TW201518321A - 抗－ｉｌ－４抗體及雙特異性抗體及其用途 - Google Patents

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Germaine G Fuh
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Lawren C Wu
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Abstract

本發明提供抗-IL-4抗體及雙特異性抗體以及該等抗體之使用方法。

Description

抗-IL-4抗體及雙特異性抗體及其用途 相關申請案交叉參考
本申請案主張在2013年4月5日申請之美國臨時申請案第61/808,748號之優先權之權益，其係全文以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有經由EFS-Web提交且其全部內容以引用方式併入本文中之序列表。在2014年3月12日創建之該ASCII拷貝命名為2014.MAR.12 P5609R1-WO_SL且大小為75,442位元組。
本發明係關於抗-IL-4抗體及雙特異性抗體及其使用方法。
氣喘在世界範圍內發病率逐漸增加之複雜疾病。尤其已報導氣喘患者氣道中之嗜酸性白血球性發炎事件。該疾病之病理生理學特徵在於可變氣流阻塞、氣道發炎、黏液分泌過多及上皮下纖維化。臨床上，患者可呈現咳嗽、喘鳴及呼吸短促。儘管許多患者已經當前可用療法充分治療，但一些氣喘患者儘管使用當前療法卻仍患有持久性疾病。
多個研究已在氣喘及過敏之發病機制中涉及IL-4、IL-13及其受體(例如，參見Wills-Karp,2004,Immunol.Rev.202,175-190；Brightling等人，2010,Clin.Exp.Allergy 40,42-49；Finkelman等人， 2010,J Immunol 184,1663-1674；Maes等人，2012,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.47,261-270；Steinke及Borish,2001,Respir.Res.2,66-70)。IL-4與兩個受體結合，一個係IL-4Rα及共同γ鏈(γc)之異二聚體，且另一個係IL-4受體α(IL-4Rα)及IL-13受體α 1(IL-13Rα1)之異二聚體。後一受體IL-4Rα/IL-13Rα1係與IL-13之共享受體，其亦獨特地結合由IL-13受體α 2(IL-13Rα2)組成之單鏈受體。IL-4、IL-13及IL-4Rα基因之多型性與氣喘及過敏相關，包括諸如以下等特徵：IgE含量、特異體質過敏症之患病率及氣喘病之嚴重度。另外，IL-4、IL-13及其受體之表現在氣喘及其他過敏性疾病中增加。此外，IL-4、IL-13及其受體之中和或缺乏在氣喘之臨床前模型中改善疾病。
多種用於治療氣喘之藥物在售或在研發中。氣喘療法之多個靶中之一者係IL-13。IL-13係活化T細胞、NKT細胞、嗜鹼性球、嗜酸性白血球及肥胖細胞產生之多效性TH2細胞介素，且其在臨床前模型中顯著參與氣喘之發病機制。先前已闡述IL-13拮抗劑(包括抗-IL-13抗體)。例如，參見國際專利申請公開案第WO 2005/062967號。該等抗體亦已作為人類治療劑來研發。最近，若干個研究已顯示單株抗體在氣喘治療中針對IL-13之臨床活性(例如，參見Corren等人，2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098；Gauvreau等人，2011,Am.J.Respir.Crit.Care Med.183,1007-1014；Ingram and Kraft,2012,J.Allergy Clin.Immunol.130,829-42；Webb,2011,Nat Biotechnol 29,860-863)。在該等抗體中，來金珠單抗(lebrikizumab，中和IL-13活性之人類化IgG4抗體)改良儘管用(對於大多數)吸入式皮質類固醇及長效β2-腎上腺素受體激動劑治療但仍顯現症狀之氣喘患者之肺功能(Corren等人，2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098)。另外，已闡述結合IL-13及IL-4之雙特異性抗體。例如，參見美國公開案第2010/0226923號。
中度至重度氣喘患者仍需要替代性治療選擇。因此，業內需要鑑別用於治療氣喘之較佳療法及用於理解如何治療氣喘患者之改良方法。
自發性肺纖維化(IPF)係限制性肺病，其特徵在於肺實質之進行性間質性纖維化，其在美國影響約100,000名患者(Raghu等人，Am J Respir Crit Care Med 174：810-816(2006))。此與IPF相關之間質性纖維化使肺功能進行性喪失，從而在大多數患者中導致因呼吸衰竭而死亡。自診斷時起之中值存活時間係2-3年(Raghu等人，Am J Respir Crit Care Med 183：788-824(2011))。IPF之病因及關鍵的分子及病理生理驅動因子未知。唯一顯示可延長IPF患者存活之治療係肺移植(Thabut等人，Annals of internal medicine 151：767-774(2009))。然而，肺移植與顯著發病率相關，並非所有IPF患者皆係肺移植之適宜候選者，且適宜供體肺相對缺乏。儘管已多次嘗試，但迄今尚無藥物療法顯示可在IPF患者之隨機化、安慰劑對照之介入性試驗中顯著延長存活，但一些介入似乎可減慢一些患者之肺功能衰退速率(Raghu等人，Am J Respir Crit Care Med 183：788-824(2011)；Richeldi等人，The New England J.of Med.365：1079-1087(2011))。
IL-4及IL-13信號傳導可在活體外誘導多種細胞類型之纖維發生反應。已顯示用IL-4或IL-13處理纖維母細胞可誘導產生膠原及分化至肌纖維母細胞表型(Borowski等人，J.British Soc.Allergy Clin.Immunol.,38：619-628(2008)；Hashimoto等人，J.Allergy Clin.Immunol.,107：1001-1008(2001)；Murray等人，Int.J.Biochem.Cell Biol.,40：2174-2182(2008)；Saito等人，Intl.Archives Allergy Immunol.,132：168-176(2003))。或者，亦已有人提出，活化巨噬細胞係纖維發生過程之主要貢獻者，此部分係基於其產生刺激纖維母細胞及肌纖維母細胞之生長因子(例如TGFβ及PDGF)之能力。IL-4及IL- 13係替代性活化巨噬細胞表型之有效誘導物且可至少部分經由其對該等細胞之活性驅動纖維發生反應(Doyle等人，Eur.J.Immunol.,24：1441-1445(1994)；Song等人，Cell.Immunol.,204：19-28(2000)；Wynn及Barron,Seminars Liver Dis.,30：245-257(2010))。
IL-4及IL-13亦可在活體內在多種組織中驅動纖維發生反應。IL-4或IL-13在小鼠肺中之轉基因過表現足以誘導膠原基因表現及顯著上皮下纖維化(Lee等人，J.Exper.Med.,194：890-821(2001)；Ma等人J.Clin.Invest.,116：1274-1283(2006)；Zhu等人，J.Clin.Invest.103：779-788(1999))。另外，多個研究已證實IL-4及IL-13在臨床前動物模型中作為纖維化驅動因子之作用。在博來黴素(Bleomycin)及FITC誘導之肺纖維化模型中，具有IL-13之靶向分解或經對IL-13具有特異性之阻斷抗體處理之小鼠顯示減少之細胞外基質分解(Belperio等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,27：419-427(2002)；Kolodsick等人，J.Immunol.,172：4068-4076(2004)；Liu等人，J.Immunol.,173：3425-3431(2004))。類似地，已顯示IL-4在博來黴素誘導之肺纖維化模型中對於維持纖維變性反應很重要(Huaux等人，J.Immunol.,170：2083-2092(2003))。
多個研究已得出結論，IL-4及/或IL-13之表現及活性在IPF患者中上升。在來自IPF患者之肺生檢樣品中發現IL-4、IL-13及IL-4/IL-13受體亞單元之表現與正常對照相比在mRNA及蛋白質層面上皆有所增加(Jakubziak等人，J.Clin.Pathol.,57：477-486(2004))。值得注意的是，在此研究中，藉由免疫組織化學在IPF生檢中發現在纖維母細胞病灶中表現IL-13Rα2(IL-4或IL-13信號傳導顯著誘導之基因，David等人，Oncogene,22：2286-3394(2003))，表明在該等細胞中存在活性IL-4或IL-13信號傳導。亦發現IL-4及IL-13在IPF患者之支氣管肺泡灌洗液中與正常對照相比有所上升。值得注意的是，該等樣品中之IL- 13含量與肺功能之關鍵量度(預測FVC及DLCO百分比)呈負相關(Park等人，J.Korean Med.Sci.,24：614-620(2009))，表明IL-13在IPF患者中之病原性功能。
IPF患者仍需要替代性治療選擇。因此，業內需要鑑別用於治療IPF之較佳療法及用於理解如何治療IPF患者之改良方法。
出於任一目的，本文引用之所有參考文獻(包括專利申請案及公開案)皆係全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，提供多特異性抗體，其中多特異性抗體包含抗原結合結構域，該抗原結合結構域包含特異性結合IL-4之第一VH/VL單元及特異性結合IL-13之第二VH/VL單元。在一些實施例中，多特異性抗體：a)抑制IL-4與IL-4受體α(IL-4Rα)之結合，b)在活體外抑制IL-4誘導之細胞增殖，及/或c)在活體外抑制IL-13誘導之細胞增殖。
在一些實施例中，多特異性抗體之第一VH/VL單元包含包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，第一VH/VL單元包含包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，第一VH/VL單元包含包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，第一VH/VL單元包含(a)與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少95% 序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。在一些實施例中，第一VH/VL單元包含選自SEQ ID NO：1及3至9之VH序列。在一些實施例中，第一VH/VL單元包含選自SEQ ID NO：2、10及11之VL序列。在一些實施例中，第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列。
在本文所述任一實施例中，多特異性抗體之第二VH/VL單元可包含：(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；或(b)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體之第二VH/VL單元可包含：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；或(b)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體之第二VH/VL單元可包含：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3；或(b)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體之第二VH/VL單元可包含：(a)與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列；(d)與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(e) 與SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(f)如(d)中之VH序列及如(e)中之VL序列。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體之第二VH/VL單元可包含SEQ ID NO：19、56或49之VH序列。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體之第二VH/VL單元可包含SEQ ID NO：20、57或48之VL序列。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體之第二VH/VL單元可包含SEQ ID NO：19或56之VH序列及SEQ ID NO：20或57之VL序列；或SEQ ID NO：49之VH序列及SEQ ID NO：48之VL序列。
在一些實施例中，多特異性抗體與包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列之抗體競爭結合至IL-4。在一些實施例中，多特異性抗體與包含SEQ ID NO：19之VH序列及SEQ ID NO：20之VL序列之抗體或與包含SEQ ID NO：49之VH序列及SEQ ID NO：48之VL序列之抗體競爭結合至IL-13。在一些實施例中，多特異性抗體結合在SEQ ID NO：29之胺基酸77至89內或在SEQ ID NO：29之胺基酸82至89內之表位。
在一些實施例中，提供多特異性抗體，其包含特異性結合IL-4之第一VH/VL單元及特異性結合IL-13之第二VH/VL單元，其中第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列，且第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：19之VH序列及SEQ ID NO：20之VL序列。
在本文所述任一實施例中，多特異性抗體可為IgG抗體。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體可為IgG1或IgG4抗體。在本文所述任一實施例中，多特異性抗體可為IgG4抗體。
在本文所述任一實施例中，多特異性抗體可包含第一重鏈恆定區及第二重鏈恆定區，其中第一重鏈恆定區包含隆凸突變且第二重鏈恆定區包含空穴突變。在一些實施例中，第一重鏈恆定區與結合IL-4 之VH/VL單元之重鏈可變區部分融合。在一些實施例中，第二重鏈恆定區與結合IL-13之VH/VL單元之重鏈可變區部分融合。在一些實施例中，第一重鏈恆定區與結合IL-13之VH/VL單元之重鏈可變區部分融合。在一些實施例中，第二重鏈恆定區與結合IL-4之VH/VL單元之重鏈可變區部分融合。
在一些實施例中，多特異性抗體係包含隆凸突變之IgG1抗體，該隆凸突變包含T366W突變。在一些實施例中，多特異性抗體係包含空穴突變之IgG1抗體，該空穴突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V之突變。在一些實施例中，多特異性抗體係包含隆凸突變之IgG4抗體，該隆凸突變包含T366W突變。在一些實施例中，多特異性抗體係包含空穴突變之IgG4抗體，該空穴突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V之突變。在一些實施例中，多特異性抗體包含第一重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36之序列。在一些實施例中，多特異性抗體包含第二重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37之序列。
在一些實施例中，提供多特異性抗體，其中抗體包含包含SEQ ID NO：38之序列之第一重鏈、包含SEQ ID NO：39之序列之第一輕鏈、包含SEQ ID NO：40之序列之第二重鏈及包含SEQ ID NO：41之序列之第二輕鏈。
在一些實施例中，提供結合至IL-4之分離抗體。在一些實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；或(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；或(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO： 16之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；或(d)與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；或(e)與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，抗體包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列及與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列。在一些實施例中，抗體包含選自SEQ ID NO：1及3至9之VH序列。在一些實施例中，抗體包含選自SEQ ID NO：2、10及11之VL序列。
在一些實施例中，提供結合至IL-4之分離抗體，其中抗體包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列。
在一些實施例中，提供編碼本文所述雙特異性抗體或分離抗體中之任一者之分離核酸。在一些實施例中，提供編碼本文所述任一多特異性抗體之第一VH/VL單元之分離核酸。在一些實施例中，提供編碼本文所述任一多特異性抗體之第二VH/VL單元之分離核酸。在一些實施例中，提供包含分離核酸之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞係大腸桿菌(E.coli)細胞或CHO細胞。在一些實施例中，提供產生抗體之方法，其包含培養宿主細胞。
在一些實施例中，提供免疫偶聯物，其中免疫偶聯物包含本文所述多特異性抗體或分離抗體中之任一者及細胞毒性劑。
在一些實施例中，提供醫藥調配物，其包含本文所述多特異性抗體或分離抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。
在一些實施例中，提供本文所述抗體用做醫藥。在一些實施例中，提供本文所述抗體用於治療嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症、IL-4介導之病症或呼吸病症。在一些實施例中，提供本文所述抗體之用途，其用於製造用於治療嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症、IL-4介導之病症或呼吸病症之醫藥。在一些實施例中，提供治療個體之嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症、IL-4介導之病症或呼吸病症之方法，其包含向該個體投與有效量之本文所述抗體。在一些該等實施例中，方法進一步包含向該個體投與TH2路徑抑制劑。 在一些實施例中，TH2路徑抑制劑抑制至少一個選自以下之靶：ITK、BTK、IL-9、IL-5、IL-13、IL-4、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33、IgE、IL-9受體、IL-5受體、IL-4受體α、IL-13受體α1、IL-13受體α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα、IL17RB、ST2、CCR3、CCR4、CRTH2、FcεRI、FcεRII/CD23、Flap、Syk激酶；CCR4、TLR9、CCR3、IL5、IL3及GM-CSF。在一些實施例中，個體患有中度至重度氣喘。在一些實施例中，個體患有自發性肺纖維化。
在本文所述任一實施例中，嗜酸性白血球性病症可選自氣喘、重度氣喘、慢性氣喘、異位性氣喘、異位性皮膚炎、過敏、過敏性鼻炎、非過敏性鼻炎、接觸性皮膚炎、多形性紅斑、大皰性皮膚病、牛皮癬、濕疹、類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎、慢性嗜酸性白血球性肺炎、過敏性支氣管肺麴菌病、乳糜瀉、丘斯症候群(Churg-Strauss syndrome，結節性動脈周圍炎加特異體質過敏症)、嗜酸性白血球性肌痛症候群、嗜酸性白血球過多症候群、水腫反應(包括發作性血管性水腫)、蠕蟲感染、蕁麻疹、盤尾絲蟲皮膚炎、嗜酸性白血球相關胃腸病症、嗜酸性白血球性食道炎、嗜酸性白血球性胃炎、嗜酸性白血球性胃腸炎、嗜酸性白血球性腸炎、嗜酸性白血球性結腸炎、潰瘍性結腸炎、惠普爾病(Whipple’s disease)、鼻微息肉病、鼻息 肉病、阿斯匹林(aspirin)不耐受症、阻塞性睡眠呼吸中止症、克隆氏病(Crohn's disease)、硬皮病、心肌心內膜纖維化、纖維化、發炎性腸病、自發性間質性肺炎、嗜酸性白血球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、硬化症繼發之肺纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、葡萄膜炎、癌症、神經膠母細胞瘤、何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非何傑金氏淋巴瘤。在一些實施例中，IL-13介導疾病選自異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、癌症、神經膠母細胞瘤及非何傑金氏淋巴瘤。在本文所述任一實施例中，IL-4介導疾病可選自異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、癌症、神經膠母細胞瘤及非何傑金氏淋巴瘤。在本文所述任一實施例中，呼吸病症可選自氣喘、過敏性氣喘、非過敏性氣喘、支氣管炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、氣腫、吸煙誘導之氣腫、氣道發炎、囊性纖維化、肺纖維化、過敏性鼻炎及支氣管擴張症。
圖1顯示，抗體19C11係IL-4受體活化之有效拮抗劑，如實例2中所述。(A)19C11阻斷IL-4與固定化IL-4Rα之結合。19C11(實心圓)、對照IgG(空心正方形)、無IgG(空心三角形)。(B)19C11抗體抑制IL-4誘導之TF-1細胞增殖。19C11(實心圓)、對照IgG(空心正方形)、無IgG(空心三角形)、未添加IL-4(實心三角形)。
圖2顯示作為大腸桿菌中之IgG1同種型之抗-IL-13.隆凸及抗-IL-4.空穴之(A)非還原及(B)還原樣品之西方墨點(Western blot)，如實例4中所述。片段名稱係重鏈(H)及輕鏈(L)且泳道標記為M(分子量標準 物)、C(對照，無抗體表現質粒)。圖2亦顯示比較抗-IL-13.隆凸(C)及抗-IL-4.空穴(D)之不同同種型及突變之免疫印跡，如實例5中所述。上圖顯示非還原條件，其代表裝配半抗體(HL)，而下圖顯示還原條件，其顯示對於所有變體合成類似量之重鏈及輕鏈。
圖3顯示雙特異性抗體之分析性表徵，如實例6中所述。(A)裝配雙特異性抗體之粒徑篩析層析。插圖顯示同一圖之高分子量區域之放大。(B)裝配雙特異性抗體之非還原CE-SDS PAGE確認鉸鏈二硫鍵之形成及鏈間二硫鍵之完整性。主峰區域對應於具有所形成鏈間二硫鍵之完整抗體。極少次要峰種類反映缺乏完整鏈間二硫鍵來穩定異二聚體之完整抗體。(C)還原CE-SDS確認存在輕鏈及重鏈之預期分佈且顯示材料之純度。在完整輕鏈及重鏈之主峰旁僅檢測到極少峰。
圖4顯示完整(A)IgG1同種型、(B)IgG4同種型及(C)IgG4R409K同種型基雙特異性抗體之ESI-TOF質譜分析，如實例6中所述。
圖5顯示抗-IL-4/IL-13 IgG1同種型及抗-IL-4/IL-13 IgG4同種型雙特異性抗體對人類IL-4-(A)、人類IL-13-(B)或人類IL-4/IL-13-(C)誘導之增殖之劑量依賴性抑制，如實例8中所述。抗-IL-4/IL-13 IgG1同種型(實心圓)、抗-IL-4/IL-13 IgG4同種型(空心三角形)、未添加抗體(空心正方形)、未添加細胞介素及抗體(實心正方形)。
圖6顯示抗-IL-4/IL-13 IgG1同種型及抗-IL-4/IL-13 IgG4同種型雙特異性抗體對食蟹猴IL-4-(A)及食蟹猴IL-13-(B)誘導之增殖之劑量依賴性抑制，如實例8中所述。抗-IL-4/IL-13 IgG1同種型(實心圓)、抗-IL-4/IL-13 IgG4同種型((A)中之實心圓，(B)中之空心三角形)、未添加抗體(空心正方形)、未添加細胞介素及抗體(實心正方形)。
圖7顯示食蟹猴在投與單一靜脈內或皮下劑量後之平均(±SD)血清抗-IL-4/IL-13 IgG4(A)及IgG1(B)雙特異性抗體濃度，如實例9中所述。ELISA之定量極限(LOQ)係0.078μg/mL。使用所有高於LOQ之 數據並排除所有低於LOQ之數據。在n2時不計算SD。
圖8顯示抗-IL-4/IL-13 IgG4及抗-IL-4/IL-13 IgG1抗體在靜脈內投與食蟹猴後之支氣管肺泡灌洗(BAL)液濃度及上皮內襯液體(ELF)濃度，該等食蟹猴經豬蛔蟲(A.suum)提取物攻毒以誘發模擬暴露於過敏原之氣喘患者之反應之過敏性發炎反應，如實例10中所述。抗-IL-4/IL-13之ELISA之定量極限(LOQ)係0.078μg/mL。使用所有高於LOQ之數據並排除所有低於LOQ之數據。在n2時不計算SD。
圖9顯示(A)用於治療過敏性氣道發炎及氣喘小鼠模型之研究設計，如實例11中所述。圖9亦顯示在各種治療後在過敏性氣道發炎及氣喘小鼠模型動物中之(B)肺嗜酸性白血球數目、(C)支氣管肺泡灌洗液嗜酸性白血球數目、(D)抗原特異性IgE含量及(E)血清TARC含量，如實例11中所述。對於每一長條圖，最初四個長條自左至右係：對照治療、抗-IL-4抗體治療、抗-IL-13抗體治療及抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體治療。若存在第五及第六長條，則其係首次接受實驗之小鼠。
圖10顯示人類κ1輕鏈可變區共有序列(SEQ ID NO：61)、mu19C11抗體輕鏈可變區(SEQ ID NO：2)及19C11-κ1接枝輕鏈可變區(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列，如實例3中所述。位置係根據Kabat來編號且自mu19C11接枝至可變輕鏈κI共有框架之高變區加框。
圖11顯示人類κ3輕鏈可變區共有序列(SEQ ID NO：62)、mu19C11抗體輕鏈可變區(SEQ ID NO：2)及19C11-κ3接枝輕鏈可變區(SEQ ID NO：11)之胺基酸序列，如實例3中所述。位置係根據Kabat來編號且自mu19C11接枝至可變輕鏈κI共有框架之高變區加框。
圖12顯示人類VH1重鏈可變區共有序列(SEQ ID NO：63)、mu19C11抗體重鏈可變區(SEQ ID NO：1)及19C11-VH1接枝物(SEQ ID NO：3)、19C11-VH1.L(SEQ ID NO：4)及19C11-VH1.FFL(SEQ ID NO： 5)重鏈可變區之胺基酸序列，如實例3中所述。位置係根據Kabat來編號且高變區及自mu19C11轉入可變重鏈亞組I共有框架之游標位置加框。
圖13顯示人類VH3重鏈可變區共有序列(SEQ ID NO：64)、mu19C11抗體重鏈可變區(SEQ ID NO：1)及19C11-VH3接枝物(SEQ ID NO：6)、19C11-VH3.FLA(SEQ ID NO：7)、19C11-VH3.LA(SEQ ID NO：8)及19C11-VH3.LA.SV(SEQ ID NO：9)重鏈可變區之胺基酸序列，如實例3中所述。位置係根據Kabat來編號且高變區及自mu19C11轉入可變重鏈亞組I共有框架之游標位置加框。
圖14顯示IL-4之人類化抗體之表面電漿子共振(SPR)親和力量測，如實例3中所述。
圖15顯示濃度遞增之抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體對結合至人類IL-4R之生物素化人類IL-4之抑制之曲線，如實例7中所述。
圖16顯示濃度遞增之抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體對結合至人類IL-13Rα1之生物素化人類IL-13之抑制之曲線，如實例7中所述。
圖17顯示濃度遞增之抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體對結合至人類IL-13Rα2之生物素化人類IL-13之抑制之曲線，如實例7中所述。
圖18顯示在抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體存在下IL-13Rα2與IL-13結合之SPR感應圖，如實例7中所述。所顯示線條代表受體介於12.5nM至200nM範圍內之兩倍濃度系列。
除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所瞭解相同之含義。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994)及March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版，John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992)為熟習此項技術者提供本申請案中所用多個術語之一般指導。
某些定義
出於闡釋本說明書之目的，將應用以下定義，且若適宜，以單數使用之術語亦將包括複數，且反之亦然。若下文所陳述之任何定義與以引用方式併入本文中之任何文件衝突，應以下文所陳述之定義為準。
除非上下文明確指示其他含義，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，在提及「一蛋白質」或一「抗體」時分別包括複數個蛋白質或抗體；在提及「一細胞」時包括細胞混合物及諸如此類。
如本文所用術語「生物樣品」包括(但不限於)血液、血清、血漿、痰、支氣管肺泡灌洗、組織生檢(例如，肺樣品)及鼻樣品(包括鼻拭子或鼻息肉)。
FENO分析係指量測FENO(呼出一氧化氮分率)值之分析。該等值可使用(例如)手持式便攜裝置NIOX MINOTM(Aerocrine,Solna,Sweden)根據American Thoracic Society(ATS)在2005年公佈之指南來評估。FENO可以其他類似方式(例如FeNO或FENO)來記錄，且應理解，所有該等類似變化形式皆具有相同含義。
氣喘係複雜病症，其特徵為可變及復發症狀、可逆氣流阻塞(例如，因支氣管擴張劑所致)及可能與潛在發炎有關或可能無關之支氣管高反應性。氣喘之實例包括阿斯匹林敏感性/加重之氣喘、異位性氣喘、重度氣喘、輕度氣喘、中度至重度氣喘、未接受過皮質類固醇之氣喘、慢性氣喘、皮質類固醇抗性氣喘、皮質類固醇難治性氣喘、剛診斷且未經治療之氣喘、吸煙所致之氣喘、未用皮質類固醇控制之氣喘及如J Allergy Clin Immunol(2010)126(5)：926-938中提及之其他 氣喘。
「嗜酸性白血球性病症」意指與嗜酸性白血球數目過多相關之病症，其中由於嗜酸性白血球之含量或活性可在體內局部或全身表現非典型症狀。與嗜酸性白血球數目或活性過高相關之病症包括(但不限於)氣喘(包括阿斯匹林敏感性氣喘、慢性氣喘及重度氣喘)、異位性氣喘、異位性皮膚炎、過敏、過敏性鼻炎(包括季節性過敏性鼻炎)、非過敏性鼻炎、接觸性皮膚炎、多形性紅斑、大皰性皮膚病、牛皮癬、濕疹、類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎、慢性嗜酸性白血球性肺炎、過敏性支氣管肺麴菌病、乳糜瀉、丘斯症候群(結節性動脈周圍炎加特異體質過敏症)、嗜酸性白血球性肌痛症候群、嗜酸性白血球過多症候群、水腫反應(包括發作性血管性水腫)、蠕蟲感染、蕁麻疹、盤尾絲蟲皮膚炎、嗜酸性白血球相關胃腸病症(EGID)(包括(但不限於)嗜酸性白血球性食道炎、嗜酸性白血球性胃炎、嗜酸性白血球性胃腸炎、嗜酸性白血球性腸炎及嗜酸性白血球性結腸炎)、潰瘍性結腸炎、惠普爾病、鼻微息肉病及鼻息肉病、阿斯匹林不耐受症、阻塞性睡眠呼吸中止症、克隆氏病、硬皮病、心肌心內膜纖維化、癌症(例如，神經膠母細胞瘤(例如多形性神經膠母細胞瘤)、非何傑金氏淋巴瘤(NHL)、何傑金氏淋巴瘤)、纖維化、發炎性腸病、自發性間質性肺炎、嗜酸性白血球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺纖維化(包括自發性肺纖維化(IPF)及硬化症繼發之肺纖維化)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化及葡萄膜炎。嗜酸性白血球產生之分泌產物亦與在腫瘤及諸如慢性氣喘、克隆氏病、硬皮病及心肌心內膜纖維化等病況中所見之纖維變性反應中促進血管發生及結締組織形成相關(Munitz A、Levi-Schaffer F.Allergy 2004；59：268-75,Adamko等人Allergy 2005；60：13-22,Oldhoff等人Allergy 2005；60：693-6)。
IL-13介導之病症意指與IL-13含量或活性相關之病症，其中可因 IL-13之含量或活性在體內局部及/或全身表現非典型症狀。IL-13介導之病症之實例包括：癌症(例如，非何傑金氏淋巴瘤、神經膠母細胞瘤)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病(包括肺纖維化，例如IPF)、COPD及肝纖維化。
IL-4介導之病症意指：與IL-4含量或活性過高相關之病症，其中可因IL-4之含量或活性在體內局部及/或全身表現非典型症狀。IL-4介導之病症之實例包括：癌症(例如，非何傑金氏淋巴瘤、神經膠母細胞瘤)、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病(包括肺纖維化，例如IPF)、COPD及肝纖維化。
氣喘樣症狀包括選自由以下組成之群之症狀：呼吸短促、咳嗽(痰產生及/或痰品質及/或咳嗽頻率之變化)、喘鳴、胸悶、支氣管收縮及歸因於上述症狀中之一者或該等症狀之組合之夜間覺醒(Juniper等人(2000)Am.J.Respir.Crit.Care Med.,162(4),1330-1334.)。
術語「呼吸病症」包括(但不限於)氣喘(例如，過敏性及非過敏性氣喘(例如，在(例如)年幼兒童中因(例如)呼吸道融合性病毒(RSV)感染所致))；支氣管炎(例如，慢性支氣管炎)；慢性阻塞性肺病(COPD)(例如，氣腫(例如，吸煙誘導之氣腫)；涉及氣道發炎、嗜酸性白血球增多、纖維化及過多黏液產生之病況，例如囊性纖維化、肺纖維化及過敏性鼻炎。特徵為氣道發炎、過多氣道分泌及氣道阻塞之疾病之實例包括氣喘、慢性支氣管炎、支氣管擴張症及囊性纖維化。
加重(一般稱為氣喘發作或急性氣喘)係呼吸短促、咳嗽(痰產生及/或痰品質及/或咳嗽頻率之變化)、喘鳴、胸悶、歸因於上述症狀中之一者或該等症狀之組合之夜間覺醒之新增加或進行性增加之發作。加重之特徵經常在於呼氣氣流(PEF或FEV1)之減少。然而，PEF差異性在加重期間通常不增加，但其可在即將自加重恢復前或在該恢復期 間增加。加重之嚴重度介於輕度至危及生命範圍內，且可基於症狀及肺功能二者來評估。如本文所述之重度氣喘加重包括導致以下住院中之任一者或組合之加重：氣喘治療、高皮質類固醇使用(例如，皮質類固醇總日劑量之四倍或在連續3天或更長時間中給予大於或等於500毫克FP之總日劑量或等效量)或經口/非經腸皮質類固醇使用。
「TH2路徑抑制劑」或「TH2抑制劑」係抑制TH2路徑之藥劑。TH2路徑抑制劑之實例包括選自由以下組成之群之任一靶之活性之抑制劑：ITK、BTK、IL-9(例如，MEDI-528)、IL-5(例如，美泊利單抗(Mepolizumab)、CAS編號196078-29-2；萊斯利珠單抗(resilizumab))、IL-13(例如，IMA-026、IMA-638(亦稱作安蘆珠單抗(anrukinzumab)，INN編號910649-32-0；QAX-576；IL-4/IL-13阱)、妥洛奴單抗(tralokinumab，亦稱作CAT-354，CAS編號1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(亦稱作人類化13C5.5抗體)、IL-4(例如，AER-001、IL-4/IL-13阱)、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33及IgE(例如，XOLAIR、QGE-031；MEDI-4212)；及諸如以下等受體：IL-9受體、IL-5受體(例如，MEDI-563(苯拉珠單抗(benralizumab)，CAS編號1044511-01-4)、IL-4受體α(例如，AMG-317、AIR-645)、IL-13受體α1(例如，R-1671)及IL-13受體α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP之輔受體)、IL17RB(IL-25之受體)、ST2(IL-33之受體)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如，AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE之受體)、Flap(例如，GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)及CCR3、IL5、IL3、GM-CSF之多細胞介素抑制劑(例如，TPI ASM8)。上文所提及靶之抑制劑之實例揭示於(例如)以下文獻中：WO2008/086395；WO2006/085938；US 7,615,213；US 7,501,121；WO2006/085938；WO 2007/080174；US 7,807,788； WO2005007699；WO2007036745；WO2009/009775；WO2007/082068；WO2010/073119；WO2007/045477；WO2008/134724；US2009/0047277；及WO2008/127,271。
術語「小分子」係指分子量介於50道爾頓至2500道爾頓之間之有機分子。
術語「抗體」係以最廣泛含義使用且明確涵蓋(例如)單株抗體、多株抗體、具有多表位特異性之抗體、單鏈抗體、多特異性抗體及抗體片段。該等抗體可為嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及合成抗體。該等抗體及其生成方法更詳細地闡述於下文中。
術語「多特異性抗體」係以最廣泛含義使用且明確涵蓋包含具有多表位特異性(即，能特異性結合至一個生物分子上之兩個或更多個不同表位或能特異性結合至兩個或更多個不同生物分子上之表位)之抗原結合結構域之抗體。在一些實施例中，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)之抗原結合結構域包含兩個VH/VL單元，其中第一VH/VL單元特異性結合至第一表位且第二VH/VL單元特異性結合至第二表位，其中每一VH/VL單元包含重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。該等多特異性抗體包括(但不限於)全長抗體、具有兩個或更多個VL及VH結構域之抗體、諸如Fab、Fv、dsFv、scFv等抗體片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體及三功能抗體、已共價或非共價連接之抗體片段。進一步包含重鏈恆定區之至少一部分及/或輕鏈恆定區之至少一部分之VH/VL單元亦可稱作「半聚體」或「半抗體」。根據一些實施例，多特異性抗體係以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM之親和力結合至每一表位之IgG抗體。在一些實施例中，半聚體包含重鏈可變區之足夠部分以容許與第二半聚體形成分子內二硫鍵。在一些實施例中，半聚體包含隆凸突變或空穴突變以(例如)容許與包含互 補空穴突變或隆凸突變之第二半聚體或半抗體異二聚化。下文進一步論述隆凸突變及空穴突變。
「雙特異性抗體」係包含能特異性結合至一個生物分子上之兩個不同表位或能特異性結合至兩個不同生物分子上之表位之抗原結合結構域之多特異性抗體。雙特異性抗體在本文中亦可稱作具有「雙重特異性」或稱作係「雙重特異性的」。
如本文所用術語「隆凸-至-空穴中(knob-into-hole)」或「KnH」技術係指在活體外或在活體內藉由在兩個多肽相互作用之界面處將隆起(隆凸)引入一個多肽中且將空洞(空穴)引入另一多肽中引導兩個多肽配對在一起之技術。舉例而言，已在抗體之Fc：Fc結合界面、CL：CH1界面或VH/VL界面中引入KnH(例如，參見US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431及Zhu等人，1997,Protein Science 6：781-788)。在一些實施例中，在多特異性抗體製造期間，KnH驅動兩個不同重鏈配對在一起。舉例而言，在其Fc區中具有KnH之多特異性抗體可進一步包含與每一Fc區連接之單一可變結構域，或進一步包含與類似或不同輕鏈可變結構域配對之不同重鏈可變結構域。KnH技術亦可用於使兩個不同受體細胞外結構域配對在一起或使任何其他包含不同靶識別序列(例如，包括親和體、肽體及其他Fc融合物)之多肽序列配對。
如本文所用術語「隆凸突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將隆起(隆凸)引入多肽中之突變。在一些實施例中，其他多肽具有空穴突變。
如本文所用術語「空穴突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將空洞(空穴)引入多肽中之突變。在一些實施例中，其他多肽具有隆凸突變。
術語「治療劑」係指任何用於治療疾病之藥劑。治療劑可為(例 如)多肽(例如，抗體、免疫黏附素或肽體)、適配體或可結合至可結合至編碼靶之核酸分子(即，siRNA)之蛋白質或核酸分子之小分子等。
術語「控制劑」或「預防劑」係指任何用於控制氣喘發炎之治療劑。控制劑之實例包括皮質類固醇、白三烯受體拮抗劑(例如，抑制白三烯之合成或活性，例如孟魯司特(montelukast)、齊留通(zileuton)、普侖司特(pranlukast)、紮魯司特(zafirlukast))、LABA、皮質類固醇/LABA組合組合物、茶鹼(包括胺茶鹼)、色甘酸鈉、奈多羅米(nedocromil)鈉、奧馬珠單抗(omalizumab)、LAMA、MABA(例如，雙功能毒蕈鹼拮抗劑-β2激動劑)、5-脂肪加氧酶活化蛋白(FLAP)抑制劑及酶PDE-4抑制劑(例如，羅氟司特(roflumilast))。「第二控制劑」通常係指不同於第一控制劑之控制劑。
術語「皮質類固醇不足」或「CS」意指由於投與另一治療劑而使用於治療服用皮質類固醇來治療疾病之患者之疾病之皮質類固醇之頻率及/或量減少或消除。「CS劑」係指可在服用皮質類固醇之患者中引起CS之治療劑。
術語「皮質類固醇」包括(但不限於)氟替卡松(fluticasone)(包括丙酸氟替卡松(FP))、倍氯米松(beclometasone)、布地奈德(budesonide)、環索奈德(ciclesonide)、莫米松(mometasone)、氟尼縮松(flunisolide)、倍他米松(betamethasone)及曲安西龍(triamcinolone)。「可吸入皮質類固醇」意指適於藉由吸入遞送之皮質類固醇。實例性可吸入皮質類固醇係氟替卡松、二丙酸倍氯米松、布地奈德、糠酸莫米松、環索奈德、氟尼縮松、曲安奈德(triamcinolone acetonide)及當前可獲得或在未來可獲得之任一其他皮質類固醇。可吸入且與長效β2-激動劑組合之皮質類固醇之實例包括(但不限於)：布地奈德/福莫特羅(formoterol)及氟替卡松/沙美特羅(salmeterol)。
皮質類固醇/LABA組合藥物之實例包括糠酸氟替卡松/三氟甲磺 酸維蘭特羅(vilanterol trifenatate)及茚達特羅(indacaterol)/莫米松。
術語「LABA」意指長效β-2激動劑，該激動劑包括(例如)沙美特羅、福莫特羅、班布特羅(bambuterol)、沙丁胺醇(albuterol)、茚達特羅、阿福莫特羅(arformoterol)及克侖特羅(clenbuterol)。
術語「LAMA」意指長效毒蕈鹼拮抗劑，該等激動劑包括：噻托溴銨(tiotropium)。
LABA/LAMA組合之實例包括(但不限於)：奧達特羅(olodaterol)噻托溴銨(Boehringer Ingelheim’s)及茚達特羅甘羅溴銨(glycopyrronium)(Novartis)。
術語「SABA」意指短效β-2激動劑，該等激動劑包括(但不限於)沙布坦(salbutamol)、左沙布坦(levosalbutamol)、非諾特羅(fenoterol)、特布他林(terbutaline)、吡布特羅(pirbuterol)、丙卡特羅(procaterol)、比托特羅(bitolterol)、利米特羅(rimiterol)、卡布特羅(carbuterol)、妥洛特羅(tulobuterol)及茶丙特羅(reproterol)。
白三烯受體拮抗劑(有時稱作盧卡斯特(leukast))(LTRA)係抑制白三烯之藥物。白三烯抑制劑之實例包括孟魯司特、齊留通、普侖司特及紮魯司特。
術語「FEV1」係指在用力呼氣第一秒鐘呼出之空氣體積。其係氣道阻塞之量度。誘導FEV1減少20%之乙醯甲膽鹼之誘發性濃度(PC20)係氣道高反應性之量度。FEV1可以其他類似形式(例如FEV1)來記錄，且應理解，所有該等類似變化形式具有相同含義。
術語「FEV1之相對變化」=(在治療第12週之FEV1-在開始治療前之FEV1)除以FEV1。
如本文所用「FVC」係指「用力肺活量」，其係指量測在完全吸氣與最大呼氣之間之肺空氣體積至殘留體積之變化(與FEV1中在一秒鐘內排出之空氣體積相反)之標準測試。其係功能性肺容量之量度。 在患有限制性肺病(例如間質性肺病(包括IPF)、過敏性肺炎、類肉瘤病及全身硬化症)之患者中，FVC通常因肺實質結瘢而減少。
術語「輕度氣喘」係指一般經歷少於一週兩次之症狀或加重、少於一個月兩次之夜間症狀且在加重之間無症狀之患者。輕度間歇性氣喘通常視需要用以下來治療：吸入式支氣管擴張劑(短效吸入式β2-激動劑)；回避已知觸發物；每年接種流感疫苗；每6至10年接種肺炎球菌疫苗；及在一些情形中，在暴露於經鑑別觸發物之前用吸入式β2-激動劑、色甘酸或奈多羅米治療。若患者對短效β2-激動劑之需要逐漸增加(例如，因急性加重1天使用短效β2-激動劑3至4次以上或一個月因症狀使用一個以上藥筒)，則患者可能需要增強療法。
術語「中度氣喘」一般係指如下氣喘：其中患者一週經歷兩次以上加重且加重影響睡眠及活動；患者一個月兩次以上因氣喘而夜間覺醒；患者具有慢性氣喘症狀，需要每天或每隔一天使用短效吸入式β2-激動劑；及患者之治療前基線PEF或FEV1係預測值之60%至80%且PEF差異性係20%至30%。
術語「重度氣喘」一般係指如下氣喘：其中患者具有幾乎連續之症狀，頻繁加重，頻繁因氣喘而夜間覺醒，活動受限，PEF或FEV1基線低於60%預測值，且PEF差異性為20%至30%。
急救藥物之實例包括沙丁胺醇、泛得林(ventolin)及其他。
「抗性」係指在用治療劑治療後顯示極少或無臨床顯著改良之疾病。舉例而言，如下氣喘通常視為重度難治性氣喘：需要至少連續三天或更長時間之高劑量ICS治療(例如，皮質類固醇總日劑量之四倍或大於或等於500毫克FP之總日劑量(或等效量))，或在兩週之試驗中需要全身性皮質類固醇以確認是否氣喘仍未受控制或FEV1無改良。
如本文所提供之治療劑可藉由任何適宜方式來投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動 脈內、腹膜內或皮下投與。在一些實施例中，治療劑係吸入式治療劑。根據一些實施例，投藥係藉由注射、例如靜脈內或皮下注射來給予。在一些實施例中，治療劑係使用注射器(例如，預填充或未預填充)或自動注射器來投與。
對於疾病之預防或治療而言，治療劑之適宜劑量可取決於欲治療疾病之類型、疾病之嚴重度及病程、投與治療劑係用於預防抑或治療目的、先前療法、患者之臨床史及對治療劑之反應以及主治醫師之慎重考慮。治療劑係一次性或經一系列治療以適當方式投與患者。治療劑組合物將以符合良好醫療實踐之方式來調配、配量及投與。在此情況下之考慮因素包括所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個別患者之臨床病況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師已知之其他因素。
「患者反應」或「反應」(及其文法變化形式)可使用任何指示對患者之益處之終點來評價，包括(但不限於)(1)在一定程度上抑制疾病進展，包括減慢及完全阻止；(2)減少疾病發作及/或症狀數目；(3)減小病灶大小；(4)抑制(即，減少、減慢或完全停止)疾病細胞至毗鄰外周器官及/或組織中之浸潤；(5)抑制(即減少、減慢或完全停止)疾病擴散；(6)減少自體免疫反應，此可能但並不一定會導致病灶之消退或消融；(7)在一定程度上緩解與病症相關之一或多個症狀；(8)增加治療後無病呈現之長度；及/或(9)在治療後之給定時間點減少死亡率。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)之間之非共價相互作用之強度總和。除非另有說明，否則本文所用之「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對(例如，抗體及抗原)之成員之間之1：1相互作用。分子X對於其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由業內已知之常 用方法(包括彼等本文所述者)來量測。用於量測結合親和力之特定說明性實例性實施例闡述於本文中。
「親和力成熟之」抗體係指與在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個改變之親代抗體相比具有該等改變之抗體，該等改變使得可改良抗體對抗原之親和力。
術語「抗-IL-4抗體」及「結合至IL-4之抗體」係指能以足夠親和力結合IL-4從而使得抗體可在靶向IL-4中用作診斷劑及/或治療劑之抗體。在一些實施例中，抗-IL-4抗體結合至無關非IL-4蛋白質之程度低於抗體與IL-4之結合之約10%，例如如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至IL-4之抗體之解離常數(Kd)為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-IL-4抗體結合至在來自不同物種之IL-4之間保守之IL-4之表位。在一些實施例中，抗-IL-4抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。
術語「抗-IL-13抗體」及「結合至IL-13之抗體」係指能以足夠親和力結合IL-13從而使得抗體可在靶向IL-13中用作診斷劑及/或治療劑之抗體。在一些實施例中，抗-IL-13抗體結合至無關非IL-13蛋白質之程度低於抗體與IL-13之結合之約10%，例如如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至IL-13之抗體之解離常數(Kd)為lμM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-IL-13抗體結合至在來自不同物種之IL-13之間保守之IL-13之表位。在一些實施例中，抗-IL-13抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛含義使用且涵蓋各種抗體結 構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；雙功能抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
與參考抗體「結合相同表位之抗體」係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高之抗體，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。本文中提供實例性競爭分析。
出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列之框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分源自具體來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種之抗體。
抗體之「種類」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。抗體有5大種類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干種可進一步分為多個亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定結構 域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用術語「細胞毒性劑」係指抑制或妨礙細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲喋呤、阿黴素(adriamycin)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如核溶酶；抗生素；毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應子功能」係指彼等歸因於抗體Fc區之生物活性，其隨抗體同種型而變。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分之C-末端區。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一些實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C-末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另外指明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基係根據EU編號系統(亦稱為EU索引)來編號，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「框架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常按以下順序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構與天然抗體結構實質上類似或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈之抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉形體」及「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及源自其之子代，不考慮傳代次數。子代與親代細胞之核酸含量可不完全相同，但可含有突變。本文包括與原始轉形細胞中所篩選或選擇者具有相同功能或生物活性之突變體子代。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列之抗體：其係由人類或人類細胞產生或利用人類抗體譜或其他人類抗體編碼序列源自非人類來源。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係代表在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列係自可變結構域序列之亞組來選擇。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版物91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一些實施例中，對於VL，亞組係如Kabat等人(上述文獻)中之亞組κI。在一些實施例中，對於VH，亞組係如Kabat等人(上述文獻)中之亞組III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDR)對應於非人類之HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式」係指已經受人類化之抗體。
如本文所用術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變結構域中序列高變(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構確定環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)之區域中之每一者。通常，抗體包含6個HVR：3個位於VH中(H1、H2、H3)，且3個位於VL中(L1、L2、L3)。本文中之實例性HVR包括：(a)在以下胺基酸殘基處出現之高變環：26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)在以下胺基酸殘基處出現之CDR：24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；(c)在以下胺基酸殘基處出現之抗原接觸：27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
在一些實施例中，HVR殘基包含圖10至13或說明書中之其他地 方鑑別之殘基。
除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(上述文獻)來編號。
「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。
「個體(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual或subject)係人類。
「分離」抗體係已與其天然環境中之組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至純度大於95%或99%，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。關於評價抗體純度之方法之綜述參見(例如)Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「分離」核酸係指已與其天然環境中之組份分離之核酸分子。分離核酸包括含於通常含有核酸分子之細胞中之該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
「編碼抗-IL-4抗體之分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括位於單一載體或分離載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之該(等)核酸分子。
「編碼抗-IL3抗體之分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括位於單一載體或分離載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之該(等)核酸分子。
如本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，亦即，構成該群之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在單株抗體製劑之產生期間產生之變體，該等變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示如自實質上同源之抗體群獲得之抗體之特徵，且不應理解為需要藉由任一具體方法產生該抗體。舉例而言，單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法及利用含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分之轉基因動物之方法，該等方法及製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。在一些實施例中，單株抗體係多特異性(例如雙特異性)抗體。
「裸抗體」係指不與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記偶聯之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有各種結構之天然免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體係約150,000道爾頓之異四聚體糖蛋白，其係由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N-至C-末端，每一重鏈具有可變區(VH，亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)，隨後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N-至C-末端，每一輕鏈具有可變區(VL，亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)，隨後為恆定輕鏈(CL)結構域。可基於抗體恆定結構域之胺基酸序列將抗體之輕鏈分配為兩種類型中之一者，稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ)。
術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於使用治療產品之警告之資訊。術語「包裝插頁」亦用於指通 常包括於診斷產品之商業包裝中之說明書，其含有關於既定用途、測試原理、試劑之製備及處置、樣本收集及製備、分析之校正及分析程序、分析之表現及精確度數據(例如靈敏度及特異性)之資訊。
相對於參考肽序列之「胺基酸序列之一致性百分比(%)」定義為在比對候選序列及參考多肽序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，候選序列中之胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之多種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之適宜參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech公司創作，且原始碼已與使用者文件一起在美國版權局，Washington D.C.,20559提出申請，其中其係以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自原始碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為具有或包含對、與或針對給定胺基酸序列B之一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：100×分數X/Y
其中X係在序列比對程式ALIGN-2對A與B之比對中由該程式評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。 應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A對B之胺基酸序列一致性%將不等於B對A之胺基酸序列一致性%。除非另外明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%之值皆係如上一段中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其呈允許其中所含活性成份之生物活性有效之形式，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性之其他組份。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份以外之對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另外指示，否則如本文所用術語「IL-4」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然IL-4，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未處理IL-4以及在細胞處理中產生之任一形式之IL-4。該術語亦涵蓋天然IL-4變體，例如剪接變體或等位基因變體。實例性人類IL-4之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：27及28中以及Swiss-Prot登錄號P05112.2中。實例性食蟹猴IL-4之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：33中。
除非另外指示，否則如本文所用術語「IL-13」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然IL-13，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未處理IL-13以及在細胞處理中產生之任一形式之IL-13。該術語亦涵蓋天然IL-13變體，例如剪接變體或等位基因變體。實例性人類IL-13之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：29及30中以及Swiss-Prot登錄號P35225.2中。實例性食蟹猴IL-13之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：32中。
如本文所用「治療(treatment)」(及其文法變化形式，例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然過程之臨床介入，且可實施用於預防或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用抗體來延遲疾病發展或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，且每一結構域包含4個保守框架區(FR)及三個高變區(HVR)。(例如，參見Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合具體抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域來分離，以分別篩選互補VL或VH結構域之文庫。例如，參見Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用術語「載體」係指能傳播與其連接之另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入將其引入其中之宿主細胞基因組中之載體。某些載體能引導與其可操作連接之核酸之表現。該等載體在本文中稱作「表現載體」。
組合物及方法
在某些實施例中，提供結合至IL-4之抗體。在某些實施例中，提供結合至IL-4及IL-13之雙特異性抗體。該等抗體可用於(例如)診斷或治療嗜酸性白血球性病症，包括呼吸病症(例如氣喘及IPF)、IL-4介導之病症及IL-13介導之病症。
實例性抗-IL-4抗體
在一些實施例中，提供結合IL-4之分離抗體。在一些實施例中，抗-IL-4抗體包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含 SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，抗體包含(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，提供抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
在上文任一實施例中，抗-IL-4抗體係人類化抗體。在一些實施例中，抗-IL-4抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在一些實施例中，抗-IL-4抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：3至9中任一者之FR1、FR2、FR3及FR4之VH。在 一些實施例中，抗-IL-4抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：9之FR1、FR2、FR3及FR4之VH。在一些實施例中，抗-IL-4抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：10及11中任一者之FR1、FR2、FR3及FR4之VL。在一些實施例中，抗-IL-4抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：10之FR1、FR2、FR3及FR4之VL。
在一些實施例中，抗-IL-4抗體包含與SEQ ID NO：1及3至9中任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-IL-4抗體保留結合至IL-4之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：9中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。視情況，抗-IL-4抗體包含SEQ ID NO：9中之VH序列，包括該序列之翻譯後修飾。在具體實施例中，VH包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，提供抗-IL-4抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：2、10及11中任一者之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗- IL-4抗體保留結合至IL-4之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：10中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。視情況，抗-IL-4抗體包含SEQ ID NO：10中之VL序列，包括該序列之翻譯後修飾。在具體實施例中，VL包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗-IL-4抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一些實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻譯後修飾。
在一些實施例中，提供抗體，其與包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列之抗-IL-4抗體競爭結合至IL-4。在一些實施例中，提供抗體，其與本文所提供之抗-IL-4抗體結合至相同表位。舉例而言，在某些實施例中，提供抗體，其與包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列之抗-IL-4抗體結合至相同表位。
在一些實施例中，上文任一實施例之抗-IL-4抗體係單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一些實施例中，抗-IL-4抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段。在一些實施例中，抗體係全長抗體，例如完整IgG1或IgG4抗體或如本文所定義之其他抗體種類或同種型。
在一些實施例中，上文任一實施例之抗-IL-4抗體可單獨或組合納入任何特徵，如下文章節1-7中所述。
實例性抗-IL-13抗體
在一些實施例中，提供結合IL-13之分離抗體。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之 胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，抗體包含(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在上文任一實施例中，抗-IL-13抗體係人類化抗體。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：19之FR1、FR2、FR3及/或FR4序列之VH。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：20之FR1、FR2、FR3及/或FR4序列之VL。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：56之FR1、FR2、FR3及/或FR4序列之VH。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：57之FR1、FR2、FR3及/或FR4序列之VL。
在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-IL-13抗體保留結合至IL-13之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：19中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含SEQ ID NO：19之VH序列，包括該序列之翻譯後修飾。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含SEQ ID NO：56之VH序列，包括該序列之翻譯後修飾。在一些實施例中，VH包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，提供抗-IL-13抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-IL-13抗體保留結合至IL-13之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：20中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含SEQ ID NO：20之VL序列，包括該序列之翻譯後修飾。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含SEQ ID NO：57之VL序 列，包括該序列之翻譯後修飾。在一些實施例中，VL包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗-IL-13抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：56中之VH序列及SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：57中之VL序列，包括彼等序列之翻譯後修飾。
在一些實施例中，提供抗體，其與包含SEQ ID NO：19之VH序列及SEQ ID NO：20之VL序列之抗-IL-13抗體競爭結合至IL-13。在一些實施例中，提供抗體，其與本文所提供之抗-IL-13抗體結合至相同表位。例如，參見Ultsch,M.等人，Structural Basis of Signaling Blockade by Anti-IL-13 Antibody Lebrikizumab,J.Mol.Biol.(2013),dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.024。在一些實施例中，提供抗體，其與本文所提供之抗-IL-13抗體結合至相同表位。舉例而言，在某些實施例中，提供抗體，其與包含SEQ ID NO：19之VH序列及SEQ ID NO：20之VL序列之抗-IL-13抗體結合至相同表位。在某些實施例中，提供抗體，其結合至人類前體IL-13(SEQ ID NO：29)之胺基酸63至74或人類IL-13之成熟形式(SEQ ID NO：30)之胺基酸45至56內之表位，該表位係YCAALESLINVS(SEQ ID NO：43)。在某些實施例中，提供抗體，其結合至人類前體IL-13(SEQ ID NO：29)之胺基酸68至75或人類IL-13之成熟形式(SEQ ID NO：30)之胺基酸50-57內之表位，該表位係ESLINVSG(SEQ ID NO：42)。
另一實例性抗-IL-13抗體係11H4及其人類化形式，包括hu11H4v6。Mu11H4包含重鏈及輕鏈可變區，該等可變區分別包含 SEQ ID NO：45及44之胺基酸序列。人類化hu11H4v6包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該等可變區分別包含SEQ ID NO：49及48之胺基酸序列。人類化hu11H4v6包含重鏈及輕鏈，該等鏈分別包含SEQ ID NO：47及46之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，抗體包含(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中， 抗體包含(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，抗體包含(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(i)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在上文任一實施例中，抗-IL-13抗體係人類化抗體。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：49之FR1、FR2、FR3及/或FR4序列之VH。在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含如上文任一實施例中之HVR，且進一步包含包含SEQ ID NO：48之FR1、FR2、FR3及/或FR4序列之VL。
在一些實施例中，抗-IL-13抗體包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-IL-13抗體保留結合至IL-13之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：49中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。視情況，抗-IL-13抗體包含SEQ ID NO：49中之VH序列，包括該序列之翻譯後修飾。在具體實施例中，VH包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，提供抗-IL-13抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-IL-13抗體保留結合至IL-13之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：48中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。視情況，抗-IL-13抗體包含SEQ ID NO：48中之VL序列，包括該序列之翻譯後修飾。在具體實施例中，VL包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗-IL-13抗體，其中該抗體包含如上文所 提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一些實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：48中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻譯後修飾。
在一些實施例中，提供抗體，其與包含SEQ ID NO：49之VH序列及SEQ ID NO：48之VL序列之抗-IL-13抗體競爭結合至IL-13。在一些實施例中，提供抗體，其與本文所提供之抗-IL-13抗體結合至相同表位。例如，參見Ultsch,M.等人，Structural Basis of Signaling Blockade by Anti-IL-13 Antibody Lebrikizumab,J.Mol.Biol.(2013),dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.053。在一些實施例中，提供抗體，其與本文所提供之抗-IL-13抗體結合至相同表位。舉例而言，在某些實施例中，提供抗體，其與包含SEQ ID NO：49之VH序列及SEQ ID NO：48之VL序列之抗-IL-13抗體結合至相同表位。
在一些實施例中，上文任一實施例之抗-IL-13抗體係單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一些實施例中，抗-IL-13抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段。在一些實施例中，抗體係全長抗體，例如完整IgG1或IgG4抗體或如本文所定義之其他抗體種類或同種型。
在一些實施例中，上文任一實施例之抗-IL-13抗體可單獨或組合納入任何特徵，如下文章節1-7中所述。
實例性抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體
在一些實施例中，提供多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，其包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域。在一些實施例中，抗原結合結構域不特異性結合至其他靶。結合IL-4及IL-13之多特異性抗體可包含本文中針對抗-IL-4抗體所述之任一實施例之第一組可變區(VH及VL；亦稱作VH/VL單元)及本文中針對抗-IL-13抗體所述之任一實施例之第二組可變區(VH及VL；亦稱作VH/VL單元)。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之VH(重鏈可變結構域)。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之VL(輕鏈可變結構域)。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元與包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之VL之抗體競爭結合至IL-4。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：56之胺基酸序列之VH(重鏈可變結構域)。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：57之胺基酸序列之VL(輕鏈可變結構域)。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：56之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：57之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元與包含包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之VL之抗體競爭結合至 IL-13。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元結合由SEQ ID NO：29之胺基酸82至89組成之IL-13表位。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元結合由SEQ ID NO：29胺基酸77至89組成之IL-13表位。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之VH(重鏈可變結構域)。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之VL(輕鏈可變結構域)。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元與包含包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之VL之抗體競爭結合至IL-13。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之第一VH及包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之第一VL；且包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：56之胺基酸序列之第二VH及包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：57之胺基酸序列之第二VL。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13 之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之第一VH及包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之第一VL；且包含第二VH/VL單元，該單元包含包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之第二VH及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之第二VL。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VH及與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VL。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VH及與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VL。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VH及與SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之VL。在某些實施例中，在上文序列中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13 之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第一VH及與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第一VL；及第二VH/VL單元，該單元包含與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第二VH及與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第二VL。在某些實施例中，在上文序列中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第一VH及與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第一VL；及第二VH/VL單元，該單元包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第二VH及與SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之第二VL。在某些實施例中，在上文序列中總計1至10個胺基酸發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在HVR以外之區域中(即，在FR中)發生取代、插入或缺失。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13 之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序 列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；及第二VH/VL單元，該單元包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；及第二VH/VL單元，該單元包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含 SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO： 13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR- L3；及第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；及第二VH/VL單元，該單元包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之 胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第二VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；及第二VH/VL單元，該單元 包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；及第二VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；及第二VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，多特異性抗體包含特異性結合至IL-4及IL-13之抗原結合結構域，其中該抗體包含第一VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；及第二VH/VL單元，該單元包含3個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3；及3個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
在各個實施例中，多特異性抗體包含第一半聚體，該半聚體包含結合IL-4之第一VH/VL單元，其中第一半聚體在重鏈恆定區中包含隆凸突變；及第二半聚體，該半聚體包含結合IL-13之第二VH/VL單元，其中第二半聚體在重鏈恆定區中包含空穴突變。在各個實施例 中，多特異性抗體包含第一半聚體，該半聚體包含結合IL-4之第一VH/VL單元，其中第一半聚體在重鏈恆定區中包含空穴突變；及第二半聚體，該半聚體包含結合IL-13之第二VH/VL單元，其中第二半聚體在重鏈恆定區中包含隆凸突變。在一些實施例中，包含空穴突變之重鏈恆定區具有SEQ ID NO：35(IgG1)或SEQ ID NO：37(IgG4)中顯示之序列。在一些實施例中，包含隆凸突變之重鏈恆定區具有SEQ ID NO：34(IgG1)或SEQ ID NO：36(IgG4)中顯示之序列。在一些實施例中，多特異性抗體包含第一半聚體，該半聚體包含具有SEQ ID NO：38之序列之第一重鏈及具有SEQ ID NO：39之序列之第一輕鏈；及第二半聚體，該半聚體包含具有SEQ ID NO：40或58之序列之第二重鏈及具有SEQ ID NO：41或59之序列之第二輕鏈。在一些實施例中，多特異性抗體包含第一半聚體，該半聚體包含具有SEQ ID NO：38之序列之第一重鏈及具有SEQ ID NO：39之序列之第一輕鏈；及第二半聚體，該半聚體包含具有SEQ ID NO：40之序列之第二重鏈及具有SEQ ID NO：41之序列之第二輕鏈。
在一些實施例中，上文任一實施例之抗-IL-4/IL-13多特異性抗體係單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一些實施例中，抗-IL-4/IL-13多特異性抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段。在一些實施例中，抗體係全長抗體，例如完整IgG1或IgG4抗體或如本文所定義之其他抗體種類或同種型。
在一些實施例中，上文任一實施例之抗-IL-4/IL-13多特異性抗體可單獨或組合納入任一特徵，如下文章節1-7中所述：
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供抗體對抗原之解離常數(Kd)為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001 nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一些實施例中，Kd係藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測。在一些實施例中，RIA係用所關注抗體之Fab形式及其抗原來實施。舉例而言，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下方式來量測：在一系列濃度遞增之未標記抗原存在下用最低濃度之(125I)標記抗原平衡Fab，然後用抗-Fab抗體塗佈之板捕獲已結合抗原(例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之捕獲用抗-Fab抗體(Cappel Labs)塗佈過夜，隨後在室溫(約23℃)下用於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在非吸收性板(Nunc編號269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與所關注Fab之連續稀釋液混合(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗-VEGF抗體(Fab-12)之評價一致)。然後將所關注Fab培育過夜；然而，培育可持續較長時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。然後，將混合物轉移至捕獲板中以供在室溫下培育(例如，1小時)。然後移除溶液且用於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)將板洗滌8次。在板已乾燥時，添加150μl/孔之閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTMγ計數器(Packard)上對該等板進行10分鐘計數。選擇每一Fab得到小於或等於20%最大結合之濃度用於競爭結合分析。
根據一些實施例，Kd係使用BIACORE®表面電漿子共振分析來量測。舉例而言，在25℃下用約10反應單位(RU)之固定化抗原CM5晶片實施使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)之分析。在一些實施例中，按照供應商說明書使用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯 亞胺(NHS)來活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，然後以5μl/分鐘之流速注射以達成約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷非反應基團。對於動力學量測，在25℃下以約25μl/min之流速注射Fab於含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑(PBST)之PBS中之兩倍連續稀釋物(0.78nM至500nM)。締合速率(kon)及解離速率(koff)係使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算。以比率koff/kon來計算平衡解離常數(Kd)。例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上文表面電漿子共振分析得知締合速率超過106M-1 s-1，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術係在25℃下在濃度遞增之抗原存在下量測於PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之升高或降低，如在光譜儀中所量測，例如配備有停流件(stop-flow)之分光光度計(Aviv Instruments)或帶有攪拌光析管之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic)。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述參見(例如)Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段 之論述參見美國專利第5,869,046號。
雙特異性抗體係具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦闡述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分之抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由多種技術來製備，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)來產生，如本文所述。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一實例中，嵌合抗體編號非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係「種類轉換」抗體，其中種類或亞類已自親代抗體之種類或亞類變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保持親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)源自非人類抗體，且FR(或其部分)源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦可包含人類恆定區之至少一部分。在 一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如)Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述特異性決定區(SDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(闡述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；輕鏈或重鏈可變區之具體亞組中源自人類抗體之共有序列之框架區(例如，參見Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及自篩選FR文庫獲得之框架區(例如，參見Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。人類抗體可使用業內已知之多種技術來產生。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin. Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備，該轉基因動物已經改良以因應抗原攻毒產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座替代內源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已經不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。該等動物生成之完整抗體之人類可變區可進一步藉由(例如)與不同人類恆定區組合來修飾。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術生成之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述自雜交瘤細胞系闡述單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(闡述人類-人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein， Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來生成。然後，可將該等可變結構域序列與期望人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
5. 源自文庫之抗體
本文所述抗體可藉由在組合文庫中篩選具有期望活性之抗體來分離。舉例而言，業內已知多種用於生成噬菌體展示文庫及在該等文庫中篩選具有期望結合特徵之抗體之方法。該等方法綜述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖VH及VL譜且將其在噬菌體文庫中隨機重組，然後可在其中篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自經免疫來源之文庫無需構築雜交瘤即可提供針對免疫原之高親和力抗體。或者，可選殖未免疫譜(例如，來自人類)以不經任何免疫即提供針對眾多種非自體抗原亦及自體抗原之單一抗體源，如 Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)中所述。最後，未免疫文庫亦可藉由以下方式以合成方式來製備：選殖來自幹細胞之未重組V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引物編碼高度可變之CDR3區並在活體外完成重組，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)中所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
本文中將自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，一種結合特異性係針對IL-4且另一種係針對任一其他抗原。在某些實施例中，一種結合特異性係針對IL-4且另一種係針對IL-13。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至IL-4之兩個不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位至細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段來製備。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸-於-空穴中」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號；美國公開案第2011/0287009號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式來製備：改造靜電牽引效應以供製備抗體Fc-異二聚分子(WO 2009/089004A1)；交聯兩個或更多個抗體或片段(例如，參見美國專 利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用單一VH/VL單元之CL結構域與VH結構域之間之弗林蛋白酶(furin)可裂解系留物(例如，參見國際專利申請案第PCT/US2012/059810號)；使用「雙功能抗體」技術以供製備雙特異性抗體片段(例如，參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。
本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之改造抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(例如，參見US 2006/0025576A1)。
本文中之抗體或片段亦包括包含結合至IL-4以及另一不同抗原(例如IL-13)之抗原結合位點之「雙重作用FAb」或「DAF」(例如，參見US 2008/0069820)。
隆凸至空穴中
使用隆凸至空穴中作為產生多特異性抗體之方法闡述於(例如)以下文獻中：美國專利第5,731,168號、WO2009/089004、US2009/0182127、US2011/0287009、Marvin及Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6)：649-658，及Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26：1-9。下文提供簡短非限制性論述。
「隆起」係指至少一個胺基酸側鏈，其自第一多肽之界面突出且因此可定位於毗鄰界面(即第二多肽之界面)中之補償性空洞中，從而(例如)穩定異多聚體，且由此有利於異多聚體形成而非同多聚體形成。隆起可存在於原始界面中或可以合成方式引入(例如藉由改變編碼界面之核酸)。在一些實施例中，編碼第一多肽之界面之核酸經改 變以編碼隆起。為達成此目的，用編碼至少一個側鏈體積大於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基之核酸替代編碼第一多肽界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基之核酸。將瞭解，可有一個以上原始殘基及相應輸入殘基。各種胺基殘基之側鏈體積顯示於(例如)US2011/0287009之表1中。
在一些實施例中，用於形成隆起之輸入殘基係選自以下之天然胺基酸殘基：精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。在一些實施例中，輸入殘基係色胺酸或酪胺酸。在某一實施例中，用於形成隆起之原始殘基具有小側鏈體積，例如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
「空洞」係指至少一個胺基酸側鏈，其自第二多肽之界面凹進且因此接納第一多肽之毗鄰界面上之相應隆起。空洞可存在於原始界面中或可以合成方式引入(例如藉由改變編碼界面之核酸)。在一些實施例中，編碼第二多肽之界面之核酸經改變以編碼空洞。為達成此目的，用編碼至少一個側鏈體積小於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基之DNA替代編碼第二多肽界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基之核酸。將瞭解，可有一個以上原始殘基及相應輸入殘基。在一些實施例中，用於形成空洞之輸入殘基係選自以下之天然胺基酸殘基：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。在一些實施例中，輸入殘基係絲胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。在一些實施例中，用於形成空洞之原始殘基具有大側鏈體積，例如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。
隆起「可定位」於空洞中，此意指分別在第一多肽及第二多肽之界面上之隆起及空洞之空間位置及隆起及空洞之大小應使得隆起可在不顯著影響第一多肽與第二多肽在界面處之正常締合之情況下位於空洞中。由於諸如Tyr、Phe及Trp等隆起通常不自界面之軸垂直延伸 且具有較佳構象，故隆起與相應空洞之比對在一些情況中可依賴於基於三維結構(例如藉由X-射線結晶學或核磁共振(NMR)所獲得者)對隆起/空洞對建模。此可使用業內廣泛接受之技術來達成。
在一些實施例中，IgG1恆定區中之隆凸突變係T366W。在一些實施例中，IgG1恆定區中之空穴突變包含一或多個選自以下之突變：T366S、L368A及Y407V。在一些實施例中，IgG1恆定區中之空穴突變包含T366S、L368A及Y407V。SEQ ID NO：34顯示具有隆凸突變之實例性IgG1恆定區，且SEQ ID NO：35顯示具有空穴突變之實例性IgG1恆定區。
在一些實施例中，IgG4恆定區中之隆凸突變係T366W。在一些實施例中，IgG4恆定區中之空穴突變包含一或多個選自以下之突變：T366S、L368A及Y407V。在一些實施例中，IgG4恆定區中之空穴突變包含T366S、L368A及Y407V。SEQ ID NO：36顯示具有隆凸突變之實例性IgG4恆定區，且SEQ ID NO：37顯示具有空穴突變之實例性IgG4恆定區。
7. 抗體變體
在某些實施例中，涵蓋本文所提供抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適宜修飾或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終構築體，前提係最終構築體具有期望特徵，例如抗原結合性。
取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。保守取代顯示於表1中之「保守取代」標題下。其他實質性變化提供於表1中之「實例性取 代」標題下，且如下文參照胺基酸側鏈種類進一步闡述。可將胺基酸取代引入所關注抗體及針對期望活性(例如保持/改良抗原結合、降低免疫原性或改良ADCC或CDC)篩選之產物中。
胺基酸可根據常見側鏈性質分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代使得需要交換該等種類之一種與另一種類之成員。
一種類型之取代變體涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，所選擇用於進一步研究之所得變體將相對於親代抗體改變(例如改良)某些生物學性質(例如，提高親和力、降低免疫原性)及/或將實質上保持親代抗體之某些生物學性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地使用(例如)基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如本文所述之彼等)來生成。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上展示變體抗體並針對具體生物學活性(例如結合親和力)篩選。
可改變(例如，取代)HVR以(例如)改良抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點(hotspot)」(即，藉由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變之密碼子編碼之殘基)中(例如，參見Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行，且測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由自二級文庫構築及重新選擇來達成親和力成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中之任一者將多樣性引入所選用於成熟之可變基因中。然後創建二級文庫。然後篩選文庫以鑑別具有期望親和力之任何抗體變體。另一種引入多樣性之方法涉及HVR引導方法，其中將若干個HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。抗原結合中所涉及之HVR殘基可使用(例如)丙胺酸掃描誘變或建模特定鑑別。具體而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可在一或多個HVR內發生，只要該等改變不顯著降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR進行不顯著降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。該等改變可在HVR「熱點」或SDR以外。在上文所提供變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過1個、2個或3個胺基酸取代。
可用於鑑別抗體中可靶向用於誘變之殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085中所述。在此方法中，鑑別殘基或靶殘基組(例如，諸如arg、asp、his、lys及glu等帶電殘基)，並藉由中性或帶負電胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)替代以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入進一步取代。或者或另外，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間之接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可作為候選取代殘基來靶向或消除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。
胺基酸序列插入包括長度介於一個殘基至含有上百個或更多殘基之多肽範圍內之胺基-及/或羧基末端融合物，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲二磺醯殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體N-或C-末端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體之血清半衰期之多肽之融合物。
糖基化變體
在某些實施例中，改變本文所提供抗體以提高或降低抗體之糖基化程度。抗體糖基化位點之添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以使得產生或移除一或多個糖基化位點便捷地完成。
倘若抗體包含Fc區，則可改變附接至其之碳水化合物。哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈二分枝寡糖，其通常藉由N-連 接附接至Fc區之CH2結構域之Asn297。例如，參見Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡糖可包括多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接至二分枝寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本文中所提供抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。
在一些實施例中，提供碳水化合物結構無附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之抗體變體。例如，該抗體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖之量係藉由相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和計算Asn297處糖鏈內岩藻糖之平均量來測定，如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，如(例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中約297位(Fc區殘基之Eu編號)之天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可位於297位上游或下游之約±3個胺基酸處，亦即，介於294位與300位之間。該等岩藻糖基化變體可具有改良ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。關於「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」之抗體變體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專 利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因敲除細胞系，例如敲除α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8之CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡糖之抗體變體，例如，其中附接至抗體Fc區之二分枝寡糖係藉由GlcNAc二等分。該等抗體變體可具有減少之岩藻糖基化及/或改良ADCC功能。該等抗體變體之實例闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變體。該等抗體變體可具有改良CDC功能。該等抗體變體闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此生成Fc區變體。Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)。
在一些實施例中，抗體恆定區(例如重鏈恆定區)包含隆凸突變及/或空穴突變以促進形成多特異性抗體。非限制性實例性隆凸突變及空穴突變以及隆凸-至-空穴中技術通常闡述於(例如)美國專利第5,731,168號、WO2009/089004、US2009/0182127、US2011/0287009；Marvin及Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6)：649-658；及Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26：1-9。某些非限制性實例性隆凸突變及空穴突變論述於本文中。
在某些實施例中，提供具有一些(但非全部)效應子功能之抗體變 體，該等效應子功能使該抗體變體成為許多其中抗體之活體內半衰期非常重要之應用之合意候選物，但某些效應子功能(例如補體及ADCC)係不必要的或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-492(1991)第464頁之表3中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用於該等分析之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如在動物模型中，例如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示者)評價所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見 Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低效應子功能之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者具有取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述某些與FcR之結合改良或降低之抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如，在Fc區之298位、333位及/或334位(殘基之EU編號)之取代。
在一些實施例中，在Fc區中進行導致改變(即，改良或減小)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之改變，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
具有延長半衰期及改良之與新生Fc受體(FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之結合之抗體闡述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。該等Fc變體包括彼等在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第 5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351，其係關於Fc區變體之其他實例。
在一些實施例中，抗體恆定區包含一個以上本文所論述之突變(例如，隆凸及/或空穴突變及/或提高穩定性之突變及/或降低ADCC之突變等)。
半胱胺酸改造之抗體變體
在某些實施例中，可期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，由此使反應性硫醇基團定位於抗體之可及位點處且其可用於將抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物，如本文中進一步闡述。在某些實施例中，以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(EU編號)及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來生成。
抗體衍生物
在某些實施例中，本文所提供抗體可經進一步修飾以含有業內已知且易於獲得之其他非蛋白質性部分。適用於抗體之衍生之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而有利於製造。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物 數目可變，且若附接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考慮因素來確定：欲改良之抗體之具體性質或功能、抗體衍生物是否將用於在界定條件下之療法等。
在一些實施例中，提供抗體與非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射選擇性加熱。在一些實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長：其不會危害普通細胞，但其將非蛋白質性部分加熱至可殺死抗體-非蛋白質性部分附近細胞之溫度。
重組方法及組合物
抗體可使用重組方法及組合物來產生，例如，如美國專利第4,816,567號中所述。在一些實施例中，提供編碼本文所述抗-IL-4抗體之分離核酸。在一些實施例中，提供編碼本文所述抗-IL-13抗體之分離核酸。在一些實施例中，提供編碼本文所述抗-IL-4/IL-13雙特異性/抗體之分離核酸。該等核酸可編碼抗體中包含VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一些實施例中，提供一或多個包含該核酸之載體(例如，表現載體)。在一些實施例中，提供包含該核酸之宿主細胞。在一個該實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉形)：(1)載體，其包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸；或(2)第一載體，其包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸，及第二載體，其包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸。
在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一些實施例中，提供製備抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條 件下培養包含編碼如上文所提供抗體之核酸之宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
在一些實施例中，提供製備多特異性抗體之方法，其中該方法包括在適於表現該抗體之條件下培養包含編碼該多特異性抗體之核酸之宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該多特異性抗體。在一些實施例中，提供製備多特異性抗體之方法，其中該方法包含在適於表現第一VH/VL單元之條件下培養包含編碼多特異性抗體之第一VH/VL單元(包括恆定區(若存在)，有時稱作「半聚體」或「半抗體」)之核酸之第一宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收第一VH/VL單元，以及在適於表現第二VH/VL單元之條件下培養包含編碼多特異性抗體之第二VH/VL單元(包括恆定區(若存在))之核酸之第二宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收第二VH/VL單元。在一些實施例中，該方法進一步包含自經分離第一VH/VL單元及經分離第二VH/VL單元裝配多特異性抗體。在一些實施例中，該裝配可包含氧化還原步驟以在兩個VH/VL單元(或半聚體)之間形成分子內二硫鍵。產生多特異性抗體之非限制性實例性方法闡述於(例如)US 2011/0287009、US 2007/0196363、US2007/0178552、美國專利第5,731,168號、WO 96/027011、WO 98/050431及Zhu等人，1997,Protein Science 6：781-788中。非限制性實例性方法亦闡述於以下實例中。
對於抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之重組產生，分離編碼(例如)如上文所述之抗體之核酸並將其插入一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。該核酸可使用習用程序容易地分離及測序(例如，藉由使用能與編碼抗體重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)。
適用於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原 核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，具體而言在無需糖基化及Fc效應子功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現參見(例如)美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。在表現後，抗體可在可溶部分中與細菌細胞糊狀物分離且可將經進一步純化。
除了原核生物以外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)亦係適用於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括其糖基化路徑已經「人類化」從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體之真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株可結合昆蟲細胞使用，尤其用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞之轉染。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。可用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係藉由SV40轉形之猴腎CV1系(COS-7)；人類胚胎腎系(293或293細胞，如(例如)Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼小倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽托利細胞(sertoli cell)(TM4細胞，如(例如)Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適用於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞系之概述參見(例如)Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
實例性分析 結合分析及其他分析
在一些實施例中，藉由(例如)已知方法(例如ELISA、西方墨點等)測試本文所提供抗體之抗原結合活性。
在一些實施例中，可使用競爭分析來鑑別與本文所述IL-4抗體競爭結合IL-4之抗體。在一些實施例中，可使用競爭分析來鑑別與本文所述IL-4/IL-13雙特異性抗體競爭結合IL-4及/或IL-13之抗體。在某些實施例中，對於結合IL-4，此一競爭抗體結合至包含包含SEQ ID NO：9之VH胺基酸序列及包含SEQ ID NO：10之VL胺基酸序列之抗體所結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。在某些實施例中，對於結合IL-13，此一競爭抗體結合至包含包含SEQ ID NO：19之VH胺基酸序列及包含SEQ ID NO：20之VL胺基酸序列之抗體所結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。在某些實施例中，對於結合IL-13，此一競爭抗體結合至包含包含SEQ ID NO：49之VH胺基酸序列及包含SEQ ID NO：48之VL胺基酸序列之抗體所結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位之詳細實例性方法提供於Morris (1996)「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在實例性競爭分析中，在包含結合至IL-4之第一標記抗體(例如，包含包含SEQ ID NO：9之VH胺基酸序列及包含SEQ ID NO：10之VL胺基酸序列之抗體)及第二未標記抗體之溶液中培育固定化IL-4，測試該第二未標記抗體與第一抗體競爭結合至IL-4之能力。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育固定化IL-4。在允許第一抗體結合至IL-4之條件下培育後，移除過量未結合抗體，且量測與固定化IL-4締合之標記之量。若與固定化IL-4締合之標記之量在測試樣品中相對於對照樣品顯著降低，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合IL-4。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
在另一實例性競爭分析中，在包含結合至IL-13之第一標記抗體(例如，包含包含SEQ ID NO：19之VH胺基酸序列及包含SEQ ID NO：20之VL胺基酸序列之抗體，或包含包含SEQ ID NO：49之VH胺基酸序列及包含SEQ ID NO：48之VL胺基酸序列之抗體)及第二未標記抗體之溶液中培育固定化IL-13，測試該第二未標記抗體與第一抗體競爭結合至IL-13之能力。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育固定化IL-13。在允許第一抗體結合至IL-13之條件下培育後，移除過量未結合抗體，且量測與固定化IL-13締合之標記之量。若與固定化IL-13締合之標記之量在測試樣品中相對於對照樣品顯著降低，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合至IL-13。
活性分析
在一些實施例中，提供用於鑑別具有生物活性之抗-IL-4抗體及 抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之分析。生物活性可包括(例如)抑制IL-4結合至IL-4受體、抑制IL-4誘導之STAT6磷酸化、抑制IL-4誘導之細胞增殖、抑制IL-4誘導之B細胞至IgE之種類轉換、在氣喘中之活性及在IPF中之活性。在一些實施例中，生物活性包括(例如)抑制IL-13結合至IL-13受體(例如，包含IL-4Rα及IL-13Rα1之異二聚受體)、抑制IL-13誘導之STAT6磷酸化、抑制IL-13誘導之細胞增殖、抑制IL-13誘導之B細胞至IgE之種類轉換、抑制IL-13誘導之黏液產生、在氣喘中之活性及在IPF中之活性。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。用於測試該等生物活性之非限制性實例性分析闡述於本文中及/或為業內已知。
免疫偶聯物
在一些實施例中，提供包含與一或多種細胞毒性劑偶聯之抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之免疫偶聯物。非限制性實例性之該等細胞毒性劑包括化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物源酶活性毒素或其片段)及放射性同位素。
在一些實施例中，免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體偶聯至一或多種藥物，該等藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid，例如，參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧裏斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF，例如，參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(例如，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環抗生素，例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(例如，參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲喋呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇、拉羅他塞(larotaxel)、特西他塞(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；單端孢黴烯(trichothecene)；及CC1065。
在一些實施例中，免疫偶聯物包含與酶活性毒素或其片段偶聯之如本文所述之抗體，該酶活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-八疊球菌(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、米托菌素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯。
在一些實施例中，免疫偶聯物包含偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物之如本文所述之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在使用偶聯物進行檢測時，其可包含用於閃爍研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，例如碘- 123(再次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰酸苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於偶聯放射性核苷酸與抗體之例示性螯合劑。例如，參見WO94/11026。連接體可係促進在細胞中釋放細胞毒性藥物之「可裂解連接體」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含有二硫化物之連接體(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫偶聯物或ADC明確涵蓋(但不限於)該等使用包括(但不限於)以下之交聯劑製備之偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB、以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，該等交聯劑可自市面購得(例如，購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.,U.S.A)。
用於診斷及檢測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供任一抗-IL-4抗體可用於檢測生物樣品中IL-4之存在。在某些實施例中，本文所提供之任一抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體可用於檢測IL-4及/或IL-13在生物樣品中之存在。如本文所用術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，例如血清、血漿、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液及痰。
在一些實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗-IL-4抗體。在另一態樣中，提供檢測IL-4在生物樣品中之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗-IL-4抗體在允許抗-IL-4抗體結合至IL-4之條件下接觸，及檢測在抗-IL-4抗體與IL-4之間是否形成複合物。該方法可為活體外或活體內方法。在一些實施例中，使用抗-IL-4抗體來選擇適用於使用抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體或任何其他TH2路徑抑制劑之療法之個體，例如其中IL-4係用於選擇患者之生物標記。
在一些實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗-IL-4/IL-13抗體。在另一態樣中，提供檢測IL-4/IL-13在生物樣品中之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體在允許抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體結合至IL-4及/或IL-13之條件下接觸，及檢測在抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體與IL-4及/或IL-13之間是否形成複合物。該方法可為活體外或活體內方法。在一些實施例中，使用抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體來選擇適用於使用抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體或任何其他TH2路徑抑制劑之療法之個體，例如其中IL-4及/或IL-13係用於選擇患者之生物標記。
可使用抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體診斷之實例性病症提供於本文中。
在某些實施例中，提供經標記抗-IL-4抗體。在某些實施例中， 提供經標記抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、玫瑰紅(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯、傘形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、山葵過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶聯)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。
醫藥調配物
如本文所述抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之醫藥調配物係藉由混合具有期望純度之該抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾之調配物或水溶液形式來製備。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、 組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文中之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一些實施例中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺聚糖酶(例如軟骨素酶)組合。
實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中者，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文中之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療具體適應症之活性成份，較佳為彼等具有彼此不會產生不利影響之互補活性者。舉例而言，可期望進一步提供控制劑及/或TH2路徑抑制劑及抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。該等活性成份適宜以有效用於既定目的之量組合存在。
可將活性成份包埋於藉由(例如)凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物件形式，例如薄膜或微膠 囊。
欲用於活體內投與之調配物一般無菌。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜過濾容易地達成。
治療方法及組合物
本文所提供任一抗-IL-4抗體可用於治療方法中。本文所提供任一抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體可用於治療方法中。
在某些實施例中，提供用作醫藥之抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。在某些實施例中，提供用於治療氣喘、IPF、呼吸病症、嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症或IL-4介導之病症之抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法之抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。在某些實施例中，提供抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體，其用於治療患有氣喘、呼吸病症、嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症或IL-4介導之病症之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。在一個該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種(例如)如下文所述之其他治療劑。
上文任一實施例之「個體」較佳係人類。
在一些實施例中，提供抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體在製造或製備醫藥中之用途。在一個實施例中，該醫藥用於治療氣喘、呼吸病症、嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症或IL-4介導之病症。在另一實施例中，該醫藥用於治療氣喘、IPF、呼吸病症、嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症或IL-4介導之病症之方法中，該方法包含向患有氣喘、呼吸病症、嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症或IL-4介導之病症之個體投與有效量之該醫藥。在一個該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種(例如)如下 文所述之其他治療劑。
在一些實施例中，提供包含本文所述任一抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之醫藥調配物，其用於(例如)上文任一治療方法中。在一些實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任一抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任一抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體及至少一種(例如)如下文所述之其他治療劑。
本文所提供抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。例如，本文所提供抗體可與至少一種其他治療劑共投與。在某些實施例中，其他治療劑係TH2抑制劑。在某些實施例中，其他治療劑係氣喘發炎之控制劑，例如皮質類固醇、白三烯受體拮抗劑、LABA、皮質類固醇/LABA組合組合物、茶鹼、色甘酸鈉、奈多羅米鈉、奧馬珠單抗、LAMA、MABA(例如，雙功能毒蕈鹼拮抗劑-β2激動劑)、5-脂肪加氧酶活化蛋白(FLAP)抑制劑或酶PDE-4抑制劑。
上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或分開調配物中)及分開投與(在此情形中，抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之投與可在投與其他治療劑之前、同時及/或之後進行)。在一些實施例中，抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之投與及其他治療劑之投與彼此相隔在約一個月內，或在約1週、2週或3週內，或在約1天、2天、3天、4天、5天或6天內。
在一些實施例中，抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體用於治療癌症，例如神經膠母細胞瘤或非何傑金氏淋巴瘤。在一些實施例中，本文所提供抗體亦可與放射療法組合使用。
抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適宜方式來投與，包括非經腸、肺內及鼻內，以及(若期 望局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑投藥，例如注射，例如靜脈內或皮下注射，此部分端視投與係短期投與或長期投與而定。本文涵蓋多種投藥方案，包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、推注投與及脈衝輸注。
抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體可以符合良好醫學實踐之方式來調配、配量及投與。在此情況下之考慮因素包括所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個別患者之臨床病況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師已知之其他因素。抗體不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於調配物中存在之抗體之量、所治療病症之類型以及上文所論述之其他因素。該等藥劑一般以與本文所述相同之劑量及如本文所述之投與途徑來使用，或以本文所述劑量之約1%至99%來使用，或以憑經驗/臨床確定適宜之任一劑量及任一途徑來使用。
對於疾病之預防或治療，抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之適宜劑量(在單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於欲治療之疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重度及病程、投與抗體用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。抗體係以適宜方式一次性或經一系列治療投與患者。熟習此項技術者可端視疾病之類型及嚴重度確定抗體之適宜劑量。抗-IL-13抗體之非限制性實例性投藥闡述於(例如)PCT公開案第WO 2012/083132號中。用於抗體投藥之一般指導可參見(例如)Bai等人，Clinical Pharmacokinetics,51：119-135(2012)及Deng等人，Expert Opin.Drug Metab.Toxicol.8(2)：141-160(2012)。抗體療法之進展可藉由習用技術及分析來監測。
應理解，上文任一調配物或治療方法可使用免疫偶聯物代替抗-IL 4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體來實施，或除了抗-IL 4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體以外可使用免疫偶聯物來實施。
製造物件
在一些實施例中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料之製造物件。製造物件包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合可有效治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌出入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。標記或包裝插頁指示，組合物用於治療所選病況。此外，製造物件可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含抗-IL-4抗體及/或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。在一些實施例中，製造物件進一步包含指示組合物可用於治療具體病況之包裝插頁。或者或另外，製造物件可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另外包括自商業及使用者角度期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應理解，上文任一製造物件可包括免疫偶聯物來代替抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體，或除了抗-IL-4抗體或抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體亦包括免疫偶聯物。
實例
以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，鑒於上文所提供 之一般說明，可實踐多個其他實施例。
實例1-某些方法及試劑 表面電漿共振(SPR)BIAcore親和力量測
抗-IL-4、抗-IL-13及抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之結合動力學係使用表面電漿子共振(SPR)在Biacore 3000儀器(GE Healthcare)上量測。使用製造商提供之方案經由基於胺之偶合將抗-人類Fc(GE Healthcare)固定化在CM5感測器晶片上。以1200共振單位(RU)之含量捕獲抗體。
在0、3.13、6.25、12.50、25.0及50.0nM濃度下量測與人類IL-4、食蟹猴IL-4、人類IL-13、人類IL-13 R130Q(SEQ ID NO：31)及食蟹猴IL-13之雙特異性結合。結合細胞介素之感應圖係使用2分鐘注射時間以30μl/min流速在25℃溫度下記錄，且使用10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl及0.005% Tween 20之電泳緩衝液。在注射後，在電泳緩衝液中監測細胞介素自抗體之解離1000秒。在結合循環之間用3M氯化鎂之60μl注射液使表面再生。在減去僅含電泳緩衝液之空白後，用製造商供應之軟體使用1：1 Langmuir結合模型分析所觀察到之細胞介素與抗-IL-13/抗-IL-4雙特異性抗體之結合之感應圖，以計算動力學及結合常數。
表面電漿共振(SPR)BIAcore結合競爭分析
在Biacore 3000儀器(GE Healthcare)上使用表面電漿子共振(SPR)量測測試抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體對人類IL-13Rα2與人類IL-13之結合之抑制。使用製造商之關於基於胺之偶合之方案將人類IL-13固定化在CM5感測器晶片上。將IL-13以985共振單位(RU)含量固定化在流動細胞4(FC4)上，且隨後使用1M乙醇胺-HCl阻斷非反應位點。使用FC3作為用於量測之參考細胞，且其係藉由在活化後用乙醇胺阻斷來製備。IL-13Rα2(根據業內標準方法製備並純化之組胺酸-標記之重組 人類IL-13Rα2)之結合之感應圖係使用2分鐘注射時間以30μl/min流速在25℃溫度下記錄，且使用10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl及0.005% Tween 20之電泳緩衝液。為確定IL-13Rα2結合至IL-13之結合常數，記錄濃度自12.5至200nM變化(2倍稀釋液)之一系列IL-13Rα2溶液之感應圖。在注射後，在電泳緩衝液中監測受體自細胞介素之解離600秒。在結合循環之間用10mM甘胺酸-HCl pH 1.7之60μl注射液使表面再生。
為評價在抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體存在下IL-13Rα2與IL-13之結合，作為另一步驟添加250nM抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之60μl注射液以評價在競爭抗體存在下受體與細胞介素之結合。在減去僅含電泳緩衝液之空白後，用製造商供應之軟體使用1：1 Langmuir結合模型分析所觀察到之在競爭抗體不存在或存在下受體與細胞介素結合之感應圖，以計算動力學及結合常數。
ELISA結合競爭分析
為確定抗體抑制IL-4是否與IL-4受體(IL-4R)結合，使用ELISA分析。在96孔板中，將150μg/mL(1000nM)抗體溶液在分析緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水[PBS]，pH 7.5，含有0.05% Tween 20及0.5%牛血清白蛋白[BSA])中連續稀釋三倍以提供0.0009、0.003、0.008、0.02、0.07、0.21、0.62、1.9、5.6、16.7、50.0及150μg/mL(分別係0.0056、0.017、0.05、0.15、0.46、1.37、4.12、12.3、37、111、333及1000nM)之範圍。每一稀釋液之體積為35μL。向每孔中添加35μL 11.6ng/mL(780pM)生物素化IL 4溶液。將混合物在室溫下培育40分鐘。在培育後，將孔中之內容物轉移至96孔Nunc Maxisorp板(Roskilde,Denmark)中，該板經可溶IL-4R蛋白質(R&D Systems，目錄號230-4R/CF)於PBS中之50μL 2.0μg/mL溶液塗佈過夜且經含有1% BSA之PBS阻斷。在培育40分鐘後，將板在洗滌緩衝液(1×含有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌5次。然後每孔接收50μL鏈黴親和素山葵過氧化物酶溶液(Caltag Laboratories,Invitrogen；Carlsbad,CA)並培育40分鐘。在用洗滌緩衝液洗滌5次後，將50μL四甲基聯苯胺(TMB)受質(KPL；Gaithersburg,MD)添加至每孔中。在若干分鐘後，添加50μL之1N HCl溶液以終止反應。在450nM下使用Spectra Max 340讀板器(Molecular Devices；Sunnyvale,CA)讀取板。對於每一樣品，繪製在450nM下之光學密度(OD)讀數對濃度之曲線。曲線係在Kaleidagraph(Synergy Software；Reading,PA)中繪製且使用4參數擬合來擬合，或係點對點繪製。
為確定抗體是否抑制IL-13與IL-13Rα1受體之結合，實質上如上文所述實施ELISA分析，但使用生物素化IL-13 R130Q(SEQ ID NO：31)代替生物素化IL-4，且使用可溶IL-13Rα1-Fc蛋白質(R&D Systems，目錄號146-IR-100)代替可溶IL-4R-Fc。
為確定抗體是否抑制IL-13與IL-13Rα2受體之結合，實質上如上文所述實施ELISA分析，但使用生物素化IL-13代替生物素化IL-4，且使用可溶IL-13Rα2-Fc蛋白質(R&D Systems，目錄號614-IR-100)代替可溶IL-4R-Fc。
抗體之質粒構築及表現
將抗體選殖至先前闡述之表現載體中(Simmons等人，2002,J Immunol Methods263,133-147)。具有重鏈及輕鏈中之一者或二者之翻譯起始強度之STII信號序列位於編碼成熟抗體之序列之前。對於蛋白質表現，使於適宜W3110衍生物(Reilly及Yansura,2010,Antibody Engineering(Berlin,Heidelberg：Springer Berlin Heidelberg))中之過夜培養物在30℃下在LB(100μg/ml卡本西林(carbenicillin))中生長，以1：100稀釋至CRAP培養基(100μg/ml卡本西林)中並在30℃下生長24小時。對於較大製劑，使培養物在10L發酵罐中生長，例如，如先前所 述(Simmons等人，2002,J Immunol Methods 263,133-147)。
對於在非還原條件下之SDS-PAGE分析，收穫200μl過夜培養物且將其再懸浮於100μl NR-溶解緩衝液(88μl PopCulture試劑(Novagen)、10μl 100mM碘乙醯胺、2μl lysonase試劑(EMD Biosciences))中。在室溫下培育10分鐘後，將樣品以9300rcf旋轉2’且將50μl上清液轉移至新管中，並與相同體積之2×SDS樣品緩衝液(Invitrogen)混合。在NuPAGE 4-12%雙Tris/MES凝膠(Invitrogen)上加載10μl樣品之前，將樣品在95℃下加熱5’且以16000rcf旋轉1’。藉由iBlot(Invitrogen)將凝膠轉移至硝化纖維素膜上，用與IRDye800CW偶聯之抗-人類IgG F(c)抗體(Rockland)進行免疫印跡切用LiCOR Odyssey成像儀成像。
對於總還原細胞樣品，將細胞團塊再懸浮於R-溶解緩衝液(10μl 1M DTT、88μl PopCulture試劑(Novagen)、2μl lysonase)中並在室溫下培育10分鐘，之後將樣品與2×SDS樣品緩衝液混合。西方墨點係如先前所述之影像，但使用與IRDye800CW偶聯之抗-人類抗體(Rockland)進行免疫檢測。
雙特異性抗體之純化及裝配
使用得自GEA(Bedford,NH,U.S.A)之Niro-Soavi勻漿器將大腸桿菌全細胞培養液勻漿化。然後藉由添加聚乙烯亞胺絮凝劑至0.4%之最終濃度來提取所得勻漿物，用純化水稀釋並在室溫下混合16小時。藉由離心澄清提取物且在使用0.2μm無菌過濾器過濾後冷卻至15℃，並加載於預平衡之(25mM Tris,25mM NaCl 5mM EDTA pH 7.1)蛋白質A管柱上。用平衡緩衝液及0.4M磷酸鉀(pH 7.0)洗滌管柱，且最後用100mM乙酸(pH 2.9)溶析。然後在裝配反應中合併蛋白質A池。
用0.2M精胺酸調理分離的半抗體蛋白質A池，使用1.5M Tris鹼將pH調節至pH 8.0，合併且添加相對於雙特異性抗體莫耳過量200× 之L-還原谷胱甘肽(GSH)並在20℃下培育48小時。在培育後，藉由陰離子交換層析步驟及陽離子交換層析步驟純化裝配雙特異性抗體。濃縮陽離子交換溶析物並將緩衝液交換為最終調配緩衝液。
抗體藉由完整及約化質譜分析之分析性表徵
雙特異性抗體之約化及完整質量係藉由LC/MS分析使用與奈米-晶片-LC系統耦聯之Agilent 6210 ESI-TOF質譜儀來獲得。先前經或未經TCEP還原之雙特異性樣品以約5ng抗體/注射藉由RP-HPLC脫鹽以供直接線上MS分析。經還原及非還原樣品之所得光譜展現多電荷蛋白質離子之分佈，且使用MassHunter工作站軟體/定性分析B.03.01(Agilent Technologies公司2009)將光譜解卷積至零電荷狀態。
分析型粒徑篩析層析
使用TosoHaas TSK G3000SWXL管柱(7.8×300mm)用由0.2M磷酸鉀及0.25M氯化鉀(pH 6.2)組成之流動相等位溶析來分離大小變體。該分離係在室溫下以0.5mL/min之流速實施。在280nm下監測管柱流出物。高分子量物質(HMWS)、主峰及低分子量物質(LMWS)之峰面積之相對百分比係藉由使用來自Dionex公司之Chromeleon軟體v6.80 SR11來實施。
毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉分析(CE-SDS)
首先用檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(pH 6.6)稀釋雙特異性樣品，並用SDS及N-乙基馬來醯亞胺在70℃下處理3分鐘。在冷卻後，在過量氰化鉀存在下在50℃下將樣品用3-(2-糠醯基)喹啉-2-甲醛)(FQ)標記10分鐘。藉由緩衝液交換淬滅標記反應，然後用1% SDS處理。將非還原樣品在70℃下加熱5分鐘。用50mM二硫蘇糖醇(DTT)將還原樣品在70℃下處理10分鐘。
藉由CE-SDS使用Beckman PA 800 CE系統及50μm直徑之無塗層熔融二氧化矽毛細管分析非還原及還原樣品二者。電動注射樣品(在5 kV下40秒)，且在15kV恆定電壓下以反向極性實施35分鐘分離。將毛細管溫度維持在40℃。藉由LIF檢測來監測經標記組份之移動；在488nm下激發，且在600nm下監測發射。
細胞培養(TF-1細胞)
在加濕培育器中在37℃及5% CO2下在含有以下物質之生長培養基中培養人類TF-1(紅白血病細胞，R&D Systems,Minneapolis,MN)：RPMI 1640(Genentech Media Preparation Facility,South San Francisco,CA)，其含有10%熱不活化胎牛血清(FBS)(目錄號SH30071.03,HyClone Laboratories公司，Logan,UT)；及1×青黴素：鏈黴素：麩醯胺酸(目錄號10378-016,Gibco Invitrogen公司，Carlsbad,CA)及2ng/mL rhGM-CSF(目錄號215-GM,R&D Systems,Minneapolis,MN)。分析培養基係不含2ng/mL rhGM-CSF之生長培養基。將細胞介素以以下最終濃度添加至所指定分析培養基中：0.2ng/ml人類IL-4(目錄號204-IL,R&D Systems,Minneapolis,MN)、10ng/ml人類IL-13(Genentech,So.San Francisco,CA)、10ng/ml人類IL-13 R130Q(Genentech,So.San Francisco,CA)、2ng/ml食蟹猴IL-4(Genentech,So.San Francisco,CA)及20ng/ml食蟹猴IL-13(Genentech,So.San Francisco,CA)。
實例2-結合IL-4之抗體之生成
使用市售人類IL-4(R&D Systems,Minneapolis,MN)生成一組選擇性結合人類介白素-4(IL-4)之抗體。以3天至4天間隔向5只BALB/c小鼠之每一後足墊注射0.5μg IL-4，該IL-4再懸浮於總計25μl於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之基於單磷醯基-脂質A及海藻糖二黴菌酸酯(MPLTM+TDM)之佐劑(Corixa,Hamilton,MT)中。在7次加強後取血清樣品，且藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定效價以鑑別對IL-4具有陽性免疫反應之小鼠。經由(0.5μg，25μl/足墊)、腹膜內空腔(2 μg，100μl)及靜脈內(1μg，50μl)途徑使用於PBS中之佐劑對動物再加強兩次。在最終加強後3天，殺死藉由ELISA顯示正血清效價之動物，且使用電融合(Cyto Pulse Sciences公司，Glen Burnie,MD)將脾細胞之單細胞懸浮液與小鼠骨髓瘤細胞系P3X63Ag.U.1(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas,VA)融合。融合雜交瘤細胞係在來自ClonaCell®雜交瘤選擇套組(StemCell Technologies公司，Vancouver,BC,Canada)之培養基D中使用次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷(HAT)選擇選自未融合脾細胞、膕結細胞或骨髓瘤細胞。在來自ClonaCell®雜交瘤選擇套組之培養基E中培養雜交瘤細胞，且使用細胞培養物上清液進行進一步表徵及篩選。為篩選所生成之1921雜交瘤細胞系，一般如先前所述(Baker,K.N.等人，Trends Biotechnol.20,149-156(2002))實施酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
鑑別純系19C11，其以親和力10pM結合至人類IL-4，如藉由表面電漿子共振(SPR)分析所測定。為確定19C11是否阻斷人類IL-4與IL-4Rα之結合，將生物素化IL-4(0.17nM)與50μl來自純系19C11或對照抗體之連續稀釋之IgG上清液(1000、200、40、8、1.6及0.32nM，終濃度)預混合。在室溫下培育30分鐘後，將混合物轉移至含有固定化可溶人類IL-4Rα(R&D Systems,Minneapolis,MN)之Nunc Maxisorp板上。對於固定化，藉由用2μg/ml於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之IL-4Rα在4℃下將板塗佈過夜來將可溶人類IL-4Rα固定化。用200μL稀釋於PBS中之0.5%牛血清白蛋白溶液(Sigma,St.Louis,MO)阻斷板，之後添加抗體/IL-4。再添加抗體/IL-4混合物後，將板在室溫下培育60分鐘。在培育後，用含有0.05%聚山梨醇酯20(Sigma)之PBS將板洗滌3次。在分析緩衝液中以1：5000稀釋偶聯至鏈黴親和素(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)之山葵過氧化物酶，且以100μL添加至每孔。在室溫下培育30分鐘後，如上文所述洗滌板。添加100μL TMB受質且將板培育5至15分鐘。藉由添加1N磷酸來終止反應。在OD450下使用Spectra Max 340讀板器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)讀取ELISA板。使用Kaleidagraph繪圖軟體(Synergy Software,Reading,PA)繪製曲線。
為確定19C11是否阻斷IL-4誘導之TF-1細胞增殖，將純化19C11或無關對照抗體之連續稀釋液與IL-4及TF-1細胞一起培育。在培育48小時後，每一樣品接收3H-胸苷且在4小時培育後測定3H-胸苷之納入。
19C11阻斷生物素化IL-4與IL-4Rα之結合(圖1A)，表明IL-4上之表位與結合至IL-4Rα所涉及區域重疊。19C11亦抑制IL-4誘導之TF-1細胞增殖(圖1B)。阻斷IL-4誘導之TF-1細胞增殖之IC50經測定為0.014μg/ml，且IC90經測定為0.07μg/ml(數據未顯示)。隨後藉由將高變區接枝至具有選擇點突變之人類Vκ-1/VHIII受體框架中使19C11人類化。在人類化過程中保存19C11之結合親和力、表位及細胞活性(數據未顯示)。
實例3-19C11之人類化
將來自mu19C11之高變區(HVR)接枝至人類VL κI(huKI)、VL κIII(huKIII)、VH亞組I(huVH1)及VH亞組III(huVHIII)共有受體框架中以生成CDR接枝物(19C11-κ1接枝物、19C11-κ3接枝物、19C11-VH1接枝物、19C11-VH3接枝物)(參見圖10至13)。在VL結構域中，對以下區域進行接枝：位置24-34(HVRL1,SEQ ID NO：15)、50-56(HVRL2,SEQ ID NO：16)及89-97(HVRL3,SEQ ID NO：17)。在VH結構域中，對位置26-35b(HVRH1,SEQ ID NO：12)、49-65(HVRH2,SEQ ID NO：13)及95-102(HVRH3,SEQ ID NO：14)進行接枝。
19C11-接枝物係藉由Kunkel誘變作為IgG表現構築物使用每一高變區之單獨寡核苷酸來生成。藉由DNA測序來鑑別正確純系。為可能 地增強19C11-接枝物之親和力及功能，在VH結構域接枝物中恢復某些鼠類游標框架位置(參見圖12及13)。特定而言，使19C11-VH1接枝物之位置67、69及71及19C11-VH3接枝物之位置69、71及78變化以生成19C11-VH1.L、19C11-VH1.FFL、19C11-VH3.LA及19C11-VH3.FLA。另外，將突變D62S及F63V引入19C11-VH3.LA之CDR-H2中以生成19C11-VH3.LA.SV(參見圖13)。
出於篩選目的，首先在6孔板之293細胞中產生IgG變體。使用FuGene系統將編碼VL及VH(各自2μg)之載體轉移至293細胞中。將6μl FuGene與100μl不含FBS之DMEM培養基混合，且在室溫下培育5分鐘。將每一鏈(2μg)添加至此混合物中並在室溫下培育20分鐘，然後將其轉移至6孔板中以供在37℃下於5% CO2中轉染過夜。第二天移除含有轉染混合物之培養基且用2ml細胞培養基(例如含有FBS之DMEM)替代。將細胞再培育5天，之後以1000rpm經5分鐘收穫培養基並使用0.22μm低蛋白質結合過濾器進行無菌過濾。在4℃下儲存樣品。
藉由表面電漿子共振使用BIAcoreTM-A100實施親和力測定。在10mM乙酸鈉(pH 4.8)中在CM5感測器晶片上對抗-人類Fcγ抗體(約7000RU)進行固定化。藉由抗-人類Fcγ抗體捕獲293細胞中表現之人類化19C11 IgG變體。然後以30μL/min之流速注射重組IL-4。在每次注射後，使用3M MgCL2使晶片再生。藉由自人類化19C11變體IgG流動細胞減去對照流動細胞來校正結合反應。使用kon及koff之同時擬合之1：1Languir模型進行動力學分析。
製備12種不同人類化19C11變體，組合每一人類化輕鏈(19C11-κ1接枝物、19C11-κ3接枝物)與每一人類化重鏈(19C11-VH1接枝物、19C11-VH1.L、19C11-VH1.FFL、19C11-VH3接枝物、19C11-VH3.LA及19C11-VH3.FLA)。藉由SPR測試12種人類化19C11變體以及嵌合 19C11(其中小鼠可變區與人類IgG恆定區組合)之IL-4親和力(圖14)。大多數變體保留小於10pM之對IL-4之親和力，但19C11-VH1接枝物/κ1接枝物、19C11-VH3接枝物/κ1接枝物、19C11-VH3.FLA/κ1接枝物及19C11-VH3接枝物/κ3接枝物例外。19C11-VH1.FFL/κ3接枝物及19C11-VH3.FLA/κ3接枝物具有11pM之對IL-4之親和力。
選擇19C11-VH3.LA.SV/κ1接枝物進行進一步研究。人類化抗體19C11-VH3.LA.SV/κ1接枝物(在下文實例中稱作抗-IL-4)之重鏈及輕鏈可變區序列分別顯示於SEQ ID NO：9及10中。抗體19C11-VH3.LA.SV/κ1接枝物之重鏈高變區(HVR)顯示於SEQ ID NO：12至14中，且輕鏈HVR顯示於SEQ ID NO：15至17中。
實例4-IL-4/IL-13 IgG1雙特異性抗體之生成
先前已建立在大腸桿菌中生成具有兩個不同輕鏈之人類IgG1雙特異性抗體之技術(Yu等人，2011,Sci Transl Med 3,84ra44)。該方法利用隆凸-至-空穴中技術(Ridgway等人，1996,Protein Eng.9,617-621；Atwell等人，1997,J Mol Biol 270,26-35)促進免疫球蛋白重鏈之異二聚化。為使得能使用兩個不同輕鏈而無輕鏈錯配，在單獨大腸桿菌細胞中培養呈半聚體之每一臂。應用此方法藉由將抗-IL-4及抗-IL-13親代抗體亞選殖至容許表現呈人類IgG1空穴之抗-IL-4臂及呈人類IgG1隆凸之抗-IL-13臂之載體中來生成抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。IgG1隆凸恆定區之序列顯示於SEQ ID NO：34中，且IgG1空穴恆定區之序列顯示於SEQ ID NO：35中。
雙特異性抗體之抗-IL-13 Fab係基於先前已生成並表徵之來金珠單抗。例如，參見PCT公開案第WO 2005/062967 A2號。來金珠單抗結合可溶人類IL-13，且Biacore源Kd低於10pM之檢測極限。來金珠單抗與IL-13之結合不抑制細胞介素與IL-13Rα1之結合，但阻斷異二聚信號傳導組份IL-4Rα/IL-13Rα1複合物之後續形成(Ultsch,M.等人， 2013,J.Mol.Biol.,dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.024；Corren等人，2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098)。
對於抗體表現，使用大腸桿菌菌株64B4。使過夜培養物在30℃下在LB(100μg/ml卡本西林)中生長，以1：100稀釋至5ml CRAP培養基(100μg/ml卡本西林)中(Simmons等人，2002,J.Immunol.Methods,263：133-147)並在30℃下生長24小時。在表現後，可溶部分經受SDS-PAGE，之後經受抗-Fc免疫染色以分析半抗體物質之形成。隆凸及空穴突變二者皆產生主要半抗體物質。對於放大規模至10L發酵罐，使初始起始培養物(500ml)生長至靜止期並用於接種10L發酵(Simmons等人，2002,J.Immunol.Methods,263：133-147)。
抗-IL-13 IgG1隆凸半聚體在大腸桿菌中之初始表現低於預期。先前已顯示，隨機誘變及/或替代Fab序列之疏水表面殘基可改良Fab穩定性及摺疊(Forsberg等人，1997,J.Biol.Chem.,272：12430-12436；Demarest等人，2006,Protein Eng.Des.Sel.,19：325-336；Kugler等人，2009,Protein Eng.Des.Sel.,22：135-147)。
在大腸桿菌細胞中表現變體，且藉由非還原SDS-PAGE及之後之抗-Fc免疫印跡分析非還原全細胞提取物。使用Odyssey®(LiCOR Biosciences)對半聚體帶進行定量且正規化至來金珠單抗信號。
發現重鏈及輕鏈中之若干種變化可改良半聚體產率及/或摺疊。選擇一種變化，即輕鏈中之M4L。另外，在重鏈中引入Q1E變化。在單一半聚體中組合該兩種變化，且發現所得半聚體相對於野生型半聚體具有改良之產率及摺疊。來金珠單抗Q1E重鏈可變區之序列顯示於SEQ ID NO：19中，且來金珠單抗M4L輕鏈可變區之序列顯示於SEQ ID NO：20中。使用彼等可變區來構築抗-IL-4/IL-13 IgG1雙特異性抗體。
藉由氧化還原化學使用先前闡述於(例如)美國專利公開案第 2011/0287009號及國際專利申請案第PCT/US2012/059810號中之方法自分離半抗體裝配完整雙特異性抗體。
實例5-IL-4/IL-13 IgG4雙特異性抗體之生成
在建立人類IgG1同種型之抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之產生後，將雙特異性平臺改變為人類IgG4同種型。期望製備呈人類IgG4抗體之抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體以匹配來金珠單抗之同種型，該來金珠單抗係已在中度至重度不受控氣喘之治療中顯示臨床益處之抗-IL-13抗體(Corren等人，2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098)。
與IgG1相比，IgG4之重鏈-輕鏈鏈間二硫鍵係藉由不連續二硫鍵形成。此不連續二硫鍵模式對於大腸桿菌蛋白質而言並不常見(Berkmen,2005,J.Biol.Chem.280,11387-11394)。另外，IgG4之鉸鏈區因S228殘基而去穩定，且IgG4之CH3二聚體界面含有去穩定性R409殘基(Dall'Acqua等人，1998,Biochemistry 37,9266-9273)(EU編號慣例)。設計若干種構築體來剖析IgG4 Fc區序列、鏈間二硫鍵模式及CH3 R409對半抗體在大腸桿菌中之功能性表現及後續裝配成雙特異性分子之影響。在每一情形中，在鉸鏈區中引入穩定性S228P突變以減弱裝配後之Fab臂交換(Stubenrauch等人，2010,Drug Metab.Dispos.38,84-91)。首先將具有相應隆凸/空穴突變(隆凸：T366W；空穴：T366S、L368A、Y407V)之IgG4 Fc區接枝至IgG1 Fab上，以評價IgG4 Fc區對半抗體之功能性表現之影響。對於兩種抗體(抗-IL-4及抗-IL-13)，此產生與IgG1同種型類似量之二硫鍵結材料(圖2C及2D)，表明同種型之間在Fc區中之差異不影響半抗體在大腸桿菌中之功能性表現。隨後將重鏈之完整恆定區轉化為IgG4亞類。儘管此導致功能性表現之半抗體減少，但其顯示大腸桿菌原則上能在抗體之恆定區中自不連續半胱胺酸形成分子內二硫鍵。
由於409位可能對於CH3穩定性非常重要(Dall'Acqua等人，1998, Biochemistry 37,9266-9273)且在此階段R409對下游裝配過程之影響不確定，故亦設計具有R409K突變之構築體以重建在IgG1同種型中發現之CH3界面。對於兩種抗體，此部分挽救了IgG4同種型之功能性表現之略微降低(圖2C及2D)。
實例6-IL-4/IL-13雙特異性抗體之裝配及純化
為比較不同雙特異性抗體構築體之裝配，使將半抗體表現為IgG1、IgG4及IgG4R409K之培養物生長。在藉由蛋白質A層析純化半抗體後，混合半聚體對，且藉由異二聚隆凸/空穴對之氧化還原化學步驟形成完整雙特異性抗體。藉由陰離子及陽離子交換層析步驟移除過量半抗體。在最終層析步驟後，在0.2M精胺酸琥珀酸鹽(pH 5.5)、0.02%聚山梨醇酯-20中以45g/l調配材料。為確認裝配抗體自半抗體物質轉變為穩定完整抗體，藉由粒徑篩析層析對其進行表徵。所有三種構築體係以對應於完整150kDa抗體之保留時間來溶析(圖3A)。此外，未檢測到大量聚集物質(0.6/0.4/0.4%，對於IgG1/IgG4/IgG4R409K)且僅檢測到痕量低分子量物質(0.2/0/4.4%，對於IgG1/IgG4/IgG4R409K)，表明兩個同種型皆可用於裝配低聚集傾向之抗體。
在雙特異性裝配期間之一個步驟係形成鉸鏈二硫鍵。由於粒徑篩析層析無法解析鏈間二硫鍵之氧化態，使抗體經受毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉分析(CE-SDS)且發現，所有三種格式皆以類似效率形成鉸鏈二硫鍵。對於IgG1、IgG4及IgG4R409K，分別觀察到89.3%、91.4%及86.7%之材料呈完全氧化構象(圖3B)。隨後還原樣品且藉由CE-SDS再分析以測定輕鏈對重鏈之各別比率(圖3C)。所有三種格式皆具有輕鏈(31.3/31.4/30.9%，對於IgG1/IgG4/IgG4R409K)及重鏈(65.8/64.9/65.4%，對於IgG1/IgG4/IgG4R409K)之類似預期分佈，從而進一步確認了天然抗體構象之存在。
為確保在裝配過程期間生成異二聚物質，藉由質譜分析最終雙特異性分子。完整及約化質量概述於表2、圖4及表3中。對於所有三種雙特異性抗體，實驗質量與理論質量密切匹配，且不能檢測任何對應於同二聚物質之質量。反相HPLC分析進一步確認，抗體具有雙特異性，且無同二聚抗體之證據(數據未顯示)。
由於在R409及R409K IgG4雙特異性隆凸-至-空穴中抗體之裝配中無法檢測到任何顯著差異，所有進一步研究皆利用野生型(R409)IgG4雙特異性抗體格式。
實例7-IL-4/IL-13雙特異性抗體之生物化學表徵
之後表徵IgG1及IgG4雙特異性抗體以評價其對IL-4及IL-13之結合親和力以及其阻斷IL-4及IL-13與其受體結合之能力是否相當。IgG1及IgG4雙特異性抗體對IL-4及IL-13之親和力係藉由Biacore如實例1中所述來量測，且發現與親代抗體相當(表4)且類似，從而表明結合配體之能力不受雙特異性格式或同種型影響。
抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體以高親和力結合至人類IL-13、人類IL-13 R130Q(SEQ ID NO：31)及食蟹猴IL-13。對彼等細胞介素之解離常數分別計算為0.056、0.142及0.048(nM)。動力學常數提供於表4中。其他SPR實驗顯示，抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體以高親和力結合至人類IL-4及食蟹猴IL-4。對彼等細胞介素之解離常數分別計算為0.046及0.076nM。動力學常數提供於表4中。
為確保雙特異性分子可阻斷細胞介素與其受體之結合，使用實質上如實例1中所述之ELISA結合競爭分析。抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體抑制生物素化人類IL-4(5.8ng/mL)直接結合至人類IL-4R(參見圖15)。在0.035至25μg/mL(0.23至167nM)之雙特異性抗體下觀察到生物素化IL-4與IL-4R之結合之降低。
與之相比，抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體不抑制生物素化人類IL-13(0.625μg/mL)直接結合至人類IL-13Rα1(參見圖16)。在以所測試濃度添加雙特異性抗體時未觀察到生物素化人類IL-13與IL-13Rα1之結合之降低。
抗-IL-4/IL-13雙特異性不顯著抑制生物素化人類IL-13(0.056μg/mL)直接結合至人類IL-13Rα2(參見圖17)。觀察到生物素化IL-13與IL-13Rα2之結合部分降低。
如實例1中所述使用SPR觀察IL-13Rα2與IL-13之結合。收集在固定化IL-13上以一系列濃度注射IL-13Rα2之感應圖。基於該等感應圖，觀察到結合常數(Kd)為0.365nM(kon=24.27×104±0.49Ms-1,koff=0.891×10-4±0.026s-1)。先前顯示抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體在單獨SPR實驗中可以高親和力(Kd=56pM)結合IL-13(參見表4)。為測試對IL-13Rα2與IL-13之結合之抑制，在注射IL-13Rα2之前，在固定化IL-13上注射250nM抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體。雙特異性抗體之結合不妨礙IL-13Rα2與固定化IL-13之締合(參見圖18)。IL-13Rα2與雙特異性抗體：IL-13複合物結合之Kd係1.09nM(kon=10.06×104±0.56Ms-1,koff=1.10×10-4±0.12s-1)。用雙特異性抗體將固定化IL-13預飽和僅輕度破壞IL-13Rα2與IL-13之結合且表明，雙特異性抗體不顯著抑制IL-13與IL-13Rα2之結合。
因此，與親代抗-IL-4及抗-IL-13抗體類似，雙特異性抗體完全抑 制IL-4與IL-4Rα之結合，且不顯著抑制IL-13與IL-13Rα1或IL-13Rα2之結合。該等發現表明，在雙特異性抗體中保存每一IL-13及IL-4臂之結合表位及單價親和力。
實例8-在細胞分析中IL-4及IL-13活性之中和
在活體外細胞分析中評價抗-IL-4/IL-13 IgG1及抗-IL-4/IL-13 IgG4雙特異性抗體二者之活性，在該分析中人類IL-4及IL-13誘導TF-1細胞增殖。如下文所述評估每一雙特異性抗體阻斷人類IL-4及人類IL-13單獨及組合誘導之TF-1細胞增殖之能力。
將抗體在96孔組織培養板(目錄號353072,Falcon BD,Franklin Lakes,NJ)中在50μl含有細胞介素之分析培養基中連續稀釋3.3倍。將板在37℃下培育30分鐘。將TF-1細胞在分析培養基中洗滌兩次且以2.5×105個細胞/ml之最終體積再懸浮。將50μl細胞添加至每一孔中達成100μl之總體積。將板在加濕培育器中在37℃及5% CO2下培育4天，之後每孔添加1μCi之3H胸苷。在再培育4小時後，使用液體閃爍計數器依據細胞締合之3H胸苷納入量測增殖。以平均值表述一式兩份樣品之結果。使用KaleidaGraph(Synergy Software,Reading,PA)生成圖。
抗-IL-4/IL-13 IgG1及抗-IL-4/IL-13 IgG4雙特異性抗體二者皆以劑量依賴性方式抑制人類IL-4-及IL-13誘導之TF-1細胞增殖，且在兩種不同雙特異性抗體之間，活體外中和之IC50無顯著差異(圖5及表5)。
實施類似分析以確定抗-IL-4/IL-13 IgG1及抗-IL-4/IL-13 IgG4雙特異性抗體是否以劑量依賴性方式抑制食蟹猴IL-4-及IL-13誘導之TF-1細胞增殖(圖6)。
實例9-食蟹猴中之藥物動力學研究
在單次靜脈內(IV)或皮下(SC)投與食蟹猴之後評價IgG4及IgG1抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之活體內藥物動力學。食蟹猴中之藥物動力學(PK)研究經實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准。使用抗-IL-4/IL-13 IgG4之PK研究係在Charles River Laboratories(CRL)Preclinical Services(Reno,NV)實施。將來自CRL庫存之總計15只雌性食蟹猴(2.2-2.6kg)隨機分配至5組(n=3/組)中。向第1組中之動物給予對照媒劑之靜脈內(IV)及皮下(SC)劑量。分別向第2、3及4組中之動物以10、30及100mg/kg給予抗-IL-4/IL-13 IgG4之單次IV推注劑量。向第5組中之動物以10mg/kg給予抗-IL-4/IL-13 IgG4之SC劑量。
使用抗-IL-4/IL-13 IgG1之PK研究係在Shin Nippon Biomedical Laboratories(SNBL)USA(Everett,WA)實施。將來自SNBL庫存之總計12只雌性食蟹猴(2.4-3.1kg)隨機分配至4組(n=3/組)中。向第1中之動物給予對照媒劑之IV劑量。分別向第2、3及4組中之動物以10、30及60mg/kg給予抗-IL-4/IL-13 IgG1之單次IV推注劑量。
對於兩個研究，在直至投藥後4-5週之不同時間點收集血清樣品，且抗-IL-4/IL-13 IgG4或抗-IL-4/IL-13 IgG1之濃度係藉由ELISA以0.078μg/mL之定量極限來評價，且抗治療劑抗體(ATA)之濃度係藉由橋式ELISA來評價。對於PK數據計算，將研究第1天轉化為PK第0天以指示劑量投與之開始。將在生存中投藥日之後之所有時間點按研究第-1天計算。使用2區室分析及WinNonlin® 5.2.1版(Pharsight；Mountain View,CA)分析每一動物之血清濃度數據。
抗-IL-4/IL-13 IgG4及抗-IL-4/IL-13 IgG1雙特異性抗體之血清濃度-時間曲線在所測試劑量範圍內展現雙相配置及線性藥物動力學(圖7A及7B)。兩個抗體之中心區室之初始體積類似於血清體積，此指示有限分佈。兩種抗體皆具有相對緩慢之清除(CL)及長終末半衰期，如對於人類IgG4及IgG1抗體在食蟹猴中所預期(平均CL=抗-IL-4/IL-13 IgG4之5.79至6.70mL/天/kg及抗-IL-4/IL-13 IgG1之3.59至4.09mL/天/kg)。基於針對10mg/kg劑量組計算之曲線下面積(AUC)，抗-IL-4/IL-13 IgG4抗體之SC生物利用度係95.1%。在50%之給予抗-IL-4/IL-13 IgG4之動物(包括100mg/kg IV劑量組中之所有3個動物)中檢測到抗治療劑抗體(ATA)之存在，且其似乎與在第14天後促進消除抗-IL-4/IL-13 IgG4有關。在經抗-IL-4/IL-13 IgG1治療之動物中檢測到ATA之低發生率，此似乎不影響PK。總之，在食蟹猴中，抗-IL-4/IL-13 IgG4及抗-IL-4/IL-13 IgG1雙特異性抗體二者之藥物動力學與其他人類化IgG1及IgG4單株抗體類似且相當。
實例10-食蟹猴氣喘模型中之肺分配
在食蟹猴氣喘模型中評估IgG4對IgG1抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之肺分配之潛在差異。在此氣喘模型中，天然對豬蛔蟲(Ascaris suum，豬蛔蟲)敏化之食蟹猴接受豬蛔蟲提取物之氣溶膠攻毒以誘發模擬暴露於過敏原之氣喘患者之過敏性發炎反應。
食蟹猴中之肺分配研究經IACUC批准。此比較抗-IL-4/IL-13 IgG4及抗-IL-4/IL-13 IgG1之研究係在CRL,Preclinical Services(Reno,NV)實施。此研究由兩個不同時期組成。在第一時期中，來自CRL庫存之食蟹猴(3-10kg)接受豬蛔蟲(A.suum)之基線氣溶膠攻毒以確定豬蛔蟲攻毒在每一動物中誘發適當氣道反應之適宜性。在整個攻毒階段期間監測動物之痛苦體徵且在此時期期間不給予抗體。4週後，開始第二時期且將總計7只雄性食蟹猴隨機分配至2組(在IgG4組中n=3； 在IgG1組中n=4)中。然後該等猴子在研究第1天及研究第8天經由IV推注劑量接受10mg/kg之抗-IL-4/IL-13 IgG4或抗-IL-4/IL-13 IgG1。隨後，在研究第9天經由豬蛔蟲之氣溶膠吸入攻毒動物。在直至投藥後23天之不同時間點，收集支氣管肺泡灌洗(BAL)液及血清樣品並藉由ELISA以0.078μg/mL之定量極限分析抗-IL-4/IL-13 IgG4或抗-IL-4/IL-13 IgG1濃度。對於數據計算，將研究第1天轉化為PK第0天以指示劑量投與之開始。將在生存中投藥日之後之所有時間點按研究第-1天計算。分別在BAL及血清中量測尿素及白蛋白以估計上皮內襯液體(ELF)濃度並校正發炎誘導之血管洩漏。亦在血清中藉由ELISA量測蛔蟲特異性IgE。使用BAL及血清尿素濃度數據估計稀釋因子，如Rennard等人，1986,J.Appl.Physiol.,60(2)：532-538中所述。
在研究第1天及第8天IV投與10mg/kg後及在研究第9天用豬蛔蟲提取物肺攻毒後比較抗-IL-4/IL-13 IgG4及抗-IL-4/3 IgG1抗體之血清濃度與上皮內襯液體(ELF)濃度。ELF中之IgG濃度值係藉由針對BAL液收集程序之固有稀釋校正BAL液IgG濃度數據來導出，如(例如)Rennard等人，1986,J.Appl.Physiol.,60(2)：532-538中所述。在整個研究期間，抗-IL-4/IL-13 IgG4及抗-IL-4/IL-13 IgG1雙特異性抗體之血清與肺分配相當(圖8)。在過敏原攻毒之前，兩種抗體之ELF濃度為IgG血清濃度之約1%-4%，表明僅少部分全身性抗體到達ELF。在研究第9天用豬蛔蟲吸入攻毒似乎導致增加兩種抗體之肺分配。然而，在將IgG濃度正規化至ELF中之白蛋白濃度並比較該等值與血清IgG濃度後，數據表明，在呼吸攻毒後增加之ELF IgG濃度係由於該攻毒誘導之非特異性大分子血管洩漏所致。
實例11-抗-IL-4、抗-IL-13及抗-IL-4/IL-13抗體在小鼠過敏性氣道發炎及氣喘模型中之效力
在此研究中使用8只BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)。在 第0天用100μl無菌PBS中之於2mg明礬中之50μg三硝基苯基-卵白蛋白(TNP-OVA)對所有小鼠進行腹膜內(IP)免疫。在免疫後第35天開始，連續7天每天經由霧化器用PBS中之1% TNP-OVA對所有小鼠進行30分鐘之氣溶膠攻毒。在第37天開始，在7天中每天在每次氣溶膠攻毒之前用IP投與之單株抗體(mAb)處理小鼠4小時，如圖9A中所示。
在第42天，在麻醉下對所有小鼠進行眶後取血以最終獲得200μl血清(以量測TNP-OVA特異性IgE、IgG1，且在研究期間獲得抗體血清濃度)。在異氟烷麻醉下對小鼠進行眼眶取血以獲得血清樣品用於藉由ELISA進行TNP-OVA特異性免疫球蛋白及血清TARC(胸腺及活化調節之趨化介素)量測。收集支氣管肺泡灌洗液樣品用於分類計數。用冷PBS灌注肺，然後藉由FACS分析。將肺切碎成小塊，然後經由金屬粉料磨碎以獲得單細胞懸浮液，然後經由小瓶0.7μm耐綸(nylon)過濾器過濾。將肺樣品再懸浮於5ml中。將固定體積之細胞懸浮液添加至固定濃度之FITC標記之螢光珠粒並在流式細胞儀上分析，每個樣品收集5000個珠粒事件以獲得細胞計數。對於肺之定量及表型分析，用針對表面白血球標記物之螢光染料標記之mAb(CD44-FTC、CD4-APC、CCR3-Pe及CD4-APC，或CD11c-FITC、CD11b-PE及Gr-1-APC；BD Biosciences,San Jose,CA)對每個樣品之3百萬個肺細胞進行染色。在BD FACSCalibur(BD,San Jose,CA)上運行樣品並在Flowjo軟體(Ashland,OR)上分析。
該實驗之結果顯示於圖9B至9E中。投與抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體抑制肺嗜酸性白血球之程度大於抗-IL-4抗體(p=0.0381)，且抑制肺嗜酸性白血球之程度似乎大於抗-IL-13抗體，但該差異未達到統計學顯著(p=0.1803)(圖9B)。類似地，投與抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體抑制支氣管肺泡灌洗液中之嗜酸性白血球之程度大於抗-IL-4抗體(p=0.0031)或抗-IL-13抗體(p=0.0135)(圖9C)。投與抗-IL-4抗體或抗- IL-4/IL-13雙特異性抗體與對照治療相比似乎減少TNP-OVA特異性IgE，但該等結果未達到統計學顯著(圖9D)。最後，投與抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體抑制血清TARC含量之程度大於抗-IL-4抗體或抗-IL-13抗體(分別係p<0.0001及p=0.0323)(圖9E)。
論述
本文中應用先前研發之隆凸-至-空穴中雙特異性抗體平臺以生成針對細胞介素IL-4及IL-13之人類IgG1及人類IgG4雙特異性抗體。慮及IL-4及IL-13之重疊及獨特生物學，以及抗-IL-13抗體在治療中度至重度氣喘患者中之活性，靶向IL-4及IL-13二者之雙特異性抗體可為相對於抗-IL-13改良之治療氣喘之療法。上文實例11中呈現之數據支持此假設。本發明抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體係抗-IL-13抗體來金珠單抗之擴展，其在中度至重度不受控氣喘之II期研究中顯示臨床效力。由於來金珠單抗係人類IgG4抗體，使用具有人類IgG4之隆凸-至-空穴中雙特異性抗體平臺以匹配本發明抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體之同種型與來金珠單抗之同種型。
在人類IgG1與IgG4同種型之間之一個關鍵差異係CH3二聚體界面，其影響二聚體穩定性。差異係由409位驅動。本發明結果顯示，隆凸-至-空穴中突變與IgG4之CH3結構域中之Arg409在作為半抗體之表現以及裝配成雙特異性抗體兩方面相容。無法檢測兩個不同同種型之間之裝配效率或最終抗體材料之品質中之任何顯著差異。
儘管不同同種型之人類抗體之表現在哺乳動物細胞中已確立，但在大腸桿菌中表現不同人類抗體同種型之嘗試較少，且因此，人類IgG4同種型之全長抗體或半抗體在大腸桿菌中之表現沒有大量記載。本發明中對於該等抗-IL-4/IL-13雙特異性抗體顯示，人類IgG4半聚體可在大腸桿菌細胞中順利地大量表現，並與人類IgG1雙特異性抗體一樣容易地裝配成雙特異性抗體。
隆凸-至-空穴中技術之一個標誌係在最終雙特異性分子中保留單價親代抗體之生物物理性質。IgG1及IgG4雙特異性抗體二者皆保留親代Fab之靶表位及結合性質，包括對IL-4或IL-13靶細胞介素之高親和力，從而在活體外細胞分析中產生高潛能。
食蟹猴中之藥物動力學研究顯示IgG1及IgG4雙特異性抗體二者之緩慢清除及類似的終末半衰期。另外，IgG1及IgG4雙特異性抗體二者以可使得能完全中和肺中之病原性IL-4及IL-13之含量同等地自血清分配至肺，此對於氣喘治療至關重要。儘管在食蟹猴中IgG4雙特異性與IgG1雙特異性相比似乎具有較高ATA比率，慮及在本發明研究中所使用動物之小數目，以及缺乏人類化抗體在食蟹猴對人類中之免疫原性之間之明確聯繫，無法得出關於本發明抗-IL-4/IL-13 IgG4及IgG1雙特異性抗體在人類中之相對免疫原性之任何結論。然而，應注意，除了抗體Fab之CDR區以外，本發明雙特異性抗體由應在人類中展現最小免疫原性之完整人類IgG1及IgG4序列組成。因此，已生成之雙特異性抗體係臨床研發用於治療氣喘以及IPF及其他呼吸病症之良好候選藥物。此外，基於本文所呈現之活體內數據，自然會獲得治療人類病症(例如氣喘、IPF及其他呼吸病症)之方法。
由於與血清補體蛋白質及免疫效應細胞上之Fcγ受體之結合之差異，不同人類同種型之抗體之活體外及活體內性質可顯著不同(Nirula,A.等人，2011,Curr Opin Rheumatol 23,119-124)。具體而言，人類IgG1同種型之抗體有效活化補體系統並接合Fcγ受體以觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，而人類IgG4同種型之抗體不活化補體系統且具有降低之ADCC。重要的是，抗體效應子功能中之該等性質需要在哺乳動物細胞中表現期間生成之抗體糖基化。不管是何種同種型，由於缺乏抗體糖基化，在諸如大腸桿菌等細菌細胞中產生之抗體缺乏抗體效應子功能(Jung,S.T.等人，2011,Curr.Opin.Biotechnol. 22,858-867；Simmons,L.C.等人，2002,J Immunol Methods 263,133-147)。儘管在此研究中產生之雙特異性抗體係在大腸桿菌中產生且因此缺乏糖基化及Fc效應子功能，但本文所述雙特異性抗體亦可在哺乳動物細胞中產生。此方法可有效擴展用於該等抗體之隆凸-至-空穴中雙特異性抗體平臺以包括完全糖基化之人類IgG1及IgG4抗體同種型之雙特異性抗-IL-4/IL-13，且繼而可提供眾多種具有不同效應子功能之治療性雙特異性抗體。
儘管已出於理解清楚之目的藉助闡釋及實例相當詳細地闡述上述發明，但說明及實例不應視為限制本發明之範圍。本文所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容皆係全文以引用方式明確併入本文中。
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<223> 人工序列之說明：合成肽
<400> 60
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<210> 63
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之說明：合成多肽
<400> 64

Claims (63)

  1. 一種多特異性抗體，其包含抗原結合結構域，該抗原結合結構域包含特異性結合IL-4之第一VH/VL單元及特異性結合IL-13之第二VH/VL單元，其中該抗體：a)抑制IL-4與IL-4受體α(IL-4Rα)之結合，b)在活體外抑制IL-4誘導之細胞增殖，及/或c)在活體外抑制IL-13誘導之細胞增殖。
  2. 如請求項1之多特異性抗體，其中該第一VH/VL單元包含包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2。
  3. 如請求項1或2之多特異性抗體，其中該第一VH/VL單元包含包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3。
  4. 如請求項1或2之多特異性抗體，其中該第一VH/VL單元包含包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
  5. 如請求項1或2之多特異性抗體，其中該第一VH/VL單元包含(a)與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
  6. 如請求項1或2之多特異性抗體，其中該第一VH/VL單元包含選自SEQ ID NO：1及3至9之VH序列。
  7. 如請求項1或2之多特異性抗體，其中該第一VH/VL單元包含選自SEQ ID NO：2、10及11之VL序列。
  8. 如請求項1之多特異性抗體，其中該第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列。
  9. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該第二VH/VL單元包含：a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；或b)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2。
  10. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該第二VH/VL單元包含：a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列或SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；或b)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-H3。
  11. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該第二VH/VL單元包含：a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3；或b)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之HVR-L3。
  12. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該第二VH/VL單元包含：a)與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；b)與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列；d)與SEQ ID NO：49之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；e)與SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；f)如(d)中之VH序列及如(e)中之VL序列。
  13. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：19、56或49之VH序列。
  14. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：20、57或48之VL序列。
  15. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：19或56之VH序列及SEQ ID NO：20或57之VL序列；或SEQ ID NO：49之VH序列及SEQ ID NO：48之VL序列。
  16. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該抗體與包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列之抗體競爭結合至IL-4。
  17. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該抗體與包含 SEQ ID NO：19之VH序列及SEQ ID NO：20之VL序列之抗體或與包含SEQ ID NO：49之VH序列及SEQ ID NO：48之VL序列之抗體競爭結合至IL-13。
  18. 如請求項1、2及8中任一項之多特異性抗體，其中該抗體結合在SEQ ID NO：29之胺基酸77至89內或在SEQ ID NO：29之胺基酸82至89內之表位。
  19. 一種多特異性抗體，其包含特異性結合IL-4之第一VH/VL單元及特異性結合IL-13之第二VH/VL單元，其中該第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列，且該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：19之VH序列及SEQ ID NO：20之VL序列。
  20. 如請求項1、2、8及19中任一項之多特異性抗體，其中該抗體係IgG抗體。
  21. 如請求項20之多特異性抗體，其中該抗體係IgG1或IgG4抗體。
  22. 如請求項21之多特異性抗體，其中該抗體係IgG4抗體。
  23. 如請求項1、2、8及19中任一項之多特異性抗體，其中該抗體包含第一重鏈恆定區及第二重鏈恆定區，其中該第一重鏈恆定區包含隆凸突變且該第二重鏈恆定區包含空穴突變。
  24. 如請求項23之多特異性抗體，其中該第一重鏈恆定區與結合IL-4之VH/VL單元之重鏈可變區部分融合。
  25. 如請求項23之多特異性抗體，其中該第二重鏈恆定區與結合IL-13之VH/VL單元之重鏈可變區部分融合。
  26. 如請求項23之多特異性抗體，其中該第一重鏈恆定區與結合IL-13之VH/VL單元之該重鏈可變區部分融合。
  27. 如請求項23之多特異性抗體，其中該第二重鏈恆定區與結合IL-4之VH/VL單元之該重鏈可變區部分融合。
  28. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體係IgG1抗體且其中該隆凸突變包含T366W突變。
  29. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體係IgG1抗體且其中該空穴突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V之突變。
  30. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體係IgG4抗體且其中該隆凸突變包含T366W突變。
  31. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體係IgG4抗體且其中該空穴突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V突變之突變。
  32. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體包含第一重鏈恆定區，該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：34之序列。
  33. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體包含第二重鏈恆定區，該第二重鏈恆定區包含SEQ ID NO：35之序列。
  34. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體包含第一重鏈恆定區，該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：36之序列。
  35. 如請求項23之多特異性抗體，其中該抗體包含第二重鏈恆定區，該第二重鏈恆定區包含SEQ ID NO：37之序列。
  36. 一種結合IL-4及IL-13之多特異性抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO：38之序列之第一重鏈、包含SEQ ID NO：39之序列之第一輕鏈、包含SEQ ID NO：40之序列之第二重鏈及包含SEQ ID NO：41之序列之第二輕鏈。
  37. 一種結合IL-4之分離抗體，其中該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；或 (b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3；或(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3；或(d)與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；或(e)與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列。
  38. 如請求項37之分離抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L3。
  39. 如請求項37或38之分離抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列及與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列。
  40. 如請求項37或38之分離抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID NO：1及3至9之VH序列。
  41. 如請求項37或38之分離抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID NO：2、10及11之VL序列。
  42. 一種分離抗體，其包含SEQ ID NO：9之VH序列及SEQ ID NO：10之VL序列。
  43. 一種分離核酸，其編碼： (a)如請求項1至42中任一項之抗體；(b)如請求項1至34中任一項之多特異性抗體之第一VH/VL單元；或(c)如請求項1至34中任一項之多特異性抗體之第二VH/VL單元。
  44. 一種宿主細胞，其包含如請求項43之核酸。
  45. 如請求項44之宿主細胞，其中該宿主細胞係大腸桿菌(E.coli)細胞或CHO細胞。
  46. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項44或45之宿主細胞。
  47. 一種免疫偶聯物，其包含如請求項1至42中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  48. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至42中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  49. 如請求項1、2、8、19及36至38中任一項之抗體，其用作醫藥。
  50. 如請求項1、2、8、19及36至38中任一項之抗體，其用於治療嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症、IL-4介導之病症或呼吸病症。
  51. 如請求項50之抗體，其中該嗜酸性白血球性病症選自氣喘、重度氣喘、慢性氣喘、異位性氣喘、異位性皮膚炎、過敏、過敏性鼻炎、非過敏性鼻炎、接觸性皮膚炎、多形性紅斑、大皰性皮膚病、牛皮癬、濕疹、類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎、慢性嗜酸性白血球性肺炎、過敏性支氣管肺麴菌病、乳糜瀉、丘斯症候群(Churg-Strauss syndrome，結節性動脈周圍炎加特異體質過敏症)、嗜酸性白血球性肌痛症候群、嗜酸性白血球過多症候群、水腫反應(包含發作性血管性水腫)、蠕蟲感染、蕁 麻疹、盤尾絲蟲皮膚炎、嗜酸性白血球相關胃腸病症、嗜酸性白血球性食道炎、嗜酸性白血球性胃炎、嗜酸性白血球性胃腸炎、嗜酸性白血球性腸炎、嗜酸性白血球性結腸炎、潰瘍性結腸炎、惠普爾病(Whipple’s disease)、鼻微息肉病、鼻息肉病、阿斯匹林(aspirin)不耐受症、阻塞性睡眠呼吸中止症、克隆氏病(Crohn's disease)、硬皮病、心肌心內膜纖維化、纖維化、發炎性腸病、自發性間質性肺炎、嗜酸性白血球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、硬化症繼發之肺纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、葡萄膜炎、癌症、神經膠母細胞瘤、何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非何傑金氏淋巴瘤。
  52. 如請求項50之抗體，其中該IL-13介導疾病選自異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、癌症、神經膠母細胞瘤及非何傑金氏淋巴瘤。
  53. 如請求項50之抗體，其中該IL-4介導疾病選自異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、癌症、神經膠母細胞瘤及非何傑金氏淋巴瘤。
  54. 如請求項50之抗體，其中該呼吸病症選自氣喘、過敏性氣喘、非過敏性氣喘、支氣管炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、氣腫、吸煙誘導之氣腫、氣道發炎、囊性纖維化、肺纖維化、過敏性鼻炎及支氣管擴張症。
  55. 一種如請求項1至42中任一項之抗體之用途，其用於製造用於治 療嗜酸性白血球性病症、IL-13介導之病症、IL-4介導之病症或呼吸病症之醫藥。
  56. 如請求項55之用途，其中該嗜酸性白血球性病症選自氣喘、重度氣喘、重度氣喘、慢性氣喘、異位性氣喘、異位性皮膚炎、過敏、過敏性鼻炎、非過敏性鼻炎、接觸性皮膚炎、多形性紅斑、大皰性皮膚病、牛皮癬、濕疹、類風濕性關節炎、幼年型慢性關節炎、慢性嗜酸性白血球性肺炎、過敏性支氣管肺麴菌病、乳糜瀉、丘斯症候群(結節性動脈周圍炎加特異體質過敏症)、嗜酸性白血球性肌痛症候群、嗜酸性白血球過多症候群、水腫反應(包含發作性血管性水腫)、蠕蟲感染、蕁麻疹、盤尾絲蟲皮膚炎、嗜酸性白血球相關胃腸病症、嗜酸性白血球性食道炎、嗜酸性白血球性胃炎、嗜酸性白血球性胃腸炎、嗜酸性白血球性腸炎、嗜酸性白血球性結腸炎、潰瘍性結腸炎、惠普爾病、鼻微息肉病、鼻息肉病、阿斯匹林不耐受症、阻塞性睡眠呼吸中止症、克隆氏病、硬皮病、心肌心內膜纖維化、纖維化、發炎性腸病、自發性間質性肺炎、嗜酸性白血球性肺炎、過敏性肺炎、杯細胞化生、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、硬化症繼發之肺纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、葡萄膜炎、癌症、神經膠母細胞瘤、何傑金氏淋巴瘤及非何傑金氏淋巴瘤。
  57. 如請求項55之用途，其中該IL-13介導疾病選自異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、癌症、神經膠母細胞瘤及非何傑金氏淋巴瘤。
  58. 如請求項55之用途，其中該IL-4介導疾病選自異位性皮膚炎、過 敏性鼻炎、氣喘、纖維化、發炎性腸病、克隆氏病、發炎性肺病、肺纖維化、自發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纖維化、癌症、神經膠母細胞瘤及非何傑金氏淋巴瘤。
  59. 如請求項55之用途，其中該呼吸病症選自氣喘、過敏性氣喘、非過敏性氣喘、支氣管炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、氣腫、吸煙誘導之氣腫、氣道發炎、囊性纖維化、肺纖維化、過敏性鼻炎及支氣管擴張症。
  60. 如請求項55至59中任一項之用途，其中該醫藥進一步包含TH2路徑抑制劑或欲與該抑制劑一起投與。
  61. 如請求項60之用途，其中該TH2路徑抑制劑抑制至少一個選自以下之靶：ITK、BTK、IL-9、IL-5、IL-13、IL-4、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33、IgE、IL-9受體、IL-5受體、IL-4受體α、IL-13受體α1、IL-13受體α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα、IL17RB、ST2、CCR3、CCR4、CRTH2、FcεRI、FcεRII/CD23、Flap、Syk激酶；CCR4、TLR9、CCR3、IL5、IL3及GM-CSF。
  62. 如請求項55至59中任一項之用途，其中個體患有中度至重度氣喘。
  63. 如請求項55至59中任一項之用途，其中個體患有自發性肺纖維化。
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