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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verpackungszellen,
die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen
produzieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
zur Gentherapie solider Tumore, wobei die Verpackungszellen Stammzellen
sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren und wobei
menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind. Ferner sind
Verpackungszellen, die für
diese Verwendung geeignet sind, sowie diese enthaltende pharmazeutische
Zusammensetzungen Gegenstand der Erfindung.
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Retrovirale
Vektoren finden im Stand der Technik zunehmend Verwendung, beispielsweise
für den Gentransfer
in der gentechnischen bzw. medizinischen Forschung oder bei gentherapeutischen
Ansätzen
(vgl. z.B. C. Baum et al. in Seminars in Oncology: Gene Therapy
of Cancer: Translational approaches from preclinical studies to
clinical implementations., eds. Gerson, & Lattime, Academic Press, 1998).
Die retroviralen Vektoren sind meist von murinen Leukämieviren
(MLV) abgeleitet und enthalten alle für die Integration notwendigen
Sequenzen der LTR-Regionen und das für die Verpackung verantwortliche ψ-Element.
Die für
die Virusproteine kodierenden Bereiche sind durch Fremdgene und
Kontrollsequenzen ersetzt, die man in menschliche Zellen einbringen
möchte.
Die Vektoren werden in sogenannten Helferzelllinien (Verpackungszelllinien)
hergestellt, die im Allgemeinen eine Kopie der kodierenden Bereiche
eines kompletten Retrovirusgenoms enthalten. Es synthetisiert alle
für die
Replikation und Infektion notwendigen Proteine, kann jedoch seine
genomische Virus-RNA nicht in Partikel verpacken, da es einen Defekt
in den ψ-Sequenzen
aufweist. Werden die retroviralen Vektoren in diese Helferzellen
eingebracht und transkribiert, kann die gebildete transgene mRNA
durch die ihr eigene ψ-Region
mit den Strukturproteinen des Helfervirus interagieren und zu Partikeln
verpackt werden. Die rekombinanten Virionen, die keinerlei Erbinformation
für Viruskomponenten
besitzen, adsorbieren über
ihre Oberflächenproteine
an Zellen, die Capside werden in das Cytoplasma aufgenommen, und
die transgene RNA wird in doppelsträngige DNA überschrieben und ins Wirtszellgenom
integriert. Der Vorteil dieses Systems ist die stabile Integration
der Fremdgene, die bei Teilungen auf die Tochterzellen weitergegeben
werden. Nachteilig ist die Retroviren eigene unspezifische Integration
an willkürlichen
Stellen des Zellgenoms.
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Retrovirale
Vektoren vermitteln eine stabile, kolineare Integration (d.h. ohne
Rekombinationen und Rearrangierung der kodierenden Sequenzen im
Vektorgenom) und dadurch eine langfristige Expression des Transgens.
Eine langfristige Genexpression ist sonst bislang nur noch durch
die episomalen Herpesvirusvektoren oder die Adeno-associated virus-Vektoren
(AAV-Vektoren) möglich.
Für die
letztgenannten Vektorsysteme sind die Verpackungssysteme (Verpackungszelllinien)
jedoch noch nicht optimiert. AAV-Vektoren
weisen ferner eine geringe Verpackungskapazität (ca. 5 kb für AAV gegenüber ca.
10-12 kb für
retrovirale Vektoren) auf.
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In
Verpackungszellen wird das Vektorgenom, das retrovirale cis-Elemente enthält, durch
Transkription gebildet. Dieses genomische Vektortranskript kodiert
für das
zu transferierende Gen, aber nicht für retrovirale Proteine. Es
wird jedoch in den Verpackungslinien mit Hilfe der gag-, pol- und
env-Genprodukte aus der Verpackungszelle in ein infektiöses, aber
nicht replikationsfähiges
Virion eingebaut. Dieses Virion kann dann als retroviraler Vektor
zum Transfer des in das Vektorgenom integrierten Transgens in die
gewünschten
Zielzellen eingesetzt werden, ohne daß es dort zur weiteren Vermehrung
des Vektors kommt. Mit anderen Worten, der virale Vektor kann die
Zielzellen infizieren, sich dort aber nicht weiter vermehren.
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Die
Entwicklung retroviraler Verpackungssysteme ist bereits weit fortgeschritten,
und Vektorüberstände, die
frei von replikationskompetenten Viren sind, können in großen Mengen unter GMP-Bedingungen (Good manufacturing
practice; Richtlinie der Kommission zur Festlegung der Grundsätze und
Leitlinien der guten Herstellungspraxis (GMP) für bestimmte Arzneimittel zur
Anwendung beim Menschen (91/356/EWG) vom 13.6.91) hergestellt werden.
Vektoren auf Basis des murinen Leukämievirus (MLV-Vektoren) wurden
bereits mehrfach in klinischen Studien eingesetzt (P. Chu et al.,
J. Mol. Med. 76 (1998) 184-192).
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Im
Stand der Technik sind zwei grundsätzliche Typen retroviraler
Verpackungssysteme bekannt (J.M. Wilson, Clin. Exp. Immunol 107
Suppl. 1 (1997) 31-32; C. Baum et al. (1998), loc. cit.).
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Zum
einen werden oncoretrovirale Verpackungssysteme verwendet. MLV-Verpackungszelllinien
enthalten die retroviralen Gene gag, pol und env (1),
und die für
die Verpackung der retroviralen RNA erforderliche Sequenzen sind
deletiert (C. Baum et al. (1998), loc. cit.).
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Der
zweite Typ der bekannten Verpackungssysteme leitet sich von den
Lentiviren ab (R. Carroll et al., J. Virol. 68 (1994) 6047-6051;
P. Corbeau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 14070-14075;
L. Naldini et al., Science 272 (1996) 263-267; C. Parolin et al.,
J. Virol. 68 (1994) 3888-3895; J. Reiser et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93 (1996) 15266-15271; J.H. Richardson et al., J. Gen.
Virol. 76 (1995) 691-696; T. Shimada et al., J. Clin. Innest. 88
(1991) 1043-1047). Lentiviren sind komplexe Retroviren, die zusätzlich zu
den gag-, pol- und
env-Genprodukten noch eine Reihe regulatorischer Gene exprimieren.
Beispiele für
Lentiviren, aus denen Verpackungssysteme abgeleitet wurden, sind
das „Humane
Immundefizienzvirus" (HIV),
das „Simian Immundefizienzvirus" (SIV), das „Equine
infektiöse
Anämievirus" (EIAV) und das „Feline
Immundefizienzvirus" (FIV).
Der Aufbau der lentiviralen Verpackungssysteme ähnelt prinzipiell demjenigen
der MLV-Vektoren.
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Vorteil
der lentiviralen Vektoren ist, daß sie auch ruhende Zellen infizieren
können.
Bei MLV-Vektoren hingegen kann das Vektorgenom nur während der
Zellteilung in den Zellkern transportiert werden, d.h. wenn die
Kernmembran aufgelöst
ist. Allerdings weisen von Lentiviren abgeleitete Verpackungssysteme
aufgrund des komplexen Aufbaus des lentiviralen Genoms Nachteile
auf, die sich in einem vergleichsweise geringen Titer und einer
geringeren Sicherheit äußern. Durch
den komplexen Genomaufbau lassen sich cis- und trans-Elemente im
Genom nicht klar von einander trennen. In den Verpackungskonstrukten,
die lentivirale gag-, pol- und env-Gene exprimieren, befinden sich
daher auch wichtige cis-regulatorische Sequenzen (z.B. Teile des
Verpackungssignals), die auch im Vektor-Genom enthalten sein müssen. Durch
diese Homologien kann es zu Rekombinationen zwischen Vektorgenom
und den Verpackungskonstrukten und damit zur Freisetzung replikationskompetenter
Retroviren (z.B. einem HIV-Wildtypvirus, was hochgradig unerwünscht wäre) kommen,
so daß diese
Systeme von der Sicherheit her nicht mit MLV-Verpackungslinien vergleichbar
sind. Nicht alle Lentiviren sind jedoch für Menschen bzw. die zu behandelnde
Spezies infektiös,
so dass sich durch die Auswahl eines geeigneten, für die Spezies
nicht infektiösen
Retrovirus die Sicherheit des Systems erhöhen läßt, da in diesem Fall eine
Rekombination unwahrscheinlich ist.
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Um
das Problem zu lösen,
dass retrovirale Vektoren meist nur in unzureichenden Titern produziert werden
und durch die Instabilität
ihrer Hüllproteine
nicht weiter aufkonzentriert oder ohne Verlust der Infektiosität aufgereinigt
werden können,
können
die Vektoren mit dem rhabdoviralen G-Protein von Vesikulärem Choriomeningitisvirus
(VSV) pseudotypisiert werden (Emi et al., J. Virol. 65 (1991) 1202-1207;
J. C. Burns et al., PNAS 90 (1993) 8033-8037; T. Friedmann et al.,
Nat. Med. 1 (1995) 275-277; D. von Laer et al., J. Virol. 72 (1998)
1424-1430; R.A.
Weiss (1993), In: J.A. Levy (ed.), The Retroviridae, Plenum Press,
New York).
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Derartige,
mit VSV G-Protein pseudotypisierte retrovirale Vektoren wurden im
Stand der Technik bereits zur Therapie solider Tumore eingesetzt.
Verwendung dieser Vektoren zum Gentransfer der Herpes simplex-Virus
Thymidinkinase (HSV-tk) mit anschliessender Gancyclovir-Behandlung
in einem Ratten-Gliom-Modell zeigte eine hohe Effizienz der Transduktion
und eine gute therapeutische Wirkung (Galipeau et al., Cancer Res.
59 (1999) 2384-2394).
Ein Hauptproblem bei der Pseudotypisierung mit VSV-G ist jedoch
die Toxizität des
VSV G-Proteins.
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Zusätzlich reicht
für die
effektive Therapie eines soliden Tumors die Gabe von Virionen alleine
oft nicht aus, um eine ausreichende Transduktion aller Tumorzellen
zu gewährleisten.
Faktoren, die hier eine Rolle spielen, sind vor allem die Größe des Tumors,
aber auch seine Vaskularisierung. Daher wurden im Stand der Technik
bereits Versuche unternommen, in denen anstelle der Virionen die
diese produzierenden Verpackungszellen verabreicht wurden. Dazu
wurden klassische Verpackungszelllinien wie Fibroblasten, die amphotrope
MLV-Vektoren freisetzen,
verwendet. Diese Versuche ergaben eine verbesserte, jedoch noch
nicht ausreichende, therapeutisch wirksame Transduktion des Tumorgewebes
(z.B. Stand N, Weber F, Mariani L, Bernstein M, Gianella-Borradori
A, Long Z, Sorensen AG, Barbier N., Hum Gene Ther. 1999 Sep 20;10(14):2325-35.
A phase 1-2 clinical trial of gene therapy for recurrent glioblastoma
multiforme by tumor transduction with the herpes simplex thymidine
kinase gene followed by ganciclovir, GLI328 European-Canadian Study
Group). Insgesamt ist der Mangel an klinischem Erfolg der Gentherapie
von Gliomen mit retroviralen Vektoren nicht auf die Ineffektivität der therapeutischen
Gene, sondern auf die mangelnde Gentransfereffizienz zurückzuführen.
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Somit
stellt sich für
den Fachmann die Aufgabe, zur Herstellung einer gentherapeutischen
pharmazeutischen Zusammensetzung, vor allem zur Gentherapie solider
Tumore, geeignete Systeme zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile
der im Stand der Technik üblichen
Systeme vermeiden und geeignet sind, effektiv und trotzdem gezielt
Tumorzellen zu transduzieren.
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Diese
Aufgabe wird von dem Gegenstand der nachfolgenden Patentansprüche gelöst. Insbesondere betrifft
die Erfindung Verpackungszellen, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte
Virionen produzieren und die in der Lage sind, solide Tumore zu
infiltrieren, wobei die Verpackungszellen Stammzellen sind und wobei
menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, sowie die Verwendung
dieser Verpackungszellen zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zur Gentherapie solider Tumore. Es wird ferner eine
pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die die erfindungsgemäßen Verpackungszellen
umfasst.
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Es
konnte nunmehr festgestellt werden, dass bisher für die Gentherapie
verwendete Verpackungszelllinien nicht in solide Tumoren eindringen,
sondern sich nur in der Peripherie des Tumors befinden. Im Gegensatz
dazu wurde erfindungsgemäß überraschenderweise
festgestellt, dass Stammzellen, in der Lage sind, solide Tumore
zu infiltrieren.
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Die
Fähigkeit,
solide Tumore zu infiltrieren, spiegelt sich darin wieder, dass
sich in einem Zeitraum von ca. 1 bis 5 Tagen, bevorzugt auch bis
zu 20 Tage nach Injektion der Zellen in einen soliden Tumor oder
in dessen unmittelbare Umgebung mindestens 50 %, bevorzugt mindestens
60 %, am meisten bevorzugt mindestens 70 oder mindestens 80 % der
nachzuweisenden Zellen innerhalb des Tumors befinden. Dabei sind
bevorzugt mindestens 50 %, am meisten bevorzugt mindestens 75 %
der Tumormasse infiltriert. Im Detail ist ein geeigneter Test im
Beispielteil beschrieben.
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Besonders
positive Migrationseigenschaften weisen Stammzellen auf. Unter Stammzellen
werden im Rahmen dieser Erfindung sowohl multipotente als auch pluripotente
Stammzellen verstanden. Diese können nach
bekannten Verfahren hergestellt werden. Bevorzugt ist jedoch die
Verwendung adulter Stammzellen als Verpackungszellen, um ethische
Probleme bei Verwendung embryonaler Stammzellen zu vermeiden. Zu
den Stammzellen, die bereits eine grundlegende Differenzierung durchlaufen
haben, zählen
beispielsweise mesenchymale Stammzellen (MSC). Experimente zeigen,
dass MSC verschiedener Herkunft die Fähigkeit besitzen, solide Tumore,
insbesondere Hirntumore, zu infiltrieren. Eine besondere Eignung
zu diesem Zweck wurde auch für
multipotente adulte Progenitorzellen (MAPC) gezeigt. Die Generierung
derartiger Zellen ist im Stand der Technik bekannt (z.B. Y. Jiang
et al., Nature 418 (2992)41-49). Die Verwendung von MSC und/oder
MAPC als Verpackungszellen für
die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
solider Tumore ist daher eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.
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Im
Stand der Technik ist weiterhin bekannt, dass z.B. T-Lymphozyten, die
einen T-Zell-Rezeptor tragen, der spezifisch ein Tumorantigen erkennt,
solide Tumore infiltrieren können.
Tumor-infiltrierende Lymphozyten lassen sich z.B. nach der Resektion
eines Tumors aus diesem isolieren. Es wurde bereits versucht, die Migrationseigenschaften
dieser Zellen therapeutisch auszunutzen, indem z.B. das immunstimulierende
Gen IL-2 in Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) eingebracht wurde.
Derartige transgene TIL konnten in einigen Fällen eine Regression von Tumoren
(S.A. Rosenberg et al., N. Engl. J. of Med. 319 (1988) 1676-1680)
vermitteln.
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Bevorzugt
werden, um xenogene Immunreaktionen gegen die Verpackungszellen
zu minimieren, zur Gentherapie Verpackungszellen verwendet, die
aus der zu behandelnden Spezies stammen. Vorzugsweise sind die Verpackungszellen
humanen Ursprungs. Es ist möglich,
autologe Zellen als Verpackungszellen zu verwenden. Da die Zellen
nur vorübergehend
im Tumor verbleiben, kann man auch sehr gut allogene Zellen nehmen.
Aus Sicherheitsgründen
(Entstehung einer allogenen Neoplasie aus den Verpackungszellen
ist unwahrscheinlich) und Gründen
der vereinfachten Herstellung (Fertigarzneimittel versus Individualrezeptur)
wäre eine
allogene Zelle zu bevorzugen. Etwas Inflammation ist sogar eher
förderlich.
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Eine
Voraussetzung, die eine Gentherapie von Tumoren mit viralen Vektoren
ermöglicht,
ist die Spezifität
der Transduktion der Tumorzellen durch die Vektoren. Eine unspezifische Transduktion
von nicht-Tumorzellen führt
im Rahmen der Gentherapie zu Nebenwirkungen, da die Gentherapie
im allgemeinen auf die Zerstörung
der transduzierten Zellen abzielt. Die Infiltration der erfindungsgemäßen Verpackungszellen
in den Tumor verringert daher die Wahrscheinlichkeit, dass die von
den Verpackungszellen produzierten Virionen Zellen ausserhalb des
Tumors transduzieren.
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Eine
erhöhte
Spezifität
und eine Verringerung von Nebenwirkungen läßt sich weiterhin dadurch erreichen,
dass die durch den retroviralen Vektor übertragenen therapeutisch anwendbaren
Gene unter der Expressionskontrolle eines Promotors stehen, der
spezifisch in Tumorzellen aktiviert wird, im Gegensatz zur Verwendung
konstitutiver Promotoren. In diesem Fall muss jedoch ausgetestet
werden, in wie weit der Tumor-spezifische Promotor tatsächlich zu
einer Expression in den Tumorzellen führt, während umliegende Zellen diesen Promotor
nicht aktivieren.
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Eine
weiterer entscheidender Faktor für
die Spezifität
der Transduktion ist jedoch der Tropismus der Virionen. Dieser wird
im wesentlichen durch das Hüllprotein
des Virus bestimmt. In bisherigen Versuchen wurde ein sehr breites
Spektrum an Zielzellen für
retrovirale, mit LCMV-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren gefunden
(W. Beyer et al., J. Virol 76 (2002) 1488-1495). Fibroblastenzelllinien,
Epitheliale Zelllinien, Glioma- und Neuroblastomazelllinien, myeloide
Progenitorzelllinien, eine Hepatomazelllinie und Thymuszelllinie
aus den Spezies Mensch, Hamster, Hund und Maus ließen sich
mit hoher Effizienz von den mit LCMV Glykoprotein pseudotypisierten
Vektoren transduzieren. Auch primäre Glioblastomzellen und Oligodendrogliomzellen
konnten erfolgreich transduziert werden. Verschiedene Autoren haben
bereits die in vivo Transduktionsmuster retroviraler Vektoren, die
mit verschiedenen Glykoproteinen, u.a. mit LCMV-Glykoprotein, pseudotypisiert
waren, in Gehirn untersucht. Es wurde, wenn auch mit geringerer
Effezienz als mit andern Vektoren, z.B. VSV G-Protein pseudotypisierten Vektoren,
eine Transduktion verschiedener Zellen des Striatum, Thalamus und
Corpus callosum gefunden (D. Watson et al., Mol. Ther. 5 (2002)
528-537; L.-F. Wong
et al., Mol. Ther. 9 (2004) 101-111).
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Überraschenderweise
konnte nun gezeigt werden, dass retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein,
insbesondere mit LCMV-Glykoprotein
pseudotypisierte Vektoren in vivo spezifisch Hirntumore transduzieren.
Die Verwendung von Virionen ist insbesondere bei kleineren oder
gut vaskularisierten Tumoren empfehlenswert, da hier die bei einer
oder mehreren Applikationen eingebrachte Menge an Virionen zur Transduktion
einer ausreichenden Menge an Tumorzellen ausreichen kann, wobei
eine möglichst
vollständige
Transduktion aller Tumorzellen bevorzugt ist. Um die Anzahl der
Applikationen zu begrenzen, ist es, vor allem bei größeren Tumoren,
empfehlenswert, zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung
zur Behandlung solider Tumore Verpackungszellen zu verwenden, die
retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein (insbesondere LCMV-Glykoprotein) pseudotypisierte
Virionen produzieren.
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Gegenstand
der Erfindung ist daher die Verwendung von Verpackungszellen, die
retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein (insbesondere LCMV-Glykoprotein)
pseudotypisierte Virionen produzieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zur Gentherapie von Hirntumoren, wobei die Verpackungszellen
Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren
und wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind.
Die Applikation der Verpackungszellen erfolgt entweder durch stereotaktische
Injektion oder durch Einbringen in den Innenraum oder Injektion
in die Wand der Resektionshöhle
nach operativer Entfernung des Tumors.
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Unter
soliden Tumoren werden im Rahmen dieser Erfindung alle Tumore verstanden,
die nicht hämatopoetischen
Ursprungs sind, also beispielsweise Karzinome, z.B. Mamma-Karzinom,
oder Sarkome. Der Tumor kann beispielsweise ein Gliom, Neuroblastom,
Oligodendrogliom oder Astrocytom sein. Der Tumor kann gutartig sein,
bevorzugt ist der Tumor jedoch maligne, insbesondere ein malignes
Gliom. Maligne Gliome stellen den am häufigsten vorkommenden Hirntumor
dar und führen
besonders oft zum Tod der Patienten (Y. Kew et al., Curr. Opin.
Neurol. 16 (2003) 665-670). Sowohl solide Primärtumore als auch einzelne daraus
auswandernde Tumorzellen und Metastasen werden im Rahmen dieser
Erfindung als solide Tumore bezeichnet.
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Die
erfindungsgemäßen Verpackungszellen
produzieren retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein, insbesondere
LCMV-Glykoprotein, pseudotypisierte Virionen.
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Experimente
haben gezeigt, dass diese Virionen in vivo spezifisch die Zellen
eines Hirntumors infizieren. Insbesondere infizieren die Virionen
bei der Tumortherapie in vivo keine Neuronen. Darunter wird im Rahmen
dieser Erfindung verstanden, dass bei Injektion in einen Hirntumor
weniger als 5 %, bevorzugt weniger als 2 %, fast keine oder keine
der umliegenden Neuronen infiziert werden. Weiterhin infizieren
die Virionen bei der Tumortherapie in vivo nur zu einem geringen
Teil Astrozyten, bevorzugt weniger als 15 %, weniger als 10 % oder
weniger als 5 % der umliegenden Astrocyten. Hingegen wurden sogar
einzelne metastasierende Tumorzellen von den Virionen infiziert.
Diese hohe Spezifität
für die
Tumorzellen macht die Virionen besonders zur Behandlung von Tumoren,
vor allem von soliden Tumoren und insbesondere von Hirntumoren,
geeignet.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur Pseudotypisierung ein
Arenavirus-Glykoprotein, z.B. von Lassa oder LCMV, eingesetzt. Dabei
ist es möglich
oder kann sogar bevorzugt sein, statt des Wildtyp-Glykoproteins
ein Glykoprotein anderer LCMV- oder
Lassa-Stämme
einzusetzen. So können
leichte Variationen in der gp-Nukleinsäuresequenz bzw. in der Aminosäure-Sequenz
des exprimierten Hüllproteins
in verschiedenen Stämmen
den Zelltropismus (Wirtszellspektrum) erheblich verändern (M.
Matloubian et al., J. Virol. 67 (1993) 7340-7349; M.N. Teng, J.
Virol. 70 (1996) 8438-8443; King et al., J.Virol 64 (1990) 5611-5616).
Es wird damit erfindungsgemäß eine gezieltere
Transduktion des gewünschten
Zelltyps ermöglicht.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kann es daher von Vorteil sein, Verpackungssysteme
mit verschiedenen Glykoprotein-Varianten (GP-Varianten) für unterschiedliche
Anwendungen, wie die Therapie unterschiedlicher solider Tumore,
herzustellen. Derartige Varianten sind z.B. in M. Matloubian et
al., J. Virol 67 (1993) 7340-7349 oder M.N. Teng et al., J. Virol.
70 (1996) 8438-8443 offenbart. Der Tropismus von Varianten bezüglich eines
bestimmten Tumortyps lässt
sich experimentell, wie beispielhaft für Glioblastome gezeigt, testen.
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Auch
Wildtyp-LCMV kann verschiedene Zelltypen aus unterschiedlichen Geweben
und Spezies infizieren. Es wurde gezeigt, dass zumindest alpha-Dystroglykan,
das eine breite Expression zeigt, ein Rezeptor für LCMV sein kann (P. Borrow
et al., J. Virol. 66 (1992) 7270-7281; W. Cao et al., Science 282
(1998) 2079-2081). In der Flexibilität des Tropismus durch Mutationen
des Glykoproteins kann daher ein Hinweis gesehen werden, dass die
Glykoproteine an verschiedene, eng verwandte Rezeptoren oder einen
Rezeptor mit unterschiedlichen post-translationalen Modifikationen
binden könnten.
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Die
Hüllproteine
der Arenaviren werden zunächst
als Precursor-Polypeptid
exprimiert, GP-C, das durch eine zelluläre Protease post-translational
in GP-1 und GP-2 gespalten wird. Dabei interagiert GP-1 mit dem
Rezeptor alpha-Dystroglykan, während
GP-2 das für
die Fusion verantwortliche Peptid und die Transmembran-Domäne enthält.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung kann von den gp-Genen des eher
neurotropen LCMV-Stammes Armstrong, L(ARM) (L. Villarete et al.,
J. Virol. 68 (1994) 7490-7496) (für SEQ ID NO: 4 kodierender
Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 3) ausgegangen
werden. Vorzugsweise wird der eher hämatotropen Stammes WE (V. Romanowski
et al., Virus Res. 3, (1985) 101-114) (SEQ ID NO: 1) verwendet.
Besonders bevorzugt ist die Pseudotypisierung mit einer Variante
von LCMV-WE-HPI (LCMV-WE-HPIopt,
siehe SEQ ID NO: 27), in der die Benutzung der Kodons optimiert
wurde und "kryptische Spleiß-Regionen" entfernt wurden,
um eine verbesserte Expression zu erzielen.
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Durch
eine solche Optimierung der GP-Expression kann die Pseudotypisierung
verbessert werden, wobei auf eine zusätzliche Unterstützung durch
mindestens ein weiteres LCMV-Protein verzichtet werden kann.
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Eine
bevorzugte Variante ist das im Rahmen der vorliegenden Erfindung
beschriebene LCMV Glykoprotein WE-HPI. Die kodierende Nukleinsäuresequenz
gp (Open reading frame (ORF) in SEQ ID NO: 25 dargestellt) enthält gegenüber dem
LCMV-Stamm WE Mutationen an den Positionen 281, 329, 385, 397, 463, 521,
543, 631, 793, 1039, 1363 und 1370 und besitzt somit gegenüber dem
Glykoprotein vom LCMV-Stamm WE Aminosäureaustäusche an den Positionen 94,
110, 129, 133, 155, 174, 181, 211, 265, 347, 455 und 457. Diese
GP-Variante mit der in SEQ ID NO: 26 gezeigten Aminosäuresequenz
weist den Vorteil auf, daß sie
auch ohne zusätzliche
LCMV-Hilfsproteine stabil ist und gegenüber dem Stamm WE eine verbesserte
Pseudotypisierung bewirkt. Es wurde gezeigt, dass nur eine der Mutationen,
die die zunächst
veröffentlichte
Sequenz des LCMV-Glykoproteins
LCMV-WE gegenüber
der neu klonierten Sequenz LCMV-WE-HPI enthält, eine Leucin ⇒ Prolin-Mutation
an Aminosäure
110, die Prozessierung des exprimierten Proteins und damit die Expression
auf der Oberfläche
von Zellen beeinträchtigte
(W. Beyer et al., J. Virol. 75 (2001) 1061-1064). Varianten mit
dieser Mutation sollten daher bevorzugt nicht für die Pseudotypisierung verwendet
werden.
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Die
Erfindung betrifft daher ferner die Verwendung einer Variante des
Lymphozytären
Chroriomeningitis Virus, die das Gen gp enthält, das für die in SEQ ID NO: 26 dargestellte
Sequenz oder einen Teil derselben kodiert, wobei das gp-Gen vorzugsweise
die in SEQ ID NO: 25 dargestellte Sequenz oder einen Teil derselben aufweist.
Ferner ist erfindungsgemäß ein Protein
mit der in SEQ ID NO: 26 gezeigten Aminosäuresequenz oder einem Teil
derselben eingeschlossen sowie eine für dieses Protein kodierende
Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise
die in SEQ ID NO: 25 dargestellte Sequenz oder ein Teil derselben.
Diese Virusvariante sowie die letztgenannten Nuklein- und Aminosäuresequenzen
sind, z.B. ausgehend von der LCMV-Variante WE, durch dem Fachmann
allgemein bekannte Verfahren (z.B. durch Einführung von Punktmutationen)
erhältlich.
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„LCMV" umfaßt erfindungsgemäß, wie bereits
erwähnt,
also neben dem LCMV Wildtyp auch andere LCMV-Stämme, insbesondere LCMV-WE-HPI (siehe SEQ ID
NO: 25) oder die künstlich
hergestellte kodonoptimierte und „spleißbereinigte" Variante LCMV-WE-HPIopt (siehe SEQ
ID NO 27). Insbesondere kann im Rahmen der Erfindung für die Pseudotypisierung
ein Glykoprotein verwendet werden, bei dem die Nukleotidsequenz
des Glykoproteingens für
ein Glykoprotein mit mindestens 80 % Homologie zu der Aminosäuresequenz des
Glykoproteins von LCMV-Wildtyp oder von LCMV-WE, LCMV-WE-HPI, LCMV-WE-HPIopt
oder Lassa-Virus kodiert (siehe SEQ ID NOS: 1, 25, 27, 28). Bevorzugt
beträgt
die Homologie mindestens 90 %, mindestens 95 % oder etwa 99 %.
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Eine
besondere Ausführungsform
dieser Erfindung betrifft Stammzellen als Verpackungszellen zur Gentherapie
solider Tumore, die ein oder mehrere Expressionskassetten für die retroviralen
Gene gag, pol und ferner ein für
Arenavirus- Glykoprotein
kodierendes Gen umfassen, wobei das Arenavirus-Glykoprotein insbesondere Lassa-Virus
Glykoprotein ist.
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Zur
Expression des Glykoproteins eignen sich allgemein Expressionsvektoren,
die eine hohe stabile Genexpression in eukaryontischen Zellen ermöglichen.
Die Wahl des Expressionsvektors ist für die Verpackung der retroviralen
Pseudotypen jedoch nur insoweit entscheidend, als er ein hohes und
stabiles Expressionsniveau gewährleisten
muß, d.h.
ein Expressionsniveau, das hoch genug ist, um die Bildung von Pseudotypen
zu ermöglichen,
und das dauerhaft (stabil) ist, ohne daß es zum Abschalten des Promoters
kommt.
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Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt sind die folgenden beiden Expressionskassetten (S. Mizushima,
Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322, T. Uetsuki, J. Biol. Chem. 264
(1989) 5791-5798):
(CMV-Promoter)--(β-Globin-Intron-2)--(gp)--(SV40
poly A-Signal)
und
(EF-1alpha-Promoter)--(gp)--(poly-A-Signal
des G-CSF-Genes).
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Die
Sequenzen für
die Bestandteile der Expressionskassetten sind im Sequenzprotokoll
dargestellt oder allgemein bekannt:
Cytomegalovirus-Promoter
(CMV-Promoter): (M. Boshart et al., Cell 41 (1958) 521-530; F. Langle-Rouault
et al., Virol. 72(7) 6181-5 (1998))
betaglobin-Intron-2: (Jeffreys,
A.J. et al., Cell 12 (1977) 1097-1108)
SV40 poly A-Signal:
(M. Boshart et al., Cell 41 (1958) 521-530; F. Langle-Rouault et
al., Virol. 72(7) 6181-5 (1998))
EF-1alpha-Promoter: SEQ ID
NO: 9 (S. Mizushima, Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322, T. Uetsuki,
J. Biol. Chem. 264 (1989) 5791-5798).
G-CSF poly A-Signal:
(S. Mizushima, Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322, T. Uetsuki, J.
Biol. Chem. 264 (1989) 5791-5798).
gp (LCMV): vgl. z.B. SEQ
ID NO: 1, 3, für
SEQ ID NO: 4 kodierender Bereich (siehe auch Anlage zum Sequenzprotokoll).
gp
(Lassa): vgl. SEQ ID NO 28
-
Beispielhafte
Sequenzen für
derartige Expressionsplasmide sind in der EMBL Datenbank unter den Zugangsnummern
AJ318512 (pHCMV-LCMV-GP(WE),
AJ318513 (pHCMV-LCMV-GP(WE-HPI) hinterlegt.
-
Änderungen
in den jeweiligen Nukleinsäuresequenzen
sind möglich,
solange die Funktionalität
der Expressionskassetten erhalten bleibt, d.h. deren erfindungsgemäße Verwendung
die Pseudotypisierung der Verpackungszellen ermöglicht und auch die Transfektion
der Zielzellen und die stabile Integration der Transgene in das
Wirtsgenom nicht behindert.
-
Ferner
zeigt auch ein episomaler EBV-Expressionsvektor (Epstein-Barr-Virus; vgl.
F. Langle-Rouault et al., Virol. 72(7) (1998) 6181-5) (pCep4) der
Firma Invitrogen hohe Expression und kommt daher im Rahmen der vorliegenden
Erfindung bevorzugt in Betracht.
-
Retroviren,
die mit dem Arenavirus Lymphozytärer
Choriomeningitisvirus (LCMV) pseudotypisiert sind, und dafür geeignete
retrovirale Verpackungssysteme sind im Stand der Technik bekannt
(
EP 1 006 196 ; Miletic et
al., J. Virol. 73 (1999) 6114-6116). Die dort beschriebenen, mit
LCMV-Glykoprotein pseudotypisierten Vektoren sind für die Verwendung
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie von
Hirntumoren geeignet. Für
die Pseudotypisierung werden im allgemeinen Verpackungszellen verwendet, die
für das
retrovirale Hüllprotein
env defizient sind, so dass nur dann Virionen produziert werden,
wenn ein Hüllprotein
anderweitig zur Verfügung
gestellt wird, z.B. durch Infektion der Zellen mit dem Virus, z.B.
mit LCMV, oder durch Transduktion mit einem Plasmid mit einer Expressionskassette
für das
entsprechende Hüllprotein,
z.B. das Glykoprotein des LCMV.
-
Im
Vergleich zu Vektoren, die das oft verwendete Amphotrophe murine
Leukämivirus-Hüllprotein (A-MLVenv)
oder VSV-G enthalten, zeigt sich bei LCMV-pseudotypisierten Vektoren
eine ähnliche
Effizienz in der Produktion und Stabilität. Es können jedoch – im Gegensatz
zu VSV-G – mit
LCMV Glykoprotein stabile, das Glykoprotein konstitutiv exprimierende
Verpackungszelllinien generiert werden, da dieses Protein nicht
cytopathisch wirkt. Die pseudotypisierten Virionen sind auch stabil
genug für
eine starke Aufkonzentrierung durch Ultrazentrifugation, so dass
LCMV-pseudotypisierte retrovirale Vektoren Grundvoraussetzungen
für die
Eignung zur Gentherapie aufweisen.
-
Das
Retrovirus, das mit dem Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisiert
ist, kann ein Onkoretrovirus oder ein Lentivirus sein. Ein häufig verwendetes
Onkoretrovirus ist z.B. MLV (Murines Leukämivirus), insbesondere MoMLV
(Moloney MLV). Vorzugsweise verwendet man jedoch ein Lentivirus,
insbesondere HIV (Humanes Immunodefizienzvirus), SIV (Simian Immunodefizienzvirus),
EIAV (Equines Infektiöses
Anämievirus)
oder FIV (Felines Immunodefizienzvirus), da Lentiviren auch ruhende
Zellen transduzieren können.
-
Die
Verpackungszellen umfassen die retroviralen Gene (die hier angegebenen
Sequenzen beziehen sich beispielhaft auf MoMLV, die Sequenzen der
Gene anderer Retroviren sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt)
gag (für
SEQ ID NO: 12 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll,
ZU SEQ ID NO: 11), pol (für
SEQ ID NO: 13 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll,
ZU SEQ ID NO: 11) und gegebenenfalls das retrovirale Gen env (für SEQ ID
NO: 14 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU
SEQ ID NO: 11) und/oder regulatorische retrovirale Gene (im Falle
lentiviraler Verpackungssysteme z.B. das für das lentivirale Rev-Protein
kodierende Gen, das ein Spleißen
der retroviralen genomischen RNA verhindert) und ferner das für die Glykoproteine
GP-1 und GP-2 eines Arenavirus kodierende Gen gp (LCMV: z.B. für SEQ ID
NO: 4 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU
SEQ ID NO: 3; Lassa: SEQ ID NO: 28) oder einen Teil desselben. Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
können
die Verpackungssysteme auch die gag- und pol-Genprodukte von Lentiviren
enthalten. In diesem Zusammenhang könnte es für eine effiziente Produktion
infektiöser
Lentivirusvektoren erforderlich sein, zusätzlich akzessorische lentivirale
Gene wie rev (für
SEQ ID NO: 21 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll,
ZU SEQ ID NO: 15) oder tat (für
SEQ ID NO: 20 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll,
ZU SEQ ID NO: 15) bei HIV-Vektoren zu exprimieren. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung können
Arenavirus-Glykoproteine in allen lentiviralen Verpackungssystemen
zur Pseudotypisierung eingesetzt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verpackungszellen
umfassen bevorzugt ein oder mehrere Expressionskassetten für die retroviralen
Gene gag, pol, ein für
ein Arenavirus-Glykoprotein kodierendes Gen und ferner einen retroviralen
Gentransfervektor zur Verpackung in die pseudotypisierten Virionen,
der mindestens ein therapeutisch anwendbares Transgen und/oder Markergen.
Ferner können
die Verpackungszellen auch das Gen tat, rev und/oder env umfassen.
Ferner eingeschlossen sind Nukleinsäuresequenzen, die Abweichungen
(Punktmutationen, Deletionen) in den Sequenzen aufweisen (Derivate).
Bevorzugt haben die Nukleinsäuren
eine Homologie von mindestens 70 %, mindestens 80 %, bevorzugt mindestens
90 oder 95 % zu der ursprünglichen Nukleinsäure. Entscheidend
ist, dass bei der erfindungsgemäßen Verwendung
die Pseudotypisierung von retroviralen Gentransferpartikeln gewährleistet
bleibt und auch die Transduktion der Zielzellen sowie die stabile Integration
der Transgene in das Wirtsgenom nicht behindert wird. Im folgenden
sollen diese Derivate stets mitumfaßt sein, wenn ein beliebiges
Gen als solches erwähnt
wird.
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Erfindungsgemäß werden
ferner Pseudotyp-Verpackungssysteme bereitgestellt, in denen neben
dem gp-Genprodukt (SEQ ID NO: 4) ein oder mehrere weitere Gene von
Arenaviren, z.B. LCMV exprimiert werden, wie zum Beispiel das für das Nukleoprotein
kodierende Gen np (LCMV: für
SEQ ID NO: 5 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll,
ZU SEQ ID NO: 3), das für
ein Protein mit unbekannter Funktion kodierenden Gen z (LCMV: für SEQ ID
NO: 8 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU
SEQ ID NO: 6) und das für
die RNA-Polymerase
kodierende Gen l (LCMV: für
SEQ ID NO: 7 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll,
ZU SEQ ID NO: 6).
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Diese
Gene können
gemäß einer
besonderen Ausführungsform
der Erfindung z.B. vom WE- oder Armstrong-Stamm des LCMV stammen.
In diesem Zusammenhang können
entweder die vollständigen
Sequenzen der Gene np, z und/oder l eingesetzt werden (SEQ ID NOs:
s.o.) oder Teile derselben verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verpackungszellen
können
daher zusätzlich
zu dem gp-Gen des LCMV mindestens ein Gen aus der Gruppe bestehend
aus dem für
das Nukleoprotein kodierenden Gen np, dem für die RNA-Polymerase kodierenden
Gen l und dem für
ein Protein mit unbekannter Funktion kodierenden Gen z des LCMV
umfassen.
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Die
erfindungsgemäßen Verpackungszellen
und die davon produzierten Virionen umfassen mindestens ein therapeutisch
anwendbares Transgen und/oder Markergen. Unter einem therapeutisch
anwendbaren Markergen wird dabei ein Gen verstanden, das in der
Tumortherapie dazu verwendet werden kann, um direkt oder indirekt
das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen oder diese zu töten. Beispielsweise
kann das Suizid-Gen Herpes simplex-Thymidinkinase (HSV-tk) und/oder
Cytosin-Deaminase verwendet werden. HSV-tk macht die damit transfizierten
Zellen empfindlich gegenüber
Gancyclovir. Weiterhin kann ein therapeutisch anwendbares Gen immunstimulatorisch
wirken. Eine solche Wirkung haben z.B. IL-4 oder Flt3L. Auch eine
Therapie mit B7 oder IL-2 kann zur Regression von Tumoren führen, wie
für Hirntumore
beispielhaft von T. Lichtor et al. gezeigt wurde (J. Neurooncol
63 (2003) 247-259). Bei der Therapie maligner Gliome wurden u.a.
Erfolge bei einer Expression von Antisense-DNA erzielt, die z.B.
gegen TGF-beta gerichtet ist (K. Lou, Ann. Med. 36 (2004) 2-8).
Weitere Gene, die therapeutisch zur Tumortherapie verwendet werden
können,
sind z.B. in Y. Kew et al., Curr. Opin. Neurol. 16 (2003) 665-670,
beschrieben. Selbstverständlich
können
auch zwei oder mehr therapeutisch anwendbare Gene, sowie gegebenenfalls
zusätzlich
ein oder mehrere Markergene umfasst sein.
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Bevorzugt
ist das Markergen lacZ, ein Antibiotikaresistenzgen, wie z.B. neo,
und/oder ein Gen für
ein Fluoreszenz-Protein, wie z.B. eGFP (enhanced green fluorescent
Protein). Vorzugsweise wird das therapeutisch anwendbare Transgen
und/oder Markergen nach der Therapie spezifisch in den Zellen des
Tumors exprimiert.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Verpackungszellen
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ferner
geeignete Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe umfaßt. Gegenstand
der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
zur Gentherapie solider Tumore geeignet ist und die Verpackungszellen
umfasst, die mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren
produzieren und infiltrierende Verpackungszellen sind und/oder mit
Lassa-Virus-Glykoprotein
pseudotypisiert sind, wobei die Verpackungszellen Stammzellen sind,
die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren und wobei menschliche
embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind. Die pharmazeutische
Zusammensetzung kann ferner geeignete Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe
umfassen.
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Bevorzugt
werden die Vepackungszellen so formuliert, dass sie direkt in den
Tumor eingebracht werden können,
beispielsweise durch Injektion in den Tumor oder seine direkte Umgebung.
Bei einem Hirntumor ist eine intracraniale Injektion geeignet. Es
ist jedoch auch möglich,
eine indirekte Verabreichung zu wählen, da die infiltrierenden
Verpackungszellen spezifisch in den Tumor einwandern und die Virionen
eine hohe Spezifität
für die
Tumorzellen aufweisen. Beispielsweise können die Verpackungszellen
intravenös
(i.v.) verabreicht werden. Besonders bevorzugt ist eine Applikation
nach Resektion eines Tumors, bei der die pharmazeutische Zusammensetzung
in die Resektionshöhle
oder ihre direkte Umgebung gegeben wird.
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Beispiele
-
Beispiel 1: Generierung von Verpackungszellen
und Virionen
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Produktion
von Verpackungszellen. Multipotente adulte Progenitorzellen (MAPC)
aus Ratten (Fischer-Ratten, Sprague-Dawley-Ratten) werden nach bekannten
Verfahren gewonnen (Y. Jiang et al., Nature 418 (2992)41-49).
-
Diese
Zellen werden mit dem Expressionsvektor pGag-Pol-IRES-bsr (S. Morita
et al., Gene Therapy 7 (2000) 1063-1066) transfiziert und mit Blasticidin
10 Tage lang selektioniert. Der daraus resultierende Zellpool exprimiert
stabil MoMLVgagpol.
-
Stabile
LCMV-GP Expression in diesem Zellpool wird durch Transduktion mit
dem lentiviralen selbstinaktivierenden (SIN) Vektor SEW/GPopt erzielt.
Der lentivirale SIN Vektor SEW/GPopt wurde auf Basis des Vektors
pHR'SIN.cPPT-SEW
(C. Demaison et al., Hum. Gene Ther. 13 (2002) 803-813) entwickelt,
in dem das GFP-Gen durch das kodonoptimierte LCMV-WE-HPIopt ersetzt
wurde. Zur Produktion lentiviraler SEW/GPopt-Vektoren wurden 5μg SEW/GPopt
mit 5μg
pRSVrev und 15μg
pMDLg/RRE (T. Dull et al., Journal of Virology 72 (1998) 8463-8471)
in 293T Zellen kotransfiziert. Zellkulturüberstände wurden 48 bzw. 72 Stunden
nach Transfektion abgenommen und direkt zur Transduktion MoMLVgagpol
exprimierender MAPC-Zellpools verwendet. Drei Tage nach der Transduktion
wurden die Zellpools mittels Durchflusszytometrie auf Expression
von LCMV-GP untersucht.
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Durchflußzytometrische
Analyse der LCMV-GP-Expression. Zur Analyse der Expression des LCMV Glykoproteins
wurden 5 × 105 Zellen geerntet, pelletiert und mit einem
monoklonalen Antikörper
gegen LCMV-GP1 inkubiert (M. Bruns et al., Virology 130 (1983) 247-251).
Nach 20-minütiger
Inkubation auf Eis wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) gewaschen und für
weitere 20 Minuten in einer 1:10 Verdünnung eines PE-markierten Ziege
Anti-Maus Antikörpers
inkubiert (Dako, Glostrup, Dänemark).
Nach drei abschließenden
Waschschritten in PBS wurden die Zellen mittels eines FACScalibur
Geräts analysiert
(Becton Dickinson, Heidelberg).
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Produktion
von LCMV Pseudotypen. Zur Untersuchung der Vektorproduktion in stabil
MoMLVgasgpol und LCMV-GPopt exprimierenden Zellpools wurden diese
zunächst
mit einem retroviralen Vektor, z.B. MP7IEGFP (A. Schambach et al.
Molecular Therapy 2 (2000) 435-445), transduziert.
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Dafür wurden
retrovirale MP71EGFP-Vektorüberstände durch
Kotransfektion von 293T Zellen mit pGag-Pol-IRES-bsr (12μg), MP71EGFP
(7μg) pHCMV-LCMV-GP
(WE-HPI) (2μg)
produziert. Das Expressionsplasmid pHCMV-LCMV-GP (WE-HPI) wurde
auf Basis der bekannten Sequenz des WE-HPI-Stammes (SEQ ID NO: 26;
EMBL database accession no. AJ297484) und dem pHCMV Expressionsvektors
(V. Romanowski et al., Virus Res. 3 (1985) 101-114; J.-K. Yee, Methods
Cell Biol. 43 (1994) 99-112) entwickelt (W.R. Beyer et al., J. Virol.
75 (2001) 1061-1064; EMBL database accession no. AJ318513).
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Fünf Tage
nach Transduktion der Verpackungszellen mit MP71EGFP werden Zellkulturüberstände der stabil
exprimierenden Pools abgenommen und je 0,5ml auf 5 × 104 Indikatorzellen transferiert. Expression
des EGFP-Proteins (enhanced green fluorescence Protein) in den Indikatorzellen
wurde drei Tage später
mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
-
Der
retrovirale Vektor MP71EGFP wurde mit Hilfe der GagPol- und LCMV-GP-Proteine,
die in den stabil exprimierenden Zellpools vorhanden sind, in infektiöse Partikel
verpackt. Die MAPC-Zellen sind als Verpackungszellen geeignet.
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Beispiel 2: Selektive Transduktion von
Tumoren
-
Material und Methoden
-
Zelllinien.
9L Ratten-Gliosarcom-, 294 humane Nieren- und TE671 humane Fibroblasten-Zellinien wurden
von der American Type Culture Collection erhalten. G62 humane Gliom-Zellen
wurden freundlicherweise von M. Westphal (Universitätskrankenhaus
Eppendorf, Deutschland) zur Verfügung
gestellt. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt durch 10 % Fetales Kälberserum
und Penicillin/Streptomycin in einer feuchten Atmosphäre bei 5
% CO2 kultiviert.
-
Transduktion
von 9L Zellen mit DsRed. DsRed in einem pMP71-Vektorgerüst wurde freundlicherweise von
Norbert Dinauer zur Verfügung
gestellt. Zur Transduktion der 9L Zellen mit DsRed wurdeen 9L Zellen
in 24-Well(Loch)-Platten in einer Dichte von 5 × 104 Zellen/well
ausgesäat.
Nach 4 Stunden wurden retrovirale Überstände zur Verpackung des pMP71
DsRed Vektors hinzugefügt.
Die Platten wurden für
1 Stunde bei 1000xg zentrifugiert. Die Transduktion der Zellen wurde
16 Stunden nach der ersten Transduktion wiederholt. Die Expression
von DsRed wurde fluoreszenzmikroskopisch bestätigt (Nicon Eclipse TE300,
Düsseldorf, Deutschland).
Zur Isolation DsRed exprimierender einzelner Klone wurden 100 transduzierte
9L Zellen in 10 cm Schalen ausplattiert und Kolonien wachsen gelassen.
DsRed-positive Kolonien wurden mit Fluoreszenz-Mikroskopie identifiziert und in getrennte
Wells von 24-Well-Platten übertragen.
Das Expressionsniveau isolierter Klone wurde durchflußcytometrisch
mit einem FACS-Calibur bestimmt (Becton Dickinson, San Jose, Californien).
Zur in vivo Implantation wurde ein Klon ausgewählt, der 95 % DsRed-positive Zellen enthielt.
-
Transiente Produktion von Pseudotypen
lentiviraler Vektoren.
-
Lentivirale
Vektoren wurden durch transiente Transfektionen von 293T Zellen
produziert. 16 Stunden vor der Transfektion wurden 5 × 106 Zellen in Kulturgefäßen mit 10 cm Durchmesser in
DMEM/FBS ausgesät. Eine
Stunde vor der Transfektion wurde das Kulturmedium gegen 10 ml DMEM/FBS/PS
pro Gefäß ausgewechselt,
mit 25 μmol/l
Chloroquin, 50 U Penicillin/ml, 50 μg/ml Streptomycin (PS, Gibco-Invitrogen).
Für die Transfektion
eines Kulturgefäßes wurden
dann 5 μg
pRRL.sinCMVeGFPpre, 5 μg
pRSV-Rev, 15 μg pMDLg/pRRE
(Dull et al., J. Virol. 72 (1998) 8463-8471), und 1-2 μg eines pHCMV Expressionsplasmids
für das
Glykoprotein des LCMV, pHCMV-LCMV-GP (WE-HPI) (W.R. Beyer et al.,
J. Virol. 75 (2001) 1061-1064), verwendet. Eine Mischung, die 450 μl des Plasmids
in ddH2O und 50 μl 2,5 mol/l CaCl2 enthielt,
wurde gut gemischt und dann tropfenweise zu 500 μl zweifach HEPES-gepufferter
Salzlösung
(280 mmol/l NaCl, 100 mmol/l HEPES, 1,5 mmol/l Na2HPO4, pH 7,1) hinzugefügt. Nach dem Vortexen wurde
der Niederschlag sofort zu den Kulturen hinzugefügt. Das Medium wurde nach acht
Stunden gegen 10 ml pro Gefäß DMEM/FBS/PS mit
20 mmol/l HEPES ausgetauscht. Vektorenthaltende Überstände wurden 24 Stunden nach
der Transfektion und danach alle 8-16 Stunden für einen Zeitraum von 2 Tagen
gesammelt. Die Zellkulturüberstände wurden gepoolt
und durch einen MILEX GP Filter mit 0,22 μm Porengröße (Millipore, Redford, Mass.)
filtriert. Für
in vivo und in vitro (kultivierte Gehirnzellen) Anwendungen, wurden
die Vektorüberstände durch
Ultrazentrifugation bei 19.500 rpm für 2 Stunden in einem SW28-Rotor
(Beckmann Instruments, Kalifornien) konzentriert.
-
Vektortitration.
Lentivirale Vektortiter wurden duch Transduktion verschiedener Zelllinien
bestimt. Serielle Verdünnungen
der Zellüberstände wurden
hergestellt und 0,5 ml jeder Verdünnung wurden zu 5 × 104 Zellen hinzugefügt und in einem Well einer
24-Wellplatte vier Stunden vor der Transduktion ausgesät. Die Platten
wurden für
eine Stunde bei 1000 g zentrifugiert. Die Zellen wurden 65 Stunden
nach der Transduktion durchflusscytometrisch mit einem FACSCalibur
(Becton Dickinson, San José,
Kalifornien) auf GFP-Expression untersucht. Die Titer wurden aus
den Verdünnungen
errechnet, die zu 0,5% bis 20% eGFP positiven Zellen führten, einem
Bereich der linearen Relation zwischen Vektoreinsatz und Prozentsatz
transduzierter Zellen, da multiple Integrationen von Vektor in die
Zielzelle normalerweise nicht erwartet werden.
-
Ratten-Hippocampus
Neuronen Kultur. Primäre
Hippocampus Neuronen Zellkulturen wurden, wie bereits beschrieben,
hergestellt (Neumann et al., Science 269 (1995) 549-552). Im wesentlichen
wurden Hippocampi aus dem gesamten Hirn von Wistarratten an Tag
16 der Embryonalentwicklung isoliert, die Hirnhaut wurde entfernt.
Das beschnittene Gewebe wurde durch Zerreiben mit einer sterilen
Pasteurpipette dissoziiert. 5 × 104 Zellen pro ml wurden in Vierkammerobjektträger, die
mit Poly-L-Ornithin (0,5 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) in 0,15 mol/l
Borsäure
vorbehandelt wurden, gegeben. Die Zellen wurden in chemisch definiertem
Medium kultiviert, das basales Eagle-Medium (BME, Invitrogen, Gaithersburg,
MD) mit B27 Ergänzung
(2% (v/v), Invitrogen) und Glucose (1% (v/v), 45%, Sigma) enthielt.
-
Für Ratten-Astrozyten
angereicherte Gliazellkultur. Hippocampi von Wistarratten wurden
an Tag 16 der Embryonalentwicklung isoliert und, wie für die neuronale
Hippocampuszubereitung beschrieben, in Einzelzellsuspensionen dissoziiert.
Zellen wurden in 50 ml Gewebekulturflaschen ausplattiert, die mit
Poly-L-Lysin (5 μg/ml, Sigma)
vorbehandelt wurden. Die Zellen wurden in Serum kultiviert, das
Medium mit MEM-D-Valin (Invitrogen), 10% durch Hitze inaktiviertem
FCS (Pan System, Würzburg,
Deutschland) und 1% L-Glutamin enthielt. Für Astrozyten angereicherte
Gliazellen wurden für
10-20 Tage kultiviert und dann in BME mit B27 Ergänzung (2%
(v/v), Invitrogen) und Glucose (1% (v/v), 45%, Sigma) in einer Dichte
von 2 × 104 Zellen/ml in Vierkammerobjekträgern vor
der Transduktion ausplattiert.
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Insgesamt
waren, wie mit einer Immunomarkierung mit Kaninchenantikörpern gegen
GFAP (10μg/ml, Dako,
Glostrup, Dänemark)
bestimmt wurde, 94% (+3% SD) der Zellen Astrozyten.
-
Transduktion
kultivierter Gehirnzellen. 14 Tage nach dem Ausplattieren wurden
Neuronen und Astrozyten mit lentiviralen pseudotypisierten Vektoren
transduziert, die das eGFP Markergen trugen. Zwei Tage nach der
Transduktion wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert und
mit monoklonalem Maus-Anti-beta-Tubulin-III
Antikörper
(Sigma) auf Neuronen und monoklonalem Kaninchen-Anti-GFAP Antikörper (Dako) auf
Astrozyten gefärbt.
Die Zellen wurden über
Nacht bei 4° C
mit dem Primärantikörper inkubiert.
Cy3-Ziege-Anti-Maus und Cy3-Ziege-Anti-Kaninchen wurden als Sekundärantikörper für zwei Stunden
bei Raumtemperatur verwendet. Die relativen Zahlen der transduzierten
(eGFP-positiven) und untransduzierten (eGFP-negativen) neuronalen
(beta-Tubulin-III positiven) und astrozytären (GFAP-positiven) Zellen wurde fluoreszenzmikroskopisch
durch das Auszählen
von 10 Kamerafeldern für
jeden Pseudotyp bestimmt.
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Tumorimplantation und Einbringen
lentiviraler Vektoren
-
Erwachsene
weibliche Fischer 344 Raten (Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland)
wurden durch i.p. Injektion von Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (2
mg/kg) anästhetisiert.
Intracraniale 9L Ds Red-Tumoren wurden etabliert, indem 1 × 105 9L Ds Red-Zellen (in 5μl PBS) unter Verwendung einer
Hamilton-Spritze in einem stereotaktischen Apparat (Stoelting, IL)
in das rechte Striatum injiziert wurden. Die verwendeten Koordinaten
waren 4 mm lateral gegenüber
dem Bregma und in 5 mm Tiefe gegenüber der duralen Oberfläche. 6 Tage
nach der Tumorimplantation wurden die Ratten anästhetisiert und lentivirale
Vektor-Pseudotypen
mit Titern im Bereich von 2 × 106 bis 1 × 107 transduzierenden Units (TU)/ml wurden unter
Verwendung derselben stereotaktischen Koordinaten und in 1 mm Entfernung
(7 verschiedene Orte) injiziert. Ein Gesamtvolumen von 10 μl wurde in
jeden Tumor injiziert. Fischerratten, die keine Tumorzellen erhielten,
wurden anästhetisiert
und lentivirale Pseudotypen wurden in das rechte Striatum oder den
rechten Hippocampus injiziert. Die für die Hippocampusregion verwendeten
Koordinaten waren 4,5 mm lateral gegenüber dem Bregma, 5,5 mm hinter
der coronalen Platte und 3 mm tief gegenüber der duralen Oberfläche.
-
Analyse
von Rattengehirn auf Transduktion durch Lentiviren. 7 (tumortragende
Ratten) und 14 Tage (Ratten ohne Tumor) nach dem Einbringen des
lentiviralen Vektors wurden die Tiere euthanisiert und mit 4% Paraformaldehyd
durchströmt.
Das Gehirn wurde entfernt, 3 Tage in 30% Sucrose suspendiert und
dann in mit flüssigem
Stickstoff gekühltem
Isopentan schockgefroren. Coronale Sektionen (12 μm) wurden
mit einem Cryostat hergestellt und entweder mit Kaninchen-Anti-GFAP-Antikörpern (Dako,
Hamburg, Deutschland) auf Astrozyten oder Maus-Anti-NeuN-Antikörpern (Chemicon,
Hofheim, Deutschland) auf Neuronen gefärbt. Primäre Antikörper wurden über Nacht
bei 4° C
inkubiert. Cy3-Ziege-Anti-Maus und Cy3-Ziege-Anti-Kaninchen (Dianova,
Hamburg, Deutschland) wurden als Sekundärantikörper für zwei Stunden bei Raumtemperatur
benutzt. Die Sektionen wurden unter einem Floureszenz-Mikroskop
untersucht (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Transduktionseffizienzen
in infizierten Tumorregionen wurden geschätzt (0-10%, 10-50% und 50-100%).
Zusätzlich
wurden die Sektionen mit Confokaler Laser Scanning Mikroskopie (Leica,
UK) analysiert.
-
Ergebnisse
-
Mit LCMV GP- und VSV G-pseudotypisierte
lentivirale Vektoren transduzieren 9L Tumorzellen in vitro
-
Es
wurde die Transduktionseffizienz sowohl VSV G- als auch LCMV GP-pseudotypisierter
lentiviraler Vektoren in den Ratten gliomzelllinien 9L und 9LDsred
(verwendet für
Tumorimplantation) in vitro verglichen. Die humane epitheliale Zelllinie
TE671, die sowohl durch mit VSV G als auch mit LCMV pseudotypisierte
Vektoren transduziert werden konnte, wie in einer vorherigen Untersuchung
gezeigt (Beyer et al., 2002, Loc. cit.), wurde als Infektionskontrolle
verwendet. Es wurden Endpunktverdünnungen mit 9L, 9LDsred und
TE671-Zellen durchgeführt,
und der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde mittels durchflusszytometrischer
Analyse gemessen. Beide Vektoren transduzierten 9L Zellen, VSV G-Pseudotypen
jedoch mit einer höheren
Effizienz (Tabelle 1). Die relative Transduktion im Vergleich zu
TE671 war für
LCMV 0,65 und für
VSV G Pseudotypen 1,91. Weiterhin unterschieden sich die Transduktionseffizienzen
für 9L
und 9LDsred Tumorzellen in vitro nicht signifikant (Tabelle 1). Tabelle 1: Vektortiter pseudotypisierter
lentiviraler Vektoren gegenüber
TE671 und Gliom-Zelllinien
Zelllinie (Zahl der Experimente) | LCMV GP | VSV G |
Pseudotyp
Titer [TU/ml] (± SD) | Titer
gegnüber TE671
(± SD) | Pseudotyp
Titer [tu/ml] (± SD) | Titer
gegenüber TE671
(± SD) |
TE671
(4) | 2,75
(± 1,07) × 104 | 1 | 6,08
(± 6,00) × 104 | 1 |
9L
(4) | 1,80
(± 0,78) × 104 | 0,65
(± 0.03) | 8,83
(± 5,81) × 104 | 1,91
(± 0,63) |
9LDsRed
(2) | 1,29
(± 1,00) × 104 | 0,35
(± 0,21) | 8,35
(± 5,97) × 104 | 1,89
(± 0,07) |
-
Zellinien
wurden mit LCMV GP- oder VSV G-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren
transduziert, die eGFP verpackten. Die Titer wurden durch FACS Analyse
gemessen. Die Ergebnisse stellen Durchschnitt und Standardabweichung
von mindestens zwei Experimenten dar.
-
VSV G-Pseudotypen transduzieren kultivierte
Neuronen und Astrozyten effizienter als LCMV GP Pseudotypen.
-
Um
den Tropismus beider pseudotypisierter Vektoren für normale
Gehirnzellen in vitro zu analysieren, wurden kultivierte Neuronen
und Astrozyten, die aus 16 Tage alten embryonalen Wistarratten durch
Endpunktverdünnungen
gewonnen wurden, infiziert. Die humane Gliom-Zelllinie G62, von
der in einer vorhergehenden Untersuchung bereits gezeigt wurde,
dass sie von beiden Pseudotypen infiziert werden kann, wurde als
Infektionskontrolle verwendet. VSV G-Pseudotypen transduzierten
GFAP-positive Astrozyten und beta-Tubulin-III-positive Neuronen
auf einem höheren
Niveau als LCMV-Pseudotypen (Tabelle 2). Insbesondere war die Transduktionseffizienz
für Neuronen
deutlich unterschiedlich: VSV G-Pseudotypen transduzierten 62,5%, während LCMV
Pseudotypen nur 2,2% der gezählten
Neuronen infizierten. Zusätzlich
zeigten LCMV GP-Pseudotypen
einen höheren
Grad der Transduktion der humanen Gliom-Zelllinie G62 (89,5%) als
von kultivierten Astrozyten (71,7%) und Neuronen (2,2%). Im Gegensatz
dazu transduzierten VSV G-Pseudotypen Astrozyten (85,5%) und Neuronen
(62,5%) zu einem höheren
Grad als G62-Zellen (56,9%). Tabelle 2:
Kultivierte
Zellen | Lentiviraler
Pseudotypisierter Vector (Titer auf TE 671) | Transduzierte cells/high
power field (±SD) | Gesmtzellzahl/high
power field (±SD) | Ratio
(%) (± SD) |
Astrozyten | LCMV-GP
(8 × 104) | 35.7
(± 12.6) | 49.0
(± 13.3) | 71.7
(± 10.3) |
VSV-G
(3 × 104) | 43.5
(± 18.0) | 49.9
(± 16.4) | 85.5
(± 12.4) |
Neuronen | LCMV-GP
(8 × 104) | 0.4
(± 0.5) | 17.9
(± 5.9) | 2.2
(± 3.0) |
VSV-G
(3 × 104) | 8.2
(± 3.3) | 13.8
(± 6.1) | 62.5
(± 16.9) |
G62 | LCMV-GP
(8 × 104) | 67.3
(± 18.3) | 75.5
(± 20.3) | 89.5
(± 6.7) |
VSV-G
(3 × 104) | 41.1
(± 14.5) | 72.3
(± 12.2) | 56.9
(± 17.0) |
-
Kultivierte
Ratten-Astrozyten oder -Neuronen wurden mit 3 × 104 bis
8 × 104 eGFP TU von mit LCMV GP- or VSV G-pseudotypisierten
lentiviralen Vektoren transduziert. Die Zellen wurden fluoreszenzmikroskopisch
nach Färbung
mit monoklonalen anti-GFAP Antikörpern
gegen Astrozyten oder Anti-beta-Tubulin-III-Antikörpern gegen Neuronen analysiert.
Die Ergebnisse stellen die durchschnittlichen Zellzahlen und Standardabweichungen
aus 10 zufällig
ausgewählten
Kamerafeldern dar.
-
VSV G- und LCMV GP-Pseudotypen
zeigen einen unterschiedlichen Tropismus gegenüber normalen Gehirnzellen in
vivo
-
Die
in vitro Ergebnisse wurden in einem Rattenmodell bestätigt. Zu
diesem Zweck wurden LCMV GP- und VSV G-Pseudotypen in Striatum und Hippocampus
von Fischerratten injiziert. Der relative Anteil der transduzierten
Zelltypen wurde durch Immunfloureszenzfärbung mit zellspezifischen
Markern und confokaler Mikroskopie analysiert. LCMV GP Pseudotypen
transduzierten in beiden Gehirnregionen fast ausschließlich Astrozyten,
wie mit der Färbung
mit Antikörpern
gegen GFAP gezeigt werden konnte (2A-C).
Diese Beobachtung konnte sogar in Regionen mit hoher Neuronendichte
bestätigt
werden (2D-F). Transduktion von Neuronen
kamen selten vor. Im Gegensatz dazu infizierten VSV G-Pseudotypen
Neuronen sehr effizient und das geschätzte Verhältnis transduzierter Neuronen
gegenüber
Astrozyten war in beiden Gehirnregionen 3:1 (2G-I,
K-M, N-P).
-
LCMV-GP-Pseudotypen zeigen
eine spezifische und effiziente Transduktion glialer Tumorzellen
in vivo
-
Schließlich wurde
der Tropismus der verschiedenen Pseudotypen in einem Rattengliom-Modell
untersucht. Zunächst
wurde getestet, ob die in vivo Wachstumscharakteristika der genmarkierten,
für die
Tumorimplantation verwendeten Gliom-Zelllinie (9LDsred) sich von denen der
parentalen Zelllinie 9L unterschieden. Zwei Wochen nach i.c. Tumorzellimplantation
in Fischerratten wurden die etablierten Tumore histologisch auf ihre
Größe und durch
Licht (9L) oder Floureszenzmikroskopie (9LDsRed) auf ihre Fähigkeit,
in das Hirnparenchym einzudringen, untersucht. 9L und 9LDsRed-Tumore
zeigten keine Unterschiede in ihrer Größe, und beide infiltrierten
zu einem gleichen Ausmaß normales
Gehirn. Mit dem DsRed Marker konnten sogar einzelne Tumorzellen
detektiert werden, die in das Gehirnparenchym einwanderten.
-
Um
die Transduktion der 9LDsRed Tumore in vivo durch beide Pseudotypen
zu analysieren, erhielten zwei Gruppen weiblicher Fischerratten,
die 9LDsRed Tumore trugen, LCMV GP- und VSV G-Pseudotypen injiziert. Um die Transduktion
des soliden Tumors und der infiltrierenden Gliom-Zellen zu messen,
wurden die Injektionen in dem Zentrum des Tumors und 1 mm entfernt
gesetzt. Die Transduktionseffizienzen der infizierten Tumorregionen
wurden wie oben beschrieben geschätzt. LCMV GP-Pseudotypen zeigten
eine sehr effiziente Transduktion des soliden Tumors: 50-100% der
Tumorzellen waren in Tumorregionen, in die Vektorüberstände injiziert
wurden, GFP-positiv
(1A-C). In den infiltrierenden Regionen der 9LDsRed
Tumore infizierten LCMV GP-Pseudotypen spezifisch die Gliomzellen
(1D-F). Selbst einzelne infiltrierende Tumorzellen
wurden durch diesen Vektorpseudotypen transduziert (1E-I).
Nur wenige reaktive Astrozyten in dem Bereich des Tumorbettes waren
GFP-positiv, wie durch Färbung
mit Antikörpern
gegen GFAP gezeigt werden konnte. Neuronen in infiltrierenden Tumorregionen
waren nicht infiziert. VSV G-Pseudotypen
zeigten ein unterschiedliches Transduktionsmuster: Solider Tumor
wurde zu einem deutlich geringeren Ausmaß (0-10%) transduziert als mit den LCMV GP
Pseudotypen (1K-M). Im Gegensatz dazu waren
viele normale Gehirnzellen, einschl. Neuronen und reaktive Astrozyten
in der infiltrierenden Region und um das Gehirnparenchym herum GFP-positiv,
während
nur selten Tumorzellen transduziert waren (1N-P).
-
Die
Versuche zeigen also, dass bei intracranialer Applikation lentiviraler
Vektoren, die mit LCMV Glykoprotein pseudotypisiert waren, spezifisch
Tumorzellen infiziert wurden. Obwohl bei in vitro Versuchen und auch
bei der Verabreichung der LCMV GP-pseudotypisierten Vektoren in
Gehirn, in denen keine Tumore vorlagen, durchaus Astrozyten und,
wenn auch zu einem geringen Prozentsatz, Neuronen infiziert wurden,
kann bei der Behandlung von Tumoren in vivo eine hervorragende Spezifität der Transduktion
mit dem in den pseudotypisierten Vektoren enthaltenen Transgen erreicht
werden.
-
Beispiel 3: Migrationsstudien
-
Material und Methoden
-
Rotfluoreszierendes
Protein exprimierende Tumorzellen (9L RFP) wurden Fischerratten
stereotaktisch intracranial implantiert (Protokoll siehe Beispiel
2). An Tag 5 wurden Zellen der zu untersuchenden Zelllinie implantiert.
Diese Zellen waren mit grünfloureszierendem
Protein (eGFP) transfiziert. An Tag 8 wurde das Gehirn entnommen
und eine histologische Untersuchung durchgeführt. Es wurden folgende hämatopoetische
und nichthämatopoetische
Zelllinien auf ihre Migrationsfähigkeit
untersucht:
- – K562 (human, Chronisch Myeloide
Leukämie-Zelllinie)
- – U937
(human, Monozyten)
- – Raji
(human, B-Zelllinie)
- – Jurkat
(human, T-Zelllinie)
- – 3T3
(murin, Fibroblasten)
-
Weiterhin
wurden verschiedene Stammzellen, die nach im Stand der Technik bekannten
Verfahren hergestellt wurden, auf ihre Migrationsfähigkeit
untersucht. Es wurden Multiple adulte Progenitorzellen (MAPC aus
Fischerratten, fMAPC) (Young et al., Nature 418 (2002) 41-49), SdMSC
(mesenchymale Stammzellen aus Sprague-Dawly-Ratten), sowie murine
mesenchymale Stammzellen (mMSC) (P. Tropelet al., Exp Cell Res. 2004
May 1;295(2):395-406) und murine neurale Stammzellen (C17-2 Zelllinie:
A.B. Brown et al., Hum Gene Ther. 2003 Dec 10;14(18):1777-85). getestet.
-
Die
Fähigkeit
verschiedener Zellen, den soliden Tumor spezifisch zu infiltrieren,
ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3:
Neurale
Stammzellen (NSC), murin | +++ |
Mesinchemale
Stammzellen (MSC), murin und Ratte | + |
Mulitpotente
adulte Progenitorzellen (MAPC), Ratte (Fisher, Sprague Dawly) | +++ |
K562,
humane Chronisch Myeloide Leukämie-Zelllinie | – |
Jurkat,
humane T-Zelllinie | – |
Raji,
humane B-Zelllinie | – |
U937,
humane monozitäre
Zelllinie | – |
293,
humane Nierenepithelzelllinie | – |
TE671,
humane Fibroblastenzelllinie | – |
3T3
murine Fibroblastenzelllinie | – |
- + und – zeigen
die Fähigkeit
des Zelltyps an, den Tumor spezifisch zu infiltrieren.
-
Wie
in der Tabelle gezeigt, sind die untersuchten Tumor-Zelllinien nicht
in der Lage, in den Tumor zu infiltrieren. In einigen Fällen verbleiben
einige Zellen im Zentrum des Tumors, werden jedoch apoptotisch.
Die Mehrzahl der Zellen ist rings um den Tumor angeordnet, einzelne
Zellen waren jedoch auch im gesunden Gehirngewebe weit entfernt
vom Tumor nachweisbar. Die aus primären Zellen gewonnenen Stammzelllinien
sind in der Lage, den Tumor zu infiltrieren. Bei den MSC infiltriert
ein Teil der Zellen den Tumor jedoch nur oberflächlich. Eine optimale Infiltration
ist bei Verwendung von MAPC zu beobachten. Für NSC wurde eine solche spezifische
Infiltration schon früher
beobachtet. Primäre
NSC sind ex vivo jedoch nur zu wenigen Teilungen fähig und
müssen
für die
Anlage stabiler Linien erst genetisch (z.B. durch SV40 large T)
transformiert werden. Somit können
NSC nur nach Bestrahlung der Zellen eingesetzt werden. MAPC hingegen
können über 80 Teilungen
ex vivo vollziehen, ohne zu transformieren.
-
Der
Versuch zeigt die Eignung von Stammzellen, als infiltrierende Verpackungszellen
bei der Gentherapie solider Tumore eingesetzt zu werden.
-
Legenden der Abbildungen:
-
1: Solide
und infiltrierende Regionen eines Rattenglioms wurden effizient
durch LCMV GP-pseudotypisierte lentivirale Vektoren transduziert.
-
Intracraniale
9LDsRed Gliome wurden 7 Tage nach der Tumorimplantation mit LCMV
GP- oder VSV G-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren infiziert,
die eGFP exprimierten, und an Tag 14 mit confokaler Laserscanning-Mikroskopie
analysiert.
- (A) 50-100% des soliden Tumors
waren durch LCMV GP-pseudotypisierte
Vektoren transduziert.
- (B) Solider Tumor, der DsRed exprimiert.
- (C) Zusammengeführte
Bilder von (A) und (B).
- (D) Transfektion infiltrierender Gliom-Regionen durch LCMV GP-pseudotypisierte
Vektoren.
- (E) Infiltrierende Gliom-Regionen, die DsRed exprimieren.
- (F) Zusammengeführte
Bilder von (D) und (E).
- (G) Einzelne infiltrierende Tumorzellen, transduziert durch
LCMV GP-pseudotypisierte Vektoren.
- (H) Einzelne infiltrierende Tumorzellen, die DsRed exprimieren.
- (I) Zusammengeführte
Bilder von (G) und (H).
- (K) 0-10% des soliden Tumors wurden durch VSV G-pseudotypisierte
Vektoren transduziert.
- (L) Solider Tumor, der DsRed exprimiert.
- (M) Zusammengeführte
Abbildungen von (K) und (L)
- (N) Infiltrierende Gliom-Regionen, transduziert duch VSV G-pseudotypisierte
Vektoren.
- (O) Infiltrierende Gliom-Regionen, die DsRed exprimieren.
- (P) Zusammengeführte
Abbildung von (N) und (O).
Originalvergrößerung 20 ×.
-
2: Neuronen
und Astrozyten wurden durch VSV G-pseudotypisierte lentivirale Vektoren
in vivo transduziert.
-
Normales
Rattenhirn wurde mit LCMV GP- oder VSV G-pseudotypisierten Vektoren infiziert,
die eGFP exprimierten. Die Transduktion von Neuronen und Astrozyten
wurde nach Färbung
mit Antikörpern
gegen NeuN und GFRP an Tag 14 durch confokale Laserscanning-Mikroskopie
analysiert.
- (A) Transduktion von Astrozyten
im Striatum durch LCMV GP-pseudotypisierte
Vektoren.
- (B) Astrozyten im Striatum, die GFAP exprimieren.
- (C) Zusammengeführte
Abbildungen von (A) und (B).
- (D) In Bereichen mit großer
Neuronendichte (Hippocampus) wurden Neuronen nicht transduziert,
jedoch einzelne Astrozyten.
- (E) Hippocampusneuronen, die NeuN exprimieren.
- (F) Zusammengeführte
Abbildungen von (D) und (E).
- (G) Transduktion von Hippocampus-Neuronen durch VSV G-pseudotypisierte
Vektoren.
- (H) Hippocampus-Neuronen, die NeuN exprimieren.
- (I) Zusammengeführte
Abbildung (G) und (H).
- (K) Transduktion von Striatum-Neuronen durch VSV G-pseudotypisierte
Vektoren.
- (L) Striatum-Neuronen, die NeuN exprimieren.
- (M) Zusammengeführte
Abbildungen von (K) und (L).
- (N) Hippocampus-Astrozyten, transduziert durch VSV G-pseudotypisierte
Vektoren.
- (O) Hippocampus-Astrozyten, die GFAP exprimieren.
- (P) Zusammengeführte
Abbildungen von (N) und (O).
Originalvergrößerung 40 ×.
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ANLAGE ZUM SEQUENZPROTOKOLL
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(Anmerkung:
Die folgenden Angaben sind der Datenbank des National Institute
of Health (NIH), U.S.A., entnommen. Die ursprünglich darin enthaltenen Nuklein-
und Aminosäuresequenzen
wurden durch den Verweis auf die entsprechende SEQ ID NO. (numerische
Kennzahl <400> nach WIPO Standard
ST. 25) des Sequenzprotokolls ersetzt.)
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