TW202039585A - 靶向htra1之基於抗體之療法及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於治療、預防或抑制眼睛疾病之組合物及方法。在一個態樣中，本發明提供抗HTRA1抗體或抗原結合片段及其使用方法。

Description

靶向HTRA1之基於抗體之療法及使用方法
年齡相關黃斑變性(Age-related macular degeneration；AMD)為醫學病狀且為西方社會中合法失明之主要原因。AMD通常影響老年人且由於黃斑(負責視敏度之視網膜之中心處的著色區域)之變性及新生血管變化而引起中心視覺之喪失。存在四種主要AMD亞型：早期AMD；中期AMD；晚期非新生血管性(「乾性」) AMD；以及晚期新生血管性(「濕性」) AMD。通常，藉由視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium：RPE)之病灶性色素過多及脈絡膜小疣沈積物之積聚來鑑別AMD。脈絡膜小疣沈積物之大小及數目通常與AMD嚴重度相關。
至多8%的超過60歲之個體出現AMD，且AMD之發病率隨著年齡增長而持續增加。預計到2050年美國將具有接近2200萬AMD病例，而到2040年，預期全球AMD病例接近2.88億。
需要用於預防AMD自早期發展至中期及/或自中期發展至晚期以防止視力喪失之新穎治療。
在一些實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段或其功能片段，其結合於HTRA1蛋白質。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段亦結合於HTRA2、HTRA3或HTRA4中之一或多者。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段亦結合於HTRA4。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段不結合於HTRA2、HTRA3及HTRA4或顯示與其的較弱結合。在一些實施例中，該HTRA1蛋白質為人類HTRA1蛋白質或其功能片段。在一些實施例中，該HTRA1蛋白質包含與SEQ ID NO: 121之胺基酸序列或其功能片段至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制任何一或多種HTRA1功能。在一些實施例中，相較於在不存在該HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在該HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在相同細胞類型中之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制細胞中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在該HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在另一隻眼睛中之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制任何眼睛中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段能夠降低HTRA1裂解任何一或多種HTRA1受質之能力。在一些實施例中，該HTRA1受質選自由以下組成之群：纖調蛋白(fibromodulin)、彈性蛋白、群集素、ADAM9、玻連蛋白、α2-巨球蛋白、踝蛋白-1、肌成束蛋白(fascin)、LTBP-1、EFEMP1、纖蛋白5、tau、RseA及氯化物胞內通道蛋白。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段能夠抑制HTRA1裂解補體級聯之調節子(例如，玻連蛋白、纖調蛋白或群集素)的能力。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段能夠抑制HTRA1，使得相較於在不存在抗HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下HTRA1裂解HTRA1受質及/或補體級聯之調節子的能力，該HTRA1裂解該HTRA1受質及/或該補體級聯之調節子的能力降低達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段能夠抑制該HTRA1蛋白質三聚之能力。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或抗原結合片段之情況下該HTRA1蛋白質三聚之能力，該抗體或抗原結合片段能夠抑制該HTRA1蛋白質三聚之能力達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含圖2中所指示的CDR序列中之任一者或其組合。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 1-120之CDR胺基酸序列中之任一者或其任何組合。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為以下集合中之任一者之CDR集合：SEQ ID NO: 1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72、73-78、79-84、85-90、91-96、97-102、103-108、109-114或115-120。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 1-6之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 7-12之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 19-24之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 31-36之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 37-42之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 61-66之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 73-78之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 103-108之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 109-114之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 115-120之該等CDR。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 1-120之該等胺基酸序列中之任一者或其組合，但其中該等胺基酸序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸取代。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含闡述為以下集合中之任一者之CDR集合：SEQ ID NO: 1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72、73-78、79-84、85-90、91-96、97-102、103-108、109-114或115-120，但其中該等胺基酸序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸取代。在一些實施例中，該等取代為保守性取代。在一些實施例中，相較於缺乏該等取代之該抗體或抗原結合片段，該等取代增加該抗體或抗原結合片段對HTRA1抗原決定基之結合親和力，或該等取代造成結合親和力減小不超過5%、10%、20%、30%、40%或50%。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段為全長抗體。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段為單株抗體。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段為人類化抗體。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段為其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗原結合片段為scFv。在一些實施例中，該抗原結合片段選自由以下組成之群：Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dAb片段及/或dsFv。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段結合於以下HTRA1結構域中之一或多者：類胰島素生長因子結合結構域、kazal結構域、類胰蛋白酶肽酶結構域及/或PDZ結構域。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段能夠結合於非人類物種HTRA1。在一些實施例中，該非人類物種HTRA1為小鼠、大鼠、家兔、母牛、猴(例如，食蟹獼猴)或猿(例如，黑猩猩) HTRA1蛋白質。
在一些實施例中，本發明提供一種聚核苷酸，其編碼本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。
在一些實施例中，本發明提供一種載體，其包含該等聚核苷酸中之任一者。
在一些實施例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文中所揭示之載體中之任一者且能夠表現該聚核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供一種宿主細胞，其表現本文中所揭示之聚核苷酸中任一者中之一或多者，該等聚核苷酸編碼本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之疾病或病症之方法，其中該疾病或病症與異常表現之HTRA1相關聯，其中該方法包含向該個體投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之疾病或病症之方法，其中相較於未患有該疾病或病症之對照個體之水準，HTRA1以大至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%或500%之水準表現於患有該疾病或病症之個體中，其中該方法包含向該個體投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之年齡相關黃斑變性或息肉狀脈絡膜血管病變之方法，其中該疾病或病症與異常表現之HTRA1相關聯，其中該方法包含向該個體投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。在一些實施例中，該對照個體為與患有該疾病或病症之該個體具有相同性別及/或具有類似年齡的個體。在一些實施例中，該個體在HTRA1基因中具有一或多個突變。在一些實施例中，該一或多個突變並未在該HTRA1基因之編碼序列中。在一些實施例中，該一或多個突變在人類個體中之10q26中。在一些實施例中，該一或多個突變對應於人類個體中之以下多態性中之任何一或多者：rs61871744；rs59616332；rs11200630；rs61871745；rs11200632；rs11200633；rs61871746；rs61871747；rs370974631；rs200227426；rs201396317；rs199637836；rs11200634；rs75431719；rs10490924；rs144224550；rs36212731；rs36212732；rs36212733；rs3750848；rs3750847；rs3750846；rs566108895；rs3793917；rs3763764；rs11200638；rs1049331；rs2293870；rs2284665；rs60401382；rs11200643；rs58077526；rs932275及/或rs2142308。在一些實施例中，該個體患有年齡相關黃斑變性。在一些實施例中，該個體患有濕性AMD。在一些實施例中，該個體患有乾性AMD。在一些實施例中，該個體患有息肉狀脈絡膜血管病變。在一些實施例中，該個體為人類。在一些實施例中，該人類為至少40歲。在一些實施例中，該人類為至少50歲。在一些實施例中，該人類為至少65歲。在一些實施例中，局部投與該抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，玻璃體內投與該抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，視網膜下投與該抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，全身性投與該抗體或抗原結合片段。
在一些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，該組合物實質上無熱原質。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2018年11月16日申請之美國臨時申請案第62/768,557號之優先權權益。前述申請案之說明書以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供用於治療、預防或抑制眼睛疾病的組合物及方法。在一個態樣中，本發明提供抗HTRA1抗體或其抗原結合片段。在另一態樣中，本發明提供治療、預防或抑制眼睛疾病之方法，該方法藉由眼內(例如，玻璃體內)投與有效量的本文中所揭示之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者來進行。
可使用本文提供之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段及方法中之任一者來治療或預防眼睛之多種疾病。可使用本發明之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段及方法來治療或預防的眼睛疾病包括(但不限於)青光眼、黃斑變性(例如，年齡相關黃斑變性)、糖尿病性視網膜病、遺傳性視網膜退化(諸如視網膜色素變性)、視網膜脫落或損傷及視網膜病(諸如為遺傳的，由手術、外傷、潛在病因(諸如重度貧血症、SLE、高血壓、血質不調、全身性感染)或潛在頸動脈疾病、毒性化合物或藥劑或光學上誘導的視網膜病)。
通用技術 除非本文中另外定義，否則本申請案中所用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所理解之含義。一般而言，與本文所描述之化學、細胞及組織培養、分子生物學、細胞及癌症生物學、神經生物學、神經化學、病毒學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學結合使用之命名法及其技術為此項技術中熟知且常用者。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。
除非另外指明，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其完全處於熟習此項技術者之範圍內。此等技術完整解釋於以下文獻中，諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(Sambrook等人, 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編, 1993-1998) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Sambrook及Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)；Harlow及Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998)；Coligan等人, Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003)；Short Protocols in Molecular Biology (Wile及Sons, 1999)。
根據製造商之說明書如此項技術中通常實行或如本文所描述執行酶促反應及純化技術。與本文所描述之分析化學、生物化學、免疫學、分子生物學、合成有機化學及醫學及醫藥化學結合使用之命名法及其之實驗程序及技術為此項技術中熟知且常用者。標準技術係用於化學合成及化學分析。
在本說明書及實施例通篇中，措詞「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變體應理解為暗示包括所陳述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。
應理解，在本文用語言「包含」描述的任何地方，亦提供關於「由…組成」及/或「基本上由…組成」描述的其他類似實施例。
術語「包括」用於意謂「包括(但不限於)」。「包括」及「包括(但不限於)」可互換使用。
在術語「例如(e.g./for example)」之後的任何實例並不意謂為窮盡性或限制性的。
除非另外為情形所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本文中使用冠詞「一(a及an)」指代該冠詞之一個或超過一個(亦即指至少一個)語法對象。藉助於實例，「元素」意謂一種元素或超過一種元素。本文中對「約」一值或參數之提及包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍包括限定該範圍之數字。
儘管闡述本發明之廣泛範疇之數值範圍及參數為近似值，但儘可能精確地報導特定實例中所闡述之數值。然而，任何數值均固有地含有因其對應測試量測值中發現之標準差所必然引起的某些誤差。另外，本文中所揭示之所有範圍應理解為涵蓋其中所包含之任何及所有子範圍。舉例而言，認為「1至10」之所陳述範圍應包括最小值1與最大值10之間(且包括最小值及最大值)的任何及所有子範圍；亦即所有子範圍以最小值1或更大(例如，1至6.1)開始且以最大值10或更小(例如，5.5至10)結束。
在根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代分組描述本發明之態樣或實施例時，本發明不僅涵蓋作為整體列出之整個群組，而且亦單獨地涵蓋群組之各成員及主要群組之所有可能子組，且亦涵蓋缺少一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除本發明中之群組成員中之任一者中之一或多者。
本文中描述例示性方法及物質，但類似或等效於本文所描述之方法及物質的方法及物質亦可用於實踐或測試本發明。物質、方法及實例僅為說明性的且不欲為限制性的。
定義 除非另外指示，否則以下術語應理解為具有以下含義：
如本文所用，「殘基」係指蛋白質中的位置及其相關胺基酸一致性。
如此項技術中已知，如在本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，可在鏈組合之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。可在聚合後，諸如藉由與標記組分結合進一步修飾聚核苷酸。其他類型之修飾包括例如「蓋(cap)」；用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵聯(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸醯胺酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵聯(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之修飾，含有諸如蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)之側位部分之修飾、具有嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)之修飾、含有螯合物(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)之修飾、含有烷基化劑之修飾、具有修飾鍵(例如，α變旋異構核酸等)之修飾；以及聚核苷酸之未經修飾之形式。此外，一般存在於糖中之任何羥基可例如由膦酸酯基、磷酸酯基置換，由標準保護基保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可結合於固體支撐物。5'及3'端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或去氧核糖，包含例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)；哌喃醣、呋喃醣、景天庚酮糖(sedoheptuloses)、非環類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括(但不限於)其中磷酸經P(O)S (「硫代酸酯」)、P(S)S (「二硫代酸酯」)、(O)NR2 (「醯胺」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲縮醛」)置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵的經取代或未經取代之烷基(1-20 C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳醛基。聚核苷酸中之所有鍵不需要一致。前述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所用，「鹼基」、「核苷酸鹼基」或「核鹼基」為雜環嘧啶或嘌呤化合物，其為所有核酸之標準組分，且包括形成核苷酸腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)之鹼基。核鹼基可進一步經修飾以包括(但不限於)通用鹼基、疏水性鹼基、混雜鹼基、尺寸擴展鹼基及氟化鹼基。如本文所使用，術語「核苷酸」可包括經修飾之核苷酸(諸如核苷酸模擬物、無鹼基殘基(Ab)或替代性置換部分)。
如本文所使用，術語「序列」及「核苷酸序列」意謂使用標準命名法用一連串字母描述的核鹼基或核苷酸的連續或順序。
術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代任何長度之胺基酸鏈。鏈可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，及/或可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋已經天然或由干預修飾之胺基酸鏈；例如二硫鍵形成、醣基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或諸如與標記組分結合的任何其他操作或修飾。該定義亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應理解，多肽可作為單一鏈或相關鏈出現。
「同源」在所有其語法形式及拼寫變體下係指擁有「共同進化源」之兩個蛋白質之間的關係，包括來自相同生物物種之超家族之蛋白質以及來自不同生物物種之同源蛋白質。如由其序列相似性反映，無論關於一致性百分比或根據特定殘基或基元及保存位置之存在，此等蛋白質(及其編碼核酸)具有序列同源性。
然而，在常見用法及本申請案中，在經諸如「高度」之副詞修飾時，術語「同源」可指序列相似性且可或可不關於共同進化源。
在所有其語法形式下，術語「序列相似性」係指可共用或可不共用共同進化源之核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性程度。
關於參考多肽(或核苷酸)序列之「序列一致性百分比(%)」或「與…一致百分比(%)」定義為在比對序列且引入間隙(視需要)以實現最大序列一致性百分比後，與參考多肽(核苷酸)中之胺基酸殘基(或核酸)一致的候選序列中之胺基酸殘基(或核酸)之百分比，且不考慮任何保守性取代作為序列一致性之部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於比對序列之參適當數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。
如本文所用，「宿主細胞」包括個體細胞或細胞培養物，該個體細胞或細胞培養物包含能夠表現本文中所揭示之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者的一或多種聚核苷酸。
如本文所用，「載體」係指包含編碼本文中所揭示之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者或任何組分之一或多種聚核苷酸的重組質體。
如本文所用，「純化」及其語法變化形式係指自含有多肽及一或多種雜質之混合物中移除(無論完全地或部分地)至少一種雜質，其由此改良組合物中之多肽之純度水準(亦即，藉由減小組合物中之雜質之量(ppm))。
如本文所用，「實質上純」係指至少50%純(亦即，無污染物)、更佳至少90%純、更佳至少95%純、又更佳至少98%純且最佳至少99%純的物質。術語「患者」、「個體(subject)」及「個體(individual)」在本文中可互換使用且係指人類或非人類動物。此等術語包含哺乳動物，諸如人類、非人類靈長類動物、實驗室動物、家畜動物(包括牛類、豬、駱駝等)、伴侶動物(例如，犬科動物、貓科動物、其他家養動物等)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。在一些實施例中，個體為至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95歲的人類。
在一個實施例中，個體患有眼睛疾病或處於罹患眼睛疾病之風險下。眼睛疾病包括(不限於)：AMD、視網膜色素變性、桿體-錐體營養不良、萊伯氏先天性黑蒙症(Leber's congenital amaurosis)、尤希爾氏症候群(Usher's syndrome)、巴迪特別鐸症候群(Bardet-Biedl Syndrome)、貝斯特氏疾病(Best disease)、視網膜劈裂症、斯特格氏疾病(Stargardt disease) (常染色體顯性或常染色體隱性)、未經治療視網膜脫落、模式營養不良、錐體-桿體營養不良、色盲、眼部白化病、增強型S錐狀症候群、糖尿病性視網膜病變、年齡相關黃斑變性、早產兒視網膜病、鐮狀細胞性視網膜病、先天性固定夜盲症、青光眼或視網膜靜脈栓塞。在另一實施例中，個體患有青光眼、萊伯氏遺傳性眼神經病變(Leber's hereditary optic neuropathy)、溶酶體貯積病或過氧化體病症或處於罹患青光眼、萊伯氏遺傳性眼神經病變、溶酶體貯積病或過氧化體病症之風險下。在另一實施例中，個體需要光遺傳學療法。在另一實施例中，個體已展示眼睛疾病之臨床症狀。
在一些實施例中，個體患有AMD或處於罹患AMD之風險下。在一些實施例中，AMD為早期AMD；中期AMD；晚期非新生血管性(「乾性」)AMD或晚期新生血管性(「濕性」)AMD。
眼睛疾病之臨床症狀包括(但不限於)下降的周邊視覺、下降的中心(讀取)視力、下降的夜間視力、顏色感知喪失、視敏度降低、降低的感光功能及色素變化。在一個實施例中，個體展示外核層(outer nuclear layer；ONL)之變性。在另一實施例中，個體已經診斷患有眼睛疾病。在另一實施例中，個體尚未展示眼睛疾病之臨床症狀。
如本文所用，術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指作為投與療法(例如，預防劑或治療劑)之結果，個體之疾病或病狀(例如，眼睛疾病)之一或多種症狀之復發或發作的預防或個體之疾病或病狀(例如，眼睛疾病)之一或多種症狀的減輕。舉例而言，在向感染個體投與療法之情形下，「預防(prevent/preventing/prevention)」係指作為投與療法(例如，預防劑或治療劑)或投與療法之組合(例如，預防劑或治療劑之組合)的結果，個體之疾病或病狀(例如，眼睛疾病)之出現或發作的抑制或減輕或個體之疾病或病狀(例如，眼睛疾病)之一或多種症狀之復發、發作或發展的預防。
「治療」病狀或患者係指採取步驟以獲得有益或所需結果，包括臨床結果。關於疾病或病狀(例如，眼睛疾病)，治療係指由投與一或多種療法(包括(但不限於)投與一或多種預防劑或治療劑)引起的感染(例如，眼睛疾病或與其相關之症狀)之進展、嚴重度及/或持續時間的減少或改善或一或多種症狀的改善。
向個體「投與(Administering)」或「投與(administration)」物質、化合物或藥劑(例如，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者)可使用熟習此項技術者已知之各種方法中之一者來進行。舉例而言，可玻璃體內或視網膜下投與化合物或藥劑。在特定實施例中，玻璃體內投與化合物或藥劑。在一些實施例中，投與可為局部的。在其他實施例中，投與可為全身性的。投與亦可執行例如一次、複數次及/或歷經一或多個延長之週期。在一些態樣中，投與包括直接投與(包括自投與)及間接投與(包括開具藥物之處方的操作)兩者。舉例而言，如本文所用，指導患者自我投與藥物或由另一人投與藥物之醫師及/或向患者提供藥物處方之醫師為向患者投與藥物。
如本文所用，術語「眼細胞」係指眼睛內或與眼睛之功能相關聯的任何細胞。術語可指感光細胞中之任何一或多者，包括桿體、錐體及感光性神經節細胞、視網膜色素上皮(RPE)細胞、膠細胞、穆勒細胞(Muller cells)、雙極細胞、水平細胞、無軸突神經細胞。在一個實施例中，眼細胞為雙極細胞。在另一實施例中，眼細胞為水平細胞。在另一實施例中，眼細胞為神經節細胞。在特定實施例中，細胞為RPE細胞。
如本文所用，術語「能夠」意謂所提及組合物(例如，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者)具有執行特定功能之能力，但其不需要在任何特定時刻執行彼特定功能。術語「能夠」涵蓋組合物有效地執行特定功能之個例。
本文所描述之各實施例可單獨地或與本文所描述之任何其他實施例組合使用。
抗 HTRA1 抗體或其抗原結合片段 HTRA1為靶向各種蛋白質，包括諸如纖維結合蛋白之細胞外基質蛋白的絲胺酸蛋白酶。由HTRA1裂解產生之纖維結合蛋白片段能夠進一步誘導滑膜細胞上調MMP1及MMP3產生。有跡象表明HTRA1亦可劣化蛋白多醣，諸如聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖及纖調蛋白。藉由裂解蛋白多醣，HTRA1可釋放提昇胞外空間中之FGF信號之範圍及強度的可溶FGF-葡糖胺聚糖複合物。HTRA1亦藉由裂解IGF結合蛋白來調節類胰島素生長因子(IGF)之可用性。HTRA1胞內降解TSC2，從而引起TSC2下游目標之活化。
HTRA1之過度表現更改布魯赫膜(Bruch's membrane)之完整性，其准許脈絡膜毛細管在諸如濕性年齡相關黃斑變性之病狀中侵入胞外基質。Tong等人, 2010, Mol. Vis., 16:1958-81。HTRA1亦抑制由TGF-β家族成員介導之信號傳導，其可調節多種生理過程，包括發展期間的視網膜血管生成及神經元存活及成熟。先前已測定，發現HTRA1基因之啟動子區中之單核苷酸多形現象(rs11200638)與對各種患者群體中之AMD的敏感性顯著地相關。Tong等人, 2010。
在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段亦結合於HTRA2、HTRA3或HTRA4中之一或多者。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段亦結合於HTRA4。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段不結合於HTRA2、HTRA3及HTRA4或顯示與其的較弱結合。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者能夠抑制任何一或多種HTRA1功能。在一些實施例中，抗HTRA1抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1蛋白質之所有功能。在一些實施例中，抗HTRA1抗體或其抗原結合片段能夠結合於HTRA1蛋白質且抑制HTRA1蛋白質之功能。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者能夠抑制HTRA1蛋白質之蛋白分解活性。在一些實施例中，相較於在不存在HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質(例如，具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的HTRA1蛋白質)之蛋白分解活性，抗HTRA1抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在相同細胞類型中之蛋白分解活性，抗HTRA1抗體或其抗原結合片段能夠抑制細胞中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在另一隻眼睛中之蛋白分解活性，抗HTRA1抗體或其抗原結合片段能夠抑制一隻眼睛中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者能夠抑制HTRA1裂解任何一或多種HTRA1受質之能力。在一些實施例中，HTRA1受質選自由以下組成之群：纖調蛋白、群集素、ADAM9、彈性蛋白、玻連蛋白、α2-巨球蛋白、踝蛋白-1、肌成束蛋白、LTBP-1、EFEMP1、纖蛋白5、tau、RseA及氯化物胞內通道蛋白。在一些實施例中，抗HTRA1抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1裂解補體級聯之調節子(例如，玻連蛋白、纖調蛋白或群集素)之能力。在一些實施例中，抗HTRA1抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1以使得相較於在不存在抗HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下HTRA1裂解HTRA1受質及/或補體級聯之調節子的能力，HTRA1裂解HTRA1受質及/或補體級聯之調節子的能力降低達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
如本文所使用，與術語「免疫球蛋白」(Ig)同義的術語「抗體」(Ab)意謂包含由二硫鍵互連之兩個重(H)鏈(約50-70 kDa)及兩個輕(L)鏈(約25 kDa)之四聚體。存在兩種類型之輕鏈：λ及K。在人體內，其為類似的，但僅一種類型存在於各抗體中。重鏈分類為mu、δ、γ、α或ε，且將抗體之同種型分別地定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE1。通常參見Fundamental Immunology 第7章 (Paul, W.編, 第2版 Raven Press, N.Y. (1989))。各重鏈(本文中有時被稱作H鏈或Hc)由重鏈可變結構域(VH或H可變結構域)及重鏈恆定區(CH)構成。重鏈恆定區包含三個結構域：CH1、CH2及CH3。各輕鏈(本文中有時被稱作L鏈或Lc)由輕鏈可變結構域(VL或L-可變結構域)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區包含由結構域(CL)構成。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括具有約3個或更多個胺基酸之「D」區。VH及VL區可進一步細分成高變區，稱為「互補決定區」(complementarity determining region；CDR)，穿插有較保守之區，稱為「構架區」(framework region；FR)。各VH及VL由三個CDR (本文中H-CDR指示來自重鏈之CDR；且本文中L-CDR指示來自輕鏈之CDR)及四個FR構成，按以下順序自胺基端至羧基端佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含來自本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者的1、2、3、4、5或6個CDR。在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 125-144中之任一者至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 125至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 126至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 127至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 128至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 129至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 130至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 131至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 132至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 133至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 134至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 135至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 136至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 137至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 138至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 139至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 140至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 141至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 142至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 143至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變重鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 144至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 145-164中之任一者至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 145至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 146至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 147至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 148至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 149至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 150至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 151至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 152至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 153至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 154至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 155至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 156至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 157至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 158至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 159至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 160至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 161至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 162至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 163至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自可變輕鏈胺基酸序列之1、2或3個CDR，該可變輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 164至少75%、80%、85%、90%、95%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 143之序列的1、2或3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 143之序列的3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 144之序列的1、2或3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 144之序列的3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 163之序列的1、2或3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 163之序列的3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 164之序列的1、2或3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 164之序列的3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 143之序列的1、2或3個CDR及來自SEQ ID NO: 163之序列的1、2或3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 143之序列的3個CDR及來自SEQ ID NO: 163之序列的3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 144之序列的1、2或3個CDR及來自SEQ ID NO: 164之序列的1、2或3個CDR。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含來自SEQ ID NO: 144之序列的3個CDR及來自SEQ ID NO: 164之序列的3個CDR。在一些實施例中，將胺基酸分配至各結構域係根據Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest之定義(National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987及1991))。在一些實施例中，將胺基酸分配至各結構域係根據Chothia & Lesk, J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)；Chothia等人, Nature 342:878-883 (1989)。在一些實施例中，將胺基酸分配至各結構域係根據MacCallum。在一些實施例中，將胺基酸分配至各結構域係根據AbM。在一些實施例中，將胺基酸分配至各結構域係根據IMGT。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含可變重鏈胺基酸序列，該可變重鏈胺基酸序列與SEQ ID NO: 125-144中之任一者至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 125至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 126至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 127至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 128至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 129至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 130至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 131至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 132至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 133至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 134至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 135至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 136至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 137至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 138至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 139至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 140至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 141至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 142至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 143至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 144至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含與SEQ ID NO: 145-164中之任一者至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的可變輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 145至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 146至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 147至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 148至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 149至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 150至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 151至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 152至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 153至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 154至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 155至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 156至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 157至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 158至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 159至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 160至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 161至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 162至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 163至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 164至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 143至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的可變重鏈胺基酸序列，且進一步包含與SEQ ID NO: 163至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的可變輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO: 144至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的可變重鏈胺基酸序列，且進一步包含與SEQ ID NO: 164至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的可變輕鏈胺基酸序列。
如本文所用，術語「抗原結合片段」係指保留特異性結合於抗原之能力的抗體之一或多個片段。已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。涵蓋於術語「抗原結合片段」內的結合片段之非限制性實例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，其為包含由鉸鏈區處之二硫橋鍵連結之兩個Fab片段的二價片段；(iii) Fab'片段，其係藉由裂解F(ab')2之鉸鏈區之二硫鍵獲得；(iv) Fd片段，其由VH及CH1結構域組成；(v) Fv片段，其由抗體之單臂之VL及VH結構域組成；(vi) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341 :544-546)，其由VH結構域組成；(vii)經分離互補決定區(CDR)；以及(viii) dsFv，其由藉由二硫鍵穩定之VH::VL異質二聚體組成。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH由單獨的基因編碼，但其可使用重組方法藉由使其能夠以單一蛋白鏈形式製造的合成連接子接合，其中VL及VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人 Science 242:423-426 (1988)及Huston等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。包含VN及/或VL之抗原結合分子亦在本發明之範疇內。在VH之情況下，分子亦可包含CH1、鉸鏈、CH2或CH3區中之一或多者。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL結構域表現於單一多肽鏈上，但使用過短以不允許在相同鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，由此迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如，Holliger等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)；Poljak等人 Structure 2:1121-1123 (1994))。
如本文所用，術語「抗原結合片段」亦包括例如單結構域抗體，諸如駱駝化單結構域抗體。參見例如Muyldermans等人 (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235；Nuttall等人 (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263；Reichmann等人 (1999) J Immunol Meth 231:25-38；PCT申請公開案第WO 94/04678號及第WO 94/25591號；以及美國專利第6,005,079號，其均以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本發明提供包含兩個VH結構域之單結構域抗體，該等VH結構域具有修飾以便形成單結構域抗體。
如本文所用，術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指免疫球蛋白或抗體所特異性結合的抗原(例如，HTRA1)上之位點。抗原決定基可由鄰接胺基酸或藉由蛋白質之三級摺疊而並列的非鄰接胺基酸兩者形成。由相鄰胺基酸形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑後保留，而藉由三級摺疊形成之抗原決定基在用變性溶劑處理後通常消失。抗原決定基通常以獨特的空間構形包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。用於測定給定抗體結合何種抗原決定基的方法(亦即抗原決定基定位)為此項技術中所熟知且包括例如免疫墨點法及免疫沈澱分析，其中測試針對與給定抗HTRA1抗體之反應性來測試來自HTRA1之重疊或鄰接肽。測定抗原決定基之空間構形之方法包括此項技術中之技術及本文所描述之彼等技術，例如x射線結晶及2維核磁共振(參見例如, Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, 第66卷, G. E. Morris編 (1996))。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者結合於人類HTRA1中之抗原決定基。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合於SEQ ID NO: 121之胺基酸序列中之抗原決定基或其功能片段。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含圖2中所指示的CDR胺基酸序列中之任一者或其任何組合。在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含SEQ ID NO: 1-120之CDR胺基酸序列中之任一者或其任何組合。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為以下集合中之任一者的CDR集合：SEQ ID NO: 1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72、73-78、79-84、85-90、91-96、97-102、103-108、109-114或115-120。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 1-6之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 7-12之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 19-24之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 31-36之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 37-42之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 61-66之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 73-78之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 103-108之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 109-114之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 115-120之CDR。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段包含前述CDR胺基酸序列中之任一者中之任一者或其組合，但具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸取代。在一些實施例中，該等取代為保守性取代。在較佳實施例中，相較於缺乏取代之抗體或抗原結合片段，取代增加抗體或抗原結合片段對HTRA1抗原決定基之結合親和力，或取代引起結合親和力減小不超過5%、10%、20%、30%、40%或50%。以下八個組各自含有作為彼此之保守取代的胺基酸。此等組例示性作為熟習此項技術者已知之其他保守性取代。 1)     丙胺酸(A)、甘胺酸(G)； 2)     天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)； 3)     天冬醯胺(N)，麩醯胺酸(Q)； 4)     精胺酸(R)、離胺酸(K)； 5)     異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)； 6)     苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)； 7)     絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及 8)     半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)
舉例而言，當提及特定殘基處之天冬胺酸時，亦涵蓋殘基處之保守性取代，例如麩胺酸。舉例而言，亦涵蓋用甘胺酸取代脯胺酸的非保守性取代。在一些實施例中，本文中所揭示之CDR中之任一者在本文中所揭示之CDR序列中之任一者之N端及/或C端處缺乏一個或兩個但不超過三個胺基酸。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含本文中所揭示之重鏈CDR中之任一者。在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者包含本文中所揭示之重鏈CDR1、CDR2及CDR3之組合中之任一者。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含三個重鏈CDR之以下集合中之任一者：SEQ ID NO: 1-3、7-9、13-15、19-21、25-27、31-33、37-39、43-45、49-51、55-57、61-63、67-69、73-75、79-81、85-87、91-93、97-99、103-105、109-111或115-117，或包含一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)保守性取代之前述CDR組合之中任一者。在一特定實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 109-111之重鏈CDR。在一特定實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 109-111之重鏈CDR。在一特定實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 109-111之重鏈CDR，該等重鏈CDR包含一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)保守性取代。在另一實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 115-117之重鏈CDR。在一特定實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 115-117之重鏈CDR，該等重鏈CDR包含一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)保守性取代。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含共用輕鏈。
在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段為全長抗體。在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體為人類抗體。在一些實施例中，抗體為人類化抗體。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為嵌合抗體。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為人類化抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段選自由以下組成之群：Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dAb或scFv。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者能夠結合於HTRA1且抑制HTRA1之一或多個功能。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合於以下HTRA1結構域中之一或多者：類胰島素生長因子結合結構域、kazal結構域、類胰蛋白酶肽酶結構域及/或PDZ結構域。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或其抗原結合片段中之任一者以以下結合親和力(KD)結合於人類HTRA1蛋白質：至少50 nM、至少25 nM、至少10 nM、至少7 nM、至少5 nM、至少3 nM、至少2 nM、至少1 nM、至少500 pM、至少100 pM、至少50 pM或至少10 pM。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段能夠結合於HTRA1，使得抑制一或多個HTRA1功能。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段能夠結合於HTRA1，使得降低HTRA1裂解任何一或多種HTRA1受質之能力。在一些實施例中，HTRA1受質選自由以下組成之群：纖調蛋白、彈性蛋白、群集素、LTBP-1、EFEMP1、ADAM9、玻連蛋白、α2-巨球蛋白、踝蛋白-1、肌成束蛋白、纖蛋白5、tau、RseA及氯化物胞內通道蛋白質。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合於HTRA1，使得降低HTRA1裂解補體級聯之調節子(例如，玻連蛋白、纖調蛋白或群集素)的能力。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合於HTRA1，使得相較於在不存在該抗體或其抗原結合片段之情況下HTRA1裂解HTRA1受質及/或補體級聯之調節子的能力，該HTRA1裂解HTRA1受質及/或補體級聯之調節子的能力降低達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段能夠抑制HTRA1蛋白質之蛋白分解活性。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質之蛋白分解活性，該抗體或抗原結合片段能夠抑制HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在相同細胞類型中之蛋白分解活性，該抗體或抗原結合片段能夠抑制細胞中之HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在一隻眼睛中之蛋白分解活性，該抗體或抗原結合片段能夠抑制一隻眼睛中之HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者能夠抑制HTRA1三聚。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質之三聚，該抗體或抗原結合片段能夠抑制HTRA1三聚達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者能夠結合人類HTRA1。在一些實施例中，該抗體或抗原結合片段能夠結合於非人類物種HTRA1。在一些實施例中，非人類物種HTRA1為小鼠、大鼠、家兔、母牛、猴(例如，食蟹獼猴)或猿(例如黑猩猩) HTRA1蛋白質。
可使用常規技術來鑑別識別與已知抗體相同或重疊抗原決定基或競爭結合已知抗體的抗體。此等技術包括例如免疫分析，其展示一種抗體阻斷另一抗體結合於目標抗原的能力，亦即競爭性結合分析。在受測試之免疫球蛋白抑制參考抗體特異性結合於諸如HTRA1之共同抗原的分析中來測定競爭性結合。已知許多類型之競爭性結合分析，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見Stahli等人, Methods in Enzymology 9:242 (1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見Kirkland等人, J. Immunol. 137:3614 (1986))；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988))；使用I-125標記之固相直接標記RIA (參見Morel等人, Mol. Immunol. 25(1):7 (1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Cheung等人, Virology 176:546 (1990))；及直接標記RIA (Moldenhauer等人, Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))。典型地，此分析涉及使用結合於帶有未經標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白中之任一者之固體表面或細胞的經純化抗原。競爭性抑制係藉由測定在存在測試免疫球蛋白之情況下結合於固體表面或細胞的標記之量來量測。測試免疫球蛋白通常過量存在。通常，當競爭抗體過量存在時，其將抑制參考抗體特異性結合於共同抗原達至少約50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更大。
其他技術包括例如抗原決定基定位法，諸如：抗原:抗體複合物之晶體之x射線分析，其提供抗原決定基之原子解析度；及質譜分析組合氫/氘(H/D)交換，其研究抗原:抗體相互作用之構形及動力學。其他方法監測抗體對抗原片段或抗原之突變變異體之結合，其中因抗原序列內之胺基酸殘基進行修飾所致的結合損失通常視為抗原決定基組分之指示。另外，亦可使用抗原決定基定位之計算組合方法。此等方法依賴於所關注之抗體親和分離來自組合噬菌體呈現肽文庫之特定短肽的能力。接著，將肽經視為與用於篩選肽庫之抗體對應的抗原決定基之定義之榜樣。對於抗原決定基定位而言，亦已研發出已展示可對不連續構形抗原決定基進行定位的計算算法。
本發明亦提供用於產生本文所描述之抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者的方法。在一些實施例中，用於製備本文所描述之抗體的方法可包括藉由適合免疫原(例如，具有SEQ ID NO: 121之胺基酸序列的HTRA1多肽或其片段)來免疫個體(例如，非人類哺乳動物)。本文中闡述用於產生本文所描述之抗體中之任一者的適合免疫原。舉例而言，為產生結合於HTRA1之抗體，熟習此項技術者可使適合個體(例如，非人類哺乳動物，諸如大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、狗、貓、豬、山羊、馬或非人類靈長類)免疫接種有人類HTRA1。
適合個體(例如，非人類哺乳動物)可藉由適當抗原免疫，隨後進行多次加強免疫，足以誘使哺乳動物產生抗體。免疫原可與佐劑一起投與至個體(例如，非人類哺乳動物)。用於在個體中產生抗體之佐劑包括(但不限於)蛋白質佐劑；細菌佐劑，例如完整細菌(BCG、棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)或明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota))及細菌組分，包括細胞壁骨架、海藻糖二黴菌酸酯、單磷醯基脂質A、結核桿菌(tubercle bacillus)之甲醇可萃取殘餘物(methanol extractable residue；MER)、完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)；病毒佐劑；化學佐劑，例如氫氧化鋁，及碘乙酸鹽及膽固醇基半丁二酸鹽。可用於誘導免疫反應之方法中的其他佐劑包括例如霍亂毒素及副痘病毒蛋白質。參見例如Bieg等人 (1999) Autoimmunity 31(1):15-24。亦參見，例如Lodmell等人 (2000) Vaccine 18:1059-1066；Johnson等人 (1999) J Med Chem 42:4640-4649；Baldridge等人 (1999) Methods 19:103-107；及Gupta等人 (1995) Vaccine 13(14): 1263-1276。
在一些實施例中，方法包括製備分泌結合於免疫原之單株抗體的融合瘤細胞系。舉例而言，如上所描述，藉由HTRA1多肽使適合哺乳動物(諸如實驗室小鼠)免疫。經免疫哺乳動物之產抗體細胞(例如，脾臟之B細胞)可在免疫原的至少一次加強免疫後二至四天分離，且接著在與適合骨髓瘤細胞株之細胞融合之前在培養物中短暫生長。細胞可在存在融合啟動子(諸如，牛痘病毒或聚乙二醇)之情況下融合。將在融合中獲得之雜交細胞進行選殖，且選擇分泌所需抗體之細胞純系。舉例而言，用適合免疫原免疫的Balb/c小鼠之脾臟細胞可與骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag 14之細胞融合。融合後，細胞在適合培養基中擴增，該培養基以規律時間間隔補充有選擇培養基(例如，HAT培養基)，以便防止正常骨髓瘤細胞過度生長所需融合瘤細胞。接著篩選所獲得雜交細胞以分泌所需抗體，例如結合於如本文所描述之人類HTRA1的抗體。
在一些實施例中，熟習此項技術者可鑑別來自非免疫偏差文庫之抗HTRA1抗體，如例如美國專利第6,300,064號(屬於Knappik等人；Morphosys AG)及Schoonbroodt等人 (2005) Nucleic Acids Res 33(9):e81中所描述。
在一些實施例中，本文所描述之方法可能涉及例如以下技術或用於與以下技術結合：噬菌體呈現技術、細菌呈現、酵母表面呈現、真核病毒呈現、哺乳動物細胞呈現及不含細胞(例如，核糖體呈現)抗體篩選技術(參見例如, Etz等人 (2001) J Bacteriol 183:6924-6935；Cornelis (2000) Curr Opin Biotechnol 11:450-454；Klemm等人 (2000) Microbiology 146:3025-3032；Kieke等人 (1997) Protein Eng 10:1303-1310；Yeung等人 (2002) BiotechnolProg 18:212-220；Boder等人 (2000) Methods Enzymology328:430-444；Grabherr等人 (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192；Michael等人 (1995) Gene Ther 2:660-668；Pereboev等人 (2001) J Virol 75:7107-7113；Schaffitzel等人 (1999) J Immunol Methods 231:119-135；及Hanes等人 (2000) Nat Biotechnol 18:1287-1292)。
使用各種噬菌體呈現方法鑑別抗體之方法為此項技術中已知的。在噬菌體呈現方法中，功能抗體結構域呈現於攜帶編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體顆粒之表面上。此等噬菌體可用於呈現由譜系或組合抗體文庫(例如人類或鼠類)表現的抗體之抗原結合結構域，諸如Fab、Fv或二硫鍵穩定之Fv抗體片段。用於此等方法中之噬菌體通常為絲狀噬菌體，諸如fd及M13。抗原結合結構域表現為與噬菌體包衣蛋白質pIII、pVIII或pIX中之任一者重組融合的蛋白質。參見例如，Shi等人 (2010) JMB 397:385-396。可用於製造本文所描述之免疫球蛋白或其片段的噬菌體呈現方法之實例包括Brinkman等人 (1995) J Immunol Methods 182:41-50；Ames等人 (1995) J Immunol Methods 184:177-186；Kettleborough等人 (1994) Eur J Immunol 24:952-958；Persic等人 (1997) Gene 187:9-18；Burton等人 (1994) Advances in Immunology 57:191-280；及PCT公開案第WO 90/02809號、第WO 91/10737號、第WO 92/01047號、第WO 92/18619號、第WO 93/11236號、第WO 95/15982號及第WO 95/20401號中所揭示之彼等方法。適合方法亦描述於例如美國專利第5,698,426號；第5,223,409號；第5,403,484號；第5,580,717號；第5,427,908號；第5,750,753號；第5,821,047號；第5,571,698號；第5,427,908號；第5,516,637號；第5,780,225號；第5,658,727號；第5,733,743號及第5,969,108號中。
在一些實施例中，可使用自經免疫之哺乳動物之B細胞收集的mRNA產生噬菌體呈現抗體文庫。舉例而言，可自用如上所描述之HTRA1多肽免疫的小鼠中分離包含B細胞之脾細胞樣本。mRNA可自細胞中分離且使用標準分子生物學技術轉化為cDNA。參見例如, Sambrook等人 (1989) 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版,」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Harlow及Lane (1988), 同上；Benny K. C. Lo (2004), 同上；及Borrebaek (1995), 同上。編碼免疫球蛋白多肽重鏈及輕鏈多肽可變區之cDNA用來構築噬菌體呈現文庫。產生此文庫之方法描述於例如Merz等人, (1995) J Neurosci Methods 62(1-2):213-9；Di Niro等人 (2005) Biochem J 388(Pt 3):889-894；及Engberg等人, (1995) Methods Mol Biol 51:355-376中。
在一些實施例中，可採用選擇及篩選之組合來鑑別來自例如融合瘤衍生之抗體群或噬菌體呈現抗體文庫的所關注抗體。適合方法為此項技術中已知的且描述於例如Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 15:62-70；Brinkman等人 (1995), 同上；Ames等人 (1995), 同上；Kettleborough等人 (1994), 同上；Persic等人 (1997), 同上；及Burton等人 (1994), 同上中。舉例而言，使用標準分子生物學技術產生複數個噬菌粒載體且接著將其引入細菌群(例如，大腸桿菌(E. coli))，各噬菌粒載體編碼噬菌體包衣蛋白(例如，M13噬菌體之pIII、pVIII或pIX)及不同抗原組合區之融合蛋白。在一些實施例中，噬菌體在細菌中之表現可能需要使用輔助噬菌體。在一些實施例中，不需要輔助噬菌體(參見例如, Chasteen等人, (2006) Nucleic Acids Res 34(21):e145)。回收由細菌產生之噬菌體，且接著使其與例如結合於固體支撐物(固定化)之目標抗原接觸。亦可使噬菌體與溶液中之抗原接觸，且接著將複合物結合於固體支撐物。
使用上述方法篩選的抗體之子群可使用此項技術中已知的任何基於免疫學或生物化學之方法來表徵其對特定抗原(例如，人類HTRA1)之特異性及結合親和力。舉例而言，抗體與HTRA1之特異性結合可例如使用基於免疫學或生物化學之方法來測定，諸如(但不限於)如上所描述之ELISA分析、SPR分析、免疫沈澱分析、親和層析及平衡透析。可用於分析抗體之免疫特異性結合及交叉反應性的免疫分析包括(但不限於)使用諸如西方墨點之技術的競爭性及非競爭性分析系統、RIA、酶聯免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay；ELISA)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射測定分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。此等分析為常規的且為此項技術中熟知的。
在所選CDR胺基酸序列為短序列(例如，長度少於10-15個胺基酸)之實施例中，編碼CDR之核酸可如Shiraishi等人. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130及美國專利第6,995,259號中所描述化學上合成。對於編碼受體抗體之給定核酸序列，可使用標準分子生物學技術用化學合成之核酸置換編碼CDR之核酸序列區。化學合成之核酸的5'及3'端可經合成以包含黏性末端限制酶位點，用於將核酸選殖至編碼供體抗體之可變區的核酸中。
在一些實施例中，本文所描述之抗HTRA1抗體包含更改的重鏈恆定區，其相對於其對應未更改恆定區而具有降低的(或無)效應功能。涉及抗HTRA1抗體之恆定區的效應功能可藉由更改恆定區或Fc區之特性來調節。更改的效應功能包括例如以下活性中之一或多者中的調節：抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity；ADCC)、補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)、細胞凋亡、與一或多種Fc受體之結合及促炎性反應。調節係指相較於未更改形式之恆定區之活性，含有更改的恆定區的個體抗體所展現的效應功能活性的增加、減少或消除。在特定實施例中，調節包括消除或完全不存在活性之情形。
具有更改的FcR結合親和力及/或ADCC活性及/或更改的CDC活性的更改的恆定區為相較於未更改形式之恆定區具有增強或減弱的FcR結合活性及/或ADCC活性及/或CDC活性的多肽。顯示與FcR之增強的結合的更改的恆定區以比未更改的多肽更大的親和力結合至少一種FcR。顯示與FcR之減少的結合的更改的恆定區以比未更改形式之恆定區更低的親和力結合至少一種FcR。相較於天然序列免疫球蛋白恆定區或Fc區與FcR之結合水準，顯示與FcR之減少的結合的此等變體可具有與FcR很少或不明顯的結合，例如與FcR之之0至50% (例如，少於50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%)結合。類似地，相較於未更改的恆定區，呈現經調節之ADCC及/或CDC活性的更改的恆定區可展現增強或減少的ADCC及/或CDC活性。舉例而言，在一些實施例中，抗HTRA1抗體包含更改的恆定區，該更改的恆定區可展現大致0至50% (例如，少於50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%)的未更改形式之恆定區之ADCC及/或CDC活性。包含顯示降低的ADCC及/或CDC之更改的恆定區的本文所描述之抗HTRA1抗體可展現降低的ADCC及/或CDC活性或無ADCC及/或CDC活性。
在一些實施例中，本文所描述之抗HTRA1抗體或抗原結合片段展現降低的效應功能或無效應功能。在一些實施例中，抗HTRA1抗體包含雜交恆定區或其部分，諸如G2/G4雜交恆定區(參見例如, Burton等人 (1992) Adv Immun 51:1-18；Canfield等人 (1991) J Exp Med 173:1483-1491；及Mueller等人 (1997) Mol Immunol 34(6):441-452)。參見上文。
在一些實施例中，抗HTRA1抗體或抗原結合片段可含有展現增強或降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)之更改的恆定區。經調節之CDC活性可藉由在抗體之Fc區中引入一或多個胺基酸取代、插入或缺失來達成。參見例如美國專利第6,194,551號。替代地或另外，可在Fc區中引入半胱胺酸殘基，由此允許在此區中形成鏈間二硫鍵。因此產生之均二聚抗體可具有改良的或降低的內化能力及/或增加的或減少的補體介導之細胞殺滅。參見例如, Caron等人 (1992) J Exp Med 176:1191-1195及Shopes (1992) Immunol 148:2918-2922；PCT公開案第WO 99/51642號及第WO 94/29351號；Duncan及Winter (1988) Nature 322:738-40；及美國專利第5,648,260號及第5,624,821號。
本文所描述之抗體或其抗原結合片段可使用分子生物學及蛋白質化學技術中已知的多種技術產生。舉例而言，可將編碼抗體之重鏈及輕鏈多肽中之一或兩者的核酸插入含有轉錄及轉譯調節序列之表現載體中，該等轉錄及轉譯調節序列包括例如啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始及終止序列、轉譯起始及終止序列、轉錄終止子信號、聚腺苷酸化信號及強化子或活化子序列。調節序列包括啟動子及轉錄起始及終止序列。另外，表現載體可包括超過一種複製系統，使得其可在兩種不同生物體中維持，例如在哺乳動物或昆蟲細胞中維持以用於表現且在原核生物宿主中維持以用於選殖及擴增。
數種可能的載體系統可用於在哺乳動物細胞中自核酸表現選殖的重鏈及輕鏈多肽。一類載體依賴於將所需基因序列整合至宿主細胞基因組中。具有穩定整合之DNA的細胞可藉由同時引入諸如大腸桿菌gpt (Mulligan及Berg. (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072)或Tn5 neo (Southern及Berg. (1982) Mol Appl Genet 1:327)之抗藥性基因來選擇。可選標記物基因可連接至待表現之DNA基因序列，或藉由共轉染引入同一細胞中(Wigler等人, (1979) Cell 16:77)。第二類載體利用DNA元件，其賦予染色體外質體自主複製能力。此等載體可來源於動物病毒，諸如牛乳頭狀瘤病毒(Sarver等人, (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147)、細胞巨大病毒、多瘤病毒(Deans等人, (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292)或SV40病毒(Lusky及Botchan, (1981) Nature 293:79)。
可以適用於核酸後續表現之方式將表現載體引入細胞中。引入方法主要由目標細胞類型決定，如下文論述。例示性方法包括CaPO4 沈澱、脂質體融合、陽離子脂質體、電穿孔、病毒感染、聚葡萄糖介導之轉染、凝聚胺介導之轉染、原生質體融合及直接顯微注射。
用於表現抗體或其抗原結合片段之適合宿主細胞包括酵母、細菌、昆蟲、植物及哺乳動物細胞。備受關注的為細菌，諸如大腸桿菌；真菌，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及甲醇酵母(Pichia pastoris)；昆蟲細胞，諸如SF9；哺乳動物細胞株(例如，人類細胞株)；以及原代細胞株。
在一些實施例中，抗體或其片段可在轉殖基因動物(例如，轉殖基因哺乳動物)中表現且自其純化。舉例而言，抗體可在轉殖基因非人類哺乳動物(例如，嚙齒動物)中產生且自乳汁分離，例如Houdebine, (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629；van Kuik- Romeijn等人, (2000) Transgenic Res 9(2):155-159；及Pollock等人, (1999) J Immunol Methods 231(1-2):147-157。
可藉由在條件下培養用含有編碼抗體或片段之核酸的表現載體轉化之宿主細胞且持續足以允許表現蛋白質之一定時間而自細胞產生抗體及其片段。用於蛋白質表現之此等條件將隨表現載體及宿主細胞之選擇而變化，且將容易地由熟習此項技術者經由常規實驗來確定。舉例而言，大腸桿菌中表現之抗體可自包涵體再摺疊(參見例如, Hou等人(1998) Cytokine 10:319-30)。細菌表現系統及其使用方法為此項技術中所熟知(參見Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons及Molecular Cloning--A Laboratory Manual --第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001))。密碼子、適合表現載體及適合宿主細胞之選擇將根據多種因素而改變，且容易根據需要最佳化。本文所描述之抗體(或其片段)可表現於哺乳動物細胞或其他表現系統中，包括(但不限於)酵母、桿狀病毒及活體外表現系統(參見例如, Kaszubska等人 (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220)。
表現之後，可分離抗體及其片段。抗體或其片段可視何種其他組分存在於樣本中而定以熟習此項技術者已知之多種方法來分離或純化。標準純化方法包括電泳技術、分子技術、免疫學技術及層析技術，包括離子交換層析、疏水性層析、親和層析及逆相HPLC層析。舉例而言，可使用標準抗抗體管柱(例如，蛋白質A或蛋白質G管柱)來純化抗體。與蛋白質濃度相結合之超濾及透濾技術亦為適用的。參見例如，Scopes (1994) 「Protein Purification,第3版」 Springer-Verlag, New York City, New York。所需純化程度將視所需用途而變化。在一些情況下，將不需要純化所表現之抗體或其片段。
用於測定純化抗體或其片段之產率或純度的方法為此項技術中已知的且包括例如布拉福分析(Bradford assay)、UV光譜分析、縮二脲蛋白質分析(Biuret protein assay)、洛瑞蛋白質分析(Lowry protein assay)、醯胺黑蛋白質分析、高壓液相層析(high pressure liquid chromatography；HPLC)、質譜分析(mass spectrometry；MS)及凝膠電泳方法(例如，使用蛋白質染色劑，諸如庫馬斯藍(Coomassie Blue)或膠態銀染色劑)。
抗體或其抗原結合片段可在其表現及純化之後加以修飾。修飾可為共價或非共價修飾。可藉由例如使多肽之靶向胺基酸殘基與有機衍生劑反應來將此等修飾引入抗體或片段中，該有機衍生劑能夠與所選側鏈或末端殘基反應。可使用多種準則中之任一者來選擇適合修飾位點，包括例如抗體或片段之結構分析或胺基酸序列分析。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可結合於異源部分。異源部分可為例如異源多肽、治療劑(例如，毒素或藥物)，或可偵測標記，諸如(但不限於)放射性標記、酶標記、螢光標記、重金屬標記、發光標記或親和標籤，諸如生物素或抗生蛋白鏈菌素。適合異源多肽包括例如抗原標籤(例如，FLAG (DYKDDDDK (SEQ ID NO: 122))、聚組胺酸(6-His；HHHHHH (SEQ ID NO: 123))、血球凝集素(HA；YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 124))、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP)，以用於純化抗體或片段。異源多肽亦包括適用作診斷或可偵測標記物之多肽(例如，酶)，例如螢光素酶、螢光蛋白(例如，綠色螢光蛋白(green fluorescent protein；GFP))或氯黴素乙醯基轉移酶(chloramphenicol acetyl transferase；CAT)。適合放射性標記包括例如32P、33P、14C、125I、131I 35S及3H。適合螢光標記包括(但不限於)螢光素、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、綠色螢光蛋白(GFP)、DyLight™ 488、藻紅素(PE)、碘化丙錠(PI)、PerCP、PE-Alexa Fluor® 700、Cy5、別藻藍蛋白及Cy7。發光標記包括例如各種發光鑭系元素(例如，銪或鋱)螯合物中之任一者。舉例而言，適合銪螯合物包括二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)或四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)之銪螯合物。酶標記包括例如鹼性磷酸酶、CAT、螢光素酶及辣根過氧化酶。
可使用許多已知化學交聯劑中之任一者來交聯兩種蛋白質(例如，抗體及異源部分)。此等交聯劑之實例為經由包括「受阻」二硫鍵之鍵聯連接兩個胺基酸殘基的彼等交聯劑。在此等鍵聯中，藉由例如還原型麩胱甘肽或酶二硫鍵還原酶之作用來保護(藉由阻礙二硫鍵之任一側上之基團)交聯單元內之二硫鍵以免於還原。一種適合試劑4-丁二醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α (2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)利用蛋白質中之一者上之末端離胺酸及另一蛋白質上之末端半胱胺酸在兩個蛋白質之間形成此鍵聯。亦可使用藉由每一蛋白質上之不同偶合部分交聯的異雙官能試劑。其他適用的交聯劑包括(但不限於)連接兩個胺基(例如，N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基丁二醯亞胺)、兩個硫氫基(例如，1,4-雙-馬來醯亞胺丁烷)、胺基及硫氫基(例如，間-馬來醯亞胺苄醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯)、胺基及羧基(例如，4-[對-疊氮基柳基醯胺基]丁胺)及胺基以及存在於精胺酸之側鏈中之鈲基(例如，對-疊氮苯基乙二醛單水合物)。
在一些實施例中，放射性標記可直接結合於抗體之胺基酸主鏈。替代地，放射性標記可經包括作為較大分子(例如，間[125 I]碘苯基-N-羥基丁二醯亞胺([125 I]mIPNHS)中之125 I，其結合於游離胺基以形成相關蛋白質之間碘苯基(mIP)衍生物(參見例如, Rogers等人 (1997) J Nucl Med 38:1221-1229))或螯合物(例如，DOTA或DTPA) (該螯合物繼而結合於蛋白質主鏈)之一部分。將放射性標記或含有其之較大分子/螯合物結合至本文所描述之抗體或抗原結合片段結合之方法為此項技術中已知的。此等方法涉及在促進放射性標記或螯合物與蛋白質結合之條件(例如，pH、鹽濃度及/或溫度)下將蛋白質與放射性標記一起培育(參見例如，美國專利第6,001,329號)。
用於使螢光標記(有時被稱作「螢光團」)結合於蛋白質(例如，抗體)之方法為蛋白質化學技術中已知的。舉例而言，螢光團可使用與螢光團連接之丁二醯亞胺基(NHS)酯或四氟苯基(TFP)酯部分與蛋白質之游離胺基(例如，離胺酸)或硫氫基(例如，半胱胺酸)結合。在一些實施例中，螢光團可結合於異雙官能交聯劑部分，諸如磺酸基-SMCC。適合結合方法涉及在促進螢光團與蛋白質結合之條件下將抗體蛋白質或其片段與螢光團一起培育。參見例如，Welch and Redvanly (2003) 「Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,」 John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)。
在一些實施例中，抗體或片段可例如用改良抗體在循環中(例如，在血液、血清或其他組織中)之穩定性及/或保持性的部分來修飾。舉例而言，抗體或片段可如Lee等人, (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8；Kinstler等人, (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485；及Roberts等人, (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476中所描述經聚乙二醇化或經羥乙基澱粉化(Fresenius Kabi, Germany；參見例如， Pavisić等人, (2010) Int J Pharm 387(1-2):110-119)。穩定性部分可將抗體(或片段)之穩定性或保持率提高至少約1.5 (例如，至少約2、5、10、15、20、25、30、40或50或更多)倍。
在一些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段可經醣基化。在一些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段可經歷酶處理或化學處理，或由細胞產生，使得抗體或片段之醣基化減輕或不存在。用於產生醣基化減輕之抗體的方法為此項技術中已知的且描述於例如美國專利第6,933,368號中；Wright等人 (1991) EMBO J 10(10):2717-2723；及Co等人 (1993) Mol Immunol 30:1361。
本發明亦提供編碼抗HTRA1抗體或其抗原結合片段中之任一者的一或多個聚核苷酸。在一些實施例中，本發明提供編碼本文中所揭示之聚核苷酸中之任何一或多者的一或多個載體。在一些實施例中，該一或多個載體進一步包含可促進一或多個聚核苷酸之表現的一或多個啟動子。在一些實施例中，本發明提供一種能夠表現本文中所揭示之聚核苷酸中之任何一或多者的宿主細胞。
在一些實施例中，本發明提供包含本文中所揭示之聚核苷酸中之任一者的載體，該等聚核苷酸編碼本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。在一些實施例中，本發明提供一種向有需要之個體投與本文中所揭示之載體中之任一者的方法。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為逆轉錄病毒載體、慢病毒載體或桿狀病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺病毒載體。在特定實施例中，病毒載體為AAV載體。各種rAAV載體可用於將聚核苷酸遞送至眼睛且導引其表現。已知超過30種來自人類及非人類靈長類動物之AAV的天然存在之血清型。存在AAV衣殼之多種天然變體，且本發明之rAAV載體可基於具有特定適合於眼細胞之特性的AAV進行設計。
本發明之重組AAV載體可由各種腺相關病毒產生。舉例而言，來自任何AAV血清型之ITR預期具有關於複製、整合、切除及轉錄機制之類似結構及功能。AAV血清型之實例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12。在一些實施例中，rAAV載體由血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5或AAV8產生。已知此等血清型靶向感光細胞或視網膜色素上皮。在特定實施例中，rAAV載體由血清型AAV2產生。在某些實施例中，AAV血清型包括AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。亦將理解，rAAV載體可為選自血清型AAV1至AAV12之兩種或更多種血清型之嵌合體。可藉由將一種血清型之重組基因組封裝至來源於另一AAV血清型之衣殼中來更改載體之趨向性。在一些實施例中，rAAV病毒之ITR可基於AAV1-12中之任一者之ITR且可與選自以下中之任一者的AAV衣殼合併：AAV1-12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9或其他經修飾血清型。在某些實施例中，任何AAV衣殼血清型可與本發明之載體一起使用。AAV血清型之實例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。在某些實施例中，AAV衣殼血清型為AAV2。
用於裝配至載體中之所需AAV片段可包括cap蛋白質，包括vp1、vp2、vp3及高變區；rep蛋白質，包括rep 78、rep 68、rep 52及rep 40；及編碼此等蛋白質之序列。此等片段可容易地用於各種載體系統及宿主細胞中。此等片段可單獨使用，與其他AAV血清型序列或片段組合使用或與來自其他AAV或非AAV病毒序列之元素組合使用。如本文所用，人造AAV血清型包括(但不限於)具有非天然存在之衣殼蛋白之AAV。可利用任何適合之技術使用所選AAV序列(例如，vpl衣殼蛋白之片段)以及可自不同所選AAV血清型、相同AAV血清型之非連續部分、非AAV病毒源或非病毒源獲得的異源序列來產生此人造衣殼。人造AAV血清型可為(而不限於)假型AAV、嵌合AAV衣殼、重組AAV衣殼或「人類化」AAV衣殼。假型載體適用於本發明，其中一種AAV之衣殼經異源衣殼蛋白置換。在一些實施例中，AAV為AAV2/5。在另一實施例中，AAV為AAV2/8。當假型化AAV載體時，編碼必要rep蛋白中之每一者的序列可由不同AAV來源(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8)供應。舉例而言，rep78/68序列可來自AAV2，而rep52/40序列可來自AAV8。
在一個實施例中，本發明之載體以最小量含有編碼所選AAV血清型衣殼(例如，AAV2衣殼)之序列或其片段。在另一實施例中，本發明之載體以最小量含有編碼所選AAV血清型rep蛋白(例如，AAV2 rep蛋白)之序列或其片段。視情況，此等載體可含有AAV cap及rep蛋白兩者。在提供AAV rep及cap兩者之載體中，AAV rep及AAV cap序列均可均具有一種AAV血清型來源，例如所有AAV2來源。在某些實施例中，載體可包含來自AAV血清型之rep序列，該AAV血清型不同於提供cap序列之AAV血清型。在一些實施例中，rep及cap序列由單獨來源(例如，單獨的載體，或宿主細胞及載體)表現。在一些實施例中，此等rep序列在框架中融合至不同AAV血清型之cap序列以形成嵌合AAV載體，諸如描述於美國專利第7,282,199號中之AAV2/8，該專利以引用之方式併入本文中。AAV血清型之實例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。在一些實施例中，cap來源於AAV2。
在一些實施例中，本文中所揭示之載體中之任一者包括間隔子，亦即，插入於啟動子與rep基因ATG起始位點之間的DNA序列。在一些實施例中，間隔子可為核苷酸之無規序列，或替代地，其可編碼基因產物，諸如標記物基因。在一些實施例中，間隔子可含有通常併入起始/停止位點及聚A位點之基因。在一些實施例中，間隔子可為來自原核生物或真核生物之非編碼DNA序列、重複非編碼序列、無轉錄對照之編碼序列或具有轉錄對照之編碼序列。在一些實施例中，間隔子為噬菌體階梯序列或酵母階梯序列。在一些實施例中，間隔子具有足以減少rep78及rep68基因產物之表現的大小，使得rep52、rep40及cap基因產物以正常水準表現。在一些實施例中，間隔子之長度可因此在約10 bp至約10.0 kbp之範圍內，較佳地在約100 bp至約8.0 kbp之範圍內。在一些實施例中，間隔子長度小於2 kbp。
在某些實施例中，衣殼經修飾以改良療法。可使用習知的分子生物學技術來修飾衣殼。在某些實施例中，出於最小化免疫原性、較佳穩定性及顆粒壽命、高效降解及/或精確遞送編碼本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者的本文中所揭示之聚核苷酸中之任一者來修飾衣殼。在一些實施例中，修飾或突變為衣殼蛋白中之胺基酸缺失、插入、取代或其任何組合。經修飾多肽可包含1、2、3、4、5個，至多10個或更多個胺基酸取代及/或缺失及/或插入。「缺失」可包含個別胺基酸之缺失；小組胺基酸(諸如2、3、4或5個胺基酸)之缺失；或較大胺基酸區之缺失，諸如特定胺基酸結構域或其他特徵之缺失「插入」可包含個別胺基酸之插入；小組胺基酸(諸如2、3、4或5個胺基酸)之插入；或較大胺基酸區之插入，諸如特定胺基酸結構域或其他特徵之插入。「取代」包含由另一胺基酸(例如，非野生型胺基酸)置換野生型胺基酸。在一些實施例中，另一(例如，非野生型)或插入的胺基酸為Ala (A)、His (H)、Lys (K)、Phe (F)、Met (M)、Thr (T)、Gln (Q)、Asp (D)或Glu (E)。在一些實施例中，另一(例如，非野生型)或插入的胺基酸為A。在一些實施例中，另一(例如，非野生型)胺基酸為Arg (R)、Asn (N)、Cys (C)、Gly (G)、Ile (I)、Leu (L)、Pro (P)、Ser (S)、Trp (W)、Tyr (Y)或Val (V)。習知的或天然存在之胺基酸基於共同側鏈特性而劃分成以下基本組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、He；(2)無電之極性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin；(3)酸性(帶負電)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電)：Lys、Arg；及(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；以及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。習知胺基酸包括L或D立體化學。在一些實施例中，另一(例如，非野生型)胺基酸為不同組之成員(例如，芳族胺基酸取代非極性胺基酸)。多肽之生物特性之實質性修飾係藉由選擇在維持以下之作用方面顯著不同的取代來實現：(a)多肽主鏈在取代區域中的結構，例如呈β層狀或螺旋狀構形；(b)分子在目標位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈之堆積。天然存在之殘基基於共同側鏈特性而劃分成以下組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)無電之極性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電)：Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；以及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。在一些實施例中，另一(例如，非野生型)胺基酸為不同組之成員(例如，疏水性胺基酸取代親水性胺基酸、帶電胺基酸取代中性胺基酸、酸性胺基酸取代鹼性胺基酸等)。在一些實施例中，另一(例如，非野生型)胺基酸為同一組之成員：(例如，另一鹼性胺基酸、另一酸性胺基酸、另一中性胺基酸、另一帶電胺基酸、另一親水性胺基酸、另一疏水性胺基酸、另一極性胺基酸、另一芳族胺基酸或另一脂族胺基酸)。在一些實施例中，另一(例如，非野生型)胺基酸為非習知胺基酸。非習知胺基酸為非天然存在之胺基酸。非習知胺基酸之實例包括(但不限於)胺基己二酸、β-丙胺酸、β-胺基丙酸、胺基丁酸、哌啶酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基異丁酸、胺基庚二酸、瓜胺酸、二胺基丁酸、鎖鏈離胺酸(desmosine)、二胺基庚二酸、二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、羥基離胺酸、別羥基離胺酸(allo-hydroxylysine)、羥脯胺酸、異鎖鏈離胺酸、別-異白胺酸(allo-isoleucine)、N-甲基甘胺酸、肌胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、4-羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸，及其他類似胺基酸及胺基酸(例如，4-羥脯胺酸)。在一些實施例中，將一或多個胺基酸取代引入VP1、VP2及VP3中之一或多者中。在一個態樣中，經修飾衣殼蛋白相對於野生型多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守性或非保守性取代。在另一態樣中，本發明之經修飾衣殼多肽包含經修飾序列，其中此等修飾可包括保守性取代及非保守性取代兩者、缺失及/或添加，且通常包括與對應野生型衣殼蛋白共用至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的肽。
在一些實施例中，可使用任何適合基因元件(載體)將用於產生本發明之rAAV所需的重組AAV載體、rep序列、cap序列及輔助功能遞送至封裝宿主細胞。在一些實施例中，將編碼所有三個衣殼蛋白(例如，VP1、VP2及VP3)之單一核酸遞送至單一載體中之封裝宿主細胞中。在一些實施例中，藉由兩個載體將編碼衣殼蛋白之核酸遞送至封裝宿主細胞中；第一載體包含編碼兩個衣殼蛋白(例如，VP1及VP2)之第一核酸且第二載體包含編碼單一衣殼蛋白(例如，VP3)之第二核酸。在一些實施例中，將各自包含編碼不同衣殼蛋白之核酸的三個載體遞送至封裝宿主細胞。可藉由任何適合方法(包括本文所描述之彼等方法)來遞送所選基因元件。用於構築本發明之任何實施例之方法為核酸操作領域的技術人員所已知的，且包括基因工程、重組工程及合成技術。參見例如， Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y。類似地，產生rAAV病毒粒子之方法為所熟知的且適合方法之選擇並不限制本發明。參見例如，K. Fisher等人, J. Virol., 70:520-532 (1993)及美國專利第5,478,745號。
在如下文所描述比對最大對應性時，若兩個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則將兩個聚核苷酸或多肽序列稱為「一致」。通常藉由在比較窗口比較序列以鑑別且比較局部區之序列相似性來進行兩個序列之間的比較。如本文所用，「比較窗口」係指至少約20個連續位置，通常約30至約75，或40至約50個位置的區段，其中在最佳比對兩個序列之後，可將序列與相同數目之連續位置之參考序列進行比較。
可使用生物資訊軟體之Lasergene® 套件中之MegAlign® 程式(DNASTAR® , Inc., Madison, WI)使用預設參數來進行用於比較的最佳序列之比對。此程序體現以下參考文獻中描述之若干比對方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, 第5卷, 增刊3, 第345-358頁；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes, 第626-645頁, Methods in Enzymology, 第183卷, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G.及Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153；Myers, E.W.及Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17；Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A.及Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J.及Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
較佳地，關於本文中所揭示之聚核苷酸中之任一者，「序列一致性百分比」係藉由在至少20個位置之比較窗口上比較兩個最佳比對序列來測定，其中相較於兩個序列之最佳比對的參考序列(其不包含添加或缺失)，比較窗口中之聚核苷酸或多肽序列之部分可包含20%或更少，通常5%至15%，或10%至12%之添加或缺失(亦即間隙)。百分比係藉由以下計算：測定兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基時之位置數以得到匹配位置數，用匹配位置數除以參考序列中之位置總數目(亦即窗口大小)以及使結果乘以100，以得到序列一致性百分比。適合的「適度嚴格條件」包括在5 × SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃-65℃、5 × SSC下雜交隔夜；接著在65℃下用含有0.1% SDS之2×、0.5×及0.2× SSC中之每一者洗滌兩次，歷時20分鐘。如本文所用，「高度嚴格條件」或「較高嚴格度條件」如下：(1)使用低離子強度及高溫用於洗滌，例如在50℃下0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下具有0.1%牛血清白蛋白之50% (v/v)甲醯胺/0.1%菲科爾(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/具有750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之pH 6.5的50 mM磷酸鈉緩衝液；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺、5 × SSC (0.75 M NaCl，0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 × 登哈特氏溶液(Denhardt's solution)、音波處理鮭魚精子DNA (50 µg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，其中在42℃下在0.2 × SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃下在50%甲醯胺中洗滌，隨後在55℃下用由含EDTA之0.1 × SSC組成的較高嚴格度洗液洗滌。熟習此項技術者將知道如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及類似物之因素。
一般熟習此項技術者將瞭解，由於基因密碼之簡併，存在編碼如本文所描述之多肽的許多核苷酸序列。此等聚核苷酸中之一些與任何天然基因之核苷酸序列攜帶最小同源性。儘管如此，本發明尤其預期因密碼子使用差異而改變的聚核苷酸。此外，包含本文所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因在本發明之範疇內。對偶基因為由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加及/或取代)而變化的內源基因。所得mRNA及蛋白質可(但未必)具有更改的結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來鑑別。
本發明之核酸/聚核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學聚核苷酸合成方法為此項技術中所熟知且無需詳細描述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商用DNA合成器來產生所需DNA序列。在一些實施例中，本發明提供一種在高度嚴格條件下與本文中所揭示之特定核苷酸序列中之任一者雜交的聚核苷酸。一般熟習此項技術者將容易理解可改變促進DNA雜交之適合嚴格條件。舉例而言，可在約45℃下以6.0 × 氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)進行雜交，隨後在50℃下洗滌2.0 × SSC。舉例而言，洗滌步驟中之鹽濃度可選自處於50℃的約2.0 × SSC的低嚴格度至處於50℃的約0.2 × SSC的高嚴格度。另外，洗滌步驟中之溫度可自處於室溫(約22℃)的低嚴格度條件增加至處於約65℃的高嚴格度條件。可改變溫度及鹽兩者，或溫度或鹽濃度可保持恆定，同時改變另一變數。在一個實施例中，本發明提供在室溫下在6 × SSC之低嚴格度條件下雜交，隨後在室溫下在2 × SSC下洗滌的核酸。
由於基因密碼中之簡併而不同的經分離核酸亦在本發明之範疇內。舉例而言，藉由超過一個三重態指定多個胺基酸。指定相同胺基酸之密碼子或同義語(例如，CAU及CAC為組胺酸之同義語)可引起不影響蛋白質之胺基酸序列之「靜默」突變。熟習此項技術者將瞭解，由於天然對偶基因變異，編碼特定蛋白質的核酸之一或多個核苷酸(至多約3-5%之核苷酸)中之此等變異可存在於給定物種之成員中。任何及所有此等核苷酸變異及所得胺基酸多態現象在本發明之範疇內。
醫藥組合物 本文亦提供包含本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。醫藥組合物可適用於本文所描述之任何投藥模式，例如藉由玻璃體內或靜脈內投藥。
在一些實施例中，使用本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者來治療視網膜疾病(諸如LCA、視網膜色素變性及年齡相關黃斑變性)需要將抗HTRA1抗體或抗原結合片段局部遞送至視網膜中之細胞。在一些實施例中，將為此等疾病中之治療目標的細胞為視網膜中之感光細胞或感覺神經視網膜下層之RPE之細胞。
在一些實施例中，包含本文所描述之抗體或抗原結合片段中之任一者及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物適用於投與至人類個體。此等載體為此項技術中所熟知(參見例如, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, 第1035-1038頁及第1570-1580頁)。在一些實施例中，包含本文所描述之抗體或抗原結合片段中之任一者及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物適用於眼部注射。在一些實施例中，醫藥組合物適用於玻璃體內注射。在一些實施例中，醫藥組合物適用於視網膜下遞送。此等醫藥學上可接受之載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油及類似物。亦可採用生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液、聚乙二醇(PEG)及丙三醇溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。醫藥組合物可進一步包含額外成分，例如防腐劑、緩衝劑、張力劑、抗氧化劑及穩定劑、非離子濕潤或澄清劑、增黏劑及類似物。本文所描述之醫藥組合物可以單一單位劑量或以多劑量形式封裝。組合物通常被調配為無菌及實質上等張溶液。
在一個實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者經調配成意欲用於視網膜下或玻璃體內注射之醫藥組合物。此調配涉及使用醫藥學上及/或生理學上可接受之媒劑或載劑(特定言之適用於例如藉由視網膜下注射投與至眼睛之媒劑或載劑，諸如緩衝生理食鹽水或其他緩衝劑(例如，HEPES)，以將pH維持處於適合生理水準)，且視情況，使用其他藥劑、醫藥劑、穩定劑、緩衝劑、載劑、佐劑、稀釋劑等。對於注射，載劑將通常為液體。例示性生理學上可接受之載劑包括無菌、無熱原質的水及無菌、無熱原質的磷酸鹽緩衝鹽水。各種此等已知載劑提供於美國專利公開案第7,629,322號中，該公開案以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，載劑為等張氯化鈉溶液。在另一實施例中，載劑為平衡鹽溶液。在一個實施例中，載劑包括吐溫(tween)。若將長期儲存抗體或抗原結合片段，則可在存在丙三醇或Tween20之情況下將其冷凍。在另一實施例中，醫藥學上可接受之載劑包含界面活性劑，諸如全氟辛烷(全氟液體)。
在本文所描述之方法之某些實施例中，藉由視網膜下注射將上文所描述之醫藥組合物投與至個體。在其他實施例中，藉由玻璃體內注射投與醫藥組合物。可適用於本文所描述之方法中的其他投藥形式包括(但不限於)直接遞送至所需器官(例如，眼睛)、經口、吸入、鼻內、氣管內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內及其他親體投藥途徑。視需要，可組合投藥途徑。
在一些實施例中，向患者投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段/醫藥組合物中之任一者，使得該等抗體或抗原結合片段/醫藥組合物靶向視網膜或黃斑之任何一或多個層或區之細胞。舉例而言，本文中所揭示之組合物靶向視網膜，包括內部限制膜、神經纖維層、神經節細胞層(ganglion cell layer；GCL)、內網狀層、內核層、外網狀層、外核層、外部限制膜、桿體及錐體層或視網膜色素上皮(RPE)之任何一或多個層之細胞。在一些實施例中，本文中所揭示之組合物靶向GCL之膠細胞、穆勒細胞及/或視網膜色素上皮細胞。在特定實施例中，本文中所揭示之組合物靶向血管內皮細胞。在一些實施例中，本文中所揭示之組合物靶向黃斑，包括(例如)鼓膜凸(umbo)、中心凹(foveolar)、視窩無血管區域、中央凹(fovea)、近凹區(parafovea)或近中心凹(perifovea)之任何一或多個區之細胞。在一些實施例中，投藥途徑並不特異性靶向神經元。在一些實施例中，選擇投藥途徑，使得其降低患者之視網膜脫落之風險(例如，玻璃體內而非視網膜下投藥)。在一些實施例中，若待向老年人(例如，至少60歲)投與抗體或抗原結合片段/組合物，則選擇玻璃體內投藥。在特定實施例中，向個體玻璃體內投與本文中所揭示之抗體/抗原結合片段/組合物中之任一者。用於玻璃體內注射之程序為此項技術中已知的(參見例如，Peyman, G.A.,等人 (2009) Retina 29(7):875-912及Fagan, X.J.及Al-Qureshi, S. (2013) Clin. Experiment. Ophthalmol. 41(5):500-7)。簡言之，玻璃體內注射之個體可通過瞳孔擴張、對眼睛進行滅菌且投與麻醉劑為程序做準備。此項技術中已知的任何適合擴瞳劑可用於瞳孔擴張。可在治療前確認充足的瞳孔擴張。滅菌可藉由應用滅菌眼睛治療劑，例如含碘化物溶液(諸如聚維酮-碘(BETADINE®))來實現。類似溶液亦可用於清潔眼瞼、睫毛及任何其他附近組織(例如，皮膚)。可以任何適合濃度使用任何適合麻醉劑，諸如利多卡因(lidocaine)或丙美卡因(proparacaine)。可藉由此項技術中已知之任何方法投與麻醉劑，包括(但不限於)局部液滴、凝膠或凍膠及結膜下塗覆麻醉劑。在注射之前，經滅菌眼瞼鏡筒可用於自該區域清除睫毛。可藉由注射器標記注射位點。可基於患者之晶狀體選擇注射位點。舉例而言，注射位點可為距假晶體(pseudophakic)或無晶體(aphakic)患者之角膜緣3-3.5 mm，且距晶體患者之角膜緣3.5-4 mm。患者可看向與注射位點相對之方向。在注射期間，可將針頭垂直於鞏膜且指向眼睛之中心插入。可插入針頭，使得尖端終止於玻璃體中而非視網膜下腔。可使用此項技術中已知用於注射之任何適合體積。在注射後，眼睛可經滅菌劑(諸如抗生素)治療。眼睛亦可經沖洗以移除過量滅菌劑。
此外，在某些實施例中，需要執行非侵入性視網膜成像及功能性研究以鑑別待靶向用於療法之特定眼細胞區域。在此等實施例中，臨床診斷性測試用於測定用於一或多個視網膜下注射之確切位置。此等測試可包括檢眼鏡(ophthalmoscopy)、視網膜電圖描記(ERG) (特定言之，b波量測)、視野量測、藉助於共焦掃描雷射檢眼鏡(confocal scanning laser ophthalmoscopy；cSLO)及光同調斷層掃描(optical coherence tomography；OCT)構形映射視網膜層且量測該等層之厚度、經由調適光學(adaptive optics；AO)構形映射錐體密度、功能性眼睛檢驗等。
視待治療區域之大小、所使用抗體或抗原結合片段之量、投藥途徑及方法之所需效果而定，可以約0.1 μL至約1 mL之體積(包括該範圍內之所有數值)遞送組合物。在一個實施例中，體積為約50 μL。在另一實施例中，體積為約70 μL。在一較佳實施例中，體積為約100 μL。在另一實施例中，體積為約125 μL。在另一實施例中，體積為約150 μL。在另一實施例中，體積為約175 μL。在另一實施例中，體積為約200 μL。在另一實施例中，體積為約250 μL。在另一實施例中，體積為約300 μL。在另一實施例中，體積為約450 μL。在另一實施例中，體積為約500 μL。在另一實施例中，體積為約600 μL。在另一實施例中，體積為約750 μL。在另一實施例中，體積為約850 μL。在另一實施例中，體積為約1000 μL。
治療 / 防治方法 本文中描述各種預防、治療眼部病症及與其相關的視網膜變化、遏制眼部病症及與其相關的視網膜變化之進展或改善眼部病症及與其相關的視網膜變化的方法。大體而言，該等方法包括向有需要之哺乳動物個體投與有效量的包含本文中所揭示之抗HTRA1抗體或抗原結合片段中之任一者的組合物。本文所描述之抗體或抗原結合片段中之任一者或編碼本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者的本文中所揭示之載體中之任一者適用於下文描述之方法。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者或編碼本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者的本文中所揭示之載體中之任一者用於治療視網膜疾病，諸如LCA、視網膜色素變性及年齡相關黃斑變性，該治療可能需要將抗體或抗原結合片段局部遞送至視網膜中之細胞。將為此等疾病中之治療目標的細胞為視網膜中之感光細胞或感覺神經視網膜下層之RPE之細胞。在一些實施例中，將本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者遞送至此等細胞需要注射至視網膜與RPE之間的視網膜下腔中。在一些實施例中，玻璃體內或靜脈內投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者。
在某一態樣中，本發明提供一種治療患有年齡相關黃斑變性(AMD)之個體之方法，其包含向該個體投與本發明之抗體或抗原結合片段中之任一者的步驟。在一些實施例中，AMD為早期AMD；中期AMD；晚期非新生血管性(「乾性」) AMD或晚期新生血管性(「濕性」) AMD中之任一者。在一些實施例中，本發明提供治療患有濕性AMD之個體之方法。在一些實施例中，本發明提供治療患有乾性AMD之個體之方法。在一些實施例中，本發明提供治療患有息肉狀脈絡膜血管病變(polypoidal choroidal vasculopathy；PCV)之個體之方法。在一些實施例中，個體具有地圖狀萎縮(geographic atrophy)。
在某些實施例中，本發明之醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物包含PBS。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物包含普洛尼克(pluronic)。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物包含PBS、NaCl及普洛尼克。
在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者能夠抑制有需要之個體中的HTRA1蛋白質之蛋白分解活性。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在相同細胞類型中之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制細胞中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在該抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在另一隻眼睛中之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制一隻眼睛中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1裂解一或多種HTRA1受質之能力。在一些實施例中，HTRA1受質選自由以下組成之群：纖調蛋白、群集素、ADAM9、彈性蛋白、玻連蛋白、α2-巨球蛋白、踝蛋白-1、肌成束蛋白、LTBP-1、EFEMP1、纖蛋白5、tau、RseA及氯化物胞內通道蛋白。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1裂解補體級聯之調節子(例如，玻連蛋白、纖調蛋白或群集素)的能力。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或其抗原結合片段之情況下HTRA1裂解HTRA1受質及/或補體級聯之調節子的能力，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1以使得HTRA1裂解HTRA1受質及/或補體級聯之調節子之能力降低達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，相較於在不存在抗體或其抗原結合片段之情況下HTRA1蛋白質三聚之能力，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1以使得HTRA1三聚之能力降低達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一些實施例中，將本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者投與至測試個體之細胞或組織。在一些實施例中，測試個體之細胞或組織表現比參考對照個體或參考對照個體群體內之相同細胞類型或組織類型所表現的水準更高的HTRA1水準。在一些實施例中，參考對照個體與測試個體具有相同年齡及/或性別。在一些實施例中，參考對照個體為健康個體，例如未患眼睛疾病或病症之個體。在一些實施例中，參考對照個體未患與補體級聯之活化相關聯的眼睛疾病或病症。在一些實施例中，參考對照個體未患黃斑變性。在一些實施例中，相較於參考對照個體或參考對照個體群之水準，測試個體之眼睛或眼睛之特定細胞類型(例如，視窩區中之細胞)表現多至少300%、250%、200%、150%、100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%的HTRA1。在一些實施例中，測試個體之眼睛或眼睛之特定細胞類型(例如，視窩區中之細胞)表現具有本文中所揭示之突變中之任一者的HTRA1基因。在一些實施例中，參考對照個體之眼睛或眼睛之特定細胞類型(例如，視窩區中之細胞)並未表現具有本文中所揭示之HTRA1突變中之任一者的HTRA1基因。在一些實施例中，在測試個體之細胞或組織中投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者引起HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之水準的減少。在一些實施例中，在測試個體之細胞或組織中投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者能夠減少HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之水準，使得減少的水準在由參考對照個體或參考對照個體群體內的相同細胞類型或組織表現的HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之水準之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%內或與該等水準相同。在一些實施例中，在測試個體之細胞或組織中投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者引起HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之水準的減少，但HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之減少的水準並不低於由參考對照個體或參考對照個體群體內之相同細胞類型或組織類型表現的HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之水準。在一些實施例中，在測試個體之細胞或組織中投與本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者能夠減少HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之水準，但HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之減少的水準低於HTRA1蛋白質或功能性HTRA1蛋白質之水準不超過由參考對照個體或參考對照個體群體內之相同細胞類型或組織類型表現的水準之1%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在一些實施例中，將本文中所揭示之治療及/或防治性方法中之任一者應用於個體。在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，人類為成年人。在一些實施例中，人類為老年人。在一些實施例中，人類為至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95歲。在特定實施例中，人類為至少60或65歲。
在一些實施例中，本文中所揭示之治療及/或防治性方法中之任一者用於治療具有造成黃斑變性(AMD)或增加患者罹患AMD之可能性之一或多個突變的患者。在一些實施例中，該一或多個突變在患者之HTRA1基因中。
在一些實施例中，本文中所揭示之治療及/或防治方法中之任一者用於治療在患者之HTRA1基因中具有一或多個突變的個體。如本文所用，「突變」涵蓋與增加HTRA1表現相關聯之多態性。在一些實施例中，突變與AMD或PCV相關聯。在一些實施例中，一或多個突變引起HTRA1基因之過度表現。在一些實施例中，相較於未患疾病或病症之對照個體中之水準，HTRA1以至少25%、50%、75%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%或500%更大之水準表現於患有疾病或病症之個體中。在一些實施例中，該對照個體為與患有該疾病或病症之該個體具有相同性別及/或具有類似年齡的個體。在一些實施例中，該一或多個突變並未在該HTRA1基因之編碼序列中。在一些實施例中，一或多個突變在人類患者中之10q26中。在一些實施例中，一或多個突變對應於以下人類多態性中之任何一或多者：rs61871744；rs59616332；rs11200630；rs61871745；rs11200632；rs11200633；rs61871746；rs61871747；rs370974631；rs200227426；rs201396317；rs199637836；rs11200634；rs75431719；rs10490924；rs144224550；rs36212731；rs36212732；rs36212733；rs3750848；rs3750847；rs3750846；rs566108895；rs3793917；rs3763764；rs11200638；rs1049331；rs2293870；rs2284665；rs60401382；rs11200643；rs58077526；rs932275及/或rs2142308。
上文所描述的視網膜疾病與多種視網膜變化相關聯。此等變化可包括感光結構或功能之喪失；外核層(ONL)之薄化或增厚；外網狀層(outer plexiform layer；OPL)之薄化或增厚；結構紊亂，隨後桿體及錐體外部區段之喪失；桿體及錐體內部區段之縮短；雙極細胞樹突之收縮；包括內核層、內網狀層、神經節細胞層及神經纖維層之內視網膜層之薄化或增厚；視蛋白錯誤定位、神經纖毛之過度表現；視網膜之特定部分(諸如中央凹或黃斑)之薄化；ERG功能之喪失；視敏度及對比敏感度之喪失；視動反射之喪失；瞳孔光反射之喪失；以及視覺引導行為之喪失。在一個實施例中，提供一種預防與此等視網膜疾病相關聯之視網膜變化中之任一者、遏制該等視網膜變化中之任一者之進展或改善該等視網膜變化中之任一者的方法。因此，個體之視力經提高，或視力喪失停滯及/或改善。
在一特定實施例中，提供一種預防與個體之眼部病症相關聯之視力喪失、遏制視力喪失之進展或改善視力喪失之方法。與眼部病症相關聯之視力喪失係指周邊視力、中心(讀取)視力、夜間視力、白天視力之任何下降；顏色感知之喪失；對比敏感度之喪失；或視敏度之降低。
在另一實施例中，提供一種靶向一或多種類型之眼細胞以用於有需要之個體之基因增強療法的方法。在另一實施例中，提供一種靶向一或多種類型之眼細胞以用於有需要之個體之基因抑制療法的方法。在又一實施例中，提供一種靶向一或多種類型之眼細胞以用於有需要之個體之基因減弱/增強療法的方法。在另一實施例中，提供一種靶向一或多種類型之眼細胞以用於有需要之個體之基因校正療法的方法。在再一實施例中，提供一種靶向一或多種類型之眼細胞以用於有需要之個體之親神經因子基因療法的方法。
在本文所描述之方法中之任一者中，目標細胞可為眼細胞。在一個實施例中，目標細胞為膠細胞。在一個實施例中，目標細胞為RPE細胞。在另一實施例中，目標細胞為感光體。在另一實施例中，感光體為視錐細胞。在另一實施例中，目標細胞為穆勒細胞。在另一實施例中，目標細胞為雙極細胞。在又一實施例中，目標細胞為水平細胞。在另一實施例中，目標細胞為無軸突神經細胞。在再一實施例中，目標細胞為神經節細胞。在再一實施例中，基因可經表現並遞送至胞內細胞器，諸如粒線體或溶酶體。
在一些實施例中，本文中所揭示之方法中之任一者增強感光功能。如本文所使用，「感光功能喪失」意謂相較於正常、未患病眼睛或較早時間點處之同一眼睛，感光作用減弱。如本文所用，「增強感光功能」意謂相較於患病眼睛(患有相同眼部疾病)、較早時間點處之同一眼睛、同一眼睛之未經治療部分或同一患者之對側眼睛，改良感光體之功能或增強功能性感光體之數目或百分比。可使用上文及下文實例中所描述之功能性研究(例如，ERG或視野量測)來評估感光功能，該等功能性研究為此項技術中習知的。
對於所描述方法中之每一者，治療可用於預防視網膜損傷之出現或用於急救患有輕度或重病之眼睛。如本文所用，術語「急救」意謂預防疾病進展至完全失明，預防傷害擴散至未受損傷眼細胞，改善受傷眼細胞之損傷或提供增強的視力。在一個實施例中，在疾病變得有症狀之前或在感光喪失之前投與組合物。有症狀意謂上文所描述的各種視網膜變化中之任一者之發作或視力喪失。在另一實施例中，在疾病變得有症狀後投與組合物。在又一實施例中，在感光喪失開始後投與組合物。在另一實施例中，在外核層(ONL)變性開始後投與組合物。在一些實施例中，需要在雙極細胞迴路對於神經節細胞及視神經保持完整時投與組合物。
在另一實施例中，在感光喪失開始後投與組合物。在又一實施例中，相較於未患病眼睛，當小於90%之感光體起作用或剩餘時，投與組合物。在另一實施例中，當少於80%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在另一實施例中，當少於70%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在另一實施例中，當少於60%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在另一實施例中，當少於50%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在另一實施例中，當少於40%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在另一實施例中，當少於30%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在另一實施例中，當少於20%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在另一實施例中，當少於10%之感光體起作用或保留時，投與組合物。在一個實施例中，僅向眼睛之一或多個區域投與組合物。在另一實施例中，向整隻眼睛投與組合物。
在另一實施例中，方法包括進行功能性及成像研究以測定治療之功效。此等研究包括ERG及活體內視網膜成像，如下文實例中所描述。另外，可進行視場研究；視野量測及微視野量測；瞳孔量測；移動測試；視敏度、對比敏感度、色覺測試。
在又一實施例中，進行上文所描述方法中之任一者以及另一種或二級療法。療法可為幫助預防、遏止或改善所描述之視網膜變化及/或視力喪失中之任一者的任何目前已知或尚且未知的療法。在一個實施例中，二級療法為囊封細胞療法(諸如遞送睫狀神經營養因子(Ciliary Neurotrophic Factor；CNTF))。參見Sieving, P.A.等人, 2006. Proc Natl Acad Sci USA, 103(10):3896-3901，其特此以引用之方式併入。在另一實施例中，二級療法為神經營養因子療法(諸如色素上皮來源因子，PEDF；睫狀神經營養因子3；桿體來源錐體存活因子(rod-derived cone viability factor；RdCVF)或膠質來源神經營養因子)。在另一實施例中，二級療法為抗細胞凋亡療法(諸如遞送X連接之細胞凋亡抑制劑(XIAP)之療法)。在又一實施例中，二級療法為桿體來源錐體存活因子2。可在投與上文所描述之抗體/抗原結合片段之前、同時或之後投與二級療法。
在一些實施例中，向個體投與本文中所揭示之抗體、抗原結合片段或組合物中之任一者以及另一種治療劑或治療程序。在一些實施例中，額外治療劑為抗VEGF治療劑(例如，諸如抗VEGF抗體或其片段，諸如蘭比珠單抗(ranibizumab)、貝伐單抗(bevacizumab)或阿柏西普(aflibercept))、維生素或礦物質(例如，維生素C、維生素E、葉黃素、玉米黃素、鋅或銅)、Ω-3脂肪酸及/或VisudyneTM 。在一些實施例中，其他治療程序為減少Ω-6脂肪酸之膳食、雷射手術、雷射光凝、黃斑下手術、視網膜位移及/或光動力療法。
套組 在一些實施例中，將本文中所揭示之抗體或其抗原結合片段中之任一者組裝至醫藥或診斷性或研究套組中以有助於將其用於治療性、診斷性或研究應用中。套組可包括容納本文中所揭示之抗體或其抗原結合片段中之任一者的一或多個容器及使用說明書。
套組可經設計以有助於研究人員使用本文所描述之方法且可採用許多形式。適用時，可以液體形式(例如，呈溶液)或以固體形式(例如，乾粉)提供套組之組合物中之每一者。在某些情況下，組合物中之一些可例如藉由添加適合溶劑或其他物種(例如，水或細胞培養基)為可構成的或可以其他方式處理的(例如，處理成活性形式)，其可或可不具備套組。如本文所用，「說明書」可定義說明及/或促銷組分，且通常涉及本發明之封裝上之書面說明書或與本發明之封裝相關聯的書面說明書。說明書亦可包括以任何方式提供之任何口頭或電子說明書，該方式使得使用者將清楚地識別與套組相關聯之說明，例如視聽(例如，錄影帶、DVD等)、網際網路及/或基於網頁之通訊等。書面說明書可呈由管理藥物或生物學產品之製造、使用或出售的政府機構規定之形式，該等說明書亦可反映由用於動物投藥之製造、使用或出售之機構的批准。
實例 本發明現已大體上描述，參考以下實例將更容易地理解本發明，僅處於說明本發明之某些態樣及實施例之目的包括該等實例，且不意欲限制本發明。
實例 1 ：抗HTRA1結合子之噬菌體淘選 基於珠粒之淘選與抗生蛋白鏈菌素珠粒上捕獲之生物素化HTRA一起採用。以不同嚴格度執行四輪噬菌體淘選。測試總共4種條件(不同抗原濃度及洗液)。所測試的不同抗原為0.5 mg生物素化HTRA1；生物素化L2肽201 (19-聚體)；以及生物素化L3肽202 (19-聚體)。如下文所概述進行淘選輪次：
水淘選輪次 抗原(皮莫耳) 洗滌條件
1 100 3 PBST (5 min) + 3 PBS (5 min)
2 25 5 PBST (2× 30sec, 3× 5min) + 5 PBS (2× 30sec, 3× 5min)
3 10 8 PBST (4× 30sec, 4× 5min) + 8 PBS (4× 30sec, 4× 5min)
4 1 8 PBST (3× 30sec, 4× 5min, 1× 30min) + 8 PBS (3× 30sec, 4× 5min, 1× 30min)
關於淘選輸出之噬菌體ELISA展示增加的富集。針對HTRA1結合篩選來自第3輪及第4輪輸出的總共14個培養盤。藉由用抗v5 mAb偵測PPE表現中之scFv來測定結合。三百八十七個純系最初被鑑別為ELISA結合子且經重新排列以用於scFv測序。鑑別出九十一個特有序列及經ELISA重新確認之純系。此等純系之PPE經測試以供與呈ELISA型式之兩個不同的對照抗HTRA1 IgG (BM1及BM2)競爭結合以測定抗原決定基結合子。兩個對照基準「BM」抗HTRA1抗體用作此等實驗中之比較物。藉由被動吸收使抗生蛋白鏈菌素培養盤塗佈有1 ug/ml HTRA1。將含二十五微升scFv PPE及25 ul 0.08 ug/ml BM IgG之4% BSA/PBS一式兩份地添加至培養盤中之孔中。培養盤1經HRP抗人類Fc (偵測BM IgG)處理，而培養盤2經抗v5 mAb及HRP抗小鼠IgG (偵測scFv)處理。若scFv結合與BM IgG相同的抗原決定基，則scFv之ELISA信號將低於BM IgG。若scFv結合與BM IgG不同的抗原決定基，則scFv之ELISA信號不受BM IgG影響。四十五個純系似乎獨立於BM1及BM2結合。
針對Pep201結合篩選來自第3輪及第4輪輸出之總共12個培養盤。藉由用抗v5 mAb偵測PPE表現中之scFv來測定結合。四十二個純系最初被鑑別為ELISA結合子且經重新排列以用於scFv測序。十五個序列為特有的且鑑別出ELISA重新確認之純系。經由ELISA針對HTRA1結合測試此等純系之PPE，但此等純系中無一者結合。
針對Pep202結合篩選來自第3輪及第4輪輸出之總共12個培養盤。藉由用抗v5 mAb偵測PPE表現中之scFv來測定結合。八十八個純系最初被鑑別為ELISA結合子且經重新排列以用於scFv測序。十七個序列為特有的且鑑別出ELISA重新確認之純系。經由ELISA針對HTRA1結合測試此等純系之PPE，但此等純系中無一者結合。
在25℃下在Octet HTX上進行結合實驗。將生物素標記之HTRA1抗原(0.5 ug/mL)裝載至抗生蛋白鏈菌素上，且將經裝載感測器浸入測試抗體(50 nM)中。使用單價(1:1)模型計算動力學常數。展示較強結合之純系係如下：
裝載樣本ID 樣本ID KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) 完整X2 完整R2
bt-HTRA1 BM1 ＜1.0E-12 4.99E+05 ＜1.0E-07 0.0965 0.9784
bt-HTRA1 BM2 1.07E-09 7.32E+05 7.86E-04 0.0972 0.9535
bt-HTRA1 SR8047-17 2.75E-09 2.97E+05 8.16E-04 0.0015 0.8527
bt-HTRA1 SR8047-06 9.58E-09 2.18E+05 2.09E-03 0.002 0.9877
bt-HTRA1 SR8047-16 2.41E-09 1.50E+06 3.62E-03 0.0589 0.9078
bt-HTRA1 SR8047-43 2.64E-09 1.44E+06 3.81E-03 0.2557 0.9229
bt-HTRA1 SR8047-38 1.05E-08 5.62E+05 5.91E-03 0.1755 0.9764
bt-HTRA1 SR8047-42 3.09E-09 2.03E+06 6.28E-03 0.0722 0.86
bt-HTRA1 SR8047-31 1.61E-08 4.16E+05 6.70E-03 0.2527 0.9839
bt-HTRA1 SR8047-44 4.06E-09 1.86E+06 7.55E-03 0.1612 0.9245
bt-HTRA1 SR8047-40 9.14E-09 1.15E+06 1.05E-02 0.3556 0.9679
bt-HTRA1 SR8047-23 5.13E-09 2.16E+06 1.11E-02 0.0908 0.9325
在抗原決定基分組實驗中測試結合子。簡言之，在25℃下在Octet HTX上進行分組實驗。以串聯方式，設置分組分析型式。將生物素化抗原bt-HTRA1 (10 nM)裝載至抗生蛋白鏈菌素感測器上，持續240秒。將裝載感測器浸入飽和抗體(20 ug/mL)中持續900秒，隨後浸入競爭抗體中(5 ug/mL，持續300秒)。
藉由評估完整成對比較中之結合競爭程度來完成抗原決定基分組實驗。簡言之，第一抗體以飽和濃度結合於HTRA1。隨後，接著使Octet感測器頂端曝露於潛在競爭結合子之溶液且將動力學及結合水準進行比較以分析兩個抗體是否結合於類似抗原決定基。基於此等資料，限定六個分組連同抗原決定基分組不明確的一額外組。
在AlphaLISA分析型式中使用AlphaScreen信號抑制測試結合子。簡言之，N端Flag RseA-C-末端His受質與供體珠粒(抗Flag)及受體珠粒(鎳螯合物)締合。當珠粒與未裂解RseA受質締合時，其足夠接近於釋放信號。HTRA1能夠裂解RseA且減少輸出信號。最佳化分析條件如下。所使用緩衝液包括150 mM NaH2 PO4 pH 8.3、380 mM NaCl、0.05% Triton X-100、0.3% BSA。添加五微升經稀釋HTRA1 (最終400 nM)及5 ul緩衝液/抗體(最終400 nM)且在室溫下培育30分鐘。添加五微升經稀釋RseA (最終25 nM)且接著在室溫下培育1或4小時。添加十五微升AlphaLISA鎳螯合受體珠粒(最終10 ug/mL)及15 uL抗FLAG供體珠粒(最終20 ug/mL)且在室溫下培育1小時。用EnSpire 2390量測樣本。分析指示，10種潛在抑制劑(經純化IgG)與分析中之BM抗體相當或更佳。
圖1中提供來自測試不同結合子之各種分析的結果之概述。圖2中提供圖1中列出的結合子中之每一者的CDR序列。
實例 2 ：用抗HTRA1抗體治療患有AMD之患者 此研究將評估實例1之抗體或抗原結合片段治療患有AMD之患者的功效。患有AMD之患者將經抗體或抗原結合片段中之任一者或對照治療。將藉由玻璃體內、視網膜下或靜脈內注射來投與抗體或抗原結合片段。將監測患者之AMD症狀的改善。
吾人預期，抗體或抗原結合片段治療將改善AMD症狀。
實例 3 ： 抗 HTRA1 抗體之功能性測試 重組HTRA1經產生含有StrepII親和標籤且缺失HTRA1 N端Mac結構域(StrepII-ΔMac-HTRA1)。使用西方墨點確認對HTRA1之抗體特異性。抗體SR8047-38、SR8047-40、SR8047-17、SR8047-44、SR8047-16、SR8047-43、SR8047-31、SR8047-06、SR8047-23及SR8047-42全部經測定結合於HTRA1。SR8047-38及SR8047-40亦結合於HTRA4。抗體中無一者顯示任何與HTRA2或HTRA3之可偵測結合。
A. 彈性蛋白分析 在存在及不存在抗HTRA1抗體之情況下量測HTRA1介導之彈性蛋白之蛋白分解，以便測定此等抗體是否抑制HTRA1絲胺酸蛋白酶活性。利用Sensolyte® 綠色彈性蛋白酶套組(Anaspec, Inc.)量測HTRA1介導之彈性蛋白之蛋白分解。在不透明96孔培養盤中製備且實行反應溶液。各溶液係藉由以下來製備：將StrepII-ΔMac-HTRA1 (200 nM)與含1.2 μM抗HTRA1抗體之分析緩衝液(pH 8.0)混合，隨後在37℃下後續培育45分鐘。培育之後，將標記有5-FAM及QXL® 520淬滅劑之彈性蛋白添加至反應溶液。HTRA1介導之彈性蛋白之蛋白分解產生5-FAM螢光團之螢光以及與StrepII-ΔMac-HTRA1之蛋白分解活性成比例的強度的增加。在37℃下分別用490 nm及520 nm之激勵及發射波長來量測螢光之變化。每60秒量測螢光強度且繪製為時間函數(圖3A、圖3B)。對於各樣本至少一式兩份地進行量測。抗HTRA1抗體SR8047-44及SR8047-43相對於完全活性陽性對照(圖3C)產生HTRA1介導之彈性蛋白之蛋白分解的70%及50% (分別)減小，表明此等特定抗體為HTRA1蛋白分解活性之抑制劑。
B. 纖蛋白 5 分析 在存在及不存在抗HTRA1抗體之情況下量測HTRA1介導之纖蛋白5之蛋白分解，以便測試此等抗體是否將發揮抑制作用。在含有25 mM HEPES pH 7.5及75 mM NaCl之緩衝液中製備含StrepII-ΔMac-HTRA1 (100 nM)及抗HTRA1抗體(600 nM)之反應溶液且使其以300 rpm在37℃下培育45分鐘。在37℃及300 rpm下添加纖蛋白5 (1 μM)後開始蛋白分解反應。藉由用SDS-PAGE凝膠裝載緩衝液及DTT (1 M)淬滅反應樣本以在0、1、3及22小時處取得反應時間點。使用SDS-PAGE在各時間點觀測反應進展(圖4A及圖4B)。HTRA1介導之纖蛋白5之蛋白分解隨時間推移產生纖蛋白5譜帶強度之減弱。含有抗體SR8047-17、SR8047-44、SR8047-43及SR8047-42之反應的纖蛋白5譜帶強度隨時間推移相對於對照反應(BM1及BM2；圖4B)保持恆定，其表明此等抗體能夠抑制HTRA1介導之纖蛋白5之蛋白分解。
C. Tau 分解分析 使用與纖蛋白5分析中所描述大體上相同的SDS-PAGE方法來進一步測試抗體抑制HTRA1介導之Tau之蛋白分解的能力。在含有50 mM Tris pH 8.0之緩衝液中製備含StrepII-ΔMac-HTRA1 (100 nM)及抗-HTRA1抗體(600 nM)之反應溶液且使其在37℃下培育45分鐘。在37℃及300 rpm下添加Tau (800 nM)後開始反應。藉由用SDS-PAGE凝膠裝載緩衝液及DTT (1 M)淬滅反應樣本以在0、7及22小時處取得反應時間點。使用SDS-PAGE在各時間點觀測反應進展(圖5A及圖5B)。Tau譜帶強度隨時間推移的減弱展現HTRA1介導之蛋白分解。Tau之HTRA1蛋白分解未由SR8047-23抑制，使得7及22小時後，引起Tau譜帶強度之較大減弱(圖5A)。保留對照，所有其他反應之Tau譜帶強度並未減弱，指示除SR8047-23之外的所有抗體抑制HTRA1介導之Tau之蛋白分解(圖5A及圖5B)。觀測到含有抗體SR8047-17、SR8047-44、SR8047-43及SR8047-42之反應的上文平均抑制程度隨時間推移相對於對照反應(BM1及BM2；圖5B)保持恆定。此等結果表明，SR8047-17、SR8047-44、SR8047-43及SR8047-42抗體為HTRA1介導之Tau蛋白分解之更有效抑制劑。
D. RseA 分析 進一步篩選抗體抑制HTRA1介導之RseA之蛋白分解的能力。利用描述於纖蛋白5及Tau分解分析中之基於SDS-PAGE之篩選，且在含有150 mM NaH2 PO4 (磷酸鈉) pH 8.0及380 mM NaCl之緩衝液中製備含有StrepII-ΔMac-HTRA1 (100 nM)及抗HTRA1抗體(600 nM)之反應溶液。使此等反應溶液在37℃下培育45分鐘。在培育之後，在37℃及300 rpm下添加RseA (1 μM)後開始反應。藉由用SDS-PAGE凝膠裝載緩衝液及DTT (1 M)淬滅反應樣本以在0、5及7小時處取得反應時間點。使用SDS-PAGE在各時間點觀測反應進展(圖6A及圖6B)。類似於Tau分解分析，RseA譜帶強度對於除BM1及BM2對照之外的所有反應隨時間推移減弱(圖6A)。藉由SR8047-44、SR8047-43、SR8047-17及SR8047-42抗體觀測到更高抑制程度，表明此等特定抗體可為HTRA1介導之RseA之蛋白分解之更有效抑制劑。
E. β- 酪蛋白分解分析 使用與上文所利用類似的SDS-PAGE篩選進一步篩選抗體抑制HTRA1介導之β-酪蛋白之蛋白分解的能力。在含有50 mM Tris pH 8.0及150 mM NaCl之緩衝液中製備含有StrepII-ΔMac-HTRA1 (100 nM)及抗HTRA1抗體(600 nM)之反應溶液。使此等反應溶液在37℃下培育15分鐘。在培育之後，在37℃及300 rpm下添加β-酪蛋白(2 μM)後開始反應。藉由用SDS-PAGE凝膠裝載緩衝液及DTT (1 M)淬滅反應樣本以在0、5及30分鐘處取得反應時間點。使用SDS-PAGE在各時間點觀測反應進展(圖7A及圖7B)。除對照反應(BM1及BM2；圖7B)以外，未針對任何反應觀測到β-酪蛋白譜帶強度之減弱，表明抗體中無一者能夠有效地抑制HTRA1介導之β-酪蛋白之蛋白分解。
F. HTRA1 抗體及片段篩選之概述 所彙集分析資料(圖8)揭露SR8047-44及SR8047-43能夠在除β-酪蛋白分解分析之外的所有篩選中抑制HTRA1。此等資料表明，SR8047-44及SR8047-43抗體為HTRA1蛋白分解活性之兩個最有效抑制劑。為測定此等抗體之關鍵片段是否將有效地在分離中起作用，各抗體之Fab區經分離且針對彈性蛋白分析進行篩選(圖9A)。SR8047-43及SR8047-44抗HTRA1 Fab片段產生與其抗HTRA1 IgG對應物幾乎相等的蛋白分解減少(圖9A)。在不存在抗體之情況下， SR8047-43及SR8047-44 Fab片段及IgG之V max 大致等於HTRA1之V max (圖9B)。綜合而言，此等篩選分析中產生的資料突出顯示SR8047-43及SR8047-44 (無論作為全長抗體或作為抗體片段)有效地抑制HTRA1之蛋白酶活性的能力。
引用式併入 本文提及之所有公開案及專利均以全文引用的方式併入本文中，如同各個別公開案或專利具體地且獨立地以引用之方式併入本文中。
雖然已論述本發明之特定實施例，但以上說明書為例示性而非限制性的。熟習此項技術者在審閱本說明書及以下申請專利範圍時將顯而易知許多變化形式。本發明之完整範疇以及其等效物之完整範疇，及說明書，以及此等變化形式，應參照申請專利範圍確定。序列表 SEQ ID NO: 1— SR8047-06 HCDR1胺基酸序列 LSFSNYAMS SEQ ID NO: 2— SR8047-06 HCDR2胺基酸序列 SGISGSGSNTYYA SEQ ID NO: 3— SR8047-06 HCDR3胺基酸序列 CARQPGITMVRGGHYGMDVW SEQ ID NO: 4— SR8047-06 LCDR1胺基酸序列 QASQDISTYLN SEQ ID NO: 5— SR8047-06 LCDR2胺基酸序列 EASALQS SEQ ID NO: 6— SR8047-06 LCDR3胺基酸序列 CQQSYTTPLTF SEQ ID NO: 7— SR8047-08 HCDR1胺基酸序列 YMFTAYYIH SEQ ID NO: 8— SR8047-08 HCDR2胺基酸序列 GWMNPNSGDTGYA SEQ ID NO: 9— SR8047-08 HCDR3胺基酸序列 CVNPYNWNDRDYW SEQ ID NO: 10— SR8047-08 LCDR1胺基酸序列 RASQAIYSYLA SEQ ID NO: 11— SR8047-08 LCDR2胺基酸序列 DASSLES SEQ ID NO: 12— SR8047-08 LCDR3胺基酸序列 CLQHNTYPYTF SEQ ID NO: 13— SR8047-12 HCDR1胺基酸序列 YSFTSQYMH SEQ ID NO: 14— SR8047-12 HCDR2胺基酸序列 GGIIPIFGTANYA SEQ ID NO: 15— SR8047-12 HCDR3胺基酸序列 CAREEYSSSLGDYYYYYMDVW SEQ ID NO: 16— SR8047-12 LCDR1胺基酸序列 QASQDISNYLN SEQ ID NO: 17— SR8047-12 LCDR2胺基酸序列 AASRLQG SEQ ID NO: 18— SR8047-12 LCDR3胺基酸序列 CQQATSFPFTF SEQ ID NO: 19— 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SR8047-18 LCDR1胺基酸序列 RASQDIRNYLA SEQ ID NO: 41— SR8047-18 LCDR2胺基酸序列 QASSLES SEQ ID NO: 42— SR8047-18 LCDR3胺基酸序列 CLQHNSYPFTF SEQ ID NO: 43— SR8047-20 HCDR1胺基酸序列 FIFYDYAMQ SEQ ID NO: 44— SR8047-20 HCDR2胺基酸序列 SSISPSSSYIYYA SEQ ID NO: 45— SR8047-20 HCDR3胺基酸序列 CTRGGYDYGDHW SEQ ID NO: 46— SR8047-20 LCDR1胺基酸序列 RASQGISGYLA SEQ ID NO: 47— SR8047-20 LCDR2胺基酸序列 DASSLET SEQ ID NO: 48— SR8047-20 LCDR3胺基酸序列 CLQHDSYPFTF SEQ ID NO: 49— SR8047-21 HCDR1胺基酸序列 GTFRRYLNN SEQ ID NO: 50— SR8047-21 HCDR2胺基酸序列 GIINPSGGSSSYA SEQ ID NO: 51— SR8047-21 HCDR3胺基酸序列 CARDGGTEGYW SEQ ID NO: 52— SR8047-21 LCDR1胺基酸序列 RASQGISSYLA SEQ ID NO: 53— SR8047-21 LCDR2胺基酸序列 DGSTLET SEQ ID NO: 54— SR8047-21 LCDR3胺基酸序列 CLQHSTYPHTF SEQ ID NO: 55— SR8047-22 HCDR1胺基酸序列 GTFTTYYMQ SEQ ID NO: 56— SR8047-22 HCDR2胺基酸序列 GWINPNSGGTNYA SEQ ID NO: 57— SR8047-22 HCDR3胺基酸序列 CARGQYSSSWYYMDVW SEQ ID NO: 58— SR8047-22 LCDR1胺基酸序列 RASQSISSYLN SEQ ID NO: 59— SR8047-22 LCDR2胺基酸序列 AASSLQS SEQ ID NO: 60— SR8047-22 LCDR3胺基酸序列 CQQSYMTPLTF SEQ ID NO: 61— SR8047-23 HCDR1胺基酸序列 YTLTTWYMQ SEQ ID NO: 62— SR8047-23 HCDR2胺基酸序列 GWMNPNSGDTGYA SEQ ID NO: 63— SR8047-23 HCDR3胺基酸序列 CARAWNLDHSGYDERDYYYGMDVW SEQ ID NO: 64— SR8047-23 LCDR1胺基酸序列 QASQDISNYLN SEQ ID NO: 65— SR8047-23 LCDR2胺基酸序列 AASSLHS SEQ ID NO: 66— SR8047-23 LCDR3胺基酸序列 CQQSYDTPFTF SEQ ID NO: 67— SR8047-25 HCDR1胺基酸序列 FTFSNYWMH SEQ ID NO: 68— SR8047-25 HCDR2胺基酸序列 SALSGSGGSTYYA SEQ ID NO: 69— SR8047-25 HCDR3胺基酸序列 CARGGLDYDGVYYYGMDVW SEQ ID NO: 70— SR8047-25 LCDR1胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD SEQ ID NO: 71— SR8047-25 LCDR2胺基酸序列 AASSLQS SEQ ID NO: 72— SR8047-25 LCDR3胺基酸序列 CMQALQIPLTF SEQ ID NO: 73— SR8047-28 HCDR1胺基酸序列 YTFTNYYMH SEQ ID NO: 74— SR8047-28 HCDR2胺基酸序列 GGIIPIFGTANYA SEQ ID NO: 75— SR8047-28 HCDR3胺基酸序列 CARPSSGWSNYDYW SEQ ID NO: 76— SR8047-28 LCDR1胺基酸序列 RASQDISSYLV SEQ ID NO: 77— SR8047-28 LCDR2胺基酸序列 DASNLET SEQ ID NO: 78— SR8047-28 LCDR3胺基酸序列 CLQHNSYPFTF SEQ ID NO: 79— SR8047-31 HCDR1胺基酸序列 YPFIGQYLH SEQ ID NO: 80— SR8047-31 HCDR2胺基酸序列 GWMNPNSGNTGYA SEQ ID NO: 81— SR8047-31 HCDR3胺基酸序列 CARGRYGSGSYSYYFDYW SEQ ID NO: 82— SR8047-31 LCDR1胺基酸序列 RASQSISTYLN SEQ ID NO: 83— SR8047-31 LCDR2胺基酸序列 GASSLQS SEQ ID NO: 84— SR8047-31 LCDR3胺基酸序列 CQQGYSTPLTF SEQ ID NO: 85— SR8047-36 HCDR1胺基酸序列 FTFSNSDMN SEQ ID NO: 86— SR8047-36 HCDR2胺基酸序列 SYISSSSRYIYYA SEQ ID NO: 87— SR8047-36 HCDR3胺基酸序列 CAKDGPAVVTPIDYW SEQ ID NO: 88— SR8047-36 LCDR1胺基酸序列 KSSQSVLSSSNNKNYLA SEQ ID NO: 89— SR8047-36 LCDR2胺基酸序列 WASTRES SEQ ID NO: 90— SR8047-36 LCDR3胺基酸序列 CHQYYSTPYTF SEQ ID NO: 91— SR8047-38 HCDR1胺基酸序列 YTFTDYYVH SEQ ID NO: 92— SR8047-38 HCDR2胺基酸序列 GWMNPNSGNTGYA SEQ ID NO: 93— SR8047-38 HCDR3胺基酸序列 CAKGVWDFSYYLDYW SEQ ID NO: 94— SR8047-38 LCDR1胺基酸序列 RASQNIGYYLN SEQ ID NO: 95— SR8047-38 LCDR2胺基酸序列 SASTLQR SEQ ID NO: 96— SR8047-38 LCDR3胺基酸序列 CQQSYSTPLTF SEQ ID NO: 97— SR8047-40 HCDR1胺基酸序列 YTFTNYGFN SEQ ID NO: 98— SR8047-40 HCDR2胺基酸序列 GLINLSDGNTMYA SEQ ID NO: 99— SR8047-40 HCDR3胺基酸序列 CVKAGYSSGWYAGYFQHW SEQ ID NO: 100— SR8047-40 LCDR1胺基酸序列 RSSQSLLHSNGYNYLD SEQ ID NO: 101— SR8047-40 LCDR2胺基酸序列 LGSNRAS SEQ ID NO: 102— SR8047-40 LCDR3胺基酸序列 CMQALQTPLTF SEQ ID NO: 103— SR8047-42 HCDR1胺基酸序列 GTFSSYAIS SEQ ID NO: 104— SR8047-42 HCDR2胺基酸序列 GWMNPNSGATGYA SEQ ID NO: 105— SR8047-42 HCDR3胺基酸序列 CASGDGWFDYW SEQ ID NO: 106— SR8047-42 LCDR1胺基酸序列 RASQYIGSWLA SEQ ID NO: 107— SR8047-42 LCDR2胺基酸序列 AASSLQS SEQ ID NO: 108— SR8047-42 LCDR3胺基酸序列 CQQYYNSPITF SEQ ID NO: 109— SR8047-43 HCDR1胺基酸序列 YTFTSQYMH SEQ ID NO: 110— SR8047-43 HCDR2胺基酸序列 GGIIPIFPTPDYA SEQ ID NO: 111— SR8047-43 HCDR3胺基酸序列 CARESSSSGPDGAFDIW SEQ ID NO: 112— SR8047-43 LCDR1胺基酸序列 RASQSINHWLA SEQ ID NO: 113— SR8047-43 LCDR2胺基酸序列 AASSLQS SEQ ID NO: 114— SR8047-43 LCDR3胺基酸序列 CQQSYSIPLTF SEQ ID NO: 115— SR8047-44 HCDR1胺基酸序列 YTFTSYYMH SEQ ID NO: 116— SR8047-44 HCDR2胺基酸序列 GIINPSGGSTSYA SEQ ID NO: 117— SR8047-44 HCDR3胺基酸序列 CARDGVDYYMDVW SEQ ID NO: 118— SR8047-44 LCDR1胺基酸序列 QASQDISNYLN SEQ ID NO: 119— SR8047-44 LCDR2胺基酸序列 DASNLET SEQ ID NO: 120— SR8047-44 LCDR3胺基酸序列 CQQSYSTPLTF SEQ ID NO: 121—人類HTRA1胺基酸序列- GenBank存取號NP_002766.1 MQIPRAALLPLLLLLLAAPASAQLSRAGRSAPLAAGCPDRCEPARCPPQPEHCEGGRARDACGCCEVCGAPEGAACGLQEGPCGEGLQCVVPFGVPASATVRRRAQAGLCVCASSEPVCGSDANTYANLCQLRAASRRSERLHRPPVIVLQRGACGQGQEDPNSLRHKYNFIADVVEKIAPAVVHIELFRKLPFSKREVPVASGSGFIVSEDGLIVTNAHVVTNKHRVKVELKNGATYEAKIKDVDEKADIALIKIDHQGKLPVLLLGRSSELRPGEFVVAIGSPFSLQNTVTTGIVSTTQRGGKELGLRNSDMDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVTAGISFAIPSDKIKKFLTESHDRQAKGKAITKKKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVISGAYIIEVIPDTPAEAGGLKENDVIISINGQSVVSANDVSDVIKRESTLNMVVRRGNEDIMITVIPEEIDP SEQ ID NO: 122— FLAG DYKDDDDK SEQ ID NO: 123—聚組胺酸 HHHHHH SEQ ID NO: 124—血細胞凝集素 YPYDVPDYA
SEQ ID NO 純系 VH序列
125 SR8047-06 EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGLSFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQPGITMVRGGHYGMDVWGQGTTVTVSS
126 SR8047-08 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTAYYIHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGDTGYAQKFQARVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVNPYNWNDRDYWGQGTLVTVSS
127 SR8047-12 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEYSSSLGDYYYYYMDVWGKGTTVTVSS
128 SR8047-14 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASWAGVDDYWGQGTLVTVSS
129 SR8047-16 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRQYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAVLGYFDYWGQGTLVTVSS
130 SR8047-17 EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDQYMSWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDEFDDGDYEDYWGQGTLVTVSS
131 SR8047-18 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTSSAMQWVRQAPGQGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCALDGYNFWGQGTLVTVSS
132 SR8047-20 EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFYDYAMQWVRQAPGKGLEWVSSISPSSSYIYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRGGYDYGDHWGQGTLVTVSS
133 SR8047-21 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFRRYLNNWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSSSYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGGTEGYWGQGTLVTVSS
134 SR8047-22 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFTTYYMQWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGQYSSSWYYMDVWGKGTTVTVSS
135 SR8047-23 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTTWYMQWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGDTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAWNLDHSGYDERDYYYGMDVWGQGTTVTVSS
136 SR8047-25 EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMHWVRQAPGKGLEWVSALSGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLDYDGVYYYGMDVWGQGTTVTVSS
137 SR8047-28 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYMHWLRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPSSGWSNYDYWGQGTLVTVSS
138 SR8047-31 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGRYGSGSYSYYFDYWGQGTLVTVSS
139 SR8047-36 QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSRYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGPAVVTPIDYWGQGTLVTVSS
140 SR8047-38 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYVHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGVWDFSYYLDYWGQGTLVTVSS
141 SR8047-40 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYGFNWVRQAPGQGLEWMGLINLSDGNTMYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVKAGYSSGWYAGYFQHWGQGTLVTVSS
142 SR8047-42 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGATGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASGDGWFDYWGQGTLVTVSS
143 SR8047-43 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFPTPDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARESSSSGPDGAFDIWGQGTMVTVSS
144 SR8047-44 QVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQTFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVDYYMDVWGKGTTVTVSS
SEQ ID NO 純系 VL序列
145 SR8047-06 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYEASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPLTFGGGTKVEIK
146 SR8047-08 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPYTFGQGTKLEIK
147 SR8047-12 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQATSFPFTFGPGTKVDIK
148 SR8047-14 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNTYPFTFGPGTKVDIK
149 SR8047-16 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
150 SR8047-17 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLEPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNTYPFTFGPGTKVDIK
151 SR8047-18 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYQASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPFTFGGGTKVEIK
152 SR8047-20 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISGYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHDSYPFTFGPGTKVDIK
153 SR8047-21 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDGSTLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHSTYPHTFGPGTKVDIK
154 SR8047-22 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYMTPLTFGGGTKVEIK
155 SR8047-23 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYDTPFTFGPGTKVDIK
156 SR8047-25 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYAASSLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQIPLTFGGGTKVEIK
157 SR8047-28 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLVWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPFTFGQGTKVEIK
158 SR8047-31 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPLTFGGGTKLEIK
159 SR8047-36 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYYSTPYTFGQGTKLEIK
160 SR8047-38 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGYYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
161 SR8047-40 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK
162 SR8047-42 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNSPITFGQGTKVEIK
163 SR8047-43 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINHWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGSTKVEIK
164 SR8047-44 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGRTKVEIK
圖1提供針對各種特定抗HTRA1抗體/抗原結合片段純系之來自實例1的實驗性總結資料。 圖2提供圖1中提及之純系的重鏈及輕鏈CDR胺基酸序列。 圖3A及圖3B為展示FAM標記之彈性蛋白之HTRA1介導之蛋白分解隨時間推移在存在及不存在抗HTRA1單株抗體(mAb)之情況下的圖式。蛋白分解藉由相對螢光單位(relative fluorescence unit；RFU)隨時間推移之增加來指示。圖3C展示概述圖3A及圖3B相對於無抗體HTRA1陽性對照反應之結果的柱狀圖。用於此分析中之重組HTRA1含有StrepII親和標籤且缺失HTRA1 N端Mac結構域(StrepII-ΔMac-HTRA1)。抗體分配係如下：71= SR8047-38；72= SR8047-40；73= SR8047-17；74= SR8047-44；76= BM1；77= SR8047-43；78= SR8047-31；79= SR8047-06；80= SR8047-42；82= BM2。 圖4A展示纖蛋白5之StrepII-ΔMac-HTRA1介導之蛋白分解在存在及不存在抗HTRA1 mAb之情況下歷經22小時之時程的四個時間點的西方墨點凝膠影像(Western Blot gel image)。各蛋白分解反應展示為12% SDS-PAGE凝膠上之泳道。各反應之含量列表於凝膠上方。在各泳道中，展示表示纖蛋白5、抗HTRA1 mAb重鏈、HTRA1及抗HTRA1 mAb輕鏈之譜帶。圖4B展示使各抗HTRA1 mAb與圖4A之凝膠中所指示之其各別數目相關聯的彙總表。 圖5A展示Tau之StrepII-ΔMac-HTRA1介導之蛋白分解在存在及不存在抗HTRA1 mAb之情況下歷經22小時之時程的三個時間點的西方墨點凝膠影像。各蛋白分解反應展示為12% SDS-PAGE凝膠上之泳道。各反應之含量列表於凝膠上方。在各泳道中，展示表示Tau、抗HTRA1 mAb重鏈、HTRA1及抗HTRA1 mAb輕鏈之譜帶。圖5B展示使各抗HTRA1 mAb與圖5A之凝膠中所指示之其各別數目相關聯的彙總表。 圖6A展示RseA之StrepII-ΔMac-HTRA1介導之蛋白分解在存在及不存在抗HTRA1 mAb之情況下歷經七小時之時程的三個時間點的西方墨點凝膠影像。各蛋白分解反應展示為12% SDS-PAGE凝膠上之泳道。各反應之含量列表於凝膠上方。在各泳道中，展示表示抗HTRA1 mAb重鏈、HTRA1、抗HTRA1 mAb輕鏈及RseA之譜帶。圖6B展示使各抗HTRA1 mAb與圖6A之凝膠中所指示之其各別數目相關聯的彙總表。 圖7A展示β-酪蛋白之StrepII-ΔMac-HTRA1介導之蛋白分解在存在及不存在抗HTRA1 mAb之情況下歷經三十分鐘之時程的三個時間點的西方墨點凝膠影像。各蛋白分解反應展示為12% SDS-PAGE凝膠上之泳道。各反應之含量列表於凝膠上方。在各泳道中，展示表示抗HTRA1 mAb重鏈、HTRA1、β-酪蛋白及抗HTRA1 mAb輕鏈之譜帶。圖7B展示使各抗HTRA1 mAb與圖7A之凝膠中所指示之其各別數目相關聯的彙總表。 圖8為概述各HTRA1蛋白分解分析與其各別抗HTRA1抗體名稱及批次號相關的結果。在第2行中，針對所使用之各抗體相對於無抗體HTRA1陽性對照反應展示彈性蛋白蛋白分解之抑制百分比。β-酪蛋白、Tau、RseA或纖蛋白5蛋白分解之抑制由+表示。低於或高於蛋白分解之平均抑制分別地由+/-或++表示。不抑制蛋白分解由-表示。抗HTRA1 SR8047-23 mAb活化Tau之StrepII-ΔMac-HTRA1介導之蛋白分解，且此效果指示為「活化」。 圖9A為展示FAM標記之彈性蛋白之StrepII-ΔMac-HTRA1介導之蛋白分解隨時間推移在存在及不存在抗HTRA1 Fab抗體片段或抗HTRA1 IgG抗體之情況下的圖式。蛋白分解藉由相對螢光單位(RFU)隨時間推移之增加來指示。圖9B展示針對圖9A中展示之各反應的V max 之圖式。

Claims (65)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，其結合於HTRA1蛋白質或其功能片段。
  2. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其中該HTRA1蛋白質為人類HTRA1蛋白質或其功能片段。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該HTRA1蛋白質包含與SEQ ID NO:121之胺基酸序列或其功能片段至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段能夠抑制任何一或多種HTRA1功能。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中相較於在不存在該HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中相較於在不存在該HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在相同細胞類型中之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制細胞中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中相較於在不存在該HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下野生型HTRA1蛋白質在另一隻眼睛中之蛋白分解活性，該抗體或其抗原結合片段能夠抑制任何眼睛中HTRA1蛋白分解活性達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
  8. 如請求項1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠減小HTRA1裂解任何一或多種HTRA1受質之能力。
  9. 如請求項8之抗體或其抗原結合片段，其中該HTRA1受質選自由以下組成之群：纖調蛋白、彈性蛋白、群集素、ADAM9、玻連蛋白、α2-巨球蛋白、踝蛋白-1、肌成束蛋白、LTBP-1、EFEMP1、纖蛋白5、tau、RseA及氯化物胞內通道蛋白。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠抑制HTRA1裂解補體級聯之調節子(例如，玻連蛋白、纖調蛋白或群集素)之能力。
  11. 如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中相較於在不存在該抗HTRA1抗體或其抗原結合片段之情況下該HTRA1裂解該HTRA1受質及/或該補體級聯之調節子的能力，該抗體或抗原結合片段能夠抑制HTRA1以使得HTRA1裂解HTRA1受質及/或該補體級聯之調節子的能力降低達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠抑制該HTRA1蛋白質三聚之能力。
  13. 如請求項12之抗體或抗原結合片段，其中相較於在不存在該抗體或抗原結合片段之情況下該HTRA1蛋白質三聚之能力，該抗體或抗原結合片段能夠抑制該HTRA1蛋白質三聚之能力達至少5%、10%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含圖2中所指示的CDR序列中之任一者或其組合。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 1-120之CDR胺基酸序列中之任一者或其任何組合。
  16. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為以下集合中之任一者的CDR集合：SEQ ID NO: 1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72、73-78、79-84、85-90、91-96、97-102、103-108、109-114或115-120。
  17. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 1-6之該等CDR。
  18. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 7-12之該等CDR。
  19. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 19-24之該等CDR。
  20. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 31-36之該等CDR。
  21. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 37-42之該等CDR。
  22. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 61-66之該等CDR。
  23. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 73-78之該等CDR。
  24. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 103-108之該等CDR。
  25. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 109-114之該等CDR。
  26. 如請求項1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為SEQ ID NO: 115-120之該等CDR。
  27. 如請求項1至13中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 1-120之該等胺基酸序列中之任一者或組合，但其中該等胺基酸序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個胺基酸取代。
  28. 如請求項1至13中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含闡述為以下集合中之任一者的CDR集合：SEQ ID NO: 1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72、73-78、79-84、85-90、91-96、97-102、103-108、109-114或115-120，但其中該等胺基酸序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個胺基酸取代。
  29. 如請求項27或28之抗體或抗原結合片段，其中該等取代為保守性取代。
  30. 如請求項27至29中任一項之抗體或抗原結合片段，其中相較於缺乏該等取代之該抗體或抗原結合片段，該等取代增加該抗體或抗原結合片段對HTRA1抗原決定基之結合親和力，或該等取代造成結合親和力減小不超過5%、10%、20%、30%、40%或50%。
  31. 如請求項1至30中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段為全長抗體。
  32. 如請求項31之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段為單株抗體。
  33. 如請求項31或32之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段為人類化抗體。
  34. 如請求項1至30中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段為其抗原結合片段。
  35. 如請求項34之抗體或抗原結合片段，其中該抗原結合片段為scFv。
  36. 如請求項34之抗體或抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自由以下組成之群：Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、dAb片段及/或dsFv。
  37. 如請求項1至36中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合於以下HTRA1結構域中之一或多者：類胰島素生長因子結合結構域、kazal結構域、類胰蛋白酶肽酶結構域及/或PDZ結構域。
  38. 如請求項1至37中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠結合於非人類物種HTRA1。
  39. 如請求項1至38中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該非人類物種HTRA1為小鼠、大鼠、家兔、母牛、猴(例如，食蟹獼猴)或猿(例如，黑猩猩) HTRA1蛋白質。
  40. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至39之抗體或抗原結合片段中之任一者之該抗體或抗原結合片段。
  41. 一種載體，其包含如請求項40之聚核苷酸。
  42. 一種宿主細胞，其包含如請求項41之載體且能夠表現該聚核苷酸。
  43. 一種宿主細胞，其表現編碼如請求項1至39之抗體或抗原結合片段的一或多種聚核苷酸。
  44. 一種治療有需要之個體之疾病或病症之方法，其中該疾病或病症與異常表現之HTRA1相關聯，其中該方法包含向該個體投與如請求項1至39中任一項之抗體或抗原結合片段。
  45. 一種治療有需要之個體之疾病或病症之方法，其中相較於未患該疾病或病症之對照個體之水準，HTRA1以大至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%或500%的水準表現於患有該疾病或病症之該個體中，其中該方法包含向該個體投與如請求項1至39中任一項之抗體或抗原結合片段。
  46. 一種治療有需要之個體之年齡相關黃斑變性或息肉狀脈絡膜血管病變之方法，其中該疾病或病症與異常表現之HTRA1相關聯，其中該方法包含向該個體投與如請求項1至39中任一項之抗體或抗原結合片段。
  47. 如請求項45之方法，其中該對照個體為與患有該疾病或病症之該個體具有相同性別及/或具有類似年齡的個體。
  48. 如請求項44至47中任一項之方法，其中該個體在HTRA1基因中具有一或多個突變。
  49. 如請求項48之方法，其中該一或多個突變並未在該HTRA1基因之編碼序列中。
  50. 如請求項48之方法，其中該一或多個突變在人類個體中之10q26中。
  51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該一或多個突變對應於人類個體中之以下多態性中之任何一或多者：rs61871744；rs59616332；rs11200630；rs61871745；rs11200632；rs11200633；rs61871746；rs61871747；rs370974631；rs200227426；rs201396317；rs199637836；rs11200634；rs75431719；rs10490924；rs144224550；rs36212731；rs36212732；rs36212733；rs3750848；rs3750847；rs3750846；rs566108895；rs3793917；rs3763764；rs11200638；rs1049331；rs2293870；rs2284665；rs60401382；rs11200643；rs58077526；rs932275及/或rs2142308。
  52. 如請求項44至51中任一項之方法，其中該個體具有年齡相關黃斑變性。
  53. 如請求項44至51中任一項之方法，其中該個體為人類。
  54. 如請求項53之方法，其中該人類為至少40歲。
  55. 如請求項53之方法，其中該人類為至少50歲。
  56. 如請求項53之方法，其中該人類為至少65歲。
  57. 如請求項44至56中任一項之方法，其中局部投與該抗體或抗原結合片段。
  58. 如請求項44至56中任一項之方法，其中玻璃體內投與該抗體或抗原結合片段。
  59. 如請求項44至56中任一項之方法，其中視網膜下投與該抗體或抗原結合片段。
  60. 如請求項44至56中任一項之方法，其中全身性投與該抗體或抗原結合片段。
  61. 如請求項44至56中任一項之方法，其中該個體患有息肉狀脈絡膜血管病變。
  62. 如請求項44至61中任一項之方法，其中該個體患有濕性AMD。
  63. 如請求項44至62中任一項之方法，其中該個體患有乾性AMD。
  64. 一種組合物，其包含如請求項1至39中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
  65. 如請求項62之組合物，其中該組合物實質上無熱原質。
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