CN110198738A

CN110198738A - 用于靶向的TGF-β抑制的给药方案和剂型

Info

Publication number: CN110198738A
Application number: CN201880006085.0A
Authority: CN
Inventors: I·度赛特; S·厄尔巴瓦博; Y·乌戈梅斯特; A·坎德瓦
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2017-01-07
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2019-09-03
Also published as: EP3565599A4; EP3565599A1; PH12019501574A1; BR112019013924A2; RU2019124875A3; IL267856A; KR20190102059A; WO2018129331A1; CL2019001871A1; RU2019124875A; JP2020514290A; US20190330375A1; CA3048646A1; AU2018205233A1; SG11201906157YA; MX2019008001A

Abstract

本公开内容一般涉及靶向人蛋白程序性死亡配体1(PD‑L1)和转化生长因子β(TGFβ)的双功能蛋白质的体重非依赖性(BW‑非依赖性)给药方案和剂型。

Description

用于靶向的TGF-β抑制的给药方案和剂型

相关申请交叉引用

本申请要求2017年1月7日提交的美国申请号62/443,698和2017年11月6日提交的美国申请号62/581,978的权益和优先权，其中各自内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。

技术领域

本公开内容一般涉及靶向人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)和转化生长因子β(TGFβ)的双功能蛋白质的体重非依赖性(BW-非依赖性)给药方案和剂型。

背景技术

程序性死亡1(PD-1)/PD-L1轴是肿瘤免疫逃避的重要机制。长期感应抗原的效应T细胞呈现以PD-1表达为标志的耗尽表型，这是通过上调PD-L1与肿瘤细胞密切相关的状态。另外，在肿瘤微环境中，骨髓细胞，巨噬细胞，实质细胞和T细胞上调PD-L1。阻断该轴会恢复这些T细胞中的效应功能。

通过引用纳入本文的美国专利申请公开号US20150225483A1描述了一种双功能融合蛋白，其将抗程序性死亡配体1(PD-L1)抗体与作为TGFβ中和“阱(Trap)”的II型肿瘤生长因子β受体(TGFβRII)的可溶性细胞外结构域组合成单个分子。具体而言，该蛋白质是异四聚体，由抗PD-L1的两条免疫球蛋白轻链，和包含通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头遗传融合至人TGFβRII的细胞外结构域的抗PD-L1的重链的两条重链组成(参见图1)。该抗PD-L1/TGFβ阱分子被设计成靶向肿瘤微环境中免疫抑制的两种主要机制。美国专利申请公开号US20150225483A1描述了以基于患者体重的剂量给予阱分子。

发明内容

本公开内容提供了用于给予靶向PD-L1和TGFβ的双功能蛋白的改进的给药方案。具体地，涉及给予以各种给药频率给予至少500mg双功能蛋白质的体重非依赖性(BW-非依赖性)给药方案和相关剂型可用作抗肿瘤和抗癌疗法。BW非依赖性给药方案确保所有患者，无论其体重如何，都将在肿瘤部位具有足够的药物暴露。

本公开的双功能蛋白质(抗PD-L1/TGFβ阱分子)包括第一和第二多肽。第一多肽包括：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链的可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段(例如，可溶性片段)。第二多肽至少包括结合PD-L1的抗体的轻链的可变区，其中第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)。因为本公开的双功能蛋白质结合两个靶标，(1)PD-L1，其主要是膜结合的，和(2)TGFβ，其可溶于血液和间质，BW非依赖性给药方案需要不仅有效抑制肿瘤部位的PD-L1，而且足以抑制TGFβ的剂量。

在一个方面，本公开提供癌症的治疗或肿瘤的抑制，例如非小细胞肺癌，黑素瘤，胰腺癌，结直肠癌(例如，预治疗的结直肠癌(CRC))，卵巢癌，成胶质细胞瘤，胃癌(例如，预治疗的复发性或难治性不可切除的IV期胃癌)，胆道癌，食道癌(鳞状细胞癌或腺癌)，头颈部的腺瘤，以及头颈部的鳞状癌。

本发明的特点还在于，如上所述的双功能蛋白质用于治疗癌症或用于抑制肿瘤生长的用途。所述癌症或肿瘤可选自：结直肠癌(例如，预治疗的结直肠癌(CRC))、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌(例如，预治疗的复发性或难治性不可切除的IV期胃癌)、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头颈部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。该用途还可包括给予放射或给予化学治疗剂，生物制剂或疫苗。

本公开的特点还在于，一种促进TGFβ的局部消耗的方法。该方法包括给予上述蛋白质，其中蛋白质结合溶液中的TGFβ，结合细胞表面上的PD-L1，并将结合的TGFβ携带到细胞(例如癌细胞)中。

本公开的特点还在于，一种抑制细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)中SMAD3磷酸化的方法，所述方法包括，使肿瘤微环境中的所述细胞接触如上所述的蛋白质。

本公开的特点还在于，一种抑制肿瘤生长或治疗癌症的方法。所述方法包括使肿瘤暴露于如上前文所述蛋白质。所述方法还可包括：使所述肿瘤接触辐照或暴露至化疗剂、生物制品，或疫苗。在某些实施方式中，所述癌症或肿瘤选自：结直肠癌(例如，预治疗的结直肠癌(CRC))、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌(例如，预治疗的复发性或难治性不可切除的IV期胃癌)、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头颈部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤，和骨髓增生异常综合征。

“TGFβRII”或“TGFβ受体II”表示：具有野生型人2型TGFβ受体同种型A序列(如NCBI参考序列(RefSeq)登记号NP_001020018的氨基酸序列(SEQ ID NO:8))的多肽，或具有野生型人2型TGFβ受体同种型B序列(如NCBI RefSeq登记号NP_003233的氨基酸序列(SEQ IDNO:9))或具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列基本相同序列的多肽。TGFβRII可保留野生型序列TGFβ结合活性的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％。表达的TGFβRII多肽没有信号序列。

“能够结合TGFβ的TGFβRII片段”表示NCBI RefSeq登记号NP_001020018(SEQ IDNO:8)或NCBI RefSeq登记号NP_003233(SEQ ID NO:9)或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9基本相同序列的任意部分，片段长度至少20(例如至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、175或200)个氨基酸且保留野生型受体或其野生型片段的至少部分TGFβ结合活性(例如至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％)。通常，这些片段是可溶性片段。示例性片段之一是具有SEQ ID NO:10序列的TGFβRII胞外域。

“基本相同”表示多肽与参照氨基酸序列显示至少50％，优选60％、70％、75％或80％，更优选85％、90％或95％，且最优选99％的氨基酸序列相同性。比较序列的长度一般至少10个氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，至少20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350个连续氨基酸更好，最好是全长氨基酸序列。

“患者”表示人或非人动物(例如哺乳动物)。“患者”，“对象”，“有此需要的患者”和“有此需要的对象”在本公开中可互换使用，并且是指患有或易患可通过使用本公开中提供的方法和组合物的给药治疗的疾病或病症的活生物体。

本公开中使用的术语“治疗”或“处理”以及其他语法等同物包括缓解，减轻，改善或预防疾病，病症或症状，预防其他症状，改善或预防的症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病症，例如，阻止疾病或病症的发展，缓解疾病或病症，引起疾病或病症的消退，缓解由疾病或病症引起的病症，或停止疾病或病症的症状，并且旨在包括预防。该术语还包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在病症。此外，通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，使得在患者中观察到改善，尽管患者仍然可能患有潜在病症。

“癌症”指异常增殖的细胞集群。如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症，肿瘤，恶性或良性肿瘤，包括白血病，癌和肉瘤。示例性癌症包括乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，肝癌，肾癌，肺癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤。其他示例包括脑癌，肺癌，非小细胞肺癌，黑素瘤，肉瘤，前列腺癌，子宫颈癌，胃癌，头颈癌，子宫癌，间皮瘤，转移性骨癌，成神经管细胞瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤，原发性血小板增多症，原发性巨噬细胞血症，膀胱癌，癌前皮肤病变，睾丸癌，淋巴瘤，甲状腺癌，神经母细胞瘤，食道癌，泌尿生殖道癌，恶性高钙血症，子宫内膜癌，肾上腺皮质癌，以及内分泌和外分泌胰腺的肿瘤。

在本说明书的整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词的其他形式，例如“含有”和“包含”，意味着包括但不限于，并且不旨在排除例如其他组分。

“共同给予”是指本文所述的组合物在给予另外疗法的同时，紧接之前或之后给予。本公开的蛋白质和组合物可以单独给予，或者可以与第二，第三或第四治疗剂共同给予于患者。共同给予意指包括单独或组合地同时或依次给予蛋白质或组合物(多于一种治疗剂)。

术语“一个”并不意味着限制为单数。在某些实施方式中，术语“一个”可以指复数形式。如本文全文所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。因此，例如，提及“组合物”包括多种这样的组合物，以及单一组合物。

“重建的”制剂是通过将冻干制剂溶解在水性载体中制备的制剂，使得双功能分子溶解在重建的制剂中。重建的制剂适合于对有此需要的患者静脉内给药(IV)。

术语“约”是指药剂的浓度或量的任何最小改变，其在制剂制备和治疗疾病或病症中不改变药剂的功效。在实施方式中，术语“约”可包括指定数值或数据点的±15％。

本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表示这样一个范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相关以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。还应理解，在本公开中公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值还被公开为“约”该特定值。还应理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据表示数据点的任何组合的端点和起始点和范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解为大于，大于或等于，小于，小于或等于，等于10和15以及在10和15之间被认为是公开的。还应该理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11，12，13和14。

“等渗”制剂是与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂通常具有约250至350mOsmol/KgH₂O的渗透压。术语“高渗”用于描述渗透压高于人血液的制剂。例如，可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量等渗性。

术语“缓冲剂”是指一种或多种组分，当加入到水溶液中时，当加入酸或碱时，或在用溶剂稀释时，能够保护溶液免受pH变化。除磷酸盐缓冲液外，还可以使用甘氨酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐缓冲液等，在这种情况下，钠离子，钾离子或铵离子可用作抗衡离子。

“酸”是在水溶液中产生氢离子的物质。“药学上可接受的酸”包括无机酸和有机酸，它们在配制它们的浓度和方式下是无毒的。

“碱”是在水溶液中产生氢氧根离子的物质。“药学上可接受的碱”包括无机和有机碱，它们在配制它们的浓度和方式下是无毒的。

“冻干保护剂”是当与感兴趣的蛋白质组合时，在冻干和随后储存时防止或降低蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。

“防腐剂”是降低细菌作用的试剂，并且可以任选地加入到本文的制剂中。添加防腐剂可以，例如，促进多用途(多剂量)制剂的生产。潜在防腐剂的示例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵，六甲基氯化铵，苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇如苯酚，丁基和苄醇，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇和间甲酚。

“表面活性剂”是含有疏水部分(例如烷基链)和亲水部分(例如羧基和羧酸酯基团)的表面活性分子。表面活性剂可以加入到本发明的制剂中。适用于本发明制剂的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；脱水山梨糖醇酯和衍生物；曲通；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基-，肉豆蔻酰基-，亚油基-或硬脂基-磺基丁二烯；十二烷基-，肉豆蔻酰基-，亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-，肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-椰油酰胺丙基-，亚油酰胺丙基-，肉豆蔻酰胺丙基-，棕榈酰基丙基-或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰基丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基钠，或甲基油基-牛磺酸二钠；和MONAQUAT^TM系列(蒙钠工业公司(Mona Industries,Inc.)，新泽西州帕特森(Paterson,N.J.))，聚乙二醇，聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics，PF68等)。

本公开的其他实施方式和详细内容可见后文。

附图说明图1是抗PD-L1/TGFβ阱分子的示意图，该分子包含通过(Gly₄Ser)₄Gly(SEQ ID NO:11)接头与TGFβII型受体的两个胞外域(ECD)融合的一个抗PD-L1抗体。

图2显示两步ELISA的图，证明抗PD-L1/TGFβ阱同时结合PD-L1和TGFβ两者。

图3是显示抗PD-L1/TGFβ阱诱导IL-2水平显著增加的图。

图4A是显示响应抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβ1体内消耗的图。线图表示原初同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4B是显示响应抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβ2体内消耗的图。线图表示原初，同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4C是显示响应抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβ3体内消耗的图。线图表示原初，同种型对照，和三种不同剂量，如图例中所示。图4D是显示抗-PD-L1/TGFβ阱对PD-L1的占据支持EMT-6肿瘤系统中的受体结合模型的图。

图5是显示抗PD-L1/TGFβ阱对照(抗PD-L1(mut)/TGFβ)在底特律562异种移植模型中的抗肿瘤功效的图。

图6A是示出清除率(clearance)和体重之间的关系的散点图。该线代表回归线，表明CL和BW之间的关系。图6B是示出分布体积(V)和体重之间的关系的散点图。该线代表回归线，表明V和BW之间的关系。

图7A是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的整个群体的C_avg分布的箱形图。图7B是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的整个群体的暴露AUC分布的箱形图。图7C是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的整个群体的C_低谷分布的箱形图。图7D是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的整个群体的C_max分布的箱形图。

图7E是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的整个群体的C_avg分布的箱形图。图7F是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的整个群体的暴露AUC分布的箱形图。图7G是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的整个群体的C_低谷分布的箱形图。图7H是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的整个群体的C_max分布的箱形图。

图8A是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的体重四分位数间的C_avg分布的箱形图。图8B是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的体重四分位数间的暴露(AUC)分布的箱形图。图8C是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的体重四分位数间的C_低谷分布的箱形图。图8D是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(1200mg)对比基于mg/kg的给药(17.65mg/kg)的体重四分位数间的C_max分布的箱形图。

图8E是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的体重四分位数间的C_avg分布的箱形图。图8F是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的体重四分位数间的暴露(AUC)分布的箱形图。图8G是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的体重四分位数间的C_低谷分布的箱形图。图8H是在68kg中值体重的模拟群体中针对固定(500mg)对比基于mg/kg的给药(7.35mg/kg)的体重四分位数间的C_max分布的箱形图。

图9A是PK-效力模型的拟合优度散点图，显示了预测的肿瘤体积对比观察到的肿瘤体积。图9B是PK-效力模型的拟合优度散点图，其显示条件加权残差(GWRES)对比剂量后的时间。

图10A-10C是显示在与小鼠肿瘤消退相关的剂量和方案中抗PD-L1/TGFβ阱分子的预测的PK和PD-L1受体占有(“RO”)的图。图10A是显示预测的血浆浓度对比时间的图。图10B是显示PBMC中预测的PD-L1 RO对比时间的图。图10C是显示肿瘤中预测的PD-L1 RO对比时间的图。

图11A-11C是显示在与小鼠肿瘤停滞相关的剂量和方案中抗PD-L1/TGFβ阱分子的预测的PK和PD-L1受体占有(“RO”)的图。图11A是显示预测的血浆浓度对比时间的图。图11B是显示PBMC中预测的PD-L1 RO对比时间的图。图11C是显示肿瘤中预测的PD-L1 RO对比时间的图。

图12A-12B是针对68kg中值体重的模拟群体中的各种给药方案的整个群体的模拟暴露分布的箱形图(图12A：C_平均，图12B：C_低谷)。

图13是蜘蛛图，其表明先前患有进行性疾病(具有原发性难治性和获得性耐药性疾病)的患者实现了显著的疾病稳定性。注意到有疾病响应和疾病稳定的患者在该研究起始之前进行了一系列先前的治疗，甚至在即将开始试验之前进行了一系列治疗，表明具有先前PDx暴露的患者的异质群体中抗PD-L1/TGFβ阱的临床活性(实心三角形：对象停止治疗(off-treatment)；实心菱形：首次出现新病灶)。

图14显示了用抗PD-1/PD-L1处理的患者中抗PD-L1/TGFβ阱分子的功效的直方图。在抗PD-1/PD-L1群体中一些被鉴定为难治性(黑色柱)和耐药性(白色柱)的患者中观察到抗PD-L1/TGFβ阱分子的功效(直径总和的百分比变化约为零(0)的值或负值表示功效)。

具体实施方式

体重非依赖性给药方案

已经开发了涉及给予至少500mg本文所述的双功能抗PD-L1/TGFβ阱分子的体重非依赖性给药方案，其通过分子的各种临床前和临床评估的结果得到证实。两项研究考察了分子的安全性，耐受性和药代动力学，并包括对从受治疗患者的血液中获得的外周血单核细胞上的PD-L1靶标占据的评估以及TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3浓度的测量。这些评估基于来自总共350名对象的数据(实体肿瘤中1，3，10和20mg/kg的剂量递增组，以及选择的肿瘤类型中3mg/kg，10mg/kg，500mg和1200mg的扩展组)。截至分析时的数据截止日期，中位治疗持续时间约为28天。

PK/功效模型(小鼠模型)

还进行实验以确定抗PD-L1/TGFβ阱分子在肿瘤模型中的功效。使用EMT-6异种移植物的功效结果来建立PK/功效模型。在小鼠中建立的PK模型用于模拟抗PD-L1/TGFβ阱血浆暴露以用于功效实验设置。估计的参数报告在表1中。估计的KC50值为55.3μg/mL。该值表示可以实现抗PD-L1/TGFβ阱分子的最大抗肿瘤活性的50％的平均血浆浓度。

模型的基本诊断图显示没有模型错误指定。模型预测能够捕获肿瘤体积分布(图9A)。条件加权残差通常以0均值和1方差分布而没有趋势(图9B)。然后使用PK/功效模型采用不同剂量的人预测浓度-时间曲线来模拟肿瘤生长抑制(TGI)。

表1：EMT-6异种移植小鼠中抗PD-L1/TGFβ阱分子的小鼠PK/功效模型参数

参数	估计	Std	CV％	％IIV
					K<sub>g</sub>(h<sup>-1</sup>)	0.068	0.0005	0.82	40
K<sub>tr</sub>(h<sup>-1</sup>)	0.055	0.0024	4.4	76
					KC<sub>50</sub>(ng/mL)	55324.6	522.3	4.4	232
K<sub>max</sub>	2	0.09	1	93
					基线(mm<sup>3</sup>)	88.3	0.87	1	47

基于PD-L1占据的响应分析(在小鼠模型中)使用功效实验，已经分析了小鼠中的响应并通过肿瘤消退或肿瘤停滞进行分选，并且已经基于整合的PK/RO模型预测了PK和PD-L1受体占据(RO)。该方法证明，肿瘤消退需要与肿瘤中PD-L1 RO高于95％相关的、40至100μg/mL的抗PD-L1/TGFβ阱分子血浆浓度(图9A-9B)。需要与外周中PD-L1 RO高于95％相关的、10至40μg/mL的抗-PD-L1/TGFβ阱分子血浆浓度以达到肿瘤停滞(图10A-10C)。

小鼠中的响应分析和预测的PK/RO得到图11A-11C，其总结了小鼠中抗PD-L1/TGFβ阱分子的PK/RO/功效。在血浆浓度为40μg/mL时达到95％的PD-L1 RO，预期/估计TGI仅为约65％。将浓度增加至高于40μg/mL会导致肿瘤生长抑制的进一步增加。在平均血浆浓度为约100μg/mL时实现95％的肿瘤生长抑制。

基于下面描述的群体PK模型，需要每两周给予一次至少500mg的平剂量(flatdose)以维持约100μg/mL的平均浓度，而需要每两周给予一次约1200mg的平剂量以维持约100μg/mL的C_低谷。在某些实施方式中，将约1200mg至约3000mg(例如，约1200，约1300，约1400，约1500，约1600，约1700，约1800，约1900，约2000，约2100，约2200，约2300，约2400等)的本公开的蛋白质产物(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)给予对象。在某些实施方式中，每两周一次向对象给予约1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，每三周一次向对象给予约1800mg的抗PD-L1/TGFβ阱分子。

在实施方式中，将约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg等)的具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物给予对象。

在某些实施方式中，将约1200mg具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每两周一次给予对象。在某些实施方式中，将约1800mg具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象。

人中的药代动力学(PK)分析取样

在第一剂量开始前和第一剂量后的下列时间点收集用于药代动力学(PK)数据分析的血清样品：在输注后即刻第1天和输注开始后4小时；在第1天输注结束后至少24小时的第2天；以及在第8天和第15天。在给药前，输注结束时和输注结束后2至8小时的选定后续给药时机，在第15，29，43天收集样品。对于第57，71和85天的后续时间点，收集或计划收集给药前样品，然后每6周一次PK取样直至12周，然后每12周一次PK取样。在扩增阶段，进行稀疏PK取样。

建立体重非依赖性给药方案通过临床和临床前数据，我们创建了一种新的，体重非依赖性给药方案，用于给予抗PD-L1/TGFβ阱分子，以减少暴露的变异性，减少给药误差，减少剂量制备所需时间，与mg/kg给药相比减少药物浪费，从而促进有利的治疗结果。根据一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少500mg的平剂量。根据另一个实施方式，不论患者的体重如何，可以给予至少1200mg的平剂量。通常，这种剂量可以重复给药，例如每两周一次或每三周一次。

来自上述“人中PK分析采样”的PK数据用于产生群体PK模型并进行可能的给药方案的模拟。将称为全接近模型(full approach model)并描述于Gastonguay,M.，全协变量模型作为方法的替代方案，依赖于关于协变量效应的推论的统计显著性：方法学和42个案例研究综述(Full Covariate Models as an Alternative to Methods Relying onStatistical Significance for Inferences about Covariate Effects:A Review ofMethodology and 42Case Studies)，(2011)，第20页，摘要2229的建模方法应用于从模拟中获得的群体模型数据，以获得具有以下特征的参数：具有线性消除的二室PK模型，CL，V1和V2上的IIV，组合的加法和比例残差，CL和V1上的全协变量模型。以下基线协变量包括在最终模型中：年龄，体重，性别，种族，白蛋白，CRP，血小板计数，eGFR，肝损伤，ECOG评分，肿瘤大小，肿瘤类型和生物制剂先前治疗。获得本公开蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)的药代动力学的典型参数估计值的以下估计值：清除率(CL)0.0177L/h(6.2％)，中心分布体积(V1)3.64L(8.81％)，外周分布体积(V2)0.513L(25.1％)，和室间清除率(Q)0.00219L/h(17.8％)。CL的患者间变异性为22％，V1为20％，V2为135％。体重是CL和V1的相关协变量。为了支持平剂量给药方法，研究了给药策略对本公开内容的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)的暴露变异性的影响。具体而言，进行模拟以比较暴露分布，使用每两周一次1200mg的平剂量给药方法，对比每两周一次17.65mg/kg(对应于68kg对象每两周一次1200mg)或每两周一次15mg/kg(对应于80kg对象1200mg)的BW调整的给药方法。进行进一步模拟以比较使用每两周一次500mg平剂量给药方法对比每两周一次7.35mg/kg(对应于68kg对象每两周一次500mg)的BW调整的给药方法的暴露分布。另外，进行模拟以评估每三周一次的以下平剂量：1200mg，1400mg，1600mg，1800mg，2000mg，2200mg，2400mg，2600mg，2800mg，3000mg。

使用以下用于模拟的方法：使用最终PK模型方差-协方差矩阵，从参数估计值的多元正态分布中抽取N＝200组参数估计值。对于每个参数估计，从$OMEGA多变量正态分布中抽取200个IIV估计值，得到总共40000(200×200)个对象。对原始数据集(N＝380)进行重新取样以替换以生成40000组匹配的协变量，并且为每种给药方案生成稳态暴露度量(AUC，C_avg，C_低谷和C_max)。

模拟显示，与固定剂量相比，对于基于BW的给药范围，在宽BW范围内，暴露的变异性略高。图7A和7B分别显示了对于中位体重68kg，17.65mg/kg和1200mg平剂量或7.35mg/kg和500mg平剂量的暴露分布的示例。模拟还显示了患者群体中重量四分位数的暴露分布的相反趋势：低体重患者采用固定剂量具有较高暴露，而高体重患者采用BW调整的剂量具有较高暴露。

图8A和8B分别显示了对于中位体重68kg，17.65mg/kg和1200mg平剂量或7.35mg/kg和500mg平剂量的重量四分位数间暴露分布的示例。

在人中建立有效的剂量/给药方案和暴露：每2周一次(q2w)给予抗PD-L1/TGFβ阱后第二线非小细胞肺癌(2L NSCLC)的初步剂量响应和暴露响应

在一个方面，剂量响应和暴露-响应评估基于来自80名对象的数据，在2L NSCLC的治疗中，向对象每2周一次给予500mg或1200mg抗PD-L1/TGFβ阱(q2w)(每组n＝40)。评估对象的剂量响应和暴露响应。截至分析时的数据截止，共有17名对象仍在接受治疗，中位随访时间为35.2(范围，1.3-47.3)周。研究者评估的未确认的总体响应率(ORR)为25.0％(500mgORR，22.5％；1200mg ORR，27.5％)，其中在500mg下具有9个部分响应(PR)，在1200mg下具有1个完全响应(CR)和10个PR。在PD-L1表达水平上观察到临床活性，在具有≥80％PD-L1肿瘤表达的患者(7名患者)中注意到1200mg的ORR为71.4％。最常见的治疗相关不良事件(TRAE)是瘙痒症(18.8％)，斑丘疹(17.5％)，食欲减退(12.5％)和虚弱(11.3％)。20名患者(25％)发生≥3级TRAE。没有发生与治疗相关的死亡。

对于暴露-响应评估，使用上述群体PK模型基于来自这80名患者的剂量和协变量信息来预测第一周期暴露。具体地，使用群体PK参数的经验贝叶斯估计值(表2和3)，针对每个对象预测单剂量后的AUC和C_低谷。

表2：预测的AUC_0-336h,sd的分组总结

AUC_0-336h,sd＝在单次剂量后0-336小时上的AUC，如使用群体PK模型所预测。

表3：预测的C_低谷,sd的分组总结

C_低谷,sd＝单剂量后的C_低谷，如使用群体PK模型所预测。

将500mg q2w和1200mg q2w组的预测的暴露数据组合用于计算每四分位的预测的暴露的响应率，如下表4和表5所示。这些初步数据表明，与500mg q2w相比，1200mg q2w可提供更有利的功效概况。此外，这些数据表明，使用1200mg q2w给药方案所达到的暴露范围与2L NSCLC中的响应(每RECIST v1.1)相关，并且该暴露范围可用于设计如下面的示例所示的替代给药方案@@(图12)。

表4：每2周一次用500mg或1200mg抗PD-L1/TGFβ阱处理的2L NSCLC对象中AUC_0-336h,sd的观察到的响应率

表5：每2周一次用500mg或1200mg抗-PD-L1/TGFβ阱处理的2L NSCLC对象中C_低谷,sd的观察到的响应率(每剂量组n＝40)。

C_低谷,sd＝单剂量后的C_低谷，如使用群体PK模型所预测。

用各种给药频率建立给药方案

已经创建了具有各种给药频率的数据方案以允许较低频率的给药和/或允许采用伴随药物的协调给药方案。具体地，上述初步群体PK建模和模拟方法已被用于模拟各种给药方案的暴露并基于暴露来比较方案。

基于这些模拟，对于一般对象，需要每两周给予一次至少500mg的平剂量以维持约100μg/mL的平均浓度，而需要每两周给予一次约1200mg的平剂量以维持约100μg/mL的C_低谷。

基于C_avg的模拟，每两周一次1200mg相当于每三周一次1800mg(图12A)，而对于C_低谷，每两周一次1200mg相当于每三周一次2800mg(图12B)。而对于C_avg来说，每两周一次500mg相当于每三周一次750mg；对于C_低谷来说，每两周一次500mg相当于每三周一次1167mg。

以TGFβ为癌症靶标

本公开能够实现肿瘤微环境中TGFβ的局部减少，这是通过用与抗体部分相连的可溶性细胞因子受体(TGFβRII)来捕获TGFβ，所述抗体部分靶向某些肿瘤细胞或免疫细胞外表面上的细胞免疫检查点受体。本发明抗体部分的一个例子是针对免疫检查点蛋白的如抗PD-L1。该双功能分子，有时在本文件中亦称“抗体-细胞因子阱”，是确实有效的，因为抗受体抗体与细胞因子阱物理连接。由此产生的优势(例如相对于所述抗体和所述受体分开给予)部分归因于细胞因子通过自泌和旁泌作用成为局部环境中的主要作用。抗体部分将细胞因子阱引向肿瘤微环境，细胞因子阱在此可通过中和局部免疫抑制性自泌或旁泌作用而表现得最为有效。此外，当抗体的靶标一旦被抗体结合即被内化，则由此提供了清除细胞因子/细胞因子受体复合物的有效机制。显示PD-L1的抗体介导的靶标内化，并且显示抗PD-L1/TGFβ阱具有与抗PD-L1相似的内化率。这是使用抗TGFβ抗体的明显优势，因为首先，抗TGFβ抗体可能不是完全中和的；并且第二，抗体可以作为延长细胞因子半衰期的运载体。

实际上，如下所述，由于同时阻断肿瘤细胞上的PD-L1与免疫细胞上的PD-1之间的相互作用以及TGFβ在肿瘤微环境中的中和作用，用抗PD-L1/TGFβ阱治疗引起协同抗肿瘤作用。不受理论束缚，这可能是由于同时阻断两种主要免疫逃逸机制而获得的协同效应，以及由单一分子实体在肿瘤微环境中消耗TGFβ。所述清除是通过以下方式实现：(1)抗PD-L1靶向肿瘤细胞；(2)肿瘤微环境中的TGFβ自泌/旁泌被TGFβ阱所结合和(3)被结合的TGFβ被PD-L1受体介导的内吞作用所破坏。并且，TGFβRII融合于Fc(IgG的结晶片段)的C末端比将TGFβRII置于Fc的N末端的TGFβRII-Fc强数倍。

TGFβ作为癌症免疫治疗的靶标曾一度遭到质疑，因为其双重作用好比癌症的分子性双重人格(Jekyll and Hyde)(Bierie等，Nat Rev Cancer.2006；6:506-20)。就像其他有些细胞因子，TGFβ活性具有发育阶段和背景依赖性。实际上，TGFβ既可以作为肿瘤促进因子也可以作为肿瘤抑制因子影响肿瘤的发生、进展和转移。TGFβ这种双重作用的潜在机制仍不清楚(Yang等，Trends Immunol.2010；31：220-227)。虽然曾假定Smad依赖性信号传导介导TGFβ信号传导的生长抑制，而非Smad依赖性途径提供肿瘤促进作用，但也有数据显示Smad依赖性途径参与肿瘤进展(Yang等，Cancer Res.2008；68：9107-11)。

人们已对TGFβ配体及其受体作为治疗靶标都进行了深入的研究。有三种配体同种型：TGFβ1、2和3，都是均二聚体。还存在三种TGFβ受体(TGFβR)，其被称为I型、II型和III型TGFβR(López-Casillas等，J Cell Biol.1994；124:557-68)。TGFβRI是信号传导链并但不结合配体。TGFβRII高亲合性地结合配体TGFβ1和3，对TGFβ2则不然。TGFβRII/TGFβ复合物募集TGFβRI形成信号传导复合物(Won等，Cancer Res.1999；59:1273-7)。TGFβRIII是TGFβ与其信号传导受体结合的正向调节物，并以高亲和性结合全部3种TGFβ同种型。在细胞表面上，TGFβ/TGFβRIII复合物结合TGFβRII，然后募集TGFβRI取代TGFβRIII形成信号传导复合物。

尽管三种不同的TGFβ同种型均通过相同的受体发出信号，但已知它们在体内具有差异表达模式且功能不重叠。敲除了三种不同TGF-β同种型的小鼠具有不同的表型，表明它们有许多非代偿行的功能(Bujak等，Cardiovasc Res.2007；74:184-95)。TGFβ1缺失小鼠具有造血功能和血管形成缺陷，TGFβ3缺失小鼠表现出肺发育和腭形成缺陷，TGFβ2缺失小鼠表现出各种发育异常，最突出的是多种心脏畸形(Bartram等，Circulation.2001；103:2745-52；Yamagishi等，Anat Rec.2012；295:257-67)。此外，TGFβ还在缺血和再灌注损伤后的心肌损伤修复中起重要作用。在成人心脏中，心肌细胞分泌TGFβ作为自泌物维持自发搏动速率。重要的是，心肌细胞分泌的TGFβ中70-85％是TGFβ2(Roberts等，J ClinInvest.1992；90:2056-62)。尽管用TGFβRI激酶抑制剂治疗引起心脏毒性问题，但本申请人已观察到猴子中抗PD-L1/TGFβ阱没有毒性，包括心脏毒性。

中和TGFβ的治疗方法包括采用TGFβ受体的胞外域作为可溶性受体阱和中和抗体。在受体阱方法中，可溶性TGFβRIII似乎是显然的选择，因为它结合所有三种TGFβ配体。然而，TGFβRIII的天然形式是280-330kD的葡糖胺聚糖(GAG)-糖蛋白，具有762个氨基酸残基的胞外域，对于生物治疗开发来说是非常复杂的蛋白质。可在昆虫细胞中产生去GAG的可溶性TGFβRIII并显示是有效的TGFβ中和剂(Vilchis-Landeros等，Biochem J.355:215,2001)。TGFβRIII两个分开的结合域(内皮糖蛋白(endoglin)相关和尿调节素相关)可以各自独立表达，但是它们的亲和性比可溶性TGFβRIII低20至100倍，中和活性也低得多(Mendoza等,Biochemistry.2009；48:11755-65)。另一方面中，TGFβRII的胞外域长度仅为136个氨基酸残基，可以25-35kD糖蛋白质的形式生产。还显示，重组可溶性TGFβRII以200pM的K_D结合TGFβ1，这与细胞上全长TGFβRII 50pM的KD非常相近(Lin等,J Biol Chem.1995；270:2747-54)。对可溶性TGFβRII-Fc进行了作为抗癌剂的测试，在肿瘤模型中表现为能够抑制已建立鼠恶性间皮瘤生长(Suzuki等，Clin.Cancer Res.2004；10:5907-18)。由于TGFβRII不结合TGFβ2，TGFβRIII结合TGFβ1和3的亲和力低于TGFβRII，于是在细菌中生产TGFβRIII的内皮糖蛋白结构域与TGFβRII胞外域的融合蛋白，该蛋白在细胞实验中表现为抑制TGFβ1和2的信号传导比TGFβRII或RIII更有效(Verona等,Protein Eng Des Sel.2008；21:463-73)。

中和TGFβ配体全部三种同种型的另一种方法是筛选泛中和性抗TGFβ抗体或阻断受体与TGFβ1、2和3结合的抗受体抗体。GC1008是对全部TGFβ同种型特异的人抗体，已进入晚期恶性黑素瘤或肾细胞癌患者的I/II期研究(Morris等，J Clin Oncol 2008；26：9028(会议摘要))。虽然发现该治疗安全且耐受良好，但仅观察到有限的临床效果，因此难以在不进一步鉴定免疫作用的情况下解释抗TGFβ治疗的重要性(Flavell等,Nat RevImmunol.2010；10:554-67)。也有TGFβ同种型特异性抗体进入临床试验。TGFβ1特异性的美替木单抗(Metelimumab)进行过用于预防青光眼术后过度术后瘢痕形成的2期临床试验；TGFβ2特异性的乐德木单抗(Lerdelimumab)在3期研究中被发现是安全的但不能有效改善眼科手术后的瘢痕形成(Khaw等，Ophthalmology 2007；114:1822-1830)。阻断受体与全部三种TGFβ同种型结合的抗TGFβRII抗体，例如抗人TGFβRII抗体TR1和抗小鼠TGFβRII抗体MT1，也显示出对小鼠原发性肿瘤生长和转移的一些治疗功效(Zhong等，Clin CancerRes.2010；16:1191-205)。然而，在最近的抗体TR1(LY3022859)的I期研究中，尽管进行了预防性治疗，但由于不受控制的细胞因子释放所致的剂量递增超过25mg(平剂量)被认为是不安全的(Tolcher等，Cancer Chemother Pharmacol 2017；79:673-680)。迄今为止，绝大多数对TGFβ靶向抗癌治疗的研究，包括通常具有相当毒性的TGFβ信号传导小分子抑制剂，大多数处于临床前阶段，并且获得的抗肿瘤效果非常有限(Calone等,Exp Oncol.2012；34:9-16；Connolly等,Int J Biol Sci.2012；8:964-78)。

本公开的抗体-TGFβ阱是双功能蛋白质，其包含能够结合TGFβ的人TGFβ受体II(TGFβRII)的至少部分。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽是能够结合TGFβ的2型人TGFβ受体同种型A(SEQ ID NO:8)的可溶性部分。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含至少SEQ IDNO:8的氨基酸73-184。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸24-184。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽是能够结合TGFβ的2型人TGFβ受体同种型B(SEQ ID NO:9)的可溶性部分。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含至少SEQ ID NO:9的氨基酸48-159。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸24-159。在某些实施方式中，TGFβ阱多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸24-105。

作用机制

用治疗性抗体靶向T细胞抑制检查点来去抑制(dis-inhibition)是一个具有深入研究的领域(综述可见Pardoll,Nat Rev Cancer.2012；12:253-264)。方案之一中，抗体部分或其抗原结合片段靶向T细胞上的T细胞抑制检查点受体蛋白，例如：CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-3或LAIR1。另一方案中，抗体部分靶向抗原呈递细胞和肿瘤细胞(它们也选择这些反受体中的某些用于它们自身的免疫逃逸)上的反受体(counter-receptor)，例如：PD-L1(B7-H1)、B7-DC、HVEM、TIM-4、B7-H3或B7-H4。

本公开考虑采用通过其抗体部分或其抗原结合片段靶向T细胞抑制检查点的抗体TGFβ阱来去抑制。为此，申请人测试了TGFβ阱与靶向多种T细胞抑制检查点受体蛋白的抗体(例如抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM-3和抗LAG3)联合的抗肿瘤效果。

程序性死亡1(PD-1)/PD-L1轴是肿瘤免疫逃避的重要机制。长期感应抗原的效应T细胞呈现由PD-1表达为标志的耗尽表型，这是通过上调PD-L1与肿瘤细胞密切相关的状态。另外，在肿瘤微环境中，骨髓细胞，巨噬细胞，实质细胞和T细胞上调PD-L1。阻断该轴会恢复这些T细胞中的效应功能。抗PD-L1/TGFβ阱还结合TGFβ(1，2和3同种型)，其是肿瘤微环境中由包括凋亡中性粒细胞，骨髓衍生抑制细胞，T细胞和肿瘤的细胞产生的抑制性细胞因子。可溶性TGFβRII对TGFβ的抑制以与CD8+T细胞抗肿瘤作用增加相关的方式减少恶性间皮瘤。由活化的CD4+T细胞和Treg细胞产生的TGFβ1的缺失已显示抑制肿瘤生长，并保护小鼠免于自发性癌症。因此，TGFβ似乎对肿瘤免疫逃避很重要。

TGFβ对正常上皮细胞具有生长抑制作用，作为上皮细胞稳态的调节剂，并且在早期癌发生过程中起到肿瘤抑制剂的作用。随着肿瘤向恶性肿瘤发展，TGFβ对肿瘤的生长抑制作用通过一种或多种TGFβ途径信号传导组分中的突变或通过致癌重编程而丧失。在失去对TGFβ抑制的敏感性后，肿瘤继续产生高水平的TGFβ，然后其用于促进肿瘤生长。TGFβ细胞因子在各种癌症类型中过表达，与肿瘤分期相关。肿瘤微环境中的许多类型的细胞产生TGFβ，包括肿瘤细胞本身，未成熟骨髓细胞，调节性T细胞和基质成纤维细胞；这些细胞共同在细胞外基质中产生大的TGFβ储库。TGFβ信号传导通过促进转移，刺激血管生成和抑制先天性和适应性抗肿瘤免疫来促进肿瘤进展。作为广泛的免疫抑制因子，TGFβ直接下调活化的细胞毒性T细胞和NK细胞的效应功能，并有效诱导原初CD4+T细胞向免疫抑制性调节T细胞(Treg)表型分化。此外，TGFβ将巨噬细胞和嗜中性粒细胞极化为与免疫抑制细胞因子产生相关的伤口愈合表型。作为治疗策略，中和TGFβ活性具有通过恢复有效的抗肿瘤免疫力，阻断转移和抑制血管生成来控制肿瘤生长的潜力。

结合这些途径，PD-1或PD-L1和TGFβ作为抗肿瘤方法是有吸引力的。伴随的PD-1和TGFβ阻断可以恢复促炎细胞因子。抗PD-L1/TGFβ阱包括，例如，通过甘氨酸/丝氨酸接头共价连接到完全人IgG1抗PD-L1抗体的每条重链的C末端的人TGFβ受体TGFβRII的细胞外结构域。鉴于PD-1/PD-L1类的新兴蓝图，其中响应明显但具有增加效应大小的空间，假设共同靶向互补免疫调节步骤将改善肿瘤响应。类似的TGF-β靶向剂，弗瑞索单抗(fresolimumab)，一种靶向TGFβ1，2和3的单克隆抗体，在患有黑素瘤的对象的I期试验中显示出肿瘤响应的初步证据。

在某些实施方式中，本公开内容提供了实验，其证明抗PD-L1/TGFβ阱的TGFβRII部分(阱对照“抗-PDL-1(mut)/TGFβ阱”)引发抗肿瘤活性。例如，在底特律562人咽癌模型中皮下植入后，当以25μg，76μg或228μg给予时，抗PDL-1(mut)/TGFβ阱引起肿瘤体积的剂量依赖性降低(图5)。

在某些实施方式中，本公开内容提供了实验，其证明本公开的蛋白质同时与PD-L1和TGFβ结合(图2)。

在某些实施方式中，本公开内容提供了实验，其证明本公开的蛋白质(例如抗PD-L1/TGFβ阱)在体外抑制PD-L1和TGFβ依赖性信号传导。在某些实施方式中，本公开提供实验，其证明本公开的蛋白质通过阻断PD-L1介导的免疫抑制在体外增强T细胞效应功能，如通过超抗原刺激后的IL-2诱导测定所测量(图3)。在约100ng/ml时，本公开的蛋白质在体外诱导IL-2水平的显著增加(图3)。

在某些实施方式中，本公开提供了实验，其证明本公开的蛋白质(例如抗PD-L1/TGFβ阱)在体内引起血液中TGFβ的消耗。用55μg，或164μg，或492μg本公开的蛋白质处理JH小鼠中的原位植入的EMT-6乳腺癌细胞导致TGFβ1(图4A)，TGFβ2(图4B)，和TGFβ3(图4C)的高效和特异性消除。此外，本公开内容提供了实验，其证明本公开的蛋白质占据PD-L1靶标，支持本公开的蛋白质契合EMT-6肿瘤系统中的受体结合模型的概念(图4D)。

在某些实施方式中，本公开内容提供了实验，其证明本公开的蛋白质高效地，特异性地并且同时结合PD-L1和TGFβ，在多种小鼠模型中具有有效的抗肿瘤活性，抑制肿瘤生长和转移，以及延长的存活期和赋予长期保护性抗肿瘤免疫力。

在首次人体I期剂量递增研究中，除了监测抗PD-L1/TGFβ阱分子的药代动力学外，还研究了作用机制，特别是对TGFβ细胞因子的作用机制。

患者以每两周一次约0.3，约1，约3，约10或约20mg/kg的5个剂量水平静脉内给予抗-PD-L1/TGFβ阱分子，从样品进行PK分析直至第85天。通过流式细胞术从在给药前，第2天(D2)，D15和D43收集的患者血液中测量CD3+PBMC中的PD-L1靶标占据。此外，使用经分析验证的基于Luminex珠和基于ECLIA的多重免疫测定，在这些时间点与D8的另外时间点测量TGFβ1-3和促炎细胞因子的血液水平。在一个方面，患者可以用约30mg/kg或约40mg/kg的剂量静脉内给予6剂量水平，包括上述剂量水平的抗PD-L1/TGFβ阱分子治疗。在6剂量水平下治疗的患者的PK分析可以从样品中进行直至第6剂量之后。还可以通过流式细胞术从在给药前，第2天(D2)，D15，D43和直至D85收集的患者血液中测量CD3+PBMC中的PD-L1靶标占据。此外，可使用经分析验证的基于Luminex珠和基于ECLIA的多重免疫测定，在这些时间点与例如，D8的另外时间点测量TGFβ1-3和促炎细胞因子的血液水平。

结果表明，第一周期中抗PD-L1/TGFβ阱分子PK暴露以大约剂量成比例的方式在3至20mg/kg之间增加，在治疗的前85天内没有显著积累。在整个给药间隔期间，在3mg/kg-20mg/kg下维持约80％的PD-L1靶标占据。在0.3-20mg/kg下还有一小部分(D2上为1.7倍)但显著的IFNγ诱导(p＝0.001，n＝19)。在剂量水平1-20mg/kg的所有时间点，血液中TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3的水平分别降低最少99％，92％和91％。在0.3mg/kg的较低剂量下，TGFβ1-3水平在D2和D8处消耗，但在D15处不消耗。此外，药物PK水平与TGFβ捕获之间进一步存在强相关性。因此，在1mg/kg或更高的药物剂量水平下实现完全TGFβ1-3捕获。

抗PD-L1抗体

本公开可包括本领域中所述的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。抗PD-L1抗体是可购得的，例如29E2A3抗体(Biolegend,批号329701)。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体片段包括Fab、F(ab’)2、scFv和Fv片段，详见后文。

示例性抗体可见PCT公开文本WO 2013/079174。这些抗体可包含含有HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区多肽，其中：

(a)HVR-H1序列是X₁YX₂MX₃(SEQ ID NO:21)；

(b)HVR-H2序列是SIYPSGGX₄TFYADX₅VKG(SEQ ID NO:22)；

(c)HVR-H1序列是IKLGTVTTVX₆Y(SEQ ID NO:23)；

其中：X₁是K、R、T、Q、G、A、W、M、I或S；X₂是V、R、K、L、M或I；X₃是H、T、N、Q、A、V、Y、W、F或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D。

实施方式之一中，X₁是M、I或S；X₂是R、K、L、M或I；X₃是F或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D。

另一个实施方式中X₁是M、I或S；X₂是L、M或I；X₃是F或M；X₄是I；X₅是S或T；X₆是D。

另一个实施方式中，X₁是S；X₂是I；X₃是M；X₄是I；X₅是T；X₆是D。

另一方面中，所述多肽还包含位于HVR之间的可变区重链框架序列，如下所示：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。

另一个方面，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

另一方面中，所述框架序列至少之一如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。另一方面中，重链多肽进一步与包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合，其中：

(a)HVR-L1序列是TGTX₇X₈DVGX₉YNYVS(SEQ ID NO:28)；

(b)HVR-L2序列是X₁₀VX₁₁X₁₂RPS(SEQ ID NO:29)；

(c)HVR-L3序列是SSX₁₃TX₁₄X₁₅X₁₆X₁₇RV(SEQ ID NO:30)；

其中：X₇是N或S；X₈是T、R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是I、N或S；X₁₂是D、H或N；X₁₃是F或Y；X₁₄是N或S；X₁₅是R、T或S；X₁₆是G或S；X₁₇是I或T。

另一实施方式中，X₇是N或S；X₈是T、R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是N或S；X₁₂是N；X₁₃是F或Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是G或S；X₁₇是T。

另一实施方式中，X₇是S；X₈是S；X₉是G；X₁₀是D；X₁₁是S；X₁₂是N；X₁₃是Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是S；X₁₇是T。

另一方面中，所述轻链还包含位于HVR之间的可变区轻链框架序列，如下所示：(LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述轻链框架序列源自人共有框架序列或人种系框架序列。

另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

另一方面中，所述框架序列至少其一如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

另一实施方式中，本公开提供抗PD-L1抗体或包含重链和轻链可变区序列的抗原结合片段，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，并且其中：(i)HVR-H1序列是X₁YX₂MX₃(SEQ ID NO:21)；ii)HVR-H2序列是SIYPSGGX₄TFYADX₅VKG(SEQ ID NO:22)；(iii)HVR-H3序列是IKLGTVTTVX₆Y(SEQ ID NO:23)，且；(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，并且其中：(iv)HVR-L1序列是TGTX₇X₈DVGX₉YNYVS(SEQ ID NO:28)；(v)HVR-L2序列是X₁₀VX₁₁X₁₂RPS(SEQ ID NO:29)；(vi)HVR-L3序列是SSX₁₃TX₁₄X₁₅X₁₆X₁₇RV(SEQ ID NO:30)；其中：X₁是K，R，T，Q，G，A，W，M，I，或S；X₂是V，R，K，L，M，或I；X₃是H，T，N，Q，A，V，Y，W，F，或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D；X₇是N或S；X₈是T，R，或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是I，N，或S；X₁₂是D，H，或N；X₁₃是F或Y；X₁₄是N或S；X₁₅是R，T，或S；X₁₆是G或S；X₁₇是I或T。

实施方式之一中，X₁是M、I或S；X₂是R、K、L、M或I；X₃是F或M；X₄是F或I；X₅是S或T；X₆是E或D；X₇是N或S；X₈是T，R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是N或S；X₁₂是N；X₁₃是F或Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是G或S；X₁₇是T。

另一实施方式中，X₁是M、I或S；X₂是L、M或I；X₃是F或M；X₄是I；X₅是S或T；X₆是D；X₇是N或S；X₈是T、R或S；X₉是A或G；X₁₀是E或D；X₁₁是N或S；X₁₂是N；X₁₃是F或Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是G或S；X₁₇是T。

在另一个实施方式中，X₁是S；X₂是I；X₃是M；X₄是I；X₅是T；X₆是D；X₇是S；X₈是S；X₉是G；X₁₀是D；X₁₁是S；X₁₂是N；X₁₃是Y；X₁₄是S；X₁₅是S；X₁₆是S；X₁₇是T。

另一方面中，所述重链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且所述轻链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1MHVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述框架序列源自人共有框架序列或人种系序列。

另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

另一方面中，所述轻链框架序列是λ轻链序列。

另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

另一方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含至少C_H1结构域。

在一更具体的方面中，重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含C_H1、C_H2和C_H3结构域。

另一方面中，可变区轻链、抗体或抗体片段还包含C_L结构域。

另一方面中，抗体还包括C_H1、C_H2、C_H3和C_L结构域。

另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。

在另一个方面中，人恒定区选自下组：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4。

在一更具体的方面中，人或鼠恒定区是lgG1。

另一实施方式中，本公开的特征在于一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，它们分别与SYIMM(SEQ ID NO:35)，SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)，和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％总体序列相同性，且

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，它们分别与TGTSSDVGGYNYVS(SEQ IDNO:38)，DVSNRPS(SEQ ID NO:39)，和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％总体序列相同性。

在一个具体方面，所述序列相同性是81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

另一实施方式中，本公开的特征包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，它们分别与MYMMM(SEQ ID NO:41)，SIYPSGGITFYADSVKG(SEQ ID NO:42)，和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％总体序列相同性，且

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，它们分别与TGTSSDVGAYNYVS(SEQ IDNO:43)，DVSNRPS(SEQ ID NO:39)，和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％总体序列相同性。

另一方面中，本公开的抗体或抗体片段中，相比HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)在HVR-H1 SYIMM(SEQ ID NO:35)中，

(b)在HVR-H2 SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)中，

(c)在HVR-H3 IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)中；

并且其中，相比HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的序列，至少如下所示以下划线突出显示的那些氨基酸保持不变：

(a)HVR-L1 TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO:38)

(b)HVR-L2 DVSNRPS(SEQ ID NO:39)

(c)HVR-L3 SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)。

另一方面中，所述重链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，并且所述轻链可变区包含如下所示位于HVR之间的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。

另一方面中，所述框架序列源自人种系序列。

另一方面中，所述重链框架序列中一个或多个如下所述：

HC-FR1是EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:24)；

HC-FR2是WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:25)；

HC-FR3是RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:26)；

HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。

另一方面中，所述轻链框架序列源自λ轻链序列。

另一方面中，所述轻链框架序列中一个或多个如下所述：

LC-FR1是QSALTQPASVSGSPGQSITISC(SEQ ID NO:31)；

LC-FR2是WYQQHPGKAPKLMIY(SEQ ID NO:32)；

LC-FR3是GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC(SEQ ID NO:33)；

LC-FR4是FGTGTKVTVL(SEQ ID NO:34)。

另一更具体的方面中，抗体还包含人或鼠恒定区。

在某些实施方式中，本公开的特征包括一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMVWRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADWKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:44)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:45)。在一具体的方面中，所述序列相同性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在某些实施方式中，本公开提供了一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEVWSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:46)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO：47)。在一具体方面中，所述序列相同性是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

另一实施方式中，所述抗体结合人、小鼠或猕猴PD-L1。在一具体方面中，抗体能够阻断人、小鼠或猕猴PD-L1与相应人、小鼠或猕猴PD-1受体之间的相互作用。

另一实施方式中，抗体以5x10^-9M或更低K_D、优选以2x10^-9M或更低K_D、甚至更优选以1x10^-9M或更低K_D结合人PD-L1。

另一实施方式中，本公开涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其结合包含人PD-L1残基Y56和D61的功能性表位。

在一具体方面中，所述功能性表位还包含人PD-L1的E58、E60、Q66、R113和M115。

在一更具体的方面中，所述抗体结合包含人PD-L1残基54-66和112-122的构象表位。

在某些实施方式中，本公开涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段与本文所述的本公开抗体交叉竞争结合PD-L1。

在某些实施方式中，本公开的特征在于，包含任何上述的抗PD-L1抗体的蛋白质和多肽，其与至少一种药学上可接受的运载体组合。

在某些实施方式中，本公开的特征在于，一种分离的核酸，其编码本文所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的多肽，或轻链或重链可变区序列。在某些实施方式中，本公开提供一种分离的核酸，其编码抗PD-L1抗体的轻链或重链可变区序列，其中：

(a)所述重链包括HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，它们分别与SYIMM(SEQ ID NO:35)，SIYPSGGITFYADTVKG(SEQ ID NO:36)，和IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:37)具有至少80％序列相同性，或

(b)所述轻链包括HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列，它们分别与TGTSSDVGGYNYVS(SEQID NO:38)，DVSNRPS(SEQ ID NO:39)，和SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:40)具有至少80％序列相同性。

另一方面，重链的核酸序列是：

(SEQ ID NO:48)

并且轻链的核酸序列是：

(SEQ ID NO:49).

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗-PD-L1抗体可见美国专利申请公开文本US 2010/0203056。本公开的实施方式之一中，抗体部分是YW243.55S70。本公开另一实施方式中，抗体部分是MPDL3289A。

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:13)

(a)所述重链序列与以下重链序列具有至少85％序列相同性：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:14)，并且

(b)所述轻链序列与以下轻链序列具有至少85％序列相同性：

可用于抗PD-L1/TGFβ阱的其它示例性抗-PD-L1抗体可见美国专利公开文本US 7,943,743。

本公开的实施方式之一中，所述抗PD-L1抗体是MDX-1105。

在某些实施方式中，所述抗PD-L1抗体是MEDI-4736。

恒定区

本公开的蛋白质和肽可包含免疫球蛋白的恒定区，或所述恒定区的片段、类似物、变体、突变体，或衍生物。在某些实施方式中，恒定区源自人免疫球蛋白重链，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类。在某些实施方式中，恒定区包括CH2结构域。另某些实施方式中，恒定区包括CH2和CH3结合域或包括铰链-CH2-CH3。或者，恒定区可包括全部或部分铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。

实施方式之一中，恒定区包含降低对Fc受体亲和力或降低Fc效应功能的突变。例如，恒定区可包含消除IgG重链恒定区中糖基化位点的突变。一些实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297或Pro331的突变、缺失或插入(氨基酸根据EU命名法编号)。具体实施方式之一中，恒定区在对应于IgG1Asn297的氨基酸位置含有突变。另一实施方式中，恒定区含有氨基酸位置对应于IgG1的Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344或Pro378的突变、缺失或插入。

一些实施方式中，恒定区含有源自人IgG2或IgG4重链的CH2结构域。优选地，CH2结构域包含消除CH2结构域中糖基化位点的突变。实施方式之一中，突变改变IgG2或IgG4重链CH2结构域内Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内的天冬酰胺。优选地，突变将天冬酰胺变成谷氨酰胺。或者，突变改变Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内苯丙氨酸和天冬酰胺两者。在实施方式之一中，Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列被Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO:16)氨基酸序列取代。Gln-Phe-Asn-Ser(SEQ ID NO:15)氨基酸序列内的天冬酰胺对应于IgG1的Asn297。

另一实施方式中，恒定区包括CH2结构域和至少部分铰链区。铰链区可以是源自免疫球蛋白重链例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类的。优选地，铰链区源自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类。更优选地，铰链区源自人IgG1重链。实施方式之一中，IgG1铰链区Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:17)氨基酸序列中的半胱氨酸被改变。在某些实施方式中，Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys(SEQ ID NO:17)氨基酸序列被Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys(SEQ ID NO:18)氨基酸序列取代。在某些实施方式中，恒定区包括源自第一抗体同种型的CH2结构域和源自第二抗体同种型的铰链区。在某些实施方式中，CH2结构域源自人IgG2或IgG4重链，而铰链区源自经改变的人IgG1重链。

Fc部分与非Fc部分连接处附近的氨基酸改变会显著提高Fc融合蛋白的血清半衰期(PCT公开文本WO 01/58957，其公开内容通过引用纳入本文)。因此，本公开的蛋白质或多肽的连接区可含有相对于免疫球蛋白重链和促红细胞生成素天然序列的改变，优选距连接点约10个氨基酸以内。这些氨基酸改变会引起疏水性增强。实施方式之一中，恒定区源自IgG序列，其中C末端的赖氨酸残基被替换。优选地，IgG序列的C末端赖氨酸被替换成非赖氨酸的氨基酸(例如丙氨酸或亮氨酸)以进一步提高血清半衰期。另一实施方式中，恒定区源自IgG序列，其中，恒定区C末端附近的Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)氨基酸序列具有消除潜在接合性T细胞表位的改变。例如，实施方式之一中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO:20)氨基酸序列取代。其他实施方式中，Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO:19)段内的氨基酸被例如甘氨酸或脯氨酸等其他氨基酸替换。在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或他类免疫球蛋白分子的C-末端附近产生Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ IDNO:19)段氨基酸取代的方法可详见美国专利公开文本20030166877，其公开内容通过引用纳入本文。

本公开的适宜铰链区可源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其他免疫球蛋白类别。IgG1铰链区有三个半胱氨酸，其中两个参与免疫球蛋白两重链之间的二硫键。这些相同的半胱氨酸使得Fc部分之间二硫键的形成高效且一致。因此，本公开的铰链区源自IgG1，例如，人IgG1。优选实施方式中，人IgG1铰链区内的第一个半胱氨酸突变为其他氨基酸，优选丝氨酸。IgG2同种型铰链区有四个二硫键，它们倾向于促成重组系统分泌期间的寡聚化和可能不正确的二硫键。适宜的铰链区可源自IgG2铰链，其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。已知IgG4的铰链区形成链间二硫键不大有效。然而，本公开的合适铰链区可以源自IgG4铰链区，优选含有增强重链衍生部分之间正确形成二硫键的突变(Angal S等，(1993)Mol.Immunol.,30:105-8)。

根据本公开，恒定区可包含源自不同抗体同种型的CH2和/或CH3结构域和铰链区，即杂交(hybrid)恒定区。例如，实施方式之一中，恒定区含有源自IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域和源自IgG1的突变铰链区。或者，杂交恒定区中可采用源自其他IgG亚类的突变铰链区。例如，可以采用IgG4铰链的突变形式来有效形成两条重链之间的二硫键结合。突变型铰链也可源自IgG2铰链，其中前两个半胱氨酸各自突变成其他氨基酸。杂交恒定区的组装可见美国专利公开20030044423，其公开内容通过引用纳入本文。

根据本公开，恒定区可包含一处或多处本文所述的突变。Fc部分中突变的组合对延长血清半衰期和提高双功能分子体内效力具有累加或协同效应。因此，示例性实施方式之一中，恒定区可包含(i)衍生自IgG序列的区域，其中Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO：19)氨基酸序列被Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO：20)氨基酸序列替换；(ii)C-末端丙氨酸残基代替赖氨酸；(iii)衍生自不同抗体同种型的CH2结构域和铰链区，例如IgG2CH2结构域和改变的IgG1铰链区；和(iv)消除IgG2衍生的CH2结构域内的糖基化位点的突变，例如IgG2衍生的CH2结构域内的Gln-Ala-Gln-Ser(SEQ ID NO：16)氨基酸序列而不是Gln-Phe-Asn-Ser(SEQID NO：15)氨基酸序列。

抗体片段

本公开的蛋白质和多肽还可以包括抗体的抗原结合片段。示例性抗体片段包括scFv、Fv、Fab、F(ab’)₂和单域VHH片段，例如来自骆驼科动物的那些。

单链抗体片段，也称为单链抗体(scFv)，是重组多肽，它们通常结合抗原或受体；这些片段包含用或不用一个或多个互连接头相连的至少一个抗体可变轻链序列(V_L)片段和至少一个抗体可变重链氨基酸序列(V_H)片段。这样的接头可以是短的柔性肽，选来确保VL和VH结构域相连后正确的三维折叠，从而保留作为单链抗体片段来源的全抗体的靶分子结合特异性。通常，V_L或V_H序列的羧基末端通过这样的肽接头共价连接至互补V_L和V_H序列的氨基酸末端。单链抗体片段可通过分子克隆、抗体噬菌体文库展示或类似技术来产生。这些蛋白质可以在真核细胞中也可以在原核细胞(包括细菌)中生产。

单链抗体片段包含具有本文所述完整抗体可变区或CDR中至少其一的氨基酸序列，但缺失那些抗体的全部或部分恒定域。这些恒定域对于抗原结合来说不是必需的，但是构成完整抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服采用包含部分或全部恒定区的抗体相关的一些问题。例如，单链抗体片段倾向于没有生物分子与重链恒定区之间不希望有的相互作用或其他不希望有的生物活性。此外，单链抗体片段比完整抗体小得多，因此可具有比完整抗体更高的毛细血管通透性，这令单链抗体片段能够更高效地寻址并结合至靶抗原结合位点。并且，抗体片段可以在原核细胞中以相对大的规模产生，从而促进其生产。此外，单链抗体片段相对较小使得它们比完整抗体更不会在接受者中引发免疫响应。

还可以存在与完整抗体具有相同或相当的结合特征的抗体片段。这样的片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab’)₂片段。抗体片段可包含完整抗体的全部六个CDR，但包含少于全部这些区域、例如含三、四或五个CDR的片段同样具有功能。

药物组合物

本公开的特征还在于，包含治疗有效量的本文所述的蛋白质的药物组合物。所述组合物可配制成适用于多种药物递送系统。组合物中还可包含一种或多种生理学上可接受的赋形剂或运载体以制成合适的制剂。可用于本公开的合适制剂可见《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第17版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company)，1985。关于药物递送方法的综述可见例如Langer(Science249:1527-1533,1990)。

在一个方面，本公开内容提供了静脉内药物递送制剂，其包含500mg-2000mg的包含第一多肽和第二多肽的蛋白质，所述第一多肽包含：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，第二多肽至少包含结合PD-L1的抗体的轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

在某些实施方式中，本公开的蛋白质产物包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在本公开的某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约500mg至约2400mg剂量(例如，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约500mg至约1300mg，约500mg至约1200mg，约500mg至约1100mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约900mg，约500mg至约800mg，约500mg至约700mg，约500mg至约600mg，约600mg至2400mg，约700mg至2400mg，约800mg至2400mg，约900mg至2400mg，约1000mg至2400mg，约1100mg至2400mg，约1200mg至2400mg，约1300mg至2400mg，约1400mg至2400mg，约1500mg至2400mg，约1600mg至2400mg，约1700mg至2400mg，约1800mg至2400mg，约1900mg至2400mg，约2000mg至2400mg，约2100mg至2400mg，约2200mg至2400mg，或约2300mg至2400mg)的本公开内容的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约500至约2000mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约500mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含500mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约1200mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的本公开的蛋白质产物(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)。在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg或约3000mg)的蛋白质产物，其具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽。

在某些实施方式中，静脉内药物递送制剂可包含约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，约1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)。

本公开的静脉内药物递送制剂可以包含在袋，笔或注射器中。在某些实施方式中，袋可以连接至包括管和/或针的通道。在某些实施方式中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方式中，制剂可以冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方式中，制剂可以是冷冻干燥的，并且约45mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，约40mg-约100mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自12，27或45个小瓶的冷冻干燥制剂组合以在静脉内药物制剂中获得治疗剂量的蛋白质。在某些实施方式中，制剂可以是蛋白质产物的液体制剂，该产物具有包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽，并储存为约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶(例如，约250mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1300mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1100mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约300mg/小瓶，约300mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约400mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约500mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约600mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约700mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约800mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约900mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1000mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1100mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1200mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1300mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1400mg/小时小瓶至约2000mg/小瓶，约1500mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1600mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1700mg/小瓶至约2000mg/小瓶，约1800mg/小瓶至约2000mg/小瓶，或约1900mg/小瓶至约2000mg/小瓶)。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约600mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1200mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约1800mg/小瓶。在某些实施方式中，制剂可以是液体制剂并储存为约250mg/小瓶。

本公开内容提供了液体水性药物制剂，其包含在形成制剂的缓冲溶液中的治疗有效量的本公开内容的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)。

这些组合物可用常规灭菌技术灭菌或可进行无菌过滤。所得水性溶液可包装成原样使用(“use as-is”)型产品或冻干，冻干制剂在给予之前与无菌水性运载体合并。制剂的pH通常在3至11之间，5至9之间或6至8之间更好，7至8之间例如7至7.5之间最好。得到的固体形式的组合物可以包装成多个单剂量单位，每个单位剂量单位含有固定量的上述一种或多种药剂。固体形式的组合物也可以包装在容器中以获得灵活的量。

在某些实施方式中，本公开提供了具有延长的保质期的制剂，包括本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))，与甘露醇，柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，氯化钠，聚山梨醇酯80，水和氢氧化钠。

在某些实施方式中，制备包含在pH缓冲溶液中的本公开的蛋白质的水性制剂(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的第二多肽))。本发明的缓冲液的pH可以为约4至约8，例如约4至约8，约4.5至约8，约5至约8，约5.5至约8，约6至约8，约6.5至约8，约7至约8，约7.5至约8，约4至约7.5，约4.5至约7.5，约5至约7.5，约5.5至约7.5，约6至约7.5，约6.5至约7.5，约4至约7，约4.5至约7，约5至约7，约5.5至约7，约6至约7，约4至约6.5，约4.5至约6.5，约5至约6.5，约5.5至约6.5，约4至约6.0，约4.5至约6.0，约5至约6，或约4.8至约5.5，或可具有约5.0至约5.2的pH。上述pH的中间范围也是本公开的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在该范围内的缓冲剂的示例包括乙酸盐(例如乙酸钠)，琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)，葡糖酸盐，组氨酸，柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。

在某些实施方式中，制剂包括含有柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲系统，以将pH维持在约4至约8的范围内。在某些实施方式中，pH范围可以为约4.5至约6.0，或约pH4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，缓冲系统包括柠檬酸一水合物，柠檬酸钠，二水合磷酸氢二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方式中，缓冲系统包含约1.3mg/ml的柠檬酸(例如，1.305mg/ml)，约0.3mg/ml的柠檬酸钠(例如，0.305mg/ml)，约1.5mg/ml的二水合磷酸氢二钠(例如，1.53mg/ml)，约0.9mg/ml的二水合磷酸二氢钠(例如，0.86)，和约6.2mg/ml的氯化钠(例如，6.165mg/ml)。在某些实施方式中，缓冲系统包含约1-1.5mg/ml的柠檬酸，约0.25至约0.5mg/ml的柠檬酸钠，约1.25至约1.75mg/ml的二水合磷酸氢二钠，约0.7至约1.1mg/ml的二水合磷酸二氢钠，和6.0至6.4mg/ml的氯化钠。在某些实施方式中，用氢氧化钠调节制剂的pH。

用作调理剂并可稳定抗体的多元醇也可包括在制剂中。将多元醇加入到制剂中，其量可以相对于制剂的所需等渗性而变化。在某些实施方式中，水性制剂可以是等渗的。加入的多元醇的量也可以相对于多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以加入较低量的单糖(例如甘露醇)。在某些实施方式中，可以在制剂中用作张力剂的多元醇是甘露醇。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约5至约20mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约7.5至约15mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约10至约14mg/ml。在某些实施方式中，甘露醇浓度可为约12mg/ml。在某些实施方式中，多元醇山梨糖醇可包含在制剂中。

洗涤剂或表面活性剂也可以加入到制剂中。示例性洗涤剂包括非离子洗涤剂，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。加入的洗涤剂的量使得它减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。在某些实施方式中，制剂可包括表面活性剂，其为聚山梨醇酯。在某些实施方式中，制剂可含有洗涤剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler，《辅料百科》(Lexikon der Hilfsstoffe)，Editio Cantor VerlagAulendorf出版，第4版，1996)。在某些实施方式中，制剂可含有约0.1mg/mL至约10mg/mL，或约0.5mg/mL至约5mg/mL的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在制剂中加入约0.1％的聚山梨醇酯80。

冻干制剂

本公开的冻干制剂包含抗PD-L1/TGFβ阱分子和冻干保护剂。冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方式中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可包含缓冲剂，表面活性剂，填充剂和/或防腐剂中的一种或多种。

可用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可以是至少1：2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖重量比。在某些实施方式中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1：2至1：5。

在某些实施方式中，在冻干之前，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定制剂的pH。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。

在冻干之前，含有本公开的蛋白质的溶液的pH可以在约6至约8之间调节。在某些实施方式中，冻干药物产品的pH范围可以为约7至约8。

在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以约10mM-约200mM的量加入。盐和/或缓冲剂是药学上可接受的，并且衍生自具有“碱形成”金属或胺的各种已知酸(无机和有机)。在某些实施方式中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方式中，缓冲液可以是甘氨酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐缓冲液，在这种情况下，钠离子，钾离子或铵离子可以用作抗衡离子。

在某些实施方式中，可以添加“填充剂”。“填充剂”是一种化合物，它可以增加冻干混合物的质量并有助于冻干饼体的物理结构(例如，有助于生产保持开孔结构的基本上均匀的冻干饼体)。示例性填充剂包括甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干制剂可含有这种填充剂。

可任选地将防腐剂加入本文的制剂中以减少细菌作用。添加防腐剂可以，例如，促进多用途(多剂量)制剂的生产。

在某些实施方式中，冻干药物产品可以由水性运载体构成。本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(例如，对人给予是安全且无毒的)并且在冻干后可用于制备液体制剂。示例性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)，抑菌性注射用水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干药物产品用无菌注射用水，USP(SWFI)或0.9％氯化钠注射液，USP重建。在重建期间，冻干粉末溶解成溶液。

在某些实施方式中，本公开的冻干蛋白质产物构成约4.5mL注射用水并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。

液体制剂

在实施方式中，将本公开的蛋白质产物配制成液体制剂。液体制剂可以10mg/mL浓度存在于USP/Ph Eur I型50R小瓶中，其用橡皮塞关闭并用铝卷边密封封闭。塞子可以由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以填充有约61.2mL的蛋白质产物溶液，以允许有60mL的可提取体积。在某些实施方式中，液体制剂可以用0.9％盐水溶液稀释。在某些实施方式中，小瓶可含有约61.2mL的约20mg/mL至约50mg/mL(例如，约20mg/mL，约25mg/mL，约30mg/mL，约35mg/mL，约40mg/mL，约45mg/mL或约50mg/mL)的蛋白质产物(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))溶液，以允许有60mL的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的蛋白质产物(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))至对象。

在某些实施方式中，小瓶可含有约61.2mL的约20mg/mL至约50mg/mL(例如，约20mg/mL，约25mg/mL，约30mg/mL，约35mg/mL，约40mg/mL，约45mg/mL或约50mg/mL)的蛋白质产物溶液(例如，具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物)，以允许有60mL的可提取体积用于递送约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，约1500mg，约1600mg，约1700mg，约1800mg，约1900mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，约2400mg，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的蛋白质产物至对象。

在某些实施方式中，本发明的液体制剂可以制备成10mg/mL浓度的溶液与稳定化水平的糖的组合。在某些实施方式中，液体制剂可以在水性运载体中制备。在某些实施方式中，稳定剂的加入量可以不大于可能导致粘度不合需要或不适合静脉内给药的量。在某些实施方式中，糖可以是二糖，例如蔗糖。在某些实施方式中，液体制剂还可包含缓冲剂，表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。

在某些实施方式中，可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定液体制剂的pH。在某些实施方式中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方式中，碱可以是氢氧化钠。

除聚集外，脱酰胺是肽和蛋白质的常见产物变体，其可在发酵，收获/细胞澄清，纯化，药物/药物产品储存期间和样品分析期间发生。脱酰胺作用是形成可经历水解的琥珀酰亚胺中间体的蛋白质中失去NH₃。琥珀酰亚胺中间体导致母肽质量减少17u。随后的水解导致质量增加18u。由于在水性条件下的不稳定性，难以分离琥珀酰亚胺中间体。因此，脱酰胺通常可检测为1u质量增加。天冬酰胺的脱酰胺产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH，温度，溶剂介电常数，离子强度，一级序列，局部多肽构象和三级结构。肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn后的Gly和Ser导致对脱酰胺的更高敏感性。

在某些实施方式中，本发明的液体制剂可以在pH和湿度条件下保存，以防止蛋白质产物脱氨基。

本文所关注的水性运载体是药学上可接受的(对人给予是安全且无毒的)并且可用于制备液体制剂。示例性运载体包括无菌注射用水(SWFI)，抑菌性注射用水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，无菌盐水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液。

在特定情况下，静脉内(IV)制剂可以是优选的给药途径，例如当患者在移植后在医院中通过IV途径接受所有药物时。在某些实施方式中，在给药前用0.9％氯化钠溶液稀释液体制剂。在某些实施方式中，用于注射的稀释的药物产品是等渗的并且适于通过静脉内输注给药。

治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法

在一个方面，本公开内容提供了在有此需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括向对象给予剂量至少500mg的蛋白质，该蛋白质包括第一多肽和第二多肽。第一多肽包括：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链的可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段。第二多肽至少包括结合PD-L1的抗体的轻链的可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

在某些实施方式中，本公开内容的治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法包括向对象给予包含两种肽的蛋白质，其中第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，第二多肽包含SEQID NO：1的氨基酸序列。在某些实施方式中，蛋白质是抗PD-L1/TGFβ阱分子。

在某些实施方式中，本公开内容的治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法包括向对象给予剂量为约1200mg至约3000mg(例如，约1200mg至约3000mg，约1200mg至约2900mg，约1200mg至约2800mg，约1200mg至约2700mg，约1200mg至约2600mg，约1200mg至约2500mg，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，约2900mg至约3000mg，约1200，约1300，约1400，约1500，约1600，约1700，约1800，约1900，约2000，约2100，约2200，约2300，约2400，约2500mg，约2600mg，约2700mg，约2800mg，约2900mg，或约3000mg)的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱分子(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，每两周一次向对象给予约1200mg的抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，每三周一次向对象给予约1800mg的抗PD-L1/TGFβ阱分子。在某些实施方式中，将约1200mg具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每两周一次给予对象。在某些实施方式中，将约1800mg具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽的蛋白质产物每三周一次给予对象。

在某些实施方式中，剂量可以是约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，或约2400mg。

在某些实施方式中，剂量可以每两周给予一次。在某些实施方式中，蛋白质可以通过静脉内给药，例如用预填充袋，预填充笔或预填充注射器给药。在某些实施方式中，蛋白质从250ml盐水袋静脉内给予，并且静脉内输注可以持续约1小时(例如，50至80分钟)。在某些实施方式中，袋连接至包括管和/或针的通道。

在某些实施方式中，该方法治疗癌症或抑制肿瘤生长，例如，所述癌症或肿瘤包括：非小细胞肺癌，黑素瘤，胰腺癌，结直肠癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，成胶质细胞瘤，胃癌，胆道癌，食道癌(鳞状细胞癌或腺癌)，头颈部腺瘤，头颈部鳞状细胞癌，前列腺癌，肾癌，宫颈癌，骨髓瘤，淋巴瘤，白血病，甲状腺癌，子宫内膜癌，子宫癌，膀胱癌，神经内分泌癌，肝癌，鼻咽癌，睾丸癌，小细胞肺癌，基底细胞皮肤癌，鳞状细胞皮肤癌，皮肤纤维肉瘤，梅克尔细胞癌，胶质瘤，肉瘤，间皮瘤和骨髓增生异常综合征。在某些实施方式中，该方法治疗预治疗患者的癌症，例如预治疗的非小细胞肺癌，预治疗的黑素瘤，预治疗的胰腺癌，预治疗的结直肠癌，预治疗的卵巢癌，预治疗的乳腺癌，预治疗的胶质母细胞瘤，预治疗的复发或难治性不可切除的IV期胃癌，预治疗的胆道癌，预治疗的食管癌(鳞状细胞癌或腺癌)，预治疗的头颈部腺瘤，预治疗的头颈部鳞状细胞癌，预治疗的前列腺癌，预治疗的肾癌，预治疗的宫颈癌，预治疗的骨髓瘤，预治疗的淋巴瘤，预治疗的白血病，预治疗的甲状腺癌，预治疗的子宫内膜癌，预治疗的子宫癌，预治疗的膀胱癌，预治疗的神经内分泌癌，预治疗的肝癌，预治疗的鼻咽癌，预治疗的睾丸癌，预治疗的小细胞肺癌，预治疗的基底细胞皮肤癌，预治疗的鳞状细胞皮肤癌，预治疗的皮肤纤维肉瘤，预治疗的梅克尔细胞癌，预治疗的胶质瘤，预治疗的肉瘤，预治疗的间皮瘤和预治疗的骨髓增生异常综合征。

在某些实施方式中，肿瘤是晚期实体瘤。在某些实施方式中，肿瘤对于先前治疗是难治的。在某些实施方式中，患有晚期NSCLC且先前用抗PD-1或抗PD-L1剂(“PDx疗法”)治疗并且随后具有记录的疾病进展的患者通过静脉内给予约1200mg抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。记录患者对先前PDx治疗的最佳总体响应(BOR)。在某些实施方式中，先前PDx治疗后患有进行性疾病(PD)因此被认为是原发性难治性的患者(即，在这些患者中，在PDx治疗开始后观察到疾病进展而没有任何观察到的治疗益处)通过静脉内给予约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg至约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，表征为获得性耐药性，即患者的疾病最初响应于先前的PDx治疗但是患者最终恢复到疾病进展阶段的患者通过静脉内给予约1200mg至约2400mg的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗，其包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽。这些患者对先前PDx治疗的BOR是稳定的疾病(SD)，部分响应(PR)或完全响应(CR)，然后经历随后的疾病进展。在这些NSCLC PDx-失败亚组中使用抗PD-L1/TGFβ阱的基本原理是同时中和TGF-β，一种已知抑制肿瘤免疫激活的分子，用于刺激对先前单独PDx治疗没有响应的患者的临床响应。。

在某些实施方式中，在单线铂基化学疗法时或之后有难治性，复发性或进展性疾病的晚期NSCLC患者通过静脉内给予约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg-约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，在单线铂基化学疗法时或之后有难治性，复发性或进展性疾病的晚期NSCLC患者通过每2周一次静脉内给予约1200mg剂量的抗-PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，在单线铂基化学疗法时或之后有难治性，复发性或进展性疾病的晚期NSCLC患者通过以约500mg-约1200mg(例如，约500mg至约1000mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约900mg，约500mg至约800mg，约500mg至约700mg，约500mg至约600mg)的剂量静脉内给予抗PD-L1/TGFβ阱来治疗，其包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽。在某些实施方式中，在单线铂基化学疗法时或之后患有晚期NSCLC伴有难治性，复发性或进展性疾病的患者通过每2周一次静脉内给予约500mg剂量的抗-PD-L1/TGFβ阱来治疗。

在某些实施方式中，具有重度预治疗的复发或难治性不可切除的IV期胃癌的患者通过静脉内给予约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg-约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，具有重度预治疗的复发或难治性不可切除的IV期胃癌的患者通过以每2周一次约1200mg的剂量静脉内给予抗PD-L1/TGFβ阱持续2-30周来治疗。在某些实施方式中，治疗的患者接受至少3次先前的抗癌疗法。在某些实施方式中，治疗的患者接受至少4次先前的抗癌疗法。

在某些实施方式中，具有预治疗的结直肠癌(CRC)的患者通过静脉内给予约1200mg-约2400mg(例如，约1200mg-约2400mg，约1200mg至约2300mg，约1200mg至约2200mg，约1200mg至约2100mg，约1200mg至约2000mg，约1200mg至约1900mg，约1200mg至约1800mg，约1200mg至约1700mg，约1200mg至约1600mg，约1200mg至约1500mg，约1200mg至约1400mg，约1200mg至约1300mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。在某些实施方式中，患有预治疗的结直肠癌(CRC)的患者用抗-PD-L1/TGFβ阱治疗，剂量为约每2周一次1200mg，持续2-38周。在某些实施方式中，治疗的患者接受至少3次先前的抗癌疗法。

递送装置

在一个方面，本公开提供了包含制剂的药物递送装置，该制剂包含约500mg-约3000mg的包含第一多肽和第二多肽的蛋白质，所述第一多肽包含：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，第二多肽至少包含结合PD-L1的抗体的轻链可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

在某些实施方式中，该装置可以是袋，笔或注射器。在某些实施方式中，袋可以连接至包括管和/或针的通道。

在本公开的某些实施方式中，药物递送装置可包含约500mg至约3000mg(例如，约500mg至约3000mg，约500mg至约2900mg，约500mg至约2800mg，约500mg至约2700mg，约500mg至约2600mg，约500mg至约2500mg，约500mg至约2400mg，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约500mg至约1300mg，约500mg至约1200mg，约500mg至约1100mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约900mg，约500mg至约800mg，约500mg至约700mg，约500mg至约600mg，约600mg至约3000mg，约700mg至约3000mg，约800mg至约3000mg，约900mg至约3000mg，约1000mg至约3000mg，约1100mg至约3000mg，约1200mg至约3000mg，约1300mg至约3000mg，约1400mg至约3000mg，约1500mg至约3000mg，约1600mg至约3000mg，约1700mg至约3000mg，约1800mg至约3000mg，约1900mg至约3000mg，约2000mg至约3000mg，约2100mg至约3000mg，约2200mg至约3000mg，约2300mg至约3000mg，约2400mg至约3000mg，约2500mg至约3000mg，约2600mg至约3000mg，约2700mg至约3000mg，约2800mg至约3000mg，或约2900mg至约3000mg)的本公开的蛋白质产物(例如抗PD-L1/TGFβ阱，其具有包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)。在某些实施方式中，药物递送装置可包含约500至约1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，其包括包含SEQID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)。在某些实施方式中，药物递送装置可包含约500mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，其包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)。在某些实施方式中，药物递送装置包含约1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱，其包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)。在某些实施方式中，药物递送装置包含约1200mg或约1800mg剂量的包含第一多肽和第二多肽的本公开的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在某些实施方式中，药物递送装置可包含约1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，药物递送装置可包含约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，约1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，抗-PD-L1/TGFβ阱)。

试剂盒在一个方面，本公开提供了一种试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器共同包括约500mg至约2400mg(例如，约500mg至约2400mg，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约500mg至约1300mg，约500mg至约1200mg，约500mg至约1100mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约900mg，约500mg至约800mg，约500mg至约700mg，约500mg至约600mg，约600mg至约2400mg，约700mg至约2400mg，约800mg至约2400mg，约900mg至约2400mg，约1000mg至约2400mg，约1100mg至约2400mg，约1200mg至约2400mg，约1300mg至约2400mg，约1400mg至约2400mg，约1500mg至约2400mg，约1600mg至约2400mg，约1700mg至约2400mg，约1800mg至约2400mg，约1900mg至约2400mg，约2000mg至约2400mg，约2100mg至约2400mg，约2200mg至约2400mg，或约2300mg至约2400mg)的包含第一多肽和第二多肽的蛋白质的制剂，第一多肽包括：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链的可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，第二多肽至少包含结合PD-L1的抗体的轻链的可变区，并且第一多肽的重链和第二多肽的轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

在本公开的某些实施方式中，容器共同包括约500mg至约2400mg(例如，约500mg至约2300mg，约500mg至约2200mg，约500mg至约2100mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1900mg，约500mg至约1800mg，约500mg至约1700mg，约500mg至约1600mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1400mg，约500mg至约1300mg，约500mg至约1200mg，约500mg至约1100mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约900mg，约500mg至约800mg，约500mg至约700mg，约500mg至约600mg，约600mg至2400mg，约700mg至2400mg，约800mg至2400mg，约900mg至2400mg，约1000mg至2400mg，约1100mg至2400mg，约1200mg至2400mg，约1300mg至2400mg，约1400mg至2400mg，约1500mg至2400mg，约1600mg至2400mg，约1700mg至2400mg，约1800mg至2400mg，约1900mg至2400mg，约2000mg至2400mg，约2100mg至2400mg，约2200mg至2400mg，或约2300mg至2400mg)剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽))。在某些实施方式中，容器共同可包含500至1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱)。在某些实施方式中，容器共同可包含500mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱)。在某些实施方式中，容器共同可包含1200mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱)。在某些实施方式中，容器共同可包含1800mg剂量的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱)。在某些实施方式中，制剂制备并包装为液体制剂并以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶(例如，约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约300mg/小瓶，约300mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约400mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约500mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约600mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约700mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约800mg/小瓶至约1000mg/小瓶，或约900mg/小瓶至约1000mg/小瓶)储存。例如，在某些实施方式中，制剂是液体制剂并以约600mg/小瓶储存，或以约250mg/小瓶储存。

在某些实施方式中，容器共同可包含约1200mg或约1800mg剂量的具有第一多肽和第二多肽的蛋白质产物，其中第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在某些实施方式中，制剂制备并包装为液体制剂并以约250mg/小瓶至约1200mg/小瓶(例如，约250mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1100mg/小瓶，约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶，约250mg/小瓶至约900mg/小瓶，约250mg/小瓶至约800mg/小瓶，约250mg/小瓶至约700mg/小瓶，约250mg/小瓶至约600mg/小瓶，约250mg/小瓶至约500mg/小瓶，约250mg/小瓶至约400mg/小瓶，约250mg/小瓶至约300mg/小瓶，约300mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约400mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约500mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约600mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约700mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约800mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约900mg/小瓶至约1200mg/小瓶，约1000mg/小瓶至约1200mg/小瓶，或约1100mg/小瓶至约1200mg/小瓶)的具有第一多肽和第二多肽的蛋白质产物储存，其中第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。例如，在某些实施方式中，制剂是液体制剂并以约1200mg/小瓶储存，或以约600mg/小瓶储存，或以约250mg/小瓶储存。

在某些实施方式中，容器可共同包括约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1025mg，约1050mg，约1075mg，约1100mg，约1125mg，约1150mg，约1175mg，约1200mg，约1225mg，约1250mg，约1275mg，约1300mg，约1325mg，约1350mg，约1375mg，约1400mg，约1425mg，约1450mg，约1475mg，约1500mg，约1525mg，约1550mg，约1575mg，约1600mg，约1625mg，约1650mg，约1675mg，约1700mg，约1725mg，约1750mg，约1775mg，约1800mg，约1825mg，约1850mg，约1875mg，约1900mg，约1925mg，约1950mg，约1975mg，约2000mg，约2100mg，约2200mg，约2300mg，或约2400mg的本公开的蛋白质(例如，抗PD-L1/TGFβ阱(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)。

在某些实施方式中，容器中的制剂可以是冻干制剂或液体制剂。

在某些实施方式中，制剂可以包装在含有合适数量的小瓶的试剂盒中。可以包括关于药物的信息，其符合批准的提交文件。该试剂盒可以在运输冷却容器(2℃至8℃)中运输，该容器用温度控制装置监测。

制剂可以在2℃至8℃下储存直至使用。在某些实施方式中，冷冻干燥药物产品可以用4.5mL注射用水重建并用约0.9％盐水溶液(氯化钠注射液)稀释，而液体制剂可以用约0.9％盐水溶液稀释。制剂的小瓶可以是无菌和无热原的，并且可以不含抑菌防腐剂。

在某些实施方式中，递送装置是注射笔。注射笔是设计成允许使用者皮下或肌肉内自我给予预先测量剂量的药物组合物的装置。注射笔可具有壳体，壳体内部是药筒。药筒可具有一个或多个容纳药物组合物或其组分的腔室，并适于连接到针组件上。药筒可以容纳预混合的液体药物或固体药物和在注射之前混合的液体。壳体可以带有带储存能量源的致动组件，例如压缩弹簧。致动组件的启动引起一系列运动，由此针从注射笔延伸到使用者中，使得药物化合物然后被迫穿过针并进入使用者。在将药物剂量递送到注射部位之后，针可以保持在伸展位置。如果注射器笔是设计成在单独的密封隔室中携带药物组合物的多个组分的类型，则可以包括当致动组件被激活时迫使组分混合的结构。

蛋白质生产

抗体-细胞因子阱蛋白质一般采用包含经工程改造以表达所述蛋白质的核酸的哺乳动物细胞通过重组技术来生产。尽管在US20150225483A1的实施例1和2中描述了合适的细胞系和蛋白质生产方法的一个例子，但是已有大量合适的载体、细胞系和蛋白质生产方法用来生产基于抗体的生物药物并可以用于合成本文的抗体-细胞因子阱蛋白。

治疗适应症

本申请中描述的抗PD-L1/TGFβ阱蛋白(例如，包括包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第二多肽)可用于在患者中治疗癌症或减少肿瘤生长。示例性癌症包括非小细胞肺癌，黑素瘤，胰腺癌，结直肠癌(例如，预治疗的结直肠癌(CRC))，卵巢癌，成胶质细胞瘤，胃癌(例如，预治疗的复发性或难治性不可切除的IV期胃癌)，胆道癌，食道癌(鳞状细胞癌或腺癌)，头颈部的腺瘤，以及头颈部的鳞状癌。

待用抗PD-L1/TGFβ阱治疗的癌症或肿瘤可基于肿瘤中PD-L1和TGFβ的表达或升高的表达、其表达水平与预后或疾病进展的相关性，以及针对肿瘤对于靶向PD-L1和TGFβ的治疗的敏感性进行的临床前和临床经验来选择。这些癌症或肿瘤包括但不限于，结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、头颈部癌、肝癌、非小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌、黑素瘤、梅克尔细胞癌和间皮瘤。

实施例

以上是对本发明的一般性说明，参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅用于说明本发明的某些方面和实施方案，无意于以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：静脉内药物制剂的包装

将抗PD-L1/TGFβ阱的制剂制备为冻干制剂或液体制剂。为了制备冻干制剂，将45mg冷冻干燥的抗PD-L1/TGFβ阱灭菌并储存在一个容器中。然后将几个这样的容器包装在试剂盒中，用于向诊断患有癌症或肿瘤的对象递送特定体重非依赖性剂量。根据剂量要求，该试剂盒包含12-60个小瓶。或者，制备制剂并包装为液体制剂，并以250mg/小瓶至1000mg/小瓶储存。例如，制剂是液体制剂并以600mg/小瓶储存，或以250mg/小瓶储存。

该制剂用于治疗癌症或肿瘤，例如非小细胞肺癌，黑素瘤，胰腺癌，结直肠癌(例如，预治疗的结直肠癌(CRC))，卵巢癌，成胶质细胞瘤，胃癌(例如，预治疗的复发性或难治性不可切除的IV期胃癌)，胆道癌，食道癌(鳞状细胞癌或腺癌)，头颈部的腺瘤，以及头颈部的鳞状癌。

向诊断患有这种癌症或肿瘤的对象静脉内给予含有500mg至2000mg抗PD-L1/TGFβ阱的制剂。例如，向对象静脉内给予500mg抗PD-L1/TGFβ阱或1200mg抗PD-L1/TGFβ阱。静脉内给药来自盐水袋，并在两周内给药一次。给予对象的抗PD-L1/TGFβ阱的量与对象的体重无关。

实施例2：BW-非依赖性给药方案

在一个示例性实施方式中，每两周一次向患有非小细胞肺癌(NSCLC)的对象给予500mg或1200mg的BW非依赖性剂量。静脉内给药持续约1小时(-10分钟/+20分钟，即50分钟至80分钟)。为了减轻潜在的输液相关反应，对于前2次输注，每剂量用药前约30至60分钟给予抗组胺药和扑热息痛(对乙酰氨基酚)(例如，25-50mg苯海拉明和500-650mg扑热息痛[对乙酰氨基酚]静脉内或口服等效物)的预先用药。如果在前两次输注期间看到≥2级输液反应，则不会停止预先用药。不允许使用类固醇作为预先用药。

对于在抗PD-L1/TGFβ阱治疗中实现PR或CR然后在停止治疗后发展疾病进展的对象，允许以相同剂量和时间表以及治疗持续时间长达12个月的1个再起始疗程。在该实施例中，对象≥18岁并且具有组织学或细胞学证实的转移性或局部晚期实体瘤，对其没有有效的标准疗法或标准疗法失败。优选对象具有由白细胞计数(WBC)≥3×10⁹/L，绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.5×10⁹/L，淋巴细胞计数≥0.5×10⁹/L，血小板计数≥120×10⁹/L，Hgb≥9g/dL(没有输血)确定的充分的血液功能；由总胆红素水平≤1.5×ULN，AST水平≤2.5×ULN，ALT水平≤2.5×ULN确定的充分的肝功能；和根据Cockcroft-Gault公式或24小时尿液收集的肌酐清除率测量，由估计的肌酐清除率>50mL/分钟确定的充分的肾功能。对于肝脏受累于肿瘤的对象，AST≤5.0×ULN，ALT≤5.0×ULN，且胆红素≤3.0是可接受的。

在其他实施方式中，某些对象具有：

-组织学或细胞学证实的IIIb期或IV期NSCLC，在单线铂类化疗时或之后有复发性，难治性或进行性疾病，并且之前没有联合免疫疗法治疗。

-组织学证实的肝细胞癌，其是不可切除的或不适合根治性切除的晚期疾病，具有在1线先前索拉非尼治疗(至少14天的索拉非尼，每天至少400mg)后进展或以前被认为是索拉非尼不耐受的癌症。

-组织学证实的IV期，或复发性NSCLC，没有先前的全身抗癌疗法。

-在接受单一治疗形式的基于铂的化疗但失败，并且疾病进展失败的患者中经组织学证实的IV期或复发性NSCLC。

-在接受单一治疗形式的基于铂的化疗但失败，并且疾病进展失败，并且已经接受单一治疗形式的抗PD-1或抗PD-L1且疾病进展失败的患者中经组织学证实的IV期或复发性NSCLC。

-无法切除的III期或转移性(IV期)黑素瘤。

-组织学证实的胰腺癌，其是不可切除的，晚期的和/或转移性的，先前未经放射疗法。

-组织学证实的结肠或直肠腺癌，其在包括氟嘧啶，奥沙利铂，伊立替康和/或贝伐单抗的第二线全身治疗期间或之后进展。

-在化疗的第一线期间或之后进展的三阴性乳腺癌。

-组织学证实的上皮卵巢，输卵管或腹膜癌，有不可切除的转移性疾病，其在先前用至少2种化疗方案(包括铂和紫杉烷类药物)治疗的患者中是铂耐药性/难治性的。

-组织学证实的复发性或转移性食管腺癌，在接受过至少一种先前含铂化疗方案的患者中有不可切除的(III期或IV期)疾病。

-组织学证实的IV级恶性胶质瘤，其先前用放疗和替莫唑胺治疗。

-组织学证实的复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)(口腔，咽，喉)，III/IV期，在最后一剂铂剂治疗后6个月内肿瘤进展或复发(即手术后放疗)，原发性(即放疗)，复发性或转移性。

-组织学证实的复发性或持续性鳞状细胞癌，腺鳞癌或宫颈腺癌，遵循晚期疾病的全身治疗的标准护理治疗。

-组织学或细胞学证实的复发性或难治性的不可切除的IV期胃或胃食管交界性腺癌，对其没有标准疗法或标准疗法失败。

-组织学或细胞学证实的食管鳞状细胞癌，对其没有标准疗法或标准疗法失败。

-组织学或细胞学证实的胆道癌，已经失败或对一线全身治疗不耐受。

选择的对象没有当接受免疫刺激剂时可能会恶化的自身免疫性疾病或活动性结核病。

实施例3：功效评价

通过CT扫描或MRI进行肿瘤响应评估。在随后的访视中重复在基线处执行的扫描。通常，在随后的肿瘤评估访视时使用相同的成像方法并且优选相同的成像设备跟踪在基线处检测到的病灶。根据使用卡尺测量的RECIST 1.1，如果它们满足目标病变的RECIST 1.1，则可以将皮肤转移用作靶病变。

实施例4：对用抗PD-1或抗PD-L1药剂的先前治疗具有耐药性或难治性的晚期NSCLC患者的治疗

目的：选择在接受基于铂的化疗作为单一疗法并且疾病进展失败，并且已经接受抗PD-1或抗PD-L1作为单一疗法且疾病进展失败的患者中的组织学证实IV期，或复发性NSCLC用1200mg抗PD-L1/TGFβ阱疗法治疗。在这些NSCLC PDx-失败亚组中使用抗PD-L1/TGFβ阱的基本原理是同时中和TGF-β，一种已知抑制肿瘤免疫激活的分子，可能刺激对单独PDx治疗没有响应的患者的临床响应。。

小结：选择患有晚期NSCLC且先前用抗PD-1或抗PD-L1药剂(“PDx疗法”)治疗并且随后具有记录的疾病进展的患者用静脉内给予约1200mg抗PD-L1/TGFβ阱来治疗。记录患者对先前PDx治疗的最佳总体响应(BOR)。在PDx治疗之后患有进展性疾病(PD)的亚组患者被认为是“原发性难治性”，即，在这些患者中，在PDx治疗开始后观察到疾病进展，而没有任何观察到的治疗益处。另一个亚组患者被表征为“获得性耐药性”，即患者的疾病最初对先前的PDx治疗有响应，但患者最终恢复到疾病进展阶段。获得性耐药性患者的特征在于在随后的疾病进展之前对先前的PDx治疗具有稳定疾病(SD)，部分响应(PR)或完全响应(CR)的BOR。

研究设计和结果：共有83名患者接受抗PD-L1/TGFβ阱治疗，剂量为每2周1200mg。中位随访时间为27.3周。主要终点是按照RECIST v1.1的BOR，次要终点是安全性/耐受性。患者的基线特征列于下表中。总之，这是一个经过大幅预治疗的患者群体，其中74.7％的患者接受了超过3次的先前治疗方案，并且包括许多不同年龄和性别。对先前PDx治疗的响应大致平衡(原发性难治性，43.4％；获得性耐药性，53％)。另外，所有患者在治疗开始后28天内进行活组织检查，并且基于Dako 73-10PD-L1测定，大多数(65.1％)患者具有≥1％的肿瘤细胞PD-L1表达。

表6：患者特征

截至分析时的数据截止日期，根据RECIST v1.1，共有2名患者(2.4％)有研究者确认的响应。在20名患者(24.1％)中报告了疾病控制。通过独立的放射学检查，3名患者(3.6％)有确认的部分响应。此外，研究者报告了另外1例确认的PR和1例未确认的PR，因此将未确认的ORR增加至4.8％；继续治疗6名患者。在具有原发性难治性疾病患者和对先前抗PDx治疗有获得性耐药性的患者中出现响应。

如图13所示，先前患有进行性疾病(具有原发性难治性和获得性耐药性疾病)的患者实现了显著的疾病稳定性。注意到，具有疾病响应和疾病稳定的患者在本研究起始之前的先前治疗中进行了一系列治疗，甚至在即将开始试验之前接受了一系列治疗，表明具有先前PDx暴露的患者的异质群体中抗PD-L1/TGFβ阱的临床活性。在高和低PD-L1表达患者中注意到响应和疾病控制(不论试验开始时的PD-L1状态)，以及在具有高或低循环TGF-β1血浆水平的患者中也注意到该情况。

在NSCLC PDx-失败患者中，治疗相关不良事件(TRAE)发生率与其他抗PD-1或抗PD-L1单一疗法相似的患者总体良好耐受抗PD-L1/TGFβ阱。大多数患者(n＝60，72.3％)经历任何TRAE，较小比例(n＝19，22.9％)经历3级或更高级别事件。下表报告了表示≥5％患者中的TRAE的表。疲劳/无力是最常见的(36.1％，G3+6.0％)，其次是瘙痒症(21.7％，G3+2.4％)和食欲下降(16.9％，G3+1.2％)。一名患者因治疗相关的AE(G2，斑块湿疹)而停止了该研究。一名患者死于肺炎，由研究人员评估为治疗相关。值得注意的是，5例患者(6.0％)发生皮肤病变，包括角化棘皮瘤和鳞状细胞癌(与其他TGF-β抑制剂相似)，并通过手术切除得到很好的控制。

表7：治疗相关的不良事件(TRAE)

N＝85	任何级别	级别≥3
			任何TRAE,n(％)	60(72.3)	19(22.9)
贫血	5(6.0)	1(1.2)
			关节痛	6(7.2)	1(1.2)
食欲减退	14(16.9)	1(1.2)
			腹泻	6(7.2)	0(0.0)
干性皮肤	5(6.0)	0(0.0)
			流鼻血	8(9.6)	0(0.0)
疲劳/虚弱	30(36.1)	5(6.0)
			瘙痒	18(21.7)	2(2.4)
斑丘疹	6(7.2)	1(1.2)

总之，抗PD-L1/TGFβ阱被发现是一种创新的一流双功能融合蛋白，旨在同时靶向2种免疫抑制途径：PD-L1和TGF-β。因此，抑制TGF-β途径有助于克服抗PD-1/PD-L1试剂的治疗失败。用抗PD-L1/TGFβ阱治疗导致对用抗PD-1或抗PD-L1治疗的先前治疗具有原发性难治性或获得性耐药性疾病的重度预治疗的NSCLC患者的初始临床活性。

实施例5：预治疗的复发性或难治性IV期胃癌患者的治疗

目的：选择经过重度预治疗的复发或难治性的无法切除的IV期胃癌患者，用1200mg抗PD-L1/TGFβ阱疗法进行治疗，并评估安全性和疗效。

研究设计和结果：共有31名患者接受抗PD-L1/TGFβ阱治疗，剂量为每2周1200mg，直至确认进行性疾病，不可接受的毒性或试验退出。该组包括经过大幅预治疗的亚洲患者群体，其中67.7％接受至少3次先前抗癌治疗，29.3％接受至少4次抗癌治疗。

患者的基线特征列于下表8中。

表8：患者特征

截至分析时的数据截止日期，患者接受抗PD-L1/TGFβ阱的中位持续时间为6.1周(范围：2-30周)。在31名可评估的患者中，5名患者具有确认的部分响应，5名患者具有稳定的疾病(SD)作为其根据RECIST v1.1的BOR，如研究者所评估。总响应率(ORR)为16.1％，疾病控制率(DCR)为32.3％。

表9：患者特征

具有与其他抗PD-1/PD-L1单一疗法相似的治疗相关不良事件(TRAE)率的患者总体良好耐受抗PD-L1/TGFβ阱。14名患者(45.2％)经历了与治疗相关的不良事件。4名患者(12.9％)经历了3级TRAE。未发生与治疗相关的4级AE。1个5级事件(共接受5次剂量)被认为可能与治疗有关，但研究者怀疑先前存在的胸主动脉瘤破裂是否归为其他可能原因。

表10：治疗相关的不良事件(TRAE)

总之，抗PD-L1/TGFβ阱被发现是一种创新的一流双功能融合蛋白，旨在同时靶向2种免疫抑制途径：PD-L1和TGF-β。抑制TGF-β途径可有助于克服抗PD-1/PD-L1试剂的治疗失败。用抗PD-L1/TGFβ阱治疗导致患有重度预治疗的胃癌的亚洲患者的初始临床活性。

实施例6：经大幅预治疗的结直肠癌(CRC)患者的治疗

背景和目的：CRC分别是全球女性和男性中第二大和第三大最常见癌症。最近，已经描述了4个CRC的共有分子亚组(CMS)-包括不良预后，间充质CMS4组，其特征在于血管生成，炎症和免疫抑制性质。假设TGF-β可能在介导这种免疫抑制表型中发挥作用，提供了在这些患者中使用抗PD-L1/TGFβ阱的基本原理。抗PD-L1治疗已经显示出错配修复缺陷(例如微卫星不稳定性高(MSI-H))CRC患者的实质活性，但只有约4％的转移性CRC患者患有MSI-H肿瘤，并且这些治疗方法对于具有精确错配修复的患者的活性极小。

研究设计和结果：共有32名患者接受抗PD-L1/TGFβ阱治疗，剂量为每2周1200mg。治疗的中值持续时间为7.1周(范围：2-38)，并且截至分析时的数据截止日期，2名患者仍在进行积极治疗。主要终点是按照RECIST v1.1的BOR，次要终点是安全性/耐受性。患者的基线特征列于下表中。总之，这是一个经过大幅预治疗的患者群体，其中74.7％的患者接受了超过3次先前治疗方案，总体良好的临床状态(PS 0-1)并且包括许多不同年龄和性别。基于Dako 73-10PD-L1测定，大约34％的肿瘤是KRAS突变的，并且大多数患者(81.3％)在肿瘤细胞上具有<1％的PD-L1表达。在数据库中没有前瞻性地收集肿瘤侧向(tumor-sidedness)，但是基于患者之前的癌症手术史确定。使用该临床评估，40.6％的肿瘤被认为是左侧的，28.1％是右侧的，31.3％的肿瘤不能根据现有数据确定。

表11：患者特征

截至分析时的数据截止日期，1名患者(3.1％)有确认的部分响应(PR)。另外一名患者病情稳定，27名患者的进展性疾病为最佳总体响应。响应标准由独立审查委员会裁定，并根据RECISTv1.1定义。具有PR的患者具有精确错配修复(即微卫星稳定)，CMS4，KRAS突变体和PD-L1+(经IHC，在肿瘤细胞中PD-L1>1％)的CRC。该患者在我们组中具有最高的肿瘤细胞PD-L1表达(20％)。截至2017年11月1日，患有PR的患者仍在研究中(12.5个月)并且持续部分响应。由于在治疗的第5个月期间接受了对靶病灶的缓解性RT，另外的患者在13个月时仍然处于不可评估的疾病的治疗中。自那时以来没有出现新的病灶，非靶病灶保持稳定。该患者的CRC是KRAS突变的；CMS和微卫星状态待查，PD-L1状态未知。

在CRC患者中，具有与其他抗PD-1/PD-L1单一疗法相似的治疗相关不良事件(TRAE)率的患者总体良好耐受抗PD-L1/TGFβ阱。大多数患者(n＝22，68.8％)经历任何TRAE，较小比例(n＝4，12.5％)经历3级事件。没有4/5级TRAE。下表报告了表示≥5％患者中的TRAE的表。贫血，腹泻，输液相关响应和恶心是最常见的(所有n＝5，15.6％)。有一个3级相关的贫血事件(3.1％)。只有一个TRAE导致治疗中止(3级肠炎)。该事件与疾病进展同时发生。

表12：治疗相关的不良事件(TRAE)

总之，抗PD-L1/TGFβ阱被发现是一种创新的一流双功能融合蛋白，旨在同时靶向2种免疫抑制途径：TGF-β和PD-L1。用抗PD-L1/TGFβ阱治疗导致在预治疗的晚期CRC患者中具有初始临床活性；1名患者有持久的PR；1名患者有SD；并且27名患者的PD为BOR。PR持续8.3个月的患者的CRC为MSI，CMS4，KRAS突变体和PD-L1+。第二名患者在最初进展性疾病后13个月保持良好且不复发。

实施例7：在人中建立有效的剂量/给药方案和暴露：每2周一次(q2w)给予抗PD-L1/TGFβ阱后第二线非小细胞肺癌(2L NSCLC)的初步剂量响应和暴露响应

在这项研究中，向80名晚期/复发性NSCLC，铂后治疗和未针对PD-L1选择的对象每2周一次(q2w)给予500mg或1200mg抗PD-L1/TGFβ陷阱(每组n＝40)直到疾病进展，不可接受的毒性或试验退出。评估对象的剂量响应和暴露响应。截至分析时的数据截止，共有17名对象仍在接受治疗，中位随访时间为35.2(范围，1.3-47.3)周。研究者评估的未经证实的总体响应率(ORR)为25.0％(500mg ORR，22.5％；1200mg ORR，27.5％)，其中在500mg下具有9个部分响应(PR)，而在1200mg下具有1个完全响应(CR)和10个PR。在PD-L1表达水平上观察到临床活性，在具有≥80％PD-L1肿瘤表达的患者(7名患者)中注意到1200mg的ORR为71.4％。最常见的治疗相关不良事件(TRAE)是瘙痒症(18.8％)，斑丘疹(17.5％)，食欲减退(12.5％)和虚弱(11.3％)。20名患者(25％)发生≥3级TRAE。没有发生与治疗相关的死亡。

对于暴露-响应评估，使用群体PK模型基于来自这80名患者的剂量和协变量信息来预测第一周期暴露。具体地，使用群体PK参数的经验贝叶斯估计值(参见表2和3)，针对每个对象预测单剂量后的AUC和C_低谷。将500mg q2w和1200mg q2w组的预测的暴露数据组合用于计算每四分位的预测的暴露的响应率，如表4和表5所示。

序列

SEQ ID NO:1

分泌的抗PD-L1λ轻链肽序列

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:2

分泌的抗PDL1的H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:3

分泌的抗PDL1/TGFβ阱的H链的肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:4

抗PD-L1λ轻链从翻译起始密码子到翻译终止密码子的DNA序列(VL之前的前导序列是来自尿激酶纤溶酶原激活物的信号肽)

atgagggccctgctggctagactgctgctgtgcgtgctggtcgtgtccgacagcaagggcCAGTCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCTGggccagcccaaggccaacccaaccgtgacactgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctcagatttctatccaggcgccgtgaccgtggcctggaaggctgatggctccccagtgaaggccggcgtggaaaccaccaagccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaagaccgtcgcccccaccgagtgctcaTGA

SEQ ID NO:5

从翻译起始密码子至翻译终止密码子的DNA序列(mVK SP前导序列：小写下划线；VH：大写字母；含K至A突变的IgG1m3：小写字母；(G4S)x4-G(SEQ ID NO：11)接头：粗体大写字母；TGFβRII：粗体下划线小写字母；两个终止密码子：粗体下划线大写字母)

atggaaacagacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcccggctccacaggcGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGGCGGCATCACCTTCTACGCCGACACCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCAAGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtgctGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGAGGTGGCTCCGGAatccctccccacgtgcagaagtccgtgaacaacgacatg atcgtgaccgacaacaacggcgccgtgaagttccctcagctgtgcaagttctgcgacgtgaggttcagcacctgcg acaaccagaagtcctgcatgagcaactgcagcatcacaagcatctgcgagaagccccaggaggtgtgtgtggccgt gtggaggaagaacgacgaaaacatcaccctcgagaccgtgtgccatgaccccaagctgccctaccacgacttcatc ctggaagacgccgcctcccccaagtgcatcatgaaggagaagaagaagcccggcgagaccttcttcatgtgcagct gcagcagcgacgagtgcaatgacaacatcatctttagcgaggagtacaacaccagcaaccccgacTGATAA

SEQ ID NO:6

分泌的抗PD-L1(mut)/TGFβ阱的λ轻链的多肽序列，具有突变A31G，D52E，R99Y

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:7

分泌的抗PD-L1(mut)/TGFβ阱重链的多肽序列

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYMMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:8

人TGFβRII同种型A前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_001020018)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK

SEQ ID NO:9

人TGFβRII同种型B前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_003233)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK

SEQ ID NO:10

人TGFβRII同种型B细胞外结构域多肽

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

SEQ ID NO:11

(Gly₄Ser)₄Gly接头

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG

SEQ ID NO:12

分泌的抗PD-L1抗体MPDL3289A重链可变区的多肽序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:13

分泌的抗PD-L1抗体MPDL3289A轻链可变区的多肽序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR

SEQ ID NO:14

分泌的抗PD-L1抗体YW243.55S70重链可变区的多肽序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA

通过参考纳入

本文提及的每篇专利文献和科学论文的全部公开内容通过援引纳入本文用于所有目的。

等同形式

在不脱离本公开的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式实施。因此，以上所述实施例从各方面讲都是说明性的而不是对本文所述发明的限制。不同实施例中的各种结构元件和所述各种方法步骤可以任意组合排列而所有这些变型都应视为本公开的方式。因此由附加的权利要求而不是前面描述指示发明的范围，并且因此意味着包含与权利要求等同含义和范围之内的所有改变。

下面列出了本公开的编号实施方式：

1.一种在有此需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述对象给予剂量至少500mg的蛋白质，所述蛋白质包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包含：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链的可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，

其中所述第二多肽至少包含结合PD-L1的抗体的轻链的可变区，和

其中所述第一多肽的重链和所述第二多肽的轻链在组合时形成结合PD-L1的抗原结合位点。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述剂量为500mg至2400mg。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述剂量为1200mg至1800mg。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述剂量为1200mg。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述剂量为1800mg。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述剂量每两周给予一次或每三周给予一次。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述蛋白质通过静脉内给药来给予。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述静脉内给药使用包含含有所述蛋白质的制剂的预填充袋，预填充笔或预填充注射器进行。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述袋连接到包括管和/或针的通道。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述癌症或肿瘤选自下组：非小细胞肺癌，黑素瘤，胰腺癌，结直肠癌，卵巢癌，成胶质细胞瘤，胃癌，胆道癌，食道癌(鳞状细胞癌或腺癌)，头颈部腺瘤，和头颈部鳞状细胞癌。

12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌症选自下组：结直肠、乳腺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肾、宫颈、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺、子宫内膜、子宫、膀胱、神经内分泌、头部颈部、肝、鼻咽、睾丸、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和骨髓增生异常综合征。

13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是晚期实体瘤。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述肿瘤对先前治疗是难治性的和/或耐药性的。

15.一种包含500mg-2400mg蛋白质的静脉内药物递送制剂，所述蛋白质包含第一多肽和第二多肽，

其中第一多肽包含：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链的可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，

16.如权利要求15所述的静脉内药物递送制剂，其中，所述第一多肽包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

17.如权利要求15或16所述的静脉内药物递送制剂，其包含1200mg的所述蛋白质。

18.如权利要求15或16所述的静脉内药物递送制剂，其包含1200mg至2400mg的所述蛋白质。

19.如权利要求15或16所述的静脉内药物递送制剂，其包含1800mg的所述蛋白质。

20.如权利要求15-19中任一项所述的静脉内药物递送制剂，其中所述制剂包含在袋，笔或注射器中。

21.如权利要求20所述的静脉内药物递送制剂，其中所述袋连接到包括管和/或针的通道。

22.如权利要求15-21中任一项所述的静脉内药物递送制剂，其中所述制剂是冻干制剂或液体制剂。

23.一种含制剂的药物递送装置，所述制剂包含500mg-2400mg蛋白质，所述蛋白质包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包含：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链的可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，

24.如权利要求23所述的药物递送装置，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

25.如权利要求23或24所述的药物递送装置，其包含1200mg的所述蛋白质。26.如权利要求23或24所述的药物递送装置，其包含1200mg至2400mg的所述蛋白质。

27.如权利要求23或24所述的药物递送装置，其包含1800mg的所述蛋白质。

28.如权利要求23-27中任一项所述的药物递送装置，其中所述装置是袋，笔或注射器。

29.如权利要求28所述的药物递送装置，其中所述袋连接到包括管和/或针的通道。

30.一种包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器共同包含含有500mg-2400mg的蛋白质的制剂，所述蛋白质包含第一多肽和第二多肽，

31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

32.权利要求30或31的试剂盒，其中所述容器共同包含1200mg的所述蛋白质。

33.如权利要求30或31所述的试剂盒，其中所述容器共同包含1200至2400mg的所述蛋白质。

34.权利要求30或31的试剂盒，其中所述容器共同包含1800mg的所述蛋白质。

35.如权利要求30-34中任一项所述的试剂盒，其中所述制剂是冻干制剂或液体制剂。

36.权利要求15-22中任一项所述的静脉内药物递送制剂，如权利要求23-29中任一项所述的药物递送装置，或如权利要求30-35中任一项所述的试剂盒，用于在有此需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤生长。

37.如权利要求36所述的静脉内药物递送制剂，药物递送装置或试剂盒，其中所述癌症或肿瘤选自下组：非小细胞肺癌，黑素瘤，胰腺癌，结直肠癌，卵巢癌，成胶质细胞瘤，胃癌，胆道癌，食道癌(鳞状细胞癌或腺癌)，头颈部腺瘤，和头颈部鳞状细胞癌。

38.如权利要求36所述的静脉内给药制剂，药物递送装置或试剂盒，其中所述癌症或肿瘤选自下组：结直肠、乳腺、卵巢、胰腺、胃、前列腺、肾、宫颈、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺、子宫内膜、子宫、膀胱、神经内分泌、头部颈部、肝、鼻咽、睾丸、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和骨髓增生异常综合征。

39.如权利要求36所述的静脉内药物递送制剂，药物递送装置或试剂盒，其中所述肿瘤是晚期实体瘤。

40.如权利要求36所述的静脉内药物递送制剂，药物递送装置或试剂盒，其中所述肿瘤对于先前治疗是难治性的。

41.如权利要求36-40中任一项所述的静脉内药物递送制剂，药物递送装置或试剂盒，其中所述制剂每两周一次给予所述对象。

序列表

<110> 默克专利有限公司（MERCK PATENT GMBH）

<120> 用于靶向的TGF-β抑制的给药方案和剂型

<130> EMD-005PC

<140>

<141>

<150> 62/443,698

<151> 2017-01-07

<150> 62/581,978

<151> 2017-11-06

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 1

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

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Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

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<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

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450

<210> 3

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

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Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 4

atgagggccc tgctggctag actgctgctg tgcgtgctgg tcgtgtccga cagcaagggc 60

cagtccgccc tgacccagcc tgcctccgtg tctggctccc ctggccagtc catcaccatc 120

agctgcaccg gcacctccag cgacgtgggc ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 180

caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaaccggcc ctccggcgtg 240

tccaacagat tctccggctc caagtccggc aacaccgcct ccctgaccat cagcggactg 300

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cacgagggct ccaccgtgga aaagaccgtc gcccccaccg agtgctcatg a 711

<210> 5

<211> 1887

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 5

atggaaacag acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcccgg ctccacaggc 60

gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 120

tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacatca tgatgtgggt gcgacaggcc 180

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctacccct ccggcggcat caccttctac 240

gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 300

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcaag 360

ctgggcaccg tgaccaccgt ggactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 420

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720

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ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140

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gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

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ttcttcatgt gcagctgcag cagcgacgag tgcaatgaca acatcatctt tagcgaggag 1860

tacaacacca gcaaccccga ctgataa 1887

<210> 6

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 6

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

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<210> 7

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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485 490 495

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

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Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp

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Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

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Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

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180 185 190

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Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His

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Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys

245 250 255

Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp

260 265 270

Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu

275 280 285

Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe

290 295 300

Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser

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Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu

325 330 335

Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe

340 345 350

His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser

355 360 365

Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala

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His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile

385 390 395 400

Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu

405 410 415

Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr

420 425 430

Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg

435 440 445

Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val

450 455 460

Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp

465 470 475 480

Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu

485 490 495

Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met

500 505 510

Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe

515 520 525

Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu

530 535 540

Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala

545 550 555 560

Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser

565 570 575

Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

580 585 590

<210> 9

<211> 567

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

20 25 30

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

50 55 60

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

65 70 75 80

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

130 135 140

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu

145 150 155 160

Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu

165 170 175

Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn

180 185 190

Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys

195 200 205

Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg

210 215 220

Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu

225 230 235 240

Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala

245 250 255

Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu

260 265 270

Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys

275 280 285

Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile

290 295 300

Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln

305 310 315 320

Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr

325 330 335

Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser

340 345 350

Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys

355 360 365

Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn

370 375 380

Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu

385 390 395 400

Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser

405 410 415

Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser

420 425 430

Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr

435 440 445

Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val

450 455 460

Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu

465 470 475 480

His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly

485 490 495

Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met

500 505 510

Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg

515 520 525

Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu

530 535 540

Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp

545 550 555 560

Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

565

<210> 10

<211> 136

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly

20

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 14

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 15

Gln Phe Asn Ser

1

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 16

Gln Ala Gln Ser

1

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 17

Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 18

Pro Lys Ser Ser Asp Lys

1 5

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 19

Leu Ser Leu Ser

1

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 20

Ala Thr Ala Thr

1

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Lys, Arg, Thr, Gln, Gly, Ala, Trp, Met, Ile或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Val, Arg, Lys, Leu, Met or Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> His, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Tyr, Trp, Phe或Met

<400> 21

Xaa Tyr Xaa Met Xaa

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Phe或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Ser或Thr

<400> 22

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Xaa Thr Phe Tyr Ala Asp Xaa Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Glu或Asp

<400> 23

Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Xaa Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 25

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 26

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 27

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Thr, Arg或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Ala或Gly

<400> 28

Thr Gly Thr Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Glu或Asp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Ile, Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Asp, His或Asn

<400> 29

Xaa Val Xaa Xaa Arg Pro Ser

1 5

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Phe或Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Asn或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Arg, Thr或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Gly或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Ile或Thr

<400> 30

Ser Ser Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val

1 5 10

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 31

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys

20

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 32

Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 33

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 34

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

1 5 10

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 35

Ser Tyr Ile Met Met

1 5

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 36

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 37

Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 38

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 39

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 40

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val

1 5 10

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 41

Met Tyr Met Met Met

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 42

Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 43

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 44

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 44

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Val Trp Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Trp Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 45

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 46

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr

20 25 30

Met Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Val Trp

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 47

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 48

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：来自人Fab文库的合成多核苷酸

<400> 48

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctag ctccagcgag 60

gtgcagctgc tggaatccgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120

tgcgccgcct ccggcttcac cttctccagc tacatcatga tgtgggtgcg acaggcccct 180

ggcaagggcc tggaatgggt gtcctccatc tacccctccg gcggcatcac cttctacgcc 240

gacaccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300

cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gatcaagctg 360

ggcaccgtga ccaccgtgga ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctccgcc 420

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcacg ggatgagctg 1140

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagagcctct ccctgtcccc gggtaaa 1407

<210> 49

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：来自人Fab文库的合成多核苷酸

<400> 49

atggagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cttaagccag 60

tccgccctga cccagcctgc ctccgtgtct ggctcccctg gccagtccat caccatcagc 120

tgcaccggca cctccagcga cgtgggcggc tacaactacg tgtcctggta tcagcagcac 180

cccggcaagg cccccaagct gatgatctac gacgtgtcca accggccctc cggcgtgtcc 240

aacagattct ccggctccaa gtccggcaac accgcctccc tgaccatcag cggactgcag 300

gcagaggacg aggccgacta ctactgctcc tcctacacct cctccagcac cagagtgttc 360

ggcaccggca caaaagtgac cgtgctgggc cagcccaagg ccaacccaac cgtgacactg 420

ttccccccat cctccgagga actgcaggcc aacaaggcca ccctggtctg cctgatctca 480

gatttctatc caggcgccgt gaccgtggcc tggaaggctg atggctcccc agtgaaggcc 540

ggcgtggaaa ccaccaagcc ctccaagcag tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac 600

ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc caccggtcct acagctgcca ggtcacacac 660

gagggctcca ccgtggaaaa gaccgtcgcc cccaccgagt gctca 705

Claims

1.一种在有此需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述对象给予剂量至少500mg的蛋白质，所述蛋白质包含第一多肽和第二多肽，

其中所述第一多肽包含：(a)至少与人蛋白程序性死亡配体1(PD-L1)结合的抗体的重链的可变区；和(b)能够结合转化生长因子β(TGFβ)的人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其片段，

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述剂量为500mg至2400mg。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述剂量为1200mg至1800mg。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述剂量为1800mg。

16.如权利要求15所述的静脉内药物递送制剂，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述第二多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

23.一种含制剂的药物递送装置，所述制剂包含500mg-2400mg蛋白质，所述蛋白质包含第一多肽和第二多肽，

25.如权利要求23或24所述的药物递送装置，其包含1200mg的所述蛋白质。

26.如权利要求23或24所述的药物递送装置，其包含1200mg至2400mg的所述蛋白质。