타내며, 위치 17, 79 및 82에서 아미노산은 가변 경쇄에서 돌연변이된다.
"BAN2401"은 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 가변 중쇄를 포함하는 생쥐 항체 mAb158의 인간화 단일 클론 항체를 의미한다. VL-CDR1-3 및 VH-CDR1-3을 포함하는 BAN2401 및 mAb158 및 이의 특성은 EP2004688에 기술된다. BAN2401은 본 발명에서 제외된다.
이하 약어는 다음을 의미한다:
BAN2401: SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D: SEQ ID NO: 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T: SEQ ID NO: 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T/R82S: SEQ ID NO: 21에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R82S: SEQ ID NO: 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 1: SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 2: SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 3: SEQ ID NO: 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 4: SEQ ID NO: 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 5: SEQ ID NO: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 6: SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 7: SEQ ID NO: 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
A17D/R79T_DI 8: SEQ ID NO: 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 가변 경쇄에서 위치 17(Kabat 위치 17)에 아미노산 A, D, E, Q 또는 기능적 유사체, 위치 79(Kabat 위치 74)에 아미노산 R, T, K, A, G 또는 기능적 유사체 및 위치 82(Kabat 위치 77)에 아미노산 R, S, C, G, N 또는 기능적 유사체를 포함한다. 기능적 유사체는 항원과의 결합에 부정적인 영향을 미치지 않으며 각각 A(위치 17) 및 R(위치 79 및 82)과 비교하여 항체의 낮은 pI 값을 제공하는 아미노산이다.
본 발명의 아미노산 서열은 다음과 같이 제공된다:
SEQ ID NO: 1: BAN2401의 가변 중쇄 VH-CDR1.
SEQ ID NO: 2: BAN2401의 가변 중쇄 VH-CDR2.
SEQ ID NO: 3: BAN2401의 가변 중쇄 VH-CDR3.
SEQ ID NO: 4: BAN2401의 가변 경쇄 VL-CDR1.
SEQ ID NO: 5: BAN2401의 가변 경쇄 VL-CDR2.
SEQ ID NO: 6: BAN2401의 가변 경쇄 VL-CDR3.
SEQ ID NO: 7: BAN2401의 가변 경쇄.
SEQ ID NO: 8: 본 발명의 항체의 일반적 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 9: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 10: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 11: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 12: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 13: BAN2401의 가변 중쇄.
SEQ ID NO: 14: 본 발명의 항체의 일반적 가변 중쇄 서열.
SEQ ID NO: 15: 본 발명의 항체의 특정 가변 중쇄 서열.
SEQ ID NO: 16: 본 발명의 항체의 특정 가변 중쇄 서열.
SEQ ID NO: 17: 본 발명의 항체의 특정 가변 중쇄 서열.
SEQ ID NO: 18: 본 발명의 항체의 특정 가변 중쇄 서열.
SEQ ID NO: 19: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 20: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 21: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 22: 본 발명의 항체의 특정 가변 경쇄 서열.
SEQ ID NO: 23: 본 발명의 항체로 이루어진 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 24: 본 발명의 항체로 이루어진 인간 κ 사슬 불변 영역의 아미노산 서열.
BAN2401의 가변 경쇄(SEQ ID NO: 7) 및 본 발명의 항체는 3개의 CDR-서열(VL-CDR1-3):
VL-CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 4
VL-CDR2: KVSNRFS SEQ ID NO: 5
VL-CDR3: FQGSHVPPT SEQ ID NO: 6을 포함하며,
및 BAN2401의 가변 중쇄(SEQ ID NO: 13) 및 본 발명의 항체는 3개의 CDR-서열(VH-CDR1-3):
VH-CDR1: SFGMH SEQ ID NO: 1
VH-CDR2: YISSGSSTIYYGDTVKG SEQ ID NO: 2
VH-CDR3: EGGYYYGRSYYTMDY SEQ ID NO: 3을 포함한다.
본 발명의 한 양태에 따라, Aβ 프로토피브릴에 결합하는 항체가 제공되며, 다음 CDR 서열 조합:
VH-CDR1: SFGMH SEQ ID NO: 1
VH-CDR2: YISSGSSTIYYGDTVKG SEQ ID NO: 2
VH-CDR3: EGGYYYGRSYYTMDY SEQ ID NO: 3
VL-CDR1: RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO: 4
VL-CDR2: KVSNRFS SEQ ID NO: 5
VL-CDR3: FQGSHVPPT SEQ ID NO: 6을 가지며
SEQ ID NO: 8을 가진 가변 경쇄를 포함하며, x1은 A, D, E, Q 또는 기능적 유사체이며, x2는 R, T, K, A, G 또는 기능적 유사체이며 x3는 R, S, C, G, N 또는 기능적 유사체이며, 조합 x1=A, x2=R 및 x3=R을 예외로 한다.
기능적 유사체는 항원과의 결합에 부정적인 영향을 미치지 않으며 A(x1) 또는 R(x2 및 x3)과 비교하여 항체의 낮은 pI 값을 제공하는 아미노산이다.
가변 중쇄는 임의의 조합으로 z1, z2 및 z3를 포함하는 SEQ ID NO: 14로 제공된 아미노산 서열을 가지며
z1은 V 및 I로부터 선택되며;
z2는 R 및 Q로부터 선택되며;
z3는 A, N 및 T로부터 선택되며;
조합 z1=V, z2=R 및 z3=A는 예외로 한다.
이런 교시에 기초하여, 각각의 위치에 대해 상기 정의된 특정 아미노산에 대한 기능적 유사체의 동정은 당업자가 쉽게 수행할 수 있다는 것을 주목해야 하는데, 이는 본 발명에 따른 특정 위치에 아미노산을 도입하는 것뿐만 아니라 결과적인 생성물을 시험하기 위한 방법, 예를 들어, Aβ 프로토피브릴에 대한 친화성 및 다른 중요한 특성에 대해 시험하기 위한 방법이 개시되어 있기 때문이며, 아래를 참조하기 바란다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서 Aβ 프로토피브릴에 대해 친화성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 8에 따른 가변성 경쇄,
x1은 A, D, E 및 Q, 또는 이의 기능적 유사체로부터 선택되며;
x2는 R, T, K, A 및 G, 또는 이의 기능적 유사체로부터 선택되며;
x3는 R, S, C, G 및 N, 또는 이의 기능적 유사체로부터 선택되며;
y1은 V 및 A로부터 선택되며;
y2는 I 및 V로부터 선택되며;
y3는 S 및 Q로부터 선택되며;
y4는 E 및 D로부터 선택되며; 및 선택적으로
SEQ ID NO: 14에 따른 가변성 중쇄를 가지며,
z1은 V 및 I로부터 선택되며;
z2는 R 및 Q로부터 선택되며;
z3는 A, N 및 T로부터 선택되며
조합 x1=A, x2=R 및 x3=R은 예외로 한다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 A, D, E 및 Q로부터 선택되며;
x2는 R, T, K, A 및 G로부터 선택되며;
x3는 R, S, C, G 및 N으로부터 선택되며;
y1은 V 및 A로부터 선택되며;
y2는 I 및 V로부터 선택되며;
y3는 S 및 Q로부터 선택되며;
y4는 E 및 D로부터 선택되며; 및
SEQ ID NO: 14에 따른 가변성 중쇄,
z1은 V 및 I로부터 선택되며;
z2는 R 및 Q로부터 선택되며;
z3는 A, N 및 T로부터 선택되며;
조합 x1=A, x2=R 및 x3=R은 예외로 한다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 경쇄는 다음으로부터 선택된 돌연변이의 조합을 포함한다:
x1 및 (y1 및/또는 y2);
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x2 및 (y3 및/또는 y4);
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x2 및 x3 및 (y3 및/또는 y4);
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x3 및 (y3 및/또는 y4);
x2 및 (y3 및/또는 y4);
x2 및 x3 및 (y3 및/또는 y4); 및
x3 및 (y3 및/또는 y4);
조합 x1=A, x2=R 및 x3=R은 예외로 한다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 가변 경쇄는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다:
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며;
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며, x2는 T 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며, x2는 T이며, x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x1은 D 및 (y1 및/또는 y2)이며 x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x2는 T 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x2는 T이며 x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
x3는 S 및 (y3 및/또는 y4)이며;
y1은 V 또는 A이며 y2는 V 또는 I이며, 조합 y1=V 및 y2=I는 예외로 하며; y3는 S 또는 Q이며 y4는 E 또는 D이며 조합 y3=S 및 y4=E는 예외로 한다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 y1은 A이며, y2는 V이며, y3는 Q이며 y4는 D이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 V 및 A로부터 선택되며;
y2는 V 및 I로부터 선택되며;
y3는 Q 및 S로부터 선택되며;
y4는 D 및 E로부터 선택되며;
z1는 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 N, T 및 A로부터 선택되며;`
y1이 V이며, y2가 I이며, y3가 S이며, y4가 E이며, z1이 V이며, z2가 R이고 z3가 A인 조합을 예외로 한다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 V이며;
y2는 V이며;
y3는 Q이며;
y4는 E이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 N이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 V이며;
y2는 V이며;
y3는 S이며;
y4는 D이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 N이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 A이며;
y2는 I이며;
y3는 Q이며;
y4는 E이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 N이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 A이며;
y2는 I이며;
y3는 S이며;
y4는 D이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 N이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 V이며;
y2는 V이며;
y3는 Q이며;
y4는 E이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 T이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 V이며;
y2는 V이며;
y3는 S이며;
y4는 D이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 T이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 A이며;
y2는 I이며;
y3는 Q이며;
y4는 E이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 T이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서
x1은 D이며;
x2는 T이며;
x3는 R이며;
y1은 A이며;
y2는 I이며;
y3는 S이며;
y4는 D이며;
z1은 V이며;
z2는 R이며; 및
z3는 T이다.
본 발명의 한 양태에 따라, 각 돌연변이 x1-x3는 하나 이상의 다른 돌연변이 y1-y4와 결합된다:
x1이 A가 아닐 때, 돌연변이 y1 및/또는 y2가 도입되며;
y2가 R이 아니고 및/또는 x3가 R이 아닐 때, 돌연변이 y3 및 /또는 y4가 도입되며;
SEQ ID NO: 7과 비교된 돌연변이체의 다음 조합을 포함하는 가변 경쇄를 제공한다:
x1 및 (y1 및/또는 y2); 또는
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x2 및 (y3 및/또는 y4); 또는
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x2 및 x3 및 (y3 및/또는 y4); 또는
x1 및 (y1 및/또는 y2) 및 x3 및 (y3 및/또는 y4); 또는
x2 및 (y3 및/또는 y4); 또는
x2 및 x3 및 (y3 및/또는 y4); 또는
x3 및 (y3 및/또는 y4);
변수 x 및 y는 위에서 정의한 것과 같다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체의 경쇄(SEQ ID NO: 8) 또는 이의 항원 결합 단편은 가변 경쇄에서 하나 이상의 돌연변이 x1-x3(N-말단 넘버링을 사용)를 포함한다: A17D(x1), R79T(x2) 및 R82S(x3):
A17D; 또는
A17D 및 R79T; 또는
A17D 및 R79T 및 R82S; 또는
A17D 및 R82S; 또는
R79T; 또는
R79T 및 R82S; 또는
R82S;
여기서 y1은 V이며, y2는 I이며, y3는 S이며 y4는 E이다(SEQ ID NO: 7과 비교하여 변화 없음).
추가 실시태양에 따라, 다음 조합을 제공하는 돌연변이 y1-y4가 도입된다:
A17D 및 (y1 및/또는 y2);
A17D 및 (y1 및/또는 y2) 및 R79T 및 (y3 및/또는 y4);
A17D 및 (y1 및/또는 y2) 및 R79T 및 R82S 및 (y3 및/또는 y4);
A17D 및 (y1 및/또는 y2) 및 R82S (y3 및/또는 y4);
R79T (y3 및/또는 y4);
R79T 및 R82S 및 (y3 및/또는 y4);
R82S 및 (y3 및/또는 y4);
여기서 y1는 V 또는 A이며 y2는 V 또는 I이며, 조합 y1=V 및 y2=I을 예외로 하며, y3는 S 또는 Q이며 y4는 E 또는 D이며, 조합 y3=S 및 Y4=E을 예외로 한다.
추가 특정 조합들은 SEQ ID NOS: 9-12에 개시된다.
본 발명에 따른 항체의 가변 중쇄(VH)는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 14를 가지며, 여기서 z1은 V 또는 I이며, z2는 R 또는 Q이며 z3는 A, N 또는 T, 예를 들어 SEQ ID NO: 15-18이다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NOS: 9-12 중 어느 하나로 기재된 아미노산 서열로부터 선택된 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NOS: 15-18 중 어느 하나로 기재된 아미노산 서열로부터 선택된 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NOS:9-12 중 어느 하나로 기재된 아미노산 서열로부터 선택된 가변 경쇄; 및 SEQ ID NOS: 15-18 중 어느 하나로 기재된 아미노산 서열로부터 선택된 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다..
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 11로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 11로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
이런 양태의 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 12로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄; 및 SEQ ID NO: 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 본 발명에 참조로 포함된 Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에서 논의된 바와 같이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역 또는 이의 임의의 대립 변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 이런 서열 중 임의의 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다. 더욱 바람직한 한 실시태양에서, 항체 중쇄 불변 영역은 IgG1이다. 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며 SEQ ID NO: 23으로 기재된다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 본 발명에 참조로 포함된 Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에서 논의된 바와 같이 κ- 및 λ-사슬 불변 영역 또는 이의 임의의 대립 변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 포함한다. 이런 서열 중 임의의 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다. 더욱 바람직한 한 실시태양에서, 항체 경쇄 불변 영역은 κ이다. 인간 κ 불변 영역의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며 SEQ ID NO: 24로 기재된다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편 또는 단일 사슬 Fv 단편이다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 위에서 정의한 가변 경쇄 및 중쇄의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따라 예를 들어 본 발명에 따른 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 알츠하이머병 및 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)와 같은 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 환자에 투여함으로써 치료에 사용하기 위한 Aβ 프로토피브릴에 대한 높은 친화성을 가진 개선된 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다. 적절한 투여량은 선택된 주기, 예를 들어, 1회 투여, 매일, 매주, 분기 또는 더 적은 빈도의 투여 이외에, 의학적 징후 및 환자 상태, 투여 경로, 예를 들어, i.v., s.c., 주사 또는 국소 투여에 따라, 넓은 범위, 예를 들어, 0.01 내지 100 mg/kg/dose 내에서 변할 수 있다.
한 양태에서, 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다.
한 양태에서, 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 제공된다. 통상적으로, 이런 다른 이상은 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택될 수 있다.
한 양태에서, 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상의 치료 및/또는 예방에 유용한 약물의 제조에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 용도가 제공된다. 통상적으로, 이런 다른 이상은 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택될 수 있다.
한 양태에서, 사람에게 본 발명의 치료적 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하여 사람의 Aβ 프로토피브릴의 양을 감소시키는 방법이 제공된다.
한 양태에서, 사람에게 본 발명의 치료적 유효량의 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하여 질환에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상의 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 통상적으로, 이런 다른 이상은 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택될 수 있다.
"대상"은 통상적으로 인간과 같은 포유류이다. 다른 포유류는 수의학적 사용/치료/예방을 적용할 수 있는 이런 포유류를 나타낸다.
한 양태에서, 사람의 조직 또는 체액을 생체내 또는 생체외로 본 발명의 표지화된 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 Aβ 프로토피브릴 및/또는 응집된 Aβ 단백질에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 인간의 Aβ 프로토피브릴 및/또는 응집된 Aβ 단백질의 양을 측정하는 방법이 제공될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편은 탐지 목적을 위해, I131, C11, C14, H3, F18, 또는 Gallium68와 같으나 이런 방사성동위원소에 제한되지 않는 방사성활성 리간드로 표지화될 수 있다.
한 양태에서, 사람의 조직 또는 체액을 생체내 또는 생체외로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 응집된 Aβ 단백질에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 알츠하이머병 및 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)와 같은 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 사람의 상기 질환을 진단하는 방법이 제공될 수 있다. 통상적으로, 상기 다른 이상은 Aβ 단백질 응집과 관련이 있으며 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택될 수 있다. 통상적으로, 사람의 체액 또는 조직은 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편의 제제와 접촉함으로써 생체내 또는 생체외(환자로부터 채취한 샘플에서)로 분석될 수 있고 Aβ 프로토피브릴에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 양이 측정될 수 있다. 프로토피브릴의 정량화는 상기한 질환의 진단, 이후 다양한 치료뿐만 아니라 새로운 의약의 개발에 사용될 수 있다. 선택적으로, 이런 제제에서 항체 또는 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 기술 중 임의의 것, 예를 들어, ELISA, Biacore에 의한 분석 및/또는 SPECT, PET, MRI에 의한 영상화에 의해 탐지되고 측정될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편은 탐지 목적을 위해, I131, C11, C14, H3, F18, 또는 Gallium68와 같으나 이런 방사성동위원소에 제한되지 않는 방사성활성 리간드로 표지화될 수 있다.
본 발명의 추가 양태에 따라 본 발명에 따른 유효량의 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물이 제조된다. 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물은 이런 제제에 사용하는 것으로 알려진 다른 구성요소, 예를 들어, 보관 및 안정성을 위한 구성요소인 완충제 이외에, 유효량의 항체를 포함할 수 있다.
다른 양태에서 수의학적 사용을 위한 본 발명의 항체가 제공될 수 있다. 통상적으로, 상기 수의학적 사용은 Aβ 단백질 응집과 관련된 이상의 치료 및/또는 예방을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태에 따라 아세틸콜린 에스테라제 억제제, NMDA 길항제 및 5HT6 억제제와 같은 대증 치료와 조합으로 본 발명에 따른 항체를 사용하는 치료가 제공될 수 있다.
γ-세크레테아제 억제제(GSI), γ-세크레테아제 조절제(GSM), β-세크레테아제(BACE) 억제제, BACE 조절제, 백신, 기타 항체, 타우 또는 신경 염증 과정을 표적으로 하는 약물, 항고혈압제 등과 같은 다른 질환 조절 치료와의 조합은 효율적인 치료를 위한 추가 가능성을 제공한다.
영양 제품과의 조합은 효율적인 치료를 위한 추가 가능성을 제공한다.
한 양태에서, 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제와 함께 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 추가의 치료제를 더 포함할 수 있다. 통상적으로, 상기 추가 치료제는 아세틸콜린 에스테라제 억제제, NMDA 길항제, 5HT6 억제제, GSI, GSM, BACE 억제제, BACE 조절제, 백신, 다른 항체, 타우 또는 신경 염증 과정을 표적으로 하는 약물, 항고혈압제 및 영양 제품으로부터 선택될 수 있다. 조성물은 단일 또는 연속 투여로 제공 될 수 있다.
본 발명은 여러 비-제한적인 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예 1. 항체의 생산 및 사용된 방법
참조 항체의 생산
참조 항체 BAN2401은 EP2004688에 이미 기술된 방법에 따라 생산하였다.
본 발명의 항체의 생산
본 발명의 항체는 CHOK1SV GS 및 CHOK1SV GS-KO XceedTM 발현 시스템 (Lonza)을 각각 사용하여 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 일시적 및/또는 안정한 생산에 의해 생산하였다. 다음 돌연변이체는 각각 CHOK1SV GS-KO XceedTM 발현 시스템: A17D, A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S를 사용하여 일시적인 형질감염에 의해 생산하였다. 다음 돌연변이체는 CHOK1SV GS-KO XceedTM 발현 시스템: A17D/R79T_DI 1, A17D/R79T_DI 2, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4, A17D/R79T_DI 5, A17D/R79T_DI 6, A17D/R79T_DI 7 및 A17D/R79T_DI 8을 사용하여 일시적 및 안정적 형질감염에 의해 생산하였다. A17D/R82S 돌연변이체는 CHOK1SV GS 발현 시스템을 사용하여 안정한 형질감염에 의해 생산하였다.
돌연변이체의 경쇄 및 중쇄 암호화 영역의 서열은 통상적인 방법을 사용하여 합성하였다.
CHOK1SV GS-KO XeedTM 발현 시스템의 일시적인 형질감염을 위해, 경쇄 암호화 영역을 pXC-17.4 벡터 및 중쇄 암호화 영역을 pXC-18.4 벡터로 서브 클로닝하였다. 발현 배양물을 형질감염 6일 후에 수확하고 원심분리 및 멸균 여과에 의해 정화시켰다. 정화된 세포 배양 상등액을 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 용출된 항체를 PBS (pH 7.4)에 제공하였다. 생성물을 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가로 정제하여 응집체를 제거하였다. 수집된 단량체 피크를 분석 SEC로 분석한 후 모든 생성물에서 응집체 수준을 2% 미만으로 측정하였다.
CHOK1SV GS-KO XeedTM 시스템에서의 안정한 발현은 필수적으로 제조자의 권고에 따라 수행되었다. 간략하게, 경쇄 및 중쇄(pXC-17.4 및 pXC-18.4)를 함유하는 두 벡터를 두 유전자를 함유하는 하나의 이중 유전자 벡터에 결찰시켰다. CHOK1SV GS-KO 세포를 선형화된 이중 유전자 벡터로 전기천공하여 형질감염시켰다. 클론의 스크리닝 및 사멸 배양물의 생산성 스크리닝을 ELISA로 분석하였다. 생산은 15% Feed A와 15% Feed B(Life Technologies)가 보충된 CD-CHO 배지를 사용하여 수행되었다. 상등액을 원심분리 및 무균 여과에 의해 수확하였다. 정화된 세포 배양 상등액을 단백질 G 크로마토그래피 및 듈베코 PBS(Gibco)로 교환된 완충액을 사용하여 정제하였다.
CHOK1SV GS 발현 시스템(Lonza)을 사용하여 안정한 형질감염을 위해, 중쇄 유전자를 pEE6.4 벡터에 결찰하고 경쇄 유전자를 pEE12.4 벡터에 결찰하였다. 두 벡터를 결찰하여 이중 유전자 벡터를 형성하였다. CHOK1SV 세포를 선형화된 이중 유전자 벡터로 전기천공하여 형질감염시켰다. 본질적으로, 형질감염은 제조자의 권고에 따라 수행되었다. 클론의 스크리닝 및 사멸 배양물의 생산성 스크리닝을 ELISA로 분석하였다. 생산물은 15% Feed A와 15% Feed B (Life Technologies)가 보충된 CD-CHO 배지를 사용하여 수행되었다. 상등액을 원심분리 및 무균 여과에 의해 수확하였다. 정화된 세포 배양 상등액을 단백질 G 크로마토 그래피 및 듈베코 PBS (Gibco)로 교환된 완충액을 사용하여 정제하였다. 크기 배제 HPLC 및 SDS-PAGE에 의한 생성물 품질 분석은 생산된 모든 돌연변이체의 정제 물질을 사용하여 실행되었다.
억제 ELISA에 의한 표적 결합 분석
BAN2401과 비교된 본 발명의 항체의 Aβ 프로토피브릴 및 Aβ 모노머에 대한 결합 특성을 항체를 Aβ 프로토피 브릴 또는 Aβ 모노머와 함께 용액 중에서 미리 배양 한 후, Tucker et. al. J Alzheimers Dis. 2015; 43(2):575-88. doi: 10.3233/JAD-140741에 기재된 바와 같이, Aβ 코팅된 ELISA 플레이트로 옮긴 억제 ELISA를 사용하여 분석하였다. PubMed PMID: 25096615 및 인용된 참고문헌.
야생형 생쥐에서 약동학적 연구
8-10 주령의 암컷 C57BL/6 생쥐를 그룹화하고 BAN2401 또는 본 발명의 항체를 10 mg/kg의 용량으로 단일 정맥내(i.v.) 주사하였다. 모든 동물의 혈장을 주사 후 30분에서 29일까지의 시점에서 수집하고, 항체 농도의 측정 및 이후의 약동학적(PK) 매개변수의 계산에 사용하였다. 생쥐는 말기 혈장 수집 시점에서 희생되었다.
쥐에서 약동학적 연구
8-10 주령의 암컷 스프래그 돌리 쥐를 그룹화하고 BAN2401 또는 본 발명의 항체를 10 mg/kg의 용량으로 단일 i.v. 주사하였다. 모든 동물의 혈장을 주사 후 30분에서 29일까지의 시점에서 수집하고, 항체 농도의 측정 및 이후의 PK 매개변수의 계산에 사용하였다. 쥐는 말기 혈장 수집 시점에서 희생되었다.
원숭이에서 약동학적 연구
수컷 시노몰구스 원숭이를 그룹화하고(N = 3) 5 mg/kg의 BAN2401 또는 10 mg/kg의 본 발명의 항체를 단일 i.v. 주사하였다. 모든 동물의 혈청을 주사 후 5분에서 28일까지의 시간 지점에서 수집하고 항체 농도의 측정에 사용하였다. BAN2401 및 본 발명의 항체의 혈청 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. 비오티닐화 Aβ1-42 프로토피브릴을 아비딘 고정화 마이크로플레이트에 첨가하여 코팅하였다. 차단 후, 원숭이 혈청 샘플을 웰에 첨가하였다. 임의의 결합되지 않은 물질을 세척한 후, 알칼리성 포스파타제(AP) 표지된 염소 항-인간 IgG를 웰에 첨가하였다. 결합되지 않은 시약을 제거하기 위해 세척 후, AP용 기질인 p-나이트로페닐포스페이트를 웰에 첨가하였다. 반응을 수산화나트륨 용액으로 중단시키고 흡광도를 405nm 및 492nm에서 측정하였다.
405nm에서의 흡광도에서 492nm에서의 흡광도를 뺐다. 값은 표준 곡선에 의해 농도로 변환되었고 이후 PK 매개변수의 계산에 사용되었다.
Aβ 항체의 측정을 위한 직접 ELISA
생쥐 및 쥐 PK 연구에서 수집된 세포 배양 배지, 정제된 항체 생성물 및 혈장에서 BAN2401 및 항체의 수준을 항-Aβ 항체의 측정을 위한 직접 ELISA로 측정하였다. 샘플을 연속 희석시키고 Aβ1-40으로 코팅된 미세적정 플레이트 웰에서 배양하여 BAN2401 및 본 발명의 항체가 결합하게 하였다. 말 무당 과산화 효소(HRP)-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG를 검출 항체로서 사용하고, HRP에 대한 기질인 TMB를 첨가하였다. 반응을 2M H2SO4의 첨가에 의해 중단시켰는데, 이는 450nm에서 측정된 황색을 얻게 한다. 이 방법은 OD450 값이 표준 곡선을 통해 농도로 변환되는 양적 방식으로 사용되었다.
비-구획 분석에 의해 PK 매개변수의 계산
개별 말단 반감기 계산은 Phoenix WinNonLin 6.3 소프트웨어(Pharsight)가 장착된 비-구획 모델을 사용하여 수행되었다. 곡선 아래의 면적(AUC0-inf) 계산은 라인-업 로그-다운(lin-up log-down) 방법을 사용하여 Phoenix WinNonLin으로 수행되었다. AUC 및 말단 반감기의 그룹 평균 및 표준 편차는 GraphPad Prism(v 6.04)을 사용하여 계산하였다.
통계 분석
개별적으로 결정된 말단 반감기 및 AUC의 그룹 평균의 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 6.04)를 사용하여 수행하였다. 일원 ANOVA 후 본페로니 다중 비교 사후 검증이 이 연구에 사용되었다. 검증은 유의 수준 * P<0.05, ** P <0.01, *** P<0.001 및 **** P<0.0001에서 수행되었다.
실시예 2. 표적 결합 특징묘사
BAN2401과 비교된 A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S에 보존된 Aβ-프로토피브릴 결합
본 발명의 항체의 표적 결합 프로파일을 실시예 1(억제 ELISA)에 기재된 억제 ELISA에 의해 BAN2401(대조군)과 나란히 분석하였다. 결과는 A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S 및 BAN2401에 대한 Aβ 모노머와 비교된 Aβ 프로토 피브릴에 대한 결합 및 선택성 분석이 도시된 도 1에 제공된다. 결과는 Aβ 모노머에 대한 결합과 비교된 Aβ 프로토피브릴에 대한 결합 및 결합의 선택성이 본 발명의 항체(A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S)에서 보존되었다는 것을 보여 주었다.
실시예 3. 생쥐에서 항체의 약동학적 프로파일
야생형 생쥐에서 BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 약동학적 연구
야생형 생쥐에서 본 발명의 항체의 약동학적 프로파일을 연구하기 위해, 8-10주령 C57BL/6 암컷 생쥐에게 10mg/kg BAN2401(N = 8), A17D(N=7), A17D/R79T(N = 6), A17D/R82S(N = 8) 또는 A17D/R79T/R82S(N = 7)의 단일 i.v. 주사로 투여하였다. 동물은 0.5시간, 2일, 7일, 14일 또는 15일 후 및 28일 또는 29일 후에 채혈되었고, BAN2401 및 본 발명의 항체의 수준은 실시예 1(직접 ELISA)에 기재된 바와 같이 포획을 위해 Aβ1-40 및 탐지를 위해 HRP-결합된 염소-항-인간 IgG를 사용하는 ELISA에 의해 분석하였다. A17D/R82S는 다른 항체와 비교하여 별도의 경우에서 시작된 연구에서 투여되었다. 그러나, 두 다른 연구의 혈장 샘플을 분석간 편차를 피하기 위해 동시에 ELISA로 분석하였다.
도 2의 시간 대 농도 그래프 및 표 1에 제시된 계산된 PK 파라미터에 도시된 바와 같이, 본 발명의 항체(A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S)의 PK 프로파일은 특히 주사 후 처음 48시간 동안 BAN2401과 실질적으로 다르다. 곡선의 면적(AUC0-inf)으로 측정된 노출의 6배 증가가 BAN2401에 비해 A17D에서 나타난 반면, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 AUC는 10-11배 증가하였다(표 1). 또한, 본 발명의 항체의 말단 혈장 반감기는 BAN2401에 비해 상당히 연장되었다 (표 1).
생쥐에서 BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 혈장 PK 매개변수. 모든 항체에 대한 반감기 및 AUC0-inf를 Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 모든 동물에 대해 개별적으로 계산하고 일원 ANOVA 후 본페로니 다중 비교 사후 검증에 의해 통계 분석하였다. 평균 AUC0-inf 값 및 평균 말단 반감기가 표에 도시된다. BAN2401과 돌연변이체 사이의 말단 반감기 및 AUC0-inf의 통계적 차이는 표에 나타내었고, ***은 p <0.001, ****는 p <0.0001을 나타낸다.
항체 AUC 0-inf (mg*h/ml) 말단 반감기(일)
BAN2401 3.7 4.5
A17D 23.3**** 8.7***
A17D/R79T 40.2**** 10.7****
A17D/R82S 37.9**** 11.1****
A17D/R79T/R82S 41.0**** 10.9****
실시예 4. 쥐에서 항체의 약동학적 프로파일 쥐에서 BAN2401, A17D, A17D/R79T, 및 A17D/R79T/R82S의 약동학적 연구
야생형 생쥐에서 본 발명의 항체의 약동학적 프로파일을 연구하기 위해, 8-10주령 스프래그-돌리 쥐에게 10mg/kg BAN2401(N=3), A17D(N=4), A17D/R79T(N=6) 또는 A17D/R79T/R82S (N=5)의 단일 i.v. 주사로 투여하였다. 동물은 주사 0.5시간, 2시간, 7시간, 24시간, 2일, 4일, 7일 14일 및 29일 후에 채혈되었다. BAN2401 및 본 발명의 항체의 수준은 실시예 1(직접 ELISA)에 기재된 바와 같이 포획을 위해 Aβ1-40 및 탐지를 위해 HRP-결합된 염소-항-인간 IgG를 사용하는 ELISA에 의해 분석하였다. 낮은 노출을 유도하는 투여 후 처음 48시간 동안 야생형 생쥐의 혈장에서 BAN2401의 빠른 감소(도 2)는 쥐에서 보이지 않았고, 대신 BAN2401 및 본 발명의 항체는 유사한 PK 프로파일을 나타낸다(도 3). 연구에서 모든 쥐에 대해 개별적으로 계산된 혈장 반감기 및 AUC0-inf 값의 통계 분석은 BAN2401 및 A17D 또는 A17D/R79T/R82S 사이의 AUC0-inf 또는 말단 반감기에 큰 차이를 나타내지 않았다(표 2). AUC0-inf에 현저한 증가가 BAN2401에 비해 A17D/R79T에 대해 나타난 반면, 이 둘 사이의 말단 반감기에 통계적 차이는 없었다(표 2).
쥐에서 BAN2401, A17D, A17D/R79T, 및 A17D/R79T/R82S의 혈장 PK 매개변수. 모든 항체에 대한 반감기 및 AUC0-inf를 Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 모든 동물에 대해 개별적으로 계산하고 일원 ANOVA 후 본페로니 다중 비교 사후 검증에 의해 통계 분석하였다. 계산된 BAN2401, A17D, A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S의 평균 AUC0-inf 값 및 평균 말단 반감기가 표에 도시된다. BAN2401과 돌연변이체 사이의 말단 반감기 및 AUC0-inf의 통계적 차이는 표에 나타내었고, **은 p <0.01을 나타낸다.
항체 AUC 0-inf (mg*h/ml) 말단 반감기(일)
BAN2401 31.1 10.2
A17D 38.0 10.9
A17D/R79T 47.6** 12.8
A17D/R79T/R82S 36.6 11.2
실시예 5. 탈면역화 BAN2401, A17D, A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S의 생체외 총 단백질 T 세포 분석
본 발명의 항체에 도입된 돌연변이가 인간에서 면역원성 반응에 대해 증가된 위험을 초래했는지 여부를 평가하기 위해, A17D, A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S를 생체외 총 단백질 T 세포 활성화 분석에 의해 BAN2401과 나란히 분석하였다. EpiScreenTM 시간 경과 T 세포 분석은 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 항체의 능력을 측정한다(Antitope Ltd, Cambridge, UK). 샘플은 광범위한 HLA 다양성을 지닌 25 명의 건강한 기증자(기증자 1-25, 표 3)의 집단으로부터 CD8+ 고갈 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대해 시험하였다. CD4+ T 세포 반응을 유도하는 항체의 능력은 증식 및 IL-2 분비에 의해 측정되었다.
연구 결과는 면역원성의 잠재적 위험은 BAN2401에 대해 낮았고 경계는 A17D에 대해 낮았으며 각각 기증자의 8%와 12%가 양성 반응을 보였다는 것을 나타내었다(표 3). A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S의 분석은 예상치 못하게 다소 높은 면역원성의 위험을 나타냈는데, 이는 확산과 IL-2 분비의 결합 빈도가 각각 연구 집단의 24%와 20%이었기 때문이다.
BAN2401, A17D, A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S에 대한 건강한 기증자 T 세포 증식과 IL-2 ELISpot 반응의 요약. 증식에 대한 양성 T 세포 반응은 "P"로 표시되고 양성 ELISpot 반응은 "E"로 표시된다. 경계선 반응은 (*)표시된다. 상관관계는 ELISpot 분석에서 양성인 증식 반응의 백분율로 표현된다. 한 기증자의 반응으로 간주되기 위해서, 증식 및 ELISpot 분석 모두 양성이어야 한다. 클리닉에서 32%의 평균 면역원성을 가진 치료용 항체 대조군인 인간화된 A33(Welt S et al., Clin Cancer Res. 2003 Apr; 9 (4) : 1347-53., 2003)는 통상적으로 T 세포 증식 분석에서 20-30%의 기증자가 양성으로 반응하도록 자극한다. 피토헤마글루티닌(PHA)과 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)은 양성 대조군으로 사용되는 강력한 항원이다.
BAN2401 A17D A17D/R79T A17D/R79T
/R82S 		A33 KLH PHA
기증자 1 PE PE PE
기증자 2 PE P*E PE PE PE
기증자 3 E* PE PE
기증자 4 PE PE
기증자 5 PE PE
기증자 6 PE PE
기증자 7 PE PE
기증자 8 PE PE PE PE
기증자 9 PE PE
기증자 10 PE PE
기증자 11 E PE
기증자 12 P* PE
기증자 13 PE PE PE
기증자 14 PE PE PE PE PE
기증자 15 P PE PE
기증자 16 PE P P P E PE PE
기증자 17 PE PE PE PE PE
기증자 18 PE PE
기증자 19 PE PE PE PE PE PE
기증자 20 PE PE
기증자 21 P PE* P P PE PE
기증자 22 E PE
기증자 23 PE PE PE
기증자 24 E PE PE PE
기증자 25 PE PE
증식 % 12 16 32 28 24 92 100
ELISpot % 8 12 28 24 24 96 100
증식 및 ELISpot % 8 12 24 20 20 88 100
상관관계 % 67 75 75 71 83 96 100
인 실리코(in silico) BAN2401의 T-세포 에피토프 스크리닝돌연변이에 의해 추론된 면역 원성 위험을 추가로 설명하고 탈면역화시킬 관련 위치를 찾기 위해서, BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S는 인 실리코 T 세포 에피토프 스크리닝을 받았다. BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 가변 영역 서열은 독점적인 실리코 기술 iTopeTM 및 TCEDTM에 의한 분석을 위해 Antitope Ltd(Cambridge, UK)에 제공되었다. 비-생식 세포 무차별 MHC 클래스 II 결합 서열이 분석된 항체의 중쇄 및 경쇄 모두에서 동정되었다. TCEDTM의 BLAST 검색 분석은 생체외 공지된 면역원성을 가진 펩타이드의 데이터베이스에서 이전에 동정된 에피토프와 두 부분 일치를 나타냈다.
BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 생체외 T 세포 에피토프 매핑
새로운 돌연변이에 의해 추론된 면역원성 위험을 확인하고 탈면역화시킬 위치를 확인하기 위해, BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 가변 영역에서 유래된 44개의 펩타이드(15-mer)를 EpiScreenTM T 세포 에피토프 매핑 기술(Antitope Ltd, Cambridge, UK)을 사용하여 CD4+ T 세포 에피토프의 존재에 대해 평가하였다. 펩타이드는 인 실리코 스크린에 의해 동정된 모든 잠재적 T 세포 에피토프 및 A17D 치환과 R79T 및 R82S 치환(돌연변이가 있거나 없는 펩타이드 포함)의 영역을 포함하는 두 영역을 포함하도록 선택되었다.
상기 펩타이드는 이전 섹션에서 기술된 EpiscreenTM 총 항체 분석으로부터 선택된 11명의 인간 기여자 집단에 대해 시험하였다. T 세포 반응은 3[H] - 티미 딘 도입을 측정하는 증식 분석을 사용하여 각각의 펩타이드에 대한 각 기증자에 대해 측정되었다. 그 결과는 서열에서 3개의 잠재적인 T 세포 에피토프(에피토프 1, 5 및 8)의 존재를 동정하였다. 중쇄에 존재하는 "에피토프 1"은 약한 것으로 여겨졌다. A17D 돌연변이를 포함하는 "에피토프 5"는 약하며 야생형 BAN2401 서열의 관련 펩타이드에 대해서는 기증자 반응이 관찰되지 않았다. "에피토프 8"은 T 세포 반응의 빈도에 기초하여 가장 중요한 에피토프이었고 항체 A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 펩타이드에서 동정되었으나 야생형 BAN2401 또는 A17D에서는 동정되지 않았다.
생체외 T 세포 에피토프 매핑의 데이터는 A17D/R79T 및 A17D/R79T/R82S가 면역원성의 전반적인 위험성 증가와 관련된다는 총 항체 시간 경과 T 세포 분석의 결론을 뒷받침했다. 또한, A17D/R82S(총 항체 T 세포 분석에 포함되지 않음)는 "에피토프 8"에서 R82S 돌연변이로 인해 면역원성의 위험성이 증가한 것처럼 보였다.
생체외 T 세포 에피토프 매핑에 의해 잠재적 T 세포 에피토프로 동정된 펩티드의 탈면역화
일반적으로, 탈면역화는 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 펩타이드의 중요한 고정 위치(9-mer의 p1, p4, p6, p7 및 p9) 중 하나에서 단일 아미노산을 변화시킴으로써 달성된다. 위에서 기술한 생체외 펩타이드 매핑에서 동정된 3개의 에피토프(에피토프 1, 5 및 8)에서 특이적 탈면역화 돌연변이가 선택되었다. 치환은 MHC 클래스 II 분자의 결합 포켓에 대한 예측된 펩타이드의 감소된 결합 친화성에 기초하여 선택되었다. 2가지 탈면역화 치환을 잠재적으로 면역원성을 나타내는 것으로 밝혀진 각각의 펩타이드에 대해 시험하였고 이런 펩타이드는 EpiscreenTM 펩타이드 매핑 기술을 사용하여 BAN2401, A17D, A17D/R79T, A17D/R82S 및 A17D/R79T/R82S의 원래 펩타이드와 함께 분석하였다 .
T 세포 반응은 3[H]-티미딘 포함을 측정하는 증식 분석을 사용하여 각각의 펩타이드에 대한 각 기증자에 대해 측정되었다. 이 연구의 결과는 초기 발견을 확인하였지만, 모든 에피토프(에피토프 1, 5 및 8)는 이 연구에서 약한 것으로 간주되었다(표 4). 그럼에도 불구하고, 모든 탈면역화 치환은 원래의 펩타이드와 비교하여 3개의 에피토프를 덮는 펩타이드에 대한 면역원성의 위험을 성공적으로 감소 시켰으며, T 세포 반응자도 없거나 거의 없었다(표 4). 이것은 선택한 치환이 효과적이었으며 탈면역화가 성공적이었다는 것을 나타낸다.
[표 4]
탈면역화는 EpiScreenTM T 세포 에피토프 매핑 기술을 사용하여 면역원성으로 확인된 에피토프의 펩타이드 수준에서 일어난다. BAN2401 및 면역원성으로 확인된 본 발명의 항체로부터 유래된 펩타이드 및 탈면역화 치환이 도입된 동일한 펩타이드(밑줄)가 도시된다. 반감기 개선 돌연변이는 굵게 도시된다. 모든 탈면역화 펩타이드를 생체외 T 세포 분석에서 시험하였고, 결과는 가장 오른쪽 열(기증자 반응 빈도)에 도시된다.
*) 비-탈면역화 항체
A17D/R79T의 탈면역화 변이체의 설계 및 생산
A17D/R79T의 8개 탈면역화 변이체는 위에 기술된 T 세포 에피토프 매핑 및 펩타이드 탈면역화의 결과에 기초하여 설계되었다. 잠재적으로 면역원성으로 확인 된 3개 에피토프 모두에서, 생체외 T 세포 에피토프 매핑에서 면역원성을 감소시키는 것으로 나타난 탈면역 돌연변이가 표 5에 제시된 조합에 도입되었다.
이중 돌연변이체 A17D/R79T의 8개 탈면역화 변이체의 개요. 펩타이드 수준에서의 생체외 T 세포 분석에서 선택되고 기능적으로 검증된 에피토프 1, 5 및 8에 대한 탈면역화 돌연변이가 특정 항체에 대해 나타난다. N-말단 넘버링이 사용되었다. VH = 가변 중쇄, VL = 가변 경쇄.
A17D/R79T 변이체 에피토프 1에서 탈면화(VH) 에피토프 5에서 탈면화(VL) 에피토프 8에서 탈면화(VL)
A17D/R79T _DI 1 A40N I21V S81Q
A17D/R79T _DI 2 A40N I21V E84D
A17D/R79T _DI 3 A40N V13A S81Q
A17D/R79T _DI 4 A40N V13A E84D
A17D/R79T _DI 5 A40T I21V S81Q
A17D/R79T _DI 6 A40T I21V E84D
A17D/R79T _DI 7 A40T V13A S81Q
A17D/R79T _DI 8 A40T V13A E84D
실시예 6. 탈면역화 항체의 표적 결합 특징묘사 BAN2401과 비교된 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 8개 탈면역화 변이체에 보존된 Aβ-프로토피브릴 결합
A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 8개 탈 면역화 변이체의 표적 결합 프로파일을 실시예 1(억제 ELISA)에 기술된 억제 방법에 의해 BAN2401(대조군)과 나란히 분석하였다. A17D/R79T_DI 1-8 및 BAN2401에 대한 Aβ 단량체와 비교된 Aβ 프로토 피브릴의 결합 및 선택성의 분석이 도시된 결과가 도 4에 제시된다. 결과는 Aβ 모노머에 대한 결합과 비교된 Aβ 프로토피브릴에 대한 결합 및 결합의 선택성이 본 발명의 항체(A17D/R79T_DI 1-8)에서 보존되었다는 것을 나타내었다.
실시예 7. 생쥐에서 탈면역화 항체의 약동학적 프로파일
야생형 생쥐에서 BAN2401, A17D/R79T 및 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 8개 탈면역화 변이체의 약동학적 연구
야생형 생쥐에서 탈면역화 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 8개 변이체의 PK 프로파일을 BAN2401 및 A17D/R79T의 PK 프로파일과 비교하기 위해서, 8-10 주령의 C57BL/6 암컷 생쥐를 그룹화하고(N = 5) 10mg/kg 항체의 단일 i.v. 주사하였다. 동물을 0.5시간, 2일, 7일, 14일 및 28일 후에 채혈시켰으며, BAN2401 및 본 발명의 항체의 수준을 실시예 1(직접 ELISA)에 기술된 바와 같이 포획을 위해 Aβ1-40 및 탐지를 위해 HRP-결합된 염소-항-인간 IgG를 사용하는 ELISA에 의해 분석하였다. 도 5의 시간 대 농도 그래프에 도시된 대로, 탈면역화 A17D/R79T 돌연변이 체(A17D/R79T_DI 1-8)의 PK 프로파일은 A17D/R79T의 PK 프로파일과 유사하고 BAN2401과는 상이하다. 결과는 A17D/R79T 및 탈면역화 변이체(A17D/R79T_DI 1-8)의 AUC0-inf 및 말단 반감기 모두가 BAN2401과 비교하여 현저하게 향상되었다는 것을 시사하였다. 따라서, 모든 탈면역화 변이체는 BAN2401과 비교하여 PK 프로파일이 개선되었고 A17D/R79T의 PK 프로파일과 유사하여, 노출이 증가하고 제거 반감기가 연장된 PK 프로파일을 나타내었다.
생쥐에서 BAN2401, A17D/R79T 및 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 탈면역화 변이체의 혈장 PK 매개변수. 모든 항체에 대한 반감기 및 AUC0-inf를 Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 모든 동물에 대해 개별적으로 계산하고 일원 ANOVA 후 본페로니 다중 비교 사후 검증에 의해 통계 분석하였다. 평균 AUC0-inf 값 및 평균 말단 반감기가 표에 도시된다. BAN2401과 돌연변이체 사이의 말단 반감기 및 AUC0-inf의 통계적 차이는 표에 나타내었고, *은 p <0.005, **는 p <0.01, ***는 p <0.001 및 ****는 p <0.0001을 나타낸다.
항체 AUC 0-inf (mg* h/ml) 말단 반감기(일)
BAN2401 3.6 3.5
A17D/R79T 38.0**** 10.7**
A17D/R79T_DI 1 42.3**** 13.0***
A17D/R79T_DI 2 40.4**** 10.5**
A17D/R79T_DI 3 44.9**** 12.6***
A17D/R79T_DI 4 43.7**** 12.7***
A17D/R79T_DI 5 32.6**** 10.4*
A17D/R79T_DI 6 33.4**** 12.2***
A17D/R79T_DI 7 41.7**** 14.1****
A17D/R79T_DI 8 43.8**** 10.0*
실시예 8. 쥐에서 탈면역화 항체의 약동학적 프로파일 쥐에서 BAN2401, A17D/R79T 및 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 8개 탈면역화 변이체의 약동학적 프로파일
쥐에서 탈면역화 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 8개 변이체의 PK 프로파일을 BAN2401 및 A17D/R79T의 PK 프로파일과 비교하기 위해서, 8주령의 암컷 스프래그 돌리 쥐를 그룹화하고(N = 5) 10mg/kg 항체의 단일 i.v. 주사하였다. 동물을 0.5시간, 2일, 7일, 14일 및 28일 후에 채혈시켰으며, BAN2401 및 본 발명의 항체의 수준을 실시예 1(직접 ELISA)에 기술된 바와 같이 포획을 위해 Aβ1-40 및 탐지를 위해 HRP-결합된 염소-항-인간 IgG를 사용하는 ELISA에 의해 분석하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, BAN2401, A17D/R79T 및 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 탈면역화 변이형은 쥐에서 상당히 유사한 PK 프로파일을 나타내었다. 결과는 쥐에서 A17D/R79T_DI1이 BAN2401과 비교하여 BAN2401보다 현저하게 더 긴 말단 반감기를 가졌고(p <0.05), 반면 AUC0-inf는 BAN2401과 비교하여 A17D/R79T, A17D/ R79T_DI 1 및 A17D/R79T_DI 4에서 현저하게 더 컸다는 것을 나타내었다(p <0.01) (표 7).
쥐에서 BAN2401, A17D/R79T 및 A17D/R79T(A17D/R79T_DI 1-8)의 탈면역화 변이형의 혈장 PK 매개변수. 모든 항체에 대한 반감기 및 AUC0-inf를 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 모든 동물에 대해 개별적으로 계산하고 일원 ANOVA 후 본페로니 다중 비교 사후 검증에 의해 통계 분석하였다. 평균 AUC 및 평균 말단 반감기가 표에 도시된다. BAN2401과 본 발명의 항체 사이의 말단 반감기 및 AUC의 통계적 차이는 표에 나타내었고, *는 P <0.05 및 ** P <0.01를 나타낸다.
항체 AUC 0-inf (mg*h/ml) 말단 반감기(일)
BAN2401 35.1 10.2
A17D/R79T 48.6** 11.0
A17D/R79T_DI 1 47.3** 13.3*
A17D/R79T_DI 2 33.7 11.8
A17D/R79T_DI 3 43.1 11.7
A17D/R79T_DI 4 47.3** 11.7
A17D/R79T_DI 5 44.1 11.6
A17D/R79T_DI 6 39.6 11.3
A17D/R79T_DI 7 35.6 11.8
A17D/R79T_DI 8 40.9 10.6
실시예 9. 원숭이에서 탈면역화 항체의 약동학적 프로파일 시노몰구스 원숭이에서 BAN2401, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 and A17D/R79T_DI 8의 약동학적 프로파일
원숭이에서 A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 및 A17D/R79T_DI 8의 PK 프로파일을 BAN2401의 PK 프로파일과 비교하기 위하여, 수컷 시노몰구스 원숭이를 그룹화하고(N = 3), 5mg/kg BAN2401 또는 10 mg/kg의 본 발명의 항체를 단일 i.v. 주사하였다. BAN2401 주사된 원숭이는 투여 후 5분, 1시간, 2시간, 8시간, 24시간, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일 및 28일 후에 채혈된 반면, 본 발명의 항체로 주사된 원숭이는 5분, 2시간, 8시간, 24시간, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일 후에 채혈되었다. 투여된 항체의 혈장 농도를 실시예 1(직접 ELISA)에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. PK 프로파일은 도 7에 시간 대 농도 그래프로 도시된 반면, 모든 항체에 대한 반감기 및 AUC0-inf는 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비 구획 분석에 의해 계산되었다(표 8). 표 8에 도시된 BAN2401의 PK 매개변수는 BAN2401이 5 mg/kg BAN2401의 용량으로 i.v. 주사된 개별 연구로부터의 결과이다.
시노몰구스 원숭이에서 BAN2401, A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 및 A17D/R79T_DI 8의 혈장 PK 매개변수. 모든 항체에 대한 말단 반감기 및 AUC0-inf는 Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)을 사용하여 비-구획 분석에 의해 계산하였다. 여기에 도시된 BAN2401의 PK 매개변수는 BAN2401이 5 mg/kg BAN2401의 용량으로 i.v. 주사된 개별 연구로부터의 것이다. BAN2401과 본 발명의 항체 사이의 AUC 비교를 단순화하기 위해, 투여량 조절된 평균 AUC0-inf 및 평균 말단 반감기 값이 표에 도시된다.
항체 (mg/kg) 당 투여량 보정 AUC0-inf (mg*h/ml) 말단 반감기(일)
BAN2401 5.3 12.0
A17D/R79T_DI 3 6.1 12.0
A17D/R79T_DI 4 6.5 12.6
A17D/R79T_DI 8 7.1 17.2
실시예 10. 단순 알로메트릭 스케일링 - 생쥐, 쥐 및 원숭이 내지 인간본 발명의 항체(본 발명에서 A17D/R79T_DI3, A17D/R79T_DI4 및 A17D/R79T_DI8에 대해 나타냄)의 인간 반감기를 예측하기 위해, 2-구획 모델링 및 단순 알로메트릭 스케일링이 수행되었다. 생쥐, 쥐 및 원숭이에서 청소율(CL) 및 부피(V) 값을 측정하기 위해, 2-구획 모델이 Phoenix WinNonlin 6.3 (Pharsight)을 사용하여 BAN2401 및 본 발명의 항체의 혈장 PK 매개변수에 적용되었다. CL 및 V 값을 체중에 대해 좌표로 나타내고 단순 알로메트릭 스케일링을 적용하였다(Deng et al. mAbs 2011: 3(1): p. 61-66. doi:10.4161/mabs.3.1.13799). 말단 반감기는 다음 방정식에 따라 계산되었다:
부피(volume) 또는 청소율(clearance)의 단순 알로메트릭 스케일링에서, 임상전 종의 추정 매개변수의 값이 체중에 대해 좌표로 나타내어진다. 회귀선의 상수와 지수는 70kg 체중의 사람의 V와 CL을 예측하는데 사용된다. 지수(바람직하게는 청소율에 대해 약 0.85 및 부피에 대해 1이어야 한다) 및 회귀선에 대한 준수 모두는 사람의 특정 매개변수의 추정 신뢰의 측정이다.
도 11에 도시된 바와 같이, BAN2401은 테스트 된 종들 중에서 중앙 CL의 선형 상관관계가 낮아, 불확실한 단순 알로메트릭 스케일링을 초래한다. 지수와의 편차(0.85에 가까워야 함)는 빈약한 상관관계가 생쥐에서 BAN2401의 높은 청소율의 효과라는 것을 시사한다. 이것은 인간에서 예상되는 CL의 과소평가를 가져 왔고 예측된 말단 반감기의 과대평가로 이어졌다. BAN2401의 말단 반감기는 41일로 추정되어, 클리닉에서 측정한 반감기(5-7 일)에서 크게 벗어났다. BAN2401의 실제 CL은 도 11(열린 정사각형)에 표시되었다. BAN2401에 대한 생쥐, 쥐 및 시노몰구스 원숭이 사이의 빈약한 선형 상관관계와는 대조적으로, 본 발명의 항체(A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 및 A17D/R79T_DI 8)는 우수한 상관관계를 보였다(도 11). 사람에서 예측된 PK 매개변수로부터 계산된 말단 반감기는 A17D/R79T_DI 3, A17D/R79T_DI 4 및 A17D/R79T_DI 8에 대해 인간의 반감기를 13일, 15일 및 20일로 시사했다. 부피 (V)의 단순 알로메트릭 스케일링은 BAN2401 및 본 발명의 항체(도시되지 않음)에 대해 양호한 선형 상관관계 및 약 1의 지수를 시사하였다.
본 발명의 항체는 더 확실한 알로메트릭 스케일링을 갖는 종들 사이의 CL의 선형 상관관계를 나타내며, 이들은 Deng et al, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol 8(2) (2012): p. 141-160에 기술된 바와 같이, 베바시주 맙, 오말리주맙 및 트라 스투주맙과 같은 다른 치료용 IgG1과 유사하게 행동하며, 약 15-30일의 사람 반감기를 가진다. 많은 다른 치료용 IgG1에서 벗어나서 생쥐 및 사람에서 차선의 PK 프로파일을 갖는 BAN2401과 대조적으로, 본 발명의 항체는 생쥐에서 표준화된 PK 프로파일을 생성하도록 조작되었다. 이들은 약 15-30일의 사람 반감기를 갖는 다른 치료용 IgG1과 유사한 생쥐, 쥐 및 시노몰구스에서 PK 프로파일 및 반감기를 나타낸다. 이 발견은 생쥐에서 본 발명의 항체의 연장된 반감기가 인간으로 전환될 것을 시사할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> BioArctic Neuroscience AB Eisai R&D Management Co., Ltd. <120> Improved AB protofibril binding antibodies <130> P141879WO00 <140> PCT <141> 2015-07-08 <150> US 62/022952 <151> 2014-07-10 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Pro Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Asp Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 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Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa can be Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa can be Arg or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa can be Ala, Asn or Thr <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Asn Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (13)

  1. 아밀로이드-β(Aβ) 프로토피브릴에 대해 친화성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 8에 따른 가변성 경쇄, 여기서
    x1은 D이며; 여기서 x1은 SEQ ID NO: 8의 위치 17의 Xaa이고;
    x2는 T이며; 여기서 x2는 SEQ ID NO: 8의 위치 79의 Xaa이고;
    x3는 R이며; 여기서 x3는 SEQ ID NO: 8의 위치 82의 Xaa이고;
    y1은 V 및 A로부터 선택되며; 여기서 y1은 SEQ ID NO: 8의 위치 13의 Xaa이고;
    y2는 V 및 I로부터 선택되며; 여기서 y2는 SEQ ID NO: 8의 위치 21의 Xaa이고;
    y3는 Q 및 S로부터 선택되며; 여기서 y3는 SEQ ID NO: 8의 위치 81의 Xaa이고;
    y4는 D 및 E로부터 선택되며; 여기서 y4는 SEQ ID NO: 8의 위치 84의 Xaa이고; 및
    SEQ ID NO: 14에 따른 가변성 중쇄를 가지며, 여기서
    z1는 V이며; 여기서 z1는 SEQ ID NO: 14의 위치 37의 Xaa이고;
    z2는 R이며; 여기서 z2는 SEQ ID NO: 14의 위치 38의 Xaa이고;
    z3는 N, T 및 A로부터 선택되며; 여기서 z3는 SEQ ID NO: 14의 위치 40의 Xaa이고;
    y1이 V이며, y2가 I이며, y3가 S이며, y4가 E이며, z1이 V이며, z2가 R이며, z3가 A인 조합은 제외하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 치료에 사용하기 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체.
  4. 알츠하이머병과 Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    Aβ 단백질 응집과 관련된 다른 이상은 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매 (LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택되는 것인 항체.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 알츠하이머병에 걸린 또는 걸릴 위험에 있는 대상의 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상의 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
  8. 사람의 조직 또는 체액을 생체외로(in vitro) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 Aβ 프로토피브릴, 응집된 Aβ 단백질 또는 이들 모두에 결합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 사람의 Aβ 프로토피브릴, 응집된 Aβ 단백질 또는 이들 모두의 양을 측정하는 방법.
  9. 사람의 조직 또는 체액을 생체외로(in vitro) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계 및 응집된 Aβ 단백질에 결합된 상기 항체의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 알츠하이머 질환에 걸린 또는 걸릴 위험에 있는 사람의 상기 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 사람의 조직 또는 체액을 생체외로(in vitro) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계 및 응집된 Aβ 단백질에 결합된 상기 항체의 양을 측정하는 단계를 포함하여, 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 대상의 상기 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 이들 모두와 함께, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 알츠하이머병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
  12. 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 이들 모두와 함께, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 외상성 뇌 손상(TBI), 루이소체 치매(LBD), 다운 증후군(DS), 근위축성 측삭경화증(ALS), 전두 측두엽 치매, 타우병, 전신성 아밀로이드증, 죽상 동맥 경화증 및 파킨슨병 치매(PDD)로부터 선택되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
  13. 수의학적 사용을 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체.
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