ES2870141T3

ES2870141T3 - Anticuerpos anti-HtrA1 y procedimientos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2870141T3
Application number: ES16794157T
Authority: ES
Inventors: Robert Kelley; Daniel Kirchhofer; Joyce Lai; Chingwei Lee; Wei-Ching Liang; Michael Lipari; Kelly Loyet; Tao Sai; Lookeren Campagne Menno Van; Yan Wu; Germaine Fuh
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2036-10-27
Also published as: KR20190131624A; CA3088612A1; CA3001362C; TW201722992A; TWI747850B; US20170145113A1; US11512143B2; CA3001362A1; DK3368578T3; MX2022002954A; EP3368578A1; RU2021117293A; IL258627A; US20230383008A1; MA43113A; AU2019204537A1; HRP20210736T1; RU2018119014A; SI3368578T1; JP2019506135A

Abstract

Un anticuerpo humanizado monoclonal aislado que se une específicamente a HtrA1, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-HtrA1 y procedimientos de uso de los mismos

Campo de la invención

La invención se refiere, en general, a anticuerpos anti-HtrA1 y procedimientos de uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

La serina proteasa serina peptidasa HtrA 1 (HtrA1) (PRSS11; clan PA, familia 51) pertenece a una familia conservada evolutivamente de proteínas HtrA. En los seres humanos, HtrA1, HtrA3 y HtrA4 comparten la misma arquitectura de dominios: un módulo similar a IGFBP N terminal y un módulo similar a Kazal, un dominio proteasa con pliegue similar a tripsina y un dominio PDZ C terminal. La pertinencia fisiológica de HtrA1 se ha establecido firmemente por la identificación de mutaciones humanas con pérdida de función que provocan microangiopatía cerebral isquémica hereditaria. El mecanismo molecular implica una inhibición de TGFp insuficiente por HtrAI, lo que da como resultado una señalización de TGFp incrementada. La señalización de TGFp regulada incorrectamente por la expresión de HtrA1 anómala también puede contribuir a la enfermedad artrítica, quizás junto con la degradación mediada por HtrA1 de diversos componentes de la matriz extracelular, o indirectamente por medio de la regulación por incremento de las metaloproteasas de la matriz. Además, los estudios genéticos en seres humanos identificaron una fuerte correlación entre la evolución de la degeneración macular senil (DMS) y un SNP en la región promotora de HtrA1 que da como resultado niveles transcritos de HtrA1 incrementados (véanse, por ejemplo, Dewan et al., Science 314:989-992, 2006 y Yang et al., Science 314:992-993, 2006).

La DMS es una enfermedad crónica progresiva de la retina central con consecuencias significativas para la agudeza visual. Las formas tardías de la enfermedad son la causa principal de pérdida de visión en los países industrializados. Para la población de raza blanca > 40 años, la prevalencia de DMS temprana se estima en aproximadamente un 6,8 % y DMS avanzada en aproximadamente un 1,5 %. La prevalencia de DMS tardía se incrementa drásticamente con la edad, ascendiendo a aproximadamente un 11,8 % después de los 80 años. Existen dos tipos de DMS, DMS no exudativa (seca) y exudativa (húmeda). La DMS seca más común implica cambios atróficos e hipertróficos en el epitelio pigmentario retiniano (EPR) subyacente a la retina central (mácula), así como depósitos (drusas) en el EPR. La DMS seca avanzada puede dar como resultado un daño retiniano significativo, incluyendo atrofia geográfica (AG), con pérdida de visión irreversible. Además, los pacientes con DMS seca pueden evolucionar a la forma húmeda, en la que se desarrollan vasos sanguíneos anómalos llamados membranas neovasculares coroideas (MNVC) debajo de la retina, expulsan líquido y sangre y, finalmente, provocan una cicatriz disciforme que conduce a ceguera en y debajo de la retina. El documento WO 2013/055998 A1 divulga anticuerpos anti-HtrA1 y procedimientos de uso de los mismos.

Sigue existiendo la necesidad de obtener anticuerpos anti-HtrA1 con propiedades mejoradas, tales como afinidad de unión, estabilidad y actividad inhibidora (bloqueante), así como usos terapéuticos y de diagnóstico de los mismos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos anti-HtrA1 y procedimientos de uso de los mismos con propósitos terapéuticos y de diagnóstico. Los anticuerpos anti-HtrA1 de la invención son altamente potentes y tienen una alta afinidad de unión por HtrA1. Las propiedades mejoradas de los anticuerpos de la invención los hacen adecuados para su uso en el tratamiento.

En un aspecto de la invención, la invención presenta un anticuerpo humanizado monoclonal aislado que se une específicamente a HtrA1, en el que el anticuerpo comprende un dominio de unión que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a HtrA1. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFV y (Fab')². En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo es un Fab. En algunos modos de realización, el Fab comprende un truncamiento en la región bisagra de la región constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, el Fab comprende un truncamiento en la bisagra superior de la región constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada termina en la posición 221 (numeración EU). En algunos modos de realización, el residuo de aminoácido en la posición 221 es un residuo de ácido aspártico (Asp). En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 160. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 159. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 160 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 159.

En algunos modos de realización, el Fab es un Fab de IgG1.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. En algunos modos de realización, el anticuerpo biespecífico comprende un segundo dominio de unión que se une al factor D.

En otro aspecto, la invención presenta un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En otro aspecto, la invención presenta un vector (por ejemplo, un vector de expresión) que comprende el ácido nucleico aislado para expresar el anticuerpo. En otro aspecto, la invención presenta células huésped que comprenden los ácidos nucleicos y/o vectores precedentes. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos modos de realización, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula 293. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula procariota. En algunos modos de realización, la célula procariota es E. coli.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento de producción de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores precedentes (por ejemplo, vectores de expresión) en un medio de cultivo. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped o del medio de cultivo.

En otro aspecto, la invención presenta una composición que comprende uno cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunos modos de realización, la composición comprende además un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunos modos de realización, la composición es una composición farmacéutica. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica está liofilizada. En algunos modos de realización, la composición comprende además un antagonista de unión al factor D. En algunos modos de realización, el antagonista de unión al factor D es un anticuerpo anti factor D o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos modos de realización, el fragmento de unión a antígeno es un Fab o un (Fab')². En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti factor D es lampalizumab.

En otro aspecto, la invención engloba una formulación terapéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes y un antagonista del factor D. En un modo de realización particular, el antagonista del factor D es un anticuerpo anti factor D. En un modo de realización particular, el antagonista del factor D es lampalizumab. En un modo de realización particular, el antagonista anti factor D se administra secuencialmente.

En algunos aspectos, se puede usar uno cualquiera de los anticuerpos precedentes como medicamento.

En algunos aspectos, se puede usar uno cualquiera de los anticuerpos precedentes en el tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1 o un trastorno ocular. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética, retinopatía del prematuro o vasculopatía coroidea polipoidea. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es DMS. En algunos modos de realización, la DMS es DMS seca temprana, DMS seca intermedia o DMS seca avanzada. En algunos modos de realización, la DMS seca avanzada es atrofia geográfica.

En algunos aspectos, se puede usar uno cualquiera de los anticuerpos precedentes en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno asociado con HtrA1 o un trastorno ocular. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es DMS, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro o vasculopatía coroidea polipoidea. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es DMS. En algunos modos de realización, la DMS es DMS seca temprana, DMS seca intermedia o DMS seca avanzada. En algunos modos de realización, la DMS seca avanzada es atrofia geográfica. En algunos modos de realización, el medicamento se formula para su uso en combinación con un antagonista de unión al factor D. En algunos modos de realización, el antagonista de unión al factor D es un anticuerpo anti factor D o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos modos de realización, el fragmento de unión a antígeno es un Fab o un (Fab')². En algunos modos de realización, el fragmento de unión a antígeno anti factor D es lampalizumab.

En otro aspecto, la invención presenta uno cualquiera de los anticuerpos precedentes para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1 o un trastorno ocular en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es DMS, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro o vasculopatía coroidea polipoidea. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es DMS. En algunos modos de realización, la DMS es DMS seca temprana, DMS seca intermedia o DMS seca avanzada. En algunos modos de realización, la DMS seca avanzada es atrofia geográfica. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además administrar un antagonista de unión al factor D.

En otro aspecto, la invención presenta uno cualquiera de los anticuerpos precedentes para su uso en un procedimiento para inhibir la degeneración retiniana o de las células fotorreceptoras en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes, inhibiendo, de este modo, la degeneración retiniana o de las células fotorreceptoras.

En otro aspecto, la invención presenta uno cualquiera de los anticuerpos precedentes para su uso en un procedimiento para inhibir la actividad serina proteasa de HtrA1 en el ojo de un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes, inhibiendo, de este modo, la actividad serina proteasa de HtrA1 en el ojo. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además administrar un antagonista de unión al factor D.

En otro aspecto, la invención presenta uno cualquiera de los anticuerpos precedentes para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1 o un trastorno asociado con el complemento en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de unión a HtrA1 y un antagonista de unión al factor D. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno asociado con el complemento es un trastorno ocular. En algunos modos de realización, el trastorno ocular se selecciona del grupo que consiste en DMS, retinopatía diabética, neovascularización coroidea (NVC), uveítis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de Von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena retiniana central, vascularización corneal y neovascularización retiniana. En algunos modos de realización, el trastorno ocular es DMS. En algunos modos de realización, la DMS es DMS seca temprana, DMS seca intermedia o DMS seca avanzada. En algunos modos de realización, la DMS seca avanzada es atrofia geográfica.

En otro aspecto, la invención presenta uno cualquiera de los anticuerpos precedentes para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1 o un trastorno asociado con el complemento en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes y una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de unión al factor D.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el antagonista de unión al factor D es un anticuerpo anti factor D o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos modos de realización, el fragmento de unión a antígeno es un Fab o un (Fab')². En algunos modos de realización, el fragmento de unión a antígeno anti factor D es lampalizumab.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el anticuerpo se administra por vía intravítrea, ocular, intraocular, yuxtaescleral, subtenoniana, supracoroidea, tópica, intravenosa, intramuscular, intradérmica, percutánea, intrarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intrarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intraperitoneal, peritoneal, intraventricular, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraorbital, oral, transdérmica, por inhalación, por inyección, por colirio, por implantación, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada bañando las células diana directamente, por catéter, por lavado, en cremas o en composiciones lipídicas. En algunos modos de realización, el anticuerpo se administra por vía intravítrea, ocular, intraocular, yuxtaescleral, subtenoniana, supracoroidea o tópica. En algunos modos de realización, el anticuerpo se administra por vía intravítrea por inyección. En algunos modos de realización, el anticuerpo se administra por vía tópica por colirio o pomada. En algunos modos de realización, el anticuerpo se administra por un sistema de administración de acción prolongada. En modos de realización particulares, el sistema de administración de acción prolongada es un implante sólido basado en PLGA o un sistema de administración por vía implantable.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el sujeto es un ser humano.

Breve descripción de los dibujos

Las FIGS. 1A-1B son gráficos que muestran que la mayoría de los clones de hibridoma positivos para el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) mostraron perfiles de reactividad similares con respecto al dominio proteasa (PD) de HtrA1 tanto humana (hu) como murina (mu). Los gráficos muestran la densidad óptica a 650 nm (DO650nm) para cada uno de los 75 clones indicados. La señal de fondo en este ensayo fue una DO650 nm < 0,05. Los dominios proteasa de HtrA1 humana y murina comparten un 91 % de homología.

La FIG. 2A es un diagrama esquemático de un ensayo de bloqueo usado para determinar la capacidad de los sobrenadantes de clones de hibridoma anti-HtrA1 indicados de inhibir la escisión mediada por HtrA1-PD de un sustrato fluorescente marcado con BODIPY® FL.

Las FIGS. 2B-2C son gráficos que muestran que 10 sobrenadantes de clones de hibridoma anti-HtrA1 inhibieron notablemente la escisión del sustrato mediada por HtrA1-PD humana usando el ensayo de bloqueo descrito en la fig. 2A y el ejemplo 1. Los gráficos muestran la señal fluorescente promedio (mili unidades fluorescentes relativas (mUFR)/min) para los sobrenadantes de hibridoma de los clones indicados. El anticuerpo YW505.94 (también denominado "94 IgG", véase la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2013/055998, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad) a 10 pg/ml en medios acondicionados (MA o medio acond.) sirvió como control positivo para demostrar que el ensayo no mostraba ningún cambio debido a los medios y es estable durante el tiempo de ensayo. El tampón o los medios sirvieron como controles negativos. La fig. 2C muestra los resultados iniciales y finales del ensayo para tampón, medio E (un medio rico en nutrientes de CLONACELL™) y medio acondicionado. Un 100 % indica una inhibición completa.

Las FIGS. 3A-3B son gráficos que muestran la capacidad de los sobrenadantes de hibridoma indicados de inhibir la escisión de un sustrato fluorescente por muHtrA1-PD (fig. 3A) o huHtrA1-PD (fig. 3B). En la fig. 3A, se usaron 40 nM de muHtrA1-PD en una proporción de 40 pl de muHtrA1-PD con respecto a 60 pl de sobrenadante de hibridoma. En la fig. 3B, se usaron 20 nM de huHtrA1-PD en una proporción de 40 pl de huHtrA1-PD con respecto a 60 pl de sobrenadante de hibridoma. El anticuerpo YW505.94 ("94 IgG") sirvió como control positivo. El tampón y los MA sirvieron como controles negativos.

La FIG. 4A es un diagrama esquemático de un ensayo de bloqueo basado en FRET usado para determinar la capacidad de los clones de anticuerpo anti-HtrA1 purificados de inhibir la escisión mediada por HtrA1-PD de un sustrato basado en FRET, H2-Opt.

Las FIGS. 4B-4C son gráficos que muestran que los clones de anticuerpo purificados 15H6, 19B12, 3A5, 12A5 y 20E2 retuvieron la capacidad de inhibir la escisión del sustrato mediada por HtrA1-PD murina (fig. 4B) y humana (fig. 4C). La adición de ningún anticuerpo ("sin ab") sirvió como control negativo, mientras que el anticuerpo YW505.94 ("94 IgG") sirvió como control positivo. Los anticuerpos purificados se añadieron a concentraciones de 5 nM, 50 nM o 500 nM. Se usaron 15 nM de muHtrA1-PD-Fc en el ensayo presentado en la fig. 4B, mientras que se usaron 3 nM de huHtrA1-PD-Fc en el ensayo presentado en la fig. 4C.

Las FIGS. 5A-5B son gráficos que muestran que los clones de anticuerpo mIgG purificados indicados inhiben la escisión mediada por HtrA1 humana de longitud completa (huHtrA1-FL) de un sustrato peptídico de FRET. El gráfico muestra la actividad (mUFR/min) como una función de la concentración de IgG. Se añadió huHtrA1-FL a una concentración de 5 nM. YW505.94 en formato IgG ("IgG94") y una variante quimérica del mismo ("IgG94-ch") como se describe en Cifferi et al. (2015) Biochem. J. 472(2):169-81 sirvieron como controles positivos. Se muestra la concentración inhibidora semimáxima (CI50) para cada clon de anticuerpo.

Las FIGS. 5C-5D son gráficos que muestran que los clones de anticuerpo mIgG purificados indicados inhiben la escisión mediada por muHtrA1-FL de un sustrato peptídico de FRET. El gráfico muestra la actividad (mUFR/min) como una función de la concentración de IgG. Se añadió muHtrA1-FL a 5 nM. IgG94 e IgG94-ch sirvieron como controles positivos como se describe en la descripción de las figuras para las figs. 5A y 5B. Se muestra la concentración inhibidora semimáxima (CI50).

La FIG. 6A muestra una alineación de secuencias de secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de los clones de anticuerpo 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 y 15H6.

La FIG. 6B muestra una alineación de secuencias de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de los clones de anticuerpo 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 y 15H6.

Las FIGS. 7A-7B son gráficos que muestran los resultados de un ensayo de bloqueo basado en FRET usando el clon 15H6 (fig. 7A) o el clon 19B12 (fig. 7B) de anticuerpo mIgG purificado del sobrenadante de hibridoma ("hib") o expresado de forma recombinante a partir de células 293 ("293"). Los gráficos representan Vmáx (mUFR/min) como una función de la concentración de anticuerpos (nM). Se usaron 3 nM de huHtrA1-FL en cada ensayo. También se muestran los valores de CI50 para los clones de anticuerpo indicados.

Las FIGS. 8A-8B muestran alineaciones de secuencias de las secuencias de aminoácidos de VL (fig. 8A) y VH (fig. 8B) de los clones de anticuerpo anti-HtrA1 m15H6, H15H6.v1, H15H6.v2 y h15H6.v2.APEG (también denominado en el presente documento "h15H6.v3") en comparación con la secuencia k1 (fig. 8A) o la secuencia de VH1 (fig. 8B) consenso humana. Las secuencias de HVR están delimitadas por los recuadros indicados para cada uno de los clones de anticuerpo. Las secuencias de HVR de acuerdo con la definición de Kabat están subrayadas. Los residuos mostrados en texto en blanco en los recuadros sombreados indican residuos que son diferentes entre la secuencia de VH1 consenso humana y los clones de anticuerpo anti-HtrA1.

Las FIGS. 9A-9D son gráficos que muestran los resultados del análisis por resonancia de plasmón superficial (RPS) en BIACORE™ de la unión de m15H6 o h15H6.v1 a HtrAI humana o murina biotinilada capturada con estreptavidina. Se empleó análisis de cinética de ciclo único. Los gráficos muestran las unidades de respuesta (UR) como una función del tiempo (s). La fig. 9A muestra los resultados de la unión de Fab m15H6 a huHtrA1. La fig. 9B muestra los resultados de la unión de Fab m15H6 a muHtrAI. La fig. 9C muestra los resultados de la unión de h15H6.v1 a huHtrA1. La fig. 9D muestra los resultados de la unión de h15H6.v1 a huHtrA1. Las Kas, Kdis y KD determinadas a partir de cada análisis se muestran como texto en el interior de cada gráfico.

Las FIGS. 10A-10B son gráficos que muestran los resultados de experimentos con ELISA de competencia con fagos para determinar la unión de las variantes de Fab h15H6.v1 indicadas a HtrA1 murina (fig. 10A) o humana (fig. 10B). Los gráficos muestran el fago unido (DO450nm) como una función de la concentración de HtrA1 (nM). Las FIGS. 11A-11B son gráficos que muestran los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ que compara la unión del clon de anticuerpo h15H6.v2 y las variantes LC-W91L y LC-W91Y en HVR-L3 a HtrA1 murina (fig.

11A) o humana (fig. 11B). Los anticuerpos usados estaban en formato Fab. Las Kas, Kdis y KD determinadas a partir de cada análisis se muestran como texto en el interior de cada gráfico.

La FIG. 12A es un gráfico que muestra los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ que compara la unión del clon de anticuerpo h15H6.v2 (original) y las variantes indicadas en la posición 94 de VL (es decir, LC-N94A LC-P95 (AP), LC-N94E LC-P95 (EP), LC-N94Q LC-P95 (QP) y LC-N94S LC-P95 (SP)) a huHtrA1. Los anticuerpos usados estaban en formato Fab. El gráfico muestra las unidades de respuesta (UR) como una función del tiempo (s).

La FIG. 12B es una tabla que resume los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ mostrado en la fig. 12A. La FIG. 13A es un gráfico que muestra los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ que compara la unión del clon de anticuerpo h15H6.v2 (original) y las variantes indicadas en la posición 55 y/o 56 de VH (es decir, HC-D55A HC-G56 (AG), HC-D55E HC-G56 (EG), HC-D55S HC-G56 (SG) y HC-D55 HC-G56A (DA)) a huHtrA1. Los anticuerpos usados estaban en formato Fab. El gráfico muestra las unidades de respuesta (UR) como una función del tiempo (s).

La FIG. 13B es una tabla que resume los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ mostrado en la fig. 13A. La FIG. 14A es un gráfico que muestra los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ que compara la unión del clon de anticuerpo h15H6.v2 ("original") y las variantes de combinación indicadas en la posición 94 de VL y la posición 55 y/o 56 de VH a huHtrA1. AP_EG: LC-N94A LC-P95 HC-D55E HC-G56 (también denominado "h15H6.v2.APEG" y "h15H6.v3"). EP_EG: LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56. QP_EG: LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56. SP_EG: LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56.

La FIG. 14B es una tabla que resume los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ mostrado en la fig. 14A. La FIG. 14C es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de bloqueo basado en FRET que somete a prueba la capacidad de IgG h15H6.v2, Fab h15H6.v2 y las variantes de combinación indicadas en la posición 94 de VL y la posición 55 y/o 56 de VH de inhibir la actividad de HtrA1. El gráfico representa el porcentaje de actividad máxima como una función del logaritmo de la concentración de anticuerpos (M).

La FIG. 14D es una tabla que muestra los valores de CI50 para cada uno de los clones de anticuerpo sometidos a prueba en la fig. 14C.

Las FIGS. 15A-15B muestran alineaciones de secuencias de las secuencias de aminoácidos de VL (fig. 15A) y VH (fig. 15B) de los clones de anticuerpo anti-HtrA1 m19B12 y h19B12.v1 en comparación con la secuencia k4 (fig.

15A) o la secuencia de VH3 (fig. 15B) consenso humana. Las secuencias de HVR están delimitadas por los recuadros indicados para cada uno de los clones de anticuerpo. Las secuencias de HVR de acuerdo con la definición de Kabat están subrayadas. Los residuos mostrados en texto en blanco en los recuadros sombreados indican residuos que son diferentes entre la secuencia de VH1 consenso humana y los clones de anticuerpo anti-HtrA1.

Las FIGS. 16A-16D son gráficos que muestran los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ de la unión del clon de anticuerpo m19B12 o h19B12.v1 a HtrA1 humana o murina. Se empleó análisis de cinética de ciclo único. Los gráficos muestran las unidades de respuesta (UR) como una función del tiempo (s). La fig. 16A muestra los resultados de la unión de Fab m19B12 a huHtrA1. La fig. 16B muestra los resultados de la unión de Fab m19B12 a muHtrA1. La fig. 16C muestra los resultados de la unión de Fab h19B12.v1 a huHtrA1. La fig. 16D muestra los resultados de la unión de Fab h19B12.v1 a huHtrA1. Las Kas, Kdis y KD para cada análisis se muestran como texto en el interior de cada gráfico.

La FIG. 17 es un diagrama esquemático que esboza la estrategia de adsorción en fago usada para la mutagénesis por barrido profundo con NNK de las HVR de HC y LC de h15H6.v2 para la maduración en afinidad.

Las FIGS. 18A-18B muestran matrices cromáticas de log2 de la proporción de enriquecimiento para mutaciones en las posiciones de HVR de VH (fig. 18A) o VL (fig. 18B) indicadas calculadas dividiendo la frecuencia de una mutación dada en una posición dada en la muestra clasificada con la frecuencia de la misma mutación en la muestra no clasificada. Las proporciones de enriquecimiento de mutaciones ejemplares se indican debajo de las matrices cromáticas.

La FIG. 19 es una tabla que muestra las mutaciones identificadas como enriquecidas en la muestra clasificada en comparación con la muestra no clasificada de las colecciones de NNK y/o las colecciones de aleatorización suaves de VH y VL de h15v6.v2.

La FIG. 20 es una tabla que muestra los resultados del análisis por RPS en BIACORE™ de la unión de los clones variantes de anticuerpo Fab madurados en afinidad indicados. Las Kas, Kdis y KD para cada clon variante de anticuerpo madurado en afinidad obtenido de este análisis se muestran en comparación con h15H6.v2 y h15H6.v2.APEG (también denominado h15H6.v3).

Las FIGS. 21A-21B muestran alineaciones de secuencias de las secuencias de aminoácidos de VL (fig. 21A) y de VH (fig. 21B) de clones de anticuerpo anti-HtrA1 variantes madurados en afinidad.

La FIG. 22A es una tabla que resume los resultados de los clones de anticuerpo Fab anti-HtrA1 variantes madurados en afinidad indicados para inhibir la actividad con HtrA1 como se evalúa en ensayos de actividad con H2-Opt basados en FRET. La tabla muestra los resultados de 3 experimentos independientes, así como el promedio y la desviación estándar (DE). Estos experimentos emplearon un análisis de tasa (UFR/s).

La FIG. 22B es una gráfica que muestra una gráfica ejemplar de resultados de un ensayo de actividad con H2-Opt usando la HtrA1 recombinante representada en la fig. 22A. Las condiciones del ensayo incluyeron HtrA1 400 pM y sustrato 2,5 pM. El tampón fue Tris 50 mM, NaCl 200 mM, CHAPS al 0,25 %, pH 8,3. Estos datos provienen de la segunda repetición de los tres experimentos independientes en la fig. 22A.

Las FIGS. 23A-23D son gráficos que muestran los resultados de un ensayo de actividad con H2-Opt para los formatos de variantes de anticuerpo h15H6 indicados analizados usando un enfoque de tasa UFR/s. Los gráficos muestran el porcentaje de control (UFR/s) como una función de la concentración de anticuerpos (nM) para el anticuerpo monoclonal (mAb) IgG h15H6.v4 (fig. 23A), un anticuerpo anti-HtrA1 de control positivo (IgG YW505.94A, véase, por ejemplo, el documento WO 2013/055998) (fig. 23B), Fab h15H6.v4 (fig. 23C) y Fab 15H6.v2 (fig. 23D). Una tabla junto a cada gráfico muestra la CI50, el intervalo de Y, el factor de pendiente y el fondo de cada análisis.

Las FIGS. 23E-23H son gráficos que muestran los resultados de un ensayo de actividad con H2-Opt para los formatos de variantes de anticuerpo h15H6 indicados analizados usando un enfoque de criterio de valoración (UFR). Los gráficos muestran el porcentaje de control (UFR/s) como una función de la concentración de anticuerpos (nM) para Mab IgG h15H6.v4 (fig. 23E), un anticuerpo anti-HtrA1 de control positivo (IgG YW505.94A) (fig. 23F), Fab h15H6.v4 (fig. 23G) y Fab 15H6.v2 (fig. 23H). Una tabla junto a cada gráfico muestra la CI50, el intervalo de Y, el factor de pendiente y el fondo de cada análisis.

Las FIGS. 24A-24B son tablas que muestran los resultados de CI50 (fig. 24A) y CI90 (fig. 24B) para los formatos de variantes de anticuerpo h15H6 indicados de un primer conjunto de tres experimentos independientes. Los valores de CI50 se determinaron usando ajustes de 4 parámetros. Los valores de CI90 se determinaron a partir de los valores de CI50 y las pendientes de los ajustes. El experimento I corresponde a los datos mostrados en las figs. 23A-23F. % de CV, coeficiente de variación. Los datos se analizaron usando un enfoque de tasa (UFR/s). Las FIGS. 25A-25B son tablas que muestran los resultados de CI50 (fig. 25A) y CI90 (fig. 25B) para los formatos de variantes de anticuerpo h15H6 indicados de un segundo conjunto de tres experimentos independientes. Los valores de CI50 se determinaron usando ajustes de 4 parámetros. Los valores de CI90 se determinaron a partir de los valores de CI50 y las pendientes de los ajustes. Los datos se analizaron usando un enfoque de tasa (UFR/s) o bien un enfoque de criterio de valoración (UFR).

La FIG. 26A es un gráfico que muestra una curva de valoración para a-caseína intacta. La concentración experimental se representa como una función de la concentración agregada teórica (pg/ml). El coeficiente de correlación (R2) fue 0,999.

La FIG.26B es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de actividad de HtrA1 basado en espectrometría de masas. La capacidad de APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) de inhibir la actividad de HtrA1-PD se evaluó como se describe en el ejemplo 3, sección G. El inhibidor de molécula pequeña ucf-101 sirvió como control positivo. Las FIGS. 27A-27B son gráficos que muestran los resultados de dos ensayos de actividad de HtrA1 endógena independientes, el experimento I (fig. 27A) y el experimento II (fig. 27B). Para cada Fab de anticuerpo, n.° 1 y n.° 2 indican series de diluciones separadas del mismo anticuerpo, con diluciones iniciales realizadas por separado. Las dos series de diluciones se procesaron en la misma placa con otros reactivos que eran de la misma preparación.

La FIG. 27C es una tabla que resume los resultados de los ensayos de actividad de HtrAI endógena representados en las figs. 27A y 27B.

La FIG. 28 es una tabla que resume las propiedades de unión cinética y la actividad inhibidora de las variantes y derivados de Fab h15H6.v2 indicados. YW505.94a.28 (véase, por ejemplo, el documento WO 2013/055998) sirvió como control positivo. Todas las variantes y derivados de Fab h15H6 mostraron una afinidad mejorada y potencia mejorada en comparación con Fab YW505.94a.28, mostrando Fab h15H6.v4 aproximadamente una mejora de 30 veces en la afinidad en comparación con este anticuerpo.

La FIG. 29A muestra la secuencia de aminoácidos de HtrA1 humana. La secuencia madura se muestra en letras mayúsculas, el dominio proteasa está subrayado y los residuos N224 y K248 están sombreados.

La FIG. 29B muestra la secuencia de aminoácidos de HtrA1 murina. La secuencia madura se muestra en letras mayúsculas y el dominio proteasa está subrayado.

La FIG. 30 muestra una alineación de los dominios variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo anti factor D de referencia ("WT") y sus variantes seleccionadas. Las HVR dentro de los dominios variables están subrayadas. Las sustituciones de residuos en las variantes se muestran en negrita.

Las FIGS. 31A-31B representan la unión de Fab YW505.94 (como se describe en el documento WO 2013/055998) a HtrA1. Cuando los aminoácidos designados en la fig. 31A se reemplazan con alanina, se reduce la afinidad de unión del Fab YW505.94 por la proteína mutada. La estructura mostrada en la fig. 31B se generó usando microscopia electrónica como se describe en Ciferri et al. (2015) Biochem. J. 472(2):169-81. El círculo muestra el epítopo para el Fab YW505.94 en la proteína HtrA1. El Fab YW505.94 se une a los bucles "B" y "C" de la proteína HtrA1.

Las FIGS. 32A-32B representan la unión de Fab 15H6.v4 a HtrA1, y muestran que el epítopo de HtrA1 unido por Fab 15H6.v4 es distinto del epítopo unido por Fab YW505.94. La fig. 32A representa la interacción entre el Fab 15H6.v4 y su epítopo en la proteína HtrA1, como se determina por cristalografía de rayos X. El Fab 15H6.v4 se une al bucle LA de la proteína HtrA1 (véase, por ejemplo, Glaza P et al. (2015) PLoS One 10(6):e0131142). La estructura mostrada en la fig. 32B se generó usando microscopia electrónica. El círculo muestra el epítopo de Fab 15H6V.4 en la proteína HtrA1.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error normal para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en la técnica en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que se dirigen a ese valor o parámetro per se.

Una "región estructural humana de aceptor" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana de aceptor "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana de aceptor de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.

"Activo" o "actividad" o "actividad biológica" en el contexto de un anticuerpo de la presente invención es la capacidad de antagonizar (inhibir parcial o completamente) una actividad biológica de su diana, por ejemplo, in vitro y/o in vivo. Un ejemplo de actividad biológica de un anticuerpo es la capacidad de lograr una mejora medible en el estado, por ejemplo, patología, de un trastorno asociado con su diana. Por ejemplo, para un anticuerpo anti-HtrA1, el trastorno puede ser un trastorno asociado con HtrA1, tal como, por ejemplo, d Ms (por ejemplo, atrofia geográfica). La actividad de un anticuerpo anti-HtrA1 se puede determinar en pruebas in vitro o in vivo, incluyendo ensayos de unión, ensayos de actividad (por ejemplo, ensayos de actividad basados en FRET (por ejemplo, usando un sustrato H2-Opt) o ensayos de actividad basados en espectrometría de masas), usando un modelo animal pertinente o ensayos clínicos en seres humanos. En otro ejemplo, para un anticuerpo anti factor D (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1/anti factor D), el trastorno puede ser un trastorno asociado con el complemento, tal como, por ejemplo, un trastorno ocular asociado con el complemento. La actividad de un anticuerpo anti factor D se puede determinar en pruebas in vitro o in vivo, incluyendo ensayos de unión, ensayos de hemolisis por la vía alternativa (por ejemplo, ensayos que miden la inhibición de la actividad o activación del complemento por la vía alternativa), usando un modelo animal pertinente, o ensayos clínicos en seres humanos.

"Afinidad" se refiere a la intensidad de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar, en general, por la constante de disociación (KD). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.

Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR) y/o regiones estructurales (FR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

Los términos "anticuerpo anti-HtrA1" y "un anticuerpo que se une específicamente a HtrA1" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a HtrA1 con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección como diana de HtrA1. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-HtrA1 a una proteína distinta de HtrA1 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a HtrA1 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une a HtrA1 tiene una constante de disociación (KD) de ^1 pM, ^100 nM, ^10 nM, ^1 nM, ^0,1 nM, ^0,01 nM o ^ 0,001 nM (por ejemplo, de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-HtrA1 se une a un epítopo de HtrA1 que se conserva entre HtrA1 de especies diferentes. Un anticuerpo anti-HtrA1 puede ser, por ejemplo, cualquier anticuerpo anti-HtrA1 descrito en el presente documento o en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2013/055998, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Los términos "anticuerpo anti factor D" y "un anticuerpo que se une específicamente al factor D" se refieren a un anticuerpo que se puede unir al factor D con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección como diana del factor D, por ejemplo, de tal manera que inhiba o reduzca sustancialmente la activación del complemento. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti factor D a una proteína factor D no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo al factor D como se mide, por ejemplo, por un RIA. En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une al factor D tiene una constante de disociación (KD) de ^1 pM, ^100 nM, ^10 nM, ^1 nM, ^0,1 nM, ^ 0,01 nM o ^ 0,001 nM (por ejemplo, de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo anti factor D se une a un epítopo del factor D que se conserva entre factores D de especies diferentes. Un anticuerpo anti factor D puede ser cualquier anticuerpo anti factor D descrito en el presente documento y/o en las patentes de EE. Uu . n.os 8.067.002; 8.273.352; y 8.268.310; y la solicitud de patente de EE. UU. n.° 14/700.853, incorporándose cada una en el presente documento por referencia en su totalidad.

El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')²; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en toda una cadena ligera (L) junto con el dominio de la región variable de la cadena pesada (H) (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1). El tratamiento con pepsina de un anticuerpo proporciona un único fragmento F(ab')²grande que se corresponde aproximadamente con dos fragmentos Fab enlazados por disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y que todavía puede reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener pocos residuos adicionales en el extremo carboxílico del dominio CH1, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')²se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

El término "región Fc" se usa en el presente documento para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

"Fv" consiste en un dímero de un dominio de la región variable de una cadena pesada y una ligera en estrecha asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácido para la unión a antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que solo comprenda tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque, a menudo, a una menor afinidad que todo el sitio de unión.

"Fv monocatenario", también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que posibilita que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los sFv, véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados construyendo fragmentos sFv (véase el párrafo precedente) con conectores cortos (de aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de modo que se logre el emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "de entrecruzamiento" en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en el documento EP 404.097; documento WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448,1993.

Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Determinados anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que entra en contacto con un conjunto solapante de residuos de aminoácido del antígeno en comparación con el anticuerpo de referencia o bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. Los residuos de aminoácido de un anticuerpo que entran en contacto con un antígeno se pueden determinar, por ejemplo, determinando la estructura cristalina del anticuerpo en complejo con el antígeno o realizando un intercambio de hidrógeno/deuterio. En algunos modos de realización, se considera que los residuos de un anticuerpo que están a menos de 5 A del antígeno están en contacto con el antígeno. En algunos modos de realización un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹e IgA². Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 6, £, y y M, respectivamente.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

La "región bisagra" se define, en general, como que se expande desde 216-238 (numeración EU) o 226-251 (numeración de Kabat) de IgG1 humana. La bisagra se puede dividir además en tres regiones distintas, la bisagra superior, intermedia (por ejemplo, el núcleo) e inferior. En determinados modos de realización, la región bisagra de un anticuerpo IgG1 humano se define, en general, como sigue:

La bisagra superior comprende aminoácidos que tienen la secuencia EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 157). En determinados modos de realización, la bisagra superior comprende los aminoácidos en las posiciones 216-225 (numeración EU) o 226-238 (numeración de Kabat).

La bisagra intermedia (por ejemplo, el núcleo) comprende aminoácidos que tienen la secuencia CPPC (SEQ ID NO: 122). En determinados modos de realización, la bisagra del núcleo comprende los aminoácidos en las posiciones 226-229 (numeración EU) o 239-242 (numeración de Kabat).

La bisagra inferior comprende aminoácidos que tienen la secuencia PAPELLGGP (SEQ ID NO: 158). En determinados modos de realización, la bisagra inferior comprende los aminoácidos en las posiciones 230-238 (numeración EU) o 243-251 (numeración de Kabat).

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos de aminoácido que se producen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En un modo de realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de FR de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Se realizan estas modificaciones para refinar además el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

El término "variable" se refiere al hecho de que determinados segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos. El dominio variable o "V" media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en el tramo de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables llamados regiones estructurales (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad en extremo llamadas "regiones hipervariables" que tienen cada una 9-12 aminoácidos de longitud. El término "región hipervariable" o "HVR" cuando se usa en el presente documento se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende, en general, los residuos de aminoácido, por ejemplo, de alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50 56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente los residuos 26-35 (H1), 49-65 (H2) y 95-102 (H3) en la v H (en un modo de realización, H1 es de alrededor de aproximadamente los residuos 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la VL y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en la VH); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en Vh (o Vl ): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

Los términos "numeración de residuos del dominio variable como en Kabat", "residuo de aminoácido de Kabat" o "numeración de la posición de aminoácido como en Kabat" y variaciones de los mismos, se refieren al sistema de numeración usado para los dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la recopilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un único inserto de aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, los residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por Kabat "estándar".

El sistema de numeración de Kabat se usa, en general, cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1 -107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se usa, en general, cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU que se informa en Kabat et al., supra). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU IgG1 humano. A menos que se establezca de otro modo en el presente documento, las referencias a números de residuo en el dominio variable de los anticuerpos significan la numeración de residuos por el sistema de numeración de Kabat. A menos que se establezca de otro modo en el presente documento, las referencias a números de residuo en el dominio constante de los anticuerpos significan la numeración de residuos por el sistema de numeración EU (por ejemplo, véase la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 60/640.323, figuras para la numeración EU).

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

El término un "anticuerpo aislado", cuando se usa para describir los diversos anticuerpos divulgados en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del que se expresó. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente interferirían en usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por enfoques de electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007). En modos de realización preferentes, el anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna por el uso de un secuenciador de vaso giratorio, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. El anticuerpo aislado incluye anticuerpos in situ dentro de células recombinantes, porque al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades despreciables. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), donde la unidad VH-VL tiene especificidad poliepitópica (es decir, se puede unir a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o a cada epítopo en una molécula biológica diferente). Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH, fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado covalentemente o no covalentemente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la(s) misma(s) diana(s) o diferente(s). "Doble especificidad" o "biespecificidad" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos epítopos diferentes en la(s) misma(s) diana(s) o diferente(s). Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos de doble especificidad tienen dos brazos de unión a antígeno que son idénticos en su secuencia de aminoácidos y cada brazo Fab puede reconocer a dos antígenos. La doble especificidad permite que los anticuerpos interactúen con alta afinidad con dos antígenos diferentes como una única molécula de Fab o IgG. De acuerdo con un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico en una forma IgG1 se une a cada epítopo con una afinidad de 5 pM a 0,001 pM, de 3 pM a 0,001 pM, de 1 pM a 0,001 pM, de 0,5 pM a 0,001 pM o de 0,1 pM a 0,001 pM. "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unirse solo a un epítopo.

"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están enlazadas por puentes disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

Con respecto a la unión de un anticuerpo con una molécula diana, el término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular significa que la unión es diferente de forma mensurable de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control. Por ejemplo, se puede determinar la unión específica por competencia con una molécula de control que sea similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica la unión específica si la unión de la diana marcada con respecto a una sonda se inhibe de forma competitiva por la diana no marcada en exceso. El término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular como se usa en el presente documento se puede presentar, por ejemplo, por una molécula que tenga una KD para la diana de 10-4 M o menor, de forma alternativa de 10-5 M o menor, de forma alternativa de 10-6 M o menor, de forma alternativa de 10-7 M o menor, de forma alternativa de 10-8 M o menor, de forma alternativa de 10-9 M o menor, de forma alternativa de 10-10 M o menor, de forma alternativa de 10-11 M o menor, de forma alternativa de 10-12 M o menor o una KD en el intervalo de 10-4 M a 10-6 M o de 10-6 M a 10-10 M o de 10-7 M a 10-9 M. Como se apreciará por el experto en la técnica, los valores de afinidad y de KD están inversamente relacionados. Una alta afinidad por un antígeno se mide por un bajo valor de KD. En un modo de realización, el término "unión específica" se refiere a la unión donde una molécula se une a un polipéptido particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.

Un "ácido nucleico que codifica un anticuerpo" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped. En algunos modos de realización, el ácido nucleico codifica un anticuerpo anti-HtrA1. En otros modos de realización, el ácido nucleico puede codificar un anticuerpo anti factor D (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1/anti factor D).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin tener en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derecho de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. Se debe compilar el programa ALIGN-2 para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Se establecen todos los parámetros de comparación de secuencias por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

Se dice que una proteína, incluyendo un anticuerpo, es "estable" si esencialmente retiene la estructura conformacional y actividad biológica intactas. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteínas están disponibles en la técnica y se revisan en, por ejemplo, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90. Una variante de anticuerpo con "estabilidad mejorada" se refiere a una variante de anticuerpo que es más estable en comparación con el anticuerpo de referencia de partida. Preferentemente, las variantes de anticuerpo con estabilidad mejorada son variantes de los anticuerpos de referencia (naturales) en las que se alteran residuos de aminoácido específicos con el propósito de mejorar la estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica y/o reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos naturales.

El término "isomerización" se refiere, en general, a un proceso químico por el que un compuesto químico se transforma en cualquiera de sus formas isómeras, es decir, formas con la misma composición química, pero con diferente estructura o configuración y, de ahí, en general, con propiedades físicas y químicas diferentes. En el presente documento se usa específicamente la isomerización de aspartato, un proceso en el que uno o más residuos de ácido aspártico (D o Asp) de un polipéptido se han transformado en residuo(s) de ácido isoaspártico.

Véase, por ejemplo, Geiger et al., J. Biol. Chem. 262:785-94, 1987.

El término "desamidación" se refiere, en general, a una reacción química en la que se retira un grupo funcional amida de un compuesto orgánico. En el presente documento se usa específicamente la desamidación de asparagina, un proceso en el que uno o más residuos de asparagina (N o Asn) de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) se han convertido en ácido aspártico (D o Asp), es decir, la cadena lateral de amida neutra se ha convertido en un residuo con una propiedad ácida global. Véase, por ejemplo, Xie et al., J. Pharm. Sci. 88:8-13, 1999.

Una variante "oxidada" de una molécula de polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) es un polipéptido en el que uno o más residuos de metionina (M o Met) o triptófano (W o Trp) del polipéptido original se han convertido en sulfona o sulfóxido a través del azufre de metionina. La oxidación se puede prevenir convirtiendo metionina (M o Met) en leucina (L o Leu) o isoleucina (I o Ile). Véase, por ejemplo, Amphlett et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140, 1996.

Los residuos de aminoácido "propensos" a determinados procesos físicos o químicos identificados (por ejemplo, isomerización, desamidación u oxidación) se refieren a los residuos dentro de una molécula de proteína específica que se ha identificado que tienen la propensión de experimentar los procesos identificados, tales como isomerización, desamidación u oxidación. Sus propensiones a menudo se determinan por sus posiciones relativas dentro de la estructura primaria y/o conformacional de la proteína. Por ejemplo, se ha demostrado que el primer Asp en un motivo Asp-XXX (donde XXX puede ser Asp, Gly, His, Ser o Thr) es propenso a la isomerización de Asp debido a la implicación de su residuo contiguo, donde algunos otros Asp dentro de la misma proteína pueden no poseer dicha propensión. Son conocidos en la técnica ensayos para identificar residuos propensos a determinados procesos dentro de una molécula de proteína específica. Véase, por ejemplo, Cacia et al., Biochem. 35:1897-1903, 1996.

El término "serina peptidasa HtrA 1 (HtrA1)" o "HtrA1", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a cualquier HtrA1 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos, tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba la HtrAI no procesada “de longitud completa”, así como cualquier forma de HtrAI que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de HtrA1, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una HtrA1 humana ejemplar se muestra en la SEQ ID NO: 121 (véase la fig. 29A). El número de acceso de UniProt para HtrA1 humana es Q92743. La secuencia de aminoácidos de una HtrA1 murina ejemplar se muestra en la SEQ ID NO: 155 (véase la fig. 29B). El número de acceso de UniProt para HtrA1 murina es Q9R118. Como se describe en el presente documento, los residuos de aminoácido de huHtrA1 y muHtrA1 se preparan con referencia a las SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 155, respectivamente. Las posiciones de aminoácido se especifican por el código de aminoácido de una letra seguido de su posición dentro de la SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO: 155 (véase la fig. 29B). Como se muestra en la fig. 29A, la secuencia madura de HtrA1 humana comprende una secuencia que comienza en glutamina en la posición 23 de la SEQ ID NO: 121 y termina en prolina en la posición 480 de la SEQ ID NO: 121, por ejemplo, Q23-P480. Los fragmentos ejemplares de HtrA1 humana incluyen fragmentos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en los aminoácidos D161-K379. HtrA1 también es conocida en la técnica como proteasa, serina, 11 (unión a IGF) (PRSS11), ARMD7, HtrA e IGFBP5-proteasa.

El término "HtrA1" también engloba "variantes de HtrA1", que significa un polipéptido HtrA1 activo que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido HtrA1 de secuencia natural, tal como la SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO: 155. Normalmente, una variante de HtrA1 tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de HtrA1 natural, por ejemplo, la SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO: 155.

El término "antagonista de unión a HtrA1" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que pueda neutralizar, bloquear, inhibir parcial o completamente, anular, reducir o interferir en una actividad biológica de HtrA1. Los antagonistas de unión a HtrA1 incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-HtrA1, y variantes de anticuerpo de los mismos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, otros polipéptidos, péptidos y moléculas pequeñas no peptídicas de unión, que se unen a HtrA1 y pueden neutralizar, bloquear, inhibir parcial o completamente, anular, reducir o interferir en las actividades de HtrA1, tales como la capacidad de HtrA1 de escindir un sustrato in vitro (por ejemplo, un sustrato H2-Opt o caseína) o in vivo (por ejemplo, la capacidad de HtrA1 de contribuir a la patología de un trastorno ocular (por ejemplo, DMS (por ejemplo, atrofia geográfica)).

El término "factor D", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos factor D de secuencia natural y variantes. El factor D también es conocido en la técnica como factor D del complemento (CFD), C3 proactivador convertasa, properdina factor D esterasa y adipsina.

Un "factor D de secuencia natural" es un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido factor D derivado de la naturaleza, independientemente de su modo de preparación. Por tanto, se puede aislar el factor D de secuencia natural de la naturaleza o se puede producir por medios recombinantes y/o sintéticos. Además de una proteína factor D madura, tal como una proteína factor D humana madura (véase, por ejemplo, la secuencia de referencia del NCBI NM_001928, SEQ iD NO: 126), el término "factor D de secuencia natural", engloba específicamente formas precursoras naturales del factor D (por ejemplo, una preproteína inactiva, que se escinde proteolíticamente para producir la forma activa), formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas de forma alternativa) y variantes alélicas naturales del factor D, así como variantes conformacionales estructurales de moléculas del factor D que tienen la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido factor D derivado de la naturaleza. El número de acceso de UniProt para el factor D humano es P00746. Los polipéptidos factor D de animales no humanos, incluyendo primates superiores y mamíferos no humanos, se incluyen específicamente dentro de esta definición.

"Variante del factor D" significa un polipéptido factor D activo que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido factor D de secuencia natural, tal como el polipéptido factor D humano de secuencia natural (por ejemplo, Nm _001928, SEQ ID NO: 126). Normalmente, una variante del factor D tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos humana madura (por ejemplo, NM_001928, SEQ ID NO: 126).

El término "antagonista de unión al factor D" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que pueda neutralizar, bloquear, inhibir parcial o completamente, anular, reducir o interferir en una actividad biológica del factor D. Los antagonistas de unión al factor D incluyen, sin limitación, anticuerpos anti factor D y variantes de anticuerpo de los mismos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, otros polipéptidos, péptidos y moléculas pequeñas no peptídicas de unión, que se unen al factor D y pueden neutralizar, bloquear, inhibir parcial o completamente, anular, reducir o interferir en las actividades del factor D, tales como la capacidad del factor D de participar en la patología de una afección ocular asociada con el complemento.

El término "antagonista de VEGF", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que se puede unir a VEGF, reducir los niveles de expresión de VEGF o neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades biológicas de VEGF, incluyendo, pero sin limitarse a, unión de VEGF a uno o más receptores de VEGF, señalización por VEGF y angiogénesis y supervivencia o proliferación de células endoteliales mediadas por VEGF. Por ejemplo, una molécula que puede neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades biológicas de VEGF puede ejercer sus efectos uniéndose a uno o más receptores de VEGF (VEGFR) (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, receptor de VEGF unido a membrana (mbVEGFR) o receptor de VEg F soluble (sVEGFR)). Como antagonistas de VEGF útiles en los procedimientos de la invención se incluyen polipéptidos que se unen específicamente a VEGF, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, moléculas receptoras y derivados que se unen específicamente a VEGF, secuestrando, de este modo, su unión a uno o más receptores, proteínas de fusión (por ejemplo, trampa para VEGF (Regeneran)) y VEGF¹²¹-gelonina (Peregrine). Los antagonistas de VEGF también incluyen variantes antagonistas de polipéptidos de VEGF, oligómeros de nucleobases antisentido complementarios a al menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de VEGF; pequeños ARN complementarios a al menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de VEGF; ribocimas que seleccionan como diana VEGF; pepticuerpos para VEGF; y aptámeros de VEGF. Los antagonistas de VEGF también incluyen polipéptidos que se unen a VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y derivados que se unen a VEGFR, de este modo, bloqueando, inhibiendo, anulando, reduciendo o interfiriendo en las actividades biológicas de VEGF (por ejemplo, señalización por VEGF), o proteínas de fusión. Los antagonistas de VEGF también incluyen moléculas pequeñas no peptídicas que se unen a VEGF o VEGFR y pueden bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades biológicas de VEGF. Por tanto, el término "actividades de VEGF" incluye específicamente actividades biológicas mediadas por VEGF de VEGF. En determinados modos de realización, el antagonista de VEGF reduce o inhibe, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, el nivel de expresión o la actividad biológica de VEGF. En algunos modos de realización, el VEGF inhibido por el antagonista específico de VEGF es VEGF (8-109), VEGF (1-109) o VEGF¹⁶⁵.

Como se usa en el presente documento, los antagonistas de VEGF pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos anti-VEGFR2 y moléculas relacionadas (por ejemplo, ramucirumab, tanibirumab, aflibercept), anticuerpos anti-VEGFR1 y moléculas relacionadas (por ejemplo, icrucumab, aflibercept (trampa para VEGF en el ojo; EYLEA®) y ziv-aflibercept (trampa para VEGF; ZALTRAP®)), anticuerpos frente a VEGF biespecíficos (por ejemplo, MP-0250, vanucizumab (VEGF-ANG2) y los anticuerpos biespecíficos divulgados en el documento US 2001/0236388), anticuerpos biespecíficos que incluyen combinaciones de dos de los brazos anti-VEGF, anti-VEGFR1 y anti-VEGFR2, anticuerpos anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab, sevacizumab y ranibizumab) y antagonistas de VEGF de molécula pequeña no peptídica (por ejemplo, pazopanib, axitinib, vandetanib, stivarga, cabozantinib, lenvatinib, nintedanib, orantinib, telatinib, dovitinig, cediranib, motesanib, sulfatinib, apatinib, foretinib, famitinib y tivozanib).

Los términos "anticuerpo anti-VEGF", un "anticuerpo que se une a VEGF" y "anticuerpo que se une específicamente a VEGF" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a VEGF con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección como diana de VEGF. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-VEGF a una proteína distinta de VEGF no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a VEGF como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une a VEGF tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-VEGF se une a un epítopo de VEGF que se conserva entre VEGF de especies diferentes.

En determinados modos de realización, el anticuerpo anti-VEGF se puede usar como un agente terapéutico en la selección como diana e interferencia en enfermedades o afecciones en las que está implicada la actividad de VEGF. Además, se puede someter el anticuerpo a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y del uso pretendido para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibición con HUVEC; ensayos de inhibición del crecimiento de células tumorales (como se describe en el documento WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) (pat. de EE. UU. n.° 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o hematopoyesis (véase el documento WO 95/27062). Un anticuerpo anti-VEGF normalmente no se unirá a otros homólogos de VEGF, tales como VEGF-B o VEGF-C, ni a otros factores de crecimiento, tales como PIGF, PDGF o bFGF. En un modo de realización, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. En otro modo de realización, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo, pero sin limitarse a, el anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN®).

El anticuerpo anti-VEGF "ranibizumab" también conocido como "LUCENTIS®" o "rhuFab V2" es un fragmento Fab anti-VEGF humano madurado en afinidad humanizado. Ranibizumab se produce por procedimientos de tecnología recombinante estándar en el vector de expresión en Escherichia coli y fermentación bacteriana. Ranibizumab no está glucosilado y tiene una masa molecular de ~48.000 dalton. Véanse los documentos WO 98/45331 y US 2003/0190317. Los anticuerpos preferentes adicionales incluyen los anticuerpos de la serie G6 o B20 (por ejemplo, G6-31, B20-4.1), como se describe en las publicaciones de solicitud PCT n.os WO 2005/012359 y WO 2005/044853, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Para anticuerpos preferentes adicionales, véanse las pat. de EE. UU. n.os 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.054.297; los documentos WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.os 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). Otros anticuerpos preferentes incluyen los que se unen a un epítopo funcional en el VEGF humano que comprende los residuos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103 y C104 o, de forma alternativa, que comprende los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183 y Q89. Los anticuerpos anti-VEGF adicionales incluyen los anticuerpos anti-VEGF descritos en la publicación de solicitud PCT n.° WO 2009/155724.

El término "antagonista de unión de IL-6" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de IL-6 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como un receptor de interleucina-6 (IL-6R) (también llamado CD126) y/o gp130 (también llamada CD130). Los antagonistas de unión a IL-6 ejemplares incluyen, por ejemplo, los antagonistas anti-IL-6 (incluyendo los anticuerpos anti-IL-6, por ejemplo, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics)) y los antagonistas anti-IL-6R (incluyendo anticuerpos anti-IL-6R, por ejemplo, tocilizumab (ACTEMRA®). En el presente documento, se define una "molécula pequeña" para que tenga un peso molecular por debajo de aproximadamente 600, preferentemente por debajo de aproximadamente 1000 dalton.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se van a tratar en el presente documento incluyen trastornos asociados con HtrA1, trastornos oculares y/o trastornos asociados con el complemento.

El término "trastorno asociado con HtrA1", como se usa en el presente documento, se refiere en el sentido más amplio a cualquier trastorno o afección asociado con la expresión o actividades anómalas de HtrA1. En algunos modos de realización, los trastornos asociados con HtrA1 se asocian con niveles o actividad de HtrA1 en exceso en los que se pueden manifestar síntomas atípicos debido a los niveles o actividad de HtrA1 localmente (por ejemplo, en un ojo) y/o sistémicamente en el cuerpo. Los trastornos asociados con HtrA1 ejemplares incluyen trastornos oculares asociados con HtrA1, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, degeneración macular senil (DMS), incluyendo DMS húmeda (exudativa) (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (no exudativa) (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, atrofia geográfica (AG)).

Como se usa en el presente documento, el término "trastorno ocular" incluye, pero no se limita a, trastornos del ojo, incluyendo enfermedades degenerativas maculares, tales como degeneración macular senil (DMS), incluyendo DMS húmeda (exudativa) (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (no exudativa) (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, atrofia geográfica (AG)); retinopatía diabética (RD) y otras retinopatías relacionadas con isquemia; endoftalmitis; uveítis; neovascularización coroidea (NVC); retinopatía del prematuro (RP); vasculopatía coroidea polipoidea (VCP); edema macular diabético; miopía patológica; enfermedad de Von Hippel-Lindau; histoplasmosis del ojo; oclusión de la vena retiniana central (OVRC); neovascularización corneal; y neovascularización retiniana. En algunos modos de realización, el trastorno ocular es DMS (por ejemplo, AG).

El término "trastorno asociado con el complemento" se usa en el sentido más amplio e incluye trastornos asociados con la activación excesiva o incontrolada del complemento. Incluyen la activación del complemento durante las intervenciones con circulación extracorporal; activación del complemento debido a isquemia-reperfusión después de infarto agudo de miocardio, aneurisma, apoplejía, choque hemorrágico, lesión por aplastamiento, falla orgánica múltiple, choque hipovolémico, isquemia intestinal u otros acontecimientos que provocan isquemia. También se ha demostrado que la activación del complemento está asociada con afecciones inflamatorias, tales como quemaduras graves, endotoxemia, choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, hemodiálisis; choque anafiláctico, asma grave, angioedema, enfermedad de Crohn, anemia drepanocítica, glomerulonefritis posestreptocócica y pancreatitis. El trastorno puede ser el resultado de una reacción adversa a fármacos, alergia a fármacos, síndrome de fuga vascular inducido por IL-2 o alergia a medios de contraste radiográficos. También incluye enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus eritematoso diseminado, miastenia grave, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. La activación del complemento también se asocia con el rechazo de trasplantes. La activación del complemento también se asocia con trastornos oculares, tales como trastornos oculares asociados con el complemento.

El término "trastorno ocular asociado con el complemento" se usa en el sentido más amplio e incluye todas las afecciones oculares, implicando su patología el complemento, incluyendo las vías clásica y la alternativa, y, en particular, la vía alternativa del complemento. Los trastornos oculares asociados con el complemento incluyen, sin limitación, enfermedades degenerativas maculares, tales como todas las fases de la degeneración macular senil (DMS), neovascularización coroidea (NVC), uveítis, retinopatías diabéticas y otras relacionadas con isquemia, endoftalmitis, uveítis y otras enfermedades neovasculares intraoculares, tales como edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de Von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena retiniana central (OVRC), neovascularización corneal y neovascularización retiniana. En un ejemplo, la DMS incluye DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, atrofia geográfica (AG)). En otro ejemplo, la DMS seca (no exudativa) puede incluir la presencia de drusas duras, drusas blandas, atrofia geográfica y/o acumulación de pigmentos. La DMS temprana puede incluir, por ejemplo, de múltiples drusas pequeñas a una o más drusas de tamaño mediano no extensas. La DMS intermedia puede incluir, por ejemplo, de drusas medianas extensas a una o más drusas grandes. Véanse, por ejemplo, Ferris et al., AREDS Report n.° 18; Sallo et al., Eye Res, 34(3):238-40,2009; Jager et al., New Engl. J. Med., 359(1):1735, 2008. En otro ejemplo, la DMS seca intermedia puede incluir drusas confluentes grandes. En otro ejemplo, la atrofia geográfica puede incluir pérdida de fotorreceptores y/o epitelio pigmentario retiniano (EPR). En otro ejemplo, el área de atrofia geográfica puede ser pequeña o grande y/o puede estar en el área de la mácula o en la retina periférica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado con el complemento es DMS seca intermedia. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado con el complemento es atrofia geográfica. En un ejemplo, el trastorno ocular asociado con el complemento es DMS húmeda (por ejemplo, neovascularización coroidea (NVC)).

Las listas anteriores no son totalmente inclusivas y se entenderá que una enfermedad o trastorno puede caer dentro de diversas categorías. Por ejemplo, la d Ms se puede clasificar en algunos casos como un trastorno asociado con HtrA1, un trastorno ocular y un trastorno asociado con el complemento.

Como se usa en el presente documento, "administrar" quiere decir un procedimiento de administración de una dosificación de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención) o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica, por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención) a un sujeto. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento se pueden administrar, por ejemplo, por vía intravítrea (por ejemplo, por inyección intravítrea), ocular (por ejemplo, por inyección ocular), intraocular (por ejemplo, por inyección intraocular), yuxtaescleral (por ejemplo, por inyección yuxtaescleral), subtenoniana (por ejemplo, por inyección subtenoniana), supracoroidea (por ejemplo, por inyección supracoroidea), tópica (por ejemplo, por colirio), intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutánea, intrarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intrarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, peritoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraorbital, oral, transdérmica, por inhalación, por inyección, por implantación, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada bañando las células diana directamente, por catéter, por lavado, en cremas o en composiciones lipídicas. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento también se pueden administrar sistémica o localmente. El procedimiento de administración puede variar dependiendo de diversos factores (por ejemplo, el compuesto o composición que se administra y la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno que se trata). En modos de realización particulares, los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-HtrA1, anticuerpos anti factor D y anticuerpos anti-HtrA1/anti factor D) se administran por inyección intravítrea.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

Los términos "administración de acción prolongada", "liberación mantenida" y "liberación controlada" se usan, en general, para describir un mecanismo de administración que usa una formulación, forma farmacéutica, dispositivo u otros tipos de tecnologías para lograr la liberación o biodisponibilidad prolongada o extendida de un agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo de la invención). Se puede referir a tecnologías que proporcionan una liberación o biodisponibilidad prolongada o extendida del fármaco a la circulación sistémica general o un sujeto o a sitios de acción locales en un sujeto, incluyendo (pero sin limitarse a) células, tejidos, órganos, articulaciones, regiones y similares. Además, estos términos se pueden referir a una tecnología que se usa para prolongar o extender la liberación del fármaco de una formulación o forma farmacéutica, o se pueden referir a una tecnología usada para extender o prolongar la biodisponibilidad o la farmacocinética o la duración de la acción del fármaco en un sujeto, o se pueden referir a una tecnología que se usa para extender o prolongar el efecto farmacodinámico provocado por una formulación.

Una "formulación de acción prolongada", una "formulación de liberación mantenida" o una "formulación de liberación controlada" es una formulación farmacéutica, forma farmacéutica u otra tecnología que se usa para proporcionar una administración de acción prolongada. En un aspecto, se usa la liberación controlada para mejorar la biodisponibilidad local de un agente terapéutico, específicamente el tiempo de residencia ocular en el contexto de administración ocular. "Tiempo de residencia ocular incrementado" se refiere al periodo posterior a la administración durante el que el fármaco ocular administrado sigue siendo eficaz tanto en términos de calidad (por ejemplo, actividad) como en términos de cantidad (por ejemplo, cantidad eficaz). Además de o en lugar de liberación en alta dosis y controlada, el fármaco se puede modificar postraduccionalmente, tal como por medio de PEGilación, para lograr una semivida in vivo incrementada.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano. Un "sujeto" puede ser un "paciente".

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para su profilaxis o bien durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad o trastorno, alivio de los síntomas, disminución de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad o trastorno, disminución de la tasa de evolución de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de enfermedad o trastorno y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para ralentizar la evolución de una enfermedad o trastorno. En algunos ejemplos, el trastorno es un trastorno asociado con HtrA1, un trastorno ocular y/o un trastorno asociado con el complemento, por ejemplo, DMS (por ejemplo, AG).

Una molécula de ácido nucleico "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia normalmente en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislado es distinta en la forma o configuración en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aislado se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada de forma funcional en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a ribosoma. Es conocido que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está "enlazado de forma funcional" cuando se dispone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está enlazado de forma funcional al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está enlazado de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está enlazado de forma funcional a una secuencia codificante si se sitúa para que facilite la traducción. En general, "enlazado de forma funcional" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por fijación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable y dichas designaciones incluyen la descendencia. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma, sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la descendencia puede que no sea precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. Se incluye la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula transformada originalmente. Si se pretenden designaciones distintas, esto quedará claro a partir del contexto.

Como se usa en el presente documento, "colección" se refiere a una pluralidad de secuencias de anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos anti-HtrA1 de la invención), o los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias, siendo las secuencias diferentes en la combinación de aminoácidos variantes que se introducen en estas secuencias, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

Una "mutación" es una deleción, inserción o sustitución de un nucleótido(s) con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia, tal como una secuencia natural.

Como se usa en el presente documento, "conjunto de codones" se refiere a un conjunto de secuencias de tripletes de nucleótidos diferentes usadas para codificar los aminoácidos variantes deseados. Se puede sintetizar un conjunto de oligonucleótidos, por ejemplo, por síntesis en fase sólida, incluyendo secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleótidos proporcionadas por el conjunto de codones y que codificarán el grupo deseado de aminoácidos. Una forma estándar de designación de codones es la del código IUB, que es conocida en la técnica. Un conjunto de codones se representa típicamente por 3 letras mayúsculas en cursiva, por ejemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK y similares. La síntesis de oligonucleótidos con "redundancia" de nucleótidos seleccionados en determinadas posiciones es bien conocida en esa técnica, por ejemplo, el enfoque TRIM (Knappek et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 1999; Garrard et al., Gene 128:103, 1993). Se pueden sintetizar dichos conjuntos de oligonucleótidos que tienen determinados conjuntos de codones usando sintetizadores de ácidos nucleicos comerciales (disponibles, por ejemplo, de Applied Biosystems, Foster City, CA) o se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD). Por lo tanto, un conjunto de oligonucleótidos sintetizados que tiene un conjunto de codones particular incluye típicamente una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el conjunto de codones dentro de la secuencia global. Los oligonucleótidos, como se usa de acuerdo con la invención, tienen secuencias que permiten la hibridación a un molde de ácido nucleico de dominio variable y también pueden incluir, pero no necesariamente, sitios de enzimas de restricción útiles, por ejemplo, con propósitos de clonación.

La "presentación en fagos" es una técnica por la que los polipéptidos variantes se presentan como proteínas de fusión en al menos una porción de la proteína de la cápside en la superficie de las partículas de fago, por ejemplo, fagos filamentosos. Una utilidad de la presentación en fagos reside en el hecho de que grandes colecciones de variantes de proteínas aleatorizadas se pueden clasificar rápida y eficazmente en cuanto a las secuencias que se unen a un antígeno diana con alta afinidad. La presentación de colecciones de péptidos y proteínas en fagos se ha usado para el cribado de millones de polipéptidos para determinar aquellos con propiedades de unión específica. Se han usado procedimientos de presentación en fagos polivalentes para presentar péptidos aleatorios pequeños y proteínas pequeñas a través de fusiones al gen III o bien al gen VIII del fago filamentoso. Véase, por ejemplo, Wells et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362, 1992 y las referencias citadas en el mismo. En una presentación en fagos monovalentes, una colección de proteínas o péptidos se fusiona a un gen III o una porción del mismo, y se expresa en niveles bajos en presencia de proteína del gen III natural, de modo que las partículas de fago presenten una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Los efectos de avidez se reducen con respecto al fago polivalente, de modo que la clasificación sea en base a la afinidad intrínseca por el ligando, y se usan vectores fagómidos, que simplifican las manipulaciones de ADN. Véase, por ejemplo, Lowman et al., Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-216, 1991.

Una "variante" o "mutante" de un polipéptido de partida o de referencia (por ejemplo, un anticuerpo de referencia o su(s) dominio(s) variable(s)/HVR) es un polipéptido que (1) tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la del polipéptido de partida o de referencia y (2) se derivó del polipéptido de partida o de referencia a través de mutagénesis natural o bien artificial (realizada por el hombre). Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés, denominadas en el presente documento "alteraciones de residuos de aminoácido". Por tanto, una HVR variante se refiere a una HVR que comprende una secuencia variante con respecto a una secuencia de polipéptido de partida o de referencia (tal como la de un anticuerpo fuente o fragmento de unión a antígeno). Una alteración de residuos de aminoácido, en este contexto, se refiere a un aminoácido diferente del aminoácido en la posición correspondiente en una secuencia de polipéptido de partida o de referencia (tal como la de un anticuerpo de referencia o fragmento del mismo). Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la variante o construcción mutante final, siempre que la construcción final posea las características funcionales deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procedimientos postraduccionales del polipéptido, tales como cambiar el número o la posición de sitios de glucosilación.

Una secuencia "natural (WT)" o "de referencia" o la secuencia de una proteína/polipéptido "natural" o "de referencia", tal como una HVR o un dominio variable de un anticuerpo de referencia, puede ser la secuencia de referencia de la que se derivan polipéptidos variantes a través de la introducción de mutaciones. En general, la secuencia "natural" para una proteína dada es la secuencia que es más común en la naturaleza. De forma similar, una secuencia génica "natural" es la secuencia para ese gen que se encuentra más comúnmente en la naturaleza. Se pueden introducir mutaciones en un gen "natural" (y, por tanto, en la proteína que lo codifica) a través de procesos naturales o bien a través de medios inducidos por el hombre. Los productos de dichos procesos son formas "variantes" o "mutantes" de la proteína o gen "natural" original.

Un "anticuerpo de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo en el que su secuencia de unión a antígeno sirve como secuencia molde sobre la que se realiza la diversificación de acuerdo con los criterios descritos en el presente documento. Una secuencia de unión a antígeno, en general, incluye una región variable de anticuerpo, preferentemente al menos una HVR, que incluye preferentemente regiones estructurales.

"Enriquecida", como se usa en el presente documento, significa que una entidad (por ejemplo, una alteración de residuos de aminoácido) está presente en una mayor frecuencia en una colección clasificada en comparación con una colección de referencia correspondiente (por ejemplo, una colección no clasificada o una colección que se ha clasificado en cuanto a un antígeno diferente o no pertinente). Por el contrario, "empobrecida" significa que una entidad (por ejemplo, una alteración de residuos de aminoácido) está presente en una menor frecuencia en una colección clasificada en comparación con una colección de referencia correspondiente (por ejemplo, una colección no clasificada o una colección que se ha clasificado en cuanto a un antígeno diferente o no pertinente). El término "neutro", cuando se usa en referencia a procedimientos de identificación de variantes de residuos de aminoácido, significa que una entidad no está ni enriquecida ni empobrecida, en otras palabras, está presente en aproximadamente la misma frecuencia en una colección clasificada en comparación con una colección de referencia correspondiente (por ejemplo, una colección no clasificada o una colección que se ha clasificado en cuanto a un antígeno diferente o no pertinente).

Por "punto isoeléctrico (pI)" se quiere decir el pH al que una molécula (por ejemplo, una proteína, tal como un anticuerpo) no tiene ninguna carga eléctrica neta, también denominado en la técnica "pH(I)" o "IEP".

II. Composiciones y procedimientos

La invención proporciona anticuerpos novedosos que se unen a HtrA1 y procedimientos de preparación y uso de los mismos, por ejemplo, para usos terapéuticos y de diagnóstico. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de diversos trastornos, incluyendo trastornos asociados con HtrA1, trastornos oculares y/o trastornos asociados con el complemento, incluyendo degeneración macular senil (por ejemplo, atrofia geográfica).

A. Anticuerpos anti-HtrA1 ejemplares

En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos que se unen específicamente a HtrA1. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el tratamiento o diagnóstico de trastornos que incluyen trastornos asociados con HtrA1, trastornos oculares y/o trastornos asociados con el complemento, incluyendo degeneración macular senil (por ejemplo, atrofia geográfica).

En el presente documento se divulgan anticuerpos aislados que se unen específicamente a HtrA1. En algunos casos, la HtrA1 es HtrA1 humana (huHtrA1). En otros casos, la HtrA1 es HtrA1 murina (muHtrA1). En determinados casos, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención se une específicamente a huHtrA1 con una KD de 100 nM o menor (por ejemplo, de 100 nM o menor, de 10 nM o menor, de 5 nM o menor, de 2,5 nM o menor, de 1 nM o menor, de 100 pM o menor, de 10 pM o menor, de 1 pM o menor o de 0,1 pM o menor). Por ejemplo, en algunos casos, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención se une específicamente a huHtrA1 con una KD de 1 nM o menor (por ejemplo, de 1 nM o menor, de 900 pM o menor, de 800 pM o menor, de 700 pM o menor, de 600 pM o menor, de 550 pM o menor, de 500 pM o menor, de 400 pM o menor, de 300 pM o menor, de 200 pM o menor, de 150 pM o menor, de 125 pM o menor, de 100 pM o menor, de 75 pM o menor, de 50 pM o menor, de 25 pM o menor o de 1 pM o menor). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 700 pM (por ejemplo, de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 700 pM, de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 600 pM, de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 550 pM, de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 500 pM, de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 400 pM, de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 300 pM, de entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 250 pM, de entre aproximadamente 50 pM y aproximadamente 200 pM, de entre aproximadamente 50 pM y aproximadamente 175 pM, de entre aproximadamente 50 pM y aproximadamente 150 pM, de entre aproximadamente 50 pM y aproximadamente 125 pM, de entre aproximadamente 70 pM y aproximadamente 125 pM o de entre aproximadamente 50 pM y aproximadamente 125 pM). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 se une a huHtrA1 con una KD de aproximadamente 110 pM. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 se une a huHtrA1 con una KD de aproximadamente 60 pM. Cualquiera de los valores de KD precedentes puede representar la afinidad de unión de un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención (por ejemplo, un Fab de un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención) por el dominio proteasa (PD) de huHtrA1 (huHtrA1-PD), por ejemplo, como se mide usando resonancia de plasmón superficial en BIACORE®, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención puede inhibir la actividad de HtrA1. En algunos casos, el anticuerpo inhibe la actividad del dominio proteasa de huHtrA1-PD con una concentración inhibidora de un 50 % (CI50) de 10 nM o menor (por ejemplo, de 10 nM o menor, de 5 nM o menor, de 2 nM o menor, de 1,5 nM o menor, de 1 nM o menor, de 900 pM o menor, de 800 pM o menor, de 700 pM o menor, de 600 pM o menor, de 500 pM o menor, de 400 pM o menor, de 300 pM o menor, de 200 pM o menor, de 100 pM o menor, de 50 pM o menor o de 1 pM o menor). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 inhibe la actividad de huHtrA1-PD con una CI50 de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 1 nM (por ejemplo, de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 1 nM, de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 0,9 nM, de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 0,8 nM, de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 0,7 nM, de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 0,6 nM, de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 0,5 nM o de entre aproximadamente 0,25 nM y aproximadamente 0,4 nM). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 inhibe la actividad de huHtrA1-PD con una CI50 de aproximadamente 0,3 nM. En cualquiera de los casos precedentes, la actividad inhibidora puede ser una medición del ensayo de bloqueo basado en FRET in vitro. En algunos casos, el ensayo de bloqueo basado en FRET in vitro comprende la escisión de una sonda de H2-Opt (por ejemplo, (Mca)IRRVSYSF(Drip)KK (SEQ ID NO: 152). En cualquiera de los casos precedentes, el valor de CI50 se puede basar en la capacidad del anti-HtrA1 en formato bivalente (por ejemplo, formato IgG) de inhibir la actividad de huHtrA1-PD.

La divulgación también engloba un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de HtrA1, donde el epítopo de HtrA1 comprende al menos un aminoácido de la proteína HtrA1 seleccionado del grupo que consiste en Arg190, Leu192, Pro193, Phe194 y Arg197, donde la numeración de aminoácidos se refiere a la numeración para la proteína precursora HtrA1 humana. En un modo de realización, la proteína precursora HtrA1 humana tiene la secuencia de SEQ ID NO: 121.

En algunos modos de realización, la distancia entre el anticuerpo y el uno o más aminoácidos se determina por cristalografía, por ejemplo, usando los procedimientos de cristalografía descritos en los ejemplos.

En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-HtrA1 puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEXiH (SEQ ID NO: 1), en la que Xi es Met o Leu; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETX2GAAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2), en la que X2 es Glu o Asp; (c) FIVR-FI3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASSSVX3FIH (SEQ ID NO: 4), en la que X3 es Glu o Asn; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSX4LAS (SEQ ID NO: 5), en la que X⁴es Asn, His o Glu; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQWXsSXePWT (SEQ ID NO: 6), en la que X5 es Ser o Tyr y X6 es Ala o Asn, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 1-6.

Por ejemplo, el anticuerpo anti-HtrA1 puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEMH (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETEGAAYNQKFKG (SEQ ID NO: 8); (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RA&ssvefih (SEQ ID NO: 9); (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSNLAS (SEQ ID NO: 10); y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQWSSAPWT (SEQ ID NO: 11), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 3 o 7-11.

En algunos aspectos de la divulgación, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes regiones estructurales (FR) del dominio variable de la cadena pesada (VH): (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYXiFXj (SEQ ID NO: 12), en la que Xi es Lys o Thr y X²es Thr, Lys o Arg; (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de tWRQAPGQGLEWlG (SEQ ID NO: 13); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 14); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15).

En algunos aspectos de la divulgación, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR del dominio variable de la cadena ligera (VL): (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DIQMTGSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGKAPKPLIS (SEQ ID NO: 18); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QVPSRFSGSGSGTDFTLTISSIQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 19); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGQGTKVEtK (SEQ ID NO: 20).

Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEMH (SEQ ID NO: 7); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETEGAAYNQKFKG (SEQ ID NO: 8); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RAS5SVEFIH (SEQ ID NO: 9); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSNLAS (SEQ ID NO: 10); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQWSSAPWT (SEQ ID NO: 11). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT (SEQ ID NO: 16); (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WVRGAPGQGLEWiG (SEQ ID NO: 13); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 14); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15). En otros casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DIGMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGKAPKPLIS (SEQ ID NO: 18); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPSRFSGSQSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 19); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 es APEG.LC3.HC3.

En otro ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEMH (SEQ ID NO: 7); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETDGAAYNQKFKG (SEQ ID NO: 123); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASSSVNFIH (SEQ ID NO: 124); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSNLAS (SEQ ID NO: 10); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQWSSAPWT (SEQ ID NO: 125). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 25); (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WVKQTPVHGLEWIG (SEQ ID NO: 26); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR (SEQ ID NO: 27); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 28). En otros casos, el anticuerpo antiHtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de NIWTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 29); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYGQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 30); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (SEQ ID NO: 31); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 32). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 es 15H6 (también denominado m15H6).

En otro ejemplo, el anticuerpo anti-HtrA1 puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SYIMS (SEQ ID NO: 39); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de YISNGGGTTYYSDTIKG (SEQ ID NO: 40); (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QNFRSDGSSMDY (SEQ ID NO: 41); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASESVDSYGKSFMH (SEQ ID NO: 42); (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LASKLES (SEQ ID NO: 43); y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 44), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 39-44.

En algunos casos, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR del dominio variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 47) O EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS (SEQ ID NO: 57); (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de VWRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 48) o WVRQTPEKRLEWVA (SEQ ID NO: 58); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de rftisrdnskntlylq m nslraedtavyycar (SEQ ID NO: 49) o RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR (SEQ ID NO: 59); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50) o WGQGTAVTVSS (SEQ ID NO: 60).

En algunos casos, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR del dominio variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 51) o NIWTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 61); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 52) o WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 62); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 53) O GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (SEQ ID NO: 63); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 54) o FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 64).

Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes seis HVR: syim s (SEQ ID NO: 39); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de YISNGGGTTYYSDTIKG (SEQ ID NO: 40); (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QNFRSDGSSMDY (SEQ ID NO: 41); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASESVDSYGKSFMH (SEQ ID NO: 42); (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LASKLES (SEQ ID NO: 43); y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 44). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 47); (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 48); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 49); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50). En otros casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 51); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 52); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 53); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 54). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 es h19B12.v1.

En otro ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes seis HVR: SYIMS (SEQ ID NO: 39); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de YISNGGGTTYYSDTIKG (SEQ ID NO: 40); (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QNFRSDGSSMDY (SEQ ID NO: 41); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASESVDSYGKSFMH (SEQ ID NO: 42); (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LASKLES (SEQ ID NO: 43); y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GQNNEDPYT (SEQ ID NO: 44). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS (SEQ ID NO: 57); (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WVRQTPEKRLEWVA (SEQ ID NO: 58); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR (SEQ ID NO: 59); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTAVTVSS (SEQ ID NO: 60). En otros casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye las siguientes cuatro FR del dominio variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de NIWTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 61); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 62); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (SEQ ID NO: 63); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 64). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 incluye (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 es 19B12 (también denominado m19B12).

En otro ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 divulgado en el presente documento incluye una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las HVR de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo 20E2 (SEQ ID NO: 66 y 65, respectivamente), y en el que (i) la secuencia de HVR-L1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 24 34, la secuencia de HVR-L2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-56 y la secuencia de HVR-L3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 89-97 de SEQ ID NO: 66, y (ii) la secuencia de HVR-H1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 31-35, la secuencia de HVR-H2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-65 y la secuencia de HVR-H3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 95-102 de SEQ ID NO: 65, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de las HVR anteriores del anticuerpo 20E2. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 65; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 66; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.

En otro ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 divulgado en el presente documento incluye una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las HVR de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo 3A5 (SEQ ID NO: 68 y 67, respectivamente), y en el que (i) la secuencia de HVR-L1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 24 34, la secuencia de HVR-L2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-56 y la secuencia de HVR-L3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 89-97 de SEQ ID NO: 68, y (ii) la secuencia de HVR-H1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 31-35, la secuencia de HVR-H2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-65 y la secuencia de HVR-H3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 95-102 de SEQ ID NO: 67, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de las HVR anteriores del anticuerpo 3A5. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 67; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 68; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.

En otro ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 divulgado en el presente documento incluye una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las HVR de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo 12A5 (SEQ ID NO: 70 y 69, respectivamente), y en el que (i) la secuencia de HVR-L1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 24 34, la secuencia de HVR-L2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-56 y la secuencia de HVR-L3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 89-97 de SEQ ID NO: 70, y (ii) la secuencia de HVR-H1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 31-35, la secuencia de HVR-H2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-65 y la secuencia de HVR-H3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 95-102 de SEQ ID NO: 69, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de las HVR anteriores del anticuerpo 12A5. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 69; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 70; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.

En algunos casos de la divulgación, el anticuerpo anti-HtrA1 comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, una cualquiera de SEQ ID NO: 21, 23, 76, 77, 78, 93-101, 106 o 107; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, una cualquiera de SEQ ID NO: 22, 24, 72-74, 81-92, 105 o 108; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y un dominio V l que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108.

En algunos casos, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes regiones estructurales (FR) del dominio variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYXiFXz (SEQ ID NO: 12), en la queXi es Lys o Thr y X²es Thr, Lys o Arg; (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 13); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 14); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15). En otros casos, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR del dominio variable de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 25); (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WVKQTPVFIGLEWIG (SEQ ID NO: 26); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR (SEQ ID NO: 27); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 28).

En algunos casos, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR del dominio variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 17); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGKAPKPLIS (SEQ ID NO: 18); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 19); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 20). En otros casos, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede incluir una, dos, tres o cuatro de las siguientes FR del dominio variable de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 29); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 30); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (SEQ ID NO: 31); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 32).

En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, una cualquiera de SEQ ID NO: 45, 55, 65, 67 o 69; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, una cualquiera de SEQ ID NO: 46, 56, 66, 68 o 70; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.

En algunos casos, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a HtrA1, en el que el anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y (b) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, tal como el anticuerpo denominado en el presente documento APEG.LC3.HC3.

En algunos casos, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a HtrA1, en el que el anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y (b) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, tal como el anticuerpo denominado en el presente documento h19B6.v1.

En determinados casos, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 que se une al mismo epítopo que uno cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunos casos, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 que compite por su unión a HtrA1 con uno cualquiera de los anticuerpos precedentes.

En determinados modos de realización, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 precedentes puede tener una o más de las siguientes propiedades: (i) se une a HtrA1 con una proporción de 1 dominio variable con respecto a una subunidad de un trímero de HtrA1 (por ejemplo, un Fab se une a un trímero de HtrA1 con una proporción de 3 Fab con respecto a 1 trímero de HtrA1, y una IgG se une a un trímero de HtrA1 con una proporción de 3 IgG con respecto a 2 trímeros de HtrA1), (ii) para los anticuerpos que comprenden dos dominios variables, se une a HtrA1 de una manera que da como resultado la formación de una "jaula" similar a la mostrada en la FIG. 9 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. US 2013/0129743, (iii) no previene la formación de trímeros de HtrA1, (iv) reacciona de forma cruzada con HtrA1 murina; (v) no reacciona de forma cruzada con HtrA2, HtrA3 y/o HtrA4; (vi) se une a HtrA1 de forma competitiva con un anticuerpo anti-HtrA1 YW505.94.28a (véase, por ejemplo, el documento WO 2013/055998), (vii) inhibe la formación de complejos entre HtrA1 y al-antitripsina (AIAt ). En algunos aspectos, la divulgación proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos precedentes.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-HtrA1 de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1-8 de la sección C "Propiedades y rasgos característicos de los anticuerpos" a continuación.

B. Anticuerpos anti factor D ejemplares

La divulgación proporciona anticuerpos anti factor D que se pueden usar con los anticuerpos anti-HtrA1 de la invención, por ejemplo, en procedimientos de tratamiento de un trastorno, incluyendo un trastorno asociado con HtrA1, un trastorno ocular y/o un trastorno asociado con el complemento (por ejemplo, DMS (por ejemplo, atrofia geográfica)). La divulgación también proporciona anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) que se unen específicamente a HtrA1 y al factor D (por ejemplo, anticuerpos anti-HtrA1/anti factor D). Se puede usar cualquier anticuerpo anti factor D adecuado en las composiciones y procedimientos de la invención. Como ejemplo no limitante, se puede usar cualquier anticuerpo anti factor D descrito en el presente documento y/o en las patentes de EE. UU. n.os 8.067.002; 8.268.310; 8.273.352; y/o en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 14/700.853 en las composiciones y procedimientos de la presente invención.

Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, el anticuerpo monoclonal 166-32 producido a partir del hibridoma depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) y designado HB12476. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 136; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 137; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, tal como el anticuerpo monoclonal anti factor D 166-32. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D es un derivado humanizado del anticuerpo monoclonal 166-32. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti factor D se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 166-32. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D es un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo monoclonal 166-32. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo monoclonal 166-32 es un fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv o (Fab')². En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo monoclonal 166-32 es un Fab.

En algunos casos, se pueden emplear derivados humanizados del anticuerpo monoclonal 166-32 en las composiciones y procedimientos de la invención. Por ejemplo, se puede usar cualquier derivado humanizado del anticuerpo monoclonal 166-32 descrito, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 8.067.002 en las composiciones y procedimientos de la invención. Los derivados humanizados ejemplares del anticuerpo monoclonal 166-32 descritos en la patente de EE. UU. n.° 8.067.002 incluyen, por ejemplo, los clones de anticuerpo anti factor D humanizado n.° 111, n.° 56, n.° 250 y n.° 416. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL de los clones de anticuerpo anti factor D humanizado n.° 111, n.° 56, n.° 250 y n.° 416 se muestran, por ejemplo, en la figura 5 de la patente de EE. UU. n.° 8.067.002. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, el clon de anticuerpo anti factor D n.° 111, n.° 56, n.° 250 o n.° 416.

En algunos casos, se pueden usar anticuerpos anti factor D humanizados modificados o variantes, y fragmentos de los mismos, en las composiciones y procedimientos de la invención. Por ejemplo, se puede usar cualquier versión modificada o variante del clon de anticuerpo anti factor D n.° 111 humanizado descrito, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 8.273.352 en las composiciones y procedimientos de la invención, por ejemplo, el clon de anticuerpo 238 o 238-1. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, el clon de anticuerpo anti factor D 238 o 238-1.

En algunos casos, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WlNTYTGETTYAXiDFKG (SEQ ID NO: 110), en la que Xi es Asp o Glu; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVXiN (SEQ ID NO: 111), en la que Xi es Asn o Ser; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTX¹IX²X³DMN (SEQ ID NO: 112), en la que X¹es Asp o Ser, X²es Asp o Glu y X³es Asp o Ser; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSXiSLPYT (SEQ ID NO: 114), en la que X ¹es Asp o Glu, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 109-114. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYAX¹DFKG (SEQ ID NO: 110), en la que X¹es Asp o Glu; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVX¹N (SEQ ID NO: 111), en la que X¹es Asn o Ser; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTX¹IX²X³DMN (SEQ ID NO: 112), en la que X¹es Asp o Ser, X²es Asp o Glu y X³es Asp o Ser; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSX¹SLPYT (SEQ ID NO: 114), en la que X¹es Asp o Glu.

Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID NO: 115); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVNN (SEQ ID NO: 116); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTDIDDDMN (SEQ ID NO: 117); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSDSLPYT (SEQ ID NO: 118), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 109, 113 o 115-118. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID NO: 115); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVNN (SEQ ID NO: 116); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTDIDDDMN (SEQ ID NO: 117); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSDSLPYT (SEQ ID NO: 118).

En algunos casos, el anticuerpo anti factor D comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, una cualquiera de SEQ ID NO: 119, 131 o 132; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, una cualquiera de SEQ ID NO: 120, 133, 134 o 135; o (c) un VH como en (a) y un VL como en (b). Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120. En otros casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otros casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En otros casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135. En otros casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135. Cualquiera de los anticuerpos anti factor D mostrados en la fig. 30, o una variante de los mismos, o un fragmento de los mismos, se puede usar en las composiciones y procedimientos de la invención. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti factor D es lampalizumab, que tiene el número de registro CAS 1278466-20-8.

En otro ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D es o se deriva de un anticuerpo 20D12, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8.268.310. En un ejemplo, el anticuerpo anti factor D incluye una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las HVR de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo 20D12 (SEQ ID NO: 128 y 127, respectivamente), y en el que (i) la secuencia de HVR-L1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 24-34, la secuencia de HVR-L2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-56 y la secuencia de HVR-L3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 89-97 de SEQ ID NO: 128, y (ii) la secuencia de HVR-H1 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 31-35, la secuencia de HVR-H2 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 50-65 y la secuencia de HVR-H3 comprende los residuos de aminoácido de Kabat 95-102 de SEQ ID NO: 127, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de las HVR anteriores del anticuerpo 20D12.

En algunos casos, el anticuerpo anti factor D comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 127; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 128; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128, tal como el anticuerpo anti factor D 20D12. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D es un derivado humanizado del anticuerpo monoclonal 20D12. En algunos modos de realización, el anticuerpo anti factor D se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 20D12 o un derivado humanizado del mismo. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D es un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo monoclonal 20D12 o un derivado humanizado del mismo. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo monoclonal 20D12 o un derivado humanizado del mismo es un fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv o (Fab')². En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo monoclonal 20D12 o un derivado humanizado del mismo es un Fab.

En algunos casos, se pueden usar fragmentos de cualquiera de los anticuerpos anti factor D precedentes (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno) en las composiciones y procedimientos de la invención. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')², scFv, (scFv)², dAb, de la región hipervariable (HVR), anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario, minicuerpos, diacuerpos o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. En otro modo de realización, se puede usar un fragmento de anticuerpo anti factor D (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno) que puede penetrar sustancialmente en toda la retina en las composiciones y procedimientos de la invención. En incluso otro modo de realización, se puede usar un fragmento de anticuerpo anti factor D (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno) que puede penetrar en todo el espesor de la retina en las composiciones y procedimientos de la invención.

En algunos casos, la invención puede incluir el uso de anticuerpos anti factor D humanizados, en los que un fragmento Fab de dichos anticuerpos tiene una semivida de al menos 3, 5, 7, 10 o 12 días después de la administración en el ojo de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) por medio de una única inyección intravítrea. En otro modo de realización, la invención puede incluir el uso de anticuerpos anti factor D humanizados, en los que un fragmento Fab de dichos anticuerpos inhibe la activación del complemento por la vía alternativa (AP) durante al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 7075, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 o 115 días después de la administración en el ojo de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) por medio de una única inyección intravítrea. En otro modo de realización, la invención puede incluir el uso de anticuerpos anti factor D humanizados, en los que la concentración de un fragmento Fab de dichos anticuerpos que inhibe la activación del complemento por la vía alternativa (AP) se mantiene en el tejido retiniano durante al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 días después de la administración en el ojo de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) por medio de una única inyección intravítrea. En otro modo de realización, la invención puede incluir el uso de anticuerpos anti factor D humanizados, en los que la concentración de un fragmento Fab de dichos anticuerpos que inhibe la activación del complemento por la vía alternativa (AP) se mantiene en el humor vítreo durante al menos 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 o 115 días después de la administración en el ojo de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) por medio de una única inyección intravítrea. En un ejemplo, la invención incluye el uso de un fragmento de dichos anticuerpos anti factor D (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno).

En algunos casos, cualquiera de los anticuerpos anti factor D precedentes se une al factor D con una KD de aproximadamente 20 nM o menor en su forma monovalente (por ejemplo, la KD del anticuerpo como un fragmento Fab al factor D). En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une al factor D con una KD de aproximadamente 10 nM o menor en su forma monovalente. En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une al factor D con una KD de aproximadamente 5 nM o menor en su forma monovalente. En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une al factor D con una KD de aproximadamente 2 nM o menor en su forma monovalente. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD de entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 2 nM (por ejemplo, aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 7 pM, aproximadamente 8 pM, aproximadamente 9 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 25 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 75 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 125 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 175 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 225 pM, aproximadamente 250 pM, aproximadamente 275 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 325 pM, aproximadamente 350 pM, aproximadamente 375 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 425 pM, aproximadamente 450 pM, aproximadamente 475 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 525 pM, aproximadamente 550 pM, aproximadamente 575 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 625 pM, aproximadamente 650 pM, aproximadamente 675 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 725 pM, aproximadamente 750 pM, aproximadamente 775 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 825 pM, aproximadamente 850 pM, aproximadamente 875 pM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 925 pM, aproximadamente 950 pM, aproximadamente 975 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 1,1 nM, aproximadamente 1,2 nM, aproximadamente 1,3 nM, aproximadamente 1,4 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 1,6 nM, aproximadamente 1,7 nM, aproximadamente 1,8 nM, aproximadamente 1,9 nM o aproximadamente 2 nM) en su forma monovalente. En algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD de entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 100 pM en su forma monovalente. En algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD de aproximadamente 0,5 pM en su forma monovalente. En algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD por debajo de aproximadamente 10 pM en su forma monovalente.

En algunos casos, cualquiera de los anticuerpos anti factor D precedentes se une al factor D con una KD de aproximadamente 10 nM o menor en su forma bivalente (por ejemplo, la KD del anticuerpo como una IgG al factor D). En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une al factor D con una KD de aproximadamente 5 nM o menor en su forma bivalente. En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une al factor D con una KD de aproximadamente 2 nM o menor en su forma bivalente. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD de entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 2 nM (por ejemplo, aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 7 pM, aproximadamente 8 pM, aproximadamente 9 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 25 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 75 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 125 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 175 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 225 pM, aproximadamente 250 pM, aproximadamente 275 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 325 pM, aproximadamente 350 pM, aproximadamente 375 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 425 pM, aproximadamente 450 pM, aproximadamente 475 pM aproximadamente 500 pM, aproximadamente 525 pM, aproximadamente 550 pM, aproximadamente 575 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 625 pM, aproximadamente 650 pM, aproximadamente 675 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 725 pM, aproximadamente 750 pM, aproximadamente 775 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 825 pM, aproximadamente 850 pM, aproximadamente 875 pM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 925 pM, aproximadamente 950 pM, aproximadamente 975 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 1,1 nM, aproximadamente 1,2 nM, aproximadamente 1,3 nM, aproximadamente 1,4 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 1,6 nM, aproximadamente 1,7 nM, aproximadamente 1,8 nM, aproximadamente 1,9 nM o aproximadamente 2 nM) en su forma bivalente. En algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD de entre aproximadamente 0,5 pM y aproximadamente 100 pM en su forma bivalente. En algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD de aproximadamente 0,5 pM en su forma bivalente. En algunos casos, el anticuerpo se une al factor D con una KD por debajo de aproximadamente 10 pM en su forma bivalente.

En otro aspecto, un anticuerpo anti factor D de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1-8 de la sección C "Propiedades y rasgos característicos de los anticuerpos" a continuación.

C. Propiedades y rasgos característicos de los anticuerpos

Los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-HtrA1 y anticuerpos anti factor D, como se describe anteriormente, así como anticuerpos anti-HtrA1/anti factor D descritos a continuación), así como cualquiera de los anticuerpos para su uso en un procedimiento descrito en el presente documento, pueden tener cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en las secciones 1-8 a continuación.

1. Afinidad de los anticuerpos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1, un anticuerpo anti factor D o un anticuerpo anti-HtrA1 y anti factor D biespecífico) tiene una constante de disociación (KD) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M). Por ejemplo, en algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une a HtrA1 humana (huHtrA1) con una

KD de aproximadamente 10 nM o menor. En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une a huHtrA1 con una KD de aproximadamente 5 nM o menor. En algunos casos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se une a huHtrA1 con una KD de aproximadamente 2 nM o menor. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 25 pM y aproximadamente 2 nM (por ejemplo, aproximadamente 25 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente

75 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 125 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente

175 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 225 pM, aproximadamente 250 pM, aproximadamente

275 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 325 pM, aproximadamente 350 pM, aproximadamente

375 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 425 pM, aproximadamente 450 pM, aproximadamente

475 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 525 pM, aproximadamente 550 pM, aproximadamente

575 pM, aproximadamente 600 pM, aproximadamente 625 pM, aproximadamente 650 pM, aproximadamente

675 pM, aproximadamente 700 pM, aproximadamente 725 pM, aproximadamente 750 pM, aproximadamente

775 pM, aproximadamente 800 pM, aproximadamente 825 pM, aproximadamente 850 pM, aproximadamente

875 pM, aproximadamente 900 pM, aproximadamente 925 pM, aproximadamente 950 pM, aproximadamente

975 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 1,1 nM, aproximadamente 1,2 nM, aproximadamente 1,3 nM, aproximadamente 1,4 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 1,6 nM, aproximadamente 1,7 nM, aproximadamente 1,8 nM, aproximadamente 1,9 nM o aproximadamente 2 nM). En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 600 pM (por ejemplo, aproximadamente 75 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 125 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 175 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 225 pM, aproximadamente 250 pM, aproximadamente 275 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 325 pM, aproximadamente 350 pM, aproximadamente 375 pM, aproximadamente 400 pM, aproximadamente 425 pM, aproximadamente 450 pM, aproximadamente 475 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 525 pM, aproximadamente 550 pM, aproximadamente 575 pM, aproximadamente 600 pM). En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 500 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 400 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 300 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 200 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 150 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 125 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de entre aproximadamente 75 pM y aproximadamente 100 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de aproximadamente 80 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de aproximadamente 60 pM. En algunos casos, el anticuerpo se une a huHtrA1 con una KD de aproximadamente 40 pM.

En un modo de realización, se mide la KD por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En una divulgación, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (¹²⁵I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando, a continuación, el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.° 269620), se mezcla [¹²⁵I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). A continuación, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se hayan secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™, Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un ²⁰% de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otro modo de realización, se mide la KD usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial (RPS) en BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de su inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie en dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN®-20) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (KD) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación sobrepasa ¹⁰⁶M^{' 1}s^_1por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. La KD también se puede medir usando un ensayo de RPS en BIACORE® como se describe en los ejemplos a continuación.

2. Estabilidad de los anticuerpos

La invención proporciona anticuerpos con estabilidad potenciada, por ejemplo, en comparación con un anticuerpo anti-HtrA1 de referencia. La estabilidad de un anticuerpo se puede determinar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, espectroscopia (por ejemplo, espectroscopia de masas), fluorimetría diferencial de barrido (DSF), dicroísmo circular (CD), fluorescencia de proteína intrínseca, calorimetría diferencial de barrido, dispersión de luz (por ejemplo, dispersión de luz dinámica (DLS) y dispersión de luz estática (SLS), cromatografía de autointeracción (SIC). El anticuerpo anti-HtrA1 puede tener, por ejemplo, una temperatura de fusión (Tf), temperatura de agregación (Tagr) potenciadas u otras métricas de estabilidad en comparación con un anticuerpo anti-HtrA1 de referencia.

La invención proporciona anticuerpos con desamidación reducida en comparación con un anticuerpo anti-HtrA1 de referencia. La desamidación se puede reducir o prevenir como se describe en el presente documento y/o usando procedimientos conocidos en la técnica. La invención también proporciona anticuerpos con oxidación reducida (por ejemplo, oxidación de triptófano, por ejemplo, en la posición LC-W91), por ejemplo, en comparación con un anticuerpo anti-HtrA1 de referencia. La oxidación (por ejemplo, la oxidación de triptófano) se puede reducir o prevenir como se describe en el presente documento y/o usando procedimientos conocidos en la técnica. La invención también proporciona anticuerpos con isomerización reducida, por ejemplo, en comparación con un anticuerpo anti-HtrA1 de referencia. La isomerización se puede reducir o prevenir como se describe en el presente documento y/o usando procedimientos conocidos en la técnica.

3. Fragmentos de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')², Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, eds. Rosenburg y Moore, (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de e E. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')²que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, el documento EP404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

En algunos casos, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1) proporcionado en el presente documento es un Fab. En algunos modos de realización, el Fab comprende un truncamiento en la región bisagra (por ejemplo, la bisagra superior) de la región constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada de Fab termina en la posición 221 (numeración EU). En algunos modos de realización, el residuo de aminoácido en la posición 221 es un residuo de ácido aspártico (D221). En algunos aspectos de la divulgación, la región constante de la cadena pesada del Fab comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 160. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 159. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 160 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 159. En algunos modos de realización, el Fab es un Fab de IgG1.

En algunos casos, el Fab se une a HtrA1 y puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEMH (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETEGAAYNQKFKG (SEQ ID NO: ⁸); (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RA5SSVEF1H (SEQ ID NO: 9); (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSNLAS (SEQ ID NO: 10); y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QOWSSAPWT (SEQ ID NO: 11), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 3 o 7-11. En algunos casos, un Fab de este tipo puede incluir un truncamiento en la región de bisagra (por ejemplo, la bisagra superior) de la región constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada de Fab termina en la posición 221 (numeración EU). En algunos modos de realización, el residuo de aminoácido en la posición 221 es Asp (D221). En algunos aspectos de la divulgación, la región constante de la cadena pesada del Fab comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156. En algunos casos, el Fab incluye las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEMh (SEQ ID NO: 7); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETEGAAYNQKFKG (SEQ ID NO: ⁸); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASSSVEFIH (SEQ ID NO: 9); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSNLAS (SEQ ID NO: 10); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQWSSAFWT (SEQ ID NO: 11), e incluye además una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.

En algunos casos, el Fab se une a HtrA1 y comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; y (c) un truncamiento en la región bisagra (por ejemplo, la bisagra superior) de la región constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada de Fab termina en la posición 221 (numeración EU). En algunos modos de realización, el residuo de aminoácido en la posición ²²¹es Asp (D^{2 21}). En algunos aspectos de la divulgación, la región constante de la cadena pesada del Fab comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 160. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 159. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 160 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 159.

En algunos casos, el Fab se une a HtrA1 y comprende (a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; y (c) una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156.

4. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, un dominio variable derivado de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y un dominio constante humano. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase de la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, se humaniza un anticuerpo no humano para reducir la inmunogenicidad con respecto a los seres humanos, mientras que se retienen la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpo humanas. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos modos de realización, se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791,6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de regiones determinantes de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "barajado de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el barajado de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la estirpe germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

5. Anticuerpos humanos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk et al., Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se haya modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena, en general, se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429, que describe la tecnología HUMAB®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE®, y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®. Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: ⁸⁶(1991)). Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas de células de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3).927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

6. Anticuerpos derivados de colecciones

Se pueden aislar los anticuerpos de la invención cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, es conocida en la técnica una variedad de procedimientos para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, n J, ^{20 01}) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624 ⁶²⁸(1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos no propios y propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos de genes V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contengan secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos con anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

7. Anticuerpos multiespecíficos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de HtrA1. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por HtrA1 y la otra es por cualquier otro antígeno (por ejemplo, una segunda molécula biológica, por ejemplo, el factor D). En consecuencia, el anticuerpo biespecífico puede tener especificidad de unión por HtrA1 y el factor D. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo. Se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 descritos en el presente documento para genomanipular un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), por ejemplo, un anticuerpo biespecífico anti-HtrA1/anti factor D. Se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti factor D descritos en el presente documento y/o conocidos en la técnica para genomanipular un anticuerpo biespecífico anti-HtrA1/anti factor D de este tipo.

Por ejemplo, en algunos casos, un anticuerpo anti-HtrA1 biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a HtrA1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEXiH (SEQ ID NO: 1), en la que Xi es Met o Leu; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de G V D P ETX iG A A Y N Q K FK G (SEQ ID NO: 2), en la que X¹es Glu o Asp; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASSSVX3FIH (SEQ ID NO: 4), en la que X3 es Glu o Asn; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSX-tLAS (SEQ ID NO: 5), en la que X⁴es Asn, His o Glu; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QGWXsSXePWT (SEQ ID NO: ⁶), en la que X5 es Ser o Tyr y X⁶es Ala o Asn, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 1-6, puede tener un segundo dominio de unión que se una al factor D. El segundo dominio de unión que se une específicamente al factor D, por ejemplo, puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYAXiDFKG (SEQ ID NO: 110), en la que X1 es Asp o Glu; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVX¹N (SEQ ID NO: 111), en la que X1 es Asn o Ser; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTX¹IX²X³DMN (SEQ ID NO: 112), en la que X1 es Asp o Ser, X2 es Asp o Glu y X3 es Asp o Ser; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSX¹SLPYT (SEQ ID NO: 114), en la que X1 es Asp o Glu, o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 109-114.

Por ejemplo, en algunos casos, un anticuerpo anti-HtrA1 biespecífico que comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a HtrA1 que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEMH (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETEGAAYNQKFKG (SEQ ID NO: ⁸); (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASSSVEFIH (SEQ ID NO: 9); (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSNLAS (SEQ ID NO: 10); y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQWSSAPWT (SEQ ID NO: 11), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99% de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 3 o 7-11, puede tener un segundo dominio de unión que se una al factor D. El segundo dominio de unión que se une específicamente al factor D, por ejemplo, puede incluir al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID NO: 115); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVNN (SEQ ID NO: 116); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTDIDDDMN (SEQ ID NO: 117); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSDSLPYT (SEQ ID NO: 118), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 109, 113 o 115-118.

En modos de realización particulares, la invención proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 biespecífico que se une específicamente tanto a HtrA¹como al factor D, en el que el anticuerpo comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a HtrA1 que comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DSEMH (SEQ ID NO: 7); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVDPETEGAAYNQKFKG (SEQ ID NO: ⁸); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYDYDYALDY (SEQ ID NO: 3), (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASSSVEFIH (SEQ ID NO: 9); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de ATSNLAS (SEQ ID NO: 10); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQW SSAPW T (SEQ ID NO: 11); y un segundo dominio de unión que se une específicamente al factor D que comprende las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID NO: 115); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVNN (SEQ ID NO: 116); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTDIDDDMN (SEQ ID NO: 117); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSDSLPYT (SEQ ID NO: 118). En algunos casos, el segundo dominio de unión comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR del fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti factor D lampalizumab.

En algunos casos, un anticuerpo anti-HtrA1 biespecífico comprende un primer dominio de unión que se une específicamente a HtrA1 que comprende (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 21; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 22; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b), tal como APEG.LC3.HC3, puede tener un segundo dominio de unión que se una al factor D. El segundo dominio de unión que se une específicamente al factor D, por ejemplo, puede comprender (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 119; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 120; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos casos, el segundo dominio de unión que se une específicamente al factor D puede comprender (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti factor D lampalizumab; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti factor D lampalizumab; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b).

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tengan diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), el documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas en Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a HtrA1, así como a otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).

8. Variantes de anticuerpo

En determinados modos de realización, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, variantes de anticuerpo, incluyendo una o más alteraciones de residuos de aminoácido) de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados modos de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla ¹bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

Tabla 1

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(⁶) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable y/o residuos de FR de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, estabilidad incrementada, expresión incrementada, pI alterado y/o inmunogenicidad reducida) con respecto al anticuerpo original y/o habrá(n) retenido sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración en afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fago y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, la afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o residuos que se entran en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración en afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunos modos de realización de maduración en afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para su maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una colección secundaria. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis o modelado por barrido de alanina. A menudo se seleccionan como diana HVR-H3 y HVR-L3 en particular.

En determinados modos de realización, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados modos de realización de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

En determinados modos de realización, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más FR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Dichas alteraciones, por ejemplo, pueden mejorar la afinidad y/o estabilidad de los anticuerpos (por ejemplo, como se evalúa por una temperatura de fusión incrementada).

Los ejemplos de residuos de la región estructural o residuos de la región HVR para modificar incluyen posibles sitios de desamidación (es decir, asparagina (N o Asn)), sitios de oxidación (es decir, metionina (M o Met) o triptófano (W o Trp)) o sitios de conversión a piroglutamato (es decir, glutamina (Q o Gln)), en los que la modificación en dichos sitios previene o reduce la desamidación y/u oxidación y/o conversión a piroglutamato, respectivamente.

Para prevenir o reducir la formación de variantes desamidadas, se puede mutar asparagina (N o Asn) a alanina (A o Ala), glutamina (Q o Gln) o serina (S o Ser). Para prevenir o reducir la formación de variantes oxidadas, se puede mutar metionina (Met) o triptófano (W o Trp) a leucina (L) o isoleucina (I). Para prevenir o reducir la formación de variantes de piroglutamato, se puede mutar glutamina (Q o Gln) a glutamato (E o Glu). Véase, por ejemplo, Amphlett et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140, 1996. De forma alternativa, o además, una o más alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de los residuos de la región estructural pueden estar en la región Fc del anticuerpo original.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar como diana para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se remplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones aminoacídicas que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar como diana o eliminar como candidatos para la sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amínico y/o carboxílico que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.

b) Variantes de glucosilación

En determinados modos de realización, se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o retire uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une, en general, por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia despreciables en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108; US 2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); la sol. de pat. de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con genes inactivados (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-⁶⁸⁸(2006); y el documento WO 2003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpo con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878; patente de EE. UU. n.° 6.602.684; y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.

c) Variantes de la región Fc

En determinados modos de realización, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando, de este modo, una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprenda una alteración (por ejemplo, una sustitución) de residuos de aminoácido en una o más posiciones de aminoácido. En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, que le convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo sea importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) sean innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/empobrecimiento de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carezca de unión a FcyR (de ahí que carezca probablemente de actividad ADCC), pero retenga su capacidad de unión a FcRn. Las principales células para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan FcyRiII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991).

Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); pat. de EE. UU. n.° 5.821.337; y Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo a Ct I™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CYTOTOX 96® (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C¹q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C¹q y, de ahí, que carezca de actividad c Dc . Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos w O 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar determinaciones de la unión a FcRn y la eliminación/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes con respecto a Fc incluyen mutantes con respecto a Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante con respecto a Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).

En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).

En algunos modos de realización, las alteraciones se realizan en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alterada (es decir, mejorada o bien disminuida), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

En el documento US 2005/0014934A1 (Hinton et al.) se describen anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311,312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826). Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de EE. UU. n.° 5.648.260; la patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.

d) Variantes de anticuerpo genomanipulado con cisteína

En determinados modos de realización, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados modos de realización, se puede sustituir con cisteína uno cualquiera o más de los siguientes residuos: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. Uu . n.° 7.521.541.

e) Derivados de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones, que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, independientemente de si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, y similares.

Los conjugados anticuerpo-polímero se pueden preparar usando cualquier técnica adecuada para derivatizar el anticuerpo con polímeros. Se apreciará que la invención no se limita a conjugados que utilizan cualquier tipo particular de enlace entre un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un polímero.

En un aspecto, los conjugados de la invención incluyen especies en las que un polímero se une covalentemente a un sitio específico o sitios específicos en el anticuerpo original, es decir, la unión del polímero selecciona como diana una región particular o a un residuo o residuos de aminoácido particular(es) en el anticuerpo original o fragmento de anticuerpo. La conjugación de polímeros específica de sitio se logra lo más comúnmente por unión a residuos de cisteína en el anticuerpo original o fragmento de anticuerpo. En dichos modos de realización, la química de acoplamiento puede utilizar, por ejemplo, el grupo sulfhidrilo libre de un residuo de cisteína que no esté en un puente disulfuro en el anticuerpo original. El polímero se puede activar con cualquier grupo funcional que pueda reaccionar específicamente con el/los grupo(s) sulfhidrilo o tiol libre(s) en el anticuerpo original, tal como los grupos funcionales maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tesilato, aciridina, exirano y 5-piridilo. El polímero se puede acoplar al anticuerpo original usando cualquier protocolo adecuado para la química del sistema de acoplamiento seleccionado, tal como los protocolos y sistemas descritos en las patentes de EE. UU. n.os 4.179.337 y 7.122.636; y Jevsevar et al., Biotech. J. 5:113-128, 2010.

En un modo de realización, se usa(n) uno o más residuos de cisteína naturalmente presentes en el anticuerpo original como sitio(s) de unión para la conjugación a polímeros. En otro modo de realización, se genomanipula(n) uno o más residuos de cisteína en un sitio o sitios seleccionados en el anticuerpo original con el propósito de proporcionar un sitio o sitios de unión específicos para el polímero.

En un aspecto, la divulgación engloba conjugados fragmento de anticuerpo-polímero, en los que el fragmento de anticuerpo es un Fab, y el polímero se une a uno o más residuos de cisteína en la cadena ligera o pesada del fragmento Fab que normalmente formarían el enlace disulfuro intercatenario que enlaza las cadenas ligera y pesada.

En otro aspecto, la divulgación engloba conjugados fragmento de anticuerpo-polímero, en los que el fragmento de anticuerpo es un Fab', y la unión del polímero selecciona como diana la región bisagra del fragmento Fab'. En un modo de realización, se usa(n) uno o más residuos de cisteína naturalmente presentes en la región bisagra del fragmento de anticuerpo para unir el polímero. En otro modo de realización, se genomanipula(n) uno o más residuos de cisteína en la región bisagra del fragmento Fab' con el propósito de proporcionar un sitio o sitios de unión específicos para el polímero. En un modo de realización, un fragmento Fab de la invención (por ejemplo, un fragmento Fab anti-HtrA1, un fragmento Fab anti factor D o un fragmento Fab anti-HtrA1/anti factor D) se modifica añadiendo una cisteína en el extremo C' terminal con el propósito de proporcionar un sitio de unión para la conjugación a polímeros. En otro modo de realización, el fragmento Fab de la invención se modifica añadiendo cuatro residuos adicionales, Cys-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 122), en el extremo C' terminal con el propósito de proporcionar dos sitios de unión para la conjugación a polímeros.

Una conjugación a anticuerpos comúnmente usada es la PEGilación, en la que uno o más polímeros de polietilenglicol (PEG) están unidos covalentemente a la región constante del anticuerpo. Véanse las pat. de EE. UU. n.os 4.179.337 y 7.122.636. Se han conocido y usado ampliamente en el campo polímeros de PEG de diferentes tamaños (por ejemplo, de aproximadamente 500 D a aproximadamente 300.000 D) y conformaciones (por ejemplo, lineal o ramificada). Los polímeros útiles para la presente invención se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Nippon Oil and Fats; Nektar Therapeutics; Creative PEGWorks) o preparar a partir de materiales de partida disponibles comercialmente usando procedimientos químicos convencionales. La PEGilación cambia las propiedades físicas y químicas del fármaco de anticuerpo, y puede dar como resultado comportamientos farmacocinéticos mejorados, tales como estabilidad mejorada, inmunogenicidad disminuida, vida en circulación extendida, así como tiempo de residencia incrementado. En otro modo de realización, cualquier anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención) se puede conjugar a ácido hialurónico (HA).

En otro modo de realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Karn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan el resto no proteínico a una temperatura en la que se destruyen las células proximales al anticuerpo-resto no proteínico.

f) Variantes de punto isoeléctrico

La divulgación proporciona variantes de anticuerpo con puntos isoeléctricos alterados. Por ejemplo, la divulgación proporciona variantes de anticuerpo con un punto isoeléctrico (pI) reducido, por ejemplo, en comparación con un anticuerpo anti-HtrA1 de referencia. En algunos casos, la carga superficial se reduce a pH fisiológico. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 tiene un pI igual a o menor que aproximadamente ⁸(por ejemplo, de aproximadamente ⁸, aproximadamente 7, aproximadamente ⁶, aproximadamente 5 o aproximadamente 4). En algunos casos, el anticuerpo tiene un pI de aproximadamente 4 a aproximadamente ⁸(por ejemplo, de aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente ⁶, aproximadamente 7 o aproximadamente ⁸). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 tiene un pI de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 (por ejemplo, de aproximadamente 5, aproximadamente ⁶o aproximadamente 7). En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA¹tiene un pI de aproximadamente 5 a aproximadamente ⁶(por ejemplo, de aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7, aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9 o aproximadamente ⁶).

Los anticuerpos de la divulgación se pueden genomanipular para que tengan un pI reducido, por ejemplo, sustituyendo los residuos de aminoácido naturales en una posición dada con un aminoácido que tenga un pI menor. El pI de un aminoácido se puede determinar en base a los valores de pKa de la amina (-NH²), ácido carboxílico (-COOH) y la cadena lateral del aminoácido, que son conocidos en la técnica. En algunos modos de realización, los residuos de aminoácido expuestos a la superficie se pueden sustituir para reducir el pI de un anticuerpo. En un modo de realización, los residuos de aminoácido expuestos a la superficie se pueden sustituir con glutamato (E). En un modo de realización, los residuos de aminoácido expuestos a la superficie se pueden sustituir con aspartato (D).

D. Procedimientos y composiciones recombinantes

Cualquiera de los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-HtrA1) descritos en el presente documento se puede producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. En un modo de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-HtrA¹descrito en el presente documento. Un ácido nucleico de este tipo puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En otro modo de realización, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden un ácido nucleico de este tipo. En otro modo de realización, se proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico de este tipo. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (¹) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En un modo de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-HtrA1, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-HtrA1, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan ni glucosilación ni función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli. Después de su expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras en las que sus vías de glucosilación se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adapten para su cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea c V1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293, como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A): células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TR1, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.

255-268 (2003).

E. Ensayos

Los anticuerpos anti-HtrA1 (por ejemplo, anticuerpos anti-HtrA1 y anticuerpos anti-HtrA1/anti factor D) proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar para determinar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

1. Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, se somete a prueba un anticuerpo de la divulgación para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, ensayos de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, BIACORE®), etc.

En un aspecto, la actividad de unión a antígeno (por ejemplo, como se indica por KD) se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial (RPS) en BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACo Re®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de su inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie en dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEe N®-20) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (KD) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación sobrepasa 10⁶M^{' 1}s^_1por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. La KD también se puede medir usando un ensayo de RPS en BIACORE® como se describe en los ejemplos a continuación.

En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo como se describe en el presente documento por su unión a HtrA1. En determinados modos de realización, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por un anticuerpo como se describe en el presente documento. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" en Methods in Molecular Biology vol. ⁶⁶(Humana Press, Totowa, NJ).

En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba HtrA1 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a HtrA1 y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo por su unión a HtrA1. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba HtrA1 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de su incubación, en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a HtrA1, se retira el anticuerpo no unido en exceso y se mide la cantidad de marcador asociado con HtrA1 inmovilizada. Si se reduce sustancialmente la cantidad de marcador asociado con HtrA1 inmovilizada en la muestra de prueba con respecto a la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por su unión a HtrA1. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Ensayos de actividad

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-HtrA1 de los mismos que tengan actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, inhibir, bloquear, antagonizar, suprimir, interferir, modular y/o reducir una o más actividades biológicas de HtrA1. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En determinados modos de realización, un anticuerpo de la divulgación se somete a prueba para determinar dicha actividad biológica. En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-HtrA1 se une a HtrAI y reduce o inhibe su actividad serina proteasa para uno o más sustratos para HtrA1, incluyendo, por ejemplo, el sustrato H2-Opt, los sustratos a-caseína, p-caseína o caseína con BODIPY® FL como se describe en los ejemplos a continuación o cualquier otro sustrato para HtrA1 adecuado. En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-HtrA1 inhibe la actividad serina proteasa de HtrA1 con una CI⁵⁰de menos de 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1 nM, 800 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM o menos para uno o más sustratos para HtrA1. En determinados modos de realización, un anticuerpo anti-HtrA1 protege a las células fotorreceptoras de la degradación, protege el espesor de la capa nuclear exterior o protege la actividad funcional del electrorretinograma en un modelo de enfermedad ocular, tal como el modelo de ratón de exposición constante a la luz descrito en el ejemplo 10 del documento US 2013/0129743.

Para determinar si un anticuerpo anti factor D, o variante o fragmento del mismo (por ejemplo, fragmento de unión a antígeno) se puede unir al factor D y ejercer un efecto biológico, por ejemplo, inhibición de la hemólisis por la vía alternativa, se pueden usar ensayos de inhibición hemolítica usando glóbulos rojos de conejo (RBC), incluyendo los descritos en el ejemplo 2 de la patente de EE. UU. n.° 8.273.352, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Dicha inhibición hemolítica se puede determinar usando ensayos estándar (Kostavasili et al., J. Immunology 158:1763-72, 1997; Wiesmann et al., Nature 444:159-60, 2006). La activación del complemento en dichos ensayos se puede iniciar con suero o plasma. Se pueden determinar concentraciones apropiadas del factor D en suero o plasma (Pascual et al., Kidney International 34:529-536, 1998; Complement Facts Book, editores Bernard J. Morley y Mark J. Walport, Academic Press (2000); Barnum et al., J. Immunol. Methods, 67: 303-309, 1984) de forma rutinaria de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los que se han descrito en referencias tales como Pascual et al., supra y Barnum et al., supra, y el ejemplo 4 de la patente de EE. UU. n.° 8.273.352. Los anticuerpos anti factor D descritos en el presente documento, en general, pueden inhibir las actividades biológicas asociadas con el factor D. Por ejemplo, a una concentración de 18 pg/ml (equivalente a aproximadamente 1,5 veces la concentración molar de factor D humano en la sangre; la proporción molar del anticuerpo anti factor D para el factor D de aproximadamente 1,5:1), se puede observar una inhibición significativa de la actividad del complemento alternativo por el anticuerpo (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.956.107).

3. Ensayos de estabilidad

En un aspecto, se proporcionan ensayos para determinar la estabilidad (por ejemplo, termoestabilidad) de un anticuerpo anti-HtrA¹. Por ejemplo, la estabilidad de un anticuerpo se puede determinar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, fluorimetría diferencial de barrido (DSF), dicroísmo circular (CD), fluorescencia de proteína intrínseca, calorimetría diferencial de barrido, espectroscopia, dispersión de luz (por ejemplo, dispersión de luz dinámica (DLS) y dispersión de luz estática (SLS), cromatografía de autointeracción (SIC). La estabilidad de un ensayo se puede determinar como se describe en el presente documento, por ejemplo, usando espectrometría de masas como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 4, por ejemplo, en el contexto de una prueba de agresión con AAPH y/o una prueba de agresión térmica.

F. Procedimientos y composiciones para el diagnóstico y la detección

En determinados modos de realización, cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de HtrA1 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como una muestra que comprende células fotorreceptoras, células del epitelio pigmentario retiniano, células de la capa nuclear exterior, de la capa nuclear interior, gliocitos de Müller, epitelio ciliar o tejido retiniano. En algunos modos de realización, una muestra biológica comprende un líquido corporal, por ejemplo, vítreo o sangre.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de HtrA1 en una muestra biológica. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-HtrA1 como se describe en el presente documento en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-HtrA1 a HtrA1, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-HtrA1 y HtrA1. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En un modo de realización, se usa un anticuerpo anti-HtrA1 para seleccionar sujetos idóneos para su tratamiento con un anticuerpo anti-HtrA1, por ejemplo, donde HtrA1 es un biomarcador para la selección de pacientes.

En determinados modos de realización, se puede identificar un paciente adecuado para su tratamiento con un anticuerpo anti-HtrA1 detectando uno o más polimorfismos en el gen HtrA1 o la secuencia de control de HtrA1, tal como el polimorfismo en el promotor de HtrA1 rs11200638(G/A) (véase, por ejemplo, DeWan et al., Science 314: 989-992, 2006, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad).

Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo de la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos asociados con HtrA, trastornos oculares, trastornos asociados con el complemento y preeclampsia. En algunos casos, el trastorno ocular incluye, pero no se limita a, por ejemplo, DMS, incluyendo DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, atrofia geográfica (AG)), retinopatía diabética (RD), retinopatía del prematuro (RP) o vasculopatía coroidea polipoidea (VCP).

En algunos modos de realización, la preeclampsia se puede diagnosticar usando un anticuerpo de la invención. En algunos modos de realización, un nivel incrementado de HtrA1 en una muestra derivada de un sujeto con respecto a un nivel de referencia de HtrA1 puede indicar que el sujeto tiene, o es susceptible a, preeclampsia. Véase, por ejemplo, Teoh et al. Placenta 36(9):990-995, 2015. En algunos modos de realización, se pueden detectar niveles de HtrA1 en suero usando un anticuerpo de la invención. En otros modos de realización, se pueden detectar niveles de HtrA1 en la placenta usando un anticuerpo de la invención.

En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos anti-HtrA1 marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, 3H y ¹³¹I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-⁶-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

En otro modo de realización de la divulgación, el anticuerpo no se necesita marcar y la presencia del mismo se puede detectar usando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo.

Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden emplear en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un patrón marcado de competir con el analito en la muestra de prueba en cuanto a la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de antígeno en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos, en general, se insolubilizan antes o después de la competencia, de modo que el patrón y analito que se unen a los anticuerpos se puedan separar convenientemente del patrón y analito que permanecen sin unir.

Los ensayos de tipo sándwich implican el uso de dos anticuerpos, pudiéndose unir cada uno a una diferente porción inmunógena, o epítopo, de la proteína que se va a detectar. En un ensayo de tipo sándwich, el analito de la muestra de prueba se une por un primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido y, después de esto, un segundo anticuerpo se une al analito, formando, por tanto, un complejo de tres partes insoluble. Véase, por ejemplo, la pat. de EE. Uu . n.° 4.376.110. El segundo anticuerpo se puede marcar por sí mismo con un resto detectable (ensayos directos de tipo sándwich) o se puede medir usando un anticuerpo antiinmunoglobulina que se marque con un resto detectable (ensayo de tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de tipo sándwich es un ensayo ELISA, caso en el que el resto detectable es una enzima.

Para la inmunohistoquímica, la muestra puede ser recién preparada o congelada o se puede incluir en parafina y fijar con un conservante, tal como formol, por ejemplo.

G. Kits de diagnóstico

Por comodidad, se puede proporcionar un anticuerpo de la presente divulgación (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 o un anticuerpo anti-HtrA1/anti factor D) en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo se marca con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, normalmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivos que tenga la concentración apropiada.

H. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo o variante de anticuerpo del mismo (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrAI o un anticuerpo anti-HtrA1/anti factor D de la divulgación) se pueden preparar para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes "farmacéuticamente aceptables" opcionales típicamente empleados en la técnica (denominándose todos "excipientes"). Por ejemplo, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, A. Osol, Ed. (1980). Dichos aditivos deben ser atóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.

Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Están presentes preferentemente a concentraciones que varían de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes tamponantes adecuados para su uso con la presente invención incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como tampones citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartáricohidróxido de sodio, etc.), tampones fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), tampón oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), tampones lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acéticoacetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Adicionalmente, se pueden mencionar tampones fosfato, tampones histidina y sales de trimetilamina, tales como Tris.

Se pueden añadir conservantes para retardar el crecimiento microbiano y se pueden añadir en cantidades que varían de 0,2 %-1 % (p/v). Los conservantes adecuados para su uso con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), cloruro de hexametonio, alquilparabenos, tales como metil- o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Se pueden añadir isotonicificantes, a veces conocidos como "estabilizantes", para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente invención e incluyen alditoles polihídricos, preferentemente alditoles trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función desde un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alditoles polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc.; glúcidos orgánicos o alditoles, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles, tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácido; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, ^{< 10}residuos); proteínas, tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos, tales como xilosa, manosa, fructosa y glucosa; disacáridos, tales como lactosa, maltosa y sacarosa; y trisacáridos, tales como rafinosa; y polisacáridos, tales como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a ^{10 .000}pesos por parte de proteína activa en peso.

Se pueden añadir tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar la proteína terapéutica (por ejemplo, el anticuerpo), así como para proteger a la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por agitación, lo que también permite que la formulación se exponga a esfuerzos superficiales de corte sin provocar la desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80 y similares), polioxámeros (184, 188 y similares), polioles PLURONIC®, monoéteres de sorbitán polioxietilenado (TWEEN®-20, TWEEN®-80 y similares). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Los excipientes diversos adicionales incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina y vitamina E) y codisolventes. La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable incluir un antagonista de unión a HtrA1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1) y un antagonista de unión al factor D (por ejemplo, un anticuerpo anti factor D) en la formulación. En otro ejemplo, para tratar un trastorno ocular asociado con neovascularización no deseada, tal como DMS húmeda, puede ser deseable proporcionar además un tratamiento antiangiogénico, tal como un tratamiento antagonista de VEGF, por ejemplo, LUCENTIS® (ranibizumab). Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que sean eficaces para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa, o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, A. Osal, Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, o variante o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento de unión a antígeno) del mismo, estando las matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación mantenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de ²-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (pat. de EE. UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprorrelina) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico posibilitan la liberación de moléculas durante más de ¹⁰⁰días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que da como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para su estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tiodisulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices de polímero específicas.

I. Procedimientos y composiciones terapéuticos

Cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-HtrA1 y anticuerpos anti-HtrA1/anti factor D) se puede usar en procedimientos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso como un medicamento. En otros aspectos, la invención proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 es DMS, incluyendo DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, atrofia geográfica (AG)). En algunos casos, la DMS es DMS seca avanzada (por ejemplo, AG).

En otro modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en el tratamiento de un trastorno ocular. En algunos casos, el trastorno ocular es DMS, incluyendo DMS húmeda (exudativa) (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (no exudativa) (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, Ag ); retinopatía diabética (RD) y otras retinopatías relacionadas con isquemia; endoftalmitis; uveítis; neovascularización coroidea (NVC); retinopatía del prematuro (RP); vasculopatía coroidea polipoidea (VCP); edema macular diabético; miopía patológica; enfermedad de Von Hippel-Lindau; histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena retiniana central (OVRC), neovascularización corneal o neovascularización retiniana. En algunos modos de realización, el trastorno ocular es DMS (por ejemplo, DMS seca avanzada (por ejemplo, AG)).

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado con HtrA1 que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-HtrA1. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 es DMS, incluyendo DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, AG)). En algunos casos, la DMS es DMS seca avanzada (por ejemplo, AG).

En otro caso, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno ocular que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-HtrA1. En algunos casos, el trastorno ocular es DMS, incluyendo DMS húmeda (exudativa) (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (no exudativa) (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, AG); RD y otras retinopatías relacionadas con isquemia; endoftalmitis; uveítis; NVC; RP; VCP; edema macular diabético; miopía patológica; enfermedad de Von Hippel-Lindau; histoplasmosis del ojo; OVRC; neovascularización corneal; o neovascularización retiniana. En algunos modos de realización, el trastorno ocular es DMS (por ejemplo, DMS seca avanzada (por ejemplo, AG)).

En algunos casos, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en la inhibición de la degeneración retiniana o de las células fotorreceptoras en un sujeto. En otros casos, la invención proporciona un anticuerpo anti-HtrA1 para su uso en la inhibición de la actividad serina proteasa de HtrA1 en el ojo de un sujeto. Un "sujeto" de acuerdo con cualquiera de los usos anteriores puede ser un ser humano.

La divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-HtrA1 en la fabricación o preparación de un medicamento. Por ejemplo, en un caso, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1. En otro caso, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1 que comprende administrar a un sujeto que tiene un trastorno asociado con HtrA1 una cantidad eficaz del medicamento. En cualquiera de los usos precedentes de los medicamentos, el procedimiento puede incluir administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 es DMS, incluyendo DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, AG)). En algunos casos, la DMS es DMS seca avanzada (por ejemplo, AG).

En otro caso, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno ocular que comprende administrar al sujeto que tiene un trastorno ocular una cantidad eficaz del medicamento. En algunos casos, el trastorno ocular es DMS, incluyendo DMS húmeda (exudativa) (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (no exudativa) (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, a G); RD y otras retinopatías relacionadas con isquemia; endoftalmitis; uveítis; NVC; RP; VCP; edema macular diabético; miopía patológica; enfermedad de Von Hippel-Lindau; histoplasmosis del ojo; OVRC; neovascularización corneal; o neovascularización retiniana. En algunos modos de realización, el trastorno ocular es DMS (por ejemplo, DMS seca avanzada (por ejemplo, AG)).

La divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno asociado con HtrA1. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un sujeto que tiene un trastorno asociado con HtrA1 una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-HtrA1. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 es DMS, incluyendo DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, AG)). En algunos casos, la DMS es DMS seca avanzada (por ejemplo, AG). En otros casos, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación. Un "sujeto" de acuerdo con cualquiera de los procedimientos anteriores puede ser un ser humano.

La divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno ocular. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un sujeto que tiene un trastorno ocular una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-HtrA1. En algunos casos, el trastorno ocular es DMS, incluyendo DMS húmeda (exudativa) (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (no exudativa) (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, AG); RD y otras retinopatías relacionadas con isquemia; endoftalmitis; uveítis; NVC; RP; VCP; edema macular diabético; miopía patológica; enfermedad de Von Hippel-Lindau; histoplasmosis del ojo; OVRC; neovascularización corneal; o neovascularización retiniana. En algunos modos de realización, el trastorno ocular es DMS (por ejemplo, DMS seca avanzada (por ejemplo, AG)).

La divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1, un trastorno ocular y/o un trastorno asociado con el complemento en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de unión a HtrA1 y/o un antagonista de unión al factor D. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno asociado con el complemento es un trastorno ocular. En algunos modos de realización, el trastorno ocular se selecciona del grupo que consiste en DMS, retinopatía diabética, neovascularización coroidea (NVC), uveítis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de Von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena retiniana central, vascularización corneal y neovascularización retiniana. En algunos casos, el trastorno ocular es DMS, incluyendo DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, AG)). En algunos casos, la DMS es DMS seca avanzada (por ejemplo, AG). En cualquiera de los modos de realización precedentes, el antagonista de unión a HtrA1 puede ser un anticuerpo anti-HtrA1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, cualquier anticuerpo anti-HtrA1 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFV y (Fab')². En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno es un Fab. En algunos modos de realización, el Fab comprende un truncamiento en la región bisagra (por ejemplo, la bisagra superior) de la región constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada de Fab termina en la posición 221 (numeración EU). En algunos modos de realización, el residuo de aminoácido en la posición 221 es un residuo de ácido aspártico. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada del Fab comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156. En algunos modos de realización, el Fab es un Fab de IgG1. En algunos casos, el antagonista de unión al factor D es un anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos anti factor D descritos en el presente documento.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo biespecífico que se une específicamente tanto a HtrA1 como al factor D o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno asociado con HtrA1, un trastorno ocular y/o un trastorno asociado con el complemento. En algunos modos de realización, el trastorno asociado con HtrA1 y/o el trastorno asociado con el complemento es un trastorno ocular. En algunos casos, el trastorno ocular es DMS, incluyendo DMS húmeda (incluyendo DMS húmeda temprana, intermedia y avanzada) y DMS seca (incluyendo DMS seca temprana, intermedia y avanzada (por ejemplo, AG)). En algunos modos de realización, la DMS es DMS seca avanzada (por ejemplo, a G). El anticuerpo biespecífico puede comprender un dominio de unión que se une específicamente a HtrA1 que se deriva de cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 descritos en el presente documento. El anticuerpo biespecífico puede comprender un dominio de unión que se una específicamente al factor D que se derive de cualquiera de los anticuerpos anti factor D descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno es un fragmento Fab o un fragmento (Fab')².

Cualquiera de los anticuerpos anti factor D o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento y/o conocidos en la técnica se pueden usar en cualquiera de los procedimientos o usos precedentes. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo puede incluir las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYAXiDFKG (SEQ ID NO: 110), en la que Xi es Asp o Glu; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVXiN (SEQ ID NO: 111), en la que Xi es Asn o Ser; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTX¹IX²X²DMN (SEQ ID NO: 112), en la que X ¹es Asp o Ser, X²es Asp o Glu y X³es Asp o Ser; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSX¹SLPYT (SEQ ID NO: 114), en la que X¹es Asp o Glu. En algunos casos, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO: 109); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID NO: 115); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de EGGVNN (SEQ ID NO: 116); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ITSTDIDDDMN (SEQ ID NO: 117); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GGNTLRP (SEQ ID NO: 113); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de LQSDSLPYT (SEQ ID NO: 118). En algunos modos de realización, el anticuerpo anti factor D o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye (a) un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119; (b) un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). En algunos casos, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119. En algunos casos, el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo de unión a antígeno anti factor D es lampalizumab, que tiene el número de registro CAS 1278466-20-8.

Se contempla que el anticuerpo de la presente invención se pueda usar para tratar a un mamífero. En un modo de realización, el anticuerpo se administra a un mamífero no humano con el propósito de obtener datos preclínicos, por ejemplo. Los mamíferos no humanos ejemplares que se van a tratar incluyen primates no humanos, perros, gatos, roedores (por ejemplo, ratones y ratas) y otros mamíferos en los que se realizan estudios preclínicos. Dichos mamíferos pueden ser modelos animales establecidos para una enfermedad que se va a tratar con el anticuerpo o se pueden usar para estudiar la toxicidad del anticuerpo de interés. En cada uno de estos modos de realización, se pueden realizar estudios de escalada de dosis en el mamífero.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-HtrA1 proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

En cualquiera de los usos y procedimientos terapéuticos descritos en el presente documento, el anticuerpo anti-HtrA1 puede ser un Fab. En algunos modos de realización, el Fab comprende un truncamiento en la región bisagra (por ejemplo, la región bisagra superior) de la región constante de la cadena pesada. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada de Fab termina en la posición 221 (numeración EU). En algunos modos de realización, el residuo de aminoácido en la posición 221 es un residuo de ácido aspártico. En algunos modos de realización, la región constante de la cadena pesada del Fab comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156. En algunos modos de realización, el Fab es un Fab de IgG1.

Se puede administrar un anticuerpo de la divulgación (y cualquier agente terapéutico adicional) para la prevención o tratamiento de una enfermedad o afección ocular por cualquier medio adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, inyección ocular, intraocular y/o intravítrea, y/o inyección yuxtaescleral, y/o inyección subtenoniana, y/o inyección supracoroidea y/o administración tópica en forma de colirios y/o pomada. Dichos anticuerpos de la invención se pueden administrar por una variedad de procedimientos, por ejemplo, por vía intravítrea como un dispositivo y/o depósito que permita la liberación lenta del compuesto en el vítreo, incluyendo los descritos en referencias tales como Intraocular Drug Delivery, editores Jaffe, Jaffe, Ashton y Pearson, Taylor & Francis (marzo de 2006). En un ejemplo, un dispositivo puede estar en la forma de una minibomba y/o una matriz y/o un sistema de difusión pasiva y/o células encapsuladas que liberan el compuesto durante un periodo de tiempo prolongado (Intraocular Drug Delivery, editores Jaffe, Jaffe, Ashton y Pearson, Taylor & Francis (marzo de 2006). También se pueden usar otros procedimientos de administración, que incluyen, pero no se limitan a, administración tópica, parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal e intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea.

Las formulaciones para administración ocular, intraocular o intravítrea se pueden preparar por procedimientos y usando excipientes conocidos en la técnica. Un rasgo característico importante para un tratamiento eficaz es la penetración apropiada a través del ojo. A diferencia de las enfermedades de la parte frontal del ojo, donde los fármacos se pueden administrar por vía tópica, las enfermedades retinianas típicamente se benefician de un enfoque más específico de sitio. Los colirios y pomadas rara vez penetran en la parte posterior del ojo y la barrera hematoocular dificulta la penetración de fármacos administrados sistémicamente en el tejido ocular. En consecuencia, un procedimiento de elección para la administración de fármacos para tratar la enfermedad retiniana, tal como DMS y NVC, típicamente es la inyección intravítrea directa. Las inyecciones intravítreas normalmente se repiten a intervalos que dependen de la afección del paciente y las propiedades y semivida del fármaco administrado. Para la penetración intraocular (por ejemplo, intravítrea), normalmente son preferentes moléculas de tamaño más pequeño.

Los ojos tienen muchos rasgos característicos biofísicos y anatómicos que pueden hacer que la administración ocular de fármacos sea problemática. Por ejemplo, las barreras hematooculares son mecanismos de defensa para proteger al ojo de una infección, pero, al mismo tiempo, hacen que sea difícil que el fármaco penetre, especialmente para enfermedades en los segmentos posteriores del ojo. En consecuencia, a menudo se desea la administración en alta dosis para lograr y mantener la biodisponibilidad in situ del fármaco (por ejemplo, el tiempo de residencia ocular) para mejorar la eficacia. Mientras tanto, el espacio limitado en la parte posterior del ojo restringe el volumen de fármaco que se va a administrar, lo que, a su vez, puede favorecer a los fármacos que se van a administrar en una formulación a alta concentración.

Los pacientes con trastornos oculares (por ejemplo, DMS (por ejemplo, atrofia geográfica)) también se pueden beneficiar de la administración de acción prolongada/liberación lenta de medicamentos. Una dosificación menos frecuente proporcionaría comodidad incrementada al paciente, tendría beneficios potenciales de tasa de infección disminuida y eficacia clínica incrementada. La liberación controlada de fármacos en alta dosis también podría minimizar los efectos secundarios del fármaco. Dos sistemas prometedores para la administración de acción prolongada son los implantes sólidos basados en PLGA y un sistema de administración por vía (PDS) implantable. Ambos sistemas tienen el potencial de proporcionar una cinética de liberación de casi orden cero durante un periodo de tiempo extendido. Para los implantes de PLGA, el fármaco de proteínas se encapsula en una matriz de polímero hidrófobo y la liberación del fármaco se logra por medio de hidrólisis lenta del polímero. La tasa de liberación se puede controlar cambiando la carga de fármaco, la hidrofobia del polímero o el peso molecular del polímero. El PDS es un dispositivo recargable donde la liberación en el vítreo se controla por una membrana de metal porosa que comprende una frita de titanio. Puesto que el depósito tiene un volumen bajo, se requiere una alta concentración de proteínas para la administración eficaz con el PDS.

Además de o en lugar de administración en alta concentración y de acción prolongada, una biodisponibilidad incrementada (por ejemplo, el tiempo de residencia ocular) del fármaco se puede lograr, o facilitar, por modificaciones postraduccionales, en las que el fármaco de proteínas se conjuga covalentemente con polímeros naturales o sintéticos, tales como como polisialilación, HESilación (conjugación con hidroxietilalmidón) y PEGilación. Véase, por ejemplo, Chen et al., Expert. Opin. Drug Deliv. 8:1221-36, 2011; Kontermann, BioDrugs 23:93-109, 2011. La PEGilación, la unión covalente del polímero polietilenglicol (PEG) a una proteína, es una tecnología bien establecida especialmente útil para extender la semivida de los medicamentos de fragmentos de anticuerpo. Jevsevar et al., Biotech. J. 5:113-128, 2010.

Las condiciones a las que se expone un fármaco varían dependiendo del sistema de administración usado. Para su incorporación en implantes de PLGA sólidos, se usa un fármaco liofilizado o secado por pulverización. Los implantes se producen usando un procedimiento de extrusión de fusión en caliente, de modo que el fármaco se expone brevemente a temperaturas cercanas a 90 °C. Aunque el fármaco permanece en estado sólido durante la duración de la liberación, la degradación de PLGA puede exponer al fármaco a un entorno de pH bajo. Por el contrario, el fármaco administrado con el PDS se mantiene a alta concentración en estado líquido y se expone al vitreo, que se caracteriza por ser un entorno reductor a la fuerza iónica y pH fisiológicos.

La cantidad de anticuerpo o variante de anticuerpo del mismo que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección ocular particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y se puede determinar por técnicas clínicas estándar. Cuando sea posible, es deseable determinar la curva de respuesta a la dosis y las composiciones farmacéuticas de la invención en primer lugar in vitro y, a continuación, en sistemas de modelos animales útiles antes de las pruebas en seres humanos.

Los medios de administración adecuados adicionales incluyen administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o prolongada. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación que incluyen, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples durante diversos puntos de tiempo, administración con inyección intravenosa rápida e infusión pulsada. En algunos casos, el anticuerpo anti-HtrA1 se puede administrar por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica, percutánea, intrarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intrarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intraperitoneal, peritoneal, intraventricular, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraorbital, oral, tópica, transdérmica, por inhalación, por inyección, por implantación, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada bañando las células diana directamente, por catéter, por lavado, en cremas o en composiciones lipídicas.

La eficacia del tratamiento de los trastornos oculares (por ejemplo, trastornos oculares asociados con el complemento), tales como DMS o NVC, se puede medir por diversos criterios de valoración usados comúnmente en la evaluación de las enfermedades intraoculares. Por ejemplo, se puede evaluar la pérdida de visión. La pérdida de visión se puede evaluar por cualquier procedimiento conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, medición por el cambio medio en la agudeza visual con la mejor corrección (AVMc ) desde el valor de referencia hasta un punto de tiempo deseado (por ejemplo, donde la AVMC se basa en la tabla de agudeza visual del Estudio del tratamiento temprano de la retinopatía diabética (ETDRS) y la evaluación a una distancia de prueba de 4 metros), medición de la proporción de sujetos que pierden menos de 15 letras en agudeza visual en un punto de tiempo deseado en comparación con el valor de referencia, medición de la proporción de sujetos que ganan más de o igual a 15 letras en agudeza visual en un punto de tiempo deseado en comparación con el valor de referencia, medición de la proporción de sujetos con un equivalente de Snellen de agudeza visual de 20/2000 o peor en un punto de tiempo deseado, medición del Cuestionario de funcionamiento visual del NEI, medición del tamaño de NVC y cantidad de fuga de NVC en un punto de tiempo deseado, por ejemplo, por angiografía con fluoresceína y similares. Se pueden realizar evaluaciones oculares, por ejemplo, que incluyan, pero no se limiten a, por ejemplo, realizar un examen ocular, medir la presión intraocular, evaluar la agudeza visual, medir la presión con lámpara de hendidura, evaluar la inflamación intraocular y similares.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, del tipo de anticuerpo, de la gravedad y evolución de la enfermedad, ya sea si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, del tratamiento previo, de la anamnesis del paciente y de la respuesta al anticuerpo y del criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, ⁶mg/kg, 7 mg/kg, ⁸mg/kg, 9 mg/kg o 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. En algunos modos de realización, el anticuerpo usado es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente ^{0 ,01}mg/kg a aproximadamente ²⁰mg/kg, de aproximadamente ^{0 ,01}mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg o de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente ¹pg/kg a ¹⁰⁰mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantendría, en general, hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad.

En algunos casos, se administra una dosis fija de un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención, por ejemplo, a un ojo. En algunos casos, se administran a un ojo de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg o aproximadamente 5-15 mg de un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente 0,5 mg/ojo, de aproximadamente 0,5 mg/ojo a aproximadamente 1 mg/ojo, de aproximadamente 1 mg/ojo a aproximadamente 1,5 mg/ojo, de aproximadamente 1,5 mg/ojo a aproximadamente 2 mg/ojo, de aproximadamente 2 mg/ojo a aproximadamente 2,5 mg/ojo, de aproximadamente 2,5 mg/ojo a aproximadamente 3 mg/ojo, de aproximadamente 3 mg/ojo a aproximadamente 3,5 mg/ojo, de aproximadamente 3.5 mg/ojo a aproximadamente 4 mg/ojo, de aproximadamente 4 mg/ojo a aproximadamente 4,5 mg/ojo, de aproximadamente 4,5 mg/ojo a aproximadamente 5 mg/ojo, de aproximadamente 5 mg/ojo a aproximadamente 5.5 mg/ojo, de aproximadamente 5,5 mg/ojo a aproximadamente ⁶mg/ojo, de aproximadamente ⁶mg/ojo a aproximadamente 6,5 mg/ojo, de aproximadamente 6,5 mg/ojo a aproximadamente 7 mg/ojo, de aproximadamente 7 mg/ojo a aproximadamente 7,5 mg/ojo, de aproximadamente 7,5 mg/ojo a aproximadamente ⁸mg/ojo, de aproximadamente ⁸mg/ojo a aproximadamente 8,5 mg/ojo, de aproximadamente 8,5 mg/ojo a aproximadamente 9 mg/ojo, de aproximadamente 9 mg/ojo a aproximadamente 9,5 mg/ojo o de aproximadamente 9,5 mg/ojo a aproximadamente 10 mg/ojo. En algunos casos, se usa el anticuerpo a de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente 2 mg/ojo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente 3 mg/ojo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente 5 mg/ojo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente ⁶mg/ojo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente 7 mg/ojo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente ⁸mg/ojo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente 9 mg/ojo, de aproximadamente 0,1 mg/ojo a aproximadamente 10 mg/ojo, de aproximadamente 0,5 mg/ojo a aproximadamente 2 mg/ojo, de aproximadamente 0,5 mg/ojo a aproximadamente 3 mg/ojo, de aproximadamente 1 mg/ojo a aproximadamente 3 mg/ojo o de aproximadamente 2 mg/ojo a aproximadamente 5 mg/ojo. En algunos casos, se usa una dosis fija de un anticuerpo anti-HtrA1 de aproximadamente 0,5 mg/ojo, aproximadamente 1 mg/ojo, aproximadamente 1,5 mg/ojo, aproximadamente 2 mg/ojo, aproximadamente 2,5 mg/ojo, aproximadamente 3 mg/ojo, aproximadamente 3.5 mg/ojo, aproximadamente 4 mg/ojo, aproximadamente 4,5 mg/ojo, aproximadamente 5 mg/ojo, aproximadamente 5,5 mg/ojo, aproximadamente ⁶mg/ojo, aproximadamente 6,5 mg/ojo, aproximadamente 7 mg/ojo, aproximadamente 7,5 mg/ojo, aproximadamente ⁸mg/ojo, aproximadamente 8,5 mg/ojo, aproximadamente 9 mg/ojo, aproximadamente 9,5 mg/ojo, aproximadamente 10 mg/ojo o más. En un caso particular, por ejemplo, se administra una dosis fija de un anticuerpo anti-HtrA1 a aproximadamente 2 mg/ojo.

En algunos modos de realización, la dosis se puede administrar una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada diez semanas, una vez cada once semanas o una vez cada doce semanas.

Se puede administrar un antagonista de unión a HtrA1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 de la divulgación) solo o en combinación con al menos un segundo compuesto terapéutico. La administración del antagonista de unión a HtrA1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención) y cualquier segundo compuesto terapéutico se puede realizar simultáneamente, por ejemplo, como una única composición o como dos o más composiciones distintas usando la misma vía de administración o diferentes. De forma alternativa, o adicionalmente, la administración se puede hacer secuencialmente, en cualquier orden. En determinados modos de realización, pueden estar presentes intervalos que varían de minutos a días, a semanas a meses, entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el antagonista de unión a HtrA1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención) se puede administrar en primer lugar, seguido del segundo compuesto terapéutico. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o administración del segundo compuesto terapéutico antes del antagonista de unión a HtrA1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-HtrA1 de la invención). En un ejemplo, el antagonista de unión a HtrA1 es un anticuerpo anti-HtrA1, por ejemplo, cualquier anticuerpo anti-HtrA1 descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En un ejemplo, el segundo compuesto terapéutico es un antagonista de unión al factor D. En otro ejemplo, el antagonista de unión al factor D es un anticuerpo anti factor D, por ejemplo, cualquier anticuerpo anti factor D descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En modos de realización particulares, el anticuerpo anti factor D es lampalizumab. En otros modos de realización, el anticuerpo anti factor D se administra a una dosis de 1-15 mg, por ejemplo, a una dosis de 10 mg. En modos de realización particulares, el lampalizumab se administra una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente terapéutico adecuado para el tratamiento de un trastorno ocular asociado con neovascularización no deseable en el ojo, tal como, por ejemplo, DMS húmeda. Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, tratamientos antiangiogénicos, tales como antagonistas de VEGF (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de anticuerpo, incluyendo LUCENTIS® (ranibizumab), y anticuerpos anti-VEGFR1 y moléculas relacionadas (por ejemplo, aflibercept (trampa para VEGF en el ojo; EYLEA®)); inhibidores del sistema del complemento, tales como los antagonistas del factor C2 del complemento (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-CFC2); y agentes antiinflamatorios, tales como los antagonistas de unión a IL^{- 6}(por ejemplo, tocilizumab (ACTEMRA®) y EBI-031 (Eleven Biotherapeutics)). En otros modos de realización, el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con neovascularización ocular no deseable puede implicar una combinación de un anticuerpo anti-HtrA1 y tratamiento fotodinámico (por ejemplo, con MACUGEN™ o VISUDYNE™).

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, caso en que la administración del anticuerpo de la invención se puede producir antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes terapéutico(s) adicional(es). En un modo de realización, la administración del antagonista de unión a HtrA1 (por ejemplo, anticuerpo anti-HtrA1) y la administración de un agente terapéutico adicional se producen dentro de aproximadamente un mes, o dentro de aproximadamente una, dos o tres semanas, o dentro de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días entre sí.

Se entiende que se puede llevar a cabo cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores usando un inmunoconjugado de la divulgación en lugar de o además de un anticuerpo anti-HtrA1.

J. Artículos de fabricación

En otro aspecto de la divulgación se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

III. Ejemplos

Desarrollo de anticuerpos estables, de alta potencia, de alta afinidad que se unen a HtrA1

El objetivo de los siguientes experimentos fue descubrir nuevos anticuerpos anti-HtrA1 que tengan mayor potencia y mayor afinidad por HtrA1.

En primer lugar, se generaron ratones con genes inactivados para mHtrA1. Fue necesario usar ratones con genes inactivados porque los esfuerzos iniciales para generar hibridomas a partir de ratones que expresaban HtrA1 no tuvieron éxito, probablemente porque las proteínas HtrA1 murinas y humanas comparten un 98 % de identidad de secuencia.

Luego, los ratones con genes inactivados para HtrA1 se inmunizaron con el dominio proteasa de mHtrA1. Los hibridomas resultantes se cribaron por ELISA y se identificaron 75 clones positivos para ELISA. Se sometió a prueba la capacidad de los 75 clones de inhibir la escisión de un sustrato para proteasa HtrA1. Se demostró que 10 de los 75 clones inhibían la actividad proteasa de HtrA1.

Se seleccionaron siete de estos clones para otro análisis en base a su capacidad de inhibir la actividad proteasa, de unirse a HtrA1 humana y murina y de unirse selectivamente a muHtrA1 sobre muHtrA3 y muHtrA4. Estos siete clones experimentaron otro cribado y se descubrió que cuatro tuvieron una potencia mejorada en cuanto a HtrA1 en comparación con el anticuerpo de control YW505.94. Se seleccionaron dos de estos anticuerpos, 15H6 y 9B12, para su desarrollo adicional en base a su perfil molecular preferente, incluyendo potencia y selectividad.

Las regiones hipervariables de los anticuerpos seleccionados se injertaron en una región estructural humana como se explica a continuación. Se sometió a prueba la importancia de las referencias de Vernier de la cadena ligera de ratón en cuanto a 15H6 intercambiando individualmente estos residuos y sometiendo a prueba la unión a HtrA1 humana y de ratón. Una sustitución suprimió la unión, dos redujeron la unión, dos afectaron solo la unión a HtrA1 murina y tres no tuvieron ningún impacto significativo sobre la unión. Estas tres sustituciones se introdujeron en el anticuerpo 15H6.v1 para preparar el anticuerpo 15H6.v2

A continuación, se genomanipuló 15H6.v2 para mejorar su estabilidad. Se identificaron residuos potencialmente inestables que podrían dar lugar a oxidación (W91 en HVR-L3), reticulación con inmunoprecipitación (N94 P95 en HVR-LC) y desamidación (D55 G56 en HVR-H2). Las sustituciones de W91 tuvieron sustancialmente un impacto sobre la unión. Se sometieron a prueba cuatro sustituciones en la posición N94. Dos de estas sustituciones tuvieron un impacto sobre la unión, pero se seleccionaron dos para un análisis adicional. Se sometieron a prueba cuatro sustituciones en la posición D55. Solo una de estas sustituciones mostró una unión comparable a la molécula original.

La siguiente etapa fue mejorar la afinidad de la unión de h15H6.v2 a HtrA1. Como primera etapa, se usó una secuenciación profunda para investigar la relación estructura/función para h15H6.v2. De las muchas mutaciones individuales sometidas a prueba en este experimento, se descubrió que aproximadamente 19 mutaciones individuales mejoran la afinidad por HtrA1. Se diseñaron y sometieron a prueba anticuerpos que contenían combinaciones de las mutaciones en LC y HC con la tasa de disociación más lenta, lo que dio como resultado la identificación de anticuerpos variantes que tenían una potencia y afinidad por HtrA1 mejoradas. También se genomanipularon variantes que tuvieron la mejor afinidad y potencia para introducir las sustituciones estabilizantes descritas anteriormente. De las variantes resultantes, se descubrió que h15H6.v4 tuvo la potencia más alta frente a HtrA1.

La estructura de h15H6.v4 en formato Fab unida a HtrA1 se determinó por cristalografía de rayos X y microscopia electrónica. Este análisis estructural reveló que el Fab h15H6.v4 se une estrechamente al "bucle LA" de la proteína HtrA1. El epítopo unido por h15H6.v4 es distinto del unido por el anticuerpo de control YW505.94. Aunque no se pretende que la presente invención esté vinculada a ningún mecanismo particular, es posible que la estrecha interacción entre h15H6.v4 y el bucle LA de HtrA1 explique la afinidad y potencia significativamente mejoradas de este anticuerpo en comparación con YW505.94.

Los experimentos descritos anteriormente se explican con mayor detalle a continuación.

Ejemplo 1: generación de anticuerpos anti-HtrA1 usando enfoques de hibridoma

A. Medios y anticuerpos

El medio B (n.° de cat. 03802), medio C (n.° de cat. 03803), medio D (n.° de cat. 03804) y medio E (n.° de cat.

03805) CLONACELL™-HY eran de StemCell Technologies. El medio C (n.° de cat. LCM-C) CYTOFUSION® usado para la electrofusión era de Cyto Pulse Sciences. El anti-Ig de ratón con F(ab')2 caprino marcado con aloficocianina (APC) era de SouthernBiotech (n.° de cat. 1012-11), el anticuerpo anti-Fc de IgG de ratón caprino conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) era de Sigma. El sustrato de micropocillos de HRP de un componente con TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (n.° de cat. TMBW-1000-01) y el reactivo de detención TMB (n.° de cat. BSTP-1000-01) eran de BioFx Laboratories.

B. Inmunización in vivo de ratones

Se inmunizaron cinco ratones con genes inactivados para HtrA1 (HtrA1.noneo.BALB.ko.C1-3) con dominio proteasa de HtrA¹murina recombinante marcada con His purificado (denominado en el presente documento muHtrA1-PD-His, SEQ ID NO: 153; véase el ejemplo 2 del documento w O 2013/055998) suspendido en adyuvante monofosforil lípido A/dicorinomicolato de trehalosa por inyección en almohadilla plantar (2 pg/inyección por ratón) a intervalos de 3 a 4 días para un total de 12 refuerzos, seguido de 2 refuerzos de prefusión con antígeno en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Tres días después del refuerzo final, se recogieron y aislaron linfocitos de bazos y ganglios linfáticos de ratones inmunizados. Se preparó muHtrA1-PD-His para su inyección por purificación como se describe en el ejemplo 2 del documento WO 2013/055998.

C. Fusión celular, cribado de hibridomas y subclonación

Se fusionaron células de bazo de ratón aisladas de dos ratones (números 748 y 749) con células de mieloma SP2/0 (American Type Culture Collection) usando el aparato Cyto Pulse CEEF-50 (Cyto Pulse Sciences). En resumen, después de lavar dos veces con medio C CYTOFUSION®, las células de bazo aisladas y las células SP2/0 se mezclaron a una proporción 1:1 y, a continuación, se resuspendieron en medio C CYTOFUSION® a una concentración de 10 millones de células/ml. La electrofusión se realizó de acuerdo con la orientación del fabricante. Las células fusionadas se cultivaron en medio C CLONACELL™-HY durante la noche a 37 °C en una estufa de incubación con un 7 % de CO². Al día siguiente, las células fusionadas se centrifugaron y, a continuación, se resuspendieron en 10 ml de medio C CLONACELL™-HY y, a continuación, se mezclaron suavemente con 90 ml de medio D CLONACELL™-HY basado en metilcelulosa que contenía los reactivos selectivos hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Las células se sembraron en placa en placas de Petri de 40 x 100 mm (n.° de cat.

351029, Becton Dickinson) y se dejó que crecieran a 37 °C en una estufa de incubación con un 7 % de CO². Después de 10 días de incubación, se tomaron 1429 clones de hibridoma único usando un sistema CLONEPIX™ (Genetix, Reino Unido) y se transfirieron a placas de cultivo celular de 15 x 96 pocillos (n.° 353075, Becton Dickinson) con 200 pl/pocillo de medio E CLONACELL™-HY. Se cambiaron los medios de cultivo de hibridoma y, 3 días más tarde, se cribaron los sobrenadantes de hibridoma por un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para someter a ensayo su unión a muHtrA1-PD-His.

Se realizó el ELISA de acuerdo con un protocolo estándar. En resumen, se recubrieron placas para ELISA de microvaloración de 96 pocillos (Greiner, Alemania) con 100 pl/pocillo de muHtrA1-PD-His o huHtrA1-PD-His (SEQ ID NO: 154) a 2 pg/ml en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6) a 4 °C durante la noche. Después de lavar tres veces con tampón de lavado (TWEEN® 20 al 0,05 % en PBS, Sigma), las placas se bloquearon con 100 pl de diluyentes de ensayo ELISA con BSA. Se añadieron 100 pl de sobrenadantes cultivados o anticuerpos monoclonales (mAb) purificados diluidos y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces y se incubaron con anti-Fc de IgG de ratón caprino conjugado con HRP durante 1 h. Después de lavar tres veces, se detectó la enzima unida por adición de 100 pl/pocillo del sustrato TMB (BioFX Laboratories) durante 5 min. Las reacciones se detuvieron añadiendo 100 pl/pocillo de reactivo de detención (BioFX Laboratories), seguido de detección del color a una absorbancia a 650 nm (A650 nm). Se identificaron 105 sobrenadantes positivos para ELISA iniciales. Después de la expansión y cultivo durante 3 días, estos clones se volvieron a cribar en un ELISA posterior que confirmó que 75 de los 105 clones todavía eran positivos para ELISA en cuanto a su unión a muHtrA1-PD-His (figs. 1A y 1B). La mayoría de estos 75 clones también se unieron al dominio proteasa de HtrA1 humana (figs. 1A y ¹B).

Luego, los 75 clones positivos para ELISA se sometieron a prueba usando un ensayo in vitro para evaluar la capacidad del sobrenadante de hibridoma de inhibir la escisión de un sustrato por el dominio proteasa de HtrA1 humana (huHtrA1-PD-His; SEQ ID NO: 154). Se usó el ensayo con proteasa con fluorescencia verde ENZCHEK® (ThermoFisher Scientific). Este ensayo emplea un derivado de caseína que está fuertemente marcado con el tinte BODIPY® FL verde fluorescente insensible al pH como sustrato. La fluorescencia del tinte BODIPY® FL se extingue intramolecularmente en el sustrato marcado de longitud completa. La escisión del sustrato por huHtrA1-PD libera péptidos marcados con BODIPY® FL fluorescentes, lo que da como resultado un incremento de la señal de fluorescencia (fig. 2A). En resumen, se incubaron el sobrenadante de hibridoma y HtrA1-PD (hHtrA1-PD 20 nM; 40 pl de hHtrA1-PD con respecto a 60 pl de sobrenadante) en un tampón (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, CHAPS al 0,25 %, pH 8,0) en un volumen de 200 pl durante 20 min a 37 °C. Se añadieron 5 pg/ml del sustrato marcado con BODIPY® FL y se leyó la fluorescencia (mili unidades de fluorescencia relativas (mUFR)/min) durante 20 min. Usando este ensayo de bloqueo, se descubrió que 10 de los 75 clones inhibían la escisión del sustrato mediada por HtrA1-PD humana (figs. 2B y 2C). Las figs. 3A y 3B muestran una comparación de la capacidad de un subconjunto de clones de inhibir la actividad de muHtrA1-PD en comparación con huHtrA1-PD.

Después de al menos 2 tandas de subclonación de células únicas por dilución limitante, se aumentaron a escala 7 clones con características variables (20E2, 19B12, 12A5, 3A5, 15H6, 15E3 y 19G10) y se obtuvieron los sobrenadantes para la purificación de anticuerpos y evaluación adicional. Estos clones se eligieron, en parte, en base a la capacidad de inhibir la actividad de HtrA1 in vitro y la unión a muHtrA3 (19B12). Los 7 clones también se sometieron a prueba para determinar la capacidad de detectar muHtrA1 en una inmunohistoquímica, así como para determinar la capacidad de unirse a HtrA3-PD murina y HtrA4-PD murina (como se evalúa por ELISA). La tabla 2 muestra un resumen de las propiedades cualitativas de estos 7 clones.

Tabla 2: propiedades de 7 clones finales seleccionados para la purificación de anticuerpos

La siguiente etapa fue determinar si los siete anticuerpos seleccionados anteriormente inhibían la escisión mediada por HtrA1 como se mide en un ensayo por FRET.

Los sobrenadantes de hibridoma se purificaron por cromatografía de afinidad con proteína A, seguido de filtración estéril (tamaño de poro de 0,2 pm, Nalge Nunc International, NY, USA) y almacenamiento a 4 °C en PBS. Los anticuerpos monoclonales purificados se confirmaron por ELISA y FACS antes de realizar otras pruebas en ensayos funcionales. Los isotipos de mAb purificados se determinaron por el kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón ISOSTRIP™ (Roche Diagnostics Corporation).

Los anticuerpos purificados se sometieron a prueba para determinar la capacidad de inhibir la actividad de HtrA1 en un ensayo de bloqueo basado en FRET (por ejemplo, ensayo con H2-Opt). En este ensayo, se determinó la capacidad del anticuerpo de inhibir la escisión de un sustrato de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, también denominada transferencia de energía por resonancia de Forster). El sustrato peptídico de FRET H2-Opt, que tiene un peso molecular de 1600 Da, incluye el donante Mca (7-metoxicumarin-4-il-acetilo) y el aceptor (extintor) Dnp (N-2,4-dinitrofenilo). La secuencia de longitud completa del sustrato peptídico de FRET es (Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK (SEQ ID NO: 152). En el sustrato peptídico intacto, el resto de extinción Dnp extingue la fluorescencia del donante Mca. La escisión proteolítica del sustrato peptídico de FRET separa el fluoróforo y el extintor, aliviando, de este modo, la extinción de la fluorescencia de Mca y dando como resultado una señal fluorescente incrementada (fig. 4A). El ensayo se realizó usando las condiciones del ensayo con H2-Opt descritas a continuación en el ejemplo 3, sección F. El incremento dependiente del tiempo de la intensidad de fluorescencia está relacionado con el grado de hidrólisis del sustrato. Los anticuerpos se sometieron a prueba a concentraciones de 5 nM, 50 nM y 500 nM. Cinco de los anticuerpos anti-HtrA1 purificados (15H6, 19B12, 3A5, 12A5 y 20E2) retuvieron la capacidad de bloquear la escisión del sustrato mediada por HtrA1-PD humana y murina (figs. 4B y 4C).

Luego, se sometió a prueba la capacidad de los anticuerpos purificados de inhibir la escisión del sustrato mediada por HtrA1 de longitud completa. El ensayo de bloqueo basado en FRET descrito en el párrafo precedente se empleó usando muHtrA1 o huHtrA1 de longitud completa (FL) purificada. muHtrA1-FL y huHtrA1-FL se purificaron como se describe en el ejemplo 2 del documento w O 2013/055998. Los anticuerpos purificados, incluyendo 15H6 y 19B12, inhibieron la actividad de huHtrA1-FL (figs. 5A-5B) y muHtrA1-FL (figs. 5C-5D). En este ensayo, el clon 15H6 inhibió huHtrA1-FL con una CI50 de 0,7 nM, que se mejoró aproximadamente dos veces en comparación con la CI50 del anticuerpo de control positivo YW505.94. 15H6 inhibió muHtrA1-FL con una CI50 de 1,1 nM, que se mejoró casi 5 veces en comparación con el anticuerpo de control positivo YW505.94. El clon 19B12 inhibió huHtrA1-FL con una CI50 de 1,4 nM e inhibió muHtrA1-FL con una CI50 de 1,0 nM. Los anticuerpos seleccionados se secuenciaron como se describe a continuación en la sección D. Las secuencias de estos cinco anticuerpos se muestran en las fig. ⁶A y fig. ⁶B. Se seleccionaron dos anticuerpos, 15H6 y 19B12, para su desarrollo adicional en base a su perfil molecular preferente, incluyendo su potencia y su selectividad. El reformateo de estos anticuerpos se describe a continuación en la sección E.

D. Secuenciación de anticuerpos a partir de clones de hibridoma

i. Clonación de secuencias génicas de la región variable de células de hibridoma usando amplificación rápida en 5' de extremos de ADNc (5'-RACE) en un formato de 96 pocillos

Para cada clon de hibridoma, se transfirieron aproximadamente 25 pl de células de crecimiento en fase logarítmica (0,5-1,0x10⁶células/ml) de placas de cultivo tisular a pocillos de una placa de fondo en U de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 150 pl de 1x PBS frío para lavar las células antes de su centrifugación a 1000 rpm durante 5 min. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 25 pl de 1x PBS frío.

ii. Reacción de reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR)

Se preparó una mezcla maestra que consistía en lo siguiente (para 50 pocillos) en un tubo Eppendorf: 2,5 pl de RNASEOUT™ (Invitrogen, n.° 10777019), 12,5 pl de 10x tampón de síntesis (5x tampón SUPERSCRIPT®), 12,5 pl de ditiotreitol (DTT) (0,1 M, Invitrogen, n.° P/NY00147), 6,25 pl de dNTP (10 mM, Invitrogen, n.° 18427-013), 12,5 pl de nonilfenoxipolietoxiletanol (NP-40) al 2,5 %, 6,25 pl de seroalbúmina bovina (BSA) a 2 mg/ml (BioLabs, n.° 9001S), 25 pl de cebador RACE4muHC (1:100 en agua de calidad para PCR) (se sustituyó el cebador Race 3 kappa para secuenciar la cadena ligera (LC)), 37,5 pl de agua de calidad para PCR y 10 pl de enzima SUPERSCRIPT® 3 (Invitrogen, n.° 18080-093). La secuencia de nucleótidos del cebador redundante Race4muHC es TTT YTT GTC CAC CKT GGT GCT GC (SEQ ID NO: 139), donde Y codifica C o T y K codifica G o T. La secuencia de nucleótidos del cebador Race 3 kappa es GTA GAA GTT GTT CAA GAA G (SEQ ID NO: 140).

A continuación, se transfirieron 2,5 pl/pocillo de mezcla maestra a una placa de reacción de PCR de 96 pocillos. Se añadió 1 pl de células/pocillo a la placa, la placa se centrifugó brevemente durante 30 segundos y, a continuación, la placa se agitó. La placa se colocó en la máquina de PCR y el programa se estableció en 30 min a 45 °C seguido de 30 minutos a 50 °C. Esta placa se marcó como placa A.

iii. Reacción de adición de cola

Se preparó un 10x tampón madre de adición de cola con los siguientes ingredientes (para 50 pocillos): 5 pl de MgCl²1 M, 5 pl de DTT 0,1 M, 5 pl de Tris 1 M, pH 7,5, 10 pl de dGTP 100 mM y 25 pl de agua de calidad para PCR.

Se preparó una solución de trabajo con los siguientes ingredientes (para 50 pocillos): 50 pl del 10x tampón madre de adición de cola, 312,5 pl de agua de calidad para PCR y 12,5 pl de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) de 300 unidades (Promega, n.° M828A/C).

A continuación, esta solución de trabajo se añadió a la placa A de reacción de PCR a 7,5 pl/pocillo. A continuación, se dispuso la placa A en la máquina de PCR durante 1 h a 37 °C seguido de 5 min a 65 °C. Esta placa se marcó como placa A/B para distinguir la adición de cola de esta placa.

i v. Primera reacción de PCR

Se preparó una mezcla maestra que consistía en lo siguiente (para 50 pocilios) en un tubo Falcon de 15 ml: 1050 pl de agua de calidad para PCR, 500 pl de 5x tampón de reacción de PCR para ADNc con GC, 500 pl de reactivo GC-Melt (Clontech, n.° S1091), 50 pl del cebador directo DC5dn, 50 pl de Race7muHC (cebador Race 2 kappa para LC), 50 pl de dNTP (10 mM) y 50 pl de polimerasa GC ADVANTAGE® (Clontech, n.° S1088). La secuencia de nucleótidos del cebador redundante Race7muHC es CARGTC AMD G TCACT GRC TCA G (SEQ ID NO: 141), donde R codifica A o bien G, M codifica A o bien C y D codifica G o bien A o bien T. La secuencia de nucleótidos del cebador Race 2 kappa es GAG GCA CCT CCA GAT GTT AAC (SEQ ID NO: 142).

A continuación, se transfirieron 45 pl de esta mezcla maestra a los pocillos de una nueva placa de reacción de PCR y, a continuación, se añadió 1 pl del molde de la placa A/B. A continuación, esta placa se dispuso en la máquina de PCR y se procesó en un procedimiento de Touchdown PCR con temperaturas de hibridación decrecientes, como se enumera a continuación. Esta placa se marcó como placa C.

Procedimiento de Touchdown PCR:

96 °C durante 4 min

3 ciclos de [96 °C durante 45 s, 64 °C durante 30 s, ⁶⁸°C durante 90 s], 3 ciclos de [96 °C durante 45 s, 61 °C durante 30 s, ⁶⁸°C durante 90 s], 3 ciclos de [96 °C durante 45 s, 58 °C durante 30 s, ⁶⁸°C durante 90 s], 3 ciclos de [96 °C durante 45 s, 57 °C durante 30 s, ⁶⁸°C durante 90 s], 3 ciclos de [96 °C durante 45 s, 55 °C durante 30 s, ⁶⁸°C durante 90 s]

25 ciclos de [96 °C durante 45 s, 52 °C durante 30 s, ⁶⁸°C durante 90 s]

⁶⁸°C durante 5 min, seguido de una retención final a 4 °C.

Después, se procesaron 3 pl de producto de PCR en un E-GEL® de bromuro de etidio (EtBr) al 2 % y se comprobaron las bandas. Se añadió exol/fosfatasa alcalina de gamba (SAP) a 10 pl/pocillo y se dispuso en la máquina de PCR durante 45 min a 37 °C seguido de 15 min a 85 °C. La mezcla maestra de exol/SAP se preparó para 50 pocillos: 2,5 pl de 20 unidades/pl de exonucleasa I (Fermentas, n.° EN0582), 25 pl de SAP (USB, n.° 70092Y), 472,5 pl de agua de calidad para PCR. Se preparó una dilución 1:4 del producto de PCR en agua. El cebador Race7muHC se usó para secuenciar la cadena pesada (HC) y el cebador Race7.1muLC se usó para secuenciar la LC. La secuencia de nucleótidos del cebador Race7.1muLC es ACT GCT CAC TGG ATG GTG GGA AG (SEQ ID NO: 143).

v. Caracterización por filtración en gel y espectrometría de masas

Para el análisis de filtración en gel, se inyectaron 10 ml de muestra purificada en TSK-GEL® Super SW3000 (4,6 mm de diámetro interior x 30 cm, TOSOH Bioscience) a 0,35 ml/min usando K²PO⁴200 mM, KCl 250 mM, pH 7,0 como la fase móvil. Aproximadamente se redujeron 2 mg de IgG purificada con ditiotreitol 50 mM a 37 °C durante 20 min y se analizaron por espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF) (Agilent, CL/EM 6224) después de la separación de fase inversa en línea usando una columna PLRP-S (Agilent) y gradiente de acetonitrilo. Las masas intactas se determinaron por la descircunvolución de entropía máxima de los espectros m/z obtenidos usando el programa informático de análisis cualitativo MassHunter (Agilent).

vi. Resultados

Las secuencias de la región variable de la cadena pesada (VH) para 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 y 15H6 se muestran en la fig. ⁶A. Las secuencias de la región variable de la cadena ligera (VL) para 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 y 15H6 se muestran en la fig. ⁶B. Estos clones tienen cadenas ligeras y pesadas únicas. Los datos de espectrometría de masas corroboraron los datos de secuencia (véanse las tablas 3 y 4) (véase, por ejemplo, Bos et al. Biotechnol. Bioeng. 112(9): 1832-1842, 2015).

Tabla 3: masas de HC como se determina por espectrometría de masas

Tabla 4: masas de LC como se determina por espectrometría de masas

E. Reformateo de los anticuerpos 15H6 y 19B12

i. Clonación TOPO® de los anticuerpos 15H6 y 19B12

Se realizó la clonación TOPO® para confirmar las secuencias de la región variable de los clones de anticuerpo 15H6 y 19B12 obtenidos de la secuenciación directa de los productos de PCR por 5'-RACE (descritos anteriormente). La reacción de clonación TOPO®-TA se realizó como se describe en el manual del kit de clonación pCR™4-TOPO®-TA para secuenciación (Invitrogen, K4575-02). En resumen, se combinaron en un tubo 2 pl del producto de PCR, 2 pl de agua, 1 pl del vector de pCR™4-TOPO® y 1 pl de la solución salina incluida, se mezclaron e incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se dispuso la reacción en hielo y se añadieron 2 pl de esta reacción de clonación TOPO® a un vial descongelado de células de Escherichia coli TOP10 químicamente competentes ONE-SHOT® (Invitrogen, K4575-02) y se mezclaron sin pipetear. La reacción se incubó en hielo durante 5-30 min. A continuación, las células se sometieron a choque térmico durante 30 s a 42 °C sin agitar. Los tubos se transfirieron de inmediato a hielo. Se añadieron 250 pl de medio SOC a temperatura ambiente. El tubo se tapó y se agitó horizontalmente a 200 rpm a 37 °C durante 1 h. Luego, se extendieron 50 pl de cada transformación en una placa de LB-agar precalentada que contenía 50 pg/ml de carbenicilina. Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche, las colonias se tomaron al día siguiente y se realizó la purificación de los plásmidos. Se verificaron las secuencias y se seleccionaron pocillos particulares que contenían cada uno secuencias de VH y VL de 15H6 y VH y VL de 19B12 en un vector de TOPO® para su uso como vectores fuente en la clonación libre de restricciones.

ii. Clonación libre de restricciones en mIgG2a

Se amplificaron las regiones variables de la cadena pesada y ligera en los vectores de TOPO® configurando una mezcla de PCR de la siguiente manera para la LC: 0,5 pl de ADN molde (vector fuente de minipreparación), 4 pl de cebador directo de VL de 15H6, 4 pl de cebador inverso de VL de 15h 6, 2 pl de dNTP 10 mM, 20 pl de 5x tampón HF, 1 pl de polimerasa PHUSION® (F-549L, Thermo Scientific, 2 U/pl) y 68,5 pl de agua. La mezcla de reacción para clonar la HC se configuró de la misma manera excepto porque se usaron cebadores directos e inversos de VH de 15H6. Las mezclas de PCR para 19B12 se configuraron de la misma manera que las mezclas para 15H6, excepto porque se usaron cebadores de 19B12. Las secuencias de los cebadores fueron como sigue:

Secuencia de nucleótidos del cebador directo de VL de 15H6 OCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAA ATT GTT CTC TCC CAG TCT CC (SEQ ID NO: 144).

Secuencia de nucleótidos del cebador inverso de VL de 15H6:

GGA TAC AG T TG G TGC AG C ATC AG C CCG TTT GAT TTC CAG CTT GG (SEQ ID NO: 145).

Secuencia de nucleótidos del cebador directo de VH de 15H6:

GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG (SEQ ID NO:

146).

Secuencia de nucleótidos del cebador inverso de VH de 15H6:

GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG GTT CCT TGA CCC (SEQ ID NO: 147^).

Secuencia de nucleótidos del cebador directo de VL de 19B12:

GCA A C T GCA ACT GGA GTA CAT TCA AAC ATT GTG GTG ACC CAA TCT CC (SEQ ID NO: 148).

Secuencia de nucleótidos del cebador inverso de VL de 19B12:

GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC CCG CTT TAT TTC CAG CTT GG (SEQ ID NO: 149).

Secuencia de nucleótidos del cebador directo de VH de 19B12:

GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC GAG GTG AAG CTG GTG GAA TCT GGG GGA GG

(SEQ ID NO: 150).

Secuencia de nucleótidos del cebador inverso de VH de 19B12

GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GCG GTT CCT TGA CCC (SEQ ID NO:

151).

Las condiciones del ciclado de PCR fueron como sigue:

98 °C durante 30 segundos

35 ciclos de [98 °C durante 15 segundos, ⁶⁸°C durante 30 segundos, 72 °C durante 35 segundos]

72 °C durante 10 minutos

Se usaron VH y VL amplificados como cebadores para amplificar el ADN molde configurando la mezcla de PCR de la siguiente manera para LC de 15H6: 1,25 pl de ADN para el vector PRK de mIgG2a molde (dilución 1:10 de minipreparación), 0,5 pl de producto de PCR de VL de 15h 6 (100-200 ng/pl), 1 pl de dNTP 10 mM, 10 pl de tampón HF (5x), 1 pl de polimerasa PHUSION® y 35,75 pl de agua. La mezcla de PCR para HC de 15H6 se estableció de la misma manera, excepto porque se usó el producto de PCR de VH de 15H6. Las mezclas de PCR para 19B12 se configuraron de la misma manera, excepto porque se usaron productos de PCR de 19B12.

Las condiciones del ciclado de PCR fueron como sigue:

98 °C durante 30 segundos

25 ciclos de [98 °C durante 15 segundos, ⁶⁸°C durante 30 segundos, 72 °C durante 4 minutos]

72 °C durante 10 minutos

A continuación, se transfirieron 18 pl de reacción de PCR a un nuevo tubo y se digirieron con 2 pl de Dpnl (n.° RO176L, 20.000 U/ml de NEB) durante 2 h a 37 °C, centrifugándose el tubo periódicamente. Se transformaron 30 pl de células competentes NOVABLUE SINGLES™ competentes (Novagen, 70181) con 1 pl de digestión con Dpnl de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se descongelaron, se añadió ADN y las células se incubaron en hielo durante 5 min antes de someterse a choque térmico durante 30 s, se dispusieron de nuevo en hielo durante 2 min, seguido de adición de medio SOC. Se sembraron en placa 25 pl o 50 pl en placas que contenían carbenicilina a 50 pg/ml y se establecieron a 37 °C durante la noche. Las colonias se tomaron al día siguiente, se realizó la purificación de los plásmidos por medio de minipreparación y se secuenciaron los plásmidos. iii. Purificación de anticuerpos

Se realizó la purificación automatizada de los sobrenadantes de células 293 en un sistema de manipulación de líquidos Tecan Freedom EVO® 200 con un cabezal MCA96 de 500 ml. En resumen, las IgG se capturaron usando columnas de punta que se rellenaron a medida con 20 ml de resina MABSELECT SURE™ (Glygen Corp., Columbia, Maryland & GE Healthcare, Pittsburgh, Pensilvania). Después de lavar con 1x PBS, pH 7,4, las IgG se eluyeron en 160 ml de ácido fosfórico 50 mM, pH 3, y se neutralizaron con 12 ml de 20x PBS, pH 11. Las columnas de punta MABSELECT SURE™ se limpiaron en NaOH 0,1 M y se regeneraron con 1x PBS, pH 7,4 para un uso consecutivo de hasta 15 veces. De forma similar, los Fab se capturaron usando columnas de punta rellenadas con 20 ml de resina GAMMABIND™ Plus (Glygen Corp & GE Healthcare) y posteriormente se lavaron con 1x PBS, pH 7,4. Los Fab se eluyeron en 190 ml de citrato 10 mM, pH 2,9, y se neutralizaron con 19 ml de Tris 0,4 M, pH 8,7. Las columnas de punta GAMMABIND™ Plus se limpiaron con guanidina ⁶M y se regeneraron con 1x PBS, pH 7,4 para un uso consecutivo de hasta 15 veces.

iv. Los anticuerpos 15H6 y 19B12 recombinantes retienen las actividades de bloqueo originales La capacidad de los anticuerpos 15H6 y 19B12 recombinantes de inhibir la actividad de huHtrA1-FL se evaluó usando el ensayo de bloqueo por FRET descrito en la sección C anterior. Ambos anticuerpos recombinantes retuvieron sus actividades de bloqueo originales como se determina a partir de anticuerpos derivados de hibridoma (figs. 7A y 7B). El anticuerpo 15H6 recombinante tuvo una CI50 de aproximadamente 0,7 nM, mientras que el anticuerpo 19B12 recombinante tuvo una CI50 de aproximadamente 1,2 nM, lo que reflejaba la actividad de los anticuerpos derivados de hibridoma (figs. 7A y 7B).

Ejemplo 2: humanización de los anticuerpos de hibridoma anti-HtrA1 15H6 y 19B12

A. Humanización del anticuerpo anti-HtrA1 15H6

Las secuencias de la región variable de la cadena ligera (VL) y de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo 15H6 murino (también denominado m15H6) se alinearon con secuencias consenso de anticuerpo humanas, y la cadena ligera kappa I consenso humana (huKl) y el subgrupo I de la cadena pesada consenso humana (huVH1) se identificaron como las regiones estructurales humanas más cercanas (figs. ⁸A y ⁸B).

Las regiones hipervariables (HVR) de la cadena ligera y de la cadena pesada de m15H6 se injertaron en regiones estructurales de aceptor consenso de huKl y huVHI, respectivamente, por mutagénesis de Kunkel (véase, por ejemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, 1987) usando oligonucleótidos separados para cada región hipervariable para generar el clon de anticuerpo h15H6.v1 (figs. ⁸A y ⁸B). En este procedimiento, las posiciones 24-34 en HVR-L1, 50-56 en HVR-L2 y 89-97 en HVR-L3 del VL de m15H6 se injertaron en el aceptor consenso de huKl, y las posiciones 26-35 en HVR-H1, 49-65 en HVR-H2 y 95-102 en HVR-H3 del VH de m15H6 se injertaron en el aceptor consenso de huGI. También se incluyeron las posiciones 46, 47 y 49 en la región estructural 2 de la cadena ligera (FR-L2) y las posiciones 67, 69, 71 y 93 en la región estructural 3 de la cadena pesada (FR-L3) en el procedimiento de humanización, porque Foote y Winter han analizado las estructuras cristalinas de los complejos entre anticuerpo y antígeno y descubierto que estas posiciones son parte de los residuos de la región estructural que actúan como zona "Vernier", que pueden ajustar la estructura de HVR y ajustarse para adaptarse a antígeno (Foote et al., J. Mol. Biol. 224:487-499, 1992) (figs. ⁸A-⁸B). La afinidad de unión de m15H6 y h15H6.v1 en formato Fab para HrtA1 humana y murina se midió por análisis de unión por resonancia de plasmón superficial (RPS) en BIACORE™ como se describe en la subsección ii de la sección C a continuación (figs. 9A-9D). La tabla 5 resume los resultados de este análisis.

Tabla 5: análisis de unión cinética de m15H6 y h15H6.v1 a HtrA1

Para evaluar además la importancia de los residuos de Vernier murinos en h15H6.v1, este anticuerpo se presentó en fago y los residuos murinos de Vernier individuales (LC: P46, W47, S49; HC: A67, L69, A71 y T93) se reemplazaron por residuos humanos (LC: L46, L47, Y49; HC: V67, I69, R71 y A93) para generar variantes de mutaciones puntuales. Todas las 7 variantes se sometieron a ELISA de competencia con fagos frente a HtrA1 humana o murina para determinar las afinidades de unión (en términos de CI50 del fago, véase la subsección i de la sección C a continuación). Los resultados indicaron que la variante LC-P46L suprimió totalmente la unión de h15H6.v1 a HtrA1 tanto humana como murina. La variante LC-S49Y redujo la unión con HtrA1 humana y murina aproximadamente 10 veces (figs. 10A y 10B). Ambas variantes en HC HC-A67V y HC-T93A solo afectaron la unión a HtrA1 murina, pero no a HtrA1 humana (figs. 10A y 10B). Las otras variantes, LC-W47L, HC-L69I y HC-A71R, no mostraron ninguna bajada significativa de la unión a HtrA1 humana y murina (figs. 10A y 10B). Por lo tanto, se genomanipuló adicionalmente el clon de anticuerpo h15H6.v1 añadiendo las siguientes mutaciones: LC-W47L, HC-L69I y HC-A71R para generar el clon de anticuerpo h15H6.v2 (véanse las figs. ⁸A y ⁸B).

El análisis de estabilidad química del clon de anticuerpo h15H6.v2 identificó varios residuos o pares de residuos potencialmente inestables en las HVR: W91 en HVR-L3 (oxidación), N94 P95 en HVR-L3 (reticulación con inmunoprecipitación) y D55 G56 en HVR-H2 (isomerización). Véase, por ejemplo, el ejemplo 4 a continuación. Para abordar la oxidación de W91 en HVR-L3, se generaron 2 variantes (LC-W91Y y LC-W91L) y se produjeron como Fab para el análisis de unión por RPS en BIACORE™. Los resultados, resumidos en la tabla ⁶a continuación, indicaron que la posición LC-W91 es importante para la afinidad de unión, y las sustituciones tuvieron un impacto sobre la unión a HtrA1 humana y murina en aproximadamente 20-50 veces (figs. 11A y 11B).

Tabla 6: análisis de unión cinética de las variantes LC-W91 de h15H6.v2 a HtrAI

Para la reticulación con inmunoprecipitación en las posiciones LC-N94 LC-P95 de HVR-L3, se generaron cuatro variantes de h15H6.v2 (LC-N94A LC-P95 (también denominada AP), LC-N94E LC-P95 (también denominada EP), LC-N94Q LC-P95 (también denominada QP) y LC-N94S LC-P95 (también denominada SP)) y se produjeron como Fab para el análisis de unión en BIACORE™. Los resultados indicaron que las variantes AP y EP mostraron una afinidad de unión similar a HtrA1 humana, y las variantes QP y SP tuvieron una reducción aproximada de 2 veces de la afinidad de unión a HtrA1 humana (figs. 12A-12B). En la fig. 12B se muestra una tabla que resume los resultados de este análisis.

Para la isomerización en los residuos HC-D55 HC-G56 de HVR-H2, se generaron cuatro variantes (HC-D55A HC-G56 (también denominada AG), HC-D55E HC-G56 (también denominada EG), HC-D55S HC-G56 (también denominada SG) y HC-D55 HC-G56A (también denominada DA)) y se produjeron como Fab para el análisis de unión en BIACORE™. Los resultados indicaron que solo la variante EG mostró una afinidad de unión comparable frente a HtrA1 humana, y el resto de las variantes en las posiciones 55 y/o 56 de la cadena pesada tuvieron una reducción de 2 a 3 veces de la afinidad de unión a HtrA1 humana (figs. 13A y 13B). En la fig. 13B se muestra una tabla que resume los resultados de este análisis.

En base a estos resultados, se introdujeron ambas variantes AP (HVR-L3) y EG (HVR-H2) en la secuencia del clon de anticuerpo h15H6.v2 para generar el clon de anticuerpo h15H6.v2.APEG (también denominado h15H6.v3 o AP_EG) (véanse las figuras ⁸A y ⁸B). Este clon también se comparó con varias de otras variantes de h15H6.v2, incluyendo LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56 (también denominada EP_EG); LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56 (también denominada QP_EG); y LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56 (también denominada SP_EG). El análisis por RPS en BIACORE™ indicó que h15H6.v2.APEG retuvo una afinidad de unión comparable a h15H6.v2 (figs. 14A y 14B). En la fig. 14B se muestra una tabla que resume los resultados de este análisis. La capacidad de estas variantes de bloquear la actividad de la actividad de HtrA1 se determinó usando el ensayo de bloqueo basado en FRET descrito en el ejemplo 1 (figs. 14C y 14D). El pI de estas variantes en formato Fab también se determinó usando el programa informático SMACK (véase, por ejemplo, Sharma et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 18601, 2014) y se muestra en la tabla 7 en comparación con el Fab anti-VEGF ranibizumab (LUCENTIS®).

Tabla 7: pI de variantes de H15H6.v2

B. Humanización del anticuerpo de hibridoma anti-HrtA1 19B12

Las secuencias de aminoácidos de VL y VH del anticuerpo murino 19B12 (también denominado m19B12) se alinearon con secuencias consenso humanas, y la cadena ligera kappa IV consenso humana (huk4) y el subgrupo III de la cadena pesada consenso humana (huVH3) se identificaron como las regiones estructurales humanas más cercanas (figs. 15A-15B).

Las regiones hipervariables de la cadena ligera y de la cadena pesada de m19B12 se injertaron en regiones estructurales de aceptor consenso de huK4 y huVH3, respectivamente, por mutagénesis de Kunkel usando oligonucleótidos separados para cada región hipervariable para generar una variante de injerto en HVR directa, denominada en el presente documento clon de anticuerpo h19B12.v1. En este procedimiento, las posiciones 24 34 en HVR-L1, 50-56 en HVR-L2 y 89-97 en HVR-L3 del VL de 19B12 se injertaron en el aceptor consenso de huK4, y las posiciones 26-35 en h Vr -H1, 50-65 en HVR-H2 y 95-102 en HVR-H3 del VH de 19B12 se injertaron en el aceptor consenso de huGIII (figs. 15A-15B).

La afinidad de unión de m19B12 y h19B12.v1 (en formato Fab) se determinó usando RPS en BIACORE™ (figs.

16A-16D) usando el enfoque descrito en la subsección ii de la sección C a continuación. Los resultados de este análisis se resumen en la tabla 8 a continuación. La constante de unión en equilibrio (KD) de h19B12.v1 a HtrA1 humana mejoró aproximadamente 2 veces después de la humanización (tabla 8) en comparación con m19B12.

Tabla 8: análisis de unión cinética de m19B12 o h19B12.v1 a HtrAI

C. Materiales y procedimientos

i. ELISA de competencia con fagos para determinar la CI50 del fago

Las placas de microvaloración MAXISORP™ se recubrieron con HtrA1-PD-His humana a 2 pg/ml en PBS durante 2 h y, a continuación, se bloquearon con tampón PBST (BSA al 0,5 % y TWEEN®20 al 0,05 % en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Los fagos purificados de los sobrenadantes de cultivo se incubaron con HtrA1 humana o murina diluida en serie en tampón PBST en una placa de microvaloración de cultivo tisular durante 1 h, después de lo que se transfirieron 80 pl de la mezcla a pocillos recubiertos con HtrA1 humana durante 15 min para capturar el fago no unido. La placa se lavó con tampón PBT (TWEEN®20 al 0,05 % en PBS) y se añadió anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 en tampón PBST) durante 40 min. La placa se lavó con tampón PBT y se desarrolló añadiendo sustrato de tetrametilbencidina (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Se representó la absorbancia a 450 nm como una función de la concentración diana en solución para determinar la CI50 del fago. Esto se usó como una estimación de la afinidad para el clon de Fab presentado en la superficie del fago.

ii. Determinaciones de afinidad de los anticuerpos por BIACORE™

Para determinar la afinidad de unión de los Fab anti-HtrA1 por cinética de ciclo único, se usó la medición (RPS) con un instrumento BIACORE™ T100. En resumen, se activó un chip de sensor CM5 de la serie S con los reactivos clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor, y se acopló estreptavidina (Pierce) para lograr aproximadamente 2500 unidades de respuesta (UR), seguido del bloqueo de los grupos sin reaccionar con etanolamina 1 M.

Para las mediciones cinéticas, en primer lugar se inyectó HtrA1-PD-His humana o murina biotinilada a un caudal de 10 pl/min para capturar aproximadamente 150 UR en 3 cubetas de lectura (CL) diferentes, excepto por CL1 (que sirvió como referencia), y, a continuación, se inyectaron diluciones en serie en 5 veces de Fab anti-HtrA1 en tampón HBS-P (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005 %) de baja (0,48 nM) a alta (300 nM) (caudal: 30 pl/min) uno después del otro en el mismo ciclo sin ninguna regeneración entre inyecciones. El sensograma se registró y se sometió a la resta de la referencia y el tampón antes de la evaluación por el programa informático de evaluación de BIACORE™ T100 (versión 2.0). Las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) se calcularon usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir. La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó como la proporción kdis/kas.

Ejemplo 3: maduración en afinidad del clon de anticuerpo anti-HtrA1 h15H6.v2

A. Construcción de colecciones de NNK de maduración en afinidad de h15H6.v2 y adsorción

Para mejorar además la afinidad del clon de anticuerpo anti-HtrA1 h15H6.v2, se construyeron colecciones de fagos a partir de la variante de h15H6.v2 en formato Fab-ámbar para la presentación en fagos con Fab monovalente con residuos de HVR de la cadena ligera (es decir, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3) o bien residuos de HVR de la cadena pesada (es decir, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) aleatorizados usando el codón redundante NNK que codifica los 20 aminoácidos con 32 codones (véase, por ejemplo, Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12): 5381-5383, 1992). Se diseñaron colecciones para permitir una mutación NNK en cada una de las tres HVR de la cadena ligera o de la cadena pesada. El ADN de la colección resultante se sometió a electroporación en células XL1 de E. coli., lo que proporcionó aproximadamente 109 transformantes. En algunos casos, se emplearon colecciones de aleatorización suaves y epistasia en NNK como se describe en el documento PCT/US2015/055672. Las colecciones de fagos se incubaron con NaCl 750 mM en tampón PBS SUPERBLOCK™ (Pierce) y TWEEN® 20 al 0,05 % durante 30 min y, a continuación, se aplicaron sobre la HtrA1-marca His biotinilada capturada con neutravidina para la primera tanda de adsorción para reducir la interacción cargada no específica entre HtrA1 y el fago. En las dos tandas posteriores que usan una concentración decreciente de antígeno para huHtrA1-PD-His biotinilada con 1000x HtrA1 no biotinilada como competidor en solución para incrementar la restricción de la selección. Véase la fig. 17 para un diagrama esquemático de la estrategia de adsorción.

B. Secuenciación profunda de colecciones de maduración en afinidad de h15H6.v2

Para la secuenciación profunda, se aisló ADN bicatenario de fagómidos de células XL-1 de E. coli que tenían vectores fagómidos de la colección de fagos inicial y de la tercera tanda de selección. Se usó ADN purificado como molde para una amplificación basada en PCR de ciclos limitados de las regiones VL y VH usando ADN polimerasa PHUSION® (New England Biolabs). Los productos de PCR se purificaron por extracción en gel de agarosa y limpieza (kit de extracción en gel de Qiagen). Se usó el ADN de amplicón eluido como base para la preparación de colecciones de secuenciación profunda con procedimientos de preparación de colecciones estándar de Illumina, usando un kit de preparación de muestras de ADN TRUSEQ™ (Illumina). Las colecciones fijadas a adaptador se sometieron a un ciclo único de PCR y se secuenciaron en el Illumina MISEQ®, usando secuenciación de extremos emparejados con un tamaño de inserto de 200 pb o 300 pb según fuera apropiado para cubrir toda la longitud del amplicón.

C. Análisis de secuenciación profunda de colecciones de maduración en afinidad de h15H6.v2

Los datos de secuenciación se analizaron usando el lenguaje de programación estadístico R (véase, por ejemplo, R Core Team, R: A language and environment for statistical computing, 2013) y el paquete ShortRead (véase Morgan et al., Bioinformatics 25(19): 2607-2608, 2009). Se realizó el control de calidad (CC) en las secuencias de HVR identificadas, donde se comprobó cada secuencia de HVR para determinar la longitud correcta y se permitió que solo tuviera hasta una mutación NNK y ninguna mutación distinta de NNK. Se generaron matrices de pesos posicionales calculando la frecuencia de todas las mutaciones de cada posición aleatorizada. Se calcularon las proporciones de enriquecimiento para cada mutación dividiendo la frecuencia de una mutación dada en una posición dada en la muestra clasificada por la frecuencia de la misma mutación en la muestra no clasificada, como se describe previamente (Fowler et al., Nature Methods 7(9): 741-746, 2010). Las matrices cromáticas que representan las proporciones de enriquecimiento para cada mutación en las posiciones de HVR de la cadena ligera y las posiciones de HVR de la cadena pesada se muestran en las figs. 18A y 18B, respectivamente.

Se seleccionaron mutaciones únicas de las colecciones de la cadena ligera o de la cadena pesada con alta proporción de enriquecimiento para sintetizarlas para su clonación en una construcción de expresión de Fab de mamífero que contenía una marca Flag para generar proteínas de fusión Fab-marca Flag. Los plásmidos que codifican la cadena pesada o ligera se transfectaron a células 293T para una expresión de 30 ml y los Fab se purificaron con una columna anti-Flag.

Los Fab purificados que contienen mutaciones únicas se usaron para determinar la afinidad de unión usando el análisis por RPS en BIACORE™ (véase la sección D a continuación). Los datos de afinidad para mutaciones únicas se resumen en la tabla 9. Las tasas de disociación variaron de aproximadamente 0,0013 a aproximadamente 0,004, en comparación con un valor de aproximadamente 0,0016 para h15H6.v2. La variante LC3 (LC-N31E) mejoró la tasa de disociación de 2 a 3 veces sobre 15H6.v2.

Tabla 9: afinidad de unión de mutaciones h15H6.v2 identificadas por mutagénesis por barrido profundo

D. Combinación de variantes seleccionadas para una mejora de la afinidad adicional

La mayoría de las mutaciones únicas de la colección de NNK de la cadena pesada o de la cadena ligera no mejoraron la afinidad de unión a HtrA1 frente al clon original h15H6.v2 (tabla 9). Las variantes con las tasas de disociación más lentas se seleccionaron de tanto variantes de la cadena ligera (LC3, LC4 y LC7) como de la cadena pesada (HC1, HC2, HC3 y HC5) para generar mutantes de combinación. Estos mutantes de combinación incluyeron tanto una cadena ligera variante como una cadena pesada variante. Se realizó el análisis de cinética en BIACORE™ (como se describe a continuación en la sección C) usando los mutantes de combinación. Los mutantes de combinación LC3.HC3, LC3.HC1 y LC7.HC2 tuvieron una mejora de la afinidad 2-3 veces mejorada frente al Fab original (h15H6.v2) (tabla 10).

Tabla 10: análisis de cinética de unión de los mutantes de combinación a HtrA1

Luego, se combinaron además los mutantes en LC (LC37=LC3_LC7, LC347=LC3_LC4_LC7) y mutantes en HC (HC13=HC1_HC3, HC23=HC2_HC3). Estos mutantes se modificaron además incorporando las variantes N94A en HVR-L3 y D55E en HVR-H2 (es decir, AP_EG, véase el ejemplo 2) para evitar la autoescisión y desamidación para el análisis de cinética de afinidad.

APEG.LC3.HC1, APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4), APEG.LC37.HC13, APEG.LC37.HC23, APEG.LC347.HC13 y APEG.LC347.HC23 fueron los clones superiores, con mejoras de 3 a 5 veces, en promedio, sobre h15H6.v2 (fig.

20). Las secuencias de aminoácidos de VL y VH de estas variantes se muestran en las figs. 21A y 21B, respectivamente. Las secuencias de estos clones se analizaron para determinar su riesgo potencial de oxidación en W91 en HVR-L3 usando análisis in silico (Sharma et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:18601, 2014). Se categorizaron APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4), APEG.LC37.HC13 y APEG.LC347.HC13 como de riesgo equivalente a h15H6.v3. Otras tienen mayor riesgo que h15H6.v2.

E. Determinación de afinidad de Fab por RPS en BIACORE®

Para determinar la afinidad de unión de variantes de Fab seleccionadas por HtrA1, se realizó la medición por RPS con un instrumento BIACORE™ T200. En resumen, se activó un chip de sensor CM5 de la serie S con los reactivos 1-EDC y NHS de acuerdo con las instrucciones del proveedor, y se acopló el anticuerpo anti-His para lograr 200 300 unidades de respuesta (UR), seguido, a continuación, de bloqueo de los grupos sin reaccionar con etanolamina 1 M. Para las mediciones cinéticas, en primer lugar se inyectaron aproximadamente 5 nM de huHtrA1-PD-His a un caudal de 10 pl/min para capturar aproximadamente 100 UR en 2 cubetas de lectura (CL) diferentes, excepto por CL1 (que sirvió como referencia). Luego, se inyectaron diluciones en serie en 5 veces de Fab en tampón HBS-P (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005 %) de baja (0,8 nM) a alta (50 nM) (caudal: 30 pl/min). Las respuestas de unión en HtrA1 se corrigieron restando UR de una cubeta de lectura blanco. El sensograma se registró y se sometió a la resta de la referencia y el tampón antes de la evaluación por el programa informático de evaluación de BIACORE® T200 (versión 2.0). Las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) se calcularon usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir. La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó como la proporción de kdis/kas.

F. Actividad inhibidora de las variantes de h15H6.v2 en un ensayo de bloqueo basado en FRET con HtrA1 (ensayo de bloqueo con H2-Opt)

Se sometió a prueba la capacidad de las variantes de h15H6.v2 maduradas en afinidad seleccionadas de inhibir la actividad de HtrA1. Se realizaron ensayos de bloqueo basados en FRET in vitro usando el sustrato H2-Opt ((Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK). Los ensayos de bloqueo con H2-Opt se realizaron como se describe en el ejemplo 3 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2013/0129743A1, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. En resumen, el péptido H2-Opt (Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK) (SEQ ID NO: 152), originalmente descrito como un sustrato para HtrA2 (véase, por ejemplo, Martins et al., J. Biol. Chem.

278:49417-27, 2003), se sintetizó en resina Fmoc-Lys(Boc)-wang usando procedimientos de acoplamiento estándar con HBTU. Se incorporó Fmoc-Lys(DNP)--OH (Anaspec) en la posición P5'. El péptido se sintetizó hasta P5 (Mca, 7-metoxi-cumarina, Aldrich) y, a continuación, se escindió del soporte sólido usando ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y agua durante 2 horas a temperatura ambiente. El péptido se precipitó a partir de éter etílico, se extrajo con ácido acético, acetonitrilo, agua y se liofilizó. El péptido marcado bruto se disolvió y purificó en una columna C18 de fase inversa preparativa usando acetonitrilo/agua. Las fracciones purificadas se agruparon, liofilizaron y analizaron por cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (PE/Sciex) y se descubrió que eran consecuentes con sus masas calculadas.

Se incubó HtrA1 en placas de fondo óptico negro de 96 pocillos (Nalge Nunc Int., Rochester, N.Y.) con anticuerpos anti-HtrA1 diluidos en serie en tampón de ensayo (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM, c Ha PS al 0,25 %) durante 20 min a 37 °C. Una solución madre 10 mM del sustrato peptídico Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK (SEQ ID NO: 152) (H2-Opt) en DMSO se diluyó en agua a 12,5 pM, se calentó previamente a 37 °C y, a continuación, se añadió a la mezcla de reacción. El incremento de la señal de fluorescencia (excitación a 328 nm, emisión a 393 nm) se midió en un lector de microplacas SPECTRAMAX® M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) y se determinaron las tasas lineales de escisión de H2-Opt (mUFR/min).

La fig. 22A muestra un resumen de los resultados de tres experimentos de ensayo con H2-Opt independientes realizados esencialmente como se describe anteriormente. La mayoría de los clones tuvieron valores de CI50 en el intervalo de aproximadamente 0,4 nm a aproximadamente 0,5 nM, en comparación con aproximadamente 0,39 nM para h15H6.v2. El anticuerpo anti-HtrA1 APEG.LC3.HC3 (también denominado h15H6.v4) mostró el mejor valor de CI50 a aproximadamente 0,386 nM en este ensayo (fig. 22A). La fig. 22B muestra una gráfica representativa de este análisis. En general, las variantes de h15H6.v2 maduradas en afinidad mostraron una inhibición máxima mejorada de HtrA1 en comparación con h15H6.v2 (fig. 22A), variando los valores de inhibición máxima de aproximadamente un 78 % a aproximadamente un 96 %.

El ensayo de bloqueo con H2-Opt basado en FRET se usó para evaluar la capacidad de diferentes formatos de anticuerpos de las variantes de h15H6.v2, incluyendo h15H6.v4, de inhibir la actividad de HtrA1. El ensayo con H2-Opt se realizó esencialmente como se describe anteriormente, excepto porque las condiciones del ensayo fueron: enzima huHtrA1-PD 1 nM, sustrato H2-Opt 1,25 pM, Tris 50 mM, pH 8, NaCl 200 mM, CHAPS al 0,25 %. Los resultados se analizaron en base a la tasa de unidades fluorescentes relativas (UFR)/s (50-1000 s) o los valores de UFR de criterio de valoración a 2000 s. Las figs. 23A-23H muestran los resultados de un experimento independiente ejemplar que compara la capacidad de h15H6.v2 en formato Fab, y h15H6.v4 en formatos IgG o Fab, de inhibir la actividad de huHtrA1-PD. El anticuerpo anti-HtrA1 YW505.94a (véase el documento WO2013/055988) sirvió como control positivo. Las figs. 24A y 24B muestran un resumen de los resultados de CI50 y CI90, respectivamente, de un primer conjunto de tres experimentos independientes analizados usando el enfoque de UFR/s. Las figs. 25A y 25B muestran un resumen de los resultados de CI50 y CI90, respectivamente, de un segundo conjunto de tres experimentos independientes analizados usando el enfoque de UFR/s o de UFR de criterio de valoración para Fab h15H6.v4.

G. Capacidad de bloqueo de APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) en un ensayo de actividad basado en espectrometría de masas

La capacidad de APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) de inhibir la escisión mediada por huHtrA1-PD de un sustrato de longitud completa intacto (a-caseína) se evaluó usando un ensayo de actividad basado en espectrometría de masas (EM). En este ejemplo, el anticuerpo anti-HtrA1 h15H6.v4 se comparó con un inhibidor de molécula pequeña de proteasas HtrA, ucf-101, que se ha descrito como un antagonista para HtrA2 (también conocido como Omi) (Cilenti et al., J. Biol. Chem. 278(13):11489-11494, 2003). Se emplearon marcadores de marcaje de masas isobáricos de marcas de masas en tándem (TMT) para la cuantificación basada en EM de la escisión de a-caseína por HtrA1 en presencia de h15H6.v4 o ucf-101. La a-caseína tiene tres residuos en P1' que se pueden escindir por HtrA1: Ser72, Thr95 y Ser157.

Se usaron reactivos de marcaje de masas isobáricos TMTDUPLEX™ para marcar diferencialmente patrones de a caseína y someter a ensayo muestras para la cuantificación de a-caseína intacta. Los reactivos TMTDUPLEX™ son conjuntos de compuestos isobáricos (es decir, la misma masa y estructura, también llamados isotopómeros) que se activan con n Hs para el marcado covalente e irreversible de grupos de aminas primarias (-NH2). Cada reactivo isobárico contiene un número diferente de isótopos pesados en el resto de marca indicadora de masas, lo que da como resultado una masa indicadora única durante la EM/EM en tándem para la identificación de muestras y la cuantificación relativa.

Se incubaron bicarbonato de trietilamonio 100 mM, huHtrA1 100 nM, 100 pg/ml de a-caseína y el inhibidor (es decir, ucf-101 o h15H6.v4) (volumen final de 20 pl) a 37 °C durante 18 horas (solución digerida). Por separado, se generó una solución similar sin inhibidor y se incubó de forma idéntica (solución de control). Se sometió a prueba Fab h15H6.v4 a concentraciones que variaban de 3,12 nM a 100 nM, mientras que el inhibidor de molécula pequeña de control positivo ucf-101 se sometió a prueba a concentraciones que variaban de 2 nm a 250 nM.

Se generaron soluciones madre de marcas de masas en tándem (TMTDUPLEX™) según se recomienda por el proveedor (Thermo Fisher Scientific). Se añadieron 5 pl de TMT-126 a la solución digerida y se añadieron 5 pl de TMT-127 a la solución de control. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las soluciones anteriores se combinaron en una base de volumen igual. Las muestras se procesaron en CL-EM y se cuantificaron por fragmentación de los picos de iones más intensos usando disociación en trampa C de mayor energía (HCD); se usó la proporción de intensidad de iones indicadores de 126/127 después de la fragmentación para determinar la concentración en la solución digerida.

Una curva de valoración mostró que el ensayo cuantificó con exactitud la a-caseína intacta (fig. 26B). En este ensayo, Fab h15H6.v4 inhibió la escisión mediada por huHtrA1-PD de a-caseína intacta con una CI50 de aproximadamente 45 nM (CI90 = aproximadamente 71 nM). Este valor se mejoró notablemente en comparación con el inhibidor de molécula pequeña ucf-101, que tuvo una CI50 de 77 pM.

H. Capacidad de bloqueo de variantes maduradas en afinidad de h15H6.v2 en un ensayo de actividad de HtrA1 endógena

Se evaluó la capacidad de las variantes maduradas en afinidad de h15H6.v2 de inhibir la actividad de HtrA1 endógena en un modelo de ojo de conejo. Para el ensayo de actividad de HtrA1 endógena, se usaron medios de células secretoras de HtrA1 (células de melanoma C32 humano) como fuente de HtrA1. Véase, por ejemplo, Ciferri et al. Biochem J., 18 de septiembre, 2015, DOI: 10.1042/BJ20150601. Adviértase que en el ensayo endógeno, hay una concentración aproximadamente 10 veces mayor de HtrA1 en comparación con el ensayo con H2-Opt con HtrA1 recombinante (véase, por ejemplo, la fig. 28), lo que se considera que explica los diferentes valores de CI50 observados en los ensayos con H2-Opt usando HtrA1 endógena y HtrA1 recombinante. Las figs. 27A-27C muestran los resultados del ensayo con HtrA1 endógena. En particular, el clon APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) tuvo una CI50 de aproximadamente 1,125 nM (fig. 27C), con una inhibición máxima de aproximadamente un 80,1 %.

I. Resumen de propiedades para variantes de h15H6.v2 seleccionadas

La unión cinética y la actividad inhibidora de derivados seleccionados del clon de anticuerpo anti-HtrA1 h15H6.v2 se compararon usando el análisis por RPS en BIACORE y el ensayo de actividad con H2-Opt basado en FRET. Para determinar la inhibición máxima, se usaron controles positivos y negativos para determinar un 0 % de inhibición (solo enzima, sin inhibidor) y un 100 % de inhibición (sin enzima). Los resultados de esta comparación se muestran en la fig. 28.

Ejemplo 4: análisis de evaluación molecular de los anticuerpos anti-HtrA1

Los clones de anticuerpo anti-HtrA1 h15H6.v2, h15H6.v2.APEG (también denominado h15H6.v3) y APEG.LC3.HC3 (también denominado h15H6.v4) se sometieron a prueba en análisis de evaluación molecular (EM) para determinar las propiedades de estabilidad. También se sometió a prueba el clon de anticuerpo anti-HtrAI h19B12.v1. En resumen, se sometieron a prueba los anticuerpos anti-HtrA1 (1 mg/ml) para determinar la agresión en condiciones químicas con AAPH (diclorhidrato de 2,2-azobis(2-amidinopropano)), una molécula pequeña conocida por generar radicales libres (véase, por ejemplo, Ji et al., J. Pharm. Sci. 98(12):4485-4500, 2009), así como en condiciones térmicas a pH variable (una prueba de agresión térmica de dos semanas a 40 °C, pH 5,5) (véase, por ejemplo, Zhang et al., J. Chromatography A 1272:56-64, 2013).

La tabla 11 muestra una comparación entre los resultados de los análisis de EM para h15H6.v2 y h15H6.v3. Cabe destacar que LC-W91 en HVR-L3 había incrementado su oxidación después de la agresión con AAPH tanto en h15H6.v2 como en h15H6.v3 (aproximadamente un 84,5 % y aproximadamente un 86,4 %, respectivamente). La tabla 12 muestra los resultados del análisis de EM para h15H6.v4. De forma sorprendente, la oxidación en LC-W91 en HVR-L3 para h15H6.v4 se redujo en comparación con h15H6.v2 y h15H6.v3, con solo un incremento de un 26,5 % de la oxidación después de la agresión con AAPH en comparación con aproximadamente un incremento de un 84,5-86,4 % de la oxidación para h15H6.v2 y h15H6.v3. Esta mejora fue inesperada porque APEG.LC3.HC3 tiene solo dos sustituciones en comparación con h15H6.v3, es decir, HC-T28K en la región FR-H1 y LC-N31E en HVR-L1, habiéndose introducido ambas para mejorar la afinidad y no esperándose que ninguna de ellas tuviera un impacto sobre la oxidación de LC-W91. El anticuerpo h15H6.v4 usado en este análisis de EM se preparó usando un procedimiento de purificación por única columna. Cuando se repitió el análisis de EM para h15H6.v4 usando un anticuerpo preparado usando un procedimiento de purificación por dos columnas, se demostró que LC-W91 era inestable bajo agresión con AAPH. Se cree que los resultados de la evaluación de la agresión con AAPH realizada con material purificado usando la purificación por dos columnas fueron diferentes de los resultados obtenidos usando material purificado por un procedimiento de purificación por única columna porque el material purificado por única columna contenía un contaminante que interfería en la evaluación de agresión con AAPH.

Tabla 11: propiedades de EM de h15H6.v2 y h15H6.v3

Tabla 12: propiedades de EM de h15H6.v4 (APEG.LC3.HC3)

La tabla 13 muestra los resultados del análisis de EM para el clon de anticuerpo anti-HtrA1 h19B12.v1. Se determinó que HC-N52a HC-G53 en HVR-H2 era inestable, con un incremento de un 49 % de la desamidación. En consecuencia, se espera que las sustituciones en estas posiciones de HVR-H2 de h19B12.v1 (por ejemplo, HC-N52aE, HC-N52aS, HC-N52aS y HC-N52a HC-G53A) mejoren la estabilidad.

Tabla 13: propiedades de EM de h19B12.v1

Ejemplo 5: estructura del Fab h15H6.v4 unido a HtrA1

La estructura del Fab h15H6.v4 unido a HtrA1 se determinó por cristalografía de rayos X y microscopia electrónica. Los resultados demostraron que el epítopo de HtrA1 por Fab h15H6.v4 está formado principalmente por aminoácidos que comprenden el giro del bucle LA de HtrA1.

Síntesis peptídica:

Se generaron péptidos correspondientes a regiones de la proteína HtrA1 usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Atherton, E., et al. (1978). J. Chem Soc. Chem. Commun. 13:537-539.

Cristalización:

El Fab h15H6.v4 (1 ml) a 10 mg/ml en NaCl 0,15 M, Tris 20 mM, pH 7,5, se incubó durante la noche a 4 °C con 1 mg de péptido (péptido/proteína en exceso molar de 3 veces) que contenía aminoácidos en el bucle LA de HtrA1. El complejo Fab-péptido se cristalizó usando sulfato de amonio 2 M, acetato de potasio 0,2 M.

Refinamiento por rayos X:

Se recogió un cristal de Fab h15H6.v4/péptido HtrA1 y se conservó para su análisis de difracción por inmersión en una solución crioprotectora preparada a partir de la adición de glicerol al 30 % al licor madre seguido de inmersión repentina en nitrógeno líquido. Se obtuvieron datos en la línea de haz SSRL 12-2 y se procesaron usando XDS (Kabasch W (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 266:125-32). El reemplazo molecular del complejo Fabpéptido se logró usando la estructura de Fab como una sonda de búsqueda en CCP4 (Winn MD et al. (2011) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67:235-42). Después del refinamiento del cuerpo rígido, se pudo ver la densidad Fo-Fc para el péptido. Una porción de los residuos del dominio proteasa de HtrA1 del bucle A (R K LP F S K R E V P V ) (PDB 3TJO) se ajustaron, a continuación, en la densidad esencialmente como se describe en Emsley et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66:125-32.

Se utilizaron varias tandas de refinamiento en Phenix (Adams PD et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.

66:213-21). Una tanda final de refinamiento en Buster (Bricogne G et al. (2011) llevó los valores de R a R = 16,8 %, Rlibre = 19,8 % de resolución de 2,1Á.

Estructura de microscopia electrónica (ME) de Fab15H6.v4 unido a HtrA1

Para la formación de imágenes de ME, se incubaron 4 pl de complejo HtrA1-hFab15H6.v4 durante 30 s en una rejilla de cobre de malla 400 de carbono continua descargada con brillo reciente (Electron Microscopy Sciences). Después de la incubación, la muestra se tiñó negativamente usando una solución de formiato de uranilo al 2 % (p/v) (SPI Supplies). La solución de tinción se transfirió con papel Watman y la rejilla se secó al aire. La muestra de HtrA1-Fab15H6.v4 se analizó en un Tecnai-12 BioTween (FEI) equipado con un filamento LaB6 y que funcionaba a 120 keV en condiciones de baja dosis. Las imágenes se obtuvieron usando una cámara CCD de 4 k x 4 k (Gatan Inc.) con un aumento nominal de x 62.000 (2,22 A por píxel). Se tomaron semiautomáticamente 27346 partículas que tenían un tamaño de recuadro de 128 px usando el algoritmo de enjambre disponible bajo la rutina e2dogpicker.py incluida en la distribución EMAN2 (Tang L et al. (2007) J. Chem. Inf. Model. 47:1438-45). A continuación, estas partículas se sometieron a clasificación 2D libre de referencia usando el paquete de programa informático Relion (Scheres SH (2012) J. Struct. Biol.180:519-30). Dada la flexibilidad entre el trímero de HTRA1 y los Fab unidos, se usó el algoritmo de clasificación 3D de Relion para generar cinco volúmenes 3D usando como modelo de partida la estructura cristalina del trímero de HtrA1 (PDB ID 3TJO) de paso bajo filtrado a una resolución de 60 A. Cada uno de estos volúmenes se refinó finalmente usando el algoritmo Refine3D en Relion. Las densidades atómicas del trímero de HTRA1 y la estructura cristalina del Fab15H6.v4 se ajustaron a la densidad de ME usando el algoritmo de ajuste en cartografía de Chimera (Pettersen EF et al., 2004). J. Comput. Chem. 25:1605-12 (2004).

Validación de la estructura de Fab Fab15H6.v4 unido a HtrAI usando sustituciones con alanina

Los estudios estructurales descritos anteriormente demostraron que el Fab Fab15H6.v4 interactúa estrechamente con el bucle "A" de la proteína HtrA1. Para confirmar esto, se sintetizó un péptido correspondiente a los residuos 190-201 de la secuencia de HtrA1 humana (donde la numeración corresponde a la numeración de la proteína precursora) y se sometió a prueba para determinar su unión a Fab h15H6.v4 usando resonancia de plasmón superficial (RPS) como se describe anteriormente. El péptido (LA-pep1) mostró una fuerte interacción de unión con Fab 15H6.v4, que tenía un valor de KD de 0,4 nM. Véase la tabla 14.

Las sustituciones con alanina en esta secuencia peptídica reducen (LA-pep2, LA-pep5) o suprimen completamente (LA-pep3, LA-pep4, LA-pep5) la unión a Fab 15H6.v4. Estos resultados biofísicos son consecuentes con los estudios estructurales descritos anteriormente y en las figs. 32A y 32B y demuestran que el epítopo de unión para 15H6.v4 está formado principalmente por aminoácidos que comprenden el giro del bucle LA de HtrA1.

Por el contrario, el Fab YW505.94 no se unió a LA-pep1 ni a ninguna de las formas mutantes (tabla 14). Esto indica que, a pesar del hecho de que el Fab YW505.94 y el h15H6.v4 compiten entre sí para unirse a HtrA1, los epítopos de estos dos Fab son distintos. El epítopo de Fab YW505.94 está centrado en los bucles B y C, mientras que el epítopo de Fab 15H6.v4 comprende principalmente la punta del bucle LA.

Aunque no se pretende que la presente invención esté vinculada a ningún mecanismo particular, es posible que la estrecha interacción entre h15H6.v4 y el bucle LA de HtrA1 justifique la afinidad y potencia significativamente mejoradas de este anticuerpo en comparación con YW505.94.

Tabla 14: péptidos del bucle A (LA) de HtrA1 que se unen a Fab 15H6.v4 y a Fab YW505.94

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado monoclonal aislado que se une específicamente a H trA I, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a HtrA1.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFV y (Fab')².

4. El anticuerpo de la reivindicación 2, en el que el fragmento de anticuerpo es un Fab.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que el Fab comprende un truncamiento en la bisagra superior de la región constante de la cadena pesada.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que la región constante de la cadena pesada termina en la posición 221 (numeración EU).

7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de SEQ ID NO: 160.

8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de SEQ ID NO: 159.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

10. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Un procedimiento de producción de un anticuerpo, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 10 y recuperar el anticuerpo de la célula huésped o el medio de cultivo de células huésped.

12. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 9 y que comprende además al menos un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que la composición está liofilizada.

14. Una formulación terapéutica que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un antagonista del factor D, en el que el antagonista del factor D es un anticuerpo anti factor D.

15. La formulación terapéutica de la reivindicación 14, en la que el anticuerpo anti factor D es lampalizumab.

16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como un medicamento.

17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con HtrA1 o un trastorno ocular, en el que el trastorno asociado con HtrA1 es degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética, retinopatía del prematuro o vasculopatía coroidea polipoidea.

18. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 17, en el que el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética, retinopatía del prematuro o vasculopatía coroidea polipoidea.

19. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 17 o 18, en el que el trastorno asociado con HtrA1 o el trastorno ocular es DMS seca temprana, DMS seca intermedia o DMS seca avanzada.

20. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 19, en el que la DMS seca avanzada es atrofia geográfica.

21. El anticuerpo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16-20, en el que el anticuerpo se formula para su administración con un antagonista del factor D, en el que el antagonista del factor D es un anticuerpo anti factor D.

22. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 21, en el que el anticuerpo anti factor D se administra secuencialmente.

23. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 21, en el que el anticuerpo anti factor D es lampalizumab.

24. El anticuerpo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 17-23, en el que el anticuerpo se administra por vía intravítrea, ocular, intraocular, yuxtaescleral, subtenoniana, supracoroidea o tópica.

25. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 24, en el que el anticuerpo se administra por vía intravítrea por inyección.

26. El anticuerpo para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 17-24, en el que el anticuerpo se administra por un sistema de administración de acción prolongada.

27. El anticuerpo para su uso de la reivindicación 26, en el que el sistema de administración de acción prolongada es un implante sólido basado en PLGA o un sistema de administración por vía implantable.