JP2012507299A - Ｌｉｇｈｔ標的分子およびその使用 - Google Patents

Ｌｉｇｈｔ標的分子およびその使用 Download PDF

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Abstract

ＬＩＧＨＴ標的分子（例えば、ＬＩＧＨＴ融合分子）、抗ＨＥＲ２抗体分子、組成物、例えば、その医薬組成物を開示する。過剰増殖性（例えば、新生物）障害または状態（癌および転移が挙げられるが、これらに限定されない）を治療、予防および／または診断するためのこれらの分子の使用方法も提供する。一実施形態において、本発明は、ＬＩＧＨＴ標的分子を提供し、これは、ヒトＬＩＧＨＴタンパク質もしくはその断片の少なくとも１つの細胞外ドメインを含み、ならびに癌細胞もしくは組織上の表面タンパク質に結合する抗体分子を標的とし、少なくとも２つの非隣接ポリペプチドを含む。
【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２００８年１０月３１日に出願された米国特許第６１／１１０，３５９号の優先権を米国特許法１１９条に基づいて主張し、本内容はそれらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
配列リスト
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されている配列リストを含み、本配列リストはその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。２００９年１０月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピー名はＢ２４７７０ＷＯ．ｔｘｔであり、１３４，２５５バイトのサイズである。
ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４またはＣＤ２５８としても知られている）は、リガンドのＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の成員である。この名称は、リンホトキシン様の、誘導性の発現を示し、かつヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）に対してＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合し、Ｔリンパ球によって発現される受容体（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ， ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ＨＳＶ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｆｏｒ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ （ＨＶＥＭ）， ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）に由来する。ＬＩＧＨＴは、活性化により、厳密に調節された様式でＴ細胞の表面上に発現する（非特許文献１）。ＬＩＧＨＴは、３種のＴＮＦスーパーファミリー受容体（リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）（非特許文献２、非特許文献３）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８７（３）： ４２７−３６）、およびデコイ受容体３（ＤｃＲ３）（Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ １３７３３−６）を含む）に結合することにより、その生体効果を媒介する。ＬＩＧＨＴは、受容体との相互作用時、ケモカイン発現および細胞接着分子調節などのいくつかの免疫刺激活性を示す（Ｗａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：１９６９−１９７９）。例えば、ＬＩＧＨＴおよびＬＴα１β２は、リンパ器官形成およびリンパ構造の発現において協働する（上記Ｓｃｈｅｕ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９５： １６１３−１６２４； Ｗａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００２））。ＬＩＧＨＴトランス遺伝子を介したＬＴβＲのシグナル伝達はケモカインおよび接着分子の発現の上方制御を誘発するのに十分であることが示されている（Ｗａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１３： ８２６−８３５）。ＬＩＧＨＴはまた、Ｔ細胞の初回刺激および拡大のためのＣＤ２８に依存しない共刺激活性を媒介し、腫瘍に対するＴ細胞免疫性の増強および／または増大した自己免疫性に到り得ることも示されている（Ｔａｍａｄａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：２８３−２８９； Ｗａｒｅ， Ｃ．Ｆ． （２００５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：７８７−８１９； Ｗａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４：８１７３−８１８２）。
Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７ ４２８４１−５１ Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４ ７０７−１０ Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９： ３２８８−９８
ＬＩＧＨＴに関連した広範囲の免疫刺激活性を考慮すると、様々な過剰増殖性疾患、例えば、新生物の疾患（癌および転移を含む）の治療でこれらのＬＩＧＨＴ関連活性を利用するために新規標的薬剤を同定する必要性が依然として存在する。
本発明は、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織に選択的に送達されることによって、１つ以上の抗腫瘍の反応（腫瘍細胞死および／または抗腫瘍免疫性が挙げられるが、これらに限定されない）を誘発するＬＩＧＨＴ標的分子（例えば、ＬＩＧＨＴタンパク質またはＬＩＧＨＴタンパク質をコードする核酸）の生成に少なくとも部分的に基づく。１つの例示的な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＨＥＲ２に結合する抗体分子との融合タンパク質（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物」と呼ぶ）を少なくとも１種含む。他の実施形態では、ＨＥＲ２に対する新規抗体分子が開示されている。したがって、本発明は、少なくとも部分的に、ＬＩＧＨＴ標的分子（例えば、ＬＩＧＨＴ融合分子）、抗ＨＥＲ２抗体分子、組成物、例えば、その医薬組成物、ならびに過剰増殖性（例えば、新生物）障害または状態（癌および転移が挙げられるが、これらに限定されない）を治療、予防および／または診断するためのこれらの分子の使用方法を提供する。
したがって、１つの態様では、本発明は、少なくとも１個のＬＩＧＨＴ部分（例えば、ＬＩＧＨＴタンパク質、またはその機能的変異体もしくはその断片（例えば、ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインまたはその一部）、および過剰増殖性細胞上の標的タンパク質（例えば、癌または腫瘍の細胞または組織上で発現した細胞表面タンパク質）と相互作用（例えば、結合）する少なくとも１個の標的部分（例えば、抗体分子などの結合剤）を含み、それによって、ＬＩＧＨＴ部分を、過剰増殖性細胞または組織に標的として向ける、送達する、あるいはもたらす、ＬＩＧＨＴ標的分子を特徴とする。実施形態では、ＬＩＧＨＴ分子は、（例えば、化学的結合、遺伝的またはポリペプチド融合、非共有結合などにより）標的部分に結合している。例えば、ＬＩＧＨＴ分子は、結合基（例えば、ペプチド結合基）によりもしくはよらず、遺伝的またはポリペプチド融合物として標的部分と融合できる。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ分子は、結合基（例えば、非タンパク質様生体適合性ポリマー）によりもしくはよらず反応基を介して抗体分子に共有結合している。ＬＩＧＨＴ標的分子は、少なくとも１個のＬＩＧＨＴ部分および少なくとも１個の標的部分の単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体以上であることができる。実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の隣接または非隣接ポリペプチド鎖を含むか、または本質的にそれからなる。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、１個、２個、３個、４個、５個または６個の単量体または二量体サブユニットを含むか、または本質的にそれからなり、各サブユニットは、少なくとも１個のＬＩＧＨＴ部分および少なくとも１個の標的部分を含む。例えば、ＬＩＧＨＴ標的分子は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個または６個のＬＩＧＨＴ融合分子を含んでよく、各融合分子は、少なくとも１個のＬＩＧＨＴ部分および少なくとも１個の標的部分を含む。いくつかの実施形態では、ＬＩＧＨＴ融合分子は、単鎖ポリペプチドであることができる（例えば、単鎖または単一ドメイン抗体に融合したＬＩＧＨＴ部分）、または少なくとも２個、３個、４個、５個、６個以上の非隣接ポリペプチド型、例えば、非隣接ポリペプチドの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体以上の複合体（例えば、抗体分子の一本鎖に融合したＬＩＧＨＴ部分、例えば、二本鎖抗体またはその抗原結合断片（例えば、図１および図２４に示すＦａｂ断片）となり得る。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、２個または３個のＬＩＧＨＴ融合分子を含むか、または本質的にそれからなり、それぞれ１個のＬＩＧＨＴ部分（例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ部分）および１個の標的部分（例えば、本明細書に記載の標的部分、例えば、Ｆａｂ抗体断片）を含むか、または本質的にそれからなる。別の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、図１または図２４に示すようにそれぞれ三量体または二量体配置を有する。
実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子のＬＩＧＨＴ部分は、少なくとも１個のＬＩＧＨＴタンパク質、またはその機能的変異体もしくはその断片を含むか、または本質的にそれからなる。ＬＩＧＨＴタンパク質は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴの可溶型、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン（例えば、ＬＩＧＨＴまたはその一部の完全細胞外ドメイン）の可溶型であることができる。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴタンパク質、その変異体もしくはその断片は、以下が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上のＬＩＧＨＴ関連活性を有する：（ｉ）１種以上のＬＩＧＨＴ受容体（例えば、リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、および／またはデコイ受容体３（ＤｃＲ３））に結合すること；（ｉｉ）１種以上のケモカインまたはサイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＩＬ−５、ＩＬ−８および／またはＴＮＦ）、ケモカインまたはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１０ＲＡ）、接着分子、および／または共刺激分子の発現を誘発すること；（ｉｉｉ）Ｔ細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＣＤ４もしくはＣＤ８発現Ｔ細胞、および／または調節Ｔ細胞を活性化させること；（ｉｖ）Ｔ細胞を過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織中に動員すること；（ｖ）腫瘍反応性Ｔ細胞増殖を活性化させることおよび／または増強すること；（ｖｉ）リンパ様微環境を、例えば、過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織に生成すること；（ｖｉｉ）過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織のアポトーシスを誘発すること；ならびに／または（ｖｉｉｉ）対象において免疫応答を刺激すること、例えば、過剰増殖性（例えば、腫瘍または癌性）細胞または組織に対する対象の免疫系を刺激すること。
ＬＩＧＨＴ部分のＬＩＧＨＴタンパク質の例は、以下に由来するアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる：（ｉ）（ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）の細胞外ドメインの一部に対応する）の約９３〜２４０位のアミノ酸；（Δ４リンカーを介した抗ＨＥＲ２抗体分子７１Ｆ１０のＦａｂ抗体分子の重鎖断片に融合した、本明細書で「ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０」と呼ぶＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）配列番号２の約２５３〜４００位のアミノ酸；（Ｇ４ＳΔ４リンカーを介した抗ＨＥＲ２抗体分子７１Ｆ１０のＦａｂ抗体分子の重鎖断片に融合した、本明細書で「ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１」と呼ぶＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）配列番号３の約２５８〜４０５位のアミノ酸；（（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介した抗ＨＥＲ２抗体分子７１Ｆ１０のＦａｂ抗体分子の重鎖断片に融合した、本明細書で「ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２」と呼ぶＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）配列番号４の約２４５〜３９２位のアミノ酸、またはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；または（ｉｉ）以下のうちの１つ以上からから選択されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列：配列番号５の約２７７〜７２０位のヌクレオチド（ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）；配列番号６の約７５７〜１２００位のヌクレオチド（Δ４リンカーを介した７１Ｆ１０ Ｆａｂ抗体分子の重鎖断片に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）の一部に対応するヌクレオチド配列；配列番号７の約７７２〜１２１５位のヌクレオチド（Ｇ４ＳΔ４リンカーを介した７１Ｆ１０ Ｆａｂ抗体分子の重鎖断片に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）の一部に対応するヌクレオチド配列）；または配列番号８の約７３３〜１１７６位のヌクレオチド（（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介した７１Ｆ１０ Ｆａｂ抗体分子の重鎖断片に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメイン（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）の一部に対応するヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）。
ＬＩＧＨＴ部分は任意に、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１に対応する配列番号１の約６１〜９２位のアミノ酸；Δ４リンカーを介した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）に対応する配列番号２の約２２５〜２５２位のアミノ酸；Ｇ４ＳΔ４リンカーを介した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）に対応する配列番号３の約２３０〜２５７位のアミノ酸；またはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；または、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１をコードするヌクレオチド配列に対応する配列番号５の約１８１〜２７６位のヌクレオチド由来のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；Δ４リンカーを介した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）をコードするヌクレオチド配列に対応する配列番号６の約６７３〜７５６位のヌクレオチド；Ｇ４ＳΔ４リンカーを介した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）をコードするヌクレオチド配列に対応する配列番号７の約６８８〜７７１位のヌクレオチド、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）由来のＬＩＧＨＴまたはその変異体の細胞外ドメインの１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）を含み得るか、または本質的にそれからなり得る。
ＬＩＧＨＴの１つ以上の特性、例えば、タンパク質の安定性、免疫増強機能を増大するために改変したＬＩＧＨＴタンパク質の変異体、またはその可溶性断片（例えば、ＬＩＧＨＴ細胞外ドメインまたはその一部）を使用できる。例えば、ＬＩＧＨＴタンパク質は、１つ以上のタンパク質分解部位を実質的に不活性化させるように（例えば、タンパク質分解部位の欠失、変異および／または他の不活性化により、例えば、アミノ酸挿入により）修飾することができる。１つの実施形態では、タンパク質分解部位８２〜８３位のヒトＬＩＧＨＴ配列（ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１、配列番号１）、または７９〜８２位のマウスＬＩＧＨＴ配列由来のアミノ酸ＥＫＬＩ（配列番号１０）を含むアミノ酸ＥＱＬＩ（配列番号９）を除去する。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴタンパク質非ヒト起源であり、例えば、マウスＬＩＧＨＴ由来のＬＩＧＨＴタンパク質を使用できる。完全長マウスＬＩＧＨＴのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１１３および１１４で示す。
他の実施形態では、標的部分は、ＬＩＧＨＴ部分が所望の部位（例えば、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織）に対して１つ以上のＬＩＧＨＴ関連活性（例えば、１つ以上の本明細書に記載のＬＩＧＨＴ関連活性）を誘発するように、ＬＩＧＨＴ部分を所望の部位に、例えば、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織に対して送達する、向ける、またはもたらす。ある実施形態では、標的部分は、ＬＩＧＨＴ部分に実質的に依存しない抗腫瘍または抗癌細胞効果を有し得る（例えば、腫瘍の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および／または生存に関与する細胞表面タンパク質もしくは受容体の１つ以上の活性（受容体リン酸化反応、受容体オリゴマー化が挙げられるが、これらに限定されない）の阻害、ならびに／または腫瘍細胞増殖もしくは転移の阻止もしくは遅延化（ｒｅｔａｒｄｉｎｇ）により）。
理論に縛られないが、出願者らは、本発明のＬＩＧＨＴ標的分子を介したＬＩＧＨＴの腫瘍に標的化した送達は、以下の活性の少なくとも１つ以上を通して過剰増殖性および／もしくは腫瘍増殖を阻害、遮断あるいは低減することができると考えている：（ｉ）リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）の活性化（例えば、ＬＴβＲシグナル伝達を通して１つ以上の腫瘍細胞の細胞傷害性を引き起こすことおよび／もしくは細胞傷害性Ｔリンパ球を腫瘍中に動員すること）；（ｉｉ）ＨＶＥＭの活性化；（ｉｉｉ）１種以上のケモカインもしくはサイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＩＬ−５、ＩＬ−８および／またはＴＮＦ）、ケモカインもしくはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１０ＲＡ）、接着分子、および／もしくは共刺激分子の発現を誘発すること；（ｉｖ）Ｔ細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＣＤ４もしくはＣＤ８発現Ｔ細胞、および／もしくは調節Ｔ細胞を活性化させること；ならびに／または（ｖ）例えば、標的部分（例えば、Ｆａｂ抗体分子）もしくはＬＩＧＨＴ部分を介して抗腫瘍活性を指向し、それによって、過剰増殖性細胞もしくは腫瘍（原発性腫瘍および転移を含む）に対し効果的なＴ細胞応答を搭載することにより標的化した腫瘍細胞死を誘発する。いくつかの実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的部分は、成長因子シグナル伝達の低減、阻害、あるいは遮断（例えば、リン酸化反応、受容体二量体化などのシグナル伝達経路の１つ以上の低減）を引き起こす。ＬＩＧＨＴ標的分子のために提唱された作用機序の１つの略図を本明細書の図３に示す。
標的部分に標的化できる過剰増殖性（例えば、癌性）細胞もしくは組織の例としては、乳房、肺、胃、卵巣、前立腺、膵臓、結腸、結腸直腸、腎臓、膀胱、肝臓、頭部、頸部、脳の癌もしくは固形腫瘍、ならびに軟組織悪性腫瘍（リンパ性悪性腫瘍、白血病および骨髄腫を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。標的部分は、１個以上の標的分子、例えば、１個以上の本明細書に記載の過剰増殖性細胞または組織上に発現した可溶性または細胞表面タンパク質に結合できる。例えば、標的部分は、１種以上の成長因子受容体（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ｃｒｉｐｔｏ）；癌関連インテグリンもしくはインテグリン受容体（例えば、αｖβ６、α６β４、ラミニン受容体（ＬＡＭＲ））；ならびに／またはＣＤ２３、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＥｐＣＡＭ、Ｔｗｅａｋ受容体（ＦＮ１４）癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＡＧ−７２、および／もしくは、とりわけＶＥＧＦに結合できる。標的部分により認識される標的分子のさらなる例を本明細書に記載する。
ある実施形態では、標的部分は、抗体分子または受容体リガンド（例えば、成長因子またはホルモン）である。標的部分が抗体分子である実施形態では、この抗体分子は、モノクローナルもしくは単特異的抗体、またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体またはその変異体（例えば、重鎖または軽鎖可変ドメインの単量体または二量体、例えば、ＶＨ、ＶＨＨ））；単鎖Ｆｃ断片、二重特異的抗体（ｄＡｂ）、ラクダ抗体；ＶＨもしくはＶＬドメインのレパートリー、または他の足場（例えば、フィブロネクチンドメインまたは足場、Ｔ細胞受容体、アフィボディ分子など（例えば、アフィボディタンパク質Ｚ足場または、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４（１２）：３８４０−３８４９； Ａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ５０：７８１−７８９）に記載されている他の分子、リポカリン、アンキリン反復、ＬＤＬ受容体ドメイン、ＲＮＡアプタマー、ＰＤＺドメインおよび微小体）（または上記抗体分子の１つ以上の組み合わせ）上へ移植された１個、２個、または全３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）であることができる。抗体分子は、所望の細胞表面タンパク質（例えば、本明細書に記載の細胞表面タンパク質）と相互作用（例えば、結合）することができる。例えば、抗体分子は、単鎖（例えば、単鎖Ｆｃ）およびＦａｂまたはｓｃＦｖの組み合わせを含み得る。他の実施形態では、抗体分子は、多特異的（例えば、二価または二重特異性）抗体またはその断片であることができる。いくつかの実施形態では、抗体分子は、細胞表面タンパク質上の単一のエピトープに結合する。他の実施形態では、抗体分子は、多特異的抗体であり、１つ以上の細胞表面タンパク質（例えば、１つ以上の本明細書に記載の細胞表面タンパク質）上で２個以上のエピトープに結合する。典型的には、抗体分子は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ抗体、サメ抗体、またはインビトロ生成抗体（またはその機能的断片、例えば、本明細書に記載の抗原結合断片）である。ある実施形態では、抗体分子は、少なくとも１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を特徴とする親和性で細胞表面タンパク質に結合する。
抗体分子は、完全長であることができる（例えば、少なくとも１個、典型的には２個の完全な重鎖、および少なくとも１個、典型的には２個の完全な軽鎖を含むことができる）かまたは、抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、または他の本明細書に記載の抗原結合断片）を含むことができる。さらに他の実施形態では、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から；特に、例えば、（例えば、ヒト）抗体の重鎖定常領域のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域（またはその一部、例えば、ＣＨ１領域）を有する。別の実施形態では、抗体分子は、例えば、κもしくはλの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域、またはその一部から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基（−Ｓ−Ｓ−結合）数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能の１つ以上を増大するまたは低減する）ように改変、例えば、変異させることができる。
ＬＩＧＨＴ標的分子の例を、図１〜３（図式）、６、および２４（二量体形態）として、または配列番号２〜４、６〜８、１０１〜１０４、１０９〜１１０、１６２〜１６３、１６７〜１６８、１７３〜１７４および１７８〜１７９（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む）として示す。これらの分子の例としては、ＬＩＧＨＴ部分およびＦａｂ断片の単量体、二量体または三量体形態への融合物または複合体が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ部分（例えば、本明細書に記載のヒトＬＩＧＨＴ断片（例えば、配列番号１の約９３〜２４０位のアミノ酸（ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の細胞外ドメインの一部に対応する））のＮ末端は、例えば、ポリペプチド融合物として、結合基を介してＦａｂ重鎖可変ドメインに融合したＦａｂ重鎖定常領域（例えば、ＩｇＧ１の一部、または完全な、ＣＨ１ヒンジ領域）のＣ末端領域に共有結合しており、Ｆａｂの重鎖および軽鎖が互いに結合している（図１または図２４）。１つの実施形態では、融合物中に用いられたＦａｂ ＣＨ１領域の一部は、図１に示した三量体としての３個のＬＩＧＨＴ−Ｆａｂ融合物の会合に寄与し、ＬＩＧＨＴ融合物ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２、ｐＢＩＩＢＣＤ２３−２０４およびｐＢＩＩＢＣ０６−１１７により例証される（本明細書の実施例６、７および２７を参照されたい）。他の実施形態では、ＩｇＧ１の完全ＣＨ１領域（例えば、配列番号１７２の約２２５〜２３２位のアミノ酸）が融合物に使用され、図２４に示すように１個以上のジスルフィド結合形成により安定した二量体としての２個のＬＩＧＨＴ−Ｆａｂ融合物の会合に寄与する（実施例２８）。
ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、以下の配置を有する少なくとも２個の非隣接ポリペプチドを含むことができる：軽鎖定常領域（ＣＬ）に融合した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、例えば、ＶＬ−ＣＬを有する第一のポリペプチド；ならびに、一部または完全な重鎖定常領域（ＣＨ、特に、ＣＨ１）に融合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であり、それが結合基（Ｌ）によりもしくはよらず、ＬＩＧＨＴ部分（例えば、本明細書に記載のヒトＬＩＧＨＴ断片）のＮ末端に融合している、例えば、ＶＨ−ＣＨ−（任意）−Ｌ-ＬＩＧＨＴ部分を有する第二のポリペプチド。ＬＩＧＨＴ−Ｆａｂ融合物は、二量体としてまたは三量体複合体（例えば、約２２０ｋＤの三量体複合体）としてまたは二量体複合体（例えば、約１５０ｋＤの二量体複合体）として結合できる。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ−完全抗体融合物または複合体、例えば、ＬＩＧＨＴ部分のＮまたはＣ末端領域が、例えば、ポリペプチド融合物として、完全抗体の各重鎖のＣ末端に共有結合している融合物または複合体（例えば、約２００ｋＤａのＬＩＧＨＴ二量体複合体形成）を使用できる（図２）。さらなる他の実施形態では、ＦａｂのＶＨ領域のＣ末端に融合した単鎖Ｆｃは、例えば、ポリペプチド融合物として、ＬＩＧＨＴ部分に単量体、二量体または三量体形態で共有結合している（図２）。さらに他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ部分は、例えば、ポリペプチド融合物として、単鎖Ｆｖに単量体、二量体または三量体形態で共有結合している（図２）。別の実施形態では、１個以上のアフィボディドメインがＬＩＧＨＴ部分に共有結合している（図２）。さらに別の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＬＩＧＨＴ部分は、例えば、ポリペプチド融合物として、Ｆａｂに単量体、二量体または三量体形態で共有結合している（図２または図２４）。
ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ部分および標的部分は、（例えば、化学的結合、遺伝的またはポリペプチド融合、非共有結合などにより）機能的に結合している。例えば、ＬＩＧＨＴ分子は、結合基（例えば、ペプチド結合基）によりもしくはよらず、標的部分に遺伝的またはポリペプチド融合物として融合できる。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ分子は、反応基を介して、任意に、生体適合性、非タンパク質様ポリマーを介して、抗体分子に共有結合している。結合基は、当業者に明らかな任意の結合基であることができる。例えば、結合基は、長さ１〜１００原子の生体適合性ポリマーであることができる。１つの実施形態では、結合基は、ポリグリシン、ポリセリン、ポリリシン、ポリグルタミン酸塩、ポリイソロイシン、またはポリアルギニン残基、またはそれらの組み合わせを含むか、もしくはそれからなる。例えば、ポリグリシンまたはポリセリンリンカーは、少なくとも５個、１０個、１５個または２０個のグリシンおよびセリン残基を、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号１４５）の１、２、３、４、５個以上の反復、例えば、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒの３または４個の反復（配列番号１３４）の配置で含むことができる。他の実施形態では、結合基は、ＬＩＧＨＴまたはその変異体の細胞外ドメイン由来、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の配列番号１の約６１〜９２位のアミノ酸由来の１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）の約２２５〜２５２位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）の約２３０〜２５７位のアミノ酸、もしくはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；またはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の配列番号５の約１８１〜２７６位のヌクレオチド由来のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）の約６７３〜７５６位のヌクレオチド、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）の約６８８〜７７１位のヌクレオチド、もしくはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含み得る。あるいは、結合基としては、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号１４６）の反復ならびにＬＩＧＨＴもしくはその変異体の細胞外ドメイン由来の１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の配列番号１の約６１〜９２位のアミノ酸由来、Δ４結合基による７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）の約２２５〜２５２位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）の約２３０〜２５７位のアミノ酸、もしくはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；またはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の配列番号５の約１８１〜２７６位のヌクレオチド由来のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）の約６７３〜７５６位のヌクレオチド、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）の約６８８〜７７１位のヌクレオチド、もしくはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）の１つ以上の組み合わせを挙げ得る。ＬＩＧＨＴ融合物に使用できるリンカーの例は、配列番号１３２（Δ４）、配列番号１３３（Ｇ４ＳΔ４）および配列番号１３４（Ｇ４Ｓ）として示される、またはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列である。
他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ部分および標的部分は、ＬＩＧＨＴまたは標的部分の定義したアミノ酸に、例えば、１個の反応基、例えば、サクシニミジルまたはマレイミド含有基の共有結合により化学的に結合している。ＬＩＧＨＴ部分および標的部分が化学的に結合している実施形態では、反応基は、生体適合性ポリマー、例えば、ＡＥＡ（（２−アミノ）エトキシ酢酸）、ＡＥＥＡ（［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸）およびＯＡ（式ＮＨ２−（ＣＨ２）７−ＣＯＯＨの８−アミノオクタン酸（８−アミノカプリル酸とも呼ばれる））、またはそれらの組み合わせの１つ以上から選択される単量体を有するポリマーに任意に結合していてよい。結合基は、上記生体適合性ポリマーの任意の組み合わせを含むことができる。
１つの例示的な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＨＥＲ２に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物」と呼ぶ）を少なくとも１個含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物は、図１および３に示すように約２００〜２５０ｋＤａ、典型的には約２２０ＫＤａの三量体中の少なくとも３個の融合分子（例えば、配列番号２〜４のアミノ酸配列を有するか、またはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列）；または図２および２４に示すように約１００〜２００ｋＤａ、典型的には約１５０ｋＤａの二量体中の少なくとも２つの融合分子（配列番号１７８のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列を有する）を含む。本明細書に記載のＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２重鎖に結合した軽鎖は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列（または配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列によりコードされているか、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列）を有することができる。
理論に縛られないが、ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物は抗ＨＥＲ２抗体分子に媒介される腫瘍細胞死を誘発すること、ならびに局所的なＬＩＧＨＴ媒介性抗腫瘍免疫性を刺激することにより、二重の抗癌効果を誘発すると考えられる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物は、以下の活性の１つ以上を有することができる：（ｉ）少なくとも１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を特徴とする親和性でＨＥＲ２に結合する；（ｉｉ）例えば、他のＨＥＲファミリーメンバーとの有意な交差反応なくＨＥＲ２に実質的に選択的に結合すること（ｉｉｉ）ドメイン１のエピトープ（Ｄ１）（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１〜１９６位のアミノ酸に対応する）、ドメイン２のエピトープ（Ｄ２）（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１９７〜３１８位のアミノ酸に対応する）、ドメイン３のエピトープ（Ｄ３）（図４に示すヒトＨＥＲ２の約３１９〜５０８位のアミノ酸に対応する）、またはドメイン４のエピトープ（Ｄ４）（図４に示すヒトＨＥＲ２の約５０８〜６３０位のアミノ酸に対応する）、またはそれらの組み合わせ、例えば、エピトープ１−２（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１〜３１８位のアミノ酸に対応する）またはエピトープ１−３（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１〜５０８位のアミノ酸に対応する）から選択されるＨＥＲ２上の直線状もしくは立体構造エピトープに結合すること；（ｉｖ）ＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、遮断もしくは低減すること（例えば、ＨＥＲ２、ＡＫＴおよび／またはＭＡＰキナーゼの１つ以上のリン酸化反応を阻害、遮断もしくは低減すること；ＨＥＲ２のホモ二量体化もしくはＨＥＲ２およびＨＥＲ３のヘテロ二量体化、および／またはＥＧＦＲを有するＨＥＲ２を阻害、遮断もしくは低減すること）；（ｖ）インビトロ（例えば、ＭＣＦ７およびＳＫＢＲ−３細胞）およびインビボのＨＥＲ２発現細胞における活性を阻害することおよび／または細胞死を誘発すること；（ｖｉ）抗腫瘍免疫応答をインビボで、例えば、動物モデル（乳腫瘍細胞保因マウス腫瘍モデル、またはＨＥＲ２依存性結腸直腸および胃腫瘍異種移植モデルなど）で、またはヒト対象において誘発すること；ならびに／または（ｖｉｉ）例えば、長期の単独療法または併用療法後、または別の化学治療療法（例えば、標準的な化学療法または抗ＨＥＲ２抗体療法）後に検出される腫瘍再発後の腫瘍増殖もしくは転移の長期の低減を誘発すること。
１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその変異体もしくはその断片（例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴタンパク質）と、抗ＨＥＲ２特異的抗体分子もしくはその断片（例えば、本明細書に記載の抗体分子）を少なくとも１個含むか、または本質的にそれからなる。
本明細書に記載のように、本発明は、ＨＥＲ２（例えば、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２抗体）に選択的に結合する抗体分子（例えば、単離または精製タンパク質またはポリペプチド）をさらに特徴とする。本明細書に記載の抗ＨＥＲ２抗体は、本発明のＬＩＧＨＴ標的分子中に、または、本明細書に記載の標的分子と異なる単独もしくは併用した実体として存在し得る。
ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子中に単独もしくは組み合わされた実体として存在する抗ＨＥＲ２抗体分子は、以下の特徴の１つ以上を含む。
実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１および１３のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、もしくはそれからなるか、またはＣＨＯ細胞寄託７１Ｆ１０ ｆａｂｌｉｇｈｔに対応するＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５５のＶＨおよびＶＬアミノ酸、または配列番号１２および１４のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされた、または７１Ｆ１０ ｆａｂｌｉｇｈｔのＶＨおよびＶＬアミノ酸をコードするＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５５のヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなる）；ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５および１７のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、もしくはそれからなるか、または配列番号１６および１８のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされている）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９および２１のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、もしくはそれからなるか、または配列番号２０および２２のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされている）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３および２５のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、もしくはそれからなるか、またはＣＨＯ細胞寄託６７Ｆ１１ ｆａｂｌｉｇｈｔに対応するＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５７のＶＨおよびＶＬアミノ酸、または配列番号２４および２６のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされた、または６７Ｆ１１ ｆａｂｌｉｇｈｔのＶＨおよびＶＬアミノ酸をコードするＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５７のヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなる）；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７および２９のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、またはそれからなる、；または配列番号２８および３０のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされている）；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１および３３のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、もしくはそれからなるか、または配列番号３２および３４のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされている）；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５および３７のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬ、またはＣＨＯ寄託６５Ｃ１０ ｆａｂｌｉｇｈｔに対応するＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５８のＶＨおよびＶＬアミノ酸、または配列番号３６および３８のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされている、または６５Ｃ１０ ｆａｂｌｉｇｈｔのＶＨおよびＶＬアミノ酸をコードするＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５８のヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなる）；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９および４１のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、またはそれからなる、またはＣＨＯ細胞寄託６５Ｈ０９ ｆａｂｌｉｇｈｔに対応するＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５６のＶＨおよびＶＬアミノ酸、または配列番号４０および４２のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列、または６５Ｈ０９ ｆａｂｌｉｇｈｔのＶＨおよびＶＬアミノ酸をコードするＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−１０３５６のヌクレオチド配列によりコードされている）；ならびにＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３および４５のアミノ酸配列のそれぞれＶＨおよびＶＬを含むか、もしくはそれからなるか、または配列番号４４および４６のそれぞれＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列によりコードされている）（本明細書で、「７１Ｆ１０」、「６９Ａ０９」、「６７Ｆ１０」、「６７Ｆ１１」、「６６Ａ１２」、「６６Ｃ０１」、「６５Ｃ１０」、「６５Ｈ０９」および「６５Ｂ０３」とも呼ぶ）；またはそれと実質的に同一であるアミノもしくはヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）からなる群から選択される抗体由来の抗体分子またはＦａｂ断片である。これらＦａｂのそれぞれのＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列を配列番号１１〜４６として示す。簡潔にするために、本明細書で開示するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それらの対応する配列番号により本明細書で集合的に参照する。例えば、配列番号３９〜４２を、それぞれＶＨおよびＶＬの配列番号３９および４１のアミノ酸配列、および／またはＡＴＣＣ寄託に対応するアミノ酸配列を参照する場合；またはそれぞれＶＨおよびＶＬの配列番号４０および４２のヌクレオチド配列、ならびに／または対応するＡＴＣＣ寄託よりコードされる場合に使用する。
他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）、またはそれと実質的に同一であるアミノもしくはヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）からなる群から選択される抗体由来の抗体分子またはＦａｂ断片と同程度の機能的活性を有する。
他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ヒト、マウス、ラット、および／またはカニクイザル起源から選択される１種以上に由来するＨＥＲ２と交差反応できる。抗ＨＥＲ２抗体分子は、約１〜１２０ｎＭ、約１〜１００ｎＭ、約１〜８０ｎＭ、約１〜７０ｎＭ、約１〜６０ｎＭ、約１〜４０ｎＭ、約１〜３０ｎＭ、約１〜２０ｎＭ、約１〜１５ｎＭ、約１〜１２ｎＭ、約１〜５ｎＭ、約１〜２ｎＭ、または約１〜１ｎＭの範囲のＥＣ５０でＨＥＲ２に結合できる。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＨＥＲ２と関連する生体活性の１つ以上を約５０ｎＭ〜５ｐＭ、典型的には約１００〜２５０ｐＭ未満のＩＣ５０（例えば、より良い阻害）で阻害または低減する。例えば、抗ＨＥＲ２抗体分子は、以下の活性を１つ以上有することができる：（ｉ）ＨＥＲ２シグナル伝達を約５０ｎＭ〜５ｐＭ、典型的には約１００〜２５０ｐＭ未満のＩＣ５０（例えば、より良い阻害）で阻害、遮断もしくは低減する（例えば、ＨＥＲ２、ＡＫＴまたはＭＡＰキナーゼの１つ以上のリン酸化反応を阻害、遮断もしくは低減する；またはＨＥＲ２のホモ二量体化もしくはＨＥＲ２およびＨＥＲ３のヘテロ二量体化、またはＥＧＦＲを有するＨＥＲ２を阻害、遮断もしくは低減する）；（ｉｉ）ＳＫＢＲ−３細胞中８ｅ−６ｓ−１およびＢＴ−４７４細胞中２．１ｅ−５ｓ−１である対照の抗ＨＥＲ２抗体の内部移行速度以下であると推定される遅い反応速度で内部移行すること；ならびに／または（ｉｉｉ）インビトロ（例えば、ＭＣＦ７およびＳＫＢＲ−３細胞）およびインビボでＨＥＲ２発現細胞の活性を阻害することおよび／または細胞死を誘発すること。１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、反応速度１０４〜１０７Ｍ−１ｓ−１、典型的には１０５〜１０６Ｍ−１ｓ−１の範囲でＨＥＲ２に結合する。別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ヒトＨＥＲ２にｋＤ０．１〜１００ｎＭで結合する。さらに別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の解離反応速度は１０−２〜１０−６ｓ−１、典型的には１０−２〜１０−５ｓ−１の範囲である。１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＨＥＲ２（例えば、ヒトＨＥＲ２）に、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）からなる群から選択されるモノクローナル抗体に類似した（例えば、因子２０、１０、または５以内の）親和性および／または反応速度で結合する。抗ＨＥＲ２抗体分子の親和性および結合反応速度は、例えば、バイオセンサー技術（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））を用いて試験することができる。
さらに別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＨＥＲ２、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）ＨＥＲ２のエピトープ、例えば、直線状または立体構造エピトープと特異的に結合する。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６として本明細書に記載のアミノまたはヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる）からなる群から選択される抗体として結合について競合する（例えば、同一のまたは類似した、例えば、部分的に重複したエピトープに結合する）。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１〜１９６位のアミノ酸に対応する）エピトープＤ１、（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１９７〜３１８位のアミノ酸に対応する）エピトープＤ２、（図４に示すヒトＨＥＲ２の約３１９〜５０８位のアミノ酸に対応する）エピトープＤ３、または（図４に示すヒトＨＥＲ２の約５０８〜６３０位のアミノ酸に対応する）エピトープＤ４、またはそれらの組み合わせ、例えば、（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１〜３１８位のアミノ酸に対応する）エピトープ１−２または（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１〜５０８位のアミノ酸に対応する）エピトープ１−３から選択されるＨＥＲ２上の直線状または立体構造のエピトープに結合する。
１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１（ＶＨ）、１３（ＶＬ）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５、１７）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９、２１）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３、２５、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７、２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１、３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５、３７、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９、４１、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３、４５）からなる群から選択される抗体由来のＣＤＲ、または、近似のＣＤＲ、例えば、同一または少なくとも１つのアミノ酸の改変であるが、２、３もしくは４つを超えない改変（例えば、置換（例えば、保存的置換）、欠失、または挿入）を有するＣＤＲを１個、２個、３個、４個、５個または６個すべてを含む。任意に、抗体分子は、本明細書に記載の任意のＣＤＲを含み得る。
実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３を含むか、またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号４７（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号４９（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５からのＣＤＲ）；ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号５０（ＣＤＲ１）、配列番号５１（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号５２（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５４（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号５５（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号５７（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号５８（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７からのＣＤＲ）；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号５９（ＣＤＲ１）、配列番号６０（ＣＤＲ２）および／もしくは配列番号６１（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号６２（ＣＤＲ１）、配列番号６３（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号６４（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号６５（ＣＤＲ１）、配列番号６６（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号６７（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８からのＣＤＲ）；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号６８（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号７０（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６からのＣＤＲ）；ならびにＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号７２（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号７３（ＣＤＲ３））からなる群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３と、３個、２個、または１個未満のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）だけ異なるＣＤＲを有する。
他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３を含むか、またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号７４（ＣＤＲ１）、配列番号７５（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号７６（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５からのＣＤＲ）；ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号７７（ＣＤＲ１）、配列番号７８（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号７９（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号８２（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号８３（ＣＤＲ１）、配列番号８４（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号８５（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７からのＣＤＲ）；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号８６（ＣＤＲ１）、配列番号８７（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号８８（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号８９（ＣＤＲ１）、配列番号９０（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号９１（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号９２（ＣＤＲ１）、配列番号９３（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号９４（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８からのＣＤＲ）；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号９５（ＣＤＲ１）、配列番号９６（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号９７（ＣＤＲ３）、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６からのＣＤＲ）、およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号９８（ＣＤＲ１）、配列番号９９（ＣＤＲ２）、および／もしくは配列番号１００（ＣＤＲ３））からなる群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３と３個、２個、または１個未満のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）だけ異なるＣＤＲを有する。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２もしくは配列番号１５６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ７１Ｆ１０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１３として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。他の実施形態では、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０の重鎖および軽鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５のヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＳＹＧＭＶ（配列番号４７）（ＣＤＲ１中）、ＳＩＳＳＳＧＧＬＴＷＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４８）（ＣＤＲ２中）、および／またはＰＰＧＩＡＶＡＲＤＹ（配列番号４９）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、ＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＡ（配列番号７４）（ＣＤＲ１中）、ＡＡＳＴＬＱＳ（配列番号７５）（ＣＤＲ２中）、および／またはＱＫＹＮＳＡＬＬＴ（配列番号７６）（ＣＤＲ３中）のうちの１つ以上を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５の重鎖および／もしくは軽鎖可変ドメイン由来のＣＤＲを少なくとも１個、２個または３個を有する。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３９として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４０として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｈ０９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４１として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４２として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。他の実施形態では、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９の重鎖および軽鎖可変ドメインとしては、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６のヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＷＹＳＭＷ（配列番号６８）（ＣＤＲ１中）、ＳＩＶＳＳＧＧＱＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６９）（ＣＤＲ２中）、および／またはＶＫＧＹＹＹＹＩＤＶ（配列番号７０）（ＣＤＲ３中）を１つ以上含む。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、ＲＡＳＱＳＶＤＳＳＹＬＳ（配列番号９５）（ＣＤＲ１中）、ＧＡＳＴＲＡＴ（配列番号９６）（ＣＤＲ２中）、および／またはＱＱＨＧＹＳＳＲＴ（配列番号９７）（ＣＤＲ３中）のうちの１つ以上を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６の重鎖および／もしくは軽鎖可変ドメイン由来のＣＤＲを少なくとも１個、２個または３個有する。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２３として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６７Ｆ１１の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。他の実施形態では、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１の重鎖および軽鎖可変ドメインとしては、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７のヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＮＹＹＭＭ（配列番号５６）（ＣＤＲ１中）、ＶＩＧＳＳＧＧＭＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７）（ＣＤＲ２中）、および／またはＧＹＰＴＧＹＹＤＳＳＧＷＶＹＳＹＹＧＩＤＶ（配列番号５８）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、ＱＡＳＱＤＴＤＮＲＬＨ（配列番号８３）（ＣＤＲ１中）、ＤＡＶＮＬＫＲ（配列番号８４）（ＣＤＲ２中）、および／またはＱＨＳＤＧＬＳＬＡ（配列番号８５）（ＣＤＲ３中）のうちの１つ以上を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７の重鎖および／もしくは軽鎖可変ドメイン由来のＣＤＲを少なくとも１個、２個または３個有する。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｃ１０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３７として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３８として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。他の実施形態では、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０の重鎖および軽鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８のヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＹＹＰＭＭ（配列番号６５）（ＣＤＲ１中）、ＳＩＷＰＳＧＧＦＴＫＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６６）（ＣＤＲ２中）、および／またはＶＳＳＳＳＷＹＧＹＬＹ（配列番号６７）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、ＳＧＳＳＳＮＩＧＲＮＴＶＮ（配列番号９２）（ＣＤＲ１中）、ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号９３）（ＣＤＲ２中）、および／またはＡＡＷＤＤＳＬＮＡＷＶ（配列番号９４）（ＣＤＲ３中）のうちの１つ以上を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８の重鎖および／もしくは軽鎖可変ドメイン由来のＣＤＲを少なくとも１個、２個または３個有する。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ−６５Ｂ０３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４３として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｂ０３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＷＹＲＭＮ（配列番号７１）（ＣＤＲ１中）、ＳＩＹＳＳＧＧＰＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７２）（ＣＤＲ２中）、および／またはＥＫＰＤＹＹＤＳＳＧＹＬＤＹ（配列番号７３）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、以下のうちの１つ以上を含む：抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号９８）（ＣＤＲ１中）、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９９）（ＣＤＲ２中）、および／またはＨＱＹＧＲＰＰＶ（配列番号１００）（ＣＤＲ３中）。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ６６Ａ１２の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２８として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６６Ａ１２の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２９として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３０として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＭＹＳＭＱ（配列番号５９）（ＣＤＲ１中）、ＶＩＧＳＳＧＧＱＴＧＹＡＤＳＶＫ Ｇ（配列番号６０）（ＣＤＲ２中）、および／またはＶＲＤＹＹＧＳＧＳＹＹＬＤＰ（配列番号６１）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号８６）（ＣＤＲ１中）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号８７）（ＣＤＲ２中）、および／またはＱＱＳＹＳＴＳＷＴ（配列番号８８）（ＣＤＲ３中）。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６６Ｃ０１の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＷＹＳＭＳ（配列番号６２）（ＣＤＲ１中）、ＳＩＳＳＳＧＧＰＴＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６３）（ＣＤＲ２中）、および／またはＤＳＳＹＳＧＴＳ（配列番号６４）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＥＹＶＹ（配列番号８９）（ＣＤＲ１中）、ＲＮＤＱＲＰＳ（配列番号９０）（ＣＤＲ２中）、および／またはＴＴＷＤＤＳＬＳＧＰＶ（配列番号９１）（ＣＤＲ３中）。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２０として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６７Ｆ１０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２１として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＰＹＭＭＶ（配列番号５３）（ＣＤＲ１中）、ＷＩＳＰＳＧＧＹＴＦＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５４）（ＣＤＲ２中）、および／またはＧＴＹＰＬＴＹ（配列番号５５）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＳＧＤＫＬＧＤＫＹＶＳ（配列番号８０）（ＣＤＲ１中）、ＱＤＳＫＷＰＳ（配列番号８１）（ＣＤＲ２中）、および／またはＱＶＷＤＩＳＨＶＶ（配列番号８２）（ＣＤＲ３中）。
ある実施形態では、ＢＩＩＢ６９Ａ０９の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６９Ａ０９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１８として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＲＹＮＭＷ（配列番号５０）（ＣＤＲ１中）、ＶＩＲＳＳＧＧＹＴＧＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５１）（ＣＤＲ２中）、および／またはＷＮＳＧＹＳＹＷＤＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号５２）（ＣＤＲ３中）。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖可変ドメインは、以下のうちの１つ以上を含む：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７７）（ＣＤＲ１中）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号７８）（ＣＤＲ２中）、および／またはＱＱＦＮＴＹＰＩＴ（配列番号７９）（ＣＤＲ３中）。
他の実施形態では、融合物の抗体分子は、配列番号５０〜７３および７７〜１００のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲを１個以上含む。
さらに別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、例えば、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１２、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５からのコチア超可変ループ）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１６）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２０）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２４、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７からのコチア超可変ループ）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜２８）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３２）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３６、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８からのコチア超可変ループ）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４０、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６からのコチア超可変ループ）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４４）から選択される抗体の重鎖可変領域由来のコチア超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む。さらに別の実施形態では、抗体分子は、例えば、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３〜１４、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５からのコチア超可変ループ）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７〜１８）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１〜２２）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５〜２６、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７からのコチア超可変ループ）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７〜３８、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８からのコチア超可変ループ）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１〜４２、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６からのコチア超可変ループ）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５〜４６）から選択される抗体の軽鎖可変領域由来の超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、例えば、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６からの超可変ループ）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）、または近似している超可変ループ（例えば、本明細書に開示の配列と同一または少なくとも１つのアミノ酸の改変だが２、３もしくは４つを超えない改変を有する超可変ループ）から選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域由来の超可変ループを少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、または６個含む。任意に、タンパク質は、本明細書に記載の任意の超可変ループを含み得る。
さらに別の例では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６からの超可変ループ）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）の対応する超可変ループと同一のカノニカル構造、例えば、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８からの超可変ループ）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６からの超可変ループ）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）の重鎖および／または軽鎖可変ドメインの少なくともループ１および／またはループ２の同一のまたは類似したカノニカル構造を有する超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む。例えば、超可変ループカノニカル構造の説明については、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７９９−８１７； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７７６−７９８を参照されたい。これらの構造は、これらの参考文献に記載の表の調査により決定できる。
１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワーク（例えば、個々のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３を包含するがＣＤＲは除かれた配列）はＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３）の重鎖フレームワークと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワークは、ヒトＶセグメント配列ＨＶ３−２３（配列番号１０７）と実質的に相同のアミノ酸配列を有する（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７９９−８１７； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７７６−７９８を参照されたい）。
別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖フレームワーク（例えば、個々のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３を包含するがＣＤＲは除かれた配列）は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５）の軽鎖フレームワークと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワークはヒトＶＬκＩサブグループ生殖系列配列（例えば、ＶＬκコンセンサス配列）と実質的に相同のアミノ酸配列を有する。
ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１２；配列番号１５６、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１６）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２０）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２４、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２８）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３２）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３６、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４０、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４４）の重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなるか；あるいはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３）の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１４またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１８）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２２）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２６またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３８またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４２またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４６）の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、もしくは本質的にそれからなる；またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１）、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５）の軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物は、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号４）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号８）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物は、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；配列番号１１０のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる、（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物は、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７またはＰＴＡ−１０３５８のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７またはＰＴＡ−１０３５８のヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。
別の例示的な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＣＤ２３に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＣＤ２３ Ｆａｂ融合物」と呼ぶ）を少なくとも１個含む。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＣＤ２３融合物は、（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ ＣＤ２３−２０４）（それぞれ、配列番号１０１または１７４）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ ＣＤ２３−２０４）（それぞれ、配列番号１０２または１７３）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２３融合物は、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１０４）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。
さらに別の例示的な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、インスリン様成長因子受容体に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ融合物」と呼ぶ）を少なくとも１個含む。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ融合物は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ＢＩＩＢ Ｃ０６−１１７）（配列番号１６３）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ＢＩＩＢ Ｃ０６−１１７）（配列番号１６２）のいずれかに示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＩＧＦＲ融合物は、配列番号１６８に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１６７）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。
別の態様では、本発明は、ＨＥＲ２（例えば、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２抗体）に選択的に結合する抗体分子（例えば、単離または精製したタンパク質またはポリペプチド）を特徴とする。抗体分子は、モノクローナルもしくは単特異的抗体、またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；単鎖Ｆｖ断片；単一ドメイン抗体またはその変異体（例えば、重鎖または軽鎖可変ドメイン単量体または二量体、例えば、ＶＨ、ＶＨＨ））；単鎖Ｆｃ断片；二重特異的抗体（ｄＡｂ）；ラクダ抗体；またはＶＨもしくはＶＬドメインのレパートリー、または他の足場（例えば、フィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体、本明細書に記載のアフィボディ分子（例えば、アフィボディタンパク質Ｚ足場）、フィブロネクチン足場、リポカリン、アンキリン反復、ＬＤＬ受容体ドメイン、ＲＮＡアプタマー、ＰＤＺドメインおよび微小体など）（または上記抗体分子の１個以上の組み合わせ）上への１個、２個、もしくは全３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植であることができる。抗体分子は、ＨＥＲ２、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）ＨＥＲ２と相互作用（例えば、結合）できる。例えば、抗体分子としては、単鎖（例えば、単鎖Ｆｃ）およびＦａｂまたはｓｃＦｖの組み合わせを挙げ得る。他の実施形態では、抗体分子は、多特異的（例えば、二価または二重特異性）抗体またはその断片であることができる。いくつかの実施形態では、抗体分子は、ＨＥＲ２上の単一のエピトープに結合する。他の実施形態では、抗体分子は、多特異的抗体であり、１個以上の細胞表面タンパク質（例えば、本明細書に記載のＨＥＲ２および１個以上の細胞表面タンパク質）上で２個以上のエピトープに結合する。典型的には、抗体分子はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ抗体、またはインビトロ生成抗体（またはその機能的断片、例えば、本明細書に記載の抗体断片）である。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、ファージ中のインビトロ選択により生成される。ある実施形態では、抗体分子は、少なくとも１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を特徴とする親和性で細胞表面タンパク質に結合する。
抗体分子は、完全長（例えば、少なくとも１個、典型的には２個の完全な重鎖、および少なくとも１個、典型的には２個の完全な軽鎖を含むことができる）であることもでき、抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖ断片）を含むこともできる。さらに他の実施形態では、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される；特に、例えば、（例えば、ヒトの）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体分子は、例えば、（例えば、ヒトの）κもしくはλの軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体特性を修飾する（例えば、１つ以上の：Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基（−Ｓ−Ｓ−結合）数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能を増大するまたは低減する）ように改変、例えば、変異させることができる。
ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、抗ＨＥＲ２抗体分子の本明細書に記載の活性を１つ以上有することができる。
１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３からなる群の抗体分子もしくはＦａｂ断片であるか、これらからなる群から選択される抗体またはＦａｂ断片と同程度の機能的活性を有する。
他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ヒト、マウス、ラット、またはカニクイザル起源から選択される１種以上に由来するＨＥＲ２と交差反応でき、および／または１つ以上の本明細書に記載の結合特性（例えば、親和性および／または反応速度）を有する。
さらに別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＨＥＲ２のエピトープ（例えば、直線状または立体構造エピトープ）、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）ＨＥＲ２、例えば、本明細書に記載のＨＥＲ２エピトープに特異的に結合する。
１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３、または、近似しているＣＤＲ、例えば、同一または少なくとも１つのアミノ酸の改変だが２、３もしくは４つを超えない改変（例えば、置換（例えば、保存的置換）、欠失、または挿入）を有するＣＤＲからなる群から選択される抗体由来のＣＤＲを１個、２個、３個、４個、５個または６個すべてを含む。任意に、抗体分子は、本明細書に記載の任意のＣＤＲを含み得る。
ＢＩＩＢ７１Ｆ１０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１として示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号１２もしくは配列番号１５６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ７１Ｆ１０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１３として示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号１４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ７１Ｆ１０の重鎖および軽鎖可変ドメインは、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５５のヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６５Ｈ０９の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３９として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４０として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｈ０９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４１として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４２として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｈ０９の重鎖および軽鎖可変ドメインとしては、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５６のヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６７Ｆ１１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２３として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６７Ｆ１１の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６７Ｆ１１の重鎖および軽鎖可変ドメインとしては、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５７のヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６５Ｃ１０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｃ１０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３７として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３８として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｃ１０の重鎖および軽鎖可変ドメインとしては、ＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８のアミノ酸配列を含むか、またはＡＴＣＣ特許寄託ＰＴＡ−１０３５８のヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６５Ｂ０３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４３として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６５Ｂ０３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６６Ａ１２の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２８として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６６Ａ１２の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２９として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３０として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６６Ｃ０１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３１として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６６Ｃ０１の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３３として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３４として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６７Ｆ１０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２０として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６７Ｆ１０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２１として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。
ＢＩＩＢ６９Ａ０９の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１６として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。ＢＩＩＢ６９Ａ０９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１７として示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１８として示されるヌクレオチド配列によりコードされている。
さらに別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、例えば、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９またはＢＩＩＢ６５Ｂ０３、ＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８から選択される抗体の重鎖可変領域由来のコチア超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、例えば、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９またはＢＩＩＢ６５Ｂ０３、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８から選択される抗体の軽鎖可変領域由来の超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその断片は、例えば、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８から選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域由来の超可変ループを少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、または６個含む。
さらに別の例では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の対応する超可変ループと同一のカノニカル構造、例えば、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の重鎖および／または軽鎖可変ドメインの少なくともループ１および／またはループ２と同一または類似したカノニカル構造を有する超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む。
１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワーク（例えば、個々のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３を包含するがＣＤＲは除かれた配列）は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３）の重鎖フレームワーク、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８、または本明細書に記載の重鎖と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワークはヒトＶセグメント配列ＨＶ３−２３（配列番号１０７）と実質的に相同のアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖フレームワーク（例えば、個々のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３を包含するがＣＤＲは除かれた配列）は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５）、ＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の軽鎖フレームワーク、または本明細書に記載の軽鎖フレームワークと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワークは、ヒトＶＬκＩサブグループ生殖系列配列（例えば、ＶＬκコンセンサス配列）と実質的に相同のアミノ酸配列を有する。
ある実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１２；配列番号１５６）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１６）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２０）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２４）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２８）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３２）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３６）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４０）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４４）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含むか、もしくは本質的にそれからなる；またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含むか、もしくは本質的にそれからなる；またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗体分子は、細胞傷害薬、治療薬、細胞分裂阻害剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答調節物質、医薬品、リンフォカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および任意の前記薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤と接合する。さらなる実施形態では、細胞傷害薬は、放射性核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞分裂阻害剤または細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生体応答調節物質、または任意の前記細胞傷害薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。さらなる実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、生体ルミネセンス標識、放射能標識、または任意の前記検出可能な標識の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる核酸分子（例えば、単離または精製した核酸）を特徴とする。ある実施形態では、核酸は、ＬＩＧＨＴ−部分（例えば、ＬＩＧＨＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくはその変異体）をコードするヌクレオチド配列ならびに（例えば、遺伝的融合、非共有結合などにより）機能的に結合した標的部分をコードするヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる。
本発明の核酸分子の例は、ＬＩＧＨＴ部分のＬＩＧＨＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなるか、以下に由来するアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる：ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１として示す、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約９３〜２４０位のアミノ酸、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約２５３〜４００位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約２５８〜４０５位のアミノ酸、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号４として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約２４５〜３９２位のアミノ酸、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；他の実施形態では、核酸は、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号５として示す、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約２７７〜７２０位のヌクレオチド、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約７５７〜１２００位のヌクレオチド、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約７７２〜１２１５位のヌクレオチド、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号８として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約７３３〜１１７６位のヌクレオチド、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）に由来するヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる。ＬＩＧＨＴ部分は任意に、ＬＩＧＨＴまたはその変異体の細胞外ドメイン由来の１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）の約６１〜９２位のアミノ酸、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）の約２２５〜２５２位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）の約２３０〜２５７位のアミノ酸（配列番号３）、もしくはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；またはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号５）の約１８１〜２７６位のヌクレオチド、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）の約６７３〜７５６位のヌクレオチド（配列番号６）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）の約６８８〜７７１位のヌクレオチド（配列番号７）からのヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含み得るか、または本質的にそれからなり得る。ＬＩＧＨＴの１つ以上の特性（例えば、タンパク質の安定性、免疫増強機能）を増大するように改変したＬＩＧＨＴタンパク質の変異体、またはその可溶性断片を使用してよい。例えば、ＬＩＧＨＴタンパク質は、タンパク質分解部位を１つ以上不活性化するように（例えば、タンパク質分解部位の欠失、変異または挿入により）修飾できる。１つの実施形態では、ヒトＬＩＧＨＴ配列（ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１、配列番号１）の８２〜８３位にタンパク質分解部位をなすアミノ酸ＥＱＬＩ（配列番号９）、またはマウスＬＩＧＨＴ配列の７９〜８２位のアミノ酸ＥＫＬＩ（配列番号１０）を除去する。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴタンパク質は、非ヒト起源（例えば、マウス）ＬＩＧＨＴ由来を使用できる。完全長マウスＬＩＧＨＴのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１１３および１１４で示す。
ＬＩＧＨＴ分子をコードするヌクレオチド配列は、結合基をコードするヌクレオチド配列によりもしくはよらず、標的部分をコードするヌクレオチド配列に遺伝的融合物として、遺伝的に融合し得る。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ分子をコードするヌクレオチド配列および標的部分は、個々に発現でき、互いに反応基を介して、任意に、（例えば、本明細書に記載の）生体適合性ポリマーを介して共有結合できる。結合基をコードする核酸は、少なくとも５個、１０個、１５個または２０個のグリシンおよびセリン残基を、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号１４５）の１、２、３、４、５個以上の反復、例えば、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒの４個の反復（配列番号１３４）の配置で含むことができる。他の実施形態では、結合基としては、ＬＩＧＨＴまたはその変異体の細胞外ドメイン由来の１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の約６１〜９２位のアミノ酸（配列番号１）、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）の約２２５〜２５２位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）の約２３０〜２５７位のアミノ酸（配列番号３）、もしくはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；またはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１の約１８１〜２７６位のヌクレオチド（配列番号５）、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）の約６７３〜７５６位のヌクレオチド（配列番号６）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）の約６８８〜７７１位のヌクレオチド（配列番号７）からのヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むことができる。あるいは、核酸によりコードされた結合基は、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号１４６）の反復およびＬＩＧＨＴまたはその変異体の細胞外ドメイン由来の１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）の約６１〜９２位のアミノ酸、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）の約２２５〜２５２位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）の約２３０〜２５７位のアミノ酸、もしくはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；またはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号５）の約１８１〜２７６位のヌクレオチド、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）の約６７３〜７５６位のヌクレオチド、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）の約６８８〜７７１位のヌクレオチドからのヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列の１つ以上の組み合わせを含み得る。
１つの例示的な実施形態では、核酸分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＨＥＲ２に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物」と呼ぶ）を少なくとも１個含むか、または本質的にそれからなるＬＩＧＨＴ標的分子をコードする。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物をコードする核酸は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質（例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴタンパク質）またはその変異体もしくはその断片と、抗ＨＥＲ２特異的抗体分子またはその断片（例えば、本明細書に記載の抗体分子）を少なくとも１個含むか、または本質的にそれからなる。
実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする核酸は、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の核酸からなる群から選択される抗体由来の抗体分子またはＦａｂ断片である。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする核酸は、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の核酸からなる群から選択される抗体由来の抗体分子またはＦａｂ断片と同程度の機能的活性を有する。
１つの実施形態では、融合物の抗体分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の核酸、または、近似しているＣＤＲ、例えば、同一または少なくとも１つのアミノ酸の改変だが２、３もしくは４つを超えない改変（例えば、置換（例えば、保存的置換）、欠失、または挿入）を有するＣＤＲからなる群から選択される抗体由来のＣＤＲを１個、２個、３個、４個、５個または６個すべてを含む。任意に、核酸は、本明細書に記載の任意のＣＤＲを含み得る抗体分子をコードすることができる。実施形態では、核酸は、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号４７（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４９（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号５０（ＣＤＲ１）、配列番号５１（ＣＤＲ２）、および／または配列番号５２（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５４（ＣＤＲ２）、および／または配列番号５５（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号５７（ＣＤＲ２）、および／または配列番号５８（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号５９（ＣＤＲ１）、配列番号６０（ＣＤＲ２）、および／または配列番号６１（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号６２（ＣＤＲ１）、配列番号６３（ＣＤＲ２）、および／または配列番号６４（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号６５（ＣＤＲ１）、配列番号６６（ＣＤＲ２）、および／または配列番号６７（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号６８（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、および／または配列番号７０（ＣＤＲ３））およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号７２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号７３（ＣＤＲ３））からなる群から選択されるモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３を含むか、またはその重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３と異なる３個未満のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）を有するＣＤＲ、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８由来のＣＤＲを有する重鎖免疫グロブリン可変ドメインをコードする。他の実施形態では、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸は、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号７４（ＣＤＲ１）、配列番号７５（ＣＤＲ２）、および／または配列番号７６（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号７７（ＣＤＲ１）、配列番号７８（ＣＤＲ２）、および／または配列番号７９（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８２（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号８３（ＣＤＲ１）、配列番号８４（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８５（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号８６（ＣＤＲ１）、配列番号８７（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８８（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号８９（ＣＤＲ１）、配列番号９０（ＣＤＲ２）、および／または配列番号９１（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号９２（ＣＤＲ１）、配列番号９３（ＣＤＲ２）、および／または配列番号９４（ＣＤＲ３））；ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号９５（ＣＤＲ１）、配列番号９６（ＣＤＲ２）、および／または配列番号９７（ＣＤＲ３））およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号９８（ＣＤＲ１）、配列番号９９（ＣＤＲ２）、および／または配列番号１００（ＣＤＲ３））、からなる群から選択されるモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３を含むか、またはその軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３と３個未満のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）だけ異なるＣＤＲ、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８由来のＣＤＲを有する。ＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９、ＢＩＩＢ６７Ｆ１０、ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９またはＢＩＩＢ６５Ｂ０３抗体分子の重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を本明細書に記載する。
さらに別の実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１２）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１６）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２０）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２４）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜２８）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３２）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３４〜３５）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４０）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４４）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の核酸から選択される抗体の重鎖可変領域由来のコチア超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む融合物の抗体分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。さらに別の実施形態では、核酸は、例えば、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１〜４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５〜４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の核酸から選択される抗体の軽鎖可変領域由来の超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む。さらに別の実施形態では、核酸は、例えば、本明細書に記載のＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の核酸から選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域由来の超可変ループを少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、または６個含む融合物の抗体分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。
１つの実施形態では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８、または近似している超可変ループ（例えば、本明細書に開示の配列と同一または少なくとも１つのアミノ酸の改変だが２、３もしくは４つを超えない改変を有する超可変ループ）由来の６個すべての超可変ループを含む融合物の抗体分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。任意に、核酸は、本明細書に記載の任意の超可変ループを含むタンパク質をコードし得る。
さらに別の例では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）の対応する超可変ループと同一のカノニカル構造、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８、例えば、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の重鎖および／または軽鎖可変ドメインの少なくともループ１および／またはループ２と同一のまたは類似したカノニカル構造を有する超可変ループを少なくとも１個、２個、または３個含む融合物の抗体分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。
１つの実施形態では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の重鎖フレームワークと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む重鎖フレームワーク（例えば、個々のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３を包含するがＣＤＲは除かれた配列）を含む融合物の抗体分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワークは、ヒトＶセグメント配列ＨＶ３−２３（配列番号１０７）と実質的に相同のアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の軽鎖フレームワークと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる抗体分子の軽鎖フレームワーク（例えば、個々のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３を包含するがＣＤＲは除かれた配列）をコードする。実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子の重鎖フレームワークはヒトＶＬκＩサブグループ生殖系列配列（例えば、ＶＬκコンセンサス配列）と実質的に相同のアミノ酸配列を有する。
ある実施形態では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１２；配列番号１５６）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１６）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２０）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２４）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２８）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３２）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３６）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４０）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４４）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含むか、もしくは本質的にそれからなる；またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む、融合物の抗体分子もしくは抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。
他の実施形態では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４６）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる；あるいはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５）、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８の軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む、融合物の抗体分子もしくは抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。
核酸分子の例は、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号４）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号８）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなるＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物をコードする。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物をコードする核酸分子は、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる第二の鎖（上記の鎖と遺伝的に融合または結合した）も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。実施形態では、核酸分子は、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号５）、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むか、または本質的にそれからなる。
別の例示的な実施形態では、核酸分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＣＤ２３に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＣＤ２３融合物」と呼ぶ）を少なくとも１個含むＬＩＧＨＴ標的分子をコードする。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＣＤ２３融合物をコードする核酸分子は、（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４リンカーとの抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ ＣＤ２３−２０４）（それぞれ、配列番号１０１または１７４）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。実施形態では、核酸分子は、（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４リンカー（それぞれ、配列番号１０２または１７３）による抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ ＣＤ２３−２０４）のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２３融合物をコードする核酸分子は、抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１０３）に示されるアミノ酸配列またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。実施形態では、核酸分子は、抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１０４）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。
さらに別の実施形態では、核酸分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＩＧＦＲに結合する抗体分子との融合分子を少なくとも１個含むＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、核酸は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ＢＩＩＢ Ｃ０６−１１７）（配列番号１６３）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなるＬＩＧＨＴ−抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ融合物）をコードする；ヌクレオチド配列は（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ＢＩＩＢ Ｃ０６−１１７）（配列番号１６２）、またはそれと実質的に同一である（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）ヌクレオチド配列をコードする。ある実施形態では、核酸分子は、配列番号１６８に示されるアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）をコードするヌクレオチド配列；抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１６７を含むまたはそれからなる）、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。
さらに別の態様では、本発明は、１個以上のＬＩＧＨＴ標的分子をコードする１個以上の核酸分子および／または本明細書に開示の抗ＨＥＲ２抗体分子を含む宿主細胞を提供する。
他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。さらなる実施形態では、核酸分子はプロモーターと作動可能に連結している。追加の実施形態では、本発明は、かかるベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に連結しているベクターを提供する。
追加の実施形態では、本発明は、ＬＩＧＨＴ標的分子および／または本明細書に開示の抗ＨＥＲ２抗体分子を産生する方法、または過程を提供する。本方法は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養すること、ならびに前記ＬＩＧＨＴ標的分子および／もしくは抗ＨＥＲ２抗体分子を回収することを含む。さらなる実施形態では、本発明は、本方法により産生された単離ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子によりコードされた単離ポリペプチドを提供する。
ＬＩＧＨＴ標的分子または抗ＨＥＲ２抗体分子および医薬上許容可能な担体を含む組成物（例えば医薬組成物）を開示する。組成物（例えば、医薬組成物）は、さらに第二の治療薬、例えば、本明細書に記載の第二の治療薬（例えば、抗新生物剤）を含み得ることに留意されたい。抗新生物剤、例えば、本発明の分子と組み合わせて使用できる細胞傷害薬または細胞分裂阻害剤の例としては、タキソイド（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ゲムシタビンおよびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の過剰増殖性（例えば、新生物）障害または状態の治療における使用のためのＬＩＧＨＴ標的分子または抗ＨＥＲ２抗体分子を含むパッケージした医薬組成物も本発明に包含される。任意に、パッケージした医薬組成物は、ラベルが貼られ、および／または本明細書に記載の過剰増殖性（例えば、新生物）障害または状態の治療についてのいくらかの使用説明を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、単離ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子および／または単離軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む組成物を提供し、ここで重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、本明細書に開示の抗体アミノ酸配列と同一または実質的に同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。
他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、抗体分子、組成物、ＬＩＧＨＴ標的分子の一方の鎖をコードする核酸分子、または抗体分子（例えば、重鎖または軽鎖可変領域）は、ＬＩＧＨＴ標的分子をコードする核酸分子に融合したシグナルペプチドをコードする核酸、または抗体分子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、抗体分子、組成物、ＬＩＧＨＴ標的分子の一方の鎖をコードする核酸分子、または抗体分子（例えば、重鎖または軽鎖可変領域）は、ＶＨまたはＶＬポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをさらに含む、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをさらに含む、ＶＨポリペプチドに融合した重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをさらに含むか、またはＶＨポリペプチドに融合した重鎖ヒンジ領域をさらに含む。さらなる実施形態では、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１である。他のある実施形態では、ＩｇＧ１は、カバット番号付け体系に応じて変異している。
いくつかの実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、抗体分子、組成物、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、ＶＬポリペプチドに融合した軽鎖定常領域ドメインをさらに含む。さらなる実施形態では、軽鎖定常領域はヒトＶＬκである。
いくつかの実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、抗体分子、組成物、ＶＨおよびＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除きヒトである。
いくつかの実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、第一のベクター上に含まれ、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、第二のベクター上に含まれる。さらなる実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドは第一のプロモーターと作動可能に連結しており、ＶＬをコードするポリヌクレオチドは第二のプロモーターと作動可能に連結している。他のある実施形態では、第一および第二のプロモーターは同一プロモーターの複製である。さらなる実施形態では、第一および第二のプロモーターは同一ではない。
上記の組成物の様々な実施形態では、第一のベクターおよび第二のベクターは単一の宿主細胞に含まれる場合もあり、別々の宿主細胞に含まれる場合もある。
別の態様では、本発明は、ＬＩＧＨＴ標的分子（例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴタンパク質、その変異体もしくはその断片）を過剰増殖性細胞または組織、例えば、本明細書に記載の新生物の細胞または組織に選択的に送達し、それによって、過剰増殖性細胞または組織の活性を死滅、除去、あるいは選択的に低減する方法を特徴とする。本方法は、過剰増殖性細胞をＬＩＧＨＴ標的分子、例えば、本明細書に記載の分子と接触させることを含む。接触工程は、ＬＩＧＨＴ受容体、例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ受容体を有する１つ以上の免疫細胞の存在下で実施できる。本方法は、インビトロ、例えば、培養細胞中で、またはエクスビボ、例えば、治療もしくは予防プロトコルの一部として、対象において（例えば、本明細書に記載の過剰増殖性障害または状態を呈する対象、または本明細書に記載の動物モデル（例えば、乳腫瘍細胞を保因するマウス腫瘍モデル、またはＨＥＲ２依存性結腸直腸および胃腫瘍異種移植モデル））実施できる。
別の態様では、本発明は、過剰増殖性（例えば、癌性）状態および／または障害の治療または予防（例えば、治癒、抑制、改良、発現の遅延化もしくは予防、または再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｅ）の予防）方法を特徴とする。本方法は、対象、例えば、治療を必要としている対象に、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子を投与することを含む。
ある実施形態では、本方法は、腫瘍または転移の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｅ）を予防、低減または寛解する。本方法は、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子を、対象、例えば、標準的な療法様式（例えば、化学療法、抗体ベースおよび／または外科手術）に対して部分的または完全に難治性である患者に対して投与することを含む。例えば、患者はＨＥＲ２発現癌（例えば、乳房、胃または肺癌）患者であり、外科手術、化学療法および／または抗体療法（例えば、トラスツズマブ療法）後に疾患進行を示している。他の実施形態では、患者は外科手術、化学療法および／または抗体療法（例えば、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲ抗体療法）後に疾患進行を示している結腸癌患者である。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子を別の療法様式（例えば、標準的な療法様式）で約１０日間、１〜６ヶ月、６ヶ月〜１年間、１〜２年間など治療されている患者に投与する。ある実施形態では、対象は、第一療法に対して部分的または完全に耐性を発現している。
本明細書に記載のインビトロまたはインビボ方法に関連するいくつかの実施形態は、以下のとおりである。
さらなる実施形態では、過剰増殖性障害または状態が、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはそれらの転移、または再発性悪性腫瘍（例えば、第一治療に対して部分的または完全に難治性である対象）のうちの１つ以上から選択される。
インビボ方法において、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子は、単独または別の薬剤（例えば、本明細書に記載の化学治療薬）と併用して、過剰増殖性状態および／または障害を呈している対象、例えば、哺乳類に、対象における少なくとも１つのＬＩＧＨＴ関連生体活性を誘出する上で十分な量で投与できる。
いくつかの実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子の量もしくは投与量は、例えば、対象に投与前、１つ以上の本明細書に記載の過剰増殖性活性、障害もしくは状態を低減するもしくは阻害するために必要とされるＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子のインビトロもしくはエクスビボ量を試験することにより決定できる。インビボ方法は、任意に、障害もしくは状態に関連する１つ以上の症状を呈するリスクのある、または呈する対象の特定（例えば、評価、診断、スクリーニング、および／または選択）工程（１つまたは複数）を含むことができる。
様々な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の標的部分は、過剰増殖性（例えば、新生物）細胞または組織表面上で発現した細胞表面タンパク質に特異的に結合する。標的部分は、１個以上の標的分子、例えば、１個以上の本明細書に記載の過剰増殖性細胞または組織上で発現した可溶性または細胞表面タンパク質に結合できる。例えば、標的部分は、１種以上の成長因子受容体（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ｃｒｉｐｔｏ）；癌関連インテグリンもしくはインテグリン受容体（例えば、αｖβ６、α６β４、ラミニン受容体（ＬＡＭＲ）；ならびに／または他の抗原（ＣＤ２３、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＥｐＣＡＭ、Ｔｗｅａｋ受容体（ＦＮ１４）、ＰＳＭＡ、および／または、とりわけＶＥＧＦなど））に結合できる。標的部分により認識される標的分子のさらなる例を本明細書に記載する。
さらなる実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の、過剰増殖性（例えば、新生物）細胞または組織への結合は、以下のうちの１つ以上をもたらし得る：（ｉ）１種以上のＬＩＧＨＴ受容体（例えば、リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、および／またはデコイ受容体３（ＤｃＲ３））に結合すること；（ｉｉ）１種以上のケモカインまたはサイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＩＬ−５、ＩＬ−８および／またはＴＮＦ）、ケモカインまたはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１０ＲＡ）接着分子、および／または共刺激分子の発現を誘発すること；（ｉｉｉ）Ｔ細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＣＤ４もしくはＣＤ８発現Ｔ細胞、および／または調節Ｔ細胞を活性化させること；（ｉｖ）Ｔ細胞を過剰増殖性（例えば、腫瘍）部位または細胞中に動員すること；（ｖ）腫瘍反応性Ｔ細胞増殖を活性化させることおよび／または増強すること；（ｖｉ）リンパ様微環境を、例えば、過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織に生成すること；（ｖｉ）過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織のアポトーシスを誘発すること；ならびに／または（ｖｉｉ）対象において免疫応答を刺激すること、例えば、対象の免疫系を過剰増殖性（例えば、腫瘍または癌性）細胞または組織に対して刺激すること。
ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子がＨＥＲ２に結合する実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の過剰増殖性（例えば、新生物）細胞または組織への結合は、以下のうちの１つ以上をもたらし得る：（ｉ）少なくとも約１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を特徴とする親和性でＨＥＲ２に結合する；（ｉｉ）他のＨＥＲファミリーの成員との有意な交差反応なくＨＥＲ２に実質的に選択的に結合すること（ｉｉｉ）Ｄ１エピトープ（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１〜１９６位のアミノ酸に対応する）、Ｄ２エピトープ（図４に示すヒトＨＥＲ２の約１９７〜３１８位のアミノ酸に対応する）、Ｄ３エピトープ（図４に示すヒトＨＥＲ２の約３１９〜５０８位のアミノ酸に対応する）、またはＤ４エピトープ（図４に示すヒトＨＥＲ２の約５０８〜６３０位のアミノ酸に対応する）、またはそれらの組み合わせから選択されるＨＥＲ２上の直線状もしくは立体構造エピトープに結合すること；（ｉｉｉ）ＨＥＲ２シグナル伝達を阻害、遮断もしくは低減すること（例えば、ＨＥＲ２、ＡＫＴおよび／またはＭＡＰキナーゼの１つ以上のリン酸化反応を阻害、遮断もしくは低減すること；またはＨＥＲ２のホモ二量体化またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３のヘテロ二量体化、および／またはＥＧＦＲを有するＨＥＲ２を阻害、遮断もしくは低減すること；（ｉｖ）インビトロ（例えば、ＭＣＦ７およびＳＫＢＲ−３細胞）およびインビボ（例えば、動物モデル（乳腫瘍細胞保因マウス腫瘍モデル、またはＨＥＲ２依存性結腸直腸および胃腫瘍異種移植モデルなど））で、またはヒト対象においてＨＥＲ２発現細胞の阻害活性および／または細胞死を誘発すること；（ｖ）インビボで抗腫瘍免疫応答を引き起こすこと、および／または（ｖｉ）例えば、長期の単一療法または併用療法後、または腫瘍再発後の腫瘍増殖もしくは転移の長期の低減を誘発することが、別の化学治療療法（例えば、標準的な化学療法または抗ＨＥＲ２抗体療法）後に検出される。
上記方法の様々な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子は、腫瘍細胞移動を阻害する。さらなる実施形態では、腫瘍細胞増殖は、隣接組織に拡散した腫瘍の予防または遅延化（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）を通して阻害される。
様々な実施形態では、過剰増殖性疾患または障害は、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、または泌尿生殖路に位置する新生物である。
標的部分に標的化できる過剰増殖性（例えば、癌性または新生物）細胞または組織の例としては、乳房、肺、胃、卵巣、前立腺、膵臓、結腸、結腸直腸、腎臓、膀胱、肝臓、頭部、頸部、脳の癌または固形腫瘍、ならびに軟組織悪性腫瘍（リンパ性悪性腫瘍、白血病および骨髄腫を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。治療できるさらなる障害としては、上皮扁平上皮細胞癌、黒色腫、脳癌、子宮頚癌、腎臓癌、精巣癌、および甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、癌はＨＥＲ２発現腫瘍または転移癌（例えば、ＨＥＲ２発現の乳癌、肺癌または胃癌）である。
様々な実施形態では、対象は哺乳類（例えば、動物モデルまたはヒト）である。さらなる実施形態では、対象はヒト、例えば、１種以上の本明細書に記載の癌患者である。１つの実施形態では、対象は標準的な療法様式の施行患者、例えば、化学療法および／またはトラスツズマブ治療施行のＨＥＲ２陽性患者であり、ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子を第二療法として投与する。他の実施形態では、患者は未治療患者であり、例えば、ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子を、第一療法として投与する。他の実施形態では、患者は標準的な療法様式が部分的または完全に難治性である。例えば、患者は、化学療法および／またはトラスツズマブ療法後に疾患進行を示している乳癌患者である。
他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の標的部分を単独または第二の薬剤と併用して、第一療法として、未治療対象、例えば、ＨＥＲ２発現乳癌を呈する未治療患者に投与する。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の標的部分を単独または第二の薬剤と併用して、第二療法として投与する。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の標的部分を、標準的な療法様式が部分的または完全に難治性である患者に投与する。例えば、患者は、化学療法および／またはトラスツズマブ療法後に疾患進行を示している乳癌患者である。
別の態様では、本発明は、ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子（例えば、本明細書に記載の結合剤）を用いて過剰増殖性障害または状態を検出するおよび／または診断する方法を特徴とする。本方法としては、試料（例えば、精製した試料またはインビボ）中のタンパク質標的、例えば、ＨＥＲ２の存在を検出することを含む。本方法は、以下を含む：（ｉ）ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子と試料を接触させること；ならびに（ｉｉ）ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子と試料との間の複合体形成を検出することであり、前記試料中の複合体形成は、試料中のタンパク質標的の存在を示す。ある実施形態では、タンパク質標的の存在は、基準値、例えば、対照試料と比較して、上昇または低減する。基準値と比較した変化、例えば、上昇または低減は、過剰増殖性障害または状態を示す。実施形態では、タンパク質標的がＨＥＲ２である場合、基準値と比較した試料中の上昇は過剰増殖性障害または状態を示す。
ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子はまた、本明細書で集合的に「結合剤」または「結合分子」と呼ぶ。
本明細書に記載した全刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はそれらの全体を参照することにより組み込まれる。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書および図面、ならびに特許請求の範囲から理解されるであろう。
ＬＩＧＨＴ−Ｆａｂ設計の概略図を示す。 ＬＩＧＨＴ融合タンパク質の設計改変の概略図を示す。 抗体指向による腫瘍標的化の概略図を示す。 システイン対合したヒト（配列番号１０５）およびアカゲザル（配列番号１０６）ＥｒｂＢ２細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。 ヒト抗ＨＥＲ２Ｆａｂのドメインマッピングを示す。 発現用に用いた７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ構築物の概要を示す。図６に配列番号１４７、１３４および１３２〜１３４を、それぞれ出現順に開示する。異なるリンカー配列との７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物の概略図も図６に示す。 定量化ＥＬＩＳＡにより測定された７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴのヒトＨＥＲ２−Ｆｃへの結合を示す。図７は配列番号１４７、１３４、および１３４を、それぞれ出現順に開示する。 定量化ＥＬＩＳＡにより測定された７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴのマウスＨＥＲ２−Ｆｃへの結合を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ三量体の実証を予想分子量と共に示す。７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＳＥＣ／ＬＳ分析。 精製した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴのヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）ＬＴβＲ−Ｉｇへの結合を示す。 精製した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴのヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）ＬＴβＲ−Ｉｇへの結合を示す。 精製した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴのヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）ＨＶＥＭ−Ｉｇへの結合を示す。 精製した７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴのヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）ＨＶＥＭ−Ｉｇへの結合を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴのＳＫＢＲ３細胞の結合を示す。 ＬＴβＲ−ＩｇまたはＨＥＲ２−Ｆｃのいずれかによる７１Ｆ１０−ＬＩＧＨＴのＣＨＯ／ｈＨＥＲ２細胞への結合遮断を示す。 ＬＴβＲ−ＩｇおよびＨＶＥＭ−Ｉｇ融合物を用いた機能的ｈＬＩＧＨＴ部位の検出を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴによるＴ細胞増殖の増進を示す。 組換えｈＬＩＧＨＴによるＳＫＢＲ−３細胞の増殖阻害を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質により示された「Ｕ形」増殖阻害曲線（ＳＫＢＲ３細胞）を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質によるＳＫＢＲ−３細胞のＬＩＧＨＴ活性依存の増殖阻害を示す。 ７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴによるＢＴ−４７４細胞の増殖阻害を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質によるＩＰ−１０刺激、ＨＴ２９細胞におけるＩＬ−８分泌を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質によるＨＴ２９腫瘍増殖の抑制を示す。図２１は、その最大活性のためにＬＩＧＨＴ標的が必要とされることを示す。 Ｎ８７異種移植腫瘍モデルにおける７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴの強力な抗腫瘍活性を示す。図２２は、７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴは抗Ｈｅｒ２療法耐性の腫瘍を克服できることを示す。 ＥＬＩＳＡにより測定された、抗ＩＧＦＲ Ｃ０６ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＩＧＦＲ−Ｉｇへの結合を示す。 ＥＬＩＳＡにより測定された、抗ＩＧＦＲ Ｃ０６ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＬＴβＲ−Ｉｇへの結合を示す。 ７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質の二量体形態の概略図を示す ＥＬＩＳＡにより示された、７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴの二量体形態のＨＥＲ２−Ｆｃへの結合を示す。 ＥＬＩＳＡにより示された、７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ＬＩＧＨＴの二量体形態のｈＬＴβＲおよびＨＥＲ２への同時結合を示す。
各種図面における類似の参照記号は類似の要素を示す。
表の簡単な説明
表１ フローサイトメトリーにより測定した、ＨＥＲ２に対するＦａｂの結合活性の概要を示す。
表２ ＬＩＧＨＴ融合タンパク質の結合活性の概要を示す。
表３ 定量逆転写ＰＣＲにより測定した、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０処理によりもたらされたＨＴ２９細胞中の炎症促進性遺伝子の例を示す。
本発明は、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織に選択的に送達され、それによって、（腫瘍細胞死および／または抗腫瘍免疫性を含む）抗腫瘍の反応を誘発するＬＩＧＨＴ標的分子の生成に少なくとも部分的に基づく。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、ＬＩＧＨＴ部分（例えば、ＬＩＧＨＴタンパク質、またはその機能的変異体もしくはその断片）、および癌タンパク質（例えば、癌細胞または腫瘍上で発現した細胞表面タンパク質）と相互作用（例えば、結合）する標的部分（例えば、抗体分子などの結合剤）を含む少なくとも１個のＬＩＧＨＴ融合分子を含み、それによって、過剰増殖性細胞または組織に近接したＬＩＧＨＴ部分を送達する。理論に縛られないが、および図３に示すように、本発明のＬＩＧＨＴ標的分子は、その受容体である、リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）およびヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）のうちの１種に結合する際、以下の活性の１つ以上を発揮すると考えられる：ｉ）１種以上のケモカインまたはサイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＩＬ−５、ＩＬ−８またはＴＮＦ）、ケモカインまたはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１０ＲＡ）接着分子、および／または共刺激分子の発現を誘発すること；（ｉｉ）Ｔ細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＣＤ４もしくはＣＤ８発現Ｔ細胞、および／または調節Ｔ細胞を活性化させること；（ｉｉｉ）Ｔ細胞を、過剰増殖性（例えば、腫瘍）部位または細胞中に動員すること；（ｉｖ）腫瘍反応性Ｔ細胞増殖を活性化させることおよび／または増強すること；（ｖ）リンパ様微環境を、例えば、過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織に生成すること；（ｖｉ）過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織のアポトーシスを誘発すること；ならびに／または（ｖｉｉ）対象における免疫応答を刺激すること、例えば、対象の免疫系を過剰増殖性（例えば、腫瘍または癌性）細胞または組織に対して刺激すること。
１つの例示的な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＨＥＲ２に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物」と呼ぶ）を少なくとも１つ含む。理論に縛られないが、ＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２融合物は、抗ＨＥＲ２抗体分子に媒介された腫瘍細胞死を誘発すること、ならびに局所的なＬＩＧＨＴ媒介性抗腫瘍免疫性を刺激することによって二重抗癌効果をひきおこすと考えられる。したがって、本発明は、部分的に、ＬＩＧＨＴ標的分子（例えば、ＬＩＧＨＴ融合分子）、ＨＥＲ２に対する抗体分子、およびそれを用いて様々な過剰増殖性（例えば、新生物）疾患（癌および転移を含む）を治療するための方法を提供する。
本発明がさらに容易に理解され得るように、いくつかの用語を最初に定義する。さらなる定義については、本明細書を通して説明する。
本明細書で使用する、冠詞「ａ」および「ａｎ」とは、冠詞の文法上の目的語の１つまたは複数（例えば、少なくとも１つ）を指す。
本明細書で使用する「または」という用語は、文脈が明確に別様に示さない限り、「および／または」という用語を意味し、それと同義的に使用する。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義的に使用する。
「約（Ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」とは、一般に、測定値の性質および精度を考慮した測定量の許容される誤差の程度を意味する。誤差の程度の例は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には、１０％以内、さらに典型的には、５％以内である。
「ＬＩＧＨＴタンパク質」という用語および類似した用語（「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用する）は、ＬＩＧＨＴ関連活性（例えば、以下から選択される、ＬＩＧＨＴ受容体（典型的にはマウスまたはヒトＬＩＧＨＴ受容体）と相互作用（例えば、結合）できること）を保持する、任意の種（典型的には哺乳類、例えば、マウス、またはヒトまたは非ヒト霊長類起源）由来のＴＮＦスーパーファミリーメンバー、ならびにその機能的変異体（変異体、断片およびペプチド模倣形態を含む）を指す：リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）（Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４ ７０７−１０， Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９： ３２８８−９８）；ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８７（３）： ４２７−３６）、および／またはデコイ受容体３（ＤｃＲ３）（Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ １３７３３−６））。また、ＬＩＧＨＴの可溶型、例えば、ＬＩＧＨＴまたはその機能的変異体の細胞外ドメイン含有可溶型も包含する。典型的には、ＬＩＧＨＴは、本明細書に記載の生体活性および以下の特徴のうちの１つを有する：（ｉ）天然哺乳類ＬＩＧＨＴポリペプチドまたはその断片（例えば、成熟ＬＩＧＨＴ）のアミノ酸配列、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）もしくはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム２（配列番号１１１）もしくはマウスＬＩＧＨＴ（配列番号１１３）またはそれらの断片（例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１として示す、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約９３〜２４０位のアミノ酸、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約２５３〜４００位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約２５８〜４０５位のアミノ酸、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号４として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応する）の約２４５〜３９２位のアミノ酸のアミノ酸配列、または（ｉｉ）それと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；（ｉｉｉ）ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号５として示す、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約２７７〜７２０位のヌクレオチド、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム２（配列番号１１２）、マウスＬＩＧＨＴ（配列番号１１４）、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約７５７〜１２００位のヌクレオチド、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約７７２〜１２１５位のヌクレオチド、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号８として示す、抗ＨＥＲ２抗体分子に融合したＬＩＧＨＴ細胞外ドメインの一部に対応するヌクレオチド配列）の約７３３〜１１７６位のヌクレオチド由来のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列、または（ｉｖ）それと実質的に同一であるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；または（ｖ）天然ＬＩＧＨＴヌクレオチド配列もしくはその断片、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）のアミノ酸配列もしくはその断片に退化したヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または（ｖｉ）緊縮条件下、例えば、高ストリンジェント条件で前述のヌクレオチド配列の１つにハイブリッド形成するヌクレオチド配列。
ＬＩＧＨＴ「の生体活性」という語句は、ＬＩＧＨＴに関連する生体活性（以下が挙げられるが、これらに限定されない）の１つ以上を指す：（ｉ）１つ以上のＬＩＧＨＴ受容体（例えば、リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、および／またはデコイ受容体３（ＤｃＲ３））に結合すること；（ｉｉ）１種以上のケモカインまたはサイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＩＬ−５、ＩＬ−８またはＴＮＦ）、ケモカインまたはサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１０ＲＡ）接着分子、および／または共刺激分子の発現を誘発すること；（ｉｉｉ）Ｔ細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＣＤ４もしくはＣＤ８発現Ｔ細胞、および／または調節Ｔ細胞を活性化させること；（ｉｖ）Ｔ細胞を過剰増殖性（例えば、腫瘍）部位または細胞中に動員すること；（ｖ）腫瘍反応性Ｔ細胞増殖を活性化させることおよび／または増強すること；（ｖｉ）リンパ様微環境を、例えば、過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織に生成すること；（ｖｉｉ）過剰増殖性（例えば、腫瘍）細胞または組織のアポトーシスを誘発すること；ならびに／または（ｖｉｉｉ）免疫応答を対象において刺激すること、例えば、対象の免疫系を過剰増殖性（例えば、腫瘍または癌性）細胞または組織に対して刺激すること。
本発明の方法および組成物は、特定した配列、または特定した配列と実質的に同一もしくは類似した配列、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９５％以上同一の配列を有するＬＩＧＨＴ標的分子、抗体分子および核酸を包含する。アミノ酸配列と関連して本明細書で使用する「実質的に同一」という用語は、第一および第二のアミノ酸配列が共通の構造的ドメインおよび／または共通の機能的活性を有することができるように、整列した第二のアミノ酸配列中のアミノ酸残基ｉ）と同一であるまたはｉｉ）その保存的置換であるアミノ酸残基を十分な数または最小限含む第一のアミノ酸を指す。例えば、基準配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列を指す。
ヌクレオチド配列と関連して本明細書で使用する「実質的に同一」という用語は、第一および第二のヌクレオチド配列が共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするように、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは一般的な機能的ポリペプチド活性をコードするように、整列した第二の核酸配列中のヌクレオチドと同一のヌクレオチドを十分な数または最小限含む第一の核酸配列を指す。例えば、基準配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を指す。
また、本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドの断片、誘導体、アナログ、もしくは変異体、およびそれらの任意の組み合わせも含む。「断片」、「変異体」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、ＬＩＧＨＴタンパク質について述べる場合、本発明のＬＩＧＨＴ標的分子、抗体分子は、天然抗体またはポリペプチドに対応する機能的特性を少なくとも一部保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片としては、本明細書の他の個所で論じた特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が挙げられる。本発明のポリペプチドの変異体としては、上記の断片が挙げられ、アミノ酸の置換、欠失、または挿入により改変されたアミノ酸配列を伴うポリペプチドも含む。変異体は、天然であっても非天然であってもよい。非天然変異体は、当該技術分野で知られている変異誘発技術を用いて産生し得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。本発明の断片の誘導体は、天然ポリペプチド上に見られない追加の特徴を示すように改変されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。本明細書で使用するポリペプチドの「誘導体」とは、官能性側鎖の反応により化学的に誘導体化する１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。また、「誘導体」として、２０種の標準的なアミノ酸の１種以上の天然アミノ酸誘導体を含むポリペプチドも含む。
「機能的変異体」という用語は、天然配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によりコードされており、天然配列の１つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は本明細書において同義的に使用する）の算出を、以下のように行う。至適に比較できるように配列を整列させる（例えば、至適に整列するために第一および第二のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、比較するために非相同配列を無視することができる）。比較するために整列する基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、６０％、よりさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％であることができる。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その位置で分子は同一である（本明細書で使用する、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同義である）。
２配列間の同一率（％）は、２配列の至適整列のために導入する必要があるギャップ数、および各ギャップの長さを考慮した、配列の共有する同一の位置数の関数である。配列の比較および２配列間の同一率（％）の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つのアミノ酸配列間の同一率（％）は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップウェイト、ならびに１、２、３、４、５、もしくは６のレングスウェイトを用いて決定することができる（このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている）。２つのヌクレオチド配列間の同一率（％）は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに４０、５０、６０、７０、もしくは８０のギャップウェイト、ならびに１、２、３、４、５、もしくは６のレングスウェイトを用いて決定することができる。特に好ましいパラメータ群（および他で明記しない限り使用するパラメータ群）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を用いたＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリング行列である。
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一率（％）は、Ｅ． Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ （（１９８９） ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる（このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている）。本明細書に記載の核酸およびタンパク質配列を「クエリー配列」として使用し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公開データベースにおいて検索することができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、単語の長さ＝１２で実施し、本発明の核酸（配列番号１）分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施し、本発明のタンパク質（配列番号１）分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップ整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載のようにギャップＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用時、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用できる。
本明細書で使用する「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または超高ストリンジェンシー条件下のハイブリッド形成」という用語は、ハイブリッド形成および洗浄の条件を説明する。ハイブリッド形成反応を実施するためのガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に見出すことができる。水性方法および非水性方法は、この参考文献に記載されており、いずれをも使用することができる。本明細書で参照する特異的ハイブリッド形成条件は、以下のとおりである：１）約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて少なくとも５０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄する低ストリンジェンシーハイブリッド形成条件（洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件では５５℃に上昇させることができる）、２）約４５℃での６×ＳＳＣ、続いて６０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄する中ストリンジェンシーハイブリッド形成条件、３）約４５℃での６×ＳＳＣ、続いて６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄する高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件、および好ましくは４）６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いて６５℃の０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上洗浄する超高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件。超高ストリンジェンシー条件（４）が好ましい条件であり、他で明記しない限り、これを使用する。
本発明のＬＩＧＨＴ標的分子は、それらの機能に対して大幅な影響を及ぼさない追加の保存的置換または非必須アミノ酸置換を有してもよいことが理解される。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
本発明の様々な態様を以下に詳述する。
Ｉ．ＬＩＧＨＴ標的分子
１つの態様では、本発明は、少なくとも１個のＬＩＧＨＴ部分（例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴタンパク質、またはその機能的変異体もしくはその断片）、ならびに過剰増殖性細胞上の表面タンパク質（例えば、癌または腫瘍の細胞または組織上で発現した細胞表面タンパク質）と相互作用（例えば、結合）する少なくとも１個の標的部分（例えば、抗体分子などの結合剤）を含み、それによって、ＬＩＧＨＴ部分を過剰増殖性細胞もしくは組織に送達するＬＩＧＨＴ標的分子を特徴とする。実施形態では、ＬＩＧＨＴ分子は（例えば、化学的結合、遺伝的またはポリペプチド融合、非共有結合などにより）標的部分に機能的に結合している。例えば、ＬＩＧＨＴ分子は、結合基によりもしくはよらず、遺伝的またはポリペプチド融合物として標的部分に融合できる。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ分子は、結合基（例えば、生体適合性ポリマー）によりもしくはよらず反応基を介して抗体分子に共有結合している。ＬＩＧＨＴ標的分子は、少なくとも１個のＬＩＧＨＴ部分および少なくとも１個の標的部分の単量体、二量体、三量体、四量体、五量体以上であることができる。例えば、ＬＩＧＨＴ標的分子は、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個のＬＩＧＨＴ融合分子を含み得、それぞれは、少なくとも１個のＬＩＧＨＴ部分および少なくとも１個の標的部分を含む。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、３個のＬＩＧＨＴ融合分子を含むか、または本質的にそれからなり、それぞれは、１個のＬＩＧＨＴ部分（例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ部分）および１個の標的部分（例えば、本明細書に記載の標的部分）を含むか、または本質的にそれからなる。
本明細書で使用する「融合タンパク質」とは、２個以上の作動可能に連結される（例えば、結合した）部分（例えば、タンパク質部分）を含むタンパク質を指す。典型的には、この部分は共有結合している。この部分は、直接結合することもでき、スペーサーまたはリンカー（例えば、本明細書に記載の結合基）を介して連結することもできる。
他の実施形態では、標的部分は、ＬＩＧＨＴ部分が所望の部位（例えば、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織）に対して１つ以上のＬＩＧＨＴ関連活性（例えば、１つ以上の本明細書に記載のＬＩＧＨＴ関連活性）を誘発するように、所望の部位（例えば、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織）に対しＬＩＧＨＴ標的部分を指向させる。標的部分に標的化できる過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織の例としては、乳房、肺、胃、卵巣、前立腺、膵臓、結腸、結腸直腸、腎臓、膀胱、肝臓、頭部、頸部、脳の癌または固形腫瘍、ならびに軟組織悪性腫瘍（リンパ性悪性腫瘍、白血病および骨髄腫を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。標的部分は、１個以上の本明細書に記載の過剰増殖性細胞または組織上で発現した１個以上の細胞表面タンパク質に結合できる。例えば、標的部分（例えば、本明細書に記載の抗体分子）は１種以上の成長因子受容体（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ｃｒｉｐｔｏ）；癌関連インテグリンもしくはインテグリン受容体（例えば、αｖβ６、α６β４、ラミニン受容体（ＬＡＭＲ）；ならびに／またはＣＤ２３、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＥｐＣＡＭおよび／もしくはＴｗｅａｋ受容体（ＦＮ１４）に結合できる。選択された各標的について、本明細書に詳述する。
上皮成長因子受容体：ヒトＥＧＦＲゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡのヌクレオチド酸配列は、例えば、Ｕｌｌｒｉｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０９：４１８−４２５（１９８４） （アイソフォーム１）； Ｉｌｅｋｉｓ Ｊ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４１：１４９−１５６ （アイソフォーム２）； Ｒｅｉｔｅｒ Ｊ．Ｌ． ａｎｄ Ｍａｉｈｌｅ Ｎ． Ｊ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：４０５０−４０５６（１９９６） （アイソフォーム２）； Ｉｌｅｋｉｓ Ｊ．Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ６５：３６−４１（１９９７） （アイソフォーム２）；およびＲｅｉｔｅｒ Ｊ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７１：１−２０（２００１）（アイソフォーム３および４）に開示されている。ヒトＥＧＦＲのタンパク質配列およびそのリン酸化反応およびユビキチン化部位は、例えば、Ｈｅｉｓｅｒｍａｎｎ Ｇ．Ｊ． ａｎｄ Ｇｉｌｌ Ｇ．Ｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１３１５２−１３１５８（１９８８）； Ｚｈａｎｇ Ｚ． ａｎｄ Ｈｅｎｚｅｌ Ｗ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １３：２８１９−２８２４（２００４）； Ｒｕｓｓｏ Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：５２０５−５２０８（１９８５）； Ｈｕａｎｇ Ｆ． ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ２１：７３７−７４８（２００６）；およびＡｂｅ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１１１５０−１１１５７（１９９８）に開示されている。マウスＥＧＦＲ ｍＲＮＡのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ａｖｉｖｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７：１９５７−１９６２（１９９２）； Ｐａｒｉａ Ｂ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：５５−５９（１９９３）； Ｌｕｅｔｔｅｋｅ Ｎ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：３９９−４１３（１９９４）；およびＡｖｉｖｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：６７３−６７６（１９９１）に開示されている。ヒトＥＧＦＲは遍在的に発現する。アイソフォーム２は卵巣癌にも発現する。この遺伝子変異は肺癌に関連する。ＥＧＦＲは乳癌細胞中のＭＵＣ１をリン酸化し、ＭＵＣ１とＣ−ＳＲＣおよびＣＴＮＮＢ１／β−カテニンの相互作用を増大する。
インスリン様成長因子１：ヒトＩＧＦ１ＲゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡのヌクレオチド酸配列は、例えば、Ｕｌｌｒｉｃｈ Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：２５０３−２５１２（１９８６）； Ａｂｂｏｔ Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０７５９−１０７６３（１９９２）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）； Ｃｏｏｋｅ Ｄ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １７７：１１１３−１１２０（１９９１）；およびＬｅｅ Ｓ．−Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：３４０３−３４１０（１９９３）に開示されている。ヒトＩＧＦ１Ｒのタンパク質配列は、例えば、Ｕｌｌｒｉｃｈ Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：２５０３−２５１２（１９８６）に開示されている。マウスＩＧＦ１Ｒ ｍＲＮＡのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｗａｄａ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：１０３６０−１０３６４（１９９３）；およびＷｉｌｋｓ Ａ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ８５：６７−７４（１９８９）に開示されている。ヒトＩＧＦ１Ｒは様々な組織に発現する。ＩＧＦ１Ｒ欠損は、一部の場合、インスリン様成長因子１耐性（ＩＧＦ１耐性）の原因であり得る。ＩＧＦ１耐性は、増大した血漿ＩＧＦ１を伴う子宮内成長の遅延化（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）および出生後成長不良を特徴とする増殖欠陥障害である。
ＨＥＲ３：ヒトＨＥＲ３のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｋｒａｕｓ Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：９１９３−９１９７（１９８９） （アイソフォーム１）； Ｐｌｏｗｍａｎ Ｇ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：４９０５−４９０９（１９９０） （アイソフォーム１）； Ｋａｔｏｈ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９２：１１８９−１１９７（１９９３）（アイソフォーム２）；およびＴｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）（アイソフォーム１）に開示されている。マウスＨＥＲ３のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）；およびＭｏｓｃｏｓｏ Ｌ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １７２：１５８−１６９（１９９５）に開示されている。ヒトＨＥＲ３は上皮組織および脳に発現する。それはヒト乳癌のサブセットに過剰発現する。ＨＥＲ３欠損は、致死的な先天性痙縮症候群２型（ＬＣＣＳ２）（イスラエルベドウィン多発性痙縮症候群Ａとも呼ばれる）の原因である。ＬＣＣＳ２は、脊髄前角の萎縮を伴う新生児致死的関節拘縮症の常染色体劣性神経形態である。
ＨＥＲ４：ヒトＨＥＲ４のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｐｌｏｗｍａｎ Ｇ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：１７４６−１７５０（１９９３）（アイソフォームＪＭ−Ａ）； Ｅｌｅｎｉｕｓ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２６７６１−２６７６８（１９９７）（アイソフォームＪＭ−ＡおよびＪＭ−Ｂ）；およびＴｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）（アイソフォームＪＭ−Ａ）に開示されている。マウスＨＥＲ４のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１５５９−１５６３（２００５）； Ｅｌｅｎｉｕｓ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２６７６１−２６７６８（１９９７）； Ｍｏｓｃｏｓｏ Ｌ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １７２：１５８−１６９（１９９５）に開示されている。ヒトＨＥＲ４は、骨格筋、副甲状腺、小脳、下垂体、脾臓、精巣および乳房に加えて脳、心臓、腎臓に最高レベルで；ならびに胸腺、肺、唾液腺、および膵臓により低いレベルで発現する。この遺伝子の変異は癌に関連している。
ＭＥＴ：Ｍｅｔ原腫瘍遺伝子（肝細胞成長因子受容体）（ＭＥＴ）は、当該技術分野においてＨＧＦＲ、ＡＵＴＳ９、ＲＣＣＰ２およびｃ−Ｍｅｔとしても知られている。ヒトＭＥＴのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｐａｒｋ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：６３７９−６３８３（１９８７） （アイソフォーム２）； Ｈｉｌｌｉｅｒ Ｌ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２４：１５７−１６４（２００３）； Ｃｈａｎ Ａ．Ｍ．−Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １：２２９−２３３（１９８７）． Ｌｅｅ Ｓ．−Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：３４０３−３４１０（１９９３）；およびＤｅａｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：３８５−３８８（１９８５）に開示されている。マウスＭＥＴのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｃｈａｎ Ａ．Ｍ．−Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２：５９３−５９９（１９８８）； Ｗｉｌｋｓ Ａ．Ｆ． Ｇｅｎｅ ８５：６７−７４（１９８９）；およびＷｅｉｄｎｅｒ Ｋ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２１：１４５−１５４（１９９３）に開示されている。ＴＰＲ遺伝子との再配列後のＭＥＴ活性化は、発癌性タンパク質を生成する。ＭＥＴ中の欠損は、胃癌に関連し得る。ＭＥＴ欠損は肝細胞癌（ＨＣＣ）の原因であり、遺伝性乳頭状腎臓癌（ＨＰＲＣ）（乳頭状腎臓細胞癌２（ＲＣＣＰ２）としても知られている）の原因である。ＨＰＲＣは、多発性両側性乳頭状腎臓腫瘍を発現する素因を特徴とする遺伝性腎臓癌形態である。遺伝パターンは、低減した浸透を伴う常染色体優性伝達と一致する。ＭＥＴ中の遺伝的変形は、自閉症１Ｂ型（ＡＵＴＳ１Ｂ）に対する感受性に関連し得る。
ＲＯＮ：ヒトＲＯＮのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｒｏｎｓｉｎ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１１９５−１２０２（１９９３）；およびＣｏｌｌｅｓｉ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６：５５１８−５５２６ （１９９６）に開示されている。マウスＲＯＮのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｉｗａｍａ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８３：３１６０−３１６９（１９９４）； Ｗａｌｔｚ Ｓ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：２７−４２（１９９８）；およびＰｅｒｓｏｎｓ Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２３：１５９−１６５（１９９９）に開示されている。ＲＯＮはケラチン生成細胞および肺に発現する。ＲＯＮはマウスにおけるフレンドウイルス誘発性赤白血病に対する感受性を与える。
Ｃｒｉｐｔｏ：ヒトＣｒｉｐｔｏのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａ Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１９８７−１９９１（１９８９）； Ｄｏｎｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ４９：５５５−５６５（１９９１）； Ｚｈａｎｇ Ｚ． ａｎｄ Ｈｅｎｚｅｌ Ｗ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １３：２８１９−２８２４（２００４）； Ｆｏｌｅｙ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：３６１０−３６１８（２００３）に開示されている。マウスＣｒｉｐｔｏのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｄｏｎｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８：１１５７−１１６８（１９９３）；およびＬｉｇｕｏｒｉ Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ ７：３４４−３４８（１９９６）に開示されている。Ｃｒｉｐｔｏは胃および結腸直腸癌においてそれらの正常対応物よりも選択的に発現する。マウスにおいて、成体動物の特定臓器（脾臓、心臓、肺および脳など）で低レベルで発現する。Ｃｒｉｐｔｏに結合する抗体分子の例は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１６６３４１Ａ１号に記載されている。
ＶＥＧＦＲ：ヒトＶＥＧＦＲのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｓｈｉｂｕｙａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：５１９−５２４（１９９０） （アイソフォームＦｌｔ１）； Ｋｅｎｄａｌｌ Ｒ．Ｌ． ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｋ．Ａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：１０７０５−１０７０９（１９９３） （アイソフォームＳＦＬＴ１）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４） （アイソフォームｓＦｌｔ１）； Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７８：６５５−６６１（１９８７） （アイソフォームＦｌｔ１）；およびＩｔｏ Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２３４１０−２３４１８（１９９８）に開示されている。マウスＶＥＧＦＲのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｆｉｎｎｅｒｔｙ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２２９３−２２９８（１９９３）； Ｃｈｏｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１２６１−１２６６（１９９４）；およびＫｏｎｄｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ２０８：２９７−３０５（１９９８）に開示されている。ＶＥＧＦＲは、主に正常肺に発現するが、胎座、肝臓、腎臓、心臓および脳組織にも発現する。それは特定的にはほとんどの血管内皮細胞に発現し、末梢血単核球にも発現する。それは腫瘍細胞系には発現しない。アイソフォームｓＦｌｔ１は胎座に強く発現する。
インテグリンαｖβ６：インテグリンは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と相互作用し、様々な細胞内シグナルを媒介する細胞表面受容体である。多くの種類のインテグリンがあり、多くの細胞が表面上に複数の種類を有している。インテグリンは、α（アルファ）およびβ（ベータ）サブユニットと呼ばれる２個の異なる鎖を含有する偏性ヘテロ二量体である。哺乳類において、１９αおよび８βサブユニットの特性が決定されている。ヒトインテグリンαｖのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：１４０８０−１４０８５（１９８７）； Ｓｉｍｓ Ｍ．Ａ．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ８９：２６８−２７１（２０００）； Ｈｉｌｌｉｅｒ Ｌ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４３４：７２４−７３１（２００５）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）； Ｄｏｎａｈｕｅ Ｊ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２１９：２２８−２３２（１９９４）； Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：８６１４−８６１８（１９８６）； Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５７：５９−６９（１９８９）に開示されている。マウスインテグリンαｖのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースに提出されたＡｌｍｅｉｄａ Ｊ．（２００８年４月）に開示されている。ヒトインテグリンβ６のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１１５０２−１１５０７（１９９０）； Ｈｉｌｌｉｅｒ Ｌ．Ｗ．， Ｎａｔｕｒｅ ４３４：７２４−７３１（２００５）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）； Ｊｉａｎｇ Ｗ．−Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：１０３１−１０４０（１９９２）に開示されている。マウスインテグリンβ６のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ａｒｅｎｄ Ｌ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １１：２２９７−２３０５（２０００）； Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１５５９−１５６３（２００５）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）に開示されている。
インテグリンαｖβ６は、大部分が増殖性上皮（例えば、肺および肝臓）に分布している。インテグリンαｖβ６機能は、例えば、Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ． ３６（Ｐｔ ２）：２５７−２６２ （２００８）； Ｗｉｐｆｆ Ｐ．Ｊ． ａｎｄ Ｈｉｎｚ Ｂ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８７：６０１−６１５（２００８）； Ｂａｔｅｓ Ｒ．Ｃ． Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ． １：８２１−８（２００５）； Ｔｈｏｍａｓ Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ． ３５：１−１０（２００６）； Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． ２４：３９５−４０２（２００５）； Ｂａｔｅｓ Ｒ．Ｃ． ａｎｄ Ｍｅｒｃｕｒｉｏ Ａ．Ｍ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． ４：３６５−３７０（２００５）； Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４：６５７−６５９（２００４）； Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ｄ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６：５５２−５５７（２００４）； Ｗａｄａ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １７：７５−７７（２００２）； Ｔｈｏｍａｓ Ｇ．Ｊ． ａｎｄ Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｐ．Ｍ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ． １２：４７９−４９８（２００１）；およびＩｍｈｏｆ Ｂ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１３：１９５−２０３（１９９６）に開示されている。
インテグリンα６β４：ヒトインテグリンα６のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９：４２５−４３３（１９９１） ； Ｓｔａｒｒ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：６１２−６１８（１９９２）； Ｔａｍｕｒａ Ｒ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：１０１８３−１０１８７（１９９１）； Ｚｉｏｂｅｒ Ｂ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２６７７３−２６７８３（１９９３）； Ｓｈａｗ Ｌ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１１４０１−１１４０８（１９９３）；およびＤｅｌｗｅｌ Ｇ．Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３：１４３−１６１（１９９５）に開示されている。マウスインテグリンα６のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１５５９−１５６３（２００５）に開示されている。ヒトインテグリンβ４のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ． ａｎｄ Ｎａｉｔｏｈ Ｙ． ＥＭＢＯ Ｊ． ９：７５７−７６３（１９９０）； Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ９：７６５−７７０（１９９０）；およびＴａｍｕｒａ Ｒ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１１：１５９３−１６０４（１９９０）に開示されている。マウスインテグリンβ４のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースに提出されたＢｒｏｗｎ Ｊ．（２００８年４月）に開示されている。
インテグリンα６β４は、大部分が上皮および内皮組織ならびにシュワン細胞に発現する。α６β４の発現は多くの上皮腫瘍で増大し、癌細胞中でいくつもの主要シグナリング分子を活性化する（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ経路の活性化を含む）（Ｂｏｎ Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９：２０３（２００７）； Ｗｉｌｈｅｌｍｓｅｎ Ｋ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２６：２８７７−８６（２００６））。
ＬＡＭＲ：リボソームタンパク質ＳＡ（ＬＡＭＲ）。これは、当該技術分野において、ＲＰＳＡ、ＬＲＰ、ｐ４０、６７ＬＲ、３７ＬＲＰ、ＬＡＭＢＲおよびＬＡＭＲ１としても知られている。細胞外マトリックス糖タンパクファミリーであるラミニンは、基底膜の主要な非コラーゲン性構成要素である。ヒトＬＡＭＲのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｙｏｗ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：６３９４−６３９８（１９８８）； ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄ Ａ．Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：３８２９−３８４３（１９８９）； Ｓａｔｏｈ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ６２：１９９−２０３（１９９２）； Ｊａｃｋｅｒｓ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３：４９５−５０３（１９９６）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）； Ｓｉｙａｎｏｖａ Ｅ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｏｋｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１３：２２７−２３１（１９９０）； Ｖｌａｄｉｍｉｒｏｖ Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３９：１４４−１４９（１９９６）； Ｓｅｌｖａｍｕｒｕｇａｎ Ｎ． ａｎｄ Ｅｌｉｃｅｉｒｉ Ｇ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：４００−４０１（１９９５）；およびＷｅｗｅｒ Ｕ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：７１３７−７１４１（１９８６）に開示されている。マウスＬＡＭＲのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｒａｏ Ｃ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：７４７６−７４８６（１９８９）； Ｍａｋｒｉｄｅｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：２３４９−２３４９（１９８８）； Ｃｏｇｇｉｎ Ｊ．Ｈ． Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９：５５３５−５５４２（１９９９）； Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１５５９−１５６３（２００５）；およびＴｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）に開示されている。ラミニン受容体転写物レベルは、結腸癌組織および肺癌細胞系において正常対応物よりも高いことが観察されている。また、癌細胞中のこのポリペプチドの上方制御とそれらの浸潤性および転移表現型との間に相関関係もある。
ＣＤ２３：ＩｇＥのＦｃ断片、低親和性ＩＩ、（ＣＤ２３）受容体。これは当該技術分野において、ＦＣＥＲ２、ＦＣＥ２、ＣＤ２３Ａ、ＩＧＥＢＦおよびＣＬＥＣ４Ｊとしても知られている。ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）は、Ｂ細胞活性化および増殖における主要分子である。これは低親和性のＩｇＥ受容体である。切断分子は分泌され得、次いで、強力な分裂促進成長因子として機能する。ヒトＣＤ２３のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｉｋｕｔａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：８１９−８２３（１９８７）； Ｋｉｋｕｔａｎｉ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４７：６５７−６６５（１９８６）； Ｌｕｅｄｉｎ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１０９−１１４（１９８７）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）； Ｒｏｓｅ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８６：８１９−８２４（１９９２）；およびＹｏｋｏｔａ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５５：６１１−６１８（１９８８）に開示されている。マウスＣＤ２３のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｂｅｔｔｌｅｒ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：７５６６−７５７０（１９８９）； Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｓ．Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：１９７４−１９８２（１９９０）；およびＫｏｎｄｏ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０５：３８−４８（１９９４）に開示されている。標的部分として使用できる抗ＣＤ２３抗体は、例えば、米国特許第７，３３２，１６３号および同第７，２２３，３９２号に記載されている。
ＣＤ２０：膜貫通４−ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１（ＣＤ２０）は当該技術分野において、ＭＳ４Ａ１、Ｂ１、Ｓ７、Ｂｐ３５、ＭＳ４Ａ２、ＬＥＵ−１６およびＭＧＣ３９６９としても知られている。ＣＤ２０は膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーメンバーをコードする。ヒトＣＤ２０のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ Ｉ． ａｎｄ Ｓｅｅｄ Ｂ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７：１９７５−１９８０（１９８８）； Ｔｅｄｄｅｒ Ｔ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２０８−２１２（１９８８）； Ｅｉｎｆｅｌｄ Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：７１１−７１７（１９８８）； Ｔｅｄｄｅｒ Ｔ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２：２５６０−２５６８（１９８９）； Ｔａｙｌｏｒ Ｔ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４４０：４９７−５００（２００６）；およびＴｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）に開示されている。マウスＣＤ２０のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｔｅｄｄｅｒ Ｔ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４３８８−４３９４（１９８８）； Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１５５９−１５６３（２００５）；およびＴｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）に開示されている。ＣＤ２０はＢ細胞上で発現する。この遺伝子は、Ｂ細胞の血漿細胞中への発現および分化において役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードする。
ＣＤ１６：ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩＩａまたはＩＩＩｂ、受容体（ＣＤ１６）。これは、当該技術分野において、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＣＧ３、ＣＤ１６Ａ、ＦＣＧＲ３、ＩＧＦＲ３、ＦＣＲ−１０、ＦＣＲＩＩＩ、ＦＣＧＲＩＩＩおよびＦＣＲＩＩＩＡとしても知られている。ヒトＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）；およびＳｃａｌｌｏｎ Ｂ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：５０７９−５０８３（１９８９）に開示されている。ヒトＣＤ１６ｂのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ． ａｎｄ Ｐｅｒｕｓｓｉａ Ｂ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７０：４８１−４９７（１９８９）； Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｄ． ａｎｄ Ｓｅｅｄ Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３３３：５６８−５７０（１９８８）； Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｄ． ａｎｄ Ｓｅｅｄ Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３４０：６６２−６６２（１９８９）； Ｐｅｌｔｚ Ｇ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：１０１３−１０１７（１９８９）； Ｓｃａｌｌｏｎ Ｂ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：５０７９−５０８３（１９８９）； Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６４：１１９−１３１（２００４）；およびＧｅｓｓｎｅｒ Ｊ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１３５０−１３６１（１９９５）に開示されている。マウスＣＤ１６のヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｂｏｎｎｅｒｏｔ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９： ３５３−３６１（１９９２）； ａｎｄ Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ Ａ． Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７： ２８５６−２８６０ （１９９０）に開示されている。ＦＣＧＲ３Ａによりコードされた受容体は、天然キラー（ＮＫ）細胞上で膜貫通ペプチドを介して一体の膜糖タンパク質アンカーとして発現する一方、ＦＣＧＲ３Ｂは受容体がホスファチジルイノシトール（ＰＩ）リンケージを介して固定する多核白血球（ＰＭＮ）上で発現する。この遺伝子における変異は、再発性ウイルス感染に対する感受性、全身性エリテマトーデスに対する感受性、および同種免疫新生児好中球減少症に関連付けられている。さらに活性のＦＣＧＲ３Ｂ＊０１対立遺伝子は、ある全身血管炎における重度の腎臓疾患に関連付けられている。
ＥｐＣＡＭ：腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＥｐＣＡＭ）。これは当該技術分野において、ＴＡＣＳＴＤ１、ＥＧＰ、ＫＳＡ、Ｍ４Ｓ１、ＭＫ−１、ＣＤ３２６、ＥＧＰ４０、ＭＩＣ１８、ＴＲＯＰ１、Ｅｐ−ＣＡＭ、ｈＥＧＰ−２、ＣＯ１７−１ＡおよびＧＡ７３３−２としても知られている。この９エクソンの遺伝子は腫瘍関連抗原をコードし、少なくとも２種類のＩ膜タンパク質を含むファミリーの成員である。ヒトＥｐＣＡＭのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｓｔｒｎａｄ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：３１４−３１７（１９８９）； Ｓｉｍｏｎ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：２７５５−２７５９（１９９０）； Ｐｅｒｅｚ Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ Ｌ．Ｅ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４２：３６６２−３６６７（１９８９）； Ｓｚａｌａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：３５４２−３５４６（１９９０）； Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）； Ｌｉｎｎｅｎｂａｃｈ Ａ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：２７−３１（１９８９）；およびＣｈｏｎｇ Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｐｅｉｃｈｅｒ Ｄ．Ｗ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：５８０４−５８１３（２００１）に開示されている。マウスＥｐＣＡＭのヌクレオチド酸およびタンパク質配列は、例えば、Ｔｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）；およびＣａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１５５９−１５６３（２００５）に開示されている。この抗原はほとんどの正常上皮細胞および胃腸癌上で発現し、カルシウムに依存しない同型細胞接着分子として機能する。
ＦＮ１４：腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー成員１２Ａ（ＦＮ１４）。当該技術分野において、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＣＤ２６６およびＴＷＥＡＫＲとしても知られている。これはＴＮＦＳＦ１２／ＴＷＥＡＫの受容体である。ヒトＦＮ１４のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｆｅｎｇ Ｓ．−Ｌ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５６：１２５３−１２６１（２０００）；およびＴｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）に開示されている。マウスＦＮ１４のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、例えば、Ｍｅｉｇｈａｎ−Ｍａｎｔｈａ Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３３１６６−３３１７６（１９９９）； Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１５５９−１５６３（２００５）；およびＴｈｅ ＭＧＣ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｔｅａｍ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：２１２１−２１２７（２００４）に開示されている。ヒトＦＮ１４の未加工前駆体は、約１２９個のアミノ酸の長さおよび約１３９１１Ｄａの分子量である。マウスＦＮ１４の未加工前駆体は、約１２９個のアミノ酸の長さおよび約１３６４１Ｄａの分子量である。ヒトＦＮ１４は心臓、胎座および腎臓に高度に発現し、肺、骨格筋および膵臓に中程度に発現する。マウスＦＮ１４は胎児心臓、腸管、腎臓、肝臓、肺および皮膚、成体の心臓および卵巣に高度に発現し、成体の腎臓、肺および皮膚に中程度に発現する。
標的部分、例えば、本明細書に記載の抗体分子は、以下のうちの１つ以上にも結合できる：タンパク質チロシンキナーゼ受容体（例えば、ＴＹＲＯ３（タンパク質チロシンキナーゼ受容体ＴＹＲＯ３であり、タンパク質チロシンキナーゼＲＳＥ、ＳＫＹ、ＤＴＫ、もしくはｂｙｋとしても知られている、Ｍａｒｋ Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１０７２０−１０７２８ （１９９４））；ＡＸＬ（タンパク質チロシンキナーゼ受容体ＵＦＯとしても知られている；Ｏ’Ｂｒｙａｎ Ｊ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：５０１６−５０３１（１９９１））；ＤＤＲ１（上皮ジスコイジンドメイン含有受容体１であり、チロシンキナーゼＤＤＲ、ジスコイジン受容体型チロシンキナーゼ、タンパク質チロシンキナーゼＣＡＫ、細胞接着キナーゼ、ＴＲＫ Ｅ、タンパク質チロシンキナーゼＲＴＫ６、ＨＧＫ２、ＣＤ１６７抗原様ファミリーメンバーＡ、乳癌キナーゼ１０（ＭＣＫ−１０）、もしくはＣＤ１６７ａとしても知られている；Ｐｅｒｅｚ Ｊ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２１１−２１９（１９９４））；ＤＤＲ２（ジスコイジンドメイン含有受容体２であり、受容体型タンパク質チロシンキナーゼＴＫＴ、タンパク質チロシンキナーゼＴＹＲＯ１０、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連３、ＣＤ１６７抗原様ファミリーメンバーＢ、もしくはＣＤ１６７ｂとしても知られている；Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｏ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２６：４１６８−４１７６（２００７））；ＡＬＫ（ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体であり、未分化リンパ腫キナーゼもしくはＣＤ２４６としても知られている；Ｓｉｍｏｎｉｔｓｃｈ Ｉ． ｅｌ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １５：１４１６−１４１８（２００１））；ＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体であり、Ｆｍｓ原腫瘍遺伝子、ｃ−ｆｍｓ、もしくはＣＤ１１５としても知られている；Ｈａｍｐｅ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ． ４：９−１７（１９８９）））；成長因子受容体（例えば、ＦＧＦＲ１（塩基性線維芽細胞成長因子受容体１であり、ｂＦＧＦ−Ｒ、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ２、ｃ−ｆｇｒ、もしくはＣＤ３３１としても知られている；Ｄｉｏｎｎｅ Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ９：２６８５−２６９２（１９９０））；ＦＧＦＲ２（線維芽細胞成長因子受容体２であり、ケラチン生成細胞成長因子受容体２もしくはＣＤ３３２としても知られている；Ｈａｔｔｏｒｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：５９８３−５９８７（１９９０）））；成長因子（例えば、ＰＤＧＦ１（血小板由来成長因子サブユニットＡ、血小板由来成長因子Ａ鎖、もしくは血小板由来成長因子αポリペプチドとしても知られている；Ｂｏｎｔｈｒｏｎ Ｄ．Ｔ． ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：１４９２−１４９６（１９８８）））；ＰＤＧＦ２（血小板由来成長因子サブユニットＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子βポリペプチド、もしくはｃ−ｓｉｓとしても知られている；Ｊｏｓｅｐｈｓ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：６３６−６３９（１９８４）））；アポトーシスタンパク質（例えば、ネトリン、例えば、ネトリン−１（Ｍｅｙｅｒｈａｒｄｔ Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． １０：３５−４２（１９９９）、もしくはネトリン−４（β−ネトリンもしくは肝由来ネトリン様タンパク質としても知られている；Ｋｏｃｈ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５１：２２１−２３４（２０００）））；チロシンキナーゼ（例えば、ＭＥＲ（原腫瘍遺伝子タンパク質チロシンキナーゼＭＥＲであり、Ｃ−ｍｅｒもしくは受容体型チロシンキナーゼＭｅｒＴＫとしても知られている；Ｇｒａｈａｍ Ｄ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ５：６４７−６５７（１９９４）））；ホルモン受容体（例えば、ＰＲＬ−Ｒ（プロラクチン受容体；Ｂｏｕｔｉｎ Ｊ．−Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ３：１４５５−１４６１（１９８９））；ＧＨ受容体（増殖ホルモン受容体であり、ソマトトロピン受容体、ＧＨ結合タンパク質、ＧＨＢＰ、もしくは血清結合タンパク質としても知られている；Ｌｅｕｎｇ Ｄ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５３７−５４３（１９８７）））；シグナル形質導入タンパク質（例えば、エフリン、例えば、エフリンＡ（例えば、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５；Ｈｏｌｚｍａｎ Ｌ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０ （１１）： ５８３０−５８３８（１９９０））およびエフリンＢ（例えば、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ Ｆ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２５ （１）： ３３４−３３５（１９９５））；ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１であり、Ｂ７−Ｈ１もしくはＣＤ２７４としても知られている；Ｄｏｎｇ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１３６５−１３６９（１９９９））；ニューロピリン（例えば、ＮＲＰ１（ニューロピリン−１であり、血管内皮細胞成長因子１６５受容体もしくはＣＤ３０４としても知られている；Ｈｅ Ｚ． ａｎｄ Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ Ｍ． Ｃｅｌｌ ９０：７３９−７５１（１９９７））；ＮＲＰ２（ニューロピリン−２であり、血管内皮細胞成長因子１６５受容体２としても知られている；Ｃｈｅｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ １９：５４７−５５９（１９９７））；もしくはセマフォリン（ＳＥＭＡ、例えば、ＳＥＭＡ３、ＳＥＭＡ４、ＳＥＭＡ５、ＳＥＭＡ６、もしくはＳＥＭＡ７；Ｆｌａｎｎｅｒｙ Ｅ． ａｎｄ Ｄｕｍａｎ−Ｓｃｈｅｅｌ Ｍ． Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． １０：６１１−６１９（２００９）））；細胞接着分子（例えば、メソテリン（ＭＳＬＮであり、プレプロ巨核球増強因子、ＣＡＫ１抗原、もしくは巨核球増強因子（ＭＰＦ）としても知られている；Ｃｈａｎｇ Ｋ． ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ Ｉ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３：１３６−１４０（１９９６））；ネクチン（例えば、ネクチン１、ネクチン２、ネクチン３、ネクチン４、ネクチン様タンパク質１、ネクチン様タンパク質２、ネクチン様タンパク質３、もしくはネクチン様タンパク質４；Ｔａｋａｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：６０３−６１５（２００８））；ＣＥＡ（癌胎児抗原関連細胞接着分子、例えば、ＣＥＡ５；Ｓｃｈｒｅｗｅ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：２７３８−２７４８（１９９０）；ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児抗原関連細胞接着分子６であり、正常交差反応抗原、非特異的交差反応抗原、もしくはＣＤ６６ｃとしても知られている）；Ｂａｒｎｅｔｔ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３：５９−６６（１９８８）））；ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ４（Ｃ−Ｃケモカイン受容体４であり、Ｃ−Ｃ ＣＫＲ−４、ＣＣ−ＣＫＲ−４、Ｋ５−５、もしくはＣＤ１９４としても知られている；Ｐｏｗｅｒ Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１９４９５−１９５００（１９９５））；ＣＸＣＲ７（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体７であり、ＣＸＣ−Ｒ７、Ｇタンパク質結合受容体ＲＤＣ１ホモログ、ＲＤＣ−１、ケモカインオーファン受容体１、もしくはＧタンパク質結合受容体１５９としても知られている；Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ Ｓ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：４９８６−４９９０（１９９１）））；Ｇタンパク質結合受容体（例えば、ＧＰＲ４９（ロイシンに富む反復配列を含むＧタンパク質結合受容体５であり、オーファンＧタンパク質結合受容体ＨＧ３８、Ｇタンパク質結合受容体４９、もしくはＧタンパク質結合受容体６７としても知られている；ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４７：２６６−２７０（１９９８））；Ｓ１Ｐ受容体（スフィンゴシン１−リン酸受容体であり、内皮分化Ｇタンパク質結合受容体としても知られている；例えば、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５；Ｈｌａ Ｔ． ａｎｄ Ｍａｃｉａｇ Ｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：９３０８−９３１３（１９９０）））；血管形成因子受容体（例えば、ＴＩＥ２（アンジオポエチン−１受容体、ＴＥＫ、血管内皮細胞キナーゼ、ｐ１４０ ＴＥＫ、もしくはＣＤ２０２ｂ；Ｚｉｅｇｌｅｒ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：６６３−６７０（１９９３）））；膜結合型ムチン（例えば、ＭＵＣ１（ＰＥＭ、ＰＥＭＴ、エピシアリン、ＥＭＡ、Ｈ２３ＡＧ、ＰＵＭ、もしくはＣＤ２２７としても知られている）；Ｌａｎ Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１５２９４−１５２９９（１９９０））、ＭＵＣ２（腸管ムチン−２としても知られている；Ｇｕｍ Ｊ．Ｒ． Ｊｒ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２４４０−２４４６（１９９４））、ＭＵＣ３（腸管ムチン−３としても知られている；Ｈｉｌｌｉｅｒ Ｌ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２４：１５７−１６４（２００３））、ＭＵＣ４（膵臓腺癌ムチン、精巣ムチン、ＡＳＧＰ、もしくは気管支ムチンとしても知られている；Ｍｏｎｉａｕｘ Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：４５３６−４５４４（２０００））、ＭＵＣ５ＡＣ（ＴＢＭ、主要気道糖タンパク質、胃ムチン、もしくはＬｅＢとしても知られている；Ｅｓｃａｎｄｅ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５８：７６３−７７２（２００１））、およびＭＵＣ１６（ＣＡ−１２５としても知られている）；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ． ２３：１５４−１６９（２００２）））；腫瘍マーカー（例えば、エンドシアリン（腫瘍内皮マーカー１もしくはＣＤ２４８としても知られている；Ｃタイプレクチン様タンパク質；Ｓｔ Ｃｒｏｉｘ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１１９７−１２０２（２０００））；ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原であり、ＰＳＡ、カリクレイン−３、セメノゲラーゼ、セミニン、もしくはＰ−３０抗原としても知られている；Ｌｕｎｄｗａｌｌ Ａ． ａｎｄ Ｌｉｌｊａ Ｈ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１４：３１７−３２２（１９８７））；ＴＡＧ−７２（乳房細胞、結腸細胞、および膵臓細胞を含む多くの癌細胞表面上で見られたタンパク質／糖複合体である腫瘍関連糖タンパク質７２；Ａｌｌｅｓ Ａ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｓｕｒｇ． ２１９（２）： １３１-１３４（１９９４））；ＫＩＭ−１（腎臓損傷分子１であり、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン含有分子（Ｔｉｍ−１）もしくはＡ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）としても知られている；Ｆｅｉｇｅｌｓｔｏｃｋ Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：６６２１−６６２８（１９９８）））；黒色腫上の細胞表面マーカー（例えば、ＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原であり、メランＡタンパク質、抗原ＳＫ２９−ＡＡ、もしくは抗原ＬＢ３９−ＡＡとしても知られている；Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１：３５１５−３５１９（１９９４））；ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異抗原ＧＰ１００であり、メラニン細胞タンパク質Ｐｍｅｌ １７、シルバーローカスプロテインホモログ、ＭＥ２０−Ｍ、ＭＥ２０−Ｓ、もしくは９５ｋＤａメラニン細胞特異的分泌糖タンパク質として






も知られている；Ａｄｅｍａ Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２０１２６−２０１３３（１９９４））；ＴＲＰ−１（チロシナーゼ関連タンパク質１であり、ＤＨＩＣＡオキシダーゼ、カタラーゼＢ、糖タンパク質７５、もしくは黒色腫抗原ｇｐ７５としても知られている；Ｃｏｈｅｎ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２８０７−２８０７（１９９０））；ＴＲＰ−２（チロシナーゼ関連タンパク質２であり、ＤＣＴ、ＤＴ、もしくはＬ−ドーパクロムΔ−イソメラーゼとしても知られている；Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２１７：３１７−３２１（１９９４）））；または熱ショックタンパク質（例えば、ＧＲＰ７８（７８ｋＤａグルコース調節タンパク質であり、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５、ＢｉＰ、または小胞体内腔Ｃａ（２＋）結合タンパク質ｇｒｐ７８としても知られている；Ｃｏｒｒｉｇａｌｌ Ｖ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：１４９２−１４９８（２００１）））。
融合タンパク質は、第一部分（例えば、ＬＩＧＨＴ部分）を第二部分（例えば、標的部分）に結合するリンカー配列をさらに含み得る。結合基は、当業者に明らかである任意の結合基であることができる。例えば、融合タンパク質は、ペプチドリンカー（例えば、約５〜５０個、より好ましくは、１０〜３５個、または１５〜３３個のアミノ酸の長さのペプチドリンカー）を含み得；ペプチドリンカーは、約２０個、２８個または３３個のアミノ酸の長さである。ペプチドリンカー中の各アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群から選択される；ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ因子を含む。他の実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、このペプチドリンカーは、式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｙ（式中、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有する配列（配列番号１４９）を含む。１つの実施形態では、結合基は、ポリグリシン、ポリセリン、ポリリシン、ポリグルタミン酸塩、ポリイソロイシン、もしくはポリアルギニン残基、またはそれらの組み合わせを含むか、もしくはそれからなる。例えば、ポリグリシンまたはポリセリンリンカーは、少なくとも５個、１０個、１５個または２０個のグリシンおよびセリン残基を、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号１４５）の１個、２個、３個、４個、５個以上の反復、例えば、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒの４個の反復（配列番号１３４）の配置で含むことができる。他の実施形態では、結合基としては、ＬＩＧＨＴまたはその変異体の細胞外ドメイン由来の１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）の約６１〜９２位のアミノ酸、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）の約２２５〜２５２位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）の約２３０〜２５７位のアミノ酸、もしくはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；またはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号５）の約１８１〜２７６位のヌクレオチド、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）の約６７３〜７５６位のヌクレオチド、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）の約６８８〜７７１位のヌクレオチドからのヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を挙げ得る。あるいは、結合基としては、１つ以上の（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号１４６）の反復ならびにＬＩＧＨＴもしくはその変異体の細胞外ドメイン由来の１個以上のアミノ酸残基（例えば、少なくとも１０〜３５個、１５〜３０個、または約２０〜２６個のアミノ酸残基）、例えば、ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号１）の約６１〜９２位のアミノ酸、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）の約２２５〜２５２位のアミノ酸、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）の約２３０〜２５７位のアミノ酸、もしくはそれと実質的に同一であるアミノ酸配列；またはヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１（配列番号５）の約１８１〜２７６位のヌクレオチド、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）の約６７３〜７５６位のヌクレオチド、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）の約６８８〜７７１位のヌクレオチドからのヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列の１つ以上の組み合わせを挙げ得る。
Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）のアミノ酸およびヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号２および６として示す。７１Ｆ１０ Ｆａｂの重鎖に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列はＮ末端から開始し、結合基に対応するアミノ酸（約２２５〜２５２位のアミノ酸）が続き、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインに対応するアミノ酸（２５３〜４００位のアミノ酸）が続くことが示される。７１Ｆ１０ Ｆａｂ−Δ４ｈｕＬＩＧＨＴの物理的および化学的パラメータは、以下のとおりである：吸光係数＝１．６２；ｐＩ＝８．７；ＭＷ＝６６ｋＤａ（×３＝１９８ｋＤａ）；ＡＡ数＝６１４）。
Ｇ４ＳΔ４リンカー（配列番号１４７）による７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）のアミノ酸およびヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号３および７として示す。７１Ｆ１０ Ｆａｂの重鎖に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列はＮ末端から開始し、結合基に対応するアミノ酸（２２５〜２５７位のアミノ酸）が続き、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインに対応するアミノ酸（２５８〜４０５位のアミノ酸）が続くことが示される。７１Ｆ１０ Ｆａｂ−Ｇ４Ｓ−Δ４ｈｕＬＩＧＨＴの物理的および化学的パラメータは、以下のとおりである：吸光係数＝１．６１；ｐＩ＝８．７；ＭＷ＝６６ｋＤａ（×３＝１９８ｋＤａ）；ＡＡ数＝６１９）。
（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１３４）による７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）のアミノ酸およびヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号４および８として示す。７１Ｆ１０ Ｆａｂの重鎖に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列はＮ末端から開始し、結合基に対応するアミノ酸（２２５〜２４４位のアミノ酸）が続き、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインに対応するアミノ酸（２４５〜３９２位のアミノ酸）が続くことが示される。７１Ｆ１０ Ｆａｂ−（Ｇ４Ｓ）４−Δ４ｈｕＬＩＧＨＴの物理的および化学的パラメータは、以下のとおりである：吸光係数＝１．５；ｐＩ＝８．７；ＭＷ＝６４ｋＤａ（×３＝１９８ｋＤａ）；ＡＡ数＝６０６）。
他の実施形態では、発現、検出および／または単離もしくは精製を促進するために、融合タンパク質のＮまたはＣ末端に追加のアミノ酸配列を付加することができる。例えば、融合タンパク質は、１つ以上の追加の部分、例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１５０）、ＦＬＡＧタグに結合し得る。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合しているＧＳＴ融合タンパク質にさらに結合し得る。かかる融合タンパク質は、融合タンパク質の精製を促進できる。
別の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端に異種シグナル配列（すなわち、ＬＩＧＨＴ核酸によりコードされたポリペプチドには存在しないポリペプチド配列）を含む。例えば、天然ＬＩＧＨＴシグナル配列は、除去して別のタンパク質由来のシグナル配列と置換し得る。ある宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）では、融合タンパク質の発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を通して増大し得る。本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。核酸は、融合部分が免疫グロブリンタンパク質にインフレームで結合するように、かかる発現ベクター中にクローン化できる。
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドはオリゴマー（単隣接ポリペプチド、または２個以上の非隣接ポリペプチドの二量体または三量体など）として存在する。
他の実施形態では、ＬＩＧＨＴまたは標的部分は、天然配列（野生型）に変異を有し、その結果、とりわけ、１つ以上の、（非変異配列と比較して）より高い親和性結合、増大した安定性、例えば、さらにタンパク質分解耐性に至る変異体ポリペプチドとして提供される。
他の実施形態では、発現、立体的な柔軟性、検出および／または単離もしくは精製を促進するために、融合タンパク質のＮまたはＣ末端に追加のアミノ酸配列を付加することができる。第二ポリペプチドは好ましくは可溶性である。いくつかの実施形態では、第二ポリペプチドは、結合したポリペプチドの半減期、（例えば、血清半減期）を増強する。いくつかの実施形態では、第二ポリペプチドは、第二のポリペプチドとの融合ポリペプチドの結合を促進する配列を含む。実施形態では、第二ポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチドの一領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載されている。
本明細書に記載の抗体分子および可溶性ＬＩＧＨＴまたは融合タンパク質は、１個以上の他の分子実体、とりわけ抗体（例えば、二重特異性または多特異的抗体）、毒素、放射性同位体、細胞傷害性または細胞分裂阻害剤などに（例えば、化学的結合、遺伝的融合、非共有結合などにより）機能的に結合できることが理解されるであろう。
ＬＩＧＨＴ標的分子の例としては、ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物（例えば、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物）が挙げられる。ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物は、Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号２）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号３）、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号４）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；Δ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）（配列番号６）、Ｇ４ＳΔ４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）（配列番号７）、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）（配列番号８）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物は、配列番号１０９として示されるアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；配列番号１１０のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。
別の例示的な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＣＤ２３に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＣＤ２３融合物」と呼ぶ）を少なくとも１個含む。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＣＤ２３融合物は、（Ｇ３Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４リンカー（ｐＢＩＩＢ ＣＤ２３−２０４）との抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（配列番号１０１または１７４）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；（Ｇ３Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）４リンカー（ｐＢＩＩＢ ＣＤ２３−２０４）との抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（配列番号１０２または１７３）に示されるヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２３融合物は、抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１０３）に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１０４）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。
さらに別の例示的な実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、インスリン様成長因子受容体に結合する抗体分子との融合分子（本明細書で「ＬＩＧＨＴ−抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ融合物」と呼ぶ）を少なくとも１個含む。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ融合物は、（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ＢＩＩＢ Ｃ０６−１１７）（配列番号１６３）のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；（Ｇ４Ｓ）４リンカーによる抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖（ＢＩＩＢ Ｃ０６−１１７）（配列番号１６２）に示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＩＧＦＲ融合物は、配列番号１６８に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合軽鎖（配列番号１６７）のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。
抗体分子
ある実施形態では、標的部分は、ＬＩＧＨＴ部分が所望の部位（例えば、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織）に対して１つ以上のＬＩＧＨＴ関連活性（例えば、１つ以上の本明細書に記載のＬＩＧＨＴ関連活性）を誘発するように、選択された過剰増殖性細胞表面タンパク質、例えば、過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織に対する抗体分子である。他の実施形態では、ＨＥＲ２に対する新規抗体分子を開示する。標的部分に標的化できる過剰増殖性（例えば、癌性）細胞または組織の例としては、乳房、肺、胃、卵巣、前立腺、膵臓、結腸、結腸直腸、腎臓、膀胱、肝臓、頭部、頸部、脳の癌または固形腫瘍、ならびに軟組織悪性腫瘍（リンパ性悪性腫瘍、白血病および骨髄腫を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。標的部分は、１個以上の本明細書に記載の過剰増殖性細胞または組織を発現した１個以上の細胞表面タンパク質に結合できる。例えば、標的部分（例えば、本明細書に記載の抗体分子）は、１種以上の成長因子受容体（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ｃｒｉｐｔｏ）；癌関連インテグリンもしくはインテグリン受容体（例えば、αｖβ６、α６β４、ラミニン受容体（ＬＡＭＲ）；ならびに／またはＣＤ２３、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＥｐＣＡＭおよび／もしくはＴｗｅａｋ受容体（ＦＮ１４）に結合できる。選択された標的のそれぞれを本明細書に詳述する。
１つの実施形態では、抗体分子は、ＨＥＲ２ポリペプチド（ＨＥＲ２上の、例えば、エピトープＤ１、エピトープＤ２、エピトープＤ３、もしくはエピトープＤ４、またはそれらの組み合わせ、例えば、エピトープ１−Ｄ２もしくはエピトープ１−Ｄ３から選択される直線状または立体構造のエピトープ）に結合する。他の具体的な実施形態では、抗体分子は、ＣＤ２３またはＩＧＦＲに結合する。
１つの実施形態では、抗体分子は、ＨＥＲ２に結合し、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１〜１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５〜１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９〜２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３〜２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７〜３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１〜３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３４〜３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９〜４２）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３〜４６）（本明細書で、７１Ｆ１０、６９Ａ０９；６７Ｆ１０；６７Ｆ１１、６７Ｆ１２、６６Ａ１２、６６Ｃ０１、６５Ｃ１０、６５Ｈ０９および６５Ｂ０３とも呼ぶ）からなる群から選択される抗体分子もしくは抗体由来のＦａｂ断片、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８により発現した抗体分子である。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３からなる群から選択される抗体分子もしくは抗体由来のＦａｂ断片、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８により発現した抗体分子と同程度の機能的活性を有する。抗ＨＥＲ２抗体分子は、ヒト、マウス、ラット、またはカニクイザル起源から選択される１種以上に由来するＨＥＲ２と交差反応できる。
抗ＨＥＲ２抗体分子は、約１〜１２０ｎＭ、約１〜１００ｎＭ、１〜８０ｎＭ、約１〜７０ｎＭ、約１〜６０ｎＭ、約１〜４０ｎＭ、約１〜３０ｎＭ、約１〜２０ｎＭ、約１〜１５ｎＭ、約１〜１２ｎＭ、約１〜５ｎＭ、約１〜２ｎＭ、または約１〜１ｎＭの範囲のＥＣ５０でＨＥＲ２に結合できる。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＨＥＲ２と関連する生体活性の１つ以上を約５０ｎＭ〜５ｐＭ、典型的には約１００〜２５０ｐＭ未満のＩＣ５０（例えば、より良い阻害）で阻害または低減する。例えば、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＨＥＲ２シグナル伝達を約５０ｎＭ〜５ｐＭ、典型的には約１００〜２５０ｐＭ未満のＩＣ５０（例えば、より良い阻害）で阻害、遮断もしくは低減する（例えば、ＨＥＲ２、ＡＫＴまたはＭＡＰキナーゼの１つ以上のリン酸化反応を阻害、遮断もしくは低減する；またはＨＥＲ２のホモ二量体化もしくはＨＥＲ２およびＨＥＲ３のヘテロ二量体化、またはＥＧＦＲを有するＨＥＲ２を阻害、遮断もしくは低減する；対照の抗ＨＥＲ２抗体における内部移行速度（ＳＫＢＲ−３細胞中で８ｅ−６ｓ−１およびＢＴ−４７４細胞中で２．１ｅ−５ｓ−１）以下であると推定される遅い反応速度で内部移行する；インビトロのＨＥＲ２発現細胞（例えば、ＭＣＦ７およびＳＫＢＲ−３細胞）およびインビボでＨＥＲ２発現細胞の活性を阻害するおよび／または細胞死を誘発する。１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、１０４〜１０７Ｍ−１ｓ−１、典型的には１０５〜１０６Ｍ−１ｓ−１の範囲の反応速度でＨＥＲ２に結合する。１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、０．１〜１００ｎＭのｋＤでヒトＨＥＲ２に結合する。さらに別の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、１０−２〜１０−６ｓ−１、典型的には１０−２〜１０−５ｓ−１の範囲の解離反応速度を有する。１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体分子は、ＨＥＲ２（例えば、ヒトＨＥＲ２）に、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０、ＢＩＩＢ６９Ａ０９；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１、ＢＩＩＢ６６Ａ１２、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３からなる群から選択されるモノクローナル抗体、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８により発現した抗体分子に対するものと類似した親和性および／または反応速度（例えば、２０、１０、または５因子以内）で結合する。抗ＨＥＲ２抗体分子の親和性および結合反応速度は、例えば、バイオセンサー技術（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））を用いて試験することができる。
本明細書で使用する「抗体分子」という用語は、少なくとも１個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。抗体分子という用語は、例えば、完全長、成熟抗体および抗体の抗原結合断片を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書でＶＨと略す）、および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書でＶＬと略す）を含むことができる。別の例では、抗体分子は、２本の重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２本の軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それによって、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単可変ドメイン抗体、二重特異的抗体（Ｄａｂ）（二価および二重特異性）、およびキメラ（例えば、ヒト化）抗体などの２個の抗原結合部位を形成し、これは完全抗体の修飾または組換えＤＮＡ技術を用いてｄｅ ｎｏｖｏ合成したものにより産生し得る。これらの機能的抗体断片は、それらのそれぞれの抗原または受容体との選択的な結合能を保持する。抗体および抗体断片は、任意のクラスの抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられるが、これらに限定されない）および任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）の抗体に由来し得る。本発明の抗体は、モノクローナルであることもでき、ポリクローナルであることもできる。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、またはインビトロ生成抗体であることもできる。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有することができる。抗体は、例えば、κまたはλから選択される軽鎖も有することができる。
抗原結合断片の例としては、以下が挙げられる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる二重特異的抗体（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダ科またはラクダ化可変ドメイン；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６； ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）を参照されたい；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体。これらの抗体断片を当該者に知られている従来の技術を用いて得て、これらの断片をインタクト抗体と同一様式で使用するためにスクリーニングする。
実施形態では、抗体分子は、過剰増殖性細胞表面タンパク質、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）の過剰増殖性細胞表面タンパク質（またはその機能的変異体））に結合する、モノクローナル抗体もしくは単特異的抗体、またはそれらの抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、またはラクダ科変異体）である。実施形態では、抗体分子は、過剰増殖性細胞表面タンパク質（例えば、本明細書に記載の過剰増殖性細胞表面タンパク質）の細胞外ドメインに位置する１個以上のエピトープに結合する。典型的には、抗体分子は、ヒト過剰増殖性細胞表面タンパク質（またはその機能的断片）に対するヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ抗体、またはインビトロ生成抗体である。典型的には、抗体は、過剰増殖性細胞表面タンパク質（例えば、ＨＥＲ２の１つ以上の本明細書に記載の生体活性）の１つ以上の活性を阻害、低減または中和する。
本発明の抗体は、単一ドメイン抗体であることもできる。単一ドメイン抗体は、相補的な決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含むことができる。例としては、重鎖抗体、軽鎖を天然で欠損している抗体、通常の４本鎖抗体由来の単一ドメイン抗体、遺伝子操作した抗体および抗体由来のもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、任意の当該技術分野の抗体であっても、任意の単一ドメイン抗体見込みの抗体であってもよい。単一ドメイン抗体は、任意の種（マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシが挙げられるが、これらに限定されない）由来であり得る。本発明の別の態様によれば、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている天然の単一ドメイン抗体である。かかる単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号に開示されている。明確化のために、天然で軽鎖を欠く重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、本明細書において、ＶＨＨまたはナノボディとして知られ、従来の４本鎖免疫グロブリンのＶＨとは区別される。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコに生じた抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、天然で軽鎖を欠く重鎖抗体を産生し得；かかるＶＨＨ類は本発明の範囲内である。
本発明の抗体は、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４（１２）：３８４０−３８４９； Ａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ５０：７８１−７８９）に記載のようにアフィボディ分子足場であることもできる。
本明細書で使用する「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメイン構造を形成できるアミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然可変ドメインのすべてまたは一部のアミノ酸配列を含んでよい。例えば、配列は、１個、２個、またはそれ以上のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、タンパク質構造形成に適する他の改変を含んでもよい。
「抗原結合部位」という用語は、抗原、例えば、ＨＥＲ２、またはそのエピトープと結合する接触部分を形成する決定基を含む抗体分子の一部を指す。タンパク質（またはタンパク質模倣体）に関して、抗原結合部位は、典型的には、抗原、例えば、ＨＥＲ２、またはそのエピトープに結合する接触部分を形成する１つ以上の（少なくとも４種のアミノ酸またはアミノ酸模倣体の）ループを含む。典型的には、抗体分子の抗原結合部位は、少なくとも１個または２個のＣＤＲ、またはより典型的には少なくとも３個、４個、５個または６個のＣＤＲを含む。
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって作製することもでき、ハイブリドーマ技術を用いない方法（例えば、組換え法）によって作製することもできる。
上に示したように、可変領域によって、抗体は抗原のエピトープを選択的に認識して、特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは結合して、三次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙ字の各腕の末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖それぞれの３個のＣＤＲによって定義される。いくつかの例では、例えば、ラクダ科の種由来またはラクダ科免疫グロブリンに基づき遺伝子操作した特定の免疫グロブリン分子である完全な免疫グロブリン分子は、重鎖のみからなり、軽鎖を有さない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８ （１９９３）を参照されたい。
天然抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」つまり「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその三次元配置をとるときに、抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置されるアミノ酸の短い非隣接配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残りの部分は、より低い分子内可変性を示す。フレームワーク領域は、主にβシートの立体構造をとり、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によって正しい向きでＣＤＲを配置する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫応答性抗原のエピトープに相補的な表面を定義する。この相補的表面は、抗体のその同族エピトープへの非共有結合を促進する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズによって異なる。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は正確に定義されているため、当業者はいかなる重鎖または軽鎖可変領域も容易に同定できる（それらの全体を参照することにより本明細書に組み込まれる、”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｋａｂａｔ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， （１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１−９１７ （１９８７）を参照されたい）。
本発明の抗体または抗原結合断片、その変異体または誘導体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラスであることができる。
抗体断片（単鎖抗体を含む）は、可変領域（１つまたは複数）を、単独でまたは、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体もしくは一部と組み合わせて含み得る。さらに、可変領域（１つまたは複数）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせをも含む抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。本発明の抗体またはその免疫特異的断片は、任意の動物起源（鳥類および哺乳類を含む）に由来するものであってよい。抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体、またはニワトリ抗体であることができる。別の実施形態では、可変領域は、コンドリクトイド起源（例えば、サメ由来）であってもよい。本明細書で使用する「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり以下、および、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。
本明細書で使用する「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央部、および／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくはその断片の少なくとも１つを含む。本明細書に開示のある抗体分子、多量体のポリペプチド一本鎖の重鎖部分は、多量体の第二のポリペプチド鎖上のそれらと同一である。あるいは、本発明の単量体を含む重鎖部分は同一ではない。例えば、各単量体は、例えば、二重特異的抗体を形成する異なる標的結合部位を含み得る。本明細書に開示の診断および治療方法における使用における結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子由来ヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子由来、および部分的にＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子由来、および部分的にＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジを含むことができる。
本明細書で使用する「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含む。
本明細書に開示の抗体分子は、エピトープ（１つまたは複数）または抗原の部分（１つまたは複数）、例えば、それらが認識または特異的に結合する標的ポリペプチド（例えば、ＨＥＲ２、ＣＤ２３）に関して記載または特定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は、「エピトープ」、または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含むことができるが、典型的には、少なくとも２個のエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造、および種類に応じて任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチドの「エピトープ」はまた、非ポリペプチド要素であり得るか、非ポリペプチド要素を含み得る、例えば、「エピトープ」は炭水化物側鎖を含み得ることに留意されたい。抗体のペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５個のアミノ酸と考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。ＣＤＲは抗原ペプチドまたはポリペプチドをその三次形で認識できるため、エピトープを含むアミノ酸は隣接している必要がなく、一部の場合では、同一ペプチド鎖上になくてもよい。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または約１５個〜約３０個の隣接または非隣接アミノ酸配列を含む。
「特異的に結合する」とは、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合することと、結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間に多少の相補性を要することとを一般に意味する。この定義に従い、抗体が無作為に無関係のエピトープに結合するよりも容易に抗原結合ドメインを介してあるエピトープに結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」と呼ぶ。本明細書で使用する「特異性」という用語は、ある抗体があるエピトープに結合する際の相対的親和性を限定する。
「選択的に結合する」とは、抗体が、関連する、同様の、相同の、または類似のエピトープに結合するよりも容易に、エピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「選択的に結合する」抗体は、関連するエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高い（ただし、かかる抗体は関連するエピトープと交差反応し得る）。
非限定的な例では、抗体が、第一のエピトープに、第二のエピトープに対する抗体の解離定数（ＫＤ）未満のＫＤで結合する場合、前記第一のエピトープに選択的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例では、抗体が、第一のエピトープに、第二のエピトープに対する抗体のＫＤより少なくとも１桁小さい親和性で結合する場合、第一の抗原に選択的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例では、抗体が、第一のエピトープに、第二のエピトープに対する抗体のＫＤより少なくとも２桁小さい親和性で結合する場合、第一のエピトープに選択的に結合するとみなしてよい。
別の非限定的な例では、抗体分子が、第一のエピトープに、第二のエピトープに対する抗体の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））未満のｋ（ｏｆｆ）で結合する場合、第一のエピトープに選択的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例では、抗体が、第一のエピトープに、第二のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも１桁小さい親和性で結合する場合、第一のエピトープに選択的に結合するとみなしてよい。別の非限定的な例では、抗体が、第一のエピトープに、第二のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも２桁小さい親和性で結合する場合、第一のエピトープに選択的に結合するとみなしてよい。
本明細書に開示の抗体分子は、本明細書に開示の標的ポリペプチドまたはその断片もしくはその変異体に５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１または１０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると称し得る。より好ましくは、本発明の抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチドまたはその断片もしくはその変異体と５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると称し得る。
本明細書に開示の抗体分子は、本明細書に開示の標的ポリペプチドまたはその断片もしくはその変異体に１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の会合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると称し得る。本発明の抗体分子は、本明細書に開示の標的ポリペプチドまたはその断片もしくはその変異体に１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１もしくは１０７Ｍ−１秒−１以上の会合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると称し得る。
抗体分子が、参照抗体のエピトープへの結合をある程度まで遮断する度合いでそのエピトープに選択的に結合する場合、参照抗体の所与のエピトープへの結合を競合的に阻害すると称する。競合的阻害は、当該技術分野で知られている任意の方法、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ検定法によって決定し得る。抗体は、参照抗体の所与エピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると称し得る。
本明細書で使用する「親和性」という用語は、個々のエピトープの免疫グロブリン分子のＣＤＲへの結合力の尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ｎｄ ｅｄ． １９８８） ａｔ ｐａｇｅｓ ２７−２８を参照されたい。本明細書で使用する「結合活性」という用語は、免疫グロブリン集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的結合力を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｔ ｐａｇｅｓ ２９−３４を参照されたい。結合活性は、集団における個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性、ならびに免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体とポリマーなどの高い反復エピトープ構造を備えた抗原との間の相互作用は、高い結合活性の１つである。
本発明の抗体分子は、それらの交差反応性に関して記載または特定され得る。本明細書で使用する「交差反応性」という用語は、１つの抗原に対して特異的な抗体の第二の抗原と反応する能力；２個の異なる抗原性物質の間の関連性の尺度を指す。したがって、抗体は、その形態を誘発するエピトープではないエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘発エピトープと同一の相補構造的特徴を多く含み、一部の場合では、実際に元のものより優れて適合得る。例えば、ある抗体は、参照エピトープと関連するが同一ではないエピトープ、例えば、参照エピトープと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％（当該技術分野で知られている、および本明細書に記載の方法を用いて算出）同一であるエピトープと結合する点である程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満（当該技術分野で知られている、および本明細書に記載の方法を用いて算出）同一であるエピトープに結合しない場合、交差反応性がないかほとんどないと称し得る。抗体は、あるエピトープの他のいかなるアナログ、オルトログ、またはホモログとも結合しない場合、そのエピトープに対して「高度に特異的」とみなし得る。
本発明の抗体分子は、本発明のポリペプチドへの結合親和性に関して記載または特定され得る。典型的な結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
本発明の抗体分子は、「多特異的」、例えば、二重特異性、三重特異性または四重以上の多特異性であり得、１つ以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）に同時に存在する２つ以上の異なるエピトープを認識し、結合することを意味する。したがって、抗体分子が「単一特異性」であるか「多特異性」（例えば、「二重特異性」）であるかどうかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を指す。多特異的抗体は本明細書に記載の標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的でもあり得、標的ポリペプチドならびに異種エピトープ（異種ポリペプチドなど）または固体支持材料に対して特異的でもあり得る。
本明細書で使用する「結合価」という用語は、抗体、結合ポリペプチドまたは結合抗体中の結合可能なドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）の数を指す。各結合ドメインは１個のエピトープに特異的に結合する。抗体、結合ポリペプチドまたは結合抗体が２個以上の結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、同一エピトープに特異的結合し得、２個の結合ドメインを有する抗体において「二価単一特異性」と名付けられ、または異なるエピトープに特異的結合し得、２個の結合ドメインを有する抗体において「二価二重特異性」と名付けられる。抗体は、各特異性において二重特異性かつ二価でもあり得る（「二重特異性四価抗体」と名付けられる）。別の実施形態では、四価小体またはドメインを欠く抗体を作製できる。
二重特異性二価抗体、およびそれらの作製方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；および米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号および同第２００２／０１５５５３７号に記載されており、これらすべての開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。二重特異性四価抗体、およびそれらの作製方法は、例えば、ＷＯ０２／０９６９４８号およびＷＯ００／４４７８８号に記載されており、これら両方の開示が参照することにより本明細書に組み込まれる。一般に、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５号；ＷＯ９２／０８８０２号；ＷＯ９１／００３６０号；ＷＯ９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０−６９ （１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７−１５５３ （１９９２）を参照されたい。
抗体分子は、ポリクローナル抗体であることもモノクローナル抗体であることもできる。他の実施形態では、抗体は、組換え産生、例えば、ファージディスプレイによりまたは組み合わせの方法により産生できる。生成抗体のファージディスプレイおよび組み合わせの方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．国際公開特許ＷＯ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開特許ＷＯ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．国際公開特許ＷＯ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．国際公開特許ＷＯ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．国際公開特許ＷＯ９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．国際公開特許ＷＯ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２； Ｈａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５； Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１； Ｇｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４； Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６； Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８； Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０； Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２に記載されており、これらすべての内容が参照することにより本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、抗体分子は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体を産生するために遺伝工学処理されているマウスにおいて作製された抗体）、または非ヒト抗体、例えば、齧歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、ラクダ抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は齧歯類（マウスまたはラット抗体）である。齧歯類抗体の産生方法は当該技術分野で知られている。ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を保因する遺伝子導入マウスを用いて生成できる。目的の抗原で免疫化したこれらの遺伝子導入マウス由来の脾細胞を用いて、ヒトタンパク質由来のエピトープに対して特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを産生する（例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．国際特許ＷＯ９１／００９０６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１号；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．国際特許ＷＯ９２／０３９１８号；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．国際特許第９２／０３９１７号；Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９； Ｇｒｅｅｎ， Ｌ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３−２１； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９３ Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３−４０； Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９３ ＰＮＡＳ ９０：３７２０−３７２４； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３−１３２６を参照されたい）。
抗体分子は、可変領域中の１つ、またはその一部、例えば、非ヒト生物（例えば、ラットまたはマウス）において生成したＣＤＲであることができる。キメラ、ＣＤＲ移植、およびヒト化抗体は本発明の範囲内である。抗体を非ヒト生物（例えば、ラットまたはマウス）において生成してから、例えば、可変フレームワークまたは定常領域において修飾してヒトにおける抗原性を低減することは本発明の範囲内である。キメラ抗体は、当該技術分野で知られている組換えＤＮＡ技術により産生できる。例えば、マウス（または他種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子は、制限酵素により消化されてマウスＦｃをコードする領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の均等部分が置換される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、国際特許公開ＰＣＴ／米国特許第８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａ， ｅｔ ａｌ．、欧州特許第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．、欧州特許第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際特許ＷＯ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３）； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＰＮＡＳ ８４：３４３９−３４４３； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＰＮＡＳ ８４：２１４−２１８； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９）を参照されたい）。
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、（重鎖およびまたは軽鎖免疫グロブリンの）少なくとも１個または２個だが一般に全３個のレシピエントＣＤＲがドナーＣＤＲと置換されている。抗体は、少なくとも一部の非ヒトＣＤＲと置換され得、またはいくつかのＣＤＲのみが非ヒトＣＤＲと置換され得る。ヒト化抗体の結合に必要とされるＣＤＲ数を置換することのみが必要である。好ましくは、ドナーは齧歯類抗体、例えば、ラットまたはマウス抗体であり、レシピエントはヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。１つの実施形態では、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば、齧歯類）である。アクセプターフレームワークは天然（例えば、ヒト）フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、またはそれと約８５％以上、好ましくは９０％、９５％、９９％もしくは９９％超同一の配列である。
本明細書で使用する「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリーに最も高頻度で生じるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成された配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ， Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ （Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７）を参照されたい）。タンパク質ファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置は、最も高頻度でそのファミリーにおけるその位置に生じるアミノ酸により占められる。２種のアミノ酸が同頻度で生じる場合、いずれかがコンセンサス配列中に含まれ得る。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。
抗体分子は、当該技術分野で知られている方法によりヒト化できる。ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域配列をヒトＦｖ可変領域由来の均等配列と置き換えることにより生成できる。一般的なヒト化抗体生成方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７により、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４により、およびＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号により提示されている。ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、ＣＤＲ移植またはＣＤＲ置換により産生でき、前記免疫グロブリン鎖の１個、２個、または全ＣＤＲを置換できる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５； Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ． １９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４； Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８８ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０； Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたく、これらすべての内容が参照することにより明確に本明細書に組み込まれる。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用し得るＣＤＲ移植方法について述べている（英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ号、１９８７年３月２６日出願；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号）、これらの内容は参照することにより明確に組み込まれる。
また、特異的アミノ酸が置換されている、欠失しているまたは添加されているヒト化抗体も本発明の範囲内である。好ましいヒト化抗体は、抗原結合を改善する目的などでフレームワーク領域にアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーフレームワーク残基またはレシピエントフレームワーク残基以外の別のアミノ酸と同一であるフレームワーク残基を有する。かかる抗体を生成するため、選択された、少数のヒト化免疫グロブリン鎖のアクセプターフレームワーク残基は、対応するドナーアミノ酸と置換できる。好ましい置換位置としては、ＣＤＲに隣接する、またはＣＤＲと相互作用できるアミノ酸残基が挙げられる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。ドナー由来のアミノ酸の選択基準は、米国特許第５，５８５，０８９号、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号１２〜１６項、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号１２〜１６項に記載されており、これらの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。ヒト化抗体のための他の技術については、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．の欧州特許第５１９５９６Ａ１号（１９９２年１２月２３日公開）に記載されている。
１つの実施形態では、抗体は、精製した標的細胞抗原、またはその断片、例えば、本明細書に記載の断片、膜結合抗原、組織、例えば、粗組織調製物、完全細胞、好ましくは生細胞、溶解細胞、または細胞画分（例えば、膜画分）による免疫化により作製できる。
抗体分子は、単鎖抗体であることができる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、遺伝子操作し得る（例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８８０：２６３−８０；およびＲｅｉｔｅｒ， Ｙ． （１９９６） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２：２４５−５２を参照されたい）。単鎖抗体は、同一標的の異なるエピトープの特異性を有する多価抗体を生成するために、二量体化または多量体化できる。
さらに他の実施形態では、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される；特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の（例えば、ヒトの）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体分子は、例えば、κもしくはλの（例えば、ヒトの）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能のうちの１つ以上を上昇するまたは低減する）ように改変、例えば、変異させることができる。１つの実施形態では、抗体はエフェクター機能を有し、ならびに補体を固定できる。他の実施形態では、抗体は、エフェクター細胞を動員しない、または補体を固定しない。別の実施形態では、抗体のＦｃ受容体への結合能は低減しているか欠失している。例えば、それはアイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の変異体であり、Ｆｃ受容体への結合を支持しない、例えば、そのＦｃ受容体結合領域は変異または欠失している。
抗体分子を用いて、標準的な技術（親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈殿など）により標的タンパク質を単離することができる。さらに、抗体分子を用いて、（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）標的タンパク質を検出することができる。抗体分子を用いて、臨床試験手順の一部として、例えば、所与治療レジメン効果を決定するため、組織中のタンパク質レベルを診断用にモニタリングすることができる。抗体を検出可能な物質（例えば、抗体標識化）に結合（例えば、物理的結合）させることにより検出を容易にできる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、配合団、蛍光材料、ルミネセンス材料、生体ルミネセンス材料、化学ルミネセンス材料および放射活性材料が挙げられるが、これらに限定されない。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な配合団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；ルミネセンス材料の例としては、ルミノールが挙げられる；生体ルミネセンス材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる、ならびに適切な放射活性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
抗体分子を検出可能に標識できる１つの方法は、抗体分子を酵素に結合させて、結合した生成物を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に使用することである（Ｖｏｌｌｅｒ， Ａ．， ”Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）” Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１−７ （１９７８））； Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ３１：５０７−５２０ （１９７８）； Ｂｕｔｌｅｒ， Ｊ． Ｅ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３：４８２−５２３ （１９８１）； Ｍａｇｇｉｏ， Ｅ． （ｅｄ．）， Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．， （１９８０）； Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．）， Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ， Ｔｏｋｙｏ （１９８１）。検出は、他の様々な免疫測定法のいずれを用いても達成し得る。例えば、それは、放射活性物質で標識した抗体分子により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通して抗体を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｂ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、（１９８６年３月）を参照されたい）。
様々な部分を抗体分子に接合するための技術が知られている。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ２４３−５６ （Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８５）； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”， ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ６２３−５３ （１９８７）； Ｔｈｏｒｐｅ， ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ． ４７５−５０６ （１９８５）； ”Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ． ３０３−１６ （１９８５）， ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：１１９−５８ （１９８２）を参照されたい。
特に、本明細書に開示の診断および治療方法における使用用の結合分子、例えば、結合ポリペプチド（ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子）は、細胞毒（放射性同位体、細胞傷害薬、または毒素などの）治療薬、細胞分裂阻害剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答調節物質、医薬品、免疫活性リガンド（例えば、リンフォカイン、または生成分子が新生物細胞およびエフェクター細胞（Ｔ細胞など）の両方に結合する他の抗体）、またはＰＥＧに接合し得る。別の実施形態では、本明細書に開示の診断および治療方法における使用のための結合分子（例えば結合ポリペプチド）は、腫瘍の血管化を低減する分子に接合し得る。他の実施形態では、開示した組成物は薬剤またはプロドラッグに結合した結合分子（例えば、結合ポリペプチド）を含み得る。さらに本発明の他の実施形態では、特異的生体毒素またはそれらの細胞傷害性断片（リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素など）に対して接合する結合分子（例えば、結合ポリペプチド）の使用を含む。使用する接合または非抱合型結合分子の選択は、癌の種類および進行段階、補助治療（例えば、化学療法または外部放射線）の使用および患者の状態によって変わる。本明細書の教示に照らして、当業者はかかる選択を容易に行うことができることが理解されるであろう。
同位体により標識した抗腫瘍抗体が、動物モデル、および一部の場合ではヒトにおける固形腫瘍ならびにリンパ腫／白血病中の細胞を破壊するために成功裏に使用されていることが理解されるであろう。放射性同位体の例としては、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅが挙げられる。
本明細書の教示に従い、診断および治療目的で、結合分子は異なる放射性同位体に接合し得ることも理解される。この目的のため、上記米国特許第６，６８２，１３４号、同第６，３９９，０６１号、および同第５，８４３，４３９号には、治療用抗体の投与前の腫瘍の診断的「造影」のために放射能標識した治療複合体について開示されている。
抗体分子に接合する上で好ましいさらなる薬剤は、細胞傷害薬、特に癌療法に使用されるものである。本明細書で使用する「細胞毒または細胞傷害薬」とは、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に有害であり、細胞または悪性腫瘍を低減する、阻害するまたは破壊するために作用し得る任意の薬剤を意味する。細胞毒の例としては、放射性核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞分裂阻害剤または細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫活性リガンドおよび生体応答調節物質（サイトカインなど）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答性細胞または悪性細胞増殖を遅延化または緩慢化するために作用する細胞毒はいずれも本発明の範囲内である。細胞毒の例としては、一般的に、細胞分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝物、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニストなどが挙げられる。他のクラスの細胞傷害薬としては、例えば、マイタンシノイドファミリーの薬剤、アントラサイクリンファミリーの薬剤、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬剤、ダイネン（ｄｉｙｎｅｎｅｓ）、およびポドフィロトキシンが挙げられる。
ある実施形態では、抗体分子の安定性または効果を増強する部分を接合し得る。例えば、１つの実施形態では、本発明の結合分子にＰＥＧを接合してインビボ半減期を延ばすことができる。Ｌｅｏｎｇ， Ｓ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６ （２００１）； Ａｄｖ． ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５４：５３１ （２００２）；またはＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０：５１２ （２００２）。
ＬＩＧＨＴ標的および抗体分子をコードする核酸
本発明は、本発明のＬＩＧＨＴ標的および抗体分子をコードする核酸分子も提供する。
１つの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはこれをコードする核酸からなる単離ポリヌクレオチドを提供し、ここで重鎖可変領域の少なくとも１つのＣＤＲまたは重鎖可変領域の少なくとも２つのＶＨ−ＣＤＲが、本明細書に開示のモノクローナルＨＥＲ２抗体に由来する基準重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクローナルＨＥＲ２抗体に由来する基準重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態に応じて、本発明の重鎖可変領域は、配列番号４７〜７０に示されるポリペプチド配列に関連したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
ある実施形態では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１２；配列番号１５６）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１６）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２０）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２４）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２８）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３２）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３６）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４０）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４４）の重鎖可変ドメイン、あるいはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８により発現した抗体分子の重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含むか、もしくは本質的にそれからなる；またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３）の重鎖可変ドメイン、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８により発現した抗体分子の重鎖可変ドメインと少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む、融合物の抗体分子もしくは抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。
他の実施形態では、核酸分子は、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１４）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１８）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２２）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２６）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号３０）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３４）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３８）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４２）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４６）の軽鎖可変ドメイン、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８により発現した抗体分子の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含むか、もしくは本質的にそれからなる；またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１３）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１７）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号２１）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２５）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３７）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号４１）もしくはＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４５）の軽鎖可変ドメイン、またはＰＴＡ−１０３５５、ＰＴＡ−１０３５６、ＰＴＡ−１０３５７、もしくはＰＴＡ−１０３５８により発現した抗体分子の軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９％超同一であるアミノ酸配列を含む、融合物の抗体分子もしくは抗ＨＥＲ２抗体分子をコードする。
核酸分子の例は、配列番号２、配列番号３、配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）；配列番号６、配列番号７、配列番号８のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）によりコードされたアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＨＥＲ２融合物をコードする核酸分子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と遺伝的に融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。実施形態では、核酸分子は、配列番号５のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。
別の例示的な実施形態では、核酸分子は、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＩＧＨＴタンパク質またはその機能的変異体もしくはその断片と、ＣＤ２３もしくはＩＧＦＲに結合する抗体分子との融合分子を少なくとも１つ含むＬＩＧＨＴ標的分子をコードする。１つの実施形態では、ＬＩＧＨＴ−抗ＣＤ２３またはＬＩＧＨＴ−抗ＩＧＦＲ融合物をコードする核酸分子は、配列番号１０１、１７４、１６３のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。実施形態では、核酸分子は、配列番号１０２、１７３、１６２のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２３融合物をコードする核酸分子は、配列番号１０３または１６８に示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一であるアミノ配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる（上記の鎖と融合または結合した）第二の鎖も含み得るか、または本質的にそれからなり得る。実施形態では、核酸分子は、配列番号１０４または１６７のいずれかに示されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％または９５％超同一の配列）を含むか、または本質的にそれからなる。
組換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子組換え細胞
本発明は、本明細書に記載の標的分子および／または抗体分子をコードする核酸も含む。また、核酸および核酸と形質転換した細胞、特に抗体を産生するために有用である細胞（例えば、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯまたはリンパ細胞）を含むベクターも含む。本発明は、本明細書に記載の抗体分子を生成する細胞系（例えば、組換え宿主細胞、ハイブリドーマ）、および抗体分子を前記生成細胞の使用方法も含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターを含む。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、それが結合されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指し、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターを含むことができる。ベクターは、自己複製も可能であり得、宿主ＤＮＡ中へ統合もし得る。ウイルスベクターとしては、例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形態で核酸を含むことができる。好ましくは組換え発現ベクターは、発現するために核酸配列に作動可能に連結される１つ以上の調節配列を含む。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列としては、ヌクレオチド配列、ならびに組織特異的調節および／または誘導性配列の恒常的発現を行うものが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要素に依存し得る。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入し、それによって、タンパク質またはポリペプチド（本明細書に記載の核酸によりコードされた融合タンパク質またはポリペプチドを含む）を産生することができる。
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞中のタンパク質の発現のように設計できる。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現できる。適切な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ， （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡにおいてさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロ、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて転写および翻訳できる。
原核生物中のタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を行う恒常的または誘導性プロモーターを含むベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ中で行われることが最も多い。融合ベクターは、そこでコードされたタンパク質、通常、組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を添加する。かかる融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的のために役立つ：１）組換えタンパク質の発現を上昇させること；２）組換えタンパク質の溶解度を増大すること；および３）親和性精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、タンパク質分解の切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、組換えタンパク質を融合部分から分離し融合タンパク質を精製することを可能にする。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを、それぞれ、標的組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｂ． ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ．Ｓ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）が挙げられる。
精製した組換えタンパク質は、活性測定法（例えば、以下に詳述する直接的測定法または競合的測定法）であることもでき、タンパク質特異的抗体を生成することもできる。１つの好ましい実施形態では、本発明のレトロウイルス発現ベクターに発現した融合タンパク質を用いて骨髄細胞に感染させ、これを続いて照射したレシピエントに移植することができる。次いで、対象レシピエントの病理学を十分な時間の経過（例えば、６週間）後に評価する。
Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現した組換えタンパク質を最大化することは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を損なっている宿主細菌中にタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ １１９−１２８）。別の戦略は、発現ベクター中に挿入する核酸の核酸配列を、各アミノ酸のための個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉ中で選択的に利用されるように改変することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のかかる改変は、標準的なＤＮＡ合成技術により実施できる。
発現ベクターは、酵母菌発現ベクター、昆虫細胞中の発現ベクター、例えば、バキュロウイルス発現ベクターまたは哺乳類細胞中の発現に適したベクターであることができる。哺乳類細胞に使用時、発現ベクターの制御機能は、ウイルスの調節因子により提供し得る。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。
別の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、例えば、ステロイドホルモンにより、ポリペプチドホルモンにより（例えば、シグナル形質導入経路により）、または異種ポリペプチド（例えば、テトラサイクリン誘導系、「Ｔｅｔ−Ｏｎ」および「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」；例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， ＣＡ， Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５５４７、およびＰａｉｌｌａｒｄ （１９８９） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：９８３を参照されたい）により調節されたプロモーターである。別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞種類において選択的に核酸の発現を行なわせることができる（例えば、組織特異的調節因子を用いて核酸を発現する）。適切な組織特異的プロモーターの例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ （１９８８） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体プロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０； Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許第２６４，１６６号）が挙げられるが、これらに限定されない。発現調節プロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ （１９８９） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ３：５３７−５４６）も包含する。
本発明はさらに、発現ベクター中にアンチセンス配向でクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。アンチセンス配向でクローン化された核酸に作動可能に連結される調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）は、様々な細胞種類においてこのアンチセンスＲＮＡに恒常的な、組織特異的または細胞種類特異的発現を行うよう選択し得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であることができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の核酸分子、例えば、組換え発現ベクター中の核酸分子または宿主細胞のゲノムの特定部位に相同的に組換えさせる配列を含む核酸分子を含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において同義的に使用する。かかる用語は、特定の対象細胞だけではなく、かかる細胞の後代または可能な後代も指す。継承する世代において変異または環境の影響のいずれかに起因して特定の修飾が生じ得るため、かかる後代は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、依然として、本明細書で使用する用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核生物であることも任意の真核生物細胞であることもできる。例えば、タンパク質は、バクテリア細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなど）、昆虫細胞、酵母菌または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＳＶ４０細胞起源ＣＶ−１など；Ｇｌｕｚｍａｎ （１９８１） Ｃｅｌｌ ２３：１７５−１８２）中で発現し得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に知られている。
本発明の宿主細胞は、タンパク質を産生する（すなわち、発現させる）ために使用できる。したがって、本発明はさらに本発明の宿主細胞を用いてタンパク質を産生する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、タンパク質を産生する上で適した培地中で本発明の宿主細胞を（導入されているタンパク質をコードする組換え発現ベクター中に）培養することを含む。別の実施形態では、本方法は、タンパク質を培地または宿主細胞から単離することをさらに含む。
過剰増殖性活性の阻害
本発明は、対象における過剰増殖性（例えば、新生物）状態および／または障害を治療または予防する（例えば、治癒、抑制、改良、発現の遅延化もしくは予防、または再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｅ）の予防）方法を提供する。本方法は、過剰増殖性（例えば、新生物）細胞または組織における１つ以上の生体活性を阻害または低減し、それによって、障害または状態を治療または予防するのに十分な量の本明細書に記載のＬＩＧＨＴ標的分子または抗ＨＥＲ２抗体分子を対象に投与することを含む。
ある実施形態では、本方法は、腫瘍または転移の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｅ）を予防、低減または寛解する。本方法は、本明細書に記載のＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子を対象、例えば、標準的な療法様式（例えば、化学療法、抗体ベースおよび／または外科手術）に対して部分的または完全に難治性である患者に投与することを含む。例えば、患者はＨＥＲ２発現癌（例えば、乳房、胃または肺癌）患者であり、外科手術、化学療法および／または抗体療法（例えば、トラスツズマブ療法）後に疾患進行を示している。この観点で、最初にトラスツズマブに応答した転移乳癌患者の大部分が治療開始から１年以内に疾患進行を示す（Ｎａｈｔａ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｖｏｌ． ３ （５）：２６９−２８０）。本発明のＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２分子は、トラスツズマブ難治性患者集団を治療するために使用できる。本発明のＬＩＧＨＴ−抗ＨＥＲ２分子は、抗腫瘍活性の（抗ＨＥＲ２抗体により検出された阻害を超えた）長期の阻害を発揮することが示されており（図２２）、したがって、これらの分子の治療的および予防的使用を拡大する。
他の実施形態では、患者は、外科手術、化学療法および／または抗体療法（例えば、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲ抗体療法）後に疾患進行を示している結腸癌患者である。ある実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子を別の療法様式（例えば、標準的な療法様式）で約１０日間、１〜６ヶ月、６ヶ月〜１年、１〜２年間など治療されている患者に投与する。ある実施形態では、対象は、第一療法に対して部分的または完全な耐性を発現している。
いくつかの実施形態では、投与したＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子の量または投与量は、例えば、対象への投与前に、１つ以上の本明細書に記載の過剰増殖性活性、障害または状態を低減または阻害するために必要とされるＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子量のインビトロまたはエクスビボ試験により決定できる。インビボ方法は、任意に、障害または状態に関連する１つ以上の症状を呈するリスクのある、または呈する対象の特定（例えば、評価、診断、スクリーニング、および／または選択）工程（１つまたは複数）を含むことができる。
上記の方法の様々な実施形態では、抗体またはその断片は腫瘍細胞の移動を阻害する。さらなる実施形態では、腫瘍細胞増殖は、隣接組織に拡散した腫瘍の予防または遅延化（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）を介して阻害される。
さらなる実施形態では、過剰増殖性障害または状態は、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはそれらの転移、または再発性悪性腫瘍（例えば、第一治療に対して部分的または完全に難治性である対象）のうちの１つ以上から選択される。
実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の標的部分を、単独または第二の薬剤と併用して、未治療対象（例えば、未治療のＨＥＲ２発現乳癌患者）に対して第一療法として投与する。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の標的部分を単独または第二の薬剤と併用して第二療法として投与する。他の実施形態では、ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗体分子の標的部分を、標準的な療法様式に対して部分的または完全に難治性である患者に投与する。例えば、患者は化学療法および／またはトラスツズマブ療法後に疾患進行を示している乳癌患者である。
本明細書で使用する「治療する」または「治療」という用語は、治療処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）もしくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）測定の両方を指し、その目的は、望ましくない生理的変化または障害（癌の発現または拡散など）を予防するまたは緩慢化する（軽減する）ことである。便益または所望の臨床結果としては、検出可能か検出不能かを問わず、症状の軽減、疾患範囲の縮小、病態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患進行の遅延化または緩慢化、病態の改良もしくは緩和、および寛解（部分寛解か完全寛解かを問わず）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」は、未治療の場合の予想生存と比較した延命も意味し得る。治療を必要としているものとしては、状態もしくは障害を既に呈しているもの、ならびに状態もしくは障害を呈する傾向があるもの、または状態もしくは障害を予防すべきものが挙げられる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、診断、予後判断、または療法が望ましい任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象としては、ヒト、家畜、農場動物、および動物園の動物、スポーツ動物、または飼育動物（イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、雌牛など）が挙げられる。
本明細書で使用する「結合分子の投与から便益を受ける可能性のある対象」および「治療を必要としている動物」などの語句は、例えば、結合分子により認識された抗原検出のため（例えば、診断手順のため）に使用した結合分子の投与、ならびに／または所与の標的タンパク質に特異的に結合する結合分子による治療、すなわち、疾患（癌など）の緩和もしくは予防から便益を受ける可能性のある対象（哺乳類対象など）を含む。本明細書に詳述するように、結合分子は非抱合形態で使用することも、例えば、薬剤、プロドラッグ、もしくは同位体に接合することもできる。
様々な実施形態では、対象は哺乳類（例えば、動物モデルまたはヒト）である。さらなる実施形態では、対象はヒト、例えば、１つ以上の本明細書に記載の癌または新生物の状態を呈する患者である。１つの実施形態では、対象は標準的な療法様式を施行中の患者、例えば、化学療法および／またはトラスツズマブ治療を施行中のＨＥＲ２陽性患者であり、ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子を第二療法として投与する。他の実施形態では、患者は未治療患者であり、例えば、ＬＩＧＨＴ標的分子および／または抗ＨＥＲ２抗体分子を第一療法として投与する。他の実施形態では、患者は標準的な療法様式に対して部分的または完全に難治性である。例えば、患者は化学療法および／またはトラスツズマブ療法後に疾患進行を示している乳癌患者である。
「過剰増殖性疾患または障害」とは、悪性か良性かを問わず、あらゆる形質転換した細胞および組織、ならびにすべての癌細胞および組織を含む、あらゆる新生物細胞の成長および増殖を意味する。過剰増殖性疾患または障害としては、前癌病変、異常な細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍、および「癌」が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態では、過剰増殖性疾患または障害、例えば、前癌病変、異常な細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍、または「癌」は、標的細胞抗原を発現、過剰発現、または異常なレベルで発現する細胞を含む。
過剰増殖性疾患、障害、および／または状態のさらなる例としては、良性か悪性かを問わず、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、（中枢および末梢）神経、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖路に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。かかる新生物は、ある実施形態では、標的細胞抗原を発現、過剰発現、または異常なレベルで発現する。
他の過剰増殖性障害としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ疾患、組織球増殖症、および上に列挙した臓器系に位置する新生物を除く他の任意の過剰増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態では、疾患は標的細胞抗原を発現、過剰発現、または異常なレベルで発現する細胞に関与する。
本明細書で使用する「腫瘍」または「腫瘍組織」という用語は、過剰な細胞分裂に起因した異常な組織の塊を指し、場合によっては、過剰増殖性細胞タンパク質を発現、過剰発現、または異常なレベルで発現する細胞を含む組織に起因する異常な組織の塊を指す。腫瘍または腫瘍組織は、異常増殖特性を有し、有用な生体機能のない新生物細胞である「腫瘍細胞」を含む。腫瘍、腫瘍組織および腫瘍細胞は、良性あるいは悪性であり得る。
本明細書で使用する「悪性腫瘍」という用語は、良性ではない腫瘍または癌を指す。本明細書で使用する「癌」という用語は、無秩序なまたは制御不能な細胞増殖を特徴とする悪性腫瘍を含む過剰増殖性疾患種類を含む。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。さらに特定のかかる癌の例を以下に記す：扁平上皮細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、膠芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、経腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌を含む。「癌」という用語は、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、その細胞が、対象の体内における元々の悪性腫瘍または腫瘍の他の部位へ移動していないもの）ならびに二次的な悪性細胞もしくは腫瘍（例えば、転移、悪性細胞もしくは腫瘍細胞の原発性腫瘍部位とは異なる第二の部位への移動から生じたもの）を含む。本発明の治療方法を行う癌は、標的細胞抗原を発現、過剰発現、または異常なレベルで発現する細胞に関与する。
本発明の方法は、前悪性状態を治療するため、ならびに新生物もしくは悪性状態（上記障害が挙げられるが、これらに限定されない）への進行を予防するために使用してよい。かかる使用は、新生物または癌への進行がわかっているか疑わしい状態、特に過形成、異形成からなる非新生物の細胞増殖、または最も特に、異形成が生じた場合に指定される（かかる異常増殖状態の総説については、Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌ， Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ｐｐ． ６８−７９ （１９７６）を参照されたい。標的細胞抗原を発現、過剰発現、または異常なレベルで発現し始める細胞におけるかかる状態は特に、本発明の方法により治療可能である。
本発明の方法により治療できるさらなる前新生物障害としては、良性の異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、繊維嚢胞性状態、組織肥大、腸管ポリープ、結腸ポリープ、および食道異形成）、白斑症、角化症、ボーエン疾患、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光角化症が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、癌、特に本明細書に列挙した癌の増殖、進行、および／または転移を阻害するために使用される。
さらなる過剰増殖性疾患、障害、および／または状態としては、悪性腫瘍の進行および／または転移ならびに以下のような関連障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む）を含む）および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、ならびに肉腫および癌腫を含む固形腫瘍（線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫など）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のＬＩＧＨＴ標的薬剤および抗ＨＥＲ２抗体分子の効果を評価するために、いくつもの測定系、細胞系および動物モデルが当該技術分野で知られている。例えば、異なるレベルの１つ以上のＨＥＲ２、ＬＴβＲおよびＨＶＥＭを発現する細胞系を使用できる。高いレベルのＨＥＲ２を発現するヒト細胞系の例としては、ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３、Ｎ８７およびＳＫＯＶ３が挙げられるが、これらに限定されない。中等度レベルのＨＥＲ２を発現する細胞系の例としては、ラットＴｕｂｏおよびヒトＨＴ２９が挙げられる。ＨＥＲ２の発現レベルが低いかまたは検出不能なレベルである細胞系の例としては、ヒトＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ならびにマウスＴＳＡおよび４Ｔ１が挙げられる。ＬＩＧＨＴ受容体を発現する細胞系の例としては、ＨＴ２９、Ｎ８７およびＷｉＤｒ（高レベルのＬＴβＲを発現する）；ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫＯＶ３およびＴｕｂｏ（これらのすべてが中等度レベルのＬＴβＲを発現する）；ならびにマウスＴＳＡおよび４Ｔ１（低レベルのＬＴβＲを発現する）が挙げられる。中等度レベルのＨＶＥＭを発現する細胞系としては、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＴ２９が挙げられる。本発明の分子を試験するための異種移植動物モデルを以下の例に記載する。
医薬組成物、投与量、投与方法
本発明の分子（本明細書で、「活性化合物」とも呼ぶ）は、医薬組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、または抗体および医薬上許容可能な担体を含む。本明細書で使用する「医薬上許容可能な担体」という言葉は、医薬投与に適する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延化剤などを含む。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。
医薬組成物は、意図した投与経路に適するように処方される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および経腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適応用に使用する溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：無菌希釈液（注射液、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など）；抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；酸化防止剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝液（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）および浸透圧の調節剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。ｐＨは、酸または塩基（塩酸または水酸化ナトリウムなど）で調節できる。
治療有効量の本発明の分子を静脈内、皮膚または皮下注射により投与する場合、結合剤は、発熱性物質を含まない、非経口的許容可能な水性溶液形態となる。かかる非経口的許容可能なタンパク質溶液の調製物は、適切なｐＨ、等張性、安定性などを考慮して、当該技術分野の技術内である。静脈内、皮膚、または皮下注射に好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、等張ビヒクル（塩化ナトリウム注射、リンガー注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳酸リンガー注射、または当該技術分野で知られている他のビヒクルなど）を含む。本発明の医薬組成物は、安定剤、防腐剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に知られている他の添加剤も含み得る。
吸入投与において、本発明の分子は、適切な噴射剤（例えば、気体（二酸化炭素など））を含む圧力容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレー状で送達される。
全身投与は、経粘膜的手段によることも経皮的手段によることもできる。経粘膜または経皮投与において、製剤中に、透過するべき障壁に適した浸透剤を使用する。かかる浸透剤は一般に当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与において、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻的スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与において、活性化合物は、一般に当該技術分野で知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム中に処方される。
細胞培養測定法および動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用用の投与量範囲の処方に使用できる。かかる化合物の投与量は、好ましくは毒性がないかほとんどないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用した投与形態および使用した投与経路により、この範囲内で変わり得る。本発明の方法に用いた任意の化合物のため、治療的有効量は、初めに細胞培養測定法から推定できる。用量は、細胞培養において決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分に達する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲に達するように動物モデルにおいて処方し得る。かかる情報を、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用できる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定し得る。
本明細書で定義されるように、治療有効量のタンパク質またはポリペプチド（すなわち、有効量）の範囲は約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、よりさらに好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重である。タンパク質またはポリペプチドは、週１回、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、さらに好ましくは約３〜７週間、よりさらに好ましくは約４、５、または６週間投与できる。数日間以上にわたる反復投与において、状態に応じて、治療は発現する疾患症状が望ましく抑制されるまで反復される。しかしながら、他の投与量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術および測定法（例えば、放射線腫瘍造影を含む）により容易にモニタリングされる。最終的に、担当医により、本発明の医薬組成物を用いた静脈内療法の適切な期間が決定されるであろう。
疾患もしくは障害の重症度、前治療、対象の全身の健康状態および／もしくは年齢、ならびに他の疾患既往が挙げられるが、これらに限定されないある要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量および投与時点に影響し得ることを当業者は理解するであろう。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体による対象の治療は、単独治療を含み得るが、好ましくは、一連の治療を含み得る。
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入して、遺伝子療法ベクターとして使用できる。遺伝子療法ベクターは、対象に、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照されたい）により送達できる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈液中に遺伝子療法ベクターを含むこともでき、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれているマトリックス型徐放剤を含むこともできる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞から無傷でに産生できる場合（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
医薬組成物は、投与説明書と共に容器、パック、またはディスペンサーに収容できる。
投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかによっても変わり得る。予防用途の場合、抗体またはその混合物を含む組成物を、まだその疾患の症状を呈していない患者か、または前症状患者に投与し、患者の抵抗力を高める。かかる量を「予防的有効量」と定義する。本用途でも、正確な量は、患者の健康状態および全身の免疫状態によってやはり変わるが、一般に１回の投与あたり０．１〜２５ｍｇの範囲であり、特に、１回の投与あたり０．５〜２．５ｍｇの範囲である。長期間にわたって、比較的低用量を比較的低頻度の間隔で投与する。一部の患者は、残りの生涯ずっと治療を受け続ける。
治療用途の場合、比較的高用量（例えば、結合分子（例えば、抗体）を１回の投与あたり約１〜４００ｍｇ／ｋｇ、放射性免疫複合体の場合、５〜２５ｍｇ、細胞毒−薬物コンジュゲート分子の場合には、これより多い量が一般的に使用される）を比較的短い間隔で、疾患進行が遅くなるか、または抑えられるまで、好ましくは、患者が疾患症状の部分的または完全な改良を示すまで必要とされる場合がある。その後、予防計画に沿って患者に投与できる。
１つの実施形態では、対象を、ＬＩＧＨＴ標的分子または抗体分子をコードする核酸分子（例えば、ベクターに入っている）（本明細書で集合的に「結合分子」または「分子」と呼ぶ）で治療できる。ポリペプチドをコードする核酸の用量範囲は、患者あたり、約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡである。感染ウイルスベクターの用量範囲は、１回の投与あたり、１０〜１００または１００超のビリオンである。
治療薬を、予防的および／または治療的処置のため、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内に投与できる。いくつかの方法では、癌を発現する細胞が集まっている特定の組織に薬剤を直接、例えば、頭蓋内注射により注射する。抗体を投与する場合、筋肉内注射または静脈内注射が好ましい。いくつかの方法では、特定の治療用抗体を、頭蓋に直接注射する。いくつかの方法では、抗体を徐放性組成物または徐放性機器（Ｍｅｄｉｐａｄ（商標登録）機器など）として投与する。
本発明の分子は、任意に、（例えば、予防的または治療的）処置を必要としている障害または状態を治療する上で有効な他の薬剤と併用して投与できる。ＬＩＧＨＴ標的分子、または抗ＨＥＲ２抗体分子は、単独または別の薬剤（例えば、本明細書に記載の化学治療薬）と併用して、過剰増殖性状態および／または障害を呈している対象、例えば、哺乳類に、対象における少なくとも１つのＬＩＧＨＴ関連生体活性を誘出する上で十分な量で投与できる。
１３１Ｉおよび９０Ｙについて極めて多くの臨床経験が得られているが、他の放射性同位体も当該技術分野で知られており、同様の目的で使用されている。さらなる他の放射性同位体も造影に使用されている。例えば、本発明の範囲で適するさらなる放射性同位体としては、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、および２１３Ｂｉが挙げられるが、これらに限定されない。この観点で、α放射体、γ放射体およびβ放射体のいずれも本発明に適している。さらに、本開示の観点から、当業者は、過度の実験を行わずに、選択した一連の治療にどの放射性核種が適しているのかを容易に決定できるであろう。この目的のために、臨床診断で既に使用されているさらなる放射性核種としては、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、ならびに１１１Ｉｎが挙げられる。抗体は、標的への免疫療法で使用するために、様々な放射性核種で標識もされている（Ｐｅｉｒｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６５： １１１−１２５ （１９８７））。これらの放射性核種としては、あまり頻度は高くないが、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅ、１９９Ａｕならびに６７Ｃｕが挙げられる。米国特許第５，４６０，７８５号は、かかる放射性同位体に関するさらなるデータを提供しており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明の分子を直前に記載のように投与してよい一方で、他の実施形態では接合および非抱合型結合分子をそれ以外では健常である患者に第一治療薬として投与してよいことが強調される。
しかしながら、本発明の選択された実施形態では、本発明の分子を、１つ以上の補助的療法（放射性療法または化学療法など）と併用して（すなわち、併用治療レジメンとして）患者に投与することを含む。本明細書で使用する、本発明の結合分子の補助療法と共に、またはそれと組み合わせた投与は、逐次投与、同時投与、同じ時間範囲での投与、相伴投与、または同じ期間での投与を意味する。組み合わせ治療レジメンの様々な成分の投与または適応を、全体の治療効果を高めるようにタイミング調節してよいことを当業者は理解するであろう。例えば、化学治療薬を標準的な一連の治療で投与し、数週間以内に本明細書に記載の放射性免疫複合体を投与することができる。逆に、細胞毒接合結合分子を静脈内投与し、その後に腫瘍局所的に外部光線放射線を照射し得る。さらに他の実施形態では、結合分子を１つ以上の選択された化学治療薬と単回の診察室訪問時に並行して投与してよい。当業者（例えば、経験豊富な癌専門家）は、過度の実験を伴わずに、選択された補助的療法および本明細書の教示に基づき、効果的な組み合わせ治療レジメンを容易に識別できるであろう。
この観点で、結合分子（細胞毒を含んでいても、含んでいなくてもよい）と、化学治療薬との組み合わせを、患者にとって有益な治療になるように、任意の順序および任意の期間で投与してよいことが理解されるであろう。すなわち、化学治療薬および結合分子を、任意の順序でまたは並行してに投与してよい。選択された実施形態では、本発明の結合分子を、既に化学療法を施行されている患者に投与する。さらに他の実施形態では、本発明の結合分子を、化学治療薬を用いた治療と実質的に同時に、または並行して投与する。例えば、化学療法を施行中の患者に、結合分子を投与してよい。好ましい実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から１年以内に投与する。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドを、任意の化学治療薬または治療から１０ヶ月、８ヶ月、６ヶ月、４ヶ月、または２ヶ月以内に投与する。さらに他の好ましい実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から４週間、３週間、２週間または１週間以内に投与する。さらに他の実施形態では、結合分子を、選択された化学治療薬または治療から５日、４日、３日、２日または１日以内に投与する。２種類の薬剤または治療を、数時間以内または数分以内（すなわち、実質的に同時に）患者に投与してよいことがさらに理解されるであろう。
本発明のこれらの態様では、本発明に適する化学治療薬の例としては、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサートおよびプレドニゾンが挙げられる。これら４種類の薬剤の組み合わせであるＭＯＰＰ（メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）は様々な種類のリンパ腫を治療する上できわめて効果的であり、本発明の好ましい実施形態をなす。ＭＯＰＰ耐性患者では、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）もしくはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）の組み合わせを使用できる。標準的な投与および投与計画については、Ａｒｎｏｌｄ Ｓ． Ｆｒｅｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｍ． Ｎａｄｌｅｒ， Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ， ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７７４−１７８８ （Ｋｕｒｔ Ｊ． Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １３ｔｈ ｅｄ． １９９４）およびＶ． Ｔ． ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．， （１９９７）ならびにそこで引用した参考文献。これらの療法を、１つ以上の本発明の抗体またはその免疫特異的断片と併用して、そのまま用いることもでき、特定の患者のために必要に応じて変更して用いることもできる。
中等度から重度の悪性腫瘍患者については、寛解していないか、または再発している場合、サルベージ療法を用いる。サルベージ療法は、シトシンアラビノシド、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシドおよびイホスファミドなどの薬剤を単独で、または併用して用いる。ある種の新生物障害の再発した形態または進行中の形態では、以下のプロトコルを使用することが多い。ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ギャグ、イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）およびＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）。いずれも、周知の投与速度および投与計画で行う。
本発明の結合分子と併用して使用する化学治療薬の量は、対象によって様々であり、当該技術分野で知られている方法に従って投与してもよい。例えば、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ， ｉｎ Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １２３３−１２８７ （Ｊｏｅｌ Ｇ． Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ９ｔｈ ｅｄ． （１９９６）を参照されたい）。
別の実施形態では、本発明の結合分子を、生物製剤と共に投与する。癌治療に有用な生物製剤は、当該技術分野で知られており、本発明の結合分子を、例えば、かかる既知の生物製剤と併用投与してよい。例えば、ＦＤＡは、乳癌の治療で以下の生物製剤を承認している：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標登録）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆ．；ＨＥＲ２陽性の乳癌において抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（商標登録）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， ＬＰ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｄｅｌ．；乳癌治療に使用されるエストロゲン受容体アンタゴニスト）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商標登録）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， ＬＰ；エストロゲンを生成するために必要な酵素であるアロマターゼを遮断する非ステロイド系アロマターゼ阻害剤）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（商標登録）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．；乳癌治療に使用する不可逆性ステロイド系アロマターゼ不活性化剤）；Ｆｅｍａｒａ（商標登録）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ， Ｎ．Ｊ．；ＦＤＡが承認した乳癌治療用の非ステロイド系アロマターゼ阻害剤）；およびＮｏｌｖａｄｅｘ（商標登録）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， ＬＰ；ＦＤＡが承認した乳癌治療用の非ステロイド系抗エストロゲン薬）。本発明の結合分子を併用してもよい他の生物製剤としては、Ａｖａｓｔｉｎ（商標登録）（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；最初にＦＤＡが承認した、血管形成を阻害するように設計された治療薬）；およびＺｅｖａｌｉｎ（商標登録）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．；放射能標識したモノクローナル抗体、現時点では、Ｂ細胞リンパ腫の治療薬として承認されている）が挙げられる。
加えて、ＦＤＡは、結腸直腸癌の治療に以下の生物製剤を承認している：Ａｖａｓｔｉｎ（商標登録）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標登録）（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ａｎｄ Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．；これは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するモノクローナル抗体である）；Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標登録）（メシル酸イマチニブ；タンパク質キナーゼ阻害剤）；およびＥｒｇａｍｉｓｏｌ（商標登録）（塩化レバミソール、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， ＬＰ， Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ， Ｎ．Ｊ．；デュークス期Ｃ結腸癌患者の外科切除後に、５−フルオロウラシルと併用した補助治療として、１９９０年、ＦＤＡに承認された免疫修飾物質）。
非ホジキンリンパ腫の治療で使用する場合、現時点で承認されている治療薬としては、以下が挙げられる：Ｂｅｘｘａｒ（商標登録）（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， Ｎ．Ｃ．；放射能活性分子（ヨウ素Ｉ−１３１）に結合したマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）に関与する多段階治療）；Ｉｎｔｒｏｎ（商標登録）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， Ｎ．Ｊ．；アントラサイクリンを含有する併用化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン［ＣＨＯＰ］）と併用する、小胞非ホジキンリンパ腫の治療で承認されたインターフェロンの一種）；Ｒｉｔｕｘａｎ（商標登録）（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆ．， ａｎｄ Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．；非ホジキンリンパ腫の治療で承認されたモノクローナル抗体；Ｏｎｔａｋ（商標登録）（デニロイキンジフチトクス、Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．；インターロイキン−２に遺伝的に融合したジフテリア毒素断片からなる融合タンパク質）；およびＺｅｖａｌｉｎ（商標登録）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ；Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療でＦＤＡが承認した、放射能標識したモノクローナル抗体）。
白血病の治療で使用する場合、本発明の結合分子と併用して使用してよい生物製剤の例としては、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標登録）；Ｃａｍｐａｔｈ（商標登録）−１Ｈ（アレムツズマブ、Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃａｌｉｆ．；慢性リンパ性白血病の治療で使用するモノクローナル抗体の一種）が挙げられる。加えて、Ｇｅｎａｓｅｎｃｅ（オブリメルセン、Ｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｅｒｋｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ， Ｎ．Ｊ．；白血病を治療するための開発において使用してよいＢＣＬ−２アンチセンス療法（例えば、単独で、またはフルダラビンおよびシクロホスファミドなどの１つ以上の化学治療薬と併用して）を、特許請求の範囲に記載の結合分子と共に投与してよい。
肺癌を治療する場合、生物製剤の例としては、Ｔａｒｃｅｖａ（商標登録）（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， Ｎ．Ｙ．；ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）の経路を標的とするように設計された低分子）が挙げられる。
多発性骨髄腫を治療する場合、生物製剤の例としては、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標登録）Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．；プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。さらなる生物製剤としては、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄ（商標登録）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｒｒｅｎ， Ｎ．Ｊ．；免疫修飾剤、骨髄腫細胞の増殖および生存阻害能、抗血管形成能を含む複数の作用を有すると考えられる）が挙げられる。
他の生物製剤の例としては、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．で開発されたＭＯＡＢ ＩＭＣ−Ｃ２２５が挙げられる。
結合分子および核酸増幅測定法を用いた診断または予後判断方法
結合分子は、標的細胞抗原、例えば、ＨＥＲ２またはＣＤ２３の異常なレベルで発現および／または活性に関連する疾患、障害、および／または状態を検出、診断、またはモニタリングする診断目的で使用できる。これらの標的は腫瘍組織および他の新生物の状態において発現し得る。結合分子は、哺乳類、好ましくはヒトの過剰増殖性疾患の診断、治療、予防および／または予後判断に有用である。障害の例を本明細書に開示する。したがって、本発明は、癌および他の過剰増殖性疾患の診断中に有用である診断方法を提供し、これは個体由来の組織または他の細胞または体液中の標的タンパク質または転写物の発現レベルの測定、ならびに正常組織もしくは体液中の標準的な標的発現レベルと測定した発現レベルとの比較を含み、ここで標準と比較して上昇した発現レベルは障害を示す。
１つの実施形態では、液体または組織試料中の異常な過剰増殖性細胞（例えば、前癌または癌細胞）の存在の検出方法を提供し、本方法は個体の組織または体液試料中の標的発現の測定、試料中の標的発現の存在またはレベルと標準的な組織または体液試料パネルにおける標的発現の存在またはレベルとの比較を含み、ここで標準を超える標的発現の検出または標的発現の上昇は異常な過剰増殖性細胞増殖を示す。
さらに具体的には、本発明は、体液または組織試料中の異常な過剰増殖性細胞の存在の検出方法を提供し、本方法は、（ａ）本発明の標的特異的抗体分子を用いた個体の組織または体液試料中の標的発現の測定、および（ｂ）試料中の標的発現の存在またはレベルと標準的な組織または体液試料パネルの標的発現の存在またはレベルとの比較を含み、ここで標準を超える標的発現の検出または標的発現の上昇は異常な過剰増殖性細胞増殖を示す。
癌に関して、個体由来の生検組織における比較的高量の標的タンパク質の存在は、腫瘍または他の悪性増殖の存在を示し得、かかる悪性腫瘍または腫瘍の発現素因を示し得、実際の臨床症状の発現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。さらにこの種のより確定的な診断は、医療専門家が予防測定または積極的治療をより早期に使用し、それによって、癌の発現またはさらなる進行を予防することを可能にし得る。
本発明の標的特異的抗体分子は、当業者に知られている従来の免疫組織学的方法を用いて生体試料中のタンパク質レベルを測定するために使用できる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５ （１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６ （１９８７）を参照されたい）。タンパク質発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法としては、免疫測定法（酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）など）が挙げられる。適切な抗体測定標識は当該技術分野で知られており、酵素標識（グルコースオキシダーゼなど）；放射性同位体（ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）など）；ルミネセンス標識（ルミノールなど）；ならびに蛍光標識（フルオレセインおよびローダミン、ならびにビオチンなど）が挙げられる。適切な測定法について本明細書の他の個所で詳述する。
本発明の１つの態様は、対象（好ましくは哺乳類および最も好ましくはヒト）における標的の異常なレベルで発現に関連する過剰増殖性疾患または障害のインビボ検出または診断方法である。１つの実施形態では、診断は、以下を含む：ａ）対象に、標的と特異的に結合する有効量の本発明の標識抗体またはその断片を（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）投与すること；ｂ）対象における標的が発現する部位にて標識結合分子を選択的に濃縮させるため（および結合していない標識分子を背景レベルにまで除くため）の投与後の時間間隔で待機すること；ｃ）背景レベルを決定すること；ならびにｄ）対象において標識分子を検出すること、ここで背景レベルを超える標識分子の検出は、対象が標的の異常なレベルで発現に関連する特定の疾患または障害を呈することを示す。背景レベルは、様々な方法（検出された標識分子量と、特定の系において既に決定されている標準的な値との比較を含む）により決定できる。
当該技術分野において、対象の大きさおよび使用する画像系が、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが理解されるであろう。放射性同位体部分の場合、ヒト対象において、注入する放射活性物質量は通常、（例えば、９９Ｔｃ）約５〜２０ミリキュリーの範囲となる。次いで、標識結合分子（例えば、抗体または抗体断片）は、特異的タンパク質を含む細胞位置に選択的に蓄積する。インビボ腫瘍の造影については、Ｓ． Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．” （Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓ． Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ａｎｄ Ｂ． Ａ． Ｒｈｏｄｅｓ， ｅｄｓ．， Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （１９８２）に記載されている。
いくつもの変数（用いる標識種類、投与方法を含む）に応じて、対象における部位に標識分子を選択的に濃縮させ、結合していない標識分子を背景レベルにまで除くための投与後の時間間隔は６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態では、次の投与までの時間間隔は、５〜２０日間または７〜１０日間である。
標識分子の存在は、当該技術分野で知られているインビボスキャンのための方法を用いて患者において検出できる。これらの方法は、用いた標識種類によって変わる。当業者は、特定の標識を検出するために適した方法を決定できるであろう。本発明の診断方法に使用してよい方法および機器としては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）などの全身スキャン、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、および超音波が挙げられるが、これらに限定されない。標的発現のインビボ造影のための抗体標識またはマーカーとしては、Ｘ放射線写真、核磁気共鳴画像（ＮＭＲ）、ＭＲＩ、ＣＡＴ−スキャンまたは電子スピン共鳴造影（ＥＳＲ）により検出可能なものが挙げられる。上記のものに関連する１つの実施形態では、既に診断されている疾患または障害のモニタリングを、疾患または障害の任意の１つの診断方法を、例えば、初回診断から１ヶ月後、初回診断から６ヶ月後、初回診断から１年後などに反復することにより実行する。
障害の診断（腫瘍の診断を含む）が従来の方法に従って既に行われている場合、診断、本明細書で開示の検出方法は予後判断指標として有用であり、それにより標的発現の上昇を示し続ける患者は、発現レベルが標準レベル近くまで低減した患者と比較して臨床転帰の悪化を示す。
「腫瘍関連標的ポリペプチドの発現レベルの測定」とは、第一の生体試料中の標的ポリペプチドレベルを直接（例えば、絶対的タンパク質レベルの決定または推定により）または相対的（例えば、第二の生体試料中の癌関連ポリペプチドレベルと比較することにより）のいずれかにより定性的にまたは定量的に測定または推定することを意図する。好ましくは、第一の生体試料中の標的ポリペプチド発現レベルは、障害を呈さない個体から得られる第二の生体試料から得た標準または障害を呈さない個体集団の平均値により決定した標準的な標的ポリペプチドレベルと比較して測定または推定する。当該技術分野において、理解されるであろうように、いったん「標準」の標的ポリペプチドレベルが知られると、比較用の標準として反復使用できる。
「生体試料」とは、個体、細胞系、組織培養、または標的を発現する可能性がある他の細胞源から得られる任意の生体試料であることを意図する。示すように、生体試料としては、体液（血清、血漿、尿、滑液および髄液など）、および標的を発現する可能性がある細胞を含む他の組織源が挙げられる。組織生検および体液を哺乳類から得る方法は当該技術分野において周知である。
追加の実施形態では、標的の立体構造エピトープに向けられる抗体、または抗体の免疫特異的断片を、標的遺伝子生成物またはその保存された変異体もしくはそのペプチド断片の存在を定量的にまたは定性的に検出するために使用してよい。これは、例えば、光学顕微鏡に結合した蛍光標識抗体を用いた免疫蛍光法、フローサイトメトリー、または蛍光検出法により達成し得る。
上記方法を用いて診断および／または予後判断し得る癌としては、胃癌、腎臓癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫測定法
本明細書に開示の標的特異的抗体またはその免疫特異的断片は、当該技術分野で知られている任意の方法により、免疫特異的結合を測定してよい。使用できる免疫測定法としては、限定されないが、少数の例として以下に挙げるような技術を用いた競合的および非競合的測定系が挙げられる：ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「交互重ね」免疫測定法、免疫沈殿測定法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体固定測定法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、タンパク質Ａ免疫測定法。かかる測定法は日常に行われるものであり、当該技術分野において周知である（例えば、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｖｏｌ． １ （１９９４）を参照されたい）。免疫測定法の例を、以下に簡単に記載する（ただし、限定することは意図しない）。
抗体の抗原への結合親和性および抗体抗原相互作用の解離速度を競合的結合測定法により決定できる。競合的結合測定法の１つの例はラジオイムノアッセイであり、漸増する非標識抗原の存在下、目的の抗体と共に標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）とのインキュベーションを行うことと、標識抗原に結合した抗体を検出することを含む。特定の抗原への目的の抗体の親和性および結合解離速度をスキャッチャードプロット分析によるデータから決定できる。二次抗体との競合もラジオイムノアッセイを用いて決定できる。この場合、漸増する非標識二次抗体の存在下、抗原を標識された化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に接合された目的の抗体とインキュベーションする。
標的特異的抗体はさらに、癌抗原遺伝子生成物または保存されたその変異体もしくはペプチド断片のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために、免疫蛍光、免疫電顕法または非免疫学的測定法にて組織学的に使用してよい。Ｉｎ ｓｉｔｕ検出は、患者由来の組織学的標本を取り出し、そこに標識した標的特異的抗体またはその断片を適用することにより、好ましくは生体試料上に標識抗体（または断片）を重ねて適用することにより達成し得る。
ＢＩＡｃｏｒｅ上で実施する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体抗原相互作用の親和性を測定する従来の方法に勝るいくつかの利点を提供する：（ｉ）抗体または抗原のいずれも標識する必要はない；（ｉｉ）抗体を事前に精製する必要はなく、細胞培養の上清を直接使用できる；（ｉｉｉ）異なるモノクローナル抗体相互作用の迅速な半定量比較ができるリアルタイム測定が可能であり、多くの評価のために十分である；（ｉｖ）一連の異なるモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較できるように生体特異的表面を再生成できる；（ｖ）分析的手順は完全に自動であり、ユーザーの介入なしに広い一連の測定を実施できる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ｖｅｒｓｉｏｎ ＡＢ （ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ １９９８）， ＢＩＡＣＯＲＥ ｃｏｄｅ Ｎｏ． ＢＲ−１００１−８６； ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ｖｅｒｓｉｏｎ ＡＢ （ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ １９９８）， ＢＩＡＣＯＲＥ ｃｏｄｅ Ｎｏ． ＢＲ−１００１−８４。
エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。ＢＩＡｃｏｒｅを用いたエピトープマッピングでは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは他の表面吸着方法を用いた従来の技術とは異なり、抗体を標識したり、精製したりする必要がなく、一連の数種類のモノクローナル抗体を用いた複数箇所での特異性試験が可能である。さらに、大量の分析を自動的に処理できる。
ペプチド阻害は、エピトープマッピングに用いる別の技術である。本方法は、ペアワイズ抗体結合試験を補完でき、抗原の一次配列が既知である場合、機能的エピトープを構造的特徴に関連付けることができる。ペプチドまたは抗原断片の異なるＭＡｂの免疫化抗原への結合阻害を試験する。所与のＭＡｂの結合に干渉するペプチドは、そのＭＡｂにより定義されたエピトープに構造的に関連していると推定される。
以下の実施例は本発明の理解を助けるために説明するが、いかなる方法においてもその範囲を限定することを意図せず、その範囲を限定しない。
（実施例１）
ファージライブラリーからのｈＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２特異的Ｆａｂの選択
組換えヒトＨＥＲ２外部ドメインを用いて３．５×１０１０の固有クローンを含有するヒト未治療ファージミドＦａｂライブラリーをスクリーニングした（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ Ｍａｒ；２３（３）：３４４−８．）。ファージライブラリーとのインキュベーション前に、ビオチン化ｈＨｅｒ２−Ｆｃタンパク質をストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズ上に取り込んだ。先に記載のように、ｈＥＧＦＲ−Ｆｃ上で枯渇してＦｃ特異的結合剤ならびにＥＧＦＲ交差反応結合剤を除去して選択を行った（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ Ｍａｒ；２３（３）：３４４−８）。パニングの３ラウンド後、４７９ｂｐ遺伝子ＩＩＩ ｓｔｕｍｐをＭｌｕＩ消化により除去し、ベクターをＴＧ１細胞中の可溶性Ｆａｂ発現のため再結紮した。９２０個のクローンのＥＬＩＳＡ分析により、７９個の固有配列を含む２２４個の陽性クローンを得た。固有のクローンを精製し、単濃度で組換えヒトｈＨＥＲ２外部ドメインへの結合を、完全長ヒトＨＥＲ２で安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞上でＥＬＩＳＡならびにＦＡＣＳにより再確認した（以下の細胞系構築を参照されたい）。結合データに基づき、２４個の固有クローン（６５Ａ０３、６５Ｂ０３、６５Ｃ１０、６５Ｈ０９、６６Ａ１２、６６Ｃ０１、６７Ａ０２、６７Ｃ１２、６７Ｆ１０、６７Ｆ１１、６８Ｂ１１、６８Ｄ０３、６９Ａ０９、６９Ｅ０２、６９Ｆ０２、７０Ｃ０１、７０Ｃ０８、７０Ｄ１１、７１Ａ０３、７１Ａ０６、７１Ｆ０８、７１Ｆ１０、７１Ｈ０２および７２Ｈ１０）を選択してさらに分析した。
（実施例２）
フローサイトメトリーにより測定されたＦａｂのｈＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２に対する結合活性
野生型ｈＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２へのＦａｂの結合能を、ｈＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２で安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞系を用いたフローサイトメトリーにより決定した。
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を、ｈＨＥＲ２発現ベクターで安定にトランスフェクションし、Ｇ４１８含有培地中で選択した。Ｇ４１８耐性クローンを貯留し、測定設定の２４時間前に分けて７０％集密的な単層を得た。通常の方法で、ＣＨＯ細胞系を２０継代内に維持した。細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１３１５１−０１４）により細胞を持ち上げ、計測し、洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬに調整し、次いで細胞１ｍＬを各チューブ（１２×７５ｍｍチューブ、Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５２０５４）に添加した。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、細胞をペレット化し、上清を除去してから、１００μＬの希釈した抗体を細胞ペレットに添加した。精製したＦａｂをＦＡＣＳ緩衝液による１：３希釈で２１０または６０μｇ／ｍＬのいずれかで開始し、０．００１μｇ／ｍＬまでの濃度で試験した。測定を通して用いたＦＡＣＳ緩衝液は、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−７９０６）および０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ２００２）含有するＰＢＳ（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まない）であった。試料を氷上で１時間１５分間インキュベーションさせてから、２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して、１２００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離した。上清を吸引して１００μＬの第二の検出抗体をＦＡＣＳ緩衝液中のそれぞれ対応するチューブに添加した。次いで、試料を３０分間氷上で暗闇でインキュベーションした。上記のように細胞を洗浄後、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液／チューブ／試料中で再懸濁した。
ＦＩＴＣ接合親和性精製Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギ抗ヒト−ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂカタログ番号１０９−０９６−００６；５μｇ／ｍＬで使用）を用いて細胞結合Ｆａｂを検出し、Ｆ（ａｂ’）２ ＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０９６−０６２；５μｇ／ｍＬで使用）を用いて陽性マウス対照の抗体を検出した。生細胞決定のため細胞をヨウ化プロピジウム染色溶液（死細胞除去用のＰＩ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５１−６６２１１Ｅまたは５５６４６３；ＦＡＣＳ緩衝液中で最終１：５００で使用）で染色した。試料をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で採集した１０，０００生イベント／試料により流した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４．０ソフトウェアを用いてデータ分析を行った（ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ） （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．， １１４５２ Ｅ１ Ｃａｍｉｎｏ Ｒｅａｌ， ＃２１５， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． ９２１３０ ＵＳＡ）。
試料を分析して幾何平均を決定後、抗体濃度（Ｘ軸）に対する幾何平均（Ｙ軸）を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ）グラフ化プログラムを用いて常用対数でグラフ化した。次いで、データセットをＸ＝対数（Ｘ）（Ｘ値データセット＝抗体濃度）に転換して、非直線回帰曲線近似、Ｓ字形の用量反応によってグラフ化した。Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈソフトウェアを用いてＥＣ５０値およびＲ２値を得た。
実施例１のスクリーニングから同定された２４個のＦａｂの特異性を確認するため、複数の濃度でヒトＨＥＲ２−ＣＨＯ細胞およびトランスフェクションしないＣＨＯ細胞上でＦＡＣＳにより試験した（データは示していない、表１）。
１２個のＦａｂ（６５Ｂ０３、６５Ｃ１０、６５Ｈ０９、６６Ａ１２、６６Ｃ０１、６７Ａ０２、６７Ｃ１２、６７Ｆ１０、６７Ｆ１１、６９Ａ０９、７１Ａ０６および７１Ｆ１０）がＣＨＯ細胞上で発現した野生型ＨＥＲ２／ＥｒｂＢに対して良好な結合活性を示した。ＦａｂをＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞系上で試験した（ＥＧＦＲ＋、ＨＥＲ２−）；結合は検出されず、これらのＦａｂはＨＥＲ２特異的であることが示された。ＥＣ５０概算値を算出するために、完全滴定をＭＣＦ７およびＳＫＢＲ３腫瘍細胞系、ヒトＨｅｒ２−ＣＨＯおよびマウスＨｅｒ２−ＣＨＯ細胞系上で実施した（データは示していない、表１の概要を参照されたい）。１２個のＦａｂをまた、完全長マウスＨＥＲ２およびカニクイザルＨＥＲ２で安定にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞上でも試験した；１個のＦａｂ（７１Ｆ１０）がマウスＨＥＲ２に結合することが見出され、９個がカニクイザルＨＥＲ２に結合することが見出された（表１）。
（実施例３）
ＥＬＩＳＡにより測定されたヒトおよびマウスＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２へのＦａｂの結合活性
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、Ｆａｂの野生型ｈＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２およびｍＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２への結合能を決定した。
９６ウェルマイクロタイターＩｍｍｕｌｏｎＩＩプレート（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１４２４５−６１）を１００μＬ／ウェルの２μｇ／ｍＬ非標識Ｇｔ−抗ｈｕ ＩｇＧまたは非標識Ｇｔ−抗ｈｕκ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ番号２０４０−０１；２０６０−０１）のＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．５）で４℃で一晩コーティングし、プレートからコーティング緩衝液を廃棄した。次工程では、１００μＬの希釈緩衝液（０．５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液＋０．０１％チメロサール）および１００μＬの個々の上清または精製したタンパク質の希釈緩衝液を複製ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。水道水で洗浄後、Ｇｔ−抗ｈｕκ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ番号２０６０−０５）の１／１０，０００希釈の希釈緩衝液１００μＬをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。洗浄後、ＨＲＰＯ基質結合したＴＭＢペルオキシダーゼ基質／ペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｋｉｒｄｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ、Ｃａｔ．５０−７６−００）１００μＬ／ウェルを添加した。反応を、１００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４で５〜１０分後に停止した。分子機器プレートリーダーを用いて４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでＯＤを測定し、結合曲線を作成した。
２４個中２２個のＦａｂが、野生型ｈＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２に対し中等度／強度の結合活性を示した（データは示していない、表１）。Ｆａｂ７１Ｆ１０のみが野生型ｍＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２に対し中等度／強度の結合活性を示した（データは示していない、表１）。
（実施例４）
抗体交差反応性
カニクイザルＨＥＲ２ ｃＤＮＡを、カニクイザル腎臓の腎臓ｍＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｉｎｃ， Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡ）からＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーは、カニクイザルＨＥＲ２細胞外ドメイン順行プライマーに対して、
ＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号１５９）；逆行プライマーにおいて
ＴＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣ（配列番号１６０）；細胞内ドメインにおいて：順行プライマー：ＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧ（配列番号１６１）；逆行プライマー：ＣＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＧ（配列番号１６２）である。増幅ＰＣＲ生成物をＴＡクローニングベクター、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、配列した。完全長カニクイザルＨＥＲ２ ｃＤＮＡを細胞外および細胞内ドメイン配列の両方からＢｓｍＢ Ｉ部位に集めた。プラスミドをｐＣＲ２．１カニクイザルＨＥＲ２と名付けた。
細胞系内でカニクイザルＨＥＲ２を発現させるため、ＨＥＲ２ ｃＤＮＡをＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＣＲ２．１カニクイザルＨＥＲ２から消化し、ｈＣＭＶプロモーターの制御下、レンチウイルスベクタープラスミド中にクローン化した。レンチウイルスベクターを産生し、培養上清を用いてＨＥＫ２９３細胞を形質導入した。
マウスＨＥＲ２を発現するＣＨＯ細胞系を確立するために、マウスＨＥＲ２コード配列をマウスＨＥＲ２ ｃＤＮＡ（ＭＧＣ：６２４４７ ＩＭＡＧＥ：５７０）含有プラスミドからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマー：順行プライマー：ＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＣ（配列番号１６３）；および逆行プライマー：ＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＴＧＡＣＣ（配列番号１６４）。ＰＣＲ生成物を哺乳類発現ベクターｐＶ９０に挿入した。生成プラスミドをｐＫＪＳ４６２．２１と名付けた。ｐＫＪＳ４６２．２１ＤＮＡをＤＧ４４−１ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションし、１０％透析ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ番号ＳＨ３００７９．０３）含有α−ＭＥＭ中で培養することにより安定した統合のために選択した。大量の安定した集団をサブクローン化し、高レベルのＨＥＲ２（３Ｇ１１Ｂと名付けられた）を発現する単クローンをＦＡＣＳを用いてｍＨｅｒ２に対するＦａｂ交差反応分析のために選択した。この細胞系は一般にＣＨＯ／ｍＨｅｒ２と称した。
ラットＨｅｒ２との交差反応性をＦＡＣＳ分析により（ラットＨＥＲ２遺伝子導入マウス由来）Ｔｕｂｏ癌細胞を用いて分析した。
レンチウイルスベクタープラスミド構築
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット、Ｔｅｔ抑制遺伝子を複数のクローニング部位と置換して、ＢａｍＨ１をＥｃｏＲ１部位に架橋することにより、Ｖ４８０−２０のｐＬｅｎｔｉ６／ＴＲを修飾した。センスオリゴＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧ（配列番号１１５）をアンチセンスＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧ（配列番号１１６）とアニーリングし、ＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１を消化した背骨に結紮した。このプラスミド（ＣＫ０７２）は、ブラストサイジン耐性マーカーを促進するＳＶ４０プロモーターとＣＭＶプロモーターの複数のクローニング部位下流を含む。カニクイザルＨＥＲ２遺伝子を、細胞外部分のためにオリゴＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧ（配列番号１１７）およびアンチセンスＣＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＣ−ＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＧ（配列番号１１８）を用いて、細胞内部分のためにＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧ（配列番号１１９）およびアンチセンスＴＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣ（配列番号１２０）を用いてシークエンシングのために２片にＰＣＲした。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＫ４５００−０１）中にＴＡ−ＴＯＰＯクローン化して配列化した。最終的に、細胞外および細胞内プラスミド（ＢｓｍＢ１部位で結合）からコンセンサスのカニクイザルＨｅｒ２配列を組み立て、Ｓｐｅ１／Ｘｂａ１消化により切除し、上記ＣＫ０７２の下流Ｘｂａ１部位中に結紮した。生成レンチウイルスベクタープラスミド（ＣＫ０９０．１８）を用いて標的細胞系におけるカニクイザルＨＥＲ２の過剰発現ベクターを生成した。
ベクター産生および形質導入
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号１１６６８−０１９）の製造業者の説明書に従い、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号Ｒ７００−０７）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖｉｒａｐｏｗｅｒパッケージング混合（Ｋ４９７５−００）および上記レンチウイルスベクタープラスミドＣＫ９０．１８で共トランスフェクションした。培養上清を４８時間後に回収し、細胞片１２５０ｇを１０分間ペレットし、清澄上清０．４５μをろ過した。上清をＨＥＫ２９３細胞に適用してベクターのカニクイザルＨｅｒ２トランス遺伝子送達能を検証した。安定に形質導入したＨＥＫ２９３細胞は、陽性および陰性細胞の混合集団の一部において高レベルの導入遺伝子発現を示した。
交差反応性試験
形質導入したＨＥＫ２９３細胞および形質導入していないＨＥＫ２９３細胞集団貯留物を様々なＦａｂで処理し、視覚化のため、ＦＩＴＣ接合二次抗体で以下のとおり染色した。簡単に述べると、カニクイザルＨｅｒ２発現ＨＥＫ２９３細胞をＣＣ２でコーティングした８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ番号１５４９４１）でプレートし、インキュベーター中で一晩結合させた（５％ＣＯ２、３７℃）。増殖培地を５０〜７５μＬのＤｙａｘ Ｆａｂ（１０ｍｇ／ｍＬ）で置換し、これらを４℃で９０分間結合させた。細胞を希釈緩衝液（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）ですすぎ洗いしてから、４％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で室温で２０分間固定した。固定細胞をすすぎ洗いし、第二の接合抗体と４℃で４５分間インキュベーションした。二次抗体溶液は、ＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトκ鎖およびヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２特異的断片（それぞれ、Ｓｉｇｍａ番号Ｆ３７６１およびＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ．番号１０９−０９６−０９７）の５０：５０混合であった。ウェルを希釈緩衝液ですすぎ洗いして、結合していない抗体を除去した後、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡で観察した。
結果：試験用に選択したＦａｂ １２個中９個がカニクイザルＨＥＲ２との交差反応を示した（表１）。１個のＦａｂ（７１−Ｆ１０）が、ｍＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２に対する中等度の結合交差反応性を示した（表１）ことがこの測定において確認された。７１Ｆ１０はラットＨＥＲ２とも交差反応を示した（データは示していない）。
（実施例５）
ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２ Ｆａｂエピトープマッピング
システイン対合したヒトＥｒｂＢ２ ＥＣＤ（配列番号１０５）およびアカゲザルＥｒｂＢ２ ＥＣＤ（配列番号１０６）のアミノ酸配列を図４に示す。ヒトとアカゲザル間で異なる残基を強調表示している。可能なＮ−グリコシル化部位を下線で示す。
ヒトＥｒｂＢ２コードＤＮＡ断片をＰＣＲによりｐＬＸＳＮ−ＨＥＲ２から得た。ｈｕＩｇＧ１−Ｆｃとの枠中の各ＥｒｂＢ２ ＤＮＡ断片（ヒトＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２ ＥＣＤの（Ｔｈｒ１〜Ｔｈｒ１９６（ドメイン１）、Ｔｈｒ１〜Ａｒｇ３１８（ドメイン１〜２）、Ｔｈｒ１〜Ａｓｎ５０８（ドメイン１〜３）またはＴｈｒ１〜Ａｓｎ６３０（ドメイン１〜４）残基）をＰＶ９０ベクター中へクローニングすることにより、ＣＨＯ細胞中の発現用のＥｒｂＢ２−Ｆｃベクターを生成した。このタンパク質構築物を、ＭＲ０６６（ドメイン１）、ＭＲ０６７（ドメイン１〜２）、ＭＲ０６８（ドメイン１〜３）およびＭＲ０６９（完全長ＥＣＤ）と命付ける。
タンパク質を２９３Ｅ哺乳類細胞中で一過性で発現させた。３７℃で培養４日後、細胞上清を回収し、タンパク質Ａセファロース上でろ過して精製した。タンパク質を２５ｍＭのＨ３ＰＯ４／ＮａＯＨ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．８でカラムから溶出し、１／２０容積の０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．６で直ちに中和した。タンパク質の純度および凝集度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的ＳＥＣにより評価した。タンパク質濃度を、各タンパク質において２８０ｎｍの配列予想吸光係数を用いたＵＶ吸光度により決定した。
６５Ｂ０３、６６Ｃ０１、６７Ｆ１０、６７Ｆ１１、７１Ｆ１０、６９Ａ０９、６６Ａ１２、６５Ｃ１０、６５Ｈ０９および６７Ａ０２ Ｆａｂおよび対照の抗ＨＥＲ２抗体のＭＲ０６６、ＭＲ０６７、ＭＲ０６８およびＭＲ０６９への結合能をＥＬＩＳＡにより決定した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍＬウサギｐＡｂ抗ヒトＦｃγのＰＢＳ溶液で４度で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄し、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で室温で１時間遮断した。プレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、１μｇ／ｍＬのＨＥＲ２−Ｆｃ融合タンパク質で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、遮断中のＦａｂの希釈液（１μｇ／ｍＬで開始した、４つの５倍連続希釈液）を添加して、９０分間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１：２，０００ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃａｔ番号２０６０−０５）およびＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトλ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃａｔ番号２０７０−０５）の遮断液で室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ溶液で５分間発現させ続けてから、同量の１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止した。吸光値を４５０ｎｍで読み込んだ。結果を図５に示す。
（実施例６）
Δ４；Ｇ４ＳΔ４（配列番号１４７）および（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３４）リンカーを用いた７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物の構築
７１Ｆ１０成熟重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のタンパク質配列を、それぞれ配列番号１１および１３で示す。７１Ｆ１０重鎖および軽鎖のＣＤＲ（カバット指定に基づく、相補性決定領域）を、それぞれ配列番号４７〜４９および７４〜７６で示す。７１Ｆ１０ ＶＨ（配列番号１１の１〜９７残基）とＨＶ３−２３ ＶＨ（配列番号１０７の１〜９７残基）との間のアミノ酸配列の一部の整列は、９３％（９１／９７）同一性および９５％（９３／９７）陽性（パラメータ：長さ＝９８、スコア＝１８６ビット（４７１）、および期待値＝３ｅ−０５０）を示す。ＨＶ３−２３とは、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ９９６６０のヒト生殖系列ＨＶ３−２３配列を指す。７１Ｆ１０ ＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１５６および１４で示す。７１Ｆ１０ ＶＨのヌクレオチド配列（配列番号１５６）を哺乳類細胞発現のためにコドン至適化する。ＨＶ３−２３ ＶＨのアミノ酸およびヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１０７および１０８で示す。
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ構築スキームを以下に記載する。
７１Ｆ１０ ＶＬ領域を、１１０−Ｆ１（配列番号１２１）、Ｃ０６−５’（配列番号１２２）および０３９−ＶＬＲ（配列番号１２３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅により合成した。順行プライマー１１０−Ｆ１（配列番号１２１）（Ｎｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１８０））を含む）からなる５’ＶＬ ＰＣＲプライマーに、一部の軽鎖シグナルペプチドをコードする配列、および一部の軽鎖シグナルペプチドをコードする内部順行プライマーＣ０６−５’（配列番号１２２）が続き、７１Ｆ１０ ＶＬのアミノ末端に相補的な配列が続く。３’ＶＬ ＰＣＲプライマー０３９−ＶＬＲ（配列番号１２３）は、ＢｓｉＷ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＧＴＡＣＧ（配列番号１８１））および７１Ｆ１０ ＶＬのカルボキシル末端をコードする配列を含む。７１Ｆ１０ＶＬ含有プラスミドＤＮＡ ＣＰＧ１６９由来のこれら３個のＰＣＲプライマーを用いて、軽鎖シグナルペプチドをコードする一般的な重複配列を通して、７１Ｆ１０ ＶＬ領域を２つの連続ＰＣＲ反応において増幅した。ヒトκドメインのアミノ末端にＢｓｉＷ Ｉ部位を含む修飾ｐＶ１００ベクターを消化したＮｏｔ Ｉ／Ｂｓｉｗ Ｉ中に７１Ｆ１０ ＶＬ遺伝子断片をクローン化した。正確な配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
７１Ｆ１０ ＶＨ領域を、ポリペプチド配列を変更せずにヒト免疫グロブリンＶＨデータベースからのコンセンサスコドンと置き換え、同義コドン変換により推定上の潜在性スプライスドナーおよびアクセプター部位を除去することにより記録した。記録した７１Ｆ１０ ＶＨ領域を、ＶＨ−ＦＲ１−Ｆ（配列番号１２４）、ＶＨ−ＦＲ２−Ｒ（配列番号１２５）、ＶＨ−ＦＲ３−Ｆ（配列番号１２６）、７１Ｆ１０ＶＨ−ＣＤＲ１−Ｆ（配列番号１２７）、７１Ｆ１０ＶＨ−ＣＤＲ２−Ｆ（配列番号１２８）、７１Ｆ１０ＶＨ−ＣＤＲ３＋ＦＲ４−Ｒ（配列番号１２９）、ＶＨ−ｐＶ９０−Ｆ（配列番号１３０）、およびＶＨ−ｐＶ９０−Ｒ（配列番号１３１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて会合体ＰＣＲ増幅により合成した。第一ＰＣＲ工程において、３個のオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）の２セットをアニーリングして伸長し、半分の長さの生成物を産生した。記録した７１Ｆ１０ ＶＨの５’半分を、７１Ｆ１０ ＶＨフレームワーク１領域をコードするヌクレオチド配列からなる順行５’プライマーＶＨ−ＦＲ１−Ｆ（配列番号１２４）、７１Ｆ１０ ＶＨ ＣＤＲ１領域をコードするヌクレオチド配列からなる順行５’プライマー７１Ｆ１０ＶＨ−ＣＤＲ１−Ｆ（配列番号１２５）、７１Ｆ１０ ＶＨフレームワーク２領域をコードするヌクレオチド配列からなる逆行３’プライマーＶＨ−ＦＲ２−Ｒ（配列番号１２６）を用いたＰＣＲにより生成した。記録した７１Ｆ１０ ＶＨの３’半分を、７１Ｆ１０ ＶＨ ＣＤＲ２領域をコードするヌクレオチド配列からなる順行５’プライマー７１Ｆ１０ＶＨ−ＣＤＲ２−Ｆ（配列番号１２７）、７１Ｆ１０ ＶＨフレームワーク３領域をコードするヌクレオチド配列からなる順行５’プライマーＤｙａｘＶＨ−ＦＲ３−Ｆ（配列番号１２８）、７１Ｆ１０ ＶＨ ＣＤＲ３およびフレームワーク４領域をコードするヌクレオチド配列からなる逆行３’プライマー７１Ｆ１０ＶＨ−ＣＤＲ３＋ＦＲ４−Ｒ（配列番号１２９）を用いたＰＣＲにより生成した。第二ＰＣＲ工程において、完全長の記録した７１Ｆ１０ ＶＨ遺伝子配列を、所望の完全長生成物に特異的なプライマーを用いて第一ＰＣＲ工程の２つの混合物から選択的に増幅する。５’順行プライマーであるＶＨ−ｐＶ９０−Ｆ（配列番号１３０）は、独特なＭｌｕ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＣＧＣＧＴ（配列番号１６０））を含み、重鎖シグナルペプチドの最後の３個のアミノ酸をコードする配列が続き、記録した７１Ｆ１０ ＶＨのアミノ末端に相補的な配列が続き、Ｎｈｅ Ｉ部位（ＧＣＴＡＧＣ（配列番号１８２））および記録した７１Ｆ１０ ＶＨのカルボキシル末端に相補的な配列を含む３’逆行プライマーであるＶＨ−ｐＶ９０−Ｒ（配列番号１３１）が続く。記録した７１Ｆ１０ ＶＨ遺伝子断片を、合成重鎖リーダー配列およびＭｌｕ Ｉ部位、続いてＢａｍＨ Ｉ部位をＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ末端に含む修飾ｐＶ９０ベクターを消化したＭｌｕ Ｉ／ＮｈｅＩ中にクローン化した。正確な配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
３個の異なるリンカー（配列番号１３２〜１３４）を用いて、７１Ｆ１０ Ｆａｂ重鎖をｈｕＬＩＧＨＴのアミノ末端に結合させた。これらのリンカーのアミノ酸配列をΔ４（配列番号１３２）、Ｇ４ＳΔ４（配列番号１３３）、および（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３４）に示す。至適リンカーの長さは、以下のとおり決定した。
１．Ｆａｂの最初の３Ｄ構造を、ヒトＩｇＧの結晶構造（ｐｄｂ：１ＨＺＨ）に基づき、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ９を用いた相同モデリングを通して構築した。５つのシステイン対合を拘束してジスルフィド結合を形成させた。ＴＮＦβ／ＴＮＦ−Ｒ ｐ５５（ｐｄｂ：１ＴＮＲ）の結晶構造に基づき、３Ｄ ＬＩＧＨＴ／ＬＴβＲ構造を構築した。
２．三量体Ｆａｂ構造を社内プログラムを用いてＣ３対称で構築した。
３．エネルギー分析を、三量体ＦａｂとＬＩＧＨＴ／ＬＴβＲとの間の距離を、Ｃ３軸を整列させて、変更することにより実施した。ｄは、ＬＩＧＨＴ／ＬＴβＲの１点（Ｆａｂ軸とＣ３軸の交点）と閉塞点（表面とＣ３軸の交点）との間の距離である。ｖｄＷ相互作用エネルギーを各構造で算出した。２５Ａは最短距離である；そうでなければ、三量体ＦａｂとＬＩＧＨＴとの間で著しく反発する；相互作用エネルギーは４０Ａを超えると０である。我々のリンカー至適化モデルにおいて、開始の幾何構造として４０Ａを選別した。
４．Ｍｏｄｅｌｌｅｒを用いて、４個の異なるリンカー：（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５１）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３４）、Δ４（天然ＬＩＧＨＴリンカー）、Ｇ４Ｓ＋Δ（配列番号１４７）を構築し、評価した。結果は、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５１）は短すぎ、他の３個は適切な長さのリンカーであることを示した。
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖を、ＰＣＲ反応において５’順行＋３’逆行ＰＣＲプライマー、および３個の異なるリンカーをコードする内部重複ＰＣＲプライマーセットを用いて、ｈｕＩｇＧ１含有プラスミドＤＮＡ Ｎ５ＫＧ１およびｈｕＬＩＧＨＴ含有ｐＡＢＦ０４６から構築した。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＭＢ−０４Ｆ（配列番号１３５）、１３０−Ｒ１（配列番号１３６）、１３０−Ｆ２（配列番号１３７）、１３０−Ｒ２（配列番号１３８）、１３１−Ｒ２（配列番号１３９）、１３２−Ｆ２（配列番号１４０）、および１３２−Ｒ２（配列番号１４１）として記載した。簡単に述べると、５’順行プライマーであるＭＢ−０４Ｆ（配列番号１３５）はＡｇｅ Ｉ部位（ＡＣＣＧＧＴ（配列番号１６１））を含み、ＩｇＧ１ ＣＨ１領域に相補的な配列が続く。３’逆行プライマーである１３０−Ｒ１（配列番号１３６）は、ＢａｍＨ Ｉ部位（ＧＧＡＴＣＣ（配列番号１７７））およびｈｕＬＩＧＨＴのカルボキシル末端に相補的な配列を含む。５’順行プライマーである、内部重複ＰＣＲプライマーセットの１３０−Ｆ２（配列番号１３７）および１３２−Ｆ２（配列番号１３８）は、３個の部分的リンカーを含み、続いてｈｕＬＩＧＨＴのアミノ末端に相補的な配列が続く。３’逆行プライマーである、内部重複ＰＣＲプライマーセットの１３０−Ｒ２（配列番号１３９）、１３１−Ｒ２（配列番号１４０）、および１３２−Ｒ２（配列番号１４１）は、部分的なＩｇＧ１ヒンジをコードする配列を含み、３個の部分的リンカーが続く。次いで、ＰＣＲ断片を重複した３個のリンカーをコードする配列を用いた第二ＰＣＲ反応において最終的に集め、Ａｇｅ ＩおよびＢａｍＨ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、７１Ｆ１０ ＩｇＧ１重鎖ベクターを消化したＡｇｅ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ中に結紮した。これにより、７１Ｆ１０ Ｆａｂ重鎖のｈｕＬＩＧＨＴのアミノ末端との融合生成物を得た。正確な配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
一般に、７１Ｆ１０軽鎖ベクター（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１２９）を、７１Ｆ１０Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物において用いた。このＤＮＡ（配列番号１１０）およびアミノ酸（配列番号１０９）を本明細書に開示する。７１Ｆ１０Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１、およびｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）の重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにそれらの物理的および化学的パラメータを、それぞれ配列番号２〜４および６〜８として本明細書に記載する。
７１Ｆ１０アグリＩｇＧ重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３７）を、７１Ｆ１０ ＩｇＧ重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４）を鋳型として用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔ番号２００５１３）を用いて構築した。所望の変異を含むプライマー１３７−Ｆにより、ＣＨ２ドメイン内の２９９位（カバット番号）のトレオニンアミノ酸をアラニンアミノ酸に変化させた。７１Ｆ１０ ＩｇＧ重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５７および１５８で示す。７１Ｆ１０アグリＩｇＧ重鎖（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３７）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５３および１５４で示す。一般に７１Ｆ１０軽鎖ベクター（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１２９）を７１Ｆ１０ ＩｇＧおよび７１Ｆ１０アグリＩｇＧ抗体中で用いた。
７１Ｆ１０アグリＩｇＧ重鎖の部位指向変異誘発に用いたオリゴヌクレオチド（順行５’ＰＣＲプライマー１３７−Ｆ）は、５’−ＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣ−３’（配列番号１５５）であり、これは所望の点変異コドン（下線）を含む。
（実施例７）
抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物、ＢＩＩＢ ＣＤ２３−２０４の構築
抗ＣＤ２３ＶＨ領域を２０４−Ｆ（配列番号１４２）およびＤｙａｘＶＨ−ｐＶ９０−Ｒ（配列番号１４３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅により合成した。５’順行プライマーである２０４−Ｆ（配列番号１４２）は、固有のＭｌｕ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＣＧＣＧＴ（配列番号１６０）を含み、重鎖シグナルペプチドの最後の３個のアミノ酸をコードする配列が続き、抗ＣＤ２３ ＶＨのアミノ末端に相補的な配列が続く。３’逆行プライマーであるＤｙａｘＶＨ−ｐＶ９０−Ｒ（配列番号１４３）は、Ｎｈｅ Ｉ部位（ＧＣＴＡＧＣ（配列番号１８２）および抗ＣＤ２３ ＶＨのカルボキシル末端に相補的な配列を含む。抗ＣＤ２３ ＶＨ領域を抗ＣＤ２３ ＶＨ遺伝子含有プラスミドＤＮＡ ｐＢＩＩＢ ＣＤ２３−１２１からＰＣＲ反応において増幅した。抗ＣＤ２３ ＶＨ遺伝子断片を、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２を消化したＭｌｕ Ｉ／Ｎｈｅ Ｉ中にクローン化した。ＤＮＡ配列分析により正確な配列を確認した。生成したベクターはｐＢＩＩＢＣＤ２３−２０４と名付けた。抗ＣＤ２３軽鎖ベクター（ｐＢＩＩＢＣＤ２３−１７８）を抗ＣＤ２３Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合に用いた。抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物の軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０４および１０３で示す。抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物（ｐＢＩＩＢＣＤ２３−２０４）の重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７３および１７４で示す。７１Ｆ１０ Ｆａｂの重鎖に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列はＮ末端から開始し、結合基に対応するアミノ酸（２２４〜２４３位のアミノ酸）が続き、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインに対応するアミノ酸（２４４〜３９１位のアミノ酸）が続くことが示される。
評価のために、第二の抗ＣＤ２３Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物も（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１４８）リンカーにより作製した（データは示していない）。（Ｇ４Ｓ）３リンカーによる抗ＣＤ２３ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物の軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０４および１０３で示す。（Ｇ４Ｓ）３リンカーによる抗ＣＤ２３ ＦＡｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物の重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０２および１０１として示す。７１Ｆ１０ Ｆａｂの重鎖に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列はＮ末端から開始し、結合基に対応するアミノ酸（２２２〜２３６位のアミノ酸）が続き、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインに対応するアミノ酸（２３７〜３８４位のアミノ酸）が続くことが示される。
（実施例８）
ＣＨＯ細胞中の７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物の発現
発現用に用いた７１Ｆ１０構築物の概要を図６に示す。
ＣＨＯ細胞中の７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴの一過性発現
宿主ＤＧ４４懸濁細胞をＣＤ−ＣＨＯ（２５％）およびＤＭＥＭ／Ｆ１２（７５％）中で維持し、２つの同一トランスフェクションを実行した。各トランスフェクションにおいて、細胞を６ウェルプレートで７．５×１０５細胞／ウェルで播種し、２４時間培養した；次いで、細胞を、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造プロトコルに従って用いて、１μｇのｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１２９（ｐＶ１００における軽鎖）および１μｇのｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４またはｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３７（ｐＶ９０における重鎖）でトランスフェクションした。元のＶＨ配列の７１Ｆ１０ ＩｇＧ１アグリ重鎖を含むＲＲ３９９ベクターをＣＨＯ細胞発現における対照として用いた。４８時間後、上清を回収して、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）と製造プロトコルの定量化方法に応じた代替的な標準により力価を決定した。一過性トランスフェクションからの７１Ｆ１０Ｆａｂ／Ｈｌｉｇｈｔ融合物力価は、０．０６μｇ／ｍＬ（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３７）、１．６μｇ／ｍＬ（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４）、０．９μｇ／ｍＬ（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０）、０．２μｇ／ｍＬ（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１）、および１．０μｇ／ｍＬ（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）である。
ＣＨＯ細胞中７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴの安定した発現
宿主ＤＧ４４懸濁細胞をＣＨＯ−ＳＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持し、２つの同一トランスフェクションを実行した。各トランスフェクションにおいて、細胞を６ウェルプレートで７．５×１０５細胞／ウェルで播種し、２４時間培養した；次いで、細胞を、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造プロトコルに従って用いて、１μｇのｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１２９（ｐＶ１００における軽鎖）および１μｇのｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２、ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４またはｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３７（ｐＶ９０における重鎖）でトランスフェクションした。４８時間後、２つのトランスフェクション由来の細胞を合わせ、３個のＴ−７５フラスコ中にそれぞれ１５ｍＬのＣＨＯ−ＳＳＦＭＩＩを含むように分け、４００μｇ／ｍＬのｇｅｎｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充した。２または３週間の選択後、産生行程のために、選別したまたは選別しない細胞貯留物のいずれかを、ＣＨＯ−ＳＳＦＭＩＩ中で４００μｇ／ｍＬのｇｅｎｔｉｃｉｎで、その後ＢＣＭ１６中で４００μｇ／ｍＬのｇｅｎｔｉｃｉｎで拡大した。行程最終時、上清を回収して、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）と代替的な標準により力価を決定した。
Ｏｃｔｅｔ測定法
生体層干渉法（Ｏｃｔｅｔ ＱＫ Ｓｙｓｔｅｍ， ＦｏｒｔeＢｉｏ， Ｉｎｃ． Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）によるＦａｂ−ＬＩＧＨＴ融合物の分析。抗ヒトＦｃ特異的バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＳＫＵ １８−０００１）を、ＯＢ（１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３、および０．０２％ＴＷＥＥＮ２０で補充した１×ＰＢＳ）中で測定前少なくとも５分間水和した。各測定において、それぞれの受容体-Ｆｃ融合物を１０μｇ／ｍＬのＯＢ溶液に希釈し、５分間バイオセンサーに結合させた。次いで、センサーを指定の培養上清中でさらに５分間インキュベーションし、続いて新規のウェル含有に移した。対照として、７１Ｆ１０ ＦＡｂ（ＯＢ中の１０μｇ／ｍＬ）の動向もこの測定において評価した。製造業者により提供されたソフトウェアを用いて解離定数（ｋｄ）を算出し、解離速度を７１Ｆ１０ Ｆａｂのｋｄと比較した。
（実施例９）
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質の精製
ＣＨＯ細胞中で産生した融合タンパク質を精製し、これは下記の方法を特徴とする。
タンパク質Ａ捕獲：タンパク質Ａカラムを１×ＰＢＳ（平衡緩衝液）、１００〜１５０ｃｍ／時間で３カラム容積で前平衡化する。上清を１５０ｃｍ／時間、最大１０ｍｇの７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ／ミリリットルの樹脂で負荷する。負荷後、５カラム容積の平衡緩衝液でカラムを洗浄する。次いで、上方向で、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０での溶出段階に移る。所望の画分を採集し、２Ｍトリス塩基を滴定して中性ｐＨとする。採集した画分を１×ＰＢＳに対して透析し、材料を濃縮してサイズ排除工程用に調製する。
ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００（サイズ排除）凝集物除去工程は、流速３６ｃｍ／時間、１．５カラム容積の１×ＰＢＳによるＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００の平衡化と、その後のタンパク質負荷および所望の画分採集を含む。
同一性の試験を以下のとおり実施する。
１）．質量分析による無傷質量分析で、分子質量測定をエレクトロスプレー質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳＤ）上で実施した。分析前、試料を還元してジスルフィド結合を除去した。逆重畳質量スペクトルは重鎖および軽鎖の質量を示す。
２）．Ｎ末端配列分析を、オンラインＰＴＨアナライザーを備えたＡＢＩタンパク質シークエンサーを用いたエドマン分解により実施した。軽鎖および重鎖の最初のアミノ酸の配列を同定した。
３）．質量分光分析によるペプチドマッピング：各ペプチドから生成したＬＣ／ＭＳデータ分析により完全な配列範囲を得るために、トリプシンまたは／およびＥｎｄｏＬｙｓＣペプチドマップを実施した。加えて、酸化および脱アミド化の部位決定および定量を検出した。
純度試験を以下により実施した：１）ＳＤＳ−ＰａｇｅまたはＣＥ−ＳＤＳ：還元した試料、および還元しない試料、この技術を用いて、抗体の断片化、凝集および不純度を測定する、２）ＬＳおよびＲＩ技術によるＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて凝集および断片化を測定した。またＬＩＧＨＴ散乱により試料成分のモル質量が決定される。３）ＳＤＳゲルまたはキャピラリーＩＥＦ方法を用いて、ＣおよびＮ末端の異質性および／または脱アミドに起因し得る電荷アイソフォームの等電点電気泳動パターンおよびｐＩ分布を決定した。
最終的に、カブトガニの血球抽出物（ＬＡＬ）反応速度濁度滴定方法によりエンドトキシン濃度を測定した。
（実施例１０）
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質の結合活性
２９３Ｅ細胞により一過性で発現させた７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質および７１Ｆ１０ ｍＡｂの濃度を、標準として精製した７１Ｆ１０ Ｆａｂを用いたＥＬＩＳＡにより定量化した。ヒトκ鎖に対するヤギ抗体（５μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液の８０μＬ／ウェル）で４〜８℃で一晩インキュベーションすることにより、９６ウェルプレートのウェルをコーティングした。ウェルを空にし、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ブロッキング緩衝液）で完全に充填し、室温で１時間インキュベーションした。ウェルを空にし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）含有ＰＢＳで２回洗浄し、別の９６ウェルプレートで調製した試料（標準の３倍連続希釈および上清のブロッキング緩衝液８０μＬ／ウェル）で充填した。室温で２時間インキュベーション後、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ接合ヤギｐＡｂ抗ヒトκ鎖溶液（２０００倍希釈ブロッキング緩衝液８０μＬ／ウェル）で充填した。１時間インキュベーション後、ウェルを空にし、新規に調製したＨＲＰ基質溶液で充填した。発色を３分間継続させてから、同量の１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して止めた。プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。データを加工し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いてグラフを作成した。
類似したＥＬＩＳＡ方式を用いて対照の抗ＨＥＲ２抗体、対照の抗ＨＥＲ２抗体Ｆａｂ、７１Ｆ１０ Ｆａｂ、７１Ｆ１０ ｍＡｂおよび７１Ｆ１０ Ｆａｂ−Ｌｉｇｈｔ融合タンパク質のヒト（図７）またはマウス（図８）ＨＥＲ２−Ｆｃへの結合を比較した。対照の抗ＨＥＲ２抗体をＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｂｕｙｅｒｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．から得た。対照の抗ＨＥＲ２抗体のＦａｂを、限定的なパパイン消化により調製し、標準的な技術を用いて精製した。ヒトおよびマウスＨＥＲ２−Ｆｃ（ＨＥＲ２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ断片からなるホモ二量体融合タンパク質）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。ヤギ抗ヒトκ抗体ではなくマウスまたはヒトＨＥＲ２−Ｆｃでウェルをコーティングした点を除き、上記と同一のプロトコルを用いてＥＬＩＳＡを行った。
（実施例１１）
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ三量体の特性決定
Ｆａｂ、ｍＡｂおよびＦａｂ−Ｌｉｇｈｔ融合タンパク質をタンパク質Ａセファロースおよびサイズ排除上でクロマトグラフィーにより精製し、実質的に凝集のない物質を単離した。精製したタンパク質を、２８０ｎｍのＵＶ吸光度により、配列予想吸光係数を用いて定量化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣにより純度を評価した。生体Ｓｅｐ ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）のＰＢＳ溶液と屈折指標検出器（Ｗａｔｅｒｓ）に連結したＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ機器および光散乱検出器（ＰＤ２０００、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ）を用いてＳＥＣ／静的光散乱分析により分子質量を測定した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒソフトウェアを用いて、平均分子質量を決定した（図９）。
（実施例１２）
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ／ｓｈｕＬＴβＲ複合体のＳＥＣ／ＬＳ分析
可溶性ヒトＬＴβＲ（ｓｈｕＬＴβＲ）を、ヒトＬＴβＲ−Ｉｇの限定的なタンパク質消化により調製し、タンパク質ＡセファロースおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ上でクロマトグラフィーにより精製した。７１Ｆ１０ Ｆａｂ−（Ｇ４Ｓ）４−ＬＩＧＨＴ（配列番号１３４）を５倍モル過剰のｓｈｕＬＴβＲと共に４〜８℃で一晩インキュベーションした。各タンパク質と対照も含んだ。試料を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ機器とＢｉｏＳｅｐ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）のＰＢＳ溶液を用いたＳＥＣにより分析した。結果により、より高分子量の複合体形成が示され、Ｆａｂ−Ｌｉｇｈｔは受容体に結合可能であることが示された（データは示していない）。光散乱分析データの精度では、１個のＦａｂ−Ｌｉｇｈｔ三量体に対して２または３個のｓｈｕＬＴβＲである正確なストイキオメトリーの算出はできなかった。
（実施例１３）
ＥＬＩＳＡにより測定された、精製したＬＩＧＨＴ融合タンパク質ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２の受容体への結合
７１Ｆ１０ ＦａｂまたはＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２のＬＩＧＨＴ融合タンパク質（連続希釈液）のヒトまたはマウスＨＥＲ２−Ｆｃへの結合を、ＥＬＩＳＡにより試験した。ヒトおよびマウスＥｒｂＢ２−ＦｃをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。これら６つのタンパク質（０．２または２μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液の８０μＬ／ウェル）のいずれかで４〜８℃で一晩インキュベーションすることにより、９６ウェルプレートのウェルを２μｇ／ｍＬまたは０．２μｇ／ｍＬのヒトまたはマウスＨＥＲ２−Ｆｃでコーティングした。ウェルを空にし、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ブロッキング緩衝液）で完全に充填し、室温で１時間インキュベーションした。ウェルを空にし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で２回洗浄し、別の９６ウェルプレートで調製した試料（標準の３倍連続希釈および上清のブロッキング緩衝液８０μＬ／ウェル）で充填した。室温で２時間インキュベーション後、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ接合ヤギｐＡｂ抗ヒトκ鎖溶液（２０００倍希釈したブロッキング緩衝液８０μＬ／ウェル）で充填した。１時間インキュベーション後、ウェルを空にし、新規に調製したＨＲＰ基質溶液で充填した。発色を３分間継続させてから、同量の１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して止めた。Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いて、データを処理し、グラフを作成した。結果により、ＬＩＧＨＴ融合物のＨＥＲ２結合活性はＨＥＲ２受容体濃度に依存すること、すなわち、コーティングしたプレート上にＨＥＲ２抗原が豊富に存在した場合（２μｇ／ｍＬ）、より高親和性であることが示された。結果を図７および８に示す。
ヒトまたはマウスＬＴβＲ−ＩｇへのＦｌａｇ−ｈｕＬＩＧＨＴ（対照）もしくはＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２ ＬＩＧＨＴ融合物（連続希釈液）の結合を、２μｇ／ｍＬまたは０．２μｇ／ｍＬのヒトまたはマウスＬＴβＲ−Ｉｇでプレートをコーティングし；ならびにＨＲＰ接合抗Ｆｌａｇ ｍＡｂまたはヤギ抗ヒトκｐＡｂを用いた点を除き上記プロトコルを用いてＥＬＩＳＡにより試験した（図１０Ａおよび１０Ｂならびに表２）。ヒトおよびマウスＬＴβＲ−Ｉｇを自家発現および精製した。高受容体密度時、７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴはｈＬＴβＲおよびｍＬＴβＲの両方に対して高親和性を示した。低受容体密度時、７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴはｈＬＴβＲに対して高親和性を示し、ｍＬＴβＲに対して中等度の親和性を示した。
ヒトまたはマウスＨＶＥＭ−Ｉｇ（ヘルペスウイルス侵入メディエーターＩｇ）へのＦｌａｇ−ｈｕＬＩＧＨＴ（対照）もしくはＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２（連続希釈液）の結合を、２μｇ／ｍＬまたは０．２μｇ／ｍＬのヒトまたはマウスＬＴβＲ−Ｉｇでプレートをコーティングし；ならびにＨＲＰ接合抗Ｆｌａｇ ｍＡｂまたはヤギ抗ヒトκｐＡｂを用いた点を除き上記プロトコルを用いてＥＬＩＳＡにより試験した（図１１Ａおよび１１Ｂならびに表２）。ヒトおよびマウスＨＶＥＭ−Ｉｇを自家発現および精製した。
７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質の結合活性を表２に要約する。
（実施例１４）
ＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、高Ｈｅｒ２を発現するＳＫＢＲ３細胞に結合する
方法：ＳＫ−ＢＲ−３細胞系をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から得た。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１．５ｍＭのＬ−グルタミンで補充したマッコイ５ａ培地で培養した。ＰＥ接合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２特異的抗体をＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）から購入した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を様々な濃度の７１Ｆ１０−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質（ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１およびＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）に曝露した。抗ＨＥＲ２Ｆａｂ、７１Ｆ１０ Ｆａｂおよび７１Ｆ１０ ＩｇＧ（ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４）を対照として用いた。試料をＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）中で洗浄し、ＰＥ接合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２特異的抗体で対比染色した。最終的に細胞を洗浄してＦＡＣＳ緩衝液中で１％パラホルムアルデヒドと再懸濁した。固定試料を、ＦＡＣＳｃａｎ ｆｌｏｗ微蛍光測定法（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）上の分析に供した。
結果：三量体７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴは、ＳＫＢＲ３細胞に対して、７１Ｆ１０ Ｆａｂに対するより有意に高い結合活性を示した。これはおそらくは結合活性が増大したためである（図１２）。
（実施例１５）
ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＣＨＯ／ｈＨＥＲ２細胞への結合は、ＬＴβＲ−ＩｇまたはＨＥＲ２−Ｆｃのいずれかにより遮断し得る
方法：元のＣＨＯ細胞系をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、実施例４に記載のようにｈＨＥＲ２を発現するように修飾した。高レベルのＨＥＲ２を発現するクローンＫＳ１９を本実験のために選別した。ＫＳ１９細胞を、６ウェル培養プレート中の１０％熱不活性化ＦＢＳで補充したＤＭＥＭ中で培養した。ＫＳ１９細胞を、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２およびＢＩＩＢ７１Ｆ１０−ＭＡＢに、０．２ｎＭの濃度で１時間曝露した。個別の群において、融合タンパク質およびＢＩＩＢ７１Ｆ１０−ＭＡＢをｈＬＴβＲ−Ｉｇ（２０ｍｇ／ｍＬ）またはＨＥＲ２−Ｆｃ（２０ｍｇ／ｍＬ）でプレインキュベーションした。マウス抗ＬＴβＲ ｍＡｂ（ＡＣ Ｈ１６）、ｈＬＩＧＨＴ、および７１Ｆ１０ Ｆａｂを対照として用いた（データは示していない）。試料をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＰＥ接合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２特異的抗体で対比染色した。細胞を最終的に洗浄して、ＦＡＣＳｃａｎ ｆｌｏｗ微蛍光測定法上の分析に供した。
結果：ＣＨＯ／ｈＨＥＲ２細胞に結合した７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、ＬＴβＲ−ＩｇまたはＨＥＲ２−Ｆｃのいずれかにより遮断し得る（図１３）。これらの結果により、ＬＩＧＨＴおよびＨＥＲ２特異的Ｆａｂの両方がＣＨＯ細胞表面上でそれらの受容体に結合可能であることが示唆された。結合は特異的であり、その受容体融合タンパク質、すなわち、ＬＴβＲ−ＩｇまたはＨＥＲ２−Ｆｃタンパク質により競合し得る。遮断効果レベルは、細胞表面上の受容体数によって変わる。ｈＨＥＲ２受容体はＫＳ１０細胞上のＬＴβＲよりさらに豊富であると考えられる。
（実施例１６）
ＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、ＨＥＲ２およびｈＬＩＧＨＴ受容体、ＬＴβＲおよびＨＶＥＭの両方に同時に細胞表面上で結合できる
方法：ＫＳ１９細胞をＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２およびＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４、０．２ｎＭの濃度のＩｇＧに４℃で１時間曝露した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、細胞群をＦＡＣＳ緩衝液単独、ｈＬＴβＲ−Ｉｇ（２０μｇ／ｍＬ）またはＨＶＥＭ−Ｆｃ（２０μｇ／ｍＬ）で３０分間インキュベーションしてから、再度洗浄した。ＦＡＣＳ緩衝液でインキュベーションした群において、細胞をＰＥ接合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２特異的抗体で対比染色した；ｈＬＴβＲ−ＩｇまたはＨＥＲ２−Ｆｃと接触させた群において、細胞をＰＥ接合ヤギ抗ヒトＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で３０分間染色した。細胞を最終的に洗浄し、１％パラホルムアルデヒド含有ＦＡＣＳ緩衝液で固定した。試料をＦＡＣＳｃａｎ ｆｌｏｗ微蛍光測定法上の分析に供した（図１４）。
結果：３個の融合タンパク質の両末端（７１Ｆ１０ ＦａｂおよびＬＩＧＨＴ）は、ＨＥＲ２を認識する７１Ｆ１０ Ｆａｂ部位およびＬＴβＲ−ＩｇもしくはＨＶＥＭ−Ｉｇに結合したＬＩＧＨＴ末端の同時に機能的である。
（実施例１７）
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質によるインビトロのＴ細胞増殖の増進
方法：平底９６ウェルプレートを準至適濃度の抗ＣＤ３ ｍＡｂ（０．２５ｍｇ／ウェル）で４℃で一晩、前コーティングした。未治療Ｂａｌｂ／ｃマウスから単離したナイロンウールカラムで精製したＴ細胞を続いて、様々な濃度のｈＬＩＧＨＴ、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４ ＩｇＧおよび７１Ｆ１０−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質（ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１およびＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）の存在下で３７℃で７２時間培養した。抗ＣＤ２８ ｍＡｂを対照として用いた。［３Ｈ］ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）を最後の１８時間に添加した。プレートをＴｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｍａｃｈ ＩＩＩ Ｍ ｃｅｌｌ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｈａｍｄｅｎ， ＣＮ）を用いて回収し、放射活性をＭｉｃｒｏＢｅｔａ液体シンチレーションおよびルミネセンス計算器（Ｗａｌｌａｃ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて測定した。Ｔ細胞増殖の増強を［３Ｈ］ＴｄＲ取り込み率（％）のプロットにより決定し、１００％とした抗ＣＤ３ ｍＡｂ単独で処理した細胞と比較した。
結果：ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、準至適抗ＣＤ３抗体の存在下、原発性マウスＴ細胞増殖を増強した（図１５）。これらの結果により、融合タンパク質はＴ細胞増殖の活性共刺激分子として残ることが示唆された。抗ＣＤ３の非存在下では、ＬＩＧＨＴ融合タンパク質はＴ細胞増殖に対する活性がないことが示された。
（実施例１８）
７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質による腫瘍細胞増殖の阻害
組換えｈＬＩＧＨＴタンパク質によるＳＫＢＲ３腫瘍細胞増殖阻害
方法：ヒト乳癌細胞系、ＳＫＢＲ−３、細胞を１．０×１０４細胞／ウェルのマッコイ５ａの平底９６ウェルプレート中で播種し、一晩接着させた。次いで、細胞を様々な濃度のｈＬＩＧＨＴで処理した。対照群として、ｈＬＩＧＨＴをｈＬＴβＲ−Ｉｇ（２０μｇ／ｍＬ）でプレインキュベーションして、腫瘍細胞表面上のＬＴβＲに対するＬＩＧＨＴの結合活性を遮断した。アゴニストの抗ＬＴβＲ ｍＡｂ（ＣＢＥ１１）および対照の抗ＨＥＲ２抗体を対照として用いた。プレートを７２時間インキュベーションしてから、［３Ｈ］ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）で６時間パルスした。プレートを回収してから、［３Ｈ］ＴｄＲ取り込みを測定した。
結果：組換えｈＬＩＧＨＴタンパク質処理によりＳＫＢＲ−３細胞の増殖阻害に至った。ｈＬＩＧＨＴの阻害効果はＬＴβＲ−Ｆｃ添加により特異的に遮断でき、この阻害活性はｈＬＩＧＨＴ／ＬＴβＲ相互作用によって変わることが示唆される。対照的に、アゴニストの抗体ＣＢＥ１１は、試験したいずれの濃度においても阻害を示さず、対照の抗ＨＥＲ２抗体はより高い抗体濃度（＞２ｎＭ）で増殖阻害を示した（図１６）。
ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質によるＳＫＢＲ−３細胞の増殖阻害
３個のＬＩＧＨＴ融合タンパク質の増殖阻害活性を、上節に記載の手順に従ってＳＫＢＲ−３細胞上で試験した。簡単に述べると、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を平底９６ウェルプレート（１．０×１０４／ウェル）で一晩播種した。次いで、細胞を漸増濃度のＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、−１３１、−１３２および−１３４（ＢＩＩＢ７１Ｆ１０ ｍＡｂ対照）で処理した。ここでも、対照の抗ＨＥＲ２抗体を用いた。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で７２時間インキュベーションしてから、［３Ｈ］ＴｄＲで６時間パルスした。プレートを回収し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ液体シンチレーションおよびルミネセンス計算器を用いて測定した。
結果により、３個すべてのｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質がＳＫＢＲ−３細胞増殖の強力な阻害活性を示したことが示された。しかしながら、阻害とｈＬＩＧＨＴ濃度との相関が見られたｈＬＩＧＨＴ（上記）とは異なり、３個のＬＩＧＨＴ融合タンパク質はすべて、細胞増殖をより低い濃度のみで阻害し、より高い濃度では阻害活性を失った。この増殖阻害パターンを「Ｕ」形細胞増殖阻害として記載した（図１７）。それは、これらの細胞のＬＩＧＨＴ誘発性阻害と三量体Ｆａｂ誘発性耐性または増殖促進のバランス結果であると仮定された。対照の抗体またはＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４ ｍＡｂ（ＩｇＧ）は、いずれの増殖促進も阻害効果も示さなかったことにも留意されたい。
ＳＫＢＲ−３細胞中のＬＩＧＨＴ融合タンパク質の作用機序試験
ＳＫＢＲ−３細胞増殖阻害実験を上記手順に従い設定した。この処理では１つの融合タンパク質、すなわちＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２のみを使用した。加えて、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２のＬＩＧＨＴ融合タンパク質処理、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２はＬＴβＲ−Ｉｇ（２０μｇ／ｍＬ）またはＨｅｒ２−Ｆｃ（２０μｇ／ｍＬ）でそれぞれＲＴで３０分間プレインキュベーションもし、次いで処理に用いた。ここでも、対照の抗ＨＥＲ２抗体および組換えｈＬＩＧＨＴを追加の対照として用いた。結果を図１８に示した。やはり、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２処理単独は「Ｕ」形阻害曲線を示した（図１７）。対照的に、Ｈｅｒ２−Ｆｃとの前インキュベーションによるＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＨｅｒ２結合活性の遮断は、「Ｕ」形曲線の尾を抑制した、すなわち、三量体Ｆａｂのシグナルを促進する増殖を抑制し、ｈＬＩＧＨＴで見られたものと類似した増殖阻害を示した。ＬＩＧＨＴ機能のＬＴβＲ−Ｆｃによる遮断はＬＩＧＨＴ融合タンパク質の阻害活性を完全に遮断し、阻害効果はＬＩＧＨＴ／ＬＴβＲ相互作用依存性であったことが示唆される。
ＢＴ４７４細胞のｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質増殖阻害
ＢＴ４７４細胞、０．１×１０６細胞／ｍＬの濃度の１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を平底９６ウェルプレートでプレートし（１００μＬ／ウェル）、一晩接着させた。次いで、細胞を２００μＬの異なる濃度のＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２単独、７１Ｆ１０ ｍＡｂ単独、ｈＬＩＧＨＴ単独、ｈＬＩＧＨＴ（２００ｎＭ）と混合した様々な濃度の７１Ｆ１０ ｍＡｂ、または異なる濃度のｈＬＩＧＨＴ（２００、２０、２、０．２および０．０２ｎＭ）と併用した７１Ｆ１０ ｍＡｂ（２．５ｎＭ）で処理した。対照の抗ＨＥＲ２抗体を用いた。プレートを７２時間インキュベーションしてから、［３Ｈ］ＴｄＲで６時間パルスした。放射活性をＭｉｃｒｏＢｅｔａ液体シンチレーションおよびルミネセンス計算器を用いて測定した。
結果：７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質、ｈＬＩＧＨＴならびにＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４（７１Ｆ１０ ｍＡｂ）はすべて乳癌系-ＢＴ４７４細胞における強力な増殖阻害を示した（図１９）。標的ｍＡｂ、７１Ｆ１０ ｍａｂをｈＬＩＧＨＴと共に添加時、これらの細胞において有意な相乗作用は観察されなかった。ＳＫＢＲ−３細胞結果との比較において、「Ｕ」形増殖阻害曲線は観察されなかった。これらの結果により、細胞系が異なると、ＬＩＧＨＴ融合タンパク質処理に対する反応が非常に異なることが示唆された。
（実施例１９）
７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質の内部移行
内部移行測定法（Ｆａｂ）
ＳＫＢＲ３細胞を、ＣＣ２でコーティングした８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ番号１５４９４１）中でプレートし、インキュベーター中で一晩結合させた（５％ＣＯ２、３７℃）。増殖培地を５０μＬ〜７５μＬのＤｙａｘ Ｆａｂ（１０μｇ／ｍＬ）と置換し、それらを４℃で１５分間結合させた。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ抗ヒトＮｅｕモノクローナル抗体（９Ｇ６）、Ｓｃ−０８は二次抗体と交差結合時に迅速に内部移行するため、陽性対照として用いた。スライドの１セットを１時間３７℃にした。ＳＣ０８処理ウェルをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＡ−１１０２９）含有溶液に変化させて、さらに１時間３７℃でインキュベーションを継続した。ウェルを希釈緩衝液（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を１０分間室温で４％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液により固定した。スライドを希釈緩衝液で洗浄した。細胞を０．２％トリトンＸのＰＢＳ溶液で室温で１５分間透過処理した。スライドを洗浄してから、ＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトκ鎖およびヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２特定断片（それぞれ、Ｓｉｇｍａ番号Ｆ３７６１およびＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ．番号１０９−０９６−０９７）の５０：５０混合で４℃で４５分間インキュベーションした。スライドを希釈緩衝液で洗浄し、チャンバーを除去し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ番号Ｈ−１２００）含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを添加後にカバーガラスをかけた。ライカ共焦点顕微鏡を用いて画像スタックを取り込み、セントラルプレインに焦点を合わせた１つを図用に選択した。
結合測定
ＳＫＢＲ３細胞をＣＣ２でコーティングした８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ番号１５４９４１）でプレートし、インキュベーター中で一晩結合させた（５％ＣＯ２、３７℃）。１つのウェルを、陽性対照用にマウスＬＩＧＨＴ遺伝子を送達するアデノウイルスベクターで処理した。翌日、増殖培地を１００ｍＬの試験抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）と交換し、それらを４℃で１時間結合させた。細胞を希釈緩衝液（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で洗浄し、１００ｍＬのＬＴβＲ−ヒトＦｃ融合物を添加し、４℃で１時間結合させた。細胞を洗浄してから、スライドをＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトＦｃ（γ）断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ．番号１０９−０９６−０９８）と４℃で１時間インキュベーションした。スライドを希釈緩衝液で洗浄し、チャンバーを除去し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ番号Ｈ−１２００）含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを添加した後にカバーガラスをかけた。ライカ共焦点顕微鏡を用いて画像スタックを取り込み、セントラルプレインに焦点を合わせた１つを図用に選択した。
結果：７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質は腫瘍細胞表面上で機能的ｈＬＩＧＨＴを示す（データは示していない）。
内部移行測定法（Ｆａｂ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質）
方法：上の結合測定法手順に類似し、ＳＫＢＲ３およびＢＴ４７４細胞をＣＣ２でコーティングした８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ番号１５４９４１）中でプレートし、インキュベーター中で一晩結合させた（５％ＣＯ２、３７℃）。増殖培地を０．１ｍＬ治療用抗体（１μｇ／ｍＬのＳＣ０８および１００ｎＭの融合物および対照の抗ＨＥＲ２抗体）と交換し、４℃で１５分間結合させた。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ抗ヒトＮｅｕモノクローナル抗体（９Ｇ６）、Ｓｃ−０８は二次抗体と交差結合時に迅速に内部移行するため、陽性対照として用いた。スライドの１セットを９０分間３７℃にした。ＳＣ０８処理ウェルをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＡ−１１０２９）含有溶液に変化させて、さらに３０分間３７℃でインキュベーションを継続した。ウェルを希釈緩衝液（１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を１０分間室温で４％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で固定した。スライドを希釈緩衝液で洗浄した。細胞を０．２％トリトンＸのＰＢＳ溶液で室温で１５分間透過処理した。スライドを洗浄してから、ＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトκ鎖およびヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２特定断片（それぞれ、Ｓｉｇｍａ番号Ｆ３７６１およびＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ．番号１０９−０９６−０９７）の５０：５０混合で４℃で４５分間インキュベーションした。スライドを希釈緩衝液で洗浄し、チャンバーを除去し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ番号Ｈ−１２００）含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを添加した後にカバーガラスをかけた。ライカ共焦点顕微鏡を用いて画像スタックを取り込み、セントラルプレインに焦点を合わせた１つを図用に選択した。
結果：実験条件下にて、７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質（ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３１、ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２）のいずれも内部移行を示さなかった（ＳＫＢＲ３上の共焦点顕微鏡）。
（実施例２０）
ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質による炎症誘発性遺伝子の誘発
ＬＩＧＨＴ融合タンパク質により誘発された炎症誘発性遺伝子の定量ＰＣＲ分析
方法：ＨＴ２９細胞を６ウェルプレートで播種し、処理時に約８０％集密にした。２４時間後、それらを新規培地または４ｎＭ ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３０含有新規培地で再栄養化し、さらに２４時間インキュベーションさせた。回収時、細胞を１Ｅ６／ウェルで推定した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（番号７４１０４）を製造業者の説明書に従った上で用いて（デオキシリボヌクレアーゼ処理を含む）ＲＮＡを単離し、任意のゲノム混入物を除去した。ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのキット（番号Ｃ−０３）を用いて第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。ＱＰＣＲをＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ「ヒト炎症サイトカインおよび受容体」９６ウェルアレイプレート（番号ＰＡＨＳ−０１１）、ＲＴ Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ番号ＰＡ−０１２）を用いて行い、製造業者の推奨に従いＡＢＩ ７３００リアルタイムＰＣＲサイクラー上で循環した。ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙがアレイと共に供給している「ＲＴ２ＰＣＲアレイデータ分析ソフトウェア」にサーマルサイクラーデータを入力した。簡単に述べると、様々な工程の試料調製物の対照のためならびに５つのハウスキーピング遺伝子パネル用にデータを正常化後（逆転写およびＰＣＲ）、遺伝子発現における「倍率変化」として示す未処理データにより、分割した処理物としてそれらを提示する。
結果：ＨＴ２９細胞のＬＩＧＨＴ融合物（番号１３０）処理により、炎症促進性ケモカインおよびサイトカイン発現における有意な変化に至った。我々が処理物と未処理転写物を比較時、測定した８４遺伝子のほとんどが上方制御され、少数が下方制御された。これにより、融合分子のＬＩＧＨＴ末端がＬＴβＲに結合時、それは遺伝子発現の炎症促進状態への改変を開始することが示される。高い倍率変化を示す遺伝子サンプリングを表３に提示する。
ＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＩＰ−１０およびＩＬ−８分泌に対する刺激効果
方法：ＨＴ２９細胞を３×１０４／ウェルの９６ウェルプレートでプレートし、一晩結合させた。細胞を１００μｇ／ｍＬのＩＦＮ含有培地（１００μＬ／ウェルの総容積）における希釈試薬で再栄養化した。２４時間後、上清を採集して回転し、細胞片をペレットした。清澄上清を氷上で一晩保存した。ヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８（番号Ｄ８０００Ｃ）およびヒトＩＰ−１０（番号ＤＩＰ１００）のためのＲ＋Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを製造業者の説明書に従い用いた。試料を、ＩＬ−８ ＥＬＩＳＡにおいて総１：９０、およびＩＰ−１０ ＥＬＩＳＡにおいて１：３０に希釈した。上記データをモル処理濃度上ｎｇ／ｍＬのＩＰ−１０またはＩＬ−８でプロットする。
結果：７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質はＨＴ２９細胞中のＩＰ−１０およびＩＬ−８分泌を刺激する（図２０）。
（実施例２１）
抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ、ｍＡｂおよびＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＨＥＲ２シグナル伝達分析
ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化反応に対する効果
方法：５×１０５のＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４またはＮ８７細胞／ウェルを６ウェルプレートの１ｍＬ容積でプレートした。２４時間後、指定試薬の２００ｎＭ溶液１ｍＬ（Ｆａｂ、ｍＡｂ、対照の抗ＨＥＲ２抗体またはＬＩＧＨＴ融合タンパク質）をウェルに添加し、１００ｎＭ溶液２ｍＬを得た。所望のインキュベーション時間（１、６、２４または７２時間）後、培地を除去して細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（それぞれＭｉｎｉ−ｃｏｍｐｌｅｔｅおよびＰｈｏｓＳｔｏｐ、それぞれＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ番号１１８３６１５３００１および０４９０６８３７００１で示す）含有ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ）５００μＬで溶解した。溶解物を微小遠心管中で採集し、４℃で保存した。総タンパク質濃度を、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ番号２３２３５）を用いて決定した。ＮｕＰＡＧＥ（商標登録）Ｎｏｖｅｘ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ番号。ゲルをＮｕＰＡＧＥ（商標登録）ＭＯＰＳ ＳＤＳ流れる緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ番号ＮＰ０００１）で流す）に１０μｇの総タンパク質／ウェルを２００Ｖで１時間乗せた。３０Ｖで１時間流すトランスファー緩衝液（１２．５ｍＭトリス、９６ｍＭグリシン、２０％メタノール）を用いて、ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ番号ＬＣ２００２）上にブロットした。膜をＴＢＳ−Ｔ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝液）中で１回すすぎ洗いし、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｅｃｅ ｃａｔ番号３７５４３）でＲ／Ｔで穏やかに撹拌しながら１時間遮断した。一次抗体（Ｈｅｒ２（番号２２４２）、ホスホＨｅｒ２（番号２２４９）、Ａｋｔ（番号４６９１）、ホスホＡｋｔ（番号４０６０）、ＭＡＰＫ（番号４６９５）、ホスホＭＡＰＫ（番号４３７０）（すべてＣｅｌｌ Ｓｉｇａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から）をブロッキング緩衝液に添加した。ブロットを抗体と穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベーションした。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中で完全に洗浄した。ＨＲＰ接合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ ｃａｔ番号７１１−０３５−１５２）二次抗体を１：１００００の濃度のブロッキング緩衝液に添加した。ブロットをＲ／Ｔで穏やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳ−Ｔで完全に洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ番号ＲＰＮ２１３２）を説明書どおりに添加した。ブロットをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＸＡＲ ｃａｔ番号１６５−１４５４）に曝露して現像した。あるいは、ブロットを検出抗体と穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベーションした。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中で完全に洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＤｙＬｉｇｈｔ６８０接合（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ番号３５５１８）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＤｙＬｉｇｈｔ８００接合（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔ番号３５５７１）二次抗体を１つの容器内で１：１００００の濃度のブロッキング緩衝液に添加し、Ｒ／Ｔで穏やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした。次いで、ブロットをＴＢＳ−Ｔにより完全に洗浄した。ブロットをＬｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｓｃａｎｎｅｒ上で視覚化した。
結果：
６時間または７２時間の観察により、抗ＨＥＲ２Ｆａｂのいずれも対照の抗ＨＥＲ２抗体と比較してＨＥＲ２、ＭＡＰキナーゼおよびＡＫＴリン酸化反応を誘発しないと考えられる（データは示していない）。
完全抗体であるＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４に変換後、ＭＣＦ７細胞（ｍＡｂ濃度１〜１００ｎＭ）中のヘレグリンの非存在下で、ＭＡＰキナーゼの活性化において弱いアゴニストの活性を示した。ＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４処理後、有意な総またはリン酸化Ｈｅｒ２およびＡｋｔは検出されなかった。ＬＩＧＨＴ融合タンパク質であるＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２処理により、ＭＣＦ７細胞中のヘレグリンの非存在下にて、ＭＡＰキナーゼリン酸化反応も誘発された。ＭＡＰキナーゼリン酸化の誘発は、２．５ｐＭ〜２００ｎＭのＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２融合タンパク質処理から検出し得る（データは示していない）。ＳＫＢＲ３細胞においても類似したＭＡＰキナーゼ活性化が検出されたが、より低いレベルであった（データは示していない）。
さらに、ＭＣＦ７中のＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２融合タンパク質によるＭＡＰキナーゼ活性化は、おそらくはＬＩＧＨＴ融合処理時にＨＥＲ２の三量体化を介する。このＭＡＰキナーゼ活性化はＬＩＧＨＴ経路の活性化に起因しない。なぜなら、融合タンパク質のＬＴβＲ−ＩｇによるＬＩＧＨＴ機能の遮断はＬＩＧＨＴ融合処理単独時に観察された結果と同一の結果であったからである。これらの結果により、三量体７１Ｆ１０はアゴニストであると考えられ、本実験条件下にてＨＥＲ２シグナル形質導入を活性化できることが示唆される。
ＨＥＲ３のＨＥＲ２ヘテロ二量体化に対する効果
方法：５×１０５ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３またはＮ８７細胞を６ウェルプレート中でプレートした。２４時間後、試験試薬（Ｆａｂ、完全抗体、またはＬＩＧＨＴ融合タンパク質）を５０ｎＭで添加し、これと細胞を１時間または７２時間インキュベーションした。抗体のインキュベーション後、ヘレグリンベータ（１００ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加し、細胞をさらに３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（それぞれＭｉｎｉ−ｃｏｍｐｌｅｔｅおよびＰｈｏｓＳｔｏｐ、それぞれＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ番号１１８３６１５３００１および０４９０６８３７００１で示す）含有ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ）２５０μＬで溶解した。溶解物を微小遠心管で採集し、４℃で保存した。溶解物１００μＬを、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含まないＲＩＰＡ緩衝液９００μＬに添加した。１μｇのウサギ抗ＨＥＲ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ番号ｓｃ−２８５）を、２５μＬのタンパク質Ａセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃａｔ番号１７−５２８０−０１）と共に各試料に添加した。混合物を４℃で一晩撹拌した。一晩インキュベーション後、セファロースビーズを３０００ｒｐｍで１分間遠心分離してペレットした。上清を吸引除去し、ペレットを５００μＬのＰＢＳで洗浄した。この手順をさらに２回反復した。最終上清を除去後、３０μＬの５×ＳＤＳ試料低減緩衝液（１１．５％ＳＤＳ、５０％グリセロール、０．３Ｍトリス、０．０２５％フェノールレッド、２５％β−メルカプトエタノール）をペレットに添加し、ペレットを粉砕し、９５℃に５分間熱した。次いで、試料を１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清をＮｕＰＡＧＥ（商標登録）Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に乗せた。ゲルをＮｕＰＡＧＥ（商標登録）ＭＯＰＳ ＳＤＳ流れる緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ番号ＮＰ０００１）で２００Ｖで１時間流した。３０Ｖで１時間流すトランスファー緩衝液（１２．５ｍＭトリス、９６ｍＭグリシン、２０％メタノール）を用いて、ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ番号ＬＣ２００２）上にブロットした。膜をＴＢＳ−Ｔ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝液）中で１回すすぎ洗いし、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｅｃｅ ｃａｔ番号３７５４３）でＲ／Ｔで穏やかに撹拌しながら１時間遮断した。ウサギ−抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ番号２２４２）をブロッキング緩衝液に添加した。ブロットを抗体で穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベーションした。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中で完全に洗浄した。ＨＲＰ接合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ ｃａｔ番号７１１−０３５−１５２）二次抗体を１：２００００の濃度のブロッキング緩衝液に添加した。ブロットをＲ／Ｔで穏やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳ−Ｔで完全に洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ番号ＲＰＮ２１３２）を説明書どおりに添加した。ブロットをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＸＡＲ ｃａｔ番号１６５−１４５４）に曝露して現像した。
結果：
Ｆａｂ ６５Ｈ０９はヘレグリンの非存在下でＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を増大すると考えられるが、効果はヘレグリン処理により無効化される。これは、Ｈｅｒ２の６５Ｈ０９結合部位がヘレグリンのＨＥＲ２との相互作用部位と重複することにより説明できる。ヘレグリンはＦａｂ ６５Ｈ０９よりもより高い親和性を有するため、６５Ｈ０９のＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化に対する効果促進を除去した。他のＦａｂはすべてＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化に対して無効であることを示す（データは示していない）。
Ｆａｂ７１Ｆ１０はＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化をＮ８７細胞中のＨＥＲ３リガンドヘレグリンの存在下で１時間目に低減したと考えられる。しかしながら、効果はＳＫＢＲ３細胞中で再現されない（データは示していない）。ＬＩＧＨＴ融合タンパク質がＨｅｒ２／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体化に与える効果については、上記と同一手順を用いて試験する必要が残る。
ＥＧＦＲとのＨＥＲ２ヘテロ二量体化に対するＦａｂ効果
方法：６ウェルプレートで５×１０５のＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３またはＢ８７細胞をプレートした。２４時間後、抗体を５０ｎＭで添加し、細胞を１時間または７２時間インキュベーションした。抗体のインキュベーション後、ヒト上皮成長因子（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加し、細胞をさらに３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（それぞれＭｉｎｉ−ｃｏｍｐｌｅｔｅおよびＰｈｏｓＳｔｏｐ、それぞれＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ番号１１８３６１５３００１および０４９０６８３７００１で示す）含有ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ）２５０μＬで溶解した。溶解物を微小遠心管で採集し、４℃で保存した。溶解物１００μＬを、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含まないＲＩＰＡ緩衝液９００μＬに添加した。１μｇのマウス抗ヒトＥＧＦＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｃａｔ番号６１００１６）を、２５μＬのタンパク質Ａセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃａｔ番号１７−５２８０−０１）と共に各試料に添加した。混合物を４℃で一晩撹拌した。混合物を４℃で一晩撹拌した。一晩インキュベーション後、セファロースビーズを３０００ｒｐｍで１分間遠心分離してペレットした。上清を吸引除去し、ペレットを５００μＬのＰＢＳで洗浄した。この手順をさらに２回反復した。３０μＬの５×ＳＤＳ試料低減緩衝液（１１．５％ＳＤＳ、５０％グリセロール、０．３Ｍトリス、０．０２５％フェノールレッド、２５％β−メルカプトエタノール）をペレットに添加し、ペレットを粉砕し、９５℃に５分間熱した。次いで、試料を１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清をＮｕＰＡＧＥ（商標登録）Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に乗せた。ゲルをＮｕＰＡＧＥ（商標登録）ＭＯＰＳ ＳＤＳ流れる緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ番号ＮＰ０００１）で２００Ｖで１時間流した。３０Ｖで１時間流すトランスファー緩衝液（１２．５ｍＭトリス、９６ｍＭグリシン、２０％メタノール）を用いて、ゲルをＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ番号ＬＣ２００２）上にブロットした。膜をＴＢＳ−Ｔ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝液）中で１回すすぎ洗いし、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｅｃｅ ｃａｔ番号３７５４３）でＲ／Ｔで穏やかに撹拌しながら１時間遮断した。ウサギ抗ヒトＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ番号２２４２）をブロッキング緩衝液に添加した。ブロットを抗体で穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベーションした。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中で完全に洗浄した。ＨＲＰ接合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ ｃａｔ番号７１１−０３５−１５２）二次抗体を１：２００００の濃度のブロッキング緩衝液に添加した。ブロットをＲ／Ｔで穏やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳ−Ｔで完全に洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ番号ＲＰＮ２１３２）を説明書どおりに添加した。ブロットをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＸＡＲ ｃａｔ番号１６５−１４５４）に曝露して現像した。
結果：
結果により、Ｆａｂ ６６Ａ１２はＳＫＢＲ３細胞中のＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ヘテロ二量体化を促進し、他のＦａｂはいずれも活性を示さないことが示された。同様に、６６Ａ１２にて観察されるように、対照の抗ＨＥＲ２抗体ＦａｂはまたＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ヘテロ二量体化を促進することもできた（データは示していない）。ＬＩＧＨＴ融合タンパク質のＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ヘテロ二量体化に対する効果は同一手順を用いて評価する必要性が残る。
（実施例２２）
原発性腫瘍および転移に対するＬＩＧＨＴ融合活性評価用の腫瘍モデル
潜在的なＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、ＨＥＲ２経路遮断およびＬＴβＲ経路の活性化の組み合わせを介して抗腫瘍活性を示す。したがって、ＬＴβＲおよびＨＥＲ２二重陽性腫瘍モデルがＬＩＧＨＴ融合タンパク質試験のために望ましい。これらの腫瘍モデルとしては、ヒト腫瘍細胞系（ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｎ８７、ＳＫＯＶ３、ＨＴ２９、ＷｉＤｒなど）；およびマウス乳腫瘍細胞系Ｔｕｂｏ、ＴＳＡおよび４Ｔ１細胞が挙げられる。
ＢＴ４７４、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腫瘍細胞系、Ｎ８７ヒト胃癌細胞系、およびＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌細胞系を５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で１０％ウシ胎児血清とＲＰＭＩ １６４０中で培養した。ＳＫＢＲ３ヒト乳腫瘍細胞系、ＨＴ２９、ヒト結腸直腸癌細胞Ｗｉｄｒを１．５ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％ウシ胎児血清含有マッコイ５ａ培地で培養した。マウス乳腺腫瘍細胞系Ｔｕｂｏ、ＴＳＡおよび４Ｔ１を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。培地を３日ごとに変更した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０５％トリプシン（ｐＨ７．４）で５分間インキュベーションすることにより、継代のために培養フラスコから除去した。０．１％トリパンブルーにより染色した細胞の顕微鏡試験によりそれらの生存能を決定した。生存する細胞を容積０．１ｍＬのＰＢＳ溶液でマウスに接種した。
ＬＴβＲおよびＨＥＲ２二重陽性腫瘍の異種移植モデルを確立するため、雌胸腺欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）ＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢の右腹部皮膚に２×１０６の生存する培養したヒト腫瘍細胞のＰＢＳ溶液０．１ｍＬを皮下接種した。皮下腫瘍の確立したマウスを垂直二次元腫瘍測定により週２回ノギスで評価した。皮下腫瘍の直径が１４ｍｍを超えた際にマウスを安楽死させ、致死的な腫瘍進行による死としてスコア化した。腫瘍容積を式Ｖ＝ｘｙ２／２（式中、ｘおよびｙは２つの垂線直径（長さおよび幅）である）を用いて算出した。ＭＣＦ７腫瘍はエストラジオールなしでは増殖しないため、ＭＣＦ７腫瘍を接種したすべてのマウスに、皮下１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｓａｒａｓｏｔａ， ＦＬ）移植片を腫瘍接種の７日前に投与した。
同系モデルを確立するため、雌Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２Ｋｄ）マウスの右腹部皮膚に０．５×１０６の生存する培養したマウス腫瘍細胞（Ｔｕｂｏ、ＴＳＡまたは４Ｔ１）のＰＢＳ溶液０．１ｍＬを皮下接種した。腫瘍容積を上記のように算出した。
ＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、遺伝子操作した腫瘍細胞系においてヒトまたはマウスＨｅｒ２（ＭＣＦ７／ｈＨｅｒ２、４Ｔ１／ｍＨｅｒ２、ＴＳＡ／ｍＨｅｒ２など）を過剰発現させるためにも試験することができる。これらの細胞におけるＨｅｒ２過剰発現はヒトの乳癌におけるＨｅｒ２過剰発現の模倣を試み、抗ＨＥＲ２ＬＩＧＨＴ融合タンパク質腫瘍標的能の試験をさらに実行可能にした。これらの修飾細胞系は、それらの親細胞系と同一の培養培地中で増殖するが、薬剤（Ｇ４１８およびＢＬＡＳＴｉｃｙｄｉｎなど）の選択も含む。
（実施例２３）
併用療法を用いた腫瘍増殖のインビボ阻害
方法：化学治療薬（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、フルオロウラシル（５ＦＵ）、ゲムシタビンおよびビノレルビン）と併用したＬＩＧＨＴ融合タンパク質の腫瘍増殖の阻害効果は、異種移植モデル（例えば、ＢＴ４７４またはＭＣＦモデル）または原発性腫瘍セグメントモデルにおいて試験することができる。３０ｍｇ／ｋｇで週２回７週間または６０ｍｇ／ｋｇで週１回５週間腹腔内投与（ｉ．ｐ．）したＬＩＧＨＴ−Ｆａｂ融合タンパク質の効果を、現在の標準的なケア（すなわち、８０ｍｇ／ｋｇ、３日ごと４週間）に応じて投与したゲムシタビンとの併用を評価できる。ゲムシタビン単独、ＬＩＧＨＴ−Ｆａｂ融合タンパク質単独、およびビヒクル単独の送達の偽注射を陰性対照として投与できる。療法開始時の腫瘍容積は約２００ｍｍ３であった。原発性腫瘍退化、腫瘍中のｈＬＩＧＨＴ融合蓄積、浸潤性リンパ球、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔｒｅｇおよび腫瘍再誘発を評価できる。
（実施例２４）
異種移植腫瘍モデルにおけるＦａｂ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質の抗腫瘍活性
ＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、腫瘍細胞の標的阻害（例えば、ＨＥＲ２）およびＬＩＧＨＴ受容体（すなわち、ＬＴβＲおよびＨＶＥＭ）の腫瘍細胞表面上での活性化の組み合わせを通してその抗腫瘍活性を少なくとも部分的に示すと考えられる。したがって、ＨＥＲ２およびＬＩＧＨＴ受容体（１つまたは複数）二重陽性腫瘍モデルの両方を、ＬＩＧＨＴ融合タンパク質試験に使用できる。例として、ＨＴ２９およびＮ８７異種移植腫瘍モデルをインビボのＬＩＧＨＴ融合タンパク質抗腫瘍活性を試験するために選択した。
ヒト結腸直腸腺癌由来の腫瘍細胞系であるＨＴ２９をＡＴＣＣ（ｃａｔ番号ＨＴＢ−３８）から購入した後、継代した。これらの細胞はＨＥＲ２を、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学的染色により決定した中等度レベル（ＩＨＣスコア２＋）で発現する（データは示していない）。ＨＴ２９細胞は、ＬＩＧＨＴのＬＴβＲおよびＨＶＥＭ受容体の両方も発現する。ＨＴ２９細胞はＨＥＲ２を発現するが、これらの細胞の増殖はＨＥＲ２依存性ではない。例えば、これらの細胞は抗ＨＥＲ２抗体処理後に増殖阻止を示さない（データは示していない）。したがって、７１−Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質の抗腫瘍活性は、インビトロ増殖測定法に示されるように、主に腫瘍細胞に対するＬＩＧＨＴによる直接的な死滅活性によって変わる（データは示していない）。対照的に、Ｎ８７はヒト胃癌由来の腫瘍細胞系（ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ５８２２）であり、ＳＣＩＤマウスにおいて皮下腫瘍を形成する。Ｎ８７細胞はＨＥＲ２を高レベル（ＩＨＣスコア３＋）に過剰発現し、抗ＨＥＲ２抗体処理に応答し、これは増殖阻止および細胞死に至る（データは示していない）。したがって、ＨＥＲ２の遮断およびＬＩＧＨＴにより誘発された細胞増殖阻止／細胞死は、７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ抗腫瘍活性に寄与し得る。
ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損雌マウスおよびＳＣＩＤ雌マウスの両方を６〜８週齢で、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ実験室（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）から得た。２×１０６（ＨＴ−２９）および５×１０６（Ｎ８７）腫瘍細胞をそれぞれｎｕ／ｎｕおよびＳＣＩＤマウスの右腹部に皮下接種した。腫瘍（５０〜２００ｍｍ３）の確立したマウスを試験用に選択した（Ｎ＝７〜１０／処理群）。キャリパーを用いて腫瘍寸法を測定し、楕円球（Ｌ×Ｗ２）／２＝ｍｍ３の式（式中、ＬおよびＷは各測定時に採集したより大きな寸法およびより小さな寸法を指す）を用いて腫瘍容積を算出した。試験融合タンパク質または抗体を製剤化し、静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）を介して、６ｍＬ／ｋｇ容積の用量で投与した。ビヒクル単独を対照群に投与した。動物に３日間／週間（ＴＩＷ−月曜日、水曜日、金曜日）連続６〜８週間投与した。モノクローナル抗体の場合、週２回（ＢＩＷ−月曜日および木曜日）処理した。動物の体重を測定し、腫瘍を週２回測定した。対照群の腫瘍容積が約１０００ｍｍ３に達するまでマウスを追跡調査後、ＣＯ２安楽死により屠殺した。各群の平均腫瘍容積を算出した。処理した平均腫瘍容積の変化を平均対照腫瘍容積の変化で割って１００を乗じ、１００％から差し引き、各群の腫瘍増殖阻害を得た。統計的分析の実施を、標準的なＴ検定を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（著作権）ソフトウェアを用いて行った。
（実施例２５）
抗ＨＥＲ２−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質はＨＴ２９異種移植モデルにおける強力な抗腫瘍活性を示した
ＨＴ２９腫瘍モデルにおける７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ活性の結果を図２１に要約する。７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴの有意な抗腫瘍活性が１０ｍｇ／ｋｇの７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質処理群において示された（ｐ＜０．０５）。Ｔ／Ｃ（処理群対対照群）値は、４２％未満である（データは示していない）。統計的有意差には達さなかったが、１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ群も対照群と比較して用量依存的に明確な抗腫瘍活性を示した。７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴタンパク質のＩＰ送達とＩＶ送達との間に抗腫瘍効果の差は観察されなかった（データは示していない）。対照的に、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ＢＩＩＢ７１−Ｆ１０処理単独は、いずれの抗腫瘍効果も示さなかった。実施例２４において論じたように、ＨＴ２９細胞はＨＥＲ２を発現するがこれらの細胞の増殖はＨＥＲ２依存性ではなく、このことはＢＩＩＢ−７１Ｆ１０ Ｍａｂ処理における効果の欠如に寄与し得る。さらに、これらの結果により、ＨＴ２９腫瘍の抗腫瘍効果は７１Ｆ１０−ＬＩＧＨＴ融合分子のＬＩＧＨＴ側に起因することが示された（７１Ｆ１０ Ｍａｂ処理では活性が観察されなかったため）。対照融合分子、抗ＣＤ２３−ｈＬＩＧＨＴ処理群において、ＬＩＧＨＴによる直接的な死滅活性がさらに示された。ＣＤ２３はＨＴ２９細胞上で発現せず、したがって、この処理による「標的効果」は期待すべきではない。５および１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２３−ｈＬＩＧＨＴ群で軽度の抗腫瘍活性のみが検出されたが、本効果は用量依存性ではなかった（すなわち、５および１０ｍｇ／ｋｇデータは重複した）。これらの結果により、循環中の遊離したＬＩＧＨＴ融合分子は、おそらく腫瘍増殖阻止を誘発する上で十分であることが示唆された。
ＨＥＲ２−標的化７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴは、非標的化抗ＣＤ２３−ｈＬＩＧＨＴ対照分子より強力な抗腫瘍活性を示した。抗ＣＤ２３−ｈＬＩＧＨＴのより弱い抗腫瘍活性は質または薬物動態が異なる試薬の相違に起因しない。なぜなら、ＨＴ２９細胞および同一のＰＫ値を用いたインビトロ死滅測定法により示されているように、７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴおよび抗ＣＤ２３−ｈＬＩＧＨＴは両方とも同等の効能を有するからである（データは示していない）。したがって、７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴのより強力な活性は、ＬＩＧＨＴの最大抗腫瘍活性のためにＬＩＧＨＴを腫瘍細胞に標的化させる必要性に起因し得る。これらの結果により、ＴＮＦファミリーの成員の最大シグナル伝達力を得る上で細胞表面上のＬＩＧＨＴ／ＬＴβＲ／ＨＶＥＭ受容体オリゴマー化の役割を支持するさらなる証拠が提供された。
（実施例２６）
抗ＨＥＲ２−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質は、ＨＥＲ２依存性Ｎ８７異種移植腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示した
本実験において、抗ＨＥＲ２療法とＬＩＧＨＴによる直接的な死滅活性との間の相乗作用を試験するため、Ｎ８７腫瘍モデルを用いた。上述のように、Ｎ８７細胞はＨＥＲ２を高レベル（ＩＨＣスコア３＋）に過剰発現し、対照の抗ＨＥＲ２抗体などの抗ＨＥＲ２抗体処理に応答し、これは増殖阻止および細胞死に至る（データは示していない）。Ｎ８７腫瘍はＳＣＩＤマウスの側腹部上で増殖し、腫瘍サイズが５０〜２００ｍｍ３に達した際に処理した。この処理は実施例２５で用いたものと類似するが、トラスツズマブまたは対照の抗ＨＥＲ２抗体（Ｒｏｃｈ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含んだ。結果を図２２に要約する。７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴは有意な（ｐ＜０．００１）抗腫瘍活性および抑制された腫瘍増殖（Ｔ／Ｃ＜４０％）を用量依存的に示した。実施例２５の観察と類似し、抗ＣＤ２３−ｈＬＩＧＨＴは同一用量（５ｍｇ／ｋｇ）の７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴよりも効果が低く、Ｎ８７モデルにおいて有意な効果を示した（ｐ＜０．０２）。標的抗体単独、すなわちＢＩＩＢ７１−Ｆ１０（ＬＩＧＨＴ部分なし）では腫瘍増殖の統計的有意な低減には至らなかった（ＢＩＩＢ７１−Ｆ１０抗体は対照の抗ＨＥＲ２抗体と交差遮断しないことに留意されたい）。対照の抗ＨＥＲ２抗体処理は、一連の処理を通して有意な増殖遅延化（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）を示した（ｐ＜０．０２）。しかしながら、対照の抗ＨＥＲ２抗体で処理したＮ８７腫瘍は再発し、５０日目に再び増殖し始めた。対照的に、７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴで処理した腫瘍は持続した増殖阻害を示し、腫瘍退化の傾向すら示した。これらの観察は、抗ＨＥＲ２抗体と抗ＨＥＲ２−ＬＩＧＨＴ融合分子との間の一部の分子および細胞の各抗腫瘍活性における相違を強調する。例えば、ＨＥＲ２受容体の遮断およびＬＩＧＨＴにより誘発された細胞増殖阻止／細胞死を含む機序の他に、ＬＩＧＨＴは先天的な細胞（ＮＫ細胞およびマクロファージなど）を刺激して腫瘍細胞死を補助し得る。この機序は、ＬＩＧＨＴの既知の生体機能、および７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質処理に対する腫瘍の反応にわずかな遅延があったという観察と一致する。先天的な免疫細胞の抗腫瘍活性への関与は、腫瘍切片の免疫組織化学的染色および細胞枯渇実験によりさらに調査し得る。作用機序に関わらず、７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質は抗ＨＥＲ２抗体と比較してＨＥＲ２依存性腫瘍の処理における相違を示し、抗ＨＥＲ２抗体療法耐性を克服するための代替療法を提供する。
（実施例２７）
ＬＩＧＨＴ融合処理は宿主抗腫瘍の免疫応答を刺激する
ＬＩＧＨＴはＴ細胞活性における強力な共刺激分子であり、したがって、ＬＩＧＨＴのＦａｂ−ＬＩＧＨＴを介した腫瘍組織に対する標的化は、宿主抗腫瘍の反応を起こし、腫瘍転移を低減または根絶する。免疫応答は、免疫力のある動物において試験することができる。同系マウス腫瘍モデル、（乳腫瘍細胞ＴＳＡ、４Ｔ１およびＴｕｂｏ（Ｈｅｒ２＋）細胞マウスなど）を使用できる。簡単に述べると、腫瘍細胞は、単細胞懸濁液として調製できる。１〜５×１０５腫瘍細胞は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に接種できる。皮下腫瘍部分が確立されて５０〜１００ｍｍ３に達した際、様々な投与および投与計画の７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質および対照で２週間、動物を処理できる。処理終了時および処理後２週間、腫瘍組織および排出リンパ節を回収して、免疫細胞浸潤、すなわち腫瘍に属するＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞およびマクロファージを分析できる。腫瘍組織におけるリンパ様構造の組織学分析を評価して、ＳＬＣ（ＣＣＬ２１）の腫瘍内レベルをリンパ球輸送のために決定することができる。転移分析のために、処理から１ヶ月後に排出リンパ節および肺組織を採集できる。融合タンパク質処理群は増加した数の腫瘍浸潤性リンパ球、サイトカイン／接着分子の上方制御を有し得、転移腫瘍の低減に至る。
動物の再誘発した腫瘍からの保護におけるＬＩＧＨＴ融合タンパク質誘発性の免疫効果も決定することができる。再誘発した腫瘍の一次成長および転移の両方をモニタリングすることができる。
（実施例２８）
抗ＩＧＦＲ Ｆａｂ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質、Ｃ０６−ｈＬＩＧＨＴの構築
ＤｙａｘＶＨ−ｐＶ９０−Ｆ（配列番号１５７）、２５６−Ｒ（配列番号１５８）、および１６５−Ｒ２（配列番号１５９）として記載したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によりモノクローナル抗体Ｃ０６ ＶＨ領域を合成した。５’順行プライマーであるＤｙａｘＶＨ−ｐＶ９０−Ｆは、独特なＭｌｕ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＡＣＧＣＧＴ（配列番号１６０）を含み、重鎖シグナルペプチドの最後の３個のアミノ酸をコードする配列が続き、記録したＣ０６ ＶＨのアミノ末端に相補的な配列が続く。内部逆行プライマー２５６−ＲをコードするＣ０６ ＶＨのカルボキシル末端および第二の逆行プライマー１６５−Ｒ２をコードする一部のヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインおよびＡｇｅ Ｉ部位（ＡＣＣＧＧＴ（配列番号１６１））からなる３’逆行プライマーである。記録したＤｙａｘ抗ＩＧＦ１Ｒ Ｃ０６ ＶＨ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡであるｐＢＩＩＢＣ０６−０３０由来のこれら３個のＰＣＲプライマーを用いて、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインをコードする一般的な重複配列を通して、記録したＣ０６ ＶＨ領域を２つの連続ＰＣＲ反応において増幅した。ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３２を消化したＭｌｕ Ｉ／Ａｇｅ Ｉ中にＣ０６ ＶＨ遺伝子断片をクローン化した。ＤＮＡシークエンシングにより正確な配列を確認した。Ｃ０６Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物（ｐＢＩＩＢＣ０６−２５６）の重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１６２および１６３として示す。Ｃ０６Ｆａｂの重鎖に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列はＮ末端から開始し、結合基に対応するアミノ酸（２２６〜２４５位のアミノ酸）が続き、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインに対応するアミノ酸（２４６〜３９３位のアミノ酸）が続くことが示される。Ｃ０６ ＶＨ ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１６４〜１６６で示す。
Ｃ０６軽鎖ベクター（ｐＢＩＩＢＣ０６−１１７）をＣ０６Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合物に使用した。このＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１６７および１６８として示す。Ｃ０６ ＶＬ ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１６９〜１７１で示す。
実施例８に記載のように、ＣＨＯ細胞のＣ０６−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質を一過性トランスフェクションにより産生した。培地中のタンパク質力価をＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により決定し、ＩＧＦＲおよびＬＩＧＨＴ受容体ＬＴβＲに対する結合活性を評価するＥＬＩＳＡ検定法に用いた。抗ＨＥＲ２ ７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴを対照として用いた。結果を図２３Ａおよび２３Ｂに要約する。Ｃ０６−ｈＬＩＧＨＴはＩＧＦＲ（図２３Ａ）およびＬＴβＲ（図２３Ｂ）の両方への特異的結合を示し、二機能性活性を示した。
（実施例２９）
Ｆａｂ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質の二量体形態の構築
Ｆａｂ−ＬＩＧＨＴ融合タンパク質の二量体形態を、ＩｇＧ１の完全ＣＨ１ヒンジ領域を含むことにより生成した。二量体は二重ジスルフィド結合形成により安定している。鎖間のジスルフィド結合形成のための２つのシステイン残基を含むヒトＩｇＧ１ヒンジ配列を７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴ融合重鎖中の（Ｇ４Ｓ）４リンカー領域の前に挿入した（図２４）。７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ二量体融合重鎖を５’順行＋３’逆行ＰＣＲプライマー、ならびにヒトＩｇＧ１およびｈＬＩＧＨＴ含有プラスミドＤＮＡ由来のヒトＩｇＧ１ヒンジ配列をコードする内部重複ＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ反応において構築した。プライマー配列をＭＢ−０４Ｆ（配列番号１３５）、１３０−Ｒ１（配列番号１３６）、２５５−ｍＦ（配列番号１７５）および２５５−ｍＲ（配列番号１７６）として示した。簡単に述べると、５’順行プライマーは、Ａｇｅ Ｉ部位（ＡＣＣＧＧＴ（配列番号１６１）を有するＭＢ−０４Ｆに、ＩｇＧ１ ＣＨ１領域に相補的な配列が続く。３’逆行プライマーはＢａｍＨ Ｉ部位（ＧＧＡＴＣＣ（配列番号１７７））を含む１３０−Ｒ１であり、ｈＬＩＧＨＴのカルボキシル末端に相補的な配列を含む。内部重複ＰＣＲプライマーセットの５’順行プライマーである２５５−ｍＦおよび３’逆行プライマーである２５５−ｍＲは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域をコードする配列を含み、一部の（Ｇ４Ｓ）４リンカーが続く。重複ｈｕＩｇＧ１ヒンジおよび（Ｇ４Ｓ）４リンカー配列をコードする配列を用いた第二のＰＣＲ反応においてＰＣＲ断片を集めた。最終ＰＣＲ生成物をＡｇｅ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化し、ＢＩＩＢ７１−Ｆ１０ ＩｇＧ１重鎖配列を含むｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１３４ベクターを消化したＡｇｅ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉに結紮した。構築物のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングにより確認した。７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ二量体融合物（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−２５５）の重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７８および１７９として示す。７１Ｆ１０ Ｆａｂの重鎖に対応するアミノ酸およびヌクレオチド配列はＮ末端から開始し、ＩｇＧ１のＣＨ１ヒンジ領域に対応するアミノ酸（配列番号１７２の２２５〜２３２位のアミノ酸）が続き、結合基に対応するアミノ酸（配列番号１７２の２３３〜２５２位のアミノ酸）が続き、ヒトＬＩＧＨＴ細胞外ドメインに対応するアミノ酸（配列番号１７２の２５３〜４００位のアミノ酸）が続くことが示される。
７１Ｆ１０軽鎖ベクター（ｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−１２９）を７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ二量体融合物に用いた。このＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１０および１０９として示す。
実施例８に記載のように、二量体７１Ｆ１０ Ｆａｂ−ｈＬＩＧＨＴ融合タンパク質をＣＨＯ細胞のｐＢＩＩＢ７１Ｆ１０−２５５ベクターとの一過性トランスフェクションにより産生した。培地中のタンパク質力価をＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により決定し、ＨＥＲ２標的およびＬＩＧＨＴ受容体ＬＴβＲに対する結合活性を評価するＥＬＩＳＡ検定法において用いた。抗Ｈｅｒ２ ７１Ｆ１０−ｈＬＩＧＨＴを対照として用いた。結果を図２５Ａおよび２５Ｂに要約する。図２５Ａでは、培地の２倍連続希釈を２μｇ／ｍＬのｒｈＥｒｂＢ２−Ｆｃでコーティングしたプレートに添加し、結合をヤギ−抗ヒトκ−ＨＲＰ（１：１００００）により検出した。図２５Ｂでは、培地の２倍連続希釈を２μｇ／ｍＬのｈＨＥＲ２−Ｆｃでコーティングしたプレートに添加し、１μｇ／ｍＬのビオチン−ｈＬＴβＲ−Ｆｃでインキュベーション後、結合をストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：４０００）により検出した。Ｃ０６−ｈＬＩＧＨＴはＩＧＦＲ（図２５Ａ）およびＬＴβＲ（図２５Ｂ）の両方への特異的結合を示し、二機能性活性を示した。
寄託
以下のＦａｂ−ＬＩＧＨＴ融合物を発現するＣＨＯ細胞を、２００９年９月２４日、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃ．， １４ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ ０２１４２、Ａｍｅｒｃｉａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（商標登録））に、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙの必要性に従って代理寄託した。
ＡＴＣＣ（商標登録）特許寄託指定
ＣＨＯ細胞：７１Ｆ１０ ｆａｂｌｉｇｈｔ＃１ ＰＴＡ−１０３５５
ＣＨＯ細胞：６５Ｈ０９ ｆａｂｌｉｇｈｔ５Ｆ６ ＰＴＡ−１０３５６
ＣＨＯ細胞：６７Ｆ１１ ｆａｂｌｉｇｈｔ＃４ ＰＴＡ−１０３５７
ＣＨＯ細胞：６５Ｃ１０ ｆａｂｌｉｇｈｔ選別貯留物 ＰＴＡ−１０３５８
均等物
本明細書に引用したすべての参考文献が、それぞれ個々の公開または特許または特許出願が、全目的のためにそれらの全体が参照により特定的かつ個別に組み込まれるよう指定されている場合と同程度、全目的のためにそれらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明の範囲は、本明細書に記載の具体的な実施形態により限定されない。実際、本明細書に記載のものに加えて本発明の様々な修正が本明細書上記および添付の図面から当業者にとって明らかとなるであろう。かかる修正は添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (52)

  1. ヒトＬＩＧＨＴタンパク質もしくはその断片の少なくとも１つの細胞外ドメインを含み、ならびに癌細胞もしくは組織上の表面タンパク質に結合する抗体分子を標的とするＬＩＧＨＴ標的分子であり、少なくとも２つの非隣接ポリペプチドを含む前記ＬＩＧＨＴ標的分子。
  2. 軽鎖定常領域（ＣＬ）に結合した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する第一のポリペプチド；および重鎖定常領域（ＣＨ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する第二のポリペプチド、の配置であり、これらはリンカー（Ｌ）によりもしくはよらず、ＬＩＧＨＴタンパク質もしくはその断片のＮ末端に結合している非隣接ポリペプチドを少なくとも２つ含む、請求項１のＬＩＧＨＴ標的分子。
  3. 前記抗体分子がＦａｂ断片である、請求項１または２のＬＩＧＨＴ標的分子。
  4. ＬＩＧＨＴタンパク質もしくはその断片とＦａｂ断片との、二量体もしくは三量体形態の融合物である、請求項１ないし３のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  5. 前記ＬＩＧＨＴタンパク質の細胞外ドメインが、（ｉ）１つ以上のＬＩＧＨＴ受容体に結合すること；（ｉｉ）１種以上のケモカインもしくはサイトカイン、ケモカインもしくはサイトカイン受容体、接着分子、もしくは共刺激分子の発現を誘発すること；（ｉｉｉ）Ｔ細胞を活性化させること；（ｉｖ）Ｔ細胞を腫瘍細胞もしくは腫瘍組織中に動員すること；（ｖ）腫瘍反応性Ｔ細胞増殖を活性化もしくは増強すること；（ｖｉ）腫瘍細胞もしくは組織にリンパ様微環境を生成すること；（ｖｉｉ）腫瘍細胞もしくは組織のアポトーシスを誘発すること；または（ｖｉｉｉ）対象における免疫応答を刺激すること、から選択される１つ以上のＬＩＧＨＴ関連活性を有する請求項１ないし４のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  6. 前記ＬＩＧＨＴタンパク質の細胞外ドメインが配列番号１の９３〜２４０位のアミノ酸（ヒトＬＩＧＨＴアイソフォーム１）、またはそれと少なくとも９０％同一のアミノ配列を含む、請求項１ないし５のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  7. 前記抗体分子がＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ｃｒｉｐｔｏ；αｖβ６、α６β４、ラミニン受容体（ＬＡＭＲ）、ＣＤ２３、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＥｐＣＡＭおよびＴｗｅａｋ受容体（ＦＮ１４）からなる群から選択される癌細胞タンパク質に結合する、請求項１ないし６のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  8. 前記抗体分子がヒトＨＥＲ２、ＣＤ２３またはＩＧＦＲに結合する、請求項１ないし７のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  9. 以下のうちの１つ以上：
    （ｉ）少なくとも１×１０−７Ｍの解離定数（Ｋｄ）を特徴とする親和性でＨＥＲ２に結合すること；
    （ｉｉ）他のＨＥＲファミリーメンバーとの有意な交差反応なくＨＥＲ２に結合すること；
    （ｉｉｉ）配列番号１０５の約１〜１９６位のアミノ酸（ヒトＨＥＲ２）に対応するドメイン１のエピトープ（Ｄ１）、配列番号１０５の約１９７〜３１８位のアミノ酸に対応するドメイン２のエピトープ（Ｄ２）、配列番号１０５の約３１９〜５０８位のアミノ酸に対応するドメイン３のエピトープ（Ｄ３）、もしくは配列番号１０５の約５０８〜６３０位のアミノ酸に対応するドメイン４のエピトープ（Ｄ４）、あるいはそれらの組み合わせから選択されるＨＥＲ２上の直線状もしくは立体構造エピトープに結合すること；
    （ｉｖ）ＨＥＲ２、ＡＫＴもしくはＭＡＰキナーゼの１つ以上のリン酸化反応を低減すること；またはＨＥＲ２のホモ二量体化もしくはＨＥＲ２およびＨＥＲ３のヘテロ二量体化、および／もしくはＥＧＦＲを有するＨＥＲ２を低減すること；
    （ｖ）インビトロおよびインビボでＨＥＲ２発現細胞の活性を阻害するもしくは細胞死を誘発すること；
    （ｖｉ）ＨＥＲ２依存性乳腫瘍細胞、結腸直腸腫瘍細胞もしくは胃腫瘍細胞保因の異種移植腫瘍モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を誘発すること；または
    （ｖｉｉ）単一療法後、もしくは腫瘍再発後に腫瘍増殖もしくは転移の長期の低減を誘発すること、
    から選択される活性を有する、請求項１ないし８のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  10. 前記抗体分子が、配列番号１１および１３（ＢＩＩＢ７１Ｆ１０ ＶＨおよびＶＬ）、配列番号１５および１７（ＢＩＩＢ６９Ａ０９ ＶＨおよびＶＬ）、配列番号１９および２１（ＢＩＩＢ６７Ｆ１０ ＶＨおよびＶＬ）、配列番号２３および２５（ＢＩＩＢ６７Ｆ１１ ＶＨおよびＶＬ）、配列番号２７および２９（ＢＩＩＢ６６Ａ１２ ＶＨおよびＶＬ）、配列番号３１および３３（ＢＩＩＢ６６Ｃ０１ ＶＨおよびＶＬ）、配列番号３５および３７（ＢＩＩＢ６５Ｃ１０ ＶＨおよびＶＬ）、配列番号３９および４１（ＢＩＩＢ６５Ｈ０９ ＶＨおよびＶＬ）、ならびに配列番号４３および４５（ＢＩＩＢ６５Ｂ０３ ＶＨおよびＶＬ）からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変（ＶＨおよびＶＬ）アミノ酸配列；またはそれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＦａｂ断片である、請求項９のＬＩＧＨＴ標的分子。
  11. １、２、３、４または５つの（Ｇ４Ｓ）４反復を含むリンカーを含む、請求項１ないし１０のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  12. 配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０９のアミノ酸配列を有する軽鎖、またはそれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１ないし１１のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子。
  13. 配列番号１０１もしくは１７４のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１０３のアミノ酸配列を有する軽鎖、またはそれと少なくとも９０％同一のアミノ配列を含む、請求項８のＬＩＧＨＴ標的分子。
  14. 配列番号１６３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１６８のアミノ酸配列を有する軽鎖、またはそれと少なくとも９０％同一のアミノ配列を含む、請求項８のＬＩＧＨＴ標的分子。
  15. ＢＩＩＢ７１Ｆ１０（配列番号１１、１３）、ＢＩＩＢ６９Ａ０９（配列番号１５、１７）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１０（配列番号１９、２１）；ＢＩＩＢ６７Ｆ１１（配列番号２３、２５）、ＢＩＩＢ６６Ａ１２（配列番号２７、２９）、ＢＩＩＢ６６Ｃ０１（配列番号３１、３３）、ＢＩＩＢ６５Ｃ１０（配列番号３５、３７）、ＢＩＩＢ６５Ｈ０９（配列番号３９、４１）およびＢＩＩＢ６５Ｂ０３（配列番号４３、４５）からなる群から選択される抗体由来の全６つのＣＤＲ、または前記ＣＤＲと同一もしくは２つを超える改変を有することがないＣＤＲを含むＨＥＲ２に結合する精製した抗体分子。
  16. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、および単一ドメイン抗体からなる群から選択される抗体断片である、請求項１５の抗体分子。
  17. 請求項１ないし１２のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
  18. 請求項１３のＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
  19. 請求項１４のＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
  20. 請求項１５または１６の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
  21. 請求項１ないし１２のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  22. 請求項１３のＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  23. 請求項１４のＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  24. 請求項１５または１６の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  25. 請求項１ないし１２のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むベクター。
  26. 請求項１３のＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むベクター。
  27. 請求項１４のＬＩＧＨＴ標的分子をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むベクター。
  28. 請求項１５または１６の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
  29. 組換えＬＩＧＨＴ標的分子の提供方法であり、請求項１ないし１２のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子をコードする核酸を含む宿主細胞を提供すること、および組換えＬＩＧＨＴ標的分子が発現する条件下に宿主細胞を維持すること、を含む提供方法。
  30. 宿主細胞または宿主細胞が維持されている培地からＬＩＧＨＴ標的分子を単離することをさらに含む、請求項２９の方法。
  31. 医薬組成物としてのＬＩＧＨＴ標的分子製剤の調製をさらに含む、請求項３０の方法。
  32. 組換えＬＩＧＨＴ標的分子の提供方法であり、請求項１３のＬＩＧＨＴ標的分子をコードする核酸を含む宿主細胞を提供すること、および組換えＬＩＧＨＴ標的分子が発現する条件下に宿主細胞を維持すること、を含む提供方法。
  33. 宿主細胞または宿主細胞が維持されている培地からＬＩＧＨＴ標的分子を単離することをさらに含む、請求項３２の方法。
  34. 医薬組成物としてのＬＩＧＨＴ標的分子製剤の調製をさらに含む、請求項３３の方法。
  35. 組換えＬＩＧＨＴ標的分子の提供方法であり、請求項１４のＬＩＧＨＴ標的分子をコードする核酸を含む宿主細胞を提供すること、および組換えＬＩＧＨＴ標的分子が発現する条件下に宿主細胞を維持すること、を含む提供方法。
  36. 宿主細胞または宿主細胞が維持されている培地からＬＩＧＨＴ標的分子を単離することをさらに含む、請求項３５の方法。
  37. 医薬組成物としてのＬＩＧＨＴ標的分子製剤の調製をさらに含む、請求項３６の方法。
  38. ＨＥＲ２に結合する抗体分子の提供方法であり、請求項１５もしくは１６の抗体分子をコードする核酸を含む宿主細胞を提供すること、ならびに組換えＬＩＧＨＴ標的分子が発現する条件下に宿主細胞を維持すること、を含む提供方法。
  39. 宿主細胞または宿主細胞が維持されている培地からＬＩＧＨＴ標的分子を単離することをさらに含む、請求項３８の方法。
  40. 医薬組成物としてのＬＩＧＨＴ標的分子製剤の調製をさらに含む、請求項３８または３９の方法。
  41. 請求項１ないし１２のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
  42. 請求項１３のＬＩＧＨＴ標的分子および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
  43. 請求項１４のＬＩＧＨＴ標的分子および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
  44. 請求項１５もしくは１６の抗体分子および医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
  45. 過剰増殖性状態もしくは障害の治療方法であり、前記状態もしくは障害を呈するまたはそのリスクがある対象に有効量の請求項１ないし１４のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子を投与すること、それによって、過剰増殖性状態もしくは障害を治療すること、を含む方法。
  46. 新生物の細胞または組織へのＬＩＧＨＴ標的分子の選択的な送達方法であり、新生物の細胞または組織の死滅または除去量で請求項１ないし１４のいずれかのＬＩＧＨＴ標的分子を新生物の細胞または組織に接触させることを含み、ここで前記の接触工程が対象においてインビトロ、エクスビボ、またはインビボで生じる、送達方法。
  47. 前記対象が乳癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌または肝臓癌から選択される過剰増殖性状態または障害に罹患する患者である、請求項４５の方法。
  48. 前記対象がＨＥＲ２発現乳癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、または前立腺癌に罹患する患者である、請求項４５の方法。
  49. 前記患者が化学療法または抗体ベースまたは外科手術に対して部分的または完全に難治性である、請求項４８の方法。
  50. 過剰増殖性状態もしくは障害の治療方法であり、前記状態もしくは障害を呈するまたはそのリスクがある対象に有効量の請求項１５または１６の抗ＨＥＲ２抗体分子を投与すること、それによって、前記過剰増殖性状態もしくは障害を治療すること、を含む方法。
  51. 試料中のＨＥＲ２タンパク質の存在の検出方法であり、（ｉ）試料を請求項１５もしくは１６の抗ＨＥＲ２抗体分子と接触させること；ならびに（ｉｉ）抗ＨＥＲ２抗体分子と試料との間の複合体形成を検出することを含み、前記試料中の複合体形成が試料中のＨＥＲ２の存在を示す、検出方法。
  52. 新生物の状態もしくは障害の診断方法であり、（ｉ）対象から試料を得ること；（ｉｉ）試料を請求項１５もしくは１６の抗ＨＥＲ２抗体分子と接触させること；ならびに（ｉｉｉ）前記抗ＨＥＲ２抗体分子と前記試料との間の複合体形成を検出することを含み、前記試料中の複合体形成は試料中のＨＥＲ２の存在を示し、基準値と比較して前記試料中のＨＥＲ２タンパク質の上昇した発現レベルが新生物の状態もしくは障害を示す、診断方法。
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