CN105307676A - 抗il-4抗体和双特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗IL-4抗体和双特异性抗体及其使用方法。

Description

抗IL-4抗体和双特异性抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年4月5日提交的美国临时申请号61/808,748的优选权利益，其公开内容整体合并入本文作为参考。
序列表
本申请包括通过EFS-Web提交的序列表，该序列表在此整体引入作为参考。在2014年三月12日创建的所述ASCII副本命名为2014.MAR.12P5609R1-WO_SL并且大小是75,442比特。
技术领域
本发明涉及抗IL-4抗体和双特异性抗体及其使用方法。
背景技术
哮喘是一种复杂疾病，全球发病率日益增加。除了其他事件，嗜酸性粒细胞炎症已在哮喘患者的气道中报道。该疾病的病理生理学具有如下特征：变化的气流阻塞、气道炎症、粘液分泌过多和上皮下纤维化。临床上，患者可以呈现咳嗽、哮鸣和呼吸短促。虽然许多患者用目前可得的疗法足够治疗，但一些哮喘患者尽管使用目前疗法仍具有持续性疾病。
许多研究已经提示在哮喘和变态反应的发病机理中牵涉IL-4、IL-13及其受体(参见,例如,Wills-Karp,2004,Immunol.Rev.202,175–190；Brightling等,2010,Clin.Exp.Allergy40,42–49；Finkelman等,2010,JImmunol184,1663–1674；Maes等,2012,Am.J.Respir.CellMol.Biol.47,261–270；SteinkeandBorish,2001,Respir.Res.2,66–70)。IL-4结合两个受体，一个是IL-4Rα和共同γ链(γc)的异二聚体，另一是IL-4受体α(IL-4Rα)和IL-13受体α1(IL-13Rα1)的异二聚体。后一受体IL-4Rα/IL-13Rα1是与IL-13共享的受体，IL-13也独特地结合由IL-13受体α2(IL-13Rα2)组成的单链受体。IL-4,IL-13,和IL-4Rα基因的多态性与哮喘和变态反应，包括特征例如IgE水平、特应性的流行性、和哮喘疾病的严重性，相关。此外，在哮喘和其它变态性疾病中IL-4、IL-13及其受体的表达增加。而且，在哮喘的临床前模型中，IL-4、IL-13及其受体的中和或缺乏可以改善疾病。
林林总总的用于治疗哮喘的药物在销售中或在开发中。哮喘治疗的众多靶标之一是IL-13。IL-13是由活化的T细胞、NKT细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生的多效性TH2细胞因子，并且它已被强烈提示在临床前模型中牵涉哮喘发病机理。IL-13拮抗剂，包括抗IL-13抗体，之前已经有描述。参见,例如,国际专利申请公布号WO2005/062967。这些抗体也已经被开发用作人类治疗剂。近来，几项研究已经证实抗IL-13单克隆抗体在哮喘治疗中的临床活性(参见,例如,Corren等,2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098；Gauvreau等,2011,Am.J.Respir.Crit.CareMed.183,1007-1014；IngramandKraft,2012,J.AllergyClin.Immunol.130,829-42；Webb,2011,NatBiotechnol29,860-863)。其中，lebrikizumab，一种中和IL-13活性的人源化IgG4抗体，在尽管进行了治疗(对于大多数，使用了吸入皮质类固醇和长效β2-肾上腺素能受体激动剂)但仍保持症状的哮喘患者中，改善了肺功能(Corren等,2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098)。此外，结合IL-13和IL-4的双特异性抗体已有描述。参见,例如,美国申请公布号2010/0226923。
然而，中度至重度哮喘患者仍然需要备选的治疗可选方案。因此，需要鉴定用于治疗哮喘的更佳疗法和用于理解如何治疗哮喘患者的改良方法。
特发性肺纤维化(Idiopathicpulmonaryfibrosis(IPF))是一种限制性肺疾病，特征在于肺实质的进行性间质性纤维化，在美国影响大约100,000名患者(Raghu等,AmJRespirCritCareMed174:810-816(2006))。与IPF相关的该间质性纤维化导致肺功能的进行性丧失，导致大多数患者因呼吸衰竭而死亡。自诊断时起平均存活时间为2-3年(RAGHU等,AMJRESPIRCRITCAREMED183:788-824(2011))。IPF的病因学和关键分子及病理生理学驱动因子未知。经证实在IPF患者中可以延长存活的唯一治疗是肺移植(THABUT等,ANNALSOFINTERNALMEDICINE151:767-774(2009))。然而，肺移植与显著的发病率相关，并非所有IPF患者均适用于该治疗，并且相对缺乏合适的供体肺。尽管进行了许多努力，但迄今仍没有药物疗法被证实可以在随机化、安慰剂对照干预试验中在IPF患者中实质性地延长存活，尽管一些干预看起来可以在一些患者中减慢肺功能下降的速度(RAGHU等,AMJRESPIRCRITCAREMED183:788-824(2011)；RICHELDI等,THENEWENGLANDJ.OFMED.365:1079-1087(2011))。
IL-4和IL-13信号传导在体外可以从许多细胞类型诱导纤维发生反应(fibrogenicresponses)。已经证实，使用IL-4或IL-13处理成纤维细胞可以诱导胶原产生和分化为成肌纤维细胞(myofibroblast)表型(BOROWSKI等,J.BRITISHSOC.ALLERGYCLIN.IMMUNOL.,38:619-628(2008)；HASHIMOTO等,J.ALLERGYCLIN.IMMUNOL.,107:1001-1008(2001)；MURRAY,等,INT.J.BIOCHEM.CELLBIOL.,40:2174-2182(2008)；SAITO等,INTL.ARCHIVESALLERGYIMMUNOL.,132:168-176(2003))。也已经提出，选择性活化(alternativelyactivated)的巨噬细胞，部分地基于其能够产生刺激成纤维细胞和成肌纤维细胞的生长因子例如TGFβ和PDGF，而是纤维发生进程的主要贡献者。IL-4和IL-13是选择性活化的巨噬细胞表型的有力诱导者，并可以至少部分地通过其对这些细胞的活性而驱动纤维发生反应(DOYLE等,EUR.J.IMMUNOL.,24:1441-1445(1994)；SONG等,CELL.IMMUNOL.,204:19-28(2000)；WYNNANDBARRON,SEMINARSLIVERDIS.,30:245-257(2010)。
IL-4和IL-13也可以在体内在多种组织中驱动纤维发生反应。IL-4或IL-13在小鼠肺中的转基因过表达足以诱导胶原蛋白基因表达和显著的上皮下纤维化(Lee等,J.Exper.Med.,194:890-821(2001)；Ma等J.Clin.Invest.,116:1274-1283(2006)；Zhu等,J.Clin.Invest.103:779-788(1999))。此外，许多研究表明IL-4和IL-13在临床前动物模型中作为纤维化驱动者的作用。IL-13被靶向破坏的小鼠或用特异于IL-13的阻断性抗体处理的小鼠在博来霉素-和FITC诱导的肺纤维化模型中表现出减少的胞外基质沉积(BELPERIO等,AM.J.RESPIR.CELLMOL.BIOL.,27:419-427(2002)；KOLODSICK等,J.IMMUNOL.,172:4068-4076(2004)；LIU等,J.IMMUNOL.,173:3425-3431(2004))。类似地，已经证实在博来霉素诱导的肺纤维化模型中IL-4在维持纤维化反应中是重要的(HUAUX等,J.IMMUNOL.,170:2083-2092(2003)。
大量研究得出结论，IL-4和/或IL-13的表达和活性在IPF患者中升高。已经发现，与正常对照相比，在来自IP患者的肺活检样品中IL-4,IL-13和IL-4/IL-13受体亚基的表达在mRNA和蛋白质两个水平上均增加(JAKUBZIAK等,J.CLIN.PATHOL.,57:477-486(2004))。值得注意的是，在该研究中，在IPF活检物中通过免疫组织化学发现IL-13Rα2——被IL-4或IL-13信号传导高度诱导的基因(DAVID等,ONCOGENE,22:2286-3394(2003))——在成纤维病灶中表达，提示在这些细胞中活跃的IL-4或IL-13信号传导。还发现，与正常对照相比，在IPF患者的支气管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13升高。值得注意的是，这些样品中的IL-13水平与肺功能的关键量度——预计的FVC和DLCO百分数(PARK等,J.KOREANMED.SCI.,24:614-620(2009))——负相关。
IPF患者仍然需要替代性治疗可选方案。因此，需要鉴定用于治疗IPF的更佳疗法和用于理解如何治疗IPF患者的改良方法。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，为了任何目的整体引入此处作为参考。
发明概述
在一些实施方案中，提供多特异性抗体，其中该多特异性抗体包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含特异地结合IL-4的第一VH/VL单位和特异地结合IL-13的第二VH/VL单位。在一些实施方案中，多特异性抗体：
a)抑制IL-4与IL-4受体α(IL-4Rα)的结合，
b)在体外抑制IL-4-诱导的细胞增殖，和/或
b)在体外抑制IL-13-诱导的细胞增殖。
在一些实施方案中，多特异性抗体的第一VH/VL单位包括包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2。在一些实施方案中，第一VH/VL单位包括包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方案中，第一VH/VL单位包括包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，第一VH/VL单位包括：(a)与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)的VH序列和(b)的VL序列。在一些实施方案中，第一VH/VL单位包含选自SEQIDNOs:1和3至9的VH序列。在一些实施方案中，第一VH/VL单位包含选自SEQIDNOs:2、10和11的VL序列。在一些实施方案中，第一VH/VL单位包含SEQIDNO:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列。
在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体的第二VH/VL单位可以包含：(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；或(b)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体的第二VH/VL单位可以包含：(a)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；或(b)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体的第二VH/VL单位可以包含：(a)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3；或(b)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体的第二VH/VL单位可以包含：(a)与SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)的VH序列和(b)的VL序列；(d)与SEQIDNO:49的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(e)与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(f)(d)的VH序列和(e)的VL序列。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体的第二VH/VL单位可以包含SEQIDNO:19、56、或49的VH序列。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体的第二VH/VL单位可以包含SEQIDNO:20,57,或48的VL序列。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体的第二VH/VL单位可以包含SEQIDNO:19或56的VH序列和SEQIDNO:20或57的VL序列；或SEQIDNOs:49的VH序列和SEQIDNO:48的VL序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体与包含SEQIDNOs:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列的抗体竞争结合IL-4。在一些实施方案中，多特异性抗体与包含SEQIDNOs:19的VH序列和SEQIDNO:20的VL序列的抗体，或与包含SEQIDNOs:49的VH序列和SEQIDNO:48的VL序列的抗体，竞争结合IL-13。一些实施方案中，多特异性抗体结合SEQIDNO:29的氨基酸77至89中的、或SEQIDNO:29的氨基酸82至89中的表位。
在一些实施方案中，提供多特异性抗体，其包含特异地结合IL-4的第一VH/VL单位和特异地结合IL-13的第二VH/VL单位，其中第一VH/VL单位包含SEQIDNO:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列，且第二VH/VL单位包含SEQIDNOs:19的VH序列和SEQIDNO:20的VL序列。
在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体可以是IgG抗体。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体可以是IgG1或IgG4抗体。在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体可以是IgG4抗体。
在本文所述任何实施方案中，多特异性抗体可以包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中第一重链恒定区包含杵(knob)突变，第二重链恒定区包含臼(hole)突变。一些实施方案中，第一重链恒定区与结合IL-4的VH/VL单位的重链可变区部分融合。一些实施方案中，第二重链恒定区与结合IL-13的VH/VL单位的重链可变区部分融合。一些实施方案中，第一重链恒定区与结合IL-13的VH/VL单位的重链可变区部分融合。一些实施方案中，第二重链恒定区与结合IL-4的VH/VL单位的重链可变区部分融合。
一些实施方案中，多特异性抗体是包含杵突变的IgG1抗体，所述杵突变包含T366W突变。一些实施方案中，多特异性抗体是包含臼突变的IgG1抗体，所述臼突变包含选自T366S,L368A,和Y407V的至少一个、至少两个、或三个突变。一些实施方案中，多特异性抗体是包含杵突变的IgG4抗体，所述杵突变包含T366W突变。一些实施方案中，多特异性抗体是包含臼突变的IgG4抗体，所述臼突变包含选自T366S,L368A,和Y407V的至少一个、至少两个、或三个突变。在一些实施方案中，多特异性抗体包含含有SEQIDNO:34或SEQIDNO:36的序列的第一重链恒定区。在一些实施方案中，多特异性抗体包含含有SEQIDNO:35或SEQIDNO:37的序列的第二重链恒定区。
一些实施方案中，提供多特异性抗体，其中该抗体包含含有SEQIDNO:38的序列的第一重链、含有SEQIDNO:39的序列的第一轻链、含有SEQIDNO:40的序列的第二重链、含有SEQIDNO:41的序列的第二轻链。
在一些实施方案中，提供与IL-4结合的分离的抗体。在一些实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；或(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；或(c)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；或(d)与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或(e)与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；在一些实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体包括与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列。在一些实施方案中，抗体包含选自SEQIDNOs:1和3至9的VH序列。在一些实施方案中，抗体包含选自SEQIDNOs:2、10和11的VL序列。
在一些实施方案中，提供结合IL-4的分离的抗体，其中该抗体包含SEQIDNOs:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列。
在一些实施方案中，提供编码本文所述任何双特异性抗体或分离抗体的分离核酸。在一些实施方案中，提供编码本文所述任何多特异性抗体的第一VH/VL单位的分离核酸。在一些实施方案中，提供编码本文所述任何多特异性抗体的第二VH/VL单位的分离核酸。一些实施方案中，提供包含分离核酸的宿主细胞。一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞或CHO细胞。一些实施方案中，提供产生抗体的方法，包括培养宿主细胞。
在一些实施方案中，提供免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含本文所述任何多特异性抗体或分离抗体和细胞毒性剂。
在一些实施方案中，提供药物制剂，其包含本文所述任何多特异性抗体或分离抗体和可药用载体。
一些实施方案中，提供本文所述抗体用作药物。一些实施方案中，提供本文所述抗体用于治疗嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、IL-4介导的病症、或呼吸病症。一些实施方案中，提供本文所述抗体用于制备治疗嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、IL-4介导的病症、或呼吸病症的药物的用途。一些实施方案中，提供在个体中治疗嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、IL-4介导的病症、或呼吸病症的方法，包括向个体施用有效量的本文所述抗体。在一些此类实施方案中，方法还包括向个体施用TH2途径抑制剂。在一些实施方案中，TH2途径抑制剂抑制选自以下的至少一个靶标：ITK,BTK,IL-9,IL-5,IL-13,IL-4,OX40L,TSLP,IL-25,IL-33,IgE,IL-9受体,IL-5受体,IL-4受体α,IL-13受体α1,IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα,IL17RB,ST2,CCR3,CCR4,CRTH2,FcεRI,FcεRII/CD23,Flap,Syk激酶；CCR4,TLR9,CCR3,IL5,IL3,和GM-CSF。在一些实施方案中，个体患有中度至重度哮喘。在一些实施方案中，个体患有特发性肺纤维化。
在本文所述任何实施方案中，嗜酸性粒细胞病症可以选自：哮喘(asthma)、重度哮喘(severeasthma)、慢性哮喘(chronicasthma)、特应性哮喘(atopticasthma)、特应性皮炎(atopicdermatitis)、变态反应(allergy)、变应性鼻炎(allergicrhinitis)、非变应性鼻炎(non-allergicrhinitis)、接触性皮炎(contactdermatitis)、多形红斑(erythemamultiform)、大疱皮肤病(bullousskindisease)、银屑病(psoriasis)、湿疹(eczema)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、幼年慢性关节炎(juvenilechronicarthritis)、慢性嗜酸性肺炎(chroniceosinophilicpneumonia)、变应性支气管肺曲霉病(allergicbronchopulmonaryaspergillosis)、腹腔疾病(coeliacdisease)、丘斯综合征(Churg-Strausssyndrome)(特应性结节性动脉外膜炎(periarteritisnodosaplusatopy))、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(eosinophilicmyalgiasyndrome)、嗜酸性粒细胞增多综合征(hypereosinophilicsyndrome)、水肿反应(oedematousreactions),包括周期性血管性水肿(episodicangiodema)、蠕虫感染(helminthinfections)、荨麻疹(urticaria)、盘尾丝虫皮炎(onchocercaldermatitis)、嗜酸性粒细胞相关胃肠道病症、嗜酸性粒细胞性食管炎(eosinophilicesophagitis)、嗜酸性粒细胞性胃炎(eosinophilicgastritis)、嗜酸性粒细胞性胃肠炎(eosinophilicgastroenteritis)、嗜酸性粒细胞性肠炎(eosinophilicenteritis)、嗜酸性粒细胞性结肠炎(eosinophiliccolitis)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、惠普尔病(Whipple’sdisease)、鼻微息肉病(nasalmicropolyposis)、鼻息肉病(nasalpolyposis)、阿司匹林不耐受(aspirinintolerance)、阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructivesleepapnea)、局限性回肠炎(Crohn'sdisease)、硬皮病(scleroderma)、心肌内膜纤维化(endomyocardialfibrosis)、纤维化(fibrosis)、炎性肠病(inflammatoryboweldisease)、特发性间质性肺炎(idiopathicinterstitialpneumonia)、嗜酸性肺炎(eosinophilicpneumonia)、超敏性肺炎(hypersensitivitypneumonitis)、杯状细胞化生(gobletcellmetaplasia)、肺纤维化(pulmonaryfibrosis)、特发性肺纤维化(IPF)、硬化症继发的肺纤维化(pulmonaryfibrosissecondarytosclerosis)、慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)、肝纤维化(pulmonaryfibrosis)、眼色素层炎(uveitis)、癌症、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkinslymphoma)、和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma)。一些实施方案中，IL-13介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。一些实施方案中，IL-4介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。在本文所述任何实施方案中，呼吸病症可以选自：哮喘(asthma),变应性哮喘(allergicasthma),非变应性哮喘(non-allergicasthma),支气管炎(bronchitis),慢性支气管炎(chronicbronchitis),慢性阻塞性肺疾病(COPD),肺气肿(emphysema),香烟诱导的肺气肿(cigarette-inducedemphysema),气道炎症(airwayinflammation),囊性纤维化(cysticfibrosis),肺纤维化(pulmonaryfibrosis),变应性鼻炎(allergicrhinitis),和支气管扩张(bronchiectasis)。
附图简述
图1显示，抗体19C11是IL-4受体激活的有力拮抗剂，见实施例2的描述。(A)19C11阻断IL-4与固定化IL-4Rα的结合。19C11(实心圆),对照IgG(空心方块),无IgG(空心三角)。B)19C11抗体抑制IL-4-诱导的TF-1细胞增殖。19C11(实心圆),对照IgG(空心方块),无IgG(空心三角),无IL-4添加(实心三角)。
图2显示，在大肠杆菌中作为IgG1-同种型产生的抗-IL-13.杵和抗-IL-4.臼的(A)未还原的和(B)还原的样品的Western印迹，见实施例4描述。片段名称为重链(H)和轻链(L)，泳道标记物是M(分子量标准)和C(对照，无抗体表达质粒)。图2还显示免疫印迹，比较抗-IL-13.杵(C)和抗-IL-4.臼(D)的不同同种型和突变，见实施例5描述。上方小图显示非还原条件，显示组装的半抗体(HL)；而下方小图显示还原条件，证实对于所有变体均合成了相似量的重链和轻链。
图3显示对双特异性抗体的分析性表征，见实施例6描述。(A)组装的双特异性抗体的大小排阻层析。插入的小图显示相同图在高分子量区域上的放大视图。(B)组装的双特异性抗体的非还原CE-SDSPAGE证实了铰链二硫键的形成和链间二硫键的完整性。主峰区域对应于具有形成的链间二硫键的完整抗体。少数次峰反映缺乏全部链间二硫键以稳定异源二聚体的完整抗体。(C)还原性CE-SDS证实了存在轻链和重链的预期分布并显示了该物质的纯度。除了完整轻链和重链的主峰，仅检测到痕量峰。
图4显示，完整(A)IgG1-,(B)IgG4-和(C)IgG4R409K-同种型基的双特异性抗体的ESI-TOF质谱分析，见实施例6描述。
图5显示，针对人IL-4-(A),人IL-13-(B),或人IL-4/IL-13-(C)诱导的增殖，抗-IL-4/IL-13IgG1同种型和抗-IL-4/IL-13IgG4-同种型双特异性抗体的剂量依赖性抑制作用，见实施例8描述。抗-IL-4/IL-13IgG1-同种型(实心圆),抗-IL-4/IL-13IgG4同种型(空心三角)、无抗体添加(空心方块),无细胞因子和抗体添加(实心方块)。
图6显示，针对食蟹猴(cynomolgusmonkey)IL-4-(A),食蟹猴IL-13-(B)诱导的增殖，抗-IL-4/IL-13IgG1同种型和抗-IL-4/IL-13IgG4-同种型双特异性抗体的剂量依赖性抑制作用，见实施例8描述。抗-IL-4/IL-13IgG1-同种型(实心圆),抗-IL-4/IL-13IgG4同种型(在(A)中实心圆，在(B)中空心三角)、无抗体添加(空心方块),无细胞因子和抗体添加(实心方块)。
图7显示，在食蟹猴中单剂静脉内或皮下施用后，血清抗-IL-4/IL-13IgG4(A)和IgG1(B)双特异性抗体浓度的平均值(±SD)，见实施例9描述。ELISA的量化限(LOQ)是0.078μg/mL。使用LOQ以上的所有数据，排除LOQ以下的所有数据。当n≤2时，未计算SD。
图8显示，在向食蟹猴静脉内施用后，抗-IL-4/IL-13IgG4和抗-IL-4/IL-13IgG1抗体的支气管肺泡灌洗(BAL)液浓度和上皮衬液(epithelialliningfluid(ELF))浓度，其中所述食蟹猴用A.suum提取物进行了攻击以引发类似暴露于变应原的哮喘患者的变应性炎症反应，见实施例10描述。对于抗-IL-4/IL-13，ELISA的量化限(LOQ)是0.078μg/mL。使用LOQ以上的所有数据，排除LOQ以下的所有数据。当n≤2时，未计算SD。
图9显示(A)用于治疗变应性气道炎症和哮喘小鼠模型的研究设计，见实施例11描述。图9也显示，在各种处理后在变应性气道炎症和哮喘小鼠模型动物中，(B)肺嗜酸性粒细胞数,(C)支气管肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞数,(D)抗原特异性IgE水平,和(E)血清TARC水平，见实施例11描述。对于每个条形图，头4个柱从左向右为：对照处理、抗-IL-4抗体处理、抗-IL-13抗体处理、和抗-IL-4/IL-13双特异性抗体处理。第五和第六个柱，如果存在的话，是幼稚(naive)小鼠。
图10显示，人κ1轻链可变区共有序列(SEQIDNO:61)、mu19C11抗体轻链可变区(SEQIDNO:2)、和19C11-κ1嫁接轻链可变区(SEQIDNO:10)的氨基酸序列，见实施例3描述。根据Kabat进行位置编号，从mu19C11嫁接到可变轻链κI共有构架上的高变区被加框。
图11显示，人κ3轻链可变区共有序列(SEQIDNO:62)、mu19C11抗体轻链可变区(SEQIDNO:2)、和19C11-κ3嫁接轻链可变区(SEQIDNO:11)的氨基酸序列，见实施例3描述。根据Kabat进行位置编号，从mu19C11嫁接到可变轻链κI共有构架上的高变区被加框。
图12显示，人VH1重链可变区共有序列(SEQIDNO:63)、mu19C11抗体重链可变区(SEQIDNO:1)、和19C11-VH1嫁接物(SEQIDNO:3)、19C11-VH1.L(SEQIDNO:4)、和19C11-VH1.FFL(SEQIDNO:5)重链可变区的氨基酸序列，见实施例3描述。根据Kabat进行位置编号，从mu19C11嫁接到可变重链亚组I共有构架上的高变区和vernier位置被加框。
图13显示，人VH3重链可变区共有序列(SEQIDNO:64)、mu19C11抗体重链可变区(SEQIDNO:1)、和19C11-VH3嫁接物(SEQIDNO:6)、19C11-VH3.FLA(SEQIDNO:7)、19C11-VH3.LA(SEQIDNO:8)和19C11-VH3.LA.SV(SEQIDNO:9)重链可变区的氨基酸序列，见实施例3描述。根据Kabat进行位置编号，从mu19C11嫁接到可变重链亚组I共有构架上的高变区和vernier位置被加框。
图14显示人源化抗体对IL-4的表面等离子体共振(SPR)亲合力测量表，见实施例3描述。
图15显示，生物素化的人IL-4与人IL-4R的结合被递增浓度的抗-IL-4/IL-13双特异性抗体抑制的曲线图，见实施例7描述。
图16显示，生物素化的人IL-13与人IL-13Rα1的结合被递增浓度的抗-IL-4/IL-13双特异性抗体抑制的曲线图，见实施例7描述。
图17显示，生物素化的人IL-13与人IL-13Rα2的结合被递增浓度的抗-IL-4/IL-13双特异性抗体抑制的曲线图，见实施例7描述。
图18显示，在抗-IL-4/IL-13双特异性抗体存在下IL-13与人IL-13Rα2结合的SPR传感图(sensograms)，见实施例7描述。显示的线条表示受体从12.5nM至200nM的二倍浓度系列。
发明详述
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY2NDED.,J.WILEY&SONS(NEWYORK,N.Y.1994),和MARCH,ADVANCEDORGANICCHEMISTRYREACTIONS,MECHANISMSANDSTRUCTURE4THED.,JOHNWILEY&SONS(NEWYORK,N.Y.1992)，为本领域技术人员提供有关本申请使用的许多术语的一般指导。
一些定义
为了解释本说明书的目的，将应用下述定义，并且在合适时，以单数使用的术语也涵盖复数形式，并且反之亦然。当下文给出的任何定义与引入本文作为参考的任何文献发生冲突时，以下文给出的定义为准。
如本说明书和后附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“a”、“an”和“the”涵盖对复数形式的提及。因此，例如，提及“蛋白质”或“抗体”分别涵盖多个蛋白质或抗体；提及”细胞”包括细胞的混合物等。
如本文使用的术语“生物样品”包括但不限于血液、血清、血浆、痰、支气管肺泡灌洗液、组织活检物(例如肺样品)、和鼻样品，包括鼻拭子或鼻息肉。
FENO测定法指测量FENO(呼出气一氧化氮分数)水平的测定法。此水平可以使用例如手提式便携装置NIOXMINOTM.(Aerocrine，Solna，瑞典)，依照在2005年由AmericanThoracicSociety(ATS)公开的指南，进行评估。FENO可以记为其他相似方式例如FeNO或FENO，并且应当理解所有这些相似的变化形式具有相同含义。
哮喘是一种复杂病症，具有如下特征：变化和复发的症状、可逆的气流阻塞(例如通过支气管扩张剂)和支气管高反应性，其可以与潜在的炎症相关或不相关。哮喘的例子包括，阿司匹林敏感性/恶化的哮喘、特应性哮喘、重度哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未接受过皮质类固醇的哮喘(corticosteroidasthma)、慢性哮喘、皮质类固醇抵抗哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新近诊断且未治疗的哮喘、吸烟引起的哮喘、在皮质类固醇应用时得不到控制的哮喘、和如JAllergyClinImmunol(2010)126(5):926-938中提及的其他哮喘。
“嗜酸性粒细胞病症”意指，与过量嗜酸性粒细胞数目相关的病症，其中由于身体局部或全身的嗜酸性粒细胞水平或活性，可以表现为非典型症状。与过量嗜酸性粒细胞数目或活性相关的病症包括但不限于，哮喘(包括阿司匹林敏感性哮喘、慢性哮喘和重度哮喘)；特应性哮喘；特应性皮炎；变态反应；变应性鼻炎(包括季节性变应性鼻炎)；非变应性鼻炎；接触性皮炎(contactdermatitis)；多形红斑(erythemamultiform)；大疱皮肤病(bullousskindiseases)；银屑病(psoriasis)；湿疹(eczema)；类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)；幼年慢性关节炎(juvenilechronicarthritis)；慢性嗜酸性肺炎(chroniceosinophilicpneumonia)；变应性支气管肺曲霉病(allergicbronchopulmonaryaspergillosis)；腹腔疾病(coeliacdisease)；丘斯综合征(Churg-Strausssyndrome)(特应性结节性动脉外膜炎(periarteritisnodosaplusatopy))；嗜酸粒细胞增多肌痛综合征(eosinophilicmyalgiasyndrome)；嗜酸性粒细胞增多综合征(hypereosinophilicsyndrome)；水肿反应(oedematousreactions),包括周期性血管性水肿(episodicangiodema)；蠕虫感染(helminthinfections)；荨麻疹(urticaria)；盘尾丝虫皮炎(onchocercaldermatitis)；嗜酸性粒细胞相关胃肠道病症(EGID(包括但不限于，嗜酸性粒细胞性食管炎(eosinophilicesophagitis)、嗜酸性粒细胞性胃炎(eosinophilicgastritis)、嗜酸性粒细胞性胃肠炎(eosinophilicgastroenteritis)、嗜酸性粒细胞性肠炎(eosinophilicenteritis)、和嗜酸性粒细胞性结肠炎(eosinophiliccolitis))；溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)；惠普尔病(Whipple’sdisease)；鼻微息肉病(nasalmicropolyposis)和息肉病(polyposis)；阿司匹林不耐受(aspirinintolerance)；阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructivesleepapnea)；局限性回肠炎(Crohn'sdisease)；硬皮病(scleroderma)；心肌内膜纤维化(endomyocardialfibrosis)；癌症(例如，成胶质细胞瘤(glioblastoma)(例如，多形性成胶质细胞瘤)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkinslymphoma))；纤维化(fibrosis)；炎性肠病(inflammatoryboweldisease)；特发性间质性肺炎(idiopathicinterstitialpneumonia)；嗜酸性肺炎(eosinophilicpneumonia)；超敏性肺炎(hypersensitivitypneumonitis)；杯状细胞化生(gobletcellmetaplasia)；肺纤维化(pulmonaryfibrosis)(包括特发性肺纤维化(IPF)和硬化症继发的肺纤维化(pulmonaryfibrosissecondarytosclerosis))；慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)；肝纤维化(hepaticfibrosis)；和眼色素层炎(uveitis)。嗜酸性粒细胞衍生的分泌产物也已与以下关联：肿瘤中血管发生和结缔组织形成的促进、在病状例如慢性哮喘、局限性回肠炎、硬皮病和心肌内膜纤维化中可见的纤维化反应(MUNITZA,LEVI-SCHAFFERF.ALLERGY2004；59:268-75,ADAMKO等ALLERGY2005；60:13-22,OLDHOFF,等ALLERGY2005；60:693-6)。
IL-13介导的病症意指与过量IL-13水平或活性相关的病症，其中由于身体局部和/或全身的IL-13水平或活性，可以表现为非典型症状。IL-13介导的病症的例子包括：癌症(例如非霍奇金淋巴瘤、成胶质细胞瘤)、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症(包括肺纤维化例如IPF)、COPD、和肝纤维化。
IL-4介导的病症意指与过量IL-4水平或活性相关的病症，其中由于身体局部和/或全身的IL-4水平或活性，可以表现为非典型症状。IL-4介导的病症的例子包括：癌症(例如非霍奇金淋巴瘤、成胶质细胞瘤)、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症(包括肺纤维化例如IPF)、COPD、和肝纤维化。
哮喘样症状包括选自下述的症状：呼吸短促、咳嗽(痰产生和/或痰质量和/或咳嗽频率的变化)、哮鸣、胸闷、支气管狭窄(bronchioconstriction)和归因于上述症状之一或这些症状的组合的夜间觉醒(JUNIPERETAL(2000)AM.J.RESPIR.CRIT.CAREMED.,162(4),1330-1334.)。
术语“呼吸病症”包括但不限于，哮喘(例如变应性和非变应性哮喘(例如，由于感染，例如呼吸道合胞病毒(RSV)感染，例如在幼儿中))；支气管炎(例如慢性支气管炎)；慢性阻塞性肺疾病(COPD)(例如肺气肿(例如香烟诱导的肺气肿)；涉及气道炎症、嗜酸性粒细胞增多症、纤维化和过量粘液产生的状况，例如囊性纤维化、肺纤维化和变应性鼻炎。可以具有气道炎症、过量气道分泌物和气道阻塞的特征的疾病的例子包括，哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张和囊性纤维化。
恶化(通常被称为哮喘发作或急性哮喘)是下述状况的新的或进行性增加的事件：呼吸短促、咳嗽(痰产生和/或痰质量和/或咳嗽频率的变化)、哮鸣、胸闷、归于上述症状之一或这些症状的组合的夜间觉醒。恶化常特征在于：呼出气流(PEF或FEV1)的减少。然而，PEF变异性在恶化过程中通常不增加，但它可以增加从而导致自恶化的恢复、或它可以在从恶化恢复的过程中增加。恶化的严重性可以从轻度到威胁生命，并且可以基于症状和肺功能两者进行评估。如本文描述的重度哮喘恶化包括导致下述之任一或组合的恶化：随后的住院哮喘治疗、高皮质类固醇使用(例如翻两番皮质类固醇日总剂量、或大于或等于500微克FP或等价物的日总剂量持续连续三天或更多天)、或经口/肠胃外皮质类固醇使用。
“TH2途径抑制剂”或“TH2抑制剂”是抑制TH2途径的活性剂。TH2途径抑制剂的例子包括选自下述的任何一种靶标的活性的抑制剂：ITK、BTK、IL-9(例如MEDI-528)、IL-5(例如美泊利单抗，CAS编号196078-29-2；resilizumab)、IL-13(例如IMA-026、IMA-638(也称为安芦珠单抗，INN编号910649-32-0；QAX-576；IL4/IL13阱)、tralokinumab(也称为CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称为人源化13C5.5抗体)、IL-4(例如AER-001、IL4/IL13阱)、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33和IgE(例如XOLAIR、QGE-031；MEDI-4212)；和受体例如：IL-9受体、IL-5受体(例如MEDI-563(贝那利珠单抗，CAS编号1044511-01-4))、IL-4受体α(例如AMG-317、AIR-645)、IL-13受体α1(例如R-1671)和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的共受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE的受体)、Flap(例如GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)，和CCR3、IL5、IL3、GM-CSF的多细胞因子抑制剂(例如TPIASM8)。上述靶标的抑制剂的例子公开于例如WO2008/086395；WO2006/085938；US7,615,213；US7,501,121；WO2006/085938；WO2007/080174；US7,807,788；WO2005007699；WO2007036745；WO2009/009775；WO2007/082068；WO2010/073119；WO2007/045477；WO2008/134724；US2009/0047277；和WO2008/127,271中。
术语“小分子”指具有50道尔顿–2500道尔顿的分子量的有机分子。
术语“抗体”以最广泛含义使用且特别涵盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体、单链抗体、多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合、人源化、人和合成的。此类抗体和生成其的方法在下文更详细地描述。
术语“多特异性抗体”以最广的含义使用，尤其涵盖包含具有多表位特异性(即，能够特异地结合一个生物分子上的两个或更多个不同表位或能够特异地结合两个或更多个不同生物分子上的表位)的抗原结合结构域的抗体。一些实施方案中，多特异性抗体(例如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单位，其中第一VH/VL单位特异地结合第一表位，第二VH/VL单位特异地结合第二表位，其中每个VH/VL单位均包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。此类多特异性抗体包括，但不限于，全长抗体、具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段例如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体(diabody)、双特异性双抗体和三抗体(triabody)、已共价或非共价连接的抗体片段。还包含至少一部分重链恒定区和/或至少一部分轻链恒定区的VH/VL单位也可以称作“hemimer”或“半抗体”(halfantibody)。根据一些实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM、或0.1μM至0.001pM的亲和力与每个表位结合的IgG抗体。一些实施方案中，hemimer包含足以允许与第二hemimer形成分子内二硫键的重链可变区部分。一些实施方案中，hemimer包含杵突变或臼突变，例如，以允许与包含互补臼突变或杵突变的第二hemimer或半抗体异二聚体化。杵突变和臼突变将在下面进一步讨论。
“双特异性抗体”是包含能够特异地结合一个生物分子上的两个不同表位或能够特异地结合两个不同生物分子上的表位的抗原结合结构域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也可以称作具有“双重特异性”或是“双重特异性的”。
如此处提及的术语“杵入臼”(“Knob-into-hole”)或“KnH”技术是指这样的技术，即通过在两个多肽相互作用的界面上将突出物(protuberance)(杵)引入一条多肽并将腔(臼(hole))引入另一条多肽，从而引导两条多肽在体外或体内配对在一起。例如，已将KnH引入到抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(参见,例如,US2011/0287009,US2007/0178552,WO96/027011,WO98/050431,和ZHU等,1997,PROTEINSCIENCE6:781-788)。在一些实施方案中，在制备多特异性抗体的过程中KnHs驱动两条不同重链配对在一起。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体还可以包含与各Fc区分别连接的单可变域，或还可以包含与相似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。KnH技术也可用于配对两个不同受体胞外域或含有不同靶识别序列的任何其他多肽序列(例如，包括affibody、肽体(peptibody)和其他Fc融合物)。
如本文所用，术语“杵突变”指，将突出物(杵)引入多肽中的突变，其中所述突出物被引入到该多肽与另一条多肽相互作用的界面上。一些实施方案中，另一多肽具有臼突变。
如本文所用，术语“臼突变”指，将腔(臼)引入多肽中的突变，其中所述腔被引入到该多肽与另一条多肽相互作用的界面上。一些实施方案中，另一多肽具有杵突变。
术语“治疗剂”指用于治疗疾病的任何活性剂。治疗剂可以是，例如，多肽(一或多种)(例如抗体、免疫粘附素或肽体(peptibody))、可以与蛋白质结合的适体或小分子、或可以与编码靶标的核酸分子结合的核酸分子(即，siRNA)、等等。
术语“控制剂”或“防止剂”指用于控制哮喘炎症的任何治疗剂。控制剂的例子包括皮质类固醇、白三烯受体拮抗剂(例如抑制白三烯的合成或活性，例如孟鲁司特(montelukast)、齐留通(zileuton)、普仑司特(pranlukast)、扎鲁司特(zafirlukast))、LABAs、皮质类固醇/LABA联合组合物、茶碱(包括氨茶碱(aminophylline))、色甘酸钠(cromolynsodium)、萘多罗米钠(nedocromilsodium)、奥马珠单抗(omalizumab)、LAMAs、MABA(例如双功能毒蕈碱拮抗剂-β2激动剂)、5-脂加氧酶活化蛋白质(FLAP)抑制剂、和酶PDE-4抑制剂(例如罗氟司特(roflumilast))。“第二控制剂”典型地指与第一控制剂不同的控制剂。
术语“省皮质类固醇的”或“CS”意指，在服用皮质类固醇治疗疾病的患者中，由于另一种治疗剂的施用，减少了用于治疗该疾病的皮质类固醇的频率和/或量、或消除了对皮质类固醇的使用。“CS剂”指可以在服用皮质类固醇的患者中引起CS的治疗剂。
术语“皮质类固醇”包括但不限于，氟替卡松(fluticasone)(包括丙酸氟替卡松(FP))、倍氯米松(beclometasone)、布地奈德(budesonide)、环索奈德(ciclesonide)、莫米他松(mometasone)、去氟肤轻松(flunisolide)、倍他米松(betamethasone)和曲安西龙(triamcinolone)。“可吸入皮质类固醇”意指适于通过吸入递送的皮质类固醇。示例性可吸入皮质类固醇是氟替卡松、二丙酸倍氯米松、布地奈德、糠酸莫米他松(mometasonefuroate)、环索奈德、去氟肤轻松、醋酸曲安缩松(TriamcinoloneAcetonide)、和目前可获得或将来可获得的任何其他皮质类固醇。可以吸入且与长效β2-激动剂组合的皮质类固醇的例子包括但不限于：布地奈德/福莫特罗(formoterol)和氟替卡松/沙美特罗(salmeterol)。
皮质类固醇/LABA组合药物的例子包括糠酸氟替卡松/三氟甲磺酸维兰特罗(vilanteroltrifenatate)和茚达特罗(indacaterol)/莫米他松。
术语“LABA”意指长效β2-激动剂，所述激动剂包括例如沙美特罗(salmeterol)、福莫特罗(formoterol)、班布特罗(bambuterol)、舒喘灵(albuterol)、茚达特罗、阿福特罗(arformoterol)和克伦特罗(clenbuterol)。
术语“LAMA”意指长效毒蕈碱拮抗剂，所述拮抗剂包括：噻托溴铵(tiotropium)。
LABA/LAMA组合的例子包括但不限于：奥达特罗噻托溴铵(BoehringerIngelheim’s)和茚达特罗glycopyrronium(Novartis)。
术语“SABA”意指短效β-2激动剂，所述激动剂包括但不限于,沙丁胺醇(salbutamol)、左沙丁胺醇(levosalbutamol)、非诺特罗(fenoterol)、特布他林(terbutaline)、吡布特罗(pirbuterol)、丙卡特罗(procaterol)、比托特罗(bitolterol)、利米特罗(rimiterol)、卡布特罗(carbuterol)、妥洛特罗(tulobuterol)和瑞普特罗(reproterol)。
白三烯受体拮抗剂(有时称为leukast)(LTRA)是抑制白三烯的药物。白三烯抑制剂的例子包括孟鲁司特、齐留通、普仑司特和扎鲁司特。
术语“FEV1”指在用力呼气的第一秒内呼出的空气体积。它是气道阻塞的量度。诱导20％的FEV1下降所需的乙酰甲胆碱(methacholine)激发浓度(provocativeconcentration)(PC20)是气道高反应性的量度。FEV1可以以其他相似方式例如FEV1表示，并且应当理解所有这些相似的变化形式具有相同含义。
术语“FEV1的相对变化”＝(在治疗第12周时的FEV1–在治疗开始前的FEV1)除以FEV1。
如本文所用，“FVC”指“用力肺活量”(ForcedVitalCapacity)，指用于测量在完全吸气和最大呼出至残留体积之间肺空气体积变化的标准检查(相对于FEV1中一秒内排出的空气体积)。它是功能性肺容量(functionallungcapacity)的量度。在限制性肺疾病，例如间质性肺疾病包括IPF、超敏性肺炎(hypersensitivitypneumonitis)、结节病(sarcoidosis)、和全身性硬化症(systemicsclerosis)的患者中，典型地由于肺实质的结疤，FVC减少。
术语“轻度哮喘”指患者一般经历每周小于两次的症状或恶化、每月小于两次的夜间症状，并且在两次恶化之间是无症状的。轻度、间歇性哮喘常根据需要用下述进行治疗：吸入性支气管扩张剂(短效吸入β2-激动剂)；已知触发剂的避免；每年流感疫苗接种；每6–10年肺炎球菌疫苗接种，以及在一些情况下，在暴露于鉴定的触发剂前，吸入性β2-激动剂、色甘酸或萘多罗米。如果患者对短效β2-激动剂具有增加的需要(例如对于急性恶化，在1天内使用短效β2-激动剂超过三到四次；或针对症状，每月使用超过一盒(canister))，则患者可能需要治疗的逐步增加。
术语“中度哮喘”一般指这样的哮喘，其中患者经历每周超过两次的恶化,且恶化影响睡眠和活动；患者具有每月超过两次的由哮喘导致的夜间觉醒；患者具有慢性哮喘症状，所述症状每天或每隔一天需要短效吸入β2-激动剂；以及患者的治疗前基线PEF或FEV1是预计的60％–80％，并且PEF变异性是20–30％。
术语“重度哮喘”一般指这样的哮喘，其中患者具有几乎连续的症状、频繁恶化、频繁的由哮喘导致的夜间觉醒、有限的活动、小于预计的60％的PEF或FEV1基线、和20–30％的PEF变异性。
急救药品(rescuemedications)的例子包括舒喘灵(albuterol)、万托林(ventolin)及其他。
“抵抗”指在用治疗剂治疗后几乎未表现出或根本未表现出临床上显著改善的疾病。例如，需要用高剂量ICS(例如，翻两番皮质类固醇总日剂量或大于或等于500微克日总剂量的FP(或等价物))治疗至少连续三天或更多天、或全身皮质类固醇治疗两周试验以确立哮喘是否保持不受控制或FEV1不改善的哮喘，通常被视为重度难治性哮喘。
如本文提供的治疗剂可以通过任何合适的方式进行施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，治疗剂是吸入剂。根据一些实施方案，给药是通过注射例如静脉内或皮下注射给予。在一些实施方案中，治疗剂使用注射器(例如预装或非预装)或自动注射器进行施用。
对于疾病的预防或治疗，治疗剂的合适剂量可以依赖待治疗疾病的类型、疾病的严重性和过程、治疗剂是施用用于预防还是治疗目的、先前治疗、患者的临床史和对治疗剂的应答、和主治医生的判断。治疗剂可以适宜地一次性地或经过一系列治疗而施用于患者。可以以与良好医疗实践相符的方式配制、定剂量和施用治疗剂组合物。在此考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、活性剂递送部位、施用方法、施用时间安排和医学从业者已知的其他因素。
“患者应答”或“应答”(及其语法变体)可以使用指示有益于患者的任何终点进行评价，包括但不限于(1)疾病进展的一定程度抑制，包括减慢和完全停滞，；(2)疾病发作数和/或症状的减少；(3)损伤大小的减少；(4)疾病细胞向邻近周围器官和/或组织浸润的抑制(即减少、减慢或完全停止)；(5)疾病扩散的抑制(即减少、减慢或完全停止)；(6)自身免疫反应的降低，其可以，但不必，导致疾病损伤的消退或消除；(7)与病症相关的一种或多种症状的一定程度缓解；(8)在治疗后无疾病呈现的长度(lengthofdisease-freepresentation)的增加；和/或(9)在治疗后在给定时间点上减少的死亡率。
“亲和力”指在分子(例如抗体)的单个结合位点及其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法，包括本文描述的那些，进行测量。在本文中描述用于测量结合亲和力的特定举例说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指与不具有此类改变的亲本抗体相比较，在一个或多个高变区(HVRs)中具有一个或多个改变的抗体，此类改变导致抗体对于抗原的亲和力的改善。
术语“抗-IL-4抗体”和“结合IL-4的抗体”指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合IL-4从而使抗体可以用作为靶定IL-4的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方案中，例如通过放射免疫测定法(RIA)所测定，抗IL-4抗体对不相关的非IL-4蛋白质的结合程度低于抗体对IL-4结合的约10％。在特定实施方案中，与IL-4结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗IL-4抗体结合在来自不同物种的IL-4间保守的IL-4表位上。在一些实施方案中，抗IL-4抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。
术语“抗-IL-13抗体”和“结合IL-13的抗体”指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合IL-13从而抗体可以用作为靶定IL-13的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方案中，例如通过放射免疫测定法(RIA)所测定，抗IL-13抗体对不相关的非IL-13蛋白质的结合程度低于抗体对IL-13结合的约10％。在特定实施方案中，与IL-13结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗IL-13抗体结合在来自不同物种的IL-13间保守的IL-13表位上。在一些实施方案中，抗IL-13抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需抗原结合活性即可。
“抗体片段”指非完整抗体的分子，其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指，该抗体在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％或更多，且反过来地，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原的结合达50％或更多。示例性竞争测定法在本文中提供。
用于本文目的的“受体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或人共有构架(如下文定义)的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含与其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中重和/或轻链的部分衍生自特定来源或物种，而重和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“类”指抗体重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几个可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同免疫球蛋白类别相对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
如本文使用的术语“细胞毒素剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒素剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如氨甲蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitocycinC)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段例如溶核酶；抗生素；毒素例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应子功能”指可归于抗体的Fc区的那些生物活性，其随着抗体同种型而改变。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
活性剂例如药物制剂的“有效量”指，在所需剂量和时间段，有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其含有恒定区的至少部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号系统，也称为EU索引，见Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，1991中描述。
“构架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。相应地，HVR和FR序列一般以下述顺序在VH(或VL)中出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指外源核酸已引入其内的细胞，包括此细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其衍生的后代，不考虑传代数目。后代可以在核酸内容上与亲本细胞不完全等同，而是可以含有突变。在本文中涵盖具有针对原始转化细胞所筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体后代。
“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于通过人或人细胞产生的抗体或者衍生自如下非人来源的抗体的氨基酸序列，其中所述非人来源利用人抗体库或其他人抗体编码序列。人抗体的这个定义特别地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表在选择的人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常出现的氨基酸残基的构架。一般地，该选择的人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列亚组。一般地，该序列亚组是如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第五版，NIHPublication91-3242，BethesdaMD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一些实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人，同上引文中的亚组κI。在一些实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人，同上引文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定实施方案中，人源化抗体将包含至少一个和一般两个可变结构域的基本上全部，其中HVRs(例如CDRs)的全部或基本上全部对应于非人抗体的，而FRs的全部或基本上全部对应于人抗体的。人源化抗体任选可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”指已经历人源化的抗体。
如本文使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域中在序列上高变(“互补决定区”或“CDRs”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触者”)的各个区域。一般而言，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在本文中，示例性HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位的高变环(CHOTHIAANDLESK,J.MOL.BIOL.196:901-917(1987))；
(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位的高变环(KABAT等,SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST,5THED.PUBLICHEALTHSERVICE,NATIONALINSTITUTESOFHEALTH,BETHESDA,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)位的抗原接触者(MACCALLUM等J.MOL.BIOL.262:732-745(1996))；和
(d)(a),(b),和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。
在一些实施方案中，HVR残基包含图10至13中或在本说明书其它地方鉴定的那些残基。
除非另有所指，HVR残基和可变域中的其他残基(如FR残基)在本文中根据Kabat等(见上引文)编号。
“免疫缀合物”是缀合至一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒素剂，的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物例如猴)、兔和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在特定实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已与其天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已与其天然环境中的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。
“编码抗IL-4抗体的分离核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体中或在分开载体中的此(一个或多个)核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的此(一个或多个)核酸分子。
“编码抗IL-13抗体的分离核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体中或在分开载体中的此(一个或多个)核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的此(一个或多个)核酸分子。
如本文使用的术语“单克隆抗体”指得自基本上同质的抗体群体的抗体，所谓基本上同质的抗体群体是指，除了一般以微小量存在的可能的变体抗体(例如含有天然突变或在单克隆抗体制品的生产过程中出现)外，群体中的各抗体是相同的和/或结合相同的表位。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的一个决定簇。因此，修饰词“单克隆”是指抗体得自基本上同质的抗体群体的特征，并不应解释为要求通过任何特定方法生产该抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法、和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。在一些实施方案中，单克隆抗体为多特异性抗体(例如双特异性)抗体。
“裸抗体”指不缀合至异源部分(例如细胞毒部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N到C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N到C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后为恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链，基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以分至称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型之一。
术语“包装说明书”用于指：习惯上包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有与此治疗产品使用相关的如下信息：适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌和/或警告。术语“包装说明书”也用于指习惯上包括在诊断产品的商业包装中的说明书，其含有关于如下的信息：预期用途、测试原理、试剂的准备和操作、样本的收集和准备、测定法和测定方案的校准、性能和精确度数据，例如测定法的灵敏度与特异性。
相对于参考多肽序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为，在比对参考序列和候选序列且在需要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后，不将任何保守置换考虑为序列同一的部分，在候选序列中与参考多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以在本领域内的多种方法实现，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括为在待比较的序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。然而，对于本文的目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交给美国版权局(U.S.CopyrightOffice)，WashingtonD.C.，20559，其注册为美国版权登记号TXU510087。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California公开获得，或可以由源代码编译。ALIGN-2程序应编译以用于在UNIX操作系统(包括数字UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数通过ALIGN-2程序设置并且不改变。
在ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替代地表达为，与或相对于给定氨基酸序列B，具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
100乘以分数X/Y，
其中X是在ALIGN-2程序的A和B比对中由序列比对程序ALIGN-2评为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中的氨基酸残基的总数目。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值，如紧先前段落中所述，通过ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指这样的制品，该制品的形式使得其中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且不含有对制剂将施用于的受试者具有无法接受的毒性的另外组分。
“药学可接受的载体”指，在药物制剂中除了活性成分外的对受试者无毒的成分。药学可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非另有说明，如本文使用的，术语“IL-4”指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-4，所述脊椎动物来源包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包含“全长”、未加工IL-4，以及由细胞中的加工而产生的任何形式的IL-4。该术语还包含天然存在的IL-4变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-4的氨基酸序列显示在SEQIDNOS:27和28,以及Swiss-Prot登录号P05112.2中。示例性食蟹猴IL-4的氨基酸序列显示在SEQIDNO:33中。
除非另有说明，如本文使用的，术语“IL-13”指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-13，所述脊椎动物来源包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包含“全长”、未加工IL-13，以及由细胞中的加工而产生的任何形式的IL-13。该术语还包含天然存在的IL-13变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-13的氨基酸序列显示在SEQIDNOS:29和30,以及Swiss-Prot登录号P35225.2中。示例性食蟹猴IL-13的氨基酸序列显示在SEQIDNO:32中。
如本文使用的，“治疗”(及其语法变体)指，尝试改变所治疗个体的自然过程的临床干预，其可以执行用于预防或在临床病理学的过程中执行。治疗的期望效应包括但不限于，防止疾病的出现或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态、和缓解或改善预后。在一些实施方案中，抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)一般具有相似结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FRs)和三个高变区(HVRs)。(参见,例如,Kindt等KubyImmunology,6thed.,W.H.FreemanandCo.,page91(2007).)单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库，以分离。参见,例如,Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991).
如本文使用的，术语“载体”指能够扩增与之连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组内的载体。特定载体能够指导与之可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为表达载体”。
组合物和方法
在一些实施方案中，提供与IL-4结合的抗体。在一些实施方案中，提供与IL-4和IL-13结合的双特异性抗体。这些抗体可以用于例如诊断或治疗嗜酸性粒细胞病症，包括呼吸病症(例如哮喘和IPF)、IL-4介导的病症和IL-13介导的病症。
示例性抗IL-4抗体
在一些实施方案中，提供与IL-4结合的分离的抗体。在一些实施方案中，抗IL-4抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR:(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2。一些实施方案中，抗体包含(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，抗体包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，抗体包含(a)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含(a)包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列的VH结构域：(i)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、和(iii)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列的VL结构域：(i)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、和(iii)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，抗IL-4抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗IL-4抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含受体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在一些实施方案中，抗IL-4抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNOS:3至9之任一的FR1,FR2,FR3,和FR4的VH。在一些实施方案中，抗IL-4抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:9的FR1,FR2,FR3,和FR4的VH。在一些实施方案中，抗IL-4抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNOS:10至11之任一的FR1,FR2,FR3,和FR4的VL。在一些实施方案中，抗IL-4抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:10的FR1,FR2,FR3,和FR4的VL。
在一些实施方案中，抗IL-4抗体包含与SEQIDNOS:1和3至9之任一的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列，相对于参考序列，含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-4抗体保留与IL-4结合的能力。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在SEQIDNO:9中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。任选地，抗IL-4抗体包含SEQIDNO:9中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、和(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体，其中所述抗体包含与SEQIDNO:2,10,和11之任一的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在特定实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列，相对于参考序列，含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-4抗体保留与IL-4结合的能力。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在SEQIDNO:10中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。任选地，抗IL-4抗体包含SEQIDNO:10中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQIDNO:9和SEQIDNO:10中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，提供抗体，所述抗体与包含SEQIDNOs:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列的抗IL-4抗体竞争结合IL-4。在一些实施方案中，本发明提供与本文提供的抗IL-4抗体结合相同表位的抗体。例如，在特定实施方案中，提供了与抗IL-4抗体结合相同表位的抗体，其中所述抗IL-4抗体包含SEQIDNO:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列。
在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗IL-4抗体可以是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，抗IL-4抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在一些实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1或IgG4抗体或如本文定义的其他抗体类或同种型。
在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗IL-4抗体可以并入单独或组合的如下文章节1-7中所述的任何特征。
示例性抗IL-13抗体
在一些实施方案中，提供与IL-13结合的分离的抗体。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR:(a)包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3。一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3。一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2。一些实施方案中，抗体包含(a)含有SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，抗体包含(a)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含：(a)包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列的VH结构域：(i)包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2、和(iii)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列的VL结构域：(i)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2、和(iii)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含(a)含有SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，抗IL-13抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含受体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:19的FR1,FR2,FR3,和/或FR4序列的VH。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:20的FR1,FR2,FR3,和/或FR4序列的VL。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:56的FR1,FR2,FR3,和/或FR4序列的VH。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:57的FR1,FR2,FR3,和/或FR4序列的VL。
在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含与SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列，相对于参考序列，含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-13抗体保留与IL-13结合的能力。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在SEQIDNO:19中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含SEQIDNO:19中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含SEQIDNO:56中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2、和(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，提供了抗IL-13抗体，其中所述抗体包含与SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在特定实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列，相对于参考序列，含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-13抗体保留与IL-13结合的能力。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在SEQIDNO:20中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含SEQIDNO:20中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含SEQIDNO:57中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1、(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2、和(c)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，提供了抗IL-13抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含在SEQIDNO:19或SEQIDNO:56中的VH和在SEQIDNO:20或SEQIDNO:57中VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，提供抗体，所述抗体与包含SEQIDNOs:19的VH序列和SEQIDNO:20的VL序列的抗IL-13抗体竞争结合IL-13。在一些实施方案中，本发明提供与本文提供的抗IL-13抗体结合相同的表位的抗体。参见,例如,Ultsch,M.等,StructuralBasisofSignalingBlockadebyAnti-IL-13AntibodyLebrikizumab,J.Mol.Biol.(2013),dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.024.在一些实施方案中，本发明提供与本文提供的抗IL-13抗体结合相同的表位的抗体。例如，在特定实施方案中，提供与抗IL-13抗体结合相同的表位的抗体，其中所述抗IL-13抗体包含SEQIDNO:19的VH序列和SEQIDNO:20的VL序列。一些实施方案中，提供抗体，所述抗体结合人前体IL-13(SEQIDNO:29)的氨基酸63至74中的、或成熟形式的人IL-13(SEQIDNO:30)的氨基酸45至56中的表位，其中所述氨基酸是YCAALESLINVS(SEQIDNO:43)。一些实施方案中，提供抗体，所述抗体结合人前体IL-13(SEQIDNO:29)的氨基酸68至75中的、或成熟形式的人IL-13(SEQIDNO:30)的氨基酸50至57中的表位，其中所述氨基酸是ESLINVSG(SEQIDNO:42)。
另一示例性抗IL-13抗体是11H4及其人源化形式，包括hu11H4v6。Mu11H4包含分别含有SEQIDNOs:45和44的氨基酸序列的重链和轻链可变区。人源化hu11H4v6包含分别含有SEQIDNOs:49和48的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。人源化hu11H4v6包含分别含有SEQIDNOs:47和46的氨基酸序列的重链和轻链。
在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR:(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列:(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。一些实施方案中，抗体包含含有SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2。一些实施方案中，抗体包含(a)含有SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列:(a)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，抗体包含(a)含有SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含：(a)包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列的VH结构域：(i)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2、和(iii)包含选自SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列的VL结构域：(i)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2、和(iii)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，提供抗体，所述抗体包含：(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
在任何上述实施方案中，抗IL-13抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含受体人构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:49的FR1,FR2,FR3,和/或FR4序列的VH。在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含如任何上述实施方案中的HVRs，并且进一步包含含有SEQIDNO:48的FR1,FR2,FR3,和/或FR4序列的VL。
在一些实施方案中，抗IL-13抗体包含与SEQIDNO:49的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列，相对于参考序列，含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-13抗体保留与IL-13结合的能力。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在SEQIDNO:49中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQIDNO:49中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2、和(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施方案中，提供了抗IL-13抗体，其中所述抗体包含与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在特定实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列，相对于参考序列，含有置换(例如保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗IL-13抗体保留与IL-13结合的能力。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在SEQIDNO:48中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQIDNO:48中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1、(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2、和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，提供了抗IL-13抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一些实施方案中，抗体包含分别在SEQIDNO:49和SEQIDNO:48中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，提供抗体，所述抗体与包含SEQIDNOs:49的VH序列和SEQIDNO:48的VL序列的抗IL-13抗体竞争结合IL-13。在一些实施方案中，本发明提供与本文提供的抗IL-13抗体结合相同的表位的抗体。参见,例如,Ultsch,M.等,StructuralBasisofSignalingBlockadebyAnti-IL-13AntibodyLebrikizumab,J.Mol.Biol.(2013),dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2013.01.053.在一些实施方案中，本发明提供与本文提供的抗IL-13抗体结合相同的表位的抗体。例如，在特定实施方案中，提供了与抗IL-13抗体结合相同的表位的抗体，其中所述抗IL-13抗体包含SEQIDNO:49的VH序列和SEQIDNO:48的VL序列。
在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗IL-13抗体可以是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，抗IL-13抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在一些实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1或IgG4抗体或如本文定义的其他抗体类或同种型。
在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗IL-13抗体可以并入单独或组合的如下文章节1-7中所述的任何特征。
示例性抗IL-4/IL-13双特异性抗体
在一些实施方案中，提供包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。一些实施方案中，抗原结合结构域不特异结合其它靶标。结合IL-4和IL-13的多特异性抗体可以包含根据本文中针对抗IL4抗体描述的任何实施方案的第一组可变区(VH和VL；也称作VH/VL单位)和根据本文中针对抗IL13抗体描述的任何实施方案的第二组可变区(VH和VL；也称作VH/VL单位)。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的VH(重链可变结构域)。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的VL(轻链可变结构域)。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的VL。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位与包含含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的VL的抗体竞争结合IL-4。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含含有SEQIDNO:19或SEQIDNO:56的氨基酸序列的VH(重链可变结构域)。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含含有SEQIDNO:20或SEQIDNO:57的氨基酸序列的VL(轻链可变结构域)。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含含有SEQIDNO:19或SEQIDNO:56的氨基酸序列的VH和含有SEQIDNO:20或SEQIDNO:57的氨基酸序列的VL。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位与包含含有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VH和含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的VL的抗体竞争结合IL-13。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位结合由SEQIDNO:29的氨基酸82至89组成的IL-13表位。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位结合由SEQIDNO:29的氨基酸77至89组成的IL-13表位。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含含有SEQIDNO:49的氨基酸序列的VH(重链可变结构域)。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含含有SEQIDNO:48的氨基酸序列的VL(轻链可变结构域)。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含含有SEQIDNO:49的氨基酸序列的VH和含有SEQIDNO:48的氨基酸序列的VL。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位与包含含有SEQIDNO:49的氨基酸序列的VH和含有SEQIDNO:48的氨基酸序列的VL的抗体竞争结合IL-13。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的第一VH和含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的第一VL；且该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含包含SEQIDNO:19或SEQIDNO:56的氨基酸序列的第二VH和含有SEQIDNO:20或SEQIDNO:57的氨基酸序列的第二VL。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的第一VH和含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的第一VL；且包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含含有SEQIDNO:49的氨基酸序列的第二VH和含有SEQIDNO:48的氨基酸序列的第二VL。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VH、和与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VL。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含与SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VH、和与SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VL。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含与SEQIDNO:49的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VH、和与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的VL。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在上述序列中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的第一VH、和与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的第一VL；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含与SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二VH、和与SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二VL。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在上述序列中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的第一VH、和与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％序列同一性的第一VL；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含与SEQIDNO:49的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二VH、和与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二VL。在一些实施方案中，总共1–10个氨基酸已在上述序列中被置换、插入和/或缺失。在特定实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVRs外的区域中(即在FRs中)。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。；一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(e)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的至少一个、至少两个、或所有三个VLHVR序列：(a)含有SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:21或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3。
一些实施方案中，多特异性抗体包含特异地结合IL-4和IL-13的抗原结合结构域，其中该抗体包含第一VH/VL单位，所述第一VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；和第二VH/VL单位，所述第二VH/VL单位包含选自以下的三个VHHVR序列：(a)含有SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3；和选自以下的三个VLHVR：(a)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
在多个实施方案中，多特异性抗体包含第一hemimer和第二hemimer，所述第一hemimer包含结合IL-4的第一VH/VL单位，其中第一hemimer在重链恒定区中包含杵突变，所述第二hemimer包含结合IL-13的第二VH/VL单位，其中第二hemimer在重链恒定区中包含臼突变。在多个实施方案中，多特异性抗体包含第一hemimer和第二hemimer，所述第一hemimer包含结合IL-4的第一VH/VL单位，其中第一hemimer在重链恒定区中包含臼突变，所述第二hemimer包含结合IL-13的第二VH/VL单位，其中第二hemimer在重链恒定区中包含杵突变。在一些实施方案中，包含臼突变的重链恒定区具有SEQIDNO:35(IgG1)或SEQIDNO:37(IgG4)中所示的序列。在一些实施方案中，包含杵突变的重链恒定区具有SEQIDNO:34(IgG1)或SEQIDNO:36(IgG4)中所示的序列。一些实施方案中，多特异性抗体包含第一hemimer和第二hemimer，其中第一hemimer包含具有SEQIDNO:38的序列的第一重链和具有SEQIDNO:39的序列的第一轻链，第二hemimer包含具有SEQIDNO:40或58的序列的第二重链和具有SEQIDNO:41或59的序列的第二轻链。一些实施方案中，多特异性抗体包含第一hemimer和第二hemimer，其中第一hemimer包含具有SEQIDNO:38的序列的第一重链和具有SEQIDNO:39的序列的第一轻链，第二hemimer包含具有SEQIDNO:40的序列的第二重链和具有SEQIDNO:41的序列的第二轻链。
在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗-IL-4/IL-13多特异性抗体可以是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，抗IL-4/IL-13多特异性抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在一些实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1或IgG4抗体或如本文定义的其他抗体类或同种型。
在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗-IL-4/IL-13多特异性抗体可以并入单独或组合的如下文章节1-7中所述的任何特征。
1.抗体亲和力
在一些实施方案中，本文提供的抗体对抗原具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一些实施方案中，Kd通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)进行测量。在一些实施方案中，RIA用目的抗体的Fab形式及其抗原实施。例如，Fabs对于抗原的溶液结合亲和力通过下述进行测量：在滴定系列的未标记抗原的存在下用最低浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立用于该测定法的条件，多孔板(ThermoScientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕获抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，并且随后用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭二到五小时。在非吸附性板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与系列稀释的目的Fab混合(例如，与在Presta等人，CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体Fab-12的评价一致)。目的Fab随后温育过夜；然而，温育可以继续更长时间(例如约65小时)，以确保达到平衡。其后，将混合物转移至捕获板用于在室温温育(例如一小时)。随后去除溶液并且将板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20()洗涤八次。当板干燥后，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度，用于在竞争结合测定法中使用。
根据一些实施方案，Kd使用表面等离子体共振测定法测量。例如，在25℃使用或(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)实施的测定法，其中以～10反应单位(RU)使用固定化抗原CM5芯片。在一些实施方案中，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/分钟的流速注射，以实现约10反应单位(RU)的偶联蛋白质。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注射在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍系列稀释的Fab(0.78nM-500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一兰米尔结合模型(EvaluationSoftware版本3.2)，计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比值。参见,例如,Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上文表面等离子体共振测定法结合速率超过106M-1s-1，则结合速率可以通过使用荧光猝灭技术进行测定，所述荧光猝灭技术测量在递增浓度的抗原的存在下在25℃在PBS，pH7.2中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低，其中测量可以使用例如分光光度计，例如配备停流的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
2.抗体片段
在特定实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段及下文描述的其他片段。关于一些抗体片段的综述，参见HUDSON等NAT.MED.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthün,inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,(Springer-Verlag,NewYork),pp.269-315(1994)；也参见WO93/16185；和U.S.PatentNos.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体(diabody)是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP404,097；WO1993/01161；HUDSON等,NAT.MED.9:129-134(2003)；和HOLLINGER等,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA90:6444-6448(1993)。三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)也在Hudson等人NAT.MED.9:129-134(2003)中描述。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或者轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在特定实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过多种技术进行制备，包括但不限于,完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文描述的。
3.嵌合和人源化抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。特定嵌合抗体例如在U.S.PATENTNO.4,816,567；和MORRISON等,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物例如猴的可变区)和人恒定区。在进一步例子中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类或亚类已相对于亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在特定实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般地，将非人抗体人源化，以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs例如CDRs(或其部分)衍生自非人抗体，并且FRs(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地还可以包含人恒定区的至少部分。在一些实施方案中，在人源化抗体中的一些FR残基被置换为来自非人抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备其的方法例如在ALMAGROANDFRANSSON,FRONT.BIOSCI.13:1619-1633(2008)中综述，并且例如在下述文献中进一步描述：RIECHMANN等,NATURE332:323-329(1988)；QUEEN等,PROC.NAT’LACAD.SCI.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；KASHMIRI等,METHODS36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)嫁接)；PADLAN,MOL.IMMUNOL.28:489-498(1991)(描述“表面重建”(resurfacing))；DALL’ACQUA等,METHODS36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和OSBOURN等,METHODS36:61-68(2005)和KLIMKA等,BR.J.CANCER,83:252-260(2000)(描述“引导选择”方法到FR改组)。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见,例如,SIMS等J.IMMUNOL.151:2296(1993))；衍生自特定亚组的轻或重链可变区的人抗体共有序列的构架区(参见,例如,CARTER等PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,89:4285(1992)；和PRESTA等J.IMMUNOL.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞成熟的)构架区或人种系构架区(参见,例如,ALMAGRO和FRANSSON,FRONT.BIOSCI.13:1619-1633(2008))；和自筛选FR文库得到的构架区(参见,例如,BACA等,J.BIOL.CHEM.272:10678-10684(1997)和ROSOK等,J.BIOL.CHEM.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的多种技术产生。人抗体一般描述于VANDIJK和VANDEWINKEL,CURR.OPIN.PHARMACOL.5:368-74(2001)和LONBERG,CURR.OPIN.IMMUNOL.20:450-459(2008)。
人抗体可以通过给转基因动物施用免疫原进行制备，所述转基因动物已经修饰为响应抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物一般含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座、或在染色体外存在或随机整合到动物的染色体内。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已灭活。关于用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见LONBERG,NAT.BIOTECH.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，和描述技术的美国专利申请公开号US2007/0061900)。来自此类动物生成的完整抗体的人可变区可以进一步修饰，例如与不同人恒定区组合。
人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法进行制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系已得到描述。(参见,例如,KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991).)经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中描述。其它方法包括例如描述于美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系中产生单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中的那些方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术(triomatechnology))还描述于VOLLMERS和BRANDLEIN,HISTOLOGYandHISTOPATHOLOGY,20(3):927-937(2005)和VOLLMERS和BRANDLEIN,METHODSandFINDINGSINEXPERIMENTALandCLINICALPHARMACOLOGY,27(3):185-91(2005)。
人抗体还可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变结构域序列而生成。此类可变结构域序列随后可以与所需人恒定结构域组合。用于从抗体文库中选择人抗体的技术在下文描述。
5.文库衍生的抗体
本文所述抗体可以通过在组合文库中筛选具有一种或多种期望活性的抗体进行分离。例如，本领域已知多种方法可以用于生成噬菌体展示文库且在此类文库中筛选具有所需结合特征的抗体。此类方法综述在例如HOOGENBOOM等,METHODSINMOLECULARBIOLOGY178:1-37(O’BRIEN等,ED.,HUMANPRESS,TOTOWA,NJ,2001)中，并进一步描述在例如THEMCCAFFERTY等,NATURE348:552-554；CLACKSON等,NATURE352:624-628(1991)；MARKS等,J.MOL.BIOL.222:581-597(1992)；MARKS和BRADBURY,METHODSINMOLECULARBIOLOGY248:161-175(LO,ED.,HUMANPRESS,TOTOWA,NJ,2003)；SIDHU等,J.MOL.BIOL.338(2):299-310(2004)；LEE等,J.MOL.BIOL.340(5):1073-1093(2004)；FELLOUSE,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA101(34):12467-12472(2004)；和LEE等,J.IMMUNOL.METHODS284(1-2):119-132(2004)中。
在特定噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)分开克隆，且随机重组在噬菌体文库中，随后可以如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12:433-455(1994)中所述在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体。噬菌体一般以单链Fv(scFv)片段的形式或以Fab片段的形式展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆(例如从人中)幼稚库(repertoire)，不经任何免疫接种,以提供针对广泛的非自身以及自身抗原的单个抗体来源，如通过Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后，幼稚文库还可以通过下述方式合成地制备：从干细胞中克隆未重排的V基因区段，且使用含有随机序列的PCR引物以编码高可变CDR3区，在体外实现重排，如通过Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373,和美国专利公布号2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936,和2009/0002360。
从人抗体文库中分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在特定实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是具有针对至少两个不同位点的结合特异性的单克隆抗体。在特定实施方案中，结合特异性之一针对IL-4，并且另一个针对任何其他抗原。在特定实施方案中，结合特异性之一针对IL-4，并且另一个针对IL-13。在特定实施方案中，双特异性抗体可以与IL-4的两个不同表位结合。双特异性抗体还可以用于将细胞毒素剂定位至细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)),WO93/08829,和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))、和“杵进臼(knob-in-hole)”工程(参见,例如,美国专利号5,731,168；美国申请公布号2011/0287009)。多特异性抗体还可以通过下述进行制备：改造静电转向效应(electrostaticsteeringeffects)用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见,例如,美国专利号4,676,980,和BRENNAN等,SCIENCE,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见,例如,KOSTELNY等,J.IMMUNOL.,148(5):1547-1553(1992))；在单个VH/VL单位中在CL结构域和VH结构域之间使用弗林(furin)可切割拴链(参见,例如,国际专利申请号PCT/US2012/059810)；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(参见,例如,HOLLINGER等,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见,例如GRUBER等,J.IMMUNOL.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，如例如TUTT等J.IMMUNOL.147:60(1991)中所述的。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的改造抗体，包括章鱼抗体(“Octopusantibodies”)，也包括在本文中(参见,例如US2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括包含抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”，其中所述抗原结合位点与IL-4以及另一不同抗原例如IL-13结合(参见例如US2008/0069820)。
杵进臼
在例如美国专利号5,731,168,WO2009/089004,US2009/0182127,US2011/0287009,MARVIN和ZHU,ACTAPHARMACOL.SIN.(2005)26(6):649-658,和KONTERMANN(2005)ACTAPHARMACOL.SIN.,26:1-9中，描述了将杵进臼用作产生多特异性抗体的方法。以下提供简要的非限制性讨论。
“突起”指从第一多肽表面突出的至少一个氨基酸侧链，由此该氨基酸侧链可以置入相邻界面(即，第二多肽的界面)的互补腔中，例如以稳定该异二聚体，并由此相比同二聚体形成更利于异二聚体形成。突起可以存在于原始界面中，或可以通过合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，编码第一多肽的界面的核酸被改变以编码突起。为此，将编码第一多肽界面中至少一个“原始”氨基酸残基的核酸置换为编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸，其中所述输入氨基酸残基比原始氨基酸残基具有更大的侧链体积。可以明了，可以存在一个以上原始和相应的输入残基。各种氨基酸残基的侧链体积显示在例如US2011/0287009的表1中。
一些实施方案中，用于形成突起的输入残基是选自精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的天然氨基酸残基。一些实施方案中，输入残基是色氨酸或酪氨酸。一些实施方案中，用于形成突起的原始残基具有小侧链体积，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“腔”指自第二多肽界面凹入并由此可以容纳相邻第一多肽界面上的相应突起的至少一个氨基酸侧链。腔可以存在于原始界面中，或可以通过合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码腔。为此，将编码第二多肽界面中至少一个“原始”氨基酸残基的核酸置换为编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA，其中所述输入氨基酸残基比原始氨基酸残基具有较小的侧链体积。可以明了，可以存在一个以上原始和相应的输入残基。一些实施方案中，用于形成腔的输入残基是选自丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T)和缬氨酸(V)的天然氨基酸残基。一些实施方案中，输入残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。一些实施方案中，用于形成腔的原始残基具有大侧链体积，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
突起“可以置入”腔中，意指突起和腔分别位于第一多肽和第二多肽界面上的空间位置以及突起和腔的大小使得该突起可以位于腔中而不显著地干扰第一多肽和第二多肽在该界面的正常相关性(association)。由于突起例如Tyr,Phe和Trp典型地不从界面轴垂直地伸出和具有优选的构象，因此突起与相应腔的对齐可以，在一些情况下，依赖于基于三维结构(例如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的三维结构)模建该突起/腔对。这可以使用本领域中广泛接受的技术实现。
一些实施方案中，杵突变在IgG1恒定区中是T366W。一些实施方案中，臼突变在IgG1恒定区中包含选自T366S,L368A和Y407V的一个或多个突变。一些实施方案中，臼突变在IgG1恒定区中包含T366S,L368A和Y407V。SEQIDNO:34显示具有杵突变的示例性IgG1恒定区，SEQIDNO:35显示具有臼突变的示例性IgG1恒定区。
一些实施方案中，杵突变在IgG4恒定区中是T366W。一些实施方案中，臼突变在IgG4恒定区中包含选自T366S,L368A和Y407V的一个或多个突变。一些实施方案中，臼突变在IgG4恒定区中包含T366S,L368A和Y407V。SEQIDNO:36显示具有杵突变的示例性IgG4恒定区，SEQIDNO:37显示具有臼突变的示例性IgG4恒定区。
7.抗体变体
在特定实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将合适修饰引入编码抗体的核苷酸序列内、或通过肽合成，进行制备。此类修饰包括例如在抗体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或置换。可以制备缺失、插入和置换的任何组合，以达到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
置换、插入和缺失变体
在特定实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVRs和FRs。保守置换显示于表1中标题“保守置换”下。更实质性的变化在表1中标题“示例性置换”下提供，并且在下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以将氨基酸置换引入目的抗体内且就所需活性筛选产物，例如保留/改善的抗原结合、减少的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
原始残基 示例替代 保守替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据共同侧链性质进行分组：
(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性:Asp、Glu；
(4)碱性:His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基:Gly、Pro；
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保守置换造成这些类型之一的成员交换为另一类型的成员。
一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在特定生物性质(例如增加的亲和力、减少的免疫原性)上具有修饰(例如改善)、和/或基本上了保留亲本抗体的特定生物性质。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文描述的，方便地生成。简言之，使一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上且筛选特定生物活性(例如结合亲和力)。
可以在HVRs中作出改变(例如置换)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程中高频率经历突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury，MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))、和/或SDRs(a-CDRs)中作出，测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库且从中再选择而进行的亲和力成熟，已例如描述在HOOGENBOOM等，METHODSINMOLECULARBIOLOGY178:1-37(O’BRIEN等,ED.,HUMANPRESS,TOTOWA,NJ,(2001).)中。在亲和力成熟的一些实施方案中，可以通过多种方法(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸定向诱变)中的任何，将多样性引入选择用于成熟的可变基因内。随后制备二级文库。随后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，其中几个HVR残基(例如一次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，特别鉴定。特别常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在特定实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVRs内发生，只要此类改变基本上不减少抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVRs中进行基本上不减少结合亲和力的保守改变(例如如本文提供的保守置换)。此类改变可以在HVR“热点”或SDRs外。在上文提供的变体VH和VL序列的特定实施方案中，每个HVR或者是未改变的、或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
用于鉴定可以作为靶标进行诱变的抗体残基或区域的一个有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085描述的。在此方法中，鉴定残基或靶标残基组(例如荷电残基例如arg、asp、his、lys和glu)，并且替换为中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对该最初置换显示出功能性敏感的氨基酸位置上引入进一步的置换。可替代地或另外地，可以利用抗原-抗体复合物的晶体结构，鉴定在抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为用于置换的候选物被靶向或消除。可以筛选变体，以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合(长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽)、以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C末端与酶(例如对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
糖基化变体
在特定实施方案中，改变本文提供的抗体，以增加或减少抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可以通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点，而方便地完成。
当抗体包含Fc区时，可以改变与之附着的碳水化合物。通过哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分支的、二天线型的寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见,例如,Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着在二天线型寡糖结构的“茎”中的GlcNAc上的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在本文提供的抗体中进行寡糖的修饰，以便产生具有特定改善性质的抗体变体。
在一些实施方案中，提供了具有缺乏(直接或间接)附着在Fc区上的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。如例如WO2008/077546中所述的，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，相对于与Asn297附着的所有糖结构(例如复杂的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，通过计算在Asn297的糖链内岩藻糖的平均量，确定岩藻糖的量。Asn297指位于Fc区的大约位置297上的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游的约±3个氨基酸处，即位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见,例如,美国专利公布号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。与“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺陷的”抗体变体有关的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的例子包括具有蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(RIPKA等ARCH.BIOCHEM.BIOPHYS.249:533-545(1986)；USPATAPPLNOUS2003/0157108A1,PRESTA,L；和WO2004/056312A1,ADAMS等,尤其是实施例11)，和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见,例如,YAMANE-OHNUKI等BIOTECH.BIOENG.87:614(2004)；KANDA,Y.等,BIOTECHNOL.BIOENG.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供了具有平分型寡糖(bisectedoligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区附着的二天线寡糖通过GlcNAc平分。此类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子例如在WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；和US2005/0123546(Umana等)中描述。还提供了在与Fc区附着的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体例如在WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S.)中描述。
Fc区变体
在特定实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc区内，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包括包含在一个或多个氨基酸位置上的氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在一些实施方案中，抗体恒定区，例如重链恒定区，包含杵突变和/或臼突变以利于多特异性抗体形成。非限制性示例性杵突变和臼突变、和杵进臼技术一般地描述在例如，美国专利号5,731,168,WO2009/089004,US2009/0182127,US2011/0287009,Marvin和Zhu,ActaPharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658,和Kontermann(2005)ActaPharmacol.Sin.,26:1-9.中。杵突变和臼突变的一些非限制性实例将本文中讨论。
在特定实施方案中，本发明提供具有一些但并非所有效应子功能的抗体变体，这使得其成为用于如下应用的期望候选物，在所述应用中抗体在体内的半衰期是重要的，而一些效应子功能(例如补体和ADCC)是不需要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定试验，以确保抗体缺乏FcγR结合(从而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在造血细胞上的FcR表达概括在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性例子在美国专利号5,500,362中描述(参见,例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定试验方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定试验(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)；和非放射性细胞毒性测定试验(Promega，Madison，WI)。可以用于此类测定试验的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，例如公开于Clynes等人Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)中的。还可以执行C1q结合测定试验，以证实抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见,例如,WO2006/029879和WO2005/100402中C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以执行CDC测定试验(参见,例如,Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期确定还可以使用本领域已知的方法进行(参见,例如,Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)).。
具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个上具有置换的Fc突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的置换的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或减少的FcRs结合的特定抗体变体。(参见,例如,美国专利号6,737,056；WO2004/056312,和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001).)
在特定实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334上的置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中作出改变，以导致改变的(例如改善或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如美国专利号6,194,551,WO99/51642,和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述的。
在US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了具有增加的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，所述新生儿Fc受体负责母源IgGs至胎儿的转移(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述一个或多个置换改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在如下Fc区残基的一个或多个上具有置换的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。.
关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan&Winter，Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。
一些实施方案中，抗体恒定区包含本文讨论的一个以上突变(例如，杵和/或臼突变和/或增加稳定性的突变和/或减少ADCC的突变，等等)。
半胱氨酸工程化抗体变体
在特定实施方案中，可能期望制备半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基由半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，被置换的残基位于抗体的可接近位点上。通过用半胱氨酸置换这些残基，从而将反应性巯基基团置于抗体的可接近位点上，这些巯基基团可以用于使抗体缀合至其他部分例如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在特定实施方案中，下述残基中的任何一个或多个可以由半胱氨酸残基置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述生成。
抗体衍生物
在特定实施方案中，本文提供的抗体可以进一步被修饰，以含有本领域已知的且可容易获得的另外非蛋白质性部分。适于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、propropyleneglycol同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛，由于其在水中的稳定性，可以在制造中具有优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或未分支的。附着至抗体的聚合物数目可以改变，并且如果附着超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于如下考虑进行确定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否用于在限定条件下的治疗中，等。
在一些实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射线而被选择性加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一些实施方案中，非蛋白质性部分是碳纳米管(KAM等,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA102:11600-11605(2005))。辐射线可以具有任何波长，并且包括但不限于，这样的波长，所述波长不伤害普通细胞、但使非蛋白质性部分加热至可杀死抗体-非蛋白质性部分附近的细胞的温度。
重组方法和组合物
抗体可以使用重组方法和组合物进行生产，例如如美国专利号4,816,567中所述的。在一些实施方案中，提供了编码本文描述的抗IL-4抗体的分离核酸。在一些实施方案中，提供了编码本文描述的抗IL-13抗体的分离核酸。在一些实施方案中，提供了编码本文描述的抗IL-4/IL-13双特异性抗体的分离核酸。此核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在一些实施方案中，提供了包含此核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在一些实施方案中，提供了包含此核酸的宿主细胞。在一个此实施方案中，宿主细胞包含(例如已转化了)：(1)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体、和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。
在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一些实施方案中，提供了制备抗体的方法，其中所述方法包括在适于抗体表达的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
在一些实施方案中，提供了制备多特异性抗体的方法，其中所述方法包括在适于抗体表达的条件下培养包含编码多特异性抗体的核酸的宿主细胞，且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收多特异性抗体。在一些实施方案中，提供制备多特异性抗体的方法，其中所述方法包括在适于第一VH/VL单位表达的条件下培养包含编码多特异性抗体的第一VH/VL单位(包括恒定区(如果有的话)，有时称作“hemimer”或“半抗体”)的核酸的第一宿主细胞，且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收第一VH/VL单位；和在适于第二VH/VL单位表达的条件下培养包含编码多特异性抗体的第二VH/VL单位(包括恒定区(如果有的话))的核酸的第二宿主细胞，且任选从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收第二VH/VL单位。在一些实施方案中，该方法还包括从分离的第一VH/VL单位和分离的第二VH/VL单位组装多特异性抗体。该组装可以包括，在一些实施方案中，氧化还原步骤以在两个VH/VL单位(或hemimers)之间形成分子内二硫键。生产多特异性抗体的非限制性示例方法描述在例如US2011/0287009,US2007/0196363,US2007/0178552,美国专利号5,731,168,WO96/027011,WO98/050431,和ZHU等,1997,PROTEINSCIENCE6:781-788中。非限制性示例方法也描述在以下实施例中。
对于抗IL-4抗体或抗-IL-4/IL-13双特异性抗体的重组生产，分离编码抗体，例如如上所述的抗体，的核酸，并且插入一个或多个载体内用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此核酸可以使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离且测序。
用于抗体编码载体的克隆或表达的合适宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，抗体可以在细菌中生产。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237,5,789,199,和5,840,523。(还参见CHARLTON,METHODSINMOLECULARBIOLOGY,VOL.248(B.K.C.LO,ED.,HUMANAPRESS,TOTOWA,NJ,2003),PP.245-254,描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以在可溶级分中从细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。
除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被人源化”的真菌和酵母菌株，这导致具有部分或全人糖基化模式的抗体生产。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006).
用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定了众多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别用于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见,例如,美国专利号5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978；和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，悬浮生长适应化的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如例如Graham等人，J.GenVirol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(如例如Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；Buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；如例如Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系例如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合于抗体生产的一些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
示例性测定法
结合测定法及其他测定法
在一些实施方案中，可以就其抗原结合活性，例如通过已知方法例如ELISA、蛋白质印迹等，测试本文提供的抗体。
在一些实施方案中，竞争测定法可以用于鉴定与本文所述IL-4抗体竞争结合IL-4的抗体。在一些实施方案中，竞争测定法可以用于鉴定与本文所述IL-4/IL-13双特异性抗体竞争结合IL-4和/或IL-13的抗体。一些实施方案中，此类竞争抗体与结合IL-4的抗体结合相同的表位(例如线性或构象表位)，其中所述结合IL-4的抗体包含含有SEQIDNO:9的VH氨基酸序列和含有SEQIDNO:10的VL氨基酸序列。一些实施方案中，此类竞争抗体与结合IL-13的抗体结合相同的表位(例如线性或构象表位)，其中所述结合IL-13的抗体包含含有SEQIDNO:19的VH氨基酸序列和含有SEQIDNO:20的VL氨基酸序列。一些实施方案中，此类竞争抗体与结合IL-13的抗体结合相同的表位(例如线性或构象表位)，其中所述结合IL-13的抗体包含含有SEQIDNO:49的VH氨基酸序列和含有SEQIDNO:48的VL氨基酸序列。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法在MORRIS(1996)“EPITOPEMAPPINGPROTOCOLS,”METHODSINMOLECULARBIOLOGYVOL.66(HUMANAPRESS,TOTOWA,NJ)中提供。
在示例性竞争测定法中，在溶液中温育固定化的IL-4，所述溶液包含与IL-4结合的第一标记的抗体(例如，包含含有SEQIDNO:9的VH氨基酸序列和含有SEQIDNO:10的VL氨基酸序列的抗体)、和待测试其与第一抗体竞争结合IL-4的能力的第二未标记的抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在溶液中温育固定化的IL-4，所述溶液包含第一标记的抗体但不包含第二未标记的抗体。在允许第一抗体与IL-4结合的条件下温育后，去除过量的未结合的抗体，测量与固定化的IL-4结合的标记量。如果与固定的IL-4结合的标记量在测试样品中相对于在对照样品中有实质性的减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争结合IL-4。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManualch.14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY).
在再一示例性竞争测定法中，在溶液中温育固定化的IL-13，所述溶液包含与IL-13结合的第一标记的抗体(例如，包含含有SEQIDNO:19的VH氨基酸序列和含有SEQIDNO:20的VL氨基酸序列的抗体，或包含含有SEQIDNO:49的VH氨基酸序列和含有SEQIDNO:48的VL氨基酸序列的抗体)、和待测试其与第一抗体竞争结合IL-13的能力的第二未标记的抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在溶液中温育固定化的IL-13，所述溶液包含第一标记的抗体但不包含第二未标记的抗体。在允许第一抗体与IL-13结合的条件下温育后，去除过量的未结合的抗体，测量与固定化的IL-13结合的标记量。如果与固定的IL-13结合的标记量在测试样品中相对于在对照样品中有实质性的减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争结合IL-13。
活性测定法
在一些实施方案中，提供了用于鉴定具有生物活性的抗IL-4抗体和抗-IL-4/IL-13双特异性抗体的测定法。生物活性可以包括，例如，抑制IL-4结合IL-4受体、抑制IL-4-诱导的STAT6磷酸化、抑制IL-4诱导的细胞增殖、抑制IL-4-诱导的B细胞向IgE的类型转换、在哮喘中的活性、和在IPF中的活性。在一些实施方案中，生物活性包括，例如，抑制IL-13结合IL-13受体(例如，包含IL-4Rα和IL-13Rα1的异二聚体受体)、抑制IL-13-诱导的STAT6磷酸化、抑制IL-13诱导的细胞增殖、抑制IL-13-诱导的B细胞向IgE的类型转换、抑制IL-13-诱导的粘液产生、在哮喘中的活性、和在IPF中的活性。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物活性的抗体。用于检测这些生物活性的非限制性示例测定法在本文描述和/或是本领域已知的。
免疫缀合物
在一些实施方案中，提供了包含与一或多个细胞毒性剂缀合的抗IL-4抗体或抗-IL-4/IL-13双特异性抗体的免疫缀合物。非限制性示例细胞毒性剂包括化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)、和放射性同位素。
在一些实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于类美登素(maytansinoid)(参见,例如,美国专利号5,208,020,5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；澳瑞他汀(auristatin)例如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见,例如,美国专利号5,635,483和5,780,588,和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见,例如,美国专利号5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001,和5,877,296；HINMAN等,CANCERRES.53:3336-3342(1993)；和LODE等,CANCERRES.58:2925-2928(1998))；蒽环类例如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(参见,例如,KRATZ等,CURRENTMED.CHEM.13:477-523(2006)；JEFFREY等,BIOORGANIC&MED.CHEM.LETTERS16:358-362(2006)；TORGOV等,BIOCONJ.CHEM.16:717-721(2005)；NAGY等,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA97:829-834(2000)；DUBOWCHIK等,BIOORG.&MED.CHEM.LETTERS12:1529-1532(2002)；KING等,J.MED.CHEM.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；氨甲蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)例如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯；和CC1065。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至酶促活性毒素或其片段的如本文描述的抗体，所述酶促活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素类。
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子的如本文描述的抗体，以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于放射性缀合物的产生。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒素剂的缀合物可以使用多种双官能蛋白质偶联剂进行制备，例如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二甲基己二酸酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双-叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如2,6-二异氰酸甲苯酯)、和双-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如VITETTA等,SCIENCE238:1098(1987)中所述进行制备。碳-14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见,例如,WO94/11026.接头可以是促进细胞毒药物在细胞中释放的“可断裂接头”。例如，可以使用对酸敏感的接头、对肽酶敏感的接头、光敏接头、二甲基接头或含二硫键的接头(CHARI等,CANCERRES.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
免疫缀合物或ADCs在本文中明确考虑，但不限于，用交联接头试剂制备的此类缀合物，包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其是商购可得的(例如来自PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
用于诊断和检测的方法和组合物
在特定实施方案中，本文提供的任何抗IL-4抗体可以用于检测生物样品中IL-4的存在。在特定实施方案中，本文提供的任何抗IL-4/IL-13双特异性抗体可以用于检测生物样品中IL-4和/或IL-13的存在。如本文使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在特定实施方案中，生物样品包括细胞或组织，例如血清、血浆、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、和痰。
在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体用于在诊断或检测方法中使用。在进一步方面，提供了检测生物样品中IL-4的存在的方法。在特定实施方案中，该方法包括在允许抗IL-4抗体与IL-4结合的条件下，使生物样品与如本文描述的抗IL-4抗体接触，并且检测是否在抗IL-4抗体和IL-4之间形成复合物。此方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，抗IL-4抗体用于选择如下疗法的合格受试者，所述疗法使用抗IL-4抗体或抗-IL-4/IL-13双特异性抗体或任何其它TH2途径抑制剂来进行，例如，当IL-4是用于患者选择的生物标记时。
在一些实施方案中，提供了抗IL-4/IL-13双特异性抗体用于在诊断或检测方法中使用。在进一步方面，提供了检测生物样品中IL-4和/或IL-13的存在的方法。在一些实施方案中，该方法包括在允许抗IL-4/IL-13双特异性抗体与IL-4和/或IL-13结合的条件下，使生物样品与如本文描述的抗IL-4/IL-13双特异性抗体接触，并且检测是否在抗IL-4/IL-13双特异性抗体和IL-4和/或IL-13之间形成复合物。此方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，抗IL-4/IL-13双特异性抗体用于选择如下疗法的合格受试者，所述疗法使用抗-IL-4/IL-13双特异性抗体或任何其它TH2途径抑制剂来进行，例如，当IL-4和/或IL-13是用于患者选择的生物标记时。
可以使用抗IL-4抗体或抗IL-4/IL-13双特异性抗体诊断的示例性病症在本文中提供。
在特定实施方案中，提供了标记的抗IL-4抗体。在特定实施方案中，提供了标记的抗IL-4/IL-13双特异性抗体。标记包括但不限于，可以直接检测的标记或部分(例如荧光、生色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及可以间接(例如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分，例如酶或配体。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团例如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶，杂环氧化酶例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢以氧化染料前体的酶例如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
药物制剂
可以制备如本文描述的抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体的药物制剂，例如通过使具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药学可接受的载体(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES16THEDITION,OSOL,A.ED.(1980))混合，以冻干制剂或水溶液形式制备。药学可接受的载体在采用的剂量和浓度下对接受者一般是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如聚乙二醇(PEG)。示例性药学可接受的载体在本文中进一步包括间质(insterstitial)药物分散剂例如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(BaxterInternational，Inc.)。在美国专利出版号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGPs和使用方法，包括rHuPH20。在一些实施方案中，将sHASEGP与一种或多种另外的葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后面的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文制剂还可以针对所治疗的特定适应症按照需要含有一种以上的活性成分，优选具有互补活性且不会不利地彼此影响的那些。例如，可能期望进一步与抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体一起提供控制剂和/或TH2途径抑制剂。此类活性成分适于以对于预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以截留在例如通过凝聚技术(coacervation)或通过界面聚合制备的微囊中(例如分别地羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)、在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米囊)中、或在粗乳液中。此类技术公开于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES16THEDITION,OSOL,A.ED.(1980)中。
可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质可以为成形物品例如薄膜或微胶囊的形式。
待用于体内施用的制剂一般是无菌的。无菌性可以通过例如经由无菌过滤膜过滤而容易地达到。
治疗方法和组合物
本文提供的任何抗IL-4抗体均可以用于本文描述的治疗方法中。本文提供的任何抗IL-4/IL-13双特异性抗体均可以用于本文描述的治疗方法中。
在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体用作药物。在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体用于治疗哮喘、IPF、呼吸病症、嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、或IL-4介导的病症。在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体用于治疗方法中。在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体或抗IL-4/IL-13双特异性抗体用于治疗患有如下病症的个体的方法中：哮喘、呼吸病症、嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、或IL-4介导的病症，所述方法包括向个体施用有效量的抗IL-4抗体或抗IL-4/IL-13双特异性抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下述的其它治疗剂。
根据上述任何实施方案的“个体”优选是人。
在一些实施方案中，提供了抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体用于制备或生产药物的用途。一些实施方案中，所述药物用于治疗哮喘、呼吸病症、嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、或IL-4介导的病症。在再一实施方案中，药物用于治疗哮喘、IPF、呼吸病症、嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、或IL-4介导的病症的方法中，所述方法包括向患有哮喘、呼吸病症、嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、或IL-4介导的病症的个体施用有效量的药物。在一个该实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种其它的治疗剂，例如如下述的其它治疗剂。
在一些实施方案中，提供包含本文所述任何抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体的药物制剂，例如用于任何上述治疗方法中。在一些实施方案中，提供包含本文所述任何抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体和可药用载体的药物制剂。在一些实施方案中，提供包含本文所述任何抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体和至少一种其它治疗剂(例如下文描述的其它治疗剂)的药物制剂。
本文提供的抗体可以单独或与其它活性剂组合地在治疗中使用。例如，本文提供的抗体可以与至少一种其它治疗剂共施用。在特定实施方案中，其它治疗剂是TH2抑制剂。在一些实施方案中，其它治疗剂是哮喘炎症的控制剂，例如皮质类固醇、白三烯受体拮抗剂、LABAs、皮质类固醇/LABA联合组合物、茶碱(theophylline)、色甘酸钠(cromolynsodium)、萘多罗米钠(nedocromilsodium)、奥马珠单抗(omalizumab)、LAMAs、MABA(例如双功能毒蕈碱拮抗剂-β2激动剂)、5-脂加氧酶活化蛋白质(FLAP)抑制剂、或酶PDE-4抑制剂。
上述组合治疗涵盖联合施用(其中两个或更多个治疗剂包括在相同或分开的制剂中)，和分开施用，在此情况下，抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体的施用可以在其它治疗剂(一种或多种)施用之前、同时和/或之后进行。在一些实施方案中，抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体的施用和其它治疗剂的施用可以发生在彼此的大约一个月内、或大约一、两或三周内、或大约一、二、三、四、五、或六天内。
在一些实施方案中，抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体用于治疗癌症，例如成胶质细胞瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，本文提供的抗体可以与放射治疗联合使用。
抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体(和任何其它治疗剂)可以通过任何合适方法进行施用，包括肠胃外、肺内和鼻内、和如果需要局部治疗的话，损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射(部分取决于施用是短暂的还是长期的)。本文考虑各种给药方案，包括但不限于，单次或经过多个时间点的多次施用、快速浓注施用(bolusadministration)和脉冲输注。
抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体将以符合良好医疗实践的方式配制，给药和施用。在此考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、活性剂递送部位、施用方法、施用时间安排和医学从业者已知的其他因素。抗体无需但可以任选地与目前用于预防或治疗所讨论的病症的一种或多种活性剂配制在一起。此类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其他因素。这些活性剂一般可以以与本文描述相同的剂量和施用途径使用，或以本文描述的剂量的约1-99％使用，或以经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
对于疾病预防或治疗，抗IL-4抗体和/或抗IL-4/IL-13双特异性抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的另外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体类型、疾病严重性和病程、抗体是施用用于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床史和对抗体的应答、和主治医师的判断。本发明抗体适宜一次或经过一系列治疗而施用于患者。本领域技术人员可以基于疾病类型和严重度来确定抗体的合适剂量。抗IL-13抗体剂量的非限制性示例描述在例如PCT公布号WO2012/083132中。抗体剂量的一般指导可以见于例如BAI等,CLINICALPHARMACOKINETICS,51:119-135(2012)和DENG等,EXPERTOPIN.DRUGMETAB.TOXICOL.8(2):141-160(2012).。抗体疗法的进展可以通过常规技术和测定法监控。
应当理解，可以使用免疫缀合物代替或加上抗IL-4抗体或抗IL-4/IL-13双特异性抗体，实施上述任何制剂或治疗方法。
制造品
在一些实施方案中，提供含有可以用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制造品。制造品可以包含容器和在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与对于治疗、预防和/或诊断所述状况有效的另外组合物组合的组合物，且可以具有无菌进入口(例如容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性剂是抗-IL-4抗体和/或抗-IL-4/IL-13双特异性抗体。标签或包装说明书指示组合物用于治疗所选择的状况。此外，制造品可以包含(a)含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含抗-IL-4抗体和/或抗-IL-4/IL-13双特异性抗体；和(b)含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它的细胞毒性剂或另外的治疗剂。在一些实施方案中，制造品可以进一步包含指示组合物可以用于治疗特定状况的包装说明书。可替代地或另外地，制造品可以进一步包括包含药学可接受的缓冲液的第二(或第三)容器，所述药学可接受的缓冲液例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
应当理解，任何上述制成品可以包括替代抗IL-4抗体或抗IL-4/IL-13双特异性抗体的免疫缀合物，或可以除抗IL-4抗体或抗IL-4/IL-13双特异性抗体之外还包括免疫缀合物。
实施例
以下是本发明方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1-一些方法和试剂
表面等离子体共振(SPR)BIAcore亲合力测量
在Biacore3000仪器(GEHealthcare)上，使用表面等离子体共振(SPR)，测量了抗IL-4、抗IL-13和抗IL-4/IL-13双特异性抗体的结合动力学。使用厂商提供的方案，通过基于胺的偶联，将抗人Fc(GEHealthcare)固定在CM5传感器芯片上。以1200共振单位(RU)的水平捕获抗体。
测量了与浓度0、3.13、6.25、12.50、25.0、和50.0nM的人IL-4、食蟹猴IL-4、人IL-13、人IL-13R130Q(SEQIDNO:31)、和食蟹猴IL-13的双特异性结合。使用2分钟注射时间和30μl/min流速，在25℃温度，以10mMHEPES,pH7.4,150mMNaCl和0.005％Tween20的运行缓冲液，记录了细胞因子结合的传感图。注射后，在运行缓冲液中对细胞因子自抗体的解离进行了1000秒监测。在结合周期之间通过注射60μl的3M氯化镁，再生表面。在扣除仅含有运行缓冲液的空白对照后，使用1:1Langmuir结合模型，利用厂商提供的软件，分析针对细胞因子与抗IL-13/抗IL-4双特异性抗体的结合所观察到的传感图，以计算动力学和结合常数。
表面等离子体共振(SPR)BIAcore结合竞争试验
在Biacore3000仪器(GEHealthcare)上，使用表面等离子体共振(SPR)，检测了抗IL-4/IL-13双特异性抗体对人IL-13和人IL-13Rα2结合的抑制作用。使用厂商提供的方案，通过基于胺的偶联，将抗人IL-13固定在CM5传感器芯片上。在流动池4(FC4)上以985共振单位(RU)的水平固定了IL-13，并随后使用1M乙醇胺-HCl封闭未反应的位点。FC3用作测量的参照池，其通过活化和随后以乙醇胺封闭而预备。使用2分钟注射时间和30μl/min流速，在25℃温度，以10mMHEPES,pH7.4,150mMNaCl和0.005％Tween20的运行缓冲液，记录了IL-13Rα2(根据本领域标准方法制备和纯化的、带组氨酸标签的重组人IL-13Rα2)结合的传感图。为了确定IL-13Rα2与IL-13结合的结合常数，针对浓度从12.5至200nM变化(2倍稀释)的一系列IL-13Rα2溶液，记录了传感图。注射后，在运行缓冲液中对受体自细胞因子的解离进行了600秒监测。在结合周期之间通过注射60μl的10mM甘氨酸-HClpH1.7，再生表面。
为了评价在抗IL-4/IL-13双特异性抗体存在下IL-13Rα2与IL-13的结合，加入一个额外步骤——注射60μl250nM抗IL-4/IL-13双特异性抗体，以评价在竞争性抗体存在下受体与细胞因子的结合。在扣除仅含有运行缓冲液的空白对照后，使用1:1Langmuir结合模型，利用厂商提供的软件，分析在竞争性抗体不存在和存在的情况下针对受体与细胞因子的结合所观察到的传感图，以计算动力学和结合常数。
ELISA结合竞争试验
为了确定抗体是否抑制IL-4与IL-4受体(IL-4R)结合，使用了ELISA测定法。在96孔板中，将150μg/mL(1000nM)抗体溶液三倍系列稀释在测试缓冲液(磷酸盐缓冲盐水[PBS],pH7.5,含有0.05％Tween20和0.5％牛血清白蛋白[BSA])中，以提供0.0009,0.003,0.008,0.02,0.07,0.21,0.62,1.9,5.6,16.7,50.0,和150μg/mL(分别为，0.0056,0.017,0.05,0.15,0.46,1.37,4.12,12.3,37,111,333,和1000nM)。每个稀释物的体积均为35μL。向每个孔中加入35μL11.6ng/mL(780pM)生物素化IL4溶液。室温孵育混合物40分钟。孵育后，将孔中的内容物转移到用50μL2.0μg/mL可溶性IL-4R蛋白(R&DSystems,Cat.No.230-4R/CF)在PBS中的溶液包被过夜并用含有1％BSA的PBS封闭的96孔NuncMaxisorp板(Roskilde,Denmark)。40分钟孵育后，在洗涤缓冲液(含有0.05％Tween20的1XPBS)中洗涤板5次。然后每孔接受50μL链霉亲和素辣根过氧化物酶溶液(CaltagLaboratories,Invitrogen；Carlsbad,CA)，孵育40分钟。用洗涤缓冲液洗涤5次后，向每孔加入50μL四甲基联苯胺(TMB)底物(KPL；Gaithersburg,MD)。几分钟后，加入50μL1NHCl溶液以终止该反应。使用SpectraMax340读板器(MolecularDevices；Sunnyvale,CA)在450nM读板。对于每个样品，相对于浓度，绘制450nM读取的光密度(OD)图。在Kaleidagraph(SynergySoftware；Reading,PA)中绘制曲线并使用4参数拟合进行拟合或点到点绘图。
为了确定是否抗体抑制IL-13与IL-13Rα1受体的结合，除了使用生物素化IL-13R130Q(SEQIDNO:31)替代生物素化的IL-4、和使用可溶性IL-13Rα1-Fc蛋白(R&DSystems,Cat.No.146-IR-100)替代可溶性IL-4R-Fc，基本上如上述进行ELISA试验。
为了确定是否抗体抑制IL-13与IL-13Rα2受体的结合，除了使用生物素化IL-13替代生物素化的IL-4、和使用可溶性IL-13Rα2-Fc蛋白(R&DSystems,Cat.No.614-IR-100)替代可溶性IL-4R-Fc，基本上如上述进行ELISA试验。
质粒构建和抗体表达
如前述(SIMMONS等,2002,JIMMUNOLMETHODS263,133–147)，将抗体克隆到表达载体中。对于重链和轻链两者，在编码成熟抗体的序列之前为具有翻译起始强度1的STII信号序列。为了表达蛋白，30℃在LB(100μg/ml羧苄青霉素)中生长在适宜的W3110衍生物(Reilly和Yansura,2010,AntibodyEngineering(Berlin,Heidelberg:SpringerBerlinHeidelberg))中的过夜培养物，1:100稀释到CRAP培养基(100μg/ml羧苄青霉素)中并30℃生长24小时。对于更大的制备，在10L发酵罐中，例如如前述(SIMMONS等,2002,JIMMUNOLMETHODS263,133–147)，生长培养物。
对于非还原条件下SDS-PAGE分析，收获200μl过夜培养物并重悬在100μlNR-裂解缓冲液(88μlPopCultureReagent(Novagen),10μl100mM碘乙酰胺,2μllysonase试剂(EMDBiosciences))中。在室温温育10分钟后，9300rcf离心样品2’，将50μl上清液转移到新鲜管中，与相同体积的2xSDS样品缓冲液(Invitrogen)混合。在将10μl样品上样到NuPAGE4-12％Bis-Tris/MES凝胶(Invitrogen)上前，95℃加热样品5’，16000rcf离心1’。通过iBlot(Invitrogen)将凝胶转移到硝酸纤维素膜上，用IRDye800CW缀合的抗人IgGF(c)抗体(Rockland)进行免疫印迹，用LiCOROdyssey成像仪成像。
对于完全还原的细胞样品，将细胞沉淀重悬在R-裂解缓冲液(10μl1MDTT,88μlPopCultureReagent(Novagen),2μllysonase)中，室温温育10分钟，之后样品与2xSDS样品缓冲液混合。除了使用IRDye800CW缀合的抗人抗体(Rockland)用于免疫检测之外，如前所述对Western印迹进行成像。
双特异性抗体的纯化和组装
使用GEA的Niro-Soavi匀浆器(Bedford,NH,U.S.A)，匀浆大肠杆菌全细胞培养液。所得的匀浆物然后通过加入聚乙烯亚胺絮凝剂至终浓度0.4％而进行提取，用纯化的水稀释并室温混合16小时。离心澄清提取物，使用冷却至15℃的0.2μm无菌过滤器过滤后，上样至预平衡的(25mMTris,25mMNaCl5mMEDTApH7.1)蛋白A柱上。用平衡缓冲液和0.4M磷酸钾pH7.0洗涤柱子，并最后用100mM乙酸pH2.9洗脱。然后在组装反应中合并蛋白A池。
分开的半抗体蛋白A池分别用0.2M精氨酸调理，用1.5MTris碱将pH调整至pH8.0，合并，以200x摩尔过量于双特异性抗体的量加入L-还原型谷胱甘肽(GSH)，20℃温育48小时。温育后，通过阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤，纯化组装的双特异性抗体。浓缩阳离子交换洗脱物，将缓冲液更换为最终制剂缓冲液。
通过完整和还原的质谱分析对抗体进行分析性表征
使用偶联nano-Chip-LC系统的Agilent6210ESI-TOF质谱仪，通过LC/MS分析，获得双特异性抗体的还原的和完整的质量。经和不经之前TCEP还原的双特异性样品，以每次注射大约5ng抗体的量，通过RPHPLC脱盐用于直接线上MS分析。针对还原和非还原样品所得的质谱显示出了多重荷电蛋白离子的分布，使用MassHunter工作站软件/定量分析B.03.01(AGILENTTECHNOLOGIESINC.2009)将该质谱解卷积至零电荷态。
分析性大小排阻层析
使用TosoHaasTSKG3000SWXL柱(7.8x300mm)，分离大小变体，用由0.2M磷酸钾和0.25M氯化钾(pH6.2)组成的移动相进行等度洗脱。所述分离在室温以0.5mL/min流速进行。在280nm监控柱流出液。使用DionexCorporation的Chromeleon软件v6.80SR11，获得高分子量物(HMWS)(主峰)和低分子量物(LMWS)的峰面积的相对百分数。
毛细管电泳-十二烷基硫酸钠分析(CE-SDS)
首先用柠檬酸-磷酸缓冲液pH6.6稀释双特异性样品，用SDS和N-乙基马来酰亚胺70℃处理3分钟。冷却后，将样品在50℃用3-(2-呋喃甲酰基)喹啉-2-甲醛)(FQ)在过量氰化钾存在下标记10分钟。通过缓冲液更换淬灭标记反应，然后用1％SDS处理。非还原样品在70℃加热5分钟。还原的样品用50mM二硫苏糖醇(DTT)在70℃处理10分钟。
使用BeckmanPA800CE系统(具有50μm直径、未包被的熔融石英毛细管(fusedsilicacapillary))，通过CESDS分析了非还原的和还原的样品。电动态地(electrokinetically)(以5kV，40秒)注射样品，并在15kV恒压以反向极性进行35分钟分离。毛细管温度维持在40℃。通过LIF检测，监测标记的成分的迁移；在488nm激发，在600nm监测发射。
细胞培养(TF-1细胞)
在增湿温育箱中以37℃和5％CO2将人TF-1(红白血病细胞,R&DSystems,Minneapolis,MN)培养在包含RPMI1640(GENENTECHMEDIAPREPARATIONFACILITY,SOUTHSANFRANCISCO,CA)的生长培养基中，其中所述生长培养基含有10％热灭活胎牛血清(FBS)(目录号SH30071.03,HYCLONELABORATORIES,INC.,LOGAN,UT)；以及1X青霉素:链霉素:谷氨酰胺(目录号10378-016,GIBCOINVITROGENCORP.,CARLSBAD,CA)和2ng/mLrhGM-CSF(目录号215-GM,R&DSYSTEMS,MINNEAPOLIS,MN)。测试培养基是不含2ng/mLrhGM-CSF的生长培养基。将细胞因子以如下终浓度加入所述的测试培养基中:0.2ng/ml人IL-4(目录号204-IL,R&DSYSTEMS,MINNEAPOLIS,MN),10ng/ml人IL-13(GENENTECH,SO.SANFRANCISCO,CA),10ng/ml人IL-13R130Q(GENENTECH,SO.SANFRANCISCO,CA),2ng/ml食蟹猴IL-4(GENENTECH,SO.SANFRANCISCO,CA),和20ng/ml食蟹猴IL-13(GENENTECH,SO.SANFRANCISCO,CA)。
实施例2-产生结合IL-4的抗体
使用商业可得人IL-4(R&DSYSTEMS,MINNEAPOLIS,MN)，产生了选择性结合人白介素-4(IL-4)的一组抗体。用0.5μgIL-4(重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的单磷酰脂质A和海藻糖二棒分枝菌酸(dicorynomycolate)(MPLTM+TDM)基佐剂(CORIXA,HAMILTON,MT)中，总共25μl)，以3至4天间隔，注射5只BALB/c小鼠的每个后脚垫。在7次加强后取血清样品，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)确定滴度，以鉴定具有IL-4阳性免疫反应的小鼠。通过脚垫(0.5μg在25μl中/脚垫),腹膜腔(2μg在100μl中),和静脉内(1μg在50μl中)途径，使用在PBS中的佐剂，再加强免疫小鼠两次。最后一次加强后三天，处死表现出ELISA阳性血清滴度的动物，并且使用电融合(CytoPulseSciences,Inc.,GlenBurnie,MD)，将脾细胞的单细胞悬浮液与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag.U.1(美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA)融合。使用次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸苷(HAT)选择，在来自杂交瘤选择试剂盒(StemCellTechnologies,Inc.,Vancouver,BC,Canada)的培养基D中，从未融合的脾、腘淋巴结或骨髓瘤细胞中，选择出融合的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞培养在杂交瘤选择试剂盒的培养基E中，细胞培养物上清液用于进一步表征和筛选。为了筛选产生的1921个杂交瘤细胞系，如前面所述(BAKER,K.N.,等,TRENDSBIOTECHNOL.20,149–156(2002))，实施了酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
我们鉴定了克隆19C11，其以≤10pM的亲合力结合人IL-4(通过表面等离子体共振(SPR)分析确定)。为了确定19C11是否阻断人IL-4与IL-4Rα结合，将生物素化的IL-4(0.17nM)与50μl的来自克隆19C11的系列稀释IgG上清液(1000,200,40,8,1.6,和0.32nM,终浓度)或对照抗体预先混合。在30分钟室温孵育后，将混合物转移到含有固定化的可溶性人IL-4Rα(R&DSystems,Minneapolis,MN)的NuncMaxisorp板中。为了固定化，4℃在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用2μg/mlIL-4Rα包被板子过夜，以固定可溶性人IL-4Rα。用200μL稀释在PBS中的0.5％牛血清白蛋白(SIGMA,ST.LOUIS,MO)溶液封闭板子，之后加入抗体/IL-4。加入抗体/IL-4混合物后，室温温育板子60分钟。温育后，用含有0.05％聚山梨醇酯20(Sigma)的PBS洗涤板子3次。将辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)以1:5000稀释在测试缓冲液中，向每孔中加入100μL。30分钟室温温育后，如上所述洗涤板子。加入100μLTMB底物，温育板子5至15分钟。通过加入1N磷酸终止反应。使用SpectraMax340读板器(MolecularDevices；Sunnyvale,CA)在OD450读ELISA板。使用Kaleidagraph绘图软件(SynergySoftware,Reading,PA)绘制曲线。
为了确定19C11是否封闭IL-4诱导的TF-1细胞增殖，将系列稀释的纯化19C11或无关对照抗体与IL-4及TF-1细胞一起孵育。48小时孵育后，每个样品接受3H-胸苷，并在4小时孵育后确定3H-胸苷的掺入。
19C11阻断了生物素化IL-4与IL-4Rα的结合(图1A),提示IL-4上的表位与参与结合IL-4Rα的区域重叠。19C11也抑制了IL-4-诱导的TF-1细胞增殖(图1B)。对于阻断IL-4诱导的TF-1细胞增殖，IC50经确定为0.014μg/ml，而IC90经确定为0.07μg/ml(数据未显示)。随后通过将高变区嫁接到具有选择点突变的人Vκ-1/VHIII受体构架中，人源化19C11。在人源化过程中保留了19C11的结合亲合力、表位、和细胞活性(数据未显示)。
实施例3-19C11的人源化
将来自mu19C11的高变区(HVRs)嫁接入人VLkappaI(huKI),VLkappaIII(huKIII),VH亚组I(huVH1)和VH亚组III(huVHIII)共有受体构架，以产生CDR嫁接物(19C11-κ1嫁接物,19C11-κ3嫁接物,19C11-VH1嫁接物,19C11-VH3嫁接物)(见图10至13)。在VL结构域中，嫁接了如下区域：位置24-34(HVRL1,SEQIDNO:15),50-56(HVRL2,SEQIDNO:16)和89-97(HVRL3,SEQIDNO:17)。在VH结构域中，嫁接了位置26-35b(HVRH1,SEQIDNO:12),49-65(HVRH2,SEQIDNO:13)和95-102(HVRH3,SEQIDNO:14)。
使用针对各高变区的分开寡核苷酸，通过Kunkel诱变，作为IgG表达构建体，产生了这些19C11-嫁接物。通过DNA测序，鉴定了正确克隆。为了潜在地加强19C11嫁接物的亲合力和功能，在VH结构域嫁接物中恢复了一些鼠vernier构架位置(见图12和13)。特别地，19C11-VH1嫁接物的位置67,69和71和19C11-VH3嫁接物的位置69,71和78被多样化，以产生19C11-VH1.L,19C11-VH1.FFL,19C11-VH3.LA,和19C11-VH3.FLA。此外，将突变D62S和F63V引入19C11-VH3.LA的CDR-H2，产生19C11-VH3.LA.SV(见图13)。
为了筛选目的，最初在6孔板中在293细胞中产生IgG变体。使用FuGene系统将编码VL和VH的载体(各2μg)转移到293细胞中。将6μlFuGene与不含PBS的100μlDMEM培养基混合，室温温育5分钟。向此混合物中加入每条链(2μg)，室温孵育20分钟，然而转移到6孔板用于在37℃和5％CO2中转染过夜。下一日，移出含有转染混合物的培养基，替换为2ml细胞培养基，例如含有FBS的DMEM。再孵育细胞5天，之后以1000rpm5分钟收获培养基，使用0.22μm低蛋白结合滤器无菌过滤。样品储存在4℃。
使用BIAcoreTM-A100，通过表面等离子体共振测定亲合力。抗人Fcγ抗体(大约～7000RU)在10mM乙酸钠pH4.8中固定在CM5芯片上。293细胞中表达的人源化19C11IgG变体通过抗人Fcγ抗体捕获。然后以30μL/min流速注射重组IL-4。每次注射后，使用3MMgCL2，再生芯片。通过从人源化19C11变体IgG流动池中扣除对照流动池，校正结合反应。使用同步拟合kon和koff的1:1Languir模型，进行动力学分析。
制备了十二种不同的人源化19C11变体，每个人源化轻链(19C11-κ1嫁接物,19C11-κ3嫁接物)分别与每个人源化重链(19C11-VH1嫁接物,19C11-VH1.L,19C11-VH1.FFL,19C11-VH3嫁接物,19C11-VH3.LA,和19C11-VH3.FLA)组合。通过SPR测试了十二种人源化19C11变体的IL-4亲合力，以及嵌合19C11(其中鼠可变区与人IgG恒定区组合)的IL-4亲合力(图14)。大多数变体保持了小于10pM的IL-4亲和力，除了19C11-VH1嫁接物/κ1嫁接物,19C11-VH3嫁接物/κ1嫁接物,19C11-VH3.FLA/κ1嫁接物,和19C11-VH3嫁接物/κ3嫁接物。19C11-VH1.FFL/κ3嫁接物和19C11-VH3.FLA/κ3嫁接物具有11pM的IL-4亲合力。
19C11-VH3.LA.SV/κ1嫁接物被选择用于进一步研究。SEQIDNOS:9和10中分别显示了人源化抗体19C11-VH3.LA.SV/κ1嫁接物(在以下实施例中称作抗-IL-4)的重链和轻链可变区序列。SEQIDNOS:12至14中显示了抗体19C11-VH3.LA.SV/κ1嫁接物的重链高变区(HVRs)，SEQIDNOS:15至17中显示轻链HVRs。
实施例4-产生IL-4/IL-13IgG1双特异性抗体
我们以前已经建立了在大肠杆菌中产生具有两种不同轻链的人IgG1双特异性抗体的技术(YU等,2011,SCITRANSLMED3,84RA44)。该方法利用杵进臼技术(RIDGWAY等,1996,PROTEINENG.9,617–621；ATWELL等,1997,JMOLBIOL270,26–35)促进免疫球蛋白重链的异二聚化。为了可以使用两种不同轻链而无轻链错配，我们在分开的大肠杆菌细胞中分别以hemimer的形式培养了各臂。我们应用该方法，通过将抗-IL-4和抗-IL-13亲本抗体亚克隆到载体中，允许抗IL-4臂表达为人IgG1臼和抗-IL-13臂表达为人IgG1杵，产生抗-IL-4/IL-13双特异性抗体。SEQIDNO:34中显示IgG1杵恒定区的序列，SEQIDNO:35中显示IgG1臼恒定区的序列。
对于双特异性抗体的抗IL-13Fab，我们以之前已经产生并表征过的lebrikizumab为基础。参见,例如,PCT公布号WO2005/062967A2。以低于10pM检测限的Biacore-源Kd，Lebrikizumab结合可溶性人IL-13。lebrikizumab与IL-13的结合不抑制该细胞因子与IL-13Rα1的结合，但确实阻断能够进行信号传导的异源二聚体IL-4Rα/IL-13Rα1复合物的随后形成(ULTSCH,M.等,2013,J.MOL.BIOL.,DX.DOI.ORG/10.1016/J.JMB.2013.01.024；CORREN等,2011,N.ENGL.J.MED.365,1088–1098)。
为了抗体表达，使用大肠杆菌菌株64B4。30℃在LB(100μg/ml羧苄青霉素)中生长过夜培养物，1:100稀释到5mlCRAP培养基(100μg/ml羧苄青霉素)(SIMMONS等,2002,J.IMMUNOL.METHODS,263:133-147)中并30℃培养24小时。表达后，可溶性级分进行SDS-PAGE，之后抗Fc免疫染色以分析半抗体物的形成。杵和臼突变两者均导致显著的半抗体物。为了将规模放大到10L发酵罐，将开始的起子培养物(500ml)培养到静止相，用于接种10L发酵罐(SIMMONS等,2002,J.IMMUNOL.METHODS,263:133-147)。
抗IL-13IgG1杵hemimer在大肠杆菌中的最初表达比预计的低。以前已经证实，Fab序列的随机诱变和/或置换疏水性表面残基可以导致改善的Fab稳定性和折叠(FORSBERG等,1997,J.BIOL.CHEM.,272:12430-12436；DEMAREST等,2006,PROTEINENG.DES.SEL.,19:325-336；KUGLER等,2009,PROTEINENG.DES.SEL.,22:135-147)。
在大肠杆菌细胞中表达变体，通过非还原SDS-PAGE和随后的抗Fc免疫印迹分析了非还原的全细胞提取物。使用(LiCORBiosciences)定量hemimer带，并相对于lebrikizumab信号进行了标化。
发现重链和轻链中的几个变化可以改善hemimer产量和/或折叠。选择了其中一个改变，即，轻链中的M4L。此外，在重链中引入Q1E改变。在单个hemimer中组合这两个变化，发现得到的hemimer具有优于野生型hemimer的改善产量和折叠。lebrikizumabQ1E重链可变区的序列示于SEQIDNO:19中，lebrikizumabM4L轻链可变区的序列示于SEQIDNO:20中。使用这些变体区域构建抗IL-4/IL-13IgG1双特异性抗体。
使用先前描述的方法，例如，在美国专利公布号2011/0287009和国际专利申请号PCT/US2012/059810中描述的方法，通过氧化还原化学，从分离的半抗体组装了完整的双特异性抗体。
实施例5-产生IL-4/IL-13IgG4双特异性抗体
在建立了人IgG1同种型抗IL-4/IL-13双特异性抗体的产生后，我们将该双特异性平台变为人IgG4同种型。我们希望产生人IgG4抗体形式的抗-IL-4/IL-13双特异性抗体以匹配lebrikizumab的同种型，该抗IL-13抗体lebrikizumab已经在中度至重度的不受控哮喘治疗中显示出临床益处(Corren等.,2011,N.Engl.J.Med.365,1088–1098)。
相对于IgG1，IgG4的重-轻链间二硫键由不连续的二硫键形成。该不连续二硫键连接模式对于大肠杆菌蛋白是不常见的(BERKMEN,2005,J.BIOL.CHEM.280,11387-11394).。此外，S228残基可以使IgG4的铰链区失稳定，且IgG4的CH3二聚体界面含有失稳定性R409残基(Dall'Acquaetal.,1998,Biochemistry37,9266-9273)(EU编号惯例)我们设计了几种构建体以解剖IgG4Fc区序列、链间二硫键模式、和CH3R409对半抗体在大肠杆菌中的功能性表达和随后的双特异性分子组装的影响。在每种情况下，我们均在铰链区中引入了稳定性S228P突变以减少组装后Fab臂交换(STUBENRAUCH等,2010,DRUGMETAB.DISPOS.38,84-91)。我们首先将具有相应杵/臼突变(杵:T366W；臼:T366S,L368A,Y407V)的IgG4Fc区嫁接到IgG1Fab上，以评价IgG4Fc区对半抗体功能性表达的影响。对于两种抗体,抗-IL-4和抗体-IL-13,这均产生了与IgG1同种型相似量的二硫键连接的物质(图2C和2D),说明Fc区中同种型的差异不影响半抗体在大肠杆菌中的功能性表达。接着我们将重链的整个恒定区转变为IgG4亚类。尽管这导致了功能性表达的半抗体的减少，但证实了，大肠杆菌原则上能够在抗体恒定区中从非连续半胱氨酸形成分子内二硫键。
由于位置409可能对于CH3稳定性是重要的(Dall'Acquaetal.,1998,Biochemistry37,9266–9273)，并且由于在该阶段R409对于下游组装过程的影响不清楚，所以我们也设计了具有R409K突变的构建体，以重新产生IgG1同种型中的CH3界面。对于两种抗体，这部分地挽救了IgG4同种型功能性表达的轻微下降(图2C和2D)。
实施例6-组装和纯化IL-4/IL-13双特异性抗体
为了比较不同双特异性抗体构建体的组装，我们生长了以IgG1,IgG4和IgG4R409K形式表达半抗体的培养物。通过蛋白A层析纯化半抗体后，混合hemimer对，通过异二聚体化的杵/臼对的氧化还原化学步骤形成了完整双特异性抗体。通过阴离子和阳离子交换层析步骤，移出过量的半抗体。最终层析步骤后，将物质以45g/l配制在0.2M精氨酸琥珀酸盐pH5.5,0.02％-聚山梨醇酯20中。为了证实组装的抗体从半抗体物转移为稳定的完整抗体，我们通过大小排阻层析进行了抗体表征。所有三个构建体均以相应于完整150kDa抗体的保留时间洗脱(图3A)。此外，没有检测到显著量的聚集物(对于IgG1/IgG4/IgG4R409K，0.6/0.4/0.4％)并仅检测到痕量的低分子量物(对于IgG1/IgG4/IgG4R409K，0.2/0/4.4％)，说明两种同种型均能够用于组装具有低聚集倾向的抗体。
双特异性组装过程中一个步骤是形成铰链二硫键。由于大小排阻层析不能解析链间二硫键的氧化态，我们对抗体进行了毛细管电泳-十二烷基硫酸钠分析(CE-SDS)，发现所有三种形式均以相似效率形成了铰链-二硫键。对于IgG1,IgG4和IgG4R409K,分别观察到89.3％,91.4％和86.7％的物质为完全氧化的构象(图3B)。接着我们还原了样品，重新通过CE-SDS进行分析，以确定轻链和重链的相应比率(图3C)。所有三种形式均具有相似的和预期的轻链(对于IgG1/IgG4/IgG4R409K，31.3/31.4/30.9％)和重链(对于IgG1/IgG4/IgG4R409K，65.8/64.9/65.4％)分布，进一步证实天然抗体构象的存在。
为了确保在组装过程中产生异二聚物，我们通过质谱分析了最终的双特异性分子。完整的和还原的质量总结在表2、图4和表3中。对于所有三种双特异性抗体，实验质量与理论质量紧密匹配，未能检测到相应于同二聚物的任何质量。反相HPLC测定法进一步证实，这些抗体是双特异性的，没有同二聚体抗体的迹象(数据未显示)。
表2非还原抗IL-4/IL-13双特异性抗体的质谱分析
n.o.未观察到
表3：还原的抗IL-4/IL-13双特异性抗体的质谱分析
LC轻链，HC重链
由于未能在R409和R409KIgG4双特异性杵进臼抗体组装中检测到任何显著差异，故所有其它研究均使用野生型(R409)IgG4双特异性抗体形式。
实施例7-IL-4/IL-13IgG1双特异性抗体的生化表征
接着，我们表征了IgG1和IgG4双特异性抗体以评价是否它们对IL-4和IL-13的结合亲合力以及它们阻断IL-4和IL-13结合其受体的能力是相当的。IgG1和IgG4双特异性抗体对IL-4和IL-13的亲合力如实施例1所述通过Biacore测量，发现它们是相当的(表4)并与亲本抗体是相似的，说明结合配体的能力不受双特异性形式或同种型的影响。
抗IL-4/IL-13双特异性抗体以高亲合力结合人IL-13、人IL-13R130Q(SEQIDNO:31),和食蟹猴IL-13。针对这些细胞因子分别计算了0.056,0.142,和0.048(nM)的解离常数。表4提供了动力学常数。其它SPR实验显示，抗IL-4/IL-13双特异性抗体以高亲合力结合人IL-4和食蟹猴IL-4。针对这些细胞因子分别计算了0.046和0.076nM的解离常数。表4提供了动力学常数。
表4抗IL-4/IL-13双特异性抗体的结合动力学
为了确保双特异性分子能阻断细胞因子与其受体的结合，使用了基本上如实施例1所述的ELISA结合竞争测定法。抗-IL-4/IL-13双特异性抗体抑制了生物素化的人IL-4(5.8ng/mL)与人IL4R的直接结合(见图15)。以0.035至25μg/mL(0.23至167nM)的双特异性抗体，观察到生物素化IL-4结合IL4R的减少。
相反地，抗-IL-4/IL-13双特异性抗体不抑制生物素化的人IL-13(0.625μg/mL)与人IL-13Rα1的直接结合(见图16)。以测试的浓度加入双特异性抗体，没有观察到生物素化的人IL-13与IL-13Rα1结合的减少。
抗-IL-4/IL-13双特异性抗体不实质性地抑制生物素化的人IL-13(0.056μg/mL)与人IL-13Rα2的直接结合(见图17)。观察到生物素化的人IL-13与IL-13Rα2结合的部分减少。
如实施例1所述，使用SPR观察IL-13Rα2与IL-13的结合。将一系列浓度的IL-13Rα2注射到固定化的IL-13上，收集传感图。基于这些传感图，观察到0.365nM的结合常数(Kd)(kon＝24.27x104±0.49Ms-1,koff＝0.891x10-4±0.026s-1)。之前已经在分开的SPR实验中证实了抗IL-4/IL-13双特异性抗体以高亲合力(Kd＝56pM)结合人IL-13(见表4)。为了检查对IL-13Rα2结合IL-13的抑制作用,将250nM抗-IL-4/IL-13双特异性抗体注射到固定化的IL-13上，之后注射IL-13Rα2。双特异性抗体的结合没有阻止IL-13Rα2与固定化的IL-13结合(见图18)。IL-13Rα2与双特异性抗体:IL-13复合物结合的Kd是1.09nM(kon＝10.06x104±0.56Ms-1,koff＝1.10x10-4±0.12s-1)。固定化IL-13用双特异性抗体预饱和仅仅适度地破坏了IL-13Rα2与IL-13的结合，说明双特异性抗体对IL13与IL-13Rα2结合的抑制作用不显著。
因此，类似于亲本抗-IL-4和抗IL-13抗体，双特异性抗体完全地抑制了IL-4与IL-4Rα的结合，并且不实质性地抑制IL-13与IL-13Rα1或IL-13Rα2的结合。这些发现说明，IL-13和IL-4臂的结合表位和单价亲合力均在双特异性抗体中得到保留。
实施例8-在细胞测定法中中和IL-4和IL-13活性。
在体外细胞测定法中评价了抗-IL-4/IL-13IgG1和抗IL-4/IL-13IgG4双特异性抗体两者的活性，在所述测定法中人IL-4和IL-13诱导TF-1细胞增殖。如下所述评价了每种双特异性抗体阻断人IL-4和人IL-13单独和组合地诱导TF-1细胞增殖的能力。
在96孔组织培养板(目录号353072,FALCONBD,FRANKLINLAKES,NJ)中，在50μl含有细胞因子的测定培养基中将抗体3.3倍系列稀释。37℃温育板子30分钟。在测定培养基中洗涤TF-1细胞两次，并以2.5x105细胞/ml的终体积重悬。向每孔加入50μl细胞，得到总体积100μl。板子在增湿保温箱中37℃和5％CO2中孵育4天，之后每孔加入1μCi3H胸苷。再孵育4小时后，使用液体闪烁计数器，通过细胞相关的3H胸苷掺入，测量了增殖。从一式两份样品获得的结果以平均值表达。使用KaleidaGraph(SYNERGYSOFTWARE,READING,PA)制图。
抗-IL-4/IL-13IgG1和抗-IL-4/IL-13IgG4双特异性抗体两者均以剂量依赖性方式抑制了人IL-4和IL-13诱导的TF-1细胞增殖，两种不同双特异性抗体在体外中和IC50方面没有显著差异(图5和表5)。
表5：抗IL-4/IL-13双特异性抗体的TF-1增殖抑制测定试验的IC50
进行了相似分析，以确定针对食蟹猴IL-4和IL-13诱导的TF-1细胞增殖，抗-IL-4/IL-13IgG1和抗-IL-4/IL-13IgG4双特异性抗体是否以剂量依赖性方式发挥抑制作用(图6)。
实施例9-在食蟹猴中的药代动力学研究
我们评价了在向食蟹猴单次静脉内(IV)或皮下(SC)施用后IgG4和IgG1抗-IL-4/IL-13双特异性抗体的体内药代动力学。在食蟹猴中的该药代动力学(PK)研究获得实验动物保护和使用协会(IACUC)批准。在CharlesRiver实验室(CRL)临床前服务站(Reno,NV)，进行了抗-IL-4/IL-13IgG4的PK研究。来自CRL库存的总共15只雌性食蟹猴(2.2–2.6kg)随机分成5组(n＝3/组)。组1的动物接受对照运载体(vehicle)的静脉内(IV)和皮下(SC)给药。组2,3,和4的动物分别接受10,30,和100mg/kg抗-IL-4/IL-13IgG4的单剂IV快速浓注(bolus)给药。组5的动物接受10mg/kg抗-IL-4/IL-13IgG4的SC给药。
在ShinNippon生物化学实验室(SNBL)USA(Everett,WA)，进行了抗-IL-4/IL-13IgG1的PK研究。来自SNBL库存的总共12只雌性食蟹猴(2.4–3.1kg)随机分成4组(n＝3/组)。组1的动物接受对照运载体(vehicle)的静脉内(IV)给药。组2,3,和4的动物分别接受10,30,和60mg/kg抗-IL-4/IL-13IgG1的单剂IV快速浓注给药。
对于两个研究，在不同时间点收集血清样品直到给药后4-5周，通过定量限0.078μg/mL的ELISA评价了抗IL-4/IL-13IgG4或抗-IL-4/IL-13IgG1的浓度，并通过桥式ELISA评价了抗治疗性抗体(ATA)。对于PK数据收集，将研究第1日转化为PK第0日，以指示剂量施用开始。在该实际(inlife)给药日后的所有时间点均计算为研究日减1。使用2室分析，采用的5.2.1版本(Pharsight；MountainView,CA)，分析了每个动物的血清浓度数据。
抗IL-4/IL-13IgG4和抗IL-4/IL-13IgG1双特异性抗体的血清浓度-时间曲线显示了双相处置(biphasicdisposition)和跨测试剂量范围的线性药代动力学(图7A和7B)。对于两种抗体，中央室的最初体积与血清体积相似，说明限制的分布。如针对人IgG4和IgG1抗体在食蟹猴中预期的一样，两种抗体均具有相对慢的清除(CL)和长终末半衰期(terminalhalf-life)(平均CL＝5.79至6.70mL/天/kg对于抗-IL-4/IL-13IgG4，3.59至4.09mL/天/kg对于抗-IL-4/IL-13IgG1)。基于针对10mg/kg剂量组计算的曲线下面积(AUC),抗IL-4/IL-13IgG4抗体的SC生物利用率是95.1％。在50％的抗-IL-4/IL-13IgG4给药的动物中检测到存在抗治疗性抗体(ATA)，包括在100mg/kgIV剂量组中的所有3只动物，ATA的存在看起来与第14天后抗-IL-4/IL-13IgG4的清除增加相关。在抗IL-4/IL-13IgG1处理的动物中检测到低ATA发生率，其看起来不影响PK。总之，抗-IL-4/IL-13IgG4和抗-IL-4/IL-13IgG1双特异性抗体的药代动力学是相似的，并与其它人源化IgG1和IgG4单克隆抗体在食蟹猴中的药代动力学是相当的。
实施例10-在食蟹猴哮喘模型中的肺分配
我们在食蟹猴哮喘模型中评价了IgG4相对于IgG1抗-IL-4/IL-13双特异性抗体在肺分配上的潜在差异。在该哮喘模型中，对Ascarissuum(A.suum)天然敏化的食蟹猴进行A.suum提取物的气雾剂攻击，以引发可以模拟暴露于变应原的哮喘患者的变应性炎症反应。
在食蟹猴中的该肺分配研究获得IACUC批准。在CRL临床前服务站(Reno,NV)，进行了比较抗-IL-4/IL-13IgG4和抗-IL-4/IL-13IgG1的该研究。研究由两个不同部分组成。第一部分，来自CRL库存的食蟹猴(3-10kg)接受基线Ascarissuum(Asuum)气雾剂攻击以确定Asuum攻击在每只动物中引发合适气道反应的适宜性。在整个攻击期间监测动物的窘迫迹象，在该部分中不给予抗体。4周后，开始第二部分，总共7只雄性食蟹猴随机分为2组(在IgG4组n＝3；在IgG1组n＝4)。然后，这些食蟹猴通过IV快速浓注给药在第1研究日和第8研究日接受10mg/kg抗-IL-4/IL-13IgG4或抗-IL-4/IL-13IgG1。随后，在第9研究日，通过气雾剂吸入Asuum，攻击动物。在不同时间点直到给药后23天，收集支气管肺泡灌洗液(BAL)和血清样品，通过定量限0.078μg/mL的ELISA分析抗-IL-4/IL-13IgG4或抗-IL-4/IL-13IgG1浓度。对于数据计算，将研究第1日转化为PK第0日，以指示剂量施用开始。在该实际(inlife)给药日后的所有时间点均计算为研究日减1。在BAL和血清中测量尿素和白蛋白以分别估计上皮衬液(ELF)浓度以及就炎症诱导的血管渗漏进行校正。也通过ELISA在血清中测量了Ascaris特异性IgE。如RENNARD等,1986,J.APPL.PHYSIOL.,60(2):532-538所述，使用BAL和血清尿素浓度数据估计了稀释因子。
在第1和8研究日进行10mg/kgIV施用和第9研究日用A.suum提取物进行肺攻击后，我们比较了抗IL-4/IL-13IgG4和抗-IL-4/3IgG1抗体的血清浓度和上皮衬液(ELF)浓度。如例如RENNARD等,1986,J.APPL.PHYSIOL.,60(2):532-538.所述，针对BAL液体收集程序固有的稀释，校正BAL液IgG浓度数据，从而获得ELF中IgG浓度值。抗-IL-4/IL-13IgG4和抗-IL-4/IL-13IgG1双特异性抗体的血清与肺分配在整个研究长度上是相当的(图8)。在变应原攻击前，两种抗体的ELF浓度均大约为IgG血清浓度的1％-4％，说明仅小部分系统抗体达到ELF。第9研究日A.suum的吸入攻击看起来导致两种抗体的增加的肺分配。然而，当将IgG浓度相对于ELF中的白蛋白浓度标化并将这些值与血清IgG浓度比较时，这些数据表明，在呼吸攻击后增加的ELFIgG浓度是由攻击诱导的非特异性大分子血管渗漏导致的。
实施例11-抗-IL-4,抗-IL-13,和抗-IL-4/IL-13抗体在小鼠变应性气道炎症和哮喘模型中的功效
在本研究中使用了8只BALB/c小鼠(CharlesRiverLaboratories)。在第0日，所有小鼠用100μl无菌PBS中在2mg明矾中的50μg三硝基苯基-卵白蛋白(trinitrophenyl-ovalbumin，TNP-OVA)腹膜内(IP)免疫。免疫后第35天开始，所有小鼠每日用PBS中1％TNP-OVA通过雾化器进行30分钟的气雾剂攻击，连续7日。如图9A所示，第37天开始，每日用单克隆抗体(mAbs)处理小鼠，其中在每次气雾剂攻击(7天)前4小时IP施用所述抗体。
第42天，麻醉下对所有小鼠进行眶后取血以最终获得200μl血清(以测量研究期间达到的TNP-OVA-特异性IgE,IgG1，和抗体血清浓度)。在异氟烷麻醉下进行小鼠眶内采血以获得血清样品用于TNP-OVA特异性免疫球蛋白和血清TARC(胸腺活化调节趋化因子，thymusandactivationregulatedchemokine)的ELISA测量。收集支气管肺泡灌洗液样品用于差异计数。用冷PBS灌洗肺，之后通过FACS分析。将肺切成片，然后通过金属捣碎机捣碎，以获得单细胞悬液，然后通过0.7μm尼龙滤器过滤。肺样品重悬在5ml中。将固定体积的细胞悬液加入固定浓度的FITC标记的荧光珠中，在流式细胞仪上分析，每样品收集5000个珠事件以获得细胞计数。对于肺的定量和表型分析，用抗表面白细胞标记物的荧光染料标记的mAb(CD44-FTC,CD4-APC,CCR3-Pe和CD4-APC,或CD11c-FITC,CD11b-PE和Gr-1-APC；BDBiosciences,SanJose,CA)，染色每样品的3百万个肺细胞。在BDFACSCalibur(BD,SanJose,CA)上运行样品，并在Flowjo软件(Ashland,OR)上分析。
图9B-9E中显示实验结果。抗-IL-4/IL-13双特异性抗体的施用与抗IL-4抗体相比以更大程度抑制了肺嗜酸性粒细胞(p＝0.0381),并且看起来比抗IL-13抗体以更大程度抑制肺嗜酸性粒细胞,尽管该差异没有达到统计学显著性(p＝0.1803)(图9B)。相似地，抗-IL-4/IL-13双特异性抗体的施用与抗IL-4抗体(p＝0.0031)或抗IL-13抗体(p＝0.0135)相比以更大程度抑制了支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞(图9C)。与对照处理相比，施用抗IL-4抗体或抗IL-4/IL-13双特异性抗体看起来减少TNP-OVA-特异性IgE，尽管该结果没有达到统计学显著性(图9D)。最后，抗-IL-4/IL-13双特异性抗体的施用与抗IL-4抗体或抗IL-13抗体(分别为p<0.0001和p＝0.0323)相比以更大程度抑制了血清TARC水平(图9E)。
讨论
在此，我们应用了以前开发的杵进臼双特异性抗体平台产生抗细胞因子IL-4和IL-13的人IgG1和人IgG4双特异性抗体。鉴于IL-4和IL-13的重叠的和独特的生物学、以及抗IL-13抗体在中度至重度哮喘治疗中的活性，靶向IL-4和IL-13两者的双特异性抗体可能是优于抗IL-13的用于哮喘治疗的改良疗法。实施例11中给出的数据支持了此假设。我们的抗-IL-4/IL-13双特异性抗体是抗IL-13抗体lebrikizumab的延伸，lebrikizumab在中度至重度不受控哮喘中在II期研究中显示了临床功效。由于lebrikizumab是人IgG4抗体，我们使用了杵进臼双特异性抗体平台和人IgG4以使我们的抗IL-4/IL-13双特异性抗体的同种型与lebrikizumab的匹配。
人IgG1和IgG4同种型的一个关键区别是CH3二聚体界面，其影响二聚体稳定性。差异由位置409驱动。我们的结果证实，杵进臼突变与IgG4CH3结构域中的Arg409，在半抗体表达和双特异抗体组装方面，均是相容的。我们未检测到两种不同同种型在组装效率或在最终抗体物质的质量上的任何显著差异。
尽管在哺乳动物细胞中成熟建立了各种同种型的人抗体的表达，但是一直较少尝试在大肠杆菌中表达不同人抗体同种型，因此，全长或半抗体人IgG4同种型在大肠杆菌中的表达并没有充分的文献报道。在此，我们针对这些抗IL-4/IL-13双特异性抗体证实，人IgG4hemimer可以成功地在大肠杆菌细胞中大量地表达，并和人IgG1双特异性抗体一样容易地组装为双特异性抗体。
杵进臼技术的标志之一是，在最终双特异性分子中单价亲本抗体的生物物理性质的保持。IgG1和IgG4双特异性抗体均保留了亲本Fab的靶表位和结合性质，包括对IL-4或IL-13靶细胞因子的高亲合力，从而在体外细胞测定试验中导致高效力。
食蟹猴中药代动力学研究证实IgG1和IgG4双特异性抗体两者的缓慢清除和相似的终末半衰期。此外，IgG1和IgG4双特异性抗体两者以如下水平相当地从血清向肺分配，所述水平使得可以完全中和肺中的致病性IL-4和IL-13，这对于哮喘治疗是重要的。尽管在食蟹猴中与IgG1双特异性抗体相比IgG4双特异性抗体表现出具有更高ATA率，但是考虑到我们研究中使用的动物数量小以及缺乏人源化抗体在食蟹猴中相对于在人中免疫原性的明确关系，有关我们的抗IL-4/IL-13IgG4和IgG1双特异性抗体在人中的相对免疫原性，不能作出任何结论。然而，应当注意，除了抗体Fab的CDR区外，我们的双特异性抗体由全人IgG1和IgG4序列组成，其应当在人中表现出极小的免疫原性。因此，我们产生的双特异性抗体是临床开发哮喘和IPF及其它呼吸病症治疗的良好候选者。而且，基于本文提供的体内数据，自然可以达到治疗人病症，例如哮喘、IPF和其它呼吸病症的方法。
不同人同种型的抗体可以因在结合血清补体蛋白和免疫效应细胞上的Fcγ受体方面的差异而具有非常不同的体外和体内性质(Nirula,A.etal.,2011,CurrOpinRheumatol23,119–124)。特别地，人IgG1同种型抗体可以有效地激活补体系统和与Fcγ受体结合以触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，而人IgG4同种型抗体不激活补体系统并具有减少的ADCC。重要的是，抗体效应子功能中的这些性质要求抗体糖基化(在哺乳动物细胞中在表达过程中产生)。在细菌细胞例如大肠杆菌中产生的抗体无论何种同种型均由于缺乏抗体糖基化而缺乏抗体效应子功能(Jung,S.T.etal.,2011,Curr.Opin.Biotechnol.22,858–867；Simmons,L.C.,etal.,2002,JImmunolMethods263,133–147)。尽管在本研究中产生的双特异性抗体在大肠杆菌中产生并因此缺乏糖基化和Fc效应子功能，但是本文所述双特异性抗体也可以在哺乳动物细胞中产生。该方法可以将用于这些抗体的杵进臼双特异性抗体平台有效地延伸至包括完全糖基化的双特异性抗IL-4/IL-13人IgG1和IgG4抗体同种型，并且这又可以提供广泛范围的具有不同效应子功能的治疗性双特异性抗体。
尽管为了用于理解清楚的目的本发明已通过举例说明和实施例一定详细地进行了描述，但说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地整体引入作为参考。
序列表

Claims (68)

1.多特异性抗体，其包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含特异地结合IL-4的第一VH/VL单位和特异地结合IL-13的第二VH/VL单位，其中所述抗体:
a)抑制IL-4与IL-4受体α(IL-4Rα)的结合，
b)在体外抑制IL-4-诱导的细胞增殖，和/或
b)在体外抑制IL-13-诱导的细胞增殖。
2.权利要求1的多特异性抗体，其中第一VH/VL单位包括包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2。
3.权利要求1或权利要求2的多特异性抗体，其中第一VH/VL单位包括包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。
4.权利要求1-3之任一项的多特异性抗体，其中第一VH/VL单位包括包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
5.权利要求1-4之任一项的多特异性抗体，其中第一VH/VL单位包含：(a)与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)的VH序列和(b)的VL序列。
6.权利要求1-5之任一项的多特异性抗体，其中第一VH/VL单位包含选自SEQIDNOs:1和3至9的VH序列。
7.权利要求1-6之任一项的多特异性抗体，其中第一VH/VL单位包含选自SEQIDNOs:2、10和11的VL序列。
8.权利要求1的多特异性抗体，其中第一VH/VL单位包含SEQIDNO:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列。
9.权利要求1-8之任一项的多特异性抗体，其中第二VH/VL单位包含：
(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2；或
(b)包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2。
10.权利要求1-9之任一项的多特异性抗体，其中第二VH/VL单位包含：
(a)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列或SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-H3；或
(b)包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的HVR-H3。
11.权利要求1-10之任一项的多特异性抗体，其中第二VH/VL单位包含：
(a)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的HVR-L3；或
(b)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L3。
12.权利要求1-11之任一项的多特异性抗体，其中第二VH/VL单位包含：
(a)与SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(b)与SEQIDNO:20的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；
(c)(a)的VH序列和(b)的VL序列；
(d)与SEQIDNO:49的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；
(e)与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或
(f)(d)的VH序列和(e)的VL序列。
13.权利要求1-12之任一项的多特异性抗体，其中第二VH/VL单位单位包含选自SEQIDNOs:19、56或49的VH序列。
14.权利要求1-13之任一项的多特异性抗体，其中第二VH/VL单位单位包含选自SEQIDNOs:20、57或48的VL序列。
15.权利要求1-14之任一项的多特异性抗体，其中第二VH/VL单位单位包含选自SEQIDNOs:19或56的VH序列和SEQIDNO:20或57的VL序列；或SEQIDNOs:49的VH序列和SEQIDNO:48的VL序列。
16.权利要求1-15之任一项的多特异性抗体，其中该抗体与包含SEQIDNOs:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列的抗体竞争结合IL-4。
17.权利要求1-16之任一项的多特异性抗体，其中该抗体与包含SEQIDNOs:19的VH序列和SEQIDNO:20的VL序列的抗体，或与包含SEQIDNOs:49的VH序列和SEQIDNO:48的VL序列的抗体，竞争结合IL-13。
18.权利要求1-17之任一项的多特异性抗体，其中该抗体结合SEQIDNO:29的氨基酸77至89中的、或SEQIDNO:29的氨基酸82至89中的表位。
19.多特异性抗体，其包含特异地结合IL-4的第一VH/VL单位和特异地结合IL-13的第二VH/VL单位，其中第一VH/VL单位包含SEQIDNOs:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列，且第二VH/VL单位包含SEQIDNO:19的VH序列和SEQIDNO:20的VL序列。
20.前述权利要求任一项的多特异性抗体，其中该抗体是IgG抗体。
21.权利要求20的多特异性抗体，其中所述抗体是IgG1或IgG4抗体。
22.权利要求21的多特异性抗体，其中所述抗体是IgG4抗体。
23.前述权利要求任一项的多特异性抗体，其中该抗体包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中第一重链恒定区包含杵突变，第二重链恒定区包含臼突变。
24.权利要求23的多特异性抗体，其中第一重链恒定区与结合IL-4的VH/VL单位的重链可变区部分融合。
25.权利要求23或24的多特异性抗体，其中第二重链恒定区与结合IL-13的VH/VL单位的重链可变区部分融合。
26.权利要求23的多特异性抗体，其中第一重链恒定区与结合IL-13的VH/VL单位的重链可变区部分融合。
27.权利要求23或26的多特异性抗体，其中第二重链恒定区与结合IL-4的VH/VL单位的重链可变区部分融合。
28.权利要求23至27任一项的多特异性抗体，其中所述抗体是IgG1抗体，所述杵突变包含T366W突变。
29.权利要求23至28任一项的多特异性抗体，其中所述抗体是IgG1抗体，其中所述臼突变包含选自T366S,L368A,和Y407V的至少一个、至少两个、或三个突变。
30.权利要求23至27任一项的多特异性抗体，其中所述抗体是IgG4抗体，所述杵突变包含T366W突变。
31.权利要求23至27和30任一项的多特异性抗体，其中所述抗体是IgG4抗体，其中所述臼突变包含选自T366S,L368A,和Y407V突变的至少一个、至少两个、或三个突变。
32.权利要求23的多特异性抗体，其中该抗体包含含有SEQIDNO:34的序列的第一重链恒定区。
33.权利要求23或32的多特异性抗体，其中该抗体包含含有SEQIDNO:35的序列的第二重链恒定区。
34.权利要求23的多特异性抗体，其中该抗体包含含有SEQIDNO:36的序列的第一重链恒定区。
35.权利要求23或34的多特异性抗体，其中该抗体包含含有SEQIDNO:37的序列的第二重链恒定区。
36.结合IL-4和IL-13的多特异性抗体，其中该抗体包含含有SEQIDNO:38的序列的第一重链、含有SEQIDNO:39的序列的第一轻链、含有SEQIDNO:40的序列的第二重链、含有SEQIDNO:41的序列的第二轻链。
37.结合IL-4的分离抗体，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3、和包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2；或
(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、和包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；或
(c)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、和包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3；或
(d)与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或
(e)与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列。
38.权利要求37的分离的抗体，其中该抗体包括包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQIDNO:13或SEQIDNO:18的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2、包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。
39.权利要求37或38的分离的抗体，其中该抗体包括与SEQIDNO:9的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列。
40.权利要求37-39之任一项的分离的抗体，其中该抗体包含选自SEQIDNOs:1和3至9的VH序列。
41.权利要求37-40之任一项的分离的抗体，其中该抗体包含选自SEQIDNOs:2、10和11的VL序列。
42.分离的抗体，其中该抗体包含SEQIDNOs:9的VH序列和SEQIDNO:10的VL序列。
43.分离的核酸，其编码：
(a)权利要求1至42之任一项的抗体；
(b)权利要求1-34之任一项的多特异性抗体的第一VH/VL单位；或
(c)权利要求1-34之任一项的多特异性抗体的第二VH/VL单位。
44.宿主细胞，其包含权利要求43的核酸。
45.权利要求44的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞或CHO细胞。
46.产生抗体的方法，包括培养权利要求44或权利要求45的宿主细胞。
47.免疫缀合物，其包含权利要求1至42之任一项的抗体和细胞毒性剂。
48.包含权利要求1-42之任一项的抗体和可药用载体的药物制剂。
49.权利要求1至42之任一项的抗体用作药物。
50.权利要求1至42之任一项的抗体用于治疗嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、IL-4介导的病症、或呼吸病症。
51.权利要求50的抗体，其中嗜酸性粒细胞病症选自：哮喘、重度哮喘、慢性哮喘、特应性哮喘、特应性皮炎、变态反应、变应性鼻炎、非变应性鼻炎、接触性皮炎、多形红斑、大疱皮肤病、银屑病、湿疹、类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎、慢性嗜酸性肺炎、变应性支气管肺曲霉病、腹腔疾病、丘斯综合征(特应性结节性动脉外膜炎)、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征、嗜酸性粒细胞增多综合征、水肿反应，包括周期性血管性水肿、蠕虫感染、荨麻疹、盘尾丝虫皮炎、嗜酸性粒细胞相关胃肠道病症、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞性胃炎、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、嗜酸性粒细胞性肠炎、嗜酸性粒细胞性结肠炎、溃疡性结肠炎、惠普尔病、鼻微息肉病、鼻息肉病、阿司匹林不耐受、阻塞性睡眠呼吸暂停、局限性回肠炎、硬皮病、心肌内膜纤维化、纤维化、炎性肠病、特发性间质性肺炎、嗜酸性肺炎、超敏性肺炎、杯状细胞化生、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、硬化症继发的肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、眼色素层炎、癌症、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
52.权利要求50的抗体，其中IL-13介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
53.权利要求50的抗体，其中IL-4介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
54.权利要求50的抗体，其中呼吸病症选自：哮喘、变应性哮喘、非变应性哮喘、支气管炎、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、香烟诱导的肺气肿、气道炎症、囊性纤维化、肺纤维化、变应性鼻炎、和支气管扩张。
55.权利要求1至42之任一项的抗体在制备用于治疗嗜酸性粒细胞病症、IL-13介导的病症、IL-4介导的病症、或呼吸病症的药物中的用途。
56.权利要求55的用途，其中嗜酸性粒细胞病症选自：哮喘、重度哮喘、重度哮喘、慢性哮喘、特应性哮喘、特应性皮炎、变态反应、变应性鼻炎、非变应性鼻炎、接触性皮炎、多形红斑、大疱皮肤病、银屑病、湿疹、类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎、慢性嗜酸性肺炎、变应性支气管肺曲霉病、腹腔疾病、丘斯综合征(特应性结节性动脉外膜炎)、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征、嗜酸性粒细胞增多综合征、水肿反应，包括周期性血管性水肿、蠕虫感染、荨麻疹、盘尾丝虫皮炎、嗜酸性粒细胞相关胃肠道病症、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞性胃炎、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、嗜酸性粒细胞性肠炎、嗜酸性粒细胞性结肠炎、溃疡性结肠炎、惠普尔病、鼻微息肉病、鼻息肉病、阿司匹林不耐受、阻塞性睡眠呼吸暂停、局限性回肠炎、硬皮病、心肌内膜纤维化、纤维化、炎性肠病、特发性间质性肺炎、嗜酸性肺炎、超敏性肺炎、杯状细胞化生、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、硬化症继发的肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、眼色素层炎、癌症、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
57.权利要求55的用途，其中IL-13介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
58.权利要求55的用途，其中IL-4介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
59.权利要求55的用途，其中呼吸病症选自：哮喘、变应性哮喘、非变应性哮喘、支气管炎、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、香烟诱导的肺气肿、气道炎症、囊性纤维化、肺纤维化、变应性鼻炎、和支气管扩张。
60.治疗患有嗜酸性粒细胞病症的个体的方法，包括向个体施用有效量的权利要求1-42之任一项的抗体。
61.权利要求60的方法，其中嗜酸性粒细胞病症选自：哮喘、重度哮喘、慢性哮喘、特应性哮喘、特应性皮炎、变态反应、变应性鼻炎、非变应性鼻炎、接触性皮炎、多形红斑、大疱皮肤病、银屑病、湿疹、类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎、慢性嗜酸性肺炎、变应性支气管肺曲霉病、腹腔疾病、丘斯综合征(特应性结节性动脉外膜炎)、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征、嗜酸性粒细胞增多综合征、水肿反应，包括周期性血管性水肿、蠕虫感染、荨麻疹、盘尾丝虫皮炎、嗜酸性粒细胞相关胃肠道病症、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞性胃炎、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、嗜酸性粒细胞性肠炎、嗜酸性粒细胞性结肠炎、溃疡性结肠炎、惠普尔病、鼻微息肉病、鼻息肉病、阿司匹林不耐受、阻塞性睡眠呼吸暂停、局限性回肠炎、硬皮病、心肌内膜纤维化、纤维化、炎性肠病、特发性间质性肺炎、嗜酸性肺炎、超敏性肺炎、杯状细胞化生、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、硬化症继发的肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、眼色素层炎、癌症、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、和非霍奇金淋巴瘤
62.权利要求60的方法，其中IL-13介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
63.权利要求60的方法，其中IL-4介导的疾病选自：特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎性肠病、局限性回肠炎、肺炎性病症、肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝纤维化、癌症、成胶质细胞瘤、和非霍奇金淋巴瘤。
64.权利要求60的方法，其中呼吸病症选自：哮喘、变应性哮喘、非变应性哮喘、支气管炎、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、香烟诱导的肺气肿、气道炎症、囊性纤维化、肺纤维化、变应性鼻炎、和支气管扩张。
65.权利要求60-64之任一项的方法，还包括向个体施用TH2途径抑制剂。
66.权利要求65的方法，其中TH2途径抑制剂抑制选自以下的至少一个靶标：ITK,BTK,IL-9,IL-5,IL-13,IL-4,OX40L,TSLP,IL-25,IL-33,IgE,IL-9受体,IL-5受体,IL-4受体α,IL-13受体α1,IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα,IL17RB,ST2,CCR3,CCR4,CRTH2,FcεRI,FcεRII/CD23,Flap,Syk激酶；CCR4,TLR9,CCR3,IL5,IL3,和GM-CSF。
67.根据权利要求60-66之任一项的方法，其中所述个体正患有中度至重度哮喘。
68.根据权利要求60-66之任一项的方法，其中所述个体正患有特发性肺纤维化。
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