JP6944552B2 - 抗HtrA1抗体及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2016年10月25日に作成された該ASCIIコピーは、50474−117WO4_Sequence_Listing_10_25_16_ST25という名称であり、114,779バイトのサイズである。
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む(かつ説明する)。
等で表される。ある特定の位置での選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野で周知であり、例えば、TRIMアプローチ(Knappek et al.,J.Mol.Biol.296:57−86,1999、Garrard et al.,Gene 128:103,1993)である。ある特定のコドンセットを有するかかる組のオリゴヌクレオチドは、商用核酸合成機(例えば、Applied Biosystems,Foster City,CAから入手可能)を使用して合成され得るか、または商業的に入手され得る(例えば、Life Technologies,Rockville,MDから)。したがって、特定のコドンセットを有する合成された一組のオリゴヌクレオチドは、典型的には、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、差異は、全体配列内のコドンセットによって確立される。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、例えば、クローニング目的に有用な制限酵素部位も含み得るが、必ずしも含むわけではない。
本発明は、HtrA1に結合する新規の抗体、ならびにそれを作製及び使用する方法(例えば、治療的使用及び診断的使用のため)を提供する。本発明の抗体は、例えば、様々な障害、例えば、HtrA1関連障害、眼障害、及び/または補体関連障害、例えば、加齢性黄斑変性症(例えば、地図状萎縮)の診断または治療に有用である。
一態様では、本発明は、HtrA1に特異的に結合する抗体に部分的に基づく。本発明の抗体は、例えば、障害、例えば、HtrA1関連障害、眼障害、及び/または補体関連障害、例えば、加齢性黄斑変性症(例えば、地図状萎縮)の治療または診断に有用である。
本発明は、例えば、HtrA1関連障害、眼障害、及び/または補体関連障害(例えば、AMD(例えば、地図状萎縮))を含む障害の治療方法で、本発明の抗HtrA1抗体と使用され得る抗D因子抗体を提供する。本発明は、HtrA1及びD因子に特異的に結合する多重特異性(例えば、二重特異性)抗体(例えば、抗HtrA1/抗D因子抗体)も提供する。任意の好適な抗D因子抗体が、本発明の組成物及び方法に使用され得る。非限定的な例として、本明細書に記載されており、及び/または米国特許第8,067,002号、同第8,268,310号、同第8,273,352号、及び/または米国特許出願第14/700,853号に記載されているいずれの抗D因子抗体も、本発明の組成物及び方法に使用され得る。
本明細書に記載の抗体(例えば、上述の抗HtrA1抗体及び抗D因子抗体、ならびに以下に記載の抗HtrA1/抗D因子抗体)、ならびに本明細書に記載の方法に使用するための抗体のうちのいずれかは、以下の1〜8節に記載の特徴のうちのいずれかを単独または組み合わせで有し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体(例えば、抗HtrA1抗体、抗D因子抗体、または二重特異性抗HtrA1抗D因子抗体)は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下(例えば、10−8M以下、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(KD)を有する。例えば、いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、約10nM以下のKDでヒトHtrA1(huHtrA1)に結合する。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、約5nM以下のKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本明細書に提供される抗体は、約2nM以下のKDでhuHtrA1に結合する。例えば、いくつかの例では、本抗体は、約25pM〜約2nM(例えば、約25pM、約50pM、約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM、約625pM、約650pM、約675pM、約700pM、約725pM、約750pM、約775pM、約800pM、約825pM、約850pM、約875pM、約900pM、約925pM、約950pM、約975pM、約1nM、約1.1nM、約1.2nM、約1.3nM、約1.4nM、約1.5nM、約1.6nM、約1.7nM、約1.8nM、約1.9nM、または約2nM)のKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約600pM(例えば、約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM)のKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約500pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約400pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約300pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約200pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約150pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約125pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約75pM〜約100pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約80pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約60pMのKDでhuHtrA1に結合する。いくつかの例では、本抗体は、約40pMのKDでhuHtrA1に結合する。
本発明は、例えば、参照抗HtrA1抗体と比較して、安定性が強化された抗体を提供する。抗体の安定性は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、分光法(例えば、質量分光法)、示差走査蛍光定量法(DSF)、円偏光二色性(CD)、内在性タンパク質蛍光、示差走査熱量測定、光散乱(例えば、動的光散乱(DLS)及び静的光散乱(SLS)、自己相互作用クロマトグラフィー(SIC)を使用して決定され得る。抗HtrA1抗体は、例えば、参照抗HtrA1抗体と比較して、溶融温度(Tm)、凝集温度(Tagg)、または安定性の他の測定基準の高まりを有し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv、及びscFv断片、及び以下に記載の他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Hudson et al.,Nat.Med.9:129−134(2003)を参照されたい。scFv断片の概説については、例えば、Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer−Verlag,New York),pp.269−315(1994)を参照されたく、WO93/16185、ならびに米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつ増加したインビボ半減期を有するFab及びF(ab’)2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984)に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変ドメイン)及びヒト定常ドメインを含む。さらなる一例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、概して、van Dijk et al.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368−74(2001)及びLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450−459(2008)に記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性または活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Hoogenboom et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1−37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)に概説されており、例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552−554、Clackson et al.,Nature 352:624−628(1991)、Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581−597(1992)、Marks and Bradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161−175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)、Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004)、Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004)、Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467−12472(2004)、及びLee et al.,J.Immunol.Methods 284(1−2):119−132(2004)にさらに記載されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、HtrA1の2つの異なるエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、HtrA1に対するものであり、他方は、任意の他の抗原(例えば、第2の生物学的分子、例えば、D因子)に対するものである。したがって、二重特異性抗体は、HtrA1及びD因子に対する結合特異性を有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。本明細書に記載の抗HtrA1抗体のうちのいずれかを使用して、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、例えば、抗HtrA1/抗D因子二重特異性抗体を操作することができる。本明細書に記載されており、及び/または当該技術分野で既知の抗D因子抗体のうちのいずれかを使用して、かかる抗HtrA1/抗D因子二重特異性抗体を操作することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異形(例えば、1つ以上のアミノ酸残基改変を含む抗体変異形)が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、その抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/またはそれへの挿入、及び/またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有することを条件とする。
ある特定の実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異形が提供される。置換型変異誘発のための目的とする部位としては、HVR及びFRが挙げられる。保存的置換が、表1の「好ましい置換」という見出しの下に示される。より実質的な変化が、表1の「例示の置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換が目的とする抗体に導入され得、その産物が、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低減、またはADCCもしくはCDCの改善についてスクリーニングされ得る。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
ある特定の実施形態では、1つ以上のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され、それによりFc領域変異形が生成され得る。Fc領域変異形は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域)を含み得る。ある特定の実施形態では、本発明は、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能(補体及びADCC等)が不要または有害である用途に望ましい候補となる全てではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変異形を企図する。インビトロ及び/またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、CDC及び/またはADCC活性の低減/枯渇を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを行って、抗体がFcγR結合を欠く(それ故に、ADCC活性を欠く可能性がある)が、FcRn結合能力を保持することを確実にすることができる。ADCCを媒介するための初代細胞であるNK細胞が、Fc(RIIIのみを発現する一方で、単球はFcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIを発現する。造血細胞でのFcR発現は、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457−492(1991)の464貢の表3に要約されている。
ある特定の実施形態では、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作された抗体、例えば、「thioMAb」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体の到達可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー−薬物部分にコンジュゲートして、本明細書にさらに記載されるように、イムノコンジュゲートを作製することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基:軽鎖のV205(Kabat番号付け)、重鎖のA118(EU番号付け)、及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)のうちのいずれか1つ以上が、システインで置換され得る。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように生成され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合したポリマーの数は異なり得、1つより多くのポリマーが結合している場合、それらは同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/またはタイプは、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下にてある療法で使用されるか等を含むが、これらに限定されない考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
本発明は、改変された等電点を有する抗体変異形を提供する。例えば、本発明は、参照抗HtrA1抗体と比較して、例えば、低減された等電点(pI)を有する抗体変異形を提供する。いくつかの例では、表面電荷は、生理学的pHで減少する。いくつかの例では、抗HtrA1抗体は、約8以下(例えば、約8、約7、約6、約5、または約4)のpIを有する。いくつかの例では、本抗体は、約4〜約8(例えば、約4、約5、約6、約7、または約8)のpIを有する。いくつかの例では、抗HtrA1抗体は、約5〜約7(例えば、約5、約6、または約7)のpIを有する。いくつかの例では、抗HtrA1抗体は、約5〜約6(例えば、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、または約6)のpIを有する。
本明細書に記載の抗体のうちのいずれか(例えば、抗HtrA1抗体)は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載の組換え方法及び組成物を使用して産生され得る。一実施形態では、本明細書に記載の抗HtrA1抗体をコードする単離された核酸が提供される。かかる核酸は、本抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、本抗体の軽鎖及び/または重鎖)をコードし得る。さらなる一実施形態では、かかる核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる一実施形態では、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。かかる一実施形態では、宿主細胞は、(1)本抗体のVLを含むアミノ酸配列及び本抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)本抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び本抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それで形質転換されている)。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施形態では、抗HtrA1抗体を作製する方法が提供され、本方法は、本抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、上に提供されるように、本抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、本抗体を宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から回収することとを含む。
本明細書に提供される抗HtrA1抗体(例えば、抗HtrA1抗体及び抗HtrA1/抗D因子抗体)は、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって特定され得るか、それらの物理的/化学的特性及び/または生物学的活性についてスクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ELISA、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、BIACORE(登録商標))等の既知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
一態様では、生物学的活性を有するその抗HtrA1抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、HtrA1の1つ以上の生物学的活性を阻害、遮断、拮抗、抑制、妨害、調節、及び/または低減することを含み得る。かかる生物学的活性をインビボ及び/またはインビトロで有する抗体も提供される。
一態様では、抗HtrA1抗体の安定性(例えば、熱安定性)を決定するためのアッセイが提供される。例えば、抗体の安定性は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、示差走査蛍光定量法(DSF)、円二色性(CD)、内在性タンパク質蛍光、示差走査熱量測定、分光法、光散乱(例えば、動的光散乱(DLS)及び静的光散乱(SLS)、自己相互作用クロマトグラフィー(SIC)を使用して決定され得る。アッセイの安定性は、例えば、AAPH応力試験及び/または熱応力試験との関連で、例えば、実施例4に記載の質量分析を使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗HtrA1抗体のうちのいずれかは、生物学的試料中のHtrA1の存在の検出に有用である。「検出すること」という用語は、本明細書で使用されるとき、定量的検出または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、光受容細胞、網膜色素上皮細胞、外顆粒層の細胞、内顆粒層、ミュラー細胞、毛様体上皮、または網膜組織を含む試料等の細胞または組織を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、体液、例えば、硝子体または血液を含む。
便宜上、本発明の抗体(例えば、抗HtrA1抗体または抗HtrA1/抗D因子抗体)は、キットで、すなわち、所定量の試薬と診断アッセイを行うための説明書とのパッケージ化された組み合わせで提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、酵素(例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体)によって必要とされる基質及び補因子を含む。さらに、安定剤、緩衝液(例えば、遮断緩衝液または溶解緩衝液)等の他の添加物が含まれ得る。様々な試薬の相対量を広く変化させて、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供することができる。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、乾燥粉末、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。
抗体またはその抗体変異形(例えば、本発明の抗HtrA1抗体または抗HtrA1/抗D因子抗体)の治療製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、当該技術分野で典型的に用いられる任意の「薬学的に許容される」担体、賦形剤、または安定剤(これらは全て「賦形剤」と呼ばれる)と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液として保存するために調製され得る。例えば、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤、及び他の種々の添加物。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,A.Osol,Ed.(1980)を参照されたい。かかる添加物は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。
本明細書に提供される抗HtrA1抗体(例えば、抗HtrA1抗体及び抗HtrA1/抗D因子抗体)のうちのいずれも、治療方法に使用され得る。
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び/または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。本製品は、容器と、容器上のもしくは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静脈注射用溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わせて、状態の治療、予防、及び/または診断に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した状態を治療するために使用されることを示す。さらに、本製品は、(a)本発明の抗体を含む組成物を内部に収容した第1の容器と、(b)さらなる細胞傷害性薬剤、またはさもなければ治療薬を含む組成物を内部に収容した第2の容器とを含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物が特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは、または加えて、本製品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第2(または第3)の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
以下の実験の目標は、HtrA1に対してより高い効力及びより高い親和性を有する新たな抗HtrA1抗体を発見することであった。
A.培地及び抗体
CLONACELL(商標)−HY Medium B(カタログ番号03802)、Medium C(カタログ番号03803)、Medium D(カタログ番号03804)、及びMedium E(カタログ番号03805)を、StemCell Technologiesから入手した。電気融合に使用されるCYTOFUSION(登録商標)Medium C(カタログ番号LCM−C)を、Cyto Pulse Sciencesから入手した。アロフィコシアニン(APC)標識ヤギF(ab’)2抗マウスIgを、SouthernBiotech(カタログ番号1012−11)から入手し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fc抗体を、Sigmaから入手した。TMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)One Component HRP Microwell Substrate(カタログ番号TMBW−1000−01)及びTMB Stop Reagent(カタログ番号BSTP−1000−01)を、BioFx Laboratoriesから入手した。
5匹のHtrA1ノックアウトマウス(HtrA1.noneo.BALB.ko.C1−3)を、3〜4日間隔で合計12回のブーストでの足蹠注射(マウス1匹当たり2μg/注射)、続いて、リン酸緩衝生理食塩水中での抗原での2回の融合前ブーストにより、モノホスホリル脂質A/トレハロースジコリノミコレートアジュバント中に懸濁させた精製されたHisタグ付き組換えマウスHtrA1プロテアーゼドメイン(本明細書においてmuHtrA1−PD−His(配列番号153)と称され、WO2013/055998の実施例2を参照されたい)で免疫化した。最後のブーストの3日後、免疫化されたマウスの脾臓及びリンパ節由来のリンパ球を収集し、単離した。WO2013/055998の実施例2に記載されるように、muHtrA1−PD−Hisを精製により注射のために調製した。
2匹のマウス(番号748及び749)から単離したマウス脾臓細胞を、Cyto Pulse CEEF−50装置(Cyto Pulse Sciences)を使用して、SP2/0骨髄腫細胞(American Type Culture Collection)と融合させた。手短に言えば、CYTOFUSION(登録商標)Medium Cで2回洗浄した後、単離した脾臓細胞及びSP2/0細胞を1:1比で混合し、その後、CYTOFUSION(登録商標)Medium C中に1000万細胞/mLの濃度で再懸濁させた。電気融合を製造業者の指針に従って行った。融合した細胞を、7%CO2インキュベータ内で、CLONACELL(商標)−HY Medium C中、37℃で一晩培養した。翌日、融合した細胞を遠心分離し、その後、10mLのCLONACELL(商標)−HY Medium C中に再懸濁させ、その後、選択的試薬ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン(HAT)を含有する90mLのメチルセルロース系CLONACELL(商標)−HY Medium Dと穏やかに混合した。細胞を40×100mmのペトリ皿(カタログ番号351029、Becton Dickinson)にプレーティングし、7%CO2インキュベータ内で、37℃で成長させた。10日間インキュベートした後、1429個の単一ハイブリドーマクローンを、CLONEPIX(商標)システム(Genetix,United Kingdom)を使用して採取し、200μL/ウェルCLONACELL(商標)−HY Medium Eを有する15×96ウェル細胞培養プレート(番号353075、Becton Dickinson)に移した。ハイブリドーマ培養培地を交換し、3日後、ハイブリドーマ上清を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってスクリーニングして、muHtrA1−PD−Hisへの結合についてアッセイした。
表2:抗体精製のために選択された7個の最終クローンの特性
i.96ウェル形式でcDNA末端の5’−高速増幅(5’−RACE)を使用したハイブリドーマ細胞からの可変領域遺伝子配列のクローニング
各ハイブリドーマクローンについて、約25μLの対数期増殖細胞(0.5〜1.0×106細胞/mL)を、組織培養プレートから96ウェルU底プレートのウェルに移した。その後、150μLの冷1倍PBSを添加して細胞を洗浄した後、1000rpmで5分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞ペレットを25μLの冷1倍PBS中に再懸濁させた。
以下からなるマスターミックスをエッペンドルフチューブ内で調製した(50ウェル用):2.5μLのRNASEOUT(商標)(Invitrogen番号10777019)、12.5μLの10倍合成緩衝液(5倍SUPERSCRIPT(登録商標)緩衝液)、12.5μLのジチオスレイトール(DTT)(0.1M Invitrogen番号P/NY00147)、6.25μLのdNTP(10mM Invitrogen番号18427−013)、12.5μLの2.5%ノニルフェノキシポリエトキシエタノール(NP−40)、2mg/mLで6.25μLのウシ血清アルブミン(BSA)(BioLabs番号9001S)、25μLのRACE4muHCプライマー(PCRグレード水中、1:100)(軽鎖(LC)の配列決定のためのRace 3カッパプライマーの代用)、37.5μLのPCRグレード水、及び10μLのSUPERSCRIPT(登録商標)3酵素(Invitrogen番号18080−093)。Race4muHC縮重プライマーヌクレオチド配列は、TTT YTT GTC CAC CKT GGT GCT GC(配列番号139)であり、ここで、Yは、CまたはTをコードし、Kは、GまたはTをコードする。Race 3カッパプライマーヌクレオチド配列は、GTA GAA GTT GTT CAA GAA G(配列番号140)である。
10倍ストックテーリング緩衝液を、以下の成分で作製した(50ウェル用):5μLの1M MgCl2、5μLの0.1M DTT、5μLの1M Tris(pH7.5)、10μLの100mM dGTP、及び25μLのPCRグレード水。
以下からなるマスターミックスを15mLファルコンチューブ内で調製した(50ウェル用):1050μLのPCRグレード水、500μLの5倍GC cDNA PCR反応緩衝液、500μLのGC−melt試薬(Clontech番号S1091)、50μLの順方向プライマーDC5dn、50μLのRace7muHC(LCのためのRace 2カッパプライマー)、50μLのdNTP(10mM)、及び50μLのGC ADVANTAGE(登録商標)ポリメラーゼ(Clontech番号S1088)。Race7muHC縮重プライマーヌクレオチド配列は、CAR GTC AMD GTC ACT GRC TCA G(配列番号141)であり、ここで、Rは、AまたはGのいずれかをコードし、Mは、AまたはCのいずれかをコードし、Dは、GまたはAまたはTのいずれかをコードする。Race 2カッパプライマーヌクレオチド配列は、GAG GCA CCT CCA GAT GTT AAC(配列番号142)である。
96℃で4分間
[96℃で45秒間、64℃で30秒間、68℃で90秒間]を3サイクル、[96℃で45秒間、61℃で30秒間、68℃で90秒間]を3サイクル、[96℃で45秒間、58℃で30秒間、68℃で90秒間]を3サイクル、[96℃で45秒間、57℃で30秒間、68℃で90秒間]を3サイクル、[96℃で45秒間、55℃で30秒間、68℃で90秒間]を3サイクル
[96℃で45秒間、52℃で30秒間、68℃で90秒間]を25サイクル
68℃で5分間、続いて、4℃で保持。
ゲル濾過分析のために、200mM K2PO4、250mM KCl、pH7.0を移動相として使用して、10mLの精製試料をTSK−GEL(登録商標)Super SW3000(4.6mm内径×30cm、TOSOH Bioscience)に0.35mL/分で注入した。およそ2mgの精製IgGを、50mMジチイオレイトール(dithioreitol)で、37℃で20分間にわたって還元し、PLRP−Sカラム(Agilent)及びアセトニトリル勾配を使用してオンライン逆相分離した後に、飛行時間型(TOF)質量分析(Agilent LC/MS 6224)により分析した。インタクトな質量を、MassHunter定性分析ソフトウェア(Agilent)を使用して収集されたm/zスペクトルの最大エントロピー逆重畳積分により決定した。
19B12、20E2、3A5、12A5、及び15H6の重鎖可変領域(VH)の配列を、図6Aに示す。19B12、20E2、3A5、12A5、及び15H6の軽鎖可変領域(VL)の配列を、図6Bに示す。これらのクローンは、特有の重鎖及び軽鎖を有する。質量分析データは、配列データを裏付けた(表3及び4を参照のこと)(例えば、Bos et al.Biotechnol.Bioeng.112(9):1832−1842,2015を参照のこと)。
表3:質量分析により決定されたHC質量
表4:質量分析により決定されたLC質量
i.抗体15H6及び19B12のTOPO(登録商標)クローニング
TOPO(登録商標)クローニングを行って、5’−RACE PCR産物(上述のもの)の直接配列決定から得られた抗体クローン15H6及び19B12の可変領域配列を確認した。TOPO(登録商標)TAクローニング反応を、pCR(商標)4−TOPO(登録商標)TA Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen K4575−02)マニュアルに記載されるように行った。手短に言えば、2μLのPCR産物、2μLの水、1μLのpCR(商標)4−TOPO(登録商標)ベクター、及び1μLの含塩溶液をチューブ内で組み合わせ、混合し、室温で5分間インキュベートした。その後、反応物を氷上に置き、2μLのこのTOPO(登録商標)クローニング反応物をONE−SHOT(登録商標)化学的にコンピテントなTOP10 Escherichia coli細胞(Invitrogen K4575−02)の解凍バイアルに添加し、ピペッティングせずに混合した。反応物を氷上で5〜30分間インキュベートした。その後、細胞を振盪せずに42℃で30秒間熱ショックした。チューブを直ちに氷に移した。250μLの室温SOC培地を添加した。チューブに蓋をし、37℃で1時間、200rpmで水平に振盪した。次に、各形質転換体から50μLを、50μg/mLのカルベニシリンを含有する予め加温したLB寒天プレート上に広げた。プレートを37℃で一晩インキュベートし、コロニーを翌日採取し、プラスミド精製を行った。配列を確認し、各々TOPO(登録商標)ベクター中の15H6 VH及びVL配列、ならびに19B12 VH及びVL配列を含有する特定のウェルを、無制限クローニングにおけるソースベクターとして使用するために選択した。
TOPO(登録商標)ベクターにおける重鎖及び軽鎖可変領域を、LCについて以下の方法でPCRミックスを設定することによって増幅した:0.5μLの鋳型DNA(ミニプレップソースベクター)、4μLの15H6 VL順方向プライマー、4μLの15H6 VL逆方向プライマー、2μLの10mM dNTP、20μLの5倍HF緩衝液、1μLのPHUSION(登録商標)ポリメラーゼ(F−549L、Thermo Scientific、2U/μL)、及び68.5μLの水。HCのクローニングのための反応ミックスを、15H6 VH順方向及び逆方向プライマーを使用したこと以外は、同じ方法で設定した。19B12 PCRミックスを、19B12プライマーを使用したこと以外は、15H6ミックスと同じ方法で設定した。プライマー配列は、以下の通りであった:
98℃で30秒間
[98℃で15秒間、68℃で30秒間、72℃で35秒間]を35サイクル
72℃で10分間
98℃で30秒間
[98℃で15秒間、68℃で30秒間、72℃で4分間]を25サイクル
72℃で10分間
293細胞上清からの自動精製を、500mLのMCA96ヘッドを有するTecan Freedom EVO(登録商標)200液体処理システム上で行った。手短に言えば、IgGを、20mLのMABSELECT SURE(商標)樹脂(Glygen Corp.,Columbia,Maryland&GE Healthcare,Pittsburgh,Pennsylvania)をカスタム充填した先端カラムを使用して捕捉した。1倍PBS(pH7.4)で洗浄した後、IgGを160mLの50mMリン酸(pH3)中に溶出し、12mLの20倍PBS(pH11)で中和した。MABSELECT SURE(商標)先端カラムを0.1MのNaOH中で取り除き、1倍PBS(pH7.4)で再生して、最大15回連続使用した。同様に、Fabを、20mLのGAMMABIND(商標)Plus樹脂(Glygen Corp&GE Healthcare)をカスタム充填した先端カラムを使用して捕捉し、続いて、1倍PBS(pH7.4)で洗浄した。Fabを190mLの10mMクエン酸(pH2.9)中に溶出し、19mLの0.4M Tris(pH8.7)で中和した。GAMMABIND(商標)Plus先端カラムを6Mグアニジンで取り除き、1倍PBS(pH7.4)で再生して、最大15回連続使用した。
huHtrA1−FL活性を阻害する組換え15H6及び19B12抗体の能力を、上述のC節に記載のFRET遮断アッセイを使用して評価した。これらの両方の組換え抗体は、ハイブリドーマ由来の抗体から決定されるように、それらの元の遮断活性を保持した(図7A及び7B)。組換え15H6抗体がおよそ0.7nMのIC50を有した一方で、組換え19B12抗体は、およそ1.2nMのIC50を有し、これは、ハイブリドーマ由来の抗体の活性を反映した(図7A及び7B)。
A.抗HtrA1抗体15H6のヒト化
マウス15H6抗体(m15H6とも称される)の軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)配列をヒト抗体コンセンサス配列とアラインし、ヒトコンセンサス軽鎖カッパI(huκ1)及びヒトコンセンサス重鎖下位群I(huVH1)を最も近いヒトフレームワークと特定した(図8A及び8B)。
表5:m15H6及びh15H6.v1のHtrA1への動態結合分析
表6:h15H6.v2 LC−W91変異形のHtrA1への動態結合分析
表7:H15H6.v2変異形のpI
マウス抗体19B12(m19B12とも称される)のVL及びVHのアミノ酸配列をヒトコンセンサス配列とアラインし、ヒトコンセンサス軽鎖カッパIV(huκ4)及びヒトコンセンサス重鎖下位群III(huVH3)を最も近いヒトフレームワークと特定した(図15A〜15B)。
表8:m19B12またはh19B12.v1のHtrA1への動態結合分析
i.ファージIC50を決定するためのファージ競合ELISA
MAXISORP(商標)マイクロタイタープレートをPBS中2μg/mLのヒトHtrA1−PD−Hisで2時間コーティングし、その後、PBST緩衝液(PBS中0.5%BSA及び0.05%TWEEN(登録商標)20)で、室温で1時間遮断した。培養上清から精製されたファージを、組織培養マイクロタイタープレート内でPBST緩衝液中連続希釈されたヒトまたはマウスHtrA1と1時間インキュベートし、その後、混合物の80μLをヒトHtrA1でコーティングされたウェルに15分間にわたって移して、結合していないファージを捕捉した。プレートをPBT緩衝液(PBS中0.05%TWEEN(登録商標)20)で洗浄し、HRPコンジュゲート抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)を40分間にわたって添加した(PBST緩衝液中1:5000)。プレートをPBT緩衝液で洗浄し、テトラメチルベンジジン基質(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)を添加することによって現像した。450nmでの吸光度を溶液中の標的濃度の関数としてプロットして、ファージIC50を決定した。これを、ファージの表面にディスプレイされたFabクローンの親和性推定値として使用した。
抗HtrA1 Fabの結合親和性を単一サイクル動態により決定するために、BIACORE(商標)T100機器での(SPR)測定を使用した。手短に言えば、シリーズSセンサチップCM5を、供給業者の指示に従って1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ−プロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)試薬で活性化し、ストレプトアビジン(Pierce)をカップリングしておよそ2500応答単位(RU)を達成し、その後、反応していない基を1Mエタノールアミンで遮断した。
A.h15H6.v2親和性成熟NNKライブラリ構築及びパニング
抗HtrA1抗体クローンh15H6.v2の親和性をさらに改善するために、ファージライブラリを、20個全てのアミノ酸をコードするNNK縮重コドンを使用して32個のコドンでランダム化された軽鎖HVR残基(すなわち、HVR−L1、HVR−L2、及びHVR−L3)または重鎖HVR残基(すなわち、HVR−H1、HVR−H2、及びHVR−H3)残基のいずれかを有する一価FabファージディスプレイのためのFab−amber形式の変異形h15H6.v2から構築した(例えば、Brenner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(12):5381−5383,1992を参照のこと)。ライブラリを、3つの軽鎖または重鎖HVRの各々における1つのNNK変異を許容するように設計した。結果として生じたライブラリDNAをE.coli XL1細胞に電気穿孔して、およそ109個の形質転換体を得た。いくつかの例では、ソフトランダム化ライブラリ及びNNKエピスタシスをPCT/US2015/055672に記載されるように用いた。ファージライブラリを、SUPER遮断(商標)PBS緩衝液(Pierce)及び0.05%TWEEN(登録商標)20中750mMのNaClと30分間インキュベートし、その後、ニュートラアビジンで捕捉されたビオチン化HtrA1−Hisタグに第1のパニングラウンドにわたって適用して、HtrA1とファージとの間の非特異的荷電相互作用を低減した。その後の2ラウンドでは、減少した濃度のビオチン化huHtrA1−PD−His抗原を溶液中の競合相手として1000倍非ビオチン化HtrA1とともに使用して、選択ストリンジェンシーを増加させた。パニング戦略の概略図については、図17を参照されたい。
ディープ配列決定のために、ファージミド二本鎖DNAを、初期ファージライブラリ及び第3の選択ラウンド由来のファージミドベクターを持つE.coli XL−1細胞から単離した。精製DNAを、PHUSION(登録商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用したVL及びVH領域の限定サイクルPCRに基づく増幅の鋳型として使用した。PCR産物をアガロースゲル抽出及び浄化(Qiagen Gel Extraction Kit)により精製した。溶出アンプリコンDNAを、TRUSEQ(商標)DNA Sample Prep kit(Illumina)を使用した標準のIlluminaライブラリ調製方法を用いて、ディープ配列決定ライブラリ調製物の基準として使用した。アダプターでライゲートしたライブラリを単一のPCRサイクルに供し、必要に応じて200bpまたは300bpの挿入サイズで対合末端配列決定を使用してIllumina MISEQ(登録商標)で配列決定して、アンプリコンの全長をカバーした。
配列決定データを、統計プログラミング言語R(例えば、R Core Team,R:A language and environment for statistical computing,2013を参照のこと)及びShortReadパッケージ(Morgan et al.,Bioinformatics 25(19):2607−2608,2009を参照のこと)を使用して分析した。品質管理(QC)を、各HVR配列が正しい長さについての検査を受け、かつNNK変異を最大1つのみ有し、非NNK変異を有しないよう許可された特定されたHVR配列で行った。位置重み行列を、あらゆるランダム化された位置の全ての変異の頻度を計算することによって生成した。各変異の濃縮比を、先に記載されるように(Fowler et al.,Nature Methods 7(9):741−746,2010)、選別された試料における所与の位置での所与の変異の頻度を選別されていない試料における全く同じ変異の頻度と分けることによって計算した。軽鎖HVR位置及び重鎖HVR位置における各変異の濃縮比を示すヒートマップを、それぞれ、図18A及び18Bに示す。
表9:ディープスキャニング変異誘発によって特定されたh15H6.v2変異の結合親和性
重鎖または軽鎖NNKライブラリ由来の単一変異の大半が、親クローンh15H6.v2に対してHtrA1に対する結合親和性を改善しなかった(表9)。最も遅いオフ速度を有する変異形を軽鎖(LC3、LC4、及びLC7)変異形ならびに重鎖(HC1、HC2、HC3、及びHC5)変異形の両方から選択して、組み合わせ変異体を生成した。これらの組み合わせ変異体は、変異形軽鎖及び変異形重鎖の両方を含んだ。BIACORE(商標)動態分析を、組み合わせ変異体を使用して(以下のC節に記載されるように)行った。組み合わせ変異体LC3.HC3、LC3.HC1、及びLC7.HC2は、親Fab(h15H6.v2)に対して2〜3倍の親和性改善を有した(表10)。
表10:HtrA1への組み合わせ変異体結合の動態分析
HtrA1の選択されたFab変異形の結合親和性を決定するために、BIACORE(商標)T200機器でのSPR測定を行った。手短に言えば、シリーズSセンサチップCM5を、供給業者の指示に従って1−EDC及びNHS試薬で活性化し、抗His抗体をカップリングして200〜300応答単位(RU)を達成し、その後、反応していない基を1Mエタノールアミンで遮断した。動態測定のために、およそ5nMのhuHtrA1−PD−Hisを最初に10μL/分の流量で注入して、2つの異なるフローセル(FC)でおよそ100RUを捕捉した(参照の役割を果たしたFC1を除く)。次に、低(0.8nM)〜高(50nM)のHBS−P緩衝液(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、0.005%界面活性剤P20)中Fabの5倍連続希釈を注入した(流量30μL/分)。HtrA1に対する結合応答を、RUを空のフローセルから除することによって補正した。センサグラムを記録し、参照及び緩衝液減算に供した後に、BIACORE(登録商標)T200評価ソフトウェア(バージョン2.0)で評価した。会合速度(kon)及び解離速度(koff)を、単純な一対一ラングミュア結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数(KD)をkoff/kon比として計算した。
選択された親和性成熟h15H6.v2変異形を、HtrA1活性を阻害する能力について試験した。H2−Opt基質((Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK)を使用したインビトロでのFRETに基づく遮断アッセイを行った。H2−Opt遮断アッセイを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2013/0129743A1号の実施例3に記載されるように行った。手短に言えば、HtrA2の基質として当初説明されたペプチドH2−Opt(Mca−IRRVSYSF(Dnp)KK)(配列番号152)(例えば、Martins et al.,J.Biol.Chem.278:49417−27,2003を参照のこと)を、標準のHBTUを用いたカップリング手技を使用してFmoc−Lys(Boc)−wang樹脂上で合成した。Fmoc−Lys(DNP)−−OH(Anaspec)をP5’位に組み込んだ。ペプチドを最大P5(Mca、7−メトキシ−クマリン、Aldrich)まで合成し、その後、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、及び水を使用して固体支持体から室温で2時間にわたって切断した。ペプチドをエチルエーテルから沈殿させ、酢酸、アセトニトリル、水で抽出し、凍結乾燥させた。粗標識ペプチドを溶解し、アセトニトリル/水を使用して分取逆相C18カラムで精製した。精製した画分をプールし、凍結乾燥させ、液体クロマトグラフィー/質量分析(PE/Sciex)により分析し、それらの計算された質量と一致していることを見出した。
インタクトな全長基質(α−カゼイン)のhuHtrA1−PD媒介切断を阻害するAPEG.LC3.HC3(h15H6.v4)の能力を、質量分析(MS)に基づく活性アッセイを使用して評定した。この実施例では、抗HtrA1抗体h15H6.v4を、HtrA2に対するアンタゴニストとして説明されているHtrAプロテアーゼの小分子阻害剤ucf−101(別名Omi)と比較した(Cilenti et al.,J.Biol.Chem.278(13):11489−11494,2003)。タンデム質量タグ(TMT)同重体質量タグ化標識を、h15H6.v4またはucf−101の存在下でHtrA1によるα−カゼイン切断のMSに基づく定量に用いた。α−カゼインは、HtrA1:Ser72、Thr95、及びSer157によって切断され得る3つのP1’残基を有した。
ウサギ眼モデルにおける内因性HtrA1活性を阻害するh15H6.v2親和性成熟変異形の能力を評定した。内因性HtrA1活性アッセイについて、HtrA1分泌細胞(ヒトC32メラノーマ細胞)由来の培地をHtrA1源として使用した。例えば、Ciferri et al.Biochem J.September 18,2015,DOI:10.1042/BJ20150601を参照されたい。この内因性アッセイでは、組換えHtrA1 H2−Optアッセイと比較して、およそ10倍高い濃度のHtrA1が存在し(例えば、図28を参照のこと)、これは、内因性HtrA1及び組換えHtrA1を使用してH2−Optアッセイで観察される異なるIC50値を説明すると考えられることに留意されたい。図27A〜27Cは、内因性HtrA1アッセイの結果を示す。具体的には、クローンAPEG.LC3.HC3(h15H6.v4)は、約1.125nMのIC50を有し(図27C)、最大阻害は約80.1%であった。
抗HtrA1抗体クローンh15H6.v2の選択された誘導体の動態結合及び阻害活性を、BIACORE SPR分析及びFRETに基づくH2−Opt活性アッセイを使用して比較した。最大阻害を決定するために、陽性対照及び陰性対照を使用して、0%阻害(酵素のみ、阻害剤なし)及び100%阻害(酵素なし)を決定した。この比較の結果を図28に示す。
抗HtrA1抗体クローンh15H6.v2、h15H6.v2.APEG(h15H6.v3とも称される)、及びAPEG.LC3.HC3(h15H6.v4とも称される)を、安定性特性について分子評定(MA)分析で試験した。抗HtrA1抗体クローンh19B12.v1も試験した。手短に言えば、抗HtrA1抗体(1mg/mL)を、フリーラジカルを生成することで既知の小分子であるAAPH(2,2−アゾビス(2−アミジノプロパン)二塩酸塩)を有する化学条件下での応力(例えば、Ji et al.,J.Pharm.Sci.98(12):4485−4500,2009を参照のこと)、ならびに様々なpHでの熱条件下での応力(40℃、pH5.5での2週間の熱応力試験)(例えば、Zhang et al.,J.Chromatography A 1272:56−64,2013を参照のこと)について試験した。
表11:h15H6.v2及びh15H6.v3のMA特性
表12:h15H6.v4(APEG.LC3.HC3)のMA特性
表13:h19B12.v1のMA特性
HtrA1に結合したh15H6.v4 Fabの構造をX線結晶学及び電子顕微鏡法により決定した。結果は、h15H6.v4 Fab HtrA1エピトープがHtrA1のLAループのターンを含むアミノ酸によって主に形成されることを実証した。
HtrA1タンパク質の領域に対応するペプチドを、当該技術分野で周知の方法を使用して生成した。例えば、Atherton,E.,et al.(1978).J.Chem Soc.Chem.Commun.13:537−539を参照されたい。
0.15M NaCl、20mM Tris(pH7.5)中10mg/mL h15H6.v4 Fab(1mL)を、HtrA1のLAループ内にアミノ酸を含有する1mgのペプチド(3倍モル過剰ペプチド/タンパク質)と4℃で一晩インキュベートした。Fab−ペプチド複合体を、2M硫酸アンモニウム、0.2M酢酸カリウムを使用して結晶化した。
h15H6.v4 Fab/HtrA1ペプチド結晶を収集し、30%グリセロールを母液に添加し、その後、液体窒素中に急浸漬することによって作製された抗凍結剤溶液中に浸漬することによって回折分析のために保存した。データをSSRLビームライン12−2で収集し、XDSを使用して処理した(Kabasch W(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.266:125−32)。Fab−ペプチド複合体の分子置換を、CCP4における探索プローブとしてFab構造を使用して達成した(Winn MD et al.(2011)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.67:235−42)。厳密なボディ精密化後、ペプチドのFo−Fc密度を確認することができた。その後、ループA(RKLPFSKREVPV)由来のHtrA1プロテアーゼドメイン残基の一部(PDB 3TJO)を、Emsley et al.(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.66:125−32に本質的に記載されるように、密度にフィットさせた。
EM撮像のために、4μLのHtrA1−hFab15H6.v4複合体を、新たにグロー放電された連続炭素400メッシュ銅格子(Electron Microscopy Sciences)上で30秒間インキュベートした。インキュベートした後、試料を、2w/v%ギ酸ウラニル(SPI Supplies)溶液を使用して陰性染色した。過剰な染色溶液をワットマン紙で拭き取り、格子を空気乾燥させた。HtrA1−Fab15H6.v4試料を、LaB6フィラメントを装備し、かつ低用量条件下にて120keVで動作するTecnai−12 BioTween(FEI)で分析した。画像を、見かけの倍率62,000倍(1ピクセル当たり2.22Å)の4k×4k CCDカメラ(Gatan Inc.)を使用して収集した。128pxのボックスサイズを有する27346個の粒子を、EMAN2分布に含まれたe2dogpicker.pyルーチン下で入手可能な遊走アルゴリズムを使用して半自動的に選定した(Tang L et al.(2007)J.Chem.Inf.Model.47:1438−45)。その後、これらの粒子を、ソフトウェアスイートRelionを使用して参照なしの2次元分類に供した(Scheres SH(2012)J.Struct.Biol.180:519−30)。HTRA1三量体と結合したFabとの間の柔軟性を考慮して、Relionの3次元分類アルゴリズムを使用して、60Åの分解能にローパスフィルタリングしたHtrA1三量体(PDB ID 3TJO)の結晶構造を出発モデルとして使用した5つの3次元体積を生成した。これらの体積の各々を、RelionのRefine3Dアルゴリズムを使用して最後に精密化した。HTRA1三量体及びFab15H6.v4の結晶構造の原子密度を、Chimeraのフィットインマップアルゴリズムを使用してEM密度にフィットさせた(Pettersen EF et al.,2004)。J.Comput.Chem.25:1605−12(2004)。
上述の構造研究は、Fab15H6.v4 FabがHtrA1タンパク質のループ「A」と密接に相互作用することを実証した。これを確認するために、ヒトHtrA1配列の残基190〜201(この番号付けは、前駆体タンパク質の番号付けに対応する)に対応するペプチドを合成し、上述のように表面プラズモン共鳴(SPR)を使用してh15H6.v4 Fabへの結合について試験した。ペプチド(LA−pep1)は、0.4nMのKD値を有する15H6.v4 Fabとの強力な結合相互作用を示した。表14を参照されたい。
表14:15H6.v4 Fab及びYW505.94 FabへのHtrA1ループA(LA)ペプチド結合
*NB:最大1μMで結合検出されず、**親和性損失=KD変異体/KD野生型。
Claims (35)
- HtrA1に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、以下の6つのHVR、
(a)SYIMS(配列番号39)のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(b)YISNGGGTTYYSDTIKG(配列番号40)のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(c)QNFRSDGSSMDY(配列番号41)のアミノ酸配列を含むHVR−H3、
(d)RASESVDSYGKSFMH(配列番号42)のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(e)LASKLES(配列番号43)のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び
(f)QQNNEDPYT(配列番号44)のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む結合ドメインを含む、前記単離された抗体。 - 前記抗体が、配列番号45のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号45のアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び配列番号46のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、請求項2に記載の抗体。
- 前記抗体が、モノクローナル、ヒト化、またはキメラである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が、HtrA1に結合する抗体断片である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体断片が、Fab、Fab’−SH、Fv、scFV、及び(Fab’)2断片からなる群から選択される、請求項5に記載の抗体。
- 前記抗体断片が、Fabである、請求項6に記載の抗体。
- 前記Fabが、重鎖定常領域の上部ヒンジにトランケーションを含む、請求項7に記載の抗体。
- 前記重鎖定常領域が、221位(EU番号付け)で終端する、請求項8に記載の抗体。
- 前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
- 抗体の産生方法であって、請求項11に記載の単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞を培養することと、前記抗体を前記宿主細胞または前記宿主細胞の培養培地から回収することと、を含む、前記方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体を含み、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、薬学的組成物。
- 前記組成物が凍結乾燥されている、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体を含む医薬。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体及びD因子アンタゴニストの組合わせを含む医薬。
- HtrA1関連障害または眼障害の治療に使用するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体を含む医薬。
- 前記HtrA1関連障害または前記眼障害が、加齢性黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、またはポリープ状脈絡膜血管症である、請求項17に記載の医薬。
- 前記HtrA1関連障害または前記眼障害が、早期乾燥AMD、中等度乾燥AMD、または進行性乾燥AMDである、請求項18に記載の医薬。
- 前記進行性乾燥AMDが地図状萎縮である、請求項19に記載の医薬。
- D因子アンタゴニストと組合わせて使用するための、請求項17〜20のいずれか1項に記載の医薬。
- D因子アンタゴニストが抗D因子抗体である、請求項21に記載の医薬。
- 前記抗D因子抗体がランパリズマブである、請求項22に記載の医薬。
- 前記抗D因子アンタゴニストが連続して投与される、請求項21〜23のいずれか1項に記載の医薬。
- HtrA1関連障害または眼障害の治療のための医薬の製造における、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 前記HtrA1関連障害または前記眼障害が、AMD、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、またはポリープ状脈絡膜血管症である、請求項25に記載の使用。
- 前記HtrA1関連障害または前記眼障害が、早期乾燥AMD、中等度乾燥AMD、または進行性乾燥AMDである、請求項26に記載の使用。
- 前記進行性乾燥AMDが地図状萎縮である、請求項27に記載の使用。
- 医薬がD因子アンタゴニストを含む、請求項25〜28のいずれか1項に記載の使用。
- D因子アンタゴニストが抗D因子抗体である、請求項29に記載の使用。
- 前記抗D因子抗体がランパリズマブである、請求項30に記載の使用。
- 硝子体内、眼内、眼球内、強膜近傍、テノン嚢下、超脈絡膜(superchoroidally)、または局所に投与されるためのものである、請求項15〜24のいずれか1項に記載の医薬。
- 注射により硝子体内投与されるためのものである、請求項32に記載の医薬。
- 長時間作用型送達系により投与されるためのものである、請求項15〜24のいずれか1項に記載の医薬。
- 前記長時間作用型送達系が、PLGAベースの固体インプラントまたは埋め込み型ポート送達系である、請求項34に記載の医薬。
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