CN110099924B - Gremlin-1晶体结构和抑制性抗体 - Google Patents

Gremlin-1晶体结构和抑制性抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人Gremlin‑1蛋白的晶体，以及与抑制性抗体复合的人Gremlin‑1蛋白。本发明还涉及人Gremlin‑1的结构(单独或与抗体复合)和这些结构在筛选调控Gremlin‑1活性的试剂中的用途。本发明进一步提供结合Gremlin‑1上的变构抑制位点的抗体，以及通过筛选方法鉴定的此类抗体和试剂的药物组合物和医学用途。

Description

GREMLIN-1晶体结构和抑制性抗体
【发明领域】
本发明涉及人Gremlin-1蛋白的晶体，以及与抑制性抗体复合的人Gremlin-1蛋白。本发明还涉及人Gremlin-1的结构(单独或与抗体复合)和这些结构在筛选调控Gremlin-1活性的试剂中的用途。本发明进一步提供结合Gremlin-1上的变构抑制位点的抗体，以及通过筛选方法鉴定的此类抗体和试剂的药物组合物和医学用途。
【技术背景】
Gremlin-1(也称为Drm和CKTSF1B1)是184个氨基酸的糖蛋白，其形成半胱氨酸结分泌蛋白的DAN家族的一部分(以及Cerberus和Dan等)。Gremlin可能通过VEGFR2的激动作用结合并抑制BMP-2、4和7发信号的能力以及记录的促血管生成作用。Gremlin-1的主要作用是在发育期间，其在肾脏形成和肢芽形成期间是至关重要的。这些重要的角色使得胚胎小鼠中的Gremlin纯合子敲除致死。
在成年期，Gremlin水平升高与特发性肺纤维化和肺动脉高压有关，其中BMP-2、4和7信号传导减少，TGF-β水平相关的升高。在糖尿病和慢性同种异体肾病中，Gremlin-1表达与纤维化评分相关。
Gremlin水平升高也与硬皮病、糖尿病肾病和结直肠癌有关。Gremlin-1已被证明可激活癌细胞侵袭和增殖，并被认为在子宫颈、肺、卵巢、肾、乳腺、结肠、胰腺和肉瘤中发挥作用。
迄今为止，研究Gremlin-1存在许多挑战，并且对Gremlin-1(及其伙伴Gremlin-2)缺乏一般性了解。BMP生物学复杂，并且物种之间存在高度同源性。Gremlin-1是一种难以处理的蛋白质，并且缺乏合适的工具和试剂来研究它的生物学。制作Gremlin-1也不是一个简单的过程；众所周知，半胱氨酸结蛋白质很难生产，Gremlin-1的游离半胱氨酸增加了挑战。Gremlin-1难以表达，更不用说纯化了。到目前为止，还没有结构信息，并且文献中关于这种蛋白质的信息很少。
【发明概述】
本发明中使用的术语Gremlin-1通常具有UniProt条目O60565中列出的序列(SEQID NO：1)。术语Gremlin-1也可以指Gremlin-1多肽，其中：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或由其组成，具有或不具有N末端信号肽，即可包含SEQ ID NO：21所示的成熟肽序列或由其组成；或
(b)是相对于具有或不具有N-末端信号肽的SEQ ID NO：1的氨基酸序列(如SEQ IDNO：21所示)具有一个或多个氨基酸取代、修饰、缺失或插入的衍生物，其保留了Gremlin-1的活性，例如SEQID NO：20的氨基酸序列。
(c)其变体，此类变体通常保持与SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：20或21)的至少约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性(或甚至约96％、97％、98％或99％的同一性)。换句话说，此类变体可以保持与SEQ ID NO：1的约60％-约99％的同一性，合适地与SEQ ID NO：1的约80％-约99％同一性，更合适地与SEQ ID NO：1的约90％-约99％的同一性，并且最合适地与SEQ ID NO：1的约95％-约99％同一性。变体在下面进一步描述。
如下文进一步讨论的，通常基于SEQ ID NO：1的序列引用残基编号。然而，技术人员可以容易地将残基编号外推至如上所讨论的衍生物或变体序列。在引用残基编号的情况下，本发明还包括变体或衍生序列上的这些残基。
本发明人单独结晶人Gremlin-1，并与称为Ab 7326(Fab片段)的抗体复合。Gremlin-1的结晶允许测定BMP结合位点中的推定残基。此外，用变构抑制性抗体Ab 7326进行结晶，可以确定抗体表位中的残基。结合该表位的抗体在治疗与Gremlin-1相关的疾病中具有作为治疗剂的潜力。
因此，本发明提供了Gremlin-1的晶体。
本发明还提供了由表1中的坐标所定义的人Gremlin-1的结构。
此外，本发明提供了：
·机器可读数据存储介质，其包括通过表1中Gremlin-1的结构坐标或定义该结构同源物的坐标所定义的机器可读数据编码的数据存储材料。
·使用表1中坐标所定义的Gremlin-1的结构作为结构模型。
·使用结构模型鉴定的试剂。
·筛选Gremlin-1活性的调控剂的方法，包括以下步骤：
(a)从表1中的结构坐标鉴定配体结合位点；
(b)鉴定与配体结合位点的至少部分相互作用的候选试剂；和
(c)获得或合成所述试剂。
·通过筛选方法鉴定的Gremlin-1调控剂。
·结合Gremlin-1上的表位的抗体，包含选自Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175的至少一个残基，其中残基编号基于SEQ ID NO：1。
·抗-Gremlin-1抗体，其包含在SEQ ID NO：10或12的重链可变区(HCVR)内含有的重链互补决定区(HCDR)序列和/或在SEQ ID NO：11或13的轻链可变区(LCVR)内含有的轻链互补决定区(LCDR)序列。
·抗-Gremlin-1抗体，其包含选自SEQ ID NO：3、4、5和6的至少一个HCDR序列和/或选自SEQ ID NO：7、8和9的至少一个LCDR序列。
·编码抗体的分离的多核苷酸。
·携带多核苷酸的表达载体。
·包含载体的宿主细胞。
·产生抗体的方法，包括在允许生产抗体的条件下培养宿主细胞，并且回收生产的抗体。
·包含抗体的药物组合物。
·用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中的抗体或药物组合物。
·治疗或预防肾纤维化例如糖尿病肾病、特发性肺纤维化、肺动脉高血压、血管生成和/或癌症的方法，包括给有此需要的患者施用治疗有效量的抗体或药物组合物。
【附图说明】
图1(表1)显示了Gremlin-1晶体学的结构数据。
图2显示了人Gremlin-1的结构。每种单体的带状表示以不同的灰度显示，手指1和2(F1和F2)与“手腕”区域(w)和半胱氨酸结(CK)一起标记。形成二硫键的半胱氨酸显示为黑色棒。
图3显示了人Gremlin-1和小鼠Gremlin-2(PRDC)的序列比对。标有星号的残基在BMP结合中是重要的，并且在二聚体界面中形成关键接触的残基被加框。
图4显示了突出呈现疏水性BMP结合残基的表面。单体以两个灰度显示，并且BMP结合中涉及的六个关键残基以白色显示。
图5显示人Gremlin-1和小鼠Gremlin-2的重叠。上图是两个蛋白质比对的带状表示。下图以棒状详细显示了BMP结合中涉及的氨基酸(白色的小鼠Gremlin-2和黑色的人Gremlin-1)。
图6(A)显示了在Hek Id1报告子基因测定法中全长Gremlin-1的抑制作用的代表。
图6(B)显示了在Hek Id1报告子基因测定法中截短的Gremlin-1的抑制作用的代表。
图7显示了在Hek-Id1报告子基因测定法中免疫衍生抗体的信号恢复百分比。
图8显示了Hek-Id1报告子基因测定法中文库衍生抗体的信号恢复百分比。
图9显示了Hek-Id1报告子基因测定法的结果，其中人Gremlin(图9A)和小鼠Gremlin(图9B)的滴定和抗体7326(显示为抗体PB376)在恢复BMP信号传导中的作用。
图10显示了Gremlin-Fab复合物的结构模型，其中可能的BMP结合区和Fab表位突出显示。
图11显示了以两种灰度描绘每种Gremlin-1单体的表面呈现，通过诱变鉴定的六个关键残基参与黑色中的BMP结合以及表面上的所有残基在这六个关键残基的内。
图12右心室收缩压(RVSP)的评估。在常氧和缺氧/SU5416处理的C57Bl/6小鼠中评估抗-Gremlin-1抗体对RVSP的作用。在雌性C57Bl/6小鼠中测定抗-Gremlin-1(n＝8)、IgG1抗体对照(n＝6)、PBS(n＝2)、伊马替尼(n＝8)对肺动脉高压(PAH)发展的影响，所述雌性C57Bl/6小鼠在暴露于慢性常压缺氧(10％O2)或常氧21天后，每三天皮下注射SU5416(20mg/kg)。测定RVSP并绘制平均RVSP±SEM。单因素ANOVA的*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001。
图13平均动脉系统压力(MABP)的评估。在用抗-Gremlin-1(n＝4)、IgG1抗体对照(n＝4)、伊马替尼(n＝4)和常氧/SU5416抗-Gremlin-1(n＝4)、IgG1抗体对照(n＝4)处理的缺氧/SU5416C57Bl/6小鼠中评估抗-Gremlin-1抗体对MABP的作用，并在21天后绘制MABP±SEM。单因素ANOVA的*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001。
图14右心室肥大的评估。在缺氧/SU5416C57Bl/6小鼠中评估抗-Gremlin-1抗体对右心室肥大(RV/LV+S)的作用。在雌性C57Bl/6小鼠中测定抗-Gremlin-1(n＝8)、IgG抗体对照(n＝6)、PBS(n＝2)、伊马替尼(n＝8)对肺动脉高压(PAH)发展的影响，所述雌性C57Bl/6小鼠在暴露于慢性常压缺氧(10％O2)或常氧21天后，每三天皮下注射SU5416(20mg/kg)。测定RVSP并绘制平均RVSP±SEM。单因素ANOVA的*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001。
图15肺血管肌肉化的组织学评估。评估抗-Gremlin-1抗体的作用。从抗-Gremlin-1(n＝6)、IgG抗体对照(n＝6)、伊马替尼(n＝6)分离的石蜡包埋的肺切片对平滑肌肌动蛋白(αSMA)进行染色以评估肌肉化程度和Von Willebrand因子(vWF)从而通过免疫组织化学鉴定内皮细胞。通过纳Nanozoomer虚拟显微镜(Hamamatsu，Welwyn Garden City，UK)将肺切片数字化，并且由独立的盲法观察者将每组>40个血管评分为无、部分地或完全地肌肉化的。绘制每个血管的模态评分的每组平均评分±SEM。石蜡包埋肺切片的代表性图像针对常氧IgG1；缺氧/SU5416IgG1；缺氧/SU5416伊马替尼；缺氧/SU5416抗-Gremlin-1的αSMA和vWF进行染色。单因素ANOVA的*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001。
【序列表的描述】
SEQ ID NO：1显示人Gremlin-1的序列，包括24个氨基酸的N-末端信号序列(Uniprot ID O60565)。
SEQ ID NO：2显示在结晶学中使用的截短的人Gremlin-1的序列，包括N-末端标签。
SEQ ID NO：3显示Ab 7326HCDR1(Chothia)。
SEQ ID NO：4显示Ab 7326HCDR1(Kabat)。
SEQ ID NO：5显示Ab 7326HCDR2(Kabat)。
SEQ ID NO：6显示Ab 7326HCDR3(Kabat)。
SEQ ID NO：7显示Ab 7326LCDR1(Kabat)。
SEQ ID NO：8显示Ab 7326LCDR2(Kabat)。
SEQ ID NO：9显示Ab 7326LCDR3(Kabat)。
SEQ ID NO：10显示Ab 7326重链可变区(变体1)。
SEQ ID NO：11显示Ab 7326轻链可变区(变体1)。
SEQ ID NO：12显示Ab 7326重链可变区(变体2)。
SEQ ID NO：13显示Ab 7326轻链可变区(变体2)。
SEQ ID NO：14显示小鼠Ab 7326全长IgG1重链(变体1)。
SEQ ID NO：15显示小鼠Ab 7326全长IgG1轻链(变体1)。
SEQ ID NO：16显示人Ab 7326全长IgG1重链(变体2)。
SEQ ID NO：17显示人Ab 7326全长IgG1轻链(变体2)。
SEQ ID NO：18显示Ab 7326Fab重链(变体1)。
SEQ ID NO：19显示Ab 7326Fab轻链(变体1)。
SEQ ID NO：20显示在结晶学中使用的截短的人Gremlin-1的序列，没有N-末端标签。
SEQ ID NO：21显示成熟Gremlin-1的序列(不含信号肽的SEQ ID NO：1)。
SEQ ID NO：22显示人IgG4P重链(变体1)。
SEQ ID NO：23显示人IgG4P轻链(变体1)。
SEQ ID NO：24显示人IgG1重链DNA(变体1)。
SEQ ID NO：25显示人IgG1轻链DNA(变体1)。
SEQ ID NO：26显示人IgG4P重链DNA(变体1)。
SEQ ID NO：27显示人IgG4P轻链DNA(变体1)。
SEQ ID NO：28显示小鼠全长IgG1重链(变体2)。
SEQ ID NO：29显示小鼠全长IgG1轻链(变体2)。
SEQ ID NO：30显示人全长IgG1重链(变体1)。
SEQ ID NO：31显示人全长IgG1轻链(变体1)。
SEQ ID NO：32显示Fab重链(变体2)。
SEQ ID NO：33显示Fab轻链(变体2)。
SEQ ID NO：34显示人IgG4P重链(变体2)。
SEQ ID NO：35显示人IgG4P轻链(变体2)。
【发明详述】
【Gremlin-1晶体结构】
本发明提供了人Gremlin-1的结构坐标。完整的坐标列于图1(表1)。
本发明还提供了人Gremlin-1晶体，其由C2空间群组成，晶胞尺寸为和/>
本发明进一步提供与抗体，更具体地是具有SEQ ID NO：18的重链和SEQ ID NO：19的轻链的Fab复合的Gremlin-1的晶体。
本发明还提供了机器可读数据存储介质，其包括用表1中Gremlin-1的结构坐标或定义该结构同源物的坐标所定义的机器可读数据编码的数据存储材料。
本发明提供了表1中的结构数据和机器可读数据存储介质的用途，作为Gremlin-1的结构模型。这种结构模型可用于筛选与Gremlin-1相互作用的试剂。筛选可以是高通量筛选。
与Gremlin-1相互作用的试剂通常是结合Gremlin-1的试剂。与Gremlin-1相互作用的试剂可以调控Gremlin-1。抑制性调控剂可以对Gremlin-1的任何功能产生影响，但通常降低Gremlin-1与BMP(BMP2/4/7)的结合。Gremlin-1是BMP的负调节因子，因此结合减少会增加通过BMP的信号传导。活化调控剂可以增加Gremlin-1与BMP的结合。
可以通过本领域已知的任何方法检测BMP结合和信号传导。例如，本申请的实施例描述了SMAD磷酸化测定法。SMAD1、5和8在BMP信号传导时被磷酸化。因此，SMAD磷酸化的增加可用于确定增加的BMP信号传导，其可反映与Gremlin-1结合的减少。
实施例还描述了Id1报告子基因测定法，其中Id1基因是BMP信号传导的靶基因。因此，该测定法中信号恢复的增加也可用于确定试剂是否抑制Gremlin-1与BMP的结合。
本文提及的试剂可以是可能与Gremlin-1相互作用的任何分子，但优选地是小分子或抗体。
本发明还提供筛选Gremlin-1活性的调控剂的方法，包括以下步骤：
(a)从表1中的结构坐标鉴定配体结合位点；
(b)鉴定与配体结合位点的至少部分相互作用的候选试剂；和
(c)获得或合成所述试剂。
配体结合位点可以是Gremlin-1上与蛋白质(配体)相互作用的任何推定位点。配体结合位点通常是BMP结合位点。如实施例中所示，本发明人基于Gremlin-1晶体结构已经鉴定了推定的BMP结合位点。该结合位点包含以下氨基酸：Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126和Phe138，其中残基编号基于SEQ ID NO：1。
因此，本发明的筛选方法包括鉴定与这些残基中的一个或多个，优选地这些残基中的至少2、3、4或所有6个残基相互作用的试剂。
试剂与蛋白质残基的相互作用可以通过本领域已知的任何合适的方法确定，例如通过X射线晶体学确定的残基和试剂之间的距离(通常小于或小于/>)。如下文实施例中所讨论的，可以被治疗剂靶向的Gremlin-1的区域可以包括氨基酸Asp92-Leu99、Arg116-His130、Ser137-Ser142、Cys176-Cys178。这些在Gremlin-1的表面上的那些突变的内。
筛选方法的步骤(a)和(b)通常在计算机中进行，并且可以通过本领域已知的任何方法获得和合成该试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了结合Gremlin-1上的表位的抗体，所述表位包含选自Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126和Phe138的至少一个残基，其中残基编号基于SEQ ID NO：1。本发明还提供了抗体，其结合包含所有Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126和Phe138的表位。
本发明还提供了Gremlin-1的这种BMP结合区用于产生(潜在抑制性)抗体的用途。例如，本发明提供了包含上述残基中的至少一个(优选所有)的抗原，其可用于抗体产生。
代替与Gremlin-1的BMP结合位点相互作用，试剂可以变构地发挥作用。这里，试剂远离正常结合位点而结合，但仍然能够调控Gremlin-1的活性，例如通过诱导蛋白质中的构象变化。因此，本发明的结构模型和筛选方法也可用于鉴定Gremlin-1的变构调控剂。
已发现本发明的Ab 7326抗体变构地发挥作用。该抗体的表位包含以下残基：Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175，其中残基编号基于SEQ ID NO：1。因此，本发明的筛选方法可以涉及鉴定与这些残基中的至少1、2、3、4、5或所有9个相互作用的试剂。然后可以测试这样的试剂，例如使用实施例中描述的用于抑制BMP结合的测定法。优选地，Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175位于Gremlin-1的一个单体上，并且Ile131位于Gremlin-1的另一个单体上(Gremlin-1二聚体与BMP二聚体结合)。
再次，本发明还包括包含这些残基中的至少一个(优选所有)的抗原，用于生产抗-Gremlin-1抗体。
同样，可以通过本领域已知的任何适当方法鉴定与这些残基相互作用的试剂。试剂优选地是小分子或抗体。
【抗体】
本发明提供结合Gremlin-1的抗体。
本文提及的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。抗体是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，间插有更保守的区域，称为框架区(FR)。
抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，通常是单克隆抗体。本发明的抗体可以是嵌合抗体、CDR-移植抗体、纳米抗体、人或人源化抗体或者其任何的抗原结合部分。为了生产单克隆和多克隆抗体，实验动物通常是非人哺乳动物，例如山羊、兔、大鼠或小鼠，但抗体也可以在其他物种中产生。
多克隆抗体可以通过常规方法产生，例如用目标抗原免疫合适的动物。随后可以从动物中取出血液并纯化IgG级分。
可以获得针对Gremlin-1的抗体，其中通过将多肽施用于动物，例如非人动物，对动物进行免疫是需要的，其中使用众所周知的常规方案，参见例如Handbook ofExperimental Immunology，D.M.Weir(ed.)，Vol 4，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，England，1986)。许多温血动物，如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪可以进行免疫。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的。
单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法制备，例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein，1975，Nature，256:495-497)、三体瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，Immunology Today，4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，pp77-96，Alan R Liss，Inc.，1985)。
本发明的抗体也可以使用单一淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达由选择用于生产特异性抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA通过例如Babcook，J.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377描述的方法产生。
本发明的抗体也可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法产生，并且包括Brinkman等(J.Immunol.Methods，1995,182:41-50)、Ames等(J.Immunol.Methods，1995,184:177-186)、Kettleborough等(Eur.J.Immunol.1994,24:952-958)、Persic等(Gene，19971879-18)、Burton等(Advances in Immunology，1994,57：191-280)和WO 90/02809；WO91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108公开的那些。
完全人抗体是这样的抗体，其中重链和轻链的可变区和恒定区(如果存在的话)都是人来源的，或者与人源的序列基本上相同，但不一定来自相同的抗体。完全人抗体的实例可包括例如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和由小鼠产生的抗体，其中鼠免疫球蛋白可变区和任选的恒定区基因已经被其人类对应物替代，例如EP 0546073、U5,545,806、US5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、US 5,770,429、EP 0438474和EP0463151中的一般术语所述。
备选地，可以通过包括用Gremlin-1免疫原免疫非人哺乳动物的方法生产根据本发明的抗体；从所述哺乳动物中获得抗体制备物；由此衍生识别Gremlin-1的单克隆抗体。
本发明的抗体分子可包含具有全长重链和轻链或者其片段或抗原结合部分的完整抗体分子。术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段，其保留选择性结合抗原的能力。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。抗体和其片段及抗原结合部分可以是但不限于Fab、修饰的Fab，Fab'，修饰的Fab'，F(ab')2，Fv，单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)，scFv，二、三或四价抗体，Bis-scFv，双抗体，三抗体，四抗体和任何上述的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005，Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson，2005，Drug Design Reviews-Online 2(3)，209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域熟知的(参见例如Verma等，1998，Journal ofImmunological Methods，216,165-181)。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO 2005/003170和WO 2005/003171中描述的Fab和Fab'片段以及国际专利申请WO2009/040562中描述的Fab-dAb片段。多价抗体可以包含多种特异性或可以是单特异性的(参见例如WO 92/22853和WO 05/113605)。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
如果存在，本发明的抗体分子的恒定区结构域可以考虑所提出的抗体分子的功能，特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型。备选地，当抗体分子用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，可以使用IgG2和IgG4同种型。
可以通过重组方法制备、表达、产生或分离本发明的抗体，例如(a)从对于目的免疫球蛋白基因是转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从被转化以表达目的抗体的宿主细胞，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组、组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过任何其他涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的方法制备、表达、产生或分离的抗体。
本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
这种人抗体可以是人单克隆抗体。这种人单克隆抗体可以由包括B细胞的杂交瘤产生，所述B细胞从转基因非人动物获得，例如转基因小鼠，其具有包含与永生化的细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
可通过体外免疫人淋巴细胞，然后用Epstein-Barr病毒转化淋巴细胞来制备人抗体。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”意指CDR-移植的抗体分子，其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上。可以在人类框架序列内进行额外的框架区修饰。
如本文所用，术语“CDR-嫁接的抗体分子”是指抗体分子，其中重链和/或轻链含有来自供体抗体(例如，将鼠或大鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR(如果需要，包括一个或多个修饰的CDR)移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中。关于综述，参见Vaughan等，Nature Biotechnology，16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是转移的整个CDR，仅将来自上文描述的任何一个CDR的一个或多个特异性决定残基转移至人抗体框架(参见例如，Kashmiri等，2005，Methods，36,25-34)。在一个实施方案中，仅将来自上文描述述的一个或多个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。在另一个实施方案中，仅将来自上文描述的每个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框架。
当移植CDR或特异性决定残基时，可以使用任何合适的受体可变区框架序列，考虑衍生CDR的供体抗体的类别/类型，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。合适地，根据本发明的CDR-移植的抗体具有包含人受体框架区以及上文描述的一种或多种CDR或特异性决定残基的可变结构域。因此，在一个实施方案中提供了对CDR-嫁接的抗体进行中和，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体CDR。
可用于本发明的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，并且EU、LAY和POM可用于重链和轻链。备选地，可以使用人种系序列；这些可在例如http://www.vbase2.org/获得(参见Retter等，Nucl.Acids Res.(2005)33(补充1)，D671-D674)。
在本发明的CDR-移植的抗体中，受体重链和轻链不一定需要衍生自相同的抗体，并且如果需要，可以包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。
而且，在本发明的CDR-移植抗体中，框架区不需要具有与受体抗体的那些完全相同的序列。例如，异常残基可以改变为对于该受体链类别或类型更频繁发生的残基。备选地，可以改变受体框架区中的选定残基，使得它们对应于在供体抗体中相同位置发现的残基(参见Reichmann等，1998，Nature，332,323-324)。应将这些变化保持在恢复供体抗体的亲和力所需的最小。在WO 91/09967中阐述了用于选择在受体框架区中可能需要改变的残基的方案。
本领域技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺中的变化。频繁的修饰是由于羧肽酶的作用而丧失羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)(如Harris,RJ.Journal ofChromatography 705:129-134,1995中所述)。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域并且抗体轻链包含CL结构域，κ或λ。
生物分子，例如抗体或片段，含有酸性和/或碱性官能团，从而赋予分子以净正电荷或负电荷。总的“观察到的”电荷的量将取决于实体的绝对氨基酸序列、3D结构中带电基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)是特定分子或表面不携带净电荷的pH。在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段具有至少7的等电点(pI)。在一个实施方案中，抗体或片段具有至少8，例如8.5、8.6、8.7、8.8或9的等电点。在一个实施方案中，抗体的pI是8。程序，例如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html(参见Walker，The Proteomics Protocols Handbook，Humana Press(2005)，571-607)可用于预测抗体或片段的等电点。
与本文公开的表位结合的抗体可以包含SEQ ID NO：4至6的至少一个、至少两个或所有三个重链CDR序列(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)。这些是使用Kabat方法测定的实施例的Ab 7326抗体的HCDR1/HCDR2/HCDR3序列。
用于确定CDR序列的Kabat和Chothia方法是本领域熟知的(以及其他技术)。CDR序列可以使用任何合适的方法确定，并且在本发明中，虽然通常使用Kabat，但也可以使用其他技术。在本实例中，SEQ ID NO：3呈现Ab 7326HCDR1序列，如使用组合的Chothia和Kabat定义所确定的。
本发明的抗体可以包含SEQ ID NO：7至9的至少一个、至少两个或所有三个轻链CDR序列(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)。这些是使用Kabat方法的Ab 7326的LCDR1/LCDR2/LCDR3序列。
抗体优选地至少包含SEQ ID NO：6的HCDR3序列。
通常，抗体包含选自SEQ ID NOS：3至5的至少一个重链CDR序列和选自SEQ ID NOS7至9的至少一个轻链CDR序列。抗体可包含选自SEQ ID NOS：3至5的至少两个重链CDR序列和选自SEQ ID NOS：7至9的至少两个轻链CDR序列。抗体通常包含SEQ ID NO：3至5的所有三个重链CDR序列(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)和SEQ ID NO：7至9的所有三个轻链CDR序列(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)。抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
抗体可包含SEQ ID NO：10或12的重链可变区(HCVR)序列(Ab 7326变体1和2的HCVR)。抗体可包含SEQ ID NO：11或13的轻链可变区(LCVR)序列(Ab 7326变体1和2的LCVR)。抗体优选地包含SEQ ID NO：10或12的重链可变区序列和SEQ ID NO：11或13的轻链可变区序列(尤其是SEQ ID NO：10/11或12/13的HCVR/LVCR对)。
抗体可包含以下的重链(H链)序列：
SEQ ID NO：14小鼠全长IgG1重链变体1，或
SEQ ID NO：28小鼠全长IgG1重链变体2，或
SEQ ID NO：30人全长IgG1重链变体1，或
SEQ ID NO：16人全长IgG1重链变体2，或
SEQ ID NO：22人全长IgG4P重链变体1，或
SEQ ID NO：34人全长IgG4P重链变体2，或
SEQ ID NO：18Fab重链变体1，或
SEQ ID NO：32Fab重链变体2。
抗体可包含以下的轻链(L链)序列：
SEQ ID NO：15小鼠全长IgG1轻链变体1，或
SEQ ID NO：29小鼠全长IgG1轻链变体2，或
SEQ ID NO：31人全长IgG1轻链变体1，或
SEQ ID NO：17人全长IgG1轻链变体2，或
SEQ ID NO：23人全长IgG4P轻链变体1，或
SEQ ID NO：35人全长IgG4P轻链变体2，或
SEQ ID NO：19Fab轻链变体1，或
SEQ ID NO：33Fab轻链变体2。
在一个实施例中，抗体包含以下的重链/轻链序列对
SEQ ID NO：14/15小鼠全长IgG1变体1，或
SEQ ID NO：28/29小鼠全长IgG1变体2，或
SEQ ID NO：30/31人全长IgG1变体1，或
SEQ ID NO：16/17人全长IgG1变体2，或
SEQ ID NO：22/23人全长IgG4P变体1，或
SEQ ID NOs：34/35人全长IgG4P变体2，或
SEQ ID NO：18/19Fab轻链变体1，或
SEQ ID NO：32/33Fab轻链变体2。
相应序列的变体形式可以互换。例如，抗体可包含以下的重链/轻链序列对：
SEQ ID NO：14/29小鼠全长IgG1重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NO：28/15小鼠全长IgG1重链变体2/轻链变体1，或
SEQ ID NO：30/17人全长IgG1重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NO：16/31人全长IgG1重链变体2/轻链变体1，或
SEQ ID NO：22/35人全长IgG4P重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NOs：34/23人全长IgG4P重链变体2/轻链变体1，或
SEQ ID NO：18/33Fab轻链重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NO：32/19Fab轻链重链变体2/轻链变体1。
抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
抗体可以备选地是或可以包含上述特定序列之一的变体。例如，变体可以是任何上述氨基酸序列的取代、缺失或添加变体。
变体抗体可以包含来自上文讨论的特定序列的1、2、3、4、5、多至10、多至20或更多个(通常多至50个)氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可包括缺失单个氨基酸，缺失小组的氨基酸，例如2、3、4或5个氨基酸，或删除较大的氨基酸区域，例如缺失特定的氨基酸结构域或其他特性。“取代”变体通常涉及用相同数量的氨基酸取代一个或多个氨基酸并进行保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以被具有相似性质的替代氨基酸取代，例如，另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电荷的氨基酸、另一种亲水性氨基酸、另一种疏水性氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳香族氨基酸或另一种脂肪族氨基酸。可用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下：
Ala 脂肪族、疏水性、中性 Met 疏水性、中性
Cys 极性、疏水性、中性 Asn 极性、亲水性、中性
Asp 极性、亲水性、带电(-) Pro 疏水性、中性
Glu 极性、亲水性、带电(-) Gln 极性、亲水性、中性
Phe 芳香、疏水性、中性 Arg 极性、亲水性、带电(+)
Gly 脂肪、中性 Ser 极性、亲水性、中性
His 芳香族、极性、亲水性、带电荷(+) Thr 极性、亲水性、中性
Ile 脂肪族、疏水性、中性 Val 脂肪族、疏水性、中性
Lys 极性、亲水性、带电(+) Trp 芳香、疏水性、中性
Leu 脂肪族、疏水性、中性 Tyr 芳香、极性、疏水性
“衍生物”或“变体”通常包括其中代替天然存在的氨基酸的序列中出现的氨基酸是其结构类似物的那些。序列中使用的氨基酸也可以进行衍生化或修饰，例如标记，只要抗体的功能不会受到显著的不利影响。
如上所述的衍生物和变体可以在抗体合成期间或通过生产后修饰来制备，或者当抗体是重组形式时使用已知的核酸的定点诱变、随机诱变或酶促切割和/或连接的技术。
变体抗体可以与本文公开的氨基酸序列(特别是HCVR/LCVR序列和H-和L-链序列)具有大于约60％、或大于约70％例如75％或80％，通常大于约85％例如大于约90或95％的氨基酸同一性的氨基酸序列。此外，抗体可以是与本文公开的HCVR/LCVR序列和H-链和L-链序列具有超过约60％，或超过约70％例如75％或80％，通常大于约85％例如大于约90或95％的氨基酸同一性，同时保留对这些序列公开的确切CDR的变体。变体可以与本文公开的HCVR/LCVR序列以及H-和L-链序列保持至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性(在某些情况下保留确切的CDR)。
变体通常保持约60％-约99％的同一性、约80％-约99％的同一性、约90％-约99％的同一性或约95％-约99％的同一性。在相关的SEQ ID NO序列的整个长度上或在序列的一部分上可以看到这种水平的氨基酸同一性，例如跨越约20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸，取决于全长多肽的大小。
关于氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用ClustalW(Thompson等，1994，同上)评估时具有所述值的序列，具有以下参数：
成对比对参数-方法：准确，矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，空位延伸罚分：0.10；
多个比对参数-Matrix：PAM，缺口开放罚分：10.00，延迟的同一性％：30，罚分末端空位：on，空位分离距离：0，负矩阵：no，空位延伸罚分：0.20，残基特异性缺口罚分：on，亲水性空位罚分：on，亲水性残基：GPSNDQEKR。特定残基处的序列同一性旨在包括简单衍生化的相同残基。
因此提供了具有维持这些链的功能或活性的特定序列和变体的抗体。
抗体可竞争与Gremlin-1结合，或与上文在H链/L链、HCVR/LCVR或CDR序列方面定义的相同表位结合。特别地，抗体可以与包含SEQ ID NO：4/5/6/7/8/9的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列组合的抗体竞争结合Gremlin-1或与抗体结合相同的表位。抗体可以与包含SEQ ID NO：10/11或12/13的HCVR和LCVR序列对或SEQ ID No：14/15或16/17的全长链的抗体竞争结合Gremlin-1或与抗体结合相同的表位。
术语“表位”是抗体结合的抗原区域。表位可以定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接有助于相互作用亲和力的那些残基。表位也可以是构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括是分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的决定簇，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或具体的带电特性。
通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位或竞争结合参照抗体。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参照抗体结合相同的表位，允许参照抗体在饱和条件下与蛋白质或肽结合。接下来，评估测试抗体结合蛋白质或肽的能力。如果测试抗体在与参考抗体饱和结合后能够结合蛋白质或肽，则可以得出结论，测试抗体结合不同于参考抗体的表位。另一方面，如果测试抗体在与参考抗体饱和结合后不能与蛋白质或肽结合，则测试抗体可以结合与本发明的参照抗体结合的表位相同的表位。
为了确定抗体是否竞争与参考抗体的结合，上述结合方法以两个方向进行。在第一个方向，允许参照抗体在饱和条件下与蛋白质/肽结合，然后评估测试抗体与蛋白质/肽分子的结合。在第二个方向，使测试抗体在饱和条件下与蛋白质/肽结合，然后评估参照抗体与蛋白质/肽的结合。如果在两个方向上，仅第一(饱和)抗体能够结合蛋白质/肽，则得出结论测试抗体和参照抗体竞争结合蛋白质/肽。如本领域技术人员所理解的，竞争与参考抗体结合的抗体可能不一定结合与参考抗体相同的表位，但可通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参照抗体的结合。
如果每种抗体竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体结合相同或重叠的表位。也就是说，在竞争性结合测定法中测量，一种抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量抑制另一种抗体的结合至少50％、75％、90％或甚至99％(参见，例如，Junghans等，Cancer Res，1990:50:1495-1502)。备选地，如果抗原中减少或消除一种抗体结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的测试抗体缺乏结合是否实际上是由于结合与参考抗体相同的表位或者是否是空间阻断(或另一个现象)导致缺乏观察到的结合。可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或者本领域可获得的任何其他定量或定性抗体结合测定法来进行这种实验。
可以通过例如标准ELISA或Western印迹来测试抗体与Gremlin-1的结合。ELISA测定法也可用于筛选与靶蛋白显示阳性反应的杂交瘤。抗体的结合选择性还可以通过监测抗体与表达靶蛋白的细胞的结合来确定，例如通过流式细胞术。因此，筛选方法可包括通过进行ELISA或Western印迹或者通过流式细胞术鉴定能够结合Gremlin-1的抗体的步骤。
抗体可以选择性地(或特异地)识别Gremlin-1。当其以优先或高亲和力与蛋白质结合时，抗体或其它化合物“选择性地结合”或“选择性地识别”蛋白质，对该蛋白质具有选择性，但基本上不与其他蛋白质结合或以低亲和力结合。可以通过确定抗体是否与如上所述的其他相关蛋白质结合或者是否区分它们来进一步研究抗体的选择性。本发明的抗体通常识别人Gremlin-1。
抗体也可能对相关蛋白质或人Gremlin-1和来自其他物种的Gremlin-1具有交叉反应性。
通过特异性(或选择性)，可以理解抗体与目标蛋白质结合而与任何其他分子没有显著的交叉反应性。可以通过本文描述的任何合适的方法评估交叉反应性。如果抗体与另一种分子结合是其与目标蛋白质结合强度的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％，则可以认为抗体的交叉反应性是显著的。特异性(或选择性)的抗体可以以其与目标蛋白质结合强度的小于约90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％与另一种分子结合。抗体可以以其与目标蛋白质结合强度的小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％、小于约2％或小于约1％与另一种分子结合。
先前已经描述了抗Gremlin抗体，例如WO2014/159010A1(Regeneron)描述了抑制Gremlin-1活性的抗Gremlin抗体，其结合亲和力KD值在25℃为625pM至270nM。Ciuclan等(2013)描述了具有结合亲和力KD 5.6×10-10M的抗-Gremlin-1单克隆抗体。
本发明的抗-Gremlin-1抗体是Gremlin-1活性的变构抑制剂，并且与远离BMP结合位点的新表位结合。抗体与Gremlin-1结合，具有特别高的亲和力，Kd值<100pM。因此，本发明的抗体代表了超过目前可用抗体的显著改善，并且预期其特别适用于治疗Gremlin-1介导的疾病。
因此，适用于本发明的抗体可具有对(人)Gremlin-1的高亲和力结合。抗体可具有小于<1nM，优选地<500pM的解离常数(KD)。在一个实施例中，抗体具有小于200pM的解离常数(KD)。在一个实施例中，抗体具有小于100pM的解离常数(KD)。如本领域技术人员所熟知的，多种方法可用于确定抗体对其靶抗原的结合亲和力，例如表面等离子体共振测定法、饱和测定法或免疫测定法例如ELISA或RIA。用于测定结合亲和力的示例性方法是使用CM5传感器芯片在BIAcoreTM 2000仪器(Biacore AB，Freiburg，Germany)上进行表面等离子体共振分析，如Krinner等，(2007)Mol.Immunol.February；44(5):916-25(Epub 2006年5月11日))所述。
本发明的抗体通常是抑制性抗体。Gremlin-1负调节BMP-2、4和7，因此对Gremlin-1的抑制导致通过BMP的信号传导增加。
如上所述，本申请的实施例描述了用于筛选抗体是否能够抑制Gremlin-1的两种功能测定法，即SMAD磷酸化测定法和Hek Id1报告子基因测定法。通常，抑制性抗体在HekId1报告子基因测定法中恢复SMAD磷酸化和/或恢复BMP的信号传导。与BMP对照相比，SMAD磷酸化可恢复至少80％、90％或100％。在Hek Id1报告子基因测定法中，抑制性抗体可具有小于10nM，优选地小于5nM的IC50。
一旦鉴定和选择了合适的抗体，就可以通过本领域已知的方法鉴定抗体的氨基酸序列。可以使用简并引物克隆编码抗体的基因。可以通过常规方法重组地产生抗体。
本发明还提供了编码本发明抗体分子的重链和/或轻链可变区(或全长H-链和L-链)的分离的DNA序列。
变体多核苷酸可包含在序列表中给出序列中的1、2、3、4、5、多至10、多至20、多至30、多至40、多至50、多至75或更多个核酸取代和/或缺失。通常，变体具有1-20、1-50、1-75或1-100个取代和/或缺失。
合适的变体可以与本文公开的任何一种核酸序列的多核苷酸至少约70％同源，通常与其至少约80或90％并且更合适地至少约95％、97％或99％同源。变体可以保持至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体通常保持约60％-约99％的同一性、约80％-约99％的同一性、约90％-约99％的同一性或约95％-约99％的同一性。这些水平的同源性和同一性通常至少相对于多核苷酸的编码区存在。测量同源性的方法是本领域熟知的，并且本领域技术人员将理解在本文中基于核酸同一性计算同源性。这种同源性可以存在于至少约15，至少约30，例如至少约40、60、100、200或更多个连续核苷酸(取决于长度)的区域上。这种同源性可以存在于未修饰的多核苷酸序列的整个长度上。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，UWGCG包提供BESTFIT程序，其可用于计算同源性(例如，在其默认设置下使用)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或排列序列(通常在其默认设置下)，例如在Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul，S，F等(1990)J Mol Biol215:403-10中描述的。
用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中识别长度为W的短字来识别高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中的相同长度的字对齐时匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等，同上)。这些初始邻域字命中作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的HSP。只要可以增加累积比对分数，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。当以下情况时，停止每个方向上的字命中的延伸：由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积比对评分变为零或更低；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值：字长(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。BLAST算法提供的相似性的一种测量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中的最小和概率小于约1，通常小于约0.1，合适地小于约0.01，并且最合适地小于约0.001，则认为序列与另一序列相似。例如，最小和概率可以在约1-约0.001，通常约0.01-约0.001的范围内。
同源物可以与相关多核苷酸中的序列相差小于约3、5、10、15、20或更多个突变(每个突变可以是取代、缺失或插入)。例如，同源物可以有3-50个突变，通常是3-20个突变。可以在同源物的至少30个，例如至少约40、60或100个或更多个连续核苷酸的区域上测量这些突变。
在一个实施方案中，由于遗传密码的冗余，变体序列可以与序列表中给出的特定序列不同。DNA代码具有4个主要核酸残基(A、T、C和G)，并使用它们“拼写”三个字母密码子，其代表生物体基因中编码的蛋白质的氨基酸。沿着DNA分子的密码子的线性序列被翻译成由这些基因编码的蛋白质中的氨基酸的线性序列。该代码是高度简并的，其中61个密码子编码20个天然氨基酸和代表“终止”信号的3个密码子。因此，大多数氨基酸由多于一个密码子编码-实际上几个是由四个或更多个不同密码子编码。因此，本发明的变体多核苷酸可以编码与本发明的另一种多核苷酸相同的多肽序列，但由于使用不同的密码子编码相同的氨基酸，因此可以具有不同的核酸序列。
本发明的DNA序列可以包含合成的DNA(例如通过化学处理生产的)、cDNA、基因组DNA或其任何组合产生。
编码本发明抗体分子的DNA序列可通过本领域技术人员熟知的方法获得。例如，编码抗体重链和轻链的部分或全部的DNA序列可以根据需要从确定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列来合成。
可以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员公知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”，1999，F.M.Ausubel(ed)，WileyInterscience，New York和Maniatis Manual，由Cold Spring Harbor Publishing出版。
还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述载体包含编码本发明抗体的一种或多种DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本发明抗体分子的DNA序列。可以使用细菌例如大肠杆菌(E.coli.)和其他微生物系统，或者也可以使用真核生物，例如哺乳动物宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了生产根据本发明的抗体分子的方法，包括在适于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞，并分离抗体分子。
已经鉴定本发明的Ab 7326抗体结合以下Gremlin-1的残基：Ile110(131)、Lys126(147)、Lys127(148)、Phe128(149)、Thr129(150)、Thr130(151)、Arg148(169)、Lys153(174)和Gln154(175)，其中Lys126(147)、Lys127(148)、Phe128(149)、Thr129(150)、Thr130(151)、Arg148(169)、Lys153(174)和Gln154(175)存在于一种Gremlin-1单体上，而Ile110(131)存在于第二种Gremlin-1单体上。不在括号中的编号基于结构文件和(基于结构比对匹配小鼠Gremlin-2的编号)。括号中的数字表示基于SEQ ID NO：1的UniProt条目O60565的残基。如实施例部分中所讨论的，使用NCONT分析在从Gremlin-1-Ab 7326Fab复合物的处鉴定这些表位残基。
因此，本发明的抗体可以与表位结合，所述表位包含选自Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175的至少一个残基(残基编号基于SEQ IDNO：1)。本发明的抗体可以结合包含这些残基中的2、3、4、5、6、7、8或全部9个(优选至少5个残基)的表位。
本发明的抗体还可以识别其中Ile131存在于与其他残基不同的Gremlin-1单体上的表位。
尽管针对人Gremlin-1的特定序列提供了这些残基，但技术人员可以使用常规技术将这些残基的位置可读地外推至其他相应的Gremlin序列(例如小鼠)。因此，本发明还提供了与包含其他Gremlin序列内的这些相应残基的表位结合的抗体。
为了筛选与特定表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定法，例如Antibodies，Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb.，NY)中所述的。其他方法包括丙氨酸扫描突变体，肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)，或肽切割分析。另外，可以使用诸如表位切除、表位提取和抗原化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。这些方法在本领域中是公知的。
抗体表位也可以通过X射线晶体学分析来确定。因此，可以通过对与Gremlin-1结合的抗体进行X射线晶体学分析来评估本发明的抗体。特别地，通过确定抗体互补位残基的内的Gremlin-1上的残基，可以以这种方式鉴定表位。
【药物组合物、剂量和剂量方案】
可以在药物组合物中提供本发明的抗体或通过筛选方法鉴定的调控Gremlin-1的试剂。药物组合物通常是无菌的，并且通常包括药学上可接受的运载体和/或佐剂。本发明的药物组合物可另外地包含药学上可接受的佐剂和/或运载体。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。运载体可适用于肠胃外，例如静脉内、肌肉内、皮内、眼内、腹膜内、皮下、脊柱或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。备选地，运载体可适用于非肠胃外施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径。运载体可适用于口服施用。取决于施用途径，调控剂可以涂覆在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不期望的毒理学作用的盐。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。
药学上可接受的运载体包括含水性运载体或稀释剂。可用于本发明药物组合物的合适含水性运载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其他运载体的实例包括乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。在许多情况下，希望在组合物中包含等渗剂例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。
治疗组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。
本发明的药物组合物可包含另外的活性成分。
包含本发明的抗体或调控剂和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可以进一步含有一种或多种另外的试剂，例如上面讨论的另外的治疗剂或预防剂。
可以施用本发明的调控剂和/或抗体或者其制剂或组合物用于预防性和/或治疗性处理。
在治疗性应用中，化合物以足以治愈、缓解或部分阻止病况或其一种或多种症状的量施用给已经患有如上所述的病症或病况的受试者。这种治疗性处理可导致疾病症状的严重性降低，或无症状期的频率或持续时间的增加。足以实现此目的的量被定义为“治疗有效量”。
在预防性应用中，制剂以足以预防或减少病况或其一种或多种症状的后续影响的量施用给具有如上所述的病症或病况的风险的受试者。足以实现此目的的量被定义为“预防有效量”。每种目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。
施用的受试者可以是人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。对人施用是典型的。
本发明的抗体/调控剂或药物组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径进行施用。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。本发明化合物或药物组合物的施用途径的实例包括静脉内、肌肉内、皮内、眼内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射。备选地，本发明的抗体/调控剂或药物组合物可以通过非肠胃外途径进行施用，例如施用的局部、表皮或粘膜途径。本发明的抗体/调控剂或药物组合物可用于口服施用。
合适剂量的本发明的抗体/调控剂或药物组合物可由熟练的医师确定。可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者、组合物和施用方式的所需治疗应带并对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物的活性，施用途径，施用时间，所用特定化合物的排泄速率，处理的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所处理患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
合适的剂量可以是，例如，待处理患者的约0.01μg/kg至约1000mg/kg体重，通常约0.1μg/kg至约100mg/kg体重。例如，合适的剂量可以是每天约1μg/kg至约10mg/kg体重或每天约10μg/kg至约5mg/kg体重。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需应答(例如，治疗性应答)。例如，可以施用单剂量，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以按照治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待处理受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算可与所需的药物运载体一起产生所需的治疗效果。
施用可以是单剂量或多剂量。多剂量可以通过相同或不同的途径施用在相同或不同的位置。备选地，剂量可以通过持续释放制剂，在这种情况下需要更低频率的施用。剂量和频率可以根据患者中拮抗剂的半衰期和所需治疗的持续时间而变化。
如上所述，本发明的调控剂/抗体或药物组合物可与一种或多种其他治疗剂共同施用。
可以以多种不同方式实现两种或更多种试剂的组合施用。两者可以在单一组合物中一起施用，或者它们可以作为组合疗法的一部分在单独的组合物中施用。例如，一个可以在另一个之前、之后或同时施用。
【治疗性适应症】
通过本发明的筛选方法鉴定的本发明的抗体或调控剂可用于治疗、预防或改善与Gremlin-1活性相关的任何病况。例如，通过Gremlin-1的信号传导的全部或部分的任何病况。换句话说，本发明涉及由Gremlin介导或影响的病况的治疗、预防或改善。这些病况包括纤维化疾病，包括肾纤维化(例如糖尿病肾病和慢性同种异体肾病)和特发性肺纤维化、肺动脉高血压、血管生成和癌症(例如结肠直肠癌)。
以下实施例示例说明了本发明。
【实施例1：蛋白质表达、纯化、重折叠和结构测定】
【蛋白质表达和包涵体制备】
使用BamHI/XhoI将针对在大肠杆菌中表达优化的截短的人Gremlin-1编码序列(SEQ ID NO：20)克隆到修饰的pET32a载体(Merck Millipore)中，产生编码具有N末端6His-TEV标签的Gremlin序列的载体(pET-hGremlin-1)。
表达的序列：
MGSSHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD；SEQ IDNO：2(6His-TEV标签的非Gremlin残基以斜体显示)。基于UniProt O60565和SEQ ID NO：1的序列编号。
pET-hGremlin-1质粒DNA用于转化BL21(DE3)细胞。从LB/Amp琼脂平板上挑取单个氨苄青霉素抗性菌落，并用于接种LB/Amp的100ml起始培养物。在37℃振荡(200rpm)16小时后，使用25ml起始培养物接种500mL的2xTY/Amp培养基。将培养物在37℃振荡(250rpm)直至OD600达到3。随后，向培养物中补充20mL的MOPS+甘油进料混合物(1M MOPS pH 7.4、40％甘油、0.5％MgSO4、0.42％MgCl2)，用300μM IPTG诱导，并进一步在17℃，180rpm温育16个小时。在离心机中收获细胞(4,000g，4℃，20分钟)。
将细胞沉淀在4℃重悬于裂解缓冲液(PBS pH7.4、0.35mg/ml溶菌酶、10μg/mlDNase和3mM MgCl2)中，并通过在4℃以3,500g离心30分钟来收获不溶性级分。通过重悬于洗涤缓冲液(50mM Tris、500mM NaCl、0.5％Triton X-100，pH8.0)中将沉淀的包涵体洗涤三次，然后以21,000g离心15分钟。使用不含Triton X-100的洗涤缓冲液进行另外两次洗涤。
【溶解】
将包涵体重悬于变性缓冲液(8M尿素、100mM Tris、1mM EDTA、10mM Na2S4O6和100mM Na2SO3，pH8.5)中，在室温搅拌16小时，并通过在21,000g离心15分钟进行澄清。
【预重折叠纯化】
将溶解的包涵体加载到在8M尿素、50mM MES、200mM NaCl、1mM EDTA，pH6.0中平衡的Sephacryl S-200 26/60柱(120mL)上。将含有Gremlin-1蛋白的级分用6M尿素、20mMMES，pH 6.0稀释，并加载到HiTrap SP HP阳离子交换柱上，用10柱体积(10个CV)的1M NaCl梯度进行洗脱。合并含有纯化的变性的hGremlin-1蛋白的级分。
【重折叠】
将变性的纯化的Gremlin-1蛋白逐滴添加至重折叠缓冲液(50mM Tris，pH 8.5、150mM NaCl、5mM GSH和5mM GSSG、0.5mM半胱氨酸、5mM EDTA、0.5M精氨酸)至终浓度为0.1mg/ml，并且在4℃持续搅拌温育5天。5天后，将Gremlin-1蛋白质针对20mM HEPES、100mMNaCl，pH 7.5进行透析。
透析后，将蛋白质应用于肝素HiTrap柱，并使用20CV的0-100％肝素洗脱缓冲液(20mM HEPES、1M NaCl，pH7.5)的梯度进行洗脱。正确折叠的蛋白质在1M NaCl洗脱，而任何错误折叠的蛋白质在更低的盐浓度洗脱。
将在1M NaCl洗脱的蛋白质浓缩并在用20mM Hepes，pH 7.5、1M NaCl平衡的S7526/60柱上进一步纯化。
通过SDS PAGE(凝胶移位)表征蛋白质，使用液相色谱质谱(LC-MS)证明具有预期的分子量和二硫键的正确排列并且在细胞测定法中具有活性(ID1报告子基因测定法)。
【Gremlin-1结构确定】
使用悬滴法通过将6.6mg/ml的Gremlin-1的溶液和0.1M柠檬酸(pH 4)、1M氯化锂和27％聚乙二醇(PEG)6000以1:1比率混合来生长Gremlin-1蛋白质晶体。在收集数据之前，通过向结晶缓冲液中加入20％甘油来冷冻保护晶体。在Diamond Light Source收集衍射数据并使用XDS进行处理(Kabsch，Wolfgang(2010)Acta Crystallographica Section D 66,125-132)。衍射数据统计汇总在下表中：
表2：衍射数据统计
*括号中的值对应于最高分辨率壳
**r.m.s.d均方根偏差
使用Phaser(McCoy等，J Appl Cryst(2007)，40,658-674)和可从专有Gremlin-1/Fab复合物坐标获得的Gremlin-1模型通过分子置换解析Gremlin-1结构。得到的Gremlin-1模型含有4个拷贝的Gremlin-1单体，组成两个二聚体。用Coot(Emsley等，ActaCrystallographica Section D：Biological Crystallography 66(4)，486-501)进行模型校正，并使用Refmac(Murshudov等，REFMAC5 for the refinement of macromolecularcrystal structures.Acta Crystallographica Section D:BiologicalCrystallography.2011；67(Pt 4):355-367)进行坐标的细化。用Molprobity验证最终坐标(Chen等(2010)MolProbity：all-atom structure validation for macromolecularcrystallography.Acta Crystallographica D66：12-21)。模型细化统计的摘要显示在上面的表2中。
【实施例2：在Gremlin-1上的BMP结合残基】
如上所讨论的，Gremlin-1属于称为DAN家族的亚组内的骨形态发生蛋白(BMP)拮抗蛋白家族。在DAN家族中，Gremlin-1与Gremlin-2(PRDC)具有最大的同源性。
实施例1中描述的人Gremlin-1结构与公开的小鼠Gremlin-2结构共有许多共同特征(Nolan等(2013)，Structure，21,1417-1429)。整体折叠非常相似，两个拷贝的Gremlin-1形成反平行的非共价二聚体，排列成拱形。每个单体都采用特征性的手指-手腕-手指排列，半胱氨酸结基序朝向手腕端，与手指相对(图2)。在两种结构中可见的序列内，蛋白质之间的序列同一性为52％，上升至67％。最高度保守的区域在于广泛的二聚体界面，其中所有关键接触残基都是100％保守的(图3)。
已经使用诱变鉴定了参与BMP的2、4和7与小鼠Gremlin-2(PRDC)和DAN(NBL1)结合的残基(Nolan等(2013)，Structure，21,1417-1429和Nolan等(2014)J.Biol.Chem.290,4759-4771)。预测的BMP结合表位包括横跨二聚体凸表面上的两个单体的疏水性片(图4和5)。通过诱变鉴定出六个残基；Trp72、Phe96、Tyr98、Phe104、Tyr105和Phe117并且在人Gremlin-1中100％保守(编号基于小鼠Gremlin-2序列)。同源性程度延伸至侧链的定位，其在两种蛋白质中采用相同的构象(图5)。
Gremlin PDB文件中使用的氨基酸编号与基于结构比对的已发表的小鼠Gremlin-2结构中的编号相匹配。这样可以在描述结构时进行类似的氨基酸比较。然而，为了清楚起见，下面显示了在BMP结合中发挥作用的关键残基，其编号基于PDB文件和SEQ ID NO：1的UniProt文件，在括号中：
Trp72(93)、Phe96(117)、Tyr98(119)、Phe104(125)、Tyr105(126)和Phe117(138)。
在小鼠Gremlin-2和人Gremlin-1中，疏水性BMP结合表位被每种蛋白质的N-末端残基形成的α螺旋部分地掩埋。已经提出了BMP结合的模型，其中N-末端可以屈伸，暴露完整的BMP结合界面(Nolan等(2013)，Structure，21,1417-1429)。在图4中，在呈现表面以揭示每种蛋白质上BMP结合面的相似性之前，已从人Gremlin-1和小鼠Gremlin-2结构中除去N-末端残基。
该文献仅描述了对BMP结合有影响的六种残基的诱变。实际的BMP表位可能覆盖较大的表面积，包括相邻的氨基酸。通过突出显示在Gremlin-1表面上突变的内的所有残基，揭示出Gremlin-1的更大区域可能被治疗剂靶向(图11)。这个更广泛的区域包含人Gremlin-1的以下氨基酸：
Asp92-Leu99
Arg116-His130
Ser137-Ser142
Cys176-Cys178
(基于SEQ ID NO：1的编号)
通过组合发表的信息和人Gremlin-1的晶体结构信息，已经鉴定了阻断其与BMP的相互作用而为本身提供用于治疗性介入的潜在途径的人Gremlin-1的区域。
【实施例3：Hek Id1报告子基因测定法】
【背景】
Hek Id1报告子基因测定法使用克隆12Hek293-Id1报道子细胞。用Id1转录因子稳定转染该细胞系。Id1是BMP信号传导途径中的转录因子。已知Gremlin结合BMP而防止与其受体结合，从而减少来自报告基因的荧光素酶信号。因此，使用该报道子测定法，可以筛选抗Gremlin抗体，看看是否有任何阻断Gremlin与BMP相互作用的方法。如果阻断这种相互作用，则在这些细胞中可以看到荧光素酶信号的恢复。
【方法】
将克隆12细胞在含有10％FCS、1x L-谷氨酰胺和1x NEAA的DMEM中培养。细胞也在潮霉素B(200μg/ml)存在下生长，以确保细胞不会失去Id1基因表达。在含有0.5％FCS、1xL-谷氨酰胺和1x NEAA的DMEM中测定细胞。在细胞处于测定法的短时间内不需要潮霉素B。
将细胞在PBS中洗涤，使用细胞解离缓冲液除去，旋转并计数，然后以5×104/孔接种于70μl(密度为7.14×105/ml)中。使用的板是白色的、不透明的聚-D-赖氨酸涂覆的96孔无菌。细胞进入培养箱约3-4小时以稳定下来。将BMP异二聚体在4mM HCL中重构至200μg/ml。使用玻璃小瓶在测定培养基中将BMP稀释至10μg/ml，得到新的工作原液。
在聚丙烯板中，将Gremlin-1以1:2稀释至8点剂量应答曲线，高的最终剂量为1μg/ml。
每孔加入另外体积的20μl介质，并将板在37℃温育45分钟。
将以100x制备的BMP加入到除只含有细胞的孔外的所有孔中。用测定法介质将所有孔补足至60μl，并在37℃温育再45分钟。
温育后，测定法板每孔转移30μl样品并温育20-24小时，然后测量发光信号。
Cell Steady Glo在室温预先解冻。将测定法板冷却至室温约10-15分钟，然后加入试剂。通过在室温在振荡器上添加细胞稳定的glo试剂(100μl)20分钟并使用Synergy 2上的细胞滴度球方案测量发光来检测荧光素酶信号。
从含有BMP的孔产生最大信号，并且从只含有细胞的孔产生最小信号。
【结果】
在Hek-Id1报告子基因测定法中测试Gremlin-1全长和截短形式以确认针对BMP4/7的阻断活性。全长蛋白质的结果显示在图6A中并且截短蛋白质的结果显示在图6B中。
基于测定法中的最大和最小信号计算来自剂量应答测定法的抑制百分比，并使用4参数逻辑拟合来拟合数据。基于曲线的拐点来计算IC50。
表3：Hek-Id1报告子基因测定法中全长Gremlin-1和截短Gremlin-1的效力结果。
Hek-Id1报告子基因测定法 N 几何平均数(nM) 95％CI(或范围其中N＝<4)
Gremlin-1全长 2 1.6 1.3-1.9
Gremlin-1截短 2 1.7 1.1-2.5
【结论】
Gremlin-1能够抑制Hek-Id1报告子基因测定法中的BMP 4/7信号传导。
【实施例4：抗-Gremlin-1抗体的生产】
通过免疫和文库淘选衍生抗-Gremlin-1抗体。该文库是作为一个幼稚的人类文库在内部生成的，其中V区域从献血中扩增。
免疫产生26种不同的抗体，结合来自第一轮免疫的Gremlin-1。将这些抗体按比例放大并纯化，用于筛选测定法中的测试。
使用来自R&D Systems的重组人Gremlin淘选来自文库的25种人和小鼠交叉反应抗体。选择10种抗体用于按比例放大并纯化为scFv用于筛选测定法中的测试。
【实施例5：筛选抗-Gremlin-1抗体】
使用实施例3中描述的Hek-Id1报道子基因测定法并通过测量SMAD磷酸化来筛选抗体。SMAD1、5和8在BMP信号传导时被磷酸化。因此，Gremlin-1的抑制剂增加SMAD磷酸化。
对A549细胞或人肺成纤维细胞进行SMAD磷酸化测定法。使用MSD测定磷酸化水平。
【结果】
在Hek-Id1报告子基因测定法中，免疫衍生的抗体没有明显的命中(针对BMP4/7异二聚体测试10倍过量的抗体)。结果如图7所示。
相反，许多文库衍生的抗体能够在Hek-Id1报告子基因测定法中恢复信号(50％Gremlin剂量的50倍过量的抗体)(图8)。其中，Ab2416和Ab2417含有高水平的内毒素。Ab7326在10倍过量和80％抑制Gremlin-1浓度保持阻断能力。
另外的结果显示在图9A(人类Gremlin)和9B(小鼠Gremlin)中。这些图显示Ab7326(标记为PB376)的滴定多至15nM。当被人(IC50为1.3nM)或小鼠(IC50为0.2nM Gremlin)阻断时，显示Ab7326恢复BMP的信号传导。抗体作为人和小鼠IgG1起作用。
小鼠和人全长IgG1的序列如下所示。为了合成小鼠和人全长IgG1蛋白，将衍生自文库的Ab7326可变区重新克隆到包含适当抗体恒定结构域的载体中。
因为Ab7326来自幼稚的人类文库，其中Ab被克隆为scFv，为了将7326可变区重新克隆为全长Ab或Fab，必须使用引物/简并引物的库来PCR扩增VH和VK。然后将扩增的PCR产物消化并同时克隆到小鼠和人载体中。当VH和VK通过引物/简并引物的库进行扩增时，获得产物的两种变体形式，不同之处在于从在PCR过程中退火的精细不同的引物衍生的单个氨基酸残基。
重链可变区的两种变体形式在位置6有单个氨基酸不同，并且轻链可变区的两个变体形式在位置7有单个氨基酸不同，如下所示：
·重链可变区变体1在位置6具有谷氨酸(E)。
·重链可变区变体2在位置6具有谷氨酰胺(Q)。
·轻链可变区变体1在位置7具有丝氨酸(S)。
·轻链可变区变体2在位置7具有苏氨酸(T)。
小鼠全长IgG1–重链变体1(SEQ ID NO:14)
小鼠全长IgG1–轻链变体1(SEQ ID NO:15)
小鼠全长IgG1–重链变体2(SEQ ID NO:28)
小鼠全长IgG1–轻链变体2(SEQ ID NO:29)
人全长IgG1–重链变体1(SEQ ID NO:30)
人全长IgG1–轻链变体1(SEQ ID NO:31)
人全长IgG1–重链变体2(SEQ ID NO:16)
人全长IgG1–轻链变体2(SEQ ID NO:17)
使用Kabat方法测定抗体CDR(在上述序列中以粗体突出显示)。使用Chothia定义的其他HCDR1残基以斜体显示。恒定区序列也加下划线。
用抗-Gremlin-1抗体恢复p-SMAD信号传导显示在下表4中。
表4：p-SMAD信号传导的恢复
结果显示为单独的BMP(对照BMP)的SMAD磷酸化的百分比。使用来自特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞进行实验。将rhGremlin-1和抗-Gremlin-1抗体在室温预温育45分钟。然后将rhGremlin-1和抗-Gremlin-1抗体与BMP一起加入细胞中30分钟。
表5然后显示了SMAD磷酸化测定法中的进一步结果，其中研究了抗-Gremlin-1抗体从Gremlin-1-BMP复合物中置换BMP-2或BMP4/7。使用来自特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞再次进行实验。将rhBMP-2或rhBMP 4/7与rhGremlin-1在室温预温育1小时。将BMP-2-或BMP4/7-Gremlin-1复合物与不同浓度的抗-Gremlin-1抗体在4℃温育过夜。抗体浓度代表平板上的最终浓度。
表5：抗-Gremlin-1抗体从Gremlin-1-BMP复合物中置换BMP-2或BMP4/7
表5中显示的结果证明Ab7326可以从Gremlin-1-BMP复合物中置换已经复合的BMP-2或BMP4/7。Ab7326可以在比对照抗体2484低得多的浓度实现这种置换。这提供了Ab7326是变构抑制剂的证据，与我们的发现一致，即Ab7326的结合位点远离Gremlin-1上的已知BMP结合区。因此，即使当BMP与Gremlin-1复合时，Ab7326也能够进入变构结合位点，从而显著地改善对Gremlin活性的抑制。
【实施例6：获得与7326Fab复合的Gremlin-1的晶体结构】
与Ab 7326Fab复合的人Gremlin-1的晶体结构以的分辨率进行解析。Fab序列如下所示：
重链：SEQ ID NO：18
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
轻链:SEQ ID NO:19
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
然后使用CCP4软件NCONT鉴定Gremlin-1和Fab之间的所有接触。鉴定了以下残基：Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175(编号基于SEQ ID NO：1的UniProt序列(编号为结构文件中的Ile110、Lys126、Lys127、Phe128、Thr129、Thr130、Arg148、Lys153和Gln154，与小鼠Gremlin-2的编号相匹配)。
图10显示了Gremlin-Fab复合物的结构模型，其中Fab表位残基相对于BMP结合区显示。
Ab 7326是一种抑制性抗体，以变构方式起作用，即它远离BMP结合区域进行结合。
【实施例7：抗-Gremlin-1抗体Ab7326与Gremlin-1结合的亲和力测量。】
【方法】
抗Gremlin mIgG对人Gremlin-1的亲和力通过使用表面等离子体共振(SPR)技术在Biacore T200系统GE Healthcare Bio-Sciences AB上进行的双分子相互作用分析来确定。通过固定化的抗小鼠Fc表面捕获抗Gremlin mIgG，并在捕获的mIgG上滴定Gremlin-1。
通过胺偶联化学将捕获的配体(山羊抗小鼠IgG的亲脂F(ab')2片段，Fc片段特异性，115-006-071，Jackson ImmunoResearch Inc.)以50μg/ml固定化在10mM NaAc，pH5.0中在CM4传感器芯片的流通池2上，使用600s活化和失活注射，达到～1600应答单位(RU)的水平。使用HBS-EP+缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20)作为运行缓冲液，流速为10μl/min。通过如流动池2那样激活和去活化表面但是省略捕获配体，在流动池1上制备参考表面。
测定法缓冲液是HBS-EP+加上额外的150mM NaCl，得到最终NaCl浓度为300mM加1％CMD40。将抗Gremlin mIgG(在运行缓冲液中以5μg/ml)60s注射通过流动池1和2，以在固定化的抗小鼠IgG，Fc表面上产生约100RU的捕获水平。在运行缓冲液中从5nM(使用2倍稀释)滴定重组人Gremlin-1，并以30μl/min的流速注射通过流动池1和2以3分钟，然后进行5分钟解离阶段。还包括仅缓冲对照。通过60s注射50mM HCl，30s注射5mM NaOH和30s注射50mM HCl，以10μl/min的流速再生表面。
使用Biacore T200评估软件确定动力学数据。
亲和力测量在25℃进行。
结果
发现以5次测定的平均KD值的结合亲和力低于100pM。
【实施例8：抗-Gremlin-1抗体对小鼠慢性缺氧/SU5416诱导的肺动脉高压的体内作用的评估】
【总结】
TGFβ超家族的不平衡已经强烈牵涉在许多肺病理学中，包括肺动脉高压(PAH)(Budd&Holmes Pharm Ther 2012)。Gremlin-1与PAH的发展和进展有关(Thomas等，AJP，2009；Ciuclan等，AJP，2013)。最近的研究已经证明，抗-Gremlin-1抗体可以在PAH的临床前缺氧/SU5416模型中抑制肺动脉高压的发展(Ciuclan等，AJP2013)。在这里，我们评估了抗-Gremlin-1抗体对PAH的临床前缺氧/SU5416小鼠模型中血流动力学和血管重塑的影响。
缺氧/SU5416导致右心室收缩压(RVSP)和右心室肥大的显著增加(图12和15)。与IgG1和PBS对照组相比，施用抗-Gremlin-1导致RVSP的显著(P＜0.005)减少。在常氧条件下维持的动物中没有观察到抗-Gremlin-1对RVSP的显著作用(图12)。对全身压力(平均动脉血压或MABP；图13)或右心室肥大没有观察到作用(图14)。总的来说，该研究支持Gremlin-1在肺血管重塑发展中的作用，并且在PAH的慢性缺氧/SU5416模型中升高RVSP，并且在其治疗中使用抗-Gremlin-1抗体。
【背景】
肺动脉高压(PH)是血流动力学状态，其中在肺动脉中测量的压力升高。临床上，这是由平均静息肺动脉压(mPAP)>25mmHg、肺血管阻力(PVR)≥3Wood单位和肺楔压≤15mmHg定义的(Badesch等2009)。PH的病理特征是多方面的，并且包括肺动脉压、中小动脉的血管重塑、右心室肥大和最终右心衰竭(Faber&Loscalzo 2004)。PH被WHO分为五大类，包括I组。I组代表肺动脉高压，包括特发性PAH和可遗传PAH以及相关的PAH，其导致与其他并发症如系统性硬化症的结合(Simonneau等2009)。许多预先处置的突变与PAH在可遗传和特发性PAH患者中的发展有关，其中最主要的是骨形态发生蛋白受体BMPR2的突变(Budd&HolmesPharm Ther 2012)。此外，在发展PAH的患者中也报道了BMP激活的下游信号传导组分Smads中的突变(Budd&Holmes Pharm Ther 2012)。最近，研究已经确定PAH患者中BMP抑制剂Gremlin(Gremlin-1和2)的水平增加(Cahill等，Circ 2012)。与Gremlin-1在PAH发展中的功能作用相一致，Gremlin-1的单倍缺陷扩大了缺氧小鼠肺中的BMP信号传导，并通过减弱血管重塑导致肺血管阻力降低(Cahill等，Circ 2012)。Ciuclan及其同事(AJP 2013)进一步支持了这些观察结果，他们证明了抗-Gremlin-1抗体改善小鼠中慢性缺氧/SU5416诱导的肺动脉高压。最近的研究表明，非遗传机制可能有助于系统性硬化症患者的BMPR2表达降低，并可能有助于PAH的发展(Gilbane等AJRCCM)。总的来说，BMP超家族轴的不平衡可能导致肺病变如PAH的发展。
本研究的目的是评估抗-Gremlin-1对慢性缺氧/SU5416小鼠模型中PAH发展的体内作用。
【材料和方法】
【试剂】
伊马替尼：Science Warehouse 1625-1000。
SU5416：R&D Systems 3037。
αSMA抗体：Dako M085129-2。
VWF抗体：Dako A008202-2。
生物素化的山羊抗兔IgG抗体：Vector Labs BA-1000。
生物素化的马抗小鼠IgG抗体，大鼠吸附的：Vector Labs BA-2001。
羧甲基纤维素：Sigma C5678 419273。
TWEEN 80：Sigma P1754。
苄醇：Sigma 305197；402834。
氯化钠：Sigma S7653；VWR 10241。
VECTASTAIN ABC-AP试剂盒：Vector Labs AK-5000。
VECTASTAIN Elite ABC试剂盒：Vector Labs PK-6100。
正常马血清：Vector Labs，目录参考S-2000。
聚山梨醇酯：Sigma 59924。
【实验方案】
【动物】
将C57Bl/6小鼠圈养在无特定病原体的设施中，并随意获取食物和水，并暴露于12小时光照/黑暗循环。该动物研究根据UK Home Office Animals(Scientific Procedures)Act 1986获得许可。
【肺动脉高压的缺氧/SU5416小鼠模型】
将8-10周龄的C57Bl/6雌性小鼠分配到组中(表6)。称取所有组，并皮下(sc)施用在100μl媒介物(0.5％羧甲基纤维素(CMC)；0.9％氯化钠(NaCl)；0.4％聚山梨醇酯80；0.9％苄醇，在去离子水中)中的20mg/kg SU5416，如Ciuclan等AJRCCM 2013中所述。适当时，施用第二个sc注射，如表6所示，含有：PBS、30mg/kg IgG1或30mg/kg抗-Gremlin-1。同时给予缺氧+伊马替尼组的小鼠喂食含有伊马替尼的食物以递送100mg/kg/天。然后将缺氧小鼠组置于正常缺氧(10％O2)室中，而常氧组中的小鼠饲养在常氧(21％O2)条件中，在同一房间中。
表6：治疗组：
如图所示，将C57Bl/6小鼠分配至治疗组。
组 小鼠数量
Normoxia+PBS 2
Normoxia+IgG1 6
Normoxia+抗-GREMLIN1 8
Hypoxia+PBS 2
Hypoxia+IgG 6
Hypoxia+抗-GREMLIN1 8
Hypoxia+伊马替尼 8
在第7天和第14天对所有小鼠称重，并进一步接受皮下剂量的20mg/kg SU5416。适当时，对小鼠施用另外的皮下注射的PBS、30mg/kg IgG1或30mg/kg抗-Gremlin-1(如表6中所示)。在这些研究中使用的抗-Gremlin-1抗体是Ab7326小鼠全长IgG1形式，变体1，如实施例5中所述。在第21天，获得右心室收缩压(RVSP)和平均动脉血压(MABP)，并收集组织。
【右心室收缩压和组织收集】
如表6中所示，在缺氧暴露三周和相关药物处理后从动物获得RVSP和MABP的血液动力学测量。用1.5％异氟烷麻醉动物并将其仰卧在恒温控制在37℃的加热毯上。首先，分离右颈静脉并引入压力导管(Millar小鼠SPR-671NR压力导管，直径为1.4F，MillarInstruments，UK)并进入右心室以测定RVSP。其次，通过分离左颈总动脉和引入的压力导管来测量MABP。将RVSP和MABP记录在预校准的PowerLab系统(ADInstruments，Australia)上。
通过异氟醚麻醉剂过量使动物安乐死并收集全血。将全血离心(220×g；2分钟)，取出血清并保存在-80℃。取出心脏并记录右心室和左心室重量。通过右心室用2.5ml盐水灌注肺。通过充10％福尔马林来固定左肺，然后石蜡包埋和切片。将右肺在液氮中快速冷冻并保存在-80℃。
【组织学】
将载玻片脱蜡并使用二甲苯和浓度梯度的乙醇再水合。将载玻片浸入0.3％H2O2的甲醇溶液中30分钟以回收抗原，在PBS中洗涤3次并在PBS中1:30正常马血清中封闭1小时。向每个载玻片中加入浓度为1:100的抗αSMA一抗，并在4℃温育过夜，然后在PBS中漂洗5分钟，三次。将生物素化的马抗小鼠IgG抗体，大鼠吸附的二抗以1:200稀释并移液到每个载玻片上并温育45分钟；然后在PBS中洗涤3次，每次5分钟。按照制造商的说明书，提前30分钟制备抗生物素蛋白生物素复合碱性磷酸酶(ABC-AP)，并在每个载玻片上放置30分钟；然后洗涤3次，每次5分钟。按照试剂盒说明书制备AP底物，并移液到每个载玻片上并使其显影；然后洗涤3次，每次5分钟。向每个载玻片中加入浓度为1:100的抗vWF一抗，并在4℃温育过夜，然后在PBS中漂洗5分钟，三次。将生物素化的山羊抗兔IgG二抗以1:200稀释，并在每个载玻片上放置45分钟；然后在PBS中洗涤3次，每次5分钟。根据试剂盒的说明书，提前30分钟制备ABC并放在每个载玻片上30分钟；然后洗涤3次，每次5分钟。按照试剂盒说明书制备DAB底物，并移液到每个载玻片上并使其显影～5-10分钟；然后洗涤3次，每次5分钟。将载玻片用苏木精复染～40秒，脱水并使用pertex用盖玻片固定。用Hamamatsu NanoZoomer 2.0-HT载玻片扫描仪(Hamamatsu，Welwyn Garden City，UK)对所有载玻片进行数字扫描。
【数据和统计分析】
评估每个缺氧组随机抽取的大于40个血管的肌肉化程度。至少有四名独立观察者对血管进行评分：0＝无肌肉化；1＝部分肌肉发达；2＝完全肌肉化；并确定每个测定血管的模态值。测定完全、部分或无肌肉化的百分比并绘制平均值±SEM。单因素ANOVA用于确定显著性*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001。
【结果】
在单独的PBS或IgG1对照组中21天，暴露于慢性常压缺氧(10％O2)后施用SU5416(20mg/kg)导致与单独常氧/SU5416单独相比，RVSP的显著(P＜0.01)增加(图12)。在IgG1和PBS处理组之间未观察到显著差异。药物处理对维持在缺氧施用SU5416的小鼠RVSP升高的影响：与对照组相比，伊马替尼导致RVSP的显著(P＜0.001)降低。与IgG1和PBS对照组相比，抗-Gremlin-1导致RVSP的显著(P＜0.005)减少。在维持在常氧的动物中，未观察到抗-Gremlin-1对RVSP的显著作用(图12)。
评估在缺氧和常氧条件下对抗-Gremlin-1(n＝4)或IgG1载体对照(n＝4)的MABP的影响(图13)。没有观察到处理对MABP的显著影响。
测定右心室肥大(右心室/左心室+隔膜重量)(图14)。单独的PBS或IgG1对照组中21天后，暴露于慢性常压缺氧(10％O2)后施用SU5416(20mg/kg)导致与单独常氧/SU5416相比，右心室肥大(RV/LV+S)的显著(P＜0.01)增加(图14)。没有观察到药物处理(伊马替尼或抗-Gremlin-1；)对维持在缺氧施用SU5416的小鼠中的RVSP升高的显著影响。
通过染色石蜡包埋的肺切片评估血管重塑的程度。对血管进行Von Willebrand因子(vWF)染色以鉴定内皮细胞和平滑肌肌动蛋白(αSMA)以评估肌肉化的程度。通过Hamamatsu NanoZoomer 2.0-HT载玻片扫描仪将图像数字化，并且从常氧IgG1中随机取出至少40个血管，并评估每个缺氧组的肌肉化程度。至少有四名独立观察者对血管进行评分：0＝无肌肉化；1＝部分肌肉发达；2＝完全肌肉化；确定每个血管的模态值并绘制无、部分和完全肌肉化的血管的百分比(图15)。暴露于慢性常压缺氧(10％O2)后施用SU5416(20mg/kg)导致完全肌肉化(P＜0.001)和部分肌肉化(P＜0.01)的显著增加，复合物显著减少无肌肉化的(P＜0.001)血管。药物处理对维持在缺氧施用SU5416的小鼠中RVSP升高的影响：伊马替尼导致完全肌肉化的(P＜0.01)血管显著(P＜0.001)减少。此外，与缺氧SU5416IgG1对照组相比，抗-Gremlin-1导致显著性(分别为P＜0.001和P＜0.05)(图15)。与缺氧SU5416IgG1对照组相比，没有观察到药物处理(伊马替尼或抗-Gremlin-1)对部分肌肉化的血管百分比的显著影响。与缺氧SU5416IgG1对照组相比，药物处理(伊马替尼或抗-Gremlin-1)导致非肌肉的血管的百分比增加，但是这未达到显著性。
【讨论】
在这里，我们评估了抗-Gremlin-1抗体对慢性缺氧/SU5416模型中PAH发展的影响。抗-Gremlin-1抗体显著地抑制RVSP(图12)和血管重塑(图15)，同时对PAH的缺氧/SU5416小鼠模型中的全身(MABP)压力(图13)没有影响。我们观察到抗-Gremlin-1抗体对常氧/SU5416处理的小鼠中RVSP没有显著影响。抗-Gremlin-1抗体的作用与Ciuclan及其同事(AJP 2013)的观察结果一致，其中他们证实了抗-Gremlin-1抗体的拮抗作用改善了PAH的慢性缺氧/SU5416-小鼠模型中的RVSP升高和血管重塑(图12和15)。与Ciuclan及其同事相反，我们注意到在该研究中抗-Gremlin-1抗体对右心室肥大没有显著影响(图14)。然而，在该研究中，我们注意到对照药物伊马替尼对缺氧/SU5416小鼠中右心室肥大的发展没有显著影响。总的来说，该研究支持Gremlin-1在PAH的慢性缺氧/SU5416模型中的肺血管重塑发展和RVSP升高中的作用，并且在其治疗中使用抗-Gremlin-1抗体。
【参考文献】
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Gilbane AJ,Derrett-Smith E,Trinder SL,Good RB,Pearce A,Denton CP,Holmes AM.Impaired bone morphogenetic protein receptor II signaling in atransforming growth factor-β-dependent mouse model of pulmonary hypertensionand in systemic sclerosis.Am J Respir Crit Care Med.2015 Mar 15；191(6):665-77.doi:10.1164/rccm.201408-1464OC.
Simonneau G,Robbins IM,Beghetti M,Channick RN,Delcroix M,Denton CP,Elliott CG,Gaine SP,Gladwin MT,Jing ZC,Krowka MJ,Langleben D,Nakanishi N,Souza R.Updated clinical classification of pulmonary hypertension.J Am CollCardiol.2009 Jun 30；54(1 Suppl):S43-54.doi:10.1016/j.jacc.2009.04.012.Review.PMID:19555858.
Thomas M,Docx C,Holmes AM,Beach S,Duggan N,England K,Leblanc C,LebretC,Schindler F,Raza F,Walker C,Crosby A,Davies RJ,Morrell NW,Budd DC.Activin-like kinase 5(ALK5)mediates abnormal proliferation of vascular smooth musclecells from patients with familial pulmonary arterial hypertension and isinvolved in the progression of experimental pulmonary arterial hypertensioninduced by monocrotaline.Am J Pathol.2009 Feb；174(2):380-9.doi:10.2353/ajpath.2009.080565.Epub 2008 Dec 30.
【序列表】
SEQ ID NO:1(人Gremlin-1；Uniprot ID:O60565)
MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:2(具有N末端标签的在晶体学重使用的人截短的Gremlin-1)
MGSSHHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:3(Ab 7326 HCDR1组合Kabat&Chothia)
GYTFTDYYMH
SEQ ID NO:4(Ab 7326 HCDR1 Kabat)
DYYMH
SEQ ID NO:5(Ab 7326 HCDR2 Kabat)
LVDPEDGETIYAEKFQG
SEQ ID NO:6(Ab 7326 HCDR3 Kabat)
DARGSGSYYPNHFDY
SEQ ID NO:7(Ab 7326 LCDR1 Kabat)
KSSQSVLYSSNNKNYLA
SEQ ID NO:8(Ab 7326 LCDR2 Kabat)
WASTRES
SEQ ID NO:9(Ab 7326 LCDR3 Kabat)
QQYYDTPT
SEQ ID NO:10(Ab 7326重链可变区变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:11(Ab 7326轻链可变区变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:12(Ab 7326重链可变区变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:13(Ab 7326轻链可变区变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:14(小鼠全长IgG1重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:15(小鼠全长IgG1轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:16(人全长IgG1重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:17(人全长IgG1轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:18(Fab重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO:19(Fab轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:20(无N末端标签的在晶体学重使用的人截短的Gremlin-1)
AMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:21(缺少氨基酸1-21的信号肽的SEQ ID NO:1的成熟Gremlin-1序列)
KKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:22(人IgG4P重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:23(人IgG4P轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:24(人IgG1重链DNA变体1)
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttcccgctcgctccatcatcgaagtctaccagcggaggcactgcggctctcggttgcctcgtgaaggactacttcccggagccggtgaccgtgtcgtggaacagcggagccctgaccagcggggtgcacacctttccggccgtcttgcagtcaagcggcctttactccctgtcatcagtggtgactgtcccgtccagctcattgggaacccaaacctacatctgcaatgtgaatcacaaacctagcaacaccaaggttgacaagaaagtcgagcccaaatcgtgtgacaagactcacacttgtccgccgtgcccggcacccgaactgctgggaggtcccagcgtctttctgttccctccaaagccgaaagacacgctgatgatctcccgcaccccggaggtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcacatgaggacccagaggtgaagttcaattggtacgtggatggcgtcgaagtccacaatgccaaaactaagcccagagaagaacagtacaattcgacctaccgcgtcgtgtccgtgctcacggtgttgcatcaggattggctgaacgggaaggaatacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgccggcaccgatcgagaaaactatctccaaagcgaagggacagcctagggaacctcaagtctacacgctgccaccatcacgggatgaactgactaagaatcaagtctcactgacttgtctggtgaaggggttttaccctagcgacattgccgtggagtgggaatccaacggccagccagagaacaactacaagactacccctccagtgctcgactcggatggatcgttcttcctttactcgaagctcaccgtggataagtcccggtggcagcagggaaacgtgttctcctgctcggtgatgcatgaagccctccataaccactatacccaaaagtcgctgtccctgtcgccgggaaag
SEQ ID NO:25(人IgG1轻链DNA变体1)
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
SEQ ID NO:26(人IgG4P重链DNA变体1)
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctcctccagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccccccctgccctgcccctgaatttctgggcggaccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctccagcatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctccttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtcttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagcctgggcaag
SEQ ID NO:27(人IgG4P轻链DNA变体1)
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
SEQ ID NO:28(小鼠全长IgG1重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:29(小鼠全长IgG1轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:30(人全长IgG1重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:31(人全长IgG1轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:32(Fab重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO:33(Fab轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:34(人IgG4P重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:35(人IgG4P轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列表
<110> UCB Biopharma SPRL
<120> GREMLIN-1晶体结构和抑制性抗体
<130> PF0045-WO-PCT
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 1
Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala
20 25 30
Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg
50 55 60
Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala
65 70 75 80
Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr
85 90 95
Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr
100 105 110
Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro
115 120 125
Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys
130 135 140
Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu
145 150 155 160
Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys
165 170 175
Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
180
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Ser Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser
20 25 30
Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp
35 40 45
Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn
50 55 60
Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe
65 70 75 80
Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys
85 90 95
Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn
100 105 110
Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val
115 120 125
Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
130 135
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 3
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 4
Asp Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 5
Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 6
Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 7
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 8
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 9
Gln Gln Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr
1 5
<210> 10
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
130 135 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
210 215 220
Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu
245 250 255
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val
290 295 300
Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile
340 345 350
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp
385 390 395 400
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser
405 410 415
Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 15
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 16
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys
225
<210> 19
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 20
Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro
20 25 30
Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile
35 40 45
Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His
50 55 60
Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro
65 70 75 80
Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln
85 90 95
Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys
100 105 110
Ile Ser Ile Asp Leu Asp
115
<210> 21
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 21
Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln
1 5 10 15
His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg
20 25 30
Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu
35 40 45
Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr
50 55 60
Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His
65 70 75 80
Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly
85 90 95
Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly
100 105 110
Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met
115 120 125
Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys
130 135 140
Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
145 150 155 160
<210> 22
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 23
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 24
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 24
caagtgcaac tggtggaatc cggggccgaa gtgaaaaagc ccggagccac tgtgaagatc 60
tcttgcaaag tgtccggcta caccttcacc gactattaca tgcactgggt ccagcaggca 120
cctgggaagg gccttgagtg gatgggtctg gtcgatcccg aggacggcga aactatctac 180
gccgagaagt tccagggtcg cgtcaccatc accgccgaca cttccaccga caccgcgtac 240
atggagctgt ccagcttgag gtccgaggac acagccgtgt actactgcgc cacggatgct 300
cggggaagcg gcagctacta cccgaaccac ttcgactact ggggacaggg cactctcgtg 360
actgtctcga gcgcttctac aaagggcccc tccgtgttcc cgctcgctcc atcatcgaag 420
tctaccagcg gaggcactgc ggctctcggt tgcctcgtga aggactactt cccggagccg 480
gtgaccgtgt cgtggaacag cggagccctg accagcgggg tgcacacctt tccggccgtc 540
ttgcagtcaa gcggccttta ctccctgtca tcagtggtga ctgtcccgtc cagctcattg 600
ggaacccaaa cctacatctg caatgtgaat cacaaaccta gcaacaccaa ggttgacaag 660
aaagtcgagc ccaaatcgtg tgacaagact cacacttgtc cgccgtgccc ggcacccgaa 720
ctgctgggag gtcccagcgt ctttctgttc cctccaaagc cgaaagacac gctgatgatc 780
tcccgcaccc cggaggtcac ttgcgtggtc gtggacgtgt cacatgagga cccagaggtg 840
aagttcaatt ggtacgtgga tggcgtcgaa gtccacaatg ccaaaactaa gcccagagaa 900
gaacagtaca attcgaccta ccgcgtcgtg tccgtgctca cggtgttgca tcaggattgg 960
ctgaacggga aggaatacaa gtgcaaagtg tccaacaagg cgctgccggc accgatcgag 1020
aaaactatct ccaaagcgaa gggacagcct agggaacctc aagtctacac gctgccacca 1080
tcacgggatg aactgactaa gaatcaagtc tcactgactt gtctggtgaa ggggttttac 1140
cctagcgaca ttgccgtgga gtgggaatcc aacggccagc cagagaacaa ctacaagact 1200
acccctccag tgctcgactc ggatggatcg ttcttccttt actcgaagct caccgtggat 1260
aagtcccggt ggcagcaggg aaacgtgttc tcctgctcgg tgatgcatga agccctccat 1320
aaccactata cccaaaagtc gctgtccctg tcgccgggaa ag 1362
<210> 25
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 25
gacattgtga tgacccagtc ccccgattcg cttgcggtgt ccctgggaga acgggccacc 60
attaactgca agagctcaca gtccgtcctg tattcatcga acaacaagaa ttacctcgca 120
tggtatcagc agaagcctgg acagcctccc aagctgctca tctactgggc tagcacccgc 180
gaatccgggg tgccggatag attctccgga tcgggttcgg gcactgactt cactctgact 240
atcaactcac tgcaagccga ggatgtcgcg gtgtacttct gtcagcagta ctacgacacc 300
ccgacctttg gacaaggcac cagactggag attaagcgta cggtggccgc tccctccgtg 360
ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgcctccgt cgtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
tccggcaact cccaggaatc cgtcaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540
tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 657
<210> 26
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 26
caagtgcaac tggtggaatc cggggccgaa gtgaaaaagc ccggagccac tgtgaagatc 60
tcttgcaaag tgtccggcta caccttcacc gactattaca tgcactgggt ccagcaggca 120
cctgggaagg gccttgagtg gatgggtctg gtcgatcccg aggacggcga aactatctac 180
gccgagaagt tccagggtcg cgtcaccatc accgccgaca cttccaccga caccgcgtac 240
atggagctgt ccagcttgag gtccgaggac acagccgtgt actactgcgc cacggatgct 300
cggggaagcg gcagctacta cccgaaccac ttcgactact ggggacaggg cactctcgtg 360
actgtctcga gcgcttctac aaagggcccc tccgtgttcc ctctggcccc ttgctcccgg 420
tccacctccg agtctaccgc cgctctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgagccc 480
gtgacagtgt cctggaactc tggcgccctg acctccggcg tgcacacctt ccctgccgtg 540
ctgcagtcct ccggcctgta ctccctgtcc tccgtcgtga ccgtgccctc ctccagcctg 600
ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag 660
cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cccccctgcc ctgcccctga atttctgggc 720
ggaccttccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccaggaag atcccgaggt ccagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaat gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 900
aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccct ccagcatcga aaagaccatc 1020
tccaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc tagccaggaa 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtca agggcttcta cccctccgac 1140
attgccgtgg aatgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggctc cttcttcctg tactctcggc tgaccgtgga caagtcccgg 1260
tggcaggaag gcaacgtctt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgtccct gagcctgggc aag 1353
<210> 27
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 27
gacattgtga tgacccagtc ccccgattcg cttgcggtgt ccctgggaga acgggccacc 60
attaactgca agagctcaca gtccgtcctg tattcatcga acaacaagaa ttacctcgca 120
tggtatcagc agaagcctgg acagcctccc aagctgctca tctactgggc tagcacccgc 180
gaatccgggg tgccggatag attctccgga tcgggttcgg gcactgactt cactctgact 240
atcaactcac tgcaagccga ggatgtcgcg gtgtacttct gtcagcagta ctacgacacc 300
ccgacctttg gacaaggcac cagactggag attaagcgta cggtggccgc tccctccgtg 360
ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgcctccgt cgtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
tccggcaact cccaggaatc cgtcaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540
tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 657
<210> 28
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
130 135 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
210 215 220
Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu
245 250 255
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val
290 295 300
Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile
340 345 350
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp
385 390 395 400
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser
405 410 415
Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 29
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 30
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 31
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys
225
<210> 33
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 34
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 35
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组序列
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (13)

1.抗Gremlin-1抗体，其包含SEQ ID NO：4/5/6/7/8/9或SEQ ID NO：3/5/6/7/8/9的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列组合。
2.权利要求1的抗体，其包含：
SEQ ID NO：10或12的重链可变区(HCVR)序列，和/或
SEQ ID NO：11或13的轻链可变区(LCVR)序列。
3.权利要求2的抗体，其包含SEQ ID NO：10/11或12/13的HCVR和LCVR序列对。
4.权利要求3的抗体，其包含：SEQ ID NO：14/15、16/17、18/19、22/23、28/29、30/31、32/33或34/35的重链和轻链对。
5.权利要求1～3之任一项的抗体，其是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
6.权利要求1～3之任一项的抗体，其是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
7.分离的多核苷酸，其编码权利要求1～6之任一项所定义的抗体。
8.表达载体，其携带权利要求7的多核苷酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求8所定义的载体。
10.生产权利要求1～6之任一项所定义的抗体的方法，包括在允许生产抗体的条件下培养权利要求9的宿主细胞，并回收生产的抗体。
11.药物组合物，其包含权利要求1～6之任一项所定义的抗体和药学上可接受的佐剂和/或运载体。
12.权利要求1～6之任一项所定义的抗体或权利要求11所定义的药物组合物在制造用于治疗或预防纤维化疾病、肺动脉高血压、血管生成和/或癌症的药物中的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述纤维化疾病是肾纤维化和/或特发性肺纤维化。
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