CN109715671B

CN109715671B - 双特异性抗her2抗体

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Publication number: CN109715671B
Application number: CN201780053734.8A
Authority: CN
Inventors: 李锋; 张伯彦; 叶培; 赵健; 黄思佳; 金春阳
Original assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Priority date: 2016-07-22
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2037-07-21
Also published as: AU2017298251B2; CA3031330C; EP3487888A4; JP6823175B2; CA3031330A1; US9745382B1; WO2018014864A1; CN107446045A; JP2019528779A; EP3487888A1; AU2017298251A1; CN109715671A

Abstract

人源化双特异性抗HER2抗体，其包含一个含有曲妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点，和另一个含有帕妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点。所述双特异性抗HER2抗体可有效治疗癌症，诸如乳腺癌、胃癌或卵巢癌。优选的双特异性抗HER2抗体是非岩藻糖基化抗体。还提供具有功能失调的Slc35C1基因的中国仓鼠卵巢(CHO)突变细胞系，所述基因是突变体中影响聚糖调节的唯一功能失调基因。

Description

双特异性抗HER2抗体

对序列表、表格或计算机程序的引用

序列表随同说明书以ASCII格式文本文件经EFS-Web同时提交，文件名为序列表序列表.txt，创建日期为2017年3月13日，大小为30.7千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并通过引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明涉及肿瘤学治疗和分子免疫学的领域，并涉及一种抗Her2抗体和药物组合物及其用途。具体而言，本发明涉及人源化双特异性抗Her2抗体，其包含一个含有曲妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点，和另一个含有帕妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点。本发明还涉及具有功能失调的Slc35C1基因的中国仓鼠卵巢(CHO)突变细胞系；该突变细胞系表达岩藻糖基化减少的蛋白质。

背景技术

人表皮生长因子受体2(缩写为Her2、ERBB2、HER2/neu或c-erbB2)是一种由ERBB2基因编码的蛋白质。在正常细胞中，Her2具有非常低的表达水平；但Her2在胚胎发育期间高度表达，在对细胞增殖、分化、发育、粘附和迁移的调节中非常重要(Gutierrez,C.和R.Schiff,HER2:biology,detection,and clinical implications.Arch Pathol LabMed,2011.135(1):第55-62页)。

Her2属于人表皮生长因子受体家族，该家族由4个成员组成：Her1(EGFR)、Her2、Her3和Her4。Her2没有特异性配体，并且其下游途径的激活依赖于同源或异源二聚体的形成(Gutierrez等人，Arch Pathol Lab Med,2011.135(1):第55-62页)。人表皮生长因子受体全部位于细胞表面，并且具有相似的结构：一个与配体结合的细胞外结构域(ECD)，一个单次跨膜α-螺旋跨膜结构域和一个由细胞内膜近端结构域、酪氨酸激酶催化结构域和起调节作用的富含酪氨酸的C端尾部结构域组成的细胞内区域(Eccles,Int J Dev Biol,2011.55(7-9):第685-96页)。人表皮生长因子受体的细胞外结构域(ECD)可进一步分为4个亚结构域，即I、II、III和IV区，其中II区和IV区是富含半胱氨酸的结构域，参与受体的二聚化和激活。

Her2过度表达可能导致细胞正常功能紊乱，并且通常与肿瘤的发生和发展密切相关。Her2的同源或异源聚合可导致受体酪氨酸残基磷酸化，并且引发许多信号途径并引起细胞增殖和肿瘤发生。作为预后和预测的生物标志物，Her2基因的扩增或过度表达在约15-30％的乳腺癌和10-30％的胃癌/食道癌中发生。在其它肿瘤诸如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈肿瘤中也可观察到Her2过度表达。

在乳腺癌中，通常将Her2认为是预测因子和治疗靶标。由于Her2没有特异性配体，其抗体通常通过阻断受体二聚化和激活以及介导免疫系统的杀伤作用来抑制肿瘤细胞。

目前，曲妥珠单抗(Trastuzumab)和帕妥珠单抗(Pertuzumab)是市售的主要Her2靶向治疗抗体。

1998年，FDA批准了HER2靶向性人源化单克隆抗体，Genentech公司的曲妥珠单抗(也称为

人源化程度95％)。这种抗体识别Her2细胞外结构域IV近膜表位，并且其抗原亲和常数可高达0.1nmol/L。曲妥珠单抗识别IV部分的C端处由3个环(557-561、570-573和593-603)组成的表位。因为表位可以靠近其二聚化伴侣的结合结构域或直接与之相互作用，所以曲妥珠单抗与表位的结合可以诱导抑制二聚化过程的空间位阻。另外，曲妥珠单抗的结合还可以保护Her2受体的细胞外结构域免受蛋白酶的攻击而水解。

曲妥珠单抗的作用机制可包括：免疫诱导的生物活性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和自然杀伤细胞活性)，诱导Her2受体内化，抑制DNA修复，破坏PI3K途径，激活p27kip1诱导的G1周期停止，刺激癌细胞凋亡和抑制受体细胞外结构域的细胞内p95结构域的激活[4,5]。其中，有关于曲妥珠单抗诱导的免疫介导的治疗性生物活性的报道。具体而言，ADCC发挥重要作用，正如在BT474异种移植小鼠模型中所显示的那样，当敲除Fc受体时，癌症生长的抑制率从96％降低到29％(Nat Med,2000,6:443-6)。Kohrt等人(J ClinInvest,2012.122(3):1066-75)报道称，用CD137特异性抗体刺激自然杀伤细胞增强了乳腺癌异种移植模型中曲妥珠单抗的功效。

目前将曲妥珠单抗用作治疗乳腺癌的一线药物，有效治疗Her2过度表达的转移性乳腺癌，并且单药一线治疗的客观反映率为30-50％；但是在治疗Her2表达较低的转移性乳腺癌方面效果不理想，并且抗体最初在1年内有效的许多患者中已经发展出耐药性。这可能与抗原表位的遮蔽或由肿瘤细胞中某些基因表达的变化引起的受体信号传导途径的异常激活有关。另外，Her2连同该家族的其它成员(Her1、Her3和Her4)可以形成配体依赖性或配体非依赖性异源二聚体，从而激活下游途径，然后导致肿瘤细胞增殖，而曲妥珠单抗无法抑制异源二聚体形成，所以这可能是耐药性发展的原因之一。

帕妥珠单抗

于2012年被FDA批准在美国销售，对晚期前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌有一定治疗效果，但其治疗效果还取决于Her2表达水平。

帕妥珠单抗识别Her2细胞外结构域II异源二聚化的关键位点，由此识别的表位位于II亚区中心的区段245-311，关键残基为H245、V286、S288、L295、H296和K311。其中，L295、H296是介导Her2和Her3异源二聚化的关键位点，并且L295A/H296A双重突变可完全阻断Her2/Her3的异源二聚化(Franklin,M.C.等人，Insights into ErbB signaling from thestructure ofthe ErbB2-pertuzumab complex.Cancer Cell,2004.5(4):第317-28页)。因此，帕妥珠单抗可用于有效抑制Her2/Her3异源二聚体的形成，但对EGFR/Her2异源二聚体的形成并未显示出明显的抑制作用。

目前，需要开发新的抗HER2抗体。

附图说明

图1显示了本发明的人源化双特异性抗Her2抗体的优选实施方案的结构。

图2显示了制备CHO突变体CHOK1-AF的方法的流程图，其中敲除了Slc35c1基因。

图3显示了通过FACS测定的CHO-K1细胞(A)和CHOK1-AF细胞(B)的岩藻糖表达水平。

图4显示了MBS301的完整分子量谱。

图5显示了N-糖切除修饰后MBS301的完整分子量谱。

图6显示了MIL203AF、MIL204AF和MBS301的SEC-HPLC分析结果。

图7显示了MIL203/204和MBS301的N-糖型的分析结果。

图8显示了对SKBR-3细胞的ADCC作用。

图9显示了对BT474细胞的ADCC作用。

图10显示了对SW480细胞的ADCC作用。

图11显示了对HCC1419的ADCC作用。

图12显示了对BT474细胞的细胞直接杀伤作用。

图13显示了对MDA-MB-175细胞的细胞直接杀伤作用。

图14显示了对SKBR-3细胞的细胞直接杀伤作用。

图15显示了对HCC1419细胞的细胞直接杀伤作用。

图16显示了对NCI-N87细胞的细胞直接杀伤作用。

图17显示了对BT474细胞的CDC作用。

图18显示了对裸鼠中人卵巢癌细胞SKOV3的体内肿瘤生长抑制作用。

图19显示了对小鼠中人乳腺癌细胞BT474的体内肿瘤生长抑制作用。

图20显示了对小鼠中人胃癌细胞NCI-N87的体内肿瘤生长抑制作用。

图21显示了在曲妥珠单抗耐药的胃癌GA055 PDX模型中对体内肿瘤体积的抑制作用。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“约”是指所列举的值的±10％。

如本文所用，术语“有效量”是指获得或至少部分获得所需效果的量。有效量可由本领域技术人员确定。例如，供治疗使用的有效量取决于待治疗疾病的严重程度、患者免疫系统的总体状态、患者的总体状态，诸如年龄、体重和性别，药物施用方法以及同时应用的其它疗法。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起递送时，可以增强受试者对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。有许多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)、脂多糖和细胞因子。弗氏佐剂是目前动物试验中最普遍的佐剂，而氢氧化铝佐剂常常用于临床实验。

如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链组成的免疫球蛋白(每对具有轻链(L)和重链(H))。抗体轻链可分类为κ轻链和λ轻链。重链可以分类为μ、δ、γ、α或ε，抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还含有具有约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链均由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由均轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。V_H和V_L区可以进一步分类为高度可变区(称为互补决定区(CDR))，称为骨架区(FR)的相对保守性区域分散于其中。这些V_H和V_L区由3个CDR区和4个FR区按以下顺序组成：从氨基端到羧基端为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每对重链/轻链的可变区(V_H和V_L)形成抗体结合位点。

如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是一种细胞介导的免疫防御机制，当靶细胞膜表面抗原与特异性抗体结合时，抗体可以引导此免疫系统的效应细胞去裂解靶细胞。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指含有全长抗体片段的多肽，其保持与全长抗体结合的相同抗原特异性结合的能力，和/或与全长抗体竞争特异性结合抗原。

如本文所用，术语“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是补体系统的功能。是免疫系统中通过破坏其膜来杀伤病原体而不涉及免疫系统的抗体或细胞的过程。

如本文所用，术语“核心岩藻糖”是指与N-核心五糖中与肽链中天冬酰胺相连的GlcNAC连接的岩藻糖。

如本文所用，术语“EC 50”是指针对最大效应的50％的浓度，即，引起最大效应的50％的浓度。

如本文所用，术语“FcγRIIIa”是50-70kDa糖蛋白，属于Ig超家族，具有两个C2结构，其基因位于染色体的1q23-24。FcγRIII与人IgG、IgG3结合，是低亲和力受体。FcγRIII包含2个同种异型，即FcγRIIIA和FcγRIIIB。FcγRIIIA(AAH17865.1，GenBank)具有跨膜结构并且主要分布在巨噬细胞、NK细胞和嗜酸性粒细胞中，其中巨噬细胞具有FcγRIIIA高表达水平，而单核细胞具有较低的表达水平。FcγRIII A涉及二硫键连接的CD3ζ或FcεR Iγ链二聚体，其中FcγRIII A涉及巨噬细胞上的CD3复合物γ链，而FcγRⅢA涉及NK/LGL上的ζ链。

如本文所用，术语“FcRn”是新生儿Fc受体(P61769，UniProtKB/Swiss-Prot)，其是由大亚基和小亚基组成的异源二聚体，大亚基分子量为45-53kD，称为α链；小亚基是β2微球蛋白(β2m)，分子量为14kD，称为β链，两条链以非共价键形式结合在一起。当生理pH为7.4时，FcRn不与IgG结合，但在内体酸性pH 6-6.5的条件下，FcRn与IgG Fc的亲和力范围从纳摩尔到微摩尔。

如本文所用，术语“Her2”是指全长的Her2(NP_004439.2)，或Her2的细胞外片段或结构域I、II、III或IV，或含有其中至少一个的片段；或包括含有Her2细胞外片段的融合蛋白。然而，本领域技术人员将理解，Her2的氨基酸序列可具有天然产生的或人工引入的突变或变异(包括但不限于置换、缺失和/或添加)而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“Her2”应包括这些序列中的任何一个。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以向其中引入载体的细胞，其包括但不限于，例如原核细胞诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacterium subtilis)，真菌细胞诸如酵母细胞或曲霉(Aspergillus)，昆虫细胞诸如S2果蝇细胞或Sf9细胞，或动物细胞诸如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞，NS0细胞、Hela细胞、BHK细胞、HEK293细胞或人类细胞。

如本文所用，术语“K_D”是指特异性抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体和抗原之间的结合亲和力。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指与受试者和活性组分在药理学和/或生理学上相容的载体和/或赋形剂，例如参见Remington's PharmaceuticalSciences.由Gennaro AR编辑，第19版Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995。药学上可接受的载体包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲溶液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如吐温-80(Tween-80)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体与其抗原之间的反应。

如本文所用，术语“载体”是指可用于插入多核苷酸的核酸载体。当载体使插入的多核苷酸能够表达由其编码的蛋白质时，该载体称为表达载体。可以通过转化、转导或转染将载体引入宿主细胞内，使得载体携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源人工染色体(PAC)；噬菌体诸如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒，乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)。载体可含有多种表达控制元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

发明内容

本发明涉及人源化双特异性抗Her2抗体或其双特异性抗原结合片段，其包含一个含有曲妥珠单抗的重链和轻链可变区的抗原结合位点，以及另一个含有帕图珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点。双特异性抗体识别Her2细胞外结构域IV和II。

本发明的抗Her2抗体或抗原结合片段包含与曲妥珠单抗有关的第一重链和第一轻链，以及与帕妥珠单抗有关的第二重链和第二轻链。

第一重链包含具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的CDR的V_H，和氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的C_H。在一个实施方案中，非CDR区源自人抗体。

第二重链包含具有氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的CDR的V_H，和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的C_H。在一个实施方案中，非CDR区源自人抗体。

在第一重链中，

CDR1：GFNIKDTY(SEQ ID NO:1)

CDR2：IYPTNGYT(SEQ ID NO:2)

CDR3：SRWGGDGFYAMDY(SEQ ID NO:3)。

在第二重链中，

CDR1：GFTFTDYT(SEQ ID NO:4)

CDR2：VNPNSGGS(SEQ ID NO:5)

CDR3：ARNLGPSFYFDY(SEQ ID NO:6)。

第一重链的恒定区(SEQ ID NO:7)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

第二重链的恒定区(SEQ ID NO:8)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

在一个实施方案中，第一重链V_H具有如下所示的氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)

第二重链V_H具有如下所示的氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)

抗Her2抗体或其抗原结合片段还包含第一轻链和第二轻链。

第一轻链包含具有氨基酸序列如SEQ ID NO:11-13所示的CDR的V_L。在一个实施方案中，非CDR区源自人抗体。

第二轻链包含具有氨基酸序列如SEQ ID NO:14-16所示的CDR的V_L。在一个实施方案中，非CDR区源自人抗体。

在第一轻链中，

CDR1：QDVNTA(SEQ ID NO:11)

CDR2：SASFLYS(SEQ ID NO:12)

CDR3：QQHYTTPPT(SEQ ID NO:13)。

在第二轻链中，

CDR1：QDVSIG(SEQ ID NO:14)

CDR2：SASYRYT(SEQ ID NO:15)

CDR3：QQYYIYPYT(SEQ ID NO:16)。

在本发明的一个实施方案中，第一轻链V_L具有如下所示的氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:17)

第二轻链V_L具有如下所示的氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:18)

本发明涉及人源化双特异性抗Her2抗体或其抗原结合片段，其包含：第一重链，包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变区(V_H)；第一轻链，包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变区(V_L)；第二重链，包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变区(V_H)；和第二轻链，包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变区(V_L)，

其中所述第一V_H和第一V_L形成对HER2的细胞外结构域IV有特异性的第一抗原结合位点，并且所述第二V_H和第二V_L形成对HER2的细胞外结构域II有特异性的第二抗原结合位点。

在本发明的一个实施方案中，抗Her2抗体或其抗原结合片段还包含具有SEQ IDNO:19的氨基酸序列的第一轻链C_H和/或第二轻链C_H：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:19)

在本发明的一个实施方案中，抗Her2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO:22的氨基酸序列的第一重链，其中加下划线的部分是重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRF TISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:22)

在本发明的一个实施方案中，抗Her2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO:23的氨基酸序列的第一轻链，其中加下划线的部分是轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:23)

在本发明的一个实施方案中，抗Her2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO:25的氨基酸序列的第二重链，其中加下划线的部分是重链可变区的氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:25)

在本发明的一个实施方案中，抗Her2抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO:26的氨基酸序列的第二轻链，其中加下划线的部分是轻链可变区的氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:26)

在本发明的一个实施方案中，抗Her2抗体或其抗原结合片段含有≤25％、≤20％、≤15％、≤10％、≤8％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％、≤1.5％或≤1.1％附着于抗体Fc区的总糖中的岩藻糖糖型。岩藻糖糖型的含量通过将所有含岩藻糖糖型的含量相加来获得，例如通过N-糖测定法测定。

在本发明的一个实施方案中，抗Her2抗体或其抗原结合片段与Her2蛋白结合，EC50低于约100nM，例如低于约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更低。EC50可以通过Biacore方法测定。

本发明的双特异性抗体组合了帕妥珠单抗和曲妥珠单抗，并且受益于更完全阻断Her2介导的信号转导。曲妥珠单抗抑制Her2同源二聚化的形成，并防止Her2的细胞外结构域经历蛋白水解裂解形成组成型活性p95蛋白；帕妥珠单抗阻断Her2异二聚体形成，然后完全阻断Her2介导的信号转导。单独使用时，帕妥珠单抗和曲妥珠单抗不具有CDC活性。然而，本发明的双特异性抗体表现出如同在至少一项基于体外细胞的测定中所观察的强CDC活性。

本发明的双特异性抗体靶向不同的Her2表位，其增强其肿瘤抑制作用并实现协同作用，并增强ADCC功能。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体缺乏来自Fc N-聚糖的核心岩藻糖残基，并且在低浓度下显示出强的ADCC。这是因为非岩藻糖基化抗体增强其与天然杀伤(NK)细胞上的Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)的结合亲和力，因此增加了抗体的ADCC活性。同时，非岩藻糖基化抗体可以阻遏来自血清中的人免疫球蛋白G(IgG)对与天然杀伤(NK)和巨噬细胞上Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)结合的抑制作用，因为后者与FcγRIIIa的结合亲和力较弱。

去除核心岩藻糖基化以增加抗体与FcγRIIIa的亲和力是增加ADCC最有效的方法之一。目前市场上的大多数治疗性抗体是重度岩藻糖基化的，因为它们是由哺乳动物细胞系诸如中国仓鼠卵巢(CHO)产生的，其具有内源酶活性，负责产物的Fc N-聚糖的核心岩藻糖基化。本发明提供了具有功能失调的Slc35C1基因的CHO突变体，所述基因编码严格调节聚糖岩藻糖基化的GDP-岩藻糖转运蛋白SLC35C1。本发明的CHO突变体仅含一个来自CHO的功能失调基因，其影响聚糖的调节，即Slc35C1基因敲除；CHO突变体不含任何其它影响聚糖调节的功能失调基因。例如，CHO突变体不含影响唾液酸产生的功能失调基因。本发明的SLC35C1缺陷型CHO细胞产生岩藻糖含量约≤10％、≤8％、≤6％、≤4％、≤3％，≤2％、≤1.5％或≤1.1％附着于抗体Fc区的总糖的的抗体。

本发明提供了产生突变SLC35C1缺陷型CHO细胞的方法。该方法使用锌指酶敲除技术敲除宿主CHO细胞中的关键岩藻糖修饰蛋白GFT(GDP-岩藻糖转运蛋白)，因此有效降低了所产生的抗体的岩藻糖基化水平。该方法可以阻断岩藻糖基化的经典途径和补偿途径，所以该方法可有效减少岩藻糖基化。该方法包括使用锌指核酸酶技术设计GFT基因Slc35c1序列(GenBank：BAE16173.1)的两个GFT锌指核酸酶；这两个锌指核酸酶设计成分别结合靶基因的双链DNA。克隆GFT的两个锌指核酸酶序列以构建两个表达载体。通过技术人员已知的合适方法，例如通过电转染技术将两种表达载体共同转染到靶CHO细胞中。转染后，培养转染的细胞，进行传代和扩增。通过多轮负分离和克隆培养来选择没有岩藻糖基化修饰的克隆物。图2中说明了一种具体方法。

本发明提供了去除双特异性抗体的核心岩藻糖基化的方法，其改善了抗体的ADCC作用。在本方法中，使用具有功能失调的Slc35C1基因的CHO突变体(例如CHOK1-AF)产生双特异性抗体，其导致核心-岩藻糖水平低于1.5％。与未去除核心岩藻糖单元的MIL203/204相比，本专利的MBS301的ADCC活性增加10倍。

将本发明的双特异性抗体，例如MBS301设计为结合Her2细胞外结构域IV和II；与单独使用每种抗体相比，它在小鼠中具有更高的细胞直接杀伤活性、ADCC活性、CDC活性和肿瘤抑制能力。在体外细胞系活性研究中与组合使用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相比，MBS301表现出更高的细胞直接杀伤活性、更高的ADCC活性，而CDC活性与组合使用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相似。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是“杵臼式”抗体，其在CH3区具有经修饰的氨基酸序列以促进异源半抗体的配对。例如，第一重链的恒定区具有3个来自人Fc的突变；所述突变是SEQ ID NO:7中的T369S、L371A和Y410V。第二重链的恒定区具有1个来自人Fc的突变；该突变是SEQ ID NO:8中的T368W。“杵臼式”结构抗体维持正常的抗体结构和大小并提供双功能活性。

在一个实施方案中，本发明涉及能够编码本发明的Her2抗体的第一和第二重链以及第一和所述第二轻链的分离的核酸分子。

另一方面，本发明涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸。

另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或本发明的载体。优选地，宿主细胞是CHOK1-AF细胞。优选地，在宿主细胞中，GFT(岩藻糖修饰途径中的关键蛋白)的基因被定点敲除。优选地，敲除通过锌指核酸酶技术进行。优选地，GFT基因中的SLC35c1序列(GenBank登录号：BAE16173.1)被定点敲除。在本发明的一个实施方案中，岩藻糖是核心岩藻糖。

另一方面，本发明涉及一种偶联物，其包含抗Her2抗体或其抗原结合片段和偶合部分，其中，抗Her2抗体是根据本发明任一项所述的抗Her2抗体或其抗原结合片段，偶合部分是可检测标记；优选地，偶合部分是放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含根据本发明所述的抗Her2抗体或其抗原结合片段，或包含本发明的偶联物。试剂盒还可包含特异性识别抗Her2抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，第二抗体还包含可检测标记，诸如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

另一方面，本发明涉及根据本发明所述的抗Her2抗体或其抗原结合片段或本发明的偶联物在生产试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于检测样品中Her2的存在或Her2的水平。

另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的抗Her2抗体或其抗原结合片段或偶联物；任选地，还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂；任选地，还包含一种或多种化学治疗药物或细胞毒性药物。化学治疗药物或细胞毒性药物可以选自：(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂诸如二氯甲基二乙胺、亚硝基脲、甲磺酸酯；铂类化合物诸如顺铂(cis-platinum)、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂诸如甲氨蝶呤(MTX)和Alimta等；胸苷合酶抑制剂诸如氟尿嘧啶(5FU、FT-207、卡培他滨(capecitabine)等)；嘌呤核苷合酶抑制剂诸如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂诸如羟基脲(HU)等；DNA聚合酶抑制剂诸如阿糖胞苷(Ara-C)和Gemz等；(3)作用于核酸转录的药物：通过选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖性RNA聚合酶来抑制RNA合成的药物，诸如：放线菌素D(actinomycin D)、红比霉素(rubidomycin)、阿霉素(adriamycin)、表柔比星(epirubicin)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、光神霉素(mithramycin)等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春花碱(vinblastinum)、长春瑞滨(vinorelbine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)；(5)其它细胞毒性药物：主要抑制蛋白质合成的天冬酰胺酶；激素：抗雌激素：他莫昔芬(tamoxifen)、屈洛昔芬(droloxifen)、依西美坦(exemestane)等；芳香酶抑制剂：氨鲁米特(aminoglutethimide)、兰特隆(lentaron)、来曲唑(letrozole)、瑞宁得(Arimidex)等；抗雄激素：氟他胺RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德(zoladex)、抑那通(enantone)等；生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤的干扰素；白细胞介素-2；胸腺素；单克隆抗体：利妥昔单抗(rituximab)(MabThera)；西妥昔单抗(Cetuximab)(C225)；

(曲妥珠单抗)；贝伐单抗(Bevacizumab)(Avastin)；细胞分化诱导剂诸如维甲酸(Tretinoins)；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双特异性抗体及其组合物可以与上述一种或多种抗肿瘤药物呈药物组合使用。

另一方面，本发明涉及本发明的抗Her2抗体或其抗原结合片段或本发明的偶联物在生产用于预防和/或治疗和/或诊断癌症的药物中的用途；癌症选自乳腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌，肺癌、结肠癌、头颈癌和前列腺癌；例如，前列腺癌是晚期前列腺癌；并且乳腺癌是转移性乳腺癌。

本发明还涉及治疗癌症的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗Her2抗体或其抗原结合片段的步骤。癌症包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、头颈癌和前列腺癌。

本发明的药物组合物可以通过全身施用或局部施用来应用。全身施用包括口服、肠胃外(例如静脉内、肌肉内、皮下或直肠)和其它全身施用途径。在全身施用中，活性化合物首先到达血浆，然后分配到靶组织中。

组合物的剂量可以根据癌症的程度和每个患者的个体反应而变化。对于全身施用，递送的活性化合物的血浆浓度可以变化；但通常为1×10^-10-1×10^-4摩尔/升，优选1x10^-8-1×10^-5摩尔/升。

本领域技术人员将认识到，各种递送机制也适于本发明。

本发明可用于治疗哺乳动物受试者，诸如人、马和犬。本发明特别适用于治疗人类。

通过以下实施例对本发明进行进一步说明。

实施例

实施例中使用的缩写/术语如下。

MIL40：如本发明人所制备的

样品，其与

氨基酸序列一致。

MIL41：如本发明人所制备的

样品，其与

的氨基酸序列一致。

MIL203：不完全抗体(半抗体)，其中重链和轻链的氨基酸序列如实施例1所设计。

MIL203AF：与MIL203相同的氨基酸序列，除了它在岩藻糖敲除工程化细胞系(CHOK1-AF)中表达以外。在其N-糖修饰的糖型中，没有核心岩藻糖的糖型比率≥98.5％，即核心岩藻糖<1.5％。

MIL204：不完全抗体(半抗体)，其中重链和轻链的氨基酸序列如实施例1所设计。

MIL204AF：MIL204AF的Fab的氨基酸序列与MIL204的相同，但MIL204AF在岩藻糖敲除工程化细胞系(CHOK1-AF)中表达。在其N-糖修饰的糖型中，没有核心岩藻糖的糖型比率≥98.5％，即核心岩藻糖<1.5％。

MIL203/204：通过组装MIL203和MIL204形成的双功能抗体。

MBS301：通过组装MIL203AF和MIL204AF形成的双功能抗体。

实施例1：抗体MIL203和MIL204的重链和轻链的氨基酸序列设计和基因序列优化

(1)MIL203轻链和重链的氨基酸序列

MIL203的重链具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

MIL203的轻链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

(2)MIL203的轻链和重链的核酸序列

用于编码MIL203轻链和重链的优化基因序列如下。

MIL203重链碱基序列如SEQ ID NO:20所示，其中加下划线的部分是重链可变区的碱基序列。

gaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgcgcctgagctgcgc cgccagcggcttcaacatcaaggatacctacatccactgggtgcgccaggctcccggcaagggcctggagtgggtg gcccgcatctaccccaccaacggctacacccgctacgccgatagcgtgaagggccgcttcaccatcagcgccgata ccagcaagaacaccgcctacctgcagatgaacagcctgcgcgccgaggataccgccgtgtactactgcagccgctg gggcggcgatggcttctacgccatggattactggggccagggcaccctggtcaccgtgagcagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgactgtgccctctagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctgagctgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtgagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO:20)

MIL203轻链碱基序列如SEQ ID NO:24所示，其中加下划线部分是轻链可变区的碱基序列：

gatatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgatcgcgtgaccatcacctg ccgcgccagccaggatgtgaacaccgccgtggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatc tacagcgccagcttcctgtacagcggcgtgcccagccgcttcagcggcagccgcagcggcaccgatttcaccctga ccatcagcagcctgcagcccgaggatttcgccacctactactgccagcagcactacaccaccccccccaccttcgg ccagggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:24)

(3)MIL204的轻链和重链的氨基酸序列

MIL204的重链具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

MIL204的轻链具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

(4)MIL204的轻链和重链的核酸序列

MIL204重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，其中加下划线的部分是重链可变区的碱基序列。

gaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgcgcctgtcctgcgc cgccagcggcttcacctttaccgactacaccatggactgggtgcgccaggctcccggcaagggcctggagtgggtg gccgacgtgaaccccaacagcggcggcagcatctacaaccagcgcttcaagggccgcttcaccctgagcgtggacc gcagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgcgcgccgaggacaccgccgtgtactactgcgcccgcaa cctgggccccagcttctacttcgactattgggggcagggcaccctggtcaccgtgagcagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgactgtgccctctagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaagagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO:21)

MIL204的轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，其中加下划线的部分是重链可变区的碱基序列。

gatatccagatgacccagagcccctccagcctgtccgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctg caaggccagccaggacgtgagcatcggcgtggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatc tacagcgcctcctaccgctacaccggcgtgccctcccgcttcagcggctccggcagcggcaccgactttaccctga ccatctccagcctgcagcccgaggactttgccacctactactgccagcagtactacatctatccctataccttcgg ccagggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:27)

实施例2：203抗体真核表达载体和204抗体真核表达载体的构建

使用表达载体pTGS-FRT-DHFR(中国专利ZL200510064335.0)，去除潮霉素(hygromycin)选择标记，通过PshA1和Xho1限制酶切位点添加GS(谷氨酰胺合成酶)表达盒，并用作选择标志物；其中GS cDNA可以通过RT-PCR从表达GS的细胞系CHO获得。通过修饰获得的载体命名为GS载体。

基于GS载体，通过BsiWI和NotI限制酶切位点插入完全合成的轻链恒定区(恒定区序列为SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:27未加下划线的序列)；然后，通过Nhe I和XhoI限制酶切位点插入完全合成的203重链恒定区和204重链恒定区(恒定区序列分别是SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中未加下划线的序列)；并且在恒定区修饰后，分别得到含有203轻链恒定区和重链恒定区的GS-203载体及含有204轻链恒定区和重链恒定区的GS-204载体。

203轻链可变区和重链可变区及204轻链可变区和重链可变区(其分别是SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中加下划线的序列)的基因完全合成，并且通过构建而插入pGEM-TEasy载体中以获得载体，分别命名为pGEM-TEasy-203/Vκ载体、pGEM-TEasy-204/Vκ载体、pGEM-TEasy-203/V_H载体和pGEM-TEasy-204/V_H载体。

用ClaI和BsiwI分别消化pGEM-TEasy-203/Vκ和pGEM-TEasy-204/Vκ，分别得到203轻链可变区基因和204轻链可变区基因。

分别取1μg量的如以上所构建的GS-203载体和GS-204载体，并分别用ClaI和BsiwI消化。

用T4 DNA连接酶连接如以上获得的经ClaI和BsiwI消化的GS-203载体和203轻链可变区；用T4 DNA连接酶连接如以上获得的经ClaI和BsiwI消化的GS-204载体和204轻链可变区。将携带203轻链和204轻链的所得质粒分别命名为pTGS-203Vκ载体和pTGS-204Vκ载体。

分别取pGEM-TEasy-203/V_H和pGEM-TEasy-204/V_H，用EcoR I和Nhe I消化以分别得到203重链可变区基因和204重链可变区基因。分别取1μg量的pTGS-203Vκ载体和pTGS-204Vκ载体，并分别用EcoR I和Nhe I消化。分别用T4DNA连接酶连接如以上所获得的经EcoR I和Nhe I消化的pTGS-203Vκ和203重链可变区基因，以及pTGS-204Vκ和204重链可变区基因。基于PTGS-203Vκ和PTGS-204Vκ，获得分别携带抗体203重链可变区基因和抗体204重链可变区基因的质粒，将其分别命名为203抗体真核表达载体和204抗体真核表达载体。

实施例3：宿主细胞的岩藻糖敲除和悬浮驯化

从ATCC购买的CHO-K1细胞(ATCC：58995535)进行基因敲除，使其自身表达的蛋白质几乎或完全没有岩藻糖基化修饰，并将获得的岩藻糖敲除宿主细胞命名为CHOK1-AF。具体方法包括：通过基因工程技术修饰表达系统，其中在宿主细胞CHO-K1中进行用于岩藻糖基化修饰途径的关键蛋白GFT的位点特异性敲除以进行抗体表达以有效降低抗体的岩藻糖修饰水平。该方法可以同时阻断典型岩藻糖基化机制和补偿机制，从而实现岩藻糖基化的完全去除。具体技术路线如图2所示，其中通过使用锌指核酸酶技术，为GFT基因SLC35c1序列(GenBank：BAE16173.1)设计了两个GFT锌指核酸酶序列，并分别用于结合靶基因的双链DNA。相应地构建表达载体质粒，通过电转染技术将两种质粒共转染到CHO-K1细胞中。将转染的细胞在6孔板上静置培育24小时，然后转移到125mL摇瓶中并振荡培养以便在摇瓶中进行传代和扩增。通过利用糖结合凝集素LCA(小扁豆凝集素)与蛋白质岩藻糖基的特异性亲和力，将共转染的细胞用生物素-LCA染色，通过组合使用抗生物素微珠和MACs LD柱进行负性分离，进一步进行克隆培养，并通过流式细胞术确定克隆细胞的岩藻糖敲除水平；并且通过多轮负性分离和克隆培养获得没有岩藻糖基化修饰的克隆物1G7。

图3显示了CHO-K1细胞(A)和CHOK1-AF细胞(B)的岩藻糖表达水平。深色填充峰是指不表达岩藻糖的对照细胞。黑线峰表示使用对岩藻糖单元具有高特异性结合亲和力的小扁豆凝集素(LCA)试剂，通过FCAS测定的CHO-K1(A)或CHOK1-AF细胞(B)的岩藻糖表达水平。结果显示CHO-K1细胞表达高水平的岩藻糖而CHOK1-AF细胞不表达岩藻糖。

CHOK1-AF细胞于2017年6月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(中国北京市朝阳区北辰西路1号，100101)，保藏号为CGMCC No.14287。

提取无岩藻糖基化修饰的克隆物1G7的总RNA，逆转录后，获得编码GDP转运蛋白的基因并测序以确认该基因成功突变且不能正常表达。

进一步驯化和培养：解冻后的宿主细胞gmt4^--CHO-K1在种子培养基(参见：表1-1)(含10％小牛血清)中进行贴壁培养，逐渐减少血清(从10％、5％、2.5％、1％、0.5％到完全不含血清)，转移到摇瓶中以进行悬浮驯化，并总共进行约10次传代。当宿主细胞完全悬浮并呈指数稳定增加时，最终获得能够在种子培养基中生长的稳定宿主细胞。

实施例4：含有MIL203AF和MIL204AF抗体的上清液的制备

利用电转染技术，将实施例2中获得的203抗体真核表达载体和204抗体真核表达载体分别转染到靶宿主细胞CHOK1-AF中，向种子培养基中添加50μM MSX(蛋氨酸亚氨基代砜)，在37℃、CO₂培养箱中进行培养2-4周，挑出该培养基中存活的细胞，并使用ELISA方法检测能够表达抗体的细胞。通过有限稀释法进行亚克隆筛选，并且在培养和筛选6-8周后，获得能够有效表达MIL203AF和MIL204AF抗体的单克隆细胞系。

特定培养基的制备：根据表1-1、1-2和1-3中所示的组分制备培养基。在无菌条件下用0.22μm的膜过滤后，将它们用于细胞培养。

表1-1：种子培养基

表1-2：生产培养基

表1-3：分批补料培养基

通过用培养基进行多步培养来扩增细胞系，其中接种密度为0.5±0.2×10⁶个细胞/ml，每2-4天进行一次传代，当通过扩增获得足够细胞时，将其转移到发酵培养基(该培养基包含：生产培养基:种子培养基＝1:1)，发酵培养基中的培养时间为12-14天，并且在第3天、第6天、第9天以10％体积添加分批补料培养基，培养结束后获得上清液。从而，分别获得MIL203AF和MIL204AF。

用于制备MIL203和MIL204的方法是指本实施例中用于制备MIL203AF和MIL204AF的方法，除了宿主细胞是购自ATCC的CHO-K1细胞(ATCC:58995535)，并且未进行岩藻糖敲除外。

实施例5：组装MBS301双特异性抗体

1.捕获半抗体

将实施例4中获得的细胞发酵液的上清液用0.2μm膜过滤，并使用蛋白A柱进行捕获。首先，用低盐Tris、pH7.5缓冲溶液使柱平衡，然后装载上清液，然后用低盐Tris、pH7.5缓冲溶液对柱进行洗脱，进一步用高盐磷酸钾、pH6.0缓冲溶液对柱进行洗脱，然后用低盐Tris、pH7.5缓冲溶液对柱进行洗脱和平衡，最后用低pH乙酸盐缓冲溶液洗脱以获得半抗体。将半抗体溶液用Tris碱溶液调节至pH5.5，添加适量的Arg并保存。

2.组装

使用分光光度计以280nm吸光度测定半抗体的浓度。将半抗体以1:1的摩尔比混合，用Tris碱缓冲溶液调节至pH8.0，添加一定量的还原剂GSH，在25℃反应并低速搅拌过夜。通过脱盐柱(或超滤)去除还原剂，并终止反应。

3.阴离子(QSFF)

将组装和更换的样品调节至pH为8.0，导电率为3.5mS/cm，用0.22μm膜过滤。首先，将阴离子色谱柱用低盐Tris、pH8.0缓冲溶液平衡，然后将样品装载到阴离子色谱柱上，收集穿透组分，然后使用低盐Tris、pH8.0缓冲溶液进行洗脱直至UV280趋向于基线。用乙酸溶液将收集的穿透样品调节至pH5.5。

4.阳离子(50HS)

在阴离子程序中收集的样品用0.22μm膜过滤。将样品装载到50HS柱上，然后用低浓度乙酸盐、pH5.5缓冲溶液平衡，用0-100％高浓度乙酸盐、pH5.5、20CV以线性梯度方式洗脱，并收集洗脱组分。

将所得MBS301抗体用于以下实施例。

实施例6：通过质谱测定分子量

1.实验方法

脱糖样品的制备：用10kD超滤管将500μg的MBS301抗体脱盐，添加10μL的G7消化缓冲溶液，3μL的PNGaseF，用超纯水稀释至100μL，均匀混合，用密封膜密封并置于37℃水浴中过夜；

LC-MS分析：将MBS301或脱糖样品稀释至2.5mg/ml，用PLRP-S色谱柱脱盐：使用从95％流动相A(0.1％FA水)、5％流动相B(0.1％FA乙腈)到95％流动相B的10分钟梯度，并保持10分钟；用反相色谱柱脱盐后，用TripleTOF 4600(AB Sciex)进行质谱分析，并用Analyst TF1.6对数据进行去卷积分析。

2.实验结果

MBS301的完整蛋白质分子量的质谱分析结果如图4所示，MBS301由多个具有不同分子量的分子组成，其对应于不同的糖型，并且在这些糖型中未发现岩藻糖。

去除N-糖修饰后，MBS301的质谱分析结果如图5所示，其完整蛋白分子量为145,154，与理论分子量一致，这表明MIL203AF和MIL204AF的组装成功。

实施例7：分子排阻色谱分析(SEC-HPLC)

1.实验方法

流动相：0.2mol/L磷酸钾缓冲溶液、0.25mol/L氯化钾，pH6.2±0.1

样品的制备：将待测样品用流动相稀释至2mg/mL

色谱分析条件：进样器温度为6℃，样品量：25μL，流量：0.5ml/分钟，信号器：280nm，柱温：30℃，等度洗脱30分钟。

2.实验结果

组装前的MIL203AF、MIL204AF和组装后的MBS301的SEC光谱如图6所示。可以看出在组装前，MIL203AF有许多半抗体(44.7％)和大分子；在组装前，MIL204AF具有宽的单体峰模式，这表明其分子大小分布不均匀；然而，在MBS301组装后，分子大小均一，单体纯度为99.1％。

实施例8：N-糖型分析

1.实验方法：

用10kD超滤管将500μg抗体脱盐，添加10μL的G7消化缓冲溶液，3μL的PNGaseF，用超纯水稀释至100μL，均匀混合，并用密封膜密封，置于37℃水浴中过夜；将消化后的样品添加到300μL预冷乙醇中，混合均匀并静置30分钟，12000rpm离心5分钟，取上清液，浓缩并真空干燥。将DMSO和乙酸以350μL∶150μL的比率混合，取5mg的2-AB、6mg的氰基硼氢化钠溶于100μL的DMSO与乙酸的混合溶液中，取10μL混合溶液，置于65℃烘箱中，衍生3小时后，添加200μL的80％乙腈和水的混合溶液，离心2分钟并收集上清液。

色谱柱：WATERS Acquity UPLC BEH酰胺1.7μm、2.1×50mm柱；

柱温：40℃；

激发波长：λ_激发＝330nm；λ_发射＝420nm；

样品量：10μL；

色谱柱用20％流动相A(100mM甲酸铵pH4.5)、80％流动相B(100％乙腈)平衡，装载样品后，A相的百分比于36分钟后增加至40％。

2.实验结果：

组装的MIL203/204、MBS301具有如图7所示的糖型图谱。在图7及表2和3中可以看到，与MIL203/204相比，MBS301的岩藻糖含量显著降低，并且含岩藻糖的糖型G0F的百分比仅为1.1％。

表2：MIL203/204糖型的糖型百分比

名称	G0F-GN	G0	G0F	MAN5	G1F	G1F′	G2F	G2FS	G2FS2
										203-204	1.06	0.62	44.73	0.98	9.27	5.87	8.69	10.53	9.40

表3：MBS301的糖型百分比

名称	G0-GN	G0	G0F	MAN5	G1	G1′	G2	G2S	G2S2
										203AF-204AF	3.34	46.50	1.1	1.49	7.73	6.11	4.89	5.65	7.77

实施例9：抗体的Her2结合活性分析

1.实验方法：

使用HBS-EP+缓冲液将MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物(1∶1)、MIL203/204及MBS301样品分别稀释至0.1μg/ml，以形成配体。将HER2(Sino Biological Inc，10004-H08H)用HBS-EP+缓冲液稀释至4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml和0.125μg/ml，以形成分析物。通过间接捕获法固定配体(抗体)，其中25μg/ml的抗人IgG抗体(BR100839，GE)首先通过氨基偶合共价键结合到CM5芯片的表面，然后配体和分析物结合。在

(用于自动测量和研究生物分子的相互作用的分析仪)Wizard模式下，以多循环模式分别使用MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物及MBS301样品作为配体，并使用HER2作为分析物进行亲和力分析实验。每个样品的分析包括3份启动样品、1份零浓度对照样品、6份梯度浓度样品和1份重复浓度样品，在每个循环结束后，用3M MgCl₂再生溶液使芯片再生。分析物每个浓度循环的捕获时间设为90秒，配体溶液流量为10μl/分钟；配体和分析物的结合时间为180秒，分析物溶液流量为30μl/分钟；解离时间为1200秒。将原始数据导入

X100分析软件中，扣除零浓度对照，扣除参考通道以消除体积效应，并用动力学分析方法的1∶1结合模式拟合曲线，并进行数据校对。

2.实验结果：

表4.通过Biacore技术测定的Her2结合动力学常数

样品名称	ka(1/Ms)	kd(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
				MIL40	3.293E+5	1.772E-4	5.383E-10
MIL41	1.974E+5	2.117E-4	1.073E-9
				MIL40/MIL41	3.172E+5	1.481E-4	4.668E-10
MIL203-204	3.320E+5	1.240E-4	3.735E-10
				MBS301	3.465E+5	1.161E-4	3.350E-10

从表中可以看出，根据结合动力学常数，MBS301和MIL203/204在Her2结合活性方面优于MIL41，并且基本上等同于MIL40，以及MIL40和MIL41的混合物(1∶1)。

实施例10：FcγRIIIa结合活性的分析

1.实验方法：

用HBS-EP缓冲液将FcγRIIIa(Sino Biological Inc，10389-H08C1)稀释至0.2μg/ml，以形成配体。使用HBS-EP缓冲液分别将MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物(1∶1)、MIL203/204及MBS301样品稀释至360μg/ml、120μg/ml、40μg/ml、13.3μg/ml、4.4μg/ml，以形成分析物。通过间接捕获法固定配体FcγRIIIa，其中50μg/ml的抗His IgG首先通过氨基偶合共价键结合到CM5芯片的表面，然后配体和分析物结合。在Biacore Wizard模式下，以多循环模式通过使用FcγRIIIa作为配体并分别使用MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物以及MBS301样品作为分析物，进行亲和力分析实验。每个样品的分析包括3份启动样品、1份零浓度对照样品、5份梯度浓度样品和1份重复浓度样品，在每个循环结束后，用10mMGlycine-HCl、pH 1.5再生溶液使芯片再生。分析物每个浓度循环的捕获时间设为60秒，配体溶液流量为10μl/分钟；配体和分析物的结合时间为180秒，分析物溶液流量为30μl/分钟；解离时间为180秒。将与抗His IgG偶合的CM5芯片置于槽中，并测试和分析样品。将原始数据导入BIACORE^TM X100分析软件中，扣除零浓度对照，扣除参考通道以消除体积效应，并将亲和力分析方法的稳态模型评估用于拟合曲线，并进行数据校对。

2.实验结果：

从表6可以看出，MBS301显示出最低的K_D值，这表明它对FcγRIIIa具有最强的结合活性，明显强于MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物、MIL203/204，并且这表现出经糖基化修饰的MBS301的优越性。

表5.

	K<sub>D</sub>(M)E-7	K<sub>D</sub>(M)E-7	K<sub>D</sub>平均值(M)E-7
				MIL41	8.290	8.059	8.175
MIL40	3.194	3.022	3.108
				MBS301	1.252	1.096	1.174
MIL203/204	5.886	5.852	5.869
				MIL41/MIL40混合物	4.312	4.297	4.305

实施例11：ADCC活性分析

1.实验方法：

将靶乳腺癌细胞SKBR-3(购自ATCC，CRL-2326)，效应细胞NK92MI-CD16A(购自Huabo Bio)以1200rpm离心4分钟，弃上清液，使用ADCC实验培养基使细胞重新悬浮，然后以1200rpm离心4分钟，弃上清液，使用ADCC实验培养基使细胞重新悬浮，并且根据细胞计数，细胞存活率应≥90％。将SKBR-3细胞密度调节到1.25×10⁵个/ml，将NK92MI-CD16a细胞密度调节到6.25×10⁵个/ml。

分别添加不同浓度的抗体以达到0.000001μg/ml、0.00001μg/ml、0.0001μg/ml、0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的最终浓度，然后添加效应细胞和靶细胞(效应-靶细胞比率为5:1)，在37℃下孵育6小时，添加LDH显色液，100μL/孔，在室温下避光静置20分钟。用MD SpectraMax i3进行测定。

关于靶乳腺癌细胞BT474(购自ATCC，CRL-2326)、结肠癌SW480(购自中国科学院细胞库，TCHU172)，ADCC效应细胞与靶细胞的比率为10:1，即靶细胞密度为1.25×10⁵个/ml，效应细胞密度为1.25×10⁶个/ml。对于SKBR-3而言，其它方法相同。

关于靶乳腺癌细胞HCC1419(耐曲妥珠单抗，购自ATCC，CRL-2326)，ADCC作用方法与SKBR-3相同。

杀伤率的计算：

背景组：培养基组

最小释放组：靶细胞组

最大释放组：靶细胞+裂解液组

实验组：靶细胞+效应细胞

杀伤率(％)＝[(实验组-最小释放组)/(最大释放组-最小释放组)]×100

2.实验结果：

图8-11显示的结果表明MBS301对不同靶细胞的ADCC活性均显著优于MIL40、MIL41、组合施用的MIL40和MIL41(1:1)、以及MIL203/204，并且杀伤作用取决于抗体剂量。

实施例12：直接细胞杀伤活性分析

1.实验材料

人乳腺癌BT474细胞(购自ATCC，HTB-20)。

人乳腺癌MDA-MB-175细胞(购自ATCC，HTB-25)。

人乳腺癌SKBR-3细胞(购自ATCC，HTB-30)。

人乳腺癌HCC1419细胞(购自ATCC，CRL-2326)。

人胃癌NCI-N87细胞(购自中国科学院细胞库，TCHU130)。

在这些细胞中，BT474是三阳性细胞，Her-2高表达；与BT474相比，MDA-MB-175、SKBR-3的HER-2表达量较低；HCC1419是

耐药株。

2.实验方法：

为对数生长期人乳腺癌BT474细胞(购自ATCC，HTB-20)计数，存活率>90％，调节至细胞密度为6.7×10⁴个细胞/ml，混合均匀，按150μl/孔的量接种在细胞培养板上。稀释抗体药物MIL40、MIL41、组合施用的MIL40/MIL41、MIL203/204、MBS301，然后按50μl/孔的量添加到提前将细胞接种于96孔培养板上，对于每个抗体药物，设置9个浓度，2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml、0.156μg/ml、0.078μg/ml、0.039μg/ml、0.020μg/ml、0.010μg/ml，并且为每个浓度设置重复孔；另外，还设置了无药对照组和细胞培养基空白对照组。将培养板放置在细胞培养箱中孵育120小时，然后向每个孔添加10μl的CCK-8溶液，振荡后，将培养板置于培养箱中孵育3-5小时，用ELISA测定OD₄₅₀值。药物对细胞的抑制率通过下式计算：抑制率＝(1-(药物组OD₄₅₀-空白组OD₄₅₀)/(对照组OD₄₅₀-空白组OD₄₅₀))*100％。

为对数生长期人乳腺癌MDA-MB-175细胞(购自ATCC，HTB-25)计数，存活率>90％，调节至细胞密度为1×10⁵个细胞/ml，混合均匀，按100μl/孔的量接种在细胞培养96孔板上。对于每种抗体药物，设置10个浓度，500μg/ml、125μg/ml、31.25μg/ml、5.208μg/ml、0.868μg/ml、0.145μg/ml、0.0241μg/ml、0.00402μg/ml,0.000670μg/ml、0.000112μg/ml。将培养板置于细胞培养箱中并孵育72小时，与BT474细胞其它方法相同。

为对数生长期人乳腺癌SKBR-3细胞(购自ATCC，HTB-30)计数，存活率>90％，调节至细胞密度为1×10⁵个细胞/ml，混合均匀，按100μl/孔的量接种在96孔板上进行细胞培养。对于每种抗体药物，设置9个浓度，100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml、1.56μg/ml、0.39μg/ml、0.098μg/ml、0.0244μg/ml、0.0061μg/ml、0.0015μg/ml。将培养板置于细胞培养箱中并孵育120小时，与BT474细胞其它方法相同。

为对数生长期人乳腺癌HCC1419细胞(购自ATCC，CRL-2326)计数，存活率>90％，调节至细胞密度为5×10⁴个细胞/ml，混合均匀，按100μl/孔的量接种在96孔板上进行细胞培养。对于每种抗体药物，设置9个浓度，100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml、1.56μg/ml、0.39μg/ml、0.098μg/ml、0.0244μg/ml、0.0061μg/ml、0.0015μg/ml。将培养板置于细胞培养箱中并孵育120小时，与BT474细胞其它方法相同。

为对数生长期人胃癌NCI-N87细胞(购自中国科学院细胞库，TCHU130)计数，存活率>90％，调节至细胞密度为5×10⁴个细胞/ml，混合均匀，按100μl/孔的量接种在96孔板上进行细胞培养。对于每种抗体药物，设置9个浓度，10μg/ml、3.33μg/ml、1.11μg/ml、0.37μg/ml、0.123μg/ml,0.041μg/ml、0.0137μg/ml,0.0045μg/ml、0.0015μg/ml。将培养板置于细胞培养箱中并孵育7小时，与BT474细胞其它方法相同。

3.实验结果：

如图12所示，MIL203/204、MBS301对BT474细胞的抑制率高于MIL40、MIL40/MIL41混合物，MIL41的抑制活性最弱。

如图13所示，MIL203/204、MBS301对MDA-MB-175细胞的抑制率显著高于MIL40，并且非常接近于MIL41、MIL40/MIL41混合物(1:1)的抑制率。

如图14所示，MIL203/204、MBS301对SKBR-3细胞的抑制率比MIL40、MIL41、MIL40/MIL41混合物更高。

如图15所示，MIL40、MIL41对乳腺癌细胞HCC1419无显著抑制作用，组合施用的MIL40/MIL41(1:1)可抑制细胞增殖，MIL203/204和MBS301显示出最高的抑制率，其活性显著优于组合施用的MIL40和MIL41(1:1)。

如图16所示，组合施用的MIL40和MIL41(1:1)对胃癌细胞NCI-N87的抑制作用优于MIL40，MIL41未显示出显著抑制作用；MIL203/204和MBS301显示出最高的抑制率，并且其活性显著优于组合施用的MIL40和MIL41(1:1)。

实施例13：CDC活性

1.实验方法：

将靶细胞BT474以1200rpm离心4分钟，弃上清液，用1％FBS培养基使细胞重新悬浮，计数，细胞存活率应≥90％。将BT474细胞的细胞密度调节至2×10⁵个/ml，每孔50μl。

添加不同浓度的抗体，其最终浓度分别为100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml、1.56μg/ml、0.39μg/ml、0.098μg/ml、0.0244μg/ml、0.0061μg/ml，然后添加50μl兔补体(1:20稀释)，在37℃下孵育2小时，添加LDH显色液，80μL/孔，在室温下避光静置20分钟。用MDSpectraMax i3进行测定。

杀伤率的计算：

背景组：培养基组

最小释放组：靶细胞组

最大释放组：靶细胞+裂解液组

实验组：靶细胞+补体

2.实验结果：

从图17可以看出，分别作用于靶细胞BT474的MIL40、MIL41并未表现出CDC活性，但是当它们组合施用时，它们显示出CDC作用，双功能抗体MIL203/204、MBS301的CDC活性显著比组合施用的MIL40和MIL41更强，并呈现抗体剂量依赖性CDC杀伤作用。

实施例14：抗体FcRn结合活性分析

1.实验方法

用HBS-EP缓冲液将FcRn(Sino Biological Inc，CT009-H08H)稀释至0.2μg/ml，以形成配体。使用HBS-EP缓冲液分别将MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物、MIL203/204及MBS301样品稀释至360μg/ml、120μg/ml、40μg/ml、13.3μg/ml、4.4μg/ml，以形成分析物。通过间接捕获法固定配体FcRn-His标记，其中50μg/ml的抗His IgG首先通过氨基偶合共价键结合到CM5芯片的表面，然后结合配体和分析物。在Biacore Wizard模式下，以多循环模式通过分别使用FcRn作为配体，使用MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物以及MBS301样品作为分析物，进行亲和力分析实验。每个样品的分析包括3份启动样品、1份零浓度对照样品、5份梯度浓度样品和1份重复浓度样品，在每个循环结束后，用10mM Glycine-HCl、pH 1.5再生溶液使芯片再生。分析物每个浓度循环的捕获时间设为60秒，配体溶液流量为10μl/分钟；配体和分析物的结合时间为180秒，分析物溶液流量为30μl/分钟；解离时间为180秒。将与抗His IgG偶合的CM5芯片置于槽中，并测试和分析样品。将原始数据导入BIACORE^TM X100分析软件中，扣除零浓度对照，扣除参考通道以消除体积效应，并将亲和力分析方法的稳态模型评估用于拟合曲线，并进行数据校对。

2.实验结果：

从表6可以看出MBS301显示出最低的K_D值，这表明它对FcRn具有最强的结合活性，显著优于MIL40、MIL41、MIL40和MIL41的混合物，并且基本上等同于MIL203/204。

表6.通过Biacore技术测定的FcRn结合动力学常数

实施例15：裸鼠体内抑瘤实验

1.实验方法

6-8周Nu/Nu裸鼠，体重17.0-22.0g，雌性小鼠80只/批，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物证书：SCXK(北京)-2012-0001。在具有独立气源的无菌IVC笼中饲喂实验动物，每笼5只小鼠。填充材料是用⁶⁰Co辐射灭菌的玉米芯填充材料(尺寸：4-6mm)，给小鼠喂食专门为小鼠配制的消毒饲料，并给予纯净水自由饮用。在用于进行动物实验的实验室中，室温保持在25℃左右，相对湿度保持在40-70％，并且每天照射12小时。

为裸鼠皮下接种SKOV3。当肿瘤体积增长到约1500-2000mm³时，在无菌条件下取出肿瘤块，切成约1.0×1.0×1.0mm³碎片，皮下接种于裸鼠右前肢腋下。在皮下接种的肿瘤大小为100-300mm³后，将其根据肿瘤大小随机分组。SKO-V3细胞培养：将细胞在含有10％胎牛血清(补充有青霉素和链霉素，各100μl/ml)的DMEM细胞培养基中培养，置于37℃和5％CO₂的细胞培养箱中，每1-2天更换一次培养基。通过使用0.25％胰蛋白酶消化进行传代，在以1000r/分钟离心5分钟后，弃上清液，并添加新鲜培养基用于传代和培养。

在皮下移植后，选择符合标准的荷瘤动物，并根据肿瘤大小随机分组，每组约8只动物，通过尾静脉注射进行施用，每周两次，连续2周。

每天观察实验动物的采食、饮水和运动，每3天测量一次每只动物的体重和肿瘤大小，并在实验结束时通过颈部脱位处死动物，剥离肉眼可见的肿瘤并称重。将通过解剖获得的所有组织放置并保存在4％甲醛中用于常规病理检测。

数据以X±s表示；肿瘤生长抑制率＝(实验组肿瘤体积-施用组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100％；肿瘤体积＝1/2ab²(a＝肿瘤长径；b＝肿瘤短径)；

2.实验结果

如图18所示，荷瘤小鼠中的所有肿瘤均生长，其中对照组的肿瘤显示出进行性生长，而施用组的肿瘤生长不同程度减慢或停止。在观察期结束时，对照组的裸鼠精神萎靡、痉挛、皮肤萎缩且运动缓慢。

根据肿瘤大小和时间绘制肿瘤生长曲线。在SKO-V3细胞荷瘤小鼠组中，双功能抗体MIL203/204、MBS301及组合施用的MIL40/MIL41可以有效抑制SKO-V3肿瘤生长，其肿瘤抑制能力优于单独的MIL40和MIL41。

实施例16.抗Her2双特异性抗体MBS301用于降低小鼠体内人乳腺肿瘤体积的治疗人乳腺癌细胞系BT474

已经由乳腺癌患者的导管癌建立了这种人乳腺癌细胞系。BT474细胞系在10％胎牛血清(Gibco,America)的DMEM培养基(Gibco,America)中，37℃、5％CO₂恒温恒湿箱中进行常规培养。

小鼠

雌性BALB/c裸鼠；5-6周龄；体重15-17g(北京维通利华实验动物技术有限公司)；将其保持在无特定病原体的条件下，每天12小时光照和12小时黑暗循环。到达后，将动物放在动物设施的检疫部分一周，以适应新的环境和进行观察。随意提供食物和水。

肿瘤细胞注射

在注射当天，从培养瓶中收获肿瘤细胞。将细胞滴度调节至1x 10⁸/ml。注射前，将17β-ESTRADIOL片(Innovative Research ofAmerica)皮下植入BALB/c裸鼠背部。小心地将肿瘤细胞悬浮液与

(生物细胞培养基质)以1:1的比率混合，然后细胞悬浮液为5×10e7个/ml，按0.2ml的体积将BT474细胞注入每只小鼠的右乳腺脂肪垫。

治疗

小鼠按照平均肿瘤体积125mm³随机分组，随后以10ml/kg静脉注射体积进行治疗，每周两次。对于组合治疗，同时给予MIL40和MIL41(见表7)。

表7.

组别	动物数量	化合物	剂量(mg/kg)	施用途径/模式
					1	6	空白溶液	-	静脉内，每周两次
2	6	MIL40	13.5	静脉内，每周两次
					3	6	MIL41	13.5	静脉内，每周两次
4	6	MIL40+MIL41	6.75+6.75	静脉内，每周两次
					5	6	MIL203/304	13.5	静脉内，每周两次
6	6	MBS301	13.5	静脉内，每周两次

结果如图19所示。MBS301比MIL40更有效地抑制BT474肿瘤生长，与MIL40和MIL41的1:1混合物一样有效。

实施例17.抗Her2双特异性抗体MBS301用于降低小鼠体内人胃部肿瘤体积的治疗

人胃癌细胞系NCI-N87

NCI-N87细胞系是来源于转移部位的人胃癌细胞，在10％胎牛血清(Gibco,America)的1640培养基(Gibco,America)中，在37℃、5％CO₂恒温恒湿箱中进行常规培养。

小鼠

雌性BALB/c裸鼠；6-7周龄；体重18-22g(北京维通利华实验动物技术有限公司)；将其保持在无特定病原体的条件下，每天12小时光照和12小时黑暗循环。到达后，将动物放在动物设施的检疫部分一周，以适应新的环境和进行观察。随意提供食物和水。

肿瘤细胞注射

在注射当天，从培养瓶中收获肿瘤细胞。将细胞滴度调节至5x 10e7/ml。小心地将肿瘤细胞悬浮液与Matrigel以1:1的比率混合，然后细胞悬浮液为2.5x 10e7个/ml，按0.2ml的体积将NCI-N87细胞皮下注入每只小鼠的右侧背部。

处理

小鼠按照平均肿瘤体积110mm³随机分组，随后以10ml/kg静脉注射体积进行处理，每周一次。对于组合处理，同时给予MIL40和MIL41(见表8)。

表8.

结果如图20所示。MBS301比MIL40更有效地抑制NCI-N87肿瘤生长，与MIL41同MIL40的联用一样有效。

在实施例16和17的体内肿瘤生长抑制研究中，MIL40/MIL41组合和MBS301均抑制肿瘤生长，并且两组之间无显著差异。在实施例16和17的结果中没有显示通过非岩藻糖化MBS301的ADCC的额外肿瘤细胞杀伤活性；这是因为人源化抗体不能激活BALB/c裸鼠的NK细胞和巨噬细胞。然而，在基于体外细胞的ADCC测定中，与MIL40和MIL41的混合物相比，MBS301表现出显著增强的ADCC活性(参见实施例11-13和图8-17)。

实施例18.人胃癌GA0055患者来源的异种移植(PDX)裸鼠模型

该肿瘤组织来源于一名69岁的亚洲女性的胃部，其病理诊断为明确胃窦前壁细胞腺癌，溃疡型，IHC(免疫组织化学)结果为HER-2(+)，mRNA表达水平高。

小鼠

将雌性BALB/c裸鼠保持在无特定病原体的条件下，每天12小时光照和12小时黑暗循环。到达后，将动物放在动物设施的检疫部分一周，以适应新的环境和进行观察。随意提供食物和水。

肿瘤接种

每只小鼠在右侧皮下接种原代人胃癌模型GA0055瘤块(直径2-3mm)进行肿瘤生长。当平均肿瘤大小达到146mm³时，将小鼠随机分成3组(参见表9)。

表9.

在该胃癌PDX模型中，MBS301比

更有效地抑制肿瘤生长，MBS301的最终肿瘤生长抑制率为77.82％，而Herceptin为50.15％。在治疗18天后，如图21所示，MBS301和赫赛汀之间的肿瘤大小存在显著差异。

应当理解的是，前面描述了本发明优选的实施方案，并且在不脱离如权利要求中所阐述的本发明的范围的前提下，可以在其中进行修改。

序列表

<110> 北京天广实生物技术股份有限公司

<120> 双特异性抗HER2抗体

<130> 123044-8001.US01

<150> US 15/461,732

<151> 2017-03-17

<150> CN201610584242.9

<151> 2016-07-22

<160> 27

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一重链的CDR1

<400> 1

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一重链的CDR2

<400> 2

Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一重链的CDR3

<400> 3

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二重链的CDR1

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二重链的CDR2

<400> 5

Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二重链的CDR3

<400> 6

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一重链的恒定区

<400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二重链的恒定区

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一重链的可变区

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二重链的可变区

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一轻链的CDR1

<400> 11

Gln Asp Val Asn Thr Ala

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一轻链的CDR2

<400> 12

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一轻链的CDR3

<400> 13

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二轻链的CDR1

<400> 14

Gln Asp Val Ser Ile Gly

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二轻链的CDR2

<400> 15

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二轻链的CDR3

<400> 16

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一轻链的可变区的氨基酸序列

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第二轻链的可变区的氨基酸序列

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 第一轻链的恒定区的氨基酸序列或第二轻链的恒定区的氨基酸序列

<400> 19

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 20

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 编码第一重链的核酸序列

<400> 20

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcggctt caacatcaag gatacctaca tccactgggt gcgccaggct 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgc atctacccca ccaacggcta cacccgctac 180

gccgatagcg tgaagggccg cttcaccatc agcgccgata ccagcaagaa caccgcctac 240

ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcag ccgctggggc 300

ggcgatggct tctacgccat ggattactgg ggccagggca ccctggtcac cgtgagcagc 360

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgact gtgccctcta gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaagag 1080

atgaccaaga accaggtcag cctgagctgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350

<210> 21

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 编码第二重链的核酸序列

<400> 21

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60

tcctgcgccg ccagcggctt cacctttacc gactacacca tggactgggt gcgccaggct 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgac gtgaacccca acagcggcgg cagcatctac 180

aaccagcgct tcaagggccg cttcaccctg agcgtggacc gcagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcaacctg 300

ggccccagct tctacttcga ctattggggg cagggcaccc tggtcaccgt gagcagcgct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgactgtg ccctctagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaagagatg 1080

accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347

<210> 22

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> MIL203的重链的氨基酸序列

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 23

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> MIL203的轻链的氨基酸序列

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 24

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MIL203的轻链的核酸序列

<400> 24

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgccagcca ggatgtgaac accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180

cgcttcagcg gcagccgcag cggcaccgat ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 25

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> MIL204的重链的氨基酸序列

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 26

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> MIL204的轻链的氨基酸序列

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MIL204的轻链的核酸序列

<400> 27

gatatccaga tgacccagag cccctccagc ctgtccgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgca aggccagcca ggacgtgagc atcggcgtgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gcctcctacc gctacaccgg cgtgccctcc 180

cgcttcagcg gctccggcag cggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagccc 240

gaggactttg ccacctacta ctgccagcag tactacatct atccctatac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

Claims

1.一种人源化双特异性抗Her2抗体，其包含：

包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的第一重链可变区的第一重链，

包含具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的第一轻链可变区的第一轻链，

包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的第二重链可变区的第二重链，和

包含具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的第二轻链可变区的第二轻链，

其中所述第一重链可变区和所述第一轻链可变区形成对HER2的细胞外结构域IV有特异性的第一抗原结合位点，并且所述第二重链可变区和所述第二轻链可变区形成对HER2的细胞外结构域II有特异性的第二抗原结合位点，

其中所述第一重链还包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的恒定区，所述第二重链还包含具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的恒定区。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一重链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一轻链还包含具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的恒定区。

4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述第一轻链包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第二重链包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第二轻链还包含具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的恒定区。

7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述第二轻链包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一重链包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列，所述第一轻链包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，所述第二重链包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且所述第二轻链包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。

9.根据权利要求1所述的抗体，其包含Fc区，且包含不超过附着于所述抗体Fc区的总糖10％的量的岩藻糖。

10.根据权利要求9所述的抗体，包含不超过附着于所述抗体Fc区的总糖5％的量的岩藻糖。

11.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-10中任一项所述的抗体。

12.一种分离的宿主细胞，其转化或转染有权利要求11所述的核酸分子。

13.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。

14.权利要求1-10中任一项所述的抗体或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗由HER2过表达引起的癌症的药物中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、头颈癌或前列腺癌。