JP2023523988A - Ｈｅｒ２を標的とする抗原結合構築物及び用途 - Google Patents

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Abstract

本発明では、ＨＥＲ２を標的とする抗原結合構築物及び用途が開示される。詳しく言えば、抗原結合構築物、それらをコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む細胞、それらを含む医薬組成物が提供され、さらに、ＨＥＲ２発現腫瘍を有している対象者の治療、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞の死滅又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長阻害などにおける用途が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、抗原結合構築物に関し、詳しく言えば、ＨＥＲ２を標的とする抗原結合構築物及び用途に関する。
Ｈｅｒ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２、ヒト上皮成長因子受容体２）は、ＥｒｂＢ－２（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｅｒｂＢ－２、受容体型チロシンタンパク質キナーゼ）とも呼ばれ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ－１）、Ｈｅｒ２／ｃ－ｎｅｕ（ＥｒｂＢ－２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ－３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ－４）を含むヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ）ファミリーのメンバーである。Ｈｅｒ２タンパク質は、細胞外リガンド結合ドメイン（ｄｏｍａｉｎ Ｉ～ＩＶ）と、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを有する。Ｈｅｒ２のリガンドは不明である。Ｈｅｒ２は他の３種の受容体（ＥｒｂＢ－１、ＥｒｂＢ－３、ＥｒｂＢ－４）のいずれかとヘテロ二量体を形成し、二量体化は受容体の細胞質ドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こし、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ）、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ、ホスホイノシチド３－キナーゼ）、ＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅ Ｃ、プロテインキナーゼＣ）、ＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、シグナル伝達兼転写活性化因子）を含む様々なシグナル伝達経路を活性化させる。Ｈｅｒ２遺伝子の増幅又は過剰発現は、一部の浸潤性乳がんの発生と進行に重要な役割を果たし、乳がん患者では１５～３０％がＨｅｒ２陽性で、Ｈｅｒ２が乳がん患者における重要なバイオマーカーと治療標的である。また、胃がん患者では７～３４％にＨｅｒ２が過剰発現され、唾液腺導管がんでは３０％にＨｅｒ２が過剰発現される。
Ｈｅｒ２陽性腫瘍を治療するいくつかのＨｅｒ２標的抗体薬が既に販売されており、Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＶ（ＥＣＤ４）を標的とするロシュ社のモノクローナル抗体薬トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、Ｈｅｒ２細胞外ドメインＩＩ（ＥＣＤ２）を標的とするロシュ社のペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））、及びロシュ社のＡＤＣ薬、Ｔ－ＤＭ１（登録商標）（トラスツズマブ エムタンシン、ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｍｔａｎｓｉｎｅ）などである。これらのモノクローナル抗体薬の作用機序は、１）Ｈｅｒ２シグナル伝達のダウンレギュレーション、２）Ｈｅｒ２との結合によるシグナル伝達ヘテロ二量体のエピトープの形成、３）Ｈｅｒ２の取り込み、４）モノクローナル抗体のＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞傷害）を含む。単一特異性標的化は、シグナル伝達と病因に関与し得る他の標的エピトープを対象としないため、薬剤耐性と免疫逃避が起こり得る。
抗体の凝集は、発現及び／又は精製、免疫原性、毒性、分解、親和性低下、又は保存後の活性喪失などに関する難題をもたらす。そのために、産業的な用途では、抗体の凝集低減が必要である。ｓｃＦｖの場合、単鎖分子であるため凝集しやすく、凝集した場合に二量体（Ｄｉａｂｏｄｙ）、三量体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四量体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）が形成される。
本発明では、抗原結合構築物が提供され、抗原結合構築物の凝集が低減されている。本
発明では、さらに、抗原結合構築物の用途が提供される。
本発明の一態様では、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含む抗原結合構築物が提供され、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、好ましくは、変異後のアミノ酸はＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、好ましくは、変異後のアミノ酸はＹである。
又は、本発明では、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含む抗原結合構築物が提供され、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域が含むＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸はＫ又はＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域が含むＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸はＦ又はＹである。ただし、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域のＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸がＫである場合に、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸はＦではない。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含み、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む。いくつかの特定の実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含む。またいくつかの特定の実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含み、且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは以下から選ばれるＣＤＲの群を含む。
ｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含む。
ｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｉｉｉ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。
ｉｖ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｖ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。
ｖｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれ
ぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｖｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む。
ｖｉｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３３、３２のアミノ酸配列を含む。又は、
ｉｘ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４４、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む。
ただし、配列番号２７の配列はＧＦＮＩＸ２ＤＴＹＩＨであり、Ｘ２はＫ又はＥである。配列番号３４の配列はＳＡＳＸ１ＬＹＳであり、Ｘ１はＦ又はＹである。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントはトラスツズマブの重鎖可変領域又はその変異体と、トラスツズマブの軽鎖可変領域又はその変異体とを含み、前記重鎖可変領域の変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含み、軽鎖可変領域の変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは以下から選ばれる。
ｉ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１、４２のアミノ酸配列を含む。
ｉｉ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１、４２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｉｉｉ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５、３６のアミノ酸配列を含む。
ｉｖ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５、３９のアミノ酸配列を含む。又は、
ｖ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４０、３６のアミノ酸配列を含む。
ただし、配列番号４１の配列は次のとおりである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＸ２ＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ、ただし、Ｘ２はＫ又はＥ。
配列番号４２の配列は次のとおりである。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＸ１ＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ、ただし、Ｘ１はＦ又はＹ。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合構築物は、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する第２抗原結合フラグメン
トをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはＦａｂである。いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖可変領域とペルツズマブの軽鎖可変領域とを含む。
本発明の一態様において、本明細書に記載の抗原結合構築物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の一態様において、本明細書に記載の抗原結合構築物の少なくとも１つの抗原結合フラグメントをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む分離された核酸又は分離された核酸集合が提供される。
本発明の一態様において、本明細書に記載の核酸又は核酸集合の１つ又は複数を含むベクター又はベクター集合が提供される。
本発明の一態様において、本明細書に記載の核酸若しくは核酸集合、又は本明細書に記載のベクター若しくはベクター集合を含む分離された細胞が提供される。
本発明の一態様において、前記抗原結合構築物の発現に適する条件において宿主細胞を培養することであって、前記宿主細胞は本明細書に記載の抗原結合構築物をコードする核酸、又は本明細書に記載のベクター若しくはベクター集合を含むことと、前記構築物を精製することとを含む本明細書に記載の抗原結合構築物の製造方法が提供される。
本発明の更なる態様では、対象者に、治療有効量の本明細書に記載の抗原結合構築物又は本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含むＨＥＲ２発現腫瘍を有している対象者の治療方法が提供される。
本発明の更なる態様では、腫瘍細胞を本明細書に記載の抗原結合構築物に接触させることを含むＨＥＲ２発現腫瘍細胞を死滅させ又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法が提供される。
本発明の更なる態様では、細胞に、有効量の本明細書に記載の抗原結合構築物又は本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、低減又は遮断する方法が提供される。
本発明の更なる態様では、サンプルを本明細書に記載の抗原結合構築物に接触させて、結合複合体を検出又は測定することを含むサンプルにおけるＨＥＲ２を検出又は測定する方法が提供される。
本発明の更なる態様では、抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法が提供される。前記抗原結合構築物は一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含み、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。前記方法は、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸がＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸がＹであるように、抗原結合構築物を修飾することを含む。
図１は抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－２のグリカン分析である。 図２は抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２のグリカン分析である。 図３はトラスツズマブとペルツズマブの併用、及び抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体のＢＴ４７４腫瘍細胞に対する死滅率である。 図４はトラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブの併用、Ｔ－ＤＭ１、及び抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体のＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞に対する死滅率である。 図５はトラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブの併用、Ｔ－ＤＭ１、及び抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体のＪＩＭＴ－１腫瘍細胞に対する死滅率である。 図６はトラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブの併用、及び抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体のＢＴ４７４腫瘍細胞に対する増殖阻害である。 図７はトラスツズマブとペルツズマブの併用、及び抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体の胃がんＮ８７マウス異種腫瘍移植モデルにおけるマウスの腫瘍体積変化に対する影響である。 図８はトラスツズマブとペルツズマブの併用、及び抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体の胃がんＮ８７マウス異種腫瘍に対する有効性におけるマウスの体重変化に対する影響である。 図９はいくつかの例示的な抗ＨＥＲ２（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２）二重特異性抗体の構造である。１つの黒い鎖（第１Ｆｃポリペプチド）ともう１つの灰色の鎖（第２Ｆｃポリペプチド）で二量体Ｆｃを表し、第１抗原結合フラグメントは、第１Ｆｃポリペプチドに融合されるｓｃＦｖで、第２抗原結合フラグメントは、第２Ｆｃポリペプチドに融合されるＦａｂである。
「用語」
用語「抗原結合構築物」とは、抗原に結合できる任意の物質を指し、例えば、ポリペプチド又はポリペプチド複合体である。いくつかの態様において、抗原結合構築物は目標抗原に特異的に結合するポリペプチドである。抗原結合構築物は単量体、二量体、多量体、タンパク質、ペプチド、タンパク質、ペプチド複合体であってもよいし、抗体又はその抗原結合部分であってもよいし、ｓｃＦｖなどであってもよい。抗原結合構築物は単一特異性、二重特異性又は多重特異性のポリペプチド構築物であってもよい。いくつかの態様において、抗原結合構築物は、例えば、１つ又は複数のＦｃに接続されている１つ又は複数の抗原結合成分（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ）を含む。以下の実施例の説明では、抗原結合構築物の他の例が提供される。
用語「二重特異性」とは、例えば、２つの抗原結合部分（例えば、抗原結合フラグメント）を有し、前記部分がそれぞれ独自の結合特異性を有する抗原結合構築物など、任意の物質を指す。例えば、第１抗原結合フラグメントは第１抗原におけるエピトープに結合し、第２抗原結合フラグメントは第２抗原におけるエピトープに結合する。あるいは、例えば、第１抗原結合フラグメント、第２抗原結合フラグメントはそれぞれ同じ抗原の異なるエピトープに結合する。
「抗体」は、所望の生物学的活性を備えれば、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、多機能抗体、抗体フラグメントを含むように最も広い意味で使用される。
用語「可変領域」とは抗体の軽鎖又は重鎖のＮ末端ドメインにおいて限定される、約１００から１１０個又はより多いアミノ酸からなる主に抗原認識を担うドメインを指す。用語「軽鎖可変領域（ＶＬ）」、「重鎖可変領域（ＶＨ）」はそれぞれこれらの軽鎖と重鎖ドメインを指す。
用語「ＣＤＲ（相補性決定領域）」は、「超可変領域」と同じ意味で、配列が超可変であり且つ／又は構造が限定されているループを形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。天然のテトラボディは一般に、３つが重鎖可変領域、３つが軽鎖可変領域に位置する６つのＣＤＲを含む。
用語「Ｆａｂ」とは、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と、それぞれ軽鎖と重鎖に位置する可変ドメインＶＬ（軽鎖可変領域）及びＶＨ（重鎖可変領域）とを含むものを指す。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
用語「ｓｃＦｖ」は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、それらのドメインが１つのポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬドメインの間にあるポリペプチドリンカーをさらに含み、これによって抗原結合に必要とされる構造を形成できる。
用語「ＥＣＤ」とは細胞外ドメインである。ＨＥＲ２の細胞外ドメインは４つのドメインを含み、それぞれがＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３、ＥＣＤ４である。
「トラスツズマブ」（一般名Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、ヒト上皮成長因子受容体－２（ＨＥＲ２）のＥＣＤ４に選択的に作用する組換えヒト化モノクローナル抗体であり、ＨＥＲ２陽性がんの治療に使用できる。その例としては、商品名ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）で販売される治療用モノクローナル抗体製品が挙げられる。
「ペルツズマブ」（一般名Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）は、ヒト上皮成長因子受容体－２（ＨＥＲ２）のＥＣＤ２選択的に作用する組換えヒト化モノクローナル抗体であり、ＨＥＲ２陽性がんの治療に使用できる。
用語「ＨＥＲ２」はＥＧＦＲファミリーの２番目のメンバーで、チロシンキナーゼの活性を有する。
用語「作動可能に接続された」とは２つ又はより多いペプチド又はポリペプチドドメイン又は核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント同士の機能上の接続関係を指す。タンパク質、抗体又は他のポリペプチドを取り扱う文脈で、用語「作動可能に接続された」とは、機能的なポリペプチドが生じるように２つ又はより多いアミノ酸セグメントが接続されることを指す。
用語「ＥＣ５０」とは、抗原結合構築物の５０％最大応答を引き起こす有効濃度を指す。本明細書で使用される用語「ＩＣ５０」とは、抗原結合構築物の５０％最大応答を引き起こす阻害濃度を指す。ＥＣ５０とＩＣ５０はいずれもＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ解析又は本分野で知られる任意の他の方法で測定することができる。
本明細書で使用される用語「ＫＤ」はモル濃度（Ｍ）で示す平衡解離定数である。抗原結合構築物のＫＤ値は本分野で周知される方法で測定できる。抗原結合構築物のＫＤの測定方法として好ましくは表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）であり、より好ましくはバイオセンサーシステムであり、例えば、Ｂｉａ
ｃｏｒｅシステムである。
用語「治療」とは統計学的に有意な方法で疾患（例えば、障害）、疾患の症状を治療、治癒、軽減、緩和、変更、修復、改善、改良し若しくは影響を与え、又は症状、合併症、生化学的指標の出現を予防し若しくは遅延させ、又は他の方法で疾患、障害若しくは症状の進行を遅延させ若しくは阻害するために利用する手段を指す。
「治療有効量」とは対象者に治療上及び／又は予防上の利点を得るために必要な抗原結合構築物又は組成物の量を指す。
用語「対象者」には任意のヒト又はヒトを除く動物が含まれる。用語「ヒトを除く動物」は、哺乳動物及び非哺乳動物を含め、全ての脊椎動物を含み、ヒトを除く霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などである。好ましくは、本発明にいう対象者はヒトである。特段の説明がない限り、用語「患者」と「対象者」は入れ替えて使用される。
本明細書で使用される「約」は、特定の値に対し、当業者が判定した誤差を含む許容可能範囲であり、部分的には当該値の測定方法、即ち測定システムの限界によって決定される。例えば、本分野の常識によれば「約」が１倍又は１倍を超える標準偏差以内を表す。又は、「約」は最大５％（即ち±５％）の範囲を表し、例えば、示される数値範囲±２％の範囲以内、±１％の範囲以内又は±０．５％の範囲以内で変動する。本明細書又は特許請求の範囲で特定の値が示される場合に、特段の説明がない限り、「約」の意味は当該特定の値に許容される誤差範囲以内にあると理解される。
用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は一致性と言い換える。２つの配列のパーセント同一性は配列に共有される同一の位置の数の関数であり（即ち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００％）、ただし２つの配列の最適なアラインメントを得るように導入すべきギャップの数と各ギャップの長さを考慮すべきである。次の非限定的な実施例で示されるように、数学的アルゴリズムを利用して配列の比較と２つの配列のパーセント同一性の決定を行うことができる。Ｅ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒによるアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１～１７（１９８８））を利用して２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定することができ、当該アルゴリズムにはＰＡＭ１２０重み残基表が用いられ、ギャップ長さペナルティが１２で、ギャップペナルティが４であり、既にＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈによるアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８４～４５３（１９７０））を利用して２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定することができ、当該アルゴリズムにはＢｌｏｓｓｕｍ ６２行列又はＰＡＭ２５０行列が用いられ、ギャップの重みが１６、１４、１２、１０、８、６又は４で、長さの重みが１、２、３、４、５又は６であり、既にＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍより利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている。
用語「Ｘｎ」と「Ｘａａ」は同じもので、不特定のアミノ酸（Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ
Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）を指す。これを使う表現ではその範囲を具体的に定義する。
本明細書では、特段の説明がない限り、用語「含む」又は同等なもの（例えば、有する、備えるなど）は開放的な用語で、記されている要素、ステップ又は構成を含むが、それらに限定されず、記されていない要素、ステップ又は構成については開放的であることを意味する。
本明細書では、特段の説明がない限り、単数形で使われる用語は、複数の対象の場合を
指し、逆の場合も同様である。
本明細書では説明と開示のために、特許、特許出願又は既存の刊行物が参照により全体として組み込まれる。これらの刊行物は本願の出願日前に公開されているため提供できる。これらの書類の開示日に関する声明又はその内容の記載は出願人が知り得た情報に基づくもので、これらの書類の開示日又はその内容が正しいと承諾するものではない。しかも全ての対象国において、本明細書でこれらの刊行物が参照されることが、当該刊行物が本分野で周知される常識になると認めるものではない。次の部分では本発明の各態様を詳しく説明する。
「抗原結合構築物」
本発明では、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含む抗原結合構築物が提供され、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み（いくつかの例において、位置３０における変異後のアミノ酸はＥであり）、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含む（いくつかの例において、位置５３における変異後のアミノ酸はＹである）。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する第２抗原結合フラグメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は第１抗原結合フラグメント又は／及び第２抗原結合フラグメントに作動可能に接続された免疫グロブリンドメイン、例えば、抗体のＣＬ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、及び／又はＣＨ３領域の１つ又は複数を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は第１抗原結合フラグメント又は／及び第２抗原結合フラグメントに作動可能に接続された定常領域を含む。前記定常領域は免疫グロブリンの天然配列の定常領域又は変異後の定常領域であってもよく、例えば、天然の又は変異後のＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインの１つ又は複数であり、いくつかの例において、これらのドメインは本分野の一般的な方式によって作動可能に接続されている。定常領域はヒト免疫グロブリンの定常領域に由来してもよく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。いくつかの例において、定常領域はエフェクター機能を媒介する能力が改善されるように修飾を有しても良い。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は第１抗原結合フラグメント又は／及び第２抗原結合フラグメントに作動可能に接続された免疫グロブリンドメイン又は骨格（ｓｋｅｌｅｔｏｎ）、例えば、Ｆｃを含む。用語「Ｆｃ」には天然配列Ｆｃ領域、変異体Ｆｃ領域が含まれる。ＦｃはヒトＦｃであってもよく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。Ｆｃは、エフェクター機能を媒介する能力が改善されるように修飾を有しても良く、例えば、いくつかの実施形態において、前記骨格は、ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ、Ｈ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ、脱フコース化などの修飾を有する。
本明細書に係る抗原結合構築物は一価、二価であってもよいし、又は多価であってもよい。単一特異性、二重特異性であってもよいし、又は多重特異性であってもよい。いくつ
かの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は抗体である。
抗原結合構築物のｓｃＦＶ形態の第１抗原結合フラグメントの可変領域に変異を導入すると、抗原結合構築物の凝集を低減できるという予期せぬ事実を見つけ出した。それらの変異は、例えば、第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域の第３０位（Ｋａｂａｔ番号付けシステム基準）のアミノ酸の負に帯電したグルタミン酸（Ｅ）への変異、又は第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域の第５３位（Ｋａｂａｔ番号付けシステム基準）のアミノ酸の非荷電のチロシン（Ｙ）への変異であってもよいし、又は当該２つの変異の同時導入であってもよい。さらに、発明者は、未変異の（第３０位がＥではなく又は／且つ第５３位がＹではない）ｓｃＦＶ形態の第１抗原結合フラグメントから直接二重特異性抗原結合構築物を構築する場合、その望まぬ凝集特性が二重特異性抗原結合構築物に受け継がれるが、ｓｃＦＶに本明細書に記載の変異を導入して構築された二重特異性抗体は優れた抗凝集特性を示しているということを見つけ出した。いくつかの実施形態において、変異を導入しても抗原結合構築物（例えば、単一特異性、二重特異性の抗原結合構築物）のＨＥＲ２抗原に対する親和性は明らかに低減されていない。いくつかの実施形態において、抗原結合構築物はＨＥＲ２抗原に良好な親和性を有している。いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合構築物（２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２など）はトラスツズマブ、ペルツズマブよりも抗原Ｈｅｒ２により高い結合親和性を示している。いくつかの実施形態において、抗原結合構築物のＨｅｒ２抗原に対するＫＤは約１Ｅ－８Ｍ若しくは未満、約１Ｅ－９Ｍ若しくは未満、約６．１１Ｅ－１０Ｍ若しくは未満、約１Ｅ－１１Ｍ若しくは未満、又は約１Ｅ－１１Ｍ若しくは未満である。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２抗原はヒトＨｅｒ２抗原である。いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物の結合親和性ＫＤはＢｉａｃｏｒｅによって測定される。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は優れた抗腫瘍特性、例えば、腫瘍細胞の死滅、腫瘍成長の阻害なども示している。いくつかの実施形態において、本明細書に基づいて構築される抗原結合構築物は、様々な腫瘍細胞、ＨＥＲ２の発現量の異なる様々な細胞に良好な殺傷効果を示している。例えば、一部の抗原結合構築物は、ＢＴ４７４（Ｈｅｒ２＋＋＋）腫瘍細胞に良好な殺傷効果を示している。一部の抗原結合構築物はＮＣＩ－Ｎ８７（Ｈｅｒ２＋＋）腫瘍細胞に良好な殺傷効果を示している。一部の抗原結合構築物はトラスツズマブ耐性腫瘍細胞（例えば、ＪＩＭＴ－１）に良好な殺傷効果を示している。また、一部の抗原結合構築物はＨｅｒ２低発現腫瘍細胞（例えば、ＭＣＦ－７ Ｈｅｒ２ ０／＋）に良好な殺傷効果を示している。
いくつかの実施形態において、マウスモデル実験を行ったところ、本明細書の抗原結合構築物に明らかな毒性作用がないことが判明した。
「二重特異性抗原結合構築物」
本明細書では、ＨＥＲ２に結合する二重特異性抗原結合構築物が提供される。二重特異性抗原結合構築物は、それぞれＨＥＲ２の特定のドメイン又はエピトープに結合する２つの抗原結合フラグメントを含む。
本明細書に係る抗原結合構築物は、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントと、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する第２抗原結合フラグメントとを含む二重特異性抗原結合構築物である。
ただし、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸はＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、
変異後のアミノ酸はＹである。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物であり、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸はＥである。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物であり、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸はＹである。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物であり、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸はＥであり、且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸はＹである。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異前のアミノ酸はＥではない。いくつかの実施形態において、当該変異前のアミノ酸はＫであり、つまり、いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異前のアミノ酸はＹではない。いくつかの実施形態において、当該変異前的アミノ酸はＦであり、つまり、いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの特定の実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントは軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９
１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの特定の実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントは軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、前記第１抗原結合フラグメントはそれぞれ配列番号４３、２８、２９、３０、３１、３２の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、前記第１抗原結合フラグメントはそれぞれ配列番号４３、２８、２９、３０、３３、３２の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、前記第１抗原結合フラグメントはそれぞれ配列番号４４、２８、２９、３０、３１、３２の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントはトラスツズマブの重鎖可変領域の変異体とトラスツズマブの軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域の変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントはトラスツズマブの重鎖可変領域とトラスツズマブの軽鎖可変領域の変異体とを含み、前記軽鎖可変領域の変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物
で、前記第１抗原結合フラグメントはトラスツズマブの重鎖可変領域の変異体とトラスツズマブの軽鎖可変領域の変異体とを含み、前記重鎖可変領域の変異体はＫ３０Ｅ変異を含み、且つ、軽鎖可変領域の変異体はＦ５３Ｙ変異を含む。
第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含むｓｃＦＶであり、いくつかの実施形態において、前記重鎖可変領域は前記トラスツズマブの重鎖可変領域又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は前記トラスツズマブの軽鎖可変領域又はその変異体である。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１、４２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは本明細書に記載のいずれかのＣＤＲ領域の配列特徴を含む。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１、４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５、３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５、３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４０、３６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域と軽鎖可変領域がリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって接続されてｓｃＦＶが形成される。リンカーとしては、任意の適切なリンカーであってもよく、例えば、帯電した及び／又は柔軟なリンカーである。特定の実施形態において、リンカーはペプチド結合によって接続された１～５０個のアミノ酸からなり、前記アミノ酸は２０種類の天然型アミノ酸から選ばれてもよい。より好ましい実施形態において、１～５０個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、リシンから選ばれる。さらに好ましくは、リンカーは、基本的には立体的に妨害されていないアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン）からなる。特に好適な柔軟なリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎである（（Ｇ４Ｓ）ｎとも呼ばれる）。いくつかの実施形態において、ｎは１～１０の任意の数で、即ち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であり、又は、前記数字の任意の２つから限定される任意の範囲であり、例えば、１～５、２～５、３～６、２～４、１～４などである。いくつかの特定の実施形態において、前記リンカーは、配列がＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号５２）である柔軟な接続ペプチドを含む。いくつかの特定の実施形態において、前記リンカーは、配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）である柔軟な接続ペプチドを含む。いくつかの特定の実施形態において、前記リンカーは、配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５４）である柔軟な接続ペプチドを含む。いくつかの特定の実施形態において、前記リンカーは、配列がＧＧＧＰＧＫＲ（配列番号５５）である柔軟な接続ペプチドを含む。他の適切なリンカーの例としては、特許出願ＷＯ２０１９１９５５３５の表４に記載のものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合
構築物で、前記第１抗原結合フラグメントのＶＨとＶＬは、Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－リンカー－ＶＬの順に配列される。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントのＶＨとＶＬは、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－リンカー－ＶＨの順に配列される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合構築物は二重特異性抗原結合構築物で、前記第２抗原結合フラグメントはＦａｂである。第２抗原結合フラグメントはＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含む。ペルツズマブの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれＧＦＴＦＴＤＹＴＭＤ（配列番号４５）、ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号４６）、ＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号４７）、ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号４８）、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号４９）、ＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号５０）である。
いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブのＦａｂフラグメントである。前記ペルツズマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３７に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３８に示される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合構築物は、定常領域を含む二重特異性抗原結合構築物である。いくつかの実施形態において、前記定常領域はリンカーを介して第１抗原結合フラグメント及び第２抗原結合フラグメントに接続されている。いくつかの実施形態において、定常領域は第１抗原結合フラグメント及び第２抗原結合フラグメントに直接接続されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合構築物は、骨格（ｓｋｅｌｅｔｏｎ）を含む二重特異性抗原結合構築物である。いくつかの実施形態において、前記骨格はリンカーポリペプチド（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４ヒンジ領域から選ばれる免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチド）を介して第１抗原結合フラグメント及び第２抗原結合フラグメントに接続されている。いくつかの実施形態において、骨格は第１抗原結合フラグメント及び第２抗原結合フラグメントに直接接続されている。
いくつかの実施形態において、前記骨格は第１Ｆｃポリペプチドと第２Ｆｃポリペプチドとを含む二量体Ｆｃである。本明細書でＦｃは、定常領域の少なくとも１つの部分の免疫グロブリン重鎖を含むＣ末端領域を定義し、二量体ＦｃのＦｃポリペプチドとは二量体Ｆｃドメインを形成させる２つのポリペプチドの１つ、つまり、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含む、安定的に自己会合できるポリペプチドを指す。本明細書では特段の説明がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号はＥＵ番号付けシステムに準拠する。例えば、二量体ＩｇＧ ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。ＣＨ３ドメインは、それぞれ第１Ｆｃポリペプチド、第２Ｆｃポリペプチドに由来する２つのＣＨ３配列を含み、ＣＨ２ドメインは、それぞれ第１Ｆｃポリペプチド、第２Ｆｃポリペプチドに由来する２つのＣＨ２配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは第１Ｆｃポリペプチ
ドに作動可能に接続され、第２抗原結合フラグメントは第２Ｆｃポリペプチドに作動可能に接続されている。いくつかの実施形態において、第１抗原結合フラグメントと第１Ｆｃポリペプチドは第１ポリペプチドリンカーを介して作動可能に接続され、第２抗原結合フラグメントと第２Ｆｃポリペプチドは第２ポリペプチドリンカーを介して作動可能に接続されている。前記第１リンカーポリペプチドと第２リンカーポリペプチドは互いに共有結合、例えば、ジスルフィド結合を形成することができる。いくつかの実施形態において、第１リンカーポリペプチド又は／及び第２リンカーポリペプチドはＩｇＧ１のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、第１リンカーポリペプチド又は／及び第２リンカーポリペプチドはＩｇＧ２のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、第１リンカーポリペプチド又は／及び第２リンカーポリペプチドはＩｇＧ３のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、第１リンカーポリペプチド又は／及び第２リンカーポリペプチドはＩｇＧ４のヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態において、前記二量体ＦｃはヒトＩｇＧ１のＦｃである。いくつかの実施形態において、前記二量体ＦｃはヒトＩｇＧ４のＦｃである。
いくつかの実施形態において、前記二量体Ｆｃは修飾を有している。いくつかの実施形態において、二量体ＦｃはＨ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを有し、当該修飾は第１Ｆｃポリペプチド、第２Ｆｃポリペプチドのいずれかのポリペプチド鎖に位置してもよい。いくつかの特定の実施形態において、二量体ＦｃはＨ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを有し、当該修飾は一方のＦｃポリペプチドにしか存在せず、他方のＦｃポリペプチドにない。いくつかの実施形態において、二量体Ｆｃは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗなどのｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ変異部位を有している。いくつかの実施形態において、二量体Ｆｃの一方の鎖はＴ３６６Ｙ／Ｗ又は／及びＳ３５４Ｃを有し、他方の鎖はＹ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ又は／及びＬ３６８Ａを有する。
いくつかの実施形態において、二量体Ｆｃはフコースを含まない。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物はグリコシル化されている。
いくつかの実施形態において、本明細書の抗原結合構築物は脱フコシル化されている。脱フコシル化によりＩｇＧ１とＦｃｇＲＩＩＩａの相互作用を向上させて、抗体のＡＤＣＣ効果を増強させることができる。Ｆｃグリコシル化部位にフコースが非常に少ない又はない抗原結合構築物が生成され、アミノ酸配列が変わらないようにする方法は本分野で知られている。例えば、発現細胞を含める培地の成分調整、又は発現細胞からのフコース発現関連遺伝子、例えば、ＦＵＴ８のノックアウトである。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る二重特異性抗原結合構築物は二価である。
表Ｓ１では、二重特異性抗原結合構築物の例が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書の二重特異性抗原結合構築物は二重特異性抗体である。表Ｓ２では、二重特異性抗体の例が提供され、例えば、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－２、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－３、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－４、２３Ｃ－ＨＥＲ２－２、２３Ｃ－ＨＥＲ２－３、２３Ｃ－ＨＥＲ２－４である。ＣＤＲ領域及び可変領域の配列は表Ｓ２に提供される。例示的な二重特異性抗体は２つの重鎖と１つの軽鎖とを含み、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－２、２３Ｃ－ＨＥＲ２－２の重鎖のアミノ酸配列は配列番号１１、配列番号１３に、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１５に示される。Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－３、２３Ｃ－ＨＥＲ２－３の重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１、配列番号１３に、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１５に示される
。Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－４、２３Ｃ－ＨＥＲ２－４の重鎖のアミノ酸配列は配列番号２３、配列番号１３に、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１５に示される。
本明細書では、さらに、ＡＤＣＣが増強された二重特異性抗原結合構築物がいくつか提供される。本明細書では、ＡＤＣＣが増強された二重特異性抗体の例として、２３Ｃ－ＨＥＲ２－２、２３Ｃ－ＨＥＲ２－３、２３Ｃ－ＨＥＲ２－４が提供される。
Figure 2023523988000001
Figure 2023523988000002
Figure 2023523988000003
「単一特異性抗原結合構築物」
単一特異性抗原結合構築物とは、結合特異性を１つ有する抗原結合構築物を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は単一特異性抗原結合構築物で、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントであり、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置
３０におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸はＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸はＹである。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は二価の単一特異性抗原結合構築物で、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する２つの前記第１抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は単一特異性抗原結合構築物で、その第１抗原結合フラグメントは本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物の第１抗原結合フラグメントの配列特徴を有してもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に係る抗原結合構築物は二価の単一特異性抗原結合構築物で、第１抗原結合フラグメントに作動可能に接続されたＦｃを含む。いくつかの実施形態において、ＦｃはヒトＩｇＧ１のＦｃである。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合構築物は、配列番号３のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体である。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合構築物は、配列番号９のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体である。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合構築物は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体である。
「組成物」
本明細書では、抗原結合構築物、又は前記抗原結合構築物をコードする核酸を含み、さらに、１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、二重特異性抗体、例えば、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－２、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－３、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－４、２３Ｃ－ＨＥＲ２－２、２３Ｃ－ＨＥＲ２－３、２３Ｃ－ＨＥＲ２－４の１つ又は複数と、薬学的に許容される担体とを含む。薬学的に許容される担体は、例えば、賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、充填剤、緩衝剤又は他の試薬を含む。
組成物において、抗原結合構築物は、完全に脱フコシル化されてもよいし（検出可能なフコースは含まない）、又は、部分的に脱フコシル化されてもよい。いくつかの実施形態において、抗原結合構築物の約２０％若しくは未満、約１８％若しくは未満、約１６％若しくは未満、約１４％若しくは未満、約１２％若しくは未満、約１０％若しくは未満、約８％若しくは未満、約６％若しくは未満、約５％若しくは未満、約３％若しくは未満、約２％若しくは未満、約１．５％若しくは未満、約１％若しくは未満、約０．９％若しくは未満、約０．８％若しくは未満、約０．７％若しくは未満、約０．６％若しくは未満、約０．５％若しくは未満、約０．４％若しくは未満、約０．３％若しくは未満、約０．２％若しくは未満、約０．１％若しくは未満、又は約０％はフコースを含まない。いくつかの実施形態において、抗原結合構築物の約０～約２０％、約０～約１８％、約０～約１６％、約０～約１４％、約０～約１２％、約０～約１０％、約０～約８％、約０～約６％、約０～約５％、約０～約３％、約０～約２％、約０～約１．５％、約０～約１％、約０～約０．９％、約０～約０．８％、約０～約０．７％、約０～約０．６％、約０～約０．５％、約０～約０．４％、約０～約０．３％、約０～約０．２％、約０～約０．１％、又は約０．５％～約０．６％はフコースを含まない。
「分離された核酸」
本明細書では、本明細書に記載の抗原結合構築物の少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む分離された核酸又は分離された核酸集合が提供される。いくつかの実施形態において、前記核酸は本明細書に記載の抗原結合構築物の配列をコードする。いくつかの実施形態において、前記核酸は、本明細書に記載の抗原結合構築物の第１抗原結合フラグメント又は／及び第２抗原結合フラグメントのアミノ酸配列などをコードすることができる。また、いくつかの実施形態において、前記核酸は、本明細書に記載の抗原結合構築物の重鎖又は／及び抗原結合構築物の軽鎖のアミノ酸配列などをコードすることができる。配列表には、例示的にいくつかの抗原結合構築物、例えば、二重特異性抗体の抗原結合フラグメント、抗原結合構築物の重鎖及び軽鎖の核酸配列が挙げられる。
「ベクター」
本発明では、前記分離された核酸又は核酸集合の１つ又は複数を含むベクター又はベクター集合が提供される。いくつかの実施形態において、前記ベクターはクローニングベクターである。また、いくつかの実施形態において、前記ベクターは発現ベクターである。
任意選択で、前記発現ベクターは、本明細書に記載の抗原結合構築物を発現できる任意の発現ベクターである。
「宿主細胞」
本発明のいくつかの実施形態において、前記ベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は抗原結合構築物をクローニング又はコードするための適切な宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞。また、いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は酵母細胞、哺乳動物細胞、又は抗原結合構築物の製造に適する他の細胞から選ばれる。哺乳動物細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞である。
「抗原結合構築物の製造方法」
本発明のいくつかの実施形態において、前記抗原結合構築物の発現に適する条件において、前記抗原結合構築物をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、前記宿主細胞又は宿主細胞培地から前記抗原結合構築物を回収することを含む抗原結合構築物の製造方法が提供される。前記抗原結合構築物を生成させるために、前記抗原結合構築物をコードする核酸を分離し、宿主細胞においてクローニング又は／及び発現するために１つ又は複数のベクターに挿入する。前記核酸は、遺伝子スプライシング、化学的合成、クローニングなどの本分野で知られる様々な方法で得ることができる。
「用途」
本明細書では、抗原結合構築物の用途が提供される。特定の実施形態において、使用する抗原結合構築物はＥｘｐｉ Ｈｅｒ２－２、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－３、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－４、２３Ｃ－ＨＥＲ２－２、２３Ｃ－ＨＥＲ２－３、２３Ｃ－ＨＥＲ２－４であってもよい。
いくつかの実施形態において、対象者に治療有効量の本発明の抗原結合構築物を投与すると、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞を死滅させ又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長を阻害することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞を死滅させ又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長を阻害する薬物の製造における抗原結合構築物の用途が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞を死滅させ又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長を阻害するための抗原結合構築物が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞を死滅させ又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の
成長を阻害するための、本明細書に記載の抗原結合構築物を有効成分として含む治療剤が提供される。
いくつかの実施形態において、対象者に治療有効量の本発明の抗原結合構築物を投与すると、ＨＥＲ２発現腫瘍を治療できる。治療を必要とする対象者は、既に疾患を有している又はその状態になっている対象者、疾患又はその状態になるリスクを有する対象者、及び、疾患若しくはその状態になる可能性があり疾患又はその状態を予防、遅延又は軽減することを目的とする対象者を含む。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＥＲ２発現腫瘍を有している対象者を治療する薬物の製造における前記抗原結合構築物の用途が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＥＲ２発現腫瘍を治療するための抗原結合構築物が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＥＲ２発現腫瘍を治療するための、本明細書に記載の抗原結合構築物を有効成分として含む治療剤が提供される。腫瘍の例は、胆道がん、がん肉腫、食道がん、食道胃接合部がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮がん、悪性黒色腫、咽頭がん、口腔がん、皮膚がんを含むが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＩＨＣで測定したところ、腫瘍はＨＥＲ２ ０－１＋、１＋、ＨＥＲ２ ２＋又はＨＥＲ２ ３＋である。いくつかの実施形態において、腫瘍はＨＥＲ２ ２＋若しくは未満、又はＨＥＲ２ １＋若しくは未満である。
いくつかの実施形態において、細胞に有効量の抗原結合構築物を投与すると、細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、低減又は遮断することができる。本発明のいくつかの実施形態において、細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、低減又は遮断する薬物の製造における抗原結合構築物の使用が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、低減又は遮断するための抗原結合構築物が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、低減又は遮断するための、本明細書に記載の抗原結合構築物を有効成分として含む治療剤が提供される。いくつかの実施形態において、前記細胞は腫瘍細胞である。
いくつかの実施形態において、前記サンプルを本明細書に記載の抗原結合構築物に接触させて、結合複合体を検出又は測定することを含むサンプルにおけるＨＥＲ２を検出又は測定する方法が提供される。
「抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法」
本明細書では、抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法が提供される。前記抗原結合構築物は一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含み、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。前記方法は、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸がＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸がＹであるように、抗原結合構築物を修飾することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合構築物は、一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する第２抗原結合フラグメントをさらに含み、前記第２抗原結合フラグメントはＦａｂである。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントは以下から選ばれるＣＤＲの群を含む。
ｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含む。
ｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｉｉｉ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。
ｉｖ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｖ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。
ｖｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｖｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む。
ｖｉｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３３、３２のアミノ酸配列を含む。又は、
ｉｘ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４４、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異前のアミノ酸はＥではない。いくつかの実施形態において、当該変異前のアミノ酸はＫであり、つまり、いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異前のアミノ酸はＹではない。いくつかの実施形態において、当該変異前的アミノ酸はＦであり、つまり、いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含み、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含むように、抗原結合構築物を修飾する。いくつかの実施形態において、前記第１抗原結合フラグメントがｓｃＦｖであり且つトラスツズマブの重鎖可変領域又はその変異体とトラスツズマブの軽鎖可変領域又はその変異体とを含むことにより、前記重鎖可変領域の変異体はＫ３０Ｅ変異を含み
、前記軽鎖可変領域の変異体はＦ５３Ｙ変異を含む。
いくつかの実施形態において、当該方法は、修飾された抗原結合構築物のＨＥＲ２抗原に結合する能力を確認することをさらに含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、ＨＥＲ２抗原に結合する修飾された抗原結合構築物を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、抗原結合構築物の親和性（例えば、ＫＤ）は修飾されていない抗原結合構築物より高く又は同等である。
いくつかの実施形態において、当該方法は、修飾されていない抗原結合構築物と比べて、凝集する傾向が低減された抗原結合構築物を選択することをさらに含む。
理解しやすいように、例を挙げ実施例を用いて本発明を詳しく説明しているが、当業者は、本発明の教示に基づいて、特許請求の範囲の趣旨と範囲を逸脱することなく本発明にいくつかの変更と修正を行えるのが自明である。下記の実施例は、限定を加えるためではなく、説明として提供される。当業者は様々な重要ではないパラメータを見分けることができ、前記パラメータを変更又は修正しても同様の結果は得られる。
本発明では、特に明記しない限り、実施時は本分野で周知されるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、薬理学の通常の方法を用いる。次の文献において当該技術が詳しく説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）ｖｏｌｕｍｅ Ａ，Ｂ（１９９２）である。
本発明では、さらに、次のいくつかの実施形態が提供され、ただし、本発明の保護範囲はそれらに限定されない。
実施形態１：一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含み、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖであり、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、好ましくは、変異後のアミノ酸はＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、好ましくは、変異後のアミノ酸はＹである抗原結合構築物。
実施形態２：前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含み、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む実施形態１に記載の抗原結合構築物。
実施形態３：抗体である実施形態１又は２に記載の抗原結合構築物。
実施形態４：前記第１抗原結合フラグメントは以下から選ばれるＣＤＲの群を含み、
ｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｖ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｖｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含み、
ｖｉｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３３、３２のアミノ酸配列を含み、又は、
ｉｘ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４４、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む実施形態１～３のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態５：前記第１抗原結合フラグメントはトラスツズマブの重鎖可変領域又はその変異体と、トラスツズマブの軽鎖可変領域又はその変異体とを含み、前記重鎖可変領域の変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ変異を含み、軽鎖可変領域の変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ変異を含む実施形態１～４のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態６：前記第１抗原結合フラグメントは以下から選ばれ、
ｉ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１、４２のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１、４２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５、３６のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重
鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５、３９のアミノ酸配列を含み、又は、
ｖ．前記第１抗原結合フラグメントは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域、軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４０、３６のアミノ酸配列を含む実施形態４又は５に記載の抗原結合構築物。
実施形態７：前記第１抗原結合フラグメントのＶＨとＶＬは、Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－リンカー－ＶＬの順に配列される実施形態１～６のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態８：一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する第２抗原結合フラグメントをさらに含む実施形態１～７のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態９：前記第２抗原結合フラグメントはＦａｂである実施形態８に記載の抗原結合構築物。
実施形態１０：前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含む実施形態８又は９に記載の抗原結合構築物。
実施形態１１：前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖可変領域とペルツズマブの軽鎖可変領域とを含む実施形態８又は９に記載の抗原結合構築物。
実施形態１２：第１抗原結合フラグメント又は／及び第２抗原結合フラグメントに作動可能に接続された免疫グロブリンドメインを含み、前記免疫グロブリンドメインは、ｉ．ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の１つ若しくは複数、又は、ｉｉ．Ｆｃを含む実施形態８～１１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態１３：前記ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＦｃはそれぞれヒトＩｇＧのＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｆｃから誘導される実施形態１２に記載の抗原結合構築物。
実施形態１４：前記ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＦｃは修飾を有し又は修飾を有さず、好ましくは、前記ＣＨ３又はＦｃが有する修飾は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム基準の第４３５位又は／及び第４３６位のアミノ酸の置換である実施形態１２に記載の抗原結合構築物。
実施形態１５：前記Ｆｃは第１Ｆｃポリペプチドと第２Ｆｃポリペプチドとを含む二量体Ｆｃであり、第１抗原結合フラグメントは第１Ｆｃポリペプチドに作動可能に接続され、第２抗原結合フラグメントは第２Ｆｃポリペプチドに作動可能に接続されている実施形態１２に記載の抗原結合構築物。
実施形態１６：二重特異性抗体又は多重特異性抗体である実施形態１～１５のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態１７：二価又は多価である実施形態１～１５のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態１８：一価、二価又は多価の単一特異性抗体である実施形態１～７のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態１９：ｉ．配列番号１１を含む重鎖と、配列番号１３を含む重鎖と、配列番号１５を含む軽鎖とを含む二価の二重特異性抗体と、
ｉｉ．配列番号２１を含む重鎖と、配列番号１３を含む重鎖と、配列番号１５を含む軽鎖とを含む二価の二重特異性抗体と、
ｉｉｉ．配列番号２３を含む重鎖と、配列番号１３を含む重鎖と、配列番号１５を含む軽鎖とを含む二価の二重特異性抗体と、
ｉｖ．配列番号３のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体と、
ｖ．配列番号９のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体と、
ｖｉ．配列番号５１のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体とから選ばれる実施形態１に記載の抗原結合構築物。
実施形態２０：第３０位がＥではなく又は／且つ第５３位がＹではない抗原結合構築物と比べて低減している凝集性を有し、又は／且つ、
第３０位がＥではなく又は／且つ第５３位がＹではない抗原結合構築物と比べてＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原又は／及びＥＣＤ２抗原に対する結合親和性が明らかに低減されていない実施形態１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態２１：脱フコシル化されている実施形態１～２０のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
実施形態２２：実施形態１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
実施形態２３：実施形態１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物の少なくとも１つの抗原結合フラグメントをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む分離された核酸又は分離された核酸集合。
実施形態２４：実施形態２３に記載の核酸又は核酸集合の１つ又は複数を含むベクター又はベクター集合。
実施形態２５：実施形態２３に記載の核酸若しくは核酸集合、又は実施形態２４に記載のベクター若しくはベクター集合を含む分離された細胞。
実施形態２６：前記抗原結合構築物の発現に適する条件において宿主細胞を培養することであって、前記宿主細胞は前記抗原結合構築物をコードする核酸、又は実施形態２４に記載のベクター若しくはベクター集合を含むことと、前記構築物を精製することとを含む実施形態１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物の製造方法。
実施形態２７：対象者に、治療有効量の実施形態１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物又は実施形態２２に記載の医薬組成物を投与することを含むＨＥＲ２発現腫瘍を有している対象者の治療方法。
実施形態２８：腫瘍細胞を前記抗原結合構築物に接触させることにより、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞を死滅させ又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長を阻害することを含む実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９：腫瘍は胆道がん、がん肉腫、食道がん、食道胃接合部がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮がん、悪性黒色腫、咽頭がん、口腔がん又は皮膚がんである実施形態２７又は２８に記載の方法。
実施形態３０：細胞に有効量の前記抗原結合構築物又は前記医薬組成物を投与することにより、細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、低減又は遮断することを含む実施形態２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３１：抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法であって、前記抗原結合構築物は一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含み、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖであり、
前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸がＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸変異を含み、変異後のアミノ酸がＹであるように、前記抗原結合構築物を修飾することを含む前記方法。
実施形態３２：前記抗原結合構築物は一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する第２抗原結合フラグメントをさらに含み、前記第２抗原結合フラグメントはＦａｂである実施形態３１に記載の抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法。
実施形態３３：前記第１抗原結合フラグメントは以下から選ばれるＣＤＲの群を含む実施形態３１又は３２に記載の抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法。
ｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含む。
ｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｉｉｉ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。
ｉｖ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｖ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列を含む。
ｖｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｖｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む。
ｖｉｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３３、３２のアミノ酸配列を含む。
ｉｘ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４４、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む。又は、
ｉｘ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４４、２８、２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、３２のアミノ酸配列を含む。
実施形態３４：前記第１抗原結合フラグメントがｓｃＦｖであり且つトラスツズマブの重鎖可変領域又はその変異体とトラスツズマブの軽鎖可変領域又はその変異体とを含むことにより、前記重鎖可変領域の変異体はＫ３０Ｅ変異を含み、前記軽鎖可変領域の変異体はＦ５３Ｙ変異を含む実施形態３１又は３２に記載の抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法。
実施例１：抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びその変異体の構築、発現及び精製
抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）を構築する時は、Ｆｃ部分としてヒトＩｇＧ１を用い、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）アーム可変領域配列はトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））モノクローナル抗体に基づく配列であり、設計されたリンカー１（ｌｉｎｋｅｒ １）（（ＧＧＧＧＳ）３、配列番号５３）によってトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をつなげて抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）（配列番号１）を形成させていた。そのアミノ酸配列は次のとおりである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
また、抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）配列に点変異を導入して、以下の変異体を構築した。
抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）（配列番号３）：野生型抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）から誘導され、ＶＬ領域はＦ５３Ｙを有している。そのアミノ酸配列は次のとおりである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶ
ＥＩＫＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ａ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ａ－Ｆｃ）（配列番号５）：野生型抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）から誘導され、ＶＬ領域はＦ５３Ａを有している。そのアミノ酸配列は次のとおりである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＡＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｒ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｒ－Ｆｃ）（配列番号７）：野生型抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）から誘導され、ＶＬ領域はＦ５３Ｒを有している。そのアミノ酸配列は次のとおりである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＲＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ）（配列番号９）：野生型抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）から誘導され、ＶＨ領域はＫ３０Ｅを有している。そのアミノ酸配列は次のとおりである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＥＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧ
ＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びその変異体のＤＮＡ配列（配列番号２、４、６、８、１０）を合成し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ａ２９１３３）を用いて抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）又はその変異体の発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）にトランスフェクトした。細胞をＥｘｐｉＣＨＯ発現培地に入れて、３７℃×８％ＣＯ２加湿雰囲気のインキュベータで、１３０ｒｐｍ回転するオービタルシェーカープラットフォームにおいて培養した。培養上清を収集して、プロテインＡ磁気ビーズ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号：Ｌ００２７３）を用いてタンパク質精製を行った。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｌｉｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でタンパク質濃度を測定した。
Figure 2023523988000004
実施例２：抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びその変異体の凝集体の検証及びヒトＨｅｒ２抗原との結合の検出
発現及び精製された抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びその変異体に対して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）で被検分子のヒトＨｅｒ２タンパク質との親和性を測定した。実験プロセスは次のとおりである。
抗ｈＩｇＧ（Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ）を結合したチップで一定の量の抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）又はその変異体を捕捉し、その後、チップの表面に抗原ヒトＨＥＲ２タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１０００４－Ｈ０８Ｈ）を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いてリアルタイムで反応シグナルを検出することにより、結合及び解離曲線を得た。実験で使用する緩衝液はＢｉａｃｏｒｅ汎用緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０
（ＧＥ、カタログ番号：ＢＲ－１０００－５４）、ｐＨ７．４）であった。抗ｈＩｇＧ（Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ）（由来はヒト抗体捕捉キット、ＧＥ、カタログ番号：２９－２３４６－００）がＣＭ５チップの表面に結合し結合量が約９０００ＲＵになると、抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）又はその変異体が約２００ＲＵ捕捉され、その後、異なる濃度のヒトＨＥＲ２タンパク質（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）と抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）又はその変異体の相互作用のシグナル値を検出した。フローセルの流速は５０μＬ／ｍｉｎであり、結合時間は２４０秒であり、解離時間は１４００秒であり、３Ｍ ＭｇＣｌ２（ＧＥ）で６０秒間再生させると、ベースラインが安定していた。ｂｉａｃｏｒｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅのａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ １：１結合モデルで計算して結果を得た。抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）又は変異体の抗原ヒトＨｅｒ２タンパク質との親和性は表２を参照する。抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）（ＫＤ＝０．７７ｎＭ）と比べて、変異体抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ａ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ａ－Ｆｃ）（ＫＤ＝１．２６ｎＭ）は抗原ヒトＨｅｒ２タンパク質との結合親和性に対する影響が大きかった。変異体抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）（ＫＤ＝０．８ｎＭ）の抗原ヒトＨｅｒ２タンパク質に対する結合親和性は抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）（ＫＤ＝０．７７ｎＭ）とほぼ同じで、変異体抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ）の抗原ヒトＨｅｒ２タンパク質に対する結合はＫＤ＝０．５４ｎＭであった。Ｆ５３Ｙ、Ｋ３０Ｅ変異の導入は抗原ヒトＨｅｒ２タンパク質との結合親和性を低減させないことが分かった。
ゲル濾過クロマトグラフィーカラムを用いて、抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）又はその変異体の各成分を分離した。中性ｐＨ緩衝液を移動相として溶出させ、各分子量成分は分子量が小さくなる順に溶出された。クロマトグラフィーカラムはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍｎ ２００Å、１．７μｍ、４．６×３００ｍｍゲル濾過クロマトグラフィーカラムであり、カラム温度は２５℃であった。移動相は５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液－２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムで、ｐＨ＝７．０であった（２．３３ｇのリン酸二水素ナトリウム二水和物、１２．５３ｇのリン酸水素二ナトリウム十二水和物、１１．６９ｇの塩化ナトリウムを秤量して、約８００ｍＬの超純水を加え、攪拌して充分に溶解すると、超純水を加えて１０００ｍＬとし、均一に混合してから０．２２μｍ濾過膜で濾過した）。移動相でサンプルを１０ｍｇ／ｍＬに希釈して供試品溶液とし、正確に２μＬを計量して液体クロマトグラフに注入し（サンプル濃度が１０ｍｇ／ｍＬ未満である場合に、注入量を調整して２０μｇのタンパク質を注入した）、波長２８０ｎｍにおいて検出した。流速は０．３０ｍＬ／ｍｉｎで、１５分間アイソクラティック溶出した。データを処理し、面積百分率法で結果を定量的に分析した。それぞれ凝集体、免疫グロブリン単量体及び低分子量不純物のピーク面積パーセンテージを計算し、そのうちメインピーク前は凝集体で、メインピークは免疫グロブリン単量体で、メインピーク後は低分子量不純物であった。抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）又はその変異体メインピークと凝集体の含有量の比は表２を参照する。変異体抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）と抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ）では凝集体が明らかに低減していた。凝集体は抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の６．３１％からそれぞれ４．９４％、３．３９％に低減していた。
Figure 2023523988000005
実施例３：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の構築、発現及び精製
Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ（Ｒｉｄｇｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）Ｆｃプロセスでの改変によりヒトＩｇＧ１としての抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体を生成させた。一方の重鎖のＦｃ領域配列には、ＦｃのプロテインＡに対する親和性を低減させるために、Ｈ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ変異（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）が設計され、プロテインＡアフィニティー精製において二重特異性抗体を組み立てる間に形成されたホモ二量体を除去するために役立つ（特許ＵＳ５９４５３１１Ａ）。実施例２からは、抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）変異、抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ）変異は、Ｈｅｒ２抗原に対する親和性を低減することなく、抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ）凝集体を明らかに低減できることが分かり、本実施例では抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の一方の抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）アームの抗原結合ドメインはｓｃＦｖ（ＶＨ－リンカー－ＶＬ構造）形態で、可変領域配列は変異Ｋ３０Ｅ（ｂ－抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－Ｆｃ）、配列番号２１）、変異Ｆ５３Ｙ（ｂ－抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）、配列番号２３）を含み、又は当該２つの点変異を同時に含み、抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）（配列番号１１）であった。本実施例では、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の他方の抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）アームの抗原結合ドメインは、抗Ｈｅｒ２－ドメイン２－ＨＣ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｄｏｍａｉｎ２－ＨＣ－Ｆｃ）（配列番号１３）と抗Ｈｅｒ２－ドメイン２－ＬＣ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｄｏｍａｉｎ２－ＬＣ）（配列番号１５）とを含むＦａｂ形態である。さらに、変異を含まないｓｃＦｖ（ＶＨ－リンカー－ＶＬ構造又はＶＬ－リンカー－ＶＨ構造）で、対照として抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体を構築した。

Figure 2023523988000006
Figure 2023523988000007
Figure 2023523988000008
Figure 2023523988000009
Figure 2023523988000010
抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＤＮＡ配列（配列番号１２、１４、１６）を合成し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ａ２９１３３）を用いて抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）（配列番号１１）、抗Ｈｅｒ２－ドメイン２－ＨＣ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｄｏｍａｉｎ２－ＨＣ－Ｆｃ）（配列番号１３）及び抗Ｈｅｒ２－ドメイン２－ＬＣ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｄｏｍａｉｎ２－ＬＣ）（配列番号１５）の発現ベクターをトランスフェクション比１：１：１．５でＥｘｐｉＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション密度は６×１０６細胞／ｍＬであった。培地はＥｘｐｉＣＨＯ発現培地であった。トランスフェクション後１０日目まで連続培養し、遠心分離して細胞培養上清を収集した。プロテインＡ磁気ビーズ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号：Ｌ００２７３）を用いてタンパク質精製を行った。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｌｉｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でタンパク質濃度を測定した。当該サンプルをＥｘｐｉ Ｈｅｒ２－２と命名した。当該方法に従って、上の表に示されたＤＮＡ配列での発現及び精製により他の二重特異性抗体Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－１、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－３、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－４、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－５を得た。
実施例４：フコースノックアウト二重特異性抗体の製造及び検証
フコース発現関連遺伝子ＦＵＴ８をノックアウトすると、ＩｇＧ１とＦｃｇＲＩＩＩａの相互作用を向上させて、抗体のＡＤＣＣ効果を増強させることができる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。本実施例において、ＦＵＴ８－ノックアウトＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯ ＦＵＴ８－／－細胞と命名された）でフコースノックアウト抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体を製造した。抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＤＮＡ配列（配列番号１２、１４、１６）を合成し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。ＣＨＯｇｒｏ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号：ＭＩＲ ６２７０）で抗Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｓｃＦｖ－ＶＨ－Ｋ３０Ｅ－ＶＬ－Ｆ５３Ｙ－Ｆｃ）、抗Ｈｅｒ２－ドメイン２－ＨＣ－Ｆｃ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｄｏｍａｉｎ２－ＨＣ－Ｆｃ）及び抗Ｈｅｒ２－ドメイン２－ＬＣ（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２－ｄｏｍａｉｎ２－ＬＣ）の発現ベクターをトランスフェクション比１：１：１．５でＦＵＴ８－ノックアウトＣＨＯ－Ｓ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション密度は６×１０６細胞／ｍＬであった。培地はＣＨＯｇｒｏ（登録商標）発現培地（カタログ番号：ＭＩＲ ６２００、Ｍｉｒｕｓ）であった。トランスフェクション後１０日目まで連続培養し、遠心分離して細胞培養上清を収集した。プロテインＡ磁気ビーズ（Ｇｅｎｓｃ
ｒｉｐｔ、カタログ番号：Ｌ００２７３）を用いてタンパク質精製を行った。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｌｉｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でタンパク質濃度を測定した。当該サンプルを２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２と命名した。当該方法に従って、ＣＨＯ ＦＵＴ８－／－細胞において表３に示されたＥｘｐｉ Ｈｅｒ２－１、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－３、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－４、Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－５の配列を発現して、フコースノックアウト抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－１、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－３、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－４、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－５を得た。
ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ Ｎ－グリカンキット（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、米ＭＡ）を用いてＣＨＯ ＦＵＴ８－／－細胞とＣＨＯ－Ｓ細胞によって発現された抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体サンプルを処理し、タンパク質からＮ－グリカンを放出させて、Ｎ－グリカンを標識し、クロマトグラフィーカラムで分離し、ＦＬＲ検出器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、米ＭＡ）で分析すると、Ｎ－グリカンの構造及び含有量を得、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－２のグリカン分析結果は図１を参照し、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ－Ｓ細胞による抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２の発現のグリカン分析は図２を参照し、グリカン含有量比は表４を参照し、通常の抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－２でフコースを含まない比は２１．８５％で、ＦＵＴ８－ノックアウトＣＨＯ－Ｓ細胞による抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２の発現でフコースを含まない比は９９．４０％であった。
Figure 2023523988000011
Figure 2023523988000012
実施例５：二重特異性抗体の凝集体の検証
本実施例では、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－１、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－３、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－４、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－５の凝集体を検証していた。
ゲル濾過クロマトグラフィーカラムを用いて抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体を分離し、凝集体の含有量を検証した。中性ｐＨ緩衝液を移動相として溶出させ、各分子量成分は分子量が小さくなる順に溶出された。クロマトグラフィーカラムはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ Ｃｏｌｕｍｎ ２００Å、１．７μｍ、４．６×３００ｍｍゲル濾過クロマトグラフィーカラムであり、カラム温度は２５℃であった。移動相は５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液－２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムで、ｐＨ＝７．０であった（２．３３ｇのリン酸二水素ナトリウム二水和物、１２．５３ｇのリン酸水素二ナトリウム十二水和物、１１．６９ｇの塩化ナトリウムを秤量して、約８００ｍＬの超純水を加え、攪拌して充分に溶解すると、超純水を加えて１０００ｍＬとし、均一に混合してから０．２２μｍ濾過膜で濾過した）。移動相でサンプルを１０ｍｇ／ｍＬに希釈して供試品溶液とし、正確に２μＬを計量して液体クロマトグラフに注入し（サンプル濃度が１０ｍｇ／ｍＬ未満である場合に、注入量を調整して２０μｇのタンパク質を注入した）、波長２８０ｎｍにおいて検出した。流速は０．３０ｍＬ／ｍｉｎで、１５分間アイソクラティック溶出した。データを処理し、面積百分率法で結果を定量的に分析した。それぞれ凝集体、免疫グロブリン単量体及び低分子量不純物のピーク
面積パーセンテージを計算し、そのうちメインピーク前は凝集体で、メインピークは免疫グロブリン単量体で、メインピーク後は低分子量不純物であった。
Figure 2023523988000013
結果から明らかなように、ｓｃＦＶ（変異を含まない）から二重特異性抗体を組み立てると、二重特異性抗体は依然として凝集体を大量に生成しており、変異を導入すると二重特異性抗体の凝集体の含有量が低減し、変異を含まない２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－１と比べて、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２の凝集体の含有量が８．５１％に低減していた（表５）。
実施例６：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の抗原結合検出
発現及び精製された抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体に対して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）で被検分子のＨＥＲ２タンパク質との親和性を測定し、実験プロセスは次のとおりである。
抗ｈＩｇＧ（Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ）を結合したチップで一定の量の抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体を捕捉し、その後、チップの表面にヒトＨｅｒ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１０００４－Ｈ０８Ｈ）を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いてリアルタイムで反応シグナルを検出することにより、結合及び解離曲線を得た。実験で使用する緩衝液はＢｉａｃｏｒｅ汎用緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。抗ｈＩｇＧ（Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ）（由来はヒト抗体捕捉キット、ＧＥ、カタログ番号：２９－２３４６－００）がＣＭ５チップの表面に結合し結合量が約９０００ＲＵになると、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体が約２００ＲＵ捕捉され、その後、それぞれ異なる濃度のＨｅｒ２タンパク質（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）と抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の相互作用のシグナル値を検出した。フローセルの流速は５０μＬ／ｍｉｎであり、結合時間は２４０秒であり、解離時間は１４００秒であり、３Ｍ ＭｇＣｌ２（ＧＥ）で６０秒間再生させると、ベースラインが安定していた。
ｂｉａｃｏｒｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅで計算して結果を得、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２の抗原Ｈｅｒ２との結合親和性及びトラスツズマブとペルツズマブ対照は表６を参照し、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２の抗原Ｈｅｒ２に対する結合のＫＤは６．１１Ｅ－１０Ｍで、トラスツズマブの抗原Ｈｅｒ２に対する結合のＫＤは１．２２Ｅ－０９Ｍで、ペルツズマブの抗原Ｈｅｒ２に対する結合のＫＤは２．３５Ｅ－０９Ｍであり、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２はトラスツズマブとペルツズマブよりも抗原Ｈｅｒ２に対する親和性が高かった。
Figure 2023523988000014
実施例７：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の抗原結合検出
実施例６の実験プロセスに従って、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）で、発現及び精製された抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－１、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－３、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－４、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－５のＨＥＲ２タンパク質に対する親和性を測定した。
抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の抗原ヒトＨｅｒ２タンパク質に対する親和性は表７を参照する。表６と表７の結果からは、Ｆ５３Ｙ、Ｋ３０Ｅ変異を導入すると抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の抗原ヒトＨｅｒ２タンパク質に対する結合親和性を向上できることが分かった。
Figure 2023523988000015
実施例８：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＨｅｒ２陽性標的細胞ＢＴ４７４に対する殺傷
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞、エフェクター細胞）からのＮＫ細胞の提供で、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の標的細胞（ＢＴ４７４ Ｈｅｒ２＋＋＋、提供は中国科学院典型培養物保存委員会セルバンク）に対する殺傷効果を検討し、ＥＣ５０を計算し、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のインビトロ活性を評価した。
実験プロセスの詳細は次のとおりである。
ＢＴ４７４細胞に対し、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有１６４０実験培地で細胞密度を３×１０５細胞／ｍＬに調整し、１ウェルあたり５０μＬで９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に接種した。１６４０実験培地を使用して異なる濃度（１０００ｎｇ／ｍＬ、３３３ｎｇ／ｍＬ、１１１ｎｇ／ｍＬ、３７ｎｇ／ｍＬ、１２．３ｎｇ／ｍＬ、４．１１ｎｇ／ｍＬ、１．３７ｎｇ／ｍＬ、０．４６ｎｇ／ｍＬ、０．１５ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ）の抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体を調製し、異なる濃度の抗体を前記９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェルあたり５０μＬ加えた。ヒトＰＢＭＣは１６４０実験培地を使用して細胞密度を１．５×１０６細胞／ｍＬに調整し、１ウェルあたり１００μＬとした。投与群（標的細胞＋エフェクター細胞＋抗体）、標的細胞群（ＢＴ４７４細胞）、エフェク
ター細胞群（ヒトＰＢＭＣ）、標的細胞＋エフェクター細胞群、ブランク対照群（培地）及びライセート対照群、標的細胞最大放出群（標的細胞＋ライセート）を設置し、エフェクター細胞－標的細胞比は１０：１であった。検出前４５分間に、標的細胞最大放出群、ライセート対照群には２０μＬ／ウェルでライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ１８２Ａ）を加えた。４５分間後に、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出キット（ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）キットを用いて細胞溶解率（死滅率）を検出した。
溶解率（％）＝（ＯＤ投与群－ＯＤ標的細胞＋エフェクター細胞群）／（ＯＤ標的細胞最大放出群－ＯＤ標的細胞群）×１００％。
図３には抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＢＴ４７４ Ｈｅｒ２＋＋＋腫瘍細胞に対する死滅率が示されている。ＡＤＣＣ増強抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ ＨＥＲ２－１及び２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２のＢＴ４７４腫瘍細胞に対する殺傷はトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用を上回り、ＣＨＯ－Ｓから発現される抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－１及びＥｘｐｉ ＨＥＲ２－２をも上回っていた。そのうちトラスツズマブ＋ペルツズマブ（１：１）併用のＥＣ５０は８．６２７ｎｇ／ｍＬで、Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－１のＥＣ５０は３８．０５ｎｇ／ｍＬであり、Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－２はＥｘｐｉ ＨＥＲ２－１より優れており、ＥＣ５０が３５．１７ｎｇ／ｍＬであった。ＡＤＣＣ増強２３Ｃ２ ＨＥＲ２－１のＥＣ５０は４．７２８ｎｇ／ｍＬで、ＡＤＣＣ増強２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２は２３Ｃ２ ＨＥＲ２－１より優れており、ＥＣ５０が３．６５８ｎｇ／ｍＬであった。
実施例９：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＨｅｒ２陽性標的細胞ＮＣＩ－Ｎ８７に対する殺傷
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞、エフェクター細胞）からのＮＫ細胞の提供で、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の標的細胞（ＮＣＩ－Ｎ８７ Ｈｅｒ２＋＋、提供は中国科学院典型培養物保存委員会セルバンク）に対する殺傷効果を検討し、ＥＣ５０を計算し、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のインビトロ活性を評価した。
実験プロセスの詳細は次のとおりである。
ＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対し、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有１６４０実験培地で細胞密度を３×１０５細胞／ｍＬに調整し、１ウェルあたり５０μＬで９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に接種した。１６４０実験培地を使用して異なる濃度（８．１ｎＭ、２．７ｎＭ、０．９ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０００４ｎＭ）の抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体又は対照薬を調製し、異なる濃度の抗体又は対照薬を前記９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェルあたり５０μＬ加えた。ヒトＰＢＭＣは１６４０実験培地を使用して細胞密度を１．５×１０６細胞／ｍＬに調整し、１ウェルあたり１００μＬとした。投与群（標的細胞＋エフェクター細胞＋抗体）、標的細胞群（ＮＣＩ－Ｎ８７細胞）、エフェクター細胞群（ヒトＰＢＭＣ）、標的細胞＋エフェクター細胞群、ブランク対照群（培地）及びライセート対照群、標的細胞最大放出群（標的細胞＋ライセート）を設置し、エフェクター細胞－標的細胞比は１０：１であった。検出前４５分間に、標的細胞最大放出群、ライセート対照群には２０μＬ／ウェルでライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ１８２Ａ）を加えた。４５分間後に、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出キット（ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）キットを用いて細胞溶解率（死滅率）を検出した。トラスツズマブ、Ｔ－ＤＭ１（トラスツズマブ－マイタンシン複合体、商品名Ｋａｄｃｙｌａ（登
録商標））、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用（１：１）、Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－１を対照薬とした。
溶解率（％）＝（ＯＤ投与群－ＯＤ標的細胞＋エフェクター細胞群）／（ＯＤ標的細胞最大放出群－ＯＤ標的細胞群）×１００％。
図４にはトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用、トラスツズマブ、Ｔ－ＤＭ１及び抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞に対する殺傷率が示されている。ＡＤＣＣ増強抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２
ＨＥＲ２－２のＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞に対する殺傷はトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用、トラスツズマブ、Ｔ－ＤＭ１及びＥｘｐｉ ＨＥＲ２－１を上回っていた。そのうちＡＤＣＣ増強抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２のＥＣ５０は０．０２４４７ｎＭで、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用のＥＣ５０は０．０８２６７ｎＭで、Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－１のＥＣ５０は０．１０４８ｎＭで、Ｔ－ＤＭ１のＥＣ５０は０．０７３９２ｎＭで、トラスツズマブのＥＣ５０は０．０７４６８ｎＭであった。
実施例１０：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のトラスツズマブ耐性細胞ＪＩＭＴ－１に対する殺傷
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞、エフェクター細胞）からのＮＫ細胞の提供で、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体の標的細胞（ＪＩＭＴ－１、ＡｄｄｅｘＢｉｏ提供、カタログ番号：Ｃ０００６００５）に対する殺傷効果を検討し、ＥＣ５０を計算し、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のインビトロ活性を評価した。
実験プロセスの詳細は次のとおりである：
ＪＩＭＴ－１細胞に対し、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有１６４０実験培地で細胞密度を３×１０５細胞／ｍＬに調整し、１ウェルあたり５０μＬで９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に接種した。１６４０実験培地を使用して異なる濃度（８．１ｎＭ、２．７ｎＭ、０．９ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０００４ｎＭ）の抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体又は対照薬を調製し、異なる濃度の抗体又は対照薬を前記９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェルあたり５０μＬ加えた。ヒトＰＢＭＣは１６４０実験培地を使用して細胞密度を１．５×１０６細胞／ｍＬに調整し、１ウェルあたり１００μＬとした。投与群（標的細胞＋エフェクター細胞＋抗体又は対照薬）、標的細胞群（ＢＴ４７４細胞）、エフェクター細胞群（ヒトＰＢＭＣ）、標的細胞＋エフェクター細胞群、ブランク対照群（培地）及びライセート対照群、標的細胞最大放出群（標的細胞＋ライセート）を設置し、エフェクター細胞－標的細胞比は２０：１であった。検出前４５分間に、標的細胞最大放出群、ライセート対照群には２０μＬ／ウェルでライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ１８２Ａ）を加えた。４５分間後に、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出キット（ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）キットを用いて細胞溶解率（死滅率）を検出した。トラスツズマブ、Ｔ－ＤＭ１、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用（１：１）、Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－１を対照薬とした。
溶解率（％）＝（ＯＤ投与群－ＯＤ標的細胞＋エフェクター細胞群）／（ＯＤ標的細胞最大放出群－ＯＤ標的細胞群）×１００％。
図５にはトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用、トラスツズマブ、Ｔ－ＤＭ１及び抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＪＩＭＴ－１腫瘍細胞に対する殺傷率が示されている。ＡＤＣＣ増強抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２のＪＩＭＴ－１腫瘍細胞に対する殺傷はラスツズマブ＋ペルツズマブ併用、
トラスツズマブ、Ｔ－ＤＭ１、Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－１を上回っていた。そのうちＡＤＣＣ増強抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２のＥＣ５０は０．０１００６ｎＭで、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用のＥＣ５０は０．０６７２７ｎＭで、Ｅｘｐｉ ＨＥＲ２－１のＥＣ５０は０．０８０６６ｎＭで、Ｔ－ＤＭ１のＥＣ５０は０．０８３５７ｎＭで、トラスツズマブのＥＣ５０は０．０７４４３ｎＭであった。また、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ ＨＥＲ２－２はより高い細胞溶解率を有していた。
実施例１１：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＢＴ４７４ Ｈｅｒ２＋＋＋腫瘍細胞に対する増殖阻害
２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２、トラスツズマブ、ペルツズマブを、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、ＧＩＢＣＯ、カタログ番号：１００９９－１４１）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号：１１３３０－０３２）を使用して最終濃度が３．２μｇ／ｍＬになるまで希釈し、その後、１：１の比率で勾配希釈して９つの濃度とした（１．６μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ、０．００６２５μｇ／ｍＬ）。対数増殖期のＢＴ４７４ Ｈｅｒ２＋＋＋細胞に対して、密度を１×１０５細胞／ｍＬに調整してプレーティングし、１ウェルあたり１００μＬを加え、対照として無細胞ブランクウェルを設置した。前記勾配希釈抗体を、１ウェルあたり５０μＬ加えた。３７℃×５％ＣＯ２インキュベータにおいて５日間培養した。培養液を捨て、作業溶液としてＣＣＫ－８（同仁化学、カタログ番号：ＣＫ０４）を１ウェルあたり１００μＬ加え、インキュベートして４～５時間発色させてからマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、型番：ＶａｒｉｏｓｋａｎＦｌａｓｈ）に置いて、参照波長６３０ｎｍで、波長４５０ｎｍにおける吸光度値を読み取り、記録した。腫瘍細胞の増殖阻害率を計算した。
図６の結果に示されるように、ＡＤＣＣ増強抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２のＢＴ４７４腫瘍細胞に対する増殖阻害率は７８．３８％で、トラスツズマブによる５４．１２％の増殖阻害率又はトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用による５３．７％の増殖阻害率を上回っていた。
実施例１２：抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のＮＣＩ－Ｎ８７ Ｈｅｒ２＋＋胃がんヌードマウス異種移植腫瘍に対する阻害効果
ＮＣＩ－Ｎ８７ Ｈｅｒ２＋＋胃がん細胞（中国科学院典型培養物保存委員会セルバンク）を使用するマウス異種腫瘍移植モデルにおいて、抗Ｈｅｒ２（ａｎｔｉ－Ｈｅｒ２）二重特異性抗体のインビボ有効性を評価した。ＮＣＩ－Ｎ８７ Ｈｅｒ２＋＋胃がん細胞を用意し、濃度は５×１０７個／ｍＬで０．１ｍＬ／マウスであった。無菌条件下で、ヌードマウス（常州▼カ▲文斯実験動物有限会社提供、ヌードマウス、１４～１７ｇ、雄、飼育環境：ＳＰＦ）へ右脇の下に接種した。ヌードマウスに移植された腫瘍に対しノギスで移植腫瘍の直径を測定し、腫瘍が１００～２５０ｍｍ３に成長したら動物を５群に分けた。
群１：対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）
群２：Ｅｘｐｉ Ｈｅｒ２－１、１０ｍｇ／ｋｇ
群３：２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２、５ｍｇ／ｋｇ
群４：２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２、１０ｍｇ／ｋｇ
群５：Ｐｅｒ＋Ｔｒａ（トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用）、５＋５ｍｇ／ｋｇ。
各投与群は、所定の用量で静脈注射投与し、週２回に連続で３週間（６回）投与した。群５の併用群の２種の薬物の投与体積はそれぞれ５ｍＬ／ｋｇマウス体重で、他の各群の投与体積はいずれも１０ｍＬ／ｋｇマウス体重であった。群１はＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号：ｓｈ３０２５６．０１）の１０ｍＬ／ｋｇ ｉ．ｖ．投与であった。併
用群の投与では、ペルツズマブ投与後に少なくとも３０分してからトラスツズマブを投与した。
腫瘍径測定の方法で、被験物質の抗腫瘍効果を動的に観察した。腫瘍の体積を週に２～３回で測定し（測定時間は表８参照）、同時にマウスの重量を量り、データを記録した。マウスの一般的な挙動を毎日に観察した。
検出指標：
腫瘍体積（ＴＶ）であった。計算式はＴＶ＝１／２×ａ×ｂ２で、ここで、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅であった。
本実験では、ｄ０日から投与を開始し、合計で６回（ｄ０、ｄ３、ｄ７、ｄ１０、ｄ１４、ｄ１７）投与した。実験ｄ２１日目までに、動物の死亡はなかった。各群マウスの平均体重は増加する傾向にあった（図８）。薬物には明らかな毒性作用がなかった。
ｄ２１日までの群２（１０ｍｇ／ｋｇ）、群３（５ｍｇ／ｋｇ）、群４（１０ｍｇ／ｋｇ）、群５（５＋５ｍｇ／ｋｇ）のＮＣＩ－Ｎ８７胃がんヌードマウス異種移植腫瘍の体積に対する影響は表７及び図７を参照し、２３Ｃ２ Ｈｅｒ２－２は１０ｍｇ／ｋｇの用量におけるＮＣＩ－Ｎ８７胃がんヌードマウス異種移植腫瘍に対する阻害がＥｘｐｉ Ｈｅｒ２－１（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｅｒ＋Ｔｒａ併用群（５＋５ｍｇ／ｋｇ）より優れていた。
Figure 2023523988000016

Claims (31)

  1. 一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含み、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖであり、前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸突然変異を含み、好ましくは、突然変異後のアミノ酸はＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸突然変異を含み、好ましくは、突然変異後のアミノ酸はＹである抗原結合構築物。
  2. 前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ突然変異を含み、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ突然変異を含む請求項１に記載の抗原結合構築物。
  3. 抗体である請求項１又は２に記載の抗原結合構築物。
  4. 前記第１抗原結合フラグメントは以下のＣＤＲの群、
    ｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、及び２９のアミノ酸配列を含む群、
    ｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、及び２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む群、
    ｉｉｉ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、及び３２のアミノ酸配列を含む群、
    ｉｖ．軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、及び３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む群、
    ｖ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、及び２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、及び３２のアミノ酸配列を含む群、
    ｖｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７、２８、及び２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３４、及び３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む群、
    ｖｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、及び２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、及び３２のアミノ酸配列を含む群、
    ｖｉｉｉ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４３、２８、及び２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３３、及び３２のアミノ酸配
    列を含む群、又は、
    ｉｘ．重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含み、前記重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４４、２８、及び２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３０、３１、及び３２のアミノ酸配列を含む群、を含む請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  5. 前記第１抗原結合フラグメントはトラスツズマブの重鎖可変領域又はその突然変異体と、トラスツズマブの軽鎖可変領域又はその変異体とを含み、前記重鎖可変領域の突然変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＫ３０Ｅ突然変異を含み、軽鎖可変領域の突然変異体はＫａｂａｔ番号付けシステム基準のＦ５３Ｙ突然変異を含む請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  6. 前記第１抗原結合フラグメントは、
    ｉ．重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１及び４２のアミノ酸配列を含む第１抗原結合フラグメント、
    ｉｉ．重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４１及び４２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１抗原結合フラグメント、
    ｉｉｉ．重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５及び３６のアミノ酸配列を含む第１抗原結合フラグメント、
    ｉｖ．重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３５及び３９のアミノ酸配列を含む第１抗原結合フラグメント、又は、
    ｖ．重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４０及び３６のアミノ酸配列を含む第１抗原結合フラグメントから選ばれる請求項４又は５に記載の抗原結合構築物。
  7. 前記第１抗原結合フラグメントのＶＨとＶＬは、Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－リンカー－ＶＬの順に配列される請求項１～６のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  8. 一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ２抗原に特異的に結合する第２抗原結合フラグメントをさらに含む請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  9. 前記第２抗原結合フラグメントはＦａｂである請求項８に記載の抗原結合構築物。
  10. 前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖ＣＤＲ１と、重鎖ＣＤＲ２と、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖ＣＤＲ１と、軽鎖ＣＤＲ２と、軽鎖ＣＤＲ３とを含む請求項８又は９に記載の抗原結合構築物。
  11. 前記第２抗原結合フラグメントはペルツズマブの重鎖可変領域とペルツズマブの軽鎖可変領域とを含む請求項８又は９に記載の抗原結合構築物。
  12. 第１抗原結合フラグメント又は／及び第２抗原結合フラグメントに作動可能に接続された免疫グロブリンドメインを含み、前記免疫グロブリンドメインは、ｉ．ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の１つ若しくは複数、又は、ｉｉ．Ｆｃを含む請求項８～１１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  13. 前記ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＦｃはそれぞれヒトＩｇＧのＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｆｃから誘導される請求項１２に記載の抗原結合構築物。
  14. 前記ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＦｃは修飾を有し又は修飾を有さず、好ましくは、前記ＣＨ３又はＦｃが有する修飾は、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム基準の第４３５位又は／及び第４３６位のアミノ酸の置換である請求項１２に記載の抗原結合構築物。
  15. 前記Ｆｃは第１Ｆｃポリペプチドと第２Ｆｃポリペプチドとを含む二量体Ｆｃであり、第１抗原結合フラグメントは第１Ｆｃポリペプチドに作動可能に接続され、第２抗原結合フラグメントは第２Ｆｃポリペプチドに作動可能に接続されている請求項１２に記載の抗原結合構築物。
  16. 二重特異性抗体又は多重特異性抗体である請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  17. 二価又は多価である請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  18. 一価、二価又は多価の単一特異性抗体である請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  19. ｉ．配列番号１１を含む重鎖と、配列番号１３を含む重鎖と、配列番号１５を含む軽鎖とを含む二価の二重特異性抗体と、
    ｉｉ．配列番号２１を含む重鎖と、配列番号１３を含む重鎖と、配列番号１５を含む軽鎖とを含む二価の二重特異性抗体と、
    ｉｉｉ．配列番号２３を含む重鎖と、配列番号１３を含む重鎖と、配列番号１５を含む軽鎖とを含む二価の二重特異性抗体と、
    ｉｖ．配列番号３のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体と、
    ｖ．配列番号９のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体と、
    ｖｉ．配列番号５１のアミノ酸配列を含む二価の単一特異性抗体とからなる群から選ばれる請求項１に記載の抗原結合構築物。
  20. 第３０位がＥではなく又は／且つ第５３位がＹではない抗原結合構築物と比べて低減している凝集性を有し、又は／且つ、第３０位がＥではなく又は／且つ第５３位がＹではない抗原結合構築物と比べてＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原又は／及びＥＣＤ２抗原に対する結合親和性が明らかに低減されていない請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  21. 脱フコシル化されている請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗原結合構築物。
  22. 請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  23. 請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物の少なくとも１つの抗原結合フラグメントをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む分離された核酸又は分離された核酸集合。
  24. 請求項２３に記載の核酸又は核酸集合の１つ又は複数を含むベクター又はベクター集合。
  25. 請求項２３に記載の核酸若しくは核酸集合、又は請求項２４に記載のベクター若しくはベクター集合を含む分離された細胞。
  26. 前記抗原結合構築物の発現に適する条件において宿主細胞を培養することであって、前記宿主細胞は前記抗原結合構築物をコードする核酸、又は請求項２４に記載のベクター若しくはベクター集合を含むことと、前記構築物を精製することとを含む請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物の製造方法。
  27. 対象者に、治療有効量の請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合構築物又は請求項２２に記載の医薬組成物を投与することを含むＨＥＲ２発現腫瘍を有している対象者の治療方法。
  28. 腫瘍細胞を前記抗原結合構築物に接触させることにより、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞を死滅させ又はＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長を阻害することを含む請求項２７に記載の方法。
  29. 腫瘍は胆道がん、がん肉腫、食道がん、食道胃接合部がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮がん、悪性黒色腫、咽頭がん、口腔がん又は皮膚がんである請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 細胞に有効量の前記抗原結合構築物又は前記医薬組成物を投与することにより、細胞におけるＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、低減又は遮断することを含む請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 抗原結合構築物の凝集耐性を増強させる方法であって、前記抗原結合構築物は一価で且つＨＥＲ２発現細胞におけるＨＥＲ２のＥＣＤ４抗原に特異的に結合する第１抗原結合フラグメントを含み、前記第１抗原結合フラグメントはｓｃＦｖであり
    前記第１抗原結合フラグメントの重鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置３０におけるアミノ酸突然変異を含み、突然変異後のアミノ酸がＥであり、又は／且つ、前記第１抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域がＫａｂａｔ番号付けシステム基準の位置５３におけるアミノ酸突然変異を含み、突然変異後のアミノ酸がＹであるように、前記抗原結合構築物を修飾することを含む前記方法。
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