TWI747850B - 抗HtrA1抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗HtrA1抗體(包括雙特異性抗HtrA1抗因子D抗體)以及其製備及使用方法，例如在治療HtrA1相關病症、眼睛病症及/或補體相關病症之方法中。

Description

抗HtrA1抗體及其使用方法
本發明大體而言係關於抗HtrA1抗體及其使用方法。
絲胺酸蛋白酶HtrA絲胺酸肽酶1(HtrA1)(PRSS11；Clan PA，家族51)屬於在進化上保守之HtrA蛋白家族。在人類中，HtrA1、HtrA3及HtrA4共有相同域架構：N末端IGFBP樣模組及Kazal樣模組、具有胰蛋白酶樣摺疊之蛋白酶域及C末端PDZ域。HtrA1之生理學相關性已藉由鑑別人類功能喪失型突變而得以完全確立，該等突變引起家族性缺血性腦小血管病。分子機制涉及HtrA1所致之缺陷性TGFβ抑制，從而導致TGFβ信號傳導增加。由異常HtrA1表現所致之TGFβ信號傳導失調可能結合HtrA1介導之各種細胞外基質組分降解，或間接經由基質金屬蛋白酶之上調亦會造成關節病。另外，人類遺傳學研究鑑別出年齡相關之黃斑變性(AMD)進展與HtrA1啟動子區中之SNP之間的強相關性，該SNP導致HtrA1轉錄物水準增加(參見例如Dewan等人，Science 314：989-992,2006及Yang等人，Science 314：992-993,2006)。
AMD為中央視網膜之進展性慢性病，其有顯著視覺敏銳度後果。該疾病之後期形式為工業化國家中視力喪失之主因。在年齡
Figure 105135184-A0202-12-0001-306
40歲之白種人群中，早期AMD之患病率據估計為約6.8%，晚期AMD為約1.5%。後期AMD之患病率隨年齡而急劇增加，在80歲之後上升至約11.8%。存在兩種類型之AMD，即非滲出性(乾性)及滲出性(濕性)AMD。更常見之乾性AMD涉及在中央視網膜之下之視網膜色素上皮(RPE)的萎縮性及肥厚性變化(黃斑)，以及RPE上之沈積物(隱結)。晚期乾性AMD會導致顯著視網膜損傷，包括地圖狀萎縮(GA)，其伴有不可逆視力喪失。此外，乾性AMD患者會進展至濕性形式，其中稱為脈絡膜新生血管膜(CNVM)之異常血管在 視網膜下形成，洩露流體及血液，且最終在視網膜中及下方導致致盲盤狀瘢痕。
仍需要具有諸多改良之特性，諸如結合親和力、穩定性及抑制(阻斷)活性的抗HtrA1抗體，以及其治療及診斷用途。
本發明提供抗HtrA1抗體及使用其用於治療及診斷目的之方法。本發明之抗HtrA1抗體高度有效且對HtrA1具有高結合親和力。本發明抗體之改良之特性使得其適用於治療。
在一態樣中，本發明涵蓋一種經分離之抗體，其特異性結合至HtrA1抗原決定基，其中該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197，其中胺基酸編號係指人類HtrA1前驅蛋白之編號。
在一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Leu192、Pro193及Arg197。
在另一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少兩個胺基酸：Leu192、Pro193及Arg197。
在一特定實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Leu192、Pro193及Arg197。
在另一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Arg190、Leu192、Pro193及Arg197。
在另一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197。
在一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合人類HtrA絲胺酸肽酶1(HtrA1)之KD為約550pM或以下。在一些實施例中，該抗體特異性結合人類HtrA1之KD介於約40pM與約550pM之間。在一些實施例中，該抗體特異性結合人類HtrA1之KD介於約40pM與約250pM之間。在一些實施例中，該抗體特異性結合人類HtrA1之KD介於約50pM與約125pM之間。在一些實施例中，該抗體特異性結合人類HtrA1之KD為約110pM。在一些實施例中，該抗體特異性結合人類HtrA1 之KD為約60pM。在一些實施例中，KD係藉由表面電漿共振(SPR)(例如BIACORE® SPR)來量測。在一些實施例中，如本文(例如在實例部分中)所述進行SPR。
在一些實施例中，前述抗體中之任一者均能夠抑制HtrA1活性。在一些實施例中，該抗體抑制人類HtrA1(huHtrA1-PD)之蛋白酶域的活性，其50%抑制濃度(IC50)為1.5nM或以下。在一些實施例中，抗體抑制huHtrA1-PD活性，其IC50為0.25nM至約0.5nM。在一些實施例中，抗體抑制huHtrA1-PD活性，其IC50為約0.3nM。在一些實施例中，抑制活性為活體外基於FRET之阻斷分析量測值。在一些實施例中，活體外基於FRET之阻斷分析包括H2-Opt探針(例如SEQ ID NO：152)之裂解。在一些實施例中，如本文(例如在實例中)所述進行活體外基於FRET之阻斷分析。
在以上態樣之一些實施例中，抗體包含含以下各項之結合域：(a)HVR-H1，其包含DSEX1H(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列，其中X1為Met或Leu；(b)HVR-H2，其包含GVDPETX2GAAYNQKFKG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列，其中X2為Glu或Asp；及(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含含以下各項之結合域：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含：(a)FR-H1，其包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2(SEQ ID NO：12)之胺基酸序列，其中X1為Lys或Thr且X2為Thr、Lys或Arg；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：14)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含：(a)FR-H1，其包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO：16)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：14)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。
在以上態樣之一些實施例中，結合域進一步包含：(a)HVR-L1，其包含RASSSVX3FIH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列，其中X3為Glu或Asn；(b)HVR-L2，其包含ATSX4LAS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列，其中X4為Asn、His或Glu；及(c)HVR-L3，其包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO：6)之胺基酸序列，其中X5為Ser或Tyr，且X6為Ala或Asn。在一些實施例中，結合域進一步包含：(a)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體進一步包含：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域；(a)重鏈可變(VH)域，其包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)輕鏈可變(VL)域，其包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域進一步包含：(a)FR-H1，其包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO：16)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：14)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域進一步包含：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列；(b)FR-L2， 其包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下六個HVR之結合域：(a)HVR-H1，其包含DSEX1H(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列，其中X1為Met或Leu；(b)HVR-H2，其包含GVDPETX2GAAYNQKFKG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列，其中X2為Glu或Asp；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVX3FIH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列，其中X3為Glu或Asn；(e)HVR-L2，其包含ATSX4LAS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列，其中X4為Asn、His或Glu；及(f)HVR-L3，其包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO：6)之胺基酸序列，其中X5為Ser或Tyr，且X6為Ala或Asn。在一些實施例中，結合域包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域進一步包含：(a)FR-H1，其包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO：16)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：14)之胺基 酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域進一步包含：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域；(a)重鏈可變(VH)域，其包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)輕鏈可變(VL)域，其包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域進一步包含：(a)FR-H1，其包含QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT(SEQ ID NO：24)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVKQTPVHGLEWIG(SEQ ID NO：25)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR(SEQ ID NO：26)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：27)之胺基酸序列。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域進一步包含：(a)FR-L1，其包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO：29)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：30)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO：31)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：32)之胺基 酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下六個HVR之結合域：(a)HVR-H1，其包含SYIMS(SEQ ID NO：39)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO：40)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO：41)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO：42)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含LASKLES(SEQ ID NO：43)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO：44)之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：46之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域進一步包含：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：47)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：48)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：49)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)之胺基酸序列。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域進一步包含：(a)FR-L1，其包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO：51)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：52)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO：53)之胺基酸序列；及 (d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：54)之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：46之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域；(a)重鏈可變(VH)域，其包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)輕鏈可變(VL)域，其包含與SEQ ID NO：56之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域進一步包含：(a)FR-H1，其包含EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS(SEQ ID NO：57)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO：58)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR(SEQ ID NO：59)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTAVTVSS(SEQ ID NO：60)之胺基酸序列。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域進一步包含：(a)FR-L1，其包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO：61)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：62)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO：63)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：64)之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：56之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域；(a)重鏈可變(VH)域，其包含與SEQ ID NO：65之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)輕鏈可變(VL)域，其包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域；(a)重鏈可變(VH)域，其包含與SEQ ID NO：67之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)輕鏈可變(VL)域，其包含與SEQ ID NO：68之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含含以下各項之結合域；(a)重鏈可變(VH)域，其包含與SEQ ID NO：69之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)輕鏈可變(VL)域，其包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體為單株、人類、人類化或嵌合抗體。在特定實施例中，抗體為單株、人類化或嵌合抗體。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體為結合至HtrA1之抗體片段。在一些實施例中，抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab’-SH、Fv、scFV及(Fab’)2片段。在一些實施例中，抗體片段為Fab。在一些實施例中，Fab包含處於重鏈恆定區之鉸鏈區中的截短。在一些實施例中，Fab包含處於重鏈恆定區之上鉸鏈中的截短。在一些實施例中，重鏈恆定區終止於位置221(EU編號)處。在一些實施例中，位置221處之胺基酸殘基為天冬胺酸(Asp)殘基。在一些實施例中，重鏈恆定區包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。
在一些實施例中，Fab為IgG1 Fab。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體為全長抗體。在一些實施例中，抗體為IgG抗體。在一些實施例中，抗體為單特異性抗體。
在任何前述態樣之一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體包含結合至因子D之第二結合域。在一些實施例中，第二結合域包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu。在一些實施例中，第二結合域包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。在一些實施例中，第二結合域包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1與因子D兩者，其中該抗體包含第一結合域，其特異性結合HtrA1且包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3) 之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列；及第二結合域，其特異性結合因子D且包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1與因子D兩者，其中該抗體包含第一結合域，其特異性結合HtrA1且包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及第二結合域，其特異性結合因子D且包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在以上態樣之一些實施例中，本發明涵蓋一種經分離之抗體，其特異性結合至HtrA1抗原決定基，其中該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197，其中胺基酸編號係指人類HtrA1前驅蛋白之編號。
在一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Leu192、Pro193及Arg197。
在一特定實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Leu192、Pro193及Arg197。
在另一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Arg190、Leu192、Pro193及Arg197。
在另一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種經分離之核酸，其編碼如本文所述之任一抗體。在另一態樣中，本發明之特徵在於一種載體(例如表現載體)，其包含用於表現抗體之經分離之核酸。在另一態樣中，本發明之特徵在於包含前述核酸和/或載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或293細胞。在一些實施例中，宿主細胞為原核細胞。在一些實施例中，原核細胞為大腸桿菌(E.coli)。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種產生如本文所述之任一抗體的方法，該方法包括在培養基中培養包含任一前述載體(例如表現載體)之宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包括自宿主細胞或培養基回收抗體。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種包含任一前述抗體之組合物。在一些實施例中，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。在一些實施例中，組合物為醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物經凍乾。在一些實施例中，組合物進一步包含因子D結合拮抗劑。在一些實施例中，因子D結合拮抗劑為抗因子D抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段為Fab或(Fab’)2。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之 胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列。在一些實施例中，抗因子D抗原結合抗體片段為拉姆帕力珠單抗(lampalizumab)。
在另一態樣中，本發明涵蓋一種組合療法，其包含任何前述抗HtrA1抗體及因子D拮抗劑。在一特定實施例中，因子D拮抗劑為抗因子D抗體。在一特定實施例中，因子D拮抗劑為拉姆帕力珠單抗。在一特定實施例中，依序投與因子D拮抗劑。
在一些態樣中，任一前述抗體均可用作藥劑。
在一些態樣中，任一前述抗體均可用於治療HtrA1相關病症或眼睛病症。在一些實施例中，HtrA1相關病症或眼睛病症為年齡相關黃斑變性(AMD)、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。在一些實施例中，HtrA1相關病症或眼睛病症為AMD。在一些實施例中，AMD為早期乾性AMD、中期乾性AMD或晚期乾性AMD。在一些實施例中，晚期乾性AMD為地圖狀萎縮。
在一些態樣中，任一前述抗體均可用於製造用以治療HtrA1相關病症或眼睛病症之藥劑。在一些實施例中，HtrA1相關病症或眼睛病症為AMD、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。在一些實施例中，HtrA1相關病症或眼睛病症為AMD。在一些實施例中，AMD為早期乾性AMD、中期乾性AMD或晚期乾性AMD。在一些實施例中，晚期乾性AMD為地圖狀萎縮。在一些實施例中，藥劑經調配而與 因子D結合拮抗劑組合使用。，在一些實施例中，因子D結合拮抗劑為抗因子D抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段為Fab或(Fab’)2。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列。在一些實施例中，抗因子D抗原結合片段為拉姆帕力珠單抗。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種治療有需要之個體之HtrA1相關病症或眼睛病症的方法，該方法包括投與治療有效量之任一前述抗體。在一些實施例中，HtrA1相關病症或眼睛病症為AMD、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。在一些實施例中，HtrA1相關病症或眼睛病症為AMD。在一些實施例中，AMD為早期乾性 AMD、中期乾性AMD或晚期乾性AMD。在一些實施例中，晚期乾性AMD為地圖狀萎縮。在一些實施例中，該方法進一步包括投與因子D結合拮抗劑。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種抑制個體之視網膜或感光細胞變性的方法，該方法包括向該個體投與有效量之任一前述抗體，從而抑制視網膜或感光細胞變性。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種抑制個體之眼睛內的HtrA1絲胺酸蛋白酶活性之方法，該方法包括向該個體投與有效量之任一前述抗體，從而抑制眼睛內之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，該方法進一步包括投與因子D結合拮抗劑。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種治療有需要之個體之HtrA1相關病症或補體相關病症的方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之HtrA1結合拮抗劑及因子D結合拮抗劑。在一些實施例中，HtrA1相關病症或補體相關病症為眼睛病症。在一些實施例中，眼睛病症選自由以下各項組成之群：AMD、糖尿病視網膜病變、脈絡膜新血管生成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黃斑水腫、病理性近視眼、逢希伯-林道(von Hippel-Lindau)病、眼組織漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞、角膜血管形成及視網膜新血管生成。在一些實施例中，眼睛病症為AMD。在一些實施例中，AMD為早期乾性AMD、中期乾性AMD或晚期乾性AMD。在一些實施例中，晚期乾性AMD為地圖狀萎縮。在一些實施例中，HtrA1結合拮抗劑為抗HtrA1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab’-SH、Fv、scFV及(Fab’)2片段。在一些實施例中，抗原結合片段為Fab。在一些實施例中，Fab包含處於重鏈恆定區之上鉸鏈中的截短。在一些實施例中，重鏈恆定區終止於位置221(EU編號)處。在一些實施例中，位置221處之胺基酸殘基為天冬胺酸(Asp)殘基。在一些實施例中，重鏈恆定區包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。在一些實 施例中，Fab為IgG1 Fab。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種治療有需要之個體之HtrA1相關病症或補體相關病症的方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之任一前述抗體及治療有效量之因子D結合拮抗劑。
在任何前述態樣之一些實施例中，因子D結合拮抗劑為抗因子D抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段為Fab或(Fab’)2。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列。在一些實施例中，抗因子D抗原結合片段為拉姆帕力珠單抗。
在任何前述態樣之一些實施例中，HtrA1相關病症或補體相 關病症為眼睛病症。在一些實施例中，眼睛病症選自由以下各項組成之群：AMD、糖尿病視網膜病變、脈絡膜新血管生成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黃斑水腫、病理性近視眼、逢希伯-林道病、眼組織漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞、角膜血管形成及視網膜新血管生成。在一些實施例中，眼睛病症為AMD。在一些實施例中，AMD為早期乾性AMD、中期乾性AMD或晚期乾性AMD。在一些實施例中，晚期乾性AMD為地圖狀萎縮。
在任何前述態樣之一些實施例中，經玻璃體內、經眼、眼內、鞏膜旁、筋膜下、脈絡膜上、局部、靜脈內、肌肉內、皮內、透皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內、鼻內、陰道內、直腸內、局部、腹膜內、經腹膜、經室內、皮下、結膜下、膀胱內、經黏膜、心包內、臍內、眼窩內、經口、經皮、藉由吸入、藉由注射、藉由滴眼液、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部輸注對標靶細胞直接浴洗、藉由導管、藉由灌洗、在乳劑中或在脂質組合物中投與抗體。在一些實施例中，經玻璃體內、經眼、眼內、鞏膜旁、筋膜下、脈絡膜上或局部投與抗體。在一些實施例中，經玻璃體內藉由注射投與抗體。在一些實施例中，局部藉由滴眼液或軟膏投與抗體。在一些實施例中，藉由長效遞送系統投與抗體。在一特定實施例中，該長效遞送系統為基於PLGA之固體移植物或植入式端口遞送系統。
在任何前述態樣之一些實施例中，個體為人類。
圖1A-1B為示出以下之圖：大部分酶聯免疫吸附分析(ELISA)陽性融合瘤純系示出與人類(hu)及鼠類(mu)HtrA1蛋白酶域(PD)兩者相似之反應性型態。該等圖示出所指示75個純系中每一者在650nm下之光學密度(OD650nm)。此分析中之背景信號<0.05 OD650nm。人類及鼠類HtrA1蛋白酶域共有91%同源性。
圖2A為用於測定所指示抗HtrA1融合瘤純系上清液抑制HtrA1-PD介導之經BODIPY® FL標記的螢光受質裂解之能力的阻斷分析之示意圖。
圖2B-2C為示出以下之圖：使用圖2A及實例1中所述之阻 斷分析獲悉，10種抗HtrA1融合瘤純系上清液顯著抑制人類HtrA1-PD介導之受質裂解。該等圖示出來自所指示純系之融合瘤上清液的螢光信號平均值(毫相對螢光單位(mRFU)/min)。條件培養基(CM或條件培養基)中10μg/ml之抗體YW505.94(亦稱為「94 IgG」，參見國際專利申請公開案第WO 2013/055998號，其係以引用方式全部併入本文中)用作陽性對照，其示出以下：分析示出歸因於培養基而無變化，且隨分析時間推移穩定。緩衝液或培養基用作陰性對照。圖2C示出在緩衝液、E培養基(來自CLONACELLTM之富含營養物之培養基)及條件培養基中之分析的初始及最終結果。100%指示完全抑制。
圖3A-3B為示出所指示融合瘤上清液藉由muHtrA1-PD(圖3A)或huHtrA1-PD(圖3B)抑制螢光受質裂解之能力的圖。在圖3A中，40nM muHtrA1-PD按40μl muHtrA1-PD：60μl融合瘤上清液之比率使用。在圖3B中，20nM huHtrA1-PD按40μl huHtrA1-PD：60μl融合瘤上清液之比率使用。抗體YW505.94(「94 IgG」)用作陽性對照。緩衝液及CM用作陰性對照。
圖4A為基於FRET之阻斷分析之示意圖，該分析用於測定經純化抗HtrA1抗體純系抑制HtrA1-PD介導之基於FRET之受質H2-Opt裂解的能力。
圖4B-4C為示出以下之圖：經純化抗體純系15H6、19B12、3A5、12A5及20E2保留抑制鼠類(圖4B)及人類(圖4C)HtrA1-PD介導之受質裂解之能力。不添加抗體(「no ab」)用作陰性對照，而抗體YW505.94(「94 IgG」)用作陽性對照。經純化抗體之添加濃度為5nM、50nM或500nM。15nM muHtrA1-PD-Fc用於圖4B所呈現之分析中，而3nM huHtrA1-PD-Fc用在圖4C所呈現之分析中。
圖5A-5B為示出以下之圖：所指示經純化mIgG抗體純系抑制全長人類HtrA1(huHtrA1-FL)介導之FRET肽受質裂解。該圖示出活性(mRFU/min)與IgG濃度之函數關係。huHtrA1-FL之添加濃度為5nM。如Cifferi等人.(2015)Biochem.J.472(2)：169-81所述之IgG形式之YW505.94(「IgG94」)及其嵌合變異體(「IgG94-ch」)用作陽性對照。示出 各抗體純系之半數最大抑制濃度(IC50)。
圖5C-5D為示出以下之圖：所指示經純化mIgG抗體純系抑制muHtrA1-FL介導之FRET肽受質裂解。該圖示出活性(mRFU/min)與IgG濃度之函數關係。添加5nM muHtrA1-FL。IgG94及IgG94-ch用作陽性對照，如針對圖5A及5B之附圖描述中所述。示出半數最大抑制濃度(IC50)。
圖6A示出抗體純系19B12、20E2、3A5、12A5及15H6之重鏈可變區(VH)的胺基酸序列之序列比對。
圖6B示出抗體純系19B12、20E2、3A5、12A5及15H6之輕鏈可變區(VL)的胺基酸序列之序列比對。
圖7A-7B為示出使用自融合瘤上清液(「hyb」)純化或自293細胞(「293」)重組表現之mIgG抗體純系15H6(圖7A)或純系19B12(圖7B)，在基於FRET之阻斷分析中之結果的圖。該圖對V最大值(mRFU/min)與抗體濃度(nM)之函數關係作圖。在各分析中使用3nM huHtrA1-FL。亦示出所指示抗體純系之IC50值。
圖8A-8B示出與人類共同κ1序列(圖8A)或VH1序列(圖8B)相比，抗HtrA1抗體純系m15H6、H15H6.v1、H15H6.v2及h15H6.v2.APEG(本文中亦稱為「h15H6.v3」)之VL(圖8A)及VH(圖8B)之胺基酸序列的序列比對。藉由所示框來界定各抗體純系之HVR序列。對根據Kabat定義之HVR序列加底線。有陰影框中以白色文字示出之殘基指示在人類共同VH1序列與抗HtrA1抗體純系之間不同的殘基。
圖9A-9D為示出BIACORETM表面電漿共振(SPR)分析之結果的圖，該分析係針對m15H6或h15H6.v1與捕集鏈黴親和素之生物素化人類或鼠類HtrA1之結合。採用單週期動力學分析。該等圖示出反應單位與時間(秒)之函數關係。圖9A示出m15H6 Fab與huHtrA1結合之結果。圖9B示出m15H6 Fab與muHtrA1結合之結果。圖9C示出h15H6.v1與huHtrA1結合之結果。圖9D示出h15H6.v1與huHtrA1結合之結果。自各分析測定之Kon、Koff及KD在各圖內以文字示出。
圖10A-10B為示出噬菌體競爭ELISA實驗之結果的圖，該 實驗係針對所指示h15H6.v1 Fab變異體與鼠類(圖10A)或人類(圖10B)HtrA1之結合。該等圖示出結合噬菌體(OD450nm)與HtrA1濃度(nM)之函數關係。
圖11A-11B為示出BIACORETM SPR分析之結果的圖，該分析比較抗體純系h15H6.v2及HVR-L3 LC-W91L及LC-W91Y變異體與鼠類(圖11A)或人類(圖11B)HtrA1之結合。所用抗體為Fab形式。自各分析測定之Kon、Koff及KD在各圖內以文字示出。
圖12A為示出BIACORETM SPR分析之結果的圖，該分析比較抗體純系h15H6.v2(親本)及VL位置94處所指示之變異體(亦即LC-N94A LC-P95(AP)、LC-N94E LC-P95(EP)、LC-N94Q LC-P95(QP)及LC-N94S LC-P95(SP))與huHtrA1之結合。所用抗體為Fab形式。該圖示出反應單位(RU)與時間(秒)之函數關係。
圖12B為匯總圖12A中所示出之BIACORETM SPR分析之結果的表。
圖13A為示出BIACORETM SPR分析之結果的圖，該分析比較抗體純系h15H6.v2(親本)及VH位置55及/或56處所指示之變異體(亦即HC-D55A HC-G56(AG)、HC-D55E HC-G56(EG)、HC-D55S HC-G56(SG)及HC-D55 HC-G56A(DA))與huHtrA1之結合。所用抗體為Fab形式。該圖示出反應單位(RU)與時間(秒)之函數關係。
圖13B為匯總圖13A中所示出之BIACORETM SPR分析之結果的表。
圖14A為示出BIACORETM SPR分析之結果的圖，該分析比較抗體純系h15H6.v2(「親本」)及VL位置94及VH位置55及/或56處所指示之組合變異體與huHtrA1之結合。AP_EG：LC-N94A LC-P95 HC-D55E HC-G56(亦稱為「h15H6.v2.APEG」及「h15H6.v3」)。EP_EG：LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56。QP_EG：LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56。SP_EG：LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56。
圖14B為匯總圖14A中所示出之BIACORETM SPR分析之結果的表。
圖14C為示出基於FRET之阻斷分析之結果的圖，該分析測試h15H6.v2 IgG、h15H6.v2 Fab及VL位置94及VH位置55及/或56處所指示之組合變異體抑制HtrA1活性之能力。該圖對最大活性百分比與對數抗體濃度(M)之函數關係作圖。
圖14D為示出圖14C中所測試之各抗體純系的IC50值之表。
圖15A-15B示出與人類共同κ4序列(圖15A)或VH3序列(圖15B)相比，抗HtrA1抗體純系m19B12及h19B12.v1之VL(圖15A)及VH(圖15B)之胺基酸序列的序列比對。藉由所示框來界定各抗體純系之HVR序列。對根據Kabat定義之HVR序列加底線。有陰影框中以白色文字示出之殘基指示在人類共同VH1序列與抗HtrA1抗體純系之間不同的殘基。
圖16A-16D為示出BIACORETM SPR分析之結果的圖，該分析係針對抗體純系m19B12或h19B12.v1與人類或鼠類HtrA1之結合。採用單週期動力學分析。該等圖示出反應單位與時間(秒)之函數關係。圖16A示出m19B12 Fab與huHtrA1結合之結果。圖16B示出m19B12 Fab與muHtrA1結合之結果。圖16C示出h19B12.v1 Fab與huHtrA1結合之結果。圖16D示出h19B12.v1 Fab與huHtrA1結合之結果。各分析之Kon、Koff及KD在各圖內以文字示出。
圖17為概括噬菌體淘選策略之示意圖，該策略針對親和力成熟用於h15H6.v2之HC及LC HVR的NNK深度掃描誘變。
圖18A-18B示出所指示VH(圖18A)或VL(圖18B)HVR位置處突變之富集比率之log2的熱圖，該富集比率藉由經分類樣品中既定位置處既定突變之頻率除以未分類樣品中完全相同之突變之頻率來計算。示例性突變之富集比率在熱圖下方示出。
圖19為示出與來自h15v6.v2之VH及VL的NNK文庫及/或軟隨機文庫之未分類樣品相比，經鑑定為在經分類樣品中富集之突變之表。
圖20為示出BIACORETM SPR分析之結果的表，該分析係針對所指示之親和力成熟Fab抗體變異純系之結合。與h15H6.v2及 h15H6.v2.APEG(亦稱為h15H6.v3)相比較，示出自此分析獲得之各親和力成熟抗體變異純系之Kon、Koff及KD。
圖21A-21B示出親和力成熟變異抗HtrA1抗體純系之VL(圖21A)及VH(圖21B)的胺基酸序列之序列比對。
圖22A為匯總如在基於FRET之H2-Opt活性分析中所評定，所指示親和力成熟變異抗HtrA1 Fab抗體純系抑制HtrA1活性之結果的表。該表示出3個獨立實驗之結果以及平均值及標準差(StDev)。此等實驗採用率(RFU/s)分析。
圖22B為示出使用圖22A所繪示之重組HtrA1在H2-Opt活性分析中之結果的示例性繪圖之圖。分析條件包括400pM HtrA1及2.5μM受質。緩衝液為50mM Tris、200mM NaCl、0.25% CHAPS pH 8.3。此等資料來自圖22A中三個獨立實驗之第二個重複。
圖23A-23D為示出使用RFU/s率方法分析之所指示h15H6抗體變異形式的H2-Opt活性分析之結果的圖。該等圖示出h15H6.v4 IgG單株抗體(mAb)(圖23A)、陽性對照抗HtrA1抗體(YW505.94A IgG，參見例如WO 2013/055998)(圖23B)、h15H6.v4 Fab(圖23C)及15H6.v2 Fab(圖23D)之對照值(RFU/S)隨抗體濃度(nM)而變化之百分比。緊跟各圖之表格示出各分析之IC50、Y範圍、斜率因數及背景。
圖23E-23H為示出使用端點(RFU)方法分析之所指示h15H6抗體變異形式的H2-Opt活性分析之結果的圖。該等圖示出h15H6.v4 IgG Mab(圖23E)、陽性對照抗HtrA1抗體(YW505.94A IgG)(圖23F)、h15H6.v4 Fab(圖23G)及15H6.v2 Fab(圖23H)之對照值(RFU/S)隨抗體濃度(nM)而變化之百分比。緊跟各圖之表格示出各分析之IC50、Y範圍、斜率因數及背景。
圖24A-24B為示出來自第一組之三個獨立實驗的所指示h15H6抗體變異形式之IC50(圖24A)及IC90(圖24B)結果之表。使用4參數擬合測定IC50值。自擬合之IC50值及斜率測定IC90值。實驗I對應於圖23A-23F中所示之資料。CV%，變異係數。使用率(RFU/s)方法分析資料。
圖25A-25B為示出來自第二組之三個獨立實驗的所指示 h15H6抗體變異形式之IC50(圖25A)及IC90(圖25B)結果之表。使用4參數擬合測定IC50值。自擬合之IC50值及斜率測定IC90值。使用率(RFU/s)方法或端點(RFU)方法分析資料。
圖26A為示出完整α-酪蛋白滴定曲線之圖。對實驗濃度與理論加料濃度(μg/ml)之函數關係作圖。相關係數(R2)為0.999。
圖26B為示出基於質譜之HtrA1活性分析之結果的圖。如實例3部分G中所述評定APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)抑制Htra1-PD活性之能力。小分子抑制劑ucf-101用作陽性對照。
圖27A-27B為示出兩個獨立內源性HtrA1活性分析-實驗I(圖27A)及實驗II(圖27B)之結果的圖。對於各抗體Fab，#1及#2指示獨立稀釋系列之同一抗體，其中獨立進行初始稀釋。兩個稀釋系列與來自同一製備之其他試劑在同一板上進行操作。
圖27C為匯總圖27A及27B中所繪示之內源性HtrA1活性分析的結果之表。
圖28為總結所指示h15H6.v2 Fab變異體及其衍生物之動力學結合特性及抑制活性的表。YW505.94a.28(參見例如WO 2013/055998)用作陽性對照。當與YW505.94a.28 Fab相比時，所有h15H6 Fab變異體及衍生物均示出改良之親和力及改良之效力，其中h15H6.v4 Fab示出與此抗體相比親和力改良大約30倍。
圖29A示出人類HtrA1之胺基酸序列。成熟序列以大寫字母示出，對蛋白酶域加底線，且對殘基N224及K248加陰影。
圖29B示出鼠類HtrA1之胺基酸序列。成熟序列以大寫字母示出，且對蛋白酶域加底線。
圖30示出參考抗因子D抗體(「WT」)及其選定變異體之輕及重鏈可變域的比對。對可變域內之HVR加底線。變異體中之殘基取代以粗體示出。
圖31A-31B示出YW505.94 Fab(如WO 2013/055998所述)與HtrA1之結合。當圖31A所指定之胺基酸經丙胺酸置換時，YW505.94 Fab對突變蛋白之結合親和力有所降低。使用電子顯微鏡術產生圖31B示出之 結構，如Ciferri等人.(2015)Biochem.J.472(2)：169-81中所描述。圓圈示出HtrA1蛋白上YW505.94 Fab之抗原決定基。YW505.94 Fab結合至HtrA1蛋白之環「B」及「C」。
圖32A-32B示出15H6.v4 Fab與HtrA1之結合且示出為15H6.v4 Fab所結合之HtrA1抗原決定基與為YW505.94 Fab所結合之抗原決定基不同。圖32A示出15H6.v4 Fab與HtrA1蛋白上之其抗原決定基之間的相互作用，如藉由X射線晶體學所測定。15H6.v4 Fab結合至HtrA1蛋白之LA環(參見例如Glaza P等人.(2015)PLoS One 10(6)：e0131142)。使用電子顯微鏡術產生圖32B示出之結構。圓圈示出HtrA1蛋白上之15H6V4 Fab抗原決定基。
[序列表]
本申請含有序列表，其已以電子方式呈ASCII格式提交且特此以引用方式全部併入本文中。該ASCII複本創建於2016年10月25日，命名為50474-117WO4_序列_表_10_25_16_ST25且大小為114,779個位元組。
I. 定義
如本文所用術語「約」係指熟習此技術領域者易知之個別值之通常誤差範圍。本文中提及「約」某值或參數包括(且描述)針對彼值或參數本身之實施例。
出於本文之目的，「接受體人類構架」為以下構架，其包含源於如以下定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架的胺基酸序列。「源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含與人類免疫球蛋白構架或人類共同構架相同之胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化數目為10處或10處以下、9處或9處以下、8處或8處以下、7處或7處以下、6處或6處以下、5處或5處以下、4處或4處以下、3處或3處以下，或2處或2處以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
在本發明抗體之背景下，「有活性(Active)」或「活性(activity)」或「生物活性」為例如活體外及/或活體內拮抗(部分或完全抑制)標靶之生物活性的能力。抗體生物活性之一實例為在與標靶相關聯之病症的狀態(例如病變)方面達成可量測改善之能力。例如，對於抗HtrA1抗體，病症可為HtrA1相關病症，諸如例如AMD(例如地圖狀萎縮)。抗HtrA1抗體之活性可使用有關動物模型或人類臨床試驗在活體外或活體內測試中進行測定，該等測試包括結合分析、活性分析(例如基於FRET之活性分析(例如使用H2-Opt受質)或基於質譜之活性分析)。在另一實例中，對於抗因子D抗體(例如抗HtrA1/抗因子D抗體)，病症可為補體相關病症，諸如例如補體相關眼睛病症。抗因子D抗體之活性可使用有關動物模型或人類臨床試驗在活體外或活體內測試中進行測定，該等測試包括結合分析、替代途徑溶血分析(例如量測對替代途徑補體活性或活化之抑制的分析)。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用的強度總和。除非另外指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(KD)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述者)加以量測。在下文中描述量測結合親和力之特定說明性及示例性實施例。
「親和力成熟」抗體係指在一或多個高變區(HVR)及/或構架區(FR)中具有一或多處改變之抗體，與不具有該等改變之親本抗體相比，該等改變改良該抗體對抗原之親和力。
術語「抗HtrA1抗體」及「特異性結合HtrA1之抗體」係指能夠以足以使抗體在靶向HtrA1時適用作診斷劑及/或治療劑之親和力結合HtrA1之抗體。在一實施例中，抗HtrA1抗體結合無關非HtrA1蛋白之程度小於抗體與HtrA1之結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合HtrA1之抗體的解離常數(KD)為≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗HtrA1抗體結合HtrA1之在來自不同物種之HtrA1中保守的抗原決定 基。抗HtrA1抗體可為例如本文或國際專利申請公開案第WO 2013/055998號(其係以引用方式全部併入本文中)所述之任何抗HtrA1抗體。
術語「抗因子D抗體」及「特異性結合因子D之抗體」係指能夠以足以使抗體在靶向因子D時適用作診斷劑及/或治療劑之親和力結合因子D、例如以便於抑制或大體上減少補體活化之抗體。在一實施例中，抗因子D抗體結合無關非因子D蛋白之程度小於抗體與因子D之結合之約10%，如例如藉由RIA所量測。在某些實施例中，結合因子D之抗體的解離常數(KD)為≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗因子D抗體結合因子D之在來自不同物種之因子D中保守的抗原決定基。抗因子D抗體可為本文及/或美國專利第8,067,002號、第8,273,352號及第8,268,310號及美國專利申請案第14/700,853號(其各自係以引用方式全部併入本文中)所述之任何抗因子D抗體。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個稱為「Fab」片段之相同抗原結合片段，及殘餘「Fc」片段，命名反映出易於結晶之能力。Fab片段由完整輕(L)鏈連同重(H)鏈可變區域(VH)及一重鏈(CH1)之第一恆定域組成。抗體之胃蛋白酶處理得到單一大F(ab’)2片段，其大致對應於經兩個二硫鍵連接之具有二價抗原結合活性之Fab片段，且仍能夠與抗原交聯。Fab’片段不同於Fab片段之處在於在CH1域之羧基末端具有額外數個殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab’-SH為本文中對於其中恆定域之一或多個半胱胺酸殘基攜帶游離硫基的Fab’之命名。F(ab’)2抗體片段最初作 為之間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab’片段對產生。抗體片段之其他化學偶聯亦為已知的。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之含有至少一部分恆定區之C端區域。該術語包括天然序列Fc區及變異型Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外規定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
「Fv」由緊密、非共價締合之一重鏈及一輕鏈可變區域的二聚體組成。自此等兩個域之摺疊產生六個高變環(來自H及L鏈各3個環)，其貢獻供抗原結合之胺基酸殘基且將抗原結合特異性賦予抗體。然而，甚至單一可變域(或Fv之僅包含三個對抗原特異之HVR的一半)具有識別且結合抗原之能力，但親和力經常低於整個結合位點。
亦縮寫為「sFv」或「scFv」之「單鏈Fv」為包含連接成單一肽鏈之VH及VL抗體域的抗體片段。優選地，sFv多肽在VH與VL域之間進一步包含多肽連接子，其使得sFv能夠形成用於抗原形成之所需結構。對於sFv之評述，參見Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
術語「雙功能抗體」係指藉由以下製備之小抗體片段：在VH與VL域之間以短連接子(約5-10個殘基)構築sFv片段(參見以上段落)，使得達成V域之鏈內而非鏈間配對，從而產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙功能抗體為兩個「雜交」sFv片段之異二聚體，其中兩個抗體之VH及VL域存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更充分描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448,1993中。
「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為抑制或降低其所結合之抗 原的生物活性者。某些阻斷抗體或拮抗劑抗體大體上或完全抑制抗原之生物活性。
與參考抗體「結合相同抗原決定基之抗體」係指與參考抗體相比，接觸抗原之重疊集合之胺基酸殘基的抗體，或在競爭分析中阻斷參考抗體與其抗原結合達50%或以上之抗體。可例如藉由確定與抗原之複合物中抗體的晶體結構，或藉由進行氫/氘交換確定抗體之接觸抗原的胺基酸殘基。在一些實施例中，認為抗體之在抗原5Å範圍內的殘基接觸抗原。在一些實施例中，與參考抗體結合相同抗原決定基之抗體在競爭分析中阻斷參考抗體與其抗原結合達50%或以上，且反言之，參考抗體在競爭分析中阻斷抗體與其抗原結合達50%或以上本文提供示例性競爭分析。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指抗體重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干類別可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
「構架」或「構架區」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用且係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有含有如本文定義之Fc區之重鏈的抗體。
「鉸鏈區」通常定義為自人類IgG1之216-238(EU編號)或226-251(Kabat編號)伸展。鉸鏈可進一步分成三個不同區：上鉸鏈區、中間鉸鏈區(例如核心)及下鉸鏈區。在某些實施例中，人類IgG1抗體之鉸鏈區 通常定義如下：上鉸鏈包含具有序列EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：157)之胺基酸。在某些實施例中，上鉸鏈包含位置216-225(EU編號)或226-238(Kabat編號)處之胺基酸。
中間(例如核心)鉸鏈包含具有序列CPPC(SEQ ID NO：122)之胺基酸。在某些實施例中，核心鉸鏈包含位置226-229(EU編號)或239-242(Kabat編號)處之胺基酸。
下鉸鏈包含具有序列PAPELLGGP(SEQ ID NO：158)之胺基酸。在某些實施例中，下鉸鏈包含位置230-238(EU編號)或243-251(Kabat編號)處之胺基酸。
「人類抗體」為具有對應於由人類或人類細胞所產生或源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體胺基酸序列之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為表示在人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞群。在一實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群κI。在一實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群III。
「人類化」形式之非人類(例如囓齒動物)抗體為含有自非人類抗體衍生之最小序列之嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之高變區之殘基經來自具有所需抗體特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長動物之高變區的殘基置換。在一些情況中，人類免疫球蛋白之FR殘基經對應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含受體抗體或供體抗體中不可見之殘基。進行此等修飾以進一步細化抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上 全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白(Fc)恆定區、典型地人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。對於進一步詳情，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
術語「可變」係指可變域之某些節段的序列在抗體之間廣泛不同。可變或「V」域介導抗原結合且限定特定抗體對特定抗原之特異性。然而，可變性並不均勻分佈在可變域之跨度上。相反，V區由15-30個胺基酸之稱為構架區(FR)之相對不變延伸段組成，其由各9-12個胺基酸長之稱為「高變區」的較短極可變區分隔開。在本文使用時，術語「高變區」或「HVR」係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區通常包含來自以下之胺基酸殘基：例如VL中之大約殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)，及VH中之大約殘基26-35(H1)、49-65(H2)及95-102(H3)(在一實施例中，H1為大約殘基31-35)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))；及/或來自「高變環」之彼等殘基(例如，VL中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及VH中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。天然重及輕鏈之可變域各包含四個FR，大部分採用β摺疊構型，藉由三個高變區連接，其形成連接β摺疊結構之環且在一些情況下形成β摺疊之一部分。各鏈中之高變區藉由FR與其他鏈之高變區緊密接近地保持在一起，促使形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。因此，HVR及FR序列通常按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恆定域不直接涉及在抗體與抗原結合中，但展現出各種效應功能，諸如抗體參與在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)中。
術語「如在Kabat中可變域殘基編號」、「Kabat胺基酸殘基」或「如在Kabat中胺基酸位置編號」及其變化形式係指Kabat等人(同上)中 用於抗體之編撰的重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或HVR的縮短或插入之較少數或額外胺基酸。例如，重鏈可變域可在H2之殘基52後包含單一胺基酸插入(根據Kabat，殘基52a)，且在重鏈FR殘基82後包含經插入殘基(例如根據Kabat，殘基82a、82b及82c等)。可藉由抗體序列與「標準」Kabat編號序列之同源性區域的比對來確定既定抗體之殘基之Kabat編號。
在提及可變域中之殘基(大致為輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時通常使用Kabat編號系統(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時通常使用「EU編號系統」或「EU索引」(例如Kabat等人(同上)中報告之EU索引。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。除非本文中另外說明，否則對抗體可變域中之殘基編號的提及意謂藉由Kabat編號系統之殘基編號。除非本文中另外說明，否則對抗體恆定域中之殘基編號的提及意謂藉由EU編號系統之殘基編號(例如，參見美國臨時申請案第60/640,323號EU編號圖)。
除非另外指示，否則HVR殘基及可變域中之其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)加以編號。
「免疫結合物」為結合於一或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)之抗體。
當用於描述本文中揭露之各種抗體時，術語「經分離之抗體」抗體意謂已經鑑別且自表現其之細胞或細胞培養物分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染組分為典型地將干擾多肽之診斷或治療用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋白性或非蛋白性溶質。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)方法所測定。對於評定抗體純度之方法之評述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。在較佳實施例中，抗體將經純化(1)至藉由使用轉杯式測序儀足以獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度；或(2)至藉 由SDS-PAGE在非還原或還原性條件下使用庫馬斯藍、較佳地銀染色指示均勻程度。經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體，因為多肽天然環境之至少一種組分將不存在。然而，經分離之多肽通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能之變異型抗體(例如含有天然存在之突變或在製造單株抗體製劑之期間產生之突變，此等變異體通常以少量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製備物不同，單株抗體製備物之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體係獲自實質上同源之抗體群體的特徵，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，此等方法及製備單株抗體之其他示例性方法在本文中加以描述。
術語「多特異性抗體」在最寬泛意義上使用且具體而言涵蓋包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)之抗體，其中VH-VL單元具有多抗原決定基(亦即，能夠結合一個生物分子上之兩個不同抗原決定基或不同生物分子上之各抗原決定基。此等多特異性抗體包括(但不限於)全長抗體、具有兩個或兩個以上VL及VH域之抗體，抗體片段諸如Fab、Fv、dsFv、scFv，雙功能抗體、雙特異性抗體及三功能抗體、經共價或非共價連接之抗體片段。「多抗原決定基特異性」係指特異性結合同一或不同標靶上之兩個或兩個以上不同抗原決定基之能力。「雙重特異性」或「雙特異性」係指特異性結合同一或不同標靶上之兩個不同抗原決定基之能力。然而，與雙特異性抗體相對照，雙重特異性抗體具有兩個胺基酸序列一致之抗原結合臂，且各Fab臂能夠識別兩個抗原。雙重特異性允許抗體作為單一Fab或IgG分子以高親和力與兩個不同抗原相互作用。根據一個實施例，IgG1形式之多特異性抗體以以下親和力結合各抗原決定基：5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM。 「單特異性」係指僅結合一個抗原決定基之能力。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚醣蛋白，由經二硫鍵鍵結之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，之後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，之後為恆定輕(CL)域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列指定為稱為κ及λ之兩種類型中之一者。
關於抗體與其標靶分子之結合，術語「特異性結合」或「特異性結合至」特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基或「對其具有特異性」意謂結合可量測地不同於非特異性相互作用。特異性結合例如可藉由測定與對照分子之結合相比分子之結合來進行量測。例如，特異性結合可藉由與類似於標靶、例如過量未標記標靶之對照分子競爭來測定。在此情況下，若經標記標靶與探針之結合被過量未標記標靶完全抑制，則指示特異性結合。如本文所用，術語「特異性結合」或「特異性結合至」特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基或「對其具有特異性」可藉由例如對標靶具有以下KD之分子展現出：10-4M或以下、或者10-5M或以下、或者10-6M或以下、或者10-7M或以下、或者10-8M或以下、或者10-9M或以下、或者10-10M或以下、或者10-11M或以下、或者10-12M或以下，或KD在10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M範圍內。如熟習此項技術者將理解，親和力與KD值逆相關。對抗原之高親和力藉由低KD值來度量。在一實施例中，術語「特異性結合」係指以下結合，其中分子結合至特定多肽或特定多肽上之抗原決定基，而不實質上結合至任何其他多肽或多肽抗原決定基。
「編碼抗體之經分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括在單一載體或各別載體中之此(等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置上之此(等)核酸分子。在一些實施例中，核酸編碼抗HtrA1抗體。在其他實施例中，核酸可編碼抗因子D抗體(例如，抗HtrA1/抗因子D抗體)。
如本文所用之術語「載體」係指能夠使其所連接之另一核酸增殖之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構形式之載體以及併入當中已引入有其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠導引與其可操作地連接之核酸表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及源於其之子代而不考慮繼代次數。子代在核酸內含物方面可能與母細胞不完全相同，而可能含有突變。本文包括具有與在原始轉型細胞中所篩檢或選擇相同之功能或生物活性之突變型子代。
關於參照多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比，且不考慮任何保守性取代作為序列一致性之一部分之後，候選序列中與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術中之技能範圍內之多種方式，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體來比對以便測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較之序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech公司創造，且原始程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech公司(South San Francisco,California)公開獲得，或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A對於、與或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(或者可稱為既定胺基酸序列A對於、與或相對於既定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性百分比)係如下加以計算：100×分數X/Y，其中 X為藉由序列比對程式ALIGN-2在彼程式進行A與B比對時計分為相同匹配之胺基酸殘基數，且其中Y為B中之胺基酸殘基總數。應瞭解當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對於B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B對於A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外明確陳述，否則本文使用之所有胺基酸序列一致性百分比值皆係使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述來獲得。
蛋白包括抗體據稱為「穩定的」，若其實質上保留完整構型結構及生物活性。此項技術中可獲得用於量測蛋白穩定性之各種分析技術，且其評述於例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee編輯，Marcel Dekker公司，New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90中。「穩定性提高」之抗體變異體係指與起始參考抗體相比更加穩定之抗體變異體。較佳地，穩定性提高之抗體變異體為參考(野生型)抗體之變異體，其中特定胺基酸殘基經改變以用於提高物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物穩定性、及/或降低天然抗體之免疫原性目的。
術語「異構化」一般係指化合物轉化成之其任何異構體形式之化學過程，即具有相同化學組成、但不同結構或構型且因此通常具有不同物理及化學特性之形式。本文中具體使用天冬胺酸異構化，其中多肽之一或多個天冬胺酸(D或Asp)殘基轉化成一或多個異天冬胺酸殘基之過程。參見例如，Geigeret等人，J.Biol.Chem.262：785-94,1987。
術語「脫醯胺基作用」一般係指其中醯胺官能基從有機化合物去除之化學反應。本文中具體使用天冬醯胺脫醯胺基作用，其中多肽(例如抗體)之一或多個天冬醯胺(N或Asn)殘基轉化成天冬胺酸(D或Asp)，亦即中性醯胺側鏈轉化成具有總體酸性特性之殘基之過程。參見例如，Xie等人，J.Pharm.Sci.88：8-13,1999。
多肽分子(例如抗體)之「經氧化」變異體為其中原始多肽之一或多個甲硫胺酸(M或Met)或色胺酸(W或Trp)殘基經由甲硫胺酸之硫轉化成碸或亞碸之多肽。可藉由將甲硫胺酸(M或Met)轉化成白胺酸(L或Leu)或異白胺酸(I或Ile)防止氧化。參見例如，Amphlettet等人，Pharm.Biotechnol., 9：1-140,1996。
「易於」服從某些經鑑定物理或化學過程(例如異構化、脫醯胺基作用或氧化)之胺基酸殘基係指特定蛋白分子內之經鑑定具有進行經鑑定過程諸如異構化、脫醯胺基作用或氧化之傾向的殘基。其傾向經常藉由其在蛋白之一級及/或構型結構內之相對位置測定。例如，已示出Asp-XXX基元(其中XXX可為Asp、Gly、His、Ser或Thr)中之第一Asp易於服從Asp異構化，此歸因於其鄰近殘基之涉及，其中同一蛋白質內之一些其他Asp可不具有此傾向。用於鑑定特定蛋白分子內之易於服從某些過程之殘基的分析在此項技術中為已知的。參見例如，Cacia等人，Biochem.35：1897-1903,1996。
除非另外指示，否則如本文可交換使用之術語「HtrA絲胺酸肽酶1(HtrA1)」或「HtrA1」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然HtrA1，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)；及囓齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未經加工HtrA1以及由細胞中加工產生之任何形式之HtrA1。該術語亦涵蓋HtrA1之天然存在之變異體，例如拼接變異體或對偶基因變異體。示例性人類HtrA1之胺基酸序列示於SEQ ID NO：121(參見圖29A)中。人類HtrA1之UniProt入藏登記號為Q92743。示例性鼠類HtrA1之胺基酸序列示於SEQ ID NO：155(參見圖29B)中。鼠類HtrA1之UniProt入藏登記號為Q9R118。如本文中所述，huHtrA1及muHtrA1之胺基酸殘基分別參考SEQ ID NO：121及SEQ ID NO：155。藉由單字母胺基酸編碼接著其在SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：155(參見圖29B)中之位置來規定胺基酸位置。如圖29A中所示，人類HtrA1之成熟序列包含起始於SEQ ID NO：121之位置23處的麩醯胺酸且終止於SEQ ID NO：121之位置480處的脯胺酸之序列，例如Q23-P480。人類HtrA1之示例性片段包括包含、基本上由、或由胺基酸D161-K379組成之片段。HtrA1在此項技術中亦稱為絲胺酸蛋白酶11(IGF結合)(PRSS11)、ARMD7、HtrA及IGFBP5蛋白酶。
術語「HtrA1」亦涵蓋「HtrA1變異體」，其意謂與天然序列HtrA1多肽、諸如SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：155具有至少約80%胺基 酸序列一致性之活性HtrA1多肽。通常，HtrA1變異體將與天然HtrA1序列、例如SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：155具有至少約80%胺基酸序列一致性、或至少約85%胺基酸序列一致性、或至少約90%胺基酸序列一致性、或至少約95%胺基酸序列一致性、或至少約98%胺基酸序列一致性、或至少約99%胺基酸序列一致性。
術語「HtrA1結合拮抗劑」在最寬泛意義上使用且包括能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾HtrA1生物活性之任何分子。HtrA1結合拮抗劑包括(但不限於)抗HtrA1抗體及其抗體變異體、其抗原結合片段、其他結合多肽、肽及非肽小分子，其結合至HtrA1且能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾HtrA1活性，諸如HtrA1活體外(例如H2-Opt受質或酪蛋白)或活體內(例如HtrA1促成眼睛病症(例如AMD(例如地圖狀萎縮)之病變的能力)裂解受質之能力。
如本文所用，術語「因子D」係指天然序列及其變異因子D多肽。因子D在此項技術中亦稱為補體因子D(CFD)、C3前活化因子轉化酶、備解素因子D酯酶及降脂素。
「天然序列因子D」為與源自自然界之因子D多肽具有相同胺基酸序列、而不考慮其製備方式之多肽。因此，天然序列因子D可自自然界分離或可藉由重組及/或合成方式製備。除成熟因子D蛋白、諸如成熟人類因子D蛋白(參見例如NCBI參考序列NM_001928，SEQ ID NO：126)外，術語「天然序列因子D」具體涵蓋天然存在之前體形式的因子D(例如，非活性前蛋白，其經蛋白水解裂解產生活性形式)、因子D之天然存在之變異形式(例如，或者拼接形式)及天然存在之對偶基因變異體，以及因子D分子之具有與源自自然界之因子D多肽相同之胺基酸序列的結構構型變異體。人類因子D之UniProt入藏登記號為P00746。非人類動物、包括高等靈長類動物及非人類哺乳動物之因子D多肽具體而言包括在此定義中。
「因子D變異體」意謂活性因子D多肽，其與天然序列因子D多肽、諸如天然序列人類因子D多肽(例如，NM_001928，SEQ ID NO：126)具有至少約80%胺基酸序列一致性。通常，因子D變異體與成熟人類胺基酸序列(例如NM_001928，SEQ ID NO：126)將具有至少約80%胺基酸 序列一致性、或至少約85%胺基酸序列一致性、或至少約90%胺基酸序列一致性、或至少約95%胺基酸序列一致性、或至少約98%胺基酸序列一致性、或至少約99%胺基酸序列一致性。
術語「因子D結合拮抗劑」在最寬泛意義上使用且包括能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾因子D生物活性之任何分子。因子D結合拮抗劑包括(但不限於)抗因子D抗體及其抗體變異體、其抗原結合片段、其他結合多肽、肽及非肽小分子，其結合至因子D且能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾因子D活性，諸如因子D參與補體相關眼睛病症之病變的能力。
如本文所述，術語「VEGF拮抗劑」係指能夠結合至VEGF、降低VEGF表現水準或中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物活性之分子，該等VEGF生物活性包括但不限於VEGF結合至一或多種VEGF受體、VEGF信號傳導及VEGF介導之血管生成及內皮細胞存活或增殖。例如，能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物活性之分子可藉由結合至一或多種VEGF受體(VEGFR)(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR))施展其作用。所包括之適用於本發明方法的VEGF拮抗劑為特異性結合至VEGF之多肽，抗VEGF抗體及其抗原結合片段，特異性結合至VEGF、從而隔離其與一或多種受體之結合的受體分子及衍生物，融合蛋白(例如VEGF阱(Regeneron))及VEGF121-多花樹毒蛋白(Peregrine).VEGF拮抗劑亦包括VEGF多肽之拮抗劑變異體、與編碼VEGF多肽之核酸分子的至少一片段互補之反義核鹼基寡聚物；與編碼VEGF多肽之核酸分子的至少一片段互補之小RNA；靶向VEGF之核糖酶；針對VEGF之肽抗體；及VEGF適體。VEGF拮抗劑亦包括結合VEGFR、抗VEGFR抗體及其抗原結合片段之多肽及結合VEGFR治療劑，從而阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物活性(例如VEGF信號傳導)之衍生物，或融合蛋白。VEGF拮抗劑亦包括結合至VEGF或VEGFR且能夠阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物活性之非肽小分子。因此，術語「VEGF活性」具體而言包括VEGF之經VEGF介導的生物活性。在某些實施例中，VEGF拮抗劑降低或 抑制VEGF之表現水準或生物活性達至至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或以上。在一些實施例中，藉由VEGF特異性拮抗劑抑制之VEGF為VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165。
如本文所用，VEGF拮抗劑可包括(但不限於)抗VEGFR2抗體及有關分子(例如雷莫蘆單抗(ramucirumab)、坦尼布單抗(tanibirumab)、阿柏西普(aflibercept))、抗VEGFR1抗體及有關分子(例如依庫克單抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF阱眼；EYLEA®)及ziv-阿柏西普(VEGF阱；ZALTRAP®))、雙特異性VEGF抗體(例如MP-0250、瓦西株單抗(vanucizumab)(VEGF-ANG2)及US 2001/0236388中揭示之雙特異性抗體)，包含抗VEGF、抗VEGFR1及抗VEGFR2臂中之兩者之組合的雙特異性抗體、抗VEGF抗體(例如貝伐單抗，貝伐單抗(bevacizumab)、沙瓦西單抗(sevacizumab)及蘭尼單抗(ranibizumab))及非肽小分子VEGF拮抗劑(例如帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、凡德他尼(vandetanib)、瑞格菲尼(stivarga)、卡波替尼(cabozantinib)、來那替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、奧蘭替尼(orantinib)、泰拉替尼(telatinib)、多韋替尼(dovitinig)、西地尼布(cediranib)、莫特塞尼(motesanib)、索凡替尼(sulfatinib)、阿坡替尼(apatinib)、佛瑞替尼(foretinib)、法米替尼(famitinib)及替肟紮尼(tivozanib))。
術語「抗VEGF抗體」、「結合VEGF之抗體」及「特異性結合VEGF之抗體」係指能夠以足以使抗體在靶向VEGF時適用作診斷劑及/或治療劑之親和力結合VEGF之抗體。在一實施例中，抗VEGF抗體結合無關非VEGF蛋白之程度小於抗體與VEGF之結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合VEGF之抗體的解離常數(Kd)為
Figure 105135184-A0202-12-0039-322
1μM、
Figure 105135184-A0202-12-0039-309
100nM、
Figure 105135184-A0202-12-0039-310
10nM、
Figure 105135184-A0202-12-0039-311
1nM、
Figure 105135184-A0202-12-0039-312
0.1nM、
Figure 105135184-A0202-12-0039-313
0.01nM或
Figure 105135184-A0202-12-0039-314
0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗VEGF抗體結合VEGF之在來自不同物種之VEGF中保守的抗原決定基。
在某些實施例中，抗VEGF抗體在靶向及干擾其中涉及VEGG活性之疾病或病況中可用作治療劑。抗體亦可經受其他生物活性分析，例如以便評估其作為治療劑之有效性。此等分析在此項技術中為已知 的，且取決於標靶抗原及抗體之預定用途。實例包括HUVEC抑制分析；腫瘤細胞生長抑制分析(如例如WO 89/06692中所述)；抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體介導之細胞毒性(CDC)分析(美國專利第5,500,362號)；及促效劑活性或造血作用分析(參見WO 95/27062)。抗VEGF抗體通常將不結合至其他VEGF同源物，諸如VEGF-B或VEGF-C，亦不結合至其他生長因子，諸如PlGF、PDGF或bFGF。在一實施例中，抗VEGF抗體為與藉由融合瘤ATCC HB 10709產生之單株抗VEGF抗體A4.6.1結合相同抗原決定基之單株抗體。在另一實施例中，抗VEGF抗體為根據Presta等人.(1997)Cancer Res.57：4593-4599產生之重組人類化抗VEGF單株抗體，包括(但不限於)稱為貝伐單抗(BV；AVASTIN®)之抗體。
亦稱為「LUCENTIS®」或「rhuFab V2」之抗VEGF抗體「蘭尼單抗」為人類化、親和力成熟抗人類VEGF Fab片段。蘭尼單抗係藉由標準重組技術方法在大腸桿菌(Escherichia coli)表現載體中及細菌發酵產生。蘭尼單抗未經糖基化且具有約48,000道爾頓之分子量。參見WO 98/45331及US 2003/0190317。其他較佳之抗體包括G6或B20系列抗體(例如G6-31、B20-4.1)，如PCT申請公開案第WO 2005/012359號及第WO 2005/044853號中所述，其各自以引用方式全部併入本文中。對於其他較佳之抗體參見美國專利第7,060,269號、第6,582,959號、第6,703,020號、第6,054,297號；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美國專利申請公開案第2006009360號、第20050186208號、第20030206899號、第20030190317號、第20030203409號及第20050112126號；及Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。其他較佳之抗體包括結合人類VEGF上之功能性抗原決定基之抗體，該功能性抗原決定基包含殘基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、191、K101、E103及C104，或者包含殘基F17、Y21、Q22、Y25、D63、183及Q89。其他抗VEGF抗體包括PCT申請公開案第WO 2009/155724號中所述之抗VEGF抗體。
術語「IL-6結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由IL-6與其一種或多種結合搭配物諸如白介素6受體(IL-6R)(亦稱為CD126)及/或gp130(亦稱為CD130)相互作用產生之信號轉導之分子。示例 性IL-6結合拮抗劑包括例如抗IL-6拮抗劑(包括抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics))及抗IL-6R拮抗劑(包括抗IL-6R抗體，例如托珠單抗(tocilizumab)(ACTEMRA®)。「小分子」在本文中定義為具有低於約600、較佳低於約1000道爾頓之分子量。
「病症」為將受益於抗體治療之任何病狀。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易感所討論病症之病理學病狀。本文中待治療之病症的非限制性實例包括HtrA1相關病症、眼睛病症及/或補體相關病症。
如本文所用，術語「HtrA1相關病症」在最寬泛意義上係指與異常HtrA1表現或活性相關之任何病症或病狀。在一些實施例中，HtrA1相關病症與過量HtrA1水準或活性相關聯，其中由於身體局部(例如，眼睛中)及/或全身HtrA1水準或活性，可顯示出非典型症狀。示例性HtrA1相關病症包括HtrA1相關眼睛病症，其包括但不限於例如年齡相關黃斑變性(AMD)，包括濕性(滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性(非滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如地圖狀萎縮(GA))。
如本文所用，術語「眼睛病症」包括(但不限於)眼睛之病狀，包括黃斑變性性疾病，諸如年齡相關黃斑變性(AMD)，包括濕性(滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性(非滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如地圖狀萎縮(GA))；糖尿病視網膜病變(DR)及其他缺血相關視網膜病；眼內炎；葡萄膜炎；脈絡膜新血管生成(CNV)；早產兒視網膜病變(ROP)；息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)；糖尿病黃斑水腫；病理性近視眼；逢希伯-林道病；眼組織漿菌病；視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)；角膜新血管生成；及視網膜新血管生成。在一些實施例中，眼睛病症為AMD(例如GA)。
術語「補體相關病症」在最寬泛意義上使用，且包括與過度或不受控制補體活化相關之病症。其包括心肺旁路手術過程中補體活化；歸因於以下事件之後的缺血再灌注之補體活化：急性心肌梗死、動脈瘤、中風、出血性休克、擠壓損傷、多發性器官功能衰竭、血小板減少性休克、腸缺血或引起缺血之其他事件。補體活化亦經示出與炎症性病狀相關，該 等炎症性病狀諸如嚴重燒傷、內毒素血症、敗血性休克、成人呼吸窘迫症候群、血液透析、過敏性休克、嚴重哮喘、血管性水腫、克羅恩病(Crohn’s disease)、鐮狀細胞性貧血、鏈球菌感染後腎小球腎炎及胰腺炎。該病症可為不利藥物反應、藥物過敏、IL-2誘導之血管滲漏症候群或放射造影劑過敏之結果。其亦包括自體免疫疾病諸如全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、類風濕性關節炎、阿爾莰海默氏病(Alzheimer’s disease)及多發性硬化。補體活化亦與移植排斥反應相關。補體活化亦與眼睛病症相關，諸如補體相關眼睛病症。
術語「補體相關眼睛病症」在最寬泛意義上使用，且包括涉及補體之所有眼睛病狀及病變，包括經典及替代途徑，尤其補體之替代途徑。補體相關眼睛病症包括(但不限於)黃斑變性疾病，諸如所有階段之年齡相關黃斑變性(AMD)、脈絡膜新血管生成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性及其他缺血有關視網膜病、眼內炎、葡萄膜炎及其他眼內新血管疾病，諸如糖尿病黃斑水腫、病理性近視眼、逢希伯-林道病、眼組織漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管生成及視網膜新血管生成。在一實例中，AMD包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如，地圖狀萎縮(GA))。在另一實例中，乾性(非滲出性)AMD可包括硬脈絡膜小疣、軟脈絡膜小疣、地圖狀萎縮及/或色素凝集之存在。早期AMD可包括例如多個小至一或多個非廣泛中等尺寸脈絡膜小疣。中期AMD可包括例如廣泛中等脈絡膜小疣至一或多個大脈絡膜小疣。參見例如Ferris等人，第18號AREDS Report；Sallo等人，Eye Res,34(3)：238-40,2009；Jager等人，New Engl.J.Med.,359(1)：1735,2008。在另一實例中，中期乾性AMD可包括大融合性脈絡膜小疣。在另一實例中，地圖狀萎縮可包括光感受器及/或視網膜色素上皮(RPE)損失。在另一實例中，地圖狀萎縮區域可為小或大的，且/或可處於黃斑區域或周邊視網膜中。在一實例中，補體相關眼睛病症為中期乾性AMD。在一實例中，補體相關眼睛病症為地圖狀萎縮。在一實例中，補體相關眼睛病症為濕性AMD(例如脈絡膜新血管生成(CNV))。
以上列表並非全包括的，且應理解疾病或病症可屬於各種類 別。例如，AMD在某些情況中可分類為HtrA1相關病症、眼睛病症及補體相關病症。
如本文所用，「投與」意謂對個體給予本發明化合物(例如本發明之抗HtrA1抗體，編碼本發明抗HtrA1抗體之核酸)或組合物(例如醫藥組合物，例如，包含本發明之抗HtrA1抗體之醫藥組合物)劑量之方法。本文所述方法中利用之組合物可例如玻璃體內(例如藉由玻璃體內注射)、經眼(例如藉由經眼注射)、眼內(例如藉由眼內注射)、鞏膜旁(例如藉由鞏膜旁注射)、筋膜下(例如藉由筋膜下注射)、脈絡膜上(例如藉由脈絡膜上注射)、局部(例如藉由滴眼液)、肌肉內、靜脈內、皮內、透皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內、鼻內、陰道內、直腸內、腫瘤內、經腹膜、皮下、結膜下、膀胱內、經黏膜、心包內、臍內、眼窩內、經口、經皮、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部輸注對標靶細胞直接浴洗、藉由導管、藉由灌洗在乳劑中或在脂質組合物中投與。本文所述方法中利用之組合物亦可全身或局部投與。投與方法可取決於各種因素(例如所投與化合物或組合物，及所治療病狀、疾病或病症之嚴重程度)而變化。在特定實施例中，藉由玻璃體內注射投與本文所述抗體(例如抗HtrA1抗體、抗因子D抗體及抗HtrA1/抗因子D抗體)。
「組合」一種或多種其他治療劑投與包括同時(並行)及以任何順序相繼投與。
術語「長效遞送」、「持續釋放」及「受控釋放」一般用於描述使用調配物、劑型、裝置或其他類型之技術以達成治療劑(例如，本發明抗體)之延時或延長釋放或生物可用性之遞送機制。其可指對一般性全身循环或個體、或對個體之局部作用部位提供藥物之延時或延長釋放或生物可用性之技術，該等局部作用部位包括(但不限於)細胞、組織、器官、關節、區域及其類似者。此外，此等術語可指用於使藥物自調配物或劑型之釋放延時或延長之技術，或其可指用於使針對個體之藥物的生物可用性或藥物代謝動力學或作用持續時間延長或延時之技術，或其可指藉由調配物引出之用於使藥效學作用延長或延時之技術。
「長效調配物」、「持續釋放調配物」或「受控釋放調配物」為用於提供長效遞送之醫藥調配物、劑型或其他技術。在一態樣中，受控釋放用於改良治療劑之局部生物可用性，在眼部遞送之背景下具體為眼部滯留時間。「眼部滯留時間增加」係指遞送後時間段，在此期間所遞送眼部藥物在品質(例如活性)方面與量(例如有效量)方面均保持有效。除高劑量及受控釋放外或代替高劑量及受控釋放，可對藥物進行轉譯後修飾，諸如經由PEG化，以達成活體內半衰期增加。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時期，有效達成所要治療或預防結果之量。
「個體」(individual/subject)為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(例如牛、綿羊、貓、犬及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及囓齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體為人類。「個體」可為「患者」。
術語「包裝插頁」用於指慣常包括在治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此等治療性產品相關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中之除活性成分以外的對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語「醫藥調配物」係指以下製劑：其呈允許其中所含之活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之個體具有不可接受毒性之額外組分。
如本文所用之「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程，且可為達成預防目的或在臨床病理過程中進行之臨床介入。合乎需要之治療作用包括但不限於防止疾病或病症發生或復發、減輕症狀、減弱疾病或病症之任何直接或間接病理學結果、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病或病症病況及緩和或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病或病症發展或減緩疾病或病症進展。在一些實例中，病症為HtrA1相 關病症、眼睛病症及/或補體相關病症，例如AMD(例如GA)。
「經分離」核酸分子為經鑑定且自該核酸之自然來源中通常締合之其至少一種污染性核酸分子分離的核酸分子。經分離之核酸分子不處於其自然界中所見之形式或環境中。因此，經分離之核酸分子區別於在天然細胞中所存在之核酸分子。然而，經分離之核酸分子包括細胞中所含之通常表現抗體之核酸分子，其中例如核酸分子處於不同於天然細胞之染色體位置中。
表述「控制序列」係指對於有效連接之編碼序列在特定宿主生物中之表現必要的DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況操作子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸化信號及增強子。
當核酸經放置與另一核酸序列成功能性關係時，其經「有效連接」。例如，前序列或分泌前導序列之DNA有效連接至某多肽之DNA，條件為其表達為參與該多肽之分泌的前驅蛋白；啟動子或增強子有效連接至編碼序列，條件為其影響該序列轉錄；或核糖體結合位元點有效連接至編碼序列，條件為其定位成能促進翻譯。一般而言，「有效連接」意謂所連接DNA序列為鄰接的，且在分泌前導序列之情況下，鄰接且處於階段中。然而，增強子不必為鄰接的。連接伴隨在方便限制位點處接合。若此位元點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸銜接子或連接子。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可交換使用，且所有此等名稱均包括子代。因此，字詞「轉型體」及「轉型細胞」包括初級個體細胞及源於其之培養物而不考慮轉移次數。亦應理解由於有意或無意突變，所有子代在DNA內容物方面可能不會嚴格一致。包括具有與在原始轉型細胞中所篩檢相同之功能或生物活性之突變型子代。若欲用不同名稱，則根據上下文應為清楚明了的。
如本文所用，「文庫」係指多個抗體或抗體片段序列(例如，本發明之抗HtrA1抗體)或編碼此等序列之核酸，該等序列在引入此等序列中之變異胺基酸組合方面不同，例如如本文所述。
「突變」為相對於參考核苷酸序列諸如野生型序列缺失、插 入或取代一或多個核苷酸。
如本文所用，「密碼子集合」係指用於編碼所需變異胺基酸之不同核苷酸三元子序列的集合。可藉由例如固相合成法合成寡核苷酸集合，包括表示藉由密碼子集合所提供之所有可能核苷酸三元子組合之序列及將編碼所需胺基酸組之序列。標準形式之密碼子名稱為IUB碼之密碼子名稱，其在此項技術中已知。密碼子集合典型地藉由3個斜體大寫字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK及其類似者。在此項技術中熟知在某些位置具有經選擇核苷酸「簡併」之寡核苷酸的合成，例如TRIM法(Knappek等人，J.Mol.Biol.296：57-86,1999；Garrard等人，Gene 128：103,1993)。具有某些密碼子集合之此等寡核苷酸集合可使用商業核酸合成器(獲自例如Applied Biosystems,Foster City,CA)合成或可商購獲得(例如自Life Technologies,Rockville,MD)。因此，經合成具有特定密碼子集合之寡核苷酸集合典型地將包括具有不同序列之多個寡核苷酸，不同係藉由整個序列內之密碼子集合確立。如根據本發明使用之寡核苷酸具有允許雜交至可變域核酸範本且亦可(但不必)包含適用於例如選殖目的之限制酶位元元點之序列。
「噬菌體呈現」為變異多肽作為噬菌體(例如絲狀噬菌體顆粒)表面上之外殼蛋白的至少一部分之融合蛋白呈現之技術。噬菌體呈現之實用性在於以下事實：隨機化蛋白變異體之大文庫可針對以高親和力結合標靶抗原之彼等序列進行快速且有效地分類。肽及蛋白質文庫在噬菌體上之呈現已用於篩檢數百萬之多肽中之具有特異結合特性之彼等。多價噬菌體呈現方法已經由融合至絲狀噬菌體之基因III或基因VIII而用於呈現小隨機肽及小蛋白質。參見例如Wells等人，Curr.Opin.Struct.Biol.,3：355-362,1992及其中引用之參考文獻。在單價噬菌體呈現中，將蛋白或肽文庫融合至基因III或其部分，且在野生型基因III蛋白存在下以低水準表現，使得噬菌體顆粒呈現一個拷貝或不呈現融合蛋白。親和性作用相對於多價噬菌體降低，使得分類係基於固有配體親和力，且使用簡化DNA操縱之噬粒載體。參見例如，Lowman等人，Methods：A companion to Methods in Enzymology,3：205-216,1991。
起始或參考多肽(例如，參考抗體或其一或多個可變域/HVR)之「變異體」或「突變體」為(1)具有不同於起始或參考多肽之胺基酸序列且(2)經由天然或人工(人為)誘變衍生自起始或參考多肽之多肽。此等變異體包括例如相關多肽之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代，其本文中稱為「胺基酸殘基改變」。因此，變異HVR係指相對於起始或參考多肽序列(諸如源抗體或抗原結合片段之序列)包含變異序列之HVR。在此背景下，胺基酸殘基改變係指胺基酸不同於起始或參考多肽序列(諸如參考抗體或其片段之序列)中之對應位置之胺基酸。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要功能特徵。胺基酸變化亦可改變多肽之轉譯後過程，諸如改變糖基化位元點之數目及位置。
「野生型(WT)」或「參考」序列或「野生型」或「參考」蛋白質/多肽之序列，諸如參考抗體之HVR或可變域，可為經由引入突變變異多肽所源自之參考序列。一般而言，既定蛋白之「野生型」序列為自然界中最常見之序列。同樣，「野生型」基因序列為自然界中最常見之基因的序列。突變可經由自然過程或經由人為誘導方式引入「野生型」基因(且因此其編碼之蛋白質)。此等過程之產物為原始「野生型」蛋白質或基因之「變異」或「突變」形式。
如本文所用，「參考抗體」係指抗體或其片段，其抗原結合序列用作根據本文所述之標準進行多樣化之範本序列。抗原結合序列一般包括抗體可變區，較佳至少一個HVR，較佳包含構架區。
如本文所用，「富集」意謂與對應參考文庫(例如未分類文庫或已針對不同或非相關抗原進行分類)相比，整體(例如胺基酸殘基改變)以較高頻率存在於所分類文庫中。對照而言，「耗竭」意謂與對應參考文庫(例如未分類文庫或已針對不同或非相關抗原進行分類)相比，整體(例如胺基酸殘基改變)以較低頻率存在於所分類文庫中。當參考鑑定胺基酸殘基變異體之方法使用時，術語「中性」意謂與對應參考文庫(例如未分類文庫或已針對不同或非相關抗原進行分類)相比，整體既未富集亦未耗竭，換言之，其以近乎相同頻率存在於所分類文庫中。
「等電點(pI)」意謂分子(例如蛋白質，諸如抗體)不攜帶淨電荷之pH，其在此項技術中亦稱為「pH(I)」或「IEP」。
II. 組合物及方法
本發明提供結合HtrA1之新型抗體，及其製備及使用方法，例如以供用於治療及診斷用途。本發明之抗體適用於例如診斷或治療各種病症，包括HtrA1相關病症、眼睛病症及/或補體相關病症，包括年齡相關黃斑變性(例如地圖狀萎縮)。
A. 示例性抗HtrA1抗體
在一態樣中，本發明係部分基於特異性結合HtrA1之抗體。本發明之抗體適用於例如治療或診斷病症，包括HtrA1相關病症、眼睛病症及/或補體相關病症，包括年齡相關黃斑變性(例如地圖狀萎縮)。
本發明提供特異性結合HtrA1之經分離之抗體。在一些情況中，HtrA1為人類HtrA1(huHtrA1)。在其他情況中，HtrA1為鼠類HtrA1(muHtrA1)。在某些情況中，本發明之抗HtrA1抗體特異性結合huHtrA1，其KD為100nM或以下(例如100nM或以下、10nM或以下、5nM或以下、2.5nM或以下、1nM或以下、100pM或以下、10pM或以下、1pM或以下或0.1pM或以下)。例如，在一些情況中，本發明之抗HtrA1抗體特異性結合huHtrA1，其KD為1nM或以下(例如1nM或以下、900pM或以下、800pM或以下、700pM或以下、600pM或以下、550pM或以下、500pM或以下、400pM或以下、300pM或以下、200pM或以下、150pM或以下、125pM或以下、100pM或以下、75pM或以下、50pM或以下、25pM或以下或1pM或以下)。在一些情況中，抗HtrA1抗體結合huHtrA1，其KD介於約40pM與約700pM之間(例如介於約40pM與約700pM之間、介於約40pM與約600pM之間、介於約40pM與約550pM之間、介於約40pM與約500pM之間、介於約40pM與約400pM之間、介於約40pM與約300pM之間、介於約40pM與約250pM之間、介於約50pM與約200pM之間、介於約50pM與約175pM之間、介於約50pM與約150pM之間、介於約50pM與約125pM之間、介於約70pM與約125pM之間或介於約50pM與約125pM)。在一些情況中，抗HtrA1抗體結合huHtrA1之KD為約 110pM。在一些情況中，抗HtrA1抗體結合huHtrA1之KD為約60pM。任何以上KD值均可表示本發明之抗HtrA1抗體(例如本發明之抗HtrA1抗體的Fab)對huHtrA1(huHtrA1-PD)之蛋白酶域(PD)的結合親和力，例如，如使用BIACORE®表面電漿共振所量測，例如如本文所述。
在一些情況中，本發明之抗HtrA1抗體能夠抑制HtrA1之活性。在一些情況中，抗體抑制huHtrA1-PD之蛋白酶域的活性，其50%抑制濃度(IC50)為10nM或以下(例如10nM或以下、5nM或以下、2nM或以下、1.5nM或以下、1nM或以下、900pM或以下、800pM或以下、700pM或以下、600pM或以下、500pM或以下、400pM或以下、300pM或以下、200pM或以下、100pM或以下、50pM或以下或1pM或以下)。在一些情況中，抗HtrA1抗體抑制huHtrA1-PD之活性，其IC50介於約0.25nM與約1nM之間(例如介於約0.25nM與約1nM之間、介於約0.25nM與約0.9nM之間、介於約0.25nM與約0.8nM之間、介於約0.25nM與約0.7nM之間、介於約0.25nM與約0.6nM之間、介於約0.25nM與約0.5nM之間或介於約或0.25nM與約0.4nM之間)。在一些情況中，抗HtrA1抗體以約0.3nM之IC50抑制huHtrA1-PD之活性。在任何以上情況中，抑制活性可為活體外基於FRET之阻斷分析量測值。在一些情況中，活體外基於FRET之阻斷分析包括裂解H2-Opt探針(例如(Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK(SEQ ID NO：152)。在任何以上情況中，IC50值可基於二價形式之抗HtrA1(例如IgG形式)抑制huHtrA1-PD活性之能力。
本發明亦包涵一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1抗原決定基，其中該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197，其中胺基酸編號係指人類HtrA1前驅蛋白之編號。在一實施例中，人類HtrA1前驅蛋白具有SEQ ID NO：121之序列。在一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Leu192、Pro193及Arg197。在一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少兩個胺基酸：Leu192、Pro193及Arg197。在一特定實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸 Leu192、Pro193及Arg197。在另一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Arg190、Leu192、Pro193及Arg197。在另一實施例中，該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197。
在一些實施例中，抗HtrA1抗體在結合至HtrA1時定位在距胺基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197中之一或多個的4埃米或更低處。在一些實施例中，藉由晶體學例如使用實例中所述之晶體學方法測定抗體與該或該等胺基酸之間的距離。
在一些情況中，抗HtrA1抗體可包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個高變區(HVR)，其選自：(a)HVR-H1，其包含DSEX1H(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列，其中X1為Met或Leu；(b)HVR-H2，其包含GVDPETX2GAAYNQKFKG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列，其中X2為Glu或Asp；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVX3FIH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列，其中X3為Glu或Asn；(e)HVR-L2，其包含ATSX4LAS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列，其中X4為Asn、His或Glu；及(f)HVR-L3，其包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO：6)之胺基酸序列，其中X5為Ser或Tyr且X6為Ala或Asn，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：1-6中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
例如，抗HtrA1抗體可包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列；或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：3 或7-11中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
在一些情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、三個或四個以下重鏈可變域(VH)構架區(FR)：(a)FR-H1，其包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2(SEQ ID NO：12)之胺基酸序列，其中X1為Lys或Thr且X2為Thr、Lys或Arg；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：14)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。
在一些情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、三個或四個以下輕鏈可變域(VL)FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)之胺基酸序列。
例如，在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO：16)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：14)之 胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。在其他情況中，抗HtrA1抗體包含以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體為APEG.LC3.HC3。
在另一實例中，在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETDGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：123)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVNFIH(SEQ ID NO：124)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：125)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT(SEQ ID NO：25)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVKQTPVHGLEWIG(SEQ ID NO：26)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR(SEQ ID NO：27)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：28)之胺基酸序列。在其他情況中，抗HtrA1抗體包含以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO：29)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：30)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO：31)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：32)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體 為15H6(亦稱為m15H6)。
在另一實例中，抗HtrA1抗體可包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SYIMS(SEQ ID NO：39)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO：40)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO：41)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO：42)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含LASKLES(SEQ ID NO：43)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO：44)之胺基酸序列；或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：39-44中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
在一些情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、三個或四個以下重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：47)或EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS(SEQ ID NO：57)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：48)或WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO：58)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：49)或RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR(SEQ ID NO：59)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)或WGQGTAVTVSS(SEQ ID NO：60)之胺基酸序列。
在一些情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、三個或四個以下輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO：51)或NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO：61)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：52)或WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：62)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO：53)或GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO：63) 之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：54)或FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：64)之胺基酸序列。
例如，在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以下六個HVR：SYIMS(SEQ ID NO：39)；(b)HVR-H2，其包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO：40)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO：41)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO：42)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含LASKLES(SEQ ID NO：43)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO：44)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：47)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：48)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：49)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)之胺基酸序列。在其他情況中，抗HtrA1抗體包含以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO：51)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：52)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO：53)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：54)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體為h19B12.v1。
在另一實例中，在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以下六個HVR：SYIMS(SEQ ID NO：39)；(b)HVR-H2，其包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO：40)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO：41)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO：42)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含LASKLES(SEQ ID NO：43)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO：44)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含以 下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS(SEQ ID NO：57)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO：58)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR(SEQ ID NO：59)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTAVTVSS(SEQ ID NO：60)之胺基酸序列。在其他情況中，抗HtrA1抗體包含以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO：61)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：62)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO：63)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：64)之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列。在一些情況中，抗HtrA1抗體為19B12(亦稱為m19B12)。
在另一實例中，本發明之抗HtrA1抗體包含抗體20E2輕及重鏈可變域(分別為SEQ ID NO：66及65)之一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO：66之Kabat胺基酸殘基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO：66之Kabat胺基酸殘基50-56，且HVR-L3序列包含SEQ ID NO：66之Kabat胺基酸殘基89-97；且(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO：65之Kabat胺基酸殘基31-35，HVR-H2序列包含SEQ ID NO：65之Kabat胺基酸殘基50-65，且HVR-H3序列包含SEQ ID NO：65之Kabat胺基酸殘基95-102，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與抗體20E2之以上HVR中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：65具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：65之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：66具有至少約90%序列一致 性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：66之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列。
在另一實例中，本發明之抗HtrA1抗體包含抗體3A5輕及重鏈可變域(分別為SEQ ID NO：68及67)之一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO：68之Kabat胺基酸殘基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO：68之Kabat胺基酸殘基50-56，且HVR-L3序列包含SEQ ID NO：68之Kabat胺基酸殘基89-97；且(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO：67之Kabat胺基酸殘基31-35，HVR-H2序列包含SEQ ID NO：67之Kabat胺基酸殘基50-65，且HVR-H3序列包含SEQ ID NO：67之Kabat胺基酸殘基95-102，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與抗體3A5之以上HVR中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：67具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：67之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：68具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：68之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列。
在另一實例中，本發明之抗HtrA1抗體包含抗體12A5輕及重鏈可變域(分別為SEQ ID NO：70及69)之一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO：70之Kabat胺基酸殘基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO：70之Kabat胺基酸殘基50-56，且HVR-L3序列包含SEQ ID NO：70之Kabat胺基酸殘基89-97；且(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO：69之Kabat胺基酸殘基31-35，HVR-H2序 列包含SEQ ID NO：69之Kabat胺基酸殘基50-65，且HVR-H3序列包含SEQ ID NO：69之Kabat胺基酸殘基95-102，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與抗體12A5之以上HVR中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：69具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：69之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：70具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：70之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列。
在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：21、23、76、77、78、93-101、106或107中之任一者具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：21、23、76、77、78、93-101、106或107中之任一者的序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：22、24、72-74、81-92、105或108中之任一者具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：22、24、72-74、81-92、105或108中之任一者的序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。例如，在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH 域，其包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。在一些情況 中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列。
在一些情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、三個或四個以下重鏈可變域構架區(FR)：(a)FR-H1，其包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2(SEQ ID NO：12)之胺基酸序列，其中X1為Lys或Thr且X2為Thr、Lys或Arg；(b)FR-H2，其包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO：13)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO：14)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：15)之胺基酸序列。在其他情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、三個或四個以下重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT(SEQ ID NO：25)之胺基酸序列；(b)FR-H2，其包含WVKQTPVHGLEWIG(SEQ ID NO：26)之胺基酸序列；(c)FR-H3，其包含KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR(SEQ ID NO：27)之胺基酸序列；及(d)FR-H4，其包含WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：28)之胺基酸序列。
在一些情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、三個或四個以下輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：19)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)之胺基酸序列。在其他情況中，任何前述抗HtrA1抗體可包含一個、兩個、 三個或四個以下輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO：29)之胺基酸序列；(b)FR-L2，其包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO：30)之胺基酸序列；(c)FR-L3，其包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO：31)之胺基酸序列；及(d)FR-L4，其包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：32)之胺基酸序列。
在一些情況中，抗HtrA1抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：45、55、65、67或69中之任一者具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：45、55、65、67或69中之任一者的序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：46、56、66、68或70中之任一者具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：46、56、66、68或70中之任一者的序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。例如，在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列。在一些情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列。
在一些情況中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列，諸如本文稱為APEG.LC3.HC3之抗體。
在一些情況中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序 列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，諸如本文稱為h19B6.v1之抗體。
在某些情況中，本發明提供與前述抗體中之任一者結合相同抗原決定基之抗HtrA1抗體。在一些情況中，本發明提供與前述抗體中之任一者競爭結合HtrA1之抗HtrA1抗體。
在某些實施例中，任何前述抗HtrA1抗體可具有一或多個以下特性：(i)以1可變域：HtrA1三聚體之1亞基之比率結合HtrA1(例如，Fab以3個Fab：1 HtrA1三聚體之比率結合HtrA1三聚體，且IgG以3個IgG：2個HtrA1三聚體之比率結合HtrA1三聚體)；(ii)對於包含兩個可變域之抗體，則以導致形成與美國專利申請公開案US 2013/0129743之圖9所示相似的「籠」之方式結合HtrA1；(iii)不防止形成HtrA1三聚體；(iv)與鼠類HtrA1交叉反應；(v)不與HtrA2、HtrA3及/或HtrA4交叉反應；(vi)與抗HtrA1抗體YW505.94.28a(參見例如WO 2013/055998)競爭性結合HtrA1；(vii)抑制HtrA1與al-抗胰蛋白酶(AlAT)之間形成複合物。在一些實施例中，本發明提供與任何前述抗體結合相同抗原決定基之抗體。
在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗HtrA1抗體可單一地或組合地併入任何特徵，如以下C部分「抗體特性及特徵」之1-8部分中所述。
B. 示例性抗因子D抗體
本發明提供可與本發明之抗HtrA1抗體一起使用的抗因子D抗體，例如在治療包括以下病症方法中：HtrA1相關病症、眼睛病症及/或補體相關病症(例如AMD(例如地圖狀萎縮))。本發明亦提供特異性結合HtrA1及因子D之多特異性(例如雙特異性)抗體(例如抗HtrA1/抗因子D抗體)。任何合適抗因子D抗體均可用於本發明之組合物及方法中。舉非限制性實例而言，本文及/或美國專利第8,067,002號、第8,268,310號、第8,273,352號及/或美國專利申請案第14/700,853號所述之任何抗因子D抗體均可用於本發明之組合物及方法中。
例如，在一些情況中，抗因子D抗體可包含與自寄存在美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)且命名為 HB12476之融合瘤產生的單株抗體166-32具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列或包含單株抗體166-32之序列。例如，在一些情況中，抗因子D抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：136具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：136之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：137具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：137之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。例如，在一些情況中，抗因子D抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列，諸如抗因子D單株抗體166-32。在一些情況中，抗因子D抗體為單株抗體166-32之人類化衍生物。在一些實施例中，抗因子D抗體與單株抗體166-32結合相同抗原決定基。在一些情況中，抗因子D抗體為自單株抗體166-32衍生之抗體片段。在一些情況中，自單株抗體166-32衍生之抗體片段為Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一些實施例中，自單株抗體166-32衍生之抗體片段為Fab。
在一些情況中，可在本發明之組合物及方法中採用單株抗體166-32之人類化衍生物。例如，描述於例如美國專利第8,067,002號中之單株抗體166-32的任何人類化衍生物可用於本發明之組合物及方法中。描述於美國專利第8,067,002號中之單株抗體166-32的示例性人類化衍生物包括例如人類化抗因子D抗體純系#111、#56、#250及#416。人類化抗因子D抗體純系#111、#56、#250及#416之VH及VL域的胺基酸序列例如示出在美國專利第8,067,002號之圖5中。在一些情況中，抗因子D抗體可包含與抗因子D抗體純系#111、#56、#250或#416具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序 列，或包含抗因子D抗體純系#111、#56、#250或#416之序列。
在一些情況中，經修飾或變異人類化抗因子D抗體及其片段可用於本發明之組合物及方法中。例如，描述於例如美國專利第8,273,352號中之任何修飾或變異形式之人類化抗因子D抗體純系#111可用於本發明之組合物及方法中，例如抗體純系238或238-1。在一些情況中，抗因子D抗體可包含與抗因子D抗體純系238或238-1具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含抗因子D抗體純系238或238-1之序列。
在一些情況中，抗因子D抗體或其抗原結合片段可包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：109-114中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。例如，在一些情況中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu。
例如，在一些情況中，抗因子D抗體或其抗原結合片段可包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列；或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：109、113或115-118中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性)。例如，在一些情況中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。
在一些情況中，抗因子D抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119、131或132中之任一者具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：119、131或132中之任一者的序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120、133、134或135中之任一者具有至少約90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：120、133、134或135中之任一者的序列；或(c)如(a)中之VH及如(b)中之VL。例如，在一些情 況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列。在其他情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列。在其他情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列。在其他情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：131之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列。在其他情況中，抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列。圖30中所示之任何抗因子D抗體或其變異體或其片段可用於本發明之組合物及方法中。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含VH域，其包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列。在一些情況中，抗因子D抗原結合抗體片段為CAS登錄號為1278466-20-8之拉姆帕力珠單抗。
在另一實例中，在一些情況中，抗因子D抗體為或衍生自20D12抗體，例如如美國專利第8,268,310號中所述。在一實例中，抗因子D抗體包含抗體20D12輕及重鏈可變域(分別為SEQ ID NO：128及127)之一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO：128之Kabat胺基酸殘基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO：128之Kabat胺基酸殘基50-56，且HVR-L3序列包含SEQ ID NO：128之Kabat胺基酸殘基89-97；且(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO：127之Kabat胺基酸殘基31-35，HVR-H2序列包含SEQ ID NO：127之Kabat胺基酸殘基50-65，且HVR-H3序列包含SEQ ID NO：127之Kabat胺基酸殘基95-102，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與抗體20D12之以上HVR中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
在一些情況中，抗因子D抗體包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：127具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：127之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：128具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：128之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。例如，在一些情況中，抗因子D抗體包含VH域，其包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：128，諸如抗因子D抗體20D12。在一些情況中，抗因子D抗體包含重鏈，其包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列及輕鏈，其包含SEQ ID NO：130之胺基酸序列。在一些情況中，抗因子D抗體為單株抗體20D12之人類化衍生物。在一些實施例中，抗因子D抗體與單株抗體20D12或其人類化衍生物結合相同抗體。在一些情況中，抗因子D抗體為自單株抗體20D12或其人類化衍生物衍生之抗體片段。在一些情況中，自單株抗體20D12或其人類化衍生物衍生之抗體片段為Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一些實施例中，自單株抗體20D12或其人類化衍生物衍生之抗體片段為Fab。
在一些情況中，任何前述抗因子D抗體之片段(例如抗原結合片段)可用於本發明之組合物及方法中。本發明之抗體片段可為例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、dAb、高變區(HVR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、小抗體、雙功能抗體或由抗體片段形成之多特異性抗體。在另一實施例中，可在本發明之組合物及方法中使用能夠滲透實質上所有視網膜之抗因子D抗體片段(例如抗原結合片段)。在甚至另一實施例中，可在本發明之組合物及方法中使用能夠滲透貫穿視網膜之整個厚度的抗因子D抗體片段(例如抗原結合片段)。
在一些情況中，本發明可包括人類化抗因子D抗體之用途，其中此等抗體之Fab片段在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物眼睛(例如人類)後具有至少3、5、7、10或12天之半衰期。在另一實施例中，本發明可包括人類化抗因子D抗體之用途，其中此等抗體之Fab片段在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物眼睛(例如人類)後抑制替代途徑(AP)補體活化達至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、 110或115天。在另一實施例中，本發明可包括人類化抗因子D抗體之用途，其中在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物眼睛(例如人類)後，此等抗體之Fab片段的抑制替代途徑(AP)補體活化之濃度在視網膜組織中維持至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85天。在另一實施例中，本發明可包括人類化抗因子D抗體之用途，其中在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物眼睛(例如人類)後，此等抗體之Fab片段的抑制替代途徑(AP)補體活化之濃度在玻璃體液中維持至少80、85、90、95、100、105、110或115天。在一實例中，本發明包括該抗因子D抗體之片段(例如抗原結合片段)的用途。
在一些情況中，任何前述抗因子D抗體均以單價形式結合因子D，其KD為約20nM或以下(例如，抗體呈Fab片段與因子D之KD)。在一些情況中，本文提供之抗體以單價形式結合因子D，其KD為約10nM或以下。在一些情況中，本文提供之抗體以單價形式結合因子D，其KD為約5nM或以下。在一些情況中，本文提供之抗體以單價形式結合因子D，其KD為約2nM或以下。例如，在一些情況中，抗體以單價形式結合因子D，其KD介於約0.5pM與約2nM(例如約0.5pM、約1pM、約2pM、約3pM、約4pM、約5pM、約6pM、約7pM、約8pM、約9pM、約10pM、約15pM、約20pM、約25pM、約50pM、約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM、約625pM、約650pM、約675pM、約700pM、約725pM、約750pM、約775pM、約800pM、約825pM、約850pM、約875pM、約900pM、約925pM、約950pM、約975pM、約1nM、約1.1nM、約1.2nM、約1.3nM、約1.4nM、約1.5nM、約1.6nM、約1.7nM、約1.8nM、約1.9nM或約2nM)之間。在一些情況中，抗體以單價形式結合因子D，其KD介於約0.5pM與約100pM之間。在一些情況中，抗體以單價形式結合因子D，其KD為約0.5pM。在一些情況中，抗體以單價形式結合因子D，其KD為約10pM以下。
在一些情況中，任何前述抗因子D抗體以二價形式結合因子D，其KD為約10nM或以下(例如，呈IgG之抗體與因子D的KD)。在一些情況中，本文提供之抗體以二價形式結合因子D，其KD為約5nM或以下。在一些情況中，本文提供之抗體以二價形式結合因子D，其KD為約2nM或以下。例如，在一些情況中，抗體以二價形式結合因子D，其KD介於約0.5pM與約2nM(例如約0.5pM、約1pM、約2pM、約3pM、約4pM、約5pM、約6pM、約7pM、約8pM、約9pM、約10pM、約15pM、約20pM、約25pM、約50pM、約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM、約625pM、約650pM、約675pM、約700pM、約725pM、約750pM、約775pM、約800pM、約825pM、約850pM、約875pM、約900pM、約925pM、約950pM、約975pM、約1nM、約1.1nM、約1.2nM、約1.3nM、約1.4nM、約1.5nM、約1.6nM、約1.7nM、約1.8nM、約1.9nM或約2nM)之間。在一些情況中，抗體以二價形式結合因子D，其KD介於約0.5pM與約100pM之間。在一些情況中，抗體以二價形式結合因子D，其KD為約0.5pM。在一些情況中，抗體以二價形式結合因子D，其KD為約10pM以下。
在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗因子D抗體可單一地或組合地併入任何特徵，如以下C部分「抗體特性及特徵」之1-8部分中所述。
C. 抗體特性及特徵
本文所述之抗體(例如，如以上所述之抗HtrA1抗體及抗因子D抗體以及以下所述之抗HtrA1/抗因子D抗體)以及用於本文所述之方法的任何抗體可單一地或組合地具有以下1-8部分中所述之任何特徵。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體(例如抗HtrA1抗體、抗因子D抗體或雙特異性抗HtrA1抗因子D抗體)的解離常數(KD)為
Figure 105135184-A0202-12-0069-344
1μM、
Figure 105135184-A0202-12-0070-324
100nM、
Figure 105135184-A0202-12-0070-325
10nM、
Figure 105135184-A0202-12-0070-327
1nM、
Figure 105135184-A0202-12-0070-328
0.1nM、
Figure 105135184-A0202-12-0070-329
0.01nM或
Figure 105135184-A0202-12-0070-333
0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。例如，在一些情況中，本文提供之抗體結合人類HtrA1(huHtrA1)，其KD為約10nM或以下。在一些情況中，本文提供之抗體結合HtrA1(huHtrA1)，其KD為約5nM或以下。在一些情況中，本文提供之抗體結合HtrA1(huHtrA1)，其KD為約2nM或以下。例如，在一些情況中，抗體結合huHtrA1，其KD介於約25pM與約2nM之間(例如約25pM、約50pM、約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM、約625pM、約650pM、約675pM、約700pM、約725pM、約750pM、約775pM、約800pM、約825pM、約850pM、約875pM、約900pM、約925pM、約950pM、約975pM、約1nM、約1.1nM、約1.2nM、約1.3nM、約1.4nM、約1.5nM、約1.6nM、約1.7nM、約1.8nM、約1.9nM或約2nM)。在一些情況中，抗體結合huHtrA1，其KD介於約75pM與約600pM之間(例如約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM)。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD介於約75pM與約500pM之間。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD介於約75pM與約400pM之間。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD介於約75pM與約300pM之間。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD介於約75pM與約200pM之間。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD介於約75pM與約150pM之間。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD介於約75pM與約125pM之間。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD介於約75pM與約100pM之間。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD為約80pM。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD為約60pM。在一些情況中，抗體結合huHtrA1之KD為約40pM。
在一實施例中，藉由放射標記之抗原結合分析(RIA)量測KD。在一實施例中，以Fab形式之相關抗體及其抗原進行RIA。例如，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由在一滴定系列之未標記抗原存在下，使Fab與最小濃度之(125I)標記抗原平衡，接著用抗Fab抗體塗佈之板捕捉所結合抗原來量測(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)之50mM碳酸鈉(pH 9.6)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷2-5小時。在非吸附板(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體Fab-12之評定一致)。接著將相關Fab培育隔夜；然而，培育可持續較長時期(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉板中以在室溫下培育(例如1小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS將板洗滌八次。當板已乾燥時，每孔添加150μl閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對板持續10分鐘計數。選擇各Fab之達成小於或等於最大結合之20%的濃度以用於競爭性結合分析中。
根據另一實施例，使用BIACORE®表面電漿共振(SPR)分析量測KD。例如，在25℃下以固定抗原CM5晶片在約10反應單位(RU)下使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)進行分析。在一實施例中，根據供應商說明書用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore公司)。在注射前，以5μl/分鐘之流速用10mM乙酸鈉pH 4.8稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)，以達成大約10反應單位(RU)之偶聯蛋白。在注射抗原之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動力學量測，在25℃下以大約25μl/min之流速，注射Fab在含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN®-20)界面活性劑(PBST)之PBS中之2倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。藉由同時擬合締合及解離感測圖(sensorgram)，使用簡單一對一朗繆爾結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)計算締合速 率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)計算為比率koff/kon。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若由以上表面電漿子共振分析獲得之締合速率超過106M-1 s-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術量測在如在分光計(諸如停流配備分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色皿之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中量測之遞增濃度之抗原存在下，在25℃下於PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的增加或降低。KD亦可使用BIACORE® SPR分析量測，如以下實例中所述。
2. 抗體穩定性
本發明提供穩定性增強之抗體，例如如與參考抗HtrA1抗體相比。抗體穩定性可使用此項技術中已知之任何方法來測定，例如光譜法(例如質譜法)、差示掃描螢光測定法(DSF)、圓偏光二色光譜法(CD)、固有蛋白螢光、差示掃描量熱法、光散射(例如動態光散射(DLS)及靜態光散射(SLS))、自相互作用層析法(SIC)。與參考抗HtrA1抗體相比，抗HtrA1抗體可具有例如提高之熔解溫度(Tm)、聚集溫度(Tagg)或其他穩定性度量。
本發明提供與參考抗HtrA1抗體相比脫醯胺基作用降低之抗體。可如本文所述及/或使用此項技術中已知之方法來降低或防止脫醯胺基作用。本發明亦提供氧化降低之抗體(例如色胺酸氧化，例如在位置LC-W91處)，例如如與參考抗HtrA1抗體相比。可如本文所述及/或使用此項技術中已知之方法來降低或防止氧化(例如色胺酸氧化)。本發明亦提供異構化降低之抗體，例如如與參考抗HtrA1抗體相比。可如本文所述及/或使用此項技術中已知之方法來降低或防止異構化。
3. 抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下述其他片段。對於某些抗體片段之評述，參見Hudson等人.Nat.Med.9：129-134(2003)中。對於scFv片段之評述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，(Springer-Verlag,New York)， 第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。對於包含結合抗原決定基殘基之補救受體且活體內半衰期增加之Fab及F(ab')2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或全部或一部分輕鏈可變域之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術製備，包括但不限於蛋白水解消化完整抗體以及如本文所述，藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
在一些情況中，本文提供之抗體(例如抗HtrA1抗體)為Fab。在一些實施例中，Fab包含處於重鏈恆定區之鉸鏈區(例如上鉸鏈)中的截短。在一些實施例中，Fab重鏈恆定區終止於位置221(EU編號)處。在一些實施例中，位置221處之胺基酸殘基為天冬胺酸殘基(D221)。在一些實施例中，Fab之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO：156之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，Fab為IgG1 Fab。
在一些情況中，Fab結合HtrA1且可包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG (SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列；或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：3或7-11中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。在一些情況中，此Fab包含處於重鏈恆定區之鉸鏈區(例如上鉸鏈)中的截短。在一些實施例中，Fab重鏈恆定區終止於位置221(EU編號)處。在一些實施例中，位置221處之胺基酸殘基為Asp(D221)。在一些實施例中，Fab之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO：156之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。在一些情況中，Fab包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)，且進一步包含重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。
在一些情況中，Fab結合HtrA1且包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：21之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：22之序列；及(c)處於重鏈恆定區之鉸鏈區(例如上鉸鏈)中的截短。在一些實施例中，Fab重鏈恆定區終止於位置221(EU編號)處。在一些實施例中，位置221處之胺基酸殘基為Asp(D221)。在一些實施例中，Fab之重鏈恆定區包含與SEQ ID NO：156之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。
在一些情況中，Fab結合HtrA1且包含(a)VH域，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)VL域，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及(c)重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。
4. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體例如描述於美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中。在一實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類發生改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中例如CDR之HVR(或其部分)源於非人類抗體，且FR(或其部分)源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含至少一部分人類恆定區。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法評述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重整」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「引導選擇」法)中。
可用於人類化之人類構架區包括但不限於：使用「最佳擬合」法選擇之構架區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；源於輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人.J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及由篩檢FR文庫獲得之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
5. 人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體一般性地描述於van Dijk等人，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向已經修改以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體之轉殖基因動物投與免疫原來製備。此等動物通常含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座，其置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物之染色體中。在此等轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已不活化。對於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法之評述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術之美國 專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號，及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號)。來自由此等動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如描述於美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中之方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離自人類來源噬菌體呈現文庫選擇之Fv純系可變域序列來產生。此等可變域序列可接著與所要人類恆定域組合。用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術在以下描述。
6. 文庫來源之抗體
本發明之抗體可藉由篩檢組合文庫中具有一或多種所要活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知多種用於產生噬菌體呈現文庫及篩檢此等文庫中具有所要結合特徵之抗體之方法。此等方法評述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J. Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖VH及VL基因之譜系且隨機重組於噬菌體文庫中，可接著篩檢該等文庫中之抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常呈現呈單鏈Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式之抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供對免疫原具有高親和力之抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖(例如自人類選殖)天然譜系以提供單一來源之針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原的抗體而不進行任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)中所述。最後，天然文庫亦可藉由以下方式合成製備：自幹細胞選殖未重排V基因區段，及使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變CDR3區及在活體外達成重排，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)中所述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如美國專利第5,750,373號，及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中被視為人類抗體或人類抗體片段。
7. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合HtrA1之兩個不同抗原決定基。在某些實施例中，一結合特異性係針對HtrA1且另一係針對任何其他抗原(例如第二生物分子，例如因子D)。因此，雙特異性抗體可對HtrA1及因子D具有結合特異性。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。本文所述之任何抗HtrA1抗體可用於將多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、例如抗HtrA1/抗因子D雙特異性抗體工程改造。本文所述及/或此項技術中已 知之任何抗因子D抗體可用於將抗HtrA1/抗因子D雙特異性抗體工程改造。
例如，在一些情況中，包含特異性結合HtrA1之包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之高變區(HVR)的第一結合域之雙特異性抗HtrA1抗體：(a)HVR-H1，其包含DSEX1H(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列，其中X1為Met或Leu；(b)HVR-H2，其包含GVDPETX1GAAYNQKFKG(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列，其中X1為Glu或Asp；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVX3FIH(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列，其中X3為Glu或Asn；(e)HVR-L2，其包含ATSX4LAS(SEQ ID NO：5)之胺基酸序列，其中X4為Asn、His或Glu；及(f)HVR-L3，其包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO：6)之胺基酸序列，其中X5為Ser或Tyr且X6為Ala或Asn，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：1-6中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)，可具有結合至因子D之第二結合域。特異性結合因子D之該第二結合域可例如包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu，或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：109-114中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)。
例如，在一些情況中，包含特異性結合HtrA1之包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之高變區(HVR)的第一結合域之雙特異性抗HtrA1抗體：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列；或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：3或7-11中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)，可具有結合因子D之第二結合域。特異性結合因子D之該第二結合域可例如包含至少一個、兩個、三個、四個、五個、或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列；或以上HVR中之一或多個與其一或多個變異體的組合，該或該等變異體與SEQ ID NO：109、113或115-118中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性)。
在特定實施例中，本發明提供特異性結合HtrA1與因子D之雙特異性抗HtrA1抗體，其中該抗體包含第一結合域，其特異性結合HtrA1且包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸 序列；(e)HVR-L2，其包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列；及第二結合域，其特異性結合因子D且包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。在一些情況中，第二結合域包含抗因子D抗原結合抗體片段拉姆帕力珠單抗之一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR。
在一些情況中，雙特異性抗HtrA1抗體包含第一結合域，其特異性結合包含以下之HtrA1：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：21具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：21之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：22具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：22之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域，諸如APEG.LC3.HC3，且可具有結合因子D之第二結合域。特異性結合因子D之第二結合域可例如包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：119之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：120之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些情況中，特異性 結合因子D之第二結合域可包含(a)VH域，與抗因子D抗原結合抗體片段拉姆帕力珠單抗具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含抗因子D抗原結合抗體片段拉姆帕力珠單抗之序列；(b)VL域，其包含與抗因子D抗原結合抗體片段拉姆帕力珠單抗具有至少約80%序列一致性(例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，或包含抗因子D抗原結合抗體片段拉姆帕力珠單抗之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性之兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「孔中鈕(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下進行製備：工程改造靜電操控效應以製備抗體Fc-雜二聚分子(WO2009/089004A1)；交聯兩個或更多個抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈來產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術以製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如，Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述製備三特異性抗體。
經工程改造具有三個或三個以上抗原結合位點之抗體，包括「章魚抗體」亦包括在本文中(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括「雙重作用性FAb」或「DAF」，其包含結合HtrA1以及另一不同抗原之抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820)。
8. 抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體的胺基酸序列變異體(例如，包含一或多個胺基酸殘基改變之抗體變異體)。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物性質。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合性。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代性突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代示於表1中之標題「較佳取代」下。更實質性變化提供於表1中之標題「示例性取代」下，且如以下關於胺基酸側鏈類別進一步所述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩檢具有所要活性(例如維持/改良之抗原結合性、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)之產物。
Figure 105135184-A0202-12-0083-1
Figure 105135184-A0202-12-0084-2
可根據共同側鏈性質對胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別之一之成員更換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基殘基及/或FR殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得一種或多種變異體相對於親本抗體將在某些生物性質方面具有改變(例如改良)(例如親和力增加、穩定性增加、表現增加、PI改變及/或免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物性質。一示例性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述者)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且使變異型抗體呈現在噬菌體上且針對特定生物活性(例如結合親和力)加以篩檢。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經受突變之密碼子編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008)及/ 或接觸抗原之殘基)中進行此等改變，且測試所得變異型VH或VL之結合親和力。藉由構築且自二級文庫重新選擇之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人.Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一者將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩檢文庫以識別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特異性識別抗原結合中涉及之HVR殘基。特定言之，通常以HVR-H3及HVR-L3為標靶。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文提供之保守性取代)。此等改變可例如在HVR中抗原接觸殘基之外部。在以上提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個FR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。此等改變可例如改良抗體親和力及/或穩定性(例如，如藉由熔解溫度增加所評定)。
待修飾之構架區殘基或HVR區殘基之實例包括可能的脫醯胺基作用位點(亦即天冬醯胺(N或Asn))、氧化位點(亦即甲硫胺酸(M或Met)或色胺酸(W或Trp))或焦麩胺酸轉化位點(亦即麩胺醯胺(Q或Gln))，其中此等位點之修飾分別防止或降低脫醯胺基作用及/或氧化及/或焦麩胺酸轉化。
為防止或降低脫醯胺基化變異體形成，可使天冬醯胺(N或Asn)突變成丙胺酸(A或Ala)、麩胺醯胺(Q或Gln)或絲胺酸(S或Ser)。為防止或降低氧化變異體形成，可使甲硫胺酸(Met)或色胺酸(W或Trp)突變成白胺酸(L)或異白胺酸(I)。為防止或降低焦麩胺酸變異體形成，可使麩胺醯胺(Q或Gln)突變成麩胺酸(E或Glu)。參見例如，Amphlett等人，Pharm.Biotechn ol.,9：1-140,1996。或者或另外，構架區殘基之一或多種改變(例如取代)可處於親本抗體之Fc區中。
一種適用於識別抗體之可作為突變誘發標靶之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，識別某一殘基或一組標靶殘基(例如帶電荷殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置上引入進一步取代。或者或另外，使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選物而靶向或消除。可篩檢變異體以確定其是否含有所要性質。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽之範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合、以及具有單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與增加抗體之血清半衰期之酶(例如用於ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，改變本文提供之抗體以增加或降低抗體糖基化之程度。對抗體添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得產生或移除一或多個糖基化位點來便利地達成。
當抗體包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含通常藉由N-鍵聯連接於Fc區之CH2域之Asn297的分支雙觸角寡醣。參見例如，Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸、以及連接於雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質之抗體變異體。
在一實施例中，提供具有缺乏(直接或間接)連接於Fc區之海藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，海藻糖在此抗體中之 量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，藉由相對於連接於Asn297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)之總和計算Asn297上之糖鏈內海藻糖的平均量來測定海藻糖之量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中約位置297(Fc區殘基之Eu編號)上之天冬醯胺殘基；然而，Asn297亦可由於抗體中之微小序列變化而位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即在位置294與300之間。此等海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號；US 2004/0093621。與「去海藻糖基化」或「海藻糖缺乏」抗體變異體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人.J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化作用之Lec13 CHO細胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其實例11)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡醣之抗體變異體，例如其中連接於抗體之Fc區之雙觸角寡醣係由GlcNAc二等分。此等抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此等抗體變異體之實例例如描述於WO 2003/011878；美國專利第6,602,684號；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在連接於Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改良之CDC功能。此等抗體變異體例如描述於WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置上包含胺基酸殘基改變(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，該等效應功能使該抗體變異體成為抗體之活體內半衰期較為重要但某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用所需要的候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/去除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合性(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概括於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁上之表3中。
用以評定相關分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號中(參見例如Hellstrom,I.等人.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；及Bruggemann等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可採用非放射性分析方法，(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司Mountain View,CA)；及CYTOTOX 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。適用於此等分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，相關分子之ADCC活性可例如在動物模型，諸如Clynes等人.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭露之動物模型中進行活體內評定。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg等人，Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法對FcRn結合 及活體內清除率/半衰期進行測定(參見例如Petkova等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代成丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合改良或削弱之某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代(例如在Fc區之位置298、333及/或334(EU殘基編號)處之取代)之Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行導致C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或削弱)之改變，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人.J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
半衰期增加且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等Fc變異體包括在以下一或多個Fc區殘基處具有取代之變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351，涉及Fc區變異體之其他實例。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例 如「硫基單抗(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位在抗體之可及位點處且可用於使抗體結合於其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)以產生免疫結合物，如本文進一步所述。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生半胱胺酸工程改造抗體。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且容易獲得之其他非蛋白質部分。適於使抗體衍生化之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可分支或未分支。連接於抗體之聚合物之數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括但不限於欲改良之抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將在確定條件下用於療法中以及其類似考慮因素加以確定。
可使用用於用聚合物使抗體衍生化之任何合適技術製備抗體-聚合物結合物。應理解本發明不限於在抗體或抗體片段與聚合物之間利用任何特定類型之鍵聯的結合物。
在一態樣中，本發明之結合物包括其中聚合物共價附接至親本抗體上之一或多個特定位點之種類，亦即，聚合物附接靶向親本抗體或抗體片段內之特定區域或一或多個特定胺基酸殘基。聚合物之位點特異性結合最通常藉由附接至親本抗體或抗體片段內之半胱胺酸殘基來實現。在 此等實施例中，偶聯化學可例如利用親本抗體中不處於二硫橋中之半胱胺酸殘基之自由巰基。聚合物可經能夠特定地與親本抗體上之一或多個自由巰基或硫醇基團反應之任何官能基活化，諸如馬來醯亞胺、巰基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、環氧乙烷及5-吡啶基官能基。聚合物可使用適用於所選擇偶聯系統化學之任何方案偶聯至親本抗體，諸如美國專利第4,179,337號及第7,122,636號及Jevsevar等人，Biotech.J.5：113-128,2010中所述之方案及系統。
在一實施例中，天然存在於親本抗體中之一或多個半胱胺酸殘基用作聚合物結合之附接位點。在另一實施例中，一或多個半胱胺酸殘基經工程改造至親本抗體中之一或多個所選擇位點中，用於為聚合物提供一或多個特定附接位元元點目的。
在一態樣中，本發明涵蓋抗體片段-聚合物結合物，其中該抗體片段為Fab，且聚合物經附接至Fab片段之輕鏈或重鏈中的通常將形成連接輕鏈及重鏈之鏈間二硫鍵之一或多個半胱胺酸殘基。
在另一態樣中，本發明涵蓋抗體片段-聚合物結合物，其中該抗體片段為Fab’，且使聚合物附接靶向Fab’片段之鉸鏈區。在一實施例中，天然存在於抗體片段之鉸鏈區中的一或多個半胱胺酸殘基用於附接聚合物。在另一實施例中，一或多個半胱胺酸殘基經工程改造至Fab’片段之鉸鏈區中，用於為聚合物提供一或多個特定附接位元元點目的。在一實施例中，藉由在C’-末端添加一個半胱胺酸，用於為聚合物結合提供一個附接位元元點目的，來修飾本發明之Fab片段(例如抗HtrA1 Fab片段、抗因子D Fab片段或抗HtrA1/抗因子D Fab片段)。在另一實施例中，藉由在C’末端添加四個其他殘基Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：122)，用於為聚合物結合提供兩個附接位元元點目的，來修飾本發明之Fab片段。
一種常用抗體結合為PEG化，其中一或多種聚乙二醇(PEG)聚合物經共價附接至抗體之恆定區。參見美國專利第4,179,337號及第7,122,636號。在本領域中已知且廣泛使用不同大小(例如約500D至約300,000D)及形狀(例如線性或分枝)之PEG聚合物。適用於本發明之聚合物可商購獲得(例如自Nippon Oil and Fats；Nektar Therapeutics；Creative PEGWorks)或自可商購獲得之起始材料使用習知化學程式製備。PEG化改變抗體藥物之物理及化學特性，且會導致改良之藥物代謝動力學行為，諸如改良之穩定性、降低之免疫原性、延長之循环壽命以及增加之滯留時間。在另一實施例中，本文所述之抗體(例如本發明之抗HtrA1抗體)可結合至透明質酸(HA)。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由曝露於輻射而選擇性加熱之非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，且包括但不限於不損害普通細胞但會將非蛋白質部分加熱至鄰近於抗體-非蛋白質部分之細胞被殺死之溫度的波長。
f)等電點變異體
本發明提供等電點改變之抗體變異體。例如，本發明提供等電點(pI)降低之抗體變異體，例如如與參考抗HtrA1抗體相比。在一些情況中，表面電荷在生理pH下降低。在一些情況中，抗HtrA1抗體具有等於或小於約8(例如約8、約7、約6、約5或約4)之pI。在一些情況中，抗體具有約4至約8(例如約4、約5、約6、約7或約8)之pI。在一些情況中，抗HtrA1抗體具有約5至約7(例如約5、約6或約7)之pI。在一些情況中，抗HtrA1抗體具有約5至約6(例如約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9或約6)之pI。
本發明之抗體可經工程改造以具有降低之pI，例如藉由用具有較低pI之胺基酸取代既定位置處之野生型胺基酸殘基。可基於胺基酸之在此項技術中已知的胺(-NH2)、羧酸(-COOH)及側鏈之pKa值測定胺基酸之pI。在一些實施例中，可取代表面暴露之胺基酸殘基以降低抗體之pI。在一實施例中，可用麩胺酸(E)取代表面暴露之胺基酸殘基。在一實施例中，可用天冬胺酸(D)取代表面暴露之胺基酸殘基。
D. 重組方法及組合物
可使用例如如美國專利第4,816,567號中所述之重組方法及組合物產生本文描述之任何抗體(例如抗HtrA1抗體)。在一實施例中，提供編碼本文所述之抗HtrA1抗體之經分離核酸。此核酸可編碼包含抗體之VL 之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供一種包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含(例如已用以下轉型)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸之載體，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列的核酸之第一載體及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸之第二載體。在一實施例中，宿主細胞為真核的，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一實施例中，提供一種製備抗HtrA1抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如以上提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
對於重組產生抗HtrA1抗體，分離編碼例如如上所述之抗體之核酸且將其插入一或多種載體中以用於進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。此核酸可易於使用習知程式(例如藉由使用能夠特異性結合編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)進行分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼性載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，特定言之當不需要糖基化及Fc效應功能時。對於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，描述抗體片段在大腸桿菌中之表現。表現後，抗體可以可溶性部分自細菌細胞糊分離，且可進一步純化。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為適於抗體編碼性載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之抗體之真菌及酵母菌株。參見Ge rngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別 眾多可連同昆蟲細胞一起使用之桿狀病毒株，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，適合於懸浮生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎株(293或293細胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述)；小倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞爾托利細胞(TM4細胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所描述；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺癌腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。對於適於抗體製造之某些哺乳動物宿主細胞株之評述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
E. 分析
可藉由此項技術中已知之各種分析來鑑別、篩檢或表徵本文提供之抗HtrA1抗體(例如，抗HtrA1抗體及抗HtrA1/抗因子D抗體)。
1. 結合分析及其他分析
在一態樣中，例如藉由已知方法，諸如ELISA、西方墨點法、表面電漿共振分析(例如BIACORE®)等測試本發明抗體之抗原結合活性。
在一態樣中，使用BIACORE®表面電漿共振(SPR)分析量測抗原結合活性(例如，如藉由KD所指示)。例如，在25℃下以固定抗原CM5晶片在約10反應單位(RU)下使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000 (BIAcore公司，Piscataway,NJ)進行分析。在一實施例中，根據供應商說明書用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore公司)。在注射前，以5μl/分鐘之流速用10mM乙酸鈉pH 4.8稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)，以達成大約10反應單位(RU)之偶聯蛋白。在注射抗原之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動力學量測，在25℃下以大約25μl/min之流速，注射Fab在含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN®-20)界面活性劑之PBS(PBST)中之2倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。藉由同時擬合締合及解離感測圖(sensorgram)，使用簡單一對一朗繆爾結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)計算為比率koff/kon。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若由以上表面電漿子共振分析獲得之締合速率超過106M-1 s-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術量測在如在分光計(諸如停流配備分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色皿之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中量測，在遞增濃度之抗原存在下，在25℃下於PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的增加或降低。KD亦可使用BIACORE® SPR分析量測，如以下實例中所述。
在另一態樣中，競爭分析可用於鑑別與本文所述之抗體競爭結合HtrA1之抗體。在某些實施例中，該種競爭性抗體結合由本文所述之抗體所結合之同一抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。定位抗體所結合之抗原決定基之詳述示例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols，」見Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一示例性競爭分析中，在包含結合HtrA1之第一經標記抗體及第二未標記抗體(將測試其與該第一抗體競爭結合於HtrA1之能力)的溶液中培育經固定之HtrA1。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體而無第二未標記抗體之溶液中培育經固定HtrA1。在容許第一抗體結合HtrA1之條件下培育之後，移除過量未結合抗 體，且量測與經固定HtrA1締合之標記之量。若相對於對照樣品，與經固定HtrA1締合之標記之量在測試樣品中實質上降低，則指示第二抗體與第一抗體競爭結合HtrA1。參見Harlovw及Lane(1988)Antiboaies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2. 活性分析
在一態樣中，提供用於鑑定具有生物活性之抗HtrA1抗體的分析。生物活性可包括例如抑制、阻斷、拮抗、壓制、干擾、調節及/或降低HtrA1之一或多種生物活性。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明抗體之此生物活性。在某些實施例中，抗HtrA1抗體結合至HtrA1且降低或抑制其對一或多種HtrA1受質之絲胺酸蛋白酶活性，該或該等受質包括例如H2-Opt受質、如以下實例中所述之α-酪蛋白、β-酪蛋白或BODIPY® FL酪蛋白受質，或任何其他合適HtrA1受質。在某些實施例中，抗HtrA1抗體抑制針對一或多種HtrA1受質之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性，其IC50小於50nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、3nM、2.5nM、2nM、1nM、800pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM或以下。在某些實施例中，抗HtrA1抗體在眼睛疾病模型中保護感光細胞免於退化、保護外核層之厚度或保護視網膜電圖功能活性，該模型諸如U.S.2013/0129743之實例10中所述的恆定光曝露小鼠模型。
為測定抗因子D抗體或其變異體或片段(例如抗原結合片段)是否能夠結合至因子D且施加生物作用，例如抑制替代途徑溶血，可使用使用兔紅血球細胞(RBC)之溶血抑制分析，包括美國專利第8,273,352號之實例2中所述之彼等，該專利係以引用方式全部併入本文中。可使用標準分析(Kostavasili等人，J.Immunology 158：1763-72,1997；Wiesmann等人，Nature 444：159-60,2006)測定此溶血抑制。可用血清或血漿起始此等分析中之補體活化。血清或血漿中適當濃度之因子D(Pascual等人，Kidney International 34：529-536,1998；Complement Facts Book,Bernard J.Morley及Mark J.Walport編輯，Academic Press(2000)；Barnum等人，J. Immunol.Methods,67：303-309,1984)可根據此項技術中已知之方法例行測定，該等方法包括已描述於參考文獻中之彼等，該等參考文獻諸如Pascual等人(同上)及Barnum等人(同上)及美國專利第8,273,352號之實例4。本文所述之抗因子D抗體通常能夠抑制與因子D相關之生物活性。例如，在18μg/ml(等於血液中人類因子D莫耳濃度之約1.5倍；抗因子D抗體與因子D之莫耳比為約1.5：1)之濃度下，可觀察到抗體對替代補體活性之顯著抑制抗體(參見例如，美國專利第6,956,107號)。
3. 穩定性分析
在一態樣中，提供用於測定抗HtrA1抗體之穩定性(例如熱穩定性)之分析。例如，抗體穩定性可使用此項技術中已知之任何方法來測定，例如差示掃描螢光測定法(DSF)、圓偏光二色光譜法(CD)、固有蛋白螢光、差示掃描量熱法、光譜法、光散射(例如動態光散射(DLS)及靜態光散射(SLS))、自相互作用層析法(SIC)。例如在AAPH應激測試及/或熱應激測試之背景下，可如本文所述，例如使用如例如實例4中所述之質譜法測定分析之穩定性。
F. 用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文提供之任何抗HtrA1抗體均適用於偵測生物樣品中HtrA1之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如包含以下各物之樣品：感光細胞、視網膜色素上皮細胞、外核層細胞、內核層、Muller細胞、睫狀上皮或視網膜組織。在一些實施例中，生物樣品包含體液，例如玻璃體液或血液。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法中之抗HtrA1抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣品中HtrA1之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗HtrA1抗體在容許該抗HtrA1抗體結合HtrA1之條件下接觸，及偵測在該抗HtrA1抗體與HtrA1之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一實施例中，抗HtrA1抗體用於選擇適於用抗HtrA1抗體治療之個體，例如當HtrA1為用於選擇患者之生物標記時。
在某些實施例中，可藉由偵測HtrA1基因或HtrA1對照序列中之一種或多種多態現象、諸如HtrA1啟動子多態現象rs11200638(G/A)鑑定適於用抗HtrA1抗體治療之患者(參見例如DeWan等人，Science 314：989-992,2006，其係以引用方式全部併入本文中)。
可使用本發明抗體診斷之示例性病症包括(但不限於)HtrA相關病症、眼睛病症、補體相關病症及先兆子癇。在一些情況中，眼睛病症包括(但不限於)例如AMD，包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如，地圖狀萎縮(GA))、糖尿病視網膜病變(DR)、早產兒視網膜病變(ROP)或息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)。
在一些實施例中，先兆子癇可使用本發明抗體進行診斷。在一些實施例中，相對於HtrA1參考水準源自個體之樣品中HtrA1水準增加可指示個體患有或易感先兆子癇。參見例如，Teoh等人.Placenta 36(9)：990-995,2015。在一些實施例中，血清HtrA1水準可使用本發明抗體進行偵測。在其他實施例中，胎盤HtrA1水準可使用本發明抗體進行偵測。
在某些實施例中，提供經標記之抗HtrA1抗體。標記包括但不限於可直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子密集標記、化學發光標記及放射性標記)以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配體。示例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I，螢光團(諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基、傘形酮(umbelliferone)、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素(luciferin)、2,3-二氫呔嗪二酮、辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)，與採用過氧化氫以氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶(lactoperoxidase)或微過氧化酶(microperoxidase))偶聯之雜環氧化酶(諸如尿酸酶(uricase)及黃嘌呤氧化酶)，生物素/抗生蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及其類似標記。
在本發明之另一實施例中，抗體不需標記，且其存在可使用 結合至抗體之經標記抗體進行偵測。
本發明之抗體可用於任何已知分析法中，諸如競爭性結合分析、直接及間接夾心分析以及免疫沈澱分析。Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press,Inc.1987)。
競爭性結合分析依賴於經標記標準物與測試樣品分析物競爭結合有限量之抗體的能力。測試樣品中抗原之量與變得結合至抗體之標準物的量成反比。為促進測定變得結合之標準物之量，通常在競爭之前或之後使抗體不溶，使得結合至抗體之標準物及分析物可便利地與保持未結合之標準物及分析物分離。
夾心分析涉及使用兩種抗體，各自能夠結合至待偵測蛋白之不同免疫原性部分或抗原決定基。在夾心分析中，固定在固體支撐物上之第一抗體結合測試樣品分析物，且之後第二抗體結合至分析物，因此形成不可溶性三部分複合物。參見例如美國專利第4,376,110號。第二抗體本身可經可檢測部分標記(直接夾心分析)或可使用經可檢測部分標記之抗免疫球蛋白抗體量測(間接夾心分析)。例如，一種類型之夾心分析為ELISA分析，在此情況下，可檢測部分為酶。
對於免疫組織化學，樣品可為新鮮或冷凍的，或可包埋於石蠟中且經諸如例如福馬林之防腐劑固定。
G. 診斷套組
為方便起見，可在套組中提供本發明之抗體(例如抗HtrA1抗體或抗HtrA1/抗因子D抗體)，例如預定量之試劑與用於進行診斷分析之說明書之經包裝組合。若抗體經酶標記，則試劑盒將包含酶所需之受質及輔因子(例如提供可偵測發色團或螢光團之受質前體)。另外，可包含其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或裂解緩衝液)及其類似者。各種試劑之相對量可廣泛變化，以提供試劑在溶液中之實質上使分析之靈敏度最佳化之濃度。特定言之，試劑可提供為乾粉，通常凍乾之乾粉，包括溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液之賦形劑。
H. 醫藥調配物
可藉由混合具有所需純度之多肽與視情況存在之「醫藥學上 可接受之」在此項技術中典型採用的載劑、賦形劑或穩定劑(其均稱為「賦形劑」)，製備抗體或其抗體變異體(例如本發明之抗HtrA1抗體或抗HtrA1/抗因子D抗體)之治療性調配物，用於作為凍乾調配物或水性溶液儲存。例如，緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子型清潔劑、抗氧化劑及其他各種添加劑。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，A.Osol編.(1980)。此等添加劑在所用劑量及濃度下須對接受者無毒。
緩衝劑幫助維持pH在接近生理條件之範圍內。其較佳存在之濃度範圍為約2mM至約50mM。用於本發明之合適緩衝劑包括有機與無機酸及其鹽，諸如檸檬酸鹽緩衝液(例如，檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)；丁二酸鹽緩衝液(例如丁二酸-丁二酸單鈉混合物、丁二酸-氫氧化鈉混合物、丁二酸-丁二酸二鈉混合物等)；酒石酸鹽緩衝液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)；反丁烯二酸鹽緩衝液(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸單鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸單鈉-反丁烯二酸二鈉混合物等)；葡糖酸鹽緩衝液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)；草酸鹽緩衝液(例如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)；乳酸鹽緩衝液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)；及乙酸鹽緩衝液(例如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可提及磷酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液及三甲基胺鹽諸如Tris。
可添加防腐劑以阻止微生物生長，且添加之量可在0.2%-1%(w/v)範圍內。用於本發明之合適防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化銨、苯紮鹵銨(例如氯、溴、碘)、氯化六甲二銨、對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲基或丙基酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。
可添加等滲劑(有時稱為「穩定劑」)以確保本發明液體組合物之等滲性，且包括多元糖醇，優選三元或更多元糖醇，諸如甘油、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露醇。
穩定劑指廣泛類型之賦形劑，其在功能上可在填充劑至溶解治療劑或幫助防止變性或黏附至容器壁之添加劑的範圍內。典型穩定劑可為多元糖醇(以上列舉)；胺基酸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油及其類似者，包括環醇，諸如肌醇(inositol)；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、硫辛酸、硫基乙醇酸鈉、硫基甘油、α-單硫基甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即<10個殘基)；蛋白質諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣，諸如木糖、甘露糖、果糖及葡萄糖；二醣，諸如乳糖、麥芽糖及蔗糖；及三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如葡聚糖。穩定劑所存在之範圍可為每重量份活性蛋白0.1至10,000重量。
可添加非離子型界面活性劑或清潔劑(亦稱為「潤濕劑」)以幫助溶解治療性蛋白(例如抗體)以及保護治療性蛋白免於攪拌誘導之聚集，其亦允許調配物暴露至剪切表面應力，而不引起蛋白變性。合適非離子型界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80及其類似物)、泊洛沙姆(184、188及其類似物)、PLURONIC®多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80及其類似物)。非離子型界面活性劑所存在之範圍可為0.05mg/ml至約1.0mg/ml、較佳約0.07mg/ml至約0.2mg/ml。
其他各種賦形劑包括填充劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫胺酸及維生素E)及共溶劑。本文中之調配物亦可含有所治療之特定適應症所需要之一種以上活性化合物，較佳為具有互補活性且不會對彼此有不利影響者。例如，可能需要在調配物中包含HtrA1結合拮抗劑(例如抗HtrA1抗體)及因子D結合拮抗劑(例如抗因子D抗體)。在另一實例中，為治療與不合乎需要之新血管形成相關之眼睛病症諸如AMD，可能需要進一步提供一種抗血管生成療法，諸如VEGF拮抗劑療法，例如LUCENTIS®(蘭尼單抗)。此等活性成分適當地以對預期之目的有效之量組合存在。
亦可例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合將活性成分截留於所製備之微膠囊中，例如分別於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或於巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編.(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體或其抗體變異片段(例如抗原結合片段)之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件例如膜、或微膠囊之形式。持續釋放基質之實例包括聚酯，水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))；聚乳酸(美國專利第3,773,919號)，L-麩胺酸與L-麩胺酸乙酯之共聚物；不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯，可降解性乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能夠使得分子釋放持續超過100天，某些水凝膠使蛋白釋放持續較短時間段。當封裝之抗體長時間保留在體內時，其可由於在37℃下暴露至水分而變性或聚集，導致生物活性損失及可能的免疫原性變化。取決於所涉及之機制，可設計合理穩定化策略。例如，若發現聚集機制為經由硫基-二硫鍵相互交換形成分子間S--S鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物達成穩定化。
I. 治療方法及組合物
本文提供之任何抗HtrA1抗體(例如抗HtrA1抗體及抗HtrA1/抗因子D抗體)均可用於治療方法中。
在一態樣中，提供一種用作藥劑之抗HtrA1抗體。在另一態樣中，本發明提供用於治療HtrA1相關病症之抗HtrA1抗體。在一些實施例中，HtrA1相關病症為AMD，包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如地圖狀萎縮(GA))。在一些情況中，AMD為晚期乾性AMD(例如GA)。
在另一實施例中，本發明提供用於治療眼睛病症之抗HtrA1抗體。在一些情況中，眼睛病症為AMD，包括濕性(滲出性)AMD(包括早 期、中期及晚期濕性AMD)及乾性(非滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)；糖尿病視網膜病變(DR)及其他缺血有關視網膜病；眼內炎；葡萄膜炎；脈絡膜新血管生成(CNV)；早產兒視網膜病變(ROP)；息肉狀脈絡膜血管病變(PCV)；糖尿病黃斑水腫；病理性近視眼；逢希伯-林道病；眼組織漿菌病；視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)；角膜新血管生成；或視網膜新血管生成。在一些實施例中，眼睛病症為AMD(例如晚期乾性AMD(例如GA))。
在另一態樣中，提供一種用於治療方法中之抗HtrA1抗體。在某些情況中，本發明提供一種抗HtrA1抗體，其用於治療患有HtrA1相關病症之個體之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之抗HtrA1抗體。在一些實施例中，HtrA1相關病症為AMD，包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)。在一些情況中，AMD為晚期乾性AMD(例如GA)。
在另一情況中，本發明提供一種抗HtrA1抗體，其用於治療患有眼睛病症之個體之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之抗HtrA1抗體。在一些情況中，眼睛病症為AMD，包括濕性(滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性(非滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)；DR及其他缺血有關視網膜病；眼內炎；葡萄膜炎；CNV；ROP；PCV；糖尿病黃斑水腫；病理性近視眼；逢希伯-林道病；眼組織漿菌病；CRVO；角膜新血管生成；或視網膜新血管生成。在一些實施例中，眼睛病症為AMD(例如晚期乾性AMD(例如GA))。
在一些情況中，本發明提供一種抗HtrA1抗體，其用於抑制個體之視網膜或感光細胞退化。在其他情況中，本發明提供一種抗HtrA1抗體，其用於抑制個體眼睛中之HtrA1絲胺酸蛋白酶活性。根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
本發明提供抗HtrA1抗體在製造或製備藥劑中之用途。例如，在一種情況中，藥劑用於治療HtrA1相關病症。在另一情況中，藥劑用於治療HtrA1相關病症之方法中，其包括向患有HtrA1相關病症之個體投與有效量之藥劑。在藥劑之任何以上用途中，該方法可包括向該個體投 與有效量之例如至少一種如下所述之其他治療劑。在一些實施例中，HtrA1相關病症為AMD，包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)。在一些情況中，AMD為晚期乾性AMD(例如GA)。
在另一情況中，藥劑用於治療眼睛病症之方法中，其包括向患有眼睛病症之個體投與有效量之治療劑。在一些情況中，眼睛病症為AMD，包括濕性(滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性(非滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)；DR及其他缺血有關視網膜病；眼內炎；葡萄膜炎；CNV；ROP；PCV；糖尿病黃斑水腫；病理性近視眼；逢希伯-林道病；眼組織漿菌病；CRVO；角膜新血管生成；或視網膜新血管生成。在一些實施例中，眼睛病症為AMD(例如晚期乾性AMD(例如GA))。
本發明提供一種治療HtrA1相關病症之方法。在一實施例中，該方法包括向患有HtrA1相關病症之個體投與有效量之抗HtrA1抗體。在一些實施例中，HtrA1相關病症為AMD，包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)。在一些情況中，AMD為晚期乾性AMD(例如GA)。在其他情況中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種如下所述之其他治療劑。根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
本發明提供一種治療眼睛病症之方法。在一實施例中，該方法包括向患有眼睛病症之個體投與有效量之抗HtrA1抗體。在一些情況中，眼睛病症為AMD，包括濕性(滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性(非滲出性)AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)；DR及其他缺血有關視網膜病；眼內炎；葡萄膜炎；CNV；ROP；PCV；糖尿病黃斑水腫；病理性近視眼；逢希伯-林道病；眼組織漿菌病；CRVO；角膜新血管生成；或視網膜新血管生成。在一些實施例中，眼睛病症為AMD(例如晚期乾性AMD(例如GA))。
本發明提供一種治療有需要之個體之HtrA1相關病症、眼睛病症及/或補體相關病症的方法，該方法包括向該個體投與治療有效量之 HtrA1結合拮抗劑及/或因子D結合拮抗劑。在一些實施例中，HtrA1相關病症或補體相關病症為眼睛病症。在一些實施例中，眼睛病症選自由以下各項組成之群：AMD、糖尿病視網膜病變、脈絡膜新血管生成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黃斑水腫、病理性近視眼、逢希伯-林道病、眼組織漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞、角膜血管形成及視網膜新血管生成。在一些情況中，眼睛病症為AMD，包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)。在一些情況中，AMD為晚期乾性AMD(例如GA)。在任何以上實施例中，HtrA1-結合拮抗劑可為抗HtrA1抗體或其抗原結合片段，例如本文所述之任何抗HtrA1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab’-SH、Fv、scFV及(Fab’)2片段。在一些實施例中，抗原結合抗體片段為Fab。在一些實施例中，Fab包含處於重鏈恆定區之鉸鏈區(例如上鉸鏈)中的截短。在一些實施例中，Fab重鏈恆定區終止於位置221(EU編號)處。在一些實施例中，位置221處之胺基酸殘基為天冬胺酸殘基。在一些實施例中，Fab之重鏈恆定區包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab為IgG1 Fab。在一些情況中，因子D結合拮抗劑為抗因子D抗體或其抗原結合片段，例如本文所述之任何抗因子D抗體。
在另一態樣中，本發明提供特異性結合HtrA1與因子D或其抗原結合抗體片段之雙特異性抗體在製造用於治療HtrA1相關病症、眼睛病症及/或補體相關病症之藥劑中的用途。在一些實施例中，HtrA1相關病症及/或補體相關病症為眼睛病症。在一些情況中，眼睛病症為AMD，包括濕性AMD(包括早期、中期及晚期濕性AMD)及乾性AMD(包括早期、中期及晚期乾性AMD(例如GA)。在一些實施例中，AMD為晚期乾性AMD(例如GA)。雙特異性抗體可包含特異性結合HtrA1之源自於本文所述之任何抗HtrA1抗體的結合域。雙特異性抗體可包含特異性結合因子D之源自於本文所述之任何抗因子D抗體的結合域。在一些實施例中，抗原結合抗體片段為Fab片段或(Fab’)2片段。
本文所述及/或此項技術中已知之任何抗因子D抗體或其抗原結合片段可用於任何以上方法或用途中。例如，在一些情況中，抗因子D 抗體或其抗原結合片段可包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO：110)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu；(c)HVR-H3，其包含EGGVX1N(SEQ ID NO：111)之胺基酸序列，其中X1為Asn或Ser；(d)HVR-L1，其包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO：112)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Ser，X2為Asp或Glu，且X3為Asp或Ser；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO：114)之胺基酸序列，其中X1為Asp或Glu。在一些情況中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：115)之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含EGGVNN(SEQ ID NO：116)之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：117)之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含GGNTLRP(SEQ ID NO：113)之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO：118)之胺基酸序列。在一些實施例中，抗因子D抗體或其抗原結合片段包含(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：119之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：120之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些情況中，VH域包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列。在一些情況中，VL域包含SEQ ID NO：120之胺基酸序列。在一些情況中，抗因子D抗原結合抗體片段為CAS登錄號為1278466-20-8之拉姆帕力珠單抗。
預期本發明之抗體可用於治療哺乳動物。在一實施例中，將抗體投與非人類哺乳動物，例如以用於獲得臨床前資料目的。待治療之示例性非人類哺乳動物包括非人類靈長動物、犬、貓、囓齒動物(例如小鼠及大鼠)及其他哺乳動物，其中進行臨床前研究。此等哺乳動物可為建立之待用抗體治療的動物疾病模型，或可用於研究相關抗體之毒性。在此等實施例之各者中，可在哺乳動物中進行劑量逐步上升研究。
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之任何抗HtrA1 抗體之醫藥調配物，其係例如用於任何以上治療方法中。在一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗HtrA抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗HtrA1抗體及至少一種例如如下所述之其他治療劑。
在本文所述之任何治療用途及方法中，抗HtrA1抗體可為Fab。在一些實施例中，Fab包含處於重鏈恆定區之鉸鏈區(例如上鉸鏈區)中的截短。在一些實施例中，Fab重鏈恆定區終止於位置221(EU編號)處。在一些實施例中，位置221處之胺基酸殘基為天冬胺酸殘基。在一些實施例中，Fab之重鏈恆定區包含SEQ ID NO：156之胺基酸序列。在一些實施例中，Fab為IgG1 Fab。
本發明之用於預防或治療眼睛疾病或病狀之抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何合適方式投與，包括(但不限於)例如經眼、眼內、及/或玻璃體內注射、及/或鞏膜旁注射、及/或筋膜下注射、及/或脈絡膜上注射、及/或以滴眼液及/或軟膏形式局部投與。本發明之此等抗體可藉由多種方法遞送，例如作為允許化合物緩慢釋放至玻璃體中之裝置及/或儲槽玻璃體內遞送，該裝置及/或儲槽包括諸如以下之參考文獻中所述之彼等：Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton及Pearson編輯，Taylor & Francis(2006年3月)。在一實例中，裝置可呈以下形式：長時間段釋放化合物之小型泵及/或基質及/或被動擴散系統及/或封裝單元(Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton及Pearson編輯，Taylor & Francis(2006年3月)。亦可使用其他投與方法，其包括(但不限於)局部、非經腸、皮下、腹膜內、肺內、鼻內及病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。
可藉由此項技術中已知之方法且使用此項技術中已知之賦形劑製備用於經眼、眼內或玻璃體內投與之調配物。有效治療之重要特徵為正確滲透眼睛。不同於可局部遞送藥物之眼睛前部之疾病，視網膜疾病典型地受益於更加部位特定之方法。滴眼液及軟膏極少滲透眼睛背部，且血液-眼睛屏障阻礙全身投與之藥物滲透至眼部組織中。因此，用以治療視網膜疾病諸如AMD及CNV之藥物遞送方法選擇典型地為直接玻璃體內注 射。通常間隔性重複玻璃體內注射，間隔取決於患者之病狀及所遞送藥物之特性及半衰期。對於眼內(例如玻璃體內)滲透，較小尺寸之分子通常較佳。
眼睛具有許多可致使眼部藥物遞送具有挑戰性之生物物理學及解剖學特徵。例如，血液-眼睛屏障為保護眼睛免於感染之防預機制，但同時其使得藥物難以滲透，尤其對於眼睛後段之疾病而言。因此，經常需要高劑量投藥以達成且維持藥物之就地生物可用性(例如，眼睛滯留時間)，以便提高功效。同時，眼睛背部之有限空間限制待遞送之藥物體積，其轉而可支援待遞送藥物呈高濃度調配物形式。
眼睛病症(例如AMD(例如地圖狀萎縮))患者亦可受益於治療劑之長效/緩釋遞送。較小頻率之給藥將為患者提供改良之便利性，具有降低感染率且增加臨床功效之潛在益處。高劑量藥物之受控釋放亦可使藥物副作用最小化。用於長效遞送之兩種有希望的系統為基於PLGA之固體植入物及植入式端口遞送系統(PDS)。兩種系統均具有持續長時間段提供近零級釋放動力學之潛力。對於PLGA植入物，將蛋白藥物封裝在疏水性聚合物基質中，且經由聚合物之緩慢水解完成藥物釋放。可藉由改變藥物負荷、聚合物疏水性或聚合物分子量控制釋放速率。PDS為可再填充裝置，其中藉由包含鈦玻璃料之多孔金屬膜控制向玻璃體中之釋放。由於儲集層具有小體積，需要高蛋白濃度用於以PDS進行有效地送。
除高濃度及長效遞送以外或代替高濃度及長效遞送，可藉由轉譯後修飾達成或促進藥物之增加之生物可用性(例如，眼部滯留時間)，其中將蛋白藥物與天然或合成聚合物共價結合，諸如聚唾液酸化、HES化(與羥乙基澱粉結合)及PEG化。參見例如，Chen等人，Expert.Opin.Drug Deliv.8：1221-36,2011；Kontermann,BioDrugs 23：93-109,2011。PEG化-聚合物聚乙二醇(PEG)共價附接至蛋白-為尤其適用於延長抗體片段治療劑之半衰期的已充分建立之技術。Jevsevar等人，Biotech.J.5：113-128,2010。
取決於所用遞送系統，改變藥物暴露之條件。對於併入固體PLGA植入物而言，使用凍乾或噴霧乾燥之藥物。使用熱熔擠出製程製造植入物，使得藥物簡單地暴露至接近90℃之溫度。儘管藥物保持固態維持釋放時間段，PLGA之降解可使藥物暴露至低pH環境。相比之下，用PDS 遞送之藥物維持在液態高濃度下，且暴露至玻璃體，玻璃體在生理離子強度及pH下表徵為還原環境。
在治療特定眼睛病症或病狀中將有效之抗體或其抗體變異體之量將取決於該病症或病狀之性質，且可藉由標準臨床技術確定。可能時，在人體中測試之前，需要首先活體外、且接著在適用動物模型系統中測定劑量-反應曲線及本發明之醫藥組合物。
其他合適投藥方式包括非經腸、肺內及鼻內，及需要局部治療時，病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。可藉由任何適合途徑進行給藥，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射進行給藥，在某種程度上視投藥為短期抑或長期而定。本文涵蓋各種給藥時程，包括但不限於單次投藥或歷經各個時間點多次投藥、快速注射投藥及脈衝輸注。在一些情況中，可靜脈內、肌肉內、皮內、透皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內、鼻內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、腹膜內、經腹膜、經室內、皮下、結膜下、膀胱內、經黏膜、心包內、臍內、眼窩內、經口、局部、經皮、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部輸注對標靶細胞直接浴洗、藉由導管、藉由灌洗在乳劑中或在脂質組合物中投與抗HtrA1抗體。
可藉由常用於評估眼內疾病之各種終點量測治療眼睛病症(例如補體相關眼睛病症)諸如AMD或CNV之功效。例如，可評定視力損失。可藉由此項技術中已知及/或本文所述之任何方法評估視力損失，包括(但不限於)例如藉由最佳矯正視敏度(BCVA)自基線至所需時間點(例如其中BCVA基於早期治療糖尿病視網膜病變研究(ETDRS)視敏度表及在4公尺之測試距離下的評定)之平均變化來量測；量測在所需時間點與基線相比視敏度損失少於15個字母之個體的比例；量測在所需時間點與基線相比視敏度增加大於或等於15個字母之個體的比例；量測在所需時間點視敏度Snellen當量為20/2000或更差之個體的比例；量測NEI視覺功能問卷；在所需時間點量測CNV大小和CNV滲漏量，例如藉由螢光素血管造影術及其類似者。可進行眼部評定，例如，其包括(但不限於)例如進行眼睛檢查、量測眼 內壓、評定視敏度、測量狹縫燈壓力、評定眼內炎症及其類似者。
對於預防或治療疾病，本發明之抗體(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將取決於欲治療疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重性及病程、投與抗體係出於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應、及主治醫師之判斷。抗體適合一次性或歷經一系列治療投與患者。取決於疾病之類型及嚴重程度，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)抗體可為用於投與患者之初始候選劑量，無論藉由例如一或多次單獨投藥抑或藉由連續輸注。在一些實施例中，所用抗體為約0.01mg/kg至約45mg/kg、約0.01mg/kg至約40mg/kg、約0.01m難g至約35mg/kg、約0.01mg/kg至約30mg/kg、約0.01mg/kg至約25mg/kg、約0.01mg/kg至約20mg/kg、約0.01mg/kg至約15mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.01mg/kg至約5mg/kg，或約0.01mg/kg至約1mg/kg。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或以上範圍內，取決於上述因子。對於歷經數天或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療將通常持續直至對疾病症狀產生所需抑制作用為止。
在一些情況中，例如對眼睛投與固定劑量之本發明抗HtrA1抗體。在一些情況中，對眼睛投與約0.1mg至約10mg或約5-15mg之本發明抗HtrA1抗體，例如約0.1mg/眼至約0.5mg/眼、約0.5mg/眼至約1mg/眼、約1mg/眼至約1.5mg/眼、約1.5mg/眼至約2mg/眼、約2mg/眼至約2.5mg/眼、約2.5mg/眼至約3mg/眼、約3mg/眼至約3.5mg/眼、約3.5mg/眼至約4mg/眼、約4mg/眼至約4.5mg/眼、約4.5mg/眼至約5mg/眼、約5mg/眼至約5.5mg/眼、約5.5mg/眼至約6mg/眼、約6mg/眼至約6.5mg/眼、約6.5mg/眼至約7mg/眼、約7mg/眼至約7.5mg/眼、約7.5mg/眼至約8mg/眼、約8mg/眼至約8.5mg/眼、約8.5mg/眼至約9mg/眼、約9mg/眼至約9.5mg/眼或約9.5mg/眼至約10mg/眼。在一些情況中，所用抗體為約0.1mg/眼至約2mg/眼、約0.1mg/眼至約3mg/眼、約0.1mg/眼至約5mg/眼、約0.1mg/眼至約6mg/眼、約0.1mg/眼至約7mg/眼、約0.1mg/眼至 約8mg/眼、約0.1mg/眼至約9mg/眼、約0.1mg/眼至約10mg/眼、約0.5mg/眼至約2mg/眼、約0.5mg/眼至約3mg/眼、約1mg/眼至約3mg/眼或約2mg/眼至約5mg/眼。在一些情況中，使用約0.5mg/眼、約1mg/眼、約1.5mg/眼、約2mg/眼、約2.5mg/眼、約3mg/眼、約3.5mg/眼、約4mg/眼、約4.5mg/眼、約5mg/眼、約5.5mg/眼、約6mg/眼、約6.5mg/眼、約7mg/眼、約7.5mg/眼、約8mg/眼、約8.5mg/眼、約9mg/眼、約9.5mg/眼、約10mg/眼或以上之固定劑量之抗HtrA1抗體。在特定情況中，以約2mg/眼投與例如固定劑量之抗HtrA1抗體。
在一些實施例中，劑量可每週投與一次、每兩週投與一次、每三週投與一次、每四週投與一次、每五週投與一次、每六週投與一次、每七週投與一次、每八週投與一次、每九週投與一次、每十週投與一次、每十一週投與一次或每十二週投與一次。
可單獨或組合至少第二治療化合物投與HtrA1結合拮抗劑(例如本發明之抗HtrA1抗體)。投與HtrA1結合拮抗劑(例如本發明之抗HtrA1抗體)及任何第二治療劑可同時進行，例如作為單一組合物或作為兩種或更多種不同組合物使用相同或不同投藥途徑。或者或另外，投藥可按任何順序依序進行。在某些實施例中，兩種或更多種組合物之投藥之間可存在數分鐘至數天至數週至數月之間隔。例如，可首先投與HtrA1結合拮抗劑(例如本發明之抗HtrA1抗體)，接著投與第二治療化合物。然而，亦涵蓋同時投藥或在HtrA1結合拮抗劑(例如本發明之抗HtrA1抗體)之前投與第二治療化合物。在一實例中，HtrA1結合拮抗劑為抗HtrA1抗體，例如本文所述或此項技術中已知之任何抗HtrA1抗體。在一實例中，第二治療化合物為因子D結合拮抗劑。在另一實例中，因子D結合拮抗劑拮抗劑為抗因子D抗體，例如本文所述或此項技術中已知之任何抗因子D抗體。在特定實施例中，抗因子D抗體為拉姆帕力珠單抗。在其他實施例中，投與抗因子D抗體之劑量為1-15mg，例如劑量為10mg。在特定實施例中，拉姆帕力珠單抗每兩週投與一次、每三週投與一次或每四週投與一次。在某些實施例中，另一治療劑為適用於治療與眼睛中不合乎需要之新血管形成相關的眼睛病症諸如例如濕性AMD之治療劑。合適治療劑包括例如抗血管生成 療法，諸如VEGF拮抗劑(例如抗VEGF抗體及抗體片段，包括LUCENTIS®(蘭尼單抗)及抗VEGFR1抗體及有關分子(例如阿柏西普(VEGF阱眼；EYLEA®))；補體系統之抑制劑，諸如補體因子C2拮抗劑(包括例如抗CFC2抗體)；及抗炎劑，諸如IL-6結合拮抗劑(例如托珠單抗(ACTEMRA®)及EBI-031(Eleven Biotherapeutics))。在其他實施例中，治療與不合乎需要之眼部新血管形成相關的疾病或病症可包括抗HtrA1抗體與光動力療法(例如，與MACUGENTM或VISUDYNETM)之組合。
以上所述之此等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或各別調配物中)，及單獨投藥，在該情況下，可在投與其他一種或多種治療劑之前、同時及/或之後投與本發明之抗體。在一實施例中，投與HtrA1結合拮抗劑(例如抗HtrA1抗體)及投與另一治療劑在彼此之約一個月內，或在約一週、兩週或三週內，或在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。
應理解代替或除抗HtrA1抗體以外，可使用本發明之免疫結合物進行任何以上調配物或治療方法。
J. 製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料之製品。該製品包含容器及在該容器上或與該容器相伴之標籤或包裝插頁。合適容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病症之另一組合物組合之組合物且可具有無菌存取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝插頁指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或另外的治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之包裝插頁。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution) 或右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點看來合乎需要之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
III. 實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解鑒於以上提供之一般性描述，可實施各種其他實施例。
穩定、高效力、高親和力結合HtrA1之抗體的開發
以下實驗之目標為發現具有較高效力且對HtrA1具有較高親和力之新抗HtrA1抗體。
首先，產生mHtrA1敲除小鼠。必須使用敲除小鼠，因為自表現HtrA1之小鼠產生融合瘤之初始努力並未成功，此可能由於鼠類及人類HtrA1蛋白共有98%序列一致性。
接著，將HtrA1敲除小鼠用mHtrA1之蛋白酶域免疫。藉由ELISA篩檢所得融合瘤，且鑑定出75個ELISA陽性純系。測試75個純系之抑制HtrA1蛋白酶受質裂解的能力。75個純系中有10個示出抑制HtrA1蛋白酶活性。
選擇此等純系中之七個用於基於其抑制蛋白酶活性、結合人類及鼠類HtrA1及相對於muHtrA3及muHtrA4選擇性結合muHtrA1之能力，進行進一步分析。此等七個純系進行進一步篩檢且發現與對照抗體YW505.94相比，四個純系對HtrA1具有提高之效力。選擇此等抗體中之兩個15H6及9B12，用於基於其較佳分子型態(包括效力及選擇性)進行進一步開發。
將所選抗體之高變區移植至如以下所概括之人類構架上。藉由個別交換此等殘基且測試與人類及小鼠HtrA1之結合，針對15H6測試小鼠輕鏈游標參考之重要性。一種取代消除結合，兩種降低結合，兩種僅影響與鼠類HtrA1之結合，且三種對結合無顯著影響。將此三種取代引入抗體15H6.v1，以製備抗體15H6.v2。
接著將15H6.v2工程改造以提高其穩定性。鑑定會導致氧化(HVR-L3中之W91)、剪切(HVR-LC中之N94 P95)及脫醯胺基作用(HVR-H2中之D55 G56)之潛在不穩定殘基。W91之取代實質上影響結合。在位置 N94處測試四種取代。此等取代中之兩種影響結合，但選擇兩種用於額外分析。在位置D55處測試四種取代。此等取代中僅一種示出與親本分子可比之結合。
下一步為改良h15H6.v2對HtrA1之結合親和力。第一步，使用深度測序來研究h15H6.v2之結構/功能關係。在此實驗中測試之許多個別突變中，發現大約19個個別突變改良對HtrA1之親和力。設計且測試含有LC與HC突變組合、解離速率最慢之抗體，得以鑑定出效力及對HtrA1之親和力改良之變異抗體。亦將具有最佳親和力及效力之變異體工程改造以引入以上所述之穩定取代。所得變異體之中，發現h15H6.v4針對HtrA1具有最高效力。
藉由X射線晶體學及電子顯微鏡術測定結合HtrA1之Fab形式之h15H6.v4的結構。此結構分析揭示h15H6.v4 Fab緊密結合至HtrA1蛋白之「LA環」。h15H6.v4結合之抗原決定基不同於對照抗體YW505.94結合之抗原決定基。儘管不希望本發明受任何特定機制約束，但h15H6.v4與HtrA1之LA環之間的緊密相互作用有可能解釋與YW505.94相比時，此抗體之顯著改良之親和力及效力。
以上所述之實驗更詳細概括於下文中。
實例1：使用融合瘤方法產生抗HtrA1抗體
A. 培養基及抗體
CLONACELLTM-HY培養基B(Cat# 03802)、培養基C(Cat# 03803)、培養基D(Cat# 03804)及培養基E(Cat# 03805)來自StemCell Technologies。用於電融合之CYTOFUSION®培養基C(Cat# LCM-C)來自Cyto Pulse Sciences。經別藻藍蛋白(APC)標記之山羊F(ab’)2抗小鼠Ig來自SouthernBiotech(Cat#1012-11)，結合有辣根過氧物酶(HRP)之山羊抗小鼠IgG Fc抗體來自Sigma。TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)單組分HRP微孔受質(Cat# TMBW-1000-01)及TMB終止試劑(Cat# BSTP-1000-01)來自BioFx Laboratories。
B. 小鼠之活體內免疫
藉由腳墊注射(每隻小鼠2μg/注射劑)以3至4天間隔用懸 浮於單磷醯基脂質A/海藻糖二黴菌酸酯佐劑中之經純化His標記之重組鼠類HtrA1蛋白酶域(本文稱為muHtrA1-PD-His，SEQ ID NO：153；參見WO 2013/055998之實例2)免疫五隻HtrA1敲除小鼠(HtrA1.noneo.BALB.ko.C1-3)，總計加強12次，之後用含抗原之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)進行2次融合前加強。最後一次加強三天後，收集且分離來自免疫小鼠脾及淋巴結之淋巴細胞。如WO 2013/055998之實例2所述藉由純化製備注射用muHtrA1-PD-His。
C. 細胞融合、融合瘤篩檢及次選殖
使用Cyto Pulse CEEF-50裝置(Cyto Pulse Sciences)，將來自兩隻小鼠之經分離小鼠脾細胞(編號748及749)與SP2/0骨髓瘤細胞(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection))融合。簡言之，用CYTOFUSION®培養基C洗滌兩次之後，將經分離脾細胞與SP2/0細胞按1：1比率混合，且接著以100,000,000個細胞/ml之濃度重懸於CYTOFUSION®培養基C。根據製造商之指導進行電融合。將經融合細胞在CLONACELLTM-HY培養基C中在37℃、7% CO2培育器中培養隔夜。次日，將經融合細胞離心且接著重懸於10ml CLONACELLTM-HY培養基C中，且接著與90ml基於甲基纖維素之CLONACELLTM-HY培養基D輕輕混合，該培養基含有選擇性試劑次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT)。將細胞接種於40×100mm皮氏培養皿(Cat#351029，Becton Dickinson)中，且允許其在37℃、7% CO2培育器中生長。培育10天後，使用CLONEPIXTM系統(Genetix,United Kingdom)揀選1429個單一融合瘤純系，且轉移至具有200μl/孔CLONACELLTM-HY培養基E之15×96孔細胞培養板(#353075，Becton Dickinson)中。更換融合瘤培養基，且3天後藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)篩檢融合瘤上清液，以分析與muHtrA1-PD-His之結合。
根據標準方案進行ELISA。簡言之，將96孔微滴定ELISA板(Greiner,Germany)用100μl/孔之於0.05M碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中的2μg/ml muHtrA1-PD-His或huHtrA1-PD-His(SEQ ID NO：154)在4℃下塗覆隔夜。用洗滌緩衝液(含0.05% TWEEN® 20之PBS，Sigma)洗滌三次後，用含BSA之100μl ELISA分析稀釋劑阻斷板。添加100μl經培養上清液或經 稀釋之純化單株抗體(mAb)且在室溫下培育1h。將板洗滌三次且用結合有HRP之山羊抗小鼠IgG Fc培育1h。洗滌三次後，藉由添加100μl/孔之TMB受質(BioFX Laboratories)偵測結合之酶，持續5分鐘。藉由添加100μl/孔之終止試劑(BioFX Laboratories)終止反應，之後在650nm(A 650nm)之吸光度下偵測顏色。鑑定105個初始ELISA陽性上清液。擴充且培養3天後，在隨後ELISA中再次篩檢此等純系，其確認105個純系中有75個對於結合至muHtrA1-PD-His仍為ELISA陽性(圖1A及1B)。此等75個純系中之大部分亦結合至人類HtrA1蛋白酶域(圖1A及1B)。
接著使用活體外分析測試75個ELISA陽性純系，以評定融合瘤上清液抑制受質藉由人類HtrA1蛋白酶域(huHtrA1-PD-His；SEQ ID NO：154)裂解之能力。使用ENZCHEK®綠色螢光蛋白酶分析(ThermoFisher Scientific)。此分析採用經pH不敏感性綠色螢光BODIPY® FL染料濃密標記之酪蛋白衍生物作為受質。在全長標記受質中BODIPY® FL染料之螢光經分子內淬滅。受質藉由huHtrA1-PD之裂解釋放出螢光BODIPY® FL標記之肽，使得螢光信號增加(圖2A)。簡言之，在37℃下在緩衝液(50mM Tris、200mM NaCl、0.25% CHAPS，pH 8.0)中以最終體積為200μl培育融合瘤上清液及HtrA1-PD(20nM hHtrA1-PD；40μl hHtrA1-PD：60μl上清液)持續20min。添加5μg/ml BODIPY® FL標記之受質，且讀取螢光(毫相對螢光單位(mRFU)/min)20min。使用此阻斷分析，發現75個純系中有10個抑制人類HtrA1-PD介導之受質裂解(圖2B及2C)。圖3A及3B示出與huHtrA1-PD相比，純系子集抑制muHtrA1-PD活性之能力的比較。
在藉由限制稀釋至少2輪之單一細胞選殖之後，將具有不同特徵之7個純系(20E2、19B12、12A5、3A5、15H6、15E3及19G10)放大且收集上清液用於抗體純化及進一步評定。選擇此等純系，部分上係基於抑制活體外HtrA1活性之能力及與muHtrA3(19B12)之結合.亦測試該7個純系在免疫組織化學中偵測muHtrA1之能力以及結合鼠類HtrA3-PD及鼠類HtrA4-PD(如藉由ELISA所評定)之能力。表1示出此等7個純系之定性特性之總結。
表1：經選擇用於抗體純化之7個最終抗體純系的特性
Figure 105135184-A0202-12-0117-3
下一步為測定以上選擇之七種抗體是否抑制HtrA1介導之裂解，如在FRET分析中所量測。
藉由蛋白A親和力層析法純化融合瘤上清液，之後無菌過濾(0.2μm孔大小，Nalge Nunc International,NY,USA)且在4℃下儲存在PBS中。藉由ELISA及FACS確認經純化單株抗體，且之後在功能分析中進一步測試。藉由ISOSTRIPTM小鼠單株抗體分型套組(Roche Diagnostics Corporation)確定經純化mAb之同型。
測試經純化抗體在基於FRET之阻斷分析(例如H2-Opt分析)中抑制HtrA1活性之能力。在此分析中，測定抗體抑制螢光共振能量轉移(FRET，亦稱為Förster共振能量轉移)受質裂解之能力。分子量為1600Da之FRET肽受質H2-Opt包含供體Mca(7-甲氧基香豆素-4-基-乙醯基)及受體(淬滅劑)Dnp(N-2,4-二硝基苯基)。FRET肽受質之全長序列為(Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK(SEQ ID NO：152)。在完整肽受質中，淬滅部分Dnp淬滅Mca供體之螢光。FRET肽受質之蛋白水解裂解將螢光團與淬滅劑分開，從而減輕Mca螢光之淬滅且使得螢光信號增加(圖4A)。使用以下實例3F部分所述之H2-Opt分析條件進行分析。螢光強度之時間依賴性增加與受質水解之程度有關。在濃度為5nM、50nM及500nM下測試抗體。五種經純化抗HtrA1抗體(15H6、19B12、3A5、12A5及20E2)保持阻斷人類及鼠類HtrA1-PD介導之受質裂解的能力(圖4B及4C)。
接著，測試經純化抗體抑制全長HtrA1介導之受質裂解的能力。使用經純化全長(FL)muHtrA1或huHtrA1，採用以上段落中所述之基於FRET之阻斷分析。如WO 2013/055998之實例2中所述純化muHtrA1-FL及huHtrA1-FL。經純化抗體(括15H6及19B12)抑制huHtrA1-FL (圖5A-5B)及muHtrA1-FL(圖5C-5D)之活性。在此分析中，純系15H6抑制huHtrA1-FL，IC50為0.7nM，與陽性對照抗體YW505.94之IC50相比，改良接近兩倍。15H6抑制muHtrA1-FL，IC50為1.1nM，與陽性對照抗體YW505.94相比，改良幾乎5倍。純系19B12抑制huHtrA1-FL，IC50為1.4nM，且抑制muHtrA1-FL，IC50為1.0nM。如以下部分D中所述對所選抗體進行測序。此五個抗體之序列示出在圖6A及圖6B中。選擇兩個抗體15H6及19B12，用於基於其較佳分子型態(包括其效力及其選擇性)進行進一步開發。此等抗體之重排描述於以下部分E中。
D. 來自融合瘤純系之抗體測序
i. 以96孔形式使用cDNA末端之5’快速擴增(5’-RACE)自交瘤細胞選殖可變區基因序列
對於各融合瘤純系，將約25μl對數期生長細胞(0.5-1.0×106細胞/ml)自組織培養板轉移至96孔U形抵板之孔中。接著添加150μl冷1×PBS洗滌細胞，隨後在1000rpm下旋轉沈降5min。移除上清液且將細胞沈澱物重懸於25μl冷1×PBS中。
ii. 反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)
在埃彭多夫(Eppendorf)管中製備由以下各物組成之主體混合物(針對50個孔)：2.5μl RNASEOUTTM(Invitrogen #10777019)、12.5μl 10×合成緩衝液(5×SUPERSCRIPT®緩衝液)、12.5μl二硫蘇糖醇(DTT)(0.1M，Invitrogen #P/NY00147)、6.25μl dNTP(10mM，Invitrogen #18427-013)、12.5μl 2.5%壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、6.25μl 2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)(BioLabs #9001S)、25μl RACE4muHC引子(PCR級水中1：100)(取代Race3 κ引子以對輕鏈(LC)測序)、37.5μl PCR級水及10μl SUPERSCRIPT® 3酶(Invitrogen #18080-093)。Race4muHC簡併引子核苷酸序列為TTT YTT GTC CAC CKT GGT GCT GC(SEQ ID NO：139)，其中Y編碼C或T，且K編碼G或T。Race 3κ引子核苷酸序列為GTA GAA GTT GTT CAA GAA G(SEQ ID NO：140)。
接著將2.5μl/孔之主體混合物轉移至96孔PCR反應板。向板添加1μl細胞/孔，將板簡單旋轉30秒，且接著振盪板。將板設置於PCR 機中，且程式設為45℃下30min，接著50℃下30分鐘。此板標記為板A。
iii. 加尾反應
用以下成分製備10×貯備加尾緩衝液(針對50個孔)：5μl 1M MgCl2、5μl 0.1M DTT、5μl 1M Tris pH 7.5、10μl 100mM dGTP及25μl PCR級水。
用以下成分製備工作溶液(針對50個孔)：50μl 10×貯備加尾緩衝液、312.5μl PCR級水及12.5μl 300單位末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)(Promega #M828A/C)。
接著將此工作溶液以7.5μl/孔添加至PCR反應板A。接著將板A置於PCR機中，在37℃下持續1h，接著在65℃下持續5min。此板標記為板A/B以區別此板之加尾。
iv. 第一PCR反應
在15mL Falcon管中製備由以下各物組成之主體混合物(針對50個孔)：1050μl PCR級水、500μl 5×GC cDNA PCR反應緩衝液、500μl GC解鏈試劑(Clontech #S1091)、50μl正向引子DC5dn、50μl Race7muHC(Race 2 κ引子用於LC)、50μl dNTP(10mM)及50μl GC A DVANTAGE®聚合酶(Clontech #S1088)。Race7muHC簡併引子核苷酸序列為CAR GTC AMD GTC ACT GRC TCA G(SEQ ID NO：141)，其中R編碼A或G，M編碼A或C，且D編碼G或A或T。Race 2κ引子核苷酸序列為GAG GCA CCT CCA GAT GTT AAC(SEQ ID NO：142)。
然後將45μl此主體混合物轉移至新PCR反應板之孔中，且然後添加1μl來自板A/B之範本。接著，將此板置於PCR機中，且在遞減PCR法下以如以下所列之不斷降低之退火溫度進行操作。此板標記為板C。
遞減PCR法：96℃ 4min；3個循环之[96℃ 45秒、64℃ 30秒、68℃ 90秒]；3個循环之[96℃ 45秒、61℃ 30秒、68℃ 90秒]；3個循环之[96℃ 45秒、58℃ 30秒、68℃ 90秒]；3個循环之[96℃ 45秒、57℃ 30秒、68℃ 90秒]；3個循环之[96℃ 45秒、55℃ 30秒、68℃ 90秒]； 25個循环之[96℃ 45秒、52℃ 30秒、68℃ 90秒]；68℃ 5min，之後為4℃終末保持。
之後，在2%溴化乙錠(EtBr)E-GEL®上操作3μl PCR產物，且檢查帶。添加10μl/孔之ExoI/蝦鹼性磷酸酶(SAP)，且置於PCR機中在37℃下持續45min，接著在85℃下持續15min。製備ExoI/SAP主體混合物(針對50個孔)：2.5μl 20單位/μl核酸外切酶I(Fermentas #EN0582)、25μl SAP(USB #70092Y)、472.5μl PCR級水。在水中製備PCR產物之1：4稀釋液。使用Race7muHC引子對重鏈(HC)測序且使用Race7.1muLC引子對LC測序。Race7.1muLC引子核苷酸序列為ACT GCT CAC TGG ATG GTG GGA AG(SEQ ID NO：143)。
v. 凝膠過濾及質譜表徵
對於凝膠過濾分析，以0.35ml/min將10ml經純化樣品注入TSK-GEL® Super SW3000(4.6mm內徑×30cm，TOSOH Bioscience)中，使用200mM K2PO4、250mM KCl pH 7.0作為流動相。在37℃下用50mM二硫蘇糖醇還原大約2mg經純化IgG持續20min，且在使用PLRP-S柱(Agilent)及乙腈梯度線上逆向分離後藉由飛行時間(TOF)質譜法(Agilent LC/MS 6224)進行分析。使用MassHunter定量分析軟體(Agilent)藉由所收集m/z譜之最大熵退卷積測定完整品質。
vi. 結果
19B12、20E2、3A5、12A5及15H6之重鏈可變區(VH)的序列示出在圖6A中。19B12、20E2、3A5、12A5及15H6之輕鏈可變區(VL)的序列示出在圖6B中。此等純系具有獨特重鏈及輕鏈。質譜資料確證序列資料(參見表2及3)(參見例如Bos等人.Biotechnol.Bioeng.112(9)：1832-1842,2015)。
Figure 105135184-A0202-12-0120-4
Figure 105135184-A0202-12-0121-6
Figure 105135184-A0202-12-0121-345
E. 重排抗體15H6及19B12
i. 抗體15H6及19B12之TOPO®選殖
進行TOPO®選殖以證實自5’-RACE PCR產物(以上所述)之直接測序獲得的抗體純系15H6及19B12之可變區序列。如用於測序之pCRTM4-TOPO® TA選殖套組(Invitroggn K4575-02)手冊中所述進行TOPO® TA選殖反應。簡言之，將2μl PCR產物、2μl水、1μl pCRTM4-TOPO®載體及1μl所含鹽溶液合併在管中、混合且在室溫下培育5分鐘。接著將反應置於冰上且將2μl此TOPO®選殖反應添加至含ONE-SHOT®化學感受態TOP10大腸桿菌細胞(Invitrogen K4575-02)之解凍小瓶中，且混合而不敲打。將反應在冰上孵育5-30min。接著，將細胞在42℃下熱沖30，而不進行振盪。將管立即轉移至冰。添加250μl室溫SOC培養基。將管封蓋，且在200rpm在37℃下水準振盪1h。接著，將來自各轉型之50μl鋪在含有50μg/ml羧苄青黴素之預先溫熱之LB瓊脂板上。將板在37℃下培育隔夜，次日揀選菌落，且進行質粒純化。驗證序列且選擇在TOPO®載體中各含有15H6 VH與VL及19B12 VH與VL序列之特定孔在限制自由選殖中用作源載體。
ii. 限制自由選殖至mIgG2a中
針對LC按以下方式設置PCR混合物擴增TOPO®載體中之重鏈及輕鏈可變區：0.5μl範本DNA(小型製備源載體)、4μl 15H6 VL正向引子、4μl 15H6 VL反向引子、2μl 10mM dNTP、20μl 5×HF緩衝液、1μl PHUSION®聚合酶(F-549L，Thermo Scientific，2U/μl)及68.5μl水。除使用15H6 VH正向及反向引子子外，以相同方式設置用於選殖HC之反應混合物。除使用19B12引子外，以與15H6混合物相同之方式設置19B12 PCR混合物。引子序列如下：15H6 VL正向引子核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAA ATT GTT CTC TCC CAG TCT CC(SEQ ID NO：144)。
15H6 VL反向引子核苷酸序列：GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GG(SEQ ID NO：145)。
15H6 VH正向引子核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG(SEQ ID NO：146)。
15H6 VH反向引子核苷酸序列：GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG GTT CCT TGA CCC(SEQ ID NO：147)。
19B12 VL正向引子核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA AAC ATT GTG GTG ACC CAA TCT CC(SEQ ID NO：148)。
19B12 VL反向引子核苷酸序列：GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC CCG CTT TAT TTC CAG CTT GG(SEQ ID NO：149)。
19B12 VH正向引子核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC GAG GTG AAG CTG GTG GAA TCT GGG GGA GG(SEQ ID NO：150)。
19B12 VH反向引子核苷酸序列：GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GCG GTT CCT TGA CCC(SEQ ID NO：151)。
PCR循环條件如下：98℃ 30秒；35個循环之[98℃ 15秒、68℃30秒、72℃ 35秒]；72℃ 10分鐘。
經擴增之VH及VL用作引子，以針對15H6 LC按以下方式 設置PCR混合物來擴增範本DNA：1.25μl範本mIgG2a PRK載體DNA(小型製備之1：10稀釋液)、0.5μl 15H6 VL PCR產物(100-200ng/μl)、1μl 10mM dNTP、10μl HF緩衝液(5×)、1μl PHUSION®聚合酶及35.75μl水。除使用15H6 VH PCR產物外，以相同方式設置15H6 HC PCR混合物。除使用19B12 PCR產物外，以相同方式設置19B12 PCR混合物。
PCR循环條件如下：98℃持續30秒；25個循环之[98℃ 15秒、68℃ 0秒、72℃ 4分鐘]；72℃ 10分鐘。
接著，將18μl PCR反應轉移至新管中，且在37℃下用2μl DpnI(#RO176L，NEB 20,000U/ml)消化2h，其中週期性旋轉管。根據製造商之說明書，將30μl感受態NOVABLUE SINGLESTM感受態細胞(Novagen,70181)用1μl DpnI消化物轉型。簡言之，將細胞解凍、添加DNA且將細胞在冰上培育5min，隨後熱衝擊30秒、重新置於冰上2min，之後添加SOC培養基。將25μl或50μl接種在含50μg/ml羧苄青黴素之板上，且放在37℃下隔夜。次日揀選菌落，經由小型製備進行質粒純化，且對質粒測序。
iii. 抗體純化
在具有500ml MCA96頭之Tecan Freedom EVO® 200液體處理系統上進行自293細胞上清液之自動純化。簡言之，用經20ml MABSELECT SURETM樹脂(Glygen Corp.,Columbia,Maryland & GE Healthcare,Pittsburgh,Pernsylvania)定製裝填之槍頭柱捕集IgG。用1×PBS pH 7.4洗滌後，將IgG洗脫至160ml 50mM磷酸pH 3中且用12ml 20×PBS pH 11中和。在0.1M NaOH中汽提MABSELECT SURETM槍頭柱且用1×PBS pH 7.4再生以用於連續使用多達15次。同樣地，使用經20mL GAMMABINDTM Plus樹脂(Glygen Corp & GE Healthcare)裝填之槍頭柱捕集Fab，且隨後用1×PBS pH 7.4洗滌。將Fab洗脫至190ml 10mM檸檬酸鹽pH 2.9中，且用19ml 0.4M Tris pH 8.7中和。用6M胍汽提GAMMABINDTM Plus槍頭柱且用1×PBS pH 7.4再生以用於連續使用多達 15次。
iv. 重組15H6及19B12抗體保留原始阻斷活性
使用以上C部分所述之FRET阻斷分析評估重組15H6及19B12抗體抑制huHtrA1-FL活性之能力。兩種重組抗體均保留其原始阻斷活性，如自源自融合瘤之抗體所測定(圖7A及7B)。重組15H6抗體之IC50為大約0.7nM，而重組19B12抗體之IC50為大約1.2nM，此反映出源自融合瘤之抗體的活性(圖7A及1B)。
實例2：抗HtrA1融合瘤抗體15H6及19B12之人類化
A. 抗HtrA1抗體15H6之人類化
將鼠類15H6抗體(亦稱為m15H6)之輕鏈可變區(VL)及重鏈可變區(VH)序列與人類抗體共同序列進行比對，且人類共同輕鏈κI(huκ1)及人類共同重鏈子組I(huVH1)經鑑定為最接近之人類構架(圖8A及8B)。
藉由Kunkel誘變(參見例如，Kunkel等人，Methods Enzymol.154：367-382,1987)，對於各高變區使用單獨寡核苷酸以產生抗體純系h15H6.v1(圖8A及8B)，將m15H6輕鏈及重鏈之高變區(HVR)分別移植至huκI及huVH1共同受體構架中。在此過程中，將m15H6 VL之HVR-L1中之位置24-34、HVR-L2中之50-56及HVR-L3中之89-97移植至huκI共同受體中，且將m15H6 VH之HVR-H1中之位置26-35、HVR-H2中之49-65及HVR-H3中之95-102移植至huGI共同受體中。輕鏈(FR-L2)構架區2中之位置46、47及49及重鏈(FR-L3)構架區3中之位置67、69、71及93亦包含在人類化過程中，由於Foote及Winter已分析抗體與抗原複合物晶體結構且發現此等位置為充當「游標」區之構架殘基的一部分，游標區可調節HVR結構且細調以適合抗原(Foote等人，J.Mol.Biol.224：487-499,1992)(圖8A-8B)。藉由BIACORETM表面電漿共振(SPR)結合分析量測Fab形式之m15H6及h15H6.v1對人類及鼠類HrtA1的結合親和力，如以下C部分之子部分ii中所述(圖9A-9D)。表4總結此分析之結果。
Figure 105135184-A0202-12-0124-8
Figure 105135184-A0202-12-0125-9
為進一步評估h15H6.v1中鼠類游標殘基之重要性，將此抗體呈現在噬菌體上且個別游標鼠類殘基(LC：P46、W47、S49；HC：A67、L69、A71及T93)經人類殘基(LC：L46、L47、Y49；HC：V67、I69、R71及A93)置換，以產生點突變變異體。所有7種變異體經受針對人類或鼠類HtrA1之噬菌體競爭ELISA，以測定結合親和力(在噬菌體IC50方面，參見以下C部分之子部分i)。結果指示LC-P46L變異體完全消除h15H6.v1結合至人類及鼠類HtrA1。LC-S49Y變異體將與人類及鼠類HtrA1之結合降低約10倍(圖10A及10B)。HC變異體HC-A67V與HC-T93A均僅影響與鼠類HtrA1之結合，但不影響與人類HtrA1之結合(圖10A及10B)。其他變異體LC-W47L、HC-L69I及HC-A71R在與人類及鼠類HtrA1結合方面未示出任何明顯下降(圖10A及10B)。因此，抗體純系h15H6.v1藉由添加以下突變經進一步工程改造：LC-W47L、HC-L69I及HC-A71R，從而產生抗體純系h15H6.v2(參見圖8A及8B)。
抗體純系h15H6.v2之化學穩定性分析在HVR中鑑定出數個潛在不穩定殘基或殘基對：HVR-L3中之W91(氧化)；HVR-L3中之N94 P95(剪切)及HVR-H2中之D55 G56(異構化)。參見例如以下實例4。為解決HVR-L3中之W91氧化，產生2個變異體(LC-W91Y及LC-W91L)且其作為用於BIACORETM SPR結合分析之Fab製備。總結於下表5中之結果指示位置LC-W91對於結合親和力重要，且取代影響與人類及鼠類HtrA1之結合達約20-50倍(圖11A及11B)。
Figure 105135184-A0202-12-0125-10
對於HVR-L3之位置LC-N94 LC-P95處的剪切，產生h15H6.v2之四種變異體(LC-N94A LC-P95(亦稱為AP)、LC-N94E LC-P95(亦稱為EP)、LC-N94Q LC-P95(亦稱為QP)及LC-N94S LC-P95(亦稱為SP))且其作為用於BIACORETM結合分析之Fab製備。結果指示AP及EP變異體示出與人類HtrA1之相似結合親和力，且QP及SP變異體與人類HtrA1之結合親和力降低接近2倍(圖12A-12B)。總結此分析結果之表示出在圖12B中。
對於HVR-H2之殘基HC-D55 HC-G56處的異構化，產生四種變異體(HC-D55A HC-G56(亦稱為AG)、HC-D55E HC-G56(亦稱為EG)、HC-D55S HC-G56(亦稱為SG)及HC-D55 HC-G56A(亦稱為DA))且其作為用於BIACORETM結合分析之Fab製備。結果僅指示EG變異體示出針對人類HtrA1可比之結合親和力，且重鏈位置55及/或56處之其餘變異體在與人類HtrA1之結合親和力方面具有2至3倍降低(圖13A及13B)。總結此分析結果之表示出在圖13B中。
基於此等結果，變異體AP(HVR-L3)與EG(HVR-H2)均引入抗體純系h15H6.v2之序列中，以產生抗體純系h15H6.v2.APEG(亦稱為h15H6.v3或AP_EG)(參見圖8A及8B)。亦將此純系與h15H6.v2之數種其他變異體進行比較，包括LC-N94E LC-P95HC-D55E HC-G56(亦稱為EP_EG)；LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56(亦稱為QP_EG)；及LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56(亦稱為SP_EG)。BIACORETM SPR分析指示h15H6.v2.APEG保留與h15H6.v2可比之結合親和力(圖14A及14B)。總結此分析結果之表示出在圖14B中。使用實例1所述之基於FRET之阻斷分析測定此等變異體阻斷HtrA1活性之能力(圖14C及14D)。Fab形式之此等變異體之pI亦使用軟體程式SMACK(參見例如Sharma等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111：18601,2014)測定且與抗VEGF Fab蘭尼單抗(LUCENTIS®)相比較示出在表6中。
Figure 105135184-A0202-12-0126-11
Figure 105135184-A0202-12-0127-303
B. 抗HrtA1融合瘤抗體19B12之人類化
將鼠類抗體19B12(亦稱為m19B12)之VL及VH序列的胺基酸序列與人類共同序列進行比對，且人類共同輕鏈κIV(huκ4)及人類共同重鏈子組III(huVH3)經鑑定最接近人類構架(圖15A-15B)。
藉由Kunkel誘變，對於各高變區使用單獨的寡核苷酸以產生直接HVR移植變異體(本文中稱為抗體純系h19B12.v1)，將m19B12輕鏈及重鏈之高變區分別移植至huκ4及huVH3共同受體構架中。在此過程中，將19B12 VL之HVR-L1中之位置24-34、HVR-L2中之50-56及HVR-L3中之89-97移植至huκ4共同受體中，且將19B12 VH之HVR-H1中之位置26-35、HVR-H2中之50-65及HVR-H3中之95-102移植至huGIII共同受體中(圖15A-15B)。
使用BIACORETM SPR(圖16A-16D)，使用以下部分C之子部分ii中所述之方法，測定m19B12及h19B12.v1(Fab形式)之結合親和力。此分析之結果概括在下表7中。與m19B12相比，人類化後h19B12.v1與人類HtrA1之平衡結合常數(KD)提高接近2倍(表7)。
Figure 105135184-A0202-12-0127-13
C. 材料及方法
i. 噬菌體競爭ELISA測定噬菌體IC50
用PBS中2μg/ml人類HtrA1-PD-His塗覆MAXISORPTM微 量滴定板持續2h，且接著用PBST緩衝液(PBS中0.5% BSA及0.05% TWEEN®20)在室溫下阻斷1h。將自培養物上清液純化之噬菌體用在PBST緩衝液中連續稀釋之人類或鼠類HtrA1在組織培養微量滴定板中培育1h，之後將80μl混合物轉移至人類HtrA1塗覆之孔，持續15min，以捕集未結合噬菌體。用PBT緩衝液(PBS中0.05% TWEEN®20)洗滌板，且添加結合有HRP之抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)(PBST緩衝液中1：5000)，維持40min。用PBT緩衝液洗滌板，且藉由添加四甲基聯苯胺受質(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)顯影。將450nm下之吸光度隨溶液中標靶濃度變化而繪圖，以測定噬菌體IC50。此用作噬菌體表面上呈現之Fab純系的親和力估值。
ii. 藉由BIACORE TM 測定抗體親和力
為藉由單循環動力學測定抗HtrA1 Fab之結合親和力，使用BIACORETM T100儀器進行(SPR)量測。簡言之，根據供應商之說明書用1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)試劑活化系列S感測器晶片CM5，且將鏈黴親和素(Pierce)偶聯以達成大約2500反應單位(RU)，之後用1M乙醇胺阻斷未反應基團。
對於動力學量測，首先以10μl/min流速注入生物素化人類或鼠類HtrA1-PD-His，以在除FC1(其用作參考)外之3個不同流動池(FC)捕集大約150 RU，且接著在同一循环中自低(0.48nM)至高(300nM)相繼注入抗HtrA1 Fab於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005%界面活性劑P20)中之5倍連續稀釋液(流速：30μl/min)，其中注入之間無再生。記錄傳感圖且經受參考及緩衝液扣除，隨後藉由BIACORETM T100評估軟體(2.0版)評估。使用簡單一對一朗繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)計算為比率koff/kon。
實例3：抗HtrA1抗體純系h15H6.v2之親和力成熟
A. h15H6.v2親和力成熟NNK文庫構築及淘選
為進一步提高抗HtrA1抗體純系h15H6.v2之親和力，由Fab-琥珀突變形式之變異h15H6.v2構築噬菌體文庫，用於單價Fab噬菌體呈現使用NNK簡併密碼子隨機化之輕鏈HVR殘基(亦即，HVR-L1、HVR-L2 及HVR-L3)或重鏈HVR殘基(亦即HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)，該密碼子用32個密碼子編碼全部20個胺基酸(參見例如，Brenner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(12)：5381-5383,1992)。文庫經設計以在三個輕鏈或重鏈HVR之各者中允許一種NNK突變。將所得文庫DNA電穿孔至大腸桿菌XL1細胞中，得到大約109轉型體。在一些情況中，採用如PCT/US2015/055672所述之軟隨機化文庫及NNK上位性。將噬菌體文庫用SUPERBLOCKTM PBS緩衝液(Pierce)中750mM NaCl及0.05% TWEEN® 20培育30min，且接著塗佈在捕集有中性親和素之生物素化HtrA1-His tag上，用於第一輪淘選，以降低HtrA1與噬菌體之間的非特異性帶電相互作用。在隨後兩輪中使用逐漸降低濃度之生物素化huHtrA1-PD-His抗原，1000×非生物素化HtrA1在溶液中作為競爭劑，以增加選擇嚴謹性。參見圖17之淘選策略示意圖。
B. h15H6.v2親和力成熟文庫之深度測序
對於深度測序，自攜帶來自初始噬菌體文庫及來自第三輪選擇之噬粒載體的大腸桿菌XL-1細胞分離噬粒雙鏈DNA。經純化DNA用作VL及VH區之使用PHUSION® DNA聚合酶(New England Biolabs)的有限循环之PCR基擴增的範本。藉由瓊脂糖凝膠提取及清潔(Qiagen凝膠提取試劑盒)純化PCR產物。洗脫之擴增子DNA用作用標準Illumina文庫製備法使用TRUSEQTM DNA樣品製備套組(Illumina)對文庫製備物深度測序之基礎。使銜接子接合之文庫經受單個循环之PCR且使用雙端測序適當時用200bp或300bp之插入物大小以覆蓋擴增子之整個長度在Illumina MISEQ®上測序。
C. h15H6.v2親和力成熟文庫之深度掃描分析
使用統計程式語言R(參見例如R Core Team,R：A language and environment for statistical computing,2013)及ShortRead包(參見Morgan等人，Bioinformatics 25(19)：2607-2608,2009)分析測序數據。對鑑定之HVR序列進行品質控制(QC)，其中檢查各HVR序列之正確長度且允許其攜帶至多一個NNK突變及非NNK突變。藉由計算每一隨機化位置之所有突變之頻率生成位置權重矩陣。藉由經分類樣品中既定位置既定突變之頻率除以 未分類樣品中完全相同之突變之頻率來計算各突變之富集比率，如先前所述(Fowler等人，Nature Methods 7(9)：741-746,2010)。繪示出輕鏈HVR位置及重鏈HVR位置中各突變之富集比率的熱圖分別示出在圖18A及18B中。
選擇合成來自具有高富集比率之輕鏈或重鏈文庫的單個突變，以選殖至含有Flag標記之哺乳動物Fab表現構築體中，從而產生Fab-Flag標記融合蛋白。將編碼重鏈或輕鏈之質粒轉染至293T細胞，用於30ml表現且用抗Flag柱純化Fab。
含有單一突變之經純化Fab用於使用BIACORETM SPR分析(參見以下部分D)測定結合親和力。單一突變之親和力資料總結在表8中。與h15H6.v2之約0.0016的值相比，解離速率範圍為約0.0013至約0.004。與15H6.v2相比，變異體LC3(LC-N31E)將解離率改良2至3倍。
Figure 105135184-A0202-12-0130-14
Figure 105135184-A0202-12-0131-15
D. 用於進一步親和力改良之選定變異體組合
與親本純系h15H6.v2相比，來自重鏈或輕鏈NNK文庫之大多數單一突變並不改良與HtrA1之結合親和力(表8)。自輕鏈(LC3、LC4及LC7)與重鏈(HC1、HC2、HC3及HC5)變異體選自具有最慢解離速率之變異體，以產生組合突變體。此等組合突變體包括變異輕鏈與變異重鏈。使用組合突變體進行BIACORETM動力學分析(如以下部分C所述)。與親本Fab(h15H6.v2)相比，組合突變體LC3.HC3、LC3.HC1及LC7.HC2之親和力改良2-3倍(表9)。
Figure 105135184-A0202-12-0131-16
Figure 105135184-A0202-12-0132-17
接著，進一步組合LC突變體(LC37=LC3_LC7，LC347=LC3_LC4_LC7)及HC突變體(HC13=HC1_HC3，HC23=HC2_HC3)。藉由合併HVR-L3 N94A及HVR-H2 D55E突變體(亦即AP_EG，參見實例2)以避免自裂解及脫醯胺基作用來進一步修飾此等突變體，用於親和力動力學分析。
APEG.LC3.HC1、APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)、APEG.LC37.HC13、APEG.LC37.HC23、APEG.LC347.HC13及APEG.LC347.HC23為頂級純系，與h15H6.v2相比，平均改良3至5倍(圖20)。此等變異體之VL及VH胺基酸序列分別示出在圖21A及21B中。使用矽片分析(Sharma等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111：18601,2014)藉由對HVR-L3 W91之潛在氧化風險分析此等純系之序列。APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)、APEG.LC37.HC13及APEG.LC347.HC13排列為風險等於h15H6.v3。其他者具有高於h15H6.v2之風險。
E. 藉由BIACORE® SPR測定Fab親和力
為測定經選擇Fab變異體對HtrA1之結合親和力，用BIACORETM T200儀進行SPR量測。簡言之，根據供應商之說明書用1-EDC及NHS試劑活化系列S感測器晶片CM5，且將抗-His抗體偶聯以達成200-300反應單位(RU)，之後用1M乙醇胺阻斷未反應基團。對於動力學量測，首先以10μl/min流速注入大約5nM huHtrA1-PD-His，以在除FC1(其用作參考)以外之2個不同流動池(FC)捕集大約100 RU。接著，自低(0.8nM)至高(50nM)注入(流速：30μl/min)Fab於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005%界面活性劑P20)中之5倍連續稀釋液。藉由自空白流動池扣除RU校正對HtrA1之結合反應。記錄傳感圖且經受參考及緩衝液扣減，隨後藉由BIACORE® T200評估軟體(2.0版)評估。使用簡單一對一朗繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD) 計算為koff/kon比率。
F. HtrA1基於FRET之阻斷分析(H2-Opt阻斷分析)中h15H6.v2變異體之抑制活性
測試經選擇親和力成熟h15H6.v2變異體抑制HtrA1活性之能力。使用H2-Opt受質((Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK)進行活體外基於FRET之阻斷分析。如美國專利申請公開案第2013/0129743A1號之實例3所述，進行H2-Opt阻斷分析，該公開案以引用方式全部併入本文中。簡言之，使用標準偶聯程式用HBTU在Fmoc-Lys(Boc)-王樹脂上合成肽H2-Opt(Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK)(SEQ ID NO：152)，最初描述為HtrA2之受質(參見例如Martins等人，J.Biol.Chem.278：49417-27,2003)。Fmoc-Lys(DNP)--OH(Anaspec)併入P5’位置。肽經合成達至P5(Mca，7-甲氧基-香豆素，Aldrich)且接著使用三氟乙酸、三異丙基矽烷及水在室溫下自固體支撐物裂解2小時。將肽自乙酸乙酯沈澱，用乙酸、乙腈、水提取且凍乾。將粗標記之肽溶解且在製備型反相C18柱上使用乙腈/水純化。彙集所純化之部分、凍乾且藉由液相層析法分/質譜(PE/Sciex)，且發現其與所計算品質相一致。
在37℃下，將HtrA1在96孔黑色光學底板(Nalge Nunc Int.,Rochester,N.Y.)中用連續稀釋在分析緩衝液(50mM Tris-HCl pH 8.0，200mM NaCl，0.25% CHAPS)中之抗HtrA1抗體培育20min。將肽受質Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK(SEQ ID NO：152)(H2-Opt)於DMSO中之10mM貯備溶液在水中稀釋至12.5μM，在37℃下預溫熱且接著添加至反應混合物。在SPECTRAMAX® M5酶標儀(Molecular Devices,Sunnyvale,Calif.)上量測螢光信號(激發：328nm；發射393nm)之增加，且測定H2-Opt裂解之線性率(mRFU/min)。
圖22A示出實質上如以上所述進行之三個獨立H2-Opt分析實驗結果之總結。與h15H6.v2之約0.39nM相比較，大多數純系之IC50值在約0.4nm至約0.5nM範圍內。抗HtrA1抗體APEG.LC3.HC3(亦稱為h15H6.v4)示出在此分析中最佳IC50值為約0.386nM(圖22A)。圖22B示出此分析之代表性曲線圖。總體上，親和力成熟h15H6.v2變異體示出與h15H6.v2相比對HtrA1之最大抑制作用提高(圖22A)，其中最大抑制值範 圍為約78%至約96%。
使用基於FRET之H2-Opt阻斷分析評估h15H6.v2變異體之不同抗體形式(包括h15H6.v4)抑制HtrA1活性之能力。除以下分析條件外，實質上如以上所述進行H2-Opt分析：1nM huHtrA1-PD酶、1.25μM H2-Opt受質、50mM Tris pH 8、200mM NaCl、0.25% CHAPS。基於相對螢光單位(RFU)/s率(50-1000s)或2000s時之終點RFU值分析結果。圖23A-23H示出示例性獨立性實驗之結果，包括Fab形式之h15H6.v2及IgG或Fab形式之h15H6.v4抑制huHtrA1-PD活性之能力。抗HtrA1抗體YW505.94a(參見WO2013/055988)用作陽性對照。圖24A及24B分別示出來自第一組三個獨立實驗之使用RFU/s方法分析的IC50及IC90結果之總結。圖25A及25B分別示出來自第二組三個獨立實驗之針對h15H6.v4 Fab使用RFU/s或終點RFU方法分析的IC50及IC90結果之總結。
G. 基於質譜之活性分析中APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)之阻斷能力
使用質譜(MS)基活性分析評定APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)抑制huHtrA1-PD介導之完整全長受質(α-酪蛋白)裂解之能力。在此實例中，將抗HtrA1抗體h15H6.v4與HtrA蛋白酶之小分子抑制劑ucf-101進行比較，ucf-101已作為針對HtrA2之拮抗劑(亦稱為Omi)進行描述(Cilenti等人，J.Biol.Chem.278(13)：11489-11494,2003)。採用串級品質標記(TMT)異序品質標記標籤用於α-酪蛋白h15H6.v4或ucf-101存在下藉由HtrA1裂解之MS基定量。α-酪蛋白具有可藉由HtrA1裂解之三個P1’殘基：Ser72、Thr95及Ser157。
使用TMTDUPLEXTM異序品質標記試劑來有差別地標記α-酪蛋白標準及分析樣品，用於完整α-酪蛋白之定量。TMTDUPLEXTM試劑為異序化合物(亦即，相同品質及結構，亦稱為同位素異位元元體)集合，其經NHS活化用於第一胺(-NH2)基之共價不可逆標記。各異序試劑在品質報告標記部分含有不同數目之重同位素，從而在串級MS/MS過程中產生獨特報告品質用於樣品鑑別及相對定量。
將100mM三乙基碳酸氫銨、100nM huHtrA1、100μg/mL α-酪蛋白及抑制劑(亦即ucf-101或h15H6.v4)(最終體積為20μL)在37℃下培 育18小時(消化溶液)。單獨地產生無抑制劑之相似溶液，且同等培育(對照溶液)。在範圍為3.12nM至100nM之濃度下測試h15H6.v4 Fab，而在範圍為2nm至250nM之濃度下測試陽性對照小分子抑制劑ucf-101。
如供應商(Thermo Fisher Scientific)所推薦產生串級品質標記(TMTDUPLEXTM)貯備溶液。將5μL TMT-126添加至消化溶液且將5μL TMT-127添加至對照溶液。在室溫下培育1h後，在等體積基礎上合併以上溶液。在LC-MS上操作樣品且藉由使用較高能量C阱解離(HCD)碎裂最強烈離子峰來定量；碎裂後使用126/127之報告離子強度比測定所消化溶液之濃度。
滴定曲線示出分析準確定量出完成α-酪蛋白(圖26B)。在此分析中，h15H6.v4 Fab抑制huHtrA1-PD介導之完整α-酪蛋白裂解，IC50為約45nM(IC90=約71nM)。與小分子抑制劑ucf-101之IC50 77μM相比，此值顯著改良。
H. h15H6.v2親和力成熟變異體在內源性HtrA1活性分析中之阻斷能力
評定h15H6.v2親和力成熟變異體在兔眼模型中抑制內源性HtrA1活性之能力。對於內源性HtrA1活性分析，來自HtrA1分泌細胞(人類C32黑色素瘤細胞)之介質用作HtrA1來源。參見例如Ciferri等人.Biochem J.2015年9月18,DOI：10.1042/BJ20150601。應注意在內源性分析中，HtrA1之濃度比重組HtrA1 H2-Opt分析高大約10倍(參見例如圖28)，認為其可解釋使用內源性HtrA1及重組HtrA1，H2-Opt分析中所觀察到之不同IC50值。圖27A-27C示出內源性HtrA1分析之結果。具體而言，純系APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)之IC50為約1.125nM(圖27C)，其最大抑制為約80.1%。
I. 所選擇h15H6.v2變異體特性之總結
使用BIACORE SPR分析及基於FRET之H2-Opt活性分析，比較抗HtrA1抗體純系h15H6.v2之所選擇衍生物的動力學結合及抑制活性。為測定最大抑制，使用陽性及陰性對照測定0%抑制(僅酶，無抑制劑)及100%抑制(無酶)。此比較結果示出在圖28中。
實例4：抗HtrA1抗體之分子評定分析
在分子評定(MA)分析中測試抗HtrA1抗體純系h15H6.v2,h15H6.v2.APEG(亦稱為h15H6.v3)及APEG.LC3.HC3(亦稱為h15H6.v4)之穩定特性。亦測試抗HtrA1抗體純系h19B12.v1。簡言之，用AAPH(2,2-偶氮雙(2-甲脒基丙烷)二氫氯化物)在化學條件下測試抗HtrA1抗體(1mg/ml)之應激，AAPH為已知產生自由基之小分子(參見例如Ji等人，J.Pharm.Sci.98(12)：4485-4500,2009)，以及在熱條件在不同pH下(40℃、pH 5.5下兩週熱應激測試)(參見例如Zhang等人，J.Chromatography A 1272：56-64,2013)下測試其應激。
表10示出h15H6.v2及h15H6.v3之MA分析結果之間的比較。顯然，AAPH應激後h15H6.v2及h15H6.v3之HVR-L3中之LC-W91具有增加之氧化(分別為約84.5%及約86.4%)。表11示出h15H6.v4之MA分析結果。意外地，與h15H6.v2及h15H6.v3相比，h15H6.v4之HVR-L3中LC-W91處的氧化降低，與h15H6.v2及h15H6.v3之氧化增加大約84.5-86.4%相比，AAPH應激後其氧化僅增加26.5%。此改良出乎意料，因為與h15H6.v3相比，APEG.LC3.HC3僅具有兩個取代，亦即FR-H1區中之HC-T28K及HVR-L1中之LC-N31E，引入兩者以改良親和力，未預期兩者影響LC-W91之氧化。使用單柱純化程式製備此MA分析中所用之h15H6.v4抗體。當使用使用雙柱純化程式製備之抗體重複針對h15H6.v4之MA分析時，LC-W91示出在AAPH應激下不穩定。咸信用使用雙柱純化純化之材料進行的AAPH應激評定之結果不同於使用藉由單柱純化程式純化之材料獲得的結果，因為單柱純化之材料含有干擾AAPH應激評定之污染物。
Figure 105135184-A0202-12-0136-346
Figure 105135184-A0202-12-0137-19
Figure 105135184-A0202-12-0137-20
表12示出抗HtrA1抗體純系h19B12.v1之MA分析結果。HVR-H2中之HC-N52a HC-G53經測定不穩定，脫醯胺基作用增加49%。因此，預期在h19B12.v1(例如HC-N52aE、HC-N52aS、HC-N52aS及HC-N52aHC-G53A)之此等HVR-H2位置取代改良穩定性。
Figure 105135184-A0202-12-0137-21
Figure 105135184-A0202-12-0138-22
實例5：結合至HtrA1之h15H6.v4 Fab的結構
藉由X射線晶體學及電子顯微鏡術測定結合至HtrA1之h15H6.v4 Fab的結構。結果證明主要由構成HtrA1之LA環的轉角之胺基酸形成h15H6.v4 Fab HtrA1抗原決定基。
肽合成：
使用此項技術中熟知之方法產生對應於HtrA1蛋白之區域的肽。參見例如Atherton,E.等人.(1978).J.Chem Soc.Chem.Commun.13：537-539。
結晶：
將0.15M NaCl、20mM Tris pH 7.5中之10mg/ml h15H6.v4 Fab(1mL)在4℃下用含有HtrA1之LA環中的胺基酸之1mg肽(3倍莫耳過量肽/蛋白)培育隔夜。使用2M硫酸銨、0.2M乙酸鉀使Fab-肽複合物結晶。
X射線精算：
收集h15H6.v4 Fab/HtrA1肽晶體且保存用於藉由浸沒於藉由添加30%甘油至母液中製備之冷凍保護劑溶液中、接著突然浸沒於液氮中而進行繞射分析。在SSRL光束線12-2收集資料且使用XDS處理(Kabasch W(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.266：125-32)。在CCP4中使用Fab結構作為搜索探針達成Fab-肽複合物之分子置換(Wirn MD等人.(2011)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.67：235-42)。在剛性體精算後，可見肽之Fo-Fc密度。接著，基本上如Emsley等人.(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.66：125-32所述，將環A之HtrA1蛋白酶域殘基之一部分(RKLPFSKREVPV)(PDB 3TJO)擬合至密度中。
利用Phenix中之數輪精算(Adams PD等人.(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.66：213-21)。Buster中之最終一輪精算(Bricogne G等人.(2011)使R值為R=16.8%，Rfree=19.8% 2.1Å解析度。
結合至HtrA1之Fab15H6.v4的電子顯微術(EM)結構
對於EM成像，將4μl HtrA1-hFab15H6.v4複合物在新輝光放電之連續碳400目銅網(Electron Microscopy Sciences)上培育30秒。培育後，使用2%(w/v)甲酸雙氧鈾(SPI Supplies)溶液將樣品陰性染色。用Watman紙將過量染色溶液吸走，且將該網風乾。在配備LaB6絲且在120keV下、在低劑量條件下操作之Tecnai-12 BioTween(FEI)上分析HtrA1-Fab15H6.v4樣品。使用4k×4k CCD相機(Gatan公司)在×62,000(每個像素2.22Å)之標稱放大倍數下收集影像。使用常包括至EMAN2分佈中之可在e2dogpicker.py下獲得的群演算法(Tang L等人.(2007)J.Chem.Inf.Model.47：1438-45)，半自動揀選框大小為128px之27346個顆粒。接著，使用軟體套裝Relion(Scheres SH(2012)J.Struct.Biol.180：519-30)使此等顆粒經受參考自由2D分類。既定HTRA1三聚體與結合Fab之間的可撓性，使用Relion之3D分類演算法產生五個3D體積，其用作低通過濾至60Å解析度之HtrA1三聚體(PDB ID 3TJO)晶體結構之起始模型。最後使用Relion中之Refine3D演算法精算此等體積中之每一者。使用Chimera中之擬合至圖演算法(Pettersen EF等人，2004).J.Comput.Chem.25：1605-12(2004)將HTRA1三聚體之原子密度及Fab15H6.v4之晶體結構擬合至EM密度中。
使用丙胺酸取代驗證結合至HtrA1之Fab15H6.v4 Fab的結構
以上描述之結構研究證實Fab15H6.v4 Fab與HtrA1蛋白之環「A」緊密相互作用。為證實此點，合成對應於人類HtrA1序列之殘基190-201(其中編號對應於前驅蛋白之編號)的肽且使用如以上所述之表面電漿共振(SPR)測試其與h15H6.v4 Fab之結合。肽(LA-pep1)示出與15H6.v4 Fab之強結合相互作用，其KD值為0.4nM。參見表13。
此肽序列中之丙胺酸取代減少(LA-pep2、LA-pep5)或競爭性消除(LA-pep3、LA-pep4、LA-pep5)與15H6.v4 Fab之結合。此等生物物理學結果與以上及圖32A及32B中所述之結構研究一致，且證明15H6.v4之結合抗原決定基主要由構成HtrA1之LA環的轉角之胺基酸形成。
相比之下，YW505.94 Fab不結合至LA-pep1，亦不結合至任何突變形式(表13)。此指示，儘管YW505.94 Fab及h15H6.v4彼此競爭結合至HtrA1，但此兩種Fab之抗原決定基不同。YW505.94 Fab抗原決定 基集中在環B及C，而15H6.v4 Fab之抗原決定基主要包含LA環之尖端。
儘管不希望本發明受任何特定機制約束，但h15H6.v4與HtrA1之LA環之間的緊密相互作用有可能導致，與YW505.94相比時，此抗體之親和力及效力有顯著改良。
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儘管已出於理解清楚之目的藉由說明及實例之方式相當詳細地描述了上述本發明，但該等描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文引用之所有專利及科學文獻之揭示內容皆以全文引用的方式明確併入本文中。
<110> 美商建南德克公司(Genentech,Inc.)
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<223> 合成構築體
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<223> Xaa為Met或Leu
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<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa為Glu或Asp
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<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Glu或Asn
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<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Asn、His或Glu
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<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為Ala或Asn
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<213> 人工序列
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<223> Xaa為Thr、Lys或Arg
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Figure 105135184-A0305-02-0149-18
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 19
Figure 105135184-A0305-02-0150-19
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 20
Figure 105135184-A0305-02-0150-20
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 21
Figure 105135184-A0305-02-0150-21
Figure 105135184-A0305-02-0151-22
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 22
Figure 105135184-A0305-02-0151-23
Figure 105135184-A0305-02-0152-24
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 23
Figure 105135184-A0305-02-0152-25
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 24
Figure 105135184-A0305-02-0153-26
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 25
Figure 105135184-A0305-02-0153-27
Figure 105135184-A0305-02-0154-28
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 26
Figure 105135184-A0305-02-0154-29
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 27
Figure 105135184-A0305-02-0154-30
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 28
Figure 105135184-A0305-02-0154-31
<210> 29
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 29
Figure 105135184-A0305-02-0155-32
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 30
Figure 105135184-A0305-02-0155-33
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 31
Figure 105135184-A0305-02-0155-34
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 32
Figure 105135184-A0305-02-0156-35
<210> 33
<400> 33 000
<210> 34
<400> 34 000
<210> 35
<400> 35 000
<210> 36
<400> 36 000
<210> 37
<400> 37 000
<210> 38
<400> 38 000
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 39
Figure 105135184-A0305-02-0157-36
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 40
Figure 105135184-A0305-02-0157-37
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 41
Figure 105135184-A0305-02-0157-38
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 42
Figure 105135184-A0305-02-0158-39
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 43
Figure 105135184-A0305-02-0158-40
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 44
Figure 105135184-A0305-02-0158-41
<210> 45
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 45
Figure 105135184-A0305-02-0158-42
Figure 105135184-A0305-02-0159-43
<210> 46
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 46
Figure 105135184-A0305-02-0159-44
Figure 105135184-A0305-02-0160-45
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 47
Figure 105135184-A0305-02-0160-46
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
Figure 105135184-A0305-02-0160-47
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 49
Figure 105135184-A0305-02-0161-48
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 50
Figure 105135184-A0305-02-0161-49
<210> 51
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 51
Figure 105135184-A0305-02-0161-50
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 52
Figure 105135184-A0305-02-0162-51
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 53
Figure 105135184-A0305-02-0162-52
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 54
Figure 105135184-A0305-02-0162-53
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 55
Figure 105135184-A0305-02-0163-54
<210> 56
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 56
Figure 105135184-A0305-02-0163-55
Figure 105135184-A0305-02-0164-56
<210> 57
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 57
Figure 105135184-A0305-02-0164-57
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 58
Figure 105135184-A0305-02-0164-58
Figure 105135184-A0305-02-0165-59
<210> 59
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 59
Figure 105135184-A0305-02-0165-60
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 60
Figure 105135184-A0305-02-0165-61
<210> 61
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 61
Figure 105135184-A0305-02-0165-62
Figure 105135184-A0305-02-0166-63
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 62
Figure 105135184-A0305-02-0166-64
<210> 63
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 63
Figure 105135184-A0305-02-0166-65
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 64
Figure 105135184-A0305-02-0166-66
<210> 65
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 65
Figure 105135184-A0305-02-0167-67
<210> 66
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 66
Figure 105135184-A0305-02-0168-68
<210> 67
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 67
Figure 105135184-A0305-02-0168-69
Figure 105135184-A0305-02-0169-70
<210> 68
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 68
Figure 105135184-A0305-02-0169-71
Figure 105135184-A0305-02-0170-72
<210> 69
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 69
Figure 105135184-A0305-02-0170-73
<210> 70
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 70
Figure 105135184-A0305-02-0171-74
<210> 71
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 71
Figure 105135184-A0305-02-0171-75
Figure 105135184-A0305-02-0172-76
<210> 72
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 72
Figure 105135184-A0305-02-0172-77
Figure 105135184-A0305-02-0173-78
<210> 73
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 73
Figure 105135184-A0305-02-0173-79
Figure 105135184-A0305-02-0174-80
<210> 74
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 74
Figure 105135184-A0305-02-0174-81
<210> 75
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 75
Figure 105135184-A0305-02-0175-82
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 76
Figure 105135184-A0305-02-0175-83
Figure 105135184-A0305-02-0176-84
<210> 77
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 77
Figure 105135184-A0305-02-0176-85
Figure 105135184-A0305-02-0177-86
<210> 78
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 78
Figure 105135184-A0305-02-0177-87
Figure 105135184-A0305-02-0178-88
<210> 79
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 79
Figure 105135184-A0305-02-0178-89
<210> 80
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 80
Figure 105135184-A0305-02-0179-90
<210> 81
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 81
Figure 105135184-A0305-02-0179-91
Figure 105135184-A0305-02-0180-92
<210> 82
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 82
Figure 105135184-A0305-02-0180-93
Figure 105135184-A0305-02-0181-94
<210> 83
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 83
Figure 105135184-A0305-02-0181-95
<210> 84
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 84
Figure 105135184-A0305-02-0182-96
<210> 85
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 85
Figure 105135184-A0305-02-0182-97
Figure 105135184-A0305-02-0183-98
<210> 86
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 86
Figure 105135184-A0305-02-0183-99
Figure 105135184-A0305-02-0184-100
<210> 87
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 87
Figure 105135184-A0305-02-0184-101
<210> 88
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 88
Figure 105135184-A0305-02-0185-102
<210> 89
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 89
Figure 105135184-A0305-02-0185-103
Figure 105135184-A0305-02-0186-104
<210> 90
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 90
Figure 105135184-A0305-02-0186-105
Figure 105135184-A0305-02-0187-106
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 91
Figure 105135184-A0305-02-0187-107
Figure 105135184-A0305-02-0188-108
<210> 92
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 92
Figure 105135184-A0305-02-0188-109
<210> 93
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 93
Figure 105135184-A0305-02-0189-110
<210> 94
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 94
Figure 105135184-A0305-02-0189-111
Figure 105135184-A0305-02-0190-112
<210> 95
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 95
Figure 105135184-A0305-02-0190-113
Figure 105135184-A0305-02-0191-114
<210> 96
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 96
Figure 105135184-A0305-02-0191-115
Figure 105135184-A0305-02-0192-116
<210> 97
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 97
Figure 105135184-A0305-02-0192-117
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 98
Figure 105135184-A0305-02-0193-118
<210> 99
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 99
Figure 105135184-A0305-02-0194-119
<210> 100
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 100
Figure 105135184-A0305-02-0194-120
Figure 105135184-A0305-02-0195-121
<210> 101
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 101
Figure 105135184-A0305-02-0195-122
Figure 105135184-A0305-02-0196-123
<210> 102
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 102
Figure 105135184-A0305-02-0196-124
Figure 105135184-A0305-02-0197-125
<210> 103
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 103
Figure 105135184-A0305-02-0197-126
Figure 105135184-A0305-02-0198-127
<210> 104
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 104
Figure 105135184-A0305-02-0198-128
<210> 105
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 105
Figure 105135184-A0305-02-0199-129
<210> 106
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 106
Figure 105135184-A0305-02-0199-130
Figure 105135184-A0305-02-0200-131
<210> 107
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 107
Figure 105135184-A0305-02-0200-132
Figure 105135184-A0305-02-0201-133
<210> 108
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 108
Figure 105135184-A0305-02-0201-134
Figure 105135184-A0305-02-0202-135
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 109
Figure 105135184-A0305-02-0202-136
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Asp或Glu
<400> 110
Figure 105135184-A0305-02-0202-137
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Asn或Ser
<400> 111
Figure 105135184-A0305-02-0203-138
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Asp或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa為Asp或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Asp或Ser
<400> 112
Figure 105135184-A0305-02-0203-139
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 113
Figure 105135184-A0305-02-0204-140
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Asp或Glu
<400> 114
Figure 105135184-A0305-02-0204-141
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 115
Figure 105135184-A0305-02-0204-142
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 116
Figure 105135184-A0305-02-0205-143
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 117
Figure 105135184-A0305-02-0205-144
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 118
Figure 105135184-A0305-02-0205-145
<210> 119
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 119
Figure 105135184-A0305-02-0205-146
Figure 105135184-A0305-02-0206-147
<210> 120
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 120
Figure 105135184-A0305-02-0206-148
Figure 105135184-A0305-02-0207-149
<210> 121
<211> 480
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Figure 105135184-A0305-02-0207-150
Figure 105135184-A0305-02-0208-151
Figure 105135184-A0305-02-0209-152
<210> 122
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 122
Figure 105135184-A0305-02-0210-153
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 123
Figure 105135184-A0305-02-0210-154
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 124
Figure 105135184-A0305-02-0210-155
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 125
Figure 105135184-A0305-02-0211-156
<210> 126
<211> 253
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Figure 105135184-A0305-02-0211-157
Figure 105135184-A0305-02-0212-158
<210> 127
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 127
Figure 105135184-A0305-02-0212-159
Figure 105135184-A0305-02-0213-160
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 128
Figure 105135184-A0305-02-0213-161
Figure 105135184-A0305-02-0214-162
<210> 129
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 129
Figure 105135184-A0305-02-0214-163
Figure 105135184-A0305-02-0215-164
Figure 105135184-A0305-02-0216-165
<210> 130
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 130
Figure 105135184-A0305-02-0216-166
Figure 105135184-A0305-02-0217-167
<210> 131
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 131
Figure 105135184-A0305-02-0218-168
<210> 132
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 132
Figure 105135184-A0305-02-0219-169
<210> 133
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 133
Figure 105135184-A0305-02-0219-170
Figure 105135184-A0305-02-0220-171
<210> 134
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 134
Figure 105135184-A0305-02-0220-172
Figure 105135184-A0305-02-0221-173
<210> 135
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 135
Figure 105135184-A0305-02-0221-174
<210> 136
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 136
Figure 105135184-A0305-02-0222-175
<210> 137
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 137
Figure 105135184-A0305-02-0223-176
<210> 138
<400> 138 000
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 139
Figure 105135184-A0305-02-0223-177
<210> 140
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 140
Figure 105135184-A0305-02-0224-178
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 141
Figure 105135184-A0305-02-0224-179
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 142
Figure 105135184-A0305-02-0224-180
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 143
Figure 105135184-A0305-02-0224-181
<210> 144
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 144
Figure 105135184-A0305-02-0225-182
<210> 145
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 145
Figure 105135184-A0305-02-0225-183
<210> 146
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 146
Figure 105135184-A0305-02-0225-184
<210> 147
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 147
Figure 105135184-A0305-02-0225-185
<210> 148
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 148
Figure 105135184-A0305-02-0226-186
<210> 149
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 149
Figure 105135184-A0305-02-0226-187
<210> 150
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 150
Figure 105135184-A0305-02-0226-188
<210> 151
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 151
Figure 105135184-A0305-02-0226-189
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> N端Mca
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Lys(DNP)
<400> 152
Figure 105135184-A0305-02-0227-190
<210> 153
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 153
Figure 105135184-A0305-02-0227-192
Figure 105135184-A0305-02-0228-193
<210> 154
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 154
Figure 105135184-A0305-02-0228-194
Figure 105135184-A0305-02-0229-195
Figure 105135184-A0305-02-0230-196
<210> 155
<211> 480
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 155
Figure 105135184-A0305-02-0230-197
Figure 105135184-A0305-02-0231-198
Figure 105135184-A0305-02-0232-199
<210> 156
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 156
Figure 105135184-A0305-02-0232-200
Figure 105135184-A0305-02-0233-201
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 157
Figure 105135184-A0305-02-0233-202
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 158
Figure 105135184-A0305-02-0233-203
<210> 159
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 159
Figure 105135184-A0305-02-0234-204
Figure 105135184-A0305-02-0235-205
<210> 160
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 160
Figure 105135184-A0305-02-0235-206
Figure 105135184-A0305-02-0236-207

Claims (31)

  1. 一種經分離之抗體，其特異性結合HtrA1，其中該抗體包含結合域，該結合域包含以下六個HVR：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO：7)之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO：3)之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列之HVR-L2；且(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列之HVR-L3。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含VH域及VL域，其中該VH域包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；以及該VL域包含與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之抗體，其中該VH域包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；且該VL域包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體特異性結合至HtrA1抗原決定基，其中該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197。
  5. 如請求項4之抗體，其中該HtrA1抗原決定基包含HtrA1蛋白之選自由以下各項組成之群的至少一個胺基酸：Leu192、Pro193及Arg197。
  6. 如請求項5之抗體，其中該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Leu192、Pro193及Arg197。
  7. 如請求項6之抗體，其中該HtrA1抗原決定基包含HtrA1胺基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194及Arg197。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體為單株、人類化或嵌合抗體。
  9. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體為結合至HtrA1之抗體片段。
  10. 如請求項9之抗體，其中該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、 Fab’-SH、Fv、scFv及(Fab’)2片段。
  11. 如請求項10之抗體，其中該抗體片段為Fab。
  12. 如請求項11之抗體，其中該Fab在重鏈恒定區之上鉸鏈中包含截短。
  13. 如請求項12之抗體，其中該重鏈恒定區終止於位置221(EU編號)處。
  14. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：160之重鏈胺基酸序列。
  15. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：159之輕鏈胺基酸序列。
  16. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。
  17. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至16中任一項之抗體。
  18. 一種產生抗體之方法，該方法包括培養包含含如請求項17之經分離之核酸的載體之宿主細胞，及自該宿主細胞或宿主細胞培養基回收該抗體。
  19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至16中任一項之抗體，且進一步包含至少一種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
  20. 如請求項19之醫藥組合物，其中該組合物經凍乾。
  21. 一種如請求項1至16中任一項之抗體的用途，其係用於製備藥劑。
  22. 如請求項21之用途，其中該藥劑係用於治療HtrA1相關病症或眼睛病症。
  23. 如請求項22之用途，其中該HtrA1相關病症或該眼睛病症為年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變或息肉狀脈絡膜血管病變。
  24. 如請求項23之用途，其中該HtrA1相關病症或該眼睛病症為早期乾性AMD、中期乾性AMD或晚期乾性AMD。
  25. 如請求項24之用途，其中該晚期乾性AMD為地圖狀萎縮。
  26. 如請求項21至25中任一項之用途，其中該藥劑與因子D拮抗劑投與，其中該因子D拮抗劑為抗因子D抗體。
  27. 如請求項26之用途，其中該抗因子D抗體為拉姆帕力珠單抗。
  28. 如請求項21至25中任一項之用途，其中經玻璃體內、經眼、眼內、鞏膜旁、筋膜下、脈絡膜上或局部投與該藥劑。
  29. 如請求項28之用途，其中藉由注射經玻璃體內投與該藥劑。
  30. 如請求項21至25中任一項之用途，其中藉由長效遞送系統投與該藥劑。
  31. 如請求項30之用途，其中該長效遞送系統為基於PLGA之固體移植物或植入式端口遞送系統。
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