JP2017521427A - 改善されたＡβプロトフィブリル結合抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、アミロイドベータペプチド（Ａβ）に関し、より具体的には、Ａβプロトフィブリルに結合する抗体、および、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防的処置におけるそれらの使用に関する。さらに、本発明は、本発明の抗体の使用による、そのような疾患の診断ならびに疾患の進行の監視に関し得る。さらに、本発明は、本発明の抗体の獣医用途にも関し得る。

Description

本発明は、アミロイドベータペプチド（Ａβ）に関し、より具体的には、Ａβプロトフィブリルに結合する抗体、および、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防的処置でのそれらの使用に関する。さらに本発明は、本発明の抗体の使用による、そのような疾患の診断ならびに疾患の進行の監視に関し得る。さらに、本発明は、本発明の抗体の獣医用途に関し得る。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、神経変性疾患のグループに属し、認知、記憶および行動の障害を引き起こす。アルツハイマー病の特徴は、細胞外アミロイドプラーク、神経細胞内の神経原線維変化、神経の機能障害、および最終的に脳の萎縮を含む。ＡＤの進行に関するリスクは、年齢、および、高齢（高齢者の生活の質に対する影響が増加した状態）に達する人の数の増加に伴い、増加する。加えて、社会は、コストが加速した状況に直面する。

疾患が長年の間知られていて、処置に関するいくつかの提案がなされていたという事実にもかかわらず、今日でさえ、効率的に疾患を改善するような治療はなく、現在は、せいぜい対症療法を提供し得る薬しか利用可能でない。疾患の背後のメカニズムは、多くの研究に供されている。手短には、Ａβは、何らかの理由で凝集し始めて、いくつかの中間形態を経由して、最終的に、脳内に不溶性の原線維／プラーク沈着を生成する。当初、プラークは、それ自体が、ニューロンおよびそれらにより伝送されるシグナルに影響を及ぼすと考えられていたが、今日では、広範囲の研究の結果は、可溶性の、凝集した、Ａβの中間形態が、患者において観察される疾患および症状の主な原因である可能性が最も高いことを示している。

Ａβモノマーから不溶性Ａβ原線維までの凝集形態のカスケードにおける１つのそのような中間形態は、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｖｏｌ．２７２（３５）ｐ．２２３６４−７２）において、１９９７年にＷａｌｓｈにより最初に記載された、可溶性の、高分子量Ａβプロトフィブリルである。ＡＤの進行に関するＡβプロトフィブリルの重要性は、ウプサラ大学のＬａｒｓ Ｌａｎｎｆｅｌｔが率いる科学者グループにより、アークティック変異（Ａβプロトフィブリルの形成増加を引き起こすアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）におけるＥ６９３Ｇ突然変異である）に関する彼らの研究において特定された。この突然変異を保有するスウェーデン北部の家族に、若年期に重度のアルツハイマー病を発症したことが見つかり、この組み合わせの知見が、新たな治療の基本的な概念を与えた。したがって、Ａβプロトフィブリルは、疾患に強く関連して、治療の重要な標的として同定された。アークティック変異を含むＡβペプチドでの彼らの研究に基づき、Ｌａｎｎｆｅｌｔらは、インビトロで、アークティックならびに野生型のＡβプロトフィブリルを、免疫化、およびその後の、Ａβ系における他の種と比較してＡβプロトフィブリルに対して高い親和性を有する抗体の選択に十分な量で、生産することができた。Ａβプロトフィブリルおよびこれらに結合する抗体の生産のための方法の実施例は、ＷＯ０２／０３９１１およびＷＯ２００５／１２３７７５に開示される。

特に重要だったのは、Ａβプロトフィブリルに結合する抗体であるマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ１５８の開発であり、ＥＰ２００４６８８に開示され、以下のＣＤＲ配列を含む：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＨ 配列番号１
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＧＤＴＶＫＧ 配列番号２
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＥＧＧＹＹＹＧＲＳＹＹＴＭＤＹ 配列番号３
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ 配列番号４
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ 配列番号５
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ 配列番号６

ｍＡｂ１５８のヒト化バージョンであるＢＡＮ２４０１の高い親和性および選択性は、ＢＡＮ２４０１を、特にアルツハイマー病の治療および／または予防での使用のための非常に重要な候補にし、医薬品としての使用に備えて、現在、臨床試験に供されている。ＢＡＮ２４０１の特徴は、ＥＰ２００４６８８に記載される。

抗体の効能は、いくつかの薬物動態および薬力学的因子に依存する（例えば、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ ８（２）（２０１２）：ｐ．１４１−１６０；Ｂｏｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２１（２０１０）：ｐ．２１５３−２１６３；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（２０１１）：ｐ．１−９およびＩｇａｗａ ｅｔ ａｌ，ｍＡｂｓ ３：３（２０１１）：ｐ．２４３−２５２を参照）。これらのうち、全身的曝露の増大に伴う血清半減期の延長は、しばしば、重大な治療的価値の改善のためにかなりの潜在性を提供する。またそれは、全身への投与量を低減する機会を提供し、それは、重要な意味を有する。

本発明は、Ａβプロトフィブリルに結合する抗体、および、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防的処置におけるそれらの使用を提供する。さらに、本発明は、そのような疾患の診断において有用な抗体、ならびにそのような疾患の疾患進行の監視におけるそれらの使用、ならびに前記抗体の獣医用途に関連し得る。驚くべきことに、ｍＡｂ１５８に基づくヒト化抗体、すなわちＢＡＮ２４０１、の曝露ならびに半減期は、かなり、例えば約２倍またはそれ以上、主に、１つまたは複数の突然変異を、ＢＡＮ２４０１抗体の可変の軽鎖の特定の位置、すなわち１７位、７９位および／または８２位（Ｋａｂａｔの１７位、７４位および７７位）（さらに図９を参照、ここでは、これらの位置は、ｘ_１、ｘ_２およびｘ_３と呼ばれる）に導入することにより高められることが確認されている。ＢＡＮ２４０１では、１７位（Ｋａｂａｔの１７位）のアミノ酸はＡであり、７９位（Ｋａｂａｔの７４位）のアミノ酸はＲであり、８２位（Ｋａｂａｔ７７位）のアミノ酸はＲである。Ｋａｂａｔのナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏ．９１−３２４２）に従って付与される。

場合により、本発明に係る抗体のさらなる改善は、免疫学的重要性のさらなる改善、すなわち低免疫原性のために、増大した半減期を提供する突然変異のそれぞれを、１つまたは複数の隣接する突然変異、すなわち、抗体の可変の軽鎖の１３、２１、８１および／または８４（Ｋａｂａｔの１３位、２１位、７６位および７９位）（図９を参照、ここでは、これらの位置は、抗体の可変の重鎖のｙ_１−４と呼ばれる）、３７、３８および／または４０（Ｋａｂａｔの３７位、３８位および４０位）（図１０を参照、ここでは、これらの位置は、ｚ_１−３と呼ばれる）と、組み合わせることにより達成することができる。ＢＡＮ２４０１配列と比較してｘ_１が突然変異される場合は、突然変異ｙ_１および／またはｙ_２が導入され得て、ｘ_２および／またはｘ_３が突然変異される場合は、突然変異ｙ_３および／またはｙ_４が導入され得る。さらに、突然変異ｚ_１−３が導入され得る。

本発明は、以下のとおりである：
［１］Ａβプロトフィブリルに対する親和性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記の抗体またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号８に記載の可変の軽鎖、ここで、
ｘ１は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＱ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
ｘ２は、Ｒ、Ｔ、Ｋ、ＡおよびＧ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
ｘ３は、Ｒ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＮ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
ｙ１は、ＶおよびＡから選択され；
ｙ２は、ＩおよびＶから選択され；
ｙ３は、ＳおよびＱから選択され；
ｙ４は、ＥおよびＤから選択される；
および場合により、
配列番号１４に記載の可変の重鎖、ここで、
ｚ１は、ＶおよびＩから選択され；
ｚ２は、ＲおよびＱから選択され；および、
ｚ３は、Ａ、ＮおよびＴから選択される、
ただし、ｘ１＝Ａ、ｘ２＝Ｒおよびｘ３＝Ｒの組み合わせを除く、
を有する、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

［２］ ［１］に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、
ｘ１は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＱから選択され；
ｘ２は、Ｒ、Ｔ、Ｋ、ＡおよびＧから選択され；
ｘ３は、Ｒ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＮから選択され；
ｙ１は、ＶおよびＡから選択され；
ｙ２は、ＩおよびＶから選択され；
ｙ３は、ＳおよびＱから選択され；
ｙ４は、ＥおよびＤから選択され；および、
配列番号１４に記載の可変の重鎖、ここで、
ｚ１は、ＶおよびＩから選択され；
ｚ２は、ＲおよびＱから選択され；および、
ｚ３は、Ａ、ＮおよびＴから選択される；
ただし、ｘ１＝Ａ、ｘ２＝Ｒおよびｘ３＝Ｒの組み合わせを除く、
抗体または抗原結合フラグメント。

［３］ ［１］または［２］に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、軽鎖は、以下：
ｘ１および（ｙ１および／またはｙ２）；
ｘ１および（ｙ１および／またはｙ２）およびｘ２および（ｙ３および／またはｙ４）；
ｘ１および（ｙ１および／またはｙ２）およびｘ２およびｘ３および（ｙ３および／またはｙ４）；
ｘ１および（ｙ１および／またはｙ２）およびｘ３および（ｙ３および／またはｙ４）；
ｘ２（ｙ３および／またはｙ４）；
ｘ２およびｘ３および（ｙ３および／またはｙ４）；および、
ｘ３および（ｙ３および／またはｙ４）；
ただし、ｘ１＝Ａ、ｘ２＝Ｒおよびｘ３＝Ｒの組み合わせを除く、
から選択される突然変異の組み合わせを含む、
抗体または抗原結合フラグメント。

［４］ ［１］から［３］のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、可変の軽鎖は、以下：
ｘ１が、Ｄおよび（ｙ１および／またはｙ２）である；
ｘ１が、Ｄおよび（ｙ１および／またはｙ２）であり、ｘ２が、Ｔおよび（ｙ３および／またはｙ４）である；
ｘ１が、Ｄおよび（ｙ１および／またはｙ２）であり、ｘ２が、Ｔであり、ｘ３が、Ｓおよび（ｙ３および／またはｙ４）である；
ｘ１が、Ｄおよび（ｙ１および／またはｙ２）であり、ｘ３が、Ｓおよび（ｙ３および／またはｙ４）である；
ｘ２が、Ｔ（ｙ３および／またはｙ４）である；
ｘ２が、Ｔであり、ｘ３が、Ｓおよび（ｙ３および／またはｙ４）である；および、
ｘ３が、Ｓおよび（ｙ３および／またはｙ４）である；
ここで、ｙ１は、ＶまたはＡであり、ｙ２は、ＶまたはＩであるが、ｙ１＝Ｖおよびｙ２＝Ｉの組み合わせは除き；ｙ３は、ＳまたはＱであり、ｙ４は、ＥまたはＤであるが、ｙ３＝ＳおよびＹ４＝Ｅの組み合わせは除く、
から選択される１つまたは複数の突然変異を含む、
抗体または抗原結合フラグメント。

［５］ ［１］から［４］のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、
ｘ１は、Ｄであり；
ｘ２は、Ｔであり；
ｘ３は、Ｒであり；
ｙ１は、ＶおよびＡから選択され；
ｙ２は、ＶおよびＩから選択され；
ｙ３は、ＱおよびＳから選択され；
ｙ４は、ＤおよびＥから選択され；
ｚ１はＶであり；
ｚ２はＲであり；および、
ｚ３は、Ｎ、ＴおよびＡから選択され；
ただし、ｙ１がＶであり、ｙ２がＩであり、ｙ３がＳであり、ｙ４がＥであり、ｚ１がＶであり、ｚ２がＲであり、ｚ３がＡである組み合わせを除く、
抗体または抗原結合フラグメント。

［６］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［７］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［８］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［９］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［１０］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［１１］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［１２］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［１３］ ［１］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［１４］ ［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、前記の抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ重鎖定常領域を含む、抗体または抗原結合フラグメント。

［１５］ ［１］〜［１４］のいずれか１つに記載の抗体であって、治療での使用のための抗体。

［１６］ ［１］〜［１４］のいずれか１つに記載の抗体であって、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防での使用のための抗体。

［１７］使用のための、［１６］に記載の抗体であって、Ａβタンパク質凝集と関連するそのような他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択される、抗体。

［１８］ ［１］〜［１４］のいずれか１つに記載の抗体の使用であって、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防において有用な薬物の製造における使用。

［１９］ ［１８］に記載の使用であって、Ａβタンパク質凝集と関連するそのような他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択される、使用。

［２０］対象におけるＡβプロトフィブリルの量を減少させる方法であって、治療的に有効量の、［１］〜［１４］に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、前記対象に投与するステップを含む方法。

［２１］アルツハイマー病を有する、または発症するリスクがある対象における、アルツハイマー病の治療および／または予防のための方法であって、治療的に有効量の、［１］〜［１４］に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、前記対象に投与するステップを含む、方法。

［２２］外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）の、前記疾患を有する、または発症するリスクがある対象における、治療および／または予防のための方法であって、治療的に有効量の、［１］〜［１４］に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、前記対象に投与するステップを含む、方法。

［２３］ヒトにおける、Ａβプロトフィブリルおよび／または凝集したＡβタンパク質の量を測定するための方法であって、ヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、［１］〜［１４］に記載の抗体または抗原結合フラグメントと接触させるステップ、および、前記のＡβプロトフィブリルおよび／または凝集したＡβタンパク質に結合した抗体または抗原結合フラグメントの量を測定するステップ、を含む、方法。

［２４］アルツハイマー病を有する、または発症するリスクがあるヒトにおける、アルツハイマー病の診断のための方法であって、ヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、［１］〜［１４］に記載の抗体または抗原結合フラグメント、またはそれらのフラグメントと接触させるステップ、および、凝集したＡβタンパク質に結合した前記抗体の量を測定するステップ、を含む、方法。

［２５］外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）のいずれかを有する、または発症するリスクがあるヒトにおける、前記疾患のいずれかの診断のための方法であって、ヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、［１］〜［１４］に記載の抗体または抗原結合フラグメント、またはそれらのフラグメントと接触させるステップ、および、凝集したＡβタンパク質に結合した前記抗体の量を測定するステップ、を含む、方法。

［２６］ ［１］〜［１４］のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合フラグメントを、薬学的に許容できる賦形剤および／または希釈剤とともに含む、医薬組成物。

［２７］ ［１］〜［１４］のいずれか１つに記載の抗体であって、獣医用途のための、抗体。

ＢＡＮ２４０１（コントロール）と比較した、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓについての、Ａβモノマーと比較したＡβプロトフィブリルに対する結合および選択性の分析を提供する。溶液中のＡβ１−４２プロトフィブリルによる結合阻害を白丸および白四角で示し、溶液中のＡβ１−４０モノマーによる結合阻害を黒丸および黒四角で示す。 図１−１の続き。 時間対濃度のグラフとして示された、マウスにおける、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体の血漿薬物曝露を提供する。投与後０．５ｈ、２日、７日、１５日および２９日の時点で採取した、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓ、および投与後０．５ｈ、２日、７日、１４日および２８日の時点で採取した、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓの、単回ｉ．ｖ．注射後の血漿レベルをグラフに示す。Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓは、ここに示される他の抗体と同一のＰＫ試験には含まれなかったが、その代わりに、別個の機会に与えられた。しかしながら、２つの血漿サンプリング時点を除き、同一の試験デザインを２つの別個の試験に用いた。全ての血漿サンプルは、アッセイ間の変動を避けるために、同時にＥＬＩＳＡにより分析した。血漿薬物濃度（μｇ／ｍｌ）をｙ軸（対数目盛）に示し、投与後の時間（時間（ｈ））をｘ軸に示す。平均グループ値を、標準偏差を示すエラーバーで示す。平均ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}値および終末相半減期は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いた非コンパートメント分析により計算し、表１に示す。 時間対濃度のグラフとして示された、ラットにおける、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体の血漿薬物曝露を提供する。投与後０．５ｈ、２ｈ、７ｈ、２４ｈ、２日、４日、７日、１４日および２９日の時点で採取した、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの、単回ｉ．ｖ．注射後の血漿レベルをグラフで示す。血漿薬物濃度（μｇ／ｍｌ）をｙ軸（対数目盛）に示し、投与後の時間（時間（ｈ））をｘ軸に示す。平均グループ値を、標準偏差を示すエラーバーで示す。平均ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}値および平均終末相半減期は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いた非コンパートメント分析により計算し、表２に示す。 ＢＡＮ２４０１と比較した、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の脱免疫化変異体に関する、Ａβモノマーと比較したＡβプロトフィブリルに対する結合および選択性の分析によるデータを提供する。溶液中でのＡβ１−４２プロトフィブリルによる結合阻害を白丸および白四角で示し、溶液中でのＡβ１−４０モノマーによる結合阻害を黒丸および黒四角で示す。Ａ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １、Ｂ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ２、Ｃ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ｄ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４、Ｅ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ５、Ｆ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ６、Ｇ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ７、Ｈ）Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８。 図４−１の続き。 図４−２の続き。 図４−３の続き。 時間対濃度のグラフとして示された、マウスにおける、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体の血漿薬物曝露を提供する。投与後０．５ｈ、２日、７日、１４日および２８日の時点で採取された、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔの８個の脱免疫化変異体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の、単回ｉ．ｖ．注射後の血漿レベル。血漿薬物濃度（μｇ／ｍｌ）をｙ軸（対数目盛）に示し、投与後の時間（時間（ｈ））をｘ軸に示す。平均グループ値を、標準偏差を示すエラーバーで示す。平均ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}値および平均終末相半減期は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いた非コンパートメント分析により計算し、表６に示す。 時間対濃度のグラフとして示した、ラットにおける、ＢＡＮ２４０１および突然変異体の血漿薬物曝露を提供する。投与後０．５ｈ、２日、７日、１４日および２８日の時点で採取した、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔの８個の脱免疫化変異体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の、単回ｉ．ｖ．注射後の血漿レベル。血漿薬物濃度（μｇ／ｍｌ）をｙ軸（対数目盛）に示し、投与後の時間（時間（ｈ））をｘ軸に示す。平均グループ値を、標準偏差を示すエラーバーで示す。平均ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}値および平均終末相半減期は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いた非コンパートメント分析により計算し、表７に示す。 時間対濃度のグラフとして示した、カニクイザルにおける、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８の用量補正血漿薬物曝露を提供する。投与後５分、１ｈ、２ｈ、８ｈ、２４ｈ、２日、４日、７日、１４日、２１日および２８日の時点で採取された、ＢＡＮ２４０１、および、投与後５分、２ｈ、８ｈ、２４ｈ、３日、７日、１４日、２１日および２８日の時点で採取された、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８の、単回ｉ．ｖ．注射後の抗体の血漿レベル。本発明の抗体は、異なる試験において、ＢＡＮ２４０１（５ｍｇ／ｋｇ）と比較して異なる投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）で、サルに投与された。したがって、血漿曝露のグラフは、用量調整されている。注射した投与量ｍｇ／ｋｇあたりの用量補正血漿薬物濃度（μｇ／ｍｌ）をｙ軸（対数目盛）に示し、投与後の時間（時間（ｈ））をｘに示す。平均グループ値を、標準偏差を示すエラーバーで示す。用量調整した平均ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}値および終末相半減期は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いた非コンパートメント分析により計算し、表８に示す。 本発明に関するアミノ酸配列を提供する。 図８−１の続き。 ２頁に分けて、可変の軽鎖のアミノ酸配列を、ＶＬ−ＣＤＲ１−３配列を灰色にして表を提供する。ＢＡＮ２４０１：配列番号７。本発明に係る可変の軽鎖を有する新規の抗体：配列番号８。そのような可変の軽鎖の具体例：ｉ）：配列番号９；ｉｉ）：配列番号１０；ｉｉｉ）：配列番号１１；およびｉｖ）：配列番号１２。 図９−１の続き。 ３頁に分けて、可変の重鎖のアミノ酸配列を、ＶＨ−ＣＤＲ１−３配列を灰色にして表を提供する。ＢＡＮ２４０１：配列番号１３。本発明に係る可変の重鎖を有する新規の抗体 配列番号１４。そのような可変の重鎖の具体例：ｉ）：配列番号１５；ｉｉ）：配列番号１６；ｉｉｉ）：配列番号１７；およびｉｖ）：配列番号１８。 図１０−１の続き。 図１０−２の続き。 前臨床種のマウス、ラットおよびカニクイザルを含む、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８の中央クリアランス（ｃｅｎｔｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）（ＣＬ）の単純アロメトリックスケーリングを提供する。異なる種のＣＬを、それぞれ、それらの重量に対してプロットする（ダイヤ）。７０ｋｇの体重のヒトでのＣＬを示すために回帰線を推定した。ＢＡＮ２４０１に関して、測定した真の中央ＣＬは、白四角により示されるが、マウス、ラットおよびカニクイザルにおけるＢＡＮ２４０１のＣＬに基づく線形回帰線からは逸脱している。本発明の抗体のＣＬの優れた線形相関とは対照的に、ＢＡＮ２４０１は、ＣＬの不十分な線形相関を示し、半減期の不確かな予測を示した。

突然変異Ａ１７Ｄ、Ｒ７９ＴおよびＲ８２Ｓは、ＢＡＮ２４０１抗体での位置で表し、ここで、１７位、７９位および８２位のアミノ酸は、可変の軽鎖において突然変異されている。
「ＢＡＮ２４０１」とは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する可変の軽鎖および配列番号１３に記載の可変の重鎖を含む、マウス抗体ｍＡｂ１５８のヒト化モノクローナル抗体を意味する。ＢＡＮ２４０１およびｍＡｂ１５８の両方およびそれらの特徴（ＶＬ−ＣＤＲ１−３およびＶＨ−ＣＤＲ１−３を含む）は、ＥＰ２００４６８８に記載される。ＢＡＮ２４０１は、本発明から除外される。

以下の略称は、以下を意味する：

ＢＡＮ２４０１：配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ：配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ：配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓ：配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓ：配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １：配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ２：配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３：配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４：配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ５：配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ６：配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ７：配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８：配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、抗体。

本発明に係る抗体、またはその抗原結合フラグメントは、可変の軽鎖において、１７位（Ｋａｂａｔの１７位）に、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑまたは機能性類似体を含み、７９位（Ｋａｂａｔの７４位）に、アミノ酸Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｇまたは機能性類似体を含み、８２位（Ｋａｂａｔの７７位）に、アミノ酸Ｒ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｎまたは機能性類似体を含む。機能性類似体は、抗原に対する結合に悪影響を及ぼさずに、Ａ（１７位）各Ｒ（７９位および８２位）と比較して、より低いｐＩ値の抗体を提供するアミノ酸である。

本開示におけるアミノ酸配列は、以下のように表される：
配列番号１：ＢＡＮ２４０１の可変の重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１。
配列番号２：ＢＡＮ２４０１の可変の重鎖ＶＨ−ＣＤＲ２。
配列番号３：ＢＡＮ２４０１の可変の重鎖ＶＨ−ＣＤＲ３。
配列番号４：ＢＡＮ２４０１の可変の軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１。
配列番号５：ＢＡＮ２４０１の可変の軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ２。
配列番号６：ＢＡＮ２４０１の可変の軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ３。
配列番号７：ＢＡＮ２４０１の可変の軽鎖。
配列番号８：本発明の抗体における一般的な可変の軽鎖配列。
配列番号９：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号１０：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号１１：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号１２：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号１３：ＢＡＮ２４０１の可変の重鎖。
配列番号１４：本発明の抗体における一般的な可変の重鎖配列。
配列番号１５：本発明の抗体における特定の可変の重鎖配列。
配列番号１６：本発明の抗体における特定の可変の重鎖配列。
配列番号１７：本発明の抗体における特定の可変の重鎖配列。
配列番号１８：本発明の抗体における特定の可変の重鎖配列。
配列番号１９：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号２０：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号２１：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号２２：本発明の抗体における特定の可変の軽鎖配列。
配列番号２３：本発明の抗体に含まれる、ヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列。
配列番号２４：本発明の抗体に含まれる、ヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列。

本発明の抗体およびＢＡＮ２４０１の可変の軽鎖（配列番号７）は、３個のＣＤＲ−配列（ＶＬ−ＣＤＲ１〜３）を含み：
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ 配列番号４
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ 配列番号５
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ 配列番号６
そして、本発明の抗体およびＢＡＮ２４０１の可変の重鎖（配列番号１３）は、３個のＣＤＲ−配列（ＶＨ−ＣＤＲ１〜３）を含む：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＨ 配列番号１
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＧＤＴＶＫＧ 配列番号２
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＥＧＧＹＹＹＧＲＳＹＹＴＭＤＹ 配列番号３

本発明の一態様によれば、Ａβプロトフィブリルに結合する抗体が提供され、以下のＣＤＲ配列の組み合わせを有し：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＨ 配列番号１
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＧＤＴＶＫＧ 配列番号２
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＥＧＧＹＹＹＧＲＳＹＹＴＭＤＹ 配列番号３
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ 配列番号４
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ 配列番号５
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ 配列番号６
そして、配列番号８を有する可変の軽鎖を含み、ここで、ｘ_１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑまたは機能性類似体であり、ｘ_２は、Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｇまたは機能性類似体であり、ｘ_３は、Ｒ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｎまたは機能性類似体であるが、ｘ_１＝Ａ、ｘ_２＝Ｒおよびｘ_３＝Ｒの組み合わせを除く。

機能性類似体は、抗原に対する結合に悪影響を及ぼさずに、Ａ（ｘ_１）各Ｒ（ｘ_２およびｘ_３）と比較して、より低いｐＩ値の抗体を提供するアミノ酸である。

可変の重鎖は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、任意の組み合わせでｚ_１、ｚ_２およびｚ_３を含み、ここで、
ｚ_１は、ＶおよびＩから選択され；
ｚ_２は、ＲおよびＱから選択され；および、
ｚ_３は、Ａ、ＮおよびＴから選択され；
ただし、ｚ_１＝Ｖ、ｚ_２＝Ｒおよびｚ_３＝Ａの組み合わせを除く。

この教示に基づいて、本発明に従ってアミノ酸を特定の位置に導入する方法、ならびに、生じた産物を、例えばＡβプロトフィブリルに対する親和性および重要な他の特徴に関して試験する方法が開示されているので（以下を参照）、それぞれの位置に関して上記に定義された特定のアミノ酸に対する機能性類似体の同定は、当業者によって容易になされることが指摘されるべきである。

したがって、本発明の一態様では、Ａβプロトフィブリルに対する親和性を有する抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、前記の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、
配列番号８に記載の可変の軽鎖、ここで、
ｘ_１は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＱ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
ｘ_２は、Ｒ、Ｔ、Ｋ、ＡおよびＧ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
ｘ_３は、Ｒ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＮ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
ｙ_１は、ＶおよびＡから選択され；
ｙ_２は、ＩおよびＶから選択され；
ｙ_３は、ＳおよびＱから選択され；
ｙ_４は、ＥおよびＤから選択される；
および場合により、
配列番号１４に記載の可変の重鎖、ここで、
ｚ_１は、ＶおよびＩから選択され；
ｚ_２は、ＲおよびＱから選択され；および
ｚ_３は、Ａ、ＮおよびＴから選択される；
ただし、ｘ_１＝Ａ、ｘ_２＝Ｒおよびｘ_３＝Ｒの組み合わせを除く、
を有する。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＱから選択され；
ｘ_２は、Ｒ、Ｔ、Ｋ、ＡおよびＧから選択され；
ｘ_３は、Ｒ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＮから選択され；
ｙ_１は、ＶおよびＡから選択され；
ｙ_２は、ＩおよびＶから選択され；
ｙ_３は、ＳおよびＱから選択され；
ｙ_４は、ＥおよびＤから選択される；および、
配列番号１４に記載の可変の重鎖、ここで、
ｚ_１は、ＶおよびＩから選択され；
ｚ_２は、ＲおよびＱから選択され；および
ｚ_３は、Ａ、ＮおよびＴから選択される；
ただし、ｘ_１＝Ａ、ｘ_２＝Ｒおよびｘ_３＝Ｒの組み合わせを除く。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、軽鎖は、以下：
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）；
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_２および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_２およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
ｘ_２（ｙ_３および／またはｙ_４）；
ｘ_２およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；および、
ｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
ただし、ｘ_１＝Ａ、ｘ_２＝Ｒおよびｘ_３＝Ｒの組み合わせを除く、
から選択される突然変異の組み合わせを含む。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、可変の軽鎖は、以下：
ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）である；
ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）であり、ｘ_２は、Ｔおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）であり、ｘ_２は、Ｔであり、ｘ_３は、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）であり、ｘ_３は、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
ｘ_２が、Ｔ（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
ｘ_２が、Ｔであり、ｘ_３が、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；および、
ｘ_３が、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
ここで、ｙ_１は、ＶまたはＡであり、ｙ_２は、ＶまたはＩであるが、ｙ_１＝Ｖおよびｙ_２＝Ｉの組み合わせは除き；ｙ_３は、ＳまたはＱであり、ｙ_４は、ＥまたはＤであるが、ｙ_３＝ＳおよびＹ_４＝Ｅの組み合わせは除く、
から選択される１つまたは複数の突然変異を含む。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、ｙ_１は、Ａであり、ｙ_２は、Ｖであり、ｙ_３は、Ｑであり、ｙ_４は、Ｄである。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、ＶおよびＡから選択され；
ｙ_２は、ＶおよびＩから選択され；
ｙ_３は、ＱおよびＳから選択され；
ｙ_４は、ＤおよびＥから選択され；
ｚ_１はＶであり；
ｚ_２はＲであり；および、
ｚ_３は、Ｎ、ＴおよびＡから選択され；
ただし、ｙ_１がＶであり、ｙ_２がＩであり、ｙ_３がＳであり、ｙ_４がＥであり、ｚ_１がＶであり、ｚ_２がＲであり、ｚ_３がＡである組み合わせは除く。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ｖであり；
ｙ_２は、Ｖであり；
ｙ_３は、Ｑであり；
ｙ_４は、Ｅであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｎである。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ｖであり；
ｙ_２は、Ｖであり；
ｙ_３は、Ｓであり；
ｙ_４は、Ｄであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｎである。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ａであり；
ｙ_２は、Ｉであり；
ｙ_３は、Ｑであり；
ｙ_４は、Ｅであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｎである。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ａであり；
ｙ_２は、Ｉであり；
ｙ_３は、Ｓであり；
ｙ_４は、Ｄであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｎである。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ｖであり；
ｙ_２は、Ｖであり；
ｙ_３は、Ｑであり；
ｙ_４は、Ｅであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｔである。

本態様の一実施態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ｖであり；
ｙ_２は、Ｖであり；
ｙ_３は、Ｓであり；
ｙ_４は、Ｄであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｔである。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ａであり；
ｙ_２は、Ｉであり；
ｙ_３は、Ｑであり；
ｙ_４は、Ｅであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｔである。

本実施態様の一態様では、抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、
ｘ_１は、Ｄであり；
ｘ_２は、Ｔであり；
ｘ_３は、Ｒであり；
ｙ_１は、Ａであり；
ｙ_２は、Ｉであり；
ｙ_３は、Ｓであり；
ｙ_４は、Ｄであり；
ｚ_１は、Ｖであり；
ｚ_２は、Ｒであり；および、
ｚ_３は、Ｔである。

本発明の一態様によれば、ｘ_１−ｘ_３のそれぞれの突然変異は、１つまたは複数のさらなる突然変異ｙ_１−ｙ_４と組み合わされ：
ｘ_１がＡでない場合は、突然変異ｙ_１および／またはｙ_２が導入され；
ｘ_２がＲでない、および／または、ｘ_３がＲでない場合は、突然変異ｙ_３および／またはｙ_４が導入され；
配列番号７と比較して、以下の組み合わせの突然変異体を含む可変の軽鎖を提供する：
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）；または、
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_２および（ｙ_３および／またはｙ_４）；または、
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_２およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；または、
ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；または、
ｘ_２および（ｙ_３および／またはｙ_４）；または、
ｘ_２およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；または、
ｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
ここで、パラメーターｘおよびｙは、上記で定義されるとおりである。

一実施態様では、本発明に係る抗体、またはその抗原結合フラグメントの軽鎖（配列番号８）は、可変の軽鎖内に１つまたは複数の突然変異ｘ_１−ｘ_３のみを含み（Ｎ末端ナンバリングを使用）：Ａ１７Ｄ（ｘ_１）、Ｒ７９Ｔ（ｘ_２）およびＲ８２Ｓ（ｘ_３）：
Ａ１７Ｄ；または
Ａ１７ＤおよびＲ７９Ｔ；または
Ａ１７ＤおよびＲ７９ＴおよびＲ８２Ｓ；または
Ａ１７ＤおよびＲ８２Ｓ；または
Ｒ７９Ｔ；または
Ｒ７９ＴおよびＲ８２Ｓ；または
Ｒ８２Ｓ；
ここで、ｙ_１はＶであり、ｙ_２はＩであり、ｙ_３はＳであり、ｙ_４は、Ｅである（配列番号７と比較して変更なし）。

さらなる実施態様によれば、以下の組み合わせのいずれか１つを提供する突然変異ｙ_１−ｙ_４が導入される：
Ａ１７Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）；
Ａ１７Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）およびＲ７９Ｔおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）；
Ａ１７Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）およびＲ７９ＴおよびＲ８２Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）；
Ａ１７Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）およびＲ８２Ｓ（ｙ_３および／またはｙ_４）；
Ｒ７９Ｔ（ｙ_３および／またはｙ_４）；
Ｒ７９ＴおよびＲ８２Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）；
Ｒ８２Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）；
ここで、ｙ_１は、ＶまたはＡであり、ｙ_２は、ＶまたはＩであり、ｙ_１＝Ｖおよびｙ_２＝Ｉの組み合わせは除き、
ｙ_３は、ＳまたはＱであり、ｙ_４は、ＥまたはＤであり、ｙ_３＝ＳおよびＹ_４＝Ｅの組み合わせは除く。

さらに特定の組み合わせは、配列番号９〜１２に開示される。

本発明に係る抗体の可変の重鎖（ＶＨ）は、アミノ酸配列 配列番号１４を有し、ここで、ｚ_１は、ＶまたはＩであり、ｚ_２は、ＲまたはＱであり、ｚ_３は、Ａ、ＮまたはＴであり、例えば配列番号１５〜１８である。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９〜１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選択される可変の軽鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１５〜１８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選択される可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９〜１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選択される可変の軽鎖；および配列番号１５〜１８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選択される可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

本態様の一実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む。

一実施態様では、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ定常領域、または、参照により本明細書中に含まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）に記載の任意のそれらの対立遺伝子変異からなる群より選択される、重鎖定常領域を含む。任意のそのような配列が、本発明において用いられ得る。より好ましい実施態様では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ１である。ヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列は、当技術分野で知られていて、配列番号２３に記載される。

一実施態様では、本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントは、κ−およびλ−鎖定常領域、または、参照により本明細書中に含まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ． Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）に記載の任意のそれらの対立遺伝子変異からなる群より選択される、軽鎖定常領域を含む。任意のそのような配列が、本発明において用いられ得る。より好ましい実施態様では、抗体軽鎖定常領域は、κである。ヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列は、当技術分野で知られていて、配列番号２４に記載される。

一実施態様では、本発明に係る抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）_２フラグメントまたは単鎖Ｆｖフラグメントである。

本発明に係る抗体または抗原結合フラグメントは、上記で定義した可変の軽鎖および重鎖の任意の組み合わせを含み得る。

本発明の一態様によれば、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害、例えば、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体（ＤＬＢ）を有する認知症、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）を有する、または発症するリスクがある患者に、本発明に係る１つまたは複数の抗体、または抗原結合フラグメントを投与することによる、治療での使用のための、Ａβプロトフィブリルに関して高い親和性を有する改善された抗体、または抗原結合フラグメントが提供される。適切な投与量は、医療適用および患者の状態、選択される頻度、例えば単回、毎日、毎週、年４回またはさらにいっそう少ない頻度の投与に加えて、投与経路、例えばｉ．ｖ．注入、ｓ．ｃ．注入、または局所投与に応じて、幅広い範囲内、例えば０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／投与量で変化し得る。

一態様では、治療での使用のための、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供される。

一態様では、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防での使用のための、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供される。典型的に、そのような他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択され得る。

一態様では、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防において有用な薬物の製造での、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用が提供される。典型的に、そのような他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択され得る。

一態様では、治療的に有効量の、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを人に投与するステップを含む、人においてＡβプロトフィブリルの量を低減させる方法が提供される。

一態様では、治療的に有効量の、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントを人に投与するステップを含む、疾患を有する、または発症するリスクがある対象での、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防のための方法が提供される。典型的に、そのような他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択され得る。

「対象」は、典型的に哺乳類、例えばヒトである。他の哺乳類は、獣医用途／処置／予防が適用されるような哺乳類を表わす。

一態様では、ヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、本発明の標識された抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップ、および、前記Ａβプロトフィブリルおよび／または凝集したＡβタンパク質に結合した抗体、または抗原結合フラグメントの量を測定するステップ、を含む、ヒトにおけるＡβプロトフィブリルおよび／または凝集したＡβタンパク質の量を測定するための方法が提供され得る。抗体または抗原結合フラグメントは、検出目的のために、放射性リガンド、例えばＩ^１３１、Ｃ^１１、Ｃ^１４、Ｈ^３、Ｆ^１８、またはガリウム^６８で標識され得るが、これらの放射性同位体に制限されない。

一態様では、アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害、例えば、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体（ＤＬＢ）を有する認知症、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）を有する、または発症するリスクがあるヒトにおける、前記疾患の診断のための方法であって、ヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップ、および、凝集したタンパク質と結合した抗体または抗原結合フラグメントの量を測定するステップを含む、方法を提供することができる。典型的に、Ａβタンパク質凝集と関連する前記の他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体（ＤＬＢ）を有する認知症、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択され得る。典型的に、ヒトの体液または組織は、インビボまたはインビトロで（患者から得られるサンプル内で）、１つまたは複数の本発明の抗体または抗原結合フラグメントの製剤との接触により分析され、Ａβプロトフィブリルに結合した抗体または抗原結合フラグメントの量が測定される。プロトフィブリルの定量化は、上述の疾患の診断、様々な処置の追跡調査、ならびに新規の医薬の開発において用いられる。場合により、抗体またはその抗原結合フラグメントは、そのような製剤において、当技術分野で知られている任意の技術、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅおよび／またはＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩを用いたイメージングによる分析によって検出および測定される試薬で標識される。抗体または抗原結合フラグメントは、検出目的のために、放射性リガンド、例えばＩ^１３１、Ｃ^１１、Ｃ^１４、Ｈ^３、Ｆ^１８またはガリウム^６８で標識され得るが、これらの放射性同位体に制限されない。

本発明のさらなる態様によれば、有効量の本発明に係る１つまたは複数の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物が調製される。本発明に係る抗体を含む医療組成物は、有効量の抗体に加えて、そのような製剤での使用に関して知られる他の成分、例えばバッファー、保存および安定性のための成分を含み得る。

別の態様では、獣医用途のための、本発明の抗体が提供され得る。典型的に、前記獣医用途は、Ａβタンパク質凝集と関連する障害の治療および／または予防を含む。

本発明のさらなる態様によれば、対症療法、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗薬および５ＨＴ６阻害剤と組み合わせて、本発明に係る抗体を利用する治療が提供され得る。

他の疾患を修飾する処置、例えば、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、γ−セクレターゼモジュレーター（ＧＳＭ）、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）阻害剤、ＢＡＣＥモジュレーター、ワクチン、他の抗体、薬剤標的化ｔａｕまたは神経炎症性プロセス、降圧剤などとの併用は、効率的な治療のためのさらなる可能性を提供する。

栄養剤との併用は、効率的な治療のためのさらなる可能性を提供し得る。

一態様では、本発明の抗体を、薬学的に許容できる賦形剤および／または希釈剤と一緒に含む医薬組成物が提供され、前記組成物は、さらなる治療薬をさらに含んでよい。典型的に、前記のさらなる治療薬は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗薬、５ＨＴ６阻害剤、ＧＳＩ、ＧＳＭ、ＢＡＣＥ阻害剤、ＢＡＣＥモジュレーター、ワクチン、他の抗体、薬剤標的化ｔａｕまたは神経炎症性プロセス、降圧剤および栄養剤から選択され得る。組成物は、単回または連続の投与量として提供され得る。

本発明は、いくつかの非限定の実施例により説明される：

実施例１．抗体の生産および用いた方法
参照抗体の生産
参照抗体ＢＡＮ２４０１を、ＥＰ２００４６８８において既に記載された方法に従って生産した。

本発明の抗体の生産
本発明の抗体は、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳおよびＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ Ｘｃｅｅｄ（商標）発現系（Ｌｏｎｚａ）を用いたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、それぞれ、一過的および／または安定した生産により製造した。以下の突然変異体を、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ Ｘｃｅｅｄ（商標）発現系を用いた一過的なトランスフェクションにより生産した：Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓ。以下の突然変異体を、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ Ｘｃｅｅｄ（商標）発現系を用いた一過的および安定したトランスフェクションの両方により生産した：Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ２、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ５、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ６、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ７およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８。Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓ突然変異体を、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ発現系を用いた安定したトランスフェクションにより生産した。

突然変異体の領域をコードする軽鎖および重鎖の配列を、従来の方法を用いて合成した。

ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ Ｘｅｅｄ（商標）発現系における一過的なトランスフェクションのために、軽鎖をコードする領域を、ｐＸＣ−１７．４ベクター内にサブクローニングして、重鎖をコードする領域をｐＸＣ−１８．４ベクター内にサブクローニングした。発現培養物を、トランスフェクション後６日に回収して、遠心分離および滅菌濾過により浄化した。浄化された細胞培養上清を、プロテインＡクロマトグラフィーを用いた精製に供した。溶出した抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に提供した。産物を、準備のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに精製して、凝集体を除去した。回収したモノマーのピークをその後に分析ＳＥＣにより分析して、凝集体レベルは、全ての産物に関して２％未満であると判定された。

ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ Ｘｅｅｄ（商標）系における安定した発現は、本質的に、製造業者の推奨に従って行なった。手短には、軽鎖および重鎖を含む２つのベクター（ｐＸＣ−１７．４およびｐＸＣ−１８．４）を、両方の遺伝子を含む１つの二重遺伝子ベクターにライゲーションした。ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ細胞を、直線化した二重遺伝子ベクターを用いたエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。死滅培養物（ｄｅａｔｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の生産性スクリーニングおよびクローンのスクリーニングを、ＥＬＩＳＡにより分析した。生産は、１５％ Ｆｅｅｄ Ａおよび１５％ Ｆｅｅｄ Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充されたＣＤ−ＣＨＯ培地を用いて行なった。上清を、遠心分離および滅菌濾過により回収した。浄化した細胞培養上清を、プロテインＧクロマトグラフィーを用いて精製して、ダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）にバッファーを交換した。

ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ発現系（Ｌｏｎｚａ）を用いた安定したトランスフェクションのために、重鎖遺伝子をｐＥＥ６．４ベクターにライゲーションして、軽鎖遺伝子をｐＥＥ１２．４ベクターにライゲーションした。２つのベクターをライゲーションして二重遺伝子ベクターを形成した。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞を、直線化した二重遺伝子ベクターを用いたエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。本質的には、製造業者の推奨に従ってトランスフェクションを行なった。死滅培養物の生産性スクリーニングおよびクローンのスクリーニングを、ＥＬＩＳＡにより分析した。生産は、１５％ Ｆｅｅｄ Ａおよび１５％ Ｆｅｅｄ Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充されたＣＤ−ＣＨＯ培地を用いて行なった。上清を、遠心分離および滅菌濾過により回収した。浄化した細胞培養上清を、プロテインＧクロマトグラフィーを用いて精製して、ダルベッコのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）にバッファーを交換した。サイズ排除ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる産物の質分析を、生産された全ての突然変異体の精製材料を用いて行なった。

阻害ＥＬＩＳＡによる標的結合分析
ＢＡＮ２４０１と比較した、本発明の抗体のＡβプロトフィブリルおよびＡβモノマーへの結合特性を阻害ＥＬＩＳＡを用いて分析した。この阻害ＥＬＩＳＡでは、抗体を溶液中でＡβプロトフィブリルまたはＡβモノマーと事前インキュベートし、それから、Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ．２０１５；４３（２）：５７５−８８．ｄｏｉ：１０．３２３３／ＪＡＤ−１４０７４１．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５０９６６１５およびその中の引用文献に記載されるように、ＡβコートされたＥＬＩＳＡプレートに移した。

野生型マウスでの薬物動態試験
８〜１０週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをグループ化して、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、本発明の抗体またはＢＡＮ２４０１を単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。全ての動物由来の血漿を、注入後３０分から２９日にわたる時点で回収して、抗体濃度の測定およびその後の薬物動態（ＰＫ）パラメーターの計算に用いた。マウスは、終末の血漿回収時点に屠殺した。

ラットにおける薬物動態試験
８週齢雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットをグループ化して、１０ｍｇ／ｋｇの用量で本発明の抗体またはＢＡＮ２４０１を単回ｉ．ｖ．注射した。全ての動物由来の血漿を、注入後３０分から２９日にわたる時点で回収して、抗体濃度の測定およびその後のＰＫパラメーターの計算に用いた。ラットは、終末の血漿回収時点に屠殺した。

サルにおける薬物動態試験
雄カニクイザルをグループ化して（Ｎ＝３）、５ｍｇ／ｋｇのＢＡＮ２４０１または１０ｍｇ／ｋｇの本発明の抗体の単回ｉ．ｖ．注射に供した。全ての動物由来の血清を、注入後５分から２８日にわたる時点で回収して、抗体濃度の測定に用いた。ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体の血清レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。コーティングするために、ビオチン化Ａβ１−４２プロトフィブリルをアビジン固定化マイクロプレートに添加した。ブロッキング後、サル血清サンプルをウェルに添加した。任意の非結合物質を洗い流した後に、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で標識したヤギ抗−ヒトＩｇＧをウェルに添加した。任意の非結合試薬を除去するための洗浄に続いて、ＡＰの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸をウェルに添加した。水酸化ナトリウム溶液を用いて反応を止めて、吸光度を４０５ｎｍおよび４９２ｎｍで測定した。４９２ｎｍでの吸光度を４０５ｎｍでの吸光度から差し引いた。検量線を用いて値を濃度に変換して、その後のＰＫパラメーターの計算に用いた。

Ａβ抗体の測定のためのダイレクトＥＬＩＳＡ
細胞培地、精製された抗体産物、および、マウスおよびラットＰＫ試験において回収した血漿における、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体のレベルを、抗−Ａβ抗体の測定のためにダイレクトＥＬＩＳＡにより測定した。サンプルを段階希釈して、Ａβ１−４０でコーティングされたマイクロタイタープレートウェル中でインキュベートして、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体を結合させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲートヤギ抗−ヒトＩｇＧを検出抗体として使用し、ＴＭＢをＨＲＰのための基質として添加した。反応を、４５０ｎｍで測定される黄色を生じる２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４の添加により止めた。方法は、検量線を用いてＯＤ_４５０値が濃度に変換される定量的な様式で用いた。

非コンパートメント分析によるＰＫパラメーターの計算
個々の終末相半減期の計算を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ６．３ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）での非コンパートメントモデルを用いて行なった。曲線下面積（ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}）の計算を、ｌｉｎ−ｕｐ ｌｏｇ−ｄｏｗｎ法を用いてＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎで行なった。終末相半減期およびＡＵＣの標準偏差およびグループ平均を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ６．０４）を用いて計算した。

統計分析
個々に判定された終末相半減期およびＡＵＣのグループ平均の統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ．６．０４）を用いて行なった。一元配置分散分析の後にボンフェローニの多重比較事後テストを試験に用いた。試験は、有意水準^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１および^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１で行なった。

実施例２．標的結合特性
ＢＡＮ２４０１と比較して、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓにおいて保存されたＡβ−プロトフィブリル結合
ＢＡＮ２４０１（コントロール）に次いで、本発明の抗体の標的結合特性を、実施例１に記載の阻害ＥＬＩＳＡ（阻害ＥＬＩＳＡ）により（ｎｅｘｔ ｔｏ）分析した。結果を図１に示し、ここでは、ＢＡＮ２４０１、および、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓについて、Ａβモノマーと比較した、Ａβプロトフィブリルに対する結合および選択性の分析が示される。結果は、プロトフィブリルに対する結合および結合選択性は、Ａβモノマーに対する結合と比較して、本発明の抗体（Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓ）において保存されていることを示した。

実施例３．マウスにおける抗体の薬物動態プロファイル
野生型マウスにおけるＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの薬物動態試験
野生型マウスにおける本発明の抗体の薬物動態プロファイルを試験するために、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＢＡＮ２４０１（Ｎ＝８）、Ａ１７Ｄ（Ｎ＝７）、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ｎ＝６）、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓ（Ｎ＝８）またはＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓ（Ｎ＝７）の単回ｉ．ｖ．注射を投与した。動物は、０．５ｈ、２日、７日、１４または１５日、および２８または２９日後に採血し、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体のレベルを、Ａβ１−４０を捕捉に用い、実施例１に記載のＨＲＰ結合ヤギ−抗−ヒトＩｇＧを検出に用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した（ダイレクトＥＬＩＳＡ）。Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓは、他の抗体と比較して別の時点で開始した試験において投与した。しかしながら、２つの異なる試験由来の血漿サンプルは、アッセイ間の変動を避けるために、同時にＥＬＩＳＡにより分析した。

図２の時間対濃度のグラフおよび表１に示す計算されたＰＫパラメーターに示されるように、本発明の抗体（Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓ）のＰＫプロファイルは、特に注射後最初の４８時間の間は、ＢＡＮ２４０１とは実質的に異なる。曲線下面積（ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}）として測定された曝露の６倍の増加が、ＢＡＮ２４０１と比較してＡ１７Ｄに関して見られた一方で、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２ＳのＡＵＣは、１０〜１１倍改善した（表１）。また、本発明の抗体の終末血漿半減期は、ＢＡＮ２４０１と比較してかなり延長された（表１）。

実施例４．ラットにおける、抗体の薬物動態プロファイル
ラットにおけるＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの薬物動態試験
ラットにおける本発明の抗体の薬物動態プロファイルを試験するために、８週齢雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、１０ｍｇ／ｋｇのＢＡＮ２４０１（Ｎ＝３）、Ａ１７Ｄ（Ｎ＝４）、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ｎ＝６）またはＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓ（Ｎ＝５）の単回ｉ．ｖ．注射を投与した。動物は、注射後０．５ｈ、２ｈ、７ｈ、２４ｈ、２日、４日、７日、１４日および２９日後に採血した。ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体のレベルを、Ａβ１−４０を捕捉に用いて実施例１に記載のＨＲＰ結合ヤギ−抗−ヒトＩｇＧを検出に用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した（ダイレクトＥＬＩＳＡ）。低曝露をもたらす、投与後最初の４８時間の間の野生型マウスの血漿内のＢＡＮ２４０１レベルの迅速な低減（図２）は、ラットでは見られず、その代わりに、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体は、同様のＰＫプロファイルを示す（図３）。試験において全てのラットに関して個々に計算された血漿半減期およびＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}値の統計分析は、ＢＡＮ２４０１およびＡ１７ＤまたはＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの間のＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}または終末相半減期に大きな違いを示唆しなかった（表２）。ＢＡＮ２４０１と比較してＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔに関してＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}の有意な増加が示されたが、それらの２つの間の終末相半減期に統計的な違いは無かった（表２）。

実施例５．脱免疫化
ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓのエクスビボの総タンパク質Ｔ細胞アッセイ
本発明の抗体に導入された突然変異がヒトにおける免疫原性応答に関して増大したリスクをもたらしたかどうかを評価するために、ＢＡＮ２４０１に次いで、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓを、エクスビボの総タンパク質Ｔ細胞活性化アッセイにより分析した。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）経時変化Ｔ細胞アッセイは、抗体がＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力を測定する（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。サンプルを、幅広いＨＬＡ−多様性を有する２５人の健康なドナー（ドナー１〜２５、表３）のコホート由来の、ＣＤ８＋が枯渇した（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対して試験した。抗体がＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力を、増殖およびＩＬ−２分泌物により測定した。

試験からの結果は、免疫原性の全体的な潜在的リスクは、ＢＡＮ２４０１に関しては低く、Ａ１７Ｄに関してはボーダーラインの低さであり、それぞれ、ドナーの８％および１２％がポジティブに応答することを示した（表３）。増殖およびＩＬ−２分泌の組み合わせた頻度が、それぞれ試験コホートの２４％および２０％であったので、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの分析は、予想外に、免疫原性のリスクがいくらかより高いことを明らかにした。

インシリコでのＢＡＮ２４０１のＴ細胞エピトープスクリーニング
突然変異により推測される免疫原性リスクをさらに特定するため、および、脱免疫化と関連のある位置を見つけるために、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓを、インシリコでのＴ細胞エピトープスクリーニングに供した。ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの可変領域配列を、Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に、彼ら専有のインシリコ技術ｉＴｏｐｅ（商標）およびＴＣＥＤ（商標）による分析のために提供した。非生殖細胞系の無差別のＭＨＣクラスＩＩ結合配列は、分析された抗体の重鎖および軽鎖の両方において同定された。ＴＣＥＤ（商標）のＢＬＡＳＴサーチ分析は、エクスビボでの公知の免疫原性を有するペプチドのデータベースにおける以前に同定されたエピトープに対する、２つの部分的な一致を明らかにした。

ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの、エクスビボでのＴ細胞エピトープマッピング
新規の突然変異により推測される免疫原性リスクを検証するため、および、脱免疫化の位置を特定するため、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓの可変領域に由来する４４ペプチド（１５マー）を、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング技術（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープの存在に関して評価した。ペプチドは、インシリコのスクリーニングにより同定された全ての潜在的Ｔ細胞エピトープ、および、Ａ１７Ｄ置換およびＲ７９ＴおよびＲ８２Ｓ置換（突然変異を有する、または有さないペプチドを含む）の領域をカバーする２つの領域もカバーするように選択した。

ペプチドは、前のセクションに記載したＥｐｉｓｃｒｅｅｎ（商標）の全体的な抗体分析から選択した１１人のヒトドナーのコホートに対して試験した。Ｔ細胞応答は、^３［Ｈ］−チミジンの取り込みを測定する増殖アッセイを用いて、各ペプチドに対して各ドナーについて測定した。結果は、配列内に３つの潜在的Ｔ細胞エピトープの存在を同定した（エピトープ１、５および８）。重鎖に存在する「エピトープ１」は、弱いと考えられた。Ａ１７Ｄ突然変異を含む「エピトープ５」は弱く、野生型ＢＡＮ２４０１配列の関連ペプチドに対してドナーの応答は観察されなかった。「エピトープ８」は、Ｔ細胞応答の頻度に基づいて最も重大なエピトープであり、抗体Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓのペプチドにおいて同定されたが、野生型ＢＡＮ２４０１またはＡ１７Ｄにおいては同定されなかった。

エクスビボでのＴ細胞エピトープマッピング由来のデータは、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓが免疫原性の全体的リスクの増大と関連するという、全体的な抗体の経時変化Ｔ細胞アッセイからの結論を支持した。加えて、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２Ｓ（全体的な抗体Ｔ細胞アッセイには含まれない）もまた、「エピトープ８」内のＲ８２Ｓ突然変異に起因して免疫原性のリスクが増大すると考えられた。

エクスビボでのＴ細胞エピトープマッピングにより潜在的Ｔ細胞エピトープとして同定された、ペプチドの脱免疫化
概して、脱免疫化は、潜在的ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの重要なアンカーポジション（９マーのｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７およびｐ９）の１つにおける、単一アミノ酸を変更することにより達成される。上述のエクスビボでのペプチドマッピングにおいて同定された３つのエピトープ（エピトープ１、５および８）における、特定の脱免疫化突然変異が選択された。置換は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合ポケットに対する、ペプチドの期待される結合親和性の低減に基づいて選択した。２つの脱免疫化置換を、潜在的に免疫原性として示されている各ペプチドに関して試験して、これらのペプチドは、Ｅｐｉｓｃｒｅｅｎ（商標）ペプチドマッピング技術を用いて、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ８２ＳおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ／Ｒ８２Ｓのオリジナルペプチドとともに分析した。

Ｔ細胞応答を、^３［Ｈ］−チミジンの取り込みを測定する増殖アッセイを用いて、各ペプチドに対して各ドナーに関して測定した。この試験からの結果は、以前の知見を確証したが、全てのエピトープ（エピトープ１、５および８）は、この試験において弱いと考えられた（表４）。それにもかかわらず、全ての脱免疫化置換は、Ｔ細胞の応答物がない、または非常に少なく、オリジナルペプチドと比較して、３つのエピトープをカバーするペプチドに関して免疫原性のリスクを低減するのに成功した（表４）。このことは、選択した置換が効果的であったこと、および、脱免疫化が成功したことを示す。

Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔの脱免疫化変異体の設計および生産
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔの８個の脱免疫化変異体を、上述のペプチド脱免疫化およびＴ細胞エピトープマッピングからの結果に基づいて設計した。潜在的に免疫原性として同定された３つのエピトープ全てにおいて、エクスビボでのＴ細胞エピトープマッピングにおいて免疫原性を低減させることが示された脱免疫化突然変異を、表５に示される組み合わせで導入した。

実施例６．脱免疫化抗体の標的結合特性
ＢＡＮ２４０１と比較して、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の８個の脱免疫化変異体において保存されたＡβ−プロトフィブリル結合
Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の８個の脱免疫化変異体の標的結合プロファイルを、ＢＡＮ２４０１（コントロール）に次いで、実施例１に記載の阻害方法（阻害ＥＬＩＳＡ）により分析した。結果を図４に示し、ここにＢＡＮ２４０１およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８に関して、Ａβモノマーと比較したＡβプロトフィブリルに対する選択性および結合の分析を示す。結果は、Ａβモノマーに対する結合と比較して、Ａβプロトフィブリルに対する結合選択性および結合は、本発明の抗体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）において保存されていることを示した。

実施例７．マウスにおける、脱免疫化抗体の薬物動態プロファイル
野生型マウスにおける、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴおよびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の８個の脱免疫化変異体の薬物動態試験
野生型マウスにおいて、ＢＡＮ２４０１およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９ＴのＰＫプロファイルに対して、脱免疫化Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔの８個の変異体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）のＰＫプロファイルを比較するために、８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスをグループ化して（Ｎ＝５）、１０ｍｇ／ｋｇの抗体の単回ｉ．ｖ．注射に供した。動物は、０．５ｈ、２日、７日、１４日および２８日後に採血し、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体のレベルを、実施例１に記載しているように、Ａβ１−４０を捕捉に用い、ＨＲＰ結合ヤギ−抗−ヒトＩｇＧを検出に用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した（ダイレクトＥＬＩＳＡ）。図５の時間対濃度のグラフに示されるように、脱免疫化Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ突然変異体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）のＰＫプロファイルは、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴのＰＫプロファイルと似ていて、ＢＡＮ２４０１とは異なる。結果は、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔおよび脱免疫化変異体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の終末相半減期およびＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}の両方とも、ＢＡＮ２４０１と比較して有意に高められることを示唆した（表６）。それ故に、全ての脱免疫化変異体は、曝露が増大して除去半減期が延長されて、ＢＡＮ２４０１と比較して改善されたＰＫプロファイルを示し、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴのＰＫプロファイルと似たＰＫプロファイルを示した。

実施例８．ラットにおける、脱免疫化抗体の薬物動態プロファイル
ラットにおける、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、および、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９ＴＤＩ １−８）の８個の脱免疫化変異体の薬物動態プロファイル
ラットにおいて、ＢＡＮ２４０１およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９ＴのＰＫプロファイルに対して、脱免疫化Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）の８個の変異体のＰＫプロファイルを比較するために、８週齢雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットをグループ化して（Ｎ＝５）、１０ｍｇ／ｋｇの抗体の単回ｉ．ｖ．注射に供した。動物は、０．５ｈ、２日、７日、１４日および２８日後に採血し、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体のレベルを、Ａβ１−４０を捕捉に用い、ＨＲＰ結合ヤギ−抗−ヒトＩｇＧを検出に用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した（実施例１、ダイレクトＥＬＩＳＡ）。

図６に示すように、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、および、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔの脱免疫化変異体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １−８）は、ラットにおいて、かなり似たＰＫプロファイルを示した。結果は、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １は、ラットにおいて、ＢＡＮ２４０１よりも有意に長い終末相半減期を有し（ｐ＜０．０５）、一方で、ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}は、ＢＡＮ２４０１と比較して、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ １およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４に関して有意により大きい（ｐ＜０．０１）ことを示唆した（表７）。

実施例９．サルにおける、脱免疫化抗体の薬物動態プロファイル
カニクイザルにおける、ＢＡＮ２４０１、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８の薬物動態プロファイル
サルにおいて、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８のＰＫプロファイルを、ＢＡＮ２４０１のＰＫプロファイルに対して比較するために、雄カニクイザルをグループ化して（Ｎ＝３）、５ｍｇ／ｋｇのＢＡＮ２４０１または１０ｍｇ／ｋｇの本発明の抗体の単回ｉ．ｖ．注射に供した。ＢＡＮ２４０１を注射したサルは、投与後５分、１ｈ、２ｈ、８ｈ、２４ｈ、２日、４日、７日、１４日、２１日および２８日後に採血し、一方で、本発明の抗体を注射したサルは、５分、２ｈ、８ｈ、２４ｈ、３日、７日、１４日、２１日および２８日後に採血した。投与された抗体の血漿濃度を、実施例１に記載のＥＬＩＳＡにより分析した（ダイレクトＥＬＩＳＡ）。ＰＫプロファイルを、図７に時間対濃度のグラフとして示し、一方で、全ての抗体に関する半減期およびＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いた非コンパートメント分析により計算した（表８）。表８に示されるＢＡＮ２４０１によるＰＫパラメーターは、ＢＡＮ２４０１がｉ．ｖ．注射によって５ｍｇ／ｋｇ ＢＡＮ２４０１の投与量で投与された別個の試験による結果である。

実施例１０．ヒトに対するマウス、ラットおよびサルの単純アロメトリックスケーリング
本発明の抗体のヒト半減期を予測するために（ここではＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８に関して示される）、２−コンパートメントモデルおよび単純アロメトリックスケーリングを行なった。マウス、ラットおよびサルにおけるクリアランス（ＣＬ）および体積（Ｖ）の値を推定するために、２−コンパートメントモデルを、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を用いてＢＡＮ２４０１および本発明の抗体の血漿ＰＫプロファイルに適用した。ＣＬおよびＶの値を体重に対してプロットして、単純アロメトリックスケーリングを適用した（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ２０１１：３（１）：ｐ．６１−６６．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．３．１．１３７９９）。終末相半減期は、以下の等式に従って計算した：

ｔ_{（１／２）}＝（ｌｎ（２）＊体積）／クリアランス

体積またはクリアランスの単純アロメトリックスケーリングでは、前臨床種における推定パラメーターの値を、体重に対してプロットする。回帰線による定数および指数を用いて７０ｋｇの体重のヒトでのＶおよびＣＬを予測する。指数（好ましくは、体積に関しては１、および、クリアランスに関しては０．８５付近である）および回帰線に対する順守の両方とも、ヒトにおける特定のパラメーターの推定の信用の尺度である。

図１１に示すように、ＢＡＮ２４０１は、試験された種の中で中央ＣＬの線形相関に乏しく、不確かな単純アロメトリックスケーリングをもたらす。指数からの偏差（０．８５に近い）は、乏しい相関が、マウスにおけるＢＡＮ２４０１の高いクリアランスの効果であることを示唆する。このことは、ヒトにおいて期待されるＣＬの過小評価をもたらし、それ故に、予測される終末相半減期の過大評価をもたらした。ＢＡＮ２４０１の終末相半減期は、４１日と推定されて、病院で測定された半減期（５〜７日）からかなり外れた。ＢＡＮ２４０１の実際のＣＬは、図１１に示されている（白四角）。ＢＡＮ２４０１に関する、マウス、ラットおよびカニクイザルの間の乏しい線形相関と対照的に、本発明の抗体（Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８）は、優れた相関を示した（図１１）。人における予測されたＰＫパラメーターから計算された終末相半減期は、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ３、Ａ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ４およびＡ１７Ｄ／Ｒ７９Ｔ＿ＤＩ ８に関して、それぞれ、１３、１５および２０日のヒトにおける半減期を示唆した。体積（Ｖ）の単純アロメトリックスケーリングは、良好な線形相関、および、ＢＡＮ２４０１および本発明の抗体に関しておよそ１の指数を示唆した（示さず）。

本発明の抗体は、種間で、より確信のあるアロメトリックスケーリングでＣＬの線形相関を示し、それらは、他の治療的ＩｇＧ１、例えば、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ ８（２）（２０１２）：ｐ．１４１−１６０に記載のベバシズマブ、オマリズマブおよびトラスツズマブと同様に、ヒトにおいて約１５〜３０日の半減期で挙動する。多くの他の治療的ＩｇＧ１から逸脱しているマウスおよびヒトにおける準最適なＰＫプロファイルを有するＢＡＮ２４０１と対照的に、本発明の抗体は、マウスにおける標準化されたＰＫプロファイルをもたらすように改変されている。これらは、ヒトにおいて約１５〜３０日の半減期を有する他の治療的ＩｇＧ１と同様の、マウス、ラットおよびカニクイザルにおける半減期およびＰＫプロファイルを示す。この知見は、マウスにおける本発明の抗体の延長された半減期が、ヒトに変換されることを示唆する。

Claims (27)

1. Ａβプロトフィブリルに対する親和性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   前記の抗体またはその抗原結合フラグメントは、
   配列番号８に記載の可変の軽鎖、ここで、
   ｘ_１は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＱ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
   ｘ_２は、Ｒ、Ｔ、Ｋ、ＡおよびＧ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
   ｘ_３は、Ｒ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＮ、またはそれらの機能性類似体から選択され；
   ｙ_１は、ＶおよびＡから選択され；
   ｙ_２は、ＩおよびＶから選択され；
   ｙ_３は、ＳおよびＱから選択され；
   ｙ_４は、ＥおよびＤから選択される；
   および場合により、
   配列番号１４に記載の可変の重鎖、ここで、
   ｚ_１は、ＶおよびＩから選択され；
   ｚ_２は、ＲおよびＱから選択され；および
   ｚ_３は、Ａ、ＮおよびＴから選択される、
   ただし、ｘ_１＝Ａ、ｘ_２＝Ｒおよびｘ_３＝Ｒの組み合わせを除く、
   を有する、
   抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. 請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、
   ｘ_１は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＱから選択され；
   ｘ_２は、Ｒ、Ｔ、Ｋ、ＡおよびＧから選択され；
   ｘ_３は、Ｒ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＮから選択され；
   ｙ_１は、ＶおよびＡから選択され；
   ｙ_２は、ＩおよびＶから選択され；
   ｙ_３は、ＳおよびＱから選択され；
   ｙ_４は、ＥおよびＤから選択される；および、
   配列番号１４に記載の可変の重鎖、ここで
   ｚ_１は、ＶおよびＩから選択され；
   ｚ_２は、ＲおよびＱから選択され；および
   ｚ_３は、Ａ、ＮおよびＴから選択される；
   ただし、ｘ_１＝Ａ、ｘ_２＝Ｒおよびｘ_３＝Ｒの組み合わせを除く、
   抗体または抗原結合フラグメント。
3. 請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、
   前記の軽鎖は、
   ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）；
   ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_２および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
   ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_２およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
   ｘ_１および（ｙ_１および／またはｙ_２）およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；
   ｘ_２（ｙ_３および／またはｙ_４）；
   ｘ_２およびｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）；および
   ｘ_３および（ｙ_３および／またはｙ_４）
   ただし、ｘ_１＝Ａ、ｘ_２＝Ｒおよびｘ_３＝Ｒの組み合わせを除く、
   から選択される突然変異の組み合わせを含む、
   抗体または抗原結合フラグメント。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、
   前記の可変の軽鎖は、
   ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）である；
   ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）であり、ｘ_２が、Ｔおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
   ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）であり、ｘ_２が、Ｔであり、ｘ_３が、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
   ｘ_１が、Ｄおよび（ｙ_１および／またはｙ_２）であり、ｘ_３が、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
   ｘ_２が、Ｔ（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
   ｘ_２が、Ｔであり、ｘ_３が、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；および、
   ｘ_３が、Ｓおよび（ｙ_３および／またはｙ_４）である；
   ここで、ｙ_１は、ＶまたはＡであり、ｙ_２は、ＶまたはＩであるが、ｙ_１＝Ｖおよびｙ_２＝Ｉの組み合わせは除き；ｙ_３は、ＳまたはＱであり、ｙ_４は、ＥまたはＤであるが、ｙ_３＝ＳおよびＹ_４＝Ｅの組み合わせは除く、
   から選択される、１つまたは複数の突然変異を含む、
   抗体または抗原結合フラグメント。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、
   ｘ_１は、Ｄであり；
   ｘ_２は、Ｔであり；
   ｘ_３は、Ｒであり；
   ｙ_１は、ＶおよびＡから選択され；
   ｙ_２は、ＶおよびＩから選択され；
   ｙ_３は、ＱおよびＳから選択され；
   ｙ_４は、ＤおよびＥから選択され；
   ｚ_１はＶであり；
   ｚ_２はＲであり；および、
   ｚ_３は、Ｎ、ＴおよびＡから選択され；
   ただし、ｙ_１がＶであり、ｙ_２がＩであり、ｙ_３がＳであり、ｙ_４がＥであり、ｚ_１がＶであり、ｚ_２がＲであり、ｚ_３がＡである組み合わせを除く、
   抗体または抗原結合フラグメント。
6. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
   抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
   抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
   抗体またはその抗原結合フラグメント。
9. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
   抗体またはその抗原結合フラグメント。
10. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
    抗体またはその抗原結合フラグメント。
11. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
    抗体またはその抗原結合フラグメント。
12. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
    抗体またはその抗原結合フラグメント。
13. 請求項１に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む可変の軽鎖；および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む可変の重鎖を含む、
    抗体またはその抗原結合フラグメント。
14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、
    前記の抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ重鎖定常領域を含む、
    抗体または抗原結合フラグメント。
15. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体であって、
    治療での使用のための、
    抗体。
16. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体であって、
    アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防での使用のための、
    抗体。
17. 使用のための、請求項１６に記載の抗体であって、
    Ａβタンパク質凝集と関連するそのような他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択される、
    抗体。
18. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体の使用であって、
    アルツハイマー病およびＡβタンパク質凝集と関連する他の障害の治療および／または予防において有用な薬物の製造での、
    使用。
19. 請求項１８に記載の使用であって、Ａβタンパク質凝集と関連するそのような他の障害は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）から選択される、
    使用。
20. 対象におけるＡβプロトフィブリルの量を減少させる方法であって、
    治療的に有効量の、請求項１から１４に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、前記対象に投与するステップを含む、
    方法。
21. アルツハイマー病を有する、または発症するリスクがある対象における、アルツハイマー病の治療および／または予防のための方法であって、
    治療的に有効量の、請求項１から１４に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、前記対象に投与するステップを含む、
    方法。
22. 外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）の、前記疾患を有する、または発症するリスクがある対象における、治療および／または予防のための方法であって、
    治療的に有効量の、請求項１から１４に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、前記対象に投与するステップを含む、
    方法。
23. ヒトにおける、Ａβプロトフィブリルおよび／または凝集したＡβタンパク質の量を測定するための方法であって、
    前記のヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、請求項１から１４に記載の抗体または抗原結合フラグメントと接触させるステップ、および、前記のＡβプロトフィブリルおよび／または凝集したＡβタンパク質に結合した抗体または抗原結合フラグメントの量を測定するステップ、を含む、
    方法。
24. アルツハイマー病を有する、または発症するリスクがあるヒトにおける、アルツハイマー病の診断のための方法であって、
    前記のヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、請求項１から１４に記載の抗体または抗原結合フラグメント、またはそれらのフラグメントと接触させるステップ、および、凝集したＡβタンパク質に結合した前記抗体の量を測定するステップ、
    を含む、方法。
25. 外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、タウオパシー、全身性アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症およびパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）のいずれかを有する、または発症するリスクがあるヒトにおける、前記疾患のいずれかの診断のための方法であって、
    前記のヒトの組織または体液を、インビボまたはインビトロで、請求項１から１４に記載の抗体または抗原結合フラグメント、またはそれらのフラグメントと接触させるステップ、および、凝集したＡβタンパク質に結合した前記抗体の量を測定するステップ、を含む、
    方法。
26. 医薬組成物であって、
    請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、薬学的に許容できる賦形剤および／または希釈剤とともに含む、
    医薬組成物。
27. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体であって、
    獣医用途のための、
    抗体。