TW202142570A - 靶向her2的抗原結合建構體及用途 - Google Patents

靶向her2的抗原結合建構體及用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202142570A
TW202142570A TW110115652A TW110115652A TW202142570A TW 202142570 A TW202142570 A TW 202142570A TW 110115652 A TW110115652 A TW 110115652A TW 110115652 A TW110115652 A TW 110115652A TW 202142570 A TW202142570 A TW 202142570A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antigen
heavy chain
ser
light chain
gly
Prior art date
Application number
TW110115652A
Other languages
English (en)
Inventor
張兵
趙偉
杜敏
陸亞敏
馬毅敏
杜秀貞
魯娜
馬招兄
張喜全
Original Assignee
大陸商正大天晴藥業集團股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商正大天晴藥業集團股份有限公司 filed Critical 大陸商正大天晴藥業集團股份有限公司
Publication of TW202142570A publication Critical patent/TW202142570A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本發明公開了一種靶向HER2的抗原結合建構體及用途。具體地提供了抗原結合建構體、編碼它們的核酸、包含該核酸的載體、包含該載體的細胞、包含它們的藥物組合物，還提供了其治療患有HER2表達腫瘤的受試者、殺傷HER2表達腫瘤細胞或抑制HER2表達腫瘤細胞生長等方面的用途。

Description

靶向HER2的抗原結合建構體及用途
本發明涉及抗原結合建構體，具體的涉及靶向HER2的抗原結合建構體及用途。
Her2（human epidermal growth factor receptor 2，人類表皮生長因子受體2），也稱為ErbB-2（Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2），是人類表皮生長因子受體（HER/EGFR/ERBB）家族的成員，該家族包括EGFR（ErbB-1）、Her2/c-neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）和Her4（ErbB-4）。Her2蛋白具有細胞外配體結合結構域（domain I-IV)、跨膜結構域和細胞內結構域。Her2的配體未知。Her2與其它三種受體（ErbB-1、ErbB-3、ErbB-4）的任何一種形成異源二聚體，二聚化導致受體胞質結構域內酪胺酸殘基的自磷酸化，並激活多種信號通路，包括MAPK（mitogen-activated protein kinase）、PI3K/Akt（phosphoinositide 3-kinase）、PKC（protein kinase C）、STAT（Signal transducer and activator of transcription）。Her2基因的擴增或過表達在某些侵襲性乳腺癌的發生和發展中起重要作用，15%~30%乳腺癌患者中為Her2陽性，Her2是乳腺癌患者重要生物標誌物和治療靶標。此外，7%~34%的胃癌患者Her2過表達、30%的涎腺導管癌Her2過表達。
治療Her2陽性腫瘤的多款靶向Her2抗體藥物已經上市，包括靶向Her2胞外結構域IV（ECD4）的羅氏單抗藥物Herceptin®，靶向Her2胞外結構域II（ECD2）的羅氏Perjeta®，以及羅氏ADC藥物T-DM1®（ado-trastuzumab memtansine）。這些單抗藥物的作用機理包括：1）下調Her2信號，2）結合Her2形成信號傳導異源二聚體的表位，3）內吞Her2，4）單抗的ADCC（antibody dependent cellular cytotoxicity，抗體依賴的細胞毒性作用）。單特異性靶向不針對在信號傳導和發病機制中可能有關的其它靶表位，允許藥物抗性和逃避機制。
抗體的聚集將帶來表達和/或純化、免疫原性、毒性、降解、親合力受損、或儲存之後失去活性等方面的困難。因此，在工業應用中，降低抗體的聚集是需要的。對於scFv，其是單鏈分子，更易聚集，可聚集形成二聚體（Diabody）、三聚體（triabody）和四聚體（tetrabody）。
本發明提供了抗原結合建構體，降低了抗原結合建構體的聚集。本發明還提供了抗原結合建構體的用途。
一方面，本發明提供了一種抗原結合建構體，其包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，優選地，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，優選地，突變後的胺基酸為Y。
或者，本發明提供了一種抗原結合建構體，其包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸為K或E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸為F或Y；但是所述第一抗原結合片段的重鏈可變區的根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸為K時，所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區的根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸不為F。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。在一些具體的實施方案中，所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變。在另一些具體的實施方案中，所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變，並且所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含選自以下的CDR的組： i. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列； ii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； iii. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列； iv. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； v. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列； vi. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； vii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列； viii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、33和32的胺基酸序列；或 ix. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：44、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列。
其中SEQ ID NO：27所示序列為GFNIX2 DTYIH，X2 為K或E；SEQ ID NO：34所示序列為SASX1 LYS，X1 為F或Y。
在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含曲妥珠單抗的重鏈可變區或其突變體，以及曲妥珠單抗的輕鏈可變區或其突變體，所述重鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的K30E突變，輕鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段選自： i. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列； ii. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含與分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； iii. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和36的胺基酸序列； iv. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和39的胺基酸序列；或 v. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：40和36的胺基酸序列； 其中，SEQ ID NO：41所示序列為： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIX2 DTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS，X2 為K或E； SEQ ID NO：42所示序列為： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASX1 LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK，X1 為F或Y。
在一些實施方案中，本文所述的抗原結合建構體還包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原的第二抗原結合片段。在一些實施方案中，所述的第二抗原結合片段為Fab。在一些實施方案中，所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。在一些實施方案中，所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈可變區和帕妥珠單抗的輕鏈可變區。
在一方面，本發明提供了藥物組合物，其包含根據本文所述的抗原結合建構體和藥學上可接受的載體。
在一方面，本發明提供了分離的核酸或分離的核酸集合，其包含編碼根據本文所述的抗原結合建構體的至少一個抗原結合片段的至少一個核酸序列。
在一方面，本發明提供了載體或載體集合，其包含本文所述的核酸或核酸集合中的一種或多種。
在一方面，本發明提供了分離的細胞，其包含根據本文所述的核酸或核酸集合，或根據本文所述的載體或載體集合。
在一方面，本發明提供了製備本文所述的抗原結合建構體的方法，其包括在適於表達所述抗原結合建構體的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含編碼根據本文所述的抗原結合建構體的核酸、或者根據本文所述的載體或載體集合；並且純化所述建構體。
另一方面，本發明提供了治療患有HER2表達腫瘤的受試者的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的根據本文所述的抗原結合建構體或根據本文所述的藥物組合物。
另一方面，本發明提供了殺傷HER2表達腫瘤細胞或抑制HER2表達腫瘤細胞生長的方法，其包括使所述腫瘤細胞與根據本文所述的抗原結合建構體接觸。
另一方面，本發明提供了抑制、減少或阻斷細胞中的HER2信號傳導的方法，其包括向所述細胞施用有效量的根據本文所述的抗原結合建構體或根據本文所述的藥物組合物。
另一方面，本發明提供了檢測或測量樣品中的HER2的方法，其包括使所述樣品與根據本文所述的抗原結合建構體接觸並且檢測或測量結合複合物。
又一方面，本發明提供了增强抗原結合建構體的聚集抗性的方法，其中，所述抗原結合建構體包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述方法包括：對抗原結合建構體進行修飾，使得所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為Y。
術語
術語“抗原結合建構體”是指能夠與抗原結合的任何試劑，如多肽或多肽複合物。在一些方面，抗原結合建構體是與目標抗原特異性結合的多肽。抗原結合建構體可以是單體、二聚體、多聚體、蛋白質、肽、或蛋白質或肽複合物；抗體或其抗原結合部分；scFv等。抗原結合建構體可以是單特異性、雙特異性或多特異性的多肽建構體。在一些方面，抗原結合建構體可包括例如與一個或多個Fc連接的一個或多個抗原結合組分（例如，Fab或scFv）。在下面描述並且在實施例中提供了抗原結合建構體的其它實例。
術語“雙特異性”旨在說明任何試劑例如抗原結合建構體包括具有兩個抗原結合部分（例如抗原結合片段），所述部分各自具有獨特結合特異性。例如，第一抗原結合片段與第一抗原上的表位結合，而第二抗原結合片段與第二抗原上的表位結合。又例如，第一抗原結合片段、第二抗原結合片段分別與同種抗原的不同表位相結合。
“抗體”以其最廣義使用，特別涵蓋完整的單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、多功能抗體以及抗體片段，只要它們具有所需的生物學活性。
術語“可變區”是指抗體的輕鏈或重鏈的N端結構域限定的約100至110個或更多個胺基酸的主要負責抗原識別的結構域。術語輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH）分別指這些輕鏈和重鏈結構域。
術語“CDR”（互補決定區），也稱為“高變區”，是指在序列上高度可變和/或形成結構限定的環的抗體可變結構域的每個區域。天然四鏈抗體通常包含六個CDR，三個在重鏈可變區中，三個在輕鏈可變區中。
術語“Fab”是指含有輕鏈的恆定結構域（CL）和重鏈的第一恆定結構域（CH1）連同分別在輕鏈和重鏈上的可變結構域VL（輕鏈可變區）和VH（重鏈可變區）。可變結構域包含參與抗原結合的互補決定區（CDR）。
術語“scFv”包括抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於單一多肽鏈中。在一些實施方案中，scFv還包含介於VH和VL結構域之間的多肽接頭，其使得scFv能夠形成抗原結合所需的結構。
術語“ECD”為胞外結構域。HER2的胞外結構域包括四個結構域，分別為ECD1、ECD2、ECD3和ECD4。
“曲妥珠單抗”（通用名Trastuzumab）是一種重組的人源化單株抗體，選擇性地作用於人表皮生長因子受體-2（HER2）的ECD4，可以用於治療HER2陽性的癌症，其一個實例是以商品名HERCEPTIN®上市的治療性單株抗體產品。
“帕妥珠單抗”（通用名Pertuzumab）是一種重組的人源化單株抗體，選擇性地作用於人表皮生長因子受體-2（HER2）的ECD2，可以用於治療HER2陽性的癌症。
術語“HER2”是EGFR家族的第二個成員，具有酪胺酸激酶活性。
術語“可操作地連接”是指兩個或更多個肽或多肽結構域或核酸（例如，DNA）區段之間的功能連接關係。在蛋白、抗體或其他多肽的上下文中，術語“可操作地連接”是指兩個或更多個胺基酸區段被連接以便產生功能性多肽。
術語“EC50”是指有效濃度，引起抗原結合建構體的50%最大應答。如本文所用，術語“IC50”是指抑制濃度，引起抗原結合建構體的50%最大應答。EC50和IC50兩者均可以通過ELISA或FACS分析或本領域已知的任何其它方法進行測量。
術語“KD”在用於本文時指平衡解離常數，以莫耳濃度（M）表示。抗原結合建構體的KD值可以使用本領域公知的方法測定。一種優選的測定抗原結合建構體KD的方法是使用表面電漿子共振（surface plasmon resonance），更優選使用生物感測器系統，例如Biacore系統。
術語“治療”是指為了以統計學顯著的方式治療、治愈、減輕、緩解、改變、補救、改善、改進或影響疾患（例如疾病）、疾患的症狀，或預防或延緩症狀、併發症、生化指標的發作，或以其它方式阻滯或抑制疾病、疾患或病症的進一步發展而使用措施。
術語“治療有效量”是指向受試者提供治療性和/或預防性益處所必需的抗原結合建構體或組合物的量。
術語“受試者”包括任何人類或非人動物。術語“非人動物”包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類、綿羊、犬、猫、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。優選地，根據本發明的受試者是人。除非標明，術語“患者”或“受試者”可以互換使用。
如本文所用，“約”表示在本領域具有通常知識者判定的對特定值可以接受的誤差範圍內，其部分取決於如何測量或測定該值，即測量系統的限制。例如，“約”按照本領域實踐可表示1倍或超過1倍標準偏差以內。或者，“約”可以表示多至5%（即±5%）的範圍，例如在所給定的具體數值範圍±2%範圍內、±1%範圍內或±0.5%範圍內波動。當本申請或申請專利範圍中給出特定值時，除非另有說明，“約”的含義應認為是在該特定值的可接受的誤差範圍內。
術語“同一性（identity）”，也稱一致性。兩序列間的百分比同一性為序列共有的相同位置數的函數（即%同一性=相同位置數/位置總數×100），其中需考慮產生兩序列的最優比對需要引入的缺口數和每個缺口的長度。如下述非限制性實施例所示，可以使用數學算法完成序列的比較和兩序列間百分比同一性的測定。可以使用E.Meyers和W.Miller的算法（Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988)）測定兩胺基酸序列間的百分比同一性，該算法已收入到ALIGN程序（版本2.0）中，其使用PAM120殘基權重表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4。此外，可以使用Needleman和Wunsch的算法（J. Mol.Biol. 484-453(1970)）測定兩胺基酸序列的百分比同一性，該算法已摻入到GCG軟件包（可在www.gcg.com獲得）中的GAP程序中，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。
術語“Xn”和“Xaa”等同，是指未指定的胺基酸（Unspecified Amino Acid），通過相關表述中的後續定義來指定其涵蓋的範圍。
在本文中，除非另有說明，術語“包括”或其等同物（例如含有、包含等）為開放式術語，表示包括但不限於所指明的要素、步驟或者組成，而是對於未指明的要素、步驟或者組成是開放的。
在本文中，除非另有說明，否則單數術語涵蓋複數的指代物，反之亦然。
為了描述和公開的目的，以引用的方式將所有的專利、專利申請和其它已確定的出版物在此明確地併入本文。這些出版物僅因為它們的公開早於本申請的申請日而提供。所有關於這些文件的日期的聲明或這些文件的內容的表述是基於申請者可得的信息，並且不構成任何關於這些文件的日期或這些文件的內容的正確性的承認。而且，在任何國家，在本文中對這些出版物的任何引用並不構成關於該出版物成為本領域的公知常識的一部分的認可。本發明的各個方面將在下述分部中進一步詳細描述。
抗原結合建構體
本發明提供了抗原結合建構體，其包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變（在一些實例中，位置30處的突變後的胺基酸為E），或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變（在一些實例中，位置53處的突變後的胺基酸為Y）。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體還包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原的第二抗原結合片段。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體包含與第一抗原結合片段或/和第二抗原結合片段可操作地連接的免疫球蛋白功能域，例如抗體的CL區、CH1區、CH2區、和/或CH3區中的一個或多個。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體包含與第一抗原結合片段或/和第二抗原結合片段可操作地連接的恆定區。所述恆定區可以是免疫球蛋白天然序列恆定區或突變的恆定區，例如天然的或突變的CL、CH1、CH2、和/或CH3功能域中的一個或多個，在一些實例中，這些功能域通過本領域常規的方式可操作地連接。恆定區可以源自人免疫球蛋白的恆定區，如源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實例中，恆定區可以具有修飾以改善其介導效應子功能的能力。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體包含與第一抗原結合片段或/和第二抗原結合片段可操作地連接的免疫球蛋白功能域或骨架（skeleton），例如Fc。該術語Fc包括天然序列Fc區和變體Fc區。Fc可以是人Fc，如源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。Fc可以具有修飾以改善其介導效應子功能的能力，例如，在一些實施方案中，所述骨架具有修飾如knob into hole、H435R、Y436F、去岩藻糖等。
本文提供的抗原結合建構體可以是單價的、二價的或多價的；可以是單特異性的、雙特異性的、或多特異性的。在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是抗體。
意外的發現，在抗原結合建構體的scFV形式的第一抗原結合片段的可變區引入突變，可以降低抗原結合建構體的聚集。這些突變例如可以是將第一抗原結合片段的重鏈可變區的30位（Kabat編號）胺基酸突變為帶負電的麩胺酸（E），或者將第一抗原結合片段的輕鏈可變區的53位（Kabat編號）胺基酸突變為不帶電荷的酪胺酸（Y），或者同時引入這兩個突變。另外，發明人發現直接將原始未突變（第30位非E或/和第53位為非Y）的scFV形式的第一抗原結合片段構建雙特異性抗原結合建構體，會將其不期望的聚集性能賦予雙特性抗原結合建構體，而在scFV中引入本文所述的突變後，構建的雙特異性抗體展現了優異的抗聚集性。在一些實施方案中，突變的引入並未顯著降低抗原結合建構體（例如單特異性、雙特異性的抗原結合建構體）對HER2抗原的親和力。在一些實施方案中，抗原結合建構體對HER2抗原具有良好的親和力。在一些實施方案中，雙特異性抗原結合建構體（23C2 Her2-2等）展現了比曲妥珠單抗與帕妥珠單抗對抗原Her2更高的結合親和力。在一些實施方案中，抗原結合建構體對Her2抗原的KD為約1E-8M或更小、約1E-9M或更小、約6.11E-10M或更小、約1E-11M或更小、或約1E-11M或更小。在一些實施方案中，Her2抗原為人Her2抗原。在一些實施方案中，通過Biacore來測量本文提供的抗原結合建構體的結合親和力KD。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體還展現了優異的抗腫瘤性能例如殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤生長等。在一些實施方案中，本文構建的抗原結合建構體對多種腫瘤細胞、多種HER2不同表達水平的細胞展現了良好的殺傷性。例如，一些抗原結合建構體對BT474（Her2+++）腫瘤細胞展現了良好的殺傷性；一些抗原結合建構體對NCI-N87（Her2++）腫瘤細胞展現了良好的殺傷性；一些抗原結合建構體對曲妥珠抗性的腫瘤細胞（例如JIMT-1）展現了良好的殺傷性；還有一些抗原結合建構體對Her2低表達的腫瘤細胞（例如MCF-7 Her2 0/+）展現了良好的殺傷性。
在一些實施方案中，通過小鼠模型實驗發現，本文的抗原結合建構體沒有明顯的毒性作用。
雙特異性抗原結合建構體
本文提供了結合HER2的雙特異性抗原結合建構體。雙特異性抗原結合建構體包括兩個抗原結合片段，其各自與HER2的特定結構域或表位結合。
本文提供的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，和單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原的第二抗原結合片段；
其中，所述第一抗原結合片段為scFv；所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為Y。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為E。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為Y。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為E；以及所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為Y。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變前的胺基酸為非E；在一些方案中，該突變前的胺基酸為K，也就是說，在一些方案中，所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變前的胺基酸為非Y；在一些方案中，該突變前的胺基酸為F，也就是說，在一些方案中，所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，所述的第一抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性、至少81%同一性、至少82%同一性、至少83%同一性、至少84%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性的胺基酸序列。在一些具體的實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，所述的第一抗原結合片段包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性、至少81%同一性、至少82%同一性、至少83%同一性、至少84%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性的胺基酸序列。在一些具體的實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，其中所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性、至少81%同一性、至少82%同一性、至少83%同一性、至少84%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性、至少81%同一性、至少82%同一性、至少83%同一性、至少84%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列。在一些實例中，所述的第一抗原結合片段包含分別根據SEQ ID NOs：43、28、29、30、31和32的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。在一些實例中，所述的第一抗原結合片段包含分別根據SEQ ID NOs：43、28、29、30、33和32的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。在一些實例中，所述的第一抗原結合片段包含分別根據SEQ ID NOs：44、28、29、30、31和32的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含曲妥珠單抗的重鏈可變區的突變體和曲妥珠單抗的輕鏈可變區，所述重鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的K30E突變。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含曲妥珠單抗的重鏈可變區和曲妥珠單抗的輕鏈可變區的突變體，所述輕鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含曲妥珠單抗的重鏈可變區的突變體和曲妥珠單抗的輕鏈可變區的突變體，所述重鏈可變區的突變體包含K30E突變，並且輕鏈可變區的突變體包含F53Y突變。
第一抗原結合片段為scFV，包含重鏈可變區和輕鏈可變區，在一些實施方案中，所述重鏈可變區為所述曲妥珠單抗的重鏈可變區或其突變體，所述輕鏈可變區為所述曲妥珠單抗的輕鏈可變區或其突變體。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，所述的第一抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區包含與分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性或至少99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含本文任一上述的CDR區序列特徵。在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和36的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和39的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：40和36的胺基酸序列。
在一些實施方案中，第一抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區之間通過接頭（linker）連接，形成scFV。接頭可以採用任何適宜的、例如帶電的和/或柔性的接頭。在具體的實施方案中，接頭由通過肽鍵連接的1到50個胺基酸組成，其中所述胺基酸可以選自20個天然存在的胺基酸；在更優選的實施方案中，1到50個胺基酸選自甘胺酸、丙胺酸、脯銨酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸和離胺酸；甚至更優選的，接頭由大部分空間上不受阻礙的胺基酸（諸如甘胺酸和丙胺酸）組成。特別有用的柔性接頭是(GGGGS)n（也稱作(G4S)n)。在一些實施方案中，n是1-10之間的任意數，即1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或由前述數字中的任意兩個限定的任何範圍，例如1-5、2-5、3-6、2-4、1-4等等。在一些具體實施方案中，所述接頭含有序列為GGSGGSGGSGGSGG（SEQ ID NO：52）的柔性連接肽。在一些具體實施方案中，所述接頭含有序列為GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO：53）的柔性連接肽。在一些具體實施方式中，所述接頭含有序列為GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO：54）的柔性連接肽。在一些具體實施方案中，所述接頭含有序列為GGGPGKR（SEQ ID NO：55）的柔性連接肽。其它合適的接頭的例子還包括專利申請WO2019195535的表4所公開的那些。
在一些實施方案中，本文所述的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段的VH和VL從N-末端到C-末端按照如下順序排列：VH-linker-VL。在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段的VH和VL從N-末端到C-末端按照如下順序排列：VL-linker-VH。
在一些實施方案中，本文所述的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，其中所述的第二抗原結合片段為Fab。第二抗原結合片段特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原。
在一些實施方案中，所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3。在一些實施方案中，所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。在一些實施方案中，所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。帕妥珠單抗的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3的胺基酸序列依次分別為：GFTFTDYTMD（SEQ ID NO：45）、DVNPNSGGSIYNQRFKG（SEQ ID NO：46）、NLGPSFYFDY（SEQ ID NO：47）、KASQDVSIGVA（SEQ ID NO：48）、SASYRYT（SEQ ID NO：49）、QQYYIYPYT（SEQ ID NO：50）。
在一些實施方案中，所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施方案中，所述第二抗原結合片段為帕妥珠單抗的Fab片段。所述帕妥珠單抗的重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：37所示，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：38所示。
在一些實施方案中，本文所述的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，包含恆定區。在一些實施方案中，所述恆定區通過接頭與第一抗原結合片段和第二抗原結合片段連接。在一些實施方案中，恆定區直接與第一抗原結合片段和第二抗原結合片段連接。
在一些實施方案中，本文所述的抗原結合建構體是雙特異性抗原結合建構體，包含骨架（skeleton）。在一些實施方案中，所述骨架通過接頭多肽（例如選自IgG1、IgG2或IgG4鉸鏈區的免疫球蛋白鉸鏈區多肽）與第一抗原結合片段和第二抗原結合片段連接。在一些實施方案中，骨架直接與第一抗原結合片段和第二抗原結合片段連接。
在一些實施方案中，所述骨架為包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚Fc。本文的Fc用於定義含恆定區的至少一個部分的免疫球蛋白重鏈的C端區域，二聚Fc的Fc多肽是指形成二聚Fc結構域的兩個多肽之一，即包含免疫球蛋白重鏈的C端恆定區，能夠穩定自我締合的多肽。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統。例如，二聚IgG Fc的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恆定結構域序列。CH3結構域包含兩個CH3序列，分別來自於第一Fc多肽和第二Fc多肽，CH2結構域包含兩個CH2序列，分別來自於第一Fc多肽和第二Fc多肽。在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段與第一Fc多肽可操作地連接，第二抗原結合片段與第二Fc多肽可操作地連接。在一些實施方案中，第一抗原結合片段與第一Fc多肽之間通過第一多肽接頭可操作地連接，第二抗原結合片段與第二Fc多肽之間通過第二多肽接頭可操作地連接。所述第一接頭多肽和第二接頭多肽能夠相互形成共價鍵，例如二硫鍵。在一些實施方案中，第一接頭多肽或/和第二接頭多肽包含IgG1的鉸鏈區；在一些實施方案中，第一接頭多肽或/和第二接頭多肽包含IgG2的鉸鏈區；在一些實施方案中，第一接頭多肽或/和第二接頭多肽包含IgG3的鉸鏈區；在一些實施方案中，第一接頭多肽或/和第二接頭多肽包含IgG4的鉸鏈區。
在一些實施方案中，所述的二聚Fc為人IgG1的Fc。在一些實施方案中，所述的二聚Fc為人IgG4的Fc。
在一些實施方案中，所述的二聚Fc具有修飾。在一些實施方案中，二聚Fc具有H435R或/和Y436F，該修飾可以處於第一Fc多肽、第二Fc多肽的任意一條多肽鏈上。在一些具體實施方案中，二聚Fc具有H435R或/和Y436F，該修飾僅發生在一條Fc多肽上，而不發生在另一條Fc多肽上。在一些實施方案中，二聚Fc具有knob-into-hole的突變位點，例如Y349C、T366S、L368A、Y407V、S354C和T366W等。在一些實施方案中，二聚Fc的一條鏈具有T366Y/W或/和S354C，且另一條鏈具有Y407T/V、Y349C、T366S或/和L368A。
在一些實施方案中，二聚Fc不含岩藻糖。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體經糖基化。
在一些實施方案中，本文的抗原結合建構體無岩藻糖基化。通過去岩藻糖基化可以提高IgG1與 FcgRIIIa的相互作用，進而增强抗體的ADCC作用。生成在Fc糖基化位點上具有很少或沒有岩藻糖的抗原結合建構體，而不改變胺基酸序列的方法在本領域是已知的，例如調整表達細胞所處培養基的成分，或者敲除表達細胞的岩藻糖表達相關基因如FUT8。
在一些實施方案中，本文提供的雙特異性抗原結合建構體是二價的。
表S1示例性的提供了雙特性抗原結合建構體。在一些實施方案中，本文的雙特異性抗原結合建構體是雙特異性抗體。表S2示例性的提供了雙特異性抗體，例如Expi Her2-2、Expi Her2-3、Expi Her2-4、23C-HER2-2、23C-HER2-3、23C-HER2-4，CDR區及可變區的序列提供於表S2中。示例性的雙特性抗體包含兩條重鏈和一條輕鏈，Expi Her2-2、23C-HER2-2的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13所示，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示；Expi Her2-3、23C-HER2-3的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：13所示，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示；Expi Her2-4、23C-HER2-4的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：13所示，輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
本文還提供了一些ADCC增强的雙特異性抗原結合建構體。本文提供了示例性的ADCC增强的雙特異性抗體例如23C-HER2-2、23C-HER2-3、23C-HER2-4。
表S1：示例性雙特異性抗原結合建構體
名稱 說明 第一抗原結合片段 第二抗原結合片段
/ 含表位的結構域 ECD4 ECD2
形式 scFV Fab
原始序列 曲妥珠單抗 帕妥珠單抗
1 序列取代 VL：F53Y /
2 序列取代 VH：K30E /
3 序列取代 VL：F53Y VH：K30E /
表S2：示例性雙特異性抗體的CDR及可變區序列
名稱   說明 胺基酸序列
Expi Her2-2/ 23C-HER2-2 第一抗原結合片段(scFV) 重鏈CDR1 GFNIEDTYIH (SEQ ID NO：43)
重鏈CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (SEQ ID NO：28)
重鏈CDR3 WGGDGFYAMDYW (SEQ ID NO：29)
重鏈可變區 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：35)
輕鏈CDR1 CRASQDVNTAVAW (SEQ ID NO：30)
輕鏈CDR2 SASYLYS (SEQ ID NO：31)
輕鏈CDR3 QQHYTTPPT (SEQ ID NO：32)
輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：36)
第二抗原結合片段(Fab) 重鏈可變區 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：37)
輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：38)
Expi Her2-3/ 23C-HER2-3 第一抗原結合片段(scFV) 重鏈CDR1 GFNIEDTYIH (SEQ ID NO：43)
重鏈CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (SEQ ID NO：28)
重鏈CDR3 WGGDGFYAMDYW (SEQ ID NO：29)
重鏈可變區 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：35)
輕鏈CDR1 CRASQDVNTAVAW (SEQ ID NO：30)
輕鏈CDR2 SASFLYS (SEQ ID NO：33)
輕鏈CDR3 QQHYTTPPT (SEQ ID NO：32)
輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：39)
第二抗原結合片段(Fab) 重鏈可變區 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：37)
輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：38)
Expi Her2-4/ 23C-HER2-4 第一抗原結合片段(scFV) 重鏈CDR1 GFNIKDTYIH (SEQ ID NO：44)
重鏈CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (SEQ ID NO：28)
重鏈CDR3 WGGDGFYAMDYW (SEQ ID NO：29)
重鏈可變區 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：40)
輕鏈CDR1 CRASQDVNTAVAW (SEQ ID NO：30)
輕鏈CDR2 SASYLYS (SEQ ID NO：31)
輕鏈CDR3 QQHYTTPPT (SEQ ID NO：32)
輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：36)
第二抗原結合片段(Fab) 重鏈可變區 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：37)
輕鏈可變區 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO：38)
單特異性抗原結合建構體
單特異性抗原結合建構體是指具有一種結合特異性的抗原結合建構體。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是單特異性抗原結合建構體，其為單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，其中，所述第一抗原結合片段為scFv；所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為Y。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是單特異性抗原結合建構體，其是二價的，包含兩個所述單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是單特異性抗原結合建構體，其第一抗原結合片段可採用本文上述的雙特異性抗原結合建構體的第一抗原結合片段的序列特徵。
在一些實施方案中，本文提供的抗原結合建構體是單特異性抗原結合建構體，其是二價的，包含與第一抗原結合片段可操作地連接的Fc。在一些實施方案中，Fc為人IgG1的Fc。
在一些實施方案中，所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列。
組合物
本文提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含抗原結合建構體，或編碼所述抗原結合建構體的核酸，並且還包含一種或多種藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，組合物包括雙特異性抗體例如Expi Her2-2、Expi Her2-3、Expi Her2-4、23C-HER2-2、23C-HER2-3、23C-HER2-4中的一種或多種，以及藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體包括例如賦形劑、稀釋劑、包封材料、填充劑、緩衝劑或其它試劑。
組合物中，抗原結合建構體可完全無岩藻糖基化（意味著其不含可檢測的岩藻糖）或其可部分無岩藻糖基化，在一些實施方案中，約20%或更少、約18%或更少、約16%或更少、約14%或更少、約12%或更少、約10%或更少、約8%或更少、約6%或更少、約5%或更少、約3%或更少、約2%或更少、約1.5%或更少、約1%或更少、約0.9%或更少、約0.8%或更少、約0.7%或更少、約0.6%或更少、約0.5%或更少、約0.4%或更少、約0.3%或更少、約0.2%或更少、約0.1%或更少或約0%的抗原結合建構體不含岩藻糖。在一些實施方案中，約0至約20%、約0至約18%、約0至約16%、約0至約14%、約0至約12%、約0至約10%、約0至約8%、約0至約6%、約0至約5%、約0至約3%、約0至約2%、約0至約1.5%、約0至約1%、約0至約0.9%、約0至約0.8%、約0至約0.7%、約0至約0.6%、約0至約0.5%、約0至約0.4%、約0至約0.3%、約0至約0.2%、約0至約0.1%、或約0.5%至約0.6%的抗原結合建構體不含岩藻糖。
分離的核酸
本文提供了分離的核酸或分離的核酸集合，其包含編碼本文所述抗原結合建構體的至少一個多肽的至少一個核酸序列。在一些實施方案中，所述核酸編碼本文所述抗原結合建構體的序列。在一些實施方案中，所述核酸可以編碼包含本文所述抗原結合建構體的第一抗原結合片段或/和第二抗原結合片段的胺基酸序列。在另一些實施方案中，所述的核酸可以編碼包含本文所述的抗原結合建構體重鏈或/和抗原結合建構體輕鏈的胺基酸序列。序列表中示例性的列舉了一些抗原結合建構體例如雙特異性抗體的抗原結合片段、抗原結合建構體重鏈和輕鏈的核酸序列。
載體
本發明提供了包含所述的分離的核酸或核酸集合中的一種或多種的載體或載體集合。在一些實施方案中，所述的載體為選殖載體；在另一些實施方案中，所述的載體為表達載體。
所述表達載體可選的為能夠表達本文所述抗原結合建構體的任意表達載體。
宿主細胞
在一些實施方案中，本文提供包含所述載體的宿主細胞，宿主細胞為用於選殖或編碼抗原結合建構體的適當宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞為原核細胞。在另一些實施方案中，宿主細胞為真核細胞。在一些實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳細胞或適用於製備抗原結合建構體的其它細胞。哺乳細胞例如為中國倉鼠（CHO）卵巢細胞、CHO-S細胞。
製備抗原結合建構體的方法
在一些實施方案中，本文提供了製備抗原結合建構體的方法，所述方法包括：在適合所述抗原結合建構體表達的條件下，培養包含編碼所述抗原結合建構體的核酸的宿主細胞，從所述宿主細胞或宿主細胞培養基中回收所述抗原結合建構體。為了產生所述的抗原結合建構體，分離編碼所述抗原結合建構體的核酸，並插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步選殖或/和表達。所述核酸可以採用基因拼接、化學合成、選殖等多種本領域所熟知的方法獲取。
用途
本文提供了抗原結合建構體的用途。在具體的實施方案中，使用的抗原結合建構體可以為Expi Her2-2、Expi Her2-3、Expi Her2-4、23C-HER2-2、23C-HER2-3、23C-HER2-4。
一些實施方案中，向受試者施用治療有效量的本文的抗原結合建構體，可以殺傷HER2表達腫瘤細胞或抑制HER2表達腫瘤細胞生長。一些實施方案中，本文提供了抗原結合建構體在製備殺傷HER2表達腫瘤細胞或抑制HER2表達腫瘤細胞生長的藥物中的用途。一些實施方案中，本文提供了用於殺傷HER2表達腫瘤細胞或抑制HER2表達腫瘤細胞生長中的抗原結合建構體。一些實施方案中，本發明提供了一種用於傷HER2表達腫瘤細胞或抑制HER2表達腫瘤細胞生長的治療劑，其包含本文所述的抗原結合建構體作為活性成分。
一些實施方案中，向受試者施用治療有效量的本文的抗原結合建構體，可以治療HER2表達腫瘤。需要治療的受試者包括那些已經患有疾病或病狀的受試者，處於發展出疾病或病狀的風險中的受試者，以及可能患疾病或病狀並且其目的是預防、延遲或減弱疾病或病狀的受試者。一些實施方案中，本文提供了所述的抗原結合建構體在製備治療患有HER2表達腫瘤的受試者的藥物中的用途。一些實施方案中，本文提供了用於治療HER2表達腫瘤中的抗原結合建構體。一些實施方案中，本文提供了一種用於治療HER2表達腫瘤的治療劑，其包含本文所述的抗原結合建構體作為活性成分。腫瘤的實例包括但不限於：膽道癌、癌肉瘤、食管癌、胃食管結合部癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、頭頸癌、結直腸癌、腎癌、宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮癌、惡性黑素瘤、咽癌、口腔癌或皮膚癌。
在某些實施方案中，如通過IHC測定，腫瘤為HER2 0-1+、1+、HER2 2+或HER2 3+。在一些實施方案中，腫瘤為HER2 2+或更低，或HER2 1+或更低。
一些實施方案中，向細胞施用有效量的抗原結合建構體，可以抑制、減少或阻斷細胞中的HER2信號傳導。一些實施方案中，本文提供了抗原結合建構體在製備抑制、減少或阻斷細胞中的HER2信號傳導的藥物中的應用。一些實施方案中，本文提供了用於抑制、減少或阻斷細胞中的HER2信號傳導中的抗原結合建構體。一些實施方案中，本文提供了一種用於抑制、減少或阻斷細胞中的HER2信號傳導的治療劑，其包含本文所述的抗原結合建構體作為活性成分。一些實施方案中，所述細胞為腫瘤細胞。
在一些實施方案中，提供了檢測或測量樣品中的HER2的方法，其包括使所述樣品與本文所述的抗原結合建構體接觸並且檢測或測量結合複合物。
增强抗原結合建構體的聚集抗性的方法
本文提供了增强抗原結合建構體的聚集抗性的方法，其中，所述抗原結合建構體包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述方法包括：對抗原結合建構體進行修飾，使得所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為Y。
在一些實施方案中，本文的所述抗原結合建構體還包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原的第二抗原結合片段；所述的第二抗原結合片段為Fab。在一些實施方案中，所述的第一抗原結合片段包含選自以下的CDR的組： i. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列； ii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少 80%同一性的胺基酸序列； iii. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2 和輕鏈CDR3包含分別根據 SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列； iv. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； v. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列； vi. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； vii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列； viii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、33和32的胺基酸序列；或 ix. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：44、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變前的胺基酸為非E；在一些方案中，該突變前的胺基酸為K，也就是說，在一些方案中，使所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變前的胺基酸為非Y；在一些方案中，該突變前的胺基酸為F，也就是說，在一些方案中，使所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
在一些實施方案中，對抗原結合建構體進行修飾，使所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變，使所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。在一些實施方案中，所述第一抗原結合片段為scFv並且包含曲妥珠單抗的重鏈可變區或其突變體和曲妥珠單抗的輕鏈可變區或其突變體，使所述重鏈可變區的突變體包含K30E突變，使所述輕鏈可變區的突變體包含F53Y突變。
在一些實施方案中，該方法還包括確認修飾的抗原結合建構體結合到HER2抗原的能力。在一些實施方案中，該方法還包括選擇結合到HER2抗原的修飾的抗原結合建構體。在一些實施方案中，抗原結合建構體的親和力（例如KD）高於或與未修飾的抗原結合建構體相當。
在一些實施方案中，該方法還包括選擇與未修飾的抗原結合建構體相比聚集趨勢降低的抗原結合建構體。
儘管為了清楚理解的目的，已經通過舉例說明和實施例相當詳細地描述了前述發明，但是根據本發明的教義，本領域具有通常知識者將顯而易見的是，可另外對本發明進行某些改變和修改而不背離所附申請專利範圍的精神和範圍。以下實施例僅以說明方式提供，而並不起限制作用。本領域具有通常知識者將容易地識別多種非關鍵性參數，所述參數可發生改變或修改以產生基本上類似的結果。
除非另外指出，否則本發明的實踐將採用本領域技術範圍內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術和藥理學的常規方法。文獻中全面地解釋了此類技術。參見，例如，T .E .Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W .H .Freeman和公司，1993)；A .L .Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，當前增加)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989年，第2版)；Methods In Enzymology(S .Colowick和N .Kaplan編輯，Academic Press，Inc.)；Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A和B卷(1992)。
本發明還提供了以下一些具體的實施方案，但本發明的保護範圍不限於此：
實施方案1. 一種抗原結合建構體，其包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，優選地，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，優選地，突變後的胺基酸為Y。
實施方案2. 根據實施方案1所述的抗原結合建構體，其中所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
實施方案3. 根據實施方案1或2所述的抗原結合建構體，其為抗體。
實施方案4. 根據實施方案1-3任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含選自以下的CDR的組： i .包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列； ii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； iii. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列； iv. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； v. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列； vi. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； vii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列； viii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、33和32的胺基酸序列；或 ix. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：44、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列。
實施方案5. 根據實施方案1-4任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含曲妥珠單抗的重鏈可變區或其突變體，以及曲妥珠單抗的輕鏈可變區或其突變體，所述重鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的K30E突變，輕鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
實施方案6. 根據實施方案4-5任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段選自： i. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列； ii. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含與分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； iii. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和36的胺基酸序列； iv. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和39的胺基酸序列；或 v. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：40和36的胺基酸序列。
實施方案7. 根據實施方案1-6任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段的VH和VL從N-末端到C-末端按照如下順序排列：VH-linker-VL。
實施方案8. 根據實施方案1-7任一項所述的抗原結合建構體，其中所述抗原結合建構體還包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原的第二抗原結合片段。
實施方案9. 根據實施方案8所述的抗原結合建構體，其中所述的第二抗原結合片段為Fab。
實施方案10. 根據實施方案8或9所述的抗原結合建構體，其中所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。
實施方案11. 根據實施方案8或9所述的抗原結合建構體，其中所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈可變區和帕妥珠單抗的輕鏈可變區。
實施方案12. 根據實施方案8-11任一項所述的抗原結合建構體，其中抗原結合建構體包含與第一抗原結合片段或/和第二抗原結合片段可操作地連接的免疫球蛋白功能域，所述免疫球蛋白功能域包含：i. CL，CH1，CH2，或CH3中的一個多幾個，或者ii. Fc。
實施方案13. 根據實施方案12所述的抗原結合建構體，其中所述CL、CH1、CH2、CH3、Fc分別衍生自人IgG的CL、CH1、CH2、CH3、Fc。
實施方案14. 根據實施方案12所述的抗原結合建構體，其中所述CL、CH1、CH2，CH3或Fc具有修飾或不具有修飾；優選，所述CH3或Fc具有的修飾例如是根據Kabat編號系統的第435或/和第436位胺基酸的取代。
實施方案15. 根據實施方案12所述的抗原結合建構體，其中所述Fc為包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚Fc，第一抗原結合片段與第一Fc多肽的可操作地連接，第二抗原結合片段與第二Fc多肽的可操作地連接。
實施方案16. 根據實施方案1-15任一項所述的抗原結合建構體，其中抗原結合建構體為雙特異性抗體或多特異性抗體。
實施方案17. 根據實施方案1-15任一項所述的抗原結合建構體，其是二價的或多價的。
實施方案18. 根據實施方案1-7任一項所述的抗原結合建構體，其中抗原結合建構體為單特異性抗體；其中所述的抗原結合建構體為單價的、二價的或多價的。
實施方案19. 根據實施方案1所述的抗原結合建構體，其選自下組： i. 所述抗原結合建構體為二價雙特異性抗體，其包含：包含SEQ ID NO：11的重鏈、包含SEQ ID NO：13的重鏈和包含SEQ ID NO：15的輕鏈； ii. 所述抗原結合建構體為二價雙特異性抗體，其包含：包含SEQ ID NO：21的重鏈、包含SEQ ID NO：13的重鏈和包含SEQ ID NO：15的輕鏈； iii. 所述抗原結合建構體為二價雙特異性抗體，其包含：包含SEQ ID NO：23的重鏈、包含SEQ ID NO:13的重鏈和包含SEQ ID NO：15的輕鏈； iv. 所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列； v. 所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；或 vi. 所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列。
實施方案20. 根據實施方案1-19任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的抗原結合建構體與第30位非E或/和第53位為非Y的抗原結合建構體相比具有降低的聚集性；或/和， 所述的抗原結合建構體與第30位非E或/和第53位為非Y的抗原結合建構體相比未顯著降低對HER2的ECD4抗原或/和ECD2抗原的結合親和力。
實施方案21. 根據實施方案1-20任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的抗原結合建構體是無岩藻糖基化的。
實施方案22. 一種藥物組合物，其包含根據實施方案1-21任一項所述的抗原結合建構體和藥學上可接受的載體。
實施方案23. 一種分離的核酸或分離的核酸集合，其包含編碼根據實施方案1-21任一項所述的抗原結合建構體的至少一個抗原結合片段的至少一個核酸序列。
實施方案24. 一種載體或載體集合，其包含根據實施方案23所述的核酸或核酸集合中的一種或多種。
實施方案25. 一種分離的細胞，其包含根據實施方案23所述的核酸或核酸集合，或根據請求項24所述的載體或載體集合。
實施方案26. 一種製備根據實施方案1-21任一項所述的抗原結合建構體的方法，其包括在適於表達所述抗原結合建構體的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含編碼所述抗原結合建構體的核酸、或者根據實施方案24所述的載體或載體集合；並且純化所述建構體。
實施方案27. 一種治療患有HER2表達腫瘤的受試者的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的根據實施方案1-21中任一項所述的抗原結合建構體或根據實施方案22所述的藥物組合物。
實施方案28. 根據實施方案27所述的方法，包括使腫瘤細胞與所述抗原結合建構體接觸，從而殺傷HER2表達腫瘤細胞或抑制HER2表達腫瘤細胞生長。
實施方案29. 根據實施方案27或28所述的方法，其中腫瘤為膽道癌、癌肉瘤、食管癌、胃食管結合部癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、頭頸癌、結直腸癌、腎癌、宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮癌、惡性黑素瘤、咽癌、口腔癌或皮膚癌。
實施方案30. 根據實施方案27-29任一項所述的方法，包括向細胞施用有效量的所述抗原結合建構體或所述藥物組合物，從而抑制、減少或阻斷細胞中的HER2信號傳導。
實施方案31. 一種增强抗原結合建構體的聚集抗性的方法，其中，所述抗原結合建構體包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述方法包括：對所述抗原結合建構體進行修飾，使得所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，突變後的胺基酸為Y。
實施方案32. 根據實施方案31所述的增强抗原結合建構體的聚集抗性的方法，其中所述抗原結合建構體還包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原的第二抗原結合片段；所述的第二抗原結合片段為Fab。
實施方案33. 根據實施方案31或32所述的增强抗原結合建構體的聚集抗性的方法，其中所述的第一抗原結合片段包含選自以下的CDR的組： i. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NO：27、28、29的胺基酸序列； ii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NO：27、28、29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； iii. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2 和輕鏈CDR3包含分別根據 SEQ ID NO：30、34、32的胺基酸序列； iv. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NO：30、34、32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； v. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NO：27、28、29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NO：30、34、32的胺基酸序列； vi. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NO：27、28、29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NO：30、34、32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列； vii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列； viii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、33和32的胺基酸序列； ix. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：44、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列；或 ix. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：44、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列。
實施方案34. 根據實施方案31或32所述的增强抗原結合建構體的聚集抗性的方法，其中所述第一抗原結合片段為scFv並且包含曲妥珠單抗的重鏈可變區或其突變體和曲妥珠單抗的輕鏈可變區或其突變體，使所述重鏈可變區的突變體包含K30E突變，使所述輕鏈可變區的突變體包含F53Y突變。
實施例1 anti-Her2-scFv-Fc及其變體的構建、表達、純化
構建anti-Her2-scFv-Fc時，Fc部分採用人IgG1，anti-Her2臂可變區序列是基於Herceptin®單抗的序列，通過設計的linker 1（(GGGGS)3，SEQ ID NO：53）將Herceptin®單抗的輕重鏈可變區串聯併形成anti-Her2-scFv-Fc（SEQ ID NO：1），其胺基酸序列如下： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
另外在anti-Her2-scFv-Fc序列上構建點突變，構建以下變體：
anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc（SEQ ID NO：3）：衍生自野生型anti-Her2-scFv-Fc，VL區具有F53Y；其胺基酸序列如下： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
anti-Her2-scFv-VL-F53A-Fc（SEQ ID NO：5）：衍生自野生型anti-Her2-scFv-Fc，VL區具有F53A；其胺基酸序列如下： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASALYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
anti-Her2-scFv-VL-F53R-Fc（SEQ ID NO：7）：衍生自野生型anti-Her2-scFv-Fc，VL區具有F53R；其胺基酸序列如下： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASRLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc（SEQ ID NO：9）：衍生自野生型anti-Her2-scFv-Fc，VH區具有K30E；其胺基酸序列如下： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
合成anti-Her2-scFv-Fc及其變體的DNA序列（SEQ ID NOs：2、4、6、8和10）並且分別選殖到pcDNA3.1表達載體中。通過使用ExpiCHOTM表達試劑盒（Thermo Fisher，目錄號A29133）將anti-Her2-scFv-Fc或其變體的表達載體轉染到ExpiCHO細胞（CHO-S，Thermo公司）中。使細胞在ExpiCHO表達培養基中於37℃、含有8% CO2 的濕潤氣氛的培養箱中並在以130 rpm旋轉的有軌搖床平臺上培養。收集培養上清，使用蛋白A磁珠（Genscript，目錄號L00273）進行蛋白純化。通過UV-Vis分光光度計（NanoDrop lite, Thermo Scientific）測量蛋白濃度。
表1：anti-Her2-scFv-Fc及其變體的序列信息
名稱 胺基酸序列 (SEQ ID NO) 編碼DNA序列 (SEQ ID NO) 可變區突變位點
anti-Her2-scFv-Fc 1 2 無
anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc 3 4 F53Y
anti-Her2-scFv-VL-F53A-Fc 5 6 F53A
anti-Her2-scFv-VL-F53R-Fc 7 8 F53R
anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc 9 10 K30E
實施例2 anti-Her2-scFv-Fc及其變體的聚集體驗證以及與人Her2抗原結合檢測
表達並純化後的anti-Her2-scFv-Fc及其變體通過Biacore T200（GE公司）測定待測分子與人Her2蛋白的親和力，實驗過程描述如下：
用偶聯Anti-hIgG的晶片捕獲一定量的anti-Her2-scFv-Fc或其變體，然後於晶片表面流經抗原人源HER2蛋白（Sino Biological，目錄號10004-H08H），利用Biacore T200實時檢測反應信號，從而獲得結合和解離曲線。實驗中用到的緩衝液為Biacore通用緩衝液（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2 HPO4 ·12H2 O，1.8 mM KH2 PO4 ，0.05%表面活性劑P20（GE，目錄號BR-1000-54），pH 7.4）。Anti-hIgG（來源人類抗體捕獲試劑盒，GE，目錄號29-2346-00）偶聯至CM5晶片表面反應值達到9000 RU左右，捕獲anti-Her2-scFv-Fc或其變體約200 RU，然後檢測不同濃度的人源HER2蛋白（100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.125 nM）與anti-Her2-scFv-Fc或其變體相互作用的信號值。流動池的流速為50 µl/min，結合時間240 s，解離時間1400 s，用3 M MgCl2 （GE公司）再生60 s，基線平穩。根據biacore evaluation software中affinity and kinetics 1：1結合模式運算獲得結果。anti-Her2-scFv-Fc或變體與抗原人Her2蛋白的親和力見表2。與anti-Her2-scFv-Fc（KD=0.77 nM）相比，變體anti-Her2-scFv-VL-F53A-Fc（KD=1.26 nM）對抗原人Her2蛋白的結合親和力影響較大；變體anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc（KD=0.8 nM）對抗原人Her2蛋白的結合親和力與anti-Her2-scFv-Fc（KD=0.77 nM）類似，變體anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc對抗原人Her2蛋白的結合KD=0.54 nM。可知F53Y、K30E突變的引入不會降低對抗原人Her2蛋白的結合親和力。
採用凝膠層析管柱對anti-Her2-scFv-Fc或其變體的各組分進行分離。用中性pH的緩衝液作為流動相進行洗脫，各分子量組分按照分子量由大到小的順序依次被洗出。層析管柱為ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column 200Å、1.7 µm、4.6 * 300 mm規格的凝膠層析管柱，柱溫25℃。流動相為50 mmol/L磷酸鹽緩衝液-200 mmol/L氯化鈉，pH 7.0（稱取二水合磷酸二氫鈉2.33 g、十二水合磷酸氫二鈉12.53 g、氯化鈉11.69 g，加入約800 ml超純水，攪拌至充分溶解，加超純水至1000 ml，混勻後經0.22 µm濾膜過濾）。用流動相將樣品稀釋至10 mg/ml作為供試品溶液，精密量取2 µl注入液相層析儀（若樣品濃度低於10 mg/ml，則調整進樣體積以進樣20 µg蛋白），在280 nm波長處檢測。流速為0.30 ml/min，等度洗脫15 min。數據處理，採用面積歸一化法對結果進行定量分析。分別計算聚集體、免疫球蛋白單體和低分子量雜質的峰面積百分比，其中主峰前為聚集體，主峰為免疫球蛋白單體，主峰後為低分子量雜質。anti-Her2-scFv-Fc或其變體主峰與聚集體含量比例見表2。變體anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc與anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc顯著降低聚集體；聚集體從anti-Her2-scFv-Fc的6.31%分別降低到4.94%、3.39%。
表2：anti-Her2-scFv-Fc及其變體的聚集體含量及與抗原Her2的結合親和力
名稱 anti-Her2-scFv-Fc anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc anti-Her2-scFv-VL-F53A-Fc anti-Her2-scFv-VL-F53R-Fc anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc
聚集體 6.31% 4.94% 6.96% 7.83% 3.39%
單體 93.43% 94.83% 92.80% 91.90% 96.32%
低分子片段 0.25% 0.24% 0.23% 0.26% 0.28%
抗原Her2（KD） 0.77 nM 0.8 nM 1.26 nM 未測 0.54 nM
實施例3 anti-Her2雙特異性抗體的構建、表達、純化
以Knobs-into-holes（Ridgway, et al., 1996）Fc工程改造產生作為人IgG1的anti-Her2雙特異性抗體。其中一條重鏈的Fc區序列設計有H435R、Y436F突變（Jendeberg et al.,1997）降低Fc對蛋白A的親和力，有利於在蛋白A親和純化中去除雙特異性抗體組裝過程中形成的同源二聚體（專利US5945311A）。從實施例2中可知，anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc突變、anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc突變可以顯著降低anti-Her2-scFv聚集體，同時未降低對Her2抗原親和力，本實施例中anti-Her2雙特異性抗體的一條anti-Her2臂的抗原結合結構域為scFv（VH-linker-VL結構）形式，可變區序列包含突變K30E（b-anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc，SEQ ID NO：21）、突變F53Y（b-anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc，SEQ ID NO：23）或者同時包含這兩個點突變anti-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc（SEQ ID NO：11）；本實施例中anti-Her2雙特異性抗體的另一條anti-Her2臂的抗原結合結構域為Fab形式，包括anti-Her2-domain2-HC-Fc（SEQ ID NO：13）和anti-Her2-domain2-LC（SEQ ID NO：15）；另外以scFv（VH-linker-VL結構或VL-linker-VH結構）不含突變構建anti-Her2雙特異性抗體作為對照。
表3：anti-Her2雙特異性抗體的序列信息
名稱 組成 胺基酸序列 (SEQ ID NO) 核苷酸序列 (SEQ ID NO)
Expi Her2-1 anti-Her2-scFv-VL-VH-Fc DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLICLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENRYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：17) 18
anti-Her2-domain2-HC-Fc-2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO：19) 20
anti-Her2-domain2-LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：15) 16
Expi Her2-2 anti-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：11) 12
anti-Her2-domain2-HC-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：13) 14
anti-Her2-domain2-LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO：15) 16
Expi Her2-3 b-anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：21) 22
anti-Her2-domain2-HC-Fc SEQ ID NO：13 14
anti-Her2-domain2-LC SEQ ID NO：15 16
Expi Her2-4 b-anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：23) 24
anti-Her2-domain2-HC-Fc SEQ ID NO：13 14
anti-Her2-domain2-LC SEQ ID NO：15 16
Expi Her2-5 anti-Her2-scFv-VH-VL-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：25) 26
anti-Her2-domain2-HC-Fc SEQ ID NO：13 14
anti-Her2-domain2-LC SEQ ID NO：15 16
合成anti-Her2雙特異性抗體的DNA序列（SEQ ID NOs：12、14和16）並且分別選殖到pcDNA3.1表達載體中。通過使用ExpiCHOTM表達試劑盒(Thermo Fisher，目錄號A29133)將anti-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc（SEQ ID NO：11）、anti-Her2-domain2-HC-Fc（SEQ ID NO：13）和anti-Her2-domain2-LC（SEQ ID NO：15）的表達載體按轉染比率1：1：1.5共轉染到ExpiCHO細胞中。轉染密度為6×106 cells/ml。培養基為ExpiCHO表達培養基。連續培養至轉染後第10天離心收集細胞培養上清。使用蛋白A磁珠（Genscript，目錄號L00273）進行蛋白純化。通過UV-Vis分光光度計（NanoDrop lite，Thermo Scientific）測量蛋白濃度。此樣品命名為Expi Her2-2。參照該方法，按照上表給出的DNA序列表達純化得到其它雙特異性抗體Expi Her2-1、Expi Her2-3、Expi Her2-4、Expi Her2-5。
實施例4 岩藻糖敲除雙特異性抗體製備與驗證
通過敲除岩藻糖表達相關基因FUT8可以提高IgG1與FcgRIIIa的相互作用，進而增强抗體的ADCC作用（Shields et al.，2002；Yamane-Ohnuki et al., 2004）。在本實施例中，用敲除FUT8-的CHO-S細胞（命名為CHO FUT8-/-細胞）製備岩藻糖敲除anti-Her2雙特異性抗體。合成anti-Her2雙特異性抗體的DNA序列（SEQ ID NOs：12、14和16）並且分別選殖到pcDNA3.1表達載體中。通過使用CHOgro®高產表達系統（貨號：MIR 6270）將anti-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc、anti-Her2-domain2-HC-Fc和anti-Her2-domain2-LC的表達載體按轉染比率1：1：1.5共轉染到敲除FUT8-的CHO-S細胞中。轉染密度為6×106 cells/ml。培養基為CHOgro®表達培養基（貨號MIR 6200，廠家Mirus）。連續培養至轉染後第10天離心收集細胞培養上清。使用蛋白A磁珠（Genscript，目錄號L00273）進行蛋白純化。通過UV-Vis分光光度計（NanoDrop lite，Thermo Scientific）測量蛋白濃度。此樣品命名為23C2 Her2-2。參照此方法，將表3中列出的Expi Her2-1、Expi Her2-3、Expi Her2-4、Expi Her2-5的序列在CHO FUT8-/-細胞中表達，對應獲得岩藻糖敲除anti-Her2雙特異性抗體23C2 Her2-1、23C2 Her2-3、23C2 Her2-4、23C2 Her2-5。
使用GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖試劑盒（Waters, Milford, Mass., USA）對CHO FUT8-/-細胞和CHO-S細胞表達的anti-Her2雙特異性抗體樣品進行處理，將N-糖從蛋白上釋放，再對N-糖進行標記，經層析管柱分離，採用FLR檢測器（Waters, Milford, Mass., USA）進行分析，可得到N-糖的結構和含量，anti-Her2雙特異性抗體Expi HER2-2的糖譜分析見圖1，FUT8敲除CHO-S細胞表達anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-2的糖譜分析見圖2，糖型含量比例見表4，正常anti-Her2雙特異性抗體Expi HER2-2中不含岩藻糖比例為21.85%，敲除FUT8-的CHO-S細胞表達anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-2不含岩藻糖比例為99.40%。
表4：anti-Her2雙特異性抗體的糖型含量分析
成分名稱 (Component name) 含量(%)
Expi HER2-2 23C2 HER2-2
A1(M3B) 1.81 9.84
A1G(4)1 0.16 0.17
A2 1.14 70.33
A2[3]G(4)1 / 2.34
A2[6]G(4)1 / 4.19
A2[3]BG(4)1 / 0.11
A2G(4)2 / 0.55
A2G(4)2S(3)1 / 0.21
A2G(4)2S(3,3)2 / 0.46
F(6)A1G(4)1 / /
F(6)A1[3]G(4)1S(3)1 / /
F(6)A1 12.77 /
F(6)A2 60.69 0.60
F(6)A2[3]G(4)1 1.20 /
F(6)A2[6]G(4)1 0.70 /
F(6)A2G(4)2 / /
F(6)A2G(4)2S(3)1 / /
M3 / 0.26
M4 / 0.07
M4A1G(4)1 / 0.36
M4 D1 / 0.08
M5 12.31 5.67
M5A1G(4)1 / 0.05
M6 D1 2.11 0.75
M6 D3 0.73 0.18
M7 D1 0.80 0.44
M8 0.20 0.15
去岩藻糖化糖型(De-Fucosylated Glycans) 21.85 99.40
雙唾液酸修飾糖型(Di-Sialylated Glycans) / 0.46
高甘露糖糖型(High Mannose Glycans) 20.07 7.24
單唾液酸修飾糖型(Mono-Sialylated Glycans) 0.18 0.21
非唾液酸修飾糖型(Non-Sialylated Glycans) 99.82 99.33
實施例5 雙特異抗體的聚集體驗證
本實施例涉及anti-Her2雙特異性抗體23C2 Her2-1、23C2 Her2-2、23C2 Her2-3、23C2 Her2-4、23C2 Her2-5的聚集體驗證。
採用凝膠層析管柱對anti-Her2雙特異性抗體進行分離驗證聚集體含量。用中性pH的緩衝液作為流動相進行洗脫，各分子量組分按照分子量由大到小的順序依次被洗出。層析管柱為ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column 200Å、1.7 µm、4.6 * 300 mm規格的凝膠層析管柱，柱溫25℃。流動相為50 mmol/L磷酸鹽緩衝液-200 mmol/L氯化鈉，pH 7.0（稱取二水合磷酸二氫鈉2.33 g、十二水合磷酸氫二鈉12.53 g、氯化鈉11.69 g，加入約800 ml超純水，攪拌至充分溶解，加超純水至1000 ml，混勻後經0.22 µm濾膜過濾）。用流動相將樣品稀釋至10 mg/ml作為供試品溶液，精密量取2 µl注入液相層析儀（若樣品濃度低於10 mg/ml，則調整進樣體積以進樣20 µg蛋白），在280 nm波長處檢測。流速為0.30 ml/min，等度洗脫15 min。數據處理，採用面積歸一化法對結果進行定量分析。分別計算聚集體、免疫球蛋白單體和低分子量雜質的峰面積百分比，其中主峰前為聚集體，主峰為免疫球蛋白單體，主峰後為低分子量雜質。
表5：anti-Her2雙特異性抗體的聚集體含量
樣品名稱 聚集體 單體 低分子片段
23C2 Her2-2 8.51% 91.02% 0.47%
23C2 Her2-1 19.55% 80.05% 0.40%
結果表明，將scFV（不含突變）組裝成雙特異性抗體，雙特異性抗體仍然會產生大量的聚集體，而通過引入突變則可以降低雙特異性抗體的聚集體的含量，與未含突變的23C2 Her2-1相比，23C2 Her2-2的聚集體含量可以降低至8.51%（表5）。
實施例6 anti-Her2雙特異性抗體的抗原結合檢測
表達並純化後的anti-Her2雙特異性抗體通過Biacore T200（GE公司）測定待測分子與HER2蛋白的親和力，實驗過程描述如下：
用偶聯Anti-hIgG的晶片捕獲一定量的anti-Her2雙特異性抗體，然後於晶片表面流經人源Her2（Sino Biological，目錄號10004-H08H），利用Biacore T200實時檢測反應信號，從而獲得結合和解離曲線。實驗中用到的緩衝液為Biacore通用緩衝液（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2 HPO4 ·12H2 O，1.8 mM KH2 PO4 ，0.05%表面活性劑 P20，pH 7.4）。Anti-hIgG（來源人類抗體捕獲試劑盒，GE，目錄號29-2346-00）偶聯至CM5晶片表面反應值達到9000RU左右，捕獲anti-Her2雙特異性抗體約200RU，然後分別檢測不同濃度的Her2蛋白（100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.125 nM）與anti-Her2雙特異性抗體相互作用的信號值。流動池的流速為50 µl/min，結合時間240 s，解離時間1400 s，用3M MgCl2 （GE）再生60 s，基線平穩。
根據biacore evaluation software運算獲得結果，anti-Her2雙特異性抗體23C2 Her2-2與抗原Her2結合親和力以及對照曲妥珠單抗與帕妥珠單抗見表6，anti-Her2雙特異性抗體23C2 Her2-2對抗原Her2結合KD為6.11E-10M，曲妥珠單抗與抗原Her2結合KD為1.22E-09 M，帕妥珠單抗與抗原Her2結合KD為2.35E-09M，anti-Her2雙特異性抗體23C2 Her2-2比曲妥珠單抗與帕妥珠單抗對抗原Her2有更高的親和力。
表6：anti-Her2雙特異性抗體對人Her2抗原的親和力
  Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M)
23C2 Her2-2 1.79E+05 1.09E-04 6.11E-10
曲妥珠單抗對照 1.73E+05 2.12E-04 1.22E-09
帕妥珠單抗對照 1.15E+05 2.69E-04 2.35E-09
實施例7 anti-Her2雙特異性抗體的抗原結合檢測
參照實施例6的實驗過程，通過Biacore T200（GE）測定表達並純化後的anti-Her2雙特異性抗體23C2 Her2-1、23C2 Her2-2、23C2 Her2-3、23C2 Her2-4、23C2 Her2-5與HER2蛋白的親和力。
anti-Her2雙特異性抗體與抗原人Her2蛋白的親和力見表7。結合表6和表7的結果可知，引入F53Y、K30E突變可以提高anti-Her2雙特異抗體對抗原人Her2蛋白的結合親和力。
表7：anti-Her2雙特異性抗體對人Her2抗原的親和力
樣品名稱 23C2 Her2-1
抗原Her2 KD 4.02 nM
實施例8 anti-Her2雙特異性抗體對Her2陽性靶細胞BT474的殺傷
通過人PBMC（外周血單個核細胞；效應細胞）提供NK細胞來研究anti-Her2雙特異性抗體對靶細胞（BT474 Her2+++，來源：中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）的殺傷作用，計算EC50，評價anti-Her2雙特異性抗體的體外活性。
具體實驗過程如下：
BT474細胞使用含2% FBS（胎牛血清）的1640實驗培養基調整細胞密度至3×105 cells/ml，50 μl每孔接種於96孔細胞培養板（eppendorf，貨號：0030730199）。使用1640實驗培養基配製不同濃度（分別為1000 ng/ml、333 ng/ml、111 ng/ml、37 ng/ml、12.3 ng/ml、4.11 ng/ml、1.37 ng/ml、0.46 ng/ml、0.15 ng/ml、0.05 ng/ml）的anti-Her2雙特異性抗體，將不同濃度的抗體加入上述96孔細胞培養板中，每孔50 μl。人PBMC使用1640實驗培養基調整細胞密度至1.5×106 cells/ml，每孔100 μl。設置給藥組（靶細胞+效應細胞+抗體）、靶細胞組（BT474細胞）、效應細胞組（人PBMC）、靶細胞+效應細胞組、空白對照組（培養基）和裂解液對照組、靶細胞最大釋放組（靶細胞+裂解液），效靶比為10：1。在檢測前45min，靶細胞最大釋放組和裂解液對照組加入20 μl/孔裂解液（Promega，貨號G182A）。45min後使用CytoTox96®非放射性細胞毒性檢測試劑盒（cytotox 96 nonradioactive cytotoxicity assay，Promega，G1780）試劑盒檢測細胞裂解率（殺傷率）。
裂解率（%）=(OD給藥組 -OD靶細胞 + 效應細胞組 )/(OD靶細胞最大釋放組 -OD靶細胞組 )×100%
圖3顯示了anti-Her2雙特異性抗體對BT474 Her2+++腫瘤細胞的殺傷率。ADCC增强anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-1和23C2 HER2-2對BT474腫瘤細胞的殺傷優於曲妥珠+帕妥珠單抗聯用，優於CHO-S表達的anti-Her2雙特異性抗體Expi Her2-1和Expi HER2-2；其中曲妥珠+帕妥珠單抗（1:1）聯用EC50為8.627 ng/ml，Expi HER2-1的EC50為38.05 ng/ml，Expi HER2-2優於Expi HER2-1，其EC50為35.17 ng/ml；ADCC增强的23C2 HER2-1的EC50為4.728 ng/ml，ADCC增强的23C2 HER2-2優於23C2 HER2-1，其EC50為3.658 ng/ml。
實施例9 anti-Her2雙特異性抗體對Her2陽性靶細胞NCI-N87的殺傷
通過人PBMC（外周血單個核細胞；效應細胞）提供NK細胞來研究anti-Her2雙特異性抗體對靶細胞（NCI-N87 Her2++，來源：中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）的殺傷作用，計算EC50，評價anti-Her2雙特異性抗體的體外活性。
具體實驗過程如下：
NCI-N87細胞使用含2% FBS（胎牛血清）的1640實驗培養基調整細胞密度至3×105 cells/ml，50 μl每孔接種於96孔細胞培養板（eppendorf，貨號：0030730199）。使用1640實驗培養基配製不同濃度（分別為8.1nM、2.7nM、0.9nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM、0.003nM、0.001nM、0.0004nM）的anti-Her2雙特異性抗體或對照藥，將不同濃度的抗體或對照藥加入上述96孔細胞培養板中，每孔50 μl。人PBMC使用1640實驗培養基調整細胞密度至1.5×106 cells/ml，每孔100 μl。設置給藥組（靶細胞+效應細胞+抗體）、靶細胞組（NCI-N87細胞）、效應細胞組（人PBMC）、靶細胞+效應細胞組、空白對照組（培養基）和裂解液對照組、靶細胞最大釋放組（靶細胞+裂解液），效靶比為10：1。在檢測前45min，靶細胞最大釋放組和裂解液對照組加入20 μl/孔裂解液（Promega，貨號G182A）。45min後使用CytoTox96®非放射性細胞毒性檢測試劑盒（cytotox 96 nonradioactive cytotoxicity assay，Promega，G1780）試劑盒檢測細胞裂解率（殺傷率）。以曲妥珠單抗、T-DM1（曲妥珠單抗-美坦新偶聯物，商品名Kadcyla®）、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用（1:1）、Expi HER2-1作為對照藥。
裂解率（%）=(OD給藥組 -OD靶細胞 + 效應細胞組 )/(OD靶細胞最大釋放組 -OD靶細胞組 )×100%
圖4顯示了曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用、曲妥珠單抗、T-DM1以及anti-Her2雙特異性抗體對NCI-N87腫瘤細胞的殺傷率。ADCC增强anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-2對NCI-N87腫瘤細胞的殺傷優於曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用、曲妥珠單抗、T-DM1以及Expi HER2-1；其中ADCC增强的anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-2的EC50為0.02447 nM，曲妥珠+帕妥珠單抗聯用EC50為0.08267 nM，Expi HER2-1的EC50為0.1048 nM，T-DM1的EC50為0.07392 nM，曲妥珠單抗的EC50為0.07468 nM。
實施例10 anti-Her2雙特異性抗體對曲妥珠耐藥細胞JIMT-1的殺傷
通過人PBMC（外周血單個核細胞；效應細胞）提供NK細胞來研究anti-Her2雙特異性抗體對靶細胞（JIMT-1，來源：AddexBio，Catalog#：C0006005）的殺傷作用，計算EC50，評價anti-Her2雙特異性抗體的體外活性。
具體實驗過程如下：
JIMT-1細胞使用含2% FBS（胎牛血清）的1640實驗培養基調整細胞密度至3×105 cells/ml，50 μl每孔接種於96孔細胞培養板（eppendorf，貨號：0030730199）。使用1640實驗培養基配製不同濃度（分別為8.1nM、2.7nM、0.9nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM、0.003nM、0.001nM、0.0004nM）的anti-Her2雙特異性抗體或對照藥，將不同濃度的抗體或對照藥加入上述96孔細胞培養板中，每孔50 μl。人PBMC使用1640實驗培養基調整細胞密度至1.5×106 cells/ml，每孔100 μl。設置給藥組（靶細胞+效應細胞+抗體或對照藥）、靶細胞組（BT474細胞）、效應細胞組（人PBMC）、靶細胞+效應細胞組、空白對照組（培養基）和裂解液對照組、靶細胞最大釋放組（靶細胞+裂解液），效靶比為20：1。在檢測前45min，靶細胞最大釋放組和裂解液對照組加入20 μl/孔裂解液（Promega，貨號G182A）。45min後使用CytoTox96®非放射性細胞毒性檢測試劑盒（cytotox 96 nonradioactive cytotoxicity assay，Promega，G1780）試劑盒檢測細胞裂解率（殺傷率）。以曲妥珠單抗、T-DM1、曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用（1:1）、Expi HER2-1作為對照藥。
裂解率（%）=(OD給藥組 -OD靶細胞 + 效應細胞組 )/(OD靶細胞最大釋放組 -OD靶細胞組 )×100%
圖5顯示了曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用、曲妥珠單抗、T-DM1以及anti-Her2雙特異性抗體對JIMT-1腫瘤細胞的殺傷率。ADCC增强anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-2對JIMT-1腫瘤細胞的殺傷優於曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用、曲妥珠單抗、T-DM1、Expi HER2-1；其中ADCC增强的anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-2的EC50為0.01006 nM，曲妥珠+帕妥珠單抗聯用EC50為0.06727 nM，Expi HER2-1的EC50為0.08066 nM，T-DM1的EC50為0.08357 nM，曲妥珠單抗的EC50為0.07443nM，此外，anti-Her2雙特異性抗體23C2 HER2-2具有更高的細胞裂解率。
實施例11 anti-Her2雙特異性抗體對BT474 Her2+++腫瘤細胞的增殖抑制
將23C2 Her2-2、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗使用含2% FBS（胎牛血清，廠家GIBCO，貨號：10099-141）的DMEM/F12培養基（GIBCO，貨號11330-032）稀釋至終濃度為3.2 μg/ml，然後按照1：1的比例梯度稀釋9個濃度（1.6 μg/ml、0.8 μg/ml、0.4 μg/ml、0.2 μg/ml、0.1 μg/ml、0.05 μg/ml、0.025 μg/ml、0.0125 μg/ml、0.00625 μg/ml）。取對數生長期BT474 Her2+++細胞，調整密度至1×105 cells/ml進行鋪板，每孔加入100 μl，並設置無細胞空白孔作為對照。加入上述梯度稀釋的抗體，每孔50 μl。於37℃、5% CO2 二氧化碳培養箱中培養5天。棄掉培養液，加入CCK-8（日本同仁化學，貨號：CK04）工作液，每孔100 μl，孵育顯色4~5小時後置於酶標儀中（廠家Thermo，型號：VarioskanFlash），以630 nm為參比波長，讀取並記錄波長450 nm下孔板的吸光度值。計算腫瘤細胞增殖抑制率。
結果見圖6，ADCC增强的anti-Her2雙特異性抗體23C2 Her2-2對BT474腫瘤細胞增殖抑制率為78.38%，優於曲妥珠單抗的增殖抑制率54.12%或曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用的增殖抑制率53.7%。
實施例12 anti-Her2雙特異性抗體對NCI-N87 Her2++胃癌裸小鼠異種移植瘤抑制作用
通過NCI-N87 Her2++胃癌細胞（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）在小鼠異種腫瘤移植模型中評價anti-Her2雙特異性抗體體內藥效。準備NCI-N87 Her2++胃癌細胞，濃度5×107 個/ml *0.1ml/只小鼠，在無菌條件下，接種於裸小鼠（來自常州卡文斯實驗動物有限公司，裸鼠，14-17g，雄性，飼養環境：SPF級）右側腋窩下。裸小鼠移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100-250mm3 後將動物分成5組： 組1：對照（Control） 組2：Expi Her2-1，10 mg/kg 組3：23C2 Her2-2，5 mg/kg 組4：23C2 Her2-2，10 mg/kg 組5：Per+Tra（曲妥珠單抗+帕妥珠單抗聯用），5+5mg/kg
各給藥組按相應劑量靜脈注射給藥，每周2次，連續給藥3周（6次）左右。除組5聯用組兩個藥物的給藥體積分別為5 ml/kg小鼠體重，其餘各組給藥體積均為10 ml/kg小鼠體重。組1通過i.v.給予10 ml/kg PBS（Hyclone；貨號：sh30256.01）。聯用組給藥時，給完帕妥珠單抗後至少30min再給予曲妥珠單抗。
使用測量瘤徑的方法，動態觀察被試物抗腫瘤的效應，每周測2-3次瘤體積（具體測量時間見表8），同時稱鼠重，記錄數據；每日觀察小鼠一般表現。
檢測指標：
腫瘤體積（TV），計算公式為：TV= 1/2×a×b2 ，其中a、b分別表示長、寬。
本實驗從d0天開始給藥，共給藥6次（d0、d3、d7、d10、d14、d17天）。至實驗d21天，無動物死亡。各組小鼠平均體重呈增長趨勢（圖8)。藥物無明顯毒性作用。
至d21天，組2（10 mg/kg）、組3（5 mg/kg）、組4（10 mg/kg）、組5（5+5 mg/kg）的對NCI-N87胃癌裸小鼠異種移植瘤體積影響見表7與圖7，23C2 Her2-2在10mg/kg劑量下對NCI-N87胃癌裸小鼠異種移植瘤抑制優於Expi Her2-1（10mg/kg）與Per+Tra聯用組（5+5mg/kg）。
表8：anti-HER2雙特異性抗體對NCI-N87胃癌裸小鼠異種移植瘤體積的影響（mean±SD）
組別 劑量(mg/kg) 給藥途徑 動物數(隻) TV（mm3 ）
d0 d21 d0 d3 d6 d9 d12 d15 d18 d21
Control - i.v. 6 6 204±40 284±58 363±78 481±109 586±161 724±261 808±241 863±251
Expi Her2-1 10 i.v. 6 6 204±23 235±46 207±35 179±30 195±24 204±44 195±50 178±35
23C2 Her2-2 5 i.v. 6 6 204±31 246±37 250±47 277±67 318±79 348±86 353±84 358±101
23C2 Her2-2 10 i.v. 6 6 204±44 201±39 154±39 136±33 151±35 173±46 165±35 144±29
Per+Tra 5+5 i.v. 6 6 204±34 224±48 199±59 202±65 205±45 231±93 218±94 218±91
備注：於d0、d3、d7、d10、d14、d17天共給藥6次。
無。 序列表 ＜110＞  正大天晴藥業集團股份有限公司 (CHIA TAI TIANQING PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD.) ＜120＞  靶向HER2的抗原結合建構體及用途 ＜160＞  55 ＜170＞  SIPOSequenceListing 1.0 ＜210＞  1 ＜211＞  475 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130                 135                 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145                 150                 155                 160 Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165                 170                 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly 180                 185                 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195                 200                 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210                 215                 220 Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225                 230                 235                 240 Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245                 250                 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260                 265                 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275                 280                 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290                 295                 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305                 310                 315                 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325                 330                 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340                 345                 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355                 360                 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370                 375                 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385                 390                 395                 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405                 410                 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420                 425                 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435                 440                 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450                 455                 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475 ＜210＞  2 ＜211＞  1425 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  2 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggcag cctgcggctg        60 tcttgtgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccattgggt gaggcaggct       120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat       180 gccgactccg tgaagggccg gtttaccatc agcgccgata cctctaagaa cacagcttac       240 ctgcagatga attccctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcag cagatgggga       300 ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc       360 ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc       420 cagtcccctt cttccctgtc tgcctccgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct       480 agccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg taccagcaga agccaggcaa ggcccccaag       540 ctgctgatct actccgcctc cttcctgtat tccggagtgc caagcaggtt ttccggaagc       600 cggtctggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agcctgagga ttttgccaca       660 tactattgcc agcagcacta taccacaccc cctaccttcg gccagggcac aaaggtggag       720 atcaagggcg agccaaagtc cagcgacaag acccatacat gcccaccatg tcctgctcca       780 gagctgctgg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga taccctgatg       840 atctctagaa cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggatccagag       900 gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac caagccaaga       960 gaggagcagt acaattctac ctatcgcgtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat      1020 tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgctcccatc      1080 gagaagacca tctctaaggc taagggccag cccagagagc ctcaggtgta cacactgccc      1140 cctagccgcg aggagatgac caagaaccag gtgtctctga catgtctggt gaagggcttt      1200 tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag      1260 accacaccac ccgtgctgga ctctgatggc tccttctttc tgtattccaa gctgaccgtg      1320 gataagagcc gctggcagca gggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca tgaggctctg      1380 cacaatcatt acacacagaa gtctctgtcc ctgagccctg gcaag                      1425 ＜210＞  3 ＜211＞  475 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130                 135                 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145                 150                 155                 160 Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165                 170                 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly 180                 185                 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195                 200                 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210                 215                 220 Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225                 230                 235                 240 Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245                 250                 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260                 265                 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275                 280                 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290                 295                 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305                 310                 315                 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325                 330                 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340                 345                 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355                 360                 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370                 375                 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385                 390                 395                 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405                 410                 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420                 425                 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435                 440                 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450                 455                 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475 ＜210＞  4 ＜211＞  1425 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  4 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggcag cctgcggctg        60 tcttgtgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccattgggt gaggcaggct       120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat       180 gccgactccg tgaagggccg gtttaccatc agcgccgata cctctaagaa cacagcttac       240 ctgcagatga attccctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcag cagatgggga       300 ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc       360 ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc       420 cagtcccctt cttccctgtc tgcctccgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct       480 agccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg taccagcaga agccaggcaa ggcccccaag       540 ctgctgatct actccgcctc ctacctgtat tccggagtgc caagcaggtt ttccggaagc       600 cggtctggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agcctgagga ttttgccaca       660 tactattgcc agcagcacta taccacaccc cctaccttcg gccagggcac aaaggtggag       720 atcaagggcg agccaaagtc cagcgacaag acccatacat gcccaccatg tcctgctcca       780 gagctgctgg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga taccctgatg       840 atctctagaa cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggatccagag       900 gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac caagccaaga       960 gaggagcagt acaattctac ctatcgcgtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat      1020 tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgctcccatc      1080 gagaagacca tctctaaggc taagggccag cccagagagc ctcaggtgta cacactgccc      1140 cctagccgcg aggagatgac caagaaccag gtgtctctga catgtctggt gaagggcttt      1200 tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag      1260 accacaccac ccgtgctgga ctctgatggc tccttctttc tgtattccaa gctgaccgtg      1320 gataagagcc gctggcagca gggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca tgaggctctg      1380 cacaatcatt acacacagaa gtctctgtcc ctgagccctg gcaag                      1425 ＜210＞  5 ＜211＞  475 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-F53A-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130                 135                 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145                 150                 155                 160 Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165                 170                 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Tyr Ser Gly 180                 185                 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195                 200                 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210                 215                 220 Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225                 230                 235                 240 Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245                 250                 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260                 265                 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275                 280                 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290                 295                 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305                 310                 315                 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325                 330                 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340                 345                 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355                 360                 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370                 375                 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385                 390                 395                 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405                 410                 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420                 425                 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435                 440                 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450                 455                 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475 ＜210＞  6 ＜211＞  1425 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-F53A-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  6 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggcag cctgcggctg        60 tcttgtgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccattgggt gaggcaggct       120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat       180 gccgactccg tgaagggccg gtttaccatc agcgccgata cctctaagaa cacagcttac       240 ctgcagatga attccctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcag cagatgggga       300 ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc       360 ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc       420 cagtcccctt cttccctgtc tgcctccgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct       480 agccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg taccagcaga agccaggcaa ggcccccaag       540 ctgctgatct actccgcctc cgccctgtat tccggagtgc caagcaggtt ttccggaagc       600 cggtctggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agcctgagga ttttgccaca       660 tactattgcc agcagcacta taccacaccc cctaccttcg gccagggcac aaaggtggag       720 atcaagggcg agccaaagtc cagcgacaag acccatacat gcccaccatg tcctgctcca       780 gagctgctgg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga taccctgatg       840 atctctagaa cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggatccagag       900 gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac caagccaaga       960 gaggagcagt acaattctac ctatcgcgtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat      1020 tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgctcccatc      1080 gagaagacca tctctaaggc taagggccag cccagagagc ctcaggtgta cacactgccc      1140 cctagccgcg aggagatgac caagaaccag gtgtctctga catgtctggt gaagggcttt      1200 tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag      1260 accacaccac ccgtgctgga ctctgatggc tccttctttc tgtattccaa gctgaccgtg      1320 gataagagcc gctggcagca gggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca tgaggctctg      1380 cacaatcatt acacacagaa gtctctgtcc ctgagccctg gcaag                      1425 ＜210＞  7 ＜211＞  475 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-F53R-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130                 135                 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145                 150                 155                 160 Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165                 170                 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Arg Leu Tyr Ser Gly 180                 185                 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195                 200                 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210                 215                 220 Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225                 230                 235                 240 Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245                 250                 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260                 265                 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275                 280                 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290                 295                 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305                 310                 315                 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325                 330                 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340                 345                 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355                 360                 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370                 375                 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385                 390                 395                 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405                 410                 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420                 425                 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435                 440                 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450                 455                 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475 ＜210＞  8 ＜211＞  1425 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-F53R-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  8 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggcag cctgcggctg        60 tcttgtgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccattgggt gaggcaggct       120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat       180 gccgactccg tgaagggccg gtttaccatc agcgccgata cctctaagaa cacagcttac       240 ctgcagatga attccctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcag cagatgggga       300 ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc       360 ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc       420 cagtcccctt cttccctgtc tgcctccgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct       480 agccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg taccagcaga agccaggcaa ggcccccaag       540 ctgctgatct actccgcctc caggctgtat tccggagtgc caagcaggtt ttccggaagc       600 cggtctggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agcctgagga ttttgccaca       660 tactattgcc agcagcacta taccacaccc cctaccttcg gccagggcac aaaggtggag       720 atcaagggcg agccaaagtc cagcgacaag acccatacat gcccaccatg tcctgctcca       780 gagctgctgg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga taccctgatg       840 atctctagaa cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggatccagag       900 gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac caagccaaga       960 gaggagcagt acaattctac ctatcgcgtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat      1020 tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgctcccatc      1080 gagaagacca tctctaaggc taagggccag cccagagagc ctcaggtgta cacactgccc      1140 cctagccgcg aggagatgac caagaaccag gtgtctctga catgtctggt gaagggcttt      1200 tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag      1260 accacaccac ccgtgctgga ctctgatggc tccttctttc tgtattccaa gctgaccgtg      1320 gataagagcc gctggcagca gggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca tgaggctctg      1380 cacaatcatt acacacagaa gtctctgtcc ctgagccctg gcaag                      1425 ＜210＞  9 ＜211＞  475 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130                 135                 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145                 150                 155                 160 Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165                 170                 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly 180                 185                 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195                 200                 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210                 215                 220 Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225                 230                 235                 240 Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245                 250                 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260                 265                 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275                 280                 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290                 295                 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305                 310                 315                 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325                 330                 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340                 345                 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355                 360                 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370                 375                 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385                 390                 395                 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405                 410                 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420                 425                 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435                 440                 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450                 455                 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475 ＜210＞  10 ＜211＞  1425 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  10 gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggcag cctgcggctg        60 tcttgtgccg cttccggctt caacatcgag gacacctaca tccattgggt gaggcaggct       120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat       180 gccgactccg tgaagggccg gtttaccatc agcgccgata cctctaagaa cacagcttac       240 ctgcagatga attccctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcag cagatgggga       300 ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc       360 ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc       420 cagtcccctt cttccctgtc tgcctccgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct       480 agccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg taccagcaga agccaggcaa ggcccccaag       540 ctgctgatct actccgcctc cttcctgtat tccggagtgc caagcaggtt ttccggaagc       600 cggtctggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agcctgagga ttttgccaca       660 tactattgcc agcagcacta taccacaccc cctaccttcg gccagggcac aaaggtggag       720 atcaagggcg agccaaagtc cagcgacaag acccatacat gcccaccatg tcctgctcca       780 gagctgctgg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga taccctgatg       840 atctctagaa cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggatccagag       900 gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac caagccaaga       960 gaggagcagt acaattctac ctatcgcgtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat      1020 tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgctcccatc      1080 gagaagacca tctctaaggc taagggccag cccagagagc ctcaggtgta cacactgccc      1140 cctagccgcg aggagatgac caagaaccag gtgtctctga catgtctggt gaagggcttt      1200 tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag      1260 accacaccac ccgtgctgga ctctgatggc tccttctttc tgtattccaa gctgaccgtg      1320 gataagagcc gctggcagca gggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca tgaggctctg      1380 cacaatcatt acacacagaa gtctctgtcc ctgagccctg gcaag                      1425 ＜210＞  11 ＜211＞  480 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 130                 135                 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 145                 150                 155                 160 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr 165                 170                 175 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 180                 185                 190 Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 195                 200                 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 210                 215                 220 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 225                 230                 235                 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 245                 250                 255 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 260                 265                 270 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 275                 280                 285 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 290                 295                 300 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 305                 310                 315                 320 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 325                 330                 335 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 340                 345                 350 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 355                 360                 365 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 370                 375                 380 Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 385                 390                 395                 400 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 405                 410                 415 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 420                 425                 430 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 435                 440                 445 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 450                 455                 460 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475                 480 ＜210＞  12 ＜211＞  1443 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  12 gaggtgcaac tggtggaatc cggcggggga ctggtccaac ctggagggag cctgcggctg        60 tcttgcgccg cctctggctt caacatcgag gatacctaca tccactgggt gcggcaggcc       120 cctggcaagg gcctggaatg ggtcgctaga atctacccta ccaacggcta caccagatac       180 gccgactctg taaagggcag attcaccatc tctgccgata catctaagaa caccgcctac       240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgctc ccggtggggc       300 ggtgacggct tttacgccat ggactactgg ggacaaggca cacttgttac ggtgtcctct       360 ggaggcggcg gctccggcgg cggcggctct ggcggaggcg gctctggcgg cggcggatct       420 gatatccaga tgacccagtc tcctagctcc ctctccgcct ccgtgggcga cagagtgaca       480 atcacctgca gagcttctca ggacgtgaac accgctgtgg cctggtacca gcagaagcct       540 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactct gcttcctacc tgtactccgg cgtgcccagc       600 cggttctccg gctctcggtc cggcaccgac ttcactctga ccatctccag cctgcagcct       660 gaagatttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctcccac cttcggccag       720 ggcaccaaag tggagatcaa gggcgagccc aagtcctccg ataaaaccca cacctgtcct       780 ccttgccctg cccctgaact actgggcggc ccttctgtgt tcctgttccc tcctaagccc       840 aaggacaccc tgatgatctc tagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct       900 cacgaggacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc       960 aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctaca gagtggtctc cgtgctgacc      1020 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct      1080 ctgcctgctc ctatcgagaa gacaatctcc aaggccaaag gccagcctcg ggagcctcag      1140 gtgtacaccc tgcctccttg tagagaggaa atgaccaaga accaggtgtc tctgtggtgc      1200 ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc      1260 gagaacaact acaagactac cccacctgtg ctggactccg atggctcctt cttcctgtac      1320 tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg      1380 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaaatccc tgtctctgtc ccctggcaag      1440 tga                                                                    1443 ＜210＞  13 ＜211＞  449 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-domain2-HC-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20                  25                  30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100                 105                 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115                 120                 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130                 135                 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145                 150                 155                 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165                 170                 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180                 185                 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195                 200                 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210                 215                 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225                 230                 235                 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245                 250                 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260                 265                 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275                 280                 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290                 295                 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305                 310                 315                 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325                 330                 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340                 345                 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355                 360                 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370                 375                 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385                 390                 395                 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405                 410                 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420                 425                 430 Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435                 440                 445 Lys ＜210＞  14 ＜211＞  1350 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-domain2-HC-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  14 gaagtgcagc tggttgaatc tggcggcgga ttggttcagc ctggcggatc tctgagactg        60 tcttgtgccg cctctggctt caccttcacc gactacacca tggactgggt ccgacaggct       120 cctggcaaag gactggaatg ggtcgccgac gtgaacccta attccggcgg ctccatctac       180 aaccagcggt tcaagggcag attcaccctg tccgtggacc ggtctaagaa caccctgtac       240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaaacctg       300 ggaccttcct tctacttcga ctactggggc cagggcaccc tggtcacagt ttcttccgct       360 tccaccaagg gacccagcgt gttccctctg gctccttcca gcaagtctac ctctggcgga       420 acagctgctc tgggctgcct ggtcaaggac tactttcctg agcctgtgac cgtgtcctgg       480 aactctggcg ctctgacatc tggcgtgcac acctttccag ctgtgctgca gtcctccggc       540 ctgtactctc tgtcctctgt cgtgaccgtg ccttccagct ctctgggaac ccagacctac       600 atctgcaatg tgaaccacaa gccttccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag       660 tcctgcgaca agacccacac ctgtcctcca tgtcctgctc cagaactgct cggcggacct       720 tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gataccctga tgatctctcg gacccctgaa       780 gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcac gaggatcccg aagtgaagtt caattggtac       840 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc       900 acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag       960 tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgctccta tcgaaaagac catctccaag      1020 gccaagggcc agcctcggga acctcaagtc tgtaccctgc ctcctagccg ggaagagatg      1080 accaagaacc aggtgtccct gtcctgtgcc gtgaagggct tctacccttc cgatatcgcc      1140 gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc tcctgtgctg      1200 gactccgacg gctcattctt cctggtgtcc aagctgacag tggacaagtc cagatggcag      1260 cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacag gttcacccag      1320 aagtccctgt ctctgagccc cggcaaatga                                       1350 ＜210＞  15 ＜211＞  214 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-domain2-LC的胺基酸序列 ＜400＞  15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20                  25                  30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35                  40                  45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50                  55                  60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65                  70                  75                  80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85                  90                  95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100                 105                 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115                 120                 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130                 135                 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145                 150                 155                 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165                 170                 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180                 185                 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195                 200                 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 ＜210＞  16 ＜211＞  645 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-domain2-LC的核苷酸序列 ＜400＞  16 gatatccaga tgacccagtc tccttccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc        60 atcacatgca aggcctctca ggacgtgtcc atcggcgtgg catggtatca gcagaagcct       120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcctcctaca gatacacagg cgtgccctcc       180 agattctccg gctctggctc tggcacagac tttaccctga caatctccag cctgcagcct       240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacatct acccctacac cttcggccag       300 ggcaccaagg tggaaatcaa gagaaccgtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct       360 tccgacgagc agctgaagtc tggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac       420 cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa       480 gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctata gcctgtcctc cacactgacc       540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc       600 ctgtctagtc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gttga                       645 ＜210＞  17 ＜211＞  481 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-VH-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20                  25                  30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35                  40                  45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50                  55                  60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65                  70                  75                  80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85                  90                  95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly 100                 105                 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu 115                 120                 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 130                 135                 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 145                 150                 155                 160 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 165                 170                 175 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 180                 185                 190 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 195                 200                 205 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 210                 215                 220 Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225                 230                 235                 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys 245                 250                 255 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 260                 265                 270 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 275                 280                 285 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 290                 295                 300 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 305                 310                 315                 320 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 325                 330                 335 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 340                 345                 350 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 355                 360                 365 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 370                 375                 380 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ile 385                 390                 395                 400 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 405                 410                 415 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Arg Tyr Met Thr Trp Pro Pro Val Leu 420                 425                 430 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 435                 440                 445 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 450                 455                 460 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465                 470                 475                 480 Lys ＜210＞  18 ＜211＞  1443 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VL-VH-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  18 gatatccaga tgacccagtc cccttcctca ctgtctgcct ccgtgggaga cagagtgaca        60 atcacctgca gagcttccca ggatgtgaac accgcagtgg cctggtacca gcagaagcct       120 ggcaaggctc ctaagctgct gatctactct gcttccttcc tgtactccgg cgtcccttct       180 cggttctctg gctcccggtc tggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagcct       240 gaagacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ctccacccac cttcggtcag       300 ggcaccaagg tcgagatcaa gggcggctcc ggcgggggct ccggcggcgg ctctggcggc       360 ggaagcggag gcggaagtgg cgaagtgcaa ctggtcgagt ctggaggcgg cctggttcag       420 cctggcggaa gcctacggct gtcttgcgcc gcctctggct ttaacatcaa ggacacctac       480 atccactggg tgcggcaggc tcccggcaag ggcctggaat gggtggccag aatctaccct       540 accaatggct acaccagata cgccgattct gtgaaaggta gattcacaat ctccgccgac       600 acctccaaga ataccgccta cctgcagatg aactccctga gagccgagga tacagctgtc       660 tactactgtt ccagatgggg cggcgatggc ttctacgcca tggactactg gggccagggc       720 acactggtga ccgtgtcctc cgctgctgag cctaagtcct ccgacaaaac ccacacctgt       780 cccccttgtc ctgctccaga actcctgggc ggcccttccg tgtttctgtt ccccccgaag       840 cctaaagata ccctgatgat ctctcgcacc ccagaagtga catgcgtggt agtcgacgtg       900 tctcatgagg accctgaggt gaagttcaac tggtatgtgg acggcgtgga agtgcacaac       960 gccaagacca agcctagaga agagcagtac aactctacct accgggtggt gtctgtgctg      1020 acagtgctgc accaggactg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag      1080 gccctgcctg ctcccatcga gaagaccatt tctaaggcca agggacagcc cagagaacct      1140 caagtgtata ccctgcctcc tagccgggac gagctgacca agaaccaggt gtccctgatc      1200 tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagtc caacggccaa      1260 cctgagaacc ggtacatgac ctggcctcct gtgctggact ccgacggcag cttcttcctg      1320 tactctaagc tgaccgtgga caagagtaga tggcagcaag gcaacgtgtt ctcctgctcg      1380 gtgatgcacg aggctctgca taaccactac acccagaaat ccctgtcttt gagccctggc      1440 aag                                                                    1443 ＜210＞  19 ＜211＞  448 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-domain2-HC-Fc-2的胺基酸序列 ＜400＞  19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20                  25                  30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100                 105                 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115                 120                 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130                 135                 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145                 150                 155                 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165                 170                 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180                 185                 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195                 200                 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210                 215                 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225                 230                 235                 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245                 250                 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260                 265                 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275                 280                 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290                 295                 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305                 310                 315                 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325                 330                 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val 340                 345                 350 Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355                 360                 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370                 375                 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385                 390                 395                 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405                 410                 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420                 425                 430 Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435                 440                 445 ＜210＞  20 ＜211＞  1344 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-domain2-HC-Fc-2的核苷酸序列 ＜400＞  20 gaggtgcagc tggtcgagtc tggaggaggt ctggtgcagc ctggaggctc tctgcggctg        60 tcctgtgccg cttctggctt caccttcacc gactacacca tggactgggt gcggcaggcc       120 cctggcaagg ggctggaatg ggtggccgac gtgaatccta actctggcgg ctccatctac       180 aaccagcggt tcaagggcag attcacactg tccgtggaca gatccaagaa caccctgtac       240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgctgtgt actactgcgc ccggaacctg       300 ggacccagct tctacttcga ctactggggc caaggcaccc tggtcaccgt gtccagcgcc       360 agcaccaaag gccctagtgt ctttcctctg gctcccagct ctaagtccac ctccggcggc       420 accgctgctc tgggctgtct ggtgaaggac tatttccctg agcctgtgac cgtctcttgg       480 aactccggcg ctctgacctc tggcgtgcat acctttcccg ccgtgctgca gtccagcggc       540 ctgtactctt tgtcttctgt cgtgacagtg ccttcttcct ctctcggcac acagacctac       600 atctgcaacg tgaaccacaa gccatctaac accaaagtgg acaagaaggt ggaacccaag       660 agctgcgaca aaacccacac ctgtccacct tgtcctgccc ctgagctgct gggcggacct       720 tccgtgttcc tgttcccccc taagcctaag gatacactga tgatctccag aacccccgag       780 gtgacctgcg tggtggtgga tgtttcccat gaagatcctg aagtgaagtt caactggtac       840 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactct       900 acctacagag tggtttctgt gctcactgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag       960 tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgctccta tcgagaagac catcagcaag      1020 gctaagggcc agcctcgcga acctcaggtg tacgtgtatc ctccttcccg ggacgagctg      1080 accaagaacc aagtgtctct gacctgcctg gtgaaaggct tctacccctc cgacatcgcc      1140 gtggaatggg agtccaatgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc tccagtgctg      1200 gactccgatg gctccttcgc cctggtgtcc aagctgacag tagacaagtc tagatggcag      1260 cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatag attcacacag      1320 aagtccctgt ctctgtcccc tggc                                             1344 ＜210＞  21 ＜211＞  480 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  b-anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 130                 135                 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 145                 150                 155                 160 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr 165                 170                 175 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 180                 185                 190 Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 195                 200                 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 210                 215                 220 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 225                 230                 235                 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 245                 250                 255 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 260                 265                 270 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 275                 280                 285 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 290                 295                 300 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 305                 310                 315                 320 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 325                 330                 335 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 340                 345                 350 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 355                 360                 365 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 370                 375                 380 Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 385                 390                 395                 400 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 405                 410                 415 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 420                 425                 430 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 435                 440                 445 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 450                 455                 460 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475                 480 ＜210＞  22 ＜211＞  1443 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  b-anti-Her2-scFv-VH-K30E-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  22 gaggtgcaac tggtggaatc cggcggggga ctggtccaac ctggagggag cctgcggctg        60 tcttgcgccg cctctggctt caacatcgag gatacctaca tccactgggt gcggcaggcc       120 cctggcaagg gcctggaatg ggtcgctaga atctacccta ccaacggcta caccagatac       180 gccgactctg taaagggcag attcaccatc tctgccgata catctaagaa caccgcctac       240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgctc ccggtggggc       300 ggtgacggct tttacgccat ggactactgg ggacaaggca cacttgttac ggtgtcctct       360 ggaggcggcg gctccggcgg cggcggctct ggcggaggcg gctctggcgg cggcggatct       420 gatatccaga tgacccagtc tcctagctcc ctctccgcct ccgtgggcga cagagtgaca       480 atcacctgca gagcttctca ggacgtgaac accgctgtgg cctggtacca gcagaagcct       540 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactct gcttccttcc tgtactccgg cgtgcccagc       600 cggttctccg gctctcggtc cggcaccgac ttcactctga ccatctccag cctgcagcct       660 gaagatttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctcccac cttcggccag       720 ggcaccaaag tggagatcaa gggcgagccc aagtcctccg ataaaaccca cacctgtcct       780 ccttgccctg cccctgaact actgggcggc ccttctgtgt tcctgttccc tcctaagccc       840 aaggacaccc tgatgatctc tagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct       900 cacgaggacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc       960 aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctaca gagtggtctc cgtgctgacc      1020 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct      1080 ctgcctgctc ctatcgagaa gacaatctcc aaggccaaag gccagcctcg ggagcctcag      1140 gtgtacaccc tgcctccttg tagagaggaa atgaccaaga accaggtgtc tctgtggtgc      1200 ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc      1260 gagaacaact acaagactac cccacctgtg ctggactccg atggctcctt cttcctgtac      1320 tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg      1380 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaaatccc tgtctctgtc ccctggcaag      1440 tga                                                                    1443 ＜210＞  23 ＜211＞  480 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  b-anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 130                 135                 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 145                 150                 155                 160 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr 165                 170                 175 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 180                 185                 190 Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 195                 200                 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 210                 215                 220 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 225                 230                 235                 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 245                 250                 255 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 260                 265                 270 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 275                 280                 285 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 290                 295                 300 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 305                 310                 315                 320 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 325                 330                 335 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 340                 345                 350 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 355                 360                 365 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 370                 375                 380 Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 385                 390                 395                 400 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 405                 410                 415 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 420                 425                 430 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 435                 440                 445 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 450                 455                 460 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475                 480 ＜210＞  24 ＜211＞  1443 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  b-anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  24 gaggtgcaac tggtggaatc cggcggggga ctggtccaac ctggagggag cctgcggctg        60 tcttgcgccg cctctggctt caacatcaag gatacctaca tccactgggt gcggcaggcc       120 cctggcaagg gcctggaatg ggtcgctaga atctacccta ccaacggcta caccagatac       180 gccgactctg taaagggcag attcaccatc tctgccgata catctaagaa caccgcctac       240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgctc ccggtggggc       300 ggtgacggct tttacgccat ggactactgg ggacaaggca cacttgttac ggtgtcctct       360 ggaggcggcg gctccggcgg cggcggctct ggcggaggcg gctctggcgg cggcggatct       420 gatatccaga tgacccagtc tcctagctcc ctctccgcct ccgtgggcga cagagtgaca       480 atcacctgca gagcttctca ggacgtgaac accgctgtgg cctggtacca gcagaagcct       540 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactct gcttcctacc tgtactccgg cgtgcccagc       600 cggttctccg gctctcggtc cggcaccgac ttcactctga ccatctccag cctgcagcct       660 gaagatttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctcccac cttcggccag       720 ggcaccaaag tggagatcaa gggcgagccc aagtcctccg ataaaaccca cacctgtcct       780 ccttgccctg cccctgaact actgggcggc ccttctgtgt tcctgttccc tcctaagccc       840 aaggacaccc tgatgatctc tagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct       900 cacgaggacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc       960 aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctaca gagtggtctc cgtgctgacc      1020 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct      1080 ctgcctgctc ctatcgagaa gacaatctcc aaggccaaag gccagcctcg ggagcctcag      1140 gtgtacaccc tgcctccttg tagagaggaa atgaccaaga accaggtgtc tctgtggtgc      1200 ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc      1260 gagaacaact acaagactac cccacctgtg ctggactccg atggctcctt cttcctgtac      1320 tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg      1380 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaaatccc tgtctctgtc ccctggcaag      1440 tga                                                                    1443 ＜210＞  25 ＜211＞  480 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VH-VL-Fc的胺基酸序列 ＜400＞  25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 130                 135                 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 145                 150                 155                 160 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr 165                 170                 175 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 180                 185                 190 Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 195                 200                 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 210                 215                 220 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 225                 230                 235                 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 245                 250                 255 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 260                 265                 270 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 275                 280                 285 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 290                 295                 300 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 305                 310                 315                 320 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 325                 330                 335 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 340                 345                 350 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 355                 360                 365 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 370                 375                 380 Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 385                 390                 395                 400 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 405                 410                 415 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 420                 425                 430 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 435                 440                 445 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 450                 455                 460 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475                 480 ＜210＞  26 ＜211＞  1440 ＜212＞  DNA ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  anti-Her2-scFv-VH-VL-Fc的核苷酸序列 ＜400＞  26 gaggtgcaac tggtggaatc cggcggggga ctggtccaac ctggagggag cctgcggctg        60 tcttgcgccg cctctggctt caacatcaag gatacctaca tccactgggt gcggcaggcc       120 cctggcaagg gcctggaatg ggtcgctaga atctacccta ccaacggcta caccagatac       180 gccgactctg taaagggcag attcaccatc tctgccgata catctaagaa caccgcctac       240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgctc ccggtggggc       300 ggtgacggct tttacgccat ggactactgg ggacaaggca cacttgttac ggtgtcctct       360 ggaggcggcg gctccggcgg cggcggctct ggcggaggcg gctctggcgg cggcggatct       420 gatatccaga tgacccagtc tcctagctcc ctctccgcct ccgtgggcga cagagtgaca       480 atcacctgca gagcttctca ggacgtgaac accgctgtgg cctggtacca gcagaagcct       540 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactct gcttccttcc tgtactccgg cgtgcccagc       600 cggttctccg gctctcggtc cggcaccgac ttcactctga ccatctccag cctgcagcct       660 gaagatttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctcccac cttcggccag       720 ggcaccaaag tggagatcaa gggcgagccc aagtcctccg ataaaaccca cacctgtcct       780 ccttgccctg cccctgaact actgggcggc ccttctgtgt tcctgttccc tcctaagccc       840 aaggacaccc tgatgatctc tagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct       900 cacgaggacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc       960 aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctaca gagtggtctc cgtgctgacc      1020 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct      1080 ctgcctgctc ctatcgagaa gacaatctcc aaggccaaag gccagcctcg ggagcctcag      1140 gtgtacaccc tgcctccttg tagagaggaa atgaccaaga accaggtgtc tctgtggtgc      1200 ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc      1260 gagaacaact acaagactac cccacctgtg ctggactccg atggctcctt cttcctgtac      1320 tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg      1380 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaaatccc tgtctctgtc ccctggcaag      1440 ＜210＞  27 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜221＞  UNSURE ＜222＞  (5) ＜223＞  Xaa is K or E ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的重鏈CDR1 ＜400＞  27 Gly Phe Asn Ile Xaa Asp Thr Tyr Ile His 1               5                   10 ＜210＞  28 ＜211＞  17 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的重鏈CDR2 ＜400＞  28 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1               5                   10                  15 Gly ＜210＞  29 ＜211＞  12 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的重鏈CDR3 ＜400＞  29 Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 1               5                   10 ＜210＞  30 ＜211＞  13 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈CDR1 ＜400＞  30 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp 1               5                   10 ＜210＞  31 ＜211＞  7 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈CDR2 ＜400＞  31 Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser 1               5 ＜210＞  32 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈CDR3 ＜400＞  32 Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1               5 ＜210＞  33 ＜211＞  7 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈CDR2 ＜400＞  33 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1               5 ＜210＞  34 ＜211＞  7 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜221＞  UNSURE ＜222＞  (4) ＜223＞  Xaa is F or Y ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈CDR2 ＜400＞  34 Ser Ala Ser Xaa Leu Tyr Ser 1               5 ＜210＞  35 ＜211＞  120 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的重鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115                 120 ＜210＞  36 ＜211＞  107 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20                  25                  30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35                  40                  45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50                  55                  60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65                  70                  75                  80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85                  90                  95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100                 105 ＜210＞  37 ＜211＞  119 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第二抗原結合片段的重鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20                  25                  30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100                 105                 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 ＜210＞  38 ＜211＞  107 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第二抗原結合片段的輕鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20                  25                  30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35                  40                  45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50                  55                  60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65                  70                  75                  80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85                  90                  95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100                 105 ＜210＞  39 ＜211＞  107 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20                  25                  30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35                  40                  45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50                  55                  60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65                  70                  75                  80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85                  90                  95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100                 105 ＜210＞  40 ＜211＞  120 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的重鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115                 120 ＜210＞  41 ＜211＞  120 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜221＞  UNSURE ＜222＞  (30) ＜223＞  Xaa is K or E ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的重鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Xaa Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115                 120 ＜210＞  42 ＜211＞  107 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜221＞  UNSURE ＜222＞  (53) ＜223＞  Xaa is F or Y ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的輕鏈可變區胺基酸序列 ＜400＞  42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1               5                   10                  15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20                  25                  30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35                  40                  45 Tyr Ser Ala Ser Xaa Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50                  55                  60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65                  70                  75                  80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85                  90                  95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100                 105 ＜210＞  43 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  第一抗原結合片段的重鏈CDR1 ＜400＞  43 Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr Tyr Ile His 1               5                   10 ＜210＞  44 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜400＞  44 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 1               5                   10 ＜210＞  45 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜400＞  45 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp 1               5                   10 ＜210＞  46 ＜211＞  17 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜400＞  46 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1               5                   10                  15 Gly ＜210＞  47 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜400＞  47 Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 1               5                   10 ＜210＞  48 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜400＞  48 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala 1               5                   10 ＜210＞  49 ＜211＞  7 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜400＞  49 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1               5 ＜210＞  50 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  鼠(Mus musculus) ＜400＞  50 Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr 1               5 ＜210＞  51 ＜211＞  475 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  二價單特異性抗體的胺基酸序列 ＜400＞  51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1               5                   10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr 20                  25                  30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35                  40                  45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85                  90                  95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100                 105                 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115                 120                 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 130                 135                 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145                 150                 155                 160 Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165                 170                 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly 180                 185                 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195                 200                 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210                 215                 220 Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225                 230                 235                 240 Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245                 250                 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260                 265                 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275                 280                 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290                 295                 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305                 310                 315                 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325                 330                 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340                 345                 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355                 360                 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370                 375                 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385                 390                 395                 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405                 410                 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420                 425                 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435                 440                 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450                 455                 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465                 470                 475 ＜210＞  52 ＜211＞  14 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  連接肽的胺基酸序列 ＜400＞  52 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1               5                   10 ＜210＞  53 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  連接肽的胺基酸序列 ＜400＞  53 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1               5                   10                  15 ＜210＞  54 ＜211＞  20 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  連接肽的胺基酸序列 ＜400＞  54 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1               5                   10                  15 Gly Gly Gly Ser 20 ＜210＞  55 ＜211＞  7 ＜212＞  PRT ＜213＞  人工序列(Artificial Sequence) ＜220＞ ＜223＞  連接肽的胺基酸序列 ＜400＞  55 Gly Gly Gly Pro Gly Lys Arg 1               5
圖1為anti-HER2雙特異抗體Expi Her2-2糖譜分析； 圖2為anti-HER2雙特異抗體23C2 Her2-2糖譜分析； 圖3為聯用的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗、以及anti-HER2雙特異抗體對BT474腫瘤細胞的殺傷率； 圖4為曲妥珠單抗、聯用的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗、T-DM1以及anti-HER2雙特異抗體對NCI-N87腫瘤細胞的殺傷率； 圖5為曲妥珠單抗、聯用的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗、T-DM1以及anti-HER2雙特異抗體對JIMT-1腫瘤細胞的殺傷率； 圖6為曲妥珠單抗、聯用的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗、以及anti-HER2雙特異抗體對BT474腫瘤細胞的增殖抑制； 圖7為聯用的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗、以及anti-HER2雙特異性抗體對胃癌N87小鼠異種腫瘤移植模型的小鼠腫瘤體積變化的影響； 圖8為聯用的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗、以及anti-HER2雙特異性抗體對胃癌N87小鼠異種腫瘤藥效中的小鼠體重變化的影響； 圖9為一些示例性的anti-HER2雙特異性抗體的結構；其中用一條顯示為黑色的鏈（第一Fc多肽）和另一條顯示為灰色的鏈（第二Fc多肽）描繪二聚Fc，第一抗原結合片段為scFv，與第一Fc多肽融合，而第二抗原結合片段為Fab，與第二Fc多肽融合。

Claims (20)

  1. 一種抗原結合建構體，其包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD4抗原的第一抗原結合片段，所述第一抗原結合片段為scFv；所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置30處的胺基酸突變，優選地，突變後的胺基酸為E，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的位置53處的胺基酸突變，優選地，突變後的胺基酸為Y。
  2. 根據請求項1所述的抗原結合建構體，其中所述第一抗原結合片段的重鏈可變區包含根據Kabat編號系統的K30E突變，或/和所述第一抗原結合片段的輕鏈可變區包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
  3. 根據請求項1或2所述的抗原結合建構體，其為抗體。
  4. 根據請求項1-3任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含選自以下的CDR的組：i .包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列；ii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；iii. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列；iv. 包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；v. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列；vi. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：27、28和29的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含與分別根據SEQ ID NOs：30、34和32的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；vii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列；viii. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：43、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、33和32的胺基酸序列；或ix. 包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3，所述重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：44、28和29的胺基酸序列，所述輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3包含分別根據SEQ ID NOs：30、31和32的胺基酸序列。
  5. 根據請求項1-4任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段包含曲妥珠單抗的重鏈可變區或其突變體，以及曲妥珠單抗的輕鏈可變區或其突變體，所述重鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的K30E突變，所述輕鏈可變區的突變體包含根據Kabat編號系統的F53Y突變。
  6. 根據請求項4-5任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段選自：i. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列；ii. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含與分別根據SEQ ID NOs：41和42的胺基酸序列具有至少80%同一性的胺基酸序列；iii. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和36的胺基酸序列；iv. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：35和39的胺基酸序列；或v. 所述的第一抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區和輕鏈可變區包含分別根據SEQ ID NOs：40和36的胺基酸序列。
  7. 根據請求項1-6任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的第一抗原結合片段的VH和VL從N-末端到C-末端按照如下順序排列：VH-linker-VL。
  8. 根據請求項1-7任一項所述的抗原結合建構體，其中所述抗原結合建構體還包含單價且特異性地結合HER2表達細胞上的HER2的ECD2抗原的第二抗原結合片段。
  9. 根據請求項8所述的抗原結合建構體，其中所述的第二抗原結合片段為Fab。
  10. 根據請求項8或9所述的抗原結合建構體，其中所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。
  11. 根據請求項8或9所述的抗原結合建構體，其中所述的第二抗原結合片段包含帕妥珠單抗的重鏈可變區和帕妥珠單抗的輕鏈可變區。
  12. 根據請求項8-11任一項所述的抗原結合建構體，其中抗原結合建構體包含與第一抗原結合片段或/和第二抗原結合片段可操作地連接的免疫球蛋白功能域，所述免疫球蛋白功能域包含：i. CL，CH1，CH2，或CH3中的一個多幾個，或者ii. Fc。
  13. 根據請求項12所述的抗原結合建構體，其中所述Fc為包含第一Fc多肽和第二Fc多肽的二聚Fc，所述第一抗原結合片段與所述第一Fc多肽的可操作地連接，所述第二抗原結合片段與所述第二Fc多肽的可操作地連接。
  14. 根據請求項1所述的抗原結合建構體，其選自下組：i. 所述抗原結合建構體為二價雙特異性抗體，其包含：包含SEQ ID NO：11的重鏈、包含SEQ ID NO：13的重鏈和包含SEQ ID NO：15的輕鏈；ii. 所述抗原結合建構體為二價雙特異性抗體，其包含：包含SEQ ID NO：21的重鏈、包含SEQ ID NO：13的重鏈和包含SEQ ID NO：15的輕鏈；iii. 所述抗原結合建構體為二價雙特異性抗體，其包含：包含SEQ ID NO：23的重鏈、包含SEQ ID NO:13的重鏈和包含SEQ ID NO：15的輕鏈；iv. 所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列； v. 所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；或vi. 所述抗原結合建構體為二價單特異性抗體，其包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列。
  15. 根據請求項1-14任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的抗原結合建構體與第30位非E或/和第53位為非Y的抗原結合建構體相比具有降低的聚集性；或/和，所述的抗原結合建構體與第30位非E或/和第53位為非Y的抗原結合建構體相比未顯著降低對HER2的ECD4抗原或/和ECD2抗原的結合親和力。
  16. 根據請求項1-15任一項所述的抗原結合建構體，其中所述的抗原結合建構體是無岩藻糖基化的。
  17. 一種藥物組合物，其包含根據請求項1-16任一項所述的抗原結合建構體和藥學上可接受的載體。
  18. 一種分離的核酸或分離的核酸集合，其包含編碼根據請求項1-16任一項所述的抗原結合建構體的至少一個抗原結合片段的至少一個核酸序列。
  19. 一種製備根據請求項1-16任一項所述的抗原結合建構體的方法，其包括在適於表達所述抗原結合建構體的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含編碼所述抗原結合建構體的核酸；並且純化所述建構體。
  20. 一種如請求項1-16中任一項所述的抗原結合建構體或請求項17所述的藥物組合物在製備治療患有HER2表達腫瘤的受試者的藥物中的用途，其中腫瘤為膽道癌、癌肉瘤、食管癌、胃食管結合部癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、頭頸癌、結直腸癌、腎癌、宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮癌、惡性黑素瘤、咽癌、口腔癌或皮膚癌。
TW110115652A 2020-04-30 2021-04-29 靶向her2的抗原結合建構體及用途 TW202142570A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010365705.9 2020-04-30
CN202010365705 2020-04-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202142570A true TW202142570A (zh) 2021-11-16

Family

ID=78373353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110115652A TW202142570A (zh) 2020-04-30 2021-04-29 靶向her2的抗原結合建構體及用途

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230242632A1 (zh)
EP (1) EP4144760A1 (zh)
JP (1) JP2023523988A (zh)
KR (1) KR20230006823A (zh)
CN (1) CN115279791A (zh)
AU (1) AU2021262322A1 (zh)
BR (1) BR112022022036A2 (zh)
CA (1) CA3181589A1 (zh)
IL (1) IL297662A (zh)
MX (1) MX2022013632A (zh)
TW (1) TW202142570A (zh)
WO (1) WO2021219046A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5945311A (en) 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
AU2014348552A1 (en) * 2013-11-13 2016-06-02 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting EGFR and/or HER2 and uses thereof
US10947319B2 (en) * 2013-11-27 2021-03-16 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
CN107446045A (zh) * 2016-07-22 2017-12-08 北京天广实生物技术股份有限公司 一种抗her2的抗体、其药物组合物及用途
MX2019011656A (es) * 2017-03-27 2019-12-02 Hoffmann La Roche Formatos mejorados de receptor de union a antigeno.
CN112204052A (zh) 2018-04-05 2021-01-08 诺华股份有限公司 针对癌症的三特异性结合分子及其用途
CA3188508A1 (en) * 2020-08-13 2022-02-17 Xiquan Zhang Antibody drug conjugate

Also Published As

Publication number Publication date
EP4144760A9 (en) 2023-07-12
MX2022013632A (es) 2022-11-16
CA3181589A1 (en) 2021-11-04
KR20230006823A (ko) 2023-01-11
BR112022022036A2 (pt) 2022-12-13
EP4144760A1 (en) 2023-03-08
AU2021262322A1 (en) 2022-12-08
US20230242632A1 (en) 2023-08-03
CN115279791A (zh) 2022-11-01
JP2023523988A (ja) 2023-06-08
IL297662A (en) 2022-12-01
AU2021262322A9 (en) 2023-06-29
WO2021219046A1 (zh) 2021-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107922477B (zh) 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
JP5906233B2 (ja) 抗ＥｒｂＢ３抗体
EP3446707A1 (en) Surrogate binding proteins
JP2012507299A (ja) Ｌｉｇｈｔ標的分子およびその使用
JP7099709B2 (ja) ヒト化抗ベイシジン抗体およびその使用
TW201004645A (en) Anti-GD2 antibodies and methods and uses related thereto
KR20120060235A (ko) 특이성 결합 단백질 및 용도
WO2022078425A1 (zh) 抗her3抗体和抗her3抗体药物偶联物及其医药用途
CN111196856A (zh) 抗her2/pd1双特异性抗体
US20230340158A1 (en) Anti-vegf-anti-pd-l1 bispecific antibody, pharmaceutical composition of same, and uses thereof
KR20230051214A (ko) 항체 약물 접합체
EP4215549A1 (en) Anti-4-1bb-anti-pd-l1 bispecific antibody, and pharmaceutical composition and use thereof
EP4067378A1 (en) Antibody against c-kit and use thereof
JP2023545382A (ja) 抗体薬物複合体を含む医薬組成物及びその使用
WO2022184067A1 (zh) 抗tigit抗体在联合用药中的应用
TW202142570A (zh) 靶向her2的抗原結合建構體及用途
WO2021244554A1 (zh) 抗pdl1×egfr的双特异性抗体
CN112175087B (zh) 一种抗CD4和TGFβ的双特异性抗体、其药物组合及其用途
CN115304680A (zh) 基于Pep42构建的双特异性细胞接合器分子的制备及其应用
TWI843182B (zh) 一種抗b7-h4抗體及其製備方法和應用
WO2022111476A1 (zh) 抗PD-L1-抗VEGF-抗TGF-β多特异性抗体、其药物组合物及用途
JP2020532543A (ja) 抗ｅｇｆｒ抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）及びその使用
WO2023236991A1 (zh) 靶向her2，pd-l1和vegf的三特异性抗体
WO2023143535A1 (zh) 一种靶向il-18bp的抗体及其应用
WO2022073515A1 (zh) 抗pd-1抗体在联合用药中的应用