KR102523150B1 - 항-테나신 c 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

테나신-C의 FBG 도메인에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다. 또한 이러한 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 용도뿐만 아니라 이러한 항체를 동정하는 방법이 제공된다.

Description

항-테나신 C 항체 및 이의 용도{ANTI-TENASCIN C ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 테나신-C의 피브리노겐-유사 구체(fibrinogen-like globe: FBG) 도메인에 결합하기 위한 항체 및 만성 염증과 관련된 장애의 진단, 예후의 결정 및/또는 치료에서 이의 용도뿐만 아니라 이러한 항체를 동정하는 방법에 관한 것이다.
염증은 해로운 자극, 예컨대 병원균, 조직 손상 또는 자극물에 대한 조직의 복잡한 생물학적 반응이다. 이는 손상 자극을 제거할 뿐만 아니라 조직에 대한 치유 과정을 개시하기 위한 조직에 의한 보호적 시도이다. 염증과 관련된 이상은 다양한 인간 질환(염증 장애)의 기저를 이루는 장애의 거대한, 관련없는 그룹을 포함한다. 염증 양상을 지니는 질환의 예는 천식, 자가면역질환, 사구체 신염, 알레르기(과민증), 암, 염증성 장 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염 및 이식거부반응을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특히, 만성 염증은 대다수의 상기 질환과 관련된 쇠약성이며 심각한 병태이고, 감염 또는 손상 부위에서 지속적 염증 또는 유래가 알려지지 않은 또는 자가면역질환에서와 같은 변경된 면역 반응과 관련된 지속적 염증을 특징으로 한다.
류마티스 관절염(RA)은 결코 만성 염증성 병태만은 아니지만, 전형적인 예이다. RA는 활액 염증 및 전염증 사이토카인 및 기질 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase: MMP)의 지속적 합성에 의해 매개되는 관절 연골 및 뼈의 파괴를 특징으로 한다. 염증성 사이토카인, 예컨대 TNFα 및 IL-6의 합성을 억제하는 생물학적 화합물은 단기간에 RA를 치료하는 데 성공적이다. 그러나, 반복 치료가 필요한데, 이는 비싼 치료적 접근을 제공하고, 장기간의 관해를 제공하지 않는다. 더 나아가, 사이토카인 기능의 총 전신 억제는 증가된 감염 위험과 같은 고유 문제가 없지 않다. 따라서, 치유의 진보에도 불구하고, 장기간에 걸쳐 효능있는 만성 염증성 병태의 경제적인 방식의 치료를 위한 충족되지 않은 필요가 남아있다(Smolen (2006) 및 Williams (2007)).
질환 만성을 뒷받침하는 메커니즘은 불분명하게 남아있으며, 염증 및 파괴 매채체의 연장된 발현을 유발하는 인자(들)는 현재 알려져 있지 않다.
톨-유사 수용체(Toll-like receptor: TLR)는 RA에서 염증 매개체의 생성을 유발하는 데 중요한 역할을 하며, TLR 기능의 차단은 상당한 임상적 이점을 가질 수 있다(문헌[Brentano (2005) 및 O'Neill (2002)]에서 검토). 이 수용체 패밀리 형태는 면역계의 필수 부분을 형성한다. TLR은 병원균 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern: PAMP)과 손상-관련 분자 패턴(damage-associated molecular pattern: DAMP)을 둘 다 인식함으로써 감염 및 손상에 대한 숙주 방어를 매개한다(Matzinger (2002)). DAMP는 조직 손상 시 생성된 내인성 전염증 분자이고, 손상 또는 괴사 세포로부터 방출된 세포내 분자, 세포외 기질(ECM) 분자의 단편 또는 손상 시 상향 조절된 ECM 분자를 포함한다(문헌[Bianchi (2007) 및 Gordon (2002)]에서 검토).
활성화 시, TLR은 전염증 사이토카인 및 MMP의 발현 자극을 포함하는 선천성 면역반응과 적응 면역반응을 둘 다 촉진시킨다(Medzhitov (2002)). TLR은 RA 환자로부터의 활액 조직에서 고수준으로 발현되고(Radstake (2004), Roelofs (2005), Sacre (2007), 및 (Sacre, manuscript submitted 2008), TLR4에서 표적화된 결식 또는 기능 상실 돌연변이를 지니는 마우스는 실험 관절염으로부터 보호된다(문헌[Choe (2003) 및 Lee (2005)]. 더 나아가, TLR4의 저해제는 마우스에서 파괴적 관절염(Abdollahi-Roodsaz (2007)을 감소시킬 수 있고, 추정적 TLR4 저해제는 예비 I상 임상시험에서 중등증 내지 중증 RA를 지니는 23명의 환자 중 15명에서 증상을 개선시켰다(Vanags (2006). 그러나, TLR 리간드(들)가 질환 병리에 연루되는지는 불분명하다.
테나신-C(TNC)는 조직 손상 및 상처 회복과 관련된 ECM 당단백질이다. 테나신-C는 배아발생 동안의 활성 조직 리모델링 동안에 특이적으로 발현되며, 낭배형성 및 원체절 형성 동안 처음 관찰된다. 발생의 후기에서, 발현은 젖샘 및 폐의 분지 형태 발행 부위, 발생 중인 골격 내, 심혈관계 그리고 간충직 형질전환에 대한 상피 부위의 결합 조직 내로 제한된다. 일단 이들 과정이 중단되고, 배아 발생이 완료되지 건이라면, 발현은 하향조절된다(Jones (2000)).
테나신-C는 건강한 성인 조직에서 정상적으로 발현되지 않지만, 성인에서, 급성 염증 동안 특이적으로 그리고 일시적으로 상향조절되고, 만성 염증에서 지속적으로 발현된다(문헌[Chiquet-Ehrismann (2003)]에서 검토). 면역조직화학적 연구는 테나신-C가 정상 인간 관절에서 거의 발현되지 않지만, 침입 판누스(pannus) 및 주위의 혈관에서 RA 활액, 염증 및 섬유증 영역에서, 구체적으로 활액 내벽 아래로, 크게 증가된다는 것을 나타낸다(Cutolo (1992), MacCachren (1992) 및 Salter (1993)). 또한 RA 환자로부터(Chevalier (1994) 및 Hasegawa (2007)) 그리고 RA 연골에서(Salter (1993) 및 Chevalier (1994)) 활액 유체 중의 테나신-C 수준의 상당한 증가가 있다.
테나신-C는 1백 5십만 Da의 거대한 육량체 단백질이다. 각각의 쇄는 조립체 도메인(TA), EGF-유사 반복부(EGF-L), 피브로넥틴 III형-유사 반복부(TNIII) 및 피브리노겐-유사 구체(FBG)(문헌[Orend (2005)]에서 검토)를 포함하는 상이한 도메인을 포함한다. 테나신-C 및 그의 도메인의 서열을 도 1에 나타낸다.
본 발명자들은 테나신-C가 전염증성 자극이라는 것과, 그것이 관절염에서 관찰된 파괴적 관절 염증에 필요하고 만성 염증성 병태를 특징으로 하는 염증 반응의 연장에 연루된다는 것을 이전에 나타내었다. 특히, 테나신-C는 TLR4의 내인성 활성체가 되는 것으로 나타났고 이 분자는 파괴적 관절염증에 필요하다는 것이 입증되었다(WO 2010/103289).
WO 2010/103289에서, 관절에서 면역 반응을 매개하는 데 테나신-C에 대한 역할은 마우스 생체내에서 테나신-C의 FBG 도메인의 관절내 주사 시 관절 염증의 유도에 의해 입증되었다. 게다가, 자이모산에 의해 유도된 급성 관절 염증은 테나신-C 결핍 마우스에서 장기화된 바와 같지 않았다. 야생형과 테나신-C 널(null) 마우스는 둘 다 동일하게 자이모산에 의한 급성 염증 유발에 반응하였는데, 이는 테나신-C가 염증 개시에 연루된 것으로 나타나지 않음을 입증한다. 그러나, 테나신-C 널 마우스에 의하 나타나는 덜 지속적인 활액막염은 관절 염증의 유지에서 역할을 나타낸다. 장기간 관절 염증에서 테나신-C의 중요성은 테나신-C의 표적화된 결실이 mBSA에 의한 면역화에 의해 유도된 관절염 동안 지속된 미란성 관절 염증으로부터 보호된다는 관찰에 의해 강조된다.
테나신-C는 관절 내 세포를 활성화할 수 있는 것으로 나타났고, 테나신-C의 1차 활성 도메인은 분자의 C 말단에서 227개의 아미노산(26.9kDa) 구형 도메인인 피브리노겐-유사 구체(FBG)에 맵핑되었다(Siri (1991)).
RA 환자로부터의 활액막 배양물에 대한 FBG의 첨가는 전염증 사이토카인의 자발적 방출을 향상시켰다. 이는 또한 1차 인간 대식세포에서 TNF-α, IL-6 및 IL-8의 합성 및 TLR4 및 MyD88 의존적 신호전달 경로의 활성화를 통한 RA 활액 섬유아세포에서 IL-6의 합성을 자극하였다.
LPS의 경우에서와 같이, TLR4 발현은 FBG에 의한 사이토카인 합성의 유도에 필수적이라는 것을 나타내었다. 그러나, LPS와 달리, CD14도 MD-2도 TLR-4 활성화를 필요로 하는 것으로 나타나지 않는다. CD14는 다른 리간드에 의한 TLR4의 활성화가 불필요하다. 이는 MyD88 의존적 방식에서 지질 A에 반응하기 위해 TLR4를 필요로 하지 않으며(Jiang (2005)), 피브로넥틴 EDA(여분의 도메인 A)는 CD14가 없을 때조차 비만세포를 활성화시킬 수 있으며(Gondokaryono (2007)), 인간 단핵구 THP-1 세포의 하이알루론산 활성화는 TLR4, CD44 및 MD-2의 복합체를 필요로 한다(그러나 CD14는 아님)(Taylor (2007)).
각각의 TLR4 리간드에 의한 별도 수용체 복합체의 형성은 상이한 세포내 연결자/신호전달 분자의 동원(recruitment)을 용이하게 할 수 있다. 이는 본 발명자가 FBG 및 LPS에 의하 관찰한 차별적인 세포 반응을 설명할 수 있다. 유사하게, TLR4와 CD44 복합체의 하이알루론산 활성화는 LPS과 상이한 마우스 폐포대식세포 세포주에서 유전자 발현 패턴을 유도한다(Taylor (2007)).
테나신-C 발현의 단단히 조절된 패턴은 그것을 만성 염증을 치료하기 위한 매력적인 표적으로 만든다. 이는 건강한 성인에서 대부분 없지만, 그러나 조직 손상 시 발현은 특이적으로 유도된다. 급성 염증 테나신-C가 일시적으로 발현되는 동안: 유도는 종종 염증을 진행시키며, mRNA와 단백질은 둘 다 염증이 해결된 시간까지 조직에 없다(2003)).
테나신-C의 지속적 발현은 이제 만성 염증과 관련된 것으로 나타난다. RA에 추가로, 증가된 테나신-C 수준이 다발성 경화증(Gutowski (1999)) 및 쇼그렌 질환(Amin (2001)), 및 비치유 상처 및 당뇨병성 및 정맥 궤양(Loots (1998))을 포함하는 다른 자가면역질환에서 관찰된다. 테나신-C의 드노보 합성은 경구 점막 질환에서 염증 강도와 상당히 상관관계가 있으며, 테나신-C의 혈장 수준은 투약 또는 수술 전 및 후에 염증성 장 질환의 활성에 대한 신뢰 가능한 지표이다(문헌[Chiquet-Ehrismann (2003)]에서 검토).
WO 2010/103289는 만성 염증 반응의 조절을 위한 제제의 용도를 기재하되, 제제는 테나신-C의 생물학적 활성 및 만성 염증과 관련된 병태를 치료함에 있어서 그의 용도를 조절한다. 그러나, 이러한 병태에 대한 새롭고 개선된 치료에 대한 진행 중인 필요가 남아있다.
문헌[Clark et al. (1997) (52)]은 테나신에 대한 연구를 기재하며, FBG 도메인에 특이적인 항체를 기재한다. 해당 항체는 마우스 유래이며, 따라서 치료제로서 적합하지 않다. 더 나아가, 해당 항체는 단지 세포 이동의 측정(세포 활성화 및 염증성 사이토카인의 생성이 아님)인 것으로 여겨지는 "림프구 롤링(lymphocyte rolling)"을 방해하는 특성을 갖는 것으로 기재된다. 클락(Clark)에 의해 기재된 세포 롤링 활성에 연루된 세포 반대 수용체는 동정되지 않았다. 세포 롤링 또는 이동 과정의 참여는 TLR4의 상당한 특성이 되는 것으로 여겨지지 않으며, 롤링 거동에 연루된 잠재적 후보 카운터 수용체의 목록에서 클락에 의해 포함된 TLR4도 아니었다. 추가적으로, FBG에 결합하는 모든 항체가 염증성 사이토카인의 생성을 저해할 수 있지 않다. 본 명세서에 기재된 항체 서열의 개선된 특성의 신규한 세트는 클락에 의해 교시되거나, 제안되거나 또는 그에 대해 시험되지 않았다. 따라서, 클락에 기재된 항체가 본 명세서에 기재된 항체와 동일한 FBG 영역에 결합한다는 것을 나타내는 것은 없으며, TLR4 활성과 관련되지 않은 것으로 나타내는데, TLR4는 통상적으로 림프구 롤링 활성에 수반될 것으로 고려되지 않기 때문에(클락에 의해 잠재적 후보의 그들의 목록으로부터 그의 생략에 의해 포함됨), 클락 등에 의해 연구되는 기능은 본 명세서에 기재된 신규한 항체의 중요한 항염증 특성과 관련되지 않는다.
따라서, 테나신-C의 FBG 도메인, 특히 그들을 치료제로서 유용하게 만드는데 필요한 특성을 갖는 것에 특이적인 신규하고 개선된 항체를 생성할 필요가 남아있다.
본 발명자들은 테나신-C의 피브리노겐-유사 구체(FBG) 도메인에 대해 매우 높은 친화도를 갖고, FBG의 생물학적 활성을 중화시키는, 치료에서 사용하기에 적합한 특성을 지니는 항체 및 이의 단편, 특히 인간 항체를 설계하였다. 이들 친화도 항체는 다양한 치료 방법, 예컨대 테나신-C 관련 장애, 특히 류마티스 관절염(RA)을 포함하는 만성 염증과 관련된 것의 진단 또는 치료에서 항-FBG 항체 분자를 사용하는 것에서 유용하다. 항체는 또한 관련된 진단 및 예후 방법에서 유용하다.
본 발명의 제1 양상에서, 테나신-C의 FBG 도메인에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공되되, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 9 내지 15, 5, 125, 36, 37, 30 내지 35, 38 내지 47, 115 내지 118 및 140으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 1 내지 8, 124, 48 내지 91, 128 내지 138, 112 내지 114 및 139로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 5, 13, 16 내지 21, 126, 119 내지 121 및 141로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 22 내지 29, 127, 122 내지 123 및 142로부터 선택된 하나 이상의 서열로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
서열 ID 번호(서열번호)는 실시예 9 및 11에 열거된 특정 항체 및 항체 관련 서열을 표기하는 것을 지칭한다. 명확하게 언급되지 않는 경우, "항체"에 대한 언급은 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 인간 또는 인간화된 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 인간이거나 또는 인간화된다(완전 인간을 포함함).
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 TLR4의 활성화를 중화시키거나, 감소시키거나 또는 차단시킨다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 인간 또는 인간화된(완전 인간 항체 또는 결합 단편을 포함함), 본 명세서에 기재된 분석에서 IL-8과 같은 사이토카인에 대한 방출을 저해하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신 C의 FBG 도메인에 특이적이다. 즉, 이는 테나신-C 패밀리의 다른 구성원과 교차 반응하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 적어도 뮤린 및/또는 라투스 테나신 C의 FBG 도메인에 교차 반응성이고, 특히 원시 테나신-C의 FBG 도메인과 교차 반응성이다. 이는 잠재적 치료제에 대해 특히 중요한데, 그것이 인간에 대한 투여 전 생체내에서 수행될 안전성 및 효능 연구를 허용하기 때문이다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 항체에 개시되어 있고 인간 프레임워크를 추가로 포함하는, 6개의 CDR, 즉, 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 적어도 100nM 이상, 예를 들어 50nM 이상, 예컨대 1nM 이상의 친화도의 인간 테나신 C의 FBC 도메인에 대한 친화도를 제공한다. 친화도가 더 높을수록 수치 값은 더 낮다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 실시예 9 또는 11에 제공된 서열 목록에 명확하게 개시된 "항체"로 연장된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체와 교차 차단하거나 또는 본 명세서에 개시된 항체와 동일한 에피토프에 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어 인간 또는 인간화된 항체가 제공된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 전장 항체 형식, 예를 들어 IgG4 형식과 같은 비효과기 기능을 지니는 형식으로 제공된다.
일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 치료의 용도, 특히 자가면역 질환 또는 염증, 특히 본 명세서에 기재된 병태의 치료에서의 용도를 위한 것이다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 따라서 항원-결합 단편일 수 있다. 항원-결합 "단편"은 Fv 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 및 이황화-결합 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(dAb, 단일 및 이중 형식[즉, dAb-링커-dAb]을 포함)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
용어 항체 "유도체" 및 "변이체"는 당업자에게 공지된 면역분석 형식에서 항원에 결합할 수 있는 임의의 변형된 항체 분자(동족체를 포함), 예컨대 항체의 단편(예를 들어, Fab 또는 Fv 단편), 또는 항체의 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한, 거대 담체 단백질에 대한 또는 고체 지지체(예를 들어, 특히 아미노산 타이로신, 라이신, 글루탐산, 아스팔트산, 시스테인 및 이들의 유도체, NH2-아세틸기 또는 COOH-말단 아미도기)에 대한 결합을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 아미노산 또는 기타 분자의 첨가에 의해 변형된 변형 항체 분자를 지칭한다.
변이체는 항체의 아미노산 서열의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 서열 수준에서 구체화된 항체에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
변이체는 또한 가장 통상적인 천연 인간 생식세포계열 항체 프레임워크 및 CDR 다양성을 이용하기 위해 서열 변화를 포함할 수 있다. 이는 천연 인간 항체에서 통상적으로 발견되는 아미노산을 이용하는 중요한 잔기의 맞춤-공학처리에 의해 행해질 수 있다. 이 접근은 인간의 항-항체 반응 가능성을 최소화하는데, 생식세포계열 항체 프레임워크 서열이 개체 사이에서 고도로 용인되기 때문이다. 이 기법은 "생식세포계열화"로서 알려져 있으며, 얻어진 서열은 "생식세포계열화된 서열"로 칭해진다. 서열은 완전히 또는 부분적으로 생식세포계열화될 수 있다. 본 발명의 항체의 생식세포계열화된 서열의 예는 실시예 11에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 TLR4에 결합하는 FBG 도메인에 결합하여, 직접적으로, 예를 들어 TLR4에 의해 결합 부위를 물리적으로 가림으로써 TLR4 활성화를 차단할 수 있다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명자들은 TLR4가 테나신 C의 FBG 도메인에 직접 결합한다는 것을 시사하는 증거를 가진다. 이는 테나신 C가 TLR4의 활성을 향상시킬 수 있는 것으로 알려졌지만, 이전에 확립되지 않았다.
대안적으로, 항체는 TLR4에 결합하지 않는 FBG 도메인의 부분에 결합할 수 있지만, 이는 여전히 TLR4 활성화를 방지할 수 있으며(다른자리 입체성 효과); 항체는 그의 활성을 차단하는 다른 수용체와 상호작용하는 FBG 도메인에 결합할 수 있고, 이는 TLR4 활성에 대한 영향을 가질 수도 있고 또는 갖지 않을 수도 있으며/있거나; 항체는 임의의 다른 수용체에 결합하지 않지만, 여전히 이 수용체의 활성화를 방지하는 FBG 도메인에 결합할 수 있다(다른자리 입체성 효과).
일 실시형태에서, 본 개시내용은 FBG 도메인에 결합하지만, TLR4의 활성화 및/또는 사이토카인의 방출을 저해하지 않는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 특히 본 명세서에 기재된 것, 예컨대 IL-8에 관한 것이다.
전체 항체보다는 항체 단편을 이용하는 것의 이점은 몇 배이다. 더 작은 단편의 크기는 개선된 약학적 특성, 예컨대 더 양호한 고체 조직 침투를 야기할 수 있다. 게다가, 항원-결합 단편, 예컨대 Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 이콜라이(E. coli)에서 발현되고 분비될 수 있고, 따라서 다량의 상기 단편의 손쉬운 생성을 허용한다.
또한 본 발명의 범주 내에 항체 및 이의 항원-결합 단편의 변형된 형태, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체의 부착에 의해 변형된 형태가 포함된다. 항체 및 이의 항원-결합 단편의 컨쥬게이트, 예를 들어 항체-약물 컨쥬게이트가 또한 포함된다.
항체 및 항체 단편의 생성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는 항체 분자의 생체내 생성 유도, 면역글로불린 라이브러리의 선별(Orlandi. et al, 1989. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) 또는 배양물 내 세포주에 의한 단클론성 항체 분자의 생성을 사용하는 몇몇 방법 중 임의의 하나를 통해 생성될 수 있다. 이들은 하이브리도마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법, 및 엡스타인-바르 바이러스(EBV)-하이브리도마 기법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol . Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol . Cell. Biol . 62:109-120).
선택된 항원에 대해 적합한 단클론성 항체는 공지된 기법, 예를 들어, 문헌["Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)]에 개시된 것에 의해 제조될 수 있다.
항체 단편은 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 얻을 수 있다(예를 들어, 문헌[Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 참조). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 단편은 항체의 단백질 가수분해에 의해 또는 단편을 암호화하는 DNA의 이콜라이 또는 포유류 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포 배양물 또는 기타 단백질 발현 시스템) 내 발현에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻을 수 있다.
인간 치료 또는 진단을 위해, 인간화된 항체가 바람직하게 사용된다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화된 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 바람직하게는 최소-일부분을 갖는 유전자 공학 처리된 키메라 항체 또는 항체 단편이다. 인간화된 항체는 인간 항체(수용자 항체)의 상보성 결정 영역이 목적으로 하는 기능성을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 상보성 결정 영역으로부터의 잔기로 대체된 항체를 포함한다. 일부 예에서, 인간 항체의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 또한 유입된 상보성 결정 영역에서도 또는 프레임워크 서열에서도 수용자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 모두를 포함할 수 있으며, 이때 상보성 결정 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 그들에 대응하고, 프레임워크 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 적절한 인간 공통 서열의 그들에 대응한다. 인간화된 항체는 최적으로는 또한 전형적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역, 예컨대 Fc 영역의 적어도 일부를 포함한다(예를 들어, 문헌[Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596] 참조).
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비인간인 공급원으로부터 그에 대해 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 종종 유입된 잔기로서 지칭되는 이들 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 유입된 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 기재된 바와 같이 인간 상보성 결정 영역을 대응하는 설치류 상보성 결정 영역으로 치환함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l]; 미국 특허 제4,816,567호). 따라서, 이러한 인간화된 항체는 키메라 항체이되, 무손상 인간 가변도메인보다 실질적으로 더 적게 비-인간종으로부터의 대응하는 서열로 치환되었다. 실행에서, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 상보성 결정 영역 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체 내 유사한 부위로부터의 잔기로 치환되는 인간 항체일 수 있다.
본 명세서에 명확하게 개시된 항체의 CDR은 인간 유래이다. 이는 일반적으로 비인간 유래의 항체보다 덜 면역원성이기 때문에 유리하다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 동정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol . Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol . Biol . 222:581; Cole et al., 1985, Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol . 147:86-95] 참조).
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항체로부터의 CDR, 예컨대 6개의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이 제공된다. 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라일 수 있다. 키메라 항체는 비-인간종, 예를 들어 마우스, 래트, 원숭이 등으로부터의 단편, 예를 들어 프레임워크 및/또는 불변 영역을 포함한다. 이는, 예를 들어 생체내 안전성 및/또는 효능 연구에서 사용을 위해 병용 시약을 제조하는 데 사용될 수 있다.
일단 적합한 항체가 얻어지면, 그들은, 예를 들어 ELISA에 의해 활성에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 제1 양상의 일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 9 내지 11, 5, 13 내지 14, 36, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 44, 46, 116 및 118로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열; 및/또는 서열번호 1 내지 3, 5 내지 7, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 135, 88, 90 및 114로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열; 및/또는 서열번호 16 내지 18, 5, 13, 20 및 121로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열; 및/또는 서열번호 22 내지 24 및 26 내지 28로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.
"CDR"은 무손상 면역글로불린 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL)에서 발견되는 상보성 결정 영역을 지칭한다. 3개의 상보성 결정 영역(CDR)은 완전한 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 둘 다의 가변 도메인 상에 존재한다. CDR은 중쇄와 경쇄 둘 다에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 넘버링된다. 예를 들어, VH 쇄는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, VL 쇄는 또한 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 각각의 CDR 영역의 아미노산의 배치는 문헌[Kabat EA et al. 1991, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" Fifth Edition, NIH Publication No. 91 내지 3242, pp xv-xvii]에 따른 정의에 따른다.
따라서, 6개의 CDR 서열은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체에 가장 바람직하게 포함된다. 그러나, 1개만큼 적게 포함하는 더 소수의 CDR 서열이, 예를 들어 단일쇄 항체 단편에 포함될 수 있다.
추가 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 11, 14, 36, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 44 및 46으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 3, 7, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 135, 88 및 90으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 18 및 20으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 24 및 28로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열을 포함한다.
상기 기재한 바와 같이, "CDR3"은 전장 가변 중쇄(VH) 또는 전장 가변 경쇄(VL) 항체 중 하나에 존재하는 제3 CDR을 지칭한다.
일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 11, 36, 30 및 34로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 3, 54, 66 및 70으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 7, 76, 88 및 90으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 3, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 3, 54, 66 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 3 및 54로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함한다.
다른 특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 7, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 135, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열; 서열번호 7, 76, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열; 또는 서열번호 7의 VL CDR3 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 4 또는 112의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하되, VH 서열은 서열번호 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 54, 66 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 54의 VH CDR3 서열로 대체되는 CDR3 서열을 포함한다.
"대체되는"은 VH 서열의 CDR3 서열은 결실되고, 대안의 CDR3 서열(구체화한 바와 같음)은 그의 위치에 포함된다는 것을 의미한다.
이 구체적 내용에서, "대체된"은 VH 서열 서열번호 4 또는 112의 CDR3 서열이 서열로부터 결실되고, 대안의 CDR3 서열(구체화한 바와 같음)이 그의 위치에 포함된다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 서열번호 3(서열번호 4 및 112의 CDR3 서열임)은 대안의 CDR3 서열(구체화한 바와 같음)로 대체된다.
선택적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 8, 124, 113 또는 139의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하고, VL 서열은 서열번호 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 135, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열; 또는 서열번호 76, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열로 대체된 CDR3 서열을 포함한다.
본 구체적 문맥에서 "대체된"은 VL 서열 서열번호 8, 124, 113 또는 139의 CDR3 서열은 서열로부터 결실되고, 대안의 CDR3 서열(구체화한 바와 같음)은 그의 위치에 포함된다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 서열번호 7(서열번호 8, 124, 113 및 139의 CDR3 서열임)은 대안의 CDR3 서열(구체화한 바와 같음)로 대체된다.
추가 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 11, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 46으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 11, 30, 34 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 11, 30 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 15, 125, 117 또는 140의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 12 또는 서열번호 115의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하고, VH 서열은 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 46으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 30, 34 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 30 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열로 대체된 CDR3 서열을 포함한다.
이 구체적 내용에서 "대체된"은 VH 서열 서열번호 12 또는 115의 CDR3 서열이 서열로부터 결실되고, 대안의 CDR3 서열(구체화한 바와 같음)이 그의 위치에 포함된다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 서열번호 11(서열번호 12 및 115의 CDR3 서열임)은 대안의 CDR3 서열(구체화한 바와 같음)로 대체된다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 11 및 30 내지 46으로부터 선택된 서열번호 14 및 VH CDR3 서열의 VL CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 7의 VL CDR3 서열 및 서열번호 3 및 48 내지 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 3의 VH CDR3 서열 및 서열번호 7 및 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 135, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 18의 VH CDR3 서열 및 서열번호 20의 VL CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 24의 VH CDR3 서열 및 서열번호 28의 VL CDR3 서열을 포함한다.
바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 하기를 포함한다:
서열번호 1 내지 3, 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 48 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 50 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 52 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 54 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 56 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 58 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 60 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 62 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 64 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 66 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 68 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 70 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는
서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 72로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5 내지 6 및 74로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 76으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 78로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 80으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 82로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 84로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 86으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 135로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 88로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 내지 90으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 7 및 114로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는
서열번호 9 내지 11 및 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 30, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 32, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 34, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 36, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 38, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 40, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 42, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 44, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 46, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 11, 116, 5, 14 및 118로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는
서열번호 16 내지 18 및 5, 13 및 20으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 16 내지 18 및 5, 121 및 20으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 22 내지 24 및 26 내지 28로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열.
각각의 이들 서열 그룹은 VH CDR1, CDR2, CDR3 및 VL CDR1, CDR2, CDR3 영역의 서열에 대응한다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 CDR 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 적어도 3개 또는 적어도 6개의 CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 적어도 6개의 CDR 서열을 포함한다.
선택적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 하기를 포함한다: 서열번호 1 내지 3으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 48로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 50으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 52로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 54로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 56으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 58로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 60으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 62로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 64로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 66으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 68로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2 및 70으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는
서열번호 9 내지 11로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 30으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 32로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 34로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 36으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 38로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 40으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 42로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 44로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10 및 46으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는
서열번호 9, 116 및 11로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 30으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 32로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 34로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 36으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 38로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 40으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 42로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 44로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 9, 116 및 46으로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는
서열번호 16 내지 18로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열; 또는 서열번호 22 내지 24로부터 선택된 적어도 하나의 VH CDR 서열.
각각의 이들 서열 그룹은 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 서열에 대응한다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 VH CDR 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 3개의 VH CDR 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 적어도 3개의 VH CDR 서열을 포함한다.
선택적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 하기를 포함한다: 서열번호 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 72로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5 내지 6 및 74로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 76로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 78로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 80으로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 82로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 84로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 86로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 135로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 및 88로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 6 내지 90으로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 또는
서열번호 5, 114 및 7로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 72로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 74로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 76로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 78로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 80으로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 82로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 84로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 86로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 88로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 114 및 90으로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 또는
서열번호 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 118 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 또는
서열번호 5, 13 및 20으로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 5, 121 및 20으로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열; 서열번호 26 내지 28로부터 선택된 적어도 하나의 VL CDR 서열.
각각의 이들 서열 그룹은 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 서열에 대응한다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 VL CDR 서열 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 3개의 VL CDR 서열을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 열거한 군 중 하나로부터 선택된 적어도 3개의 VL CDR 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 3 및 54로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 11, 30 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 12, 15, 125, 37, 31, 33, 35, 39, 41, 43, 45, 47, 115, 117 및 140으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 4, 8, 124, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 128, 75, 129, 77, 130, 79, 131, 81, 132, 83, 133, 85, 134, 87, 136, 89, 137, 91, 138, 112, 113 및 139로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 19, 21, 126, 119, 120 및 141로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 25, 29, 127, 122, 123 및 142로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 VH 및/또는 VL 서열을 포함한다.
선택적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 VH 서열은 서열번호 12, 37, 31, 33, 35, 39, 41, 43, 45, 47 및 115로부터 선택되고/되거나; 서열번호 4, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 및 112로부터 선택되고/되거나; 서열번호 19 및 119로부터 선택되고/되거나; 서열번호 25 및 122로부터 선택된다.
선택적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 VL 서열은 서열번호 15, 125, 117 및 140으로부터 선택되고/되거나; 서열번호 8, 124, 73, 128, 75, 129, 77, 130, 79, 131, 81, 132, 83, 133, 85, 134, 87, 136, 89, 137, 91, 138, 113 및 139로부터 선택되고/되거나; 서열번호 21, 126, 120 및 141로부터 선택되고/되거나; 서열번호 29, 127, 123 및 142로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 하기 서열쌍들로부터 선택된 VH 및 VL 서열쌍의 서열을 포함하는 VH와 VL 서열을 둘 다 포함한다, 하기 서열쌍: 서열번호 12, 및 15 또는 125; 서열번호 115, 및 15 또는 125; 서열번호 12, 및 117 또는 140; 서열번호 37, 및 15 또는 125; 서열번호 37, 및 117 또는 140; 서열번호 31, 및 15 또는 125; 서열번호 33, 및 15 또는 125; 서열번호 35, 및 15 또는 125; 서열번호 39, 및 15 또는 125; 서열번호 41, 및 15 또는 125; 서열번호 43, 및 15 또는 125; 서열번호 45, 및 15 또는 125; 서열번호 47, 및 15 또는 125; 서열번호 31, 및 117 또는 140; 서열번호 33, 및 117 또는 140; 서열번호 35, 및 117 또는 140; 서열번호 39, 및 117 또는 140; 서열번호 41, 및 117 또는 140; 서열번호 43, 및 117 또는 140; 서열번호 45, 및 117 또는 140; 서열번호 47, 및 117 또는 140; 및 서열번호 115, 및 117 또는 140으로부터 선택되거나; 또는
하기 서열쌍: 서열번호 4, 및 8 또는 124; 서열번호 49, 및 8 또는 124; 서열번호 51, 및 8 또는 124; 서열번호 53, 및 8 또는 124; 서열번호 55, 및 8 또는 124; 서열번호 57, 및 8 또는 124; 서열번호 59, 및 8 또는 124; 서열번호 61, 및 8 또는 124; 서열번호 63, 및 8 또는 124; 서열번호 65, 및 8 또는 124; 서열번호 67, 및 8 또는 124; 서열번호 69, 및 8 또는 124; 서열번호 71, 및 8 또는 124; 서열번호 112, 및 8 또는 124; 서열번호 4, 및 113 또는 139; 서열번호 49, 및 113 또는 139; 서열번호 51, 및 113 또는 139; 서열번호 53, 및 113 또는 139; 서열번호 55, 및 113 또는 139; 서열번호 57, 및 113 또는 139; 서열번호 59, 및 113 또는 139; 서열번호 61, 및 113 또는 139; 서열번호 63, 및 113 또는 139; 서열번호 65, 및 113 또는 139; 서열번호 67, 및 113 또는 139; 서열번호 69, 및 113 또는 139; 서열번호 71, 및 113 또는 139; 서열번호 4, 및 73 또는 128; 서열번호 4, 및 75 또는 129; 서열번호 4, 및 77 또는 130; 서열번호 4, 및 79 또는 131; 서열번호 4, 및 81 또는 132; 서열번호 4, 및 83 또는 133; 서열번호 4, 및 85 또는 134; 서열번호 4, 및 87 또는 136; 서열번호 4, 및 89 또는 137; 서열번호 4, 및 91 또는 138; 서열번호 112, 및 73 또는 128; 서열번호 112, 및 75 또는 129; 서열번호 112, 및 77 또는 130; 서열번호 112, 및 79 또는 131; 서열번호 112, 및 81 또는 132; 서열번호 112, 및 83 또는 133; 서열번호 112, 및 85 또는 134; 서열번호 112, 및 87 또는 136; 서열번호 112, 및 89 또는 137; 서열번호 112, 및 91 또는 138; 및 서열번호 112, 및 113 또는 139; 또는
하기 서열쌍: 서열번호 19, 및 21 또는 126; 서열번호 19, 및 120 또는 141; 서열번호 119, 및 21 또는 126; 및 서열번호 119, 및 120 또는 141; 또는
하기 서열쌍: 서열번호 25, 및 29 또는 127; 서열번호 25, 및 123 또는 142; 서열번호 122, 및 29 또는 127; 및 서열번호 122, 및 123 또는 142.
다시 말해서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 VH 및 VL 서열은 구체화된 서열쌍의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 즉, 각각의 쌍은 구체화된 VH 서열 및 두 구체화된 VL 서열 중 하나로 이루어질 것이다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 4, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 및 112로부터 선택된 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 8, 124, 73, 128, 75, 129, 77, 130, 79, 131, 81, 132, 83, 133, 85, 134, 87, 136, 89, 137, 91, 138, 113 및 139로부터 선택된 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3 또는 48 또는 50 또는 52 또는 54 또는 56 또는 58 또는 60 또는 62 또는 64 또는 66 또는 68 또는 70, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7 또는 72 또는 74 또는 76 또는 78 또는 80 또는 82 또는 84 또는 86 또는 88 또는 90 또는 135를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다. 본 명명법을 이용하여, "CDRH1"는, 예를 들어 VH 쇄 CDR1을 의미한다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어, CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 48, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 50, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 52, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 54, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 56, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 58, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 60, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어, CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 62, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 64, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 66, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 68, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 70, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 7을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 72을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 74를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 76을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대한 서열번호 78을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 80을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 82을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 84를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 86을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 88을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 90을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 1, CDRH2에 대해 서열번호 2, CDRH3에 대해 서열번호 3, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 6, 및 CDRL3에 대해 서열번호 135를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 11 또는 30 또는 32 또는 34 또는 38 또는 40 또는 42 또는 44 또는 46, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 11, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 30, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 11, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 32, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 34, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 38, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 40, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 42, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 44, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 9, CDRH2에 대해 서열번호 10, CDRH3에 대해 서열번호 46, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13 및 CDRL3에 대해 서열번호 14를 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 16, CDRH2에 대해 서열번호 17, CDRH3에 대해 서열번호 18, CDRL1에 대해 서열번호 5, CDRL2에 대해 서열번호 13, 및 CDRL3에 대해 서열번호 20을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어 CDRH1에 대해 서열번호 22, CDRH2에 대해 서열번호 23, CDRH3에 대해 서열번호 24, CDRL1에 대해 서열번호 26, CDRL2에 대해 서열번호 27 및 CDRL3에 대해 서열번호 28을 포함하는 인간 가변 영역을 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체가 제공된다.
추가 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 4 또는 112의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 55의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
추가 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 12, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 115로부터 선택된 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 12 또는 115의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 31의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 37의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
선택적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 추가적으로 서열번호 8, 124, 113 또는 139의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
선택적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 추가적으로 서열번호 4 또는 112의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함한다.
선택적으로 , 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 추가적으로 서열번호 15, 125, 117 또는 140의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 37의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 15의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 37의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 125의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 31의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 15의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 31의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 125의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 55의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 8의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 55의 서열을 포함하는 VH 서열: 서열번호 124의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 4의 서열을 포함하는 VH 서열: 및 서열번호 8의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 4의 서열을 포함하는 VH 서열: 및 서열번호 124의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 12의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 15의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 12의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 125의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 19의 서열을 포함하는 VH 서열: 및 서열번호 21의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 19의 서열을 포함하는 VH 서열: 및 서열번호 126의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 25의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 29의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 25의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 127의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 9의 서열에 대응하는 VH CDR1 서열; 서열번호 10 또는 서열번호 116의 서열에 대응하는 VH CDR2; 서열번호 5의 서열에 대응하는 VL CDR1 서열; 서열번호 13 또는 서열번호 118의 서열에 대응하는 VL CDR2 서열; 서열번호 14의 서열에 대응하는 VL CDR3 서열; 및 서열번호 11, 36, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 44 또는 46으로부터 선택된 서열에 대응하는 VH CDR3 서열을 포함한다. 바람직하게는, VH CDR3 서열은 서열번호 11 또는 서열번호 36의 서열에 대응한다. 훨씬 더 바람직하게는, VH CDR3 서열은 서열번호 36의 서열에 대응한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 1의 서열에 대응하는 VH CDR1 서열; 서열번호 2의 서열에 대응하는 VH CDR2 서열; 서열번호 5의 서열에 대응하는 VL CDR1 서열; 서열번호 6 또는 서열번호 114의 서열에 대응하는 VL CDR2 서열; 서열번호 7의 서열에 대응하는 VL CDR3 서열; 및 서열번호 3, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 또는 70으로부터 선택된 서열에 대응하는 VH CDR3 서열을 포함한다. 바람직하게는, VH CDR3 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 54의 서열에 대응한다. 훨씬 더 바람직하게는, VH CDR3 서열은 서열번호 54의 서열에 대응한다.
말단 잔기가 본 명세서에 개시된 경쇄 가변 영역 서열 내 알기닌(R)인 경우, 불변 영역의 제1 아미노산이라는 것은 당업자에게 명확할 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역 서열이 제공되되, 말단 잔기(그것이 불변 영역으로부터의 알기닌(R)일 때)는 없다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 전사, 번역 및/또는 결합 특성을 변경시킴으로써 테나신-C의 생물학적 활성을 조절할 수 있다.
이러한 항체는 하기와 같이 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 동정될 수 있다:
(a) 테나신-C의 발현 수준에 대해, 예를 들어 사우던 블롯팅 또는 관련된 혼성화 기법에 의해 시험 항체의 효과를 결정함으로써;
(b) 테나신-C 단백질의 수준에 대해 시험 항체 효과를 결정함으로써, 예를 들어 항- 테나신-C 항체를 이용하여 면역분석함으로써; 및
(c) 예를 들어, 실시예 방법을 통해, 기능성 마커에 대한 시험 항체의 효과 또는 테나신-C 활성의 결과를 결정함으로써.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 생물학적 활성을 하향조절할 수 있다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 생물학적 활성을 하향조절할 수 있다. 면역 및 염증 분자 및 세포의 활성을 상향 조절하는 것의 바람직함은 면역손상된 면역 및 염증 환자에 대한 치료제의 생산에 대해 그리고 백신 개발에 적절하다. (문헌[Harandi (2009)] 참조).
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 전사의 저해제일 수 있다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 번역의 저해제일 수 있다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 결합 특성의 저해제일 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 그것이 더 이상 그의 수용체 또는 수용체들에 결합할 수 없도록 테나신-C의 입체구조를 변경시킬 수 있다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 경쟁적 결합 저해제일 수 있다. 또한 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 직접적으로(테나신-C 수용체 길항제로서 작용함으로써) 또는 간접적으로(결합 매개체 또는 보조 분자에 의해) 테나신-C 수용체 기능을 차단함으로써 테나신-C의 생물학적 활성을 저해할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 TLR-4 수용체의 길항제일 수 있다. TLR4의 길항제는 간접적 길항작용을 포함한다. 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 TLR4의 또는 또한 임의의 다른 수용체의 테나신-C 활성화를 방지할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체에 의한 테나신-C의 생물학적 활성의 저해는 전체적 또는 부분적일 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체에 노출되지 않은 염증 세포에 대한 테나신-C의 생물학적 활성에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼, 및 가장 바람직하게는 100%만큼 테나신-C의 생물학적 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 다클론성 또는 단클론성 항체로부터 선택될 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 활성 부위에 대해 실질적으로 가역적으로 또는 실질적으로 비가역적으로 결합할 수 있다. 추가 예에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 리간드 또는 수용체에 대한 결합을 방해하기 위해 활성 부위가 아닌 테나신-C의 일부분에 결합할 수 있다. 또한 추가 예에서, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 다른자리 입체성 효과에 의해 단백질 활성을 감소시키기 위해 테나신-C의 일부분에 결합할 수 있다. 다른자리 입체성 효과는 테나신-C의 활성의 천연 조절에, 예를 들어 "상류 활성체"에 의한 테나신-C의 활성화에 연루된 다른자리 입체성 효과일 수 있다.
시험 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체와 테나신-C 사이의 상호작용을 검출하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
예를 들어, 이온 분무 질량 분광학/HPLC 방법 또는 다른 물리적 및 분석적 방법과 함께 한외여과가 사용될 수 있다. 추가로, 형광 공명 에너지 전달(형광 Energy Resonance Transfer: FRET) 방법이 사용될 수 있으며, 이때 2개의 형광 표지 독립체의 결합은 서로 근접할 때 형광 표지의 상호작용을 측정함으로써 측정될 수 있다.
거대분자, 예를 들어 DNA, RNA, 단백질 및 인지질에 대한 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 대안의 방법은, 예를 들어 문헌[Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348]에 기재된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명 분석을 포함한다. 방법은, 예를 들어 방사성 또는 형광 표지로 표지된 폴리펩타이드를 사용하게 할 수 있다.
폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체를 동정하는 추가 방법은 폴리펩타이드가 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체에 노출되고, 상기 폴리펩타이드에 대한 화합물의 임의의 결합이 검출 및/또는 측정되는 경우이다. 폴리펩타이드에 대한 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 결합에 대한 결합 상수가 결정될 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 결합을 결정 및/또는 측정(정량화)하기 위한 적합한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 고속대량 작업을 가능하게 하는 방법, 예를 들어 칩-기반 방법을 이용하여 수행될 수 있다. VLSIPS(상표명)로 불리는 신규 기법은 수십 만개의 상이한 분자 프로브를 포함하는 극도로 작은 칩의 생산을 가능하게 하였다. 이들 생물학적 칩 또는 어레이는 어레이에 배열된 프로브를 가지며, 각각의 프로브는 특정 위치에 부여되었다. 각각의 위치가, 예를 들어, 10 마이크론의 규모를 갖는 생물학적 칩이 생산되었다. 칩은 표적 분자가 칩 상의 임의의 프로브와 상호작용하는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 선택 시험 조건 하에서 표적 분자에 어레이를 노출시킨 후에, 스캐닝 장치는 어레이 내 각각의 위치를 시험하고 해당 위치에서 표적 분자가 프로브와 상호작용하였는지의 여부를 결정할 수 있다.
테나신-C에 대한 결합 친화도를 지니는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체를 동정하는 다른 방법은 효모 2-혼성 시스템이며, 여기서 본 발명의 폴리펩타이드는 테나신-C에 결합하는 단백질을 "포획"하기 위해 사용될 수 있다. 효모 2-혼성 시스템은 문헌[Fields & Song, Nature 340:245-246 (1989)]에 기재되어 있다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 항체를 모방하는 고친화도 분자(소위, '애피바디(affibody)')일 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,831,012호 및 www.affibody.se 참조). 이들 리간드는 단백질 A(박테리아 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질)의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드에 기반한 3-나선 번들로 구성된 작고, 단순한 단백질이다. 이 스캐폴드는 친화도 리간드로서 우수한 특징을 가지며, 임의의 주어진 표적 단백질에 대해 높은 친화도로 결합하도록 설계될 수 있다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 톨-유사 수용체 4(TLR4) 또는 다른 수용체, 톨-유사 수용체 4의 공-수용체, 또는 이들 다른 수용체의 공-수용체의 테나신-C 활성화를 방지할 수 있다.
1차 수용체, 예컨대 TLR4에 대한 공수용체는 리간드 인식 및 결합을 용이하게 하기 위해 그리고 수용체 결합으로부터 얻어진 생물학적 과정을 개시/유지하기 위해 1차 수용체에 대한 신호전달 분자의 결합을 보조한다.
본 발명의 제1 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 바람직하게는 테나신-C의 FBG 도메인에 대한 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 제2 양상에서, 본 발명의 제1 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다.
이러한 유효량의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 이의 제형은 단일 볼루스 용량(즉, 급성 투여)으로서 또는 더 바람직하게는 시간에 따른 일련의 용량(즉, 만성 투여)으로서 전달될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 사용 중인 화합물의 효능/독성 및 그것이 사용되고 있는 적응증에 따라서, 다양한 농도로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 제형은 0.1μM 내지 1mM, 더 바람직하게는 1μM 내지 100μM, 5μM 내지 50μM, 10μM 내지 50μM, 20μM 내지 40μM 및 가장 바람직하게는 약 30μM의 농도로 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체를 포함한다. 대안적으로, 60μM 내지 70μM, 바람직하게는 약 67μM. 시험관내 적용을 위해, 제형은 본 발명의 화합물의 더 낮은 농도, 예를 들어 0.0025μM 내지 1μM을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 일반적으로 의도된 투여경로 및 표준 약제학적 실행에 대해 선택된 적합한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 투여될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다(예를 들어, 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA] 참조).
예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 속방출, 지연 방출 또는 제어 방출 용도를 위해, 향미제 또는 착색제를 함유할 수 있는 정제, 캡슐, 질좌약, 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구로, 협측으로 또는 설하로 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 음경해면체내 주사를 통해 투여될 수 있다.
이러한 정제는 부형제, 예컨대 미정질셀룰로스, 락토스, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 2염기성 인산칼슘 및 글리신, 붕해제, 예컨대 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 글리콜산나트륨 전분, 크로스카멜로스 나트륨 및 특정 규산염 복합체, 및 과립 결합제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시-프로필셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아카시아를 함유할 수 있다. 추가적으로, 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크가 포함될 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물은 또한 젤라틴 캡슐 중의 충전제로서 사용될 수 있다. 이와 관련한 바람직한 부형제는 락토스, 전분, 셀룰로스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르에 대해, 본 발명의 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료를, 유화제 및/또는 현탁제와 함께 그리고 희석제, 예컨대 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린 및 이들의 조합물과 함께 조합될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 또한 비경구로, 예를 들어 정맥내, 관절내, 동맥내, 복강내, 척추강내, 심실내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하로 투여될 수 있거나, 또는 그들은 주입 기법에 의해 투여될 수 있다. 그들은 다른 물질, 예를 들어 혈액과 등장성인 용액을 만들기에 충분한 염 또는 글루코스를 함유하는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용된다. 수용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 한다(바람직하게는 3 내지 9의 pH). 멸균 조건 하에서 적합한 비경구 제형의 제조는 당업계에 잘 공지되어 있는 표준 약제학적 기법에 의해 용이하게 달성된다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질을 함유하는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단일 용량 또는 다회 용량 용기, 예를 들어 밀봉 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석의 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기재한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
예시적 접근:
1) 수성 제형 중의 응집을 저해하기 위해 첨가된 부형제, 예컨대 완충제 및 세정제(보통 트윈(Tween)).
2) 케이크에 대해 벌크, 안정성 및 미용적 매력을 제공하기 위해 적절한 부형제와 함께 냉동 건조
3) 트레할로스와 같은 화합물을 이용하여 유리 같은 별 모양을 형성.
인간 환자에 대한 경구 및 비경구 투여 또는 다른 투여 경로에 대해, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 1일 투약량 수준은 보통 성인 당 1 내지 1000㎎(즉, 약 0.015 내지 15㎎/㎏)일 것이며, 단일 또는 분할된 용량으로 투여된다.
예로서, 투약량 수준은 약 0.5㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏일 수 있고, 투여 요법은 1주 당 2회 또는 3회일 수 있으며, 투여는 정맥내일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 비강내로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있고, 적합한 추진제, 예를 들어 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로-메탄, 다이클로로테트라플루오로-에탄, 하이드로플루오로알칸, 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3), 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체의 사용에 의해 건조 분말 흡입기 또는 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이 제공의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우에, 투약량 단위는 정량을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 네뷸라이저는 윤활제, 예를 들어 솔비탄 트라일올레이트를 추가로 함유할 수 있는 용매로서 에탄올과 추진제의 혼합물을 이용하여 활성 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 이루어짐)는 본 발명의 화합물과 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
에어로졸 또는 건조 분말 제형은 각각의 정량 또는 '퍼프'가 환자에 대한 전달을 위해 적어도 1㎎의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체를 함유하도록 바람직하게 배열된다. 에어로졸을 이용한 전체 1일 용량은 환자에 따라 다를 것이며, 단일 용량 또는 더 보통으로는 하루 종일 분할된 용량으로 투여될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
대안적으로, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 좌약 또는 페서리의 형태로 투여될 수 있거나 또는 그들은 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포제의 형태로 국소로 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한, 예를 들어, 피부 패치의 사용에 의해 경피로 투여될 수 있다. 그들은 또한 안구 경로에 의해 투여될 수 있다.
안과적 용도를 위해, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 등장성, pH 조절된, 멸균 식염수 중에서 미분화된 현탁액으로서 또는 바람직하게는 등장성, pH 조절된 멸균 식염수 중의 용액으로서, 선택적으로 염화벤질알코늄과 같은 보존제와 조합하여 제형화될 수 있다. 대안적으로, 그들은 페트롤라툼과 같은 연로로 제형화될 수 있다.
피부에 국소로 적용을 위해, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 다음의 광유, 액체 페트롤라툼, 백색 페트롤라툼, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시 프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물 중 하나 이상과의 혼합물 중에서 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유하는 적합한 연고로서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 그들은 다음의 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 파라핀, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스터 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물 중 하나 이상의 혼합물 중에서 현탁 또는 용해된 적합한 로션 또는 크림으로서 제형화될 수 있다.
마우스에서 국소 투여에 적합한 제형은 가향된 기반, 보통 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스 중에 활성 성분을 포함하는 로젠지; 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 비활성 기반 중에 활성 성분을 포함하는 파스틸; 및 적합한 액체 담체 중에 활성 성분을 포함하는 마우스 워시를 포함한다.
지속 방출 약물 전달 시스템, 예컨대 미소구체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이들은 주사 빈도를 감소시기키 위해 특별하게 설계된다. 이러한 시스템의 예는 일단 주사되면, 지속 기간에 걸쳐 rhGH를 서서히 방출하는 생분해성 미소구체에서 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH)을 캡슐화하는 뉴트로핀 데포(Nutropin Depot)이다.
대안적으로, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 필요 부위에 직접적으로 약물을 방출하는 수술로 이식된 장치에 의해 투여될 수 있다.
전기천공 치료법(Electroporation therapy: EPT) 시스템은 또한 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체의 투여를 위해 사용될 수 있다. 세포에 펄싱 전기장을 전달하는 장치는 약물에 대한 세포막의 투과성을 증가시켜, 세포내 약물 전달의 상당한 향상을 초래한다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 또한 전기혼입(electroincorporation: EI)에 의해 전달될 수 있다. EI는 피부의 표면에 대해 직경 30 마이크론까지의 작은 입자가 전기혼입에서 사용되는 것과 동일 또는 유사한 전기 펄스를 경험할 때 일어난다. EI에서, 이들 입자는 각질층을 통해 그리고 피부의 더 깊은 층 내로 공급된다. 입자는 약물 또는 유전자가 로딩되거나 또는 코팅될 수 있거나 또는 단순히 약물이 들어갈 수 있는 피부 내 기공을 생성하는 "총알"로서 작용할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 전달의 대안의 방법은 주사 가능한 열반응성 리겔(ReGel)이다. 체온 미만에서, 리겔은 주사 가능한 액체이지만, 체온에서 이는 서서히 부식되고 알려진, 안전한 생분해성 중합체로 용해되는 겔 저장소를 즉시 형성한다. 활성 약물은 생중합체가 용해됨에 따라 시간에 따라 전달된다.
항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 약제는 또한 경구로 전달될 수 있다. 하나의 이러한 시스템은 단백질 및 폴리펩타이드를 공동 전달하기 위한 신체 내 비타민 B12의 경구 흡수를 위해 천연 과정을 사용한다. 비타민 B12 흡수 시스템을 싣는 것에 의해, 단백질 또는 폴리펩타이드는 장벽을 통해 이동할 수 있다. 비타민 B12 유사체와 약물 사이에 복합체가 생성되는데, 이는 복합체의 비타민 B12 부분에서 내재성 인자(intrinsic factor: IF)에 대해 상당한 친화도 그리고 복합체의 약물 부분의 상당한 생체 활성을 둘 다 보유한다.
본 발명의 제2 양상의 조성물은 적어도 하나의 다른 제제를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 추가 제제는 비스테로이드성 항-염증제(NSAID), 질환 진행을 막는 항류마티스 제제(DMARD), 스타틴(HMG-CoA 환원 효소 저해제, 예컨대 심바스타틴을 포함), 생물학적 제제(생물 제제), 스테로이드, 면역억제제, 살리실레이트 및/또는 살균제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항영증제일 수 있다. 비스테로이드성 항-염증제는 항대사물질제제(예컨대 메토트렉세이트) 및 항염증성 금 제제(금티오말산나트륨, 금티오말산 또는 금 염, 예컨대 오라노핀을 포함)를 포함한다. 생물제제는 항 TNF 제제(아달리무맙, 에타너셉트, 인플릭시맙, 항-IL-1 시약, 항-IL-6 시약, 항-B 세포 시약(레톡시맙), 항-T 세포 시약(항-CD4 항체), 항-IL-15 시약, 항-CLTA4 시약, 항-RAGE 시약), 항체, 가용성 수용체, 수용체 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 변경 또는 약화된 기능을 지니는 돌연변이체 단백질, RNAi, 폴리뉴클레오타이드 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 오메가 3 지방산을 포함한다. 스테로이드(또한 코티코스테로이드로서 알려짐)는 코티손, 프레드니솔론 또는 덱사메타손을 포함한다. 면역억제제는 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산을 포함한다. 살리실레이트는 아스피린, 살리실산나트륨, 살리실산콜린 및 살리실산마그네슘을 포함한다. 살균제는 퀴닌 및 클로로퀸을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 NSAID, DMARD, 또는 면역억제제 중 하나 이상과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 제3 양상에서, 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 제1 및 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제4 양상에서, 만성 염증성 병태의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 본 발명의 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제5 양상에서, 만성 염증성 병태의 치료 및/또는 진단을 위한 의약의 제조에서 본 발명의 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제6 양상에서, 본 발명의 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 유효량의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 만성 염증성 병태의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 제3, 제4, 제5 또는 제6 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 조성물, 용도 또는 방법은 만성 염증성 병태의 치료에 관한 것일 수 있되, 병태는 부적절한 염증과 관련된 임의의 병태와 관련된다. 이러한 병태는 류마티스 관절염(RA), 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 비치유 상처, 다발성 경화증, 암, 죽상동맥경화증, 쇼그렌병, 당뇨병, 홍반성 낭창(전신 홍반성 낭창을 포함), 천식, 섬유성 질환(간경변증을 포함), 폐 섬유증, UV 손상 및 건선을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물은, 예를 들어, 다음 중 하나 이상에 대해 사용될 수 있다: 대상체에서 만성 염증성 병태 상태를 진단하기 위해; 만성 염증성 병태가 발생한 대상체의 가능성을 평가하기 위해; 만성 염증성 병태를 지니는 대상체에 대한 예후를 결정하기 위해; 만성 염증성 병태의 질환 진행을 모니터링하기 위해; 및/또는 만성 염증성 병태의 치료에 대한 대상체의 유효성 또는 반응을 모니터링하기 위해.
본 발명의 제7 양상에서 만성 염증성 병태의 진단 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후 결정에서 사용하기 위해 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물이 제공된다.
본 발명의 제8 양상에서, 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물을 이용하여 테나신-C의 FBG 도메인의 존재 또는 부재 또는 양을 검출하는 단계를 포함하는, 만성 염증성 병태의 진단 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후 결정 방법이 제공된다.
결정된 예후는, 만성 염증성 병태의 악화일 수 있다. 대안적으로, 예후는 만성 염증성 병태의 감소(즉, 개선)일 수 있거나, 또는 예후는 만성 염증성 병태가 동일하게 머물러 있는 것(즉, 악화 또는 개선 없이 일정하게 남아있는 것)일 수 있다.
일 실시형태에서, 제8 양상의 방법은 시험관내 방법이다. 대안의 실시형태에서, 제8 양상의 방법은 생체내 방법이다.
검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양 증가는 만성 염증성 병태 결정을 나타내고/내거나 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후를 나타낼 수 있다. 대안적으로, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양 감소는 만성 염증성 병태 결정 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후를 나타낸다.
바람직하게는 제7 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 제8 양상의 방법은 대상체 또는 환자로부터 유래된 샘플에서 테나신-C의 FBG 도메인의 수준 또는 양의 분석으로부터 대상체의 만성 염증성 병태의 진단 또는 환자 예후의 결정을 허용한다.
모든 양상의 바람직한 실시형태에서, 만성 염증성 병태는 류마티스 관절염(RA) 및/또는 미란성 류마티스 관절염이다.
대상체로부터 유래된 샘플 중에 존재하는 테나신-C의 FBG 도메인의 수준 또는 양은 임의의 적합한 분석에서 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체를 이용함으로써 결정될 수 있는데, 이는 면역분석법; 분광분석법; 웨스턴 블롯; ELISA; 면역침강법; 슬롯 또는 도트 블롯 분석; 등전위 초점법; SDS-PAGE; 항체 마이크로어레이; 면역 조직학적 염색; 방사면역측정법(RIA); 플루오로면역분석법; 및/또는 아비딘-바이오틴 또는 스트렙토아비딘-바이오틴 시스템을 이용하는 면역분석법 중 하나 이상의 사용을 포함할 수 있다. 이들 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
"샘플"은 대상체로부터 유래된 혈액(예를 들어, 혈청 또는 혈장), 활액, 뇌척수액(CSF), 소변 및/또는 관절 조직의 샘플을 포함한다.
바람직하게는, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양 또는 수준은 양 또는 수준이 기준 값에 비해 증가되거나, 감소되거나 또는 동일하게 머물러 있는지의 여부를 결정하기 위해 기준값괴 비교된다.
바람직하게는 테나신-C의 FBG 도메인의 검출 수준 또는 양이 비교되는 기준값은 임의의 검출 가능한 만성 염증성 병태/장애 또는 만성 염증성 병태/장애의 임의의 임상적 증상(본 명세서에서 "정상 샘플"로서 지칭)을 갖지 않고, 따라서 테나신-C의 FBG 도메인의 소위 "정상 값"(또한 "정상 수준" 또는 "정상 양"으로 지칭됨)을 갖는 하나 이상의 대상체로부터 유래된 샘플에서 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양 또는 수준이다. 해당 정상 수준의 실제 측정 값은 그들을 검출하기 위해 사용되는 특정 분석에 의존한다. 그러나, 샘플 중에 존재하는 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 수준/양(즉, 정상 값)의 일 예는 문헌[Page et al. (2012)]의 표 2에서 테나신-C 수준에 대해 이미 기재된 바와 같이 15 내지 25ng/㎖, 바람직하게는 20 내지 21ng/㎖, 가장 바람직하게는 20.7ng/㎖이며, 여기서, 건강한 개체 및 염증성 병태를 지니는 환자의 혈청 중의 테나신 C 발현이 기재되었다.
바람직하게는 정상 샘플 중의 수준(즉, 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 값/수준/양)에 비해 샘플에서 측정된 테나신-C의 FBG 도메인 수준에서 약 50% 이상의 증가는 만성 염증성 병태의 진단이거나 또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후를 결정한다. 그러나, 다른 실시형태에서, 정상 샘플 중의 수준에 비해 샘플에서 측정한 테나신-C의 FBG 도메인 수준의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상의 증가는 만성 염증성 병태의 진단이거나 또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후를 결정한다.
예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플에서 측정된 테나신-C의 FBG 도메인 수준이 건강한 대상체로부터의 샘플에서 측정된 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 수준으로부터 50% 이상 증가된다면(즉, 단지 하나의 특정 예에서, 그것이 31ng/㎖ 이상으로 측정된다면), 대상체는 만성 염증성 병태(예를 들어, RA)를 갖는 것으로 진단되고/되거나 해당 대상체의 예후가 결정된다. 결정된 예후는 만성 염증성 병태의 악화일 수 있다. 대안적으로, 예후는 만성 염증성 병태의 감소(즉, 개선)일 수 있거나 또는 예후는 만성 염증성 병태가 동일하게 머무른다는 것(즉, 악화 또는 개선 없이 남아있다는 것)일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 방법의 특정 실시형태에서, 정상 수준에 비해 검출된 테나신-C의 FBG 도메인 양의 적어도 50% 증가는 만성 염증성 병태 결정 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후를 나타낸다.
본 발명의 제9 양상에서, 개체를 위한 적절한 치료를 결정함에 있어서 사용하기 위한 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물이 제공되되, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양은 개체에 대한 적절한 치료를 나타낸다.
본 발명의 제10 양상에서, 제1 또는 제2 양상에서 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물을 이용하여 테나신-C의 FBG 도메인의 존재 또는 부재 또는 양을 도시하는 단계를 포함하는 개체에 대한 적절한 치료를 결정하는 방법이 제공되되, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인은 개체에 대한 적절한 치료를 나타낸다.
일 실시형태에서, 제10 양상의 방법은 시험관내 방법이다. 대안의 실시형태에서, 제10 양상의 방법은 생체내 방법이다.
적절한 치료는 유효량의 제제 또는 조성물의 투여를 포함할 수 있으며, 제제 또는 조성물은 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 또는 조성물; DMARDS(예컨대 메토트렉세이트); 항-TNF 약물; 항-IL17 치료법; T-세포 공자극 조절제(예컨대 오렌시카(Orencia)(상표명) - 아바타셉트): 인터류킨-6(IL-6) 저해제(예컨대 악템라(Actemra)(상표명) - 토실리주맙); 항-CD20 항체(예컨대 리툭산(Rituxan)(상표명) - 리툭수맙; B 세포 활성화인자(예컨대 항-BAFF); 야누스 키나제의 저해제(JAK) (예컨대 토팍시티닙(Tofacitinib)(상표명)); 비장 타이로신 키나제의 저해제(Syk)(예컨대 포스타마티닙(포스타마티닙)(상표명)); 시트룰린화된 테나신-C 도메인에 대한 항TNC 항체 또는 항체; 및/또는 시트룰린화된 및/또는 비시트룰린화된 테나신-C의 생물학적 활성을 조절하는 제제 중 하나 이상일 수 있다.
특정 실시형태에서, 적절한 치료는 테나신-C의 FBG 도메인을 표적화한다.
다른 특정 실시형태에서, 적절한 치료는 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 유효량의 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물의 투여이다.
선택적으로, 제9 및 제10 양상에 나타낸 개체는 만성 염증성 병태를 가진다. 개체는 그것으로서 수행 중인 방법 전에 진단될 수도 있고 진단되지 않을 수도 있다.
특정 실시형태에서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양 증가는 적절한 치료를 나타낸다. 대안의 실시형태에서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인 양 감소는 적절한 치료를 나타낸다.
일 실시형태에서, 정상 샘플 중의 수준(즉, 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 수준 또는 양)에 비해 샘플에서 측정한 테나신-C의 FBG 도메인 수준의 약 50% 이상의 증가 또는 감소는 개체의 적절한 치료를 결정한다. 그러나, 다른 실시형태에서, 정상 샘플 중의 수준에 비해 샘플에서 측정한 테나신-C의 FBG 도메인 수준의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 증가 또는 감소는 개체의 적절한 치료를 결정한다.
예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플에서 측정된 테나신-C의 FBG 도메인의 수준이 건강한 대상체로부터의 샘플에서 측정된 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 수준으로부터 50% 이상 증가된다면(즉, 단지 하나의 특정 예에서, 31ng/㎖ 이상으로서 측정된다면), 적절한 치료가 결정된다. 예를 들어, 이어서, 이는 유효량의 제제 또는 조성물의 투여에 의해 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있으며, 제제 또는 조성물은 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 또는 조성물; DMARDS(예컨대 메토트렉세이트); 항-TNF 약물; 항-IL17 치료법; T-세포 공자극 조절제(예컨대 오렌시아(Orencia)(상표명) - 아바타셉트): 인터류킨-6(IL-6) 저해제(예컨대 악템라(Actemra)(상표명) - 토실리주맙); 항-CD20 항체(예컨대 리툭산(상표명) - 리툭수맙; B 세포 활성화 인자(예컨대 항-BAFF); 야누스 키나제의 저해제(JAK)(예컨대 토파시티닙(Tofacitinib)(상표명)); 비장 타이로신 키나제의 저해제(Syk)(예컨대 포스타마티닙(Fostamatinib)(상표명)); 항TNC 항체 또는 시트룰린화된 테나신-C 도메인에 대한 항체, 및/또는 시트룰린화된 및/또는 비-시트룰린화된 테나신-C의 생물학적 활성을 조절하는 제제 중 하나 이상일 수 있다.
일 실시형태에서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 증가는 증가된 양의 적절한 치료가 필요하다는 것을 나타낸다. 대안의 실시형태에서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 감소는 증가된 양의 적절한 치료가 필요하다는 것을 나타낸다.
바람직하게는 정상 샘플 중의 수준(즉, 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 수준 또는 양)에 비해 샘플에서 측정된 테나신-C의 FBG 도메인 수준의 50% 이상의 증가 또는 감소는 증가된 또는 감소된 양의 적절한 치료가 필요하다는 것을 나타낸다. 그러나, 다른 실시형태에서, 정상 샘플 중의 수준에 비해 샘플에서 측정된 테나신-C의 FBG 도메인 수준의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 증가 또는 감소는 증가 또는 감소된 양의 적절한 치료가 필요하다는 것을 나타낸다. 증가된 또는 감소된 양의 적절한 치료는 용량의 증가 또는 감소, 투약 빈도 또는 치료의 지속기간일 수 있다.
제9 및 제10 양상의 체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법의 일 실시형태에서, 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 수준에 비해 검출된 테나신-C의 FBG 도메인 양의 적어도 50% 증가는 적절한 치료를 결정하고/하거나 증가된 양의 적절한 치료가 필요하다는 것을 나타낸다.
편리하게, 제8 및/또는 제10 양상의 진단방법 또는 적절한 치료를 결정하는 방법은 면역분석법; 분광분석법; 웨스턴 블롯; ELISA; 면역침강법; 슬롯 또는 도트 블롯 분석; 등전위 초점법; SDS-PAGE; 항체 마이크로어레이; 면역 조직학적 염색; 방사면역측정법(RIA); 플루오로면역분석법; 및/또는 아비딘-바이오틴 또는 스트렙토아비딘-바이오틴 시스템을 이용하는 면역분석법 중 하나 이상을 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제7, 제8, 제9 또는 제10 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 조성물 또는 방법은 만성 염증성 병태의 치료에 관한 것일 수 있되, 병태는 부적절한 염증과 관련된 임의의 병태와 관련된다. 이러한 병태는 류마티스 관절염(RA), 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 비치유 상처, 다발성 경화증, 암, 죽상동맥경화증, 쇼그렌병, 당뇨병, 홍반성 낭창(전신 홍반성 낭창을 포함), 천식, 섬유성 질환(간경변증을 포함), 폐 섬유증, UV 손상 및 건선을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 제11 양상에서, 하기를 포함하는 부품의 키트가 제공된다:
(i) 본 발명의 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물
(ii) 투여 수단
(iii) 사용 설명서
본 발명의 제7 양상의 키트는 추가로 하기를 선택적으로 포함할 수 있다:
(iv) 적어도 1종의 다른 제제.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 하기를 포함하는, 대상체의 만성 염증성 병태 상태를 결정하는 데 사용하기 위한 부품의 키트가 제공된다:
(i) 본 발명의 제1 또는 제2 양상에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물; 및
(ii) 사용 설명서
"만성 염증성 병태 상태"는 만성 염증성 병태를 지니는 또는 만성 염증성 병태가 없는 대상체의 진단, 예후 결정 및/또는 적절한 치료를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 FBG에 대해 특이성을 지니는 하나 이상의 치료적 항체, 예컨대 초기 양상에 기재된 항체(실시예에 기재한 상세한 설명의 항체 선별 방법 참조)를 동정하는 방법에 관한 것이다.
최종 치료 분자에 대한 상세한 규격은 항체 단리 프로젝트를 개시하기 전에 중요하다. 본 명세서에서 단리된 항체에 대해, 설정 규격을 이하의 표에 제공한다:
(표 A)
Figure 112017016707328-pct00001
테나신 C FBG에 반응하여 세포 활성화 및 염증성 사이토카인의 생성을 차단할 수 있는 테나신 C FBG에 대해 고친화도를 지니고, 해당 종에서 수행될(따라서 병용 시약은 필요 없음) 적절한 안전성 및 효능 연구를 허용하도록 다른 종에 대해 충분한 교차 반응성을 지니는 항체 동정의 중요한 필요가 있다.
또한 테나신 패밀리 및 테나신 R의 다른 구성원에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 리드(lead) 항체를 갖는 것이 유리한 것으로 여겨졌고, 따라서 다른 밀접하게 관련된 단백질보다 테나신 C에 대해 (아미노산 수준에서) 더 높은 정도의 상동성을 갖는 이 단백질에 기반하여 특이성 시험을 선택하였다. 세포 효능은 적절한 세포 기반 분석 상황에서 테나신 C FBG 유래 사이토카인 방출을 저해할 수 있는 절반의 최대 농도로서 정의한다. 최종적으로, 후보는 제품 제조능력에서 중요한 문제가 없는 일부 초기 적응증을 제공하기 위해 적절한 항체 형식으로 안정하게 될 것이 필요하다.
채택된 선별 방법은 정확한 규격에 의해 항체를 생성하는 것에 기반하였다. 따라서, 초기 ELISA 선별은 인간, 래트, 마우스 및 개 TNC-FBG 결합 시험을 포함하였다. 양성 클론을 또한 인간 테나신 R FBG에 대해 시험하였다. 정확한 결합 특성을 지니는 것을 효능 선별에서 시험하기 위한 적합한 항체 형식으로 서브클로닝하였다(THP-1 블루(THP-1 Blue)(상표명) 분석에서 Fc-His-FBG 유도 알칼리성 포스파타제 수용체의 저해는 선별을 위해 이용되고, 이어서, 활성을 THP-1 세포로부터의 Fc-His-FBG 유도 사이토카인 발현의 저해를 측정함으로써 확인하였다). 제1 일정을 통과한 리드 클론을 리드 최적화가 되게 하였고, 여기서 파지 디스플레이 방법을 제2 일정을 통과한 항체를 제공하도록 맞춤하였다. 리드 최적화가 되게 한 본 명세서에 기재한 '모' 항체(2A5, B12, F3 및 D8) 중에서, 제공된 둘(2A5 및 B12)은 사전 동의된 규격을 통과한 최적화된 클론을 제공하였다.
따라서, 본 발명의 추가 양상에서, 표 A에 열거된 특성 중 하나 이상을 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함하는 테나신-C의 FBG 도메인에 특이적인 하나 이상의 치료 항체를 동정하는 방법이 제공된다. 바람직하게는 항체는 "제1 일정" 하에 열거된 모든 특성을 나타내고, 훨씬 더 바람직하게는 항체는 표 A의 모든 특성을 나타낸다.
일 실시형태에서, 테나신-C의 FBG 도메인에 특이적인 하나 이상의 치료적 항체를 동정하는 방법은 다음의 특성 중 하나 이상을 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함한다:
(a) Fab 또는 전체 항체인 항체(바람직하게는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4);
(b) 항체는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정된 1 내지 10nM의 인간 테나신-C FBG에 대한 결합 친화도를 갖고/갖거나 항체는 바람직하게는 Fc-His-FBG를 이용하는 세포 기반 분석에서 IC50 < 100nM에 의해 바람직하게 유발된 테나신-C의 농도-관련 저해를 나타낸다; 그리고
(c) 항체는 바람직하게는 ELISA에 의해 측정된 인간 FBG 및 마우스, 래트 및 개 FBG 중 하나 이상에 결합하고, 바람직하게는 항체는 모든 인간, 마우스, 래트 및 개 FBG에 결합한다.
바람직하게는, 항체는 또한 다음의 추가적인 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(d) 항체는 인간 테나신-R에 결합하지 않거나, 또는 인간 테나신-C 양성 대조군에 비해 인간 테나신-R에 대한 감소된 결합을 나타낸다; 그리고
(e) 항체는 PBS 중에서 적어도 1㎎/㎖로 가용성이다.
바람직하게는, SPR에 의해 결정되는 친화도 효능은 320pM 이하이고/이거나, 바람직하게는 Fc-His-FBG를 이용하여 세포 기반 분석에서 유발된 사이토카인 방출에 대해 1nM 이하의 IC50이 있다.
바람직하게는, 항체는 적어도 1종의 설치류(예를 들어, 래트) 및 비설치류(예를 들어, 개) 테나신-C 동형 단백질 3nM 이하에 대해 친화도를 가진다.
바람직하게는, 인간 테나신-R에 대한 절반-최대 결합에 대한 농도는 바람직하게는 ELISA 결합 실험에 의해, 또는 SPR에 의해 측정된 인간 테나신-C에 대한 동등한 결합 신호보다 적어도 50배, 바람직하게는 100배이다. 바람직하게는, 인간 테나신-R에 대한 절반의 최대 결합에 대한 농도는 SPR에 의해 측정될 때 인간 테나신-C에 대한 동등한 결합 신호보다 적어도 50배 더 크다. 바람직하게는, 인간 테나신-R에 대한 절반의 최대 결합에 대한 농도는 ELISA에 의해 측정할 때 인간 테나신-C에 대한 동등한 결합 신호보다 적어도 100-배 더 크다.
바람직하게는, 항체는 14일에 걸쳐 침전/응집 없이 적어도 20㎎/㎖로 PBS 중에서 가용성이다.
본 발명의 추가 양상에서, 다음의 단계를 포함하는 테나신-C의 FBG 도메인에 특이적인 하나 이상의 치료적 항체를 동정하는 방법이 제공된다:
(i) 래트, 마우스 및 개 테나신-C FBG 중 하나 이상에 결합하는 항체 또는 단편에 대해, 바람직하게는 ELISA에 의해 항체 또는 항체 단편 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리를 선별하는 단계;
(ii) 바람직하게는 ELISA에 의해 인간 테나신-C FBG에 비해 인간 테나신-R FBG에 대해 감소된 결합을 위해 (i)에서 동정된 양성 항체 또는 단편을 시험하는 단계;
(iii) (i) 및 (ii)로부터의 목적으로 하는 특성이 동정된 항체 또는 단편을 효능 선별을 위한 적합한 형식(예를 들어, Fab, Fc-scFv, IgG2 또는 IgG4)으로 서브클로닝하는 단계; 및
(iv) Fc-His-FBG 활성의 저해를 나타내는 (iii)으로부터의 항체 또는 단편을 동정하는 단계.
선택적으로, 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 단계 (i) 및/또는 (ii)를 위해 사용된다.
바람직하게는 단계 (iv)는 (예를 들어, THP-1 블루(상표명) 분석에서) Fc-His-FBG 유도된 알칼리성 포스파타제 리포터를 이용하고; 그리고/또는 (예를 들어, THP-1 세포로부터의) Fc-His-FBG 유도 사이토카인 발현의 저해를 측정한다.
단계 (i)에서, 바람직하게는 항체 또는 단편은 모든 인간, 래트, 마우스 및 개 테나신-C FBG에 결합한다.
선택적으로 상기 방법 단계는 순서대로 수행되지만, 그러나 그들은 대안적으로 임의의 순서로 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 (i) 내지 (iv)의 방법을 수행함으로써 동정된 치료적 항체 또는 항체는 이전의 양상의 특성 (a) 내지 (e) 중 하나 이상을 나타낸다.
정의
"염증"은 조직 손상, 감염 또는 국소 면역 반응에 의해 개시되는 유체, 혈장 단백질, 및 백혈구의 국소 축적의 의미를 포함한다.
"급성 염증"은 손상, 감염 또는 국소 면역 반응 직후에 염증의 초기 단계(개시) 및 단기간의 일시적 염증 반응의 의미를 포함한다. 전형적으로, 급성 염증은 빠르게 해결되어 몇 분 내지 며칠 이내로 지속된다.
"만성 염증"은 지속적 및/또는 비해결 염증의 의미를 포함한다. 이는 종종 건강한 조직의 부적절한 파괴와 관련된다. 이는 진행성이며 몇주 이상의 기간에 걸쳐 지속될 수 있다. 만성 염증은 전형적으로 자가면역 질환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 지속적 감염 또는 질환과 관련된다.
"만성 관절 염증"은 환부 관절의 뒤틀림 및 인간 질환에서 관찰된 연골 및 뼈 파괴의 방사선 사진 증거를 야기하는 몇 주 내지 몇 개월의 기간에 걸쳐 진행성이고 끊임없는 지속적 염증의 의미를 포함한다(Kelly, Harris, Ruddy and Sledge, Textbook of Rheumatology 4th Edition).
실험 뮤린 모델에서, 만성 관절 염증은 상대적으로 단기간의 시간을 거쳐서조차, 진정되지 않고 부적절한 조직 파괴를 야기하는 염증을 특징으로 한다. 이는 활막 및 관절 공간, 연골세포 사멸, 및 연골 및 뼈 부식에서 염증 세포의 연장된 존재에 의해 조직학적으로 특성규명된다(동정될 수 있다).
"단편"은 적어도 4종의 아미노산, 예를 들어 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50종의 아미노산을 의미한다.
두 폴리펩타이드 사이의 서열 동일성 백분율은 적합한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱 컴퓨팅 그룹(University of Wisconsin Genetic Computing Group)의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있고, 서열이 최적으로 정렬된 백분율 동일성은 폴리뉴클레오타이드에 관해 계산된다는 것이 인식될 것이다.
정렬은 클러스탈 W 프로그램(문헌[Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680]에 기재한 바와 같음)을 이용하여 대안적으로 수행될 수 있다.
사용된 매개변수는 다음과 같을 수 있다:
빠른 쌍별 정렬 매개변수: K-투플(K-tuple)(워드) 크기; 1, 창 크기; 5, 갭 페널티; 3, 상부 진단의 수; 5. 스코어링 방법: x%.
다중 정렬 매개변수: 갭 오픈 페널티; 10, 갭 연장 페널티; 0.05.
스코어링 매트릭스: BLOSUM.
대안적으로, BESTFIT 프로그램은 국소 서열 정렬을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
"항체"는 실질적으로 무손상 항체 분자뿐만 아니라 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체(여기서, 적어도 1종의 아미노산은 천연 유래 인간 항체에 대해 돌연변이됨), 단일쇄 항체, 이중 특이성 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 및 이들의 항원 결합 단편 및 유도체를 포함한다.
"항원-결합 단편"은 테나신-C의 FBG 도메인에 결합할 수 있는 항체의 기능성 단편을 의미한다.
용어 "대상체" 또는 "개체"는 인간을 포함하는 모든 동물을 의미한다. 대상체의 예는 인간, 소, 개, 고양이, 염소, 양 및 돼지를 포함한다. 용어 "환자"는 치료가 필요한 장애를 갖는 대상체 또는 개체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 '약제학적 제형'은 본 발명에 따라 치료적으로 효과적인 제형을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 '치료적 유효량' 또는 유효량' 또는 '치료적으로 효과적인'은 주어진 병태 및 투여 요법에 대해 치료적인 효과를 제공하는 양을 지칭한다. 이는 필요한 첨가제 및 희석제, 즉, 담체 또는 투여 비히클과 관련하여 목적으로 하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 사전 결정된 양이다. 추가로, 숙주의 활성, 기능 및 반응의 임상적으로 상당한 결핍을 감소시키고 그리고 가장 바람직하게는 방지하는 데 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 대안적으로, 치료적 유효량은 숙주에서 임상적으로 상당한 병태의 개선을 야기하기에 충분하다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 화합물의 양은 그의 구체적 활성에 따라 다를 수 있다. 적합한 투약량은 필요한 희석제와 관련하여 목적으로 하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 활성 조성물의 사전 결정된 양을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조 방법 및 용도에서, 치료적 유효량의 활성 성분이 제공된다. 치료적 유효량은 당업계에 잘 공지된 바와 같은 환자 특징, 예컨대 연령, 체중, 성별, 병태, 합병증, 기타 질환 등에 기반하여 통상적인 숙련된 의사 또는 수의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 양상을 구현하는 실시예는 이제 다음의 도면을 참고로 하여 기재할 것이다:
도 1. 인간 테나신 -C 및 그의 도메인의 아미노산 서열을 도시한 도면
도 2. 인간 테나신 -C의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 도면
도 3. 다클론성 파지 ELISA를 도시한 도면.
다클론성 유래 제2 라운드 산출 파지를 항원 또는 융합 상대(Fc 또는 Cd4)로 코팅된 웰과 함께 인큐베이션시키고 나서, 결합된 파지를 항-M13 mAb 및 유로퓸 표지 항-마우스 항체를 이용하여 검출하였다. 라운드 2 산출 집단에서 항-Fc 또는-rCd4 파지에 비해 더 큰 비율의 huFBG와 선택 라운드 1 및 2와 사이의 항원 특이적 결합제의 풍부함이 있다.
도 4. 형광측정 분석에 의해 결정된 분비된 알칼리성 포스파타제 방출의 THP1 -블루 분석에서 정제된 항-FBG의 선별을 도시한 도면.
항체를 달성 가능한 가장 높은 농도에서 시험하였다. 정제된 scFv-Fc 클론의 확인 분석에서, 2A3, 2A5, 2B11 및 2D12를 10nM Fc-His-huFBG (a)에 의해 유발된 신호전달의 효과적인 차단제로서 동정하였다. 정제된 항-FBG FAb의 분석은 항체 A12, B12, C2, D7, D8, F3 및 G1을 포함하는 추가 분석을 위한 다수의 추가 히트를 강조하였다. 이 실험에서, 세포를 3nM Fc-His-huFBG (b)로 자극하였다.
도 5. 고정된 TNC FBG - rCD4 단백질 (인간, 마우스, 래트 및 개) 및 인간 TNR FBG-rCD4에 대한 정제된 Fab 결합에 대한 교차 반응성 ELISA 결과를 도시한 도면.
항-카파 또는 항-람다 mAb 다음에 유로퓸-컨쥬게이트된 항-마우스 mAb를 이용하여 결합을 검출하였다.
도 6. CM5 센서 칩 상에 포획된 항- FBG Fab B12 (a), 2A5 (b), F3 (c) 및 D8 (d)에 대한 FBG 단백질의 결합을 위한 역학의 결정에 대한 비아코어 ( BiAcore ) 센소 그램 추적을 도시한 도면.
추적은 인간, 래트 및 마우스 테나신-C rCd4-FBG 및 인간 테나신-R rCD4-FBG의 결합을 나타낸다.
도 7. 항- FBG Fab B12, 2A5, D8 및 F3에 의한 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 방출의 농도-관련 저해를 도시한 도면.
정제된 항체를 37℃에서 18시간 동안 3nM 인간 Fc-His-FBG의 존재 하에 THP1-블루 세포와 함께 인큐베이션시켰다. Fc-His-FBG 유발 SEAP의 저해에 대한 IC50 값은 B12(1.7nM), 2A5(20.6nM), D8(7.2nM), F3(8.4nM)이었다.
도 8. 항- FBG Fab B12, 2A5, D8 및 F3에 의한 IL-8 생성의 농도 관련 저해를 도시한 도면.
정제된 항체를 37℃에서 18시간 동안 3nM 인간 Fc-His-FBG의 존재 하에 THP1-블루 세포와 함께 인큐베이션시켰다. Fc-His-FBG 유발 IL-8 방출의 저해를 위한 IC50 값은 B12(6.9nM), 2A5(28.5nM), D8(14.9nM), F3(13.8nM)이었다.
도 9. 항- FBG 리드 항체에 대한 CDR3 무작위화 전략을 도시한 도면.
VH CDR3 무작위화를 각각 6개의 잔기(VH 3.1, VH 3.2 및 VH 3.3으로 표지)의 3개 중복 차단에서 행하고, VL CDR3을 둘(VL 3.1 및 VL 3.2으로 표지)의 차단에서 무작위화하였다. 화살표는 라이브러리를 지배하는 모 클론을 제거하기 위해 주형 DNA 내로 도입되는 중단 코돈의 위치를 나타낸다. (b) CDR3 라이브러리 생성을 위해 사용한 올리고뉴클레오타이드.
도 10. CDR 무작위화된 항체 라이브러리에 대한 선택 전략을 도시한 도면.
(a) CDR 무작위화된 라이브러리를 이용하는 인간 rCd4-His-FBG에 대한 선택. (b) B12 VH 및 VL CDR 3 무작위화된 라이브러리를 이용하는 인간 및 마우스 FBG에 대한 혼성체 선택.
도 11. 바이오틴 -표지 마우스 또는 인간 rCd4 - FBG에 대한 개선된 결합을 위해 친화도 성숙 클론을 선별하기 위해 사용한 항-FLAG 포획 ELISA 형식의 개략적 다이어그램을 도시한 도면.
도 12. 친화도 성숙 hIgG4 항체 165_13_B1, 165_13_C3, 및 160_01_A4에 의한 FBG-유발 사이토카인 방출의 저해를 도시한 도면.
1차 인간 PBMC를 200nM 인간 Fc-His-FBG 및 시험 항체(100nM 또는 1μM)의 존재 하에 인큐베이션시켰고(37℃, 24h), 상청액을 IL-8 (a) 및 TNFa (b)에 대해 분석하였다. 차단된 모든 시험 항체는 사이토카인 방출을 유발하였다. 데이터는 평균 ± 3명 별도의 공여자로부터의 결과의 s.e. 평균을 나타낸다.
도 13. 슬관절 치환술 후 류마티스 관절염 환자로부터 무릎 활막의 고정된 동결절편에서 내인성 테나신-c FBG의 면역염색을 도시한 도면.
활막의 특정 염색은 양성 대조군 항-테나신-항체(a), 및 마우스 IgG2a로서 형식화된 B12 항-FBG (c)에 의해 보였다. 더 낮은 수준의 비특이적 염색을 비면역 아이소타입 대조군 항체(b, d)에 의해 관찰하였다.
도 14. 항체 C3(165_13_C3) 및 B12는 웨스턴 블롯 분석에 대해 사용할 때 TNC-FBG에 대해 양호한 특이성을 나타낸다는 것을 도시한 도면.
재조합 TNC-FBG(나시언트(Nascient)), TNR-FBG 또는 피브리노겐(케네디 류마티스 연구소(Kennedy Institute of Rheumatology: KIR))을 다음의 항체 A) 4℃에서 밤새 1:20,000(0.25㎍/㎖)로 165_13_C3 IgG4 MAb, B) 4℃에서 밤새 1:20,000(0.25㎍/㎖)에서 B12 IgG4 MAb, C) 4℃에서 밤새 1:2,000 (0.1㎍/㎖)에서 항-테나신-R 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), sc-9875) D) 4℃에서 밤새 1:500로 항-TNC-FBG 다클론성 항체(미드우드 그룹(Midwood group))를 이용하여 검출하였다.
도 15. 단클론성 항체 B12 및 대응하는 아이소타입 대조군을 이용하는 신경교종 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면.
신경교종 세포 용해물(KIR) 및 테나신-C(나시언트)를 A. 4℃에서 밤새 1:20,000로 B12 IgG4 Mab; B. 4℃에서 밤새 1:4,000으로 IgG4 아이소타입 대조군(유레카 쎄라퓨틱스(Eureka therapeutics))을 이용하여 검출하였다.
도 16A. Fc -His- FBG는 용량 의존적 방식으로 시험관내에서 TLR4에 결합한다는 것을 도시한 도면.
PBS(또는 PBS 단독) 중의 재조합 인간 TLR4(알앤디 시스템즈(R&D systems))는 96-웰 플레이트에 결합시켰고, 표시 농도의 인간 Fc-His-FBG를 차단시킨 후에, 1㎍/㎖에서 항-인간 IgG1 MAb(AbD 세로텍(Serotec), 클론 2C11), 1㎍/㎖에서 항-마우스 HRP 컨쥬게이팅된 2차 항체(AbD 세로텍, STAR13B) 및 TMB 기질의 인큐베이션에 의해 검출을 수행하였다. n=4 평균 및 SEM을 나타냄.
도 16B. 단클론성 Ab C3(165_13_C3)은 시험관내 FBG 및 TLR4의 결합을 방해한다는 것을 도시한 도면. C3 Mab와 함께 사전 인큐베이션 한 재조합 인간 Fc-His-TNC-FBG(100nM)를 차단시킨 후 PBS(또는 PBS 단독) 중의 재조합 인간 TLR4를 96-웰 플레이트에 결합하거나 또는 아이소타입 대조군 항체를 첨가하였다. 단백질, 항-마우스 HRP 컨쥬게이팅된 2차 항체 및 TMB 기질의 Fc 부분과 관련된 항체의 연속적 인큐베이션에 의해 검출을 수행하였다. C3 사전 인큐베이션한 샘플에서 저해 백분율을 아이소타입 대조군 샘플(IC50 = 44.5nM)과 비교하여 계산하였다. n=4
도 17. 단클론성 항체 C3(165_13_C3)은 인간 또는 마우스 TNC- FBG(LPS는 아님)로 자극된 1차 인간 대식세포에 의해 전염증 사이토카인의 생성을 감소시킨다는 것을 도시한 도면.
(a) 재조합 인간 테나신-C FBG(1μM) 또는 LPS(엔조(Enzo))(1ng/㎖)를 MAb C3(1, 0.2, 및 0.04μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(1μM)와 함께 RT에서 30분 동안 사전 인큐베이션 시킨 후에 인간 M2 대식세포 배양물에 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서, IL-8, IL-6 및 TNF 사이토카인 ELISA(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 실시하였다. n=3; (b) 재조합 뮤린 테나신-C FBG(1μM)을 RT에서 30분 동안 MAb C3(1, 0.2 및 0.04μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(1μM)과 함께 사전 인큐베이션 한 후에 인간 M2 대식세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에 상청액을 취하고 나서, 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n= 3 이상, 평균 및 SEM을 나타냄; (c) Fc 부분이 비활성이 되도록 돌연변이된 단백질(Fc-Mut-His-FBG)을 사용하였다. 다른 유망한 항-TNC-FBG 항체인 B12 및 A4를 또한 이 시스템에서 시험하였다. Fc-Mut-His-FBG(1μM) 및 C3, 160_01_A4 또는 B12(1μM)를 RT에서 30분 동안 사전 인큐베이션시킨 후에 인간 M2 대식세포 배양물에 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n=3, 평균 및 SEM을 나타냄.
도 18A. 단클론성 항체 B12는 인간 TNC- FBG로 자극한 1차 인간 대식세포에 의한 전염증 사이토카인의 생성을 감소시킨다는 것을 도시한 도면. 재조합 인간 테나신-C FBG(1μM)를 MAb B12(1, 0.1, 0.01 또는 0.001μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(1μM)와 함께 사전 인큐베이션시킨 후 인간 M2 대식세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서, 사이토카인 ELISA를 실시하였다.
도 18B. 실험실 및 대규모로 생성된 단클론성 항체 C3(165_13_C3)는 1차 인간 대식세포에 의한 FBG -유도 사이토카인 합성의 차단에서 동일한 수준의 효능을 나타낸다는 것을 도시한 도면.
대규모로 생성된 항체의 효능을 실험실 규모로 생성한 것과 비교하였다. 재조합 인간 테나신-C FBG(1μM)을 RT에서 30분 동안 MAb C3(1, 0.2 및 0.04μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(1μM)와 함께 사전 인큐베이션시킨 후 인간 M2 대식세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n=1, Ico = 실험실 규모, Lon= 대규모.
도 19. 단클론성 항체 C3(165_13_C3)은 인간 TNC- FBG로 자극한 RA 활액 섬유아세포에 의한 전염증 사이토카인의 생성을 감소시킨다는 것을 도시한 도면.
재조합 인간 테나신-C FBG(1μM)를 MAb C3 또는 아이소타입 대조군 MAb와 함께 RT에서 30분 동안 사전 인큐베이션시킨 후 RA 환자로부터의 인간 활액 섬유아세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n= 1, 평균 및 SEM을 나타냄
도 20. 래트 CIA 모델에서 테나신 -C의 수준을 도시한 도면.
콜라겐 유도 관절염의 래트 모델로부터의 활액 유체 중의 TNC 수준. 각각의 발에 대한 대응하는 임상 스코어에 대해 플롯팅한 측정한 TNC의 양을 나타낸다.
도 21. 콜라겐-유도 관절염의 래트 모델에서 C3(165_13_C3) 항체의 평가로부터의 임상 스코어를 도시한 도면.
비히클 대 1㎎/㎏, 3㎎/㎏ 및 10㎎/㎏ C3 항체. 데이터를 평균 ± SEM으로서 제시한다. 통계학적 유의도: 제7일에 비교할 때 #### p < 0.0001, 비히클-처리군과 비교할 때 ** p < 0.01.
도 22: 콜라겐-유도 관절염의 래트 모델에서 C3 (165_13_C3) 항체의 평가로부터의 뒷발 용적을 도시한 도면.
비히클 대 1㎎/㎏, 3㎎/㎏ 및 10㎎/㎏ C3 항체. 데이터를 평균 ± SEM으로서 제시한다. 통계학적 유의도: 제0일과 비교할 때 ## p < 0.01 및 #### p < 0.0001, 비히클 처리군과 비교할 때 * p < 0.05 및 ** p < 0.01.
도 23. 항원 클로닝을 위해 사용한 프라이머를 도시한 도면
이 표는 항원 클로닝에서 사용하기 위한 발현 작제물을 생성하기 위해 사용한 프라이머의 상세한 설명이다.
실시예 1 - 항원 및 분석 시약으로서 정제된 테나신 -c FBG의 생성
테나신-C의 FBG 도메인(TNC FBG)을 함유하는 정제된 가용성 단백질을 항체 선택에서 항원으로서 그리고 후속적 선별 및 특성규명 분석에서 시약으로서 사용하기 위해 생성하였다. 다중 포유류 종의 테나신-C에 결합하는 항체의 단리를 위한 선택 전략을 가능하게 하기 위해, 인간[서열번호 92], 마우스[서열번호 93], 래트[서열번호 94] 또는 개[서열번호 95] 중 하나의 TNC FBG 도메인을 혼입한 DNA 발현 작제물의 범위를 합성하였다. 또한 이 상동체에 대해 원치 않는 결합을 나타낸 항체의 동정을 위해 인간 테나신-R FBG[서열번호 96] 작제물을 준비하였다. 작제물을 이하에 기재한 바와 같은 C- 또는 N-말단 FBG 도메인 중 하나에 결합된 래트 CD4 또는 인간 IgG1 Fc 태그 중 하나를 이용하여 6His-태그 단백질로서 생성하였다.
단백질 발현 작제물
항원 발현을 위한 모든 합성 DNA 작제물을 합성하였고, 젠스크립트(Genscript)(미국 피스카타웨이에 소재)에 의해 서열을 확인하였다. FBG 도메인을 포유류 발현 벡터 pBIOCAM4 또는 BIOCAM5에 클로닝시켰는데, 이는 래트 Cd4(도메인 3 및 4) 태그(Chapple et al, 2006) 또는 인간 IgG1 Fc 태그(Falk et al, 2012) 각각 중 하나를 이용하여 발현 도메인을 융합하였다. 벡터를 발현 단백질의 선택을 위해 마우스 VH 쇄로부터 유래된 소포체(ER) 신호 서열을 함유하는 pCMV/myc/ER 플라스미드(인비트로젠(Invitrogen))(Falk et al, 2012)로부터 변형시켰다. N-말단 FBG(예를 들어, FBG-Fc-His 또는 FBG-rCd4-His)를 생성한 모든 작제물에 대해, 분해된 PCR 산물을 NcoI/NotI 절단 pBIOCAM4 또는 pBIOCAM5 벡터를 이용하여 결찰시켰다. C-말단 FBG(예를 들어, Fc-His-FBG 또는 rCd4-His-FBG)를 초래한 모든 작제물에 대해, 분해된 PCR 산물을 BamHI/HindIII 절단 pBIOCAM4 또는 pBIOCAM5 벡터를 이용하여 결찰시켰다. FBG 도메인을 증폭시키기 위해 사용한 프라이머를 도 25에 열거한다. 모든 작제물은 확인된 서열이었다. ELISA 선별을 촉진시키기 위해, His-태그를 암호화하는 삽입물(프라이머 2574 및 2575)을 FBG-X(N-말단 FBG) 융합을 이용하여 발현 플라스미드에 대해 BamHI와 HindIII 부위(His-FLAG 태그를 대체) 사이에 클로닝시켰다. 전장 테나신 C를 BstXI 및 BamHI에 의한 분해에 의해 젠스크립트(Genscript) pUC57 플라스미드로부터 직접적으로 클로닝시키고, BstXI/BamHI 절단 발현 벡터 pFBG-Fc-His6 내로 클로닝시켰다. His-FBG 작제물을 생성하기 위해, 프라이머를 rCd4-His-FBG 발현 플라스미드로부터의 PCR에 대해 설계하고, His-FBG를 암호화하는 PCR 산물을 XhoI 및 HindIII을 이용하여 분해시키고 나서, XhoI/HindIII 분해된 pBIOCAM5에 클로닝시켰다.
단백질 발현 및 세포 배양물
형질감염 품질 플라스미드 DNA를 마셔리 나겔 뉴클레오본드 엑스트라 미디 키트(Machery Nagel Nucleobond Xtra Midi kit)(740410.50, 미국 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))를 이용하여 제조하였다. 항원 및 항체 발현을 위한 HEK293F 현탁액 세포 및 프리스타일(Freestyle) 및 RPMI 배지는 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)(영국 페이즐리에 소재)제이다. HEK293F 세포의 형질감염을 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다(Chapple et al, 2006).
단백질 정제 및 QC
단백질 친화도 정제는 Ni-NTA 아가로스 또는 고정 재조합 단백질 A 수지 중 하나를 사용하였다.
His-태그된 단백질의 정제를 위해, 배양물 상청액을 1시간 동안 Ni-NTA 아가로스(1018240, 영국 크롤리에 소재한 퀴아젠(Qiagen))와 함께 혼합하고 나서, 수지를 원심분리(200 x g, 2분)를 위해 프로테우스(프로테우스) 1-단계 미디 스핀 칼럼(영국에 소재한 제네론(Generon))에 옮겼다. 비결합 단백질을 20mM 이미다졸(pH 8)로 보충한 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 결합 단백질을 PBS(pH 8) 중의 300mM 이미다졸의 첨가를 통해 분획 중에 용해시키고 칼럼 원심분리시켰다(200 x g, 2분). 용해 단백질을 함유하는 풀링 분획을 게바플렉스 미디(Gebaflex Midi) 투석관(제네론 D010; 분자량 컷오프 3.5 kDa)에 넣었고, PBS에 대해 투석하였다.
인간 IgG4로서 발현시킨 Fc-태그된 단백질 및 항체를 단백질 A 세파로스(PC-A25, 제네론, 영국 메이든헤드에 소재)를 이용하여 정제시켰다. 배양물 상청액을 원심분리에 의해 정화시키고 나서(2500 x g, 15분), 단백질 A 세파로스와 함께 4℃에서 밤새 혼합한 후 프로테우스 1-단계 미디 스핀 칼럼(영국 제네론)에 잔사를 옮겼다. 칼럼을 원심분리시키고 나서(200 x g, 2분) PBS로 세척하여 비결합 단백질을 제거하였다. Fc-태그된 또는 IgG4 단백질을 원심분리(200 x g, 2분)에 의해 트리스-HCl(pH 8) 내로 0.2 M 글리신(pH 2.8)을 이용하여 단백질 A로부터의 분획 중에 용해시켰다. 용리된 분획을 풀링하고 나서, 게바플렉스 맥시(Gebaflex Maxi) 투석관(제네론 D045; 분자량 컷오프 8kDa) 내 PBS에 대해 투석하였다.
단백질을 SDS-PAGE(4 내지 12% 겔) 및 분광광도법(이론적 흡광계수를 이용하는 OD280)에 의해 순도 및 농도에 대해 분석하였다. 정제된 단백질을 세포 기반 분석에서 사용한 경우, 엔도톡신 함량을 리뮐러스 변형세포(limulus amoebocyte) 용해물 색소생산성 엔도톡신 분석(피어스(Pierce))에 의해 처음 결정하였다. 엔도톡신 수준이 밀리그램 당 1 엔도톡신 단위(즉, 1 EU/㎎)를 초과한다면 단백질을 사용하지 않았다.
실시예 2 - 1차 항- FBG 항체의 단리
항체 파지 디스플레이
테나신-C FBG 도메인에 대한 항체를 43명의 인간 림프구 공여자로부터 단리시킨 DNA를 이용하여 구성한 이온타스 엘티디(Iontas Ltd) 소유의 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 단리시켰다. 선택, 파지 구조 및 pSANG10 내로 서브클로닝(Martin et al, 2006)을 당업계에 잘 공지되어 있는 기법을 이용하여 앞서 기재한 바와 같이 모두 수행하였다(Schofield et al, 2007).
패닝 선택의 2 라운드를 융합 상대의 N 말단(예를 들어, FBG-Fc, FBG-rCd4)에서 또는 C 말단(Fc-FBG, rCd4-FBG)에서 인간 IgG1 Fc 또는 rCd4에 융합된 고정 TNC FBG 상에서 수행하였다. 카파(κ) 또는 람다(λ) 가변 경쇄(VL) 중 하나를 함유하는 파지 항체 라이브러리를 별도로 패닝시켜 불변 경쇄(CL) 카파(κ) 또는 람다(λ) 중 하나를 함유하는 Fab 발현 벡터에 대한 이후의 서브 클로닝을 용이하게 하였다.
다클론성 파지 집단을 선택 집단으로부터 준비하고 나서, TNC FBG 항원 또는 적절한 융합 상대(Fc 또는 rCd4)로 코팅한 ELISA 플레이트를 이용하여 ELISA(다클론성 파지 ELISA)에서 시험하였다. 파지와 함께 인큐베이션 후에, 플레이트를 세척하고 나서, 페록시다제-컨쥬게이팅된 항-M13 항체를 이용하여 결합된 파지를 검출하였다. 도 3은 라운드 2 산출 집단에서 항-Fc 또는-rCd4 파지에 비해 더 큰 비율의 huFBG와 선택 라운드 1 및 2 사이의 항원 특이적 결합제의 풍부함이 있음을 나타내는데, 이는 선택이 성공적이었음을 나타낸다.
ELISA에 의한 항원에 대한 scFv 결합 및 교차 반응성의 확인
라운드 2 선택 산출물을 개개 scFv 클론으로서 발현시켜 ELISA 결합 분석에서 항원 인식을 확인하였다. 산출물 집단을 박테리아 발현 벡터 pSANG10 내로 서브클로닝시키고(Martin et al, 2006), 이콜라이 BL21(DE3)로 형질전환하고 나서, 개개 형질전환체를 앞서 기재한 96-웰 플레이트에서 유도하였다(Schofield et al, 2007). 이콜라이 상청액을 수집하고 나서, 유로퓸-표지 항-FLAG 검출 항체를 이용하는 DELFIA-기반 ELISA를 이용하여 TNC FBG에 대한 scFv의 결합에 대해 분석하였다. 초기 ELISA에 대한 결과를 표 1에 요약한다.
Figure 112017016707328-pct00002
λ 라이브러리를 이용한 가장 성공적인 선택은 항원 rCd4-FBG 및 Fc-FBG(선택 147 및 148)에 대한 패닝에 기반하였다. κ 라이브러리에 대해, 가장 성공적인 선택을 항원 FBG-rCd4 (150), rCd4-FBG(152) 및 Fc-FBG(153)에 의해 얻었다. 이 ELISA 선별로부터의 79개의 양성 클론을 추가 분석을 위해 선택하였다.
교차 반응성 ELISA는 항-인간 FBG scFv의 67/79(85%)는 마우스 TNC FBG에 대해 교차반응성이라는 것을 나타내었다. 항-FBG scFv의 DNA 서열 분석은 우수한 서열 다양성을 나타내었다. 예를 들어, VL λ 라이브러리로부터의 선택 147 및 148은 92% 독특한 가변 중쇄(VH) 상보성 결정 영역 3(CDR3) 서열을 포함하였고, VL κ 라이브러리로부터의 선택 150, 152 및 153은 각각 67%, 91% 및 100% 독특한 가변 VH CDR3 서열을 포함하였다.
가장 효과적인 선택으로부터 단리된 추가 1425개 클론을 ELISA에 의해 선별하고 나서, 이는 FBG-결합 특이성을 지니는 추가 401 scFv의 동정을 초래하였다(표 2). 초기 ELISA에서 동정한 79개의 scFv와 함께 이들 클론을 추가 평가를 위해 선택하였다.
Figure 112017016707328-pct00003
1425개의 클론을 특이성 ELISA에서 추가로 시험하였고, 이때 각각의 scFv를 인간 테나신 R FBG에 대한 그리고 또한 인간, 마우스, 래트 및 개 TNC FBG에 대한 결합에 대해 시험하였다. 클론을 테나신 C에 대한 결합에 대해 얻은 ELISA 신호를 테나신 R FBG 결합에 대한 신호로 나눈 것에 따라 순위를 정하였다. 50 초과의 비를 지니는 상위 250개 클론을 서브클로닝 및 추가 분석을 위해 취하였다.
실시예 3 - 기능성 분석에서 1차 항- FBG 항체의 선별
항-FBG scFv를 전체 세포 분석 시스템에서 FBG-유발 신호전달의 저해제로서 그들의 활성 평가를 위해 2가 scFv-Fc로서 또는 단량체 Fab로서 개조하였다.
선택 147, 148, 150, 152 및 153 각각에 대해 1차 ELISA 신호에 의해 순위를 정한 상위 50개 항-FBG scFv를 개개 선택 집단으로서 포유류 발현 플라스미드 pBIOCAM5에 서브클로닝시키고(Falk et al, 2012), HEK293F 세포에서 일시적 형질감염에 의해 발현시켰다(Chapple et al, 2006). Fab 발현을 위해, 풀링한 λ 또는 κ scFv 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 삽입물을 이온타스 엘티디 소유의 프로토콜을 이용하여 이중 프로모터 Fab 발현 벡터(경쇄 생식세포 계열에 따라서 pFab-이중-κ 또는 pFab-이중-λ) 내로 클로닝시켰다. 배양물 상청액을 THP-1 세포 분석에서 활성을 위해 선별하고 나서, 선택한 scFV-Fc 및 Fab 히트는 저해 활성의 재분석 및 확인을 위한 정제된 친화도였다.
THP1 - 블루 (상표명) 리포터 세포 분석
테나신-C는 FBG 도메인의 세포 TLR4와의 상호작용에 의해 염증 세포 및 섬유아세포에서 사이토카인의 생성을 유발하는 것으로 나타났다(Midwood et al, 2009). 염증성 사이토카인, 예컨대 TNFa, IL-8 및 IL-6의 생성을 야기하는 수용체 신호전달 캐스케이드는 전사 인자 NF-κB의 활성화를 수반한다. 이 과정은 용이하게 측정된 단백질 신호의 생성과 함께 NF-κB 활성화에 반응하여 변형된 '리포터' 세포주에서 연구할 수 있다. THP1-블루(상표명) 리포터 세포주(인비보겐(InvivoGen); 프랑스 툴루즈에 소재)는 인간 THP-1 단핵구 세포주로부터 유래되며, NF-κB-유도성 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 작제물을 안정하게 발현시킨다. 이들 세포는 또한 세포 표면 TLR4를 구성적으로 발현시키는데, 이는 TNC FBG 융합 단백질의 신호전달 활성이 중간- 내지 고속 대략 처리 분석 방법을 이용하여 TNC FBG 융합 단백질의 신호전달 활성이 배양물 상청액 중의 SEAP의 표색 또는 형광측정 정량화를 이용하여 용이하게 측정될 수 있게 한다.
낮은 FBG 농도에서 활성은 임의의 선별 분석의 성공에 중요하며; 리포터 단백질의 강한 증가를 생성하는 데 필요한 FBG의 농도가 너무 높다면, 임의의 이러한 신호를 완전히 저해하는 데 필요한 scFv, Fc-ScFv 또는 Fab 작제물의 발현 수준 및 농도는 선별을 위해 허용 가능하지 않을 것이다. Fc-FBG는 이 세포 분석에서 낮은nM 수준으로 강한 SEAP 신호를 생성한다(CD4-FBG는 이 농도 범위에서 반응을 생성하지 않는다).
THP1-블루(상표명) 세포를 배양시키고 나서, 초-저 부착 T75 플라스크에서 세포를 성장시킨 것을 제외하고 공급업자의 프로토콜에 따라 보충 RPMI 배지에서 계대시켰다(http://www.invivogen.com/PDF/THP1_Blue_NF_kB_TDS.pdf). 분석을 위해, THP1-블루(상표명) 세포를 총 170㎕ 용적으로 RPMI 배지에서 Fc-FBG(3 또는 10nM)를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트(100,000개 세포/웰)에 첨가하였다. PBS 중에서 발현된 scFv-Fc 또는 Fab, 또는 친화도 정제된 항체를 함유하는 배양물 상청액을 30㎕ 용적으로 첨가하고 나서, 세포를 18시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 상청액을 채취하고 나서, 공급업자의 설명서에 따라 아토포스 AP(Attophos AP) 형광측정 정량화 시스템(S1000; 프로메가(Promega))를 이용하여 SEAP 또는 듀오셋(DuoSet) ELISA 개발 시스템(DY208; 영국 알앤디 시스템)을 이용하여 IL-8 함량에 대해 분석하였다. 데이터를 플롯팅하고 나서, 프리즘 소프트웨어(그래프패드(GraphPad))를 이용하여 곡선 적합화시켰다.
HEK293F 배양물 상청액으로서 항-FBG 항체의 선별은 THP1-블루(상표명)세포에서 Fc-His-FBG 유발 신호전달의 추정적 저해제를 강조하였는데, 이중 9은 정제된 scFv-Fc(도 4a) 또는 Fab(도 4b)로서 재분석하였을 때 확인하였다. Fc-His-FBG는 효능 분석 작업을 갖는 데 중요하다. 단량체 FBG는 THP-1블루 및 인간 세포에서 임의의 사이토카인 반응을 유발하지 않는다.
실시예 4 - 1차 항- FBG 항체의 기능성 특성규명
ELISA 교차반응성 분석
THP1-블루(상표명) 기능성 분석에서 동정한 9명의 인간 FBG 신호전달 저해제의 패널을 래트, 마우스, 및 개 FBG에 대한 교차 반응성에 대해 ELISA에 의해 평가하였다. 인간 테나신-R FBG 동족체에 대한 결합을 또한 결정하였다. 분석 웰을 인간, 래트, 마우스, 및 개 TNC FBG-rCD4, 또는 인간 TNR FBG-rCd4 융합 단백질로 코팅하고 나서, Fab의 결합을 항-카파 또는 항-람다 mAb 다음에 유로퓸-컨쥬게이팅된 항-마우스 mAb를 이용하여 검출하였다. ELISA 결과는 4개의 Fab가 인간 TNR FBG에 대해 더 낮은 겉보기 결합으로 인간 TNC FBG의 다른 포유류 동족체에 대해 양호한 교차 반응성을 나타낸다는 것을 나타내었다(도 5). 이들은 다음과 같다:
Fab 2A5 (VH 서열번호 4; VL 서열번호 8),
Fab B12 (VH 서열번호 12; VL 서열번호 15),
Fab D8 (VH 서열번호 19; VL 서열번호 21), 및
Fab F3 (VH 서열번호 25; VL 서열번호 29).
TNC-FBG에 대해 불량한 종 교차 반응성을 나타낸 Fab를 추가로 고려하지 않았다.
표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 친화도 결정
인간, 래트 및 마우스 TNC FBG, 및 인간 TNR FBG에 대한 결합을 위해 선택된 Fab의 친화도 및 결합 및 해리 역학은 25℃에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서 측정하였다. 실험을 인간 Fab 포획 키트(GE, 28 내지 9583-25)를 이용하여 제공한 프로토콜에 따라 CM5 센서 칩을 이용하는 비아코어 T100(BIAcore T100) 기기를 이용하여 수행하였다. 다양한 농도의 rCd4-FBG를 고정 Fab를 지니는 유동-세포 및 기준 유동-세포에 주사하였다. 기준 신호 차감 후에, 데이터를 T100 BIA평가 소프트웨어를 이용하여 전체 1:1로 적합화시켰다(도 6a 내지 도 6d).
계산한 역학 상수를 표 3에 나타낸다. 인간 TNC FBG에 대한 Fab의 친화도의 순위 순서는 B12(110 pM) > D8(8.49nM) > 2A5(11.4nM) > F3(27.4nM)였다. 모든 Fab는 설치류 TNC FBG에 대해 낮은 나노몰 친화도를 나타내었고, 인간 TNR FBG에 대한 친화도는 전형적으로 인간 TNR FBG보다 60배 더 낮았다.
저해 효능 분석
huFc-His-FBG 활성의 중화를 위한 정제된 Fab의 효능을 TLR4-매개 분비된 알칼리성 포스파타제 및 IL-8 사이토카인 생성의 측정을 이용하는 THP1-블루(상표명) 분석에서 결정하였다. 프리즘(Prism) 소프트웨어(그래프패드(GraphPad))를 이용하여 IC50 값의 계산을 가능하게 하기 위해 농도 범위(0.3 내지 100nM)에서 웰을 분석하기 위해 정제된 Fab를 첨가한 것을 제외하고, 분석을 실시예 2에 기재한 바와 같이 수행하였다.
Figure 112017016707328-pct00004
모든 항체는 Fc-His-HuFBG-유발 알칼리성 포스파타제의 농도-관련 저해(도 7) 및 IL-8 생성(도 8)을 나타내었다. 항-FBG Fab에 의한 알칼리성 포스파타제 저해의 저해를 위한 효능(IC50)의 순위 순서는 B12 (1.7nM) > D8 (7.2nM) > F3 (8.4nM) > 2A5 (20.6nM)이고, 효능(IC50) 랭킹은 IL-8 방출의 저해에 대해 유사하였다: B12 (6.9nM) > F3 (13.8nM) > D8 (14.9nM) > 2A5 (28.5nM).
실시예 5 - huTNC FBG 도메인에 대한 최적화된 항체의 생성 및 단리
표적화된 CDR 돌연변이유발에 의한 친화도 성숙
항-FBG 항체 2A5, B12 및 F3을 친화도 돌연변이를 위해 선택하였다. 표적화된 CDR 돌연변이유발을 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발을 이용하여 6종의 아미노산의 블록에서 VH 및 VL CDR3 잔기를 무작위화함으로써 수행하였다(Fellouse and Sidhu, 2007; Kunkel et al., 1987; Sidhu and Weiss, 2004). 주어진 클론에 대해 더 긴 VH CDR3(10 내지 16개 잔기)에 기인하여, 무작위화를 3개의 중복 블록에서 행하였고, VL CDR3(9개 잔기)은 2개의 중복 블록에서 무작위화하였다(도 9a). 32개의 코돈 조합으로부터 주어진 위치에서 임의의 20개 아미노산(및 단일 앰버 정지 코돈 단독)을 암호화할 수 있는 NNS(N= A/G/C/T 및 S= G/C) 축퇴 프라이머를 이용하여 무작위화를 수행하였다. 돌연변이유발에서 사용한 올리고뉴클레오타이드를 도 9b에서 제공한다. 따라서, 15개의 라이브러리(3개 항체에 대해 3개 라이브러리/VH 및 2개 라이브러리/VL)를 처음에 만들었고, F3 VL 3.1 및 F3 VL 3.2를 제외한 모든 라이브러리는 NNS 프라이머를 지니는 6개 잔기를 무작위화하는 것으로부터 생기는 이론적 다양성을 아우르기에 충분히 컸다(표 4)(326= 1.1 x 109). CDR3 라이브러리를 구조 과정 동안 조합하였고, 이는 각각의 모 항체 클론에 대해 조합된 돌연변이체 VH 라이브러리 및 조합된 돌연변이체 VL 라이브러리를 초래하여, 총 6개의 라이브러리를 제공하였다.
Figure 112017016707328-pct00005
고 엄격성 파지 디스플레이 선택
스트렙타비딘 다인아비드(Dynabead) 상의 파지-항체 선택을 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다(Dyson et al, 2011). 용액-상 선택의 다중 라운드를 바이오틴일화된 rCd4-His-FBG 상에서 수행하여 친화도 개선 클론을 풍부화하였다. 각각의 라운드에 대한 최적의 항원 농도를 항원 농도 범위에 대해 선택함으로써 그리고 산출 수를 항원이 없는 대조군과 비교함으로써 경험적으로 결정하였다. 선택의 엄격성은 각각의 라운드에서 사용한 항원의 양을 감소시킴으로써 증가되었다. 선택 창(선택 산출물로부터의 파지 역가와 항원이 없는 대조군 사이의 배수 차이)이 10 미만으로 하락된 후에 선택의 추가적인 라운드를 수행하지 않았다. 따라서, 3라운드의 선택(도 10a)을 라운드 3에서 관찰한 큰 선택 창에 기인하여 선택의 제4 라운드를 실시한 B12를 제외하고 모든 라이브러리에 대해 바이오틴일화된 인간 rCd4-His-FBG에 대해 수행하였다. 모든 라이브러리에 스트렙타비딘 또는 테나신-R에 대한 원치 않는 교차 반응성을 피하기 위해 각각의 선택 라운드에서 스트렙타비딘 비드 및 테나신-R(라운드 1 내지 3에 대해 100nM 및 라운드 4에 대해 1nM)에 대한 탈선택을 실시하였다. 추가로, 인간 및 마우스 항원이 선택 라운드 사이에서 번갈아 나오는 혼성체 선택 전략(도 10b)을 B12 무작위화된 라이브러리 단독에 대해 수행하였다. B12 라이브러리에 대한 이 여분의 선택을 수행하기 위한 이유는 인간 및 마우스 rCd4-his-FBG에 대한 B12 모 항체 결합에 대해 관찰된 친화도의 큰 차이였다. 이 차이는 2A5(6.9-배) 또는 F3(2.6-배) 모 항체에 대해 확연한 것과 같지 않았다. 더 나아가, 추가적인 선택 라운드를 우수한 오프속도를 지니는 항체 클론에 대해 선택하기 위해 수행하였다. 오프 속도 선택에서, 파지에 바이오틴일화된 항원(이 경우에 1nM)을 결합시키고, 큰 과량의 비-바이오틴일화된 항원(500nM)을 후속적으로 반응물에 첨가하고 나서, 20시간 또는 40시간 동안 인큐베이션시켰다. 비-바이오틴일화된 항원은 경쟁자로서 작용하고, 바이오틴일화된 항원으로부터 해리되는 파지 항체를 포획하며, 즉, 더 긴 오프 속도를 지니는 항체만이 선택의 마지막에 회수될 것이다(Hawkins et al., 1992; Zahnd et al., 2010). 계산한 선택창과 함께 각각의 선택 라운드에 대한 산출 파지 역가를 표 5a 내지 표 5c에 나타낸다.
선택 집단을 박테리아 발현 벡터 pSANG10로 서브 클로닝시키고 나서(Martin et al, 2006), 이콜라이 BL21(DE3)로 형질전환하고, 마우스 FBG 및 인간 FBG 각각에 대해 개선된 결합을 지니는 클론을 동정하기 위한 ELISA 및 HTRF 분석을 위해 개개 형질전환체를 선별하였다(선택 당 46).
(표 5a)
Figure 112017016707328-pct00006
(표 5b)
Figure 112017016707328-pct00007
(표 5c)
Figure 112017016707328-pct00008
ELISA 선별
항-FLAG 포획 ELISA를 모 항체에 비해 마우스 FBG 결합에 대해 개선된 친화도를 갖는 클론에 대한 선별을 수행하였다.
scFv pSANG10 발현 플라스미드를 보유하는 이콜라이 BL21(DE3) 클론은 앞서 기재한 바와 같은 자가 유도 배지를 지니는 96-웰 플레이트에서 유도하였다(Schofield et al, 2007). 이콜라이 상청액을 ELISA 분석을 위해 채취하였다. ELISA는 유로퓸-표지 항-FLAG 항체(영국에 소재한 시그마 알드리치(Sigma, Aldrich))를 이용하는 DELFIA(해리 향상 란탄족 형광 면역분석법) 시스템을 사용하였다. 검정색 면역흡착 플레이트(Nunc)를 2% 우유 분말, PBS (PBS-M, 300㎕/웰)의 첨가에 의해 차단한 웰에서 항-FLAG M2 항체(시그마(Sigma), F3165, PBS 중의 5㎍/㎖, 50㎕/웰)를 이용하여 밤새 코팅시켰다. 플레이트를 PBS-T(PBS, 0.1% 트윈-20)를 이용하여 3회 및 PBS를 이용하여 3회 세척한 다음 PBS-M(50㎕/웰) 중의 발현된 scFv를 함유하는 96-웰 자가 유도 배양물 상청액의 1:2 희석물을 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시키고 나서, 상기와 같이 세척하고 바이오틴일화된 마우스 또는 인간 rCd4-His-FBG(PBS-M 중의 5㎍/㎖, 50㎕)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가 1시간 동안 인큐베이션시키고 나서, 세척하고, 스트렙타비딘-Eu(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 1㎍/㎖, PBS-M, 50㎕)를 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시키고 나서, 세척 후, DELFIA 향상 용액을 첨가하고(50㎕), 플레이트를 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 융합 플레이트 판독기(여기 = 320㎚, 방출 620㎚) 상에서 판독하였다. 분석 형식을 도 11에 나타낸다.
이 분석에서, scFv 발현 수준의 차이는 정규화되는데, 자가 유도 배양물 중의 scFv의 발현 수준이 항-FLAG 코팅 웰을 포화하기 때문이다. 따라서, 분석에서 얻은 신호는 세척 후 결합된 바이오틴일화된 rCd4-His-FBG의 양을 반영하는데, 이는 마우스 또는 인간 FBG에 대한 해당 클론의 오프속도의 함수일 것이다. 2A5 및 B12 서브-라이브러리로부터의 선택 산출의 ELISA 선별은 마우스 TNC FBG에 대해 상당히 개선된 결합을 지니는 클론을 나타내었다.
HTRF 선별
인간 TNC FBG에 대해 개선된 결합을 지니는 항체 변이체에 대한 선별을 위해 HTRF-기반 경쟁 분석을 개발하였다.
모든 샘플 및 시약을 분석 완충제(50mM NaPO4, 0.1% BSA, 0.4 M KF, pH 7.0) 중에서 언급한 농도의 4x로 준비하였다. 5㎕의 각각의 시약을 후속적으로 저 용적의 384-웰 분석 플레이트(그라이너(Greiner), 784075)에 첨가하여 20㎕의 최종 반응 용적을 제공하였다. IgG 항체를 제조업자에 의해 지시된 바와 같은 d2 표지 키트(시스바이오(CisBio), 62D2DPEA)를 이용하여 표지하였다. 스트렙타비딘 유로퓸 크립테이트(시스바이오, 610SAKLA, 로트 번호 25C)를 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 20㎕ 반응물 당 1.8ng 활성 모이어티(SA)의 최종 농도에서 사용하였다. 바이오틴일화된 rCd4-His-FBG를 EZ-연결 설포-NHS-LC-바이오틴 시약(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 21327)을 이용하여 제조하고 나서, 바이오틴일화 정도를 바이오틴일화형광 정량화 키트(써모 사이언티픽, 46610)를 이용하여 정량화하였다. 적절하다면, scFv를 함유하는 상청액(ELISA 분석에 대해 상기 기재한 바와 같이 준비)을 1/20의 최종 농도(즉, 분석 완충제 중의 1/5 희석 다음에 20㎕ FRET 분석에 대해 5㎕ 희석 샘플의 첨가)로 384-웰 분석 플레이트에 첨가하였다. 선별을 위해 사용한 d2-표지 2A5 IgG 및 B12 IgG의 농도는 각각 15 및 1.25nM이었다. 달리 언급되지 않는 한, 바이오틴일화된 rCd4-His-FBG(바이오틴:단백질 비 = 1.8:1)는 2.2nM(2A5 IgG 항체를 이용하는 분석에서) 또는 1nM(B12 IgG를 이용하는 분석에서) 존재하였다. 샘플을 대략 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고 나서, BMG 페라스타(Pherastar) 기기(여기 = 320㎚; 방출 = 620㎚ 및 665㎚; 통합 시작 시간 = 60μs; 통합 시간 = 500μs; 100회 플래쉬/웰)를 이용하여 결정하였다. 배양 상청액을 함유하는 경쟁 분석을 위해, 바이오틴일화된 rCd4-His-FBG 항원을 분석 플레이트에 대한 시약 첨가 전 스트렙타비딘 유로퓸 크립테이트와 함께 45분 동안 사전 인큐베이션시켰다. 모든 FRET 신호를 ΔR로서 제시한다, 여기서 R = (E665/E620 x 104) 및 ΔR = (R샘플 - R배경 형광).
친화도 선택 돌연변이체 라이브러리로부터의 비표지 scFv 클론을 함유하는 배양물 상청액을 FBG와 형광단-표지 모 IgG 항체 사이의 저해에 대해 시험하였다. 2A5 변이체를 선별하기 위해 사용할 때, 이 접근은 모(VH CDR3 변이체 92% 및 VL CDR3 변이체 79%)에 대해 개선된 저해를 지니는 고비율의 클론을 수득하였다. FRET 신호를 완전히 저해한 클론 간을 구별하기 위해서, 2A5 변이체를 후속적으로 B12 IgG와 경쟁하는 그들의 능력에 대해 선별하였다. 이는 인간 FBG에 대한 B12의 친화도가 2A5의 친화도보다 대략 100배 더 강하다는 것을 고려할 때(25℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 이들 상호작용에 대한 해리 상수는 각각 0.11nM 및 15nM임) 더 엄격한 선별이었다. 분석 둘 다에서 유용한 범위 내에 있는 FRET 신호를 나타내는 클론의 상대적 순위는 넓게 변하지 않았는데, 이는 그들이 유사한 에피토프와 경쟁하였다는 것을 나타낸다. 따라서, 친화도 성숙 선택으로부터의 모든 2A5 및 B12 scFv 변이체는 인간 TNC FBG에 대한 B12 IgG 분자의 결합을 저해하는 그들의 능력에 대해 선별하였다. 친화도 성숙 클론과 병행하여 scFv로서 발현시킨 모 클론을 기준으로서 사용하였다(표 6).
ScFv를 서열분석하고 나서, 독특한 VH 또는 VL CDR3 서열을 지니는 클론의 패널을 ELISA 및 HTRF 분석 각각에서 마우스 및 인간 TNC FBG에 대한 그들의 결합에 기반하여 인간 IgG4 형식에서 추가 연구를 위해 선택하였다. 항체 2A5의 선택 변이체는 마우스 FBG에 대한 결합의 10-배 이상 개선 및 HTRF 분석에서 90% 이상(VH CDR3 변이체) 또는 83% 이상(VL CDR3 변이체) 저해를 나타내었다.
Figure 112017016707328-pct00009
항체 B12의 변이체는 마우스 FBG 결합에 대한 4-배 이상 개선 및 HTRF 신호의 91% 이상의 저해를 나타내었다. 전체적으로, 독특한 CDR3 서열을 지니는 이들 기준에 적합한 31개 클론을 동정하였다(표 7).
Figure 112017016707328-pct00010
이들은 인간 및 마우스 TNC FBG에 결합하는 항케 클론의 중쇄 또는 경쇄 서열이며, 따라서 본 발명의 방법, 용도, 조성물 및 화합물에서 잠재적 효용을 가진다. 예를 들어, 이들 CDR3 서열을 갖는 TNF FBG에 결합하는 항체는 TNC 또는 TNC FBG를 동정하고, 이의 기능을 저해하며, 검출 및 정제함에 있어서 유용할 수 있다.
결합 역학의 IgG4 형식 및 결정에 대한 전환
관심 대상의 31개 scFv를 힌지-안정화 돌연변이를 지니는 인간 IgG4로서 항체의 발생을 위해 인간 IgG4 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다(S241P; Angal et al, 1993). IgG4 항체를 HEK-293F 세포에서 일시적으로 발현시키고 나서, 배양물 상청액을 인간 및 마우스 TNC FBG, 및 인간 TNR FBG에 대한 결합을 위해 그들의 오프 속도 순위에 대해 표면 플라즈몬 공명 분광학을 이용하여 선별하였다. 간략하게, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험을 비아코어 T100 기기를 이용하여 수행한 다음, 인간 항체 포획 키트 프로토콜(GE, BR-1008-39)에 따르는 프로토콜을 따랐다. 오프 속도 선별을 위해, 항-인간 Fc IgG(GE, BR-1008-39)의 10,000개 반응 단위(RU)를 아민 결합 키트 프로토콜(GE, BR-1000-50)에 따라 EDC/NHS 가교 화학을 이용하여 시리즈 5 CM5 덱스트란 센서 칩(BR-1005-30) 시리즈의 유동 세포(FC1 및 FC2) 상에 고정시켰다. 발현된 IgG4를 함유하는 배양물 상청액을 2xPBS-T를 이용하여 1:2로 희석시키고 나서, FC2에 주사하여(유동 속도 5㎕/분, 60초 접촉 시간) 25℃에서 항체 포획을 가능하게 하였다. 항체 포획 수준은 상청액 중의 항체 발현 수준에 따라서 308 내지 1975 RU의 범위였다. 고정된 농도의 항원(인간 및 마우스 TNC rCd4-His-FBG 15nM 및 인간 TNR rCd4-His-FBG 100nM)을 30㎕/분의 유동 속도로 FC 1(기준 유동 세포) 및 FC 2(항체 포획 유동 세포)을 통해 유동 통로를 이용하여 주사하고, 결합 및 해리 단계를 각각 1분 및 5분 시간 기간에 걸쳐 측정하였다. 결합 표면의 재생은 30초 접촉 시간으로 3M MgCl2를 사용하였다. 오프 속도를 기준 세포 차감에 의해 결정하고 나서, BIA평가 소프트웨어(GE, BR-1005-97)를 이용하여 1:1 상호작용으로 추정하고, 센소그램 실험 데이터에 적합화하였다. 오프 속도 선별의 결과를 표 8에 요약한다.
Figure 112017016707328-pct00011
클론을 인간 및 마우스 TNC rCd4-His-FBG에 대해 낮은 오프 속도, 그리고 인간 TNR rCd4-His-FBG에 대해 높은 오프 속도에 따라 순위를 정하였다. 각각의 라이브러리로부터 3개의 가장 높은 순위의 항체를 정제된 IgG4로서 더 상세한 역학 분석을 위해 우선적으로 처리하였다. 이들 클론을 표 9, 10 및 11에 나타낸다.
Figure 112017016707328-pct00012
Figure 112017016707328-pct00013
Figure 112017016707328-pct00014
상세한 역학 매개변수를 9개의 우선 처리한 IgG4 항체에 대해 평가하였다. 결합 특징을 인간, 래트 및 개 TNC rCD4-His-FBG, 및 인간 TNR rCD4-His-FBG와의 상호작용에 대해 결정하였다. 역학 분석은 상기 기재한 오프 속도 결장과 본질적으로 동일한 프로토콜을 따랐으며, 일부 변형은 다음과 같다. 역학 매개변수 결정의 정확성을 개선시키기 위해, 항-인간 Fc IgG를 저수준(2229RU)에서 고정시켜, 포획된 항-FBG IgG4 양의 대응하는 감소를 초래하였다. 정제된 항-FBG IgG4를 PBS, pH 7.4, 0.05% 트윈-20 중에서 3.5nM의 농도로 희석시키고 나서, 유동 속도 10㎕/분, 60초 접촉 시간으로 FC2에 주사하였다. 이는 전형적으로 포획 항체의 평균 80 RU를 초래하였다(범위: 55RU 내지 90RU). 항원을 PBS, pH 7.4, 0.05% 트윈-20(7nM인 마우스 rCD4-His-FBG를 제외하고 가장 높은 농도 100nM) 중에서 2배 희석에 의해 제조하였다. 분석을 37℃에서 수행하였고(30㎕/분, 120초 접촉 시간; 마우스 rCD4-His-FBGFBG 10㎕/분, 60초 접촉 시간), 유동 세포와 주사 챔버는 둘 다 이 온도에 대해 평형상태가 되었다. 앞에서와 같이, 역학 매개변수를 기준 세포 차감에 의해 결정하였고, BIA평가 소프트웨어(GE, BR-1005-97)를 이용하여 1:1 상호작용을 가정하여, 센소그램 실험 데이터에 적합화시켰다.
모두 9개의 항체는 인간 TNC FBG에 대한 결합을 위해 서브 나노몰 KD 값을 나타내고, 인간 TNR FBG 유사체에 대해 >70-배 더 낮은 친화도를 지니는, 비친화도 성숙 모 클론, 및 항체 165_13_B1, 165_13_C3, 및 160_01_A4에 비해 마우스 마우스 TNC FBG 도메인에 대해 개선된 결합을 나타내었다(표 12).
Figure 112017016707328-pct00015
실시예 6 - 1차 인간 PBMC에서 TNC FBG -유발 사이토카인 생성의 저해
정제된 IgG4 항체 165_13_B1, 165_13_C3, 및 160_01_A4의 활성을 중화시키는 기능적 FBG를 1차 인간 PBMC에서 FBG-유발 사이토카인 방출의 시험관내 분석에서 확인하였다.
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 집단을 밀도 구배 원심분리에 의해 3명의 건강한 인간 단일 공여자 버피코트(buffy coat) 제제로부터 단리시켰다. 분석을 최종 용적 200㎕으로 96-웰 플레이트에서 수행하였고, 사용 전에 모든 시약 및 시험 항체의 엔도톡신 함량은 허용 가능한 제한 내인 것을 확인하였으며, 리뮐러스 변형세포 용해물(LAL) 엔도톡신 정량화 키트(피어스(Pierce))를 이용하여 결정하였다.
새로운 단리된 PBMC 샘플(2x105개 세포/웰)을 박테리아 지질다당류(LPS; 이콜라이 026:B6; 100ng/㎖) 또는 인간 Fc-His-FBG(200nM) 중 하나를 이용하는 준최대 자극 전에 시험 항체(100nM 및 1μM), 대조군 아이소타입 항체(시그마 I4639; 100nM 및 1μM), 덱사메타손(1μM) 또는 PBS 대조군의 존재에서 1시간 동안 배양시켰다. LPS 또는 Fc-His-FBG를 동일 용적의 PBS로 대체한 대조군 웰은 시험 항체 또는 덱사메타손을 함유하였다. 인큐베이션(24h, 37℃) 후에, 배양물 상청액을 수집하고 나서, -80℃에서 저장하였다. 사이토카인 함량에 대한 상청액의 분석 전 샘플을 실온으로 해동시켰다. 각각의 상청액의 25㎕ 분취액을 동일 용적의 RPMI 배지(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))로 희석시키고 나서, 얻어진 샘플을 루미넥스 분석에 의해 IL-8 및 TNFα에 대해 2회 중복해서 분석하였다.
24시간 동안 100ng/㎖ LPS와 함께 PBMC의 인큐베이션은 IL-8 및 TNFa 생성을 초래하였는데, 이는 대조군 IgG4 항체 또는 항-FBG 항체 중 하나에 노출에 의해 저해되지 않았다. 대조적으로, Fc-His-FBG에 의해 유발된 IL-8 및 TNFa 방출은 모든 시험 항체에 의해 완전히 차단되었는데(대조군 IgG4는 아님), 이는 3종의 친화도 성숙 항체 165_13_B1, 165_13_C3, 및 160_01_A4의 강하고 특이적인 FBG-중화 활성을 확인하였다(도 12a, b).
실시예 7 - 시트룰린화된 FBG에 대한 항- FBG IgG4 결합
시트룰린화된 FBG에 대한 항체 B12의 결합 친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정하였다. B12를 QMCF 발현 기법(에스토니아에 소재한 아이코사겐(Icosagen))을 이용하는 힌지-안정화 S241P 돌연변이를 지니는 인간 IgG4로서 발현시켰고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피(맙셀렉트 슈어(MabSelect Sure); GE 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 정제하였다.
인간 TNC FBG의 시트룰린화
정제된 인간 His-FBG를 공급업자의 설명서에 따라 펩티딜알기닌 탈이미나제 2(PAD2; MQ-16.201-2.5, 모디퀘스트(Modiquest), NL) 또는 펩티딜알기닌 탈이미나제 4(PAD4; MQ-16.203-2.5, 모디퀘스트, NL) 중 하나를 이용하여 시트룰린화하였다. 간략하게, His-FBG를 공급된 탈이민화 완충제(0.1M 트리스(Tris)-HCl pH 7.5, 10mM CaCl2, 5mM 다이티오트레이톨) 중에서 1㎎/㎖로 희석시키고 나서, 250㎕를 PAD2 또는 PAD4 효소 중 하나의 125mU와 혼합한 다음, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 시트룰린화를 효소 처리한 샘플의 아미노산 분석에 의해 확인하였다. 탈이민화 완충제 중의 His-FBG의 분취액을 비시트룰린화된 대조군 단백질로서 사용하기 위해 첨가한 PAD 효소 없이 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 시트룰린화 및 비변형된 His-FBG 단백질을 이하에 기재하는 바와 같이 SPR 실험에서 사용하였다.
표면 플라즈몬 공명
SPR 실험을 비아코어 3000 기기 상에서 수행하였다. 항-인간 IgG(GE 헬스케어)를 아미노산 결합 화학을 이용하여 CM5 센서 칩의 표면에 공유결합시켰다. RU 단위로 표현한 결합된 항-인간 IgG의 양은 6500 내지 7000(6.5 내지 7.0ng/㎟)로 변하였다. B12-hIgG4(1 내지 13nM)를 25℃에서 HBS-EP 완충제(10mM 헤페스, 0.15 M NaCl, 2.5mM EDTA 및 0.005% 트윈-20) 중의 고정 항-인간 IgG에 부착하였다. 고정된 B12-hIgG4에 대한 His-FBG 변이체의 결합을 또한 25℃에서 HBS-EP 완충제 중에서 측정하였다. 유동 속도는 고정화 실험에서 5㎕/분이고, 역학 분석에 대해 20㎕/분이었다. 센서 칩 표면을 3M MgCl2를 이용하여 재생하였다. 데이터를 BIA평가 프로그램 4.1(GE 헬스케어)를 이용하여 분석하였다.
시트룰린화된 His-FBG에 대한 B12-IgG4 결합의 분석은 비변형 His-FBG에 대한 결합에 대해 얻은 값에 비교할 때 역학 매개변수가 본질적으로 변하지 않았다는 것을 나타내었다(표 13). 이들 결과는 B12 계열의 항-FBG 항체가 치료적 또는 진단적 용도에서 TNC FBG의 시트룰린화 형태와 비시트룰린화 형태 둘 다에 결합하는 것으로 예상된다는 것을 나타낸다.
Figure 112017016707328-pct00016
실시예 8 - 면역조직화학을 이용하는 인간 RA 조직에서 TNC FBG의 검출
면역조직화학 연구를 수행하여 항-FBG 항체가 인간 조직에서 인간 TNC FBG 단백질의 내인성 형태를 효과적으로 인식하는지의 여부를 결정하였다. 테나신-C를 만성 염증 부위에서 발현시키고, 류마티스 관절염을 지니는 개체로부터의 관절의 염증 활막 내에서 그의 국소화는 상업적으로 입수가능한 항체를 이용하는 면역조직화학에 의해 이전에 입증되었다(Goh et al, 2010; Salter DM, 1993).
B12 항체를 QMCF 발현 기법(에스토니아에 소재한 아이코사겐)을 이용하여 마우스 IgG2a 형식으로서 발현시키고, 단백질 G 친화도 크로마토그래피 다음에 수퍼덱스(Superdex) 200 겔 여과에 의해 정제하였다. 전장 인간 테나신-C의 EGF 도메인을 인식하는 대조군 마우스 IgG1 항-테나신-C 항체(클론 4F10TT; 타카라 클론테크(Takara Clontech))를 양성 대조군 비교기로서 사용하였다. 부적절한 박테리아 항원에 대해 마우스 IgG1(다코(Dako) X0931) 또는 IgG2a(다코 X0943)를 대조군 1차 항체로서 사용하여 이들 아이소토프에 의한 비특이적 배경 염색 수준을 결정하였다. 확인된 RA 진단(영국에 소재한 애스터랜드)을 이용하는 공여체로부터 인간 무릎 관절 활막의 냉동 박편을 실온에 대해 평형 상태를 유지하였고, 1:1 v/v 아세톤/메탄올 중에서 고정시키고 나서(10분), 세척 완충제에 옮겼다. 제조업자의 프로토콜에 따라 엔비전 플렉스(Envision Flex) 시약(다코 K8010)을 지니는 다코 자동염색기(Dako Autostainer)를 이용하여 면역염색을 수행하였다. 간략하게, 고정된 조직 슬라이드를 자동 염색기 상에 두고, 차단시킨 후(페록시다제 차단, 5분; 단백질 차단, 10분, 다코 X0909) 1차 항체(B12 또는 클론 4F10TT; 1, 2 또는 4㎍/㎖)를 30분 적용하였다. 일부 대조군에서, 슬라이드를 1차 항체에 노출시키지 않았다. 세척 후, HRP-표지 염소 항-마우스 2차 항체를 적용하고(20분), 슬라이드를 다시 세척한 후에, DAB+ 색원체를 10분 적용하였다. 슬라이드를 세척하고 나서, 헤마톡실린으로 대비염색하고, 염색의 현미경 시각화를 위해 커버슬립하였다.
아세톤/메탄올을 이용하여 고정한 RA 활막의 동결절편에서, 항-TNC FBG B12 마우스 IgG2a는 양성 대조군 항체 클론 4F10TT에 의해 얻은 염색과 매우 유사한 패턴을 나타내었다. 활막, 섬유 피막, 맥관구조에서 그리고 사이질 내에서 특이적 면역염색을 관찰하였다. 림프구 응집물 내에서 염색은 없었다(도 13a, 도 13c). 일부 비특이적 면역염색이 비면역 대조군 처리 조직에서 존재하였다(도 13b, 도 13d). 이들 결과는 RA 활막 내에서 테나신-C 발현의 이전의 보고를 확인하고 연장시켰는데, 이는 염증 부위에서 B12가 내인성 테나신-C와 결합하기 위한 효과적인 제제라는 것을 입증하고, 추가로 RA에서 FBG가 접근 가능한 표적이라는 것을 나타낸다.
실시예 9 - 항체 서열
항체 2A5
Figure 112017016707328-pct00017
항체 B12
Figure 112017016707328-pct00018
Figure 112017016707328-pct00019
항체 D8
Figure 112017016707328-pct00020
Figure 112017016707328-pct00021
항체 F3
Figure 112017016707328-pct00022
항체 165 13 B1(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00023
Figure 112017016707328-pct00024
Figure 112017016707328-pct00025
항체 165 13 B6(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00026
Figure 112017016707328-pct00027
항체 165 13 D1(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00028
항체 165 13 C3(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00029
Figure 112017016707328-pct00030
항체 165 13 D4(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00031
Figure 112017016707328-pct00032
항체 165 13 A4(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00033
항체 165 13 B3(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00034
Figure 112017016707328-pct00035
항체 165 13 E1(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00036
Figure 112017016707328-pct00037
항체 180 11 F5(B12로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00038
항체 160 01 E3(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00039
Figure 112017016707328-pct00040
항체 160 01 D6(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00041
Figure 112017016707328-pct00042
항체 160 01 H4(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00043
항체 160 01 A4(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00044
항체 160 01 F1(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00045
Figure 112017016707328-pct00046
항체 160 01 G2(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00047
항체 161 01 F6, 또한 160 01 F6으로 알려짐(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00048
항체 161 01 A12(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00049
Figure 112017016707328-pct00050
항체 161 01 C09(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00051
항체 161 01 H10(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00052
항체 161 01 C11(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00053
Figure 112017016707328-pct00054
항체 162 02 D3(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00055
항체 162 02 C6(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00056
항체 162 02 H5(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00057
Figure 112017016707328-pct00058
항체 162 02 F3(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00059
Figure 112017016707328-pct00060
항체 162 02 C1(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00061
항체 162 02 C2(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00062
Figure 112017016707328-pct00063
항체 162 02 F4(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00064
Figure 112017016707328-pct00065
항체 162 02 C3(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00066
항체 162 02 E11(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00067
Figure 112017016707328-pct00068
항체 163 02 A12(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00069
Figure 112017016707328-pct00070
항체 163 02 D11(2A5로부터 유래됨 )
Figure 112017016707328-pct00071
IgG4 165_13_ C3 (문헌[ Angal 1993]에 기재된 바와 같은 힌지 변형을 지니는 불변 영역)
참고문헌: [Angal S1, King DJ, Bodmer MW, Turner A, Lawson AD, Roberts G, Pedley B, Adair JR. Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8].
Figure 112017016707328-pct00072
실시예 10 - 단백질 서열
인간 테나신-C FBG 도메인의 아미노산 서열 [서열번호 92]
Figure 112017016707328-pct00073
마우스 테나신-C FBG 도메인의 아미노산 서열 [서열번호 93]
Figure 112017016707328-pct00074
래트 테나신-C FBG 도메인의 아미노산 서열 [서열번호 94]
Figure 112017016707328-pct00075
개 테나신-C FBG 도메인의 아미노산 서열 [서열번호 95]
Figure 112017016707328-pct00076
인간 테나신-R FBG 도메인의 아미노산 서열 [서열번호 96]
Figure 112017016707328-pct00077
실시예 11 - 생식계열화된 서열
가장 가까운 생식세포계열 매치를 IMGT/DomainGapAlign를 이용하여 결정하였다:
문헌[Ehrenmann F., Kaas Q. 및 Lefranc M.P. Nucleic Acids Res., 38, D301 내지 307 (2010)]
비-생식세포계열화된 서열로부터의 변화를 아미노산의 밑줄에 의해 나타낸다. CDR을 박스 표시한 서열로 나타낸다.
항체 2A5
생식계열화된 프레임워크 : VH 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00078
생식계열화된 프레임워크 : VL 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00079
Figure 112017016707328-pct00080
항체 B12
생식계열화된 프레임워크 : VH 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00081
생식계열화된 프레임워크 : VL 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00082
항체 D8
생식계열화된 프레임워크 : VH 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00083
생식계열화된 프레임워크 : VL 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00084
항체 F3
생식계열화된 프레임워크 : VH 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00085
생식계열화된 프레임워크 : VL 아미노산 서열:
Figure 112017016707328-pct00086
실시예 12 - 웨스턴 블롯팅에서 항체의 용도
단클론성 항체 IgG4 C3(상기 언급한 바와 같은 165_13_C3) 및 IgG4 B12가 웨스턴 블롯팅에 대해 성공적으로 사용될 수 있다는 것을 확인하기 위해, 정제된 단백질을 이용하여 제1 특이성을 시험하였다(도 14). 다음에, 신경교종 세포 용해물을 사용하여 다른 단백질의 생물학적으로 적절한 혼합물 중의 전장 TNC를 검출하기 위한 B12의 능력을 결정하였다(도 15).
도 14의 데이터에 나타낸 바와 같이, 재조합 CD4-TNC-FBG(나시언트), CD4-TNR-FBG 또는 피브리노겐(KIR)을 환원 조건 하에서 4종의 10% SDS-PAGE 겔에 대해 실행한 후, 다음의 항체 A) 4℃에서 밤새 1:20,000(0.25㎍/㎖)로 C3 IgG4 MAb(나시언트), B) 4℃에서 밤새 1:20,000(0.25㎍/㎖)에서 B12 IgG4 MAb (나시언트), C) 4℃에서 밤새 1:2,000(0.1㎍/㎖)에서 항-테나신-R 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지, sc-9875) D) 4℃에서 밤새 1:500로 항-TNC-FBG 다클론성 항체(미드우드 그룹)를 이용하여 검출하였다. C3 및 B12 항체에 대해 사용한 2차 항체는 RT에서 1시간 동안 1:20,000에서 에이비캠(Abcam)(ab6858)이었다. TNR 항체에 대해, 2차는 RT에서 1시간 동안 1:10,000에서 HRP 컨쥬게이팅된 항-염소(시그마 알드리치, SAB3700259)였다. 다클론성 TNC 항체에 대해, 사용한 2차는 RT에서 1시간 동안 1:5,000에서 HRP 컨쥬게이팅된 항-토끼(다코, P0217)였다. 필름에 대한 노출은 나타낸 모든 블롯에 대해 5분이었다.
이 실험에서, C3과 B12는 둘 다 TNR-FBG 또는 피브리노겐 중 하나와 매우 적은 교차 반응성으로 TNC-FBG에 대한 특이성을 나타내는데, 이는 그들이 TNC-FBG에 대해 양호한 특이성을 나타내기 때문에 웨스턴 블롯팅 용도에 대한 그들의 적합성을 나타낸다.
도 15의 데이터에 의해 나타내는 바와 같이, 신경교종 세포 용해물(KIR) 및 테나신-C(나시언트)를 막에 대한 블롯팅 및 A. 4℃에서 밤새 1:20,000로 B12 IgG4 Mab(나시언트); B. 4℃에서 밤새 1:4,000으로 IgG4 아이소타입 대조군 (유레카 쎄라퓨틱스)에 의한 검출 전 환원 조건 하에서 5% SDS-PAGE 겔 상에서 실행하였다. 사용한 2차 항체는 RT에서 1시간 동안 1:10,000에서 에이비캠(ab6858)이었다. 블롯을 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약(GE 헬스케어, 아머샴)을 이용하여 진행하였다. 블롯을 1분 동안 필름에 노출시켰다.
이들 결과는 B12가 전장 TNC뿐만 아니라 TNC의 분해 산물 및/또는 스플라이스 변이체를 검출할 수 있고, 세포 용해물 중에 존재하는 다른 단백질에 대해 낮은 교차 반응성을 나타낸다는 것을 나타낸다.
실시예 13 - C3 항체 시험관내의 활성
단클론성 항체 C3(165_13_C3)가 TNC-FBG의 그의 수용체 TLR4에 대한 결합을 방해함으로써 작용한다는 것을 확인하기 위해, 처음에 시험관내 결합 분석을 TLR4 및 Fc-His-FBG에 대해 진행하였고, C3과 함께 Fc-His-FBG의 사전 인큐베이션 효과를 결정하였다.
PBS(또는 PBS 단독) 중의 재조합 인간 TLR4(알앤디 시스템즈)(1㎍/㎖ (14.6nM))를 96-웰 플레이트에 결합하였다. 차단 후(10% BSA) 표시된 농도의 인간 Fc-His-FBG를 첨가하고 나서, 1㎍/㎖에서 항-인간 IgG1 MAb(AbD 세로텍(Serotec), 클론 2C11), 1㎍/㎖에서 항-마우스 HRP 컨쥬게이팅된 2차 항체(AbD 세로텍, STAR13B) 및 TMB 기질의 인큐베이션에 의해 검출을 수행하였다. 결과를 도 16A에 나타낸다(n=4 평균 및 SEM을 나타냄). 이 실험은 Fc-His-FBG가 용량 의존적 방식으로 시험관내에서 TLR4에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 16B에 나타낸 바와 같이, 단클론성 Ab C3는 시험관내 FBG 및 TLR4 결합을 방해한다. C3 Mab 또는 아이소타입 대조군 항체와 함께 사전 인큐베이션한 재조합 인간 Fc-His-TNC-FBG(100nM)를 첨가한 후에, PBS(또는 PBS 단독) 중의 재조합 인간 TLR4를 96-웰 플레이트에 결합하였다. 단백질의 Fc 부분, 항-마우스 HRP 컨쥬게이팅된 2차 항체 및 TMB 기질과 관련된 항체의 연속적 인큐베이션에 의해 검출을 수행하였다. C3 사전 인큐베이션된 샘플 중의 저해 백분율을 아이소타입 대조군 샘플과 비교하여 계산하였다(IC50 = 44.5nM). n=4.
실시예 14 - 항체 B12, A4 및 C3의 항-염증 효과
항-TNC-FBG 항체 B12, A4(160_01_A4) 및 C3(165_13_C3)은 생물학적 시스템에서 항염증 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 이를 위하여, 인간 단핵구를 피콜 구배 및 역류 원심분리에 의해 말초 혈액(런던 혈액 은행)으로부터 단리시켰다. 이어서, 단핵구를 5일 동안 100ng/㎖ M-CSF(페프로텍(Peprotec))와 차별화시켜 M2 대식세포를 생성하였다.
도 17a의 결과에 의해 나타나는 바와 같이, 재조합 인간 Fc-TNC FBG(1μM) 또는 LPS(엔조)(1ng/㎖)를 RT에서 30분 동안 MAb C3(1, 0.2 및 0.04μM) 또는 아이소타입 대조군(유레카(Eureka)) MAb(1μM)와 함께 사전 인큐베이션시킨 후 인간 M2 대식세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 IL-8, IL-6 및 TNF 사이토카인 ELISA(BD 바이오사이언시스), n=3를 실시하였다. 이들 결과는 1uM C3이 TNC-FBG에 의해 자극한 인간 M2 대식세포에 의한 전염증 사이토카인 방출을 크게 감소시키며, 이 감소는 IL-8와 TNF 둘 다에 대해 통계학적으로 유의하다는 것을 나타낸다. 예상한 바와 같이, C3은 LPS-유도 사이토카인 방출에 대해 효과가 없었다.
도 17b는 재조합 뮤린 Fc-TNC FBG(1μM)가 MAb C3(1, 0.2 및 0.04μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(유레카)(1μM)와 함께 RT에서 30분 동안 사전 인큐베이션 된 후에 인간 M2 대식세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가된 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n= 3회 이상, 평균 및 SEM을 나타냄. 또한 1uM에서 C3은 대식세포에 의해 뮤린 Fc-TNC-FBG-유도 사이토카인 방출을 크게 감소시켰는데, 이는 항체의 양호한 교차 종을 나타낸다.
FBG-유도 사이토카인 방출이 단백질의 Fc 부분보다 FBG에 의해 유도된다는 것을 확인하기 위해, Fc 부분이 비활성이 되도록 돌연변이된 단백질(Fc-Mut-FBG)을 사용하였고, 항-TNC-FBG 항체, B12, C3(165_13_C3) 및 A4(160_01_A4)를 또한 이 분자에 대한 활성에 대해 시험하였다. Fc-Mut-FBG(1μM) 및 C3, A4 또는 B12(1μM)를 RT에서 30분 동안 사전인큐베이션시킨 후에, 인간 M2 대식세포 배양물에 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n=3, 평균 및 SEM을 나타냄. 결과를 도 17c에 나타낸다. 이 실험은 Fc-His-FBG-유도 사이토카인 합성이 Fc 부분 신호전달 내지 Fc-수용체에 기인하지 않는다는 것을 확인한다. 추가로, 관련된 항체 B12 및 A4뿐만 아니라 C3의 사전 인큐베이션은 인간 M2 대식세포에 의한 FBG-유도 사이토카인 방출을 크게 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 18A는 단클론성 항체 B12가 인간 TNC-FBG에 의해 자극한 1차 인간 대식세포에 의한 전염증 사이토카인의 생성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 해당 실험에서, 재조합 인간 테나신-C FBG(1μM)를 MAb B12(1, 0.1, 0.01 또는 0.001μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(1μM)와 함께 RT에서 30분 동안 사전 인큐베이션시킨 후에 인간 M2 대식세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA, n=1을 실시하였다. 여기서 또한 본 발명자들은 B12 항체 사전-인큐베이션이 FBG-유도 사이토카인 방출을 감소시키고, 이 공여자에서 IL-8이 최소 반응을 제공한다는 것을 안다.
도 18B는 실험실 또는 대규모로 생성된 단클론성 항체 C3이 1차 인간 대식세포에 의한 FBG-유도 사이토카인 합성의 차단에서 동일한 수준의 효능을 나타낸다는 것을 보여준다.
동물 연구에 C3 항체를 취하기 위해, IgG4 B12 165-13-C3 산물을 클로닝하고 나서, 발현 후 상업적 GS-CHO 발현을 이용하여 주요 작제물 제조 기구에서 정제하였다. 중쇄와 경쇄 가변 영역에 대한 cDNA를 CHO 발현에 대해 최적화하고 나서, 발현 벡터 내로 클로닝하기 전 라이프 테크놀로지즈에 의해 합성하였다(상업적 신호 서열을 이용). CHO 세포를 풀로서 형질감염시키고, 가장 높은 발현 풀을 대규모 진탕 플라스크 생성(22ℓ 내지 11x (5ℓ 진탕 플라스크 중의)　2ℓ)을 향하도록 취하였다. 소유권이 있는 공급물을 제12일에 배양물을 채취하기 전 제4일 및 제8일에 투여하였다. 물질을 심층 여과 및 필터 멸균 전에 원심분리시켰다. 접선유동여과(30kDa 분자량 컷오프)를 이용하여 대략 5.5배 농도의 물질을 수행하였고, 얻어진 농축물을 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe) 정제 전에 다시 필터 멸균시켰다. 생성물을 용리시키고 나서, 생성물을 중화시키고, 이어서, 20mM NaOAc, pH 5.5, 150mM NaCl 중에서 대략 11㎎/㎖로 농축/정용여과 시켰다. 크기 배제 -HPLC와 함께 환원 및 비환원 SDS-PAGE 분석은 고도로 순수하고 98% 단량체보다 더 큰 물질을 나타내었다. 엔도톡신은 ㎎ 당 0.1Eu 미만이었다.
이 실험에서, 대규모 항체 배취의 효능을 현재 더 소규모의 배취와 비교하였다. 재조합 인간 테나신-C FBG(1μM)를 RT에서 30분 동안 MAb C3(1, 0.2 및 0.04μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(1μM)과 함께 사전 인큐베이션시킨 후에, 인간 M2 대식세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n=1, Ico = 실험실 규모 Lon= 대규모 물질. 이 실험은 항체의 배취가 둘 다 FBG-유도 사이토카인 합성 감소에서 동일한 효능을 나타낸다는 것을 나타내며, 즉, 결과는 집단과 상관없이 일정하다.
실시예 15 - 단클론성 항체 C3(165_13_C3)은 인간 TNC- FBG로 자극한 RA 활액 섬유아세포에 의한 전염증 사이토카인의 생성을 감소시킨다.
활액 섬유아세포는 RA에서 전염증 사이토카인 방출의 중요한 공급원일 수 있다는 것이 보고되었고(R Bucala et al. (1991) Constitutive Production of Mitogenic and Inflammatory Cytokines by Rheumatoid Synovial Fibroblasts. J. Exp. Med. 173:569-574), 따라서 C3 항체가 또한 대식세포에서와 같이 FBG-유도 사이토카인 방출에 대해 유사한 효과를 나타내었는지의 여부를 시험하였다.
인간 RA 섬유아세포를 0.5㎎/㎖ 리버라제(로슈(Roche)) 및 0.2㎎/㎖ DNase(로슈)를 함유하는 RPMI(론자(Lonza))에서 조직의 분해에 의해 공여자 RA 활액 조직 밖에서 성장시키고, 37℃에서 1 내지 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 얻어진 조직을 200㎛ 나일론 메쉬를 통해 피펫팅하고 나서; 메쉬를 통과하지 않은 물질을 10% FBS(라이프 테크놀로지즈) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(라이프 테크놀로지즈)와 함께 RPMI를 함유하는 페트리 접시에 넣고, 37℃에서 5일 동안 인큐베이션시켰다. 5일 후에, 활액 섬유아세포를 조직 밖에서 성장시키고, 남아있는 조직을 RA 활액 섬유아세포(RASF) 배양물로부터 제거하였는데, 이는 후속적으로 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(론자)에서 유지하였다. 이 실험을 위해, RASF를 1x104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 재조합 인간 TNC-FBG(1μM)를 MAb C3(1, 0.2 및 0.04μM) 또는 아이소타입 대조군 MAb(1μM)와 함께 RT에서 30분 동안 사전 인큐베이션시킨 후에 활액 섬유아세포 배양물에 대해 3회 중복해서 첨가하였다. 24시간 후에, 상청액을 취하고 나서 사이토카인 ELISA를 실시하였다. n= 1, 평균 및 SEM을 나타냄(도 19 참조).
이들 결과는 RA 활액 섬유아세포에서 C3이 FBG 유도된 전염증 사이토카인 방출 (IL-8과 IL-6 둘 다)을 감소시키는 작용을 한다는 것을 나타내는데, 이것이 염증 RA 관절에서 발견된 다중 세포 유형에서 잠재적 메커니즘이라는 것을 보여준다.
실시예 16 - 래트 모델에서 테나신 -C의 수준.
마우스와 래트 CIA(콜라겐-유도 관절염) 모델 둘 다에서 테나신-C의 발현을 확인하였고, 질환 활성은 임상 스코어와 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
도 20은 두 별개의 CIA 연구(KWS)의 결론에서 래트 뒷발로부터 세척한 활액 유체 중의 테나신-C 수준을 측정하는 실험 결과를 나타낸다. 테나신-C 수준을 ELISA(IBL, 거대(FN III-B) 키트)에 의해 측정하였다. 이어서, 측정한 TNC 수준은 KWS에 의해 표시한 발과 관련된 임상 스코어와 상관관계가 있었다. 이 실험은 발에 대한 임상 스코어가 더 높을수록, 해당 발로부터의 활액에서 보이는 TNC 수준이 더 높다는 것을 나타낸다. 이는 래트 CIA 모델이 C3 항체의 시험을 위한 양호한 모델이라는 것을 나타낸다.
실시예 17 - 콜라겐-유도 관절염의 래트 모델에서 C3 항체의 평가
IgG4 C3(165_13_C3)을 표준 래트 콜라겐 유도 관절염 모델에서 치료적 활성에 대해 시험하였다. 성체 수컷 루이스 래트를 무작위로 실험군에 할당하였고, 1주 동안 적응시켰다. 제0일에, 동물에 등 아래 부분에서 진피내 주사에 의해 불완전 프로인트 애주번트(CII/IFA) 중의 II형 소 콜라겐의 500㎕의 1㎎/㎖ 에멀전을 투여하였다. 제7일에, 동물은 CII/IFA의 제2 주사를 받았다. 주사는 기체(아이소플루란) 마취 하에 수행하였다. 이하의 표 14에 나타낸 투여 스케줄에 따라 치료를 투여하였다.
투여 스케줄
그룹 치료 용량 경로 요법 질환 유도
1 비히클(0.9% NaCl) n/a IV 1주 2회*, 제0일 내지 종료 제0일, 제7일: CII/IFA, ID
2 대조군 IgG4 1 10㎎/㎏ IV
3 IgG4 165_13_C3 1㎎/㎏ IV
4 IgG4 165_13_C3 3㎎/㎏ IV
5 IgG4 165_13_C3 10㎎/㎏ IV
1 완전 인간 IgG4 아이소타입 대조군, 전임상 등급, (ET904, 유레카 쎄라퓨틱스), n/a: 해당 없음, IV: 정맥내 주사, ID: 진피내 주사, CII/IFA: II형 콜라겐 및 불완전 프로인트 애주번트 에멀전, * 제0일, 제3일, 제7일, 제10일, 제14일, 제17일, 제21일 및 제24일
실험의 마지막까지 제7일로부터, 동물을 치료에 대해 맹검인 실험자에 의해 관절염의 임상 징후에 대해 주 당 3회로 스코어링하였다. 제0일, 제14일, 제21일 및 제28일에, 치료에 대해 맹검인 실험자에 의해 체적변동유량계를 이용하여 발 용적을 측정하였다.
결과
비특이적 임상 관찰
제0일로부터 실험의 마지막까지, 동물을 매일 비정상적 자세(구부림), 비정상적 모질 상태(털세움) 및 비정상적 활동 수준(감소 또는 증가된 활성)을 포함하기 위한 비특이적 임상 징후에 대해 매일 확인하였다. 그룹 6(ID #6.9, 항체 10㎎/㎏-처리)에서 하나의 동물은 제21일에 아이소플루란 마취에서 회복되지 않았다. 동물은 비정상적 자세, 비정상적 모질 상태 및 비정상적 활성 수준과 같은 임의의 비특정 임상 징후를 나타내지 않았다. 그룹 1(ID #1.10, 비히클-처리)에서 한 마리의 동물은 관절염의 임상 징후의 중증도에 기인하여 실험의 마지막 전에 제22일에 도태시켰다.
임상 스코어
제7일로부터 실험의 종료까지, 동물을 앞발 및 뒷발 부종을 포함하기 위한 관절염의 임상 징후에 대해 주 당 3회 스코어링하였다. 실험자는 치료에 대해 맹검이었다. 각각의 사지를 5점 규모로 스코어링하였다: (0) 종창 없음, (1) 약간의 종창 및/또는 홍반, (2) 경증의 종창, (3) 중등증 종창 및 (4) 중증 종창 및/또는 관절 경직. 각각의 사지의 스코어를 첨가함으로써 각각의 동물에 대해 임상 스코어를 계산하였다. 도 21에서 제공한 데이터를 그래프화하고(각각의 실험군에 대해 평균 ± SEM), 2원 ANOVA 다음에, 실험군 사이의 다중 비교에 대한 던넷 사후 검정에 의해 분석하였다. 비히클 처리 동물 #1.10에 대한 마지막 기록 스코어를 제22일 후에 사용하였다. 동물 #6.9로부터 기록된 데이터를 분석으로부터 제외하였다. 비히클-처리군에서 임상 스코어는 제7일까지 측정한 임상 스코어에 비교할 때 제17일로부터 제28일에 실험의 종료까지 유의하게 증가되었다(p < 0.0001). 대조군 IgG4 및 IgG4 C3 1㎎/㎖ 용량 그룹은 제7일과 제28일의 실험 종료 사이의 비히클-처리군에 비교할 때 임의의 유의한 차이를 유도하지 않았다. 3㎎/㎏에서 투여한 IgG4 C3은 제24일의 비히클-처리군에 비교할 때, 임상 스코어의 상당한 감소를 유도하였다(p < 0.01). 10㎎/㎏에 투여한 IgG4 C3은 제28일에 실험의 마지막까지 제22일의 비히클 처리군에 비교할 때 임상 스코어의 상당한 감소를 유도하였다(p < 0.01).
발 용적
제0일, 제14일, 제21일 및 제28일에, 체적변동유량계(배수 장치)를 이용하여 뒷발 용적을 측정하였다. 기체(아이소플루란) 마취 하에 측정을 수행하였다. 실험자는 치료에 대해 맹검이었다. 각각의 실험일에 각각의 동물로부터의 오른쪽 및 왼쪽 뒷발 용적을 평균하였다. 도 22는 그래프 데이터를 나타낸다(각각의 실험군에 대해 평균 ± SEM). 데이터는 실험군 사이의 다중 비교를 위해 2원 ANOVA 다음에, 던넷(사후검정)에 의해 분석하였다. 비히클-처리 동물 #1.10에 대한 마지막 기록값을 제28일에 사용하였다. 동물 #6.9로부터 기록한 데이터는 분석으로부터 제외하였다.
비히클-처리군에서 측정한 발 용적은 제0일에 측정한 발 용적에 비교할 때 제14일로부터 제28일에 실험의 종료까지 유의하게 증가되었다(제14일에 p < 0.01, 제21일 및 제28일에 p < 0.0001). 대조군 IgG4 및 1㎎/㎏ IgG4 C3 용량 그룹은 제0일과 제28일 사이의 비히클 처리군에 비교할 때 뒷발 용적에서 임의의 차이를 유도하지 않았다. 3㎎/㎏으로 투여한 IgG4 C3은 제28일의 비히클-처리군에 비교할 때 뒷발 용적의 상당한 감소를 유도하였다(p < 0.01). 10㎎/㎏로 투여한 IgG4 C3는 제21일(p < 0.05) 및 제28일 (p < 0.01)에 비히클-처리군에 비교할 때 뒷발 용적의 상당한 감소를 유도하였다.
결론
시험 항체, IgG4 C3(165_13_C3)은 3㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏으로 투여할 때, 임상 징후의 중증도를 상당히 감소시켰다.
참고문헌
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Figure 112017016707328-pct00088
Figure 112017016707328-pct00089
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본 발명의 실시형태를 이제 다음의 넘버링한 단락에서 기재할 것이다:
1. 테나신-C의 FBG 도메인에 결합할 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 1 내지 8, 48 내지 91 및 112 내지 114로부터 선택된 하나 이상의 서열로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 5, 9 내지 15, 30 내지 47 및 115 내지 118로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 5, 13, 16 내지 21 및 119 내지 121로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 22 내지 29 및 122 내지 123으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
2. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 1 내지 3, 5 내지 7, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90 및 114로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열; 및/또는 서열번호 9 내지 11, 5, 13 내지 14, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 116 및 118로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열; 및/또는 서열번호 16 내지 18, 5, 13, 20 및 121로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열; 및/또는 서열번호 22 내지 24 및 26 내지 28로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 3, 7, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 및 90으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 11, 14, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 46으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 18 및 20으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 24 및 28로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
4. 단락 3에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 3, 54, 66 및 70으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 7, 76, 88 및 90으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열; 및/또는 서열번호 11, 30, 34 및 36으로부터 선택된 하나 이상의 CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
5. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 3, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 3, 54, 66 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 3 및 54로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
6. 단락 1 또는 단락 5에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 7, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열; 서열번호 7, 76, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열; 또는 서열번호 7의 VL CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
7. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 4 또는 112의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하되, 상기 VH 서열은 서열번호 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 54, 66 및 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 54의 VH CDR3 서열로 대체된 CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
8. 단락 1 또는 단락 7에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 8 또는 113의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하되, 상기 VL 서열은 서열번호 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열; 또는 서열번호 76, 88 및 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열로 대체된 CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
9. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 11, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 46으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 11, 30, 34 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 11, 30 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
10. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 15 또는 117의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
11. 단락 1 또는 단락 10에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 12 또는 115의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하되, 상기 VH 서열은 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 46으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 서열번호 30, 34 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 30 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열로 대체된 CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
12. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 7의 VL CDR3 서열 및 서열번호 3 및 48 내지 70으로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 3의 VH CDR3 서열 및 서열번호 7 및 72 내지 90으로부터 선택된 VL CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 14의 VL CDR3 서열 및 서열번호 11 및 30 내지 46으로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 18의 VH CDR3 서열 및 서열번호 20의 VL CDR3 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 24의 VH CDR3 서열 및 서열번호 28의 VL CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
13. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 1 내지 3, 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 48 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 50 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 52 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 54 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 56 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 58 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 60 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 62 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 64 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 66 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 68 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1, 2, 70 및 5 내지 7로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 72로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5 내지 6 및 74로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 76으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 78로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 80으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 82로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 84로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 86으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 및 88로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 6 내지 90으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 1 내지 3, 5, 7 및 114로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9 내지 11 및 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 30, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 32, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 34, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 36, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 38, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 40, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 42, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 44, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 10, 46, 5, 13 및 14로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 9, 11, 116, 5, 14 및 118로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 16 내지 18 및 5, 13 및 20으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 16 내지 18 및 5, 121 및 20으로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열; 또는 서열번호 22 내지 24 및 26 내지 28로부터 선택된 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
14. 단락 3에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 3 및 54로부터 선택된 VH CDR3 서열; 또는 서열번호 11, 30 및 36으로부터 선택된 VH CDR3 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
15. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열번호 4, 8, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 112 및 113으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 12, 15, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 115 및 117로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 19, 21, 119 및 120으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및/또는 서열번호 25, 29, 122 및 123으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 VH 및/또는 VL 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
16. 단락 15에 있어서, 상기 VH 서열은 서열번호 4, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 및 112로부터 선택되고/되거나; 서열번호 12, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 115로부터 선택되고/되거나; 서열번호 19 및 119로부터 선택되고/되거나; 서열번호 25 및 122로부터 선택된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
17. 단락 15 또는 단락 16에 있어서, 상기 VL 서열은 서열번호 8, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 및 113으로부터 선택되고/되거나; 서열번호 15 및 117로부터 선택되고/되거나; 서열번호 21 및 120으로부터 선택되고/되거나; 서열번호 29 및 123으로부터 선택된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
18. 단락 1에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 서열쌍: 서열번호 4와 8; 서열번호 49와 8; 서열번호 51과 8; 서열번호 53과 8; 서열번호 55와 8; 서열번호 57과 8; 서열번호 59와 8; 서열번호 61과 8; 서열번호 63과 8; 서열번호 65와 8; 서열번호 67과 8; 서열번호 69와 8; 서열번호 71과 8; 서열번호 112와 8; 서열번호 4와 113; 서열번호 49와 113; 서열번호 51과 113; 서열번호 53과 113; 서열번호 55와 113; 서열번호 57과 113; 서열번호 59와 113; 서열번호 61과 113; 서열번호 63과 113; 서열번호 65 및 113; 서열번호 67과 113; 서열번호 69와 113; 서열번호 71과 113; 서열번호 4와 73; 서열번호 4와 75; 서열번호 4와 77; 서열번호 4와 79; 서열번호 4와 81; 서열번호 4와 83; 서열번호 4와 85; 서열번호 4와 87; 서열번호 4와 89; 서열번호 4와 91; 서열번호 112와 73; 서열번호 112와 75; 서열번호 112와 77; 서열번호 112와 79; 서열번호 112와 81; 서열번호 112와 83; 서열번호 112와 85; 서열번호 112와 87; 서열번호 112와 89; 서열번호 112와 91; 서열번호 112와 113으로부터 선택된; 또는 서열쌍: 서열번호 12와 15; 서열번호 31 및 15; 서열번호 33과 15; 서열번호 35와 15; 서열번호 37과 15; 서열번호 39와 15; 서열번호 41과 15; 서열번호 43과 15; 서열번호 45 및 15; 서열번호 47과 15; 서열번호 115 및 15; 서열번호 12와 117; 서열번호 31과 117; 서열번호 33과 117; 서열번호 35 및 117; 서열번호 37과 117; 서열번호 39와 117; 서열번호 41과 117; 서열번호 43과 117; 서열번호 45와 117; 서열번호 47과 117; 및 서열번호 115와 117로부터 선택된; 또는 서열번호 19와 21; 서열번호 19와 120; 서열번호 119와 21; 및 서열번호 119와 120으로부터 선택된; 또는 서열쌍: 서열번호 25와 29; 서열번호 25와 123; 서열번호 122와 29; 및 서열번호 122와 123으로부터 선택된, VH 및 VL 서열쌍의 서열을 포함하는 VH와 VL을 둘 다 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
19. 단락 1에 이어서, 서열번호 4, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 및 112로부터 선택된 VH 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
20. 단락 1 또는 단락 19에 있어서, 서열번호 8, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 및 113으로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
21. 단락 1 또는 단락 20에 이어서, 서열번호 4 또는 112의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
22. 단락 1에 있어서, 서열번호 55의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
23. 단락 1에 있어서, 서열번호 12, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 115로부터 선택된 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
24. 단락 1에 있어서, 서열번호 12 또는 115의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
25. 단락 1에 있어서, 서열번호 31의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
26. 단락 1에 있어서, 서열번호 37의 서열을 포함하는 VH 서열을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
27. 단락 19 또는 단락 21 내지 단락 22에 있어서, 서열번호 8 또는 113의 서열을 포함하는 VL 서열을 추가적으로 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
28. 단락 23 내지 단락 26 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 15 또는 117의 서열을 포함하는 VL 서열을 추가로 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
29. 단락 1에 있어서, 서열번호 37의 서열을 포함하는 VH 서열; 및 서열번호 15의 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
30. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 다클론성 또는 단클론성 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체인, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
31. 단락 30에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 Fv 단편, scFv 단편, Fab, 단일 가변 도메인 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
32. 단락 1 내지 단락 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 인간화된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
33. 단락 1 내지 단락 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 이의 테나신-C 또는 도메인에 대해 특이성을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
34. 단락 33에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 상기 테나신-C의 FBG 도메인에 대한 특이성을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
35. 단락 34에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 FBG 도메인의 활성을 중화시키는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
36. 단락 1 내지 단락 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 테나신-C는 시트룰린화된 테나신-C인, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
37. 단락 36에 있어서, 상기 시트룰린화된 테나신-C은 FBG 도메인에서 시트룰린화된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
38. 단락 37에 있어서, 상기 시트룰린화된 테나신-C는 FBG 도메인에서만 시트룰린화된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
39. 단락 1 내지 단락 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 만성 염증 반응의 조절을 위한, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
40. 단락 39에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 생물학적 활성을 조절하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
41. 단락 40에 있어서, 상기 제제는 테나신-C의 전사, 번역 및/또는 결합 특성을 변경시킴으로써 테나신-C의 생물학적 활성을 조절하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
42. 단락 1 내지 단락 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 생물학적 활성을 하향조절하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
43. 단락 1 내지 단락 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 생물학적 활성을 상향조절하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
44. 단락 1 내지 단락 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 전사, 번역 및/또는 결합 특성의 저해제인, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
45. 단락 1 내지 단락 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체는 테나신-C의 경쟁적 결합 저해제인, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체.
46. 단락 1 내지 단락 45 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 조성물.
47. 단락 46에 있어서, 적어도 하나의 다른 제제를 더 포함하는, 조성물.
48. 단락 47에 있어서, 적어도 하나의 다른 제제는 항-염증제, 스타틴, 생물학적 제제(생물 제제), 면역억제제, 살리실레이트 및/또는 살균제인, 조성물.
49. 단락 48에 있어서, 상기 항-염증제는 비스테로이드성 항-염증제(NSAID), 코티코스테로이드, 질환 진행을 막는 항류마티스 제제(DMARD) 또는 면역억제제로 이루어진 군으로부터 선택된, 조성물.
50. 의약으로서 사용하기 위한 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물.
51. 만성 염증성 병태의 치료에서 사용하기 위한 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물.
52. 만성 염증성 병태의 치료 또는 진단을 위한 의약의 제조에서 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물의 용도.
53. 대상체에게 유효량의 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 만성 염증성 병태의 치료방법.
54. 만성 염증성 병태의 진단에서 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후 결정에서 사용하기 위한 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물.
55. 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물을 이용하여 테나신-C의 FBG 도메인의 존재 또는 부재 또는 양을 검출하는 단계를 포함하는, 만성 염증성 병태의 진단 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후 결정 방법.
56. 단락 54 또는 단락 55에 있어서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인 양의 증가는 만성 염증성 병태 결정 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후를 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 방법.
57. 단락 56에 있어서, 정상 수준에 비교한 검출된 테나신-C의 FBG 도메인 양의 적어도 50% 증가는 만성 염증성 병태 결정 및/또는 만성 염증성 병태를 지니는 환자의 예후를 나타내는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 방법.
58. 개체에 대한 적절한 치료를 결정함에 있어서 사용하기 위한 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물로서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양은 개체에 대한 적절한 치료를 나타내는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물.
59. 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물을 이용하여 테나신-C의 FBG 도메인 의 존재 또는 부재 또는 양을 검출하는 단계를 포함하는 개체에 대해 적절한 치료를 결정하는 방법으로서, 상기 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 양은 개체에 대한 적절한 치료를 나타내는, 방법.
60. 단락 58 또는 단락 59에 있어서, 상기 적절한 치료는 유효량의 제제 또는 조성물의 투여를 포함하되, 상기 제제 또는 조성물은 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물; DMARDS(예컨대 메토트렉세이트); 항-TNF 약물; 항-IL17 치료법; T-세포 공자극 조절제(예컨대 오렌시카(Orencia)(상표명) - 아바타셉트): 인터류킨-6(IL-6) 저해제(예컨대 악템라(Actemra)(상표명) - 토실리주맙); 항-CD20 항체(예컨대 리툭산(Rituxan)(상표명) - 리툭수맙; B 세포 활성화인자(예컨대 항-BAFF); 야누스 키나제의 저해제(JAK)(예컨대 토팍시티닙(Tofacitinib)(상표명)); 비장 타이로신 키나제의 저해제(Syk)(예컨대 포스타마티닙(포스타마티닙)(상표명)); 시트룰린화된 테나신-C 도메인에 대한 항TNC 항체 또는 항체; 및/또는 시트룰린화된 및/또는 비시트룰린화된 테나신-C의 생물학적 활성을 조절하는 제제 중 하나 이상일 수 있는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
61. 단락 58 내지 단락 60에 있어서, 상기 적절한 치료는 상기 테나신-C의 FBG 도메인을 표적화하는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
62. 단락 58 내지 단락 61에 있어서, 상기 적절한 치료는 유효량의 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 또는 조성물의 투여인, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
63. 단락 58 내지 단락 62에 있어서, 상기 개체는 만성 염증성 병태를 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
64. 단락 58 내지 단락 63에 있어서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인의 증가는 적절한 치료를 나타내는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
65. 단락 64에 있어서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인 양의 증가는 증가된 양의 적절한 치료가 필요하다는 것을 나타내는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
66. 단락 64 또는 단락 65에 있어서, 검출된 테나신-C의 FBG 도메인 양의 증가는 테나신-C의 FBG 도메인의 정상 수준에 비해 적어도 50%의 증가인, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
67. 단락 56 내지 단락 66에 있어서, 테나신-C의 FBG 도메인의 양은 면역분석법; 분광분석법; 웨스턴 블롯; ELISA; 면역침강법; 슬롯 또는 도트 블롯 분석; 등전위 초점법; SDS-PAGE; 항체 마이크로어레이; 면역 조직학적 염색; 방사면역측정법(RIA), 플루오로면역분석법; 및/또는 아비딘-바이오틴 및/또는 스트렙토아비딘-바이오틴 시스템을 이용하는 면역분석법 중 하나 이상의 사용에 의해 결정되는, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물 또는 방법.
68. 단락 51 내지 단락 67에 있어서, 상기 만성 염증 반응은 부적절한 염증을 특징으로 하는 병태와 관련된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 조성물, 용도 또는 방법.
69. 단락 51 내지 단락 67에 있어서, 상기 만성 염증 반응은 류마티스 관절염(RA), 자가면역 질환, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염을 포함), 비치유 상처, 다발성 경화증, 암, 죽상동맥경화증, 쇼그렌병, 당뇨병, 홍반성 낭창(전신 홍반성 낭창을 포함), 천식, 섬유성 질환(간경변증을 포함), 폐 섬유증, UV 손상, 건선, 강직성 척추염 및 심혈관 질환과 관련된, 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체, 조성물, 용도 또는 방법.
70. 하기를 포함하는 부품의 키트:
(i) 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물;
(ii) 투여 수단; 및
(iii) 사용 설명서.
71. 단락 70에 있어서, 선택적으로 하기를 포함하는 부품의 키트:
(iv) 적어도 1종의 다른 제제.
72. 하기를 포함하는, 대상체의 만성 염증성 병태 상태를 결정함에 있어서 사용하기 위한 부품의 키트:
(i) 단락 1 내지 단락 49에 나타낸 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편, 이의 유도체 또는 변이체 또는 조성물; 및
(ii) 사용 설명서.
본 명세서에 기재된 본 명세서의 바람직한 실시형태에 대한 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 명확할 것이라는 것이 이해되어야 한다. 이러한 변화 및 변형은 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나는 일 없이 그리고 그의 의도된 이점을 감소시키는 일 없이 이루어질 수 있다. 따라서 이러한 변화 및 변형을 다음의 청구범위에 의해 아우르는 것으로 의도한다.
SEQUENCE LISTING <110> Nascient Limited <120> ANTI-TENASCIN C ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> WO/2016/020702 <140> PCT/GB2015/052298 <141> 2015-08-07 <150> GB - 1414021.4 <151> 2014-08-07 <160> 159 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 2A5 VH CDR1 <400> 1 Glu Leu Ser Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 2A5 VH CDR2 <400> 2 Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 2A5 VH CDR3 <400> 3 Ala Gln Lys Glu Thr Tyr Ala Leu Thr Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antibody 2A5 VH amino acid sequence <400> 4 Glu Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala 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<210> 93 <211> 228 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Amino acid sequence of mouse tenascin-C FBG domain <400> 93 Ile Gly Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Arg Asp Cys Ser Gln Ala Met Leu 1 5 10 15 Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Gly Asp 20 25 30 Lys Thr Gln Ala Leu Glu Val Tyr Cys Asp Met Thr Ser Asp Gly Gly 35 40 45 Gly Trp Ile Val Phe Leu Arg Arg Lys Asn Gly Arg Glu Asp Phe Tyr 50 55 60 Arg Asn Trp Lys Ala Tyr Ala Ala Gly Phe Gly Asp Arg Arg Glu Glu 65 70 75 80 Phe Trp Leu Gly Leu Asp Asn Leu Ser Lys Ile Thr Ala Gln Gly Gln 85 90 95 Tyr Glu Leu Arg Val Asp Leu Gln Asp His Gly Glu Ser Ala Tyr Ala 100 105 110 Val Tyr Asp Arg Phe Ser Val Gly Asp Ala Lys Ser Arg Tyr Lys Leu 115 120 125 Lys Val Glu Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met Asn Tyr His 130 135 140 Asn Gly Arg Ser Phe Ser Thr Tyr Asp Lys Asp Thr Asp Ser Ala Ile 145 150 155 160 Thr Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe Trp Tyr Lys Asn Cys 165 170 175 His Arg Val Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp Asn Asn 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acacagtgga tggggaaaac cagattgtct 660 tcacacatcg catcaacatc ccccgccggg cctgtggctg tgccgcagcc cctgatgtta 720 aggagctgct gagcagactg gaggagctgg agaacctggt gtcttccctg agggagcaat 780 gtactgcagg agcaggctgc tgtctccagc ctgccacagg ccgcttggac accaggccct 840 tctgtagcgg tcggggcaac ttcagcactg aaggatgtgg ctgtgtctgc gaacctggct 900 ggaaaggccc caactgctct gagcccgaat gtccaggcaa ctgtcacctt cgaggccggt 960 gcattgatgg gcagtgcatc tgtgacgacg gcttcacggg cgaggactgc agccagctgg 1020 cttgccccag cgactgcaat gaccagggca agtgcgtaaa tggagtctgc atctgtttcg 1080 aaggctacgc cggggctgac tgcagccgtg aaatctgccc agtgccctgc agtgaggagc 1140 acggcacatg tgtagatggc ttgtgtgtgt gccacgatgg ctttgcaggc gatgactgca 1200 acaagcctct gtgtctcaac aattgctaca accgtggacg atgcgtggag aatgagtgcg 1260 tgtgtgatga gggtttcacg ggcgaagact gcagtgagct catctgcccc aatgactgct 1320 tcgaccgggg ccgctgcatc aatggcacct gctactgcga agaaggcttc acaggtgaag 1380 actgcgggaa acccacctgc ccacatgcct gccacaccca gggccggtgt gaggaggggc 1440 agtgtgtatg tgatgagggc tttgccggtg tggactgcag cgagaagagg tgtcctgctg 1500 actgtcacaa tcgtggccgc tgtgtagacg ggcggtgtga gtgtgatgat ggtttcactg 1560 gagctgactg tggggagctc aagtgtccca atggctgcag tggccatggc cgctgtgtca 1620 atgggcagtg tgtgtgtgat gagggctata ctggggagga ctgcagccag ctacggtgcc 1680 ccaatgactg tcacagtcgg ggccgctgtg tcgagggcaa atgtgtatgt gagcaaggct 1740 tcaagggcta tgactgcagt gacatgagct gccctaatga ctgtcaccag cacggccgct 1800 gtgtgaatgg catgtgtgtt tgtgatgacg gctacacagg ggaagactgc cgggatcgcc 1860 aatgccccag ggactgcagc aacaggggcc tctgtgtgga cggacagtgc gtctgtgagg 1920 acggcttcac cggccctgac tgtgcagaac tctcctgtcc aaatgactgc catggccagg 1980 gtcgctgtgt gaatgggcag tgcgtgtgcc atgaaggatt tatgggcaaa gactgcaagg 2040 agcaaagatg tcccagtgac tgtcatggcc agggccgctg cgtggacggc cagtgcatct 2100 gccacgaggg cttcacaggc ctggactgtg gccagcactc ctgccccagt gactgcaaca 2160 acttaggaca atgcgtctcg ggccgctgca tctgcaacga gggctacagc ggagaagact 2220 gctcagaggt gtctcctccc aaagacctcg ttgtgacaga agtgacggaa gagacggtca 2280 acctggcctg ggacaatgag atgcgggtca cagagtacct tgtcgtgtac acgcccaccc 2340 acgagggtgg tctggaaatg cagttccgtg tgcctgggga ccagacgtcc accatcatcc 2400 aggagctgga gcctggtgtg gagtacttta tccgtgtatt tgccatcctg gagaacaaga 2460 agagcattcc tgtcagcgcc agggtggcca cgtacttacc tgcacctgaa ggcctgaaat 2520 tcaagtccat caaggagaca tctgtggaag tggagtggga tcctctagac attgcttttg 2580 aaacctggga gatcatcttc cggaatatga ataaagaaga tgagggagag atcaccaaaa 2640 gcctgaggag gccagagacc tcttaccggc aaactggtct agctcctggg caagagtatg 2700 agatatctct gcacatagtg aaaaacaata cccggggccc tggcctgaag agggtgacca 2760 ccacacgctt ggatgccccc agccagatcg aggtgaaaga tgtcacagac accactgcct 2820 tgatcacctg gttcaagccc ctggctgaga tcgatggcat tgagctgacc tacggcatca 2880 aagacgtgcc aggagaccgt accaccatcg atctcacaga ggacgagaac cagtactcca 2940 tcgggaacct gaagcctgac actgagtacg aggtgtccct catctcccgc agaggtgaca 3000 tgtcaagcaa cccagccaaa gagaccttca caacaggcct cgatgctccc aggaatcttc 3060 gacgtgtttc ccagacagat aacagcatca ccctggaatg gaggaatggc aaggcagcta 3120 ttgacagtta cagaattaag tatgccccca tctctggagg ggaccacgct gaggttgatg 3180 ttccaaagag ccaacaagcc acaaccaaaa ccacactcac aggtctgagg ccgggaactg 3240 aatatgggat tggagtttct gctgtgaagg aagacaagga gagcaatcca gcgaccatca 3300 acgcagccac agagttggac acgcccaagg accttcaggt ttctgaaact gcagagacca 3360 gcctgaccct gctctggaag acaccgttgg ccaaatttga ccgctaccgc ctcaattaca 3420 gtctccccac aggccagtgg gtgggagtgc agcttccaag aaacaccact tcctatgtcc 3480 tgagaggcct ggaaccagga caggagtaca atgtcctcct gacagccgag aaaggcagac 3540 acaagagcaa gcccgcacgt gtgaaggcat ccactgaaca agcccctgag ctggaaaacc 3600 tcaccgtgac tgaggttggc tgggatggcc tcagactcaa ctggaccgca gctgaccagg 3660 cctatgagca ctttatcatt caggtgcagg aggccaacaa ggtggaggca gctcggaacc 3720 tcaccgtgcc tggcagcctt cgggctgtgg acataccggg cctcaaggct gctacgcctt 3780 atacagtctc catctatggg gtgatccagg gctatagaac accagtgctc tctgctgagg 3840 cctccacagg ggaaactccc aatttgggag aggtcgtggt ggccgaggtg ggctgggatg 3900 ccctcaaact caactggact gctccagaag gggcctatga gtactttttc attcaggtgc 3960 aggaggctga cacagtagag gcagcccaga acctcaccgt cccaggagga ctgaggtcca 4020 cagacctgcc tgggctcaaa gcagccactc attataccat caccatccgc ggggtcactc 4080 aggacttcag cacaacccct ctctctgttg aagtcttgac agaggaggtt ccagatatgg 4140 gaaacctcac agtgaccgag gttagctggg atgctctcag actgaactgg accacgccag 4200 atggaaccta tgaccagttt actattcagg tccaggaggc tgaccaggtg gaagaggctc 4260 acaatctcac ggttcctggc agcctgcgtt ccatggaaat cccaggcctc agggctggca 4320 ctccttacac agtcaccctg cacggcgagg tcaggggcca cagcactcga ccccttgctg 4380 tagaggtcgt cacagaggat ctcccacagc tgggagattt agccgtgtct gaggttggct 4440 gggatggcct cagactcaac tggaccgcag ctgacaatgc ctatgagcac tttgtcattc 4500 aggtgcagga ggtcaacaaa gtggaggcag cccagaacct cacgttgcct ggcagcctca 4560 gggctgtgga catcccgggc ctcgaggctg ccacgcctta tagagtctcc atctatgggg 4620 tgatccgggg ctatagaaca ccagtactct ctgctgaggc ctccacagcc aaagaacctg 4680 aaattggaaa cttaaatgtt tctgacataa ctcccgagag cttcaatctc tcctggatgg 4740 ctaccgatgg gatcttcgag acctttacca ttgaaattat tgattccaat aggttgctgg 4800 agactgtgga atataatatc tctggtgctg aacgaactgc ccatatctca gggctacccc 4860 ctagtactga ttttattgtc tacctctctg gacttgctcc cagcatccgg accaaaacca 4920 tcagtgccac agccacgaca gaggccctgc cccttctgga aaacctaacc atttccgaca 4980 ttaatcccta cgggttcaca gtttcctgga tggcatcgga gaatgccttt gacagctttc 5040 tagtaacggt ggtggattct gggaagctgc tggaccccca ggaattcaca ctttcaggaa 5100 cccagaggaa gctggagctt agaggcctca taactggcat tggctatgag gttatggtct 5160 ctggcttcac ccaagggcat caaaccaagc ccttgagggc tgagattgtt acagaagccg 5220 aaccggaagt tgacaacctt ctggtttcag atgccacccc agacggtttc cgtctgtcct 5280 ggacagctga tgaaggggtc ttcgacaatt ttgttctcaa aatcagagat accaaaaagc 5340 agtctgagcc actggaaata accctacttg cccccgaacg taccagggac ataacaggtc 5400 tcagagaggc tactgaatac gaaattgaac tctatggaat aagcaaagga aggcgatccc 5460 agacagtcag tgctatagca acaacagcca tgggctcccc aaaggaagtc attttctcag 5520 acatcactga aaattcggct actgtcagct ggagggcacc cacagcccaa gtggagagct 5580 tccggattac ctatgtgccc attacaggag gtacaccctc catggtaact gtggacggaa 5640 ccaagactca gaccaggctg gtgaaactca tacctggcgt ggagtacctt gtcagcatca 5700 tcgccatgaa gggctttgag gaaagtgaac ctgtctcagg gtcattcacc acagctctgg 5760 atggcccatc tggcctggtg acagccaaca tcactgactc agaagccttg gccaggtggc 5820 agccagccat tgccactgtg gacagttatg tcatctccta cacaggcgag aaagtgccag 5880 aaattacacg cacggtgtcc gggaacacag tggagtatgc tctgaccgac ctcgagcctg 5940 ccacggaata cacactgaga atctttgcag agaaagggcc ccagaagagc tcaaccatca 6000 ctgccaagtt cacaacagac ctcgattctc caagagactt gactgctact gaggttcagt 6060 cggaaactgc cctccttacc tggcgacccc cccgggcatc agtcaccggt tacctgctgg 6120 tctatgaatc agtggatggc acagtcaagg aagtcattgt gggtccagat accacctcct 6180 acagcctggc agacctgagc ccatccaccc actacacagc caagatccag gcactcaatg 6240 ggcccctgag gagcaatatg atccagacca tcttcaccac aattggactc ctgtacccct 6300 tccccaagga ctgctcccaa gcaatgctga atggagacac gacctctggc ctctacacca 6360 tttatctgaa tggtgataag gctgaggcgc tggaagtctt ctgtgacatg acctctgatg 6420 ggggtggatg gattgtgttc ctgagacgca aaaacggacg cgagaacttc taccaaaact 6480 ggaaggcata tgctgctgga tttggggacc gcagagaaga attctggctt gggctggaca 6540 acctgaacaa aatcacagcc caggggcagt acgagctccg ggtggacctg cgggaccatg 6600 gggagacagc ctttgctgtc tatgacaagt tcagcgtggg agatgccaag actcgctaca 6660 agctgaaggt ggaggggtac agtgggacag caggtgactc catggcctac cacaatggca 6720 gatccttctc cacctttgac aaggacacag attcagccat caccaactgt gctctgtcct 6780 acaaaggggc tttctggtac aggaactgtc accgtgtcaa cctgatgggg agatatgggg 6840 acaataacca cagtcagggc gttaactggt tccactggaa gggccacgaa cactcaatcc 6900 agtttgctga gatgaagctg agaccaagca acttcagaaa tcttgaaggc aggcgcaaac 6960 gggcataaat tccagggacc actgggtgag agaggaataa ggcccagagc gaggaaagga 7020 ttttaccaaa gcatcaatac aaccagccca accatcggtc cacacctggg catttggtga 7080 gagtcaaagc tgaccatgga tccctggggc caacggcaac agcatgggcc tcacctcctc 7140 tgtgatttct ttctttgcac caaagacatc agtctccaac atgtttctgt tttgttgttt 7200 gattcagcaa aaatctccca gtgacaacat cgcaatagtt ttttacttct cttaggtggc 7260 tctgggaatg ggagaggggt aggatgtaca ggggtagttt gttttagaac cagccgtatt 7320 ttacatgaag ctgtataatt aattgtcatt atttttgtta gcaaagatta aatgtgtcat 7380 tggaagccat cccttttttt acatttcata caacagaaac cagaaaagca atactgtttc 7440 cattttaagg atatgattaa tattattaat ataataatga tgatgatgat gatgaaaact 7500 aaggattttt caagagatct ttctttccaa aacatttctg gacagtacct gattgtattt 7560 tttttttaaa taaaagcaca agtacttttg agtttgttaa aaaaaaaaaa aaaaaa 7616 <210> 149 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Human FBG-X primer minus" /organism="Artificial Sequence" <400> 149 ggtacctcgc gaatgcatct ag 22 <210> 150 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..58 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Human FBG-X plus" /organism="Artificial Sequence" <400> 150 ttttttccat ggcccagatt ggactcctgt accccttccc caaagattgc tctcaggc 58 <210> 151 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <222> 1..22 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Mouse FBG-X primer minus " /organism="Artificial Sequence" <400> 151 ggtacctcgc gaatgcatct 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Claims (88)

  1. CDRH1이 서열번호 9이고, CDRH2가 서열번호 10이며, CDRH3이 서열번호 11, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 46으로부터 독립적으로 선택되는 VH 영역과, CDRL1이 서열번호 5이고, CDRL2가 서열번호 13이며, CDRL3이 서열번호 14인 VL 영역을 포함하는, 테나신-C의 피브리노겐-유사 구체(fibrinogen-like globe: FBG) 도메인에 대항하는 항체 또는 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 11인, 항체 또는 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 12를 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 30인, 항체 또는 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 31을 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 32인, 항체 또는 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 33을 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 34인, 항체 또는 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 35를 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 36인, 항체 또는 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 37을 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 38인, 항체 또는 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 39를 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 40인, 항체 또는 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 41을 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  16. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 42인, 항체 또는 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 43을 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  18. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 44인, 항체 또는 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 45를 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  20. 제1항에 있어서, CDRH3은 서열번호 46인, 항체 또는 결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, 상기 VH 영역은 서열번호 47을 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  22. 제1항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 15를 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  23. 제1항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열번호 125를 포함하는, 항체 또는 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 결합 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및 희석제에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 암을 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  25. 암을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 결합 단편.
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