CN115160439A - 抗-HtrA1抗体及其使用方法 - Google Patents

抗-HtrA1抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供抗‑HtrA1抗体以及制备和使用它们的方法，例如用在治疗HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症的方法中。

Description

抗-HtrA1抗体及其使用方法
本申请是国际申请日2016年10月27日，国际申请号为PCT/US2016/059110，进入中国国家阶段日期为2018年6月1日，中国国家申请号为201680070587.0，发明名称为“抗-HtrA1抗体及其使用方法”的分案申请。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且该序列表通过引用整体结合于此。所述ASCII副本创建于2016年10月25日，名称为50474-117WO4_Sequence_Listing_10_25_16_ST25并且大小为114,779字节。
发明领域
本发明大体上涉及抗-HtrA1抗体和使用它们的方法。
发明背景
丝氨酸蛋白酶HtrA1丝氨酸肽酶1(HtrA1)(PRSS11；PA集群(Clan PA)，51家族)属于HtrA蛋白的一个进化上保守的家族。在人类中，HtrA1、HtrA3、和HtrA4共享相同的结构域构造：N端IGFBP样组件和Kazal样组件，具有胰蛋白酶样折叠的蛋白酶结构域，和C端PDZ结构域。通过鉴别引起家族性缺血性脑小血管疾病(familial ischemic cerebral small-vessel disease)的人类功能缺失突变，已经可靠地确认了HtrA1的生理相关性。分子机制涉及引起增加的TGFβ信号传导的通过HtrA1的缺陷TGFβ抑制。也许与多种细胞外基质成分的HtrA1介导的降解一起，或者间接经由基质金属蛋白酶的上调，经由异常HtrA1表达的失调的TGFβ信号传导还可以导致关节炎疾病。另外，人类遗传研究确认了年龄相关性黄斑变性(AMD)的发展与HtrA1启动子区中的SNP之间的强的相关性，所述HtrA1启动子区中的SNP引起了增加的HtrA1转录水平(参见例如,Dewan等,Science 314:989-992,2006和Yang等,Science 314:992-993,2006)。
AMD是中央视网膜的进行性的慢性疾病，其对视觉敏锐性有显著后果。在工业化国家中，该疾病的晚期形式是视力丧失的主要原因。对于≥40岁的高加索人群，早期AMD的患病率估计在约6.8％而晚期AMD在约1.5％。在80岁后，晚期AMD的患病率随年龄增长显著增加至约11.8％。存在两种类型的AMD，非渗出性(干性)AMD和渗出性(湿性)AMD。更常见的干性AMD包括中央视网膜(黄斑)下的视网膜色素上皮(RPE)的萎缩和肥大性改变以及RPE上的沉积物(玻璃疣)。晚期干性AMD可以导致显著的视网膜损伤，包括地图状萎缩(GA)，以及不可逆的视力丧失。此外，患有干性AMD的患者可以进展至湿性形式，其中在视网膜下发展出被称为脉络膜新生血管膜(CNVM)的异常血管，渗液和渗血，并且最终导致视网膜中和视网膜下的致盲性盘状瘢痕。
仍然需要具有改善的性质(诸如结合亲和力、稳定性和抑制(阻断)活性)的抗-HtrA1抗体，以及其治疗性和诊断用途。
发明概述
本发明提供抗-HtrA1抗体及使用所述抗-HtrA1抗体用于治疗和诊断目的的方法。本发明的抗-HtrA1抗体具有高效力并且对HtrA1具有高结合亲和力。本发明的抗体的改善的性质使得它们适合用于治疗。
在一个方面，本发明涵盖与HtrA1表位特异性结合的分离的抗体，其中HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197组成的组，其中氨基酸编号参考人HtrA1前体蛋白的编号。
在一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由Leu192、Pro193和Arg197组成的组。
在另一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少两个氨基酸，所述氨基酸选自由Leu192、Pro193和Arg197组成的组。
在特别的实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Leu192、Pro193和Arg197。
在另一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Arg190、Leu192、Pro193和Arg197。
在另外的实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197。
在一个方面，本发明的特征在于分离的抗体，所述抗体以约550pM或更低的KD与人HtrA丝氨酸肽酶1(HtrA1)特异性结合。在一些实施方案中，抗体以约40pM至约550pM的KD与人HtrA1特异性结合。在一些实施方案中，抗体以约40pM至约250pM的KD与人HtrA1特异性结合。在一些实施方案中，抗体以约50pM至约125pM的KD与人HtrA1特异性结合。在一些实施方案中，抗体以约110pM的KD与人HtrA1特异性结合。在一些实施方案中，抗体以约60pM的KD与人HtrA1特异性结合。在一些实施方案中，通过表面等离子共振(SPR)(例如
Figure BDA0003672327960000031
SPR)测量KD。在一些实施方案中，如本文描述的(例如在实施例部分中)进行SPR。
在一些实施方案中，任一种前述抗体都能够抑制HtrA1的活性。在一些实施方案中，抗体以1.5nM或更低的50％抑制浓度(IC50)抑制人HtrA1的蛋白酶结构域(huHtrA1-PD)的活性。在一些实施方案中，抗体以0.25nM至约0.5nM的IC50抑制huHtrA1-PD的活性。在一些实施方案中，抗体以约0.3nM的IC50抑制huHtrA1-PD的活性。在一些实施方案中，抑制活性是基于FRET的体外阻断测定的测量值。在一些实施方案中，基于FRET的体外阻断测定包括H2-Opt探针(例如SEQ ID NO:152)的切割。在一些实施方案中，如本文描述的(例如在实施例部分中)进行基于FRET的体外阻断测定。
在以上方面的一些实施方案中，抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含DSEX1H(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1，其中X1是Met或Leu；(b)包含GVDPETX2GAAYNQKFKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X2是Glu或Asp；和(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含GYDYDYALDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，抗体还包含：(a)包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列的FR-H1，其中X1是Lys或Thr并且X2是Thr、Lys或Arg；(b)包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H4。在一些实施方案中，抗体还包含：(a)包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H4。
在以上方面的一些实施方案中，结合结构域还包含：(a)包含RASSSVX3FIH(SEQ IDNO:4)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X3是Glu或Asn；(b)包含ATSX4LAS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的HVR-L2，其中X4是Asn、His或Glu；和(c)包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X5是Ser或Tyr并且X6是Ala或Asn。在一些实施方案中，结合结构域还包含：(a)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含ATSNLAS(SEQ IDNO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体还包含：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)结构域；(b)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域还包含：(a)包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H4。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域还包含：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含DSEX1H(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1，其中X1是Met或Leu；(b)包含GVDPETX2GAAYNQKFKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X2是Glu或Asp；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVX3FIH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X3是Glu或Asn；(e)包含ATSX4LAS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的HVR-L2，其中X4是Asn、His或Glu；和(f)包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X5是Ser或Tyr并且X6是Ala或Asn。在一些实施方案中，结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVEFIH(SEQ IDNO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域还包含：(a)包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H4。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域还包含：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；和(b)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)结构域；(b)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域还包含：(a)包含QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVKQTPVHGLEWIG(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列的FR-H4。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域还包含：(a)包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-L4。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；和(b)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含SYIMS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含LASKLES(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域还包含：(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列的FR-H4。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域还包含：(a)包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列的FR-L4。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；和(b)包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)结构域；(b)包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域还包含：(a)包含EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTAVTVSS(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的FR-H4。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域还包含：(a)包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列的FR-L4。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；和(b)包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)结构域；(b)包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)结构域；(b)包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)结构域；(b)包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在任一个前述方面中的一些实施方案中，抗体是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在特别的实施方案中，抗体是单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在任一个前述方面中的一些实施方案中，抗体是与HtrA1结合的抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段选自由Fab、Fab’-SH、Fv、scFV和(Fab’)2片段组成的组。在一些实施方案中，抗体片段是Fab。在一些实施方案中，Fab包含重链恒定区的铰链区中的平截(truncation)。在一些实施方案中，Fab包含重链恒定区的上铰链中的平截。在一些实施方案中，重链恒定区在位置221处(EU编号)终止。在一些实施方案中，位置221处的氨基酸残基是天冬氨酸(Asp)残基。在一些实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:159的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:159的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab是IgG1 Fab。
在任一个前述方面中的一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是单特异性抗体。
在任一个前述方面中的一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含与因子D结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，第二结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu。在一些实施方案中，第二结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，第二结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:120的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1和因子D两者特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含与HtrA1特异性结合的第一结合结构域和与因子D特异性结合的第二结合结构域，所述第一结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3；所述第二结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，本发明的特征在于与HtrA1和因子D两者特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含与HtrA1特异性结合的第一结合结构域和与因子D特异性结合的第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，所述第二结合结构域包含：(a)包含与SEQ IDNO:119的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含与SEQID NO:120的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域。
在以上方面的一些实施方案中，本发明涵盖与HtrA1表位特异性结合的分离的抗体，其中HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197组成的组，其中氨基酸编号参考人HtrA1前体蛋白的编号。
在一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由Leu192、Pro193和Arg197组成的组。
在特别的实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Leu192、Pro193和Arg197。
在另一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Arg190、Leu192、Pro193和Arg197。
在另外的实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197。
在另一个方面，本发明的特征在于分离的核酸，所述核酸编码任一种本文描述的抗体。在另一个方面，本发明的特征在于包含用于表达抗体的分离的核酸的载体(例如表达载体)。在另一个方面，本发明的特征在于包含前述核酸和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或293细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，原核细胞是大肠杆菌(E.coli)。
在另一个方面，本发明的特征在于一种产生任一种本文描述的抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养包含任一种前述载体(例如表达载体)的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞或培养基回收抗体。
在另一个方面，本发明的特征在于包含任一种前述抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药用载体、赋形剂或稀释剂。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物是冻干的。在一些实施方案中，组合物还包含因子D结合拮抗剂。在一些实施方案中，因子D结合拮抗剂是抗-因子D抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab或(Fab’)2。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ IDNO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:120的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-因子D抗原结合抗体片段是lampalizumab。
在另一个方面，本发明涵盖包含任一种前述抗-HtrA1抗体与因子D拮抗剂的组合疗法。在特别的实施方案中，因子D拮抗剂是抗-因子D抗体。在特别的实施方案中，因子D拮抗剂是lampalizumab。在特别的实施方案中，将抗-因子D拮抗剂顺序施用。
在一些方面，任一种前述抗体可以用作药物。
在一些方面，任一种前述抗体可以用于治疗HtrA1相关的病症或眼部病症。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或眼部病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病或息肉状脉络膜血管病。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或眼部病症是AMD。在一些实施方案中，AMD是早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。在一些实施方案中，晚期干性AMD是地图状萎缩。
在一些方面，任一种前述抗体可以用于制备用于治疗HtrA1相关的病症或眼部病症的药物。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或眼部病症是AMD、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病或息肉状脉络膜血管病。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或眼部病症是AMD。在一些实施方案中，AMD是早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。在一些实施方案中，晚期干性AMD是地图状萎缩。在一些实施方案中，药物经配制用于与因子D结合拮抗剂组合使用。在一些实施方案中，因子D结合拮抗剂是抗-因子D抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab或(Fab’)2。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ IDNO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:120的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-因子D抗原结合片段是lampalizumab。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的受试者中HtrA1相关的病症或眼部病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的任一种前述抗体的抗体。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或眼部病症是AMD、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病或息肉状脉络膜血管病。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或眼部病症是AMD。在一些实施方案中，AMD是早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。在一些实施方案中，晚期干性AMD是地图状萎缩。在一些实施方案中，所述方法还包括施用因子D结合拮抗剂。
在另一个方面，本发明的特征在于一种用于抑制受试者中视网膜或光感受器细胞变性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任一种前述抗体，从而抑制视网膜或光感受器细胞变性。
在另一个方面，本发明的特征在于一种用于抑制受试者眼睛中的HtrA1丝氨酸蛋白酶活性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任一种前述抗体，从而抑制眼睛中的HtrA1丝氨酸蛋白酶活性。在一些实施方案中，所述方法还包括施用因子D结合拮抗剂。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的受试者中HtrA1相关的病症或补体相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的HtrA1结合拮抗剂和因子D结合拮抗剂。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或补体相关的病症是眼部病症。在一些实施方案中，眼部病症选自由以下各项组成的组：AMD、糖尿病性视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞、角膜血管化和视网膜新血管形成。在一些实施方案中，眼部病症是AMD。在一些实施方案中，AMD是早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。在一些实施方案中，晚期干性AMD是地图状萎缩。在一些实施方案中，HtrA1结合拮抗剂是抗-HtrA1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自由Fab、Fab’-SH、Fv、scFV和(Fab’)2片段组成的组。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab。在一些实施方案中，Fab包含重链恒定区的上铰链中的平截。在一些实施方案中，重链恒定区在位置221处(EU编号)终止。在一些实施方案中，位置221处的氨基酸残基是天冬氨酸(Asp)残基。在一些实施方案中，重链恒定区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQID NO:159的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:159的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab是IgG1Fab。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的受试者中HtrA1相关的病症或补体相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任一种前述抗体和治疗有效量的因子D结合拮抗剂。
在任一个前述方面的一些实施方案中，因子D结合拮抗剂是抗-因子D抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab或(Fab’)2。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ IDNO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ IDNO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ IDNO:120的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL结构域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-因子D抗原结合片段是lampalizumab。
在任一个前述方面的一些实施方案中，HtrA1相关的病症或补体相关的病症是眼部病症。在一些实施方案中，眼部病症选自由以下各项组成的组：AMD、糖尿病性视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病(vonHippel-Lindau disease)、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞、角膜血管化和视网膜新血管形成。在一些实施方案中，眼部病症是AMD。在一些实施方案中，AMD是早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。在一些实施方案中，晚期干性AMD是地图状萎缩。
在任一个前述方面的一些实施方案中，通过以下方式施用抗体：玻璃体内、经眼、眼内、巩膜旁、筋膜下、脉络膜上、局部、静脉内、肌内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、腹膜内、经腹膜、心室内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眶内、经口、透皮、通过吸入、通过注射、通过滴眼液、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴(bathing)靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏(creme)中或在脂质组合物中。在一些实施方案中，玻璃体内、经眼、眼内、巩膜旁、筋膜下、脉络膜上或局部施用抗体。在一些实施方案中，通过注射玻璃体内施用抗体。在一些实施方案中，通过滴眼液或软膏局部施用抗体。在一些实施方案中，通过长效递送系统施用抗体。在特别的实施方案中，长效递送系统是基于PLGA的固体植入物或可植入端口递送系统。
在任一个前述方面中的一些实施方案中，受试者是人。
附图简述
图1A-1B是这样的图，其表明大多数酶联免疫吸附测定(ELISA)阳性杂交瘤克隆显示出与人(hu)和鼠(mu)HtrA1蛋白酶结构域(PD)二者具有相似的反应性谱。该图显示了所示75个克隆中每一个在650nm处的光密度(OD650nm)。该测定中的背景信号<0.05OD650nm。人和鼠HtrA1蛋白酶结构域共享91％的同源性。
图2A是阻断测定的示意图，该阻断测定用于确定所示抗-HtrA1杂交瘤克隆上清液抑制HtrA1-PD介导的切割
Figure BDA0003672327960000181
FL标记的荧光底物的能力。
图2B-2C是这样的图，其显示了10个抗-HtrA1杂交瘤克隆上清液显著抑制人HtrA1-PD介导的底物切割，其中使用图2A和实施例1中描述的阻断测定。该图显示了来自所示克隆的杂交瘤上清液的平均荧光信号(千分之一相对荧光单位mRFU)/分钟)。条件培养基(CM或条件培养基)中的10μg/ml抗体YW505.94(也称为“94IgG”，参见国际专利申请公开号WO 2013/055998，其通过引用整体结合于此)作为阳性对照，以表明测定并未显示由培养基引起的变化并且在测定时间内是稳定的。缓冲液或培养基作为阴性对照。图2C显示了缓冲液培养基E(来自CLONACELLTM的富营养培养基)和条件培养基的测定的初始和最终结果。100％表示完全抑制。
图3A-3B是这样的图，其显示了所示杂交瘤上清液抑制muHtrA1-PD(图3A)或huHtrA1-PD(图3B)切割荧光底物的能力。在图3A中，以40μl muHtrA1-PD与60μl杂交瘤上清液的比率使用40nM的muHtrA1-PD。在图3B中，以40μl huHtrA1-PD与60μl杂交瘤上清液的比率使用20nM的huHtrA1-PD。抗体YW505.94(“94IgG”)作为阳性对照。缓冲液和CM作为阴性对照。
图4A是基于FRET的阻断测定的示意图，该阻断测定用于确定纯化的抗-HtrA1抗体克隆抑制HtrA1-PD介导的切割基于FRET的底物H2-Opt的能力。
图4B-4C是这样的图，其显示了纯化的抗体克隆15H6、19B12、3A5、12A5和20E2保留了抑制鼠(图4B)和人(图4C)HtrA1-PD介导的底物切割的能力。无抗体添加(“无ab”)作为阴性对照，而抗体YW505.94(“94IgG”)作为阳性对照。纯化的抗体以5nM、50nM或500nM的浓度添加。在图4B中显示的测定中使用15nM的muHtrA1-PD-Fc，而在图4C中显示的测定中使用3nM的huHtrA1-PD-Fc。
图5A-5B是这样的图，其显示了所示纯化mIgG抗体克隆抑制FRET肽底物的全长人HtrA1(huHtrA1-FL)介导的切割。该图显示了活性(mRFU/min)作为IgG浓度的函数。huHtrA1-FL以5nM的浓度添加。如Cifferi等人(2015)Biochem.J.472(2):169-81中描述的IgG格式的YW505.94(“IgG94”)及其嵌合变体(“IgG94-ch”)作为阳性对照。显示了每个抗体克隆的半数最大抑制浓度(IC50)。
图5C-5D是这样的图，其显示了所示纯化mIgG抗体克隆抑制FRET肽底物的muHtrA1-FL介导的切割。该图显示了活性(mRFU/min)作为IgG浓度的函数。muHtrA1-FL以5nM添加。IgG94和IgG94-ch作为阳性对照，如图5A和5B的附图描述中所描述的。显示了半数最大抑制浓度(IC50)。
图6A显示了抗体克隆19B12、20E2、3A5、12A5和15H6的重链可变区(VH)的氨基酸序列的序列比对。
图6B显示了抗体克隆19B12、20E2、3A5、12A5和15H6的轻链可变区(VL)的氨基酸序列的序列比对。
图7A-7B是这样的图，其显示了基于FRET的阻断测定的结果，该阻断测定使用从杂交瘤上清液(“hyb”)纯化的或从293细胞(“293”)重组表达的mIgG抗体克隆15H6(图7A)或克隆19B12(图7B)。该图显示了Vmax(mRFU/min)作为抗体浓度(nM)的函数。在每个测定中使用3nM的huHtrA1-FL。还显示了所示抗体克隆的IC50值。
图8A-8B显示了抗-HtrA1抗体克隆m15H6、H15H6.v1、H15H6.v2和15H6.v2.APEG(本文中也称为“h15H6.v3”)的VL(图8A)和VH(图8B)的氨基酸序列相比于人共有κ1序列(图8A)或VH1序列(图8B)的序列比对。HVR序列由每个抗体克隆的表示框限定。根据Kabat定义的HVR序列是加下划线的。以阴影框中白色文本显示的残基表示人共有VH1序列与抗-HtrA1抗体克隆之间不同的残基。
图9A-9D是这样的图，其显示了m15H6或h15H6.v1结合捕获链霉抗生物素蛋白的生物素化人或鼠HtrA1的BIACORETM表面等离子共振(SPR)分析结果。采用单循环动力学分析。该图显示了响应单位(RU)作为时间(秒)的函数。图9A显示了m15H6 Fab与huHtrA1结合的结果。图9B显示了m15H6 Fab与muHtrA1结合的结果。图9C显示了h15H6.v1与huHtrA1结合的结果。图9D显示了h15H6.v1与huHtrA1结合的结果。从每个分析中确定的Kon、Koff和KD在每个图中作为文本显示。
图10A-10B是这样的图，其显示了所示h15H6.v1 Fab变体与鼠(图10A)或人(图10B)HtrA1结合的噬菌体竞争ELISA实验的结果。该图显示了结合噬菌体(OD450 nm)作为HtrA1浓度(nM)的函数。
图11A-11B是这样的图，其显示了BIACORETMSPR分析的结果，该分析比较了抗体克隆h15H6.v2以及HVR-L3 LC-W91L和LC-W91Y变体与鼠(图11A)或人(图11B)HtrA1的结合。使用的抗体为Fab格式。从每个分析中确定的Kon、Koff和KD在每个图中作为文本显示。
图12A是这样的图，其显示了BIACORETMSPR分析的结果，该分析比较了抗体克隆h15H6.v2(亲本)与VL位置94处的所示变体(即，LC-N94ALC-P95(AP)、LC-N94E LC-P95(EP)、LC-N94Q LC-P95(QP)和LC-N94SLC-P95(SP))对huHtrA1的结合。使用的抗体为Fab格式。该图显示了响应单位(RU)作为时间(秒)的函数。
图12B是总结了图12A中所示的BIACORETMSPR分析结果的表格。
图13A是这样的图，其显示了BIACORETMSPR分析的结果，该分析比较了抗体克隆h15H6.v2(亲本)与VH位置55和/或56处的所示变体(即，HC-D55A HC-G56(AG)、HC-D55E HC-G56(EG)、HC-D55S HC-G56(SG)和HC-D55 HC-G56A(DA))对huHtrA1的结合。使用的抗体为Fab格式。该图显示了响应单位(RU)作为时间(秒)的函数。
图13B是总结了图13A中所示的BIACORETMSPR分析结果的表格。
图14A是这样的图，其显示了BIACORETMSPR分析的结果，该分析比较了抗体克隆h15H6.v2(亲本)与VL位置94处和VH位置55和/或56处的所示组合变体对huHtrA1的结合。AP_EG：LC-N94A LC-P95 HC-D55EHC-G56(也称为“h15H6.v2.APEG”和“h15H6.v3”)。EP_EG：LC-N94ELC-P95 HC-D55E HC-G56。QP_EG：LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56。SP_EG：LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56。
图14B是总结了图14A中所示的BIACORETMSPR分析结果的表格。
图14C是这样的图，其显示了基于FRET的阻断测定的结果，该阻断测定测试了h15H6.v2 IgG、h15H6.v2 Fab以及VL位置94处和VH位置55和/或56处的所示组合变体抑制HtrA1活性的能力。该图绘制了百分比最大活性作为对数抗体浓度(M)的函数。
图14D是显示了图14C中测试的每种抗体克隆的IC50值的表格。
图15A-15B显示了抗-HtrA1抗体克隆m19B12和h19B12.v1的VL(图15A)和VH(图15B)的氨基酸序列相比于人共有κ4序列(图15A)或VH3序列(图15B)的序列比对。HVR序列由每个抗体克隆的表示框限定。根据Kabat定义的HVR序列是加下划线的。以阴影框中白色文本显示的残基表示人共有VH1序列与抗-HtrA1抗体克隆之间不同的残基。
图16A-16D是这样的图，其显示了抗体克隆m19B12或h19B12.v1结合人或鼠HtrA1的BIACORETMSPR分析结果。采用单循环动力学分析。该图显示了响应单位(RU)作为时间(秒)的函数。图16A显示了m19B12 Fab与huHtrA1结合的结果。图16B显示了m19B12 Fab与muHtrA1结合的结果。图16C显示了h19B12.v1与huHtrA1结合的结果。图16D显示了h19B12.v1与huHtrA1结合的结果。每个分析的Kon、Koff和KD在每个图中作为文本显示。
图17是概述用于亲和力成熟的h15H6.v2的HC和LC HVR的NNK深度扫描诱变的噬菌体淘选策略的示意图。
图18A-18B显示了所示VH(图18A)或VL(图18B)HVR位置处的突变的富集比率的log2的热图，所述比率通过将分选样品中给定位置处的给定突变的频率除以未分选样本中完全相同的突变的频率来计算。示例性突变的富集比率在热图下显示。
图19是这样的表格，其显示了与来自NNK文库和/或h15v6.v2的VH和VL的软随机化文库的未分选样品相比，在分选样品中鉴定为富集的突变。
图20是这样的表格，其显示了所示亲和力成熟Fab抗体变体克隆的结合的BIACORETMSPR分析结果。相比于h15H6.v2和h15H6.v2.APEG(也称为h15H6.v3)，显示了由该分析获得的每个亲合力成熟抗体变体克隆的的Kon、Koff和KD。
图21A-21B显示了亲和力成熟变体抗-HtrA1抗体克隆的VL(图21A)和VH(图21B)的氨基酸序列的序列比对。
图22A是这样的表格，其总结了所示亲和力成熟变体抗-HtrA1 Fab抗体克隆抑制HtrA1活性的结果(如在基于FRET的H2-Opt活性测定中评价的)。该表显示了来自3次独立实验的结果以及平均值和标准误差(StDev)。这些实验采用了速率(RFU/s)分析。
图22B是这样的图，其显示了来自使用图22A所示的重组HtrA1进行的H2-Opt活性测定的结果的示例性曲线图。测定条件包括400pM HtrA1和2.5μM底物。缓冲液是50mMTris，200mM NaCl，0.25％CHAPS，pH 8.3。这些数据来自图22A中的三次独立实验的第二次重复。
图23A-23D是这样的图，其显示了使用RFU/s速率方法分析的所示h15H6抗体变体格式的H2-Opt活性测定的结果。该图显示了对照的百分比(RFU/S)作为h15H6.v4 IgG单克隆抗体(mAb)(图23A)、阳性对照抗-HtrA1抗体(YW505.94AIgG，参见例如WO 2013/055998)(图23B)、h15H6.v4 Fab(图23C)和15H6.v2 Fab(图23D)的抗体浓度的函数。每张图旁边的表格显示了每次分析的IC50、Y范围、斜率和背景。
图23E-23H是这样的图，其显示了使用终点(RFU)方法分析的所示h15H6抗体变体格式的H2-Opt活性测定的结果。该图显示了对照的百分比(RFU/S)作为h15H6.v4 IgG Mab(图23E)、阳性对照抗-HtrA1抗体(YW505.94A IgG)(图23F)、h15H6.v4 Fab(图23G)和15H6.v2 Fab(Fig.23H)的抗体浓度的函数。每张图旁边的表格显示了每次分析的IC50、Y范围、斜率和背景。
图24A-24B是这样的表格，其显示了来自三次独立实验中第一组的所示h15H6抗体变体格式的IC50(图24A)和IC90(图24B)结果。使用4参数拟合来确定IC50值。由IC50值和拟合的斜率确定IC90值。实验I对应于图23A-23F所示的数据。CV％，变异系数。使用速率(RFU/s)方法分析数据。
图25A-25B是这样的表格，其显示了来自三次独立实验中第二组的所示h15H6抗体变体格式的IC50(图25A)和IC90(图25B)结果。使用4参数拟合来确定IC50值。由IC50值和拟合的斜率确定IC90值。使用速率(RFU/s)方法或终点(RFU)方法来分析数据。
图26A是这样的图，其显示了完整的α-酪蛋白滴定曲线。将实验浓度绘制为理论添加(spike-in)浓度(μg/ml)的函数。相关系数(R2)为0.999。
图26B是这样的图，其显示了基于质谱的HtrA1活性测定的结果。如实施例3的G部分所描述的，评价APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)抑制Htra1-PD活性的能力。小分子抑制剂ucf-101作为阳性对照。
图27A-27B是这样的图，其显示了来自两次独立内源性HtrA1活性测定(即，实验I(图27A)和实验II(图27B))的结果。对于每种抗体Fab，#1和#2表示用初始稀释物分别进行的相同抗体的单独稀释系列。两个稀释系列与来自相同制备物的其它试剂在相同的平板上运行。
图27C是这样的表格，其总结了图27A和27B所示的内源性HtrA1活性测定的结果。
图28是这样的表格，其总结了所示h15H6.v2 Fab变体和衍生物的动力学结合性质和抑制活性。YW505.94a.28(参见例如WO 2013/055998)作为阳性对照。与YW505.94a.28Fab相比时，所有h15H6 Fab变体和衍生物显示出改善的亲和力和改善的效力，而与该抗体相比时，h15H6.v4 Fab显示出大约30倍的亲和力改善。
图29A显示了人HtrA1的氨基酸序列。成熟序列用大写字母表示，蛋白酶结构域是加下划线的，并且残基N224和K248用阴影表示。
图29B显示了鼠HtrA1的氨基酸序列。成熟序列用大写字母表示，并且蛋白酶结构域是加下划线的。
图30显示了参比抗-因子D抗体(“WT”)及其选择变体的轻链和重链可变结构域的比对。可变结构域内的HVR是加下划线的。变体中的残基置换以粗体显示。
图31A-31B描述了YW505.94 Fab(如WO 2013/055998中所描述的)与HtrA1的结合。当图31A中指定的氨基酸被丙氨酸替换时，YW505.94 Fab对突变蛋白的结合亲和力降低。如Ciferri等人(2015)Biochem.J.472(2):169-81所描述的，使用电子显微镜产生图31B所示的结构。圆圈显示HtrA1蛋白上的YW505.94 Fab表位。YW505.94 Fab与HtrA1蛋白的“B”环和“C”环结合。
图32A-32B描绘了15H6.v4 Fab与HtrA1的结合，并且显示了15H6.v4 Fab结合的HtrA1表位不同于YW505.94 Fab结合的表位。图32A描绘了15H6.v4 Fab与HtrA1蛋白上的其表位之间的相互作用，如通过X-射线晶体学确定的。15H6.v4 Fab与HtrA1蛋白的LA环结合(参见例如Glaza P等人(2015)PLoS One 10(6):e0131142)。使用电子显微镜产生图32B所示的结构。圆圈显示HtrA1蛋白上的15H6V.4Fab表位。
发明详述
I.定义
如本文所使用的术语“约”是指该技术领域中的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“约”某个值或参数的提及包括(并且描述)涉及该值或参数本身的方面。
出于本文目的，“受体人框架”是这样的框架，其包含如下文定义的来源于人免疫球蛋白框架或人共有序列框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或者2或更小。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
在本发明的抗体的语境中，“活性的”或“活性”或“生物活性”是例如在体外和/或在体内拮抗(部分或完全抑制)其靶标的生物活性的能力。抗体的生物活性的一个实例是实现与其靶标相关的病症的状态(例如病理学)的可测量的改善。例如，对于抗-HtrA1抗体，所述病症可以是HtrA1相关的病症，诸如例如AMD(例如，地图状萎缩)。可以在体外或体内测试中使用相关动物模型或人临床试验来确定抗-HtrA1抗体的活性，所述测试包括结合测定、活性测定(例如，基于FRET的活性测定(例如使用H2-Opt底物)或基于质谱的活性测定)。在另一个实例中，对于抗-因子D抗体(例如抗-HtrA1/抗-因子D抗体)，所述病症可以是补体相关的病症，诸如例如补体相关性眼部病症。可以在体外或体内测试中使用相关动物模型或人临床试验来确定抗-因子D抗体的活性，所述测试包括结合测定、旁路途径溶血测定(例如测量旁路途径补体活性或激活的抑制的测定)。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总计强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表。亲和力可以通过本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体是指与不拥有这类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)和/或框架区(FR)中具有一个或多个改变的抗体，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗-HtrA1抗体”和“与HtrA1特异性结合的抗体”是指这样的抗体：所述抗体能够以足够的亲和力结合HtrA1从而该抗体可用作靶向HtrA1的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗-HtrA1抗体与不相关的非HtrA1蛋白质结合的程度小于该抗体与HtrA1结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的。在某些实施方案中，与HtrA1结合的抗体具有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M以下，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗-HtrA1抗体与来自不同物种的HtrA1之间保守的HtrA1表位结合。抗-HtrA1抗体可以是例如本文描述的或在国际专利申请公开号WO 2013/055998(通过引用整体结合于此)中的任何抗-HtrA1抗体。
术语“抗-因子D抗体”和“与因子D特异性结合的抗体”是指这样的抗体：所述抗体能够以足够的亲和力结合因子D从而该抗体可用作靶向因子D的诊断剂和/或治疗剂(例如以抑制或实质上降低补体激活的方式)。在一个实施方案中，抗-因子D抗体与不相关的非因子D蛋白质结合的程度小于该抗体与因子D结合的约10％，如例如通过RIA所测量的。在某些实施方案中，与因子D结合的抗体具有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M以下，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗-因子D抗体与来自不同物种的因子D之间保守的因子D表位结合。抗-因子D抗体可以是本文描述的和/或在美国专利号8,067,002；8,273,352；和8,268,310；和美国专利申请号14/700,853(其每一个通过引用整体结合于此)中的任何抗-因子D抗体。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的包含完整抗体的一部分的分子，所述部分结合与完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段(其命名反映了易于结晶的能力)。Fab片段由完整轻(L)链连同重(H)链的可变区结构域(VH)以及一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成。用木瓜蛋白酶处理抗体得到单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段并且仍然能够与抗原交联。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有另外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文对Fab’的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。F(ab’)2抗体片段最初是作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对而产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
术语“Fc区”在本文中用来限定含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区域。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述的EU编号体系，也称作EU索引(index)。
“Fv”由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的、非共价缔合的二聚体组成。从这些两个结构域的折叠产生六个高变环(3个环各自来自H和L链)，所述高变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基并且将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使单个可变结构域(或只包含对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然通常亲和性低于完整结合位点。
“单链Fv”(也简称为“sFv”或“scFv”)是包含结合至单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选的，sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Plückthun，在The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指通过以下方式制备的小抗体片段：用VH和VL结构域之间的短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(参见前面的段落)，使得实现V结构域的链间配对(而不是链内配对)，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两种“交换型(crossover)”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更完整地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448,1993中。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。某些封闭抗体或拮抗剂抗体基本上或完全地抑制抗原的生物活性。
“与参比抗体结合相同表位的抗体”是指与参比抗体相比接触抗原的氨基酸残基的重叠集的抗体，或者在竞争测定中阻断参比抗体与其抗原的结合达50％以上的抗体。例如，可以通过确定与抗原复合的抗体的晶体结构或通过进行氢/氘交换来确定与抗原接触的抗体的氨基酸残基。在一些实施方案中，位于抗原
Figure BDA0003672327960000271
内的抗体残基被认为与抗原接触。在一些实施方案中，与参比抗体结合相同表位的抗体在竞争测定中阻断参比抗体与其抗原的结合达50％以上，并且反过来，参比抗体在竞争测定中阻断该抗体与其抗原的结合达50％以上。示例性竞争测定在本文中提供。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在抗体的5种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“效应子功能”是指随抗体同种型变化的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“框架”或“框架区”或“FR”是指不同于高变区(HVR)残基的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体(intact antibody)”和“全抗体(whole antibody)”在本文中可互换地用来指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
“铰链区”通常被定义为从人IgG1的216-238(EU编号)或226-251(Kabat编号)延伸。铰链还可以分为三个不同的区域，即上铰链、中铰链(例如核心铰链)和下铰链。在某些实施方案中，人IgG1抗体的铰链区通常如下定义：
上铰链包含具有序列EPKSCDKTHT(SEQ ID NO:157)的氨基酸。在某些实施方案中，上铰链包含位置216-225(EU编号)或226-238(Kabat编号)处的氨基酸。
中铰链(例如核心铰链)包含具有序列CPPC(SEQ ID NO:122)的氨基酸。在某些实施方案中，核心铰链包含位置226-229(EU编号)或239-242(Kabat编号)处的氨基酸。
下铰链包含具有序列PAPELLGGP(SEQ ID NO:158)的氨基酸。在某些实施方案中，下铰链包含位置230-238(EU编号)或243-251(Kabat编号)处的氨基酸。
“人抗体”是这样的一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或者拥有对应于来源于利用人抗体库或其它编码人抗体的序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是这样的框架，其代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,NIH Publication91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如上文Kabat等人中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如上文Kabat等人中的亚组III。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是含有来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。对于最大的部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体高变区的残基被来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物)的具有所需抗体特异性、亲和力和能力的高变区(供体抗体)的残基替代。在一些情形中，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少1个、并且典型2个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的那些对应，并且全部或基本上全部的FR与人免疫球蛋白序列的那些对应。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
术语“可变”是指这样的事实：可变结构域的某些区段在抗体间的序列上广泛不同。可变或“V”结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非均匀分布在可变结构域的跨度内。相反地，V区由被每个长度为9-12个氨基酸的具有最大可变性的较短区域(被称为“高变区”)分隔的15-30个氨基酸的相对不变的区段(被称为框架区(FR))组成。当在本文中使用时，术语“高变区”或“HVR”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自例如大约在VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)周围的氨基酸残基和大约在VH中的残基26-35(H1)、49-65(H2)和95-102(H3)周围的氨基酸残基(在一个实施方案中，H1大约在残基31-35周围)；Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991))，和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和VH中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3))；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其大多采取β折叠构型，通过三个高变区连接，所述三个高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β折叠结构的部分。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。因此，HVR序列和FR序列通常按照以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是展现出多种效应子功能，诸如在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”、“Kabat氨基酸残基”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指用于Kabat等人(参上)中的抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入可变结构域的FR或HVR。例如，重链可变结构域可以包括H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
当提及可变结构域中的残基(大约为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如Kabat等人(参上)报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文中另有说明，否则对抗体可变结构域中残基编号的提及意指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文中另有说明，否则对抗体恒定结构域中的残基编号的提及意指通过EU编号系统的残基编号(例如，参见美国临时申请号60/640,323，用于EU编号的附图)。
除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其它残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源性分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
当用于描述本文公开的各种抗体时，术语“分离的抗体”意指已经从表达所述抗体的细胞或细胞培养物中鉴定并分离和/或回收的抗体。它的天然环境的污染物组分是通常将干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其它蛋白性的或非蛋白性的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法所确定的。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。在优选的实施方案中，抗体将被(1)纯化至足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，如通过使用旋杯式序列分析仪，或(2)纯化至同质性，通过在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染料的SDS-PAGE。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为多肽的天然环境的至少一种组分将将是不存在的。然而，通常将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了例如含有天然存在突变的或在产生单克隆抗体制备物期间出现的可能变体抗体，这类变体通常以微量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示如从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不解释为需要通过任何特殊方法产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于制造单克隆抗体的这类方法和其它示例性方法在本文中描述。
术语“多特异性抗体”以最广意义使用并且具体涵盖包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VH-VL单元具有多表位特异性(即，能够与一个生物分子上的两个不同表位或不同生物分子上的每个表位结合)。这种多特异性抗体包括，但不限于，全长抗体、具有两个以上VL和VH结构域的抗体、抗体片段(诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体)、已经共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指与相同或不同靶标上的两个以上不同表位特异性结合的能力。“双重特异性”或“双特异性”是指与相同或不同靶标上的两个不同表位特异性结合的能力。然而，与双特异性抗体相反，双重特异性抗体具有氨基酸序列相同的两个抗原结合臂，并且每个Fab臂能够识别两种抗原。双重特异性允许抗体作为单个Fab或IgG分子与两种不同抗原以高亲和力相互作用。根据一个实施方案，IgG1形式的多特异性抗体以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力与每个表位结合。“单特异性”是指仅与一个表位结合的能力。
“天然抗体”是指具有变化的结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而分配为两种类型(称作κ和λ)之一。
关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合特定多肽或特定多肽靶标上的表位”或“与特定多肽或特定多肽靶标上的表位特异性地结合”或“对特定多肽或特定多肽靶标上的表位具有特异性”意指在测量上不同于非特异性相互作用的结合。例如通过与对照分子的结合相比确定分子的结合可以测量特异性结合。例如，通过与对照分子的竞争可以确定特异性结合，所述对照分子类似于靶标，例如，过量的未标记的靶标。在该情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。如本文所使用的，术语“特异性结合特定多肽或特定多肽靶标上的表位”或“与特定多肽或特定多肽靶标上的表位特异性结合”或“对特定多肽或特定多肽靶标上的表位具有特异性”可以例如通过对靶标具有以下KD的分子展示：10-4M以下、备选地10-5M以下、备选地10-6M以下、备选地10-7M以下、备选地10-8M以下、备选地10-9M以下、备选地10-10M以下、备选地10-11M以下、备选地10-12M以下，或者范围为10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M的KD。如普通技术人员将理解的，亲和力和KD值是负相关的。对抗原的高亲和力由低KD值测得。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指这样的分子：其中所述分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而不实质上结合任何其它多肽或多肽表位。
“编码抗体的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或分开载体中的这类核酸分子和存在于宿主细胞中一个或多个位置处的这类核酸分子。在一些实施方案中，核酸编码抗-HtrA1抗体。在其它实施方案中，核酸可以编码抗-因子D抗体(例如抗-HtrA1/抗-因子D抗体)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入宿主细胞(已经向所述宿主细胞中引入该载体)的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这种载体在本文中称作“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换地使用并且是指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。子代可以在核酸内容物方面不完全与亲本细胞相同，但是可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与针对最初转化的细胞所筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在对序列进行比对并且在需要的情况下引入空位以实现最大百分比的序列同一性并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已经随用户文档提交至U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559(美国版权办公室华盛顿特区20559)，其中它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco(南旧金山),California(加利福尼亚州)可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编用以在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数通过ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A与、同或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(这可以备选地描述为给定的氨基酸序列A具有或包含与、同或针对给定的氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)：100乘以分数X/Y，其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别声明，否则本文所用的全部％氨基酸序列同一性值如紧接前段中所述的使用ALIGN-2计算机程序获得。
如果包括抗体在内的蛋白质基本上保持完整的构象结构和生物学活性，则称其为“稳定的”。多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术是本领域中可获得的并且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90中。具有“改善的稳定性”的抗体变体是指与起始参比抗体相比更稳定的抗体变体。优选地，具有改善的稳定性的抗体变体是参比(野生型)抗体的变体，其中特定的氨基酸残基被改变以用于改善天然抗体的物理稳定性、和/或化学稳定性、和/或生物学活性、和/或降低其免疫原性。
术语“异构化”通常是指这样一种化学过程，通过所述化学过程化学化合物被转化为其异构形式，即，具有相同的化学组成但是具有不同的结构或构型并且因此通常具有不同的物理和化学性质的形式。本文中具体使用的是天冬氨酸异构化，其是这样的过程，其中多肽的一个或多个天冬氨酸(D或Asp)残基被转化为异天冬氨酸残基。参见例如Geiger等人,J.Biol.Chem.262:785-94,1987。
术语“脱酰胺”通常是指这样的化学反应，其中酰胺官能团被从有机化合物除去。本文中具体使用的是天冬酰胺脱酰胺，其是这样的过程，其中多肽(例如抗体)的一个或多个天冬酰胺(N或Asn)残基被转化为天冬氨酸(D或Asp)，即中性酰胺侧链被转化为整体具有酸性的残基。参见例如Xie等人,J.Pharm.Sci.88:8-13,1999。
多肽分子(例如抗体)的“氧化”变体是其中原始多肽的一个或多个甲硫氨酸(M或Met)或色氨酸(W或Trp)残基通过甲硫氨酸的硫已经转化为砜或亚砜的多肽。通过将甲硫氨酸(M或Met)转化为亮氨酸(L或Leu)或异亮氨酸(I或Ile)可以防止氧化。参见例如Amphlett等人,Pharm.Biotechnol.,9:1-140,1996。
氨基酸残基“倾向”于某些鉴定的物理或化学过程(例如，异构化、脱酰胺或氧化)是指特定蛋白质分子内被鉴定为具有进行鉴定的过程(诸如异构化、脱酰胺或氧化)的倾向的那些残基。它们的倾向通常通过它们在蛋白质的一级和/或构象结构内的相对位置确定。例如，已经证明，Asp-XXX基序(其中XXX可以是Asp、Gly、His、Ser或Thr)中的第一个Asp由于其相邻残基的参与而倾向于Asp异构化，其中相同蛋白质内的一些其它Asp可能不具有这种倾向。用于在具体蛋白质分子内鉴定残基对某些过程的倾向性的测定是本领域中已知的。参见例如Cacia等人,Biochem.35:1897-1903,1996。
除非另外说明，如本文可互换使用的，术语“HtrA丝氨酸肽酶1(HtrA1)”或“HtrA1”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然HtrA1，所述脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类(例如，人类)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的HtrA1以及由细胞中加工而产生的任何形式的HtrA1。所述术语还涵盖HtrA1的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人HtrA1的氨基酸序列在SEQ ID NO:121中显示(参见图29A)。人HtrA1的UniProt登录号是Q92743。示例性鼠HtrA1的氨基酸序列在SEQ ID NO:155中显示(参见图29B)。鼠HtrA1的UniProt登录号是Q9R118。如本文所描述的，huHtrA1和muHtrA1的氨基酸残基分别参照SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:155制备。氨基酸位置由单字母氨基酸编码指定，接着是其在SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:155内的位置(参见图29B)。如图29A所示，人HtrA1的成熟序列包含起始于SEQ ID NO:121的位置23处的谷氨酰胺并终止于SEQ IDNO:121的位置480处的脯氨酸的序列，例如Q23-P480。人HtrA1的示例性片段包括包含氨基酸D161-K379、基本上由其组成或由其组成的片段。HtrA1在本领域中也称为蛋白酶、丝氨酸、11(IGF结合)(PRSS11)、ARMD7、HtrA和IGFBP5-蛋白酶。
术语“HtrA1”还涵盖“HtrA1变体”，其意指与天然序列HtrA1多肽(诸如SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:155)具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性HtrA1多肽。通常，HtrA1变体将与天然HtrA1序列(例如SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:155)具有至少约80％的氨基酸序列同一性、或至少约85％的氨基酸序列同一性、或至少约90％的氨基酸序列同一性、或至少约95％的氨基酸序列同一性、或至少约98％的氨基酸序列同一性、或至少约99％的氨基酸序列同一性。
术语“HtrA1结合拮抗剂”以最广意义使用，并且包括能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、减少或干扰HtrA1生物学活性的任何分子。HtrA1结合拮抗剂包括，但不限于，抗-HtrA1抗体及其抗体变体、其抗原结合片段，其它结合多肽、肽和非肽小分子，它们与HtrA1结合并且能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、减少或干扰HtrA1活性(诸如HtrA1在体外切割底物(例如H2-Opt底物或酪蛋白)的能力或在体内切割底物的能力(例如HtrA1促进眼部病症(例如AMD(例如地图状萎缩))的病理学))。
如本文所使用的，术语“因子D”是指天然序列和变体因子D多肽。因子D在本领域中也称为补体因子D(CFD)、C3前激活剂转化酶、备解素因子D酯酶和降脂蛋白(adipsin)。
“天然序列因子D”是与来源于自然界的因子D多肽具有相同氨基酸序列的多肽，不管其制备模式如何。因此，天然序列因子D可以从自然界分离或可以通过重组和/或合成手段产生。除了成熟的因子D蛋白(诸如成熟的人因子D蛋白(参见例如NCBI参考序列NM_001928，SEQ ID NO:126))之外，术语“天然序列因子D”特别涵盖因子D的天然存在的前体形式(例如，被蛋白水解切割以产生活性形式的无活性前蛋白)，因子D的天然存在的变体形式(例如，可选择剪接形式)和天然存在的等位基因变体，以及与来源于自然界的因子D多肽具有相同氨基酸序列的因子D分子的结构构象变体。人因子D的UniProt登录号是P00746。非人动物(包括高等灵长类动物和非人哺乳动物)的因子D多肽具体包括在该定义中。
“因子D变体”意指与天然序列因子D多肽(诸如天然序列人因子D多肽(例如NM_001928，SEQ ID NO:126))具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性因子D多肽。通常，因子D变体将与成熟人氨基酸序列(例如NM_001928，SEQ ID NO:126)具有至少约80％的氨基酸序列同一性、或至少约85％的氨基酸序列同一性、或至少约90％的氨基酸序列同一性、或至少约95％的氨基酸序列同一性、或至少约98％的氨基酸序列同一性、或至少约99％的氨基酸序列同一性。
术语“因子D结合拮抗剂”以最广意义使用，并且包括能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、减少或干扰因子D生物学活性的任何分子。因子D结合拮抗剂包括，但不限于，抗-因子D抗体及其抗体变体、其抗原结合片段，其它结合多肽、肽和非肽小分子，它们与因子D结合并且能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、减少或干扰因子D活性(诸如因子D参与补体相关性眼病的病理学的能力)。
如本文所使用的，术语“VEGF拮抗剂”是指这样的分子，所述分子能够与VEGF结合，降低VEGF表达水平，或中和、阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性(包括但不限于，与一种或多种VEGF受体结合的VEGF，VEGF信号传导以及VEGF介导的血管生成和内皮细胞存活或增殖)。例如，能够中和、阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性的分子可以通过结合一种或多种VEGF受体(VEGFR)(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、结合膜的VEGF受体(mbVEGFR)、或可溶性VEGF受体(sVEGFR))。作为可用于本发明方法的VEGF拮抗剂包括与VEGF特异性结合的多肽、抗-VEGF抗体及其抗原结合片段、与VEGF特异性结合从而隔绝其与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、融合蛋白(例如VEGF-捕获剂(Regeneron))和VEGF121-白树毒素(gelonin)(Peregrine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗剂变体，与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的反义核碱基寡聚物；与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；VEGF的肽体(peptibody)；和VEGF适体(aptamer)。VEGF拮抗剂还包括与VEGFR结合的多肽，抗-VEGFR抗体及其抗原结合片段，以及与VEGFR结合从而阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性(例如VEGF信号传导)的衍生物，或融合蛋白。VEGF拮抗剂还包括与VEGF或VEGFR结合并能够阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性的非肽小分子。因此，术语“VEGF活性”具体包括VEGF介导的VEGF生物活性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂减少或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的VEGF表达水平或生物活性。在一些实施方案中，由VEGF特异性拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165。
如本文所使用的，VEGF拮抗剂可以包括，但不限于，抗-VEGFR2抗体及相关分子(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab)、tanibirumab、阿柏西普(aflibercept))，抗-VEGFR1抗体及相关分子(例如，伊克鲁库单抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF眼捕获剂；
Figure BDA0003672327960000381
)和ziv-阿柏西普(VEGF捕获剂；
Figure BDA0003672327960000382
))，双特异性VEGF抗体(例如，MP-0250、凡努西珠单抗(vanucizumab)(VEGF-ANG2)、和US 2001/0236388中公开的双特异性抗体)，包括抗-VEGF、抗-VEGFR1和抗-VEGFR2臂中的两个的组合的双特异性抗体，抗-VEGF抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab)、sevacizumab和雷珠单抗(ranibizumab))，和非肽小分子VEGF拮抗剂(例如，帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、凡德他尼(vandetanib)、瑞戈非尼(stivarga)、卡博替尼(cabozantinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、orantinib、替拉替尼(telatinib)、dovitinig、西地尼布(cediranib)、motesanib、索凡替尼(sulfatinib)、阿帕替尼(apatinib)、foretinib、法米替尼(famitinib)和tivozanib)。
术语“抗-VEGF抗体”、“与VEGF结合的抗体”和“与VEGF特异性结合的抗体”是指这样的抗体：所述抗体能够以足够的亲和力结合VEGF从而该抗体可用作靶向VEGF的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗-VEGF抗体与不相关的非VEGF蛋白质结合的程度小于该抗体与VEGF结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的。在某些实施方案中，与VEGF结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M以下，例如从10-8M至10-13M例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-VEGF抗体与来自不同物种的VEGF之间保守的VEGF表位结合。
在某些实施方案中，抗-VEGF抗体可以用作靶向和干扰其中涉及VEGF活性的疾病或病症的治疗剂。此外，可以对抗体进行其它生物活性测定，例如以评价其作为治疗剂的有效性。这种测定是本领域已知的，并且取决于靶抗原和抗体的预期用途。实例包括HUVEC抑制测定；肿瘤细胞生长抑制测定法(例如，如WO 89/06692中描述的)；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定(美国专利号5,500,362)；和激动活性或造血测定(参见WO 95/27062)。抗-VEGF抗体将通常不与其它VEGF同系物(诸如VEGF-B或VEGF-C)结合，也不与其它生长因子(诸如PlGF、PDGF或bFGF)结合。在一个实施方案中，抗-VEGF抗体是与由杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗-VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗-VEGF抗体是重组人源化抗-VEGF单克隆抗体，其根据Presta等人(1997)Cancer Res.57:4593-4599生成，包括但不限于称为贝伐单抗(BV；
Figure BDA0003672327960000391
)的抗体。
也称为
Figure BDA0003672327960000392
或“rhuFab V2”的抗-VEGF抗体“雷珠单抗”是人源化的亲和力成熟的抗-人VEGF Fab片段。通过标准重组技术方法在大肠杆菌表达载体和细菌发酵中生产雷珠单抗。雷珠单抗是未糖基化的，并且分子量为约48,000道尔顿。参见WO 98/45331和US 2003/0190317。另外优选的抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-31、B20-4.1)，如PCT申请公开号WO 2005/012359和WO 2005/044853中所描述的，其每一个通过引用整体结合于此。对于另外优选的抗体，参见美国专利号7,060,269、6,582,959、6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请公开号2006009360、20050186208、20030206899、20030190317、20030203409和20050112126；以及Popkov等人,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。其它优选的抗体包括与包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、191、K101、E103和C104或者备选地包含残基F17、Y21、Q22、Y25、D63、183和Q89的人VEGF上的功能性表位结合的那些抗体。另外的抗-VEGF抗体包括PCT申请公开号WO 2009/155724中描述的抗-VEGF抗体。
术语“IL-6结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由IL-6与其一种或多种结合配偶体(诸如白细胞介素-6受体(IL-6R)(也称为CD126)和/或gp130(也称为CD130))相互作用而产生的信号转导的分子。示例性IL-6结合拮抗剂包括，例如，抗IL-6拮抗剂(包括抗IL-6抗体，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics))和抗IL-6R拮抗剂(包括抗IL-6R抗体，例如托珠单抗(tocilizumab)
Figure BDA0003672327960000401
)。“小分子”在本文中定义为具有低于约600的分子量，优选低于约1000道尔顿的分子量。
“病症”是可以从抗体治疗中受益的任何病症。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患有该病症的那些病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症。
如本文所使用的，术语“HtrA1相关的病症”在最广意义上是指与异常HtrA1表达或活性相关的任何病症或病况。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症与过量HtrA1水平或活性相关，其中非典型症状可能由于局部(例如，在眼中)和/或在体内系统的HtrA1水平或活性而显现。示例性的HtrA1相关的病症包括HtrA1相关的眼部病症，其包括但不限于例如年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括湿性(渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA))。
如本文所使用的，术语“眼部病症”包括但不限于眼睛的病症，包括黄斑变性疾病，诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括湿性(渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA)))；糖尿病性视网膜病(DR)和其它缺血相关性视网膜病；眼内炎；葡萄膜炎；脉络膜新血管形成(CNV)；早产儿视网膜病(ROP)；息肉状脉络膜血管病(PCV)；糖尿病性黄斑水肿；病理性近视；希佩尔-林道病；眼的组织胞浆菌病；视网膜中央静脉阻塞(CRVO)；角膜新血管形成；和视网膜新血管形成。在一些实施方案中，眼部病症是AMD(例如GA)。
术语“补体相关性病症”以最广意义使用并且包括与过度或不受控的补体激活相关的病症。其包括心肺转流术期间的补体激活；由急性心肌梗塞、动脉瘤、卒中、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克、肠缺血或其它引起缺血的事件之后的缺血-再灌注引起的补体激活。补体激活还已经被证明与炎症病症相关，所述炎症病症诸如严重烧伤、内毒素血症、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、镰状细胞性贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病况可以是不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影造影剂变态反应的结果。其还包括自身免疫疾病，诸如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和多发性硬化。补体激活还与移植排斥相关。补体激活也与眼部病症(诸如补体相关性眼部病症)有关。
术语“补体相关性眼部病症”以最广意义使用并且包括病理学涉及补体(包括经典和旁路途径，并且特别是补体的旁路途径)的所有眼部病症。补体相关性眼部病症包括，但不限于，黄斑变性病(诸如所有阶段的年龄相关性黄斑变性(AMD))，脉络膜新血管形成(CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相关性视网膜病，眼内炎，葡萄膜炎，以及其它眼内新生血管性疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，角膜新血管形成和视网膜新血管形成。在一个实例中，AMD包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA)))。在另外的实例中，干性(非渗出性)AMD可以包括硬玻璃疣、软玻璃疣、地图状萎缩和/或色素凝集的存在。早期AMD可以包括例如多个小的至一个或多个非渗出性的中等大小的玻璃疣。中期AMD可以包括例如大量的中等玻璃疣至一个或多个大玻璃疣。参见例如Ferris等人,AREDS Report No.18；Sallo等人,Eye Res,34(3):238-40,2009；Jager等人,New Engl.J.Med.,359(1):1735,2008。在另外的实例中，中期干性AMD可以包括大的汇合的玻璃疣。在另外的实例中，地图状萎缩可以包括光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失。在另外的实例中，地图状萎缩的面积可以是小的或大的和/或可以是在黄斑区域中或在外围视网膜中。在一个实例中，补体相关性眼部病症是中期干性AMD。在一个实例中，补体相关性眼部病症是地图状萎缩。在一个实例中，补体相关性眼部病症是湿性AMD(例如脉络膜新血管形成(CNV))。
上述清单是非穷举的，并且应当理解疾病或病症可以落入各种种类中。例如，在一些情况中，AMD可以分类为HtrA1相关的病症、眼部病症和补体相关的病症。
如本文所使用的，“施用”意指将一定剂量的化合物(例如，本发明的抗-HtrA1抗体，编码本发明的抗-HtrA1抗体的核酸)或组合物(例如，药物组合物，例如包含本发明的抗-HtrA1抗体的药物组合物)给予受试者的方法。本文描述的方法中利用的组合物可以通过以下方式施用：例如，玻璃体内(例如通过玻璃体内注射)、经眼(例如通过眼部注射)、眼内(例如通过眼内注射)、巩膜旁(例如通过巩膜旁注射)、筋膜下(例如通过筋膜下注射)、脉络膜上(例如通过脉络膜上注射)、局部(例如通过滴眼液)、肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、瘤内、经腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眶内、经口、透皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中。本文描述的方法中利用的组合物还可以系统或局部施用。施用方法可以根据各种因素(例如，待施用的化合物或组合物，以及待治疗的病况、疾病或病症的严重程度)而变化。在特别的实施方案中，通过玻璃体内注射来施用本文描述的抗体(例如，抗-HtrA1抗体、抗-因子D抗体和抗-HtrA1抗体/抗-因子D抗体)。
与一种或多种另外的治疗剂“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何次序的连续施用。
术语“长效递送”、“持续释放”和“受控释放”通常用于描述利用制剂、剂型、装置或其它类型的技术以实现治疗剂的延长的或延展的释放或生物利用度的递送机制。其可以指向全身体循环或受试者或向受试者中的局部作用位点(包括但不限于细胞、组织、器官、关节、区域等)提供药物的延长的或延展的释放或生物利用度的技术。此外，这些术语可以指用于延长或延展药物从制剂或剂型的释放的技术，或者它们可以指用于延展或延长药物的生物利用度或药物动力学或对受试者的作用持续时间的技术，或者它们可以指用于延展或延长制剂引发的药物动力学效应的技术。
“长效制剂”、“持续释放制剂”或“受控释放制剂”是用于提供长效递送的药物制剂、剂型或其它技术。在一个方面，受控释放用于改善治疗剂的局部生物利用度，特别是在眼部递送的情况中，其用于改善眼部停留时间。“增加的眼部停留时间”是指递送后的时间段，在这期间递送的眼部药物在质量(例如活性)和数量(例如有效量)方面都保持有效。除了高剂量和受控释放以外或作为高剂量和受控释放的替代，药物可以被翻译后修饰(诸如经由PEG化)，以实现增加的体内半衰期。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗性或预防性结果的量。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受治者是人。“受试者”可以是“患者”。
术语“包装插页”用来指通常包含在治疗产品的商品包装中的使用说明，其含有关于涉及此类治疗产品的使用的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“药用载体”是指除活性成分之外，药物制剂中对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“药物制剂”是指这样的制备物，其处于这样的形式从而允许包含于其中的活性成分的生物活性有效，并且其不含有对于将施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
如本文所用，“治疗(treatment)”(和其语法变型诸如“治疗(treat/treating)”)是指意欲改变正在治疗的个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防进行或在临床病理学过程期间进行。所需的治疗效果包括，但不限于，防止疾病或病症出现或复发，减轻症状，减小疾病或病症的任何直接或间接病理学后果，降低病情进展速率，改善或缓和疾病或病症状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体是用来延缓疾病或病症的发展或用来减慢疾病或病症的进展。在一些实例中，病症是HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症，例如AMD(例如GA)。
“分离的”核酸分子是从至少一种通常与核酸的天然来源相关的污染物核酸分子中鉴定和分离的核酸分子。分离的核酸分子的形式或设置不同于其在自然界中发现的形式和设置。因此，分离的核酸分子与存在于天然细胞中的核酸分子不同。然而，分离的核酸分子包括通常表达抗体的细胞中含有的核酸分子，例如其中核酸分子处于与天然细胞不同的染色体位置。
表述“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选的操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当其与另一个核酸序列处于功能性关系时，则核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列(leader)的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果定位核糖体结合位点以便于翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处进行连接来完成连接。如果不存在这种位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头(adaptor)或接头。
如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”互换地使用，并且所有这些命名包括子代。因此，表述“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和从中衍生的培养物，而无论传代次数是多少。还应当理解，所有子代可以在DNA内容物方面不完全相同，这是由于故意的或偶然的突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与针对最初转化的细胞所筛选的功能或生物活性相同的功能或生物活性。在旨在明确指定的情况下，这将是从上下文可以清楚看出的。
如本文所使用的，“文库”是指多个抗体或抗体片段序列(例如本发明的抗-HtrA1抗体)或编码这些序列的核酸，所述序列在被引入到这些序列中的变体氨基酸组合上不同(例如如本文所描述的)。
“突变”是核苷酸相对于参比核苷酸序列(诸如野生型序列)的缺失、插入或置换。
如本文所使用的，“密码子组”是指用于编码所需变体氨基酸的一组不同的核苷酸三联体序列。一组寡核苷酸可以例如通过固相合成来合成，包括表示由密码子组提供的并且将编码所需氨基酸组的核苷酸三联体的所有可能的组合。标准形式的密码子命名是本领域已知的IUB密码的形式。密码子组通常由3个大写字母以斜体表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等。某些位置处具有选择的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域公知的，例如TRIM方法(Knappek等人,J.Mol.Biol.296:57-86,1999；Garrard等人,Gene 128:103,1993)。具有某些密码子组的这种寡核苷酸组可以使用商业核酸合成仪(可获自例如AppliedBiosystems,Foster City,CA)合成，或者可以商购的(例如来自Life Technologies,Rockville,MD)。因此，具有特定密码子组的一组合成的寡核苷酸通常包括具有不同序列的多个寡核苷酸，这些差异通过整个序列内的密码子组确立。根据本发明使用的寡核苷酸具有这样的序列，所述序列允许杂交至可变结构域核酸模板，并且还可以包括但不必须包括可用于例如克隆目的的限制性酶切位点。
“噬菌体展示”是一种将变体多肽作为融合蛋白展示为噬菌体(例如丝状噬菌体颗粒)表面上至少一部分外壳蛋白的技术。噬菌体展示的实用性在于以下事实：随机蛋白质变体的大型文库可以快速和有效地分选以高亲和力与靶抗原结合的那些序列。肽和蛋白质文库在噬菌体的展示已经用于从数百万个多肽筛选具有特定结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来展示小的随机肽和小的蛋白质。参见例如Wells等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,3:355-362,1992以及其中引用的文献。在单价噬菌体展示中，蛋白质或肽文库与基因III或其部分融合，并且在野生型基因III蛋白的存在下以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示融合蛋白的一种拷贝或不展示任一个融合蛋白。相对于多价噬菌体，亲合力效应降低，使得基于内在配体亲和力进行分选，并且使用噬菌粒载体，其简化了DNA操作。参见例如Lowman等人,Methods:Acompanion to Methodsin Enzymology,3:205-216,1991。
起始或参比多肽(例如，参比抗体或其可变结构域/HVR)的“变体”或“突变体”是这样的多肽，(1)其具有与起始或参比多肽不同的氨基酸序列，并且(2)其通过天然或人造(人工)诱变从起始或参比多肽衍生。这种变体包括，例如，从目的多肽的氨基酸序列内的残基缺失，和/或向目的多肽的氨基酸序列内的残基插入，和/或目的多肽的氨基酸序列内的残基置换，在本文中称为“氨基酸残基改变”。因此，变体HVR是指包含关于起始或参比多肽序列(诸如源抗体或抗原结合片段的序列)的变体序列的HVR。在这种情况下，氨基酸残基改变是指与起始或参比多肽序列的对应位置(诸如抗体或其片段的对应位置)处的氨基酸不同的氨基酸。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以实现最终的变体或突变体构建体，条件是所述最终构建体拥有所需特征。氨基酸变化也可以改变多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数量或位置。
“野生型(WT)”或“参比”序列或“野生型”或“参比”蛋白质/多肽的序列，诸如参比抗体的HVR或可变结构域，可以是通过引入突变从其衍生变体多肽的参比序列。通常，给定蛋白质的“野生型”序列是自然界中最常见的序列。类似地，“野生型”基因序列是自然界中最常发现的该基因的序列。突变可以通过自然过程或通过人类诱导手段引入“野生型”基因中(并且由此引入编码它的蛋白质中)。这些过程的产物是原始“野生型”蛋白质或基因的“变体”或“突变体”形式。
如本文所使用的，“参比抗体”是指其抗原结合序列用作模板序列的抗体或其片段，在该模板序列上进行根据本文所述标准的多样化。抗原结合序列通常包括抗体可变区，优选至少一个HVR，优选包括框架区。
如本文所使用的，“富集的”意指与对应参比文库(例如，未分选的文库，或对于不同或不相关抗原已经进行分选的文库)相比，在分选的文库中以较高频率存在的实体(例如氨基酸残基改变)。相比之下，“耗尽的”意指与对应参比文库(例如，未分选的文库，或对于不同或不相关抗原已经进行分选的文库)相比，在分选的文库中以较低频率存在的实体(例如氨基酸残基改变)。当参考鉴定氨基酸残基变体的方法使用时，术语“中性”意指实体既不富集也不耗尽；换言之，与对应参比文(例如，未分选的文库，或对于不同或不相关抗原已经进行分选的文库)相比，其在分选的文库中以大致相同的频率存在。
“等电点(pI)”意指分子(例如蛋白质，诸如抗体)不携带净电荷时的pH，在本领域中也称为“pH(I)”或“IEP”。
II.组合物和方法
本发明提供与HtrA1结合的新型抗体，以及制备和使用它们的方法，例如用于治疗和诊断用途。本发明的抗体可用于例如各种病症的诊断和治疗，所述病症包括HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症，包括年龄相关性黄斑变性(例如地图状萎缩)。
A.示例性抗-HtrA1抗体
在一个方面，本发明部分基于与HtrA1特异性结合的抗体。本发明的抗体可用于例如病症的治疗或诊断，所述病症包括HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症，包括年龄相关性黄斑变性(例如地图状萎缩)。
本发明提供与HtrA1特异性结合的分离的抗体。在一些情况中，HtrA1是人HtrA1(huHtrA1)。在其它情况中，HtrA1是鼠HtrA1(muHtrA1)。在某些情况中，本发明的抗-HtrA1抗体以100nM以下(例如，100nM以下、10nM以下、5nM以下、2.5nM以下、1nM以下、100pM以下、10pM以下、1pM以下、或0.1pM以下)的KD与huHtrA1特异性结合。例如，在一些情况中，本发明的抗-HtrA1抗体以1nM以下(例如，1nM以下、900pM以下、800pM以下、700pM以下、600pM以下、550pM以下、500pM以下、400pM以下、300pM以下、200pM以下、150pM以下、125pM以下、100pM以下、75pM以下、50pM以下、25pM以下、或1pM以下)的KD与huHtrA1特异性结合。在一些情况中，抗-HtrA1抗体以40pM至约700pM(例如，约40pM至约700pM、约40pM至约600pM、约40pM至约550pM、约40pM至约500pM、约40pM至约400pM、约40pM至约300pM、约40pM至约250pM、约50pM至约200pM、约50pM至约175pM、约50pM至约150pM、约50pM至约125pM、约70pM至约125pM、或约50pM至约125pM)的KD与huHtrA1结合。在一些实施方案中，抗-HtrA1抗体以约110pM的KD与huHtrA1结合。在一些实施方案中，抗-HtrA1抗体以约60pM的KD与huHtrA1结合。任一个前述KD值可以代表本发明的抗-HtrA1抗体(例如本发明的抗-HtrA1抗体的Fab)与huHtrA1的蛋白酶结构域(PD)(huHtrA1-PD)的结合亲和力，例如如使用
Figure BDA0003672327960000481
表面等离子共振所测量的(例如如本文所描述的)。
在一些实施方案中，本发明的抗-HtrA1抗体能够抑制HtrA1的活性。在一些情况中，抗体以10nM以下(例如，10nM以下、5nM以下、2nM以下、1.5nM以下、1nM以下、900pM以下、800pM以下、700pM以下、600pM以下、500pM以下、400pM以下、300pM以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、或1pM以下)的50％抑制浓度(IC50)抑制huHtrA1-PD的蛋白酶结构域的活性。在一些情况中，抗-HtrA1抗体以约0.25nM至约1nM(例如，约0.25nM至约1nM、约0.25nM至约0.9nM、约0.25nM至约0.8nM、约0.25nM至约0.7nM、约0.25nM至约0.6nM、约0.25nM至约0.5nM、或约0.25nM至约0.4nM)的IC50抑制huHtrA1-PD的活性。在一些情况中，抗-HtrA1抗体以约0.3nM的IC50抑制huHtrA1-PD的活性。在任一个前述情况中，抑制活性可以是基于FRET的体外阻断测定的测量值。在一些情况中，基于FRET的体外阻断测定包括H2-Opt探针(例如，(Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK(SEQ ID NO:152))的切割。在任一个前述情况中，IC50值可以基于二价格式(例如IgG格式)的抗-HtrA1抑制huHtrA1-PD活性的能力。
本发明还涵盖与HtrA1表位特异性结合的分离的抗体，其中HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197组成的组，其中氨基酸编号参考人HtrA1前体蛋白的编号。在一个实施方案中，人HtrA1前体蛋白具有SEQ ID NO:121的序列。在一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由Leu192、Pro193和Arg197组成的组。在一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少两个氨基酸，所述氨基酸选自由Leu192、Pro193和Arg197组成的组。在特别的实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Leu192、Pro193和Arg197。在另一个实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Arg190、Leu192、Pro193和Arg197。在另外的实施方案中，HtrA1表位包含HtrA1氨基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197。
在一些实施方案中，当与HtrA1结合时，抗-HtrA1抗体处于距离氨基酸Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197中的一个或多个4埃以下的位置处。在一些实施方案中，抗体与一个或多个氨基酸之间的距离通过晶体学确定，例如使用实施例中描述的晶体学方法确定。
在一些情况中，抗-HtrA1抗体可以包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)：(a)包含DSEX1H(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1，其中X1是Met或Leu；(b)包含GVDPETX2GAAYNQKFKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X2是Glu或Asp；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVX3FIH(SEQID NO:4)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X3是Glu或Asn；(e)包含ATSX4LAS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的HVR-L2，其中X4是Asn、His或Glu；和(f)包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X5是Ser或Tyr并且X6是Ala或Asn，或者与SEQ ID NOs:1-6中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的一个或多个上述HVR及其一个或多个变体的组合。
例如，抗-HtrA1抗体可以包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3，或者与SEQ ID NOs:3或7-11中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的一个或多个上述HVR及其一个或多个变体的组合。
在一些情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下重链可变结构域(VH)框架区(FR)中的一个、两个、三个或四个：(a)包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2(SEQ IDNO:12)的氨基酸序列的FR-H1，其中X1是Lys或Thr并且X2是Thr、Lys或Arg；(b)包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下轻链可变结构域(VL)FR中的一个、两个、三个或四个：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
例如，在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括以下六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H4。在另外的情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH结构域，和(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗-HtrA1抗体是APEG.LC3.HC3。
例如，在另一个实例中，抗-HtrA1抗体包括以下六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ IDNO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETDGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:123)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVNFIH(SEQ ID NO:124)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:125)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个重链可变结构域FR：(a)包含QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVKQTPVHGLEWIG(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列的FR-H4。在另外的情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH结构域，和(b)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗-HtrA1抗体是15H6(也称为m15H6)。
在另一个实例中，抗-HtrA1抗体可以包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SYIMS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含QNFRSDGSSMDY(SEQID NO:41)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含LASKLES(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的HVR-L3，或者与SEQ ID NOs:39-44中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的一个或多个上述HVR及其一个或多个变体的组合。
在一些情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下重链可变结构域FR中的一个、两个、三个或四个：(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:47)或EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:48)或WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:49)或RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:50)或WGQGTAVTVSS(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下轻链可变结构域FR中的一个、两个、三个或四个：(a)包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO:51)或NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:52)或WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:53)或GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ IDNO:54)或FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列的FR-L4。
例如，在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括以下六个HVR：SYIMS(SEQ ID NO:39)；(b)包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含LASKLES(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:50)的氨基酸序列的FR-H4。在另外的情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VH结构域，和(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗-HtrA1抗体是h19B12.v1。
在另一个实例中，在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括以下六个HVR：SYIMS(SEQ IDNO:39)；(b)包含YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASESVDSYGKSFMH(SEQ IDNO:42)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含LASKLES(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQNNEDPYT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS(SEQ IDNO:57)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTAVTVSS(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的FR-H4。在另外的情况中，抗-HtrA1抗体包括以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ IDNO:61)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包括：(a)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH结构域，和(b)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗-HtrA1抗体是19B12(也称为m19B12)。
在另一个实例中，本发明的抗-HtrA1抗体包括抗体20E2轻链和重链可变结构域(分别为SEQ ID NOs:66和65)的HVR中的一个、两个、三个、四个、五个或六个，并且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO:66的Kabat氨基酸残基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO:66的Kabat氨基酸残基50-56，并且HVR-L3序列包含SEQ ID NO:66的Kabat氨基酸残基89-97，以及(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO:65的Kabat氨基酸残基31-35，HVR-H2序列包含SEQ IDNO:65的Kabat氨基酸残基50-65，并且HVR-H3序列包含SEQ ID NO:65的Kabat氨基酸残基95-102，或者一个或多个上述HVR和一个或多个与抗体20E2的上述HVR中的任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其变体的组合。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包含：(a)包含与SEQ ID NOs:65或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:66或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个实例中，本发明的抗-HtrA1抗体包括抗体3A5轻链和重链可变结构域(分别为SEQ ID NOs:68和67)的HVR中的一个、两个、三个、四个、五个或六个，并且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO:68的Kabat氨基酸残基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO:68的Kabat氨基酸残基50-56，并且HVR-L3序列包含SEQ ID NO:68的Kabat氨基酸残基89-97，以及(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO:67的Kabat氨基酸残基31-35，HVR-H2序列包含SEQ IDNO:67的Kabat氨基酸残基50-65，并且HVR-H3序列包含SEQ ID NO:67的Kabat氨基酸残基95-102，或者一个或多个上述HVR和与抗体3A5的上述HVR中的任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的一个或多个其变体的组合。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包含：(a)包含与SEQ ID NOs:67或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:68或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL结构域。
在另一个实例中，本发明的抗-HtrA1抗体包括抗体12A5轻链和重链可变结构域(分别为SEQ ID NOs:70和69)的HVR中的一个、两个、三个、四个、五个或六个，并且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO:70的Kabat氨基酸残基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO:70的Kabat氨基酸残基50-56，并且HVR-L3序列包含SEQ ID NO:70的Kabat氨基酸残基89-97，以及(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO:69的Kabat氨基酸残基31-35，HVR-H2序列包含SEQ IDNO:69的Kabat氨基酸残基50-65，并且HVR-H3序列包含SEQ ID NO:69的Kabat氨基酸残基95-102，或者一个或多个上述HVR和与抗体12A5的上述HVR中的任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的一个或多个其变体的组合。在一些情况中，抗-HtrA1抗体包含：(a)包含与SEQ ID NOs:69或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:70或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况中，抗-HtrA1抗体包含：(a)包含与SEQ ID NOs:21、23、76、77、78、93-101、106或107中的任一个或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NOs:22、24、72-74、81-92、105或108中的任一个或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQID NO:107的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下重链可变结构域框架区(FR)中的一个、两个、三个或四个：(a)包含EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2(SEQ IDNO:12)的氨基酸序列的FR-H1，其中X1是Lys或Thr并且X2是Thr、Lys或Arg；(b)包含WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H4。在其它情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下重链可变结构域FR中的一个、两个、三个或四个：(a)包含QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT(SEQID NO:25)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVKQTPVHGLEWIG(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列的FR-H3；和(d)包含WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下轻链可变结构域FR中的一个、两个、三个或四个：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKPLIS(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在其它情况中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以包括以下轻链可变结构域FR中的一个、两个、三个或四个：(a)包含NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-L3；和(d)包含FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-L4。
在一些情况中，抗-HtrA1抗体包含：(a)包含与SEQ ID NOs:45、55、65、67或69中的任一个或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NOs:46、56、66、68或70中的任一个或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况中，本发明提供与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH结构域，和(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL结构域，诸如本文中称为APEG.LC3.HC3的抗体。
在一些情况中，本发明提供与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VH结构域，和(b)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL结构域，诸如本文中称为h19B6.v1的抗体。
在一些情况中，本发明提供抗-HtrA1抗体，所述抗体结合与任一种前述抗体相同的表位。在一些情况中，本发明提供抗-HtrA1抗体，所述抗体与任一种前述抗体竞争结合HtrA1。
在某些实施方案中，任一种前述抗-HtrA1抗体可以具有以下性质中的一种或多种：(i)以1个可变结构域与1个HtrA1三聚体亚基的比率与HtrA1结合(例如，Fab以3个Fab与1个HtrA1三聚体的比率与HtrA1三聚体结合，并且IgG以3个IgG与2个HtrA1三聚体的比率与HtrA1三聚体结合)，(ii)对于包含两个可变结构域的抗体，以导致形成类似于美国专利申请公开US 2013/0129743的图9所示的“笼”的方式与HtrA1结合，(iii)不阻止HtrA1的三聚体形成，(iv)与鼠HtrA1交叉反应；(v)不与HtrA2、HtrA3和/或HtrA4交叉反应；(vi)与抗-HtrA1抗体YW505.94.28a(参见例如WO 2013/055998)竞争性地结合HtrA1，(vii)抑制HtrA1与al-抗胰蛋白酶(AlAT)之间的复合物形成。在一些实施方案中，本发明提供与任一种前述抗体结合相同表位的抗体。
在另外的方面，根据任一个以上实施方案的抗-HtrA1抗体可以单独地或组合地结合如下文部分C“抗体性质和特征”的1-8部分中描述的任一特征。
B.示例性抗-因子D抗体
本发明提供抗-因子D抗体，所述抗-因子D抗体可以与本发明的抗-HtrA1抗体用于例如治疗病症的方法中，所述病症包括HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症(例如AMD(例如地图状萎缩))。本发明还提供于HtrA1和因子D特异性结合的多特异性(例如双特异性)抗体(例如，抗-HtrA1/抗-因子D抗体)。可以将任何合适的抗-因子D抗体用于本发明的组合物和方法中。作为非限制性实例，本文描述的和/或美国专利号8,067,002；8,268,310；8,273,352；和/或美国专利申请号14/700,853中的任何抗-因子D抗体可以用于本发明的组合物和方法中。
例如，在一些情况中，抗-因子D抗体可以包含由美国模式培养物保藏中心(ATCC)保藏并命名为HB12476的杂交瘤产生的单克隆抗体166-32的序列或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。例如，在一些情况中，抗-因子D抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:136的序列或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含SEQ ID NO:137的序列或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情况中，抗-因子D抗体包含：包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VL结构域，诸如抗-因子D单克隆抗体166-32。在一些情况中，抗-因子D抗体是单克隆抗体166-32的人源化衍生物。在一些实施方案中，抗-因子D抗体与单克隆抗体166-32结合相同的表位。在一些情况中，抗-因子D抗体是来源于单克隆抗体166-32的抗体片段。在一些情况中，来源于单克隆抗体166-32的抗体片段是Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，来源于单克隆抗体166-32的抗体片段是Fab。
在一些实施方案中，单克隆抗体166-32的人源化衍生物可以用于本发明的组合物和方法中。例如，描述于例如美国专利号8,067,002中的单克隆抗体166-32的任何人源化衍生物可以用于本发明的组合物和方法中。美国专利号8,067,002中描述的单克隆抗体166-32的示例性人源化衍生物包括例如人源化抗-因子D抗体克隆#111、#56、#250和#416。人源化抗-因子D抗体克隆#111、#56、#250和#416的VH和VL结构域的氨基酸序列显示于例如美国专利号8,067,002的图5中。在一些情况中，抗-因子D抗体可以包含抗-因子D抗体克隆#111、#56、#250或#416的序列或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些情况中，修饰的或变体人源化抗-因子D抗体及其片段可以用于本发明的组合物和方法中。例如，描述于例如美国专利号8,273,352中的人源化抗-因子D抗体克隆#111的任何修饰或变体形式可以用于本发明的组合物和方法中，例如抗体克隆238或238-1。在一些情况中，抗-因子D抗体可以包含与抗-因子D抗体克隆238或238-1或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些情况中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段可以包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu，或者一个或多个上述HVR和与SEQ ID NOs:109-114中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的一个或多个其变体的组合。例如，在一些情况中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu。
例如，在一些情况中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段可以包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3，或者一个或多个上述HVR及与SEQID NOs:109、113或115-118中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的一个或多个其变体的组合。例如，在一些情况中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包括以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些情况中，抗-因子D抗体包含：(a)包含与SEQ ID NOs:119、131或132中的任一个或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NOs:120、133、134或135中的任一个或其序列具有至少约90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH和如(b)中的VL。例如，在一些情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的VL结构域。在其它情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VL结构域。在其它情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列的VL结构域。在其它情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VL结构域。在其它情况中，抗体包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VL结构域。图30所示的抗-因子D抗体中的任一种或其变体或其片段可以用于本发明的组合物和方法中。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VH结构域，和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况中，抗-因子D抗原结合抗体片段是CAS登记号为1278466-20-8的lampalizumab。
在另一个实例中，在一些情况中，抗-因子D抗体是20D12抗体或来源于20D12抗体，所述20D12抗体例如如美国专利号8,268,310所描述的。在一个实例中，抗-因子D抗体包括抗体20D12轻链和重链可变结构域(分别为SEQ ID NOs:128和127)的HVR中的一个、两个、三个、四个、五个或六个，并且其中(i)HVR-L1序列包含SEQ ID NO:128的Kabat氨基酸残基24-34，HVR-L2序列包含SEQ ID NO:128的Kabat氨基酸残基50-56，并且HVR-L3序列包含SEQ IDNO:128的Kabat氨基酸残基89-97，以及(ii)HVR-H1序列包含SEQ ID NO:127的Kabat氨基酸残基31-35，HVR-H2序列包含SEQ ID NO:127的Kabat氨基酸残基50-65，并且HVR-H3序列包含SEQ ID NO:127的Kabat氨基酸残基95-102，或者一个或多个上述HVR及与抗体20D12的上述HVR中的任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其一个或多个变体的组合。
在一些情况中，抗-因子D抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:127的序列或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含SEQ ID NO:128的序列或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情况中，抗-因子D抗体包含：包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的VL结构域，诸如抗-因子D抗体20D12。在一些情况中，抗-因子D抗体包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的轻链。在一些情况中，抗-因子D抗体是单克隆抗体20D12的人源化衍生物。在一些实施方案中，抗-因子D抗体与单克隆抗体20D12或其人源化衍生物结合相同的表位。在一些情况中，抗-因子D抗体是来源于单克隆抗体20D12或其人源化衍生物的抗体片段。在一些情况中，来源于单克隆抗体20D12或其人源化衍生物的抗体片段是Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一些实施方案中，来源于单克隆抗体20D12或其人源化衍生物的抗体片段是Fab。
在一些情况中，任一种前述抗-因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)可以用于本发明的组合物和方法中。本发明的抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、dAb、高变区(HVR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微抗体(minibody)、双抗体、或由抗体片段形成的多特异性抗体。在另外的实施方案中，能够基本上穿透全部视网膜的抗-因子D抗体片段(例如抗原结合片段)可以用于本发明的组合物和方法中。在甚至另外的实施方案中，能够穿透贯穿整个视网膜厚度的抗-因子D抗体片段(例如抗原结合片段)可以用于本发明的组合物和方法中。
在一些情况中，本发明可以包括使用人源化抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段在经由单次玻璃体内注射施用至哺乳动物眼睛(例如人)后具有至少3、5、7、10或12天的半衰期。在另一个实施方案中，本发明可以包括使用人源化抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段在经由单次玻璃体内注射施用至哺乳动物眼睛(例如人)后抑制旁路途径(AP)补体激活达至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110或115天。在另一个实施方案中，本发明可以包括使用人源化抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制旁路途径(AP)补体激活的浓度在经由单次玻璃体内注射施用至哺乳动物眼睛(例如人)后在视网膜组织中维持至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85天。在另一个实施方案中，本发明可以包括使用人源化抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制旁路途径(AP)补体激活的浓度在经由单次玻璃体内注射施用至哺乳动物眼睛(例如人)后在玻璃体液中维持至少80、85、90、95、100、105、110或115天。在一个实例中，本发明包括使用所述抗-因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。
在一些情况中，任一种前述抗-因子D抗体以其单价形式以约20nM以下的KD(例如，抗体作为Fab片段与因子D的KD)与因子D结合。在一些情况中，本文提供的抗体以其单价形式以约10nM以下的KD与因子D结合。在一些情况中，本文提供的抗体以其单价形式以约5nM以下的KD与因子D结合。在一些情况中，本文提供的抗体以其单价形式以约2nM以下的KD与因子D结合。例如，在一些情况中，抗体以其单价形式以约0.5pM至约2nM(例如，约0.5pM、约1pM、约2pM、约3pM、约4pM、约5pM、约6pM、约7pM、约8pM、约9pM、约10pM、约15pM、约20pM、约25pM、约50pM、约75pM、约100pM、约125pM、约150pM、约175pM、约200pM、约225pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约375pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、约500pM、约525pM、约550pM、约575pM、约600pM、约625pM、约650pM、约675pM、约700pM、约725pM、约750pM、约775pM、约800pM、约825pM、约850pM、约875pM、约900pM、约925pM、约950pM、约975pM、约1nM、约1.1nM、约1.2nM、约1.3nM、约1.4nM、约1.5nM、约1.6nM、约1.7nM、约1.8nM、约1.9nM、或约2nM)的KD与因子D结合。在一些情况中，抗体以其单价形式以约0.5pM至约100pM的KD与因子D结合。在一些情况中，抗体以其单价形式以约0.5pM的KD与因子D结合。在一些情况中，抗体以其单价形式以低于约10pM的KD与因子D结合。
在一些情况中，任一种前述抗-因子D抗体以其二价形式以约10nM以下的KD(例如，抗体作为IgG与因子D的KD)与因子D结合。在一些情况中，本文提供的抗体以其二价形式以约5nM以下的KD与因子D结合。在一些情况中，本文提供的抗体以其二价形式以约2nM以下的KD与因子D结合。例如，在一些情况中，抗体以其二价形式以约0.5pM至2nM(例如，约0.5pM、约1pM、约2pM、约3pM、约4pM、约5pM、约6pM、约7pM、约8pM、约9pM、约10pM、约15pM、约20pM、约25pM、约50pM、约75pM、约100pM、约125pM、约150pM、约175pM、约200pM、约225pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约375pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、约500pM、约525pM、约550pM、约575pM、约600pM、约625pM、约650pM、约675pM、约700pM、约725pM、约750pM、约775pM、约800pM、约825pM、约850pM、约875pM、约900pM、约925pM、约950pM、约975pM、约1nM、约1.1nM、约1.2nM、约1.3nM、约1.4nM、约1.5nM、约1.6nM、约1.7nM、约1.8nM、约1.9nM、或约2nM)的KD与因子D结合。在一些情况中，抗体以其二价形式以约0.5pM至约100pM的KD与因子D结合。在一些情况中，抗体以其二价形式以约0.5pM的KD与因子D结合。在一些情况中，抗体以其二价形式以低于约10pM的KD与因子D结合。
在另外的方面，根据任一个以上实施方案的抗-因子D抗体可以单独地或组合地结合如下文部分C“抗体性质和特征”的1-8部分中描述的任一特征。
C.抗体性质和特征
本文描述的抗体(例如，如上文描述的抗-HtrA1抗体和抗-因子D抗体，以及下文描述的抗-HtrA1/抗-因子D抗体)，以及用于本文描述的方法中的任一种抗体，可以单独地或组合地具有下文1-8部分中描述的任一特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体(例如，抗-HtrA1抗体、抗-因子D抗体、或双特异性抗-HtrA1抗-因子D抗体)具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M以下，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。例如，在一些情况中，本文提供的抗体以约10nM以下的KD与人HtrA1(huHtrA1)结合。在一些情况中，本文提供的抗体以约5nM以下的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，本文提供的抗体以约2nM以下的KD与huHtrA1结合。例如，在一些情况中，抗体以约25pM至约2nM(例如，约25pM、约50pM、约75pM、约100pM、约125pM、约150pM、约175pM、约200pM、约225pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约375pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、约500pM、约525pM、约550pM、约575pM、约600pM、约625pM、约650pM、约675pM、约700pM、约725pM、约750pM、约775pM、约800pM、约825pM、约850pM、约875pM、约900pM、约925pM、约950pM、约975pM、约1nM、约1.1nM、约1.2nM、约1.3nM、约1.4nM、约1.5nM、约1.6nM、约1.7nM、约1.8nM、约1.9nM、或约2nM)的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约600pM(例如，约75pM、约100pM、约125pM、约150pM、约175pM、约200pM、约225pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约375pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、约500pM、约525pM、约550pM、约575pM、约600pM)的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约500pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约400pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约300pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约200pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约150pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约125pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约75pM至约100pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约80pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约60pM的KD与huHtrA1结合。在一些情况中，抗体以约40pM的KD与huHtrA1结合。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量KD。在一个实施方案中，用目的抗体的Fab形式及其抗原进行RIA。例如，通过以下方式测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列的存在下用最低浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，随后用抗-Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立用于测定的条件，将
Figure BDA0003672327960000701
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml抗-Fab捕获抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭2至5小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释物(例如，与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗-VEGF抗体Fab-12的评价一致)混合。然后，将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温孵育(例如，1小时)。然后，移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20
Figure BDA0003672327960000702
洗涤8次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定中。
根据另一个实施方案，使用
Figure BDA0003672327960000703
表面等离子共振(SPR)测定来测量KD。例如，使用
Figure BDA0003672327960000704
或
Figure BDA0003672327960000705
(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定在25℃采用固定的抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)进行。在一个实施方案中，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速注射以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。在注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab在具有0.05％聚山梨醇酯20
Figure BDA0003672327960000706
表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释物(0.78nM至500nM)在25℃以大约25μl/分钟的流速注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0003672327960000707
评价软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定的缔合速率超过106M-1s-1，那么可以通过使用荧光猝灭技术确定缔合速率，所述荧光猝灭技术在如分光计中测量的增加浓度的抗原存在下在25℃测量在PBS(pH 7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，所述光谱仪诸如配备断流(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。还可以使用如以下实施例所描述的
Figure BDA0003672327960000711
SPR测定来测量KD。
2.抗体稳定性
本发明提供了例如与参比抗-HtrA1抗体相比具有增强的稳定性的抗体。可以使用本领域已知的任何方法来确定抗体的稳定性，例如光谱法(例如质谱)、差示扫描荧光测定法(DSF)、圆二色性(CD)、内在蛋白荧光、差示扫描量热法、光散射(例如动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS)、自相互作用色谱法(SIC)。抗-HtrA1抗体可以具有例如增强的解链温度(Tm)、聚合温度(Tagg)或与参比抗-HtrA1抗体相比的其它稳定性度量。
本发明提供了例如与参比抗-HtrA1抗体相比具有减少的脱酰胺作用的抗体。如本文描述的和/或使用本领域已知的方法可以减少或防止脱酰胺作用。本发明还提供了例如与参比抗-HtrA1抗体相比具有减少的氧化(例如色氨酸氧化，例如于位置LC-W91处)的抗体。如本文描述的和/或使用本领域已知的方法可以减少或防止氧化(例如色氨酸氧化)。本发明提供了例如与参比抗-HtrA1抗体相比具有减少的异构化的抗体。如本文描述的和/或使用本领域已知的方法可以减少或防止异构化。
3.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，以及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三链抗体和四链抗体还在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中描述。
单一结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或者全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过多种技术产生，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。
在一些情况中，本文提供的抗体(例如抗-HtrA1抗体)是Fab。在一些实施方案中，Fab包含重链恒定区的铰链区(例如上铰链)中的平截。在一些实施方案中，Fab重链恒定区在位置221处(EU编号)终止。在一些实施方案中，位置221处的氨基酸残基是天冬氨酸残基(D221)。在一些实施方案中，Fab的重链恒定区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:156或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:159的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:159的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab是IgG1 Fab。
在一些情况中，Fab与HtrA1结合，并且可以包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ IDNO:11)的氨基酸序列的HVR-L3，或者一个或多个上述HVR及与SEQ ID NOs:3或7-11中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其一个或多个变体的组合。在一些情况中，这种Fab可以包括重链恒定区的铰链区(例如上铰链)中的平截。在一些实施方案中，Fab重链恒定区在位置221处(EU编号)终止。在一些实施方案中，位置221处的氨基酸残基是Asp(D221)。在一些实施方案中，Fab的重链恒定区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:156或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些情况中，Fab包括以下六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3，并且还包括：包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链恒定区。
在一些情况中，Fab与HtrA1结合，并且包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；和(c)重链恒定区的铰链区(例如上铰链)中的平截。在一些实施方案中，Fab重链恒定区在位置221处(EU编号)终止。在一些实施方案中，位置221处的氨基酸残基是Asp(D221)。在一些实施方案中，Fab的重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:156或与其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:159的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:160的重链氨基酸序列和SEQID NO:159的轻链氨基酸序列。
在一些情况中，Fab与HtrA1结合，并且包含：(a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL结构域；和(c)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的重链恒定区。
4.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类(诸如猴)的可变结构域)和人恒定结构域。在其它实例中，嵌合抗体是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类被改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将非人抗体人源化以减少针对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且进一步在例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组(shuffling)”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中描述。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳-配合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；来源于特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
5.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk等人,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。
人抗体可以通过施用免疫原至转基因动物制备，其中所述转基因动物已经被修饰以应答于抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这种动物典型地含有替换内源性免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在所述转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003672327960000751
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003672327960000752
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003672327960000753
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。例如，通过与不同的人恒定区组合，可以进一步修饰来自这种动物产生的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤(trioma)技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。这种可变结构域序列随后可以与所需的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。
6.来源于文库的抗体
可以通过对组合文库筛选具有所需一种活性或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法，用于产生噬菌体展示文库并对所述文库筛选拥有所需结合特征的抗体。所述方法综述于例如Hoogenboom等人,在Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并且进一步在例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,在Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示方法中，VH基因和VL基因库分别地由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如在Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中描述的。噬菌体典型地将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自免疫的来源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。备选地，可以克隆天然库(例如，从人)以在不进行任何免疫的情况下提供针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述的。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排，合成地产生天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开本包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文中的人抗体或人抗体片段。
7.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与HtrA1的两个不同表位结合。在某些实施方案中，结合特异性中的一者针对HtrA1并且另一者针对任何其它抗原(例如第二生物分子，例如因子D)。因此，双特异性抗体可与对HtrA1和因子D具有结合特异性。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。本文描述的抗-HtrA1抗体中的任一种可以用于工程改造多特异性抗体(例如双特异性抗体)，例如抗-HtrA1/抗-因子D双特异性抗体。本文描述的和/或本领域已知的抗-因子D抗体中的任一种可以用于工程改造这种抗-HtrA1/抗-因子D双特异性抗体。
例如，在一些情况中，包含与HtrA1特异性结合的第一结合结构域的双特异性抗-HtrA1抗体可以具有与因子D结合的第二结合结构域，所述第一结合结构域包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)：(a)包含DSEX1H(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1，其中X1是Met或Leu；(b)包含GVDPETX1GAAYNQKFKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Glu或Asp；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVX3FIH(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X3是Glu或Asn；(e)包含ATSX4LAS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的HVR-L2，其中X4是Asn、His或Glu；和(f)包含QQWX5SX6PWT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X5是Ser或Tyr并且X6是Ala或Asn，或者一个或多个上述HVR及与SEQ ID NOs:1-6中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其一个或多个变体的组合。与因子D特异性结合的第二结合结构域可以例如包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu，或者一个或多个上述HVR及与SEQ ID NOs:109-114中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其一个或多个变体的组合。
例如，在一些情况中，包含与HtrA1特异性结合的第一结合结构域的双特异性抗-HtrA1抗体可以具有与因子D结合的第二结合结构域，所述第一结合结构域包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)：(a)包含DSEMH(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3，或者一个或多个上述HVR及与SEQID NOs:3或7-11中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其一个或多个变体的组合。与因子D特异性结合的第二结合结构域可以例如包括选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ IDNO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3，或者一个或多个上述HVR及与SEQ ID NOs:109、113或115-118中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的其一个或多个变体的组合。
在特别的实施方案中，本发明提供了与HtrA1和因子D两者特异性结合的双特异性抗-HtrA1抗体，其中所述抗体包含与HtrA1特异性结合的第一结合结构域和与因子D特异性结合的第二结合结构域，所述第一结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含DSEMH(SEQ IDNO:7)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GVDPETEGAAYNQKFKG(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含GYDYDYALDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含RASSSVEFIH(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含ATSNLAS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含QQWSSAPWT(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列的HVR-L3；所述第二结合结构域包含以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ IDNO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况中，第二结合结构域包含抗-因子D抗原结合抗体片段lampalizumab的一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR。
在一些情况中，包含与HtrA1特异性结合的第一结合结构域的双特异性抗-HtrA1抗体(诸如APEG.LC3.HC3)可以具有与因子D结合的第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：(a)包含与SEQ ID NO:21或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:22或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。与因子D特异性结合的第二结合结构域可以例如包含：(a)包含与SEQ ID NO:119或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQID NO:120或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情况中，与因子D特异性结合的第二结合结构域可以包含：(a)包含与抗-因子D抗原结合抗体片段lampalizumab或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与抗-因子D抗原结合抗体片段lampalizumab或其序列具有至少约80％序列同一性(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))，以及“凸起-进入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)。还可以通过用于产生抗体Fc-异二聚体分子的工程改造静电转向效应(WO 2009/089004A1)；交联两个以上抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术用于产生双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所描述的制备三特异性抗体，产生多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程改造抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见，例如US 2006/0025576A1)。
本文中抗体或片段也包括“双重作用FAb(Dual Acting FAb)”或“DAF”，其包含与HtrA1以及另一种不同的抗原结合的抗原结合位点(例如参见US 2008/0069820)。
8.抗体变体
在某些实施方案中，构思了本文中提供的抗体的氨基酸序列变体(例如，包括一个或多个氨基酸残基改变的抗体变体)。例如，改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性可能是所需的。可以通过将适合的修饰引入到编码抗体的核苷酸序列或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列内的残基缺失，和/或向抗体的氨基酸序列内的残基插入，和/或抗体的氨基酸序列内的残基置换。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以实现最终构建体，条件是所述最终构建体拥有所需特征，例如抗原结合作用。
a)置换变体、插入变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“优选的置换”的标题下显示了保守性置换。表1中在“示例性置换”的标题下提供了更实质性的变化，并且如下文基于氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸置换引入到目的抗体中并且对产物筛选所需活性，例如，保留/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
原始残基 示例性置换 优选置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将需要将这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。
置换变体的一种类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基和/或FR残基。通常，为进一步研究选择的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力，增加的稳定性，增加的表达，改变的pI，和/或降低的免疫原性)具有改变(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文所描述的那些)便利地产生。简言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物活性(例如，结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这种改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基)(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基中做出，同时对所得变体VH或VL测试结合亲和力。已经由例如Hoogenboom等人,在Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien等人,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述了通过构建次级文库并从中重新选择的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种，将多样性引入到所选择用于成熟的可变基因中。随后建立次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及针对HVR的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地，经常靶向HVR-H3和HVR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR中出现，只要这种改变不实质上降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这种改变可以例如在HVR中的接触残基的抗原的外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR不被改变，或者含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个FR中出现，只要这种改变不实质上降低抗体结合抗原的能力。这种改变可以例如改善抗体亲和力和/或稳定性(例如，如通过增加的解链温度所评价的)。
待修饰的框架区残基或HVR区残基的实例包括可能的脱酰胺位点(即，天冬酰胺(N或Asn))、氧化位点(即，甲硫氨酸(M或Met)或色氨酸(W或Trp))或焦谷氨酸转化位点(即，谷氨酰胺(Q或Gln))，其中这些位点处的修饰分别阻止或减少脱酰胺作用和/或氧化和/或焦谷氨酸转化。
为了阻止或减少形成脱酰胺的变体，可以将天冬酰胺(N或Asn)突变成丙氨酸(A或Ala)、谷氨酰胺(Q或Gln)、或丝氨酸(S或Ser)。为了阻止或减少形成氧化变体，可以将甲硫氨酸(Met)或色氨酸(W或Trp)突变成亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。为了阻止或减少形成焦谷氨酸变体，可以将谷氨酰胺(Q或Gln)突变成谷氨酸(E或Glu)。参见例如Amphlett等人,Pharm.Biotechnol.,9:1-140,1996。备选地或另外地，框架区的一个或多个改变(例如置换)可以在亲本抗体的Fc区中。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在该方法中，将残基或一组靶残基(例如，带电荷残基诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)鉴定并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其它置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将所述接触残基和邻近残基作为置换候选物靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有成百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半衰期的多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而产生或移除一个或多个糖基化位点来便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含分枝的双分支寡糖，所述寡糖通常通过N-连接附于Fc区的CH2结构域的Asn297。例如参见，Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰基氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双分支寡糖结构的“茎”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的寡糖以产生具有某些改善特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：例如，如在WO 2008/077546中所描述的，相对于如通过MALDI-TOF质谱法测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如，复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量。Asn297是指位于Fc区中约第297位置处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以位于第297位置上游或下游约±3个氨基酸，即，在第294和300位置之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这种岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括在蛋白质岩藻糖基化方面缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人，特别是在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供具有等分寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区连接的双分支寡糖由GlcNAc等分。这种抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这种抗体变体的实例在例如WO 2003/011878；美国专利号6,602,684；和US 2005/0123546(Umana等)中描述。也提供具有与Fc区连接的寡糖中的至少一个半乳糖残基的抗体变体。这种抗体变体可以具有改善的CDC功能。这种抗体变体在例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO1999/22764中描述。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体Fc区中，因而产生Fc区变体。该Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸残基改变(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为其中抗体体内半衰期重要而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)不必要或有害的应用的所需候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR结合)测定以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留了FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。
评价目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例在美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986)和Hellstrom等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；和Bruggemann等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。备选地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CYTOTOX
Figure BDA0003672327960000871
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于这种测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内，例如，在动物模型(诸如在Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的)中评价目的分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg等人,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期的确定(参见，例如，Petkova等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能减少的抗体包括置换了一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这种Fc突变体包括在两个或更多个氨基酸位置265、269、270、297和327处具有置换的Fc突变体，包括具有将残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或削弱的FcR结合的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含Fc区，所述Fc区具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换，例如Fc区的位置298、333和/或334处的置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致改变的(即，改善的或削弱的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中描述的。
在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了具有增加的半衰期和改善的新生Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述新生Fc受体负责转移母体IgG至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善了Fc区与FcRn的结合。这种Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些(美国专利号7,371,826)。也参见涉及Fc区变体其它实例的Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些实施方案中，所需要的是产生半胱氨酸工程改造的抗体，例如，“硫代MAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在特别的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来将抗体缀合至其它部分(诸如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造的抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所描述的产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三
Figure BDA0003672327960000881
烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的疗法中等。
抗体-聚合物缀合物可以使用任何合适的用聚合物衍生化抗体的技术来制备。应当理解，本发明不限于利用抗体或抗体片段与聚合物之间的任何特定类型的连接的缀合物。
在一个方面，本发明的缀合物包括这样的种类，其中聚合物共价连接至亲本抗体上的一个或多个特定位点，即聚合物连接靶向亲本抗体或抗体片段中的特定区域或一个或多个特定氨基酸残基。聚合物的位点特异性缀合最常见地是通过与亲本抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基连接来实现的。在这样的实施方案中，偶联化学可以例如利用不在亲本抗体的二硫桥键中的半胱氨酸残基的游离巯基。聚合物可以用能够与亲本抗体上的一个或多个游离巯基或硫醇基团特异性反应的任何官能团(诸如马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸、对甲苯磺酸、氮杂环丙烷、exirane和5-吡啶基官能团)活化。可以使用适用于所选的偶联系统的化学的任何方案将聚合物偶联至亲本抗体，诸如美国专利号4,179,337和7,122,636；和Jevsevar等人,Biotech.J.5:113-128,2010中所描述的方案和系统。
在一个实施方案中，天然存在于亲本抗体中的一个或多个半胱氨酸残基被用作用于聚合物缀合的一个或多个连接位点。在另一个实施方案中，将一个或多个半胱氨酸残基工程改造到亲本抗体中的所选择的一个或多个位点中以用于为聚合物提供一个或多个特定连接位点。
在一个方面，本发明涵盖抗体片段-聚合物缀合物，其中所述抗体片段是Fab，并且所述聚合物连接至通常将形成连接轻链和重链的链间二硫键的Fab片段的轻链或重链中的一个或多个半胱氨酸残基。
在另一个方面，本发明涵盖抗体片段-聚合物缀合物，其中所述抗体片段是Fab’，并且聚合物连接靶向Fab’片段的铰链区。在一个实施方案中，天然存在于抗体片段的铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基被用于连接聚合物。在另一个实施方案中，将一个或多个半胱氨酸残基工程改造到Fab’片段的铰链区中以用于为聚合物提供一个或多个特定连接位点。在一个实施方案中，本发明的Fab片段(例如，抗-HtrA1 Fab片段，抗-因子D Fab片段，或抗-HtrA1/抗-因子D Fab片段)通过在C’-末端添加一个半胱氨酸进行修饰，以为聚合物缀合提供一个连接位点。在另一个实施方案中，本发明的Fab片段通过在C’-末端添加四个另外的半胱氨酸Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO:122)进行修饰以用于为聚合物缀合物提供两个连接位点。
一种常用的抗体缀合是PEG化，其中将一个或多个聚乙二醇(PEG)聚合物共价连接至抗体的恒定区。参见美国专利号4,179,337和7,122,636。具有不同大小(例如，约500D至约300,000D)和形状(例如，直链或支链)的PEG聚合物在本领域中是已知的且被广泛使用。可用于本发明的聚合物可以商业获得(例如，从Nippon Oil和Fats；Nektar Therapeutics；Creative PEGWorks获得)或使用常规化学程序从可商购的原料制备。PEG化改变抗体药物的物理和化学性质，并且可以导致改善的药物动力学表现，诸如改善的稳定性、降低的免疫原性、延长的循环寿命以及增加的停留时间。在另一个实施方案中，本文描述的任何抗体(例如，本发明的抗-HtrA1抗体)可以与透明质酸(HA)缀合。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部分加热至杀伤邻近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
f)等电点变体
本发明提供具有改变的等电点的抗体变体。例如，本发明提供了例如与参比抗-HtrA1抗体相比具有降低的等电点(pI)的抗体变体。在一些情况中，表面电荷在生理pH下减少。在一些情况中，抗-HtrA1抗体具有等于或低于约8(例如，约8、约7、约6、约5或约4)的pI。在一些情况中，抗体具有约4至约8(例如，约4、约5、约6、约7或约8)的pI。在一些情况中，抗-HtrA1抗体具有约5至约7(例如，约5、约6或约7)的pI。在一些情况中，抗-HtrA1抗体具有约5至约6(例如，约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9或约6)的pI。
本发明的抗体可以例如通过用具有更低的pI的氨基酸置换给定位置处的野生型氨基酸残基进行工程改造以具有降低的pI。可以基于本领域已知的氨基(-NH2)、羧基(-COOH)和氨基酸侧链的pKa值来确定氨基酸的pI。在一些实施方案中，可以置换暴露于表面的氨基酸残基以减小抗体的pI。在一个实施方案中，可以用谷氨酸(E)置换暴露于表面的氨基酸残基。在一个实施方案中，可以用天冬氨酸(D)置换暴露于表面的氨基酸残基。
D.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物(例如，如美国专利号4,816,567中描述的)产生任一种本文描述的抗体(例如，抗-HtrA1抗体)。在一个实施方案中，提供了分离的核酸，所述核酸编码本文描述的抗-HtrA1抗体。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另外的实施方案中，提供了包含这种核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在另外的实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下载体转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供产生抗-HtrA1抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
为了重组生产抗-HtrA1抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文描述的)分离并插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。
克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊状物中以可溶性级分分离并且可以进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培养的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持(sertoli)细胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,编著,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
E.测定
本文提供的抗-HtrA1抗体(例如，抗-HtrA1抗体和抗-HtrA1/抗-因子D抗体)可以通过本领域已知的多种测定来鉴定、筛选或表征它们的物理/化学特性和/或生物活性。
1.结合测定和其它测定
在一个方面，例如通过已知方法诸如ELISA、蛋白质印迹法、表面等离子共振测定(例如
Figure BDA0003672327960000931
)等，对本发明的抗体测试其抗原结合活性。
在一个方面，使用
Figure BDA0003672327960000932
表面等离子共振(SPR)测定来测量抗原结合活性(例如，如通过KD表示的)。例如，使用
Figure BDA0003672327960000933
或
Figure BDA0003672327960000935
-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定在25℃采用固定的抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)进行。在一个实施方案中，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速注射以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。在注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab在具有0.05％聚山梨醇酯20
Figure BDA0003672327960000936
表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释物(0.78nM至500nM)在25℃以大约25μl/分钟的流速注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0003672327960000934
评价软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定的缔合速率超过106M-1s-1，那么可以通过使用荧光猝灭技术确定缔合速率，所述荧光猝灭技术在如分光计中测量的增加浓度的抗原存在下在25℃测量在PBS(pH7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，所述光谱仪诸如配备断流(stop-flow)的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。还可以使用如以下实施例所描述的
Figure BDA0003672327960000941
SPR测定来测量KD。
在另一个方面，竞争测定可以用来鉴定与本文描述的抗体竞争结合至HtrA1的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合的表位与如本文描述的抗体结合的相同(例如，线性或构象表位)。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols(表位定位法),”在Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。
在示例性竞争测定中，将固定的HtrA1在溶液中温育，所述溶液包含与HtrA1结合的第一标记抗体和正在对其与第一抗体竞争结合至HtrA1的能力进行测试的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的HtrA1在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与HtrA1结合的条件下温育后，移除过多的未结合的抗体，并且测量与固定的HtrA1结合的标记物的量。如果与固定的HtrA1结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，那么这表明第二抗体正在与第一抗体竞争结合至HtrA1。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定
在一个方面，提供用于鉴定具有生物活性的抗-HtrA1抗体的测定。生物活性可以包括，例如，抑制、阻断、拮抗、遏制、干扰、调节和/或降低HtrA1的一种或多种生物活性。还提供在体内和/或在体外具有这种生物活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试这种生物活性。在某些实施方案中，抗-HtrA1抗体与HtrA1结合并且降低或抑制其对一种或多种HtrA1底物(包括例如如以下实施例中描述的H2-Opt底物、α-酪蛋白、β-酪蛋白或
Figure BDA0003672327960000942
FL丝氨酸底物，或任何其它合适的HtrA1底物)的丝氨酸蛋白酶活性。在某些实施方案中，抗-HtrA1抗体以对于一种或多种HtrA1底物小于50nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、3nM、2.5nM、2nM、1nM、800pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM的IC50来抑制HtrA1丝氨酸蛋白酶活性。在某些实施方案中，抗-HtrA1抗体保护光感受器细胞免于降解，保护外核层的厚度，或保护眼病模型(诸如U.S.2013/0129743的实施例10中描述的恒定光照射小鼠模型)中的视网膜电图功能活性。
为了确定抗-因子D抗体或其变体或片段(例如抗原结合片段)是否能够与因子D结合并发挥生物效应(例如抑制旁路途径溶血)，可以使用溶血抑制测定(使用兔红血细胞(RBC))，包括美国专利号8,273,352的实施例2中描述的那些(其通过引用整体结合于此)。这种溶血抑制可以使用标准测定进行确定(Kostavasili等人,J.Immunology 158:1763-72,1997；Wiesmann等人,Nature 444:159-60,2006)。这种测定中的补体激活可以用血清或血浆引发。因子D在血清或血浆中的适合浓度(Pascual等人,Kidney International 34:529-536,1998；Complement Facts Book,Bernard J.Morley和Mark J.Walport,编辑,Academic Press(2000)；Barnum等人,J.Immunol.Methods,67:303-309,1984)可以根据本领域已知的方法常规地确定，包括已经在参考文献中描述的那些，诸如Pascual等人,参上和Barnum等人,参上，和美国专利号8,273,352的实施例4。本文描述的抗-因子D抗体通常能够抑制与因子D有关的生物活性。例如，在18μg/ml的浓度下(相当于血液中人因子D的摩尔浓度的约1.5倍；抗-因子D抗体与因子D的摩尔比为约1.5:1)，可以观察到抗体对旁路补体活性的显著抑制(参见例如美国专利号6,956,107)。
3.稳定性测定
在一个方面，提供用于确定抗-HtrA1抗体的稳定性(例如热稳定性)的测定。例如，可以使用本领域已知的任何方法来确定抗体的稳定性，例如差示扫描荧光测定法(DSF)、圆二色性(CD)、内在蛋白荧光、差示扫描量热法、光谱法、光散射(例如动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS)、自相互作用色谱法(SIC)。可以如本文所描述的来确定测定的稳定性，例如使用如例如在实施例4中描述的质谱(例如在AAPH应激测试和/或热应激测试的情况下)。
F.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任一个抗-HtrA1抗体可用于检测生物样品中HtrA1的存在。如本文所使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，诸如包含光感受器细胞、视网膜色素上皮细胞、外核层的细胞、内核层、Muller细胞、睫状上皮或视网膜组织的样品。在一些实施方案中，生物样品包含体液，例如玻璃体液或血液。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的抗-HtrA1抗体。在其它的方面，提供了检测生物样品中HtrA1的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗-HtrA1抗体与HtrA1结合的条件下使生物样品与本文描述的抗-HtrA1抗体接触，并且检测抗-HtrA1抗体和HtrA1之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，将抗-HtrA1抗体用于选择适合用抗-HtrA1抗体治疗的受试者，例如，其中HtrA1是选择患者的生物标志物。
在某些实施方案中，可以通过检测HtrA1基因或HtrA1控制序列中的一种或多种多态性(诸如HtrA1启动子多态性rs11200638(G/A))来鉴定适合用抗-HtrA1抗体治疗的患者(参见例如DeWan等人,Science 314:989-992,2006，其通过引用整体结合于此)。
可以使用本发明抗体诊断的示例性病症可以包括，但不限于，HtrA相关的病症、眼部病症、补体相关的病症和先兆子痫。在一些情况中，眼部病症包括，但不限于，例如AMD，包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA)))，糖尿病性视网膜病(DR)，早产儿视网膜病(ROP)或息肉状脉络膜血管病(PCV)。
在一些实施方案中，可以使用本发明的抗体来诊断先兆子痫。在一些实施方案中，来源于受试者的样品中的HtrA1水平相对于HtrA1参比水平的升高可以表明受试者患有或易患先兆子痫。参见例如Teoh等人Placenta36(9):990-995,2015。在一些实施方案中，可以使用本发明的抗体来检测血清HtrA1水平。在其它实施方案中，可以使用本发明的抗体来检测胎盘HtrA1水平。
在某些实施方案中，提供了标记的抗-HtrA1抗体。标记包括，但不限于，直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色团标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)，以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括，但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，诸如稀土螯合物或者荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰(dansyl)，伞形酮，荧光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶，诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢氧化染料前体的，酶诸如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。
在本发明的另一个实施方案中，抗体不需要被标记，并且可以使用与抗体结合的标记抗体检测其存在。
本发明的抗体可以在任何已知测定方法中使用，诸如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.1987)。
竞争性结合测定依赖于标记标准物与测试样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的抗原的量与结合抗体的标准物的量成反比。为了便于确定结合的标准物的量，在竞争之前或之后抗体通常是不溶解的，使得与抗体结合的标准物和分析物可以方便地从保持未结合的标准物和分析物中分离出来。
夹心测定法涉及使用两种抗体，每种抗体都能够结合待检测的蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定法中，测试样品分析物被固定在固体支持物上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，从而形成不溶性的三部分复合物。参见例如美国专利号4,376,110。第二抗体本身可以用可检测部分进行标记(直接夹心测定法)或者可以使用用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体进行测量(间接夹心测定法)。例如，夹心测定法中的一种类型是ELISA测定，在这种情况下，可检测部分是酶。
例如，对于免疫组织化学，样品可以是新鲜的或冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并且用防腐剂(诸如福尔马林)固定。
G.诊断试剂盒
为了方便起见，本发明的抗体(例如，抗-HtrA1抗体或抗-HtrA1/抗-因子D抗体)可以在试剂盒(即，预定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书的包装组合)中提供。在抗体用酶标记的情况下，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供基本上优化测定灵敏度的试剂溶液中的浓度。特别地，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括在溶解时将提供具有合适浓度的试剂溶液的赋形剂。
H.药物制剂
可以通过将具有所需纯度的多肽与通常在本领域中使用的任选的“药用”载体、赋形剂或稳定剂(所有这些都被称为”赋形剂”)混合来制备抗体或其抗体变体(例如，本发明的抗-HtrA1抗体或抗-HtrA1/抗-因子D抗体)的治疗制剂以作为冻干制剂或水溶液储存。例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去垢剂、抗氧化剂和其它混合添加剂。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,A.Osol编著(1980)。这些添加剂在所用的剂量和浓度对于接受体必须是无毒性的。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们优选地以范围为约2mM至约50mM的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲剂(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以提及的有磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐诸如Tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且其可以以范围为0.2％-1％(w/v)的量添加。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、六甲氯铵、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以添加等渗剂(有时也被称为“稳定剂”)以保证本发明的液体组合物的等渗性，并且其包括多元糖醇，优选三元或更高元糖醇，诸如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
稳定剂是指宽的赋形剂种类，其在功能上覆盖的范围可以是从填充剂到添加剂，所述添加剂使治疗剂溶解或者有助于防止变性或粘附到容器壁上。典型的稳定剂可以是多元糖醇(以上例举的)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)，半乳糖醇、甘油等，包括环醇诸如肌醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10残基)；蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖和蔗糖；和三糖，诸如棉子糖；和多糖，诸如葡聚糖。稳定剂可以以范围为0.1至10,000重量/重量份的活性蛋白质存在。
可以添加非离子表面活性剂或去垢剂(也称为“湿润剂”)以促进治疗性蛋白质(例如抗体)的溶解以及保护治疗性蛋白质免于搅拌导致的聚集，其也允许制剂暴露于剪切表面应力而不导致蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、
Figure BDA0003672327960000991
多元醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐单酯(
Figure BDA0003672327960000992
等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml(优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml)的范围存在。
另外的混合赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。本文中的制剂也可以根据所治疗的特定适应症的需要而含有多于一种活性化合物，优选地是具有彼此不产生不利影响的互补活性的那些活性化合物。例如，可能需要在制剂中包括HtrA1结合拮抗剂(例如抗-HtrA1抗体)和因子D结合拮抗剂(例如抗-因子D抗体)。在另一个实例中，为了治疗与不需要的心血管形成有关的眼部病症(诸如湿性AMD)，可能需要进一步提供抗血管生成疗法，诸如VEGF拮抗剂疗法，例如
Figure BDA0003672327960001001
(雷珠单抗)。这种活性成分以对预期目的有效的量适当地存在于组合中。
活性成分还可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶质药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或巨乳液(macroemulsion)中。这种技术在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,A.Osal编著(1980)中公开。
可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的合适实例包括含有抗体或其抗体变体或片段(例如抗原结合片段)的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质处于成形制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(可注射微球，其由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，而某些水凝胶在更短的时间段内释放蛋白质。当被包封的抗体留在体内很长时间时，它们可能由于在37℃暴露于湿气而变性或聚集，从而导致生物活性丧失以及可能的免疫原性的改变。可以根据所涉及的机制设计用于稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫互换的分子间S--S键形成，则可以通过以下方法实现稳定化：修饰巯基残基、从酸性溶液中冷冻干燥、控制水分含量、使用合适的添加剂以及开发特异性聚合物基质组合物。
I.治疗方法和组合物
本文提供的抗-HtrA1抗体(例如抗-HtrA1抗体和抗-HtrA1/抗-因子D抗体)中的任一个可以用于治疗方法。
在一个方面，提供了用作药物的抗-HtrA1抗体。在另外的方面，本发明提供了用于治疗HtrA1相关的病症的抗-HtrA1抗体。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症是AMD，包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如地图状萎缩(GA)))。在一些情况中，AMD是晚期干性AMD(例如GA)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗眼部病症的抗-HtrA1抗体。在一些情况中，眼部病症是AMD，包括湿性(渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))；糖尿病性视网膜病(DR)和其它缺血相关性视网膜病；眼内炎；葡萄膜炎；脉络膜新血管形成(CNV)；早产儿视网膜病(ROP)；息肉状脉络膜血管病(PCV)；糖尿病性黄斑水肿；病理性近视；希佩尔-林道病；眼的组织胞浆菌病；视网膜中央静脉阻塞(CRVO)；角膜新血管形成；或视网膜新血管形成。在一些实施方案中，眼部病症是AMD(例如晚期干性AMD(例如GA))。
在另一个方面，提供了用于治疗方法中的抗-HtrA1抗体。在某些情况中，本发明提供了用于治疗患有HtrA相关病症的受试者的方法中的抗-HtrA1抗体，所述方法包括向个体施用有效量的抗-HtrA抗体。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症是AMD，包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))。在一些情况中，AMD是晚期干性AMD(例如GA)。
在另一个情况中，本发明提供了用于治疗患有眼部病症的受试者的方法中的抗-HtrA1抗体，所述方法包括向个体施用有效量的抗-HtrA抗体。在一些情况中，眼部病症是AMD，包括湿性(渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))；DR和其它缺血相关性视网膜病；眼内炎；葡萄膜炎；CNV；ROP；PCV；糖尿病性黄斑水肿；病理性近视；希佩尔-林道病；眼的组织胞浆菌病；CRVO；角膜新血管形成；或视网膜新血管形成。在一些实施方案中，眼部病症是AMD(例如晚期干性AMD(例如GA))。
在一些情况中，本发明提供了用于抑制受试者中视网膜或光感受器细胞变性的抗-HtrA1抗体。在其它情况中，本发明提供了用于抑制受试者眼睛中HtrA1丝氨酸蛋白酶活性的抗-HtrA1抗体。根据任一个上述用途的“受试者”可以是人。
本发明提供了抗-HtrA1抗体在制备或制造药物中的用途。例如，在一个情况中，药物用于治疗HtrA1相关的病症。在另外的情况中，药物用于治疗HtrA1相关的病症的方法，所述方法包括向患有HtrA1相关病症的受试者施用有效量的药物。在任一个前述药物用途中，所述方法可以包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如如以下描述的)。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症是AMD，包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))。在一些情况中，AMD是晚期干性AMD(例如GA)。
在另一个情况中，药物用于治疗眼部病症的方法，所述方法包括向患有眼部病症的受试者施用有效量的药物。在一些情况中，眼部病症是AMD，包括湿性(渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))；DR和其它缺血相关性视网膜病；眼内炎；葡萄膜炎；CNV；ROP；PCV；糖尿病性黄斑水肿；病理性近视；希佩尔-林道病；眼的组织胞浆菌病；CRVO；角膜新血管形成；或视网膜新血管形成。在一些实施方案中，眼部病症是AMD(例如晚期干性AMD(例如GA))。
本发明提供了用于治疗HtrA1相关的病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有HtrA1相关病症的受试者施用有效量的抗-HtrA1抗体。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症是AMD，包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))。在一些情况中，AMD是晚期干性AMD(例如GA)。在另外的情况中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂(如以下描述的)。根据任一个上述方法的“受试者”可以是人。
本发明提供了用于治疗眼部病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有眼部病症的受试者施用有效量的抗-HtrA1抗体。在一些情况中，眼部病症是AMD，包括湿性(渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性(非渗出性)AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))；DR和其它缺血相关性视网膜病；眼内炎；葡萄膜炎；CNV；ROP；PCV；糖尿病性黄斑水肿；病理性近视；希佩尔-林道病；眼的组织胞浆菌病；CRVO；角膜新血管形成；或视网膜新血管形成。在一些实施方案中，眼部病症是AMD(例如晚期干性AMD(例如GA))。
本发明提供了一种治疗有需要的受试者中HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的HtrA1结合拮抗剂和/或因子D结合拮抗剂。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症或补体相关的病症是眼部病症。在一些实施方案中，眼部病症选自由以下各项组成的组：AMD、糖尿病性视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病(von Hippel-Lindaudisease)、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞、角膜血管化和视网膜新血管形成。在一些情况中，眼部病症是AMD，包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))。在一些情况中，AMD是晚期干性AMD(例如GA)。在任一个前述实施方案中，HtrA1结合拮抗剂可以是抗-HtrA1抗体或其抗原结合片段，例如本文描述的任何抗-HtrA1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合抗体片段选自由Fab、Fab’-SH、Fv、scFV和(Fab’)2片段组成的组。在一些实施方案中，抗原结合抗体片段是Fab。在一些实施方案中，Fab包含重链恒定区的铰链区(例如上铰链)中的平截。在一些实施方案中，Fab重链恒定区在位置221处(EU编号)终止。在一些实施方案中，位置221处的氨基酸残基是天冬氨酸残基。在一些实施方案中，Fab的重链恒定区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab是IgG1 Fab。在一些情况中，因子D结合拮抗剂是抗-因子D抗体或其抗原结合片段，例如本文描述的抗-因子D抗体中的任一个。
在另一个方面，本发明提供了与HtrA1和因子D两者特异性结合的双特异性抗体或其抗原结合抗体片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗HtrA1相关的病症、眼部病症和/或补体相关的病症。在一些实施方案中，HtrA1相关的病症和/或补体相关的病症是眼部病症。在一些情况中，眼部病症是AMD，包括湿性AMD(包括早期、中期和晚期湿性AMD)和干性AMD(包括早期、中期和晚期干性AMD(例如GA))。在一些实施方案中，AMD是晚期干性AMD(例如GA)。双特异性抗体可以包含来源于本文描述的任一个抗-HtrA1抗体的与HtrA1特异性结合的结合结构域。双特异性抗体可以包含来源于本文描述的任一个抗-因子D抗体的与因子D特异性结合的结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合抗体片段是Fab片段或(Fab’)2片段。
本文描述的和/或本领域已知的任一个抗-因子D抗体或其抗原结合片段可以用于任一个前述方法或用途。例如，在一些情况中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段可以包括以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYAX1DFKG(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Asp或Glu；(c)包含EGGVX1N(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列的HVR-H3，其中X1是Asn或Ser；(d)包含ITSTX1IX2X3DMN(SEQ ID NO:112)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Ser，X2是Asp或Glu，并且X3是Asp或Ser；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSX1SLPYT(SEQ ID NO:114)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Asp或Glu。在一些情况中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包括以下六个HVR：(a)包含GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:109)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含EGGVNN(SEQ ID NO:116)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含GGNTLRP(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含LQSDSLPYT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗-因子D抗体或其抗原结合片段包括：(a)包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:120的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情况中，VH结构域包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。在一些情况中，VL结构域包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。在一些情况中，抗-因子D抗原结合抗体片段是CAS登记号为1278466-20-8的lampalizumab。
构思了本发明的抗体可以用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，抗体被施用于非人哺乳动物以例如用于获得临床前数据。示例性的待治疗的非人哺乳动物包括非人灵长类、狗、猫、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)和进行临床前研究的其它哺乳动物。所述哺乳动物可以是用于要用所述抗体治疗的疾病的建立的动物模型，或者可以用于研究目的抗体的毒性。在这些实施方案中的每一个中，可以在哺乳动物中进行剂量逐步增大研究。
在另外的方面，本发明提供了包含本文提供的抗-HtrA1抗体中的任一个的药物制剂，其例如用于在上述治疗方法中的任一个中使用。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的抗-HtrA1抗体中的任一个和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的抗-HtrA1抗体中的任一个和至少一种另外的治疗剂(例如，如以下描述的)。
在本文描述的治疗用途和方法中的任一个中，抗-HtrA1抗体可以是Fab。在一些实施方案中，Fab包含重链恒定区的铰链区(例如上铰链区)中的平截。在一些实施方案中，Fab重链恒定区在位置221处(EU编号)终止。在一些实施方案中，位置221处的氨基酸残基是天冬氨酸残基。在一些实施方案中，Fab的重链恒定区包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab是IgG1 Fab。
用于预防或治疗眼部疾病或病症的本发明抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，包括但不限于，例如眼部、眼内和/或玻璃体内注射，和/或巩膜旁注射，和/或筋膜下注射，和/或脉络膜上注射，和/或以滴眼液和/或软膏的形式局部施用。本发明的这种抗体可以通过多种方法递送，例如作为允许化合物缓慢释放到玻璃体内的装置和/或贮藏物经玻璃体内递送，包括在参考文献诸如Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,和Pearson,编辑,Taylor&Francis(2006年3月)中描述的那些。在一个实例中，装置可以呈微型泵和/或基质和/或被动扩散系统和/或包封的小室(cell)的形式，其在延长的时间段内释放化合物(Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,和Pearson,编辑,Taylor&Francis(2006年3月)。也可以使用其它施用方法，其包括但不限于局部、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和病变内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
可以通过本领域中已知的方法和使用本领域中已知的赋形剂来制备用于眼部、眼内或玻璃体内施用的制剂。有效治疗的重要特征是适当穿透通过眼睛。与其中可以局部递送药物的眼睛前部疾病不同，视网膜疾病通常受益于更加具有位点特异性的方法。滴眼液和软膏很少穿透眼睛的后部，并且血眼屏障妨碍被系统性施用的药物穿透到眼组织中。因此，所选择的用于药物递送以治疗视网膜疾病(诸如AMD和CNV)的方法通常是直接的玻璃体内注射。通常以一定间隔重复玻璃体内注射，所述间隔取决于患者的状态以及被递送的药物的性质和半衰期。对于眼内(例如玻璃体内)穿透，通常优选的是具有较小尺寸的分子。
眼睛具有许多生物物理和解剖学特征，其可以使得眼部药物递送具有挑战性。例如，血-眼屏障是保护眼睛免于感染的防御机制，但是同时使得药物难于渗入，尤其是对于眼睛后段中的疾病。因此，通常需要高剂量施用来实现和保持药物的原位生物利用度(例如，眼部停留时间)以便改善效力。同时，眼睛后部中的有限空间限制了递送的药物体积，其反过来可以促成药物在高浓度制剂中递送。
患有眼部病症(例如AMD(例如地图状萎缩))的患者也可以受益于治疗剂的长效/缓释递送。较低频率的给药将为患者提供改善的便利性，具有降低感染率和增加临床效力的潜在益处。高剂量药物的受控释放还可以使药物副作用最小化。两种有希望的用于长效递送的系统是基于PLGA的固体植入物和可植入端口递送系统(PDS)。两种系统都有可能提供接近零级的释放动力学用于延长的时间。对于PLGA植入物，蛋白质药物被包封在疏水聚合物基质中并且药物释放经由聚合物的缓慢水解实现。释放速率可以通过改变药物载量、聚合物疏水性或聚合物分子量来控制。PDS是一种可再填充的装置，其中向玻璃体内的释放通过包含钛玻璃料的多孔金属膜来控制。因为储库具有小的体积，所以利用PDS进行有效递送需要高的蛋白浓度。
除了高浓度和长效递送以外或作为高浓度和长效递送的替代，药物的增加的生物利用度(例如，眼部停留时间)可以通过翻译后修饰实现或受其促进，其中蛋白质药物与天然的或合成的聚合物共价缀合，如聚唾液酸化、HES化(与羟乙基淀粉缀合)和PEG化。参见例如Chen等人,Expert.Opin.Drug Deliv.8:1221-36,2011；Kontermann,BioDrugs 23:93-109,2011。PEG化，即将聚合物聚乙二醇(PEG)共价连接至蛋白质，是一种尤其可用于延长抗体片段治疗剂的半衰期的已知技术。Jevsevar等人,Biotech.J.5:113-128,2010。
药物所暴露的条件根据使用的递送系统而变化。对于在固体PLGA植入物中的结合，使用冻干的或喷雾干燥的药物。使用热熔挤出法来制备植入物，使得药物短暂地暴露于接近90℃的温度。虽然药物在释放过程中保持固态，但是PLGA的降解可以将药物暴露于低pH环境。相反，利用PDS递送的药物被保持在液态下的高浓度并被暴露于玻璃体，玻璃体被表征为一种具有减小的在生理离子强度和pH下还原的环境。
将有效治疗特定眼部病症或病况的抗体或其抗体变体的量将取决于病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。在可能的情况下，首先需要在体外测定剂量-反应曲线和本发明的药物组合物，然后在对人进行测试之前在有用的动物模型系统中进行测定。
另外的合适的施用方式包括肠胃外，肺内和鼻内，并且如有需要用于局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否是短暂的或长期的。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次施用或在各种时间点多次施用，推注(bolus)和脉冲输注(pulse infusion)。在一些情况中，可以通过以下方式施用抗-HtrA1抗体：玻璃体内、经眼、眼内、巩膜旁、筋膜下、脉络膜上、局部、静脉内、肌内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、经腹膜、心室内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眶内、经口、局部、透皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中。
可以通过通常用于评价眼内疾病的各种终点来测量眼部病症(例如补体相关性眼部病症)(诸如AMD或CNV)的治疗功效。例如，可以评价视力丧失。可以通过本领域已知的和/或本文描述的任何方法来评价视力丧失，所述方法包括但不限于，例如通过从基线到所需时间点的最佳校正视敏度(BCVA)的平均改变来测量(例如，其中BCVA是基于糖尿病性视网膜病早期治疗研究(ETDRS)视力表并且在4米的测试距离进行评价)，测量相比于基线在所需时间点在视敏度方面失去少于15个字母的受试者的比例，测量相比于基线在所需时间点在视敏度方面得到多于或等于15个字母的受试者的比例，测量在所需时间点视敏度Snellen等效值为20/2000以下的受试者的比例，测量NEI视功能问卷，测量所需时间点的CNV的尺寸和CNV的渗漏量，例如通过荧光血管造影术等。可以进行眼部评价，例如，其包括但不限于例如进行眼部检查、测量眼内压、评价视敏度、测量裂隙灯压力、评价眼内炎症等。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其它额外的治疗剂组合使用时)将取决于所治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重度和过程，抗体是否出于预防目的或治疗目的而施用、先前的疗法、患者的临床史以及对抗体的反应和主治医师的判断。将抗体以一次或经过一系列治疗来适当地施用至患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)的抗体可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如通过一次或多次单独施用或者通过连续输注施用。在一些实施方案中，所使用的抗体是约0.01mg/kg至约45mg/kg、约0.01mg/kg至约40mg/kg、约0.01mg/kg至约35mg/kg、约0.01mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约25mg/kg、约0.01mg/kg至约20mg/kg、约0.01mg/kg至约15mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、或约0.01mg/kg至约1mg/kg。一个典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg以上的范围内，这取决于以上提及的因素。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病况，治疗通常将持续直至所需的疾病症状的抑制出现。
在一些情况中，将固定剂量的本发明抗-HtrA1抗体施用至例如眼睛。在一些情况中，将约0.1mg至约10mg或约5-15mg的本发明抗-HtrA1抗体施用至眼睛，例如约0.1mg/眼至约0.5mg/眼、约0.5mg/眼至约1mg/眼、约1mg/眼至约1.5mg/眼、约1.5mg/眼至约2mg/眼、约2mg/眼至约2.5mg/眼、约2.5mg/眼至约3mg/眼、约3mg/眼至约3.5mg/眼、约3.5mg/眼至约4mg/眼、约4mg/眼至约4.5mg/眼、约4.5mg/眼至约5mg/眼、约5mg/眼至约5.5mg/眼、约5.5mg/眼至约6mg/眼、约6mg/眼至约6.5mg/眼、约6.5mg/眼至约7mg/眼、约7mg/眼至约7.5mg/眼、约7.5mg/眼至约8mg/眼、约8mg/眼至约8.5mg/眼、约8.5mg/眼至约9mg/眼、约9mg/眼至约9.5mg/眼、或约9.5mg/眼至约10mg/眼。在一些情况中，以约0.1mg/眼至约2mg/眼、约0.1mg/眼至约3mg/眼、约0.1mg/眼至约5mg/眼、约0.1mg/眼至约6mg/眼、约0.1mg/眼至约7mg/眼、约0.1mg/眼至约8mg/眼、约0.1mg/眼至约9mg/眼、约0.1mg/眼至约10mg/眼、约0.5mg/眼至约2mg/眼、约0.5mg/眼至约3mg/眼、约1mg/眼至约3mg/眼、或约2mg/眼至约5mg/眼使用所述抗体。在一些情况中，使用固定剂量的抗-HtrA1抗体，所述剂量为约0.5mg/眼、约1mg/眼、约1.5mg/眼、约2mg/眼、约2.5mg/眼、约3mg/眼、约3.5mg/眼、约4mg/眼、约4.5mg/眼、约5mg/眼、约5.5mg/眼、约6mg/眼、约6.5mg/眼、约7mg/眼、约7.5mg/眼、约8mg/眼、约8.5mg/眼、约9mg/眼、约9.5mg/眼、约10mg/眼或更多。在特别的情况中，例如，以约2mg/眼施用固定剂量的抗-HtrA1抗体。
在一些实施方案中，剂量可以每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每十一周一次或每十二周一次地施用。
HtrA1结合拮抗剂(例如本发明的抗-HtrA1抗体)可以单独施用或与至少第二治疗化合物组合施用。HtrA1结合拮抗剂(例如本发明的抗-HtrA1抗体)和任何第二治疗化合物的施用可以同时进行，例如，作为单个组合物或者作为两种以上不同的组合物，使用相同或不同的施用途径。备选地或另外地，所述施用可以以任何顺序相继进行。在某些实施方案中，在两种以上组合物的施用之间可以存在数分钟至数日至数周至数月的间隔。例如，可以首先施用HtrA1结合拮抗剂(例如本发明的抗-HtrA1抗体)，随后施用第二治疗剂。然而，也考虑同时施用第二治疗剂或在HtrA1结合拮抗剂(例如本发明的抗-HtrA1抗体)之前施用第二治疗剂。在一个实例中，HtrA1结合拮抗剂是抗-HtrA1抗体，例如本文描述的或本领域已知的任何抗-HtrA1抗体。在一个实例中，第二治疗化合物是因子D结合拮抗剂。在另外的实例中，因子D结合拮抗剂是抗-因子D抗体，例如本文描述的或本领域已知的任何抗-因子D抗体。在特别的实施方案中，抗-因子D抗体是lampalizumab。在另外的实施方案中，将抗-因子D抗体以1-15mg的剂量(例如以10mg的剂量)施用。在特别的实施方案中，每两周一次、每三周一次或每四周一次施用lampalizumab。在某些实施方案中，另外的治疗剂是适用于治疗与眼内不需要的新血管形成相关的眼部病症(诸如例如湿性AMD)的治疗剂。合适的治疗剂包括例如抗血管生成疗法，诸如VEGF拮抗剂(例如抗-VEGF抗体和抗体片段，包括
Figure BDA0003672327960001101
(雷珠单抗)和抗-VEGFR1抗体及相关分子(例如阿柏西普(aflibercept)(VEGF Trap-Eye；
Figure BDA0003672327960001102
))；补体系统的抑制剂，诸如补体因子C2拮抗剂(包括例如抗-CFC2抗体)；和抗炎剂，诸如IL-6结合拮抗剂(例如托珠单抗
Figure BDA0003672327960001103
和EBI-031(Eleven Biotherapeutics))。在其它实施方案中，与不需要的眼部新血管形成相关的疾病或病症的治疗可以涉及抗-HtrA1抗体和光动力疗法的组合(例如，用MACUGENTM或VISUDYNETM)。
上文所示的这种组合疗法涵盖组合施用(其中在相同或单独的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和单独施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在施用额外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，HtrA1结合拮抗剂(例如抗-HtrA1抗体)的施用和另外的治疗剂的施用彼此发生在约一个月内，或约一周、二周或三周内，或约一天、二天、三天、四天、五天或六天内。
应当理解，代替抗-HtrA1抗体或除抗-HtrA1抗体以外，可以使用本发明的免疫缀合物来实施上述制剂或治疗方法中的任一种。
J.制品
在本发明的另一个方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断如上描述的病症的材料的制品。所述制造品包括容器和在所述容器上或与所述容器相结合的标签或包装插页。合适的容器包括，例如，瓶、小药瓶、注射器、静脉内溶液袋等。容器可以从多种材料诸如玻璃或塑料中形成。所述容器容纳了本身或与另一种组合物组合时可有效用于治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如所述容器可以是静脉内输液袋或是具有可由皮下注射针头刺透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页说明所述组合物用于治疗选择的病症。此外，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其它方式的治疗剂。在本发明的该实施方案中的制造品可以进一步包含包装插页，所述包装插页指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地或额外地，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药用缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点来看所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
III.实施例
以下是本发明方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文提供的一般表述，可以实施多种其它实施方案。
与HtrA1结合的稳定、高效、高亲和力抗体的开发
以下实验的目标是发现对HtrA1具有更高效力和更高亲和力的新型抗-HtrA1抗体。
首先，产生mHtrA1敲除小鼠。需要使用敲除小鼠，这是因为最初从表达HtrA1的小鼠产生杂交瘤的努力并未成功，可能是因为鼠和人HtrA1蛋白共享98％的序列同一性。
接下来，用mHtrA1的蛋白酶结构域免疫HtrA1敲除小鼠。通过ELISA筛选所得杂交瘤，并且鉴定了75个ELISA阳性克隆。对75个克隆抑制HtrA1蛋白酶底物切割的能力进行测试。75个克隆中的10个显示出抑制HtrA1蛋白酶活性。
基于它们抑制蛋白酶活性的能力，选择这些克隆中的七个用于进一步分析，以结合人和鼠HtrA1以及选择性结合muHtrA1而不是muHtrA3和muHtrA4。对这七个克隆进行进一步筛选，并且发现与对照抗体YW505.94相比，4个克隆对HtrA1具有改善的效力。基于它们的优选分子谱(包括效力和选择性)，选择这些抗体中的两个(15H6和9B12)用于进一步开发。
如下所述，将所选择的抗体的高变区接枝到人框架上。通过单独交换这些残基并测试与人和小鼠HtrA1的结合来测试小鼠轻链游标(Vernier)参比物的重要性。一个置换消除了结合，两个置换降低了结合，两个置换仅影响与鼠HtrA1的结合，并且三个置换对结合没有显著影响。将这三个置换引入抗体15H6.v1以制备抗体15H6.v2。
然后，将15H6.v2进行工程改造以改善其稳定性。鉴定了可能导致氧化(HVR-L3中的W91)、剪裁(HVR-LC中的N94 P95)和脱酰胺(HVR-H2中的D55 G56)的可能的不稳定残基。W91的置换实质上影响了结合。测试了位置N94处的四个置换。这些置换中的两个影响结合，但是选择两个用于另外的分析。测试了位置D55处的四个置换。这些替换中只有一个显示出与亲本分子可比较的结合性。
下一步是改善h15H6.v2结合HtrA1的亲和力。作为第一步，使用深度测序来研究h15H6.v2的结构/功能关系。在该实验中测试的许多单独突变中，发现大约19个单独突变改善了对HtrA1的亲和力。设计并测试含有具有最慢解离速率的LC和HC突变组合的抗体，从而鉴定对HtrA1具有改善的效力和亲和力的变体抗体。对具有最佳亲和力和效力的变体进行工程改造以引入上述稳定化置换。在所得变体中，发现h15H6.v4对HtrA1具有最高的效力。
通过X-射线晶体学和电子显微镜确定与HtrA1结合的Fab格式的h15H6.v4的结构。该结构分析表明h15H6.v4 Fab与HtrA1蛋白的“LA环”紧密结合。h15H6.v4结合的表位不同于对照抗体YW505.94结合的表位。尽管不希望本发明受到任何特定机制的束缚，但是与YW505.94相比，h15H6.v4与HtrA1的LA环之间的紧密相互作用可能解释了该抗体相比于YW505.94的显著改善的亲和力和效力。
下面更详细地阐述了上述实验。
实施例1：使用杂交瘤方法产生抗-HtrA1抗体
A.培养基和抗体
CLONACELLTM-HY培养基B(Cat#03802)、培养基C(Cat#03803)、培养基D(Cat#03804)和培养基E(Cat#03805)来自StemCell Technologies。用于电融合的
Figure BDA0003672327960001131
培养基C(Cat#LCM-C)来自Cyto Pulse Sciences。别藻蓝蛋白(APC)标记的山羊F(ab’)2抗小鼠Ig来自SouthernBiotech(Cat#1012-11)，辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgGFc抗体来自Sigma。TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)一组分HRP微孔底物(Cat#TMBW-1000-01)和TMB终止试剂(Cat#BSTP-1000-01)来自BioFx Laboratories。
B.小鼠的体内免疫
以3至4天的间隔通过脚垫注射(每只小鼠2μg/注射)用纯化的His标签的重组鼠HtrA1蛋白酶结构域(本文中称为muHtrA1-PD-His，SEQ ID NO:153；参见WO 2013/055998的实施例2)免疫五只HtrA1敲除小鼠(HtrA1.noneo.BALB.ko.C1-3)，进行总计12次加强，其中将所述重组鼠HtrA1蛋白酶结构域悬浮于单磷酰脂质A/海藻糖二棒分枝菌酸酯(dicorynomycolate)佐剂中，接着用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的抗原进行2次融合前加强。最后一次加强三天后，收获并分离来自免疫小鼠脾和淋巴结的淋巴细胞。如WO 2013/055998的实施例2中所描述的，通过纯化制备muHtrA1-PD-His用于注射。
C.细胞融合、杂交瘤筛选和亚克隆
使用Cyto Pulse CEEF-50装置(Cyto Pulse Sciences)，将来自两只小鼠(编号748和749)的分离的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(美国模式培养物保藏中心)融合。简言之，用
Figure BDA0003672327960001132
培养基C洗涤两次后，将分离的脾细胞和SP2/0细胞以1:1比率混合，然后以1000万个细胞/ml的浓度重悬于
Figure BDA0003672327960001133
培养基C中。根据制造商的指导进行电融合。在37℃在7％CO2培养箱中，将融合细胞在CLONACELLTM-HY培养基C中培养过夜。第二天，将融合细胞离心，然后重悬于10ml CLONACELLTM-HY培养基C中，然后与含有选择性试剂次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)的90ml基于甲基纤维素的CLONACELLTM-HY培养基D轻轻混合。将细胞铺在40×100mm皮氏(Petri)培养皿(Cat#351029,Becton Dickinson)中，并且使其在37℃在7％CO2培养箱中生长。温育10天后，使用CLONEPIXTM系统(Genetix,United Kingdom)挑取1429个单杂交瘤克隆，并且将其转移到具有200μl/孔CLONACELLTM-HY培养基E的15×96孔细胞培养板(#353075,Becton Dickinson)中。更换杂交瘤培养基，并且在3天后通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选杂交瘤上清液以测定与muHtrA1-PD-His的结合。
根据标准方案进行ELISA。简言之，将96孔微滴定ELISA平板(Greiner，德国)用0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的2μg/ml的100μl/孔muHtrA1-PD-His或huHtrA1-PD-His(SEQ ID NO:154)在4℃包被过夜。用洗涤缓冲液(PBS中的0.05％
Figure BDA0003672327960001141
20，Sigma)洗涤3次后，用具有BSA的100μl ELISA测定稀释液封闭平板。加入100μl的培养上清液或稀释的纯化单克隆抗体(mAb)，并且在室温温育1小时。将平板洗涤三次，并且与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG Fc温育1小时。洗涤三次后，通过加入100μl/孔的TMB底物(BioFXLaboratories)5分钟来检测结合的酶。通过加入100μl/孔终止试剂(BioFX Laboratories)终止反应，然后在650nm吸光度(A650nm)下检测颜色。鉴定105个最初的ELISA阳性上清液。在扩增和培养3天后，将这些克隆在随后的ELISA中重新筛选，该ELISA证实105个克隆中的75个仍是ELISA阳性的，与muHtrA1-PD-His结合(图1A和1B)。这75个克隆中的大多数也与人HtrA1蛋白酶结构域结合(图1A和1B)。
接下来使用体外测定来测试75个ELISA阳性克隆，以评价杂交瘤上清液抑制人HtrA1蛋白酶结构域(huHtrA1-PD-His；SEQ ID NO:154)切割底物的能力。使用
Figure BDA0003672327960001143
绿色荧光蛋白酶测定(ThermoFisher Scientific)测定。该测定采用酪蛋白衍生物，其用pH不敏感的绿色荧光
Figure BDA0003672327960001142
FL染料作为底物进行高度标记。
Figure BDA0003672327960001144
FL染料的荧光在全长标记底物中被分子内猝灭。huHtrA1-PD对底物的切割释放了荧光
Figure BDA0003672327960001146
FL标记的肽，导致荧光信号增加(图2A)。简言之，将杂交瘤上清液和HtrA1-PD(20nM hHtrA1-PD；40μl hHtrA1-PD与60μl上清液)在缓冲液(50mM Tris，200mM NaCl，0.25％CHAPS，pH 8.0)中以200μl的最终体积在37℃温育20分钟。加入5μg/ml的
Figure BDA0003672327960001145
FL标记的底物，并且读取荧光(千分之一相对荧光单位(mRFU)/分钟)20分钟。使用该阻断测定，发现75个克隆中的10个抑制人HtrA1-PD介导的底物切割(图2B和2C)。图3A和3B显示了与huHtrA1-PD相比，克隆子集抑制muHtrA1-PD活性的能力的比较。
在通过有限稀释进行至少2轮单细胞亚克隆后，扩大培养具有不同特征的7个克隆(20E2、19B12、12A5、3A5、15H6、15E3和19G10)，并且收集上清液用于抗体纯化和进一步评价。部分基于体外抑制HtrA1活性并结合muHtrA3(19B12)的能力来选择这些克隆。还测试了7个克隆在免疫组织化学中检测muHtrA1的能力以及与鼠HtrA3-PD和鼠HtrA4-PD结合的能力(如通过ELISA评价的)。表2显示了这7个克隆的定性性质的总结。
表2：选择用于抗体纯化的7个最终克隆的性质
Figure BDA0003672327960001151
下一个步骤是确定如上选择的七种抗体是否抑制HtrA1介导的切割(如FRET测定中所测量的)。
通过蛋白质A亲和层析纯化杂交瘤上清液，然后进行无菌过滤(0.2μm孔径大小，Nalge Nunc International，NY，USA)，并且在4℃储存于PBS中。通过ELISA和FACS确定纯化的单克隆抗体，随后在功能测定中进行进一步测试。通过ISOSTRIPTM小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche Diagnostics Corporation)来确定纯化的mAb的同种型。
在基于FRET的阻断测定(例如H2-Opt测定)中测试纯化的抗体抑制HtrA1活性的能力。在该测定中，确定了抗体抑制荧光共振能量转移(FRET，也称为福斯特
Figure BDA0003672327960001161
共振能量转移)底物的切割的能力。分子量为1600Da的FRET肽底物H2-Opt包括供体Mca(7-甲氧基香豆素-4-基-乙酰基)和受体(猝灭剂)Dnp(N-2,4-二硝基苯基)。FRET肽底物的全长序列是(Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK(SEQ ID NO:152)。在完整的肽底物中，猝灭部分Dnp猝灭Mca供体的荧光。FRET肽底物的蛋白水解切割分离了荧光团和猝灭剂，由此减轻Mca荧光的猝灭并导致荧光信号增加(图4A)。使用以下实施例3的F部分中描述的H2-Opt测定条件进行测定。荧光强度的时间依赖性增加与底物水解的程度有关。抗体在5nM、50nM和500nM的浓度下进行测试。五种纯化的抗-HtrA1抗体(15H6、19B12、3A5、12A5和20E2)保留了阻断人和鼠HtrA1-PD介导的底物切割的能力(图4B和4C)。
接下来，测试纯化的抗体抑制全长HtrA1介导的底物切割的能力。使用纯化的全长(FL)muHtrA1或huHtrA1进行上段描述的基于FRET的阻断测定。如WO 2013/055998的实施例2所描述的来纯化muHtrA1-FL和huHtrA1-FL。纯化的抗体(包括15H6和19B12)抑制huHtrA1-FL(图5A-5B)和muHtrA1-FL(图5C-5D)的活性。在该测定中，克隆15H6以0.7nM的IC50抑制huHtrA1-FL，其与阳性对照抗体YW505.94的IC50相比为大约两倍的提高。克隆15H6以1.1nM的IC50抑制muHtrA1-FL，其与阳性对照抗体YW505.94相比为几乎5倍的提高。克隆19B12抑制huHtrA1-FL的IC50为1.4nM，并且抑制muHtrA1-FL的IC50为1.0nM。如下面D部分中所描述的对选择的抗体进行测序。这些五种抗体的序列显示在图6A和图6B中。基于它们的优选分子谱(包括它们的效力和选择性)，选择两个抗体(15H6和19B12)用于进一步开发。这些抗体的重整格式在以下部分E中描述。
D.来自杂交瘤克隆的抗体测序
i.使用cDNA末端的5’-快速扩增(5’-RACE)以96孔格式从杂交瘤细胞克隆可变区基因序列
对于每个杂交瘤克隆，将约25μl的对数期生长细胞(0.5-1.0x106个细胞/ml)从组织培养板转移至96孔U底平板的孔中。然后加入150μl的冷的1xPBS洗涤细胞，然后以1000rpm旋转5分钟。除去上清液，并且将细胞沉淀重悬于25μl的冷的1xPBS中。
ii.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)反应
在Eppendorf管中制备由以下组成的反应混合物(对于50个孔)：2.5μl的RNASEOUTTM(Invitrogen#10777019)，12.5μl的10x合成缓冲液(
Figure BDA0003672327960001171
缓冲液)，12.5μl的二硫苏糖醇(DTT)(0.1M Invitrogen#P/NY00147)，6.25μl的dNTP(10mMInvitrogen#18427-013)，12.5μl的2.5％壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)，6.25μl的2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)(BioLabs#9001S)，25μl的RACE4muHC引物(1:100，在PCR级水中)(代替Race 3κ引物用于轻链(LC)测序)，37.5μl的PCR级水，和10μl的
Figure BDA0003672327960001172
3酶(Invitrogen#18080-093)。Race4muHC简并引物核苷酸序列是TTT YTT GTC CAC CKT GGTGCT GC(SEQ ID NO:139)，其中Y编码C或T，并且K编码G或T。Race 3κ引物核苷酸序列是GTAGAA GTT GTT CAA GAAG(SEQ ID NO:140)。
然后将2.5μl/孔反应混合物转移到96孔PCR反应板中。向平板中加入1μl细胞/孔，将平板短暂离心30秒，然后摇动平板。将平板放入PCR仪中，并且将程序设定为45℃下30分钟，然后50℃下30分钟。将该平板标记为板A。
iii.加尾反应
用以下成分制备10x储备加尾缓冲液(对于50个孔)：5μl的1M MgCl2，5μl的0.1MDTT，5μl的1M Tris pH 7.5，10μl的100mM dGTP，和25μl的PCR级水。
用以下成分制备工作溶液(对于50个孔)：50μl的10x储备加尾缓冲液，312.5μl的PCR级水，和12.5μl的300单位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)(Promega#M828A/C)。
然后将该工作溶液以7.5μl/孔添加到PCR反应板A中。然后将板A置于PCR仪中，37℃下1小时，然后65℃下5分钟。将该平板标记为板A/B以区分该平板的加尾。
iv.第一次PCR反应
在15mL Falcon管中制备由以下组成的反应混合物(对于50个孔)：1050μl的PCR级水，500μl的5x GC cDNA PCR反应缓冲液，500μl的GC解链试剂(Clontech#S1091)，50μl的正向引物DC5dn，50μl的Race7muHC(用于LC的Race 2κ引物)，50μl的dNTP(10mM)，和50μl的GC
Figure BDA0003672327960001181
聚合酶(Clontech#S1088)。Race7muHC简并引物核苷酸序列是CAR GTCAMD GTC ACT GRC TCA G(SEQ ID NO:141)，其中R编码A或G，M编码A或C，并且D编码G或A或T。Race 2κ引物核苷酸序列是GAG GCA CCT CCA GAT GTT AAC(SEQ ID NO:142)。
然后将45μl的该反应混合物转移至新的PCR反应板的孔中，然后加入1μl的来自板A/B的模板。然后将该平板置于PCR仪中，并且在降低的退火温度下采用降落PCR方法运行，如下所列。将该平板标记为板C。
降落PCR方法：
96℃，4分钟
3个循环[96℃，45秒；64℃，30秒；68℃，90秒]，3个循环[96℃，45秒；61℃，30秒；68℃，90秒]，3个循环[96℃，45秒；58℃，30秒；68℃，90秒]，3个循环[96℃，45秒；57℃，30秒；68℃，90秒]，3个循环[96℃，45秒；55℃，30秒；68℃，90秒]
25个循环[96℃，45秒；52℃，30秒；68℃，90秒]
68℃，5分钟；随后保持4℃结束。
然后，将3μl的PCR产物在2％溴化乙锭(EtBr)
Figure BDA0003672327960001183
上运行，并且检查条带。以10μl/孔添加ExoI/虾碱性磷酸酶(SAP)，并置于PCR仪中在37℃保持45分钟，随后在85℃保持15分钟。制备ExoI/SAP反应混合物用于50个孔：2.5μl的20单位/μl核酸外切酶I(Fermentas#EN0582)，25μl的SAP(USB#70092Y)，472.5μl的PCR级水。在水中制备PCR产物的1:4稀释物。将Race7muHC引物用于测序重链(HC)，并且将Race7.1muLC引物用于测序LC。Race7.1muLC引物核苷酸序列是ACT GCT CAC TGG ATG GTG GGA AG(SEQ ID NO:143)。
v.凝胶过滤和质谱表征
对于凝胶过滤分析，将10ml的纯化样品以0.35ml/min注射到
Figure BDA0003672327960001182
SuperSW3000(4.6mm内径x 30cm，TOSOH Bioscience)上，使用200mM K2PO4、250mM KCl、pH 7.0作为流动相。将大约2mg的纯化IgG用50mM二硫苏糖醇在37℃还原20分钟，并且在使用PLRP-S柱(Agilent)和乙腈梯度的在线反相分离后通过飞行时间(TOF)质谱(Agilent LC/MS6224)进行分析。使用MassHunter定性分析软件(Agilent)，通过收集的m/z谱的最大熵反褶积来确定完整质量。
vi.结果
对于19B12、20E2、3A5、12A5和15H6，重链可变区(VH)的序列显示于图6A中。对于19B12、20E2、3A5、12A5和15H6，轻链可变区(VL)的序列显示于图6B中。这些克隆具有独特的重链和轻链。质谱数据证实了序列数据(参见表3和4)(参见例如Bos等人Biotechnol.Bioeng.112(9):1832-1842,2015)。
表3：如通过质谱所确定的HC质量
Figure BDA0003672327960001191
表4：如通过质谱所确定的LC质量
Figure BDA0003672327960001192
Figure BDA0003672327960001201
E.将抗体15H6和19B12重整
i.抗体15H6和19B12的
Figure BDA0003672327960001207
克隆
进行
Figure BDA0003672327960001202
克隆以确认由直接测序5’-RACE PCR产物(如上描述)获得的抗体克隆15H6和19B12的可变区序列。如用于测序的
Figure BDA0003672327960001203
TA克隆试剂盒(Invitrogen K4575-02)手册所描述的进行
Figure BDA0003672327960001204
TA克隆反应。简言之，将2μl的PCR产物、2μl的水、1μl的
Figure BDA0003672327960001205
载体和1μl的内含盐溶液在管中组合，混合，并在室温温育5分钟。然后将反应物置于冰上，并且将2μl的该
Figure BDA0003672327960001208
克隆反应物添加到
Figure BDA0003672327960001206
化学感受态TOP10大肠杆菌(Escherichia coli)细胞(Invitrogen K4575-02)中，并且在无移吸操作的情况下进行混合。将反应在冰上温育5-30分钟。然后，在不震荡的情况下将细胞在42℃热激30秒。将管立即转移至冰上。加入250μl的室温SOC培养基。将管盖上帽，并且在37℃以200rpm水平震荡1小时。接下来，将50μl的每个转化涂布在预先温热的含有50μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂板上。将平板在37℃温育过夜，第二天挑取克隆，并且进行质粒纯化。确认序列，并且选择
Figure BDA0003672327960001209
载体中各自含有15H6 VH和VL以及19B12 VH和VL序列的特定孔用于作为无限制克隆中的源载体。
ii.无限制克隆至mIgG2a
通过以以下方式(对于LC)配制PCR混合物来扩增
Figure BDA00036723279600012010
载体中的重链和轻链可变区：0.5μl的模板DNA(小量制备(miniprep)源载体)，4μl的15H6 VL正向引物，4μl的15H6VL反向引物，2μl的10mM dNTP，20μl的5xHF缓冲液，1μl的
Figure BDA00036723279600012011
聚合酶(F-549L,Thermo Scientific,2U/μl)，和68.5μl的水。用于克隆HC的反应混合物以相同的方式配制，除了使用15H6 VH正向和反向引物以外。19B12 PCR混合物以与15H6混合物相同的方式配制，除了使用19B12引物以外。引物序列如下：
15H6 VL正向引物核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAA ATT GTTCTC TCC CAG TCT CC(SEQ ID NO:144)。
15H6 VL反向引物核苷酸序列：GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC CCG TTT GATTTC CAG CTT GG(SEQ ID NO:145)。
15H6 VH正向引物核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC CAG GTC CAGCTG CAG CAG TCT GG(SEQ ID NO:146)。
15H6 VH反向引物核苷酸序列：GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACTGAG GTT CCT TGA CCC(SEQ ID NO:147)。
19B12 VL正向引物核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA AAC ATTGTG GTG ACC CAA TCT CC(SEQ ID NO:148)。
19B12 VL反向引物核苷酸序列：GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC CCG CTTTAT TTC CAG CTT GG(SEQ ID NO:149)。
19B12 VH正向引物核苷酸序列：GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC GAG GTGAAG CTG GTG GAA TCT GGG GGA GG(SEQ ID NO:150)。
19B12 VH反向引物核苷酸序列：GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTGACT GCG GTT CCT TGA CCC(SEQ ID NO:151)。
PCR循环条件如下：
98℃，30秒
35个循环[98℃，15秒；68℃，30秒；72℃，35秒]
72℃，10分钟
将扩增的VH和VL用作引物以通过以下方式(对于15H6 LC)配制PCR混合物来扩增模板DNA：1.25μl的模板mIgG2a PRK载体DNA(小量制备的1:10稀释物)，0.5μl的15H6 VLPCR产物(100-200ng/μl)，1μl的10mM dNTP，10μl的HF缓冲液(5x)，1μl的
Figure BDA0003672327960001211
聚合酶，35.75μl的水。以相同方式配制15H6 HC PCR混合物，除了使用15H6 VH PCR产物以外。以相同方式配制19B12 PCR混合物，除了使用19B12 PCR产物以外。
PCR循环条件如下：
98℃，30秒
25个循环[98℃，15秒；68℃，30秒；72℃，4分钟]
72℃，10分钟
然后，将18μl的PCR反应物转移至新管中，并且在周期性旋转该管的情况下，用2μl的DpnI(#RO176L,NEB 20,000U/ml)在37℃消化2小时。根据制造商说明书，用1μl的DpnI消化液转化30μl的感受态NOVABLUE SINGLESTM感受态细胞(Novagen,70181)。简言之，将细胞解冻，加入DNA，并且将细胞在冰上温育5分钟后热激30秒，放回冰上2分钟，税后加入SOC培养基。将25μl或50μl铺于含有50μg/ml羧苄青霉素的平板，并且置于37℃过夜。第二天挑取克隆，经由小量制备进行质粒纯化，并且对质粒进行测序。
iii.抗体纯化
在具有500ml MCA96头的Tecan Freedom
Figure BDA0003672327960001221
200液体处理系统上，从293上清液进行自动纯化。简言之，使用定制填充有20ml MABSELECT SURETM树脂(Glygen Corp.,Columbia,Maryland&GE Healthcare,Pittsburgh,Pennsylvania)的尖端柱(tip column)来捕获IgG。在用1xPBS pH 7.4洗涤后，将IgG洗脱到160ml的50mM磷酸(pH 3)中，并且用12ml的20xPBS pH 11中和。将MABSELECT SURETM尖端柱用0.1MNaOH抽提，并且用1xPBS pH7.4再生，用于连续施用多达15次。类似地，使用填充有20mL GAMMABINDTMPlus树脂(GlygenCorp&GE Healthcare)的尖端柱来捕获Fab，随后用1xPBS pH 7.4洗涤Fab。将Fab洗脱到190ml的10mM柠檬酸盐(pH 2.9)中，并且用19ml 0.4M Tris pH 8.7中和。将GAMMABINDTMPlus尖端柱用6M胍冲刷，并且用1xPBS pH 7.4再生，用于连续施用多达15次。
iv.重组15H6和19B12抗体保留原始阻断活性
使用以上部分C中描述的FRET阻断测定来评价重组15H6和19B12抗体抑制huHtrA1-FL活性的能力。如从来源于杂交瘤的抗体所确定的，两种重组抗体都保持其原始阻断活性(图7A和7B)。重组15H6抗体具有大约0.7nM的IC50，而重组19B12抗体具有大约1.2nM的IC50，这反映了来源于杂交瘤的抗体的活性(图7A和7B)。
实施例2：抗-HtrA1杂交瘤抗体15H6和19B12的人源化
A.抗-HtrA1抗体15H6的人源化
将鼠15H6抗体(也称为m15H6)的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列与人抗体共有序列进行比对，并且人共有轻链κ1(huκ1)和人共有重链亚组I(huVH1)被鉴定为最接近的人框架(图8A和8B)。
通过Kunkel诱变(参见例如Kunkel等人,Methods Enzymol.154:367-382,1987)，将m15H6轻链和重链的高变区(HVR)分别接枝到huκ1和huVH1共有受体框架中，其中对每个高变区使用单独的寡核苷酸以产生抗体克隆h15H6.v1(图8A和8B)。在该过程中，将m15H6VL中HVR-L1中的位置24-34、HVR-L2中的位置50-56和HVR-L3中的位置89-97接枝到huκI共有受体中，并且将m15H6 VH中HVR-H1中的位置26-35、HVR-H2中的位置49-65和HVR-H3中的位置95-102接枝到huGI共有受体中。轻链(FR-L2)的框架区2中的位置46、47和49以及重链(FR-L3)的框架区3中的位置67、69、71和93也包括在人源化过程中，这是因为Foote和Winter已经分析了抗体和抗原复合物的晶体结构，并且发现这些位置是充当“游标(Vernier)”区的框架残基的一部分，其可以调节HVR结构并进行微调以适应抗原(Foote等人,J.Mol.Biol.224:487-499,1992)(图8A-8B)。如以下C部分的小节ii中所描述的，通过BIACORETM表面等离子共振(SPR)结合测定来测量Fab格式的m15H6和h15H6.v1对人和鼠HrtA1的结合亲和力。表5总结了该分析的结果。
表5：m15H6和h15H6.v1与HtrA1的动力学结合分析
Figure BDA0003672327960001231
为了进一步评价h15H6.v1中鼠游标残基的重要性，将该抗体展示在噬菌体上，并且用人残基(LC：L46、L47、Y49；HC：V67、I69、R71和A93)替换个别游标鼠残基(LC：P46、W47、S49；HC：A67、L69、A71和T93)以产生点突变变体。对所有7种变体进行针对人或鼠HtrA1的噬菌体竞争性ELISA以确定结合亲和力(就噬菌体IC50而言，参见下文C部分的小节i)。结果表明LC-P46L变体完全消除h15H6.v1与人和鼠HtrA1两者的结合。LC-S49Y变体减少与人和鼠HtrA1的结合达约10倍(图10A和10B)。HC变体HC-A67V和HC-T93A两者都仅影响与鼠HtrA1的结合，但是不影响与人HtrA1的结合(图10A和10B)。其它变体LC-W47L、HC-L69I和HC-A71R并未显示出与人和鼠HtrA1结合的任何显著下降(图10A和10B)。因此，通过添加以下突变来进一步工程改造抗体克隆h15H6.v1：LC-W47L、HC-L69I和HC-A71R，以产生抗体克隆h15H6.v2(参见图8A和8B)。
抗体克隆h15H6.v2的化学稳定性分析鉴定了HVR中的几个潜在的不稳定残基或残基对：HVR-L3中的W91(氧化)、HVR-L3中的N94 P95(剪切)和HVR-H2中的D55 G56(异构化)。参见例如以下实施例4。为了解决HVR-L3中的W91氧化，产生了2种变体(LC-W91Y和LC-W91L)并且将其生产为用于BIACORETMSPR结合分析的Fab。总结于下表6中的结果表明，位置LC-W91对于结合亲和力是重要的，并且置换影响与人和鼠HtrA1的结合达约20-50倍(图11A和11B)。
表6：h15H6.v2 LC-W91变体与HtrA1的动力学结合分析
Figure BDA0003672327960001241
对于HVR-L3的位置LC-N94 LC-P95处的剪切，产生h15H6.v2的四个变体(LC-N94ALC-P95(也称为AP)、LC-N94E LC-P95(也称为EP)、LC-N94Q LC-P95(也称为QP)和LC-N94SLC-P95(也称为SP))并将其生产为Fab用于BIACORETM结合分析。结果表明，AP和EP变体显示出与人HtrA1相似的结合亲和力，并且QP和SP变体与人HtrA1的结合亲和力降低大约2倍(图12A-12B)。总结该分析结果的表格显示在图12B中。
对于HVR-H2的残基HC-D55 HC-G56处的异构化，产生四个变体(HC-D55A HC-G56(也称为AG)、HC-D55E HC-G56(也称为EG)、HC-D55S HC-G56(也称为SG)和HC-D55 HC-G56A(也称为DA))并将其生产为Fab用于BIACORETM结合分析。结果表明，仅EG变体显示出可比的针对人HtrA1的结合亲和力，并且重链位置55和/或56处的其余变体与人HtrA1的结合亲和力降低2至3倍(图13A和13B)。总结该分析结果的表格显示在图13B中。
基于这些结果，将两种变体AP(HVR-L3)和EG(HVR-H2)引入到抗体克隆h15H6.v2的序列中，以产生抗体克隆h15H6.v2.APEG(也称为h15H6.v3或AP_EG)(参见图8A和8B)。还将该克隆与h15H6.v2的几种其它变体进行比较，所述变体包括LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56(也称为EP_EG)；LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56(也称为QP_EG)；和LC-N94S LC-P95HC-D55E HC-G56(也称为SP_EG)。BIACORETMSPR分析表明，h15H6.v2.APEG保持了可比的与h15H6.v2的结合亲和力(图14A和14B)。总结该分析结果的表格显示在图14B中。使用实施例1中描述的基于FRET的阻断测定来确定这些变体阻断HtrA1活性的能力(图14C和14D)。还使用软件程序SMACK(参见例如Sharma等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:18601,2014)来确定Fab格式的这些变体的pI，并且与抗-VEGF Fab雷珠单抗
Figure BDA0003672327960001251
相比，显示于表7中。
表7：H15H6.v2变体的pI
抗体克隆 pI
h15H6.v2.APEG(h15H6.v3) 8.25
EP_EG 7.45
QP_EG 8.25
SP_EG 8.25
雷珠单抗 8.55
B.抗-HtrA1抗体19B12的人源化
将鼠抗体19B12(也称为m19B12)的VL和VH的氨基酸序列与人抗体共有序列进行比对，并且人共有轻链κ1V(huκ4)和人共有重链亚组III(huVH3)被鉴定为最接近的人框架(图15A-15B)。
通过Kunkel诱变将m19B12轻链和重链的高变区分别接枝到huκ4和huVH3共有受体框架中，其中对每个高变区使用单独的寡核苷酸以产生直接的HVR接枝的变体，本文中称为抗体克隆h19B12.v1。在该过程中，将19B12 VL中HVR-L1中的位置24-34、HVR-L2中的位置50-56和HVR-L3中的位置89-97接枝到huκ4共有受体中，并且将19B12 VH中HVR-H1中的位置26-35、HVR-H2中的位置50-65和HVR-H3中的位置95-102接枝到huGIII共有受体中(图15A-15B)。
使用以下C部分的小节ii中描述的方法，使用BIACORETMSPR(图16A-16D)来确定m19B12和h19B12.v1(Fab格式)的结合亲和力。该分析的结果总结于下表8中。与m19B12相比，h19B12.v1与人HtrA1的平衡结合常数(KD)在人源化后提高为大约2倍(表8)。
表8：m19B12或h19B12.v1与HtrA1的动力学结合分析
Figure BDA0003672327960001261
C.材料和方法
i.噬菌体竞争ELISA以确定噬菌体IC50
将MAXISORPTM微量滴定板用PBS中的2μg/ml人HtrA1-PD-His包被2小时，然后用PBST缓冲液(0.5％BSA和0.05％
Figure BDA0003672327960001262
在PBS中)在室温封闭1小时。将纯化自培养上清液的噬菌体与PBST缓冲液中的连续稀释的人或鼠HtrA1在组织培养微量滴定板中温育1小时，然后将80μl的混合物转移至人HtrA1包被的孔中15分钟以捕获未结合的噬菌体。将平板用PBT缓冲液(0.05％
Figure BDA0003672327960001263
在PBS中)洗涤，并且加入HRP缀合的抗-M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)(1:5000，在PBST缓冲液中)保持40分钟。将平板用PBT缓冲液洗涤，并且通过加入四甲基联苯胺底物(Kirkegaard和Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)进行显色。将450nm处的吸光度绘制为溶液中目标浓度的函数以确定噬菌体IC50。这被用作对噬菌体表面上展示的Fab克隆的亲和力估计。
ii.通过BIACORETM进行的抗体亲和力测定
为了通过单循环动力学确定抗-HtrA1 Fab的结合亲和力，采用了使用BIACORETMT100仪器进行的(SPR)测量。简言之，根据供应商说明书，用1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂活化S系列传感器芯片CM5，并且偶联链霉抗生物素蛋白(Pierce)以实现大约2500个响应单位(RU)，然后用1M乙醇胺阻断未反应的组。
对于动力学测量，首先以10μl/min的流速注射生物素化的人或鼠HtrA1-PD-His以在3个不同流动池(FC)上捕获大约150RU，除了FC1(作为参比)以外，然后将抗-HtrA1 Fab在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)中从低(0.48nM)至高(300nM)的5倍连续稀释物在相同的循环中一个接一个地注射(流速：30μl/min)，在注射之间不进行再生。在通过BIACORETMT100评价软件(版本2.0)进行评价之前，记录传感图并减去参比和缓冲液。使用简单的一对一Langmuir结合模型，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。
实施例3：抗-HtrA1抗体克隆h15H6.v2的亲和力成熟
A.h15H6.v2亲和力成熟NNK文库构建和淘选
为了进一步改善抗-HtrA1抗体克隆h15H6.v2的亲和力，由Fab-琥珀格式的变体h15H6.v2构建噬菌体文库用于Fab噬菌体展示，所述Fab噬菌体展示具有轻链HVR残基(即，HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)或重链HVR残基(即，HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)，使用编码所有20个氨基酸且具有32个密码子的NNK简并密码子将这些残基随机化(参见例如Brenner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(12):5381-5383,1992)。将文库设计为在三个轻链或重链HVR中的每一个中允许一个NNK突变。将所得文库DNA电穿孔到大肠杆菌XL1细胞中，产生大约109个转化体。在一些情况中，如PCT/US2015/055672中所描述的，采用软随机化文库和NNK上位性。将噬菌体文库与SUPERBLOCKTMPBS缓冲液(Pierce)和0.05％
Figure BDA0003672327960001281
20中的750mM NaCl温育30分钟，然后应用于捕获中性抗生物素蛋白的生物素化HtrA1-His标签上用于第一轮淘选，以减少HtrA1与噬菌体之间的非特异性带电相互作用。在接下来的两轮中，使用浓度降低的生物素化huHtrA1-PD-His抗原与作为溶液中的竞争剂的1000x非生物素化HtrA1以增加选择严格性。对于淘选策略的示意图，参见图17。
B.h15H6.v2亲和力成熟文库的深度测序
对于深度测序，从大肠杆菌XL-1细胞中分离噬菌粒双链DNA，所述细胞携带来自最初噬菌体文库和来自第三轮选择的噬菌粒载体。将纯化的DNA用作模板，用于使用
Figure BDA0003672327960001283
DNA聚合酶(New England Biolabs)的VL和VH区的有限循环的基于PCR的扩增。通过琼脂糖凝胶提取和清洁(Qiagen凝胶提取试剂盒)纯化PCR产物。将洗脱的扩增子DNA用作用于深度测序文库制备的基础，其使用TRUSEQTMDNA样品制备试剂盒(Illumina)，采用标准Illumina文库制备方法进行。将衔接头(adapter)连接的文库进行单个循环的PCR，并且在Illumina
Figure BDA0003672327960001282
上测序，使用配对末端测序进行，插入大小为200bp或300bp(视情况而定)，以覆盖扩增子的整个长度。
C.h15H6.v2亲和力成熟文库的深度测序分析
使用统计程序语言R(参见例如R Core Team,R:A language and environmentfor statistical computing,2013)和ShortRead软件包(参见Morgan等人,Bioinformatics 25(19):2607-2608,2009)，分析测序数据。对鉴定的HVR序列进行质量控制(QC)，其中检查每个HVR序列的正确长度，并且允许仅携带多达一个NNK突变并且无非NNK突变。通过计算每个随机位置的所有突变的频率来生成位置权重矩阵。如先前所描述的(Fowler等人,Nature Methods 7(9):741-746,2010)，通过将分选样品中给定位置处的给定突变的频率除以未分选样品中完全相同的突变的频率，计算每个突变的富集比率。描绘轻链HVR位置和重链HVR位置中每个突变的富集比率的热图分别显示于图18A和18B中。
选择来自具有高富集比率的轻链或重链文库的单突变以进行合成，用于克隆到含有Flag标签的哺乳动物Fab表达构建体中以产生Fab-Flag标签融合蛋白。将编码重链或轻链的质粒转染到293T细胞中进行30ml表达，并且用抗-Flag柱纯化Fab。
使用BIACORETMSPR分析，将含有单突变的纯化的Fab用于确定结合亲和力(参见下面的部分D)。单突变的亲和力数据总结于表9中。与对于h15H6.v2的值为约0.0016相比，解离速率的范围为约0.0013至约0.004。与15H6.v2相比，变体LC3(LC-N31E)将解离速率提高2至3倍。
表9：通过深度扫描诱变鉴定的h15H6.v2突变的结合亲和力
Figure BDA0003672327960001291
D.选择的抗体的组合用于进一步的亲和力改善
相对于亲本克隆h15H6.v2，来自重链或轻链NNK文库的大部分单突变不会改善对HtrA1的结合亲和力(表9)。从轻链(LC3、LC4和LC7)和重链(HC1、HC2、HC3和HC5)变体中选择具有最慢解离速率的变体以产生组合突变体。这些组合突变体包括变体轻链和变体重链两者。使用组合突变体进行BIACORETM动力学分析(如下文C部分中所描述的)。与亲本Fab(h15H6.v2)相比，组合突变体LC3.HC3、LC3.HC1和LC7.HC2的亲和力改善提高为2-3倍(表10)。
表10：组合突变结合HtrA1的动力学分析
样品 k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(1/s) KD(M) VL SEQ ID NO: VH SEQ ID NO:
LC3.HC3 8.01E+05 4.93E-05 6.16E-11 83 95
LC3.HC1 8.85E+05 7.95E-05 8.89E-11 83 93
LC7.HC2 1.97E+06 1.89E-04 9.55E-11 87 94
LC3.HC5 5.77E+05 1.02E-04 1.76E-10 83 97
h15H6.v2 7.22E+05 1.58E-04 2.20E-10 73 77
LC3.HC2 3.62E+05 1.09E-04 3.02E-10 83 94
LC7.HC3 7.09E+05 2.37E-04 3.35E-10 87 95
LC5.HC2 2.94E+05 2.11E-04 7.19E-10 85 94
LC7.HC5 4.06E+05 3.03E-04 7.45E-10 87 97
LC7.HC1 3.47E+05 2.67E-04 7.72E-10 87 93
LC4.HC1 2.68E+05 2.28E-04 8.52E-10 84 93
LC5.HC5 3.37E+05 2.96E-04 8.77E-10 85 97
LC3 1.27E+05 1.15E-04 9.05E-10 83 77
LC5.HC3 2.33E+05 2.51E-04 1.08E-09 85 95
LC5.HC1 2.08E+05 2.30E-04 1.10E-09 85 93
LC7 1.37E+05 1.88E-04 1.37E-09 87 77
LC4.HC5 2.12E+05 2.97E-04 1.40E-09 84 97
LC4.HC3 1.10E+05 2.40E-04 2.18E-09 84 95
LC4.HC2 2.78E+04 2.22E-04 7.98E-09 84 94
接下来，进一步组合LC突变体(LC37＝LC3_LC7、LC347＝LC3_LC4_LC7)和HC突变体(HC13＝HC1_HC3、HC23＝HC2_HC3)。通过整合HVR-L3 N94A和HVR-H2 D55E变体(即AP_EG，参见实施例2)来进一步修饰这些突变体，以避免亲和力动力学分析的自我切割和脱酰胺作用。
APEG.LC3.HC1、APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)、APEG.LC37.HC13、APEG.LC37.HC23、APEG.LC347.HC13和APEG.LC347.HC23是最优的克隆，它们与h15H6.v2相比具有3至5倍的提高(图20)。这些变体的VL和VH氨基酸序列分别显示于图21A和21B中。使用基于计算机的分析，通过HVR-L3 W91上氧化的潜在风险对这些克隆的序列进行分析(Sharma等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111:18601,2014)。APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)、APEG.LC37.HC13和APEG.LC347.HC13与h15H6.v3具有相当的风险。其它所具有的风险高于h15H6.v2。
E.通过
Figure BDA0003672327960001311
SPR进行的Fab亲和力测定
为了确定选择的Fab变体对HtrA1的结合亲和力，使用BIACORETMT200仪器进行SPR测量。简言之，根据供应商说明书，用1-EDC和NHS试剂活化S系列传感器芯片CM5，并且偶联抗-His抗体以实现200-300个响应单位(RU)，然后用1M乙醇胺阻断未反应的组。对于动力学测量，首先以10μl/min流速注射大约5nM的huHtrA1-PD-His以在2个不同流动池(FC)捕获大约100RU，除了FC1(作为参比)以外。接下来，注射Fab在HBS-P缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005％表面活性剂P20)中从低(0.8nM)至高(50nM)的5倍连续稀释物(流速：30μl/min)。通过从空白流动池中减去RU来校正HtrA1上的结合响应。在通过
Figure BDA0003672327960001312
T200评价软件(版本2.0)进行评价之前，记录传感图并减去参比和缓冲液。使用简单的一对一Langmuir结合模型，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为koff/kon的比率。
F.h15H6.v2变体在基于HtrA1 FRET的阻断测定(H2-Opt阻断测定)中的抑制活性
测试选择的亲和力成熟的h15H6.v2变体抑制HtrA1活性的能力。使用H2-Opt底物((Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK)进行体外基于FRET的阻断测定。如美国专利申请公开号2013/0129743A1的实施例3中所描述的进行H2-Opt阻断测定，其通过引用整体结合于此。简言之，使用具有HBTU的标准偶联程序，在Fmoc-Lys(Boc)-wang树脂上合成最初描述为HtrA2底物的肽H2-Opt(Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK)(SEQ ID NO:152)(参见例如Martins等人,J.Biol.Chem.278:49417-27,2003)。Fmoc-Lys(DNP)--OH(Anaspec)被并入P5’位置。将肽合成至P5(Mca，7-甲氧基-香豆素，Aldrich)，然后在室温使用三氟乙酸、三异丙基硅烷和水从固体载体切割2小时。将肽从乙醚中沉淀出来，用乙酸、乙腈、水萃取并冻干。将粗制的标记肽溶解并使用乙腈/水在制备型反相C18柱上纯化。将纯化的级分合并、冻干并通过液相色谱/质谱(PE/Sciex)进行分析，并且发现与其计算质量一致。
在96孔黑色光学底板(Nalge Nunc Int.,Rochester,N.Y.)中，将HtrA1与在测定缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，200mM NaCl，0.25％CHAPS)中连续稀释的抗-HtrA1抗体在37℃温育20分钟。将肽底物Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK(SEQ ID NO:152)(H2-Opt)在DMSO中的10mM储备溶液在水中稀释至12.5μM，在37℃预热，然后添加至反应混合物中。在
Figure BDA0003672327960001321
M5酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,Calif.)上测量荧光信号的增加(激发328nm，发射393nm)，并且确定H2-Opt切割的线性速率(mRFU/min)。
图22A显示了基本上如上所述进行的三次独立的H2-Opt测定实验的结果的总结。与h15H6.v2的约0.39nM相比，大多数克隆的IC50值在约0.4nm至约0.5nM的范围内。在该测定中，抗-HtrA1抗体APEG.LC3.HC3(也称为h15H6.v4)在约0.386nM处显示出最佳的IC 50值(图22A)。图22B显示了该分析的代表图。通常，与h15H6.v2相比，亲和力成熟的h15H6.v2变体显示出改善的HtrA1的最大抑制(图22A)，最大抑制值在约78％至约96％的范围内。
将基于FRET的H2-Opt阻断测定用于评价h15H6.v2变体(包括h15H6.v4)的不同抗体格式抑制HtrA1活性的能力。基本如上所述进行H2-Opt测定，除了测定条件为：1nMhuHtrA1-PD酶、1.25μM H2-Opt底物、50mM Tris pH 8、200mM NaCl、0.25％CHAPS以外。基于相对荧光单位(RFU)/s速率(50-1000s)或2000s时的终点RFU值来分析结果。图23A-23H显示了比较Fab格式的h15H6.v2和IgG或Fab格式的h15H6.v4抑制huHtrA1-PD活性的能力的示例性独立实验的结果。抗-HtrA1抗体YW505.94a(参见WO2013/055988)充当阳性对照。图24A和24B分别显示了IC50和IC90结果的总结，其来自使用RFU/s方法分析的三次独立实验的第一组。图25A和25B分别显示了IC50和IC90结果的总结，其来自使用RFU/s或终点RFU方法分析的三次独立实验的第二组(对于h15H6.v4 Fab)。
G.APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)在基于质谱的活性测定中的阻断能力
使用基于质谱(MS)的活性测定来评价APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)抑制huHtrA1-PD介导的切割完整全长底物(α-酪蛋白)的能力。在该实施例中，将抗-HtrA1抗体h15H6.v4与HtrA蛋白酶的小分子抑制剂ucf-101进行比较，所述ucf-101已被描述为HtrA2的拮抗剂(也称为Omi)(Cilenti等人,J.Biol.Chem.278(13):11489-11494,2003)。在h15H6.v4或ucf-101的存在下，将串联质量标签(TMT)等压质量标签标记用于HtrA1切割α-酪蛋白的基于MS的定量分析。α-酪蛋白具有可以被HtrA1切割的三个P1’残基：Ser72、Thr95和Ser157。
将TMTDUPLEXTM等压质量标签试剂用于区别地标记α-酪蛋白标准品和测定样品以定量完整α-酪蛋白。TMTDUPLEXTM试剂是一套等压化合物(即相同质量和结构，也称为同位素异位体(isotopomer))，它们是NHS激活的以用于伯胺(-NH2)基团的共价、不可逆标记。每个等压(isobaric)试剂在质量报告标签部分含有不同数量的重同位素，其在串联MS/MS期间产生独特的报告质量用于样品鉴定和相对定量。
100mM三乙基碳酸氢铵、100nM huHtrA1、100μg/mLα-酪蛋白和抑制剂(即ucf-101或h15H6.v4)在37℃温育(终体积为20μL)18小时(消化的溶液)。分开地，在不存在抑制剂的情况下产生类似的溶液，并且相同地进行温育(对照溶液)。h15H6.v4 Fab在3.12nM至100nM的浓度范围中进行测试，而阳性对照小分子抑制剂ucf-101在2nm至250nM的浓度范围中进行测试。
如根据销售商(Thermo Fisher Scientific)所推荐的，生成串联质量标签(TMTDUPLEXTM)储备溶液。将5μL的TMT-126添加至消化的溶液中，并且将5μL的TMT-127添加至对照溶液中。在室温温育1小时后，将上述溶液以等体积基准进行混合。样品在LC-MS上运行，并且使用更高能量的C阱解离(HCD)，通过最强离子峰的分裂进行定量；将在分裂后为126/127的报告离子强度比用于确定消化的溶液中的浓度。
滴定曲线显示，该测定准确定量了完整的α-酪蛋白(图26B)。在该测定中，h15H6.v4 Fab以约45nM的IC50(IC90＝约71nM)抑制完整α-酪蛋白的huHtrA1-PD介导的切割。与小分子抑制剂ucf-101(IC50为77μM)相比，该值是显著改善的。
H.h15H6.v2亲和力成熟变体在内源性HtrA1活性测定中的阻断活性
在兔眼模型中评价h15H6.v2亲和力成熟变体抑制内源性HtrA1活性的能力。对于内源性HtrA1活性测定，使用来自分泌HtrA1的细胞(人C32黑素瘤细胞)的培养基作为HtrA1的来源。参见，例如，Ciferri等人Biochem J.2015年9月18日,DOI:10.1042/BJ20150601。值得注意的是，在内源性测定中，与重组HtrA1 H2-Opt测定相比，HtrA1的浓度为大约10倍高(参见例如图28)，这被认为是解释了使用内源性HtrA1和重组HtrA1的H2-Opt测定中观察到的不同IC50值。图27A-27C显示了内源性HtrA1测定的结果。特别地，克隆APEG.LC3.HC3(h15H6.v4)具有约1.125nM的IC50(图27C)，最大抑制为约80.1％。
I.选择的h15H6.v2变体的性质的总结
使用BIACORE SPR分析和基于FRET的H2-Opt活性测定，比较抗-HtrA1抗体克隆h15H6.v2的选定衍生物的动力学结合和抑制活性。为了确定最大抑制，使用阳性和阴性对照来确定0％抑制(仅酶，无抑制剂)和100％抑制(无酶)。该比较的结果显示于图28中。
实施例4：抗-HtrA1抗体的分子评价分析
在分子评价(MA)分析中测试抗-HtrA1抗体克隆h15H6.v2、h15H6.v2.APEG(也称为h15H6.v3)和APEG.LC3.HC3(也称为h15H6.v4)的稳定性性质。还测试了抗-HtrA1抗体克隆h19B12.v1。简言之，在使用AAPH(2,2-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐)(一种已知产生自由基的小分子)(参见，例如，Ji等人,J.Pharm.Sci.98(12):4485-4500,2009)的化学条件下，以及不同pH的热条件下(在40℃、pH5.5的两周热应激测试)(参见，例如，Zhang等人,J.Chromatography A 1272:56-64,2013)，测试抗-HtrA1抗体(1mg/ml)的应激。
表11显示了h15H6.v2和h15H6.v3的MA分析结果之间的比较。值得注意的是，在h15H6.v2和h15H6.v3中两者中，HVR-L3中的LC-W91在AAPH应激后氧化增加(分别为约84.5％和约86.4％)。表12显示了h15H6.v4的MA分析的结果。令人惊讶地，与h15H6.v2和h15H6.v3相比，h15H6.v4在HVR-L3中的LC-W91处的氧化降低，其在AAPH应激后的氧化仅增加26.5％，相比之下，h15H6.v2和h15H6.v3的氧化增加大约84.5-86.4％。这种改善是意料之外的，因为与h15H6.v3相比，APEG.LC3.HC3只有两个取代，即FR-H1区域中的HC-T28K和HVR-L1中的LC-N31E，这两者被引入以改善亲和力，并且并未预期这两者中任一者会影响LC-W91的氧化。使用单柱纯化程序来制备该MA分析中使用的h15H6.v4抗体。当使用抗体(使用双柱纯化程序制备的)重复h15H6.v4的MA分析时，LC-W91显示出在AAPH应激下是不稳定的。据信，使用由双柱纯化程序纯化的材料进行的AAPH应激评价的结果不同于使用通过单柱纯化程序纯化的材料所获得的结果，这是因为单柱纯化材料含有干扰AAPH应激评价的污染物。
表11：h15H6.v2和h15H6.v3的MA性质
Figure BDA0003672327960001351
Figure BDA0003672327960001361
表12：h15H6.v4(APEG.LC3.HC3)的MA性质
Figure BDA0003672327960001362
表13显示了抗-HtrA1抗体克隆h19B12.v1的MA分析的结果。确定HVR-H2中的HC-N52a HC-G53是不稳定的，其中脱酰胺增加49％。因此，预计h19B12.v1的这些HVR-H2位置处的置换(例如，HC-N52aE、HC-N52aS、HC-N52aS和HC-N52a HC-G53A)改善了稳定性。
表13：h19B12.v1的MA性质
Figure BDA0003672327960001363
Figure BDA0003672327960001371
实施例5：与HtrA1结合的h15H6.v4 Fab的结构
通过X-射线晶体学和电子显微镜确定与HtrA1结合的h15H6.v4 Fab的结构。结果证明，h15H6.v4 Fab HtrA1表位主要由包含HtrA1的LA环的转角的氨基酸形成。
肽合成：
使用本领域公知的方法产生对应于HtrA1蛋白的区域的肽。参见，例如，Atherton,E.等人(1978).J.Chem Soc.Chem.Commun.13:537-539。
结晶：
将0.15M NaCl、20mM Tris pH 7.5中的10mg/ml的h15H6.v4 Fab(1mL)与1mg的含有HtrA1的LA环中的氨基酸的肽(3倍摩尔过量的肽/蛋白质)在4℃温育过夜。使用2M硫酸铵、0.2M乙酸钾使Fab-肽复合物结晶。
X-射线细化：
通过浸入冷冻保护剂溶液(通过向母液中加入30％甘油制得)、随后突然浸入液氮中，收获并保存h15H6.v4 Fab/HtrA1肽晶体用于衍射分析。在SSRL束线12-2处收集数据，并且使用XDS进行处理(Kabasch W(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.266:125-32)。使用Fab结构作为CCP4中的搜索探针来实现Fab-肽复合物的分子置换(Winn MD等人(2011)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.67:235-42)。刚体细化后，可以看到肽的Fo-Fc密度。然后，使来自A环的HtrA1蛋白酶结构域残基的一部分(RKLPFSKREVPV)(PDB3TJO)适应基本上如Emsley等人(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.66:125-32所描述的密度。
采用Phenix中的几轮细化(Adams PD等人(2010)Acta Crystallogr DBiolCrystallogr.66:213-21)。Buster中的最后一轮细化(Bricogne G等人(2011))使得R值为：R＝16.8％,
Figure BDA0003672327960001381
分辨率。
与HtrA1结合的Fab15H6.v4的电子显微镜(EM)结构
对于EM成像，将4μl的HtrA1-hFab15H6.v4复合物在新鲜辉光放电连续碳400目铜载网(Electron Microscopy Sciences)上温育30秒。温育后，使用2％(w/v)甲酸双氧铀(SPI Supplies)溶液对样品进行负染色。将过量的染色溶液用Watman纸吸干并将载网风干。在Tecnai-12 BioTween(FEI)上分析HtrA1-Fab15H6.v4样品，所述Tecnai-12 BioTween(FEI)配备有LaB6长丝并且在低剂量条件下在120keV进行操作。使用4k×4k CCD照相机(Gatan Inc.)以×62,000的标称放大倍数(
Figure BDA0003672327960001382
/像素)采集图像。使用包含于EMAN2分布中的e2dogpicker.py程序下可用的群算法(Tang L等人(2007)J.Chem.Inf.Model.47:1438–45)，半自动地挑取框尺寸为128px的27346个粒子。然后，使用软件套件Relion将这些粒子进行无参比2D分类(Scheres SH(2012)J.Struct.Biol.180:519-30)。鉴于HTRA1三聚体与结合的Fab之间的灵活度，使用Relion的3D分类算法来产生五个三维体(3D volume)，其中使用HtrA1三聚体(PDB ID 3TJO)的晶体结构作为起始模型低通滤波至分辨率为
Figure BDA0003672327960001383
最后，使用Relion的Refine3D算法细化这些三维体中的每一个。使用Chimera中的拟合映射算法(Pettersen EF等人,2004)，将HTRA1三聚体的原子密度和Fab15H6.v4的晶体结构拟合到EM密度中。J.Comput.Chem.25:1605–12(2004)。
使用丙氨酸置换验证与HtrA1结合的Fab15H6.v4 Fab的结构
上述结构研究表明，Fab15H6.v4 Fab与HtrA1蛋白的“A”环紧密相互作用。为了证实这一点，合成了对应于人HtrA1序列的残基190-201(其中编号对应于前体蛋白的编号)的肽，并且使用如上描述的表面等离子共振(SPR)测试与h15H6.v4 Fab的结合。肽(LA-pep1)显示出与KD值为0.4nM的15H6.v4 Fab的强结合相互作用。参见表14。
该肽序列中的丙氨酸置换减少(LA-pep2，LA-pep5)或完全消除(LA-pep3，LA-pep4，LA-pep5)与15H6.v4 Fab的结合。这些生物物理结果与上面描述的以及图32A和32B中的结构研究一致，并且证明了15H6.v4的结合表位主要由包含HtrA1的LA环的转角的氨基酸形成。
相反地，YW505.94 Fab不与LA-pep1结合，也不与任何突变形式结合(表14)。这表明，尽管YW505.94 Fab和h15H6.v4彼此竞争结合HtrA1的事实，但是这两个Fab的表位是不同的。YW505.94 Fab表位以B环和C环为中心，而15H6.v4 Fab的表位主要包含LA环的末端。
尽管不希望本发明受到任何特定机制的束缚，但是与YW505.94相比，h15H6.v4与HtrA1的LA环之间的紧密相互作用可能解释了该抗体相比于YW505.94的显著改善的亲和力和效力。
表14：与15H6.v4 Fab结合和与YW505.94 Fab结合的HtrA1 A环(LA)肽
Figure BDA0003672327960001391
*NB–未检测到高达1μM的结合，**亲和力损失＝KD突变体/KD野生型。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例的方式较详细地描述了前述发明，但是所述描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。
序列表
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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Val Asp Pro Glu Thr Glu Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Glu Phe Ile
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Ser
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ala Pro Trp Thr
85 90 95
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Val Asp Pro Glu Thr Asp Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 24
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Ser
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
<400> 63
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<223> 合成构建体
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
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<223> 合成构建体
<400> 67
Asp Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
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Ser Arg Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
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<223> 合成构建体
<400> 68
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
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<210> 74
<211> 106
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Phe Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
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<211> 119
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<223> 合成构建体
<400> 78
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Gly Gly Val Asp Pro Glu Thr Glu Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Glu Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Ser
35 40 45
Ala Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Ala Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是Asp或Glu
<400> 110
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Xaa Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Asn或Ser
<400> 111
Glu Gly Gly Val Xaa Asn
1 5
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Asp或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Asp或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Asp或Ser
<400> 112
Ile Thr Ser Thr Xaa Ile Xaa Xaa Asp Met Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Asp或Glu
<400> 114
Leu Gln Ser Xaa Ser Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Glu Gly Gly Val Asn Asn
1 5
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn
1 5 10
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 119
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 120
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 121
<211> 480
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro
20 25 30
Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro
35 40 45
Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys
50 55 60
Cys Glu Val Cys Gly Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu
65 70 75 80
Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro
85 90 95
Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys
100 105 110
Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn
115 120 125
Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg
130 135 140
Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu
145 150 155 160
Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val
165 170 175
Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu
180 185 190
Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile
195 200 205
Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn
210 215 220
Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala
225 230 235 240
Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile
245 250 255
Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu
260 265 270
Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu
275 280 285
Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly
290 295 300
Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp
305 310 315 320
Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp
325 330 335
Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser
340 345 350
Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His
355 360 365
Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly
370 375 380
Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp
385 390 395 400
Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu
405 410 415
Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp
420 425 430
Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val
435 440 445
Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg
450 455 460
Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro
465 470 475 480
<210> 122
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Gly Val Asp Pro Glu Thr Asp Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Phe Ile His
1 5 10
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
1 5
<210> 126
<211> 253
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Met His Ser Trp Glu Arg Leu Ala Val Leu Val Leu Leu Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ala Cys Ala Ala Pro Pro Arg Gly Arg Ile Leu Gly Gly Arg Glu Ala
20 25 30
Glu Ala His Ala Arg Pro Tyr Met Ala Ser Val Gln Leu Asn Gly Ala
35 40 45
His Leu Cys Gly Gly Val Leu Val Ala Glu Gln Trp Val Leu Ser Ala
50 55 60
Ala His Cys Leu Glu Asp Ala Ala Asp Gly Lys Val Gln Val Leu Leu
65 70 75 80
Gly Ala His Ser Leu Ser Gln Pro Glu Pro Ser Lys Arg Leu Tyr Asp
85 90 95
Val Leu Arg Ala Val Pro His Pro Asp Ser Gln Pro Asp Thr Ile Asp
100 105 110
His Asp Leu Leu Leu Leu Gln Leu Ser Glu Lys Ala Thr Leu Gly Pro
115 120 125
Ala Val Arg Pro Leu Pro Trp Gln Arg Val Asp Arg Asp Val Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Leu Cys Asp Val Ala Gly Trp Gly Ile Val Asn His Ala Gly
145 150 155 160
Arg Arg Pro Asp Ser Leu Gln His Val Leu Leu Pro Val Leu Asp Arg
165 170 175
Ala Thr Cys Asn Arg Arg Thr His His Asp Gly Ala Ile Thr Glu Arg
180 185 190
Leu Met Cys Ala Glu Ser Asn Arg Arg Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser
195 200 205
Gly Gly Pro Leu Val Cys Gly Gly Val Leu Glu Gly Val Val Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Arg Val Cys Gly Asn Arg Lys Lys Pro Gly Ile Tyr Thr Arg
225 230 235 240
Val Ala Ser Tyr Ala Ala Trp Ile Asp Ser Val Leu Ala
245 250
<210> 127
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asp
20 25 30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 129
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala Tyr Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225 230 235 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 130
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val
35 40 45
Asp Thr Asp Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg
50 55 60
Gly Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn
85 90 95
Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn
100 105 110
Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 131
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 132
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Ser Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 133
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Glu Ser Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 134
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Glu Ser Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Glu Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 135
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Ser Ile Glu Ser Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 136
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 137
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 138
<400> 138
000
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
tttyttgtcc accktggtgc tgc 23
<210> 140
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
gtagaagttg ttcaagaag 19
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
cargtcamdg tcactgrctc ag 22
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
gaggcacctc cagatgttaa c 21
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
actgctcact ggatggtggg aag 23
<210> 144
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
gcaactgcaa ctggagtaca ttcacaaatt gttctctccc agtctcc 47
<210> 145
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
ggatacagtt ggtgcagcat cagcccgttt gatttccagc ttgg 44
<210> 146
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
gcaactgcaa ctggagcgta cgcccaggtc cagctgcagc agtctgg 47
<210> 147
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
gggcccttgg tggaggctga ggagacggtg actgaggttc cttgaccc 48
<210> 148
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
gcaactgcaa ctggagtaca ttcaaacatt gtggtgaccc aatctcc 47
<210> 149
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
ggatacagtt ggtgcagcat cagcccgctt tatttccagc ttgg 44
<210> 150
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
gcaactgcaa ctggagcgta cgccgaggtg aagctggtgg aatctggggg agg 53
<210> 151
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
gggcccttgg tggaggctga ggagacggtg actgcggttc cttgaccc 48
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> N-端Mca
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Lys(DNP)
<400> 152
Ile Arg Arg Val Ser Tyr Ser Phe Lys Lys
1 5 10
<210> 153
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Met His
1 5 10 15
Gln Ser Thr Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu
20 25 30
Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro
35 40 45
Ala Val Val His Ile Glu Leu Tyr Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg
50 55 60
Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly
65 70 75 80
Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn Lys Asn Arg Val Lys
85 90 95
Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val
100 105 110
Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys
115 120 125
Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu
130 135 140
Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr
145 150 155 160
Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu
165 170 175
Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr
180 185 190
Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly
195 200 205
Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser
210 215 220
Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser
225 230
<210> 154
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe
20 25 30
Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu
35 40 45
Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala
65 70 75 80
His Val Val Thr Asn Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly
85 90 95
Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile
100 105 110
Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu
115 120 125
Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly
130 135 140
Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr
145 150 155 160
Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp
165 170 175
Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro
180 185 190
Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val
195 200 205
Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe
210 215 220
Leu Thr Glu Ser
225
<210> 155
<211> 480
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 155
Met Gln Ser Leu Arg Thr Thr Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Leu Ala Leu Pro Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Thr Val Cys Pro Glu His Cys Asp Pro Thr Arg Cys Ala Pro
35 40 45
Pro Pro Thr Asp Cys Glu Gly Gly Arg Val Arg Asp Ala Cys Gly Cys
50 55 60
Cys Glu Val Cys Gly Ala Leu Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu
65 70 75 80
Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro
85 90 95
Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys
100 105 110
Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Lys Thr Tyr Thr Asn
115 120 125
Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Lys Leu Arg Gln
130 135 140
Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu
145 150 155 160
Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val
165 170 175
Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Tyr Arg Lys Leu
180 185 190
Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile
195 200 205
Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn
210 215 220
Lys Asn Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala
225 230 235 240
Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile
245 250 255
Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu
260 265 270
Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu
275 280 285
Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly
290 295 300
Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp
305 310 315 320
Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp
325 330 335
Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser
340 345 350
Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His
355 360 365
Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly
370 375 380
Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp
385 390 395 400
Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Leu Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu
405 410 415
Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp
420 425 430
Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Thr Ala Asn Asp Val
435 440 445
Ser Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg
450 455 460
Gly Asn Glu Asp Ile Val Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro
465 470 475 480
<210> 156
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
100
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5
<210> 159
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Glu Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Ser
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ala Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 160
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Val Asp Pro Glu Thr Glu Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220

Claims (23)

1.与HtrA1表位特异性结合的分离的抗体，其中所述HtrA1表位包含HtrA1蛋白的至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由Arg190、Leu192、Pro193、Phe194和Arg197组成的组。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:160所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:159所示的轻链氨基酸序列。
3.与HtrA1特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含结合结构域，所述结合结构域包含以下六个HVR：
(a)由SYIMS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列组成的HVR-H1；
(b)由YISNGGGTTYYSDTIKG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列组成的HVR-H2；
(c)由QNFRSDGSSMDY(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列组成的HVR-H3；
(d)由RASESVDSYGKSFMH(SEQ ID NO:42)的氨基酸序列组成的HVR-L1；
(e)由LASKLES(SEQ ID NO:43)的氨基酸序列组成的HVR-L2；和
(f)由QQNNEDPYT(SEQ ID NO:44)的氨基酸序列组成的HVR-L3。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含：包含与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，和包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域。
5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述抗体包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VH结构域，和包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL结构域。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体是与HtrA1结合的抗体片段，其中所述抗体片段选自由Fab、Fab’-SH和(Fab’)2片段组成的组。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述抗体片段是Fab。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中所述Fab包含重链恒定区的上铰链中的平截，其中所述重链恒定区在SEQ ID NO:160的位置221处终止。
9.根据权利要求1-5和7-8任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合HtrA1，解离常数(KD)值为550皮摩尔(pM)或更低。
10.分离的核酸，其编码根据权利要求1-5和7-8中任一项所述的抗体。
11.产生抗体的方法，所述方法包括：培养包含载体的宿主细胞，以及从所述宿主细胞或宿主细胞培养基回收所述抗体，所述载体包含根据权利要求10所述的分离的核酸。
12.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-5和7-8中任一项所述的抗体，并且还包含至少一种药用载体、赋形剂或稀释剂。
13.根据权利要求1-5和7-8中任一项所述的抗体在制备用于治疗HtrA1相关眼部病症的药物中的用途，所述眼部病症选自由AMD、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病和息肉状脉络膜血管病组成的组。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述HtrA1相关的眼部病症是早期干性AMD、中期干性AMD或晚期干性AMD。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述晚期干性AMD是地图状萎缩。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的用途，其中所述抗体为适合眼部给药的形式。
17.根据权利要求14-15中任一项所述的用途，其中所述抗体为适合玻璃体内给药的形式。
18.根据权利要求14-15中任一项所述的用途，其中所述抗体为适合巩膜旁给药的形式。
19.根据权利要求14-15中任一项所述的用途，其中所述抗体为适合筋膜下给药的形式。
20.根据权利要求14-15中任一项所述的用途，其中所述抗体为适合脉络膜上给药的形式。
21.根据权利要求17所述的用途，其中所述抗体为适合玻璃体内注射给药的形式。
22.根据权利要求14-15中任一项所述的用途，其中所述抗体为适合通过长效递送系统给药的形式。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述长效递送系统是基于PLGA的固体植入物或可植入端口递送系统。
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