CN109152833B - 针对肌腱蛋白的人类抗体和其结合片段 - Google Patents

针对肌腱蛋白的人类抗体和其结合片段 Download PDF

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Abstract

本公开涉及针对肌腱蛋白、特别是肌腱蛋白的FBG结构域的完整抗体和结合片段，其可能比亲本抗体具有更低的免疫原性。本公开还涉及包含所述抗体或结合片段的组合物和其中任何一种用于诊断、预后和/或治疗病症如与慢性炎症相关的病症的用途。本公开进一步提供了制备所述抗体的方法。

Description

针对肌腱蛋白的人类抗体和其结合片段
本发明涉及对肌腱蛋白如肌腱蛋白-C的纤维蛋白原样球(fibrinogen-likeglobe；FBG)结构域具有特异性的抗体或其结合片段、包含所述抗体的组合物和其中的任一种在诊断、预后确定和/或病症治疗(例如与慢性炎症相关的病症)中的用途以及制备所述抗体的方法。
背景技术
炎症是组织对有害刺激如病原体、组织损伤或刺激物的复杂生物应答。这是组织对去除有害刺激并且启动组织愈合过程的保护性尝试。与炎症相关的异常包含一大群不相关的导致多种人类疾病的病症(炎症性病症)。具有炎症性方面的疾病的实例包括但不限于哮喘、自身免疫疾病、丝球体肾炎、过敏(过敏反应)、癌症、炎症性肠病、再灌注性损伤、类风湿性关节炎和移植排斥反应。类风湿性关节炎(RA)是慢性炎症性病况的典型实例。
Toll样受体(TLR)在驱动RA中的炎症性介质的产生和TLR功能的阻断中的关键作用可以具有显著的临床益处(综述于Brentano(2005)和O'Neill(2002)中)。此受体族构成免疫系统的组成部分。TLR通过识别病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)来介导宿主防御感染和损伤(Matzinger(2002))。DAMP是在组织损伤时产生的内源性促炎分子，并且包括从受损或坏死细胞释放的细胞内分子、在受伤时上调的细胞外基质(ECM)分子或ECM分子的片段(综述于Bianchi(2007)和Gordon(2002)中)。
激活后，TLR促进先天性和适应性免疫应答，包括刺激促炎细胞因子和MMP的表达(Medzhitov(2002))。在RA患者的滑膜组织中表达高水平的TLR(Radstake(2004)、Roelofs(2005)、Sacre(2007)和Sacre(2008))，并且保护具有TLR4中的靶向缺失或功能缺失突变(loss of function mutation)的小鼠免于实验性节炎(Choe(2003)和Lee(2005))。
肌腱蛋白-C(TNC)是与组织损伤和伤口修复有关的ECM糖蛋白。肌腱蛋白-C通常不在健康成人组织中表达，但在成人中，其在急性炎症期间特异性地且瞬时地上调而在慢性炎症中持续地表达(综述于Chiquet-Ehrismann(2003)中)。免疫组织化学研究表明，低水平肌腱蛋白-C表达于正常人关节中但在RA滑膜中、在具有炎症和纤维化的区域中(尤其在滑膜衬里下)、在侵入性血管翳(invading pannus)中和血管周围其表达水平大幅提高(Cutolo(1992)、MacCachren(1992)和Salter(1993))。来自RA患者的滑液中(Chevalier(1994)和Hasegawa(2007))和RA软骨中(Salter(1993)和Chevalier(1994))的肌腱蛋白-C水平也显著提高。
肌腱蛋白-C是150万道尔顿大六聚体蛋白。每条链包含不同的结构域，包括装配结构域(TA)、EGF样重复序列(EGF-L)、纤连蛋白III型样重复序列(TNIII)和纤维蛋白原样球(FBG)(综述于Orend(2005)中)。肌腱蛋白-C和其结构域的序列如图9所示。
肌腱蛋白-C已被证明是TLR4的内源性激活剂，并且已经证实此分子是破坏性关节炎症所必需的(WO2010/103289)。肌腱蛋白-C被证明能够激活关节中的细胞，并且肌腱蛋白-C的主要活性结构域已定位于纤维蛋白原样球(FBG)、所述分子的C末端处的227氨基酸(26.9kDa)球状结构域。(Siri(1991))。
向来自RA患者的滑膜培养物中添加FBG增强了促炎细胞因子的自发释放。它还通过激活TLR4和MyD88依赖性信号传导途径来刺激初级人类巨噬细胞中的TNF-α、IL-6和IL-8与RA滑膜成纤维细胞中的IL-6的合成。
已经表明，与LPS的情况一样，TLR4表达对于FBG诱导细胞因子合成是必需的。然而，与LPS不同，CD14和MD-2似乎都不是TLR-4激活所必需的。CD14对于其它配体激活TLR4是不必要的。不需要TLR4以MyD88依赖性方式应答脂质A(Jiang(2005))，即使在缺乏CD14(Gondokaryono(2007))的情况下纤连蛋白EDA(额外结构域A)也可以激活肥大细胞，并且透明质酸激活人类单核细胞THP-1细胞需要TLR4、CD44和MD-2但无CD14的复合物(Taylor(2007))。
每种TLR4配体形成不同的受体复合物可以促进不同细胞内衔接分子/信号传导分子的募集。这可能是我们用FBG和LPS观察到的差异细胞应答的原因。类似地，TLR4和CD44复合物的透明质酸激活诱导小鼠肺泡巨噬细胞系中的与LPS不同的基因表达模式(Taylor(2007))。
紧密调节的肌腱蛋白-C表达模式使其成为治疗慢性炎症的有吸引力的靶标。其主要不存在于健康成人中，然而在组织损伤时特异性地诱导了表达。在急性炎症期间，瞬时地表达了肌腱蛋白-C：诱导通常在炎症之前发生，并且在炎症消退时组织中已不存在mRNA和蛋白质(综述于Chiquet-Ehrismann(2003)中)。
现在已证实肌腱蛋白-C的持续表达与慢性炎症有关。除了RA，在其它自身免疫疾病包括多发性硬化中(Gutowski(1999))和斯耶格伦氏病(Sjogrens disease)(Amin(2001))和在非愈合性伤口和糖尿病性溃疡以及静脉性溃疡中(Loots(1998))观察到提高的肌腱蛋白-C水平。肌腱蛋白-C的从头合成与口腔粘膜疾病中的炎症强度密切相关，并且肌腱蛋白-C的血浆水平是药物或手术前后炎症性肠病的活动的可靠指标(综述于Chiquet-Ehrismann中(2003))。
WO2010/103289描述了用于调节慢性炎症应答的药剂的用途，其中所述药剂调节肌腱蛋白-C的生物活性和其在治疗与慢性炎症相关的病况中的用途。
Clark等人。(1997)(52)描述了对FBG结构域具有特异性的鼠抗体，其干扰“淋巴细胞滚动(lymphocyte rolling)”。后者被认为是细胞迁移的量度并且与细胞活化和炎症性细胞因子产生无关。
本发明人设计了适合用于疗法的具有特性的抗体和其片段，特别是人类抗体，其对肌腱蛋白-C的纤维蛋白原样球(FBG)结构域具有非常高的亲和力，并且其中和了FBG的生物活性。这些高亲和力抗体可用于多种治疗方法，如在诊断或治疗肌腱蛋白-C相关病症中使用抗FBG抗体分子的治疗方法，特别是与慢性炎症相关的包括类风湿性关节炎(RA)的治疗方法。所述抗体也可用于相关的诊断和预后方法。所述抗体公开于WO2016/020702,中，其以引用的方式并入本文中。此申请公开了衍生出抗体165_12_C3(本文称为C3)的抗体B12。
发明内容
本公开涉及一种修饰抗体或其称为C3*的结合片段，其中潜在的T细胞表位已经从轻链构架中去除以降低免疫原性，以及包含轻链中的所述修饰的B12抗体的变体。
因此提供：
1.一种对肌腱蛋白具有特异性(例如对肌腱蛋白C具有特异性)的抗体或结合片段，其包含SEQ ID NO:22或23，特别是SEQ ID NO:22中所示的序列。
2.根据段落1所述的抗体或结合片段，其进一步包含具有SEQ ID NO:3的CDRH1、SEQ ID NO:4的CDRH2和独立地选自SEQ ID NO:5、12、14、16、18、24、26、28、30和32或其变体的CDRH3的VH，其中VH和VL的CDR中的多达5个氨基酸发生变化。
3.根据段落1或2所述的抗体或结合片段，其包含选自SEQ ID NO:6、13、15、17、19、21、25、27、29、31、33的VH和其变体，其中所述序列中的多达5个氨基酸发生变化。
4.根据段落1到3中任一段所述的抗体或结合片段，其是Fab或Fab'片段。
5.根据段落1到3中任一段所述的抗体或结合片段，其是全长抗体。
6.根据段落5所述的抗体或结合片段，其中重链具有如SEQ ID NO:1中所示的序列。
7.根据段落5或6所述的抗体或结合片段，其中所述重链具有如SEQ ID NO:2中所示的序列。
8.一种包含根据段落1到7中任一段所述的抗体或结合片段的药物组合物。
9.根据段落1到7中任一段所述的抗体或结合片段或根据段落8所述的药物组合物，其都用于治疗。
10.根据段落9所述的以供使用的抗体、结合片段或组合物，其中所述用途是用于治疗炎症性病症，例如慢性炎症性病症，例如本文所公开的病症，如类风湿性关节炎。
11.根据段落1到7中任一段所述的抗体或结合片段或根据段落8所述的药物组合物，其都用于制备用于治疗慢性炎症应答例如本文所公开的病症如类风湿性关节炎的药剂。
12.一种治疗方法，其包含施用治疗有效量的根据段落1到7中任一段所述的抗体或结合片段或根据段落8所述的药物组合物。
13.根据段落12所述的方法，其中所述治疗是用于炎症性病症，例如慢性炎症性病症，如类风湿性关节炎。
14.一种编码根据段落1到7中任一段所述的抗体或结合片段的多核苷酸。
15.一种包含根据段落13所述的多核苷酸的载体。
16.一种宿主细胞(例如哺乳动物细胞)，其包含根据段落12所述的多核苷酸或根据段落13所述的载体。
17.一种生产(制备)本公开的抗体或结合片段的方法，其包含培养如段落16中所定义的宿主细胞以表达所述抗体或结合片段的步骤。
因此提供了对肌腱蛋白具有特异性的抗体或结合片段(例如对肌腱蛋白C具有特异性)，其包含如以下SEQ ID NO:1中所示的轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
本公开的抗体或结合片段进一步包含有包含SEQ ID NO:3的CDRH1、SEQ ID NO:4的CDRH2和独立地选自SEQ ID NO:5、12、14、16、18、20、24、26、28、30和32或其变体的CDRH3的VH，其中VH和VL的CDR中的多达5个氨基酸发生变化(特别是其中对于人类肌腱蛋白C的结合亲和力维持在与“亲本/起始”抗体的结合亲和力值相似的值)。
在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段中的VH独立地选自SEQ ID NO:6、13、15、17、19、21、25、27、29、31、33和其变体，其中所述序列中的多达5个氨基酸发生变化。
在一个实施例中，VH是在如以下SEQ ID NO:2所示的重链中：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKSYQSDEDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
因此，在一个实施例中，本公开的抗体是全长抗体或包含全长抗体的分子，例如IgG，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一个实施例中，抗体或其结合片段对FBG结构域具有特异性，特别是具有肌腱蛋白-C的FBG结构域。
在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段对人类肌腱蛋白-C具有100nM亲和力或更高的亲和力，如50nM或更高，特别是45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5nM或更高的亲和力(当然其具有更低的数值)。
本公开的抗体和结合片段可以比相应的亲本抗体具有更低的免疫原性。
在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段缀合至有效载荷。
本公开的抗体和结合片段可以比相应的亲本抗体表达地更好，例如1.5、2、2.5或3倍更好的表达。
本公开的抗体和结合片段具有与相应的亲本抗体相当的特性，如亲和力。然而，在一些情况下，本文中的其抗体或结合片段可以改进优于相应的亲本抗体的特性或活性。
附图说明
图1(A)显示TLR4和Fc-HIS-FBG体外结合测定结果的图示。(B)显示实验结果以证明单克隆Ab C3损坏体外FBG和TLR4结合的能力的图示。
图2(A)显示用经MAb C3温育后的重组人类TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞对促炎细胞因子释放的影响的图示。(B)显示用经MAb C3温育后的重组鼠TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞的促炎细胞因子释放的影响的图示。
图3(A)显示用经MAb B12温育后的重组人类TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞的促炎细胞因子释放的影响的图示。(B)显示以实验室规模/更大规模用经MAb B12温育后的重组人类TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞的促炎细胞因子释放的影响的图示。
图4显示用经MAb C3温育后的重组TNC-FBG刺激的RA滑膜成纤维细胞对促炎细胞因子释放的影响的图示。
图5显示通过ELISA测量的来自大鼠爪的滑液洗出的肌腱蛋白-C水平与临床评分的散点图。
图6显示用不同剂量的C3Mab治疗后的随时间变化的大鼠临床评分的图示。
图7显示用不同剂量的C3Mab治疗后的随时间变化的大鼠后爪体积的图示。
图8显示所使用的引物序列的表。
图9(A)显示肌腱蛋白-C结构域结构的示意图。(B)符号表。
具体实施方式
如本文所采用的“抗体”包括基本上完整的抗体分子以及嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体(其中至少一个氨基酸相对于天然存在的人类抗体发生突变)、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体和抗原结合片段以及其衍生物。
“抗原结合片段”是指能够结合到肌腱蛋白-C的FBG结构域的抗体的功能性片段。
除非上下文指出，否则抗体结合片段和抗原结合片段在本文中可互换使用。
抗体结合片段的实例包括到Fab、修饰Fab、Fab'、修饰Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价抗体、三价抗体或四价抗体、双scFv、双抗体、三抗体、四抗体和上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005，《自然生物技术(Nature Biotech.)》23(9):1126-1136；Adair和Lawson，2005，《药物设计综述-在线(Drug Design Reviews-Online)》2(3)，209-217)。用于产生和制备这些抗体片段的方法在所属领域中众所周知(参见例如Verma等人，1998，《免疫法杂志(Journalof Immunological Methods)》，216，165-181)。用于本发明的其它抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中所描述的Fab和Fab'片段。
包含全长抗体的多特异性抗体的实例包括DVD-Ig、IgG-scFv、scFv-IgG和IgG-V。
IgG-scFv 如本文所采用是具有每条重链或每条轻链的C末端上的scFv的全长抗体。
scFv-IgG 如本文所采用是具有每条重链或每条轻链的N末端上的scFv的全长抗体。
V-IgG 如本文所采用是具有每条重链或每条轻链的N末端上的可变结构域的全长抗体。
IgG-V 如本文所采用是具有每条重链或每条轻链的C末端上的可变结构域的全长抗体
DVD-Ig (也称为双V结构域IgG)是具有4个额外的可变结构域、一个每条重链和每条轻链的N-末端上的可变结构域的全长抗体。
在一个实施例中，抗体结合片段是或包含Fab或Fab'片段。
包含Fab或Fab'片段的抗体结合片段包括Fabdab、Fab'dab、FabFv、Fab'Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab'-scFv、Fab-(scFv)2、Fab'-(scFv)2、DiFab、DiFab'。
Fabdab 如本文所采用是指具有任选地经由接头附加到其重链或轻链的结构域抗体的Fab片段。
Fab'dab 如本文所采用是指具有任选地经由接头附加到其重链或轻链的结构域抗体的Fab'片段。
FabFv 如本文所采用是指具有附加到以下重链的CH1和轻链的CL中的每一个的C-末端的额外可变区的Fab片段，参见例如WO2009/040562。所述格式可以以其PEG化版本形式提供，参见例如WO2011/061492，
Fab'Fv 本文所采用与FabFv类似，其中Fab部分被Fab'取代。所述格式可以以其PEG化版本形式提供。
FabdsFv 本文所采用是指其中Fv内二硫键使所附C末端的可变区稳定化的FabFv，参见例如WO2010/035012。所述格式可以以其PEG化版本形式提供
Fab-scFv (也称为双抗体)如本文所采用是指具有任选地经由接头附加于轻链或重链的C末端上的scFv的Fab分子。
Fab'-scFv 如本文所采用是指具有任选地经由接头附加于轻链或重链的C末端上的scFv的Fab'分子。
DiFab 如本文所采用是指经由重链的其C末端连接的两个Fab分子。
DiFab' 如本文所采用是指经由一个或多个其铰链区中的二硫键连接的两个Fab'分子。
DiFab和DiFab'分子包括其化学缀合形式。
接头的实例公开于SEQ ID NO:45到86中的序列表中，并且进一步包括序列PPP和SEQ ID NO:36到44中所公开的铰链序列。
本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以下调例如肌腱蛋白-C的生物活性。
本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以是例如肌腱蛋白-C的转录抑制剂。
本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以是例如肌腱蛋白-C的翻译抑制剂。
因此，在一个实施例中，本公开的抗体或其结合片段、衍生物或变体可以下调肌腱蛋白如肌腱蛋白-C的表达，特别是在体内。
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以是肌腱蛋白-C的结合特性的抑制剂。举例来说，抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以改变肌腱蛋白-C的构象以使得其不再能够与其一个或多个受体结合(特别是肌腱蛋白-C的FBG结构域的结合和/或活性受到抑制)。
本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以是肌腱蛋白-C的竞争性结合抑制剂。所属领域的技术人员应了解，抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体也可以抑制肌腱蛋白(如肌腱蛋白-C)的生物活性，这通过直接阻断肌腱蛋白-C受体功能(通过充当肌腱蛋白-C受体拮抗剂)或间接阻断肌腱蛋白-C受体功能(通过结合中间体分子或辅助分子)进行的。
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以是TLR-4受体的拮抗剂。通过TLR4的拮抗剂，我们包括间接拮抗作用。抗原结合片段、其衍生物或变体可以防止TLR4或另外任何其它受体的肌腱蛋白-C活化。
所属领域的技术人员应了解，本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体对肌腱蛋白(如肌腱蛋白-C，特别是其FBG结构域)的生物活性的抑制可以是全部或部分地。举例来说，抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以抑制肌腱蛋白(如肌腱蛋白-C，特别是其FBG结构域)的生物活性至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，如100％，这是与未暴露于抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体的炎症性细胞上的肌腱蛋白(如肌腱蛋白-C)的生物活性相比而言的。
在一个实施例中，抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体是单克隆的。
在一个实施例中，提供了编码本公开的抗体或结合片段的多核苷酸，例如抗体或结合片段的重链和轻链可以在相同或不同的多核苷酸链上进行编码。因此，如本文所采用的“编码……的多核苷酸”包括对重链和轻链进行编码的多核苷酸或一个对重链进行编码和一个对轻链进行编码的两个独立的多核苷酸。
在一个方面中，提供了包含如上所述的多核苷酸的载体。可以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是所属领域的技术人员公知的。在这方面中，参考“《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》”，1999，F.M.Ausubel(编辑)，约翰威立(Wiley Interscience)，纽约，和冷泉港出版社(Cold Spring HarborPublishing)出版的《马尼亚蒂斯手册(Maniatis Manual)》。
在另一方面中，提供了包含如上所述的多核苷酸或载体的宿主细胞。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达对本发明的抗体分子进行编码的DNA序列。可以使用细菌例如大肠杆菌(E.coli)和其它微生物系统，或也可以使用真核生物例如哺乳动物、宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
本发明还提供了一种用于产生本发明的抗体分子的方法，其包含在适于引起表达来自对本发明的抗体分子进行编码并分离抗体分子的DNA的蛋白质的条件下培养含有本发明的载体(和/或DNA)的宿主细胞。
抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需要使用重链或轻链多肽编码的序列以转染宿主细胞。为了产生包含重链和轻链的产物，细胞系可以经两种载体、对轻链多肽进行编码的第一载体和对重链多肽进行编码的第二载体转染。可替代地，可以使用单一载体，所述载体包括对轻链和重链多肽进行编码的序列。
在一个实施例中，抗体或结合片段以包含一种或多种赋形剂、稀释剂和/或载体的药物配制物形式提供。因此，提供了包含如上所述的抗体或结合片段的药物组合物。
所属领域的技术人员应了解，本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体通常以与合适的药物赋形剂稀释剂或载体的混合物形式进行施用，所述药物赋形剂稀释剂或载体是根据预期的施用途径和标准药学实践选择的(例如参见Remington：《药学的科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)》，第19版，1995，编辑Alfonso Gennaro，美国宾夕法尼亚州的Mack Publishing Company)。
举例来说，本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以以可以含有调味剂或着色剂的片剂、胶囊、胚珠、酏剂、溶液或悬浮液的形式经口、向颊或舌下施用以用于即时、延迟或受控释放应用。
此类片剂可以含有赋形剂(如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸)、崩解剂(如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和特定复合硅酸盐)和造粒粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸酯和滑石。
类似类型的固体组合物也可以用作明胶胶囊中的填充剂。就此而言，合适的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂，本发明的化合物可以与各种甜味剂或调味剂、着色物或染料、与乳化剂和/或悬浮剂以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油和其组合组合。可替代地，胶囊可以填充有液体配制物。
本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体也可以通过阴茎海绵体内注射进行非经肠施用，例如静脉内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、脑室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下施用，或其可以通过输液技术进行施用。其最好以无菌水溶液的形式使用，其可以含有其它物质例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如果需要的话，水溶液应适当进行缓冲(优选达到3到9的pH)。在无菌条件下制备合适的非经肠配制物可以通过所属领域的技术人员公知的标准制药技术容易地完成。
适用于非经肠施用的配制物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有使配制物与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。配制物可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封安瓿和小瓶，并且可以储存于冷冻干燥(冻干)条件中，仅需要在即将使用之前添加无菌液体载体例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
示例性方法：1)添加赋形剂如缓冲剂和洗涤剂(通常为Tween)以抑制水性配制物中的聚集；2)用适当的赋形剂进行冷冻干燥以为饼块提供松厚、稳定和美观的吸引力；3)使用如海藻糖的化合物来形成玻璃糖。
对于对人类患者的经口和非经肠施用或其它施用途径，以单剂量或分剂量施用的本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体的每日剂量水平通常是每个成人1μg到1000mg(即约0.015到15mg/kg)。
作为一个实例，剂量水平可以是约0.5mg/kg到约10mg/kg，施用方案可以是每周两次或三次，施用可以是静脉内施用。在另一个实施例中，施用方案可以在静脉内或通过皮下注射输送每周一次到每月一次范围内。
本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体也可以鼻内施用或通过吸入施用并且可以方便地输送，例如以干粉吸入器、泵、喷雾器或雾化器、气雾剂喷雾器的形式由在使用合适的抛射剂情况下的加压容器呈现，所述抛射剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃(如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA3))、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供输送计量的阀来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体的溶液或悬浮液，如使用乙醇和抛射剂的混合物作为溶剂，其可以另外含有润滑剂，如脱水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可以配制成含有本发明的抗体或结合片段和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
气雾剂或干粉配制物经适当地排列以使得每个剂量(或计量剂量或‘喷射量’)含有至少1μg本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体以用于输送给患者。应当了解，具有气雾剂的总日剂量将因患者而异，并且可以以单剂量施用，或者更通常地，以整日分剂量施用。
可替代地，本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或者其可以以洗剂、溶液、乳膏、软膏或扑粉剂的形式局部施用。本发明的化合物还可以透皮施用，例如通过使用皮肤贴剂。其也可以通过眼部途径施用。
对于眼科使用，本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以配制为等渗、pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者适当地，配制为等渗、pH调节的无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂如苯扎氯铵组合。可替代地，其可以配制成软膏如凡士林。
对于局部施用于皮肤，本发明的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以配制为合适的软膏，其含有悬浮或溶解于例如具有以下中的一种或多种的混合物中的活性化合物：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替代地，其可以配制为悬浮或溶解于例如以下中的一种或多种的混合物中的合适洗剂或乳膏：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
适于在口腔中局部施用的配制物包括包含调味基质中的活性成分的锭剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；包含惰性基质中的活性成分的软锭剂，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶；和包含合适的液体载体中的活性成分的漱口剂。
在一个实施例中，采用持续释放的药物输送系统，如微球。这些经专门设计以用于降低注射频率。这种系统的一个实例是重组生长激素缓释剂(Nutropin Depot)，其将重组人类生长激素(rhGH)囊封在一旦注射就在持续的时间内缓慢释放rhGH的可生物降解的微球中。
可替代地，本发明的抗体或抗原结合片段，衍生物或变体可以通过将药物例如直接释放到所需的位点处的手术植入装置来施用。
电穿孔疗法(EPT)系统也可用于施用抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体。向细胞输送脉冲电场的装置增加了细胞膜对药物的渗透性，引起细胞内药物输送的显著增强。
抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体也可以通过电子掺入(EI)来输送。当皮肤表面上的直径达30微米的小颗粒经历与电穿孔中所使用的电脉冲相同或相似的电脉冲时，发生EI。在EI中，这些颗粒经驱动通过角质层并进入更深层的皮肤。颗粒可以装载或涂布有药物或基因，或者可以简单地充当在皮肤中产生可以使药物进入的孔的“子弹”。
另一种抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体输送的方法是热敏ReGel可注射的方法。在低于体温下，ReGel是可注射液体，而在体温下其立即形成凝胶储库，缓慢地消蚀并溶解成已知的、安全的、可生物降解的聚合物。随着生物聚合物溶解，活性药物随时间推移而输送。
抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体药物也可以经口输送。一种这样的系统采用体内口服摄取维生素B12的天然方法以辅助输送蛋白质和多肽。通过采用维生素B12摄取系统，蛋白质或多肽可以穿过肠壁。在维生素B12类似物与药物之间产生复合物，其既保留针对复合物的维生素B12部分中的内在因子(IF)的显著亲和力，也保留复合物的“抗体”部分的显著生物活性。
本公开的组合物可以进一步包含至少一种其它药剂。
这种其它药剂可能是抗炎剂，其包括但不限于非甾族抗炎剂(NSAID)、改善疾病的抗风湿药(DMARD)、他汀类药物(包括HMG-CoA还原酶抑制剂，如辛伐他汀(simvastatin))、生物药剂(生物制品)、类固醇、免疫抑制剂、水杨酸盐和/或杀微生物剂。非甾族抗炎剂包括抗代谢剂(如甲氨蝶呤)和抗炎金剂(包括硫代苹果酸金钠、硫代苹果酸金盐或金盐，如金诺芬)。生物制品包括抗TNF剂(包括阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、抗IL-1试剂、抗IL-6试剂、抗B细胞试剂(利妥昔单抗(rituximab))、抗T细胞试剂(抗CD4抗体)、抗IL-15试剂、抗CLTA4试剂、抗RAGE试剂)、抗体、可溶性受体、受体结合蛋白、细胞因子结合蛋白、功能改变或减弱的突变蛋白、RNAi、多核苷酸适体、反义寡核苷酸或ω3脂肪酸。类固醇(也称为皮质类固醇)包括可的松(cortisone)、泼尼松龙(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone)，也可以与本公开的抗体或结合片段组合疗法采用。用于本公开的组合疗法的免疫抑制剂包括环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸。用于所述组合疗法的水杨酸盐包括阿司匹林、水杨酸钠、水杨酸胆碱和水杨酸镁。杀微生物剂包括奎宁和氯喹。举例来说，抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体可以与包含本公开的抗体或结合片段的治疗方案中的一种或多种NSAID、DMARD或免疫抑制剂组合来施用。
在一个实施例中，提供了本公开的抗体或抗原结合片段或其衍生物或其变体或如用于疗法所定义的组合物。
在一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段或其衍生物或变体或组合物用于治疗病理病况，如炎症性病况/病症和/或自身免疫疾病，例如慢性炎症病况，特别是类风湿性关节炎。
在本发明的一个方面中，提供了使用本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物在制备用于治疗和/或诊断本文所公开的病理病况(例如慢性炎症性病况)的药物中的用途。
在一个实施例中，提供了一种治疗本文所公开的病理病况如慢性炎症性病况的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物。
病理病况或病症可以例如选自包含以下或由以下组成的组：关节炎如类风湿性关节炎、哮喘如严重哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、盆腔炎症性疾病、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、炎症性肠病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜泻、胆囊病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癣、血管炎、手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、中枢和周边神经系统的免疫介导的炎症性病症(如多发性硬化、狼疮(如全身性红斑性狼疮症)和格林-巴利综合征(Guillain-Barr syndrome))、异位性皮肤炎、自身免疫性肝炎、纤维性肺泡炎、格雷夫氏病(Grave's disease)、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、美尼尔氏病(Meniere'sdisease)、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳肉芽肿(Wegener'sgranulomatosis)、其它自身免疫性病症、胰腺炎、外伤(手术)、移植物抗宿主病、移植体排斥反应、心脏病(包括缺血性疾病如心肌梗塞以及动脉粥样硬化)、血管内凝血、骨骼再吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少和癌症(包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、肾脏和癌症(特别是肾细胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、胎盘绒膜癌、宫颈癌和甲状腺癌)和其转移性形式。
在一个实施例中，自身免疫疾病选自包含以下或由以下组成的组：急性播散性脑脊髓炎(adem)、急性坏死性出血性脑白质炎、阿狄森病(Addison's disease)、肾上腺功能不全、肾上腺皮质功能减退、斑秃、淀粉样变性病、强直性脊柱炎、脊椎关节炎、施-马二氏病(Strumpell-marie disease)、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(aps)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经失调、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂质血症、自身免疫性免疫缺乏、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、卡-史二氏综合征(Canale-Smith syndrome)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎(AIP)、自身免疫性多内分泌腺综合征(I、II和III型)、自身免疫性视网膜病(AR)、自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性荨麻疹、轴突/神经元神经病、巴洛病、贝塞特氏病(Behcet's disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼病、乳糜泻、查加斯病(chagas disease)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)、慢性再发性多灶性骨髓炎(CRMO)、丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮(CP)、克罗恩氏病、炎症性肠病、结肠炎、肠炎、回肠炎、科干综合征、冷凝集素病、先天性心传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、嵴病、冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病、疱疹样皮炎、杜林氏病(Duhring's disease)、皮肌炎、I型糖尿病、盘状红斑狼疮(DLE)、德雷斯勒综合征、子宫内膜异位、大疱性表皮松解(EB)和获得性大疱性表皮松解(EBA)、嗜酸性粒细胞胃肠炎、食道炎、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼综合征(schulman'ssyndrome)、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、伊凡氏综合征(Evans syndrome)、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、丝球体肾炎(非增生性：局灶节段性肾小球硬化和膜性丝球体肾炎；增生性：IgA肾病)、古德帕斯彻综合征(goodpasture'ssyndrome)、伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA)(以前称为韦格纳肉芽肿)、格雷夫氏病、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)、米费综合征(Miller Fisher syndrome)、急性运动神经轴突神经病、急性运动神经感觉轴突神经病、急性全自主神经性神经病、比氏脑干脑炎(Bickerstaff's brainstem encephalitis)、桥本氏脑炎(Hashimoto'sencephalitis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨-舒二氏紫癜、妊娠疱疹、低丙球蛋白血症、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病(IGAN)、贝格尔氏综合征(berger's syndrome)、咽炎丝球体肾炎症(synpharyngiticglomerulonephritis)、IgA天疱疮、IgG4相关硬化性病、免疫调节不育症、包涵体肌炎、胰岛素依赖性糖尿病、间质性膀胱炎、艾萨克氏综合征(Isaac's syndrome)、神经性肌强直、幼年型关节炎、幼年型肌炎、川崎氏综合征(Kawasaki syndrome)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA皮肤病(LAD)、类天疱疮、狼疮(SLE)、莱姆病(lyme disease)、美尼尔氏病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合结缔组织病(MCTD)、单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy)、莫伦氏溃疡(Mooren's ulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克氏病(devic's))、神经性肌强直、艾萨克氏综合征(获得性、类肿瘤性、遗传性)、嗜中性白血球减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、卵巢炎、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、睾丸炎、复发性风湿病、熊猫病(链球菌相关小儿自身免疫性神经精神障碍)、类肿瘤性自身免疫性多器官综合征(PAMS)、类肿瘤性小脑变性、类肿瘤性天疱疮(PNP)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕罗综合征(Parry Rombergsyndrome)、帕-特二氏综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、扁平部睫状体炎(周边葡萄膜炎)、妊娠性类天疱疮(PG)、寻常天疱疮(PV)、落叶型天疱疮(PF)、外周神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、Poems综合征、结节性多动脉炎(PAN)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、汉诺氏综合征(Hanot syndrome)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、拉斯穆森脑炎(Rasmussen's encephalitis)、慢性病灶性脑炎(CFE)、雷诺现象(Raynauds phenomenon)、反应性关节炎、莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)、恢复蛋白相关视网膜病(RAR)、反射性交感神经失养症、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、多动腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特氏综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、全身性硬化症、斯耶格伦氏综合征(sjogren's syndrome)、精子和睾丸自身免疫性、僵人综合征、亚急性细菌心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac's syndrome)、交感性眼炎、高安动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、伯格氏病(Buerger's disease)、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化型结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、风湿性多肌痛、高安氏动脉炎、颞动脉炎、伯格氏病、皮肤血管炎、川崎氏病(Kawasaki disease)、结节性多动脉炎、贝塞特氏综合征(
Figure BDA0001807689530000161
syndrome)、丘-施二氏综合征、皮肤血管炎、亨-舒紫癜(
Figure BDA0001807689530000162
purpura)、显微镜下多血管炎、韦格纳肉芽肿、高氏血管炎(golfer's vasculitis)、水疱性大疱性皮肤病和白癜风韦格纳肉芽肿(现在被称为伴有多血管炎的肉芽肿病(GPA)。
在一个实施例中，自身免疫疾病选自包含以下或由以下组成的组：ANCA血管炎、IgA肾病(Berger氏)、寻常天疱疮/大疱性类天疱疮、ITP、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫甲状腺炎(格雷夫氏病)、桥本氏病(hashimoto's disease)、狼疮肾炎、膜性丝球体肾炎(或膜性肾病)、APS、重症肌无力、视神经脊髓炎、原发性斯耶格伦氏(primary
Figure BDA0001807689530000163
)、自身免疫性嗜中性白血球低下症、自身免疫性胰腺炎、皮肌炎、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性视网膜病、贝塞特氏病、IPF、全身性硬化症、肝纤维化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、白斑病、古德帕斯彻综合征、肺泡性蛋白沉积症、慢性自身免疫性荨麻疹、牛皮癣、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、中轴型脊柱关节炎、移植(包括GvHD)、哮喘、COPD、巨细胞动脉炎、难治性自身免疫性细胞减少症、伊凡氏综合征(自身免疫性溶血性贫血)、I型糖尿病、结节病、多发性肌炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、乳糜泻、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinaemia)、局灶节段性肾小球硬化、慢性莱姆病(莱姆疏螺旋体病)、扁平苔癣、僵人综合征、扩张型心肌症、自身免疫性(淋巴球性)卵巢炎、获得性大疱性表皮松解、自身免疫性萎缩性胃炎、恶性贫血、异位性皮肤炎、动脉粥样硬化、多发性硬化症、拉斯穆森脑炎、格林-巴利综合征、获得性神经性肌强直、中风。
在一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体、组合物用于治疗慢性炎症性病况，其中所述病况与不适当的炎症相关。这些病况包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病、非愈合性伤口、多发性硬化症、癌症、动脉粥样硬化、斯耶格伦氏病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化和UV损伤和牛皮癣。
慢性炎症是与许多上述疾病相关的使人衰弱并且严重的病况，其特征在于感染或损伤部位的持续性炎症，或未知来源的持续性炎症，或与如自身免疫性疾病中的免疫应答改变有关。
因此，在一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体、组合物或方法用于治疗慢性炎症性病况，其中所述病况与不适当的炎症相关联的任何病况相关。这些病况包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性病况、炎症性肠病、非愈合性伤口、多发性硬化症、癌症、动脉粥样硬化、斯耶格伦氏病、糖尿病、红斑狼疮(包括系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包括肝硬化)、肺纤维化、UV损伤和牛皮癣。
在一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体、组合物或方法用于治疗选自中轴型脊柱关节炎、原发性胆汁性胆管炎和过敏性反应的病况。
类风湿性关节炎(RA)是慢性炎症性病况的一个典型实例，但绝不是唯一的。RA的特征在于滑膜炎症和由促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)的持续合成介导的关节软骨和骨的损坏。
在一个实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物可用于例如以下一种或多种：用于诊断受试者的慢性炎症性病况状态；用于评估受试者发生慢性炎症性病况的可能性；用于确定患有慢性炎症性病况的受试者的预后；用于监测慢性炎症性病况的疾病进展；和/或用于监测受试者对慢性炎症性病况治疗的有效性或应答。
在一个实施例中，提供了本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物以用于诊断慢性炎症性病况和/或确定患有慢性炎症性病况的患者的预后。
在一个实施例中，提供了诊断慢性炎症性病况和/或确定患有慢性炎症性病况的患者的预后的方法，其包含使用本公开的抗体、抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物来检测肌腱蛋白-C的FBG结构域的存在或不存在或量。
所确定的预后可能例如是慢性炎症性病况的恶化。可替代地，预后可能是慢性炎症性病况的减轻(即改善)，或预后可能是慢性炎症性病况保持不变(即保持恒定而无恶化或改善)。
在一个实施例中，诊断方法是体外方法。
因此，在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段缀合到标记，例如可以检测到、确定数量和/或监测到的标记，如放射性标记或荧光标记。
适当的治疗可以包含施用有效量的本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物与任选地以下中的一种或多种的组合：DMARDS(如甲氨蝶呤)；抗TNF药物；抗IL17疗法；T细胞共刺激调节剂(如OrenciaTM-阿巴西普(abatacept))；白细胞介素-6(IL-6)抑制剂(如ActemraTM-托珠单抗(tocilizumab))；抗CD20抗体(如RituxanTM-利妥昔单抗)；B细胞激活因子(如抗BAFF)；JAK激酶(JAK)抑制剂(如TofacitinibTM)；脾酪氨酸激酶(Syk)抑制剂(如FostamatinibTM)；抗TNC抗体或针对瓜氨酸化肌腱蛋白-C结构域的抗体；和/或调节瓜氨酸化和/或非瓜氨酸化肌腱蛋白-C的生物活性的药剂。
在一个特定实施例中，本公开的适当治疗靶向肌腱蛋白-C的FBG结构域。
在一个实施例中，诊断方法或确定适当治疗的方法包含进行以下中的一种或多种：免疫测定法；光谱测定法；蛋白质印迹法；ELISA；免疫沉淀反应；狭缝或斑点印迹法；等电聚焦；SDS-PAGE；抗体微阵列；免疫组织学染色；放射免疫测定(RIA)；荧光免疫测定；和/或使用抗生物素蛋白-生物素或链霉亲和素-生物素系统的免疫测定。
在一个方面中，提供了一种药剂盒，其包含：
(i)本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物。
(ii)施用方式
(iii)其使用说明书
在一个实施例中，所述药剂盒还可任选地进一步包含
(iv)至少一种其它药剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于确定受试者的慢性炎症性病况状态的药剂盒，其包含：
(i)本公开的抗体或抗原结合片段、其衍生物或变体或组合物；和
(ii)使用说明书
其它定义
本文所采用的“氨基酸变化”是指取代或缺失氨基酸，特别是取代氨基酸是指用不同的(可替代的)氨基酸取代序列中的氨基酸。
本文所采用的“炎症”是指由组织损伤、感染或局部免疫应答引发的液体、血浆蛋白和白细胞的局部积聚。
本文所采用的“急性炎症”是指炎症的初始阶段(起始)和在损伤、感染或局部免疫应答后不久的短期瞬时炎症反应。通常，急性炎症迅速消退，持续时间从几分钟到几天不再持续。
如本文所采用的“慢性炎症”是指持续性和/或未消退的炎症。它通常与健康组织的不适当损坏有关。这可能是渐进的并且持续数周或更长的时间。慢性炎症通常与持续感染或包括但不限于自身免疫性病况的疾病相关。
本文所采用的“慢性关节炎症”是指在数周到数月的时间内进行性且不间断的的持续性炎症，导致受影响关节的扭曲和人类疾病中观察到的软骨和骨质破坏的影像学证据(Kelly，Harris，Ruddy和Sledge，《风湿病学教科书(Textbook of Rheumatology)》第4版)。
在实验性小鼠模型中，慢性关节炎症的特征在于即使在相对短的时间内也不会消退并导致不适当的组织损坏的炎症。这在组织学上表征(并且可以识别)为滑膜和关节腔中长期存在的炎症性细胞、软骨细胞死亡和软骨和骨侵蚀。
本文所采用的“慢性炎症性病况状态”包括对患有或没患有慢性炎症性病况的受试者的诊断、确定预后和/或确定适当的治疗。
本文所采用的“片段”是指至少四个氨基酸，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个氨基酸。
可以使用合适的计算机程序例如威斯康辛遗传计算组大学的GAP程序来确定两个多肽之间的百分比序列同一性，并且应当了解，百分比同一性是相对于序列已被最佳地比对的多核苷酸而言计算得出的。
可替代地，可以使用Clustal W程序进行比对(如Thompson等人，1994，《核酸研究(Nuc.Acid Res.)》22:4673-4680中所描述)。
所使用的参数可能如下：快速成对比对参数：K-元组(字符)大小；1，窗口大小；5，缺口罚分；3，顶部对角线数量；5。评分方法：x％。多个比对参数：缺口开放罚分；10，缺口延伸罚分；0.05。记分矩阵：BLOSUM。可替代地，BESTFIT程序可用于确定局部序列比对。
术语“受试者”或“个体”是指所有动物，包括人类。受试者的实例包括人类、牛、狗、猫、山羊、绵羊和猪。术语“患者”是指患有需要治疗的病症的受试者或个体。通常，受试者和/或患者应是人类。
如本文所使用，“药物配制物”是指治疗有效的本公开的配制物。
如本文所使用的“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效的”是指对于给定的病况和施用方案提供治疗效果的量。这是经计算以与所需的添加剂和稀释剂即载体或施用载剂结合产生所需的治疗效果的预定量的活性物质。此外，其旨在表示足以减少和/或预防宿主/患者的活性、功能和应答的临床上显著缺陷的量。可替代地，治疗有效量足以引起宿主/患者中的临床显著病况的改善。如所属领域的技术人员所了解，活性药剂(如本公开的抗体或结合片段)的量可以根据其特异性活性而变化。合适的剂量可以含有经计算以与所需的稀释剂结合产生所需的治疗效果的预定量的活性组合物。在用于制备本发明组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性组分。如所属领域所众所周知，普通技术医务人员或兽医工作者可以根据患者特征(如年龄、体重、性别、病况、并发症、其它疾病等)来确定治疗有效量。
本文所采用的术语有效载荷包括例如生物活性蛋白(例如酶)、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段(例如DNA、RNA和其片段)、放射性核素(特别是放射性碘标记物)、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团(如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测到的化合物)。
其它有效载荷可以包括螯合放射性核素，如111In和90Y、Lu177、Bismuth213、Californium252、Iridium192和Tungsten188/Rhenium188；或药物，如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和苏拉明。
其它有效载荷包括蛋白质、肽和酶。值得关注的酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素(如相思豆毒素、蓖麻毒素A链、假单胞菌外毒素或白喉毒素)、蛋白质(如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织纤溶酶原激活物、血栓形成剂或抗血管生成剂(例如血管抑制素或内皮抑素)或生物应答调节剂(如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子)和免疫球蛋白。
其它有效载荷可以包括可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层扫描)和非放射性顺磁金属离子。一般参见美国专利第4,741,900号的金属离子，其可以与抗体缀合以用作诊断剂。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在另一个实例中，有效负载可以增加体内抗体的半衰期和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨越上皮屏障到免疫系统的输送。这类合适的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，如WO05/117984中所描述的那些。
在效应分子是聚合物的情况下，其通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选的经取代直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或支链或非支链多糖，例如同源多糖或杂源多糖。
可存在于上述合成聚合物上的具体任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选的经取代直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任选的经取代聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
如本文所使用的“衍生物”意在包括反应性衍生物，例如硫醇选择性反应性基团，如马来酰亚胺等。反应性基团可以直接连接或通过接头链段连接到聚合物上。应当了解，这种基团的残基在某些情况下会形成产物的一部分作为抗体片段与聚合物之间的连接基团。
聚合物的大小可以根据需要变化，但通常在500Da到50000Da的平均分子量范围内，例如5000到40000Da，如20000到40000Da。特别地，聚合物大小可以基于产物的预期用途来选择，例如定位于某些组织如肿瘤或延长循环半衰期的能力(参见Chapman，2002，《先进药物输送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)》，54，531-545)。
因此，举例来说，当产物意在离开循环并穿透组织时，例如用于治疗肿瘤，使用小分子量聚合物(例如分子量是约5000Da)可能是有利的。对于产物保持在循环中的应用，使用较高分子量的聚合物(例如分子量在20000Da到40000Da范围内)可能是有利的。
合适的聚合物包括聚亚烷基聚合物，如聚(乙二醇)或特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别是分子量在约15000Da到约40000Da范围内。
在一个实例中，用于本发明的抗体与聚(乙二醇)(PEG)部分连接。在一个特定实例中，抗体是抗体片段，并且PEG分子可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团连接，例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇基、羟基或羧基。此类氨基酸可以天然存在于抗体片段中，或者可以使用重组DNA方法工程化到片段中(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971；WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子是修饰Fab片段，其中所述修饰是在其重链的C-末端添加一个或多个氨基酸以允许连接效应分子。合适地，另外的氨基酸形成含有一个或多个可以与效应分子连接的半胱氨酸残基的修饰铰链区。多个位点可用于连接两个或更多个PEG分子。
合适地，PEG分子通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基共价连接。与修饰抗体片段连接的每个聚合物分子可以与位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子共价连接。共价键通常是二硫键或特别是硫-碳键。当硫醇基用作连接点时，可以使用适当活化的效应分子，例如硫醇选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化聚合物可用作制备如上所述的聚合物修饰的抗体片段中的起始材料。活化聚合物可以是任何含有硫醇反应性基团的聚合物，如α卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺、例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物。这些起始材料可以从商业上获得(例如来自Nektar，以前的美国亚拉巴马州亨茨维尔的Shearwater Polymers Inc.)，或者可以使用常规的化学程序由市售起始材料制备。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(获自Nektar，以前的Shearwater；RappPolymere；和SunBio获得)和M-PEG-SPA(获自Nektar，以前的Shearwater)。
在一个实施例中，抗体是修饰Fab片段或PEG化diFab(即具有共价连接于其上的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544或EP1090037中所公开的方法[也参见《聚(乙二醇)化学、生物技术和生物医学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical andBiomedical Applications)》，1992，J.Milton Harris(编辑)，纽约的普莱纽姆出版社(Plenum Press)，《聚(乙二醇)化学和生物学应用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry andBiological Applications)》，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(编辑)，华盛顿特区的美国化学学会(American Chemical Society)，和《用于生物医学科学的生物缀合蛋白质偶联技术(Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the BiomedicalSciences)》，1998，M.Aslam和A.Dent，纽约的Grove Publishers；Chapman,A.2002，《先进药物输送评论》2002，54:531-545]。在一个实例中，PEG与铰链区中的半胱氨酸连接。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接到修饰铰链区中的单个硫醇基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可以共价连接到马来酰亚胺基团，并且赖氨酸残基上的每个胺基团可以与分子量是约20,000Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物连接。因此，与Fab片段连接的PEG的总分子量可以是约40,000Da。
特定PEG分子包括N,N'-双(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙基酰胺，也称为PEG2MAL40K(获自Nektar，以前的Shearwater)。
PEG接头的可替代来源包括供应GL2-400MA2(其中下面结构中的m是5)和GL2-400MA(其中m是2)且n是约450的NOF：
Figure BDA0001807689530000231
也就是说每个PEG是约20,000Da。其它可替代的以下类型的PEG效应分子：
Figure BDA0001807689530000241
可以从Reddy博士、NOF和键凯(Jenkem)获得。
在一个实施例中，提供了PEG化(例如用本文所述的PEG)抗体，通过链中氨基酸226处或其附近的半胱氨酸氨基酸残基连接，例如重链的氨基酸226(通过连续编号)。
在本说明书的上下文中，“包含”应解释为“包括”。
包含特定元件的本发明的方面也意在延伸到“由相关元件组成”或“基本上由相关元件组成”的替代实施例。
在技术上适当的情况下，可以组合本发明的实施例。
如专利和申请的技术参考文献以引用的方式并入本文中。
本文具体和明确地叙述的任何实施例可单独或与一个或多个其它实施例组合形成免责声明的基础。
在序列和附图中描述了本公开的方面，其可以形成修正的基础。附图和序列的公开内容一般应用于教示本公开而不旨在视为简单非常具体的特性组合。
现在将参考以下附图仅通过说明来描述体现本发明的一个方面的实例：
附图简要说明
图1(A)显示TLR4和Fc-HIS-FBG体外结合测定结果的图示。(B)显示实验结果以证明单克隆Ab C3损坏体外FBG和TLR4结合的能力的图示。
图2(A)显示用经MAb C3温育后的重组人类TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞对促炎细胞因子释放的影响的图示。(B)显示用经MAb C3温育后的重组鼠TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞的促炎细胞因子释放的影响的图示。
图3(A)显示用经MAb B12温育后的重组人类TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞的促炎细胞因子释放的影响的图示。(B)显示以实验室规模/更大规模用经MAb B12温育后的重组人类TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞的促炎细胞因子释放的影响的图示。
图4显示用经MAb C3温育后的重组TNC-FBG刺激的RA滑膜成纤维细胞对促炎细胞因子释放的影响的图示。
图5显示通过ELISA测量的来自大鼠爪的滑液洗出的肌腱蛋白-C水平与临床评分的散点图。
图6显示用不同剂量的C3Mab治疗后的随时间变化的大鼠临床评分的图示。
图7显示用不同剂量的C3Mab治疗后的随时间变化的大鼠后爪体积的图示。
图8显示所使用的引物序列的表。
图9(A)显示肌腱蛋白-C结构域结构的示意图。(B)符号表。
实例
实例1-纯化肌腱蛋白-c FBG作为抗原和测定试剂的产生
产生含有肌腱蛋白-C的FBG结构域(TNC FBG)的纯化可溶性蛋白质以用作抗体选择中的抗原并且用作随后筛选和表征测定中的试剂。为了使分离结合多种哺乳动物物种的肌腱蛋白-C的抗体的选择策略成为可能，合成了一系列DNA表达构建体，其掺入了人类、小鼠、大鼠或狗的TNC FBG结构域。还制备了人类肌腱蛋白-R FBG构建体以用于识别显示出与此同源物不希望结合的抗体。如下所述，构建体产生为6His标记的蛋白质，并且大鼠CD4或人类IgG1Fc标记偶联到C-末端或N-末端FBG结构域。
蛋白质表达构建体
合成用于抗原表达的所有合成DNA构建体并且通过斯瑞(Genscript)(美国皮斯卡塔韦)确认序列。将FBG结构域克隆到哺乳动物表达载体pBIOCAM4或BIOCAM5中，其将表达的结构域分别与大鼠Cd4(结构域3和4)标记(Chapple等人，2006)或人类IgG1Fc标记(Falk等人，2012)融合。载体经含有衍生自小鼠VH链的内质网(ER)信号序列的pCMV/myc/ER质粒(Invitrogen)(Falk等人，2012)修饰以用于分泌表达的蛋白质。对于产生N-末端FBG(例如FBG-Fc-His或FBG-rCd4-His)的所有构建体，将消化的PCR产物与NcoI/NotI酶切的pBIOCAM4或pBIOCAM5载体连接。对于产生C-末端FBG(例如Fc-His-FBG或rCd4-His-FBG)的所有构建体，将消化的PCR产物与BamHI/HindIII酶切的pBIOCAM4或pBIOCAM5载体连接。用于扩增FBG结构域的引物列于图3中。所有构建体均经过序列确认。为了促进ELISA筛选，将对His标记进行编码的插入物(引物2574和2575)克隆到BamHI与HindIII位点之间(替换His-FLAG标记)以用于具有FBG-X(N末端FBG)融合体的表达质粒。通过用BstXI和BamHI消化直接由Genscript pUC57质粒克隆全长肌腱蛋白C，并克隆到BstXI/BamHI酶切表达载体pFBG-Fc-His6中。为了产生His-FBG构建体，由rCd4-His-FBG表达质粒将引物设计成PCR，并将对His-FBG进行编码的PCR产物用XhoI和HindIII消化并克隆到XhoI/HindIII消化的pBIOCAM5中。
蛋白质表达和细胞培养
使用Machery Nagel Nucleobond Xtra Midi药剂盒(740410.50，英国的飞世尔科技(Fisher Scientific))制备转染质量质粒DNA。用于抗原和抗体表达的HEK293F悬浮细胞和Freestyle培养基和RPMI培养基来自生命科技(Life Technologies)(英国佩斯利)。如前所述(Chapple等人，2006)进行HEK293F细胞的转染。
蛋白质纯化和QC
蛋白质亲和纯化采用Ni-NTA琼脂糖或固定化重组蛋白A树脂。
为了纯化His-标记的蛋白质，将培养物上清液与Ni-NTA琼脂糖(1018240，英国克劳利的凯杰(Qiagen))混合1小时，并将树脂转移到Proteus 1步midi旋转柱(英国的健能隆(Generon,UK))以进行离心(200×g，2分钟)。用补充有20mM咪唑(pH 8)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗去未结合的蛋白质。通过添加PBS(pH 8)中的300mM咪唑和柱离心(200×g，2分钟)将结合的蛋白质分级洗脱。将含有洗脱蛋白质的合并级分置于Gebaflex Midi透析管(健能隆D010；分子量截取值3.5kDa)中并对PBS透析。
使用蛋白质A琼脂糖(PC-A25，英国梅登黑德的健能隆)纯化Fc标记的蛋白质和表达为人类IgG4的抗体。通过离心(2500×g，15分钟)澄清培养上清液，并在4℃下与蛋白质A琼脂糖混合过夜，然后将树脂转移到Proteus 1步midi旋转柱(英国的健能隆)。将柱离心(200×g，2分钟)并用PBS洗涤以去除未结合的蛋白质。通过离心(200×g，2分钟)将Fc-标记的或IgG4蛋白质从具有0.2M甘氨酸(pH 2.8)的蛋白质A分级洗脱成Tris-HCl(pH 8)。合并洗脱的级分并在Gebaflex Maxi透析管(健能隆D045；分子量截取值8kDa)中对PBS透析。
通过SDS-PAGE(4-12％凝胶)和分光光度法(使用理论消光系数的OD280)分析蛋白质的纯度和浓度。当纯化蛋白质用于基于细胞的测定时，首先通过鲎变形细胞裂解物显色内毒素测定法(Pierce)测定内毒素含量。如果内毒素水平超过每毫克1内毒素单位(即1EU/mg)，则不使用蛋白质。
实例2-一级抗FBG抗体的分离
抗体噬菌体展示
使用Iontas Ltd专有的人类抗体噬菌体展示文库来分离抗肌腱蛋白-C FFG结构域的抗体，所述文库使用从43种人类淋巴细胞供体分离的DNA构建。如前所述(Schofield等人，2007)使用所属领域中众所周知的技术进行选择、噬菌体提取和亚克隆到pSANG10(Martin等人，2006)中。
在融合配偶体的N末端(例如FBG-Fc，FBG-rCd4)或C末端(Fc-FBG，rCd4-FBG)处与人类IgG1Fc或rCd4融合的固定化TNC FBG上进行两轮淘选选择。分别淘选含有κ(κ)或λ(λ)可变轻链(VL)的噬菌体抗体文库以便于后续亚克隆到含有恒定轻链(CL)κ(κ)或λ(λ)的Fab表达载体中。
由所选群体制备多克隆噬菌体群体，并使用涂布有TNC FBG抗原或适当的融合配偶体(Fc或rCd4)的ELISA板在ELISA(多克隆噬菌体ELISA)中测试。与噬菌体一起温育后，洗涤板，并使用过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测结合的噬菌体。富集所选择的第1轮与第2轮之间的抗原特异性结合物和与第2轮输出群体中的抗Fc或抗rCd4噬菌体相比的更大比例的FBG结合物，这表明选择是成功的。
通过ELISA确认scFv与抗原的结合和交叉反应性测定
第2轮选择输出表示为单独的scFv克隆以确认ELISA结合测定中的抗原识别。如前所述(Schofield等人，2007)，将输出群体亚克隆到细菌表达载体pSANG10(Martin等人，2006)中，转化成大肠杆菌BL21(DE3)，并在96孔板中诱导单个转化体。收集大肠杆菌上清液，并使用铕标记的抗FLAG检测抗体、使用基于DELFIA的ELISA来测定scFv与TNC FBG的结合。
使用λ文库的最成功的选择是基于针对抗原rCd4-FBG和Fc-FBG的淘选(选择147和148)。对于κ文库，用抗原FBG-rCd4(150)、rCd4-FBG(152)和Fc-FBG(153)获得最成功的选择。选择来自此ELISA筛选的79个阳性克隆以用于进一步分析。
交叉反应ELISA显示67/79(85％)的抗人类FBG scFv与小鼠TNC FBG交叉反应。抗FBG scFv的DNA序列分析表明了优异的序列多样性。举例来说，对应地，来自VLλ文库的选择147和148含有92％独特可变重(VH)互补决定区3(CDR3)的序列，并且来自VLκ文库的选择150、152和153含有67％、91％和100％独特可变VHCDR3序列。
通过ELISA筛选从最有效选择中分离的其它1425个克隆，并且这引起具有FBG结合特异性的另外的401scFv的识别。选择这些克隆以及在初始ELISA中鉴定的79scFv以用于进一步评估。
在特异性ELISA中进一步测试1425个克隆，其中测试每种scFv以用于与人类肌腱蛋白R FBG结合以及与人类、小鼠、大鼠和狗TNC FBG结合。根据所获得以用于与肌腱蛋白C结合的ELISA信号除以肌腱蛋白R FBG结合的信号对克隆进行分级。将比率高于50的前250个克隆用于亚克隆和进一步分析。
实例3-在功能测定中筛选一级抗FBG抗体
将抗FBG scFv重新格式化为二价scFv-Fc或重新格式为单体Fab以用于评估其作为全细胞测定系统中的FBG诱发的信号传导的抑制剂的活性。
对于每个选择147、148、150、152和153，通过一级ELISA信号排名的前50个抗FBGscFv亚克隆到哺乳动物表达质粒pBIOCAM5(Falk等人，2012)中作为个体选择群体并且通过HEK293F细胞中的瞬时转染表达(Chapple等人，2006)。对于Fab表达，使用专有的IontasLtd方案将合并的λ或κscFv可变重(VH)和可变轻(VL)插入物克隆到双启动子Fab表达载体(pFab-dual-κ或pFab-dual-λ，根据轻链种系而定)中。在THP-1细胞测定中筛选培养物上清液的活性，并将所选择的scFV-Fc和Fab命中物进行亲和纯化以重新测定和确认抑制活性。
THP1-BlueTM报道细胞测定
已显示肌腱蛋白-C通过FBG结构域与细胞TLR4的相互作用引起炎症性细胞和成纤维细胞中的细胞因子的产生(Midwood等人，2009)。引起炎症性细胞因子如TNFα、IL-8和IL-6产生的受体信号传导级联涉及转录因子NF-κB的激活。可以在经修饰以应答NF-κB活化并产生易于测量的蛋白质信号的“报道”细胞系中研究此过程。THP1-BlueTM报告细胞系(法国图卢兹的InvivoGen)衍生自人类THP-1单核细胞系并稳定地表达NF-κB诱导的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报道构建体。这些细胞还组成型地表达细胞表面TLR4，这使得使用中等到高通量测定方法使用比色或荧光定量培养上清液中的SEAP容易地测量的TNC FBG融合蛋白的信号传导活性成为可能。
低FBG浓度下的活性对任何筛选试验的成功至关重要；如果产生大量增加的报道蛋白而所需的FBG浓度太高，则完全抑制任何此类信号所需的scFv、Fc-ScFv或Fab构建体的表达水平和浓度对于筛选是不可接受的。在此细胞测定中，Fc-FBG产生低nM水平下的稳健SEAP信号(CD4-FBG在此浓度范围内不产生应答)。
根据供应商的方案(http://www.invivogen.com/PDF/THP1_Blue_NF_kB_TDS.pdf)培养THP1-BlueTM细胞并在补充的RPMI培养基中传代，除了细胞在超低附着T75烧瓶中生长之外。对于测定，将THP1-BlueTM细胞添加到总体积是170μl的含有RPMI培养基中的Fc-FBG(3或10nM)的96孔组织培养板(100,000细胞/孔)中。将含有表达的scFv-Fc或Fab的培养物上清液或PBS中的亲和纯化抗体以30μl的体积添加，并将细胞在37℃下温育18小时。收获上清液，并根据供应商的说明书，使用DuoSet ELISA开发系统(DY208；英国的R&DSystems)使用Attophos AP荧光定量系统(S1000；普洛麦格(Promega))或IL-8含量来测定SEAP。绘制数据并使用Prism软件(GraphPad)拟合曲线。
筛选抗FBG抗体作为THP1-BlueTM细胞中的Fc-His-FBG诱发的信号传导的HEK293F培养物上清液突出显示的假定抑制剂，其中当作为纯化scFv-Fc或Fab重新测定时确认9。Fc-His-FBG是进行潜能测定工作的关键。单体FBG在THP-1Blue和人类细胞中不引起任何细胞因子应答。
实例4-一级抗FBG抗体的功能表征
ELISA交叉反应性测定
通过ELISA评估在THP1-BlueTM功能测定中识别的9种人类FBG信号传导抑制剂组与大鼠、小鼠和狗FBG的交叉反应性。还测定了与人类肌腱蛋白-R FBG同源物的结合。使测定孔涂布有人类、大鼠、小鼠和狗TNC FBG-rCD4或人类TNR FBG-rCd4融合蛋白质，并使用抗κ或抗λmAb然后使用铕缀合的抗小鼠mAb检测Fab的结合。ELISA结果揭露，C3抗体显示对人类TNC FBG的其它哺乳动物同源物的良好交叉反应性和较低的人类TNR FBG的表观结合。这些是：
通过表面等离子体共振确定结合亲和力
通过表面等离振子共振(SPR)在25℃下测量所选Fab与人类、大鼠和小鼠TNC FBG以及人类TNR FBG结合的亲和力和缔合和解离动力学。根据提供有人类Fab捕获药剂盒(通用电气(GE)，28-9583-25)的方案，使用具有CM5传感器芯片的BIAcore T100仪器进行实验。将不同浓度的rCd4-FBG注入具有固定化Fab和参考流动池的流动池中。在参考信号减法之后，使用T100BIAevaluation软件将数据拟合到球形1:1拟合。
计算出的动力学常数显示于表3中。Fabs对人类TNC FBG的亲和力等级顺序是B12(110pM)>。所有Fab对啮齿动物TNC FBG显示出低纳摩尔亲和力，并且对人类TNRFBG的亲和力通常比人类TNR FBG低60倍。
抑制潜能测定
使用TLR4介导的分泌的碱性磷酸酶和IL-8细胞因子产生的测量结果，在THP1-BlueTM测定中确定纯化Fab对于中和huFc-His-FBG活性的潜能。如实例2中所描述进行测定，不同之处在于将纯化Fab以一定浓度范围(0.3-100nM)添加到测定孔中以能够使用Prism软件(GraphPad)计算IC50值。
本公开的C3抗体衍生自称为B12的抗体。
Figure BDA0001807689530000301
表1-通过表面等离子体共振(SPR)光谱法测定的抗FBG Fab结合动力学数据。KD，平衡解离常数；Ka，缔合常数；Kd，解离常数
实例5-产生并分离针对huTNC FBG结构域的优化抗体
通过靶向CDR诱变进行亲和力成熟
选择抗FBG抗体B12以用于亲和力成熟。通过使用Kunkel诱变(Fellouse和Sidhu，2007；Kunkel等人，1987；Sidhu和Weiss，2004)在具有6个氨基酸的区段中随机化VH和VLCDR3残基来进行靶向CDR诱变。由于给定克隆的VH CDR3(10-16个残基)较长，随机化在三个重叠区段中进行，并且VL CDR3(9个残基)在两个重叠区段中进行随机化。使用NNS(N＝A/G/C/T和S＝G/C)简并引物进行随机化，所述简并引物可编码来自32个密码子组合的给定位置处的20个氨基酸中的任一个(并且仅单个琥珀终止密码子)。创建了以下文库。
Figure BDA0001807689530000302
表2-CDR3随机化文库的估计大小
高严格性噬菌体展示选择
如前所述(Dyson等人，2011)进行链霉亲和素Dynabeads上的噬菌体-抗体选择。在生物素化rCd4-His-FBG上进行多轮溶液相选择以富集亲和力改善的克隆。通过针对一系列抗原浓度进行选择并将输出数与无抗原对照物进行比较，凭经验确定每轮的最佳抗原浓度。通过减少每轮中使用的抗原量来增加选择的严格性。在选择窗口(来自选择输出的噬菌体滴度与没有抗原对照物之间的倍数差异)降到10以下后，没有进行下一轮的选择。因此，对于除由于在第3轮观察到大选择窗口而经受第四轮选择的B12之外的所有文库，对生物素化人类rCd4-His-FBG进行三轮选择。在每轮选择中对所有文库进行针对链霉亲和素珠和肌腱蛋白-R(第1轮到第3轮100nM和第4轮1nM)的取消选择以避免与链霉亲和素或肌腱蛋白-R的不希望的交叉反应性。另外，仅对B12随机化文库进行混合选择策略，在所述杂交选择策略中人类和小鼠抗原在轮次选择之间交替。在B12文库上进行这种额外选择的原因是观察到的结合到人类和小鼠rCd4-his-FBG的B12亲本抗体的亲和力的差异很大。此外，进行另外一轮选择以选择具有优异解离速率的抗体克隆。在解离速率选择中，允许噬菌体与生物素化抗原(在这种情况下为1nM)结合，随后将大量过量的非生物素化抗原(500nM)添加到反应中并温育20小时或40小时。非生物素化抗原充当竞争者并捕获与生物素化抗原分离的噬菌体抗体，即在选择结束时仅回收具有较长解离速率的抗体(Hawkins等人，1992；Zahnd等人，2010)。每轮选择的输出噬菌体滴度以及计算出的选择窗口显示于下表3到5中。
Figure BDA0001807689530000311
表3-选择输出滴度。第1轮选择。如前所述(Schofield等人，2007)测定噬菌体输出滴度。
Figure BDA0001807689530000312
表4-选择输出滴度。第2轮选择。如前所述(Schofield等人，2007)测定噬菌体输出滴度。
Figure BDA0001807689530000321
表5-选择输出滴度。第3轮选择。如前所述(Schofield等人，2007)测定噬菌体输出滴度。
ELISA筛选
进行抗FLAG捕获ELISA以筛选与亲本抗体相比具有对于小鼠FBG结合的改善亲和力的克隆。
如前所述(Schofield等人，2007)，在具有自诱导培养基的96孔板中诱导携有scFvpSANG10表达质粒的大肠杆菌克隆。收获大肠杆菌上清液以用于ELISA测定。ELISA使用具有铕标记的抗FLAG抗体(英国的西格玛(Sigma)，奥德里奇(Aldrich))的DELFIA(解离增强的镧系元素荧光免疫测定)系统。在通过添加2％奶粉PBS(PBS-M，每孔300μl)封闭的孔中，使黑色免疫吸附板(Nunc)过夜涂布有抗FLAG M2抗体(西格玛，F3165，PBS中5μg/ml，每孔50μl)。将板用PBS-T(PBS，0.1％Tween-20)洗涤三次并用PBS洗涤三次，然后添加1:2稀释的含有在PBS-M中表达的scFv的96孔自诱导培养上清液(每孔50μl)。将板温育1小时，如上进行洗涤，并将生物素化小鼠或人类rCd4-His-FBG(在PBS-M中5μg/ml，50μl)添加到每个孔中。将板再温育1小时，洗涤并添加链霉亲和素-Eu(珀金埃尔默(Perkin Elmer)，1μg/ml，PBS-M，50μl)，温育30分钟，洗涤并添加DELFIA增强溶液(50μl)并在板上读取珀金埃尔默融合板读数器(激发＝320nm，发射620nm)上读取板。
在此测定中，scFv表达水平的差异被标准化，因为自诱导培养物中的scFv的表达水平使抗FLAG涂布的孔饱和。因此，在所述测定中获得的信号反映了洗涤后结合的生物素化rCd4-His-FBG的量，这将是小鼠或人类FBG的所述克隆的解离速率的函数。来自B12亚文库的选择输出的ELISA筛选揭露了具有改善的与小鼠TNC FBG的结合的克隆。
HTRF筛选
开发基于HTRF的竞争测定以筛选具有改善的与人类TNC FBG结合的抗体变体。
在4×所述浓度下的测定缓冲液(50mM NaPO4，0.1％BSA，0.4M KF，pH 7.0)中制备所有的样品和试剂。随后将5μl每种试剂添加到低体积的384孔测定板(葛莱娜(Greiner)，784075)中，得到20μl的最终反应体积。按照制造商的指示，使用d2标记药剂盒(CisBio，62D2DPEA)标记IgG抗体。如制造商所推荐，以每20μl反应1.8ng活性部分(SA)的最终浓度使用链霉亲和素铕穴合物(CisBio，610SAKLA，Lot#25C)。使用EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂(赛默科技(Thermo Scientific)，21327)制备生物素化rCd4-His-FBG，使用生物素化荧光定量药剂盒(赛默科技，46610)定量生物素化程度。适当时，将含有scFv的上清液(如上所述制备以用于ELISA测定)以1/20(即在测定缓冲液中1/5稀释，然后将5μl稀释样品添加到20μl FRET测定中)的最终稀释度添加到384孔测定板中。用于筛选的d2标记的B12IgG的浓度是1.25nM。除非另有说明，否则生物素化rCd4-His-FBG(生物素:蛋白质比率＝1.8:1)以2.2nM存在(于使用2A5IgG抗体的测定中)或1nM存在(于使用B12IgG的实验中)。将样品在室温下温育约1小时，并使用BMG Pherastar仪器测定FRET信号：激发＝320nm；发射＝620nm和665nm；积分开始时间＝60μs；积分时间＝500μs；每孔100次闪烁。对于含有培养上清液的竞争测定，将生物素化rCd4-His-FBG抗原与链霉亲和素铕穴合物一起预温育45分钟，然后将试剂添加到测定板中。所有FRET信号均表示为ΔR，其中R＝(E665/E620×104)并且ΔR＝(R样品-R背景荧光)。
测试含有来自亲和力选择的突变体文库的未标记scFv克隆的培养物上清液对FBG与荧光团标记的亲本IgG抗体之间的相互作用的抑制。在两种测定中在有用范围内显示FRET信号的克隆的相对等级大致未改变，这表明其在竞争相似的表位。因此，筛选来自亲和力成熟选择的所有B12scFv变体的抑制B12IgG分子与人类TNC FBG结合的能力。将表达为与亲和力成熟的克隆平行的scFv的亲本克隆用作基准。
对ScFv进行测序，并分别基于在ELISA和HTRF测定中其与小鼠和人类TNC FBG的结合，选择具有独特VH或VL CDR3序列的一组克隆以用于人类IgG4格式的进一步研究。
Figure BDA0001807689530000331
Figure BDA0001807689530000341
表6-针对具有对于人类rCD4-FBG的改善亲和力的克隆的HTRF筛选。
抗体B12的变体显示小鼠FBG结合的≥4倍改善和HTRF信号的≥91％抑制。总之，下面识别了具有独特CDR3序列的符合这些标准的31个克隆。
Figure BDA0001807689530000342
表7-经与小鼠和人类TNC FBG的改善结合识别并为转化成人类IgG格式以用于进一步研究而选择的克隆的重链或轻链CDR3序列。
这些是结合到人类和小鼠TNC FBG的抗体克隆的重链或轻链序列，因此在本发明的方法、用途、组合物和化合物中具有潜在的用途。举例来说，结合具有这些CDR3序列的TNFFBG的抗体可用于识别、抑制功能、检测和纯化TNC或TNC FBG。
转化为IgG4格式并确定结合动力学
将受到关注的31scFv亚克隆到人类IgG4表达载体中以用于产生作为具有铰链稳定突变的人类IgG4的抗体(S241P；Angal等人，1993)。在HEK-293F细胞中瞬时地表达IgG4抗体，并使用表面等离子体共振光谱法筛选培养物上清液以对其对与人类和小鼠TNC FBG和人类TNR FBG结合的解离率分等级。简单来说，使用BIAcore T100仪器进行表面等离子体共振(SPR)实验，并遵循根据人类抗体捕获药剂盒方案(通用电气，BR-1008-39)的方案。对于解离速率筛选，根据胺偶联药剂盒方案(通用电气，BR-1000-50)使用EDC/NHS交联化学将10,000个应答单位(RU)的抗人类Fc IgG(通用电气，BR-1008-39)固定在具有5系列CM5葡聚糖传感器芯片(BR-1005-30)的流动池(FC1和FC2)上。将含有表达的IgG4的培养物上清液用2×PBS-T稀释1:2并注入FC2(流速5μl/min，60s接触时间)中以使得在25℃下的抗体捕获成为可能。抗体捕获水平范围是308到1975RU，这取决于上清液中的抗体的表达水平。
用流动通路经由FC 1(参考流动池)和FC 2(抗体捕获流动池)注射固定浓度的抗原(15nM人类和小鼠TNC rCd4-His-FBG和100nM人类TNR rCd4-His-FBG)，并且流速是30μl/min，并且分别在1和5min时间段内测量缔合相和解离相。结合表面的再生采用3M MgCl2并且接触时间是30秒。通过参考细胞减法并使用BIAevaluation软件(通用电气，BR-1005-97)拟合假设1:1相互作用的传感图实验数据来确定解离速率。解离速率筛选的结果总结在下表8中。
Figure BDA0001807689530000351
表8-用于对人类IgG4抗FBG解离速率分等级的表面等离子体共振筛选
根据人类和小鼠TNC rCd4-His-FBG的低解离速率和人类TNR rCd4-His-FBG的高解离速率对克隆进行分等级。对来自每个文库的3个最高等级的抗体进行优先化以作为纯化IgG4进行更详细的动力学分析。这些克隆显示于下表9中。
克隆 VH CDR3
B12亲本 DISAVPDTFDI SEQ ID NO:5
165_13_B1 <u>VM</u>S<u>SME</u>D<u>A</u>FDI SEQ ID NO:12
165_13_D1 <u>GTRGEG</u>DTFDI SEQ ID NO:16
165_13_C3 <u>SYQSDE</u>D<u>A</u>FDI SEQ ID NO:18
表9-具有改善的FBG结合解离速率特征的B12突变体的重链CDR3氨基酸序列(下划线标出显示在B12亲本中改变的氨基酸)。
评估9种优先化IgG4抗体的详细动力学参数。测定与人类、大鼠和狗TNC rCD4-His-FBG和人类TNR rCD4-His-FBG的相互作用的结合特征。动力学测定基本上遵循与上述解离速率测定相同的方案，并且如下进行一些修改。为了提高动力学参数测定的准确性，将抗人类Fc IgG以较低水平(2229RU)固定化，引起所捕获的抗FBG IgG4的量相应减少。将纯化抗FBG IgG4稀释到浓度为在PBS，pH 7.4，0.05％Tween-20中3.5nM，并以10μl/min的流速注入FC2中，接触时间是60秒。这通常导致平均的80RU所捕获的抗体(范围：55RU到90RU)。通过在PBS，pH7.4，0.05％Tween-20(最高浓度100nM，7nM的小鼠rCD4-His-FBG除外)中倍增稀释来制备抗原。测定在37℃(30μl/min，120秒接触时间；小鼠rCD4-His-FBGFBG 10μl/min，60秒接触时间)下进行，并且将流动池和注射腔室均平衡到此温度。如前所述，通过参考细胞减法并使用BIAevaluation软件(通用电气，BR-1005-97)拟合假设1:1相互作用的传感图实验数据来确定动力学参数。
与非亲和力成熟的亲本克隆相比，所有九种抗体均显示出与小鼠TNC FBG结构域的改善结合，并且抗体165_13_B1、165_13_C3和160_01_A4表现出与人类TNC FBG结合的亚纳摩尔KD值，并且对人类TNR FBG类似物的亲和力低于>70倍：
Figure BDA0001807689530000361
表10-在37℃下通过表面等离振子共振测定的抗FBG IgG4结合动力学数据。
实例7-抗FBG IgG4与瓜氨酸化FBG的结合
通过表面等离振子共振(SPR)测定抗体B12与瓜氨酸化FBG的结合亲和力。使用QMCF表达技术(爱沙尼亚的Icosagen)将B12表达为具有铰链稳定化S241P突变的人类IgG4，并通过蛋白质A亲和力层析法(MabSelect Sure；通用电气医疗(GE Healthcare))纯化。
人类TNC FBG的瓜氨酸化
根据供应商的说明书，使用肽基精氨酸脱亚胺酶2(PAD2；MQ-16.201-2.5，Modiquest，NL)或肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4；MQ-16.203-2.5，Modiquest，NL)将纯化人类His-FBG瓜氨酸化。简单来说，将His-FBG稀释到在所供应的脱亚氨化缓冲液(0.1M Tris-HCl pH 7.5，10mM CaCl2，5mM二硫苏糖醇)中1mg/ml，并且将250μl与125MU PAD2或PAD4酶混合，随后在37℃下温育2小时。通过酶处理的样品的氨基酸分析证实了瓜氨酸化。将脫亚胺化缓冲液中的His-FBG的等分试样在37℃下在不添加PAD酶的情况下温育2小时以用作非瓜氨酸化对照蛋白。如下所述，将瓜氨酸化和未修饰的His-FBG蛋白质用于SPR实验中。
表面等离子体共振
SPR实验在BIAcore 3000仪器上进行。使用氨基偶联化学将抗人类IgG(通用电气医疗)共价偶联到CM5传感器芯片的表面。以RU单位表达的偶联抗人类IgG的量在6500-7000(6.5-7.0ng/mm2)之间变化。在25℃下，将B12-hIgG4(1-13nM)与HBS-EP缓冲液(10mMHepes、0.15M NaCl、2.5mM EDTA和0.005％Tween-20)中的固定化抗人类IgG连接。还在25℃下的HBS-EP缓冲液中测量His-FBG变体与固定化B12-hIgG4的结合。固定化实验中的流速是5μl/min，并且动力学分析的流速是20μl/min。使用3M MgCl2再生传感器芯片表面。使用BIAevaluation程序4.1(通用电气医疗)分析数据。
B12-IgG4与瓜氨酸化His-FBG结合的分析揭露，当与用于结合到未修饰His-FBG获得的值相比，动力学参数基本不变。这些结果表明，预期B12谱系的抗FBG抗体在治疗或诊断应用中结合瓜氨酸化和非瓜氨酸化形式的TNC FBG：
分析物 K<sub>D</sub>(M) K<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) K<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>)
His-FBG (1.7±0.3)×10<sup>-10</sup> (4.1±0.6)×10<sup>6</sup> (6.8±0.9)×10<sup>-4</sup>
His-FBG+PAD2 (3.2±0.3)×10<sup>-10</sup> (3.0±0.4)×10<sup>6</sup> (9.6±0.8)×10<sup>-4</sup>
His-FBG+PAD4 (3.2±0.7)×10<sup>-10</sup> (2.6±0.6)×10<sup>6</sup> (7.8±0.4)×10<sup>-4</sup>
表11-B12-hIgG4与His-FBG变体的相互作用的动力学参数。每个动力学参数代表3次独立测定的平均值±s.d.。
实例8-使用免疫组织化学检测人类RA组织中的TNC FBG
进行免疫组织化学研究以确定抗FBG抗体是否有效识别人类组织中的人类TNCFBG蛋白的内源形式。肌腱蛋白-C在慢性炎症部位表达，并且其在来自患有类风湿性关节炎的个体的关节的发炎滑膜内的定位先前已经通过使用市售抗体的免疫组织化学证实(Goh等人，2010；Salter DM，1993)。
使用QMCF表达技术(Icosagen，爱沙尼亚)将B12抗体表达为小鼠IgG2a格式，并通过蛋白质G亲和力层析法然后通过Superdex 200凝胶过滤法纯化。将识别全长人类肌腱蛋白-C的EGF结构域的对照小鼠IgG1抗肌腱蛋白-C抗体(克隆4F10TT；宝生物技术克隆技术(Takara Clontech))用作阳性对照比较物。将针对无关细菌抗原的小鼠IgG1(Dako X0931)或IgG2a(Dako X0943)用作对照一级抗体以确定这些同种型的非特异性背景染色的水平。将来自患有确认的RA诊断(英国的Asterand)的供体的人类膝关节滑膜的冷冻切片平衡到室温，在1:1v/v丙酮/甲醇中固定(10分钟)，并转移到洗涤缓冲液。根据制造商的方案，使用具有Envision Flex试剂的Dako自动染色仪(Dako K8010)进行免疫染色。简单来说，将固定的组织载玻片置于自动染色仪上并在施用一级抗体(B12或克隆4F10TT；1、2或4μg/ml)30分钟之前阻断(过氧化物酶阻断，5分钟；蛋白质阻断，10分钟，Dako X0909)。在一些对照物中，载玻片未暴露于一级抗体。洗涤后，施用HRP标记的山羊抗小鼠二级抗体(20分钟)并再次洗涤载玻片，然后施用DAB+Chromogen 10分钟。洗涤载玻片，用苏木精复染并盖上载玻片以用于显微镜观察染色。
在使用丙酮/甲醇固定的RA滑膜的冷冻切片中，抗TNC FBG B12小鼠IgG2a显示出与用阳性对照抗体克隆4F10TT获得的染色模式非常相似的染色模式。在滑膜、纤维囊、脉管系统中和间质内观察到特异性免疫染色。淋巴聚集体内没有染色。一些非特异性免疫染色存在于非免疫对照物处理的组织中。这些结果证实并扩展了关于RA滑膜内肌腱蛋白-C表达的先前报道，这证明B12是用于在炎症部位处的结合内源性肌腱蛋白-C的有效药剂并进一步表明FBG是RA中的可接近靶标。
实例9-抗体序列
VH和VL序列中的CDR由框表示。
抗体B12
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:DISAVPDTFDI(SEQ ID NO:5)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000381
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0001807689530000382
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK
Figure BDA0001807689530000383
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:6)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPASLPTPVGDRVTITC
Figure BDA0001807689530000384
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0001807689530000385
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0001807689530000386
FGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:10)；或
DIQMTQSPASLPTPVGDRVTITC
Figure BDA0001807689530000387
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0001807689530000388
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0001807689530000389
FGQGTKVDIK(SEQ ID NO:11)
抗体B12*
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:DISAVPDTFDI(SEQ ID NO:5)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDISAVPDTFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:6)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:22)；或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO:23)，或
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)，
抗体165_13_B1*(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:
Figure BDA0001807689530000391
(SEQ ID NO:12)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000392
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0001807689530000393
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK
Figure BDA0001807689530000394
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:13)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:22)；或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO:23)，或
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)。
抗体165_13_B6*(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:
Figure BDA0001807689530000401
(SEQ ID NO:14)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000402
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0001807689530000403
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK
Figure BDA0001807689530000404
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:15)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:22)；或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO:23)，或
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)。
抗体165_13_D1(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:
Figure BDA0001807689530000411
(SEQ ID NO:16)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000412
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0001807689530000413
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK
Figure BDA0001807689530000414
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:17)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:22)；或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO:23)，
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)。
抗体165_13_C3(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:
Figure BDA0001807689530000415
(SEQ ID NO:18)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000416
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0001807689530000417
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK
Figure BDA0001807689530000421
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:19)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPASLPTPVGDRVTITC
Figure BDA0001807689530000422
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0001807689530000423
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0001807689530000424
FGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:10)；或
DIQMTQSPASLPTPVGDRVTITC
Figure BDA0001807689530000425
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0001807689530000426
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0001807689530000427
FGQGTKVDIK(SEQ ID NO:11)
抗体165_13_C3*(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:SYQSDEDAFDI(SEQ ID NO:18)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKSYQSDEDAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:19)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:22)；或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO:23)，或
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)。
抗体165_13_D4*(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:
Figure BDA0001807689530000431
(SEQ ID NO:24)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000432
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0001807689530000433
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK
Figure BDA0001807689530000434
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:25)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:22)；或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO:23)，
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)。
抗体165_13_A4*(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:
Figure BDA0001807689530000435
(SEQ ID NO:26)
VH氨基酸序列：
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000436
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0001807689530000437
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK
Figure BDA0001807689530000438
WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:27)
VL CDR1:RASQYIQGFLN(SEQ ID NO:7)
VL CDR2:DASNLET(SEQ ID NO:8)
VL CDR3:QQSYSTPQT(SEQ ID NO:9)
VL氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKR(SEQ ID NO:22)；或
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIK(SEQ ID NO:23)，或
轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIQGFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)。
抗体165_13_B3*(衍生自B12)
VH CDR1:DYAMH(SEQ ID NO:3)
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:4)
VH CDR3:
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抗体165_13_E1*(衍生自B12)
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抗体180_11_F5*(衍生自B12)
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IgG4 165_13_C3(具有如Angal 1993中所述的铰链修饰的恒定区)
参考：Angal S1、King DJ、Bodmer MW、Turner A、Lawson AD、Roberts G、PedleyB、Adair JR。《分子免疫学(Mol Immunol.)》1993年1月；30(1):105-8。
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKSYQSDEDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：34)
抗体B12
构架种系化：VH氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD
Figure BDA0001807689530000464
WVRQAPGKGLEWVS
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由于种系化序列的原因，CDR发生了变化：
VH CDR2:GISGSGGSTYYADSVKY(SEQ ID NO:20)
实例13-体外C3抗体的活性
为了确认单克隆抗体C3(165_13_C3)通过损坏TNC-FBG与其受体TLR4的结合起作用，首先开发了TLR4和Fc-His-FBG的体外结合测定，然后测定了具有C3的Fc-His-FBG的预温育效果。
将PBS(或单独的PBS)中的重组人类TLR4(R&D systems)(1ug/ml(14.6nM))与96孔板结合。在阻断(10％BSA)之后，添加指定浓度的人类Fc-His-FBG并且通过培育1μg/ml下的抗人类IgG1 MAb(AbD Serotec，克隆体2C11)、1μg/ml下的抗小鼠HRP缀合的二级抗体(AbDSerotec，STAR13B)和TMB基质进行检测。结果如图1A所示，显示n＝4均值和SEM。这一实验显示Fc-His-FBG以剂量依赖性方式在体外结合TLR4。
如图1B所示，单克隆抗体Ab C3破坏体外结合FBG和TLR4。
含重组人类TLR4的PBS(或单独的PBS)在阻断与C3Mab一起预培育的重组人类Fc-His-TNC-FBG(100nM)或添加同型对照抗体之后结合到96孔板。通过连续培育针对蛋白质的Fc部分的抗体、抗小鼠HRP缀合的二级抗体和TMB基质进行检测。相比于同型对照样品(IC50＝44.5nM)计算C3预培育样品中的百分比抑制。n＝4。
实例14-抗体B12和C3的抗炎作用
证实抗TNC-FBG抗体B12和C3(165_13_C3)在生物系统中具有抗炎作用。为了做到这一点，通过聚蔗糖(Ficoll)梯度和逆流离心自外周血(伦敦血库)分离人类单核细胞。单核细胞接着用100ng/ml M-CSF(Peprotec)分化5天以产生M2巨噬细胞。
如由图2A中的结果所示，重组人类Fc-TNC FBG(1μM)或LPS(Enzo)(1ng/ml)用MAbC3(1、0.2和0.04μM)或同型对照(Eureka)MAb(1μM)在室温下预培育30分钟，随后一式三份地添加到人类M2巨噬细胞培养物。24小时后，取上清液，并且经受IL-8、IL-6和TNF细胞因子ELISA(BD Biosciences)，n＝3。这些结果表明，1μM C3通过用TNC-FBG刺激的人类M2巨噬细胞大大减少促炎细胞因子释放，这种降低对于IL-8和TNF都具有统计学意义。正如预期的那样，C3对LPS诱导的细胞因子释放没有影响。
图2B显示来自实验的结果，其中重组鼠类Fc-TNC FBG(1μM)用MAb C3(1、0.2和0.04μM)或同型对照MAb(Eureka)(1μM)在室温下预培育30分钟，随后一式三份地添加到人类M2巨噬细胞培养物。24小时后，取上清液，并且经受细胞因子ELISA。n＝3或更大，显示平均值和SEM。再次，1μM下的C3大大减少通过巨噬细胞的鼠类Fc-TNC-FBG诱导的细胞因子释放，指示抗体的良好跨种反应性。
为了证实FBG诱导的细胞因子释放通过FBG而不是蛋白质的Fc部分诱导，使用Fc部分突变为非活性的蛋白质(Fc-Mut-FBG)，也测试抗TNC-FBG抗体B12、C3(165_13_C3)和A4(160_01_A4)相对于这一分子的活性。在室温下预培育Fc-Mut-FBG(1μM)和C3、A4或B12(1μM)30分钟，随后添加到人类M2巨噬细胞培养物。24小时后，取上清液，并且经受细胞因子ELISA。n＝3，显示平均值和SEM。结果显示于图2C中。这一实验证实Fc-His-FBG诱导的细胞因子合成不归因于通过Fc受体的Fc部分信号传导。另外，其显示相关抗体B12和A4以及C3的预培育通过人类M2巨噬细胞大大减少FBG诱导的细胞因子释放。
图3A显示单克隆抗体B12通过用人类TNC-FBG刺激的初生人类巨噬细胞减少促炎性细胞因子的产生。在所述实验中，重组人类肌腱蛋白C FBG(1μM)用MAb B12(1、0.1、0.01或0.001μM)或同型对照MAb(1μM)在室温下预培育30分钟，随后一式三份地添加到人类M2巨噬细胞培养物。24小时后，取上清液,并且经受细胞因子ELISA，n＝1。在这里我们再次看到B12抗体预培育减少FBG诱导的细胞因子释放，在这一供体IL-8中产生最小的响应。
图3B显示在实验室或更大规模产生的单克隆抗体C3在通过初生人类巨噬细胞的FBG诱导的细胞因子合成的阻断中显示相同功效水准。
为了将C3抗体用于动物研究，IgG4B12 165-13-C3产物在使用商业GS-CHO表达的领先的合同制造组织下克隆、表达和纯化。用于重链和轻链可变区的cDNA关于CHO表达最佳化且在克隆到表达载体中之前由Life Technologies合成(用商业信号序列)。CHO细胞转染为集合体并且最高表现集合体前进到大规模摇瓶生产(22L-11×2L于5L摇瓶中)。在第12天收获培养物之前的第4天和第8天施用专有饲料。在深度过滤和过滤灭菌之前将材料离心。使用切向流动过滤(30kDa分子量截止)进行材料的大致5.5倍浓缩并且所得浓缩物再次经过滤器杀菌，随后进行MabSelect SuRe纯化。洗脱产物并且中和产物，并且接着在20mMNaOAc，pH 5.5，150mM NaCl中浓缩/透滤为大致11mg/mL。还原和非还原SDS-PAGE分析连同尺寸排阻-HPLC显示高纯度和大于98％单体的材料。内毒素小于0.1Eu/mg。
在这一实验中，将较大标度抗体批次的效能相比于当前较小标度批次。重组人类肌腱蛋白C FBG(1μM)用MAb C3(1、0.2和0.04μM)或同型对照MAb(1μM)在室温下预培育30min，随后一式三份地添加到人类M2巨噬细胞培养物。24小时后，取上清液，并且进行细胞因子ELISA。n＝1，Ico＝实验室规模Lon＝较大规模的材料。此实验显示两批抗体在FBG诱导的细胞因子合成的减少中显示相同效能，即结果一致，无关于生产。
实例15-单克隆抗体C3(165_13_C3)通过用人类TNC-FBG刺激的RA滑膜成纤维细胞减少促炎细胞因子的产生。
已报导滑膜成纤维细胞可为RA中的促炎性细胞因子释放的重要来源(R Bucala等人(1991)通过类风湿性滑膜成纤维细胞组成型产生促进细胞分裂和发炎性细胞因子(Constitutive Production of Mitogenic and Inflammatory Cytokines byRheumatoid Synovial Fibroblasts.)《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》173:569-574)，因此测试C3抗体是否也显示与巨噬细胞类似的对于FBG诱导的细胞因子释放的效应。
人类RA成纤维细胞通过组织在含有0.5mg/ml释放酶(Liberase)(Roche)和0.2mg/ml DNA酶(Roche)的RPMI(Lonza)中的消化和在37℃下培育1-1.5小时而从供体RA滑膜组织生长出。所得组织吹吸通过200μm尼龙网格；将不穿过网格的材料置于含有具有10％FBS(Life technologies)和1％青霉素/链霉素(Life technologies)的RPMI的皮氏培养皿中且在37℃下培育5天。在5天之后，滑膜成纤维细胞从组织生长出且从RA滑膜成纤维细胞(RASF)培养物去除其余的组织，所述培养物随后维持于含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM(Lonza)中。对于该实验，将RASF以1×104个细胞/孔铺板。重组人类TNC-FBG(1μM)用MAb C3(1、0.2和0.04μM)或同型对照MAb(1μM)在室温下预培育30分钟，随后一式三份地添加到滑膜成纤维细胞培养物。24小时后，取上清液，并且经受细胞因子ELISA。n＝1，显示平均值和SEM(参见图4)。
这些结果指示C3起减少RA滑膜成纤维细胞中的FBG诱导的促炎性细胞因子释放(IL-8和IL-6两者)的作用，显示此为发炎RA关节中发现的多种细胞类型的潜在机制。
实例16-大鼠模型中肌腱蛋白-C的水平。
证实了肌腱蛋白C在小鼠和大鼠CIA(胶原蛋白诱导性关节炎)模型中的表达且显示疾病活性与临床评分相关。
图5显示测量在两个独立CIA研究(KWS)结束时自大鼠脚爪清洗的滑膜流体中的肌腱蛋白C的水准的实验的结果。通过ELISA(IBL，大型(FN III-B)试剂盒)测量肌腱蛋白C水准。测量的TNC水准接着与临床评分相关，所述临床评分与通过KWS指示的所述脚爪相关。这一实验显示爪的临床评分越高，来自所述爪的滑膜流体中可见的TNC的水准越高。这指示大鼠CIA模型为测试C3抗体的良好模型。
实例17-评估胶原蛋白诱导性关节炎的大鼠模型中的C3抗体
测试IgG4 C3(165_13_C3)在标准大鼠胶原蛋白诱导性关节炎模型中的治疗活性。将成年雄性路易斯大鼠随机分配到实验组并且使其适应一周。在第0天，通过在下背部的皮内注射向动物施用500μl II型牛胶原蛋白与不完全弗氏佐剂(CII/IFA)中的1mg/ml乳液。在第7天，动物接受第二次CII/IFA注射。注射在气体(异氟醚)麻醉下进行。根据显示于下表12中的施用时间表施用治疗。
表12.施用时间表
Figure BDA0001807689530000501
1完全人类IgG4同型对照，临床前级别，(ET904，Eureka Therapeutics)，n/a：不适用，IV：静脉内注射，ID：皮内注射，CII/IFA：II型胶原蛋白和不完全弗氏佐剂乳液，*第0天，第3天，第7天，第10天，第14天，第17天，第21天和第24天
从第7天直到实验结束，动物每周由无视于治疗的实验者关于关节炎的临床症状评分三次。在第0天、第14天、第21天和第28天，由无视于治疗的实验者使用器官充满度测量器(plethysmometer)测量爪体积。
结果
非特异性临床观察
从第0天直到实验结束，每天检查动物的非特异性临床症状，以包括异常姿势(驼背)、异常皮毛条件(竖毛)和异常活动水准(减少或增加的活动)。第6组中的一只动物(ID#6.9，抗体10mg/kg治疗)在第21天未从异氟烷麻醉中恢复。动物未显示任何非特异性临床症状，如异常姿势、异常皮毛条件和异常活动水准。第1组中的一只动物(ID#1.10，经载剂治疗)由于关节炎的临床症状的严重程度而在实验结束之前的第22天剔除。
临床分数
从第7天直到实验结束，动物每周关于关节炎的临床症状评分三次以包括前肢和后肢肿胀。实验者对治疗视而不见。每个肢体按五个等级评分：(0)没有肿胀，(1)轻微肿胀和/或红斑，(2)轻度肿胀，(3)中度肿胀和(4)重度肿胀和/或关节僵硬。通过添加每个肢体的评分来计算每只动物的临床评分。提供于图6中的数据经图示(每一实验组的平均值±SEM)并且通过双向ANOVA分析，接着为用于实验组之间的多个比较的邓尼特事后测试(Dunnett's post-test)。在第22天后使用载剂治疗的动物#1.10的最后记录评分。从动物#6.9记录的数据被排除在分析之外。当相比于第7天测量的临床评分时，载剂治疗组中的临床评分自第17天直至实验结束(第28天)显著增加(p<0.0001)。对照IgG4和IgG4 C3 1mg/mL剂量组在第7天与第28天实验结束之间与载体治疗组相比没有诱导任何显着差异。在第24天，与载剂治疗组相比，以3mg/kg施用的IgG4 C3诱导临床评分的显着降低(p<0.01)。当相比于载剂治疗组时，以10mg/kg施用的IgG4 C3从第22天直到实验结束(第28天)诱发临床评分的显著减少(p<0.01)。
爪子体积
在第0天、第14天、第21天和第28天，使用器官充满度测量器(水置换装置)测量后爪体积。测量在气体(异氟醚)麻醉下进行。实验者对治疗视而不见。对每一实验天来自每一动物的右后爪和左后爪体积取平均值。图7显示图示的数据(每一实验组的平均值±SEM)。通过双向ANOVA，接着为用于实验组之间的多个比较的邓尼特事后测试分析数据。在第28天使用载剂治疗的动物#1.10的最后记录值。从动物#6.9记录的数据被排除在分析之外。
当相比于第0天测量的爪体积，载剂治疗组中测量的爪体积自第14天直到实验结束(第28天)显著增加(在第14天，p<0.01，在第21天和第28天，p<0.0001)。在第0天与第28天之间，与载剂治疗组相比，对照IgG4和1mg/kg IgG4 C3剂量组没有诱导后爪体积的任何差异。与第28天的载剂治疗组相比，以3mg/kg施用的IgG4 C3诱导后爪体积的显着降低(p<0.01)。当相比于第21天(p<0.05)和第28天(p<0.01)的载剂治疗组时，以10mg/kg施用的IgG4 C3诱发后爪体积的显著减小。
结论
测试抗体IgG4 C3(165_13_C3)当以3mg/kg或10mg/kg施用时显著减轻临床症状的严重程度。
实例18-用于体内测试的方案
采用将成年雄性路易斯大鼠随机分配到实验组并且使其适应一周。在第0天，通过在下背部的皮内注射向动物施用500μl II型牛胶原蛋白与不完全弗氏佐剂(CII/IFA)中的1mg/ml乳液。在第7天，动物接受第二次CII/IFA注射。注射在气体(异氟醚)麻醉下进行。根据以下施用时间表施用治疗。从第0天直到实验结束，将动物每周称重三次。从第7天直到实验结束，由无视于治疗的实验者每周对动物进行三次评分以获得关节炎的临床症状。在第0天、第14天、第21天和第28天，由无视于治疗的实验者使用器官充满度测量器(plethysmometer)测量爪体积。
治疗组和剂量
治疗组和剂量总结在表13中。用于测试化合物的载剂是0.9％氯化钠溶液(盐水)。静脉内注射的施用体积是5ml/kg。所有组均是n＝10。
表13治疗组和剂量
Figure BDA0001807689530000521
n/a：不适用，IV：静脉内注射，IP：腹膜内注射，CII：II型胶原蛋白，IFA：不完全弗氏佐剂(Freund's adjuvant)，1：铰链修饰IgG4(S241P；Angal等人，1993)。
临床分数
从第7天到实验结束，每周对动物进行三次评分以获得关节炎的临床症状以包括前肢和后肢肿胀。实验者对治疗视而不见。每个肢体按五分制评分：(0)无肿胀，(1)轻微肿胀和/或红斑，(2)轻度肿胀，(3)中度肿胀和(4)严重肿胀和/或关节僵硬。通过添加每个肢体的分数来计算每只动物的临床分数。
在模型中，作为对照物的甲氨蝶呤减弱了临床系统。C3抗体减弱临床系统，C3*抗体显示出与此模型中的C3相似或更高的活性。
实例19-C3和C3*抗体人类和小鼠TNC FBG和人类TNR FBG的Biacore分析
动力学测定：表征人类和小鼠TNC rCd4-His-FBG和人类TNR rCd4-His-FBG与NSCT抗体的结合
进行SPR实验以测试165_13_C3*中产生的种系变化是否保留了165_13_C3的亲和力或特异性。根据人类抗体捕获药剂盒(通用电气，BR-1008-39)的方案，使用BIAcore T200仪器(通用电气医疗)进行SPR实验。
对于动力学测定，根据胺偶联药剂盒方案(通用电气，BR-1000-50)使用EDC/NHS交联化学在系列S CM5传感器芯片(BR-1005-30)上的所有流动池(FC1-4)中固定了～1,500-1,900个反应单位(RU)的抗人类Fc IgG(通用电气，BR-1008-39)。在25℃下将纯化NSCT抗体在HBS-P+(Hepes pH 7.4，150mM NaCl，0.05％Tween 20)运行缓冲液中稀释到浓度是3.5nM并注入FC2和FC4(使用流速10μL/min和115秒接触时间)中。抗体捕获水平范围通常是70RU(对于TNR相互作用)到90RU(对于TNC相互作用)。
将HBS-P+中的1:1稀释系列抗原(30nM人类和小鼠TNC rCd4-His-FBG和480nM人类TNR rCd4-His-FBG)用流动通路经由参考流动池(分别为FC1和FC3)和抗体捕获流动池(分别为FC2和FC4)注入，并且流速是30μl/min。对于人类和小鼠TNC rCd4-His-FBG分别在3.5和30分钟时间段内测量缔合相和解离相，对于人类TNR rCd4-His-FBG分别在2和8分钟时间段内测量。对于与人类和小鼠TNC rCD4-His-FBG的相互作用分析，在每次抗原注射后通过注射3M MgCl 2持续60秒进行游离捕获抗体表面的再生，并且对于每个样品注射，捕获新鲜的NSCT抗体。每次注射前用50％DMSO的额外针头洗涤步骤禁止携带抗原。在37℃的更生理学相关的温度下进行操作。
通过参考细胞减法并使用BIAcore T200评估软件2.0版将传感图实验数据拟合到1:1交互作用模型来确定动力学参数。结论：165_13_C3和165_13_C3*显示与测试的TNC FBG和TNR FBG蛋白的相当的结合。
Figure BDA0001807689530000541
表14通过表面等离子体共振(SPR)光谱法在37℃下测定的初始蛋白质样品的动力学结合数据。KD，平衡常数(M)；T Rmax，应答单位(RU)中的配体的理论最大结合水平；SA，表面活性百分比(％)；ka，缔合常数(1/Ms)；kd，解离常数(1/s)；Chi2，值是拟合紧密度的统计量度(通常<2)。U值是参数重要性的附加指标。这是表示计算出的速率常数和Rmax的独特性的参数，其通过测试拟合对所选变量之间的相关变化的依赖性来确定。值越低表示对结果越有信心。高值(高于约10)表明报道的动力学常数不含有有用信息。
实例20CHO池摇瓶生产中的165_13_C3和165_13_C3*的表达
将165_13_C3和165_13_C3*克隆到具有铰链修饰IgG4重链恒定区的GS-CHO表达载体中。如实例14中所描述产生细胞系并表达和纯化材料。表15中提供了浓缩和亲和纯化之前的细胞培养上清液的抗体滴度数据。IgG4 165_13_C3*的表达比IgG4 165_13_C3高三倍以上。
Figure BDA0001807689530000542
表15：在生产结束时细胞培养上清液的滴度
序列表
<110> 纳塞恩特公司
<120> 针对肌腱蛋白的人类抗体和其结合片段
<130> P000170_WO
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链氨基酸序列
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gln Gly Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 2
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链氨基酸序列
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Gln Ser Asp Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDHR1氨基酸序列
<400> 3
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2氨基酸序列
<400> 4
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体B12/B12* VH CDR3氨基酸序列
<400> 5
Asp Ile Ser Ala Val Pro Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Ser Ala Val Pro Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1氨基酸序列
<400> 7
Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gln Gly Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2氨基酸序列
<400> 8
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体CDRL3氨基酸序列
<400> 9
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln Thr
1 5
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL氨基酸序列
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Thr Pro Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gln Gly Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
100 105
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL氨基酸序列
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Thr Pro Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gln Gly Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 12
Val Met Ser Ser Met Glu Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Met Ser Ser Met Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 14
Gly Gln Lys Gly Glu Gly Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gln Lys Gly Glu Gly Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 16
Gly Thr Arg Gly Glu Gly Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Thr Arg Gly Glu Gly Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 18
Ser Tyr Gln Ser Asp Glu Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Gln Ser Asp Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2氨基酸序列-由于种系化序列而改变的CDR
<400> 20
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Tyr
<210> 21
<211> 0
<400> 21
000
<210> 22
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL氨基酸序列
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gln Gly Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL氨基酸序列
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gln Gly Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 24
Gly Thr Val Gly Glu Gly Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Thr Val Gly Glu Gly Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 26
Asp Lys Tyr Pro Val Leu Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Tyr Pro Val Leu Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 28
Ala Leu Ala Arg Gly His Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Leu Ala Arg Gly His Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 30
Asp Ile Ser Ala Val Met Asp Val Pro Gln Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Ser Ala Val Met Asp Val Pro Gln Thr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3氨基酸序列
<400> 32
Val Met Arg Thr Gly Leu Asp Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH氨基酸序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Met Arg Thr Gly Leu Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 被修饰的IgG4
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Gln Ser Asp Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体B12构架种系化VH氨基酸序列
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Tyr Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Ser Ala Val Pro Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
1 5
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 37
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 38
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 39
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
20 25
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 41
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 41
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 43
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 43
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 46
Asp Lys Thr His Thr Ser
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 47
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 48
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 49
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 50
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 50
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 51
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 52
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 53
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 54
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser
20
<210> 55
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 55
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25
<210> 56
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 56
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 57
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 58
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
20 25
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 59
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 60
Ala Thr Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 61
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu
1 5 10 15
Ser His Lys Ser Pro
20
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 62
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 66
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 68
Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 69
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val
1 5 10 15
Arg Pro
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 70
Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 71
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 71
Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Asn
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 72
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 73
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Arg Thr
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 74
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 75
Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 76
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 77
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 77
Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 78
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 79
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 80
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 80
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 81
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 81
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro
1 5 10 15
Pro Tyr
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 82
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 83
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 83
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 84
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头
<400> 85
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头
<400> 86
Pro Pro Pro Pro
1

Claims (13)

1.一种对肌腱蛋白C的FBG结构域具有特异性的人类抗体或抗原结合片段，其包含VL序列和VH序列，其中所述VL序列在SEQ ID NO: 23中示出，和所述VH序列在SEQ ID NO: 19中示出。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其是Fab或Fab'片段。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其是全长抗体。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中轻链包含如SEQ IDNO: 1中所示的序列。
5.根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中重链包含如SEQ IDNO: 2中所示的序列。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中重链包含如SEQ IDNO: 34中所示的序列。
7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
8.根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或抗原结合片段用于制备用于治疗类风湿性关节炎的药物的用途。
9.根据权利要求7所述的药物组合物用于制备用于治疗类风湿性关节炎的药物的用途。
10.一种编码根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或抗原结合片段的多核苷酸。
11.一种包含根据权利要求10所述的多核苷酸的载体。
12.一种包含根据权利要求10所述的多核苷酸的微生物宿主细胞。
13.一种包含根据权利要求11所述的载体的微生物宿主细胞。
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