DE102004034461B4 - Gentherapie solider Tumore durch retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren - Google Patents

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Abstract

Verwendung von Verpackungszellen, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen produzieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie solider Tumore, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszellen Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren, wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verpackungszellen, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen produzieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie solider Tumore, wobei die Verpackungszellen Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren und wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind. Ferner sind Verpackungszellen, die für diese Verwendung geeignet sind, sowie diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen Gegenstand der Erfindung.
  • Retrovirale Vektoren finden im Stand der Technik zunehmend Verwendung, beispielsweise für den Gentransfer in der gentechnischen bzw. medizinischen Forschung oder bei gentherapeutischen Ansätzen (vgl. z.B. C. Baum et al. in Seminars in Oncology: Gene Therapy of Cancer: Translational approaches from preclinical studies to clinical implementations., eds. Gerson, & Lattime, Academic Press, 1998). Die retroviralen Vektoren sind meist von murinen Leukämieviren (MLV) abgeleitet und enthalten alle für die Integration notwendigen Sequenzen der LTR-Regionen und das für die Verpackung verantwortliche ψ-Element. Die für die Virusproteine kodierenden Bereiche sind durch Fremdgene und Kontrollsequenzen ersetzt, die man in menschliche Zellen einbringen möchte. Die Vektoren werden in sogenannten Helferzelllinien (Verpackungszelllinien) hergestellt, die im Allgemeinen eine Kopie der kodierenden Bereiche eines kompletten Retrovirusgenoms enthalten. Es synthetisiert alle für die Replikation und Infektion notwendigen Proteine, kann jedoch seine genomische Virus-RNA nicht in Partikel verpacken, da es einen Defekt in den ψ-Sequenzen aufweist. Werden die retroviralen Vektoren in diese Helferzellen eingebracht und transkribiert, kann die gebildete transgene mRNA durch die ihr eigene ψ-Region mit den Strukturproteinen des Helfervirus interagieren und zu Partikeln verpackt werden. Die rekombinanten Virionen, die keinerlei Erbinformation für Viruskomponenten besitzen, adsorbieren über ihre Oberflächenproteine an Zellen, die Capside werden in das Cytoplasma aufgenommen, und die transgene RNA wird in doppelsträngige DNA überschrieben und ins Wirtszellgenom integriert. Der Vorteil dieses Systems ist die stabile Integration der Fremdgene, die bei Teilungen auf die Tochterzellen weitergegeben werden. Nachteilig ist die Retroviren eigene unspezifische Integration an willkürlichen Stellen des Zellgenoms.
  • Retrovirale Vektoren vermitteln eine stabile, kolineare Integration (d.h. ohne Rekombinationen und Rearrangierung der kodierenden Sequenzen im Vektorgenom) und dadurch eine langfristige Expression des Transgens. Eine langfristige Genexpression ist sonst bislang nur noch durch die episomalen Herpesvirusvektoren oder die Adeno-associated virus-Vektoren (AAV-Vektoren) möglich. Für die letztgenannten Vektorsysteme sind die Verpackungssysteme (Verpackungszelllinien) jedoch noch nicht optimiert. AAV-Vektoren weisen ferner eine geringe Verpackungskapazität (ca. 5 kb für AAV gegenüber ca. 10-12 kb für retrovirale Vektoren) auf.
  • In Verpackungszellen wird das Vektorgenom, das retrovirale cis-Elemente enthält, durch Transkription gebildet. Dieses genomische Vektortranskript kodiert für das zu transferierende Gen, aber nicht für retrovirale Proteine. Es wird jedoch in den Verpackungslinien mit Hilfe der gag-, pol- und env-Genprodukte aus der Verpackungszelle in ein infektiöses, aber nicht replikationsfähiges Virion eingebaut. Dieses Virion kann dann als retroviraler Vektor zum Transfer des in das Vektorgenom integrierten Transgens in die gewünschten Zielzellen eingesetzt werden, ohne daß es dort zur weiteren Vermehrung des Vektors kommt. Mit anderen Worten, der virale Vektor kann die Zielzellen infizieren, sich dort aber nicht weiter vermehren.
  • Die Entwicklung retroviraler Verpackungssysteme ist bereits weit fortgeschritten, und Vektorüberstände, die frei von replikationskompetenten Viren sind, können in großen Mengen unter GMP-Bedingungen (Good manufacturing practice; Richtlinie der Kommission zur Festlegung der Grundsätze und Leitlinien der guten Herstellungspraxis (GMP) für bestimmte Arzneimittel zur Anwendung beim Menschen (91/356/EWG) vom 13.6.91) hergestellt werden. Vektoren auf Basis des murinen Leukämievirus (MLV-Vektoren) wurden bereits mehrfach in klinischen Studien eingesetzt (P. Chu et al., J. Mol. Med. 76 (1998) 184-192).
  • Im Stand der Technik sind zwei grundsätzliche Typen retroviraler Verpackungssysteme bekannt (J.M. Wilson, Clin. Exp. Immunol 107 Suppl. 1 (1997) 31-32; C. Baum et al. (1998), loc. cit.).
  • Zum einen werden oncoretrovirale Verpackungssysteme verwendet. MLV-Verpackungszelllinien enthalten die retroviralen Gene gag, pol und env (1), und die für die Verpackung der retroviralen RNA erforderliche Sequenzen sind deletiert (C. Baum et al. (1998), loc. cit.).
  • Der zweite Typ der bekannten Verpackungssysteme leitet sich von den Lentiviren ab (R. Carroll et al., J. Virol. 68 (1994) 6047-6051; P. Corbeau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 14070-14075; L. Naldini et al., Science 272 (1996) 263-267; C. Parolin et al., J. Virol. 68 (1994) 3888-3895; J. Reiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 15266-15271; J.H. Richardson et al., J. Gen. Virol. 76 (1995) 691-696; T. Shimada et al., J. Clin. Innest. 88 (1991) 1043-1047). Lentiviren sind komplexe Retroviren, die zusätzlich zu den gag-, pol- und env-Genprodukten noch eine Reihe regulatorischer Gene exprimieren. Beispiele für Lentiviren, aus denen Verpackungssysteme abgeleitet wurden, sind das „Humane Immundefizienzvirus" (HIV), das „Simian Immundefizienzvirus" (SIV), das „Equine infektiöse Anämievirus" (EIAV) und das „Feline Immundefizienzvirus" (FIV). Der Aufbau der lentiviralen Verpackungssysteme ähnelt prinzipiell demjenigen der MLV-Vektoren.
  • Vorteil der lentiviralen Vektoren ist, daß sie auch ruhende Zellen infizieren können. Bei MLV-Vektoren hingegen kann das Vektorgenom nur während der Zellteilung in den Zellkern transportiert werden, d.h. wenn die Kernmembran aufgelöst ist. Allerdings weisen von Lentiviren abgeleitete Verpackungssysteme aufgrund des komplexen Aufbaus des lentiviralen Genoms Nachteile auf, die sich in einem vergleichsweise geringen Titer und einer geringeren Sicherheit äußern. Durch den komplexen Genomaufbau lassen sich cis- und trans-Elemente im Genom nicht klar von einander trennen. In den Verpackungskonstrukten, die lentivirale gag-, pol- und env-Gene exprimieren, befinden sich daher auch wichtige cis-regulatorische Sequenzen (z.B. Teile des Verpackungssignals), die auch im Vektor-Genom enthalten sein müssen. Durch diese Homologien kann es zu Rekombinationen zwischen Vektorgenom und den Verpackungskonstrukten und damit zur Freisetzung replikationskompetenter Retroviren (z.B. einem HIV-Wildtypvirus, was hochgradig unerwünscht wäre) kommen, so daß diese Systeme von der Sicherheit her nicht mit MLV-Verpackungslinien vergleichbar sind. Nicht alle Lentiviren sind jedoch für Menschen bzw. die zu behandelnde Spezies infektiös, so dass sich durch die Auswahl eines geeigneten, für die Spezies nicht infektiösen Retrovirus die Sicherheit des Systems erhöhen läßt, da in diesem Fall eine Rekombination unwahrscheinlich ist.
  • Um das Problem zu lösen, dass retrovirale Vektoren meist nur in unzureichenden Titern produziert werden und durch die Instabilität ihrer Hüllproteine nicht weiter aufkonzentriert oder ohne Verlust der Infektiosität aufgereinigt werden können, können die Vektoren mit dem rhabdoviralen G-Protein von Vesikulärem Choriomeningitisvirus (VSV) pseudotypisiert werden (Emi et al., J. Virol. 65 (1991) 1202-1207; J. C. Burns et al., PNAS 90 (1993) 8033-8037; T. Friedmann et al., Nat. Med. 1 (1995) 275-277; D. von Laer et al., J. Virol. 72 (1998) 1424-1430; R.A. Weiss (1993), In: J.A. Levy (ed.), The Retroviridae, Plenum Press, New York).
  • Derartige, mit VSV G-Protein pseudotypisierte retrovirale Vektoren wurden im Stand der Technik bereits zur Therapie solider Tumore eingesetzt. Verwendung dieser Vektoren zum Gentransfer der Herpes simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-tk) mit anschliessender Gancyclovir-Behandlung in einem Ratten-Gliom-Modell zeigte eine hohe Effizienz der Transduktion und eine gute therapeutische Wirkung (Galipeau et al., Cancer Res. 59 (1999) 2384-2394). Ein Hauptproblem bei der Pseudotypisierung mit VSV-G ist jedoch die Toxizität des VSV G-Proteins.
  • Zusätzlich reicht für die effektive Therapie eines soliden Tumors die Gabe von Virionen alleine oft nicht aus, um eine ausreichende Transduktion aller Tumorzellen zu gewährleisten. Faktoren, die hier eine Rolle spielen, sind vor allem die Größe des Tumors, aber auch seine Vaskularisierung. Daher wurden im Stand der Technik bereits Versuche unternommen, in denen anstelle der Virionen die diese produzierenden Verpackungszellen verabreicht wurden. Dazu wurden klassische Verpackungszelllinien wie Fibroblasten, die amphotrope MLV-Vektoren freisetzen, verwendet. Diese Versuche ergaben eine verbesserte, jedoch noch nicht ausreichende, therapeutisch wirksame Transduktion des Tumorgewebes (z.B. Stand N, Weber F, Mariani L, Bernstein M, Gianella-Borradori A, Long Z, Sorensen AG, Barbier N., Hum Gene Ther. 1999 Sep 20;10(14):2325-35. A phase 1-2 clinical trial of gene therapy for recurrent glioblastoma multiforme by tumor transduction with the herpes simplex thymidine kinase gene followed by ganciclovir, GLI328 European-Canadian Study Group). Insgesamt ist der Mangel an klinischem Erfolg der Gentherapie von Gliomen mit retroviralen Vektoren nicht auf die Ineffektivität der therapeutischen Gene, sondern auf die mangelnde Gentransfereffizienz zurückzuführen.
  • Somit stellt sich für den Fachmann die Aufgabe, zur Herstellung einer gentherapeutischen pharmazeutischen Zusammensetzung, vor allem zur Gentherapie solider Tumore, geeignete Systeme zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile der im Stand der Technik üblichen Systeme vermeiden und geeignet sind, effektiv und trotzdem gezielt Tumorzellen zu transduzieren.
  • Diese Aufgabe wird von dem Gegenstand der nachfolgenden Patentansprüche gelöst. Insbesondere betrifft die Erfindung Verpackungszellen, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen produzieren und die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren, wobei die Verpackungszellen Stammzellen sind und wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, sowie die Verwendung dieser Verpackungszellen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie solider Tumore. Es wird ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die die erfindungsgemäßen Verpackungszellen umfasst.
  • Es konnte nunmehr festgestellt werden, dass bisher für die Gentherapie verwendete Verpackungszelllinien nicht in solide Tumoren eindringen, sondern sich nur in der Peripherie des Tumors befinden. Im Gegensatz dazu wurde erfindungsgemäß überraschenderweise festgestellt, dass Stammzellen, in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren.
  • Die Fähigkeit, solide Tumore zu infiltrieren, spiegelt sich darin wieder, dass sich in einem Zeitraum von ca. 1 bis 5 Tagen, bevorzugt auch bis zu 20 Tage nach Injektion der Zellen in einen soliden Tumor oder in dessen unmittelbare Umgebung mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, am meisten bevorzugt mindestens 70 oder mindestens 80 % der nachzuweisenden Zellen innerhalb des Tumors befinden. Dabei sind bevorzugt mindestens 50 %, am meisten bevorzugt mindestens 75 % der Tumormasse infiltriert. Im Detail ist ein geeigneter Test im Beispielteil beschrieben.
  • Besonders positive Migrationseigenschaften weisen Stammzellen auf. Unter Stammzellen werden im Rahmen dieser Erfindung sowohl multipotente als auch pluripotente Stammzellen verstanden. Diese können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Bevorzugt ist jedoch die Verwendung adulter Stammzellen als Verpackungszellen, um ethische Probleme bei Verwendung embryonaler Stammzellen zu vermeiden. Zu den Stammzellen, die bereits eine grundlegende Differenzierung durchlaufen haben, zählen beispielsweise mesenchymale Stammzellen (MSC). Experimente zeigen, dass MSC verschiedener Herkunft die Fähigkeit besitzen, solide Tumore, insbesondere Hirntumore, zu infiltrieren. Eine besondere Eignung zu diesem Zweck wurde auch für multipotente adulte Progenitorzellen (MAPC) gezeigt. Die Generierung derartiger Zellen ist im Stand der Technik bekannt (z.B. Y. Jiang et al., Nature 418 (2992)41-49). Die Verwendung von MSC und/oder MAPC als Verpackungszellen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung solider Tumore ist daher eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.
  • Im Stand der Technik ist weiterhin bekannt, dass z.B. T-Lymphozyten, die einen T-Zell-Rezeptor tragen, der spezifisch ein Tumorantigen erkennt, solide Tumore infiltrieren können. Tumor-infiltrierende Lymphozyten lassen sich z.B. nach der Resektion eines Tumors aus diesem isolieren. Es wurde bereits versucht, die Migrationseigenschaften dieser Zellen therapeutisch auszunutzen, indem z.B. das immunstimulierende Gen IL-2 in Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) eingebracht wurde. Derartige transgene TIL konnten in einigen Fällen eine Regression von Tumoren (S.A. Rosenberg et al., N. Engl. J. of Med. 319 (1988) 1676-1680) vermitteln.
  • Bevorzugt werden, um xenogene Immunreaktionen gegen die Verpackungszellen zu minimieren, zur Gentherapie Verpackungszellen verwendet, die aus der zu behandelnden Spezies stammen. Vorzugsweise sind die Verpackungszellen humanen Ursprungs. Es ist möglich, autologe Zellen als Verpackungszellen zu verwenden. Da die Zellen nur vorübergehend im Tumor verbleiben, kann man auch sehr gut allogene Zellen nehmen. Aus Sicherheitsgründen (Entstehung einer allogenen Neoplasie aus den Verpackungszellen ist unwahrscheinlich) und Gründen der vereinfachten Herstellung (Fertigarzneimittel versus Individualrezeptur) wäre eine allogene Zelle zu bevorzugen. Etwas Inflammation ist sogar eher förderlich.
  • Eine Voraussetzung, die eine Gentherapie von Tumoren mit viralen Vektoren ermöglicht, ist die Spezifität der Transduktion der Tumorzellen durch die Vektoren. Eine unspezifische Transduktion von nicht-Tumorzellen führt im Rahmen der Gentherapie zu Nebenwirkungen, da die Gentherapie im allgemeinen auf die Zerstörung der transduzierten Zellen abzielt. Die Infiltration der erfindungsgemäßen Verpackungszellen in den Tumor verringert daher die Wahrscheinlichkeit, dass die von den Verpackungszellen produzierten Virionen Zellen ausserhalb des Tumors transduzieren.
  • Eine erhöhte Spezifität und eine Verringerung von Nebenwirkungen läßt sich weiterhin dadurch erreichen, dass die durch den retroviralen Vektor übertragenen therapeutisch anwendbaren Gene unter der Expressionskontrolle eines Promotors stehen, der spezifisch in Tumorzellen aktiviert wird, im Gegensatz zur Verwendung konstitutiver Promotoren. In diesem Fall muss jedoch ausgetestet werden, in wie weit der Tumor-spezifische Promotor tatsächlich zu einer Expression in den Tumorzellen führt, während umliegende Zellen diesen Promotor nicht aktivieren.
  • Eine weiterer entscheidender Faktor für die Spezifität der Transduktion ist jedoch der Tropismus der Virionen. Dieser wird im wesentlichen durch das Hüllprotein des Virus bestimmt. In bisherigen Versuchen wurde ein sehr breites Spektrum an Zielzellen für retrovirale, mit LCMV-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren gefunden (W. Beyer et al., J. Virol 76 (2002) 1488-1495). Fibroblastenzelllinien, Epitheliale Zelllinien, Glioma- und Neuroblastomazelllinien, myeloide Progenitorzelllinien, eine Hepatomazelllinie und Thymuszelllinie aus den Spezies Mensch, Hamster, Hund und Maus ließen sich mit hoher Effizienz von den mit LCMV Glykoprotein pseudotypisierten Vektoren transduzieren. Auch primäre Glioblastomzellen und Oligodendrogliomzellen konnten erfolgreich transduziert werden. Verschiedene Autoren haben bereits die in vivo Transduktionsmuster retroviraler Vektoren, die mit verschiedenen Glykoproteinen, u.a. mit LCMV-Glykoprotein, pseudotypisiert waren, in Gehirn untersucht. Es wurde, wenn auch mit geringerer Effezienz als mit andern Vektoren, z.B. VSV G-Protein pseudotypisierten Vektoren, eine Transduktion verschiedener Zellen des Striatum, Thalamus und Corpus callosum gefunden (D. Watson et al., Mol. Ther. 5 (2002) 528-537; L.-F. Wong et al., Mol. Ther. 9 (2004) 101-111).
  • Überraschenderweise konnte nun gezeigt werden, dass retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein, insbesondere mit LCMV-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren in vivo spezifisch Hirntumore transduzieren. Die Verwendung von Virionen ist insbesondere bei kleineren oder gut vaskularisierten Tumoren empfehlenswert, da hier die bei einer oder mehreren Applikationen eingebrachte Menge an Virionen zur Transduktion einer ausreichenden Menge an Tumorzellen ausreichen kann, wobei eine möglichst vollständige Transduktion aller Tumorzellen bevorzugt ist. Um die Anzahl der Applikationen zu begrenzen, ist es, vor allem bei größeren Tumoren, empfehlenswert, zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung solider Tumore Verpackungszellen zu verwenden, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein (insbesondere LCMV-Glykoprotein) pseudotypisierte Virionen produzieren.
  • Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von Verpackungszellen, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein (insbesondere LCMV-Glykoprotein) pseudotypisierte Virionen produzieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie von Hirntumoren, wobei die Verpackungszellen Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren und wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind. Die Applikation der Verpackungszellen erfolgt entweder durch stereotaktische Injektion oder durch Einbringen in den Innenraum oder Injektion in die Wand der Resektionshöhle nach operativer Entfernung des Tumors.
  • Unter soliden Tumoren werden im Rahmen dieser Erfindung alle Tumore verstanden, die nicht hämatopoetischen Ursprungs sind, also beispielsweise Karzinome, z.B. Mamma-Karzinom, oder Sarkome. Der Tumor kann beispielsweise ein Gliom, Neuroblastom, Oligodendrogliom oder Astrocytom sein. Der Tumor kann gutartig sein, bevorzugt ist der Tumor jedoch maligne, insbesondere ein malignes Gliom. Maligne Gliome stellen den am häufigsten vorkommenden Hirntumor dar und führen besonders oft zum Tod der Patienten (Y. Kew et al., Curr. Opin. Neurol. 16 (2003) 665-670). Sowohl solide Primärtumore als auch einzelne daraus auswandernde Tumorzellen und Metastasen werden im Rahmen dieser Erfindung als solide Tumore bezeichnet.
  • Die erfindungsgemäßen Verpackungszellen produzieren retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein, insbesondere LCMV-Glykoprotein, pseudotypisierte Virionen.
  • Experimente haben gezeigt, dass diese Virionen in vivo spezifisch die Zellen eines Hirntumors infizieren. Insbesondere infizieren die Virionen bei der Tumortherapie in vivo keine Neuronen. Darunter wird im Rahmen dieser Erfindung verstanden, dass bei Injektion in einen Hirntumor weniger als 5 %, bevorzugt weniger als 2 %, fast keine oder keine der umliegenden Neuronen infiziert werden. Weiterhin infizieren die Virionen bei der Tumortherapie in vivo nur zu einem geringen Teil Astrozyten, bevorzugt weniger als 15 %, weniger als 10 % oder weniger als 5 % der umliegenden Astrocyten. Hingegen wurden sogar einzelne metastasierende Tumorzellen von den Virionen infiziert. Diese hohe Spezifität für die Tumorzellen macht die Virionen besonders zur Behandlung von Tumoren, vor allem von soliden Tumoren und insbesondere von Hirntumoren, geeignet.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur Pseudotypisierung ein Arenavirus-Glykoprotein, z.B. von Lassa oder LCMV, eingesetzt. Dabei ist es möglich oder kann sogar bevorzugt sein, statt des Wildtyp-Glykoproteins ein Glykoprotein anderer LCMV- oder Lassa-Stämme einzusetzen. So können leichte Variationen in der gp-Nukleinsäuresequenz bzw. in der Aminosäure-Sequenz des exprimierten Hüllproteins in verschiedenen Stämmen den Zelltropismus (Wirtszellspektrum) erheblich verändern (M. Matloubian et al., J. Virol. 67 (1993) 7340-7349; M.N. Teng, J. Virol. 70 (1996) 8438-8443; King et al., J.Virol 64 (1990) 5611-5616). Es wird damit erfindungsgemäß eine gezieltere Transduktion des gewünschten Zelltyps ermöglicht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann es daher von Vorteil sein, Verpackungssysteme mit verschiedenen Glykoprotein-Varianten (GP-Varianten) für unterschiedliche Anwendungen, wie die Therapie unterschiedlicher solider Tumore, herzustellen. Derartige Varianten sind z.B. in M. Matloubian et al., J. Virol 67 (1993) 7340-7349 oder M.N. Teng et al., J. Virol. 70 (1996) 8438-8443 offenbart. Der Tropismus von Varianten bezüglich eines bestimmten Tumortyps lässt sich experimentell, wie beispielhaft für Glioblastome gezeigt, testen.
  • Auch Wildtyp-LCMV kann verschiedene Zelltypen aus unterschiedlichen Geweben und Spezies infizieren. Es wurde gezeigt, dass zumindest alpha-Dystroglykan, das eine breite Expression zeigt, ein Rezeptor für LCMV sein kann (P. Borrow et al., J. Virol. 66 (1992) 7270-7281; W. Cao et al., Science 282 (1998) 2079-2081). In der Flexibilität des Tropismus durch Mutationen des Glykoproteins kann daher ein Hinweis gesehen werden, dass die Glykoproteine an verschiedene, eng verwandte Rezeptoren oder einen Rezeptor mit unterschiedlichen post-translationalen Modifikationen binden könnten.
  • Die Hüllproteine der Arenaviren werden zunächst als Precursor-Polypeptid exprimiert, GP-C, das durch eine zelluläre Protease post-translational in GP-1 und GP-2 gespalten wird. Dabei interagiert GP-1 mit dem Rezeptor alpha-Dystroglykan, während GP-2 das für die Fusion verantwortliche Peptid und die Transmembran-Domäne enthält.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann von den gp-Genen des eher neurotropen LCMV-Stammes Armstrong, L(ARM) (L. Villarete et al., J. Virol. 68 (1994) 7490-7496) (für SEQ ID NO: 4 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 3) ausgegangen werden. Vorzugsweise wird der eher hämatotropen Stammes WE (V. Romanowski et al., Virus Res. 3, (1985) 101-114) (SEQ ID NO: 1) verwendet. Besonders bevorzugt ist die Pseudotypisierung mit einer Variante von LCMV-WE-HPI (LCMV-WE-HPIopt, siehe SEQ ID NO: 27), in der die Benutzung der Kodons optimiert wurde und "kryptische Spleiß-Regionen" entfernt wurden, um eine verbesserte Expression zu erzielen.
  • Durch eine solche Optimierung der GP-Expression kann die Pseudotypisierung verbessert werden, wobei auf eine zusätzliche Unterstützung durch mindestens ein weiteres LCMV-Protein verzichtet werden kann.
  • Eine bevorzugte Variante ist das im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebene LCMV Glykoprotein WE-HPI. Die kodierende Nukleinsäuresequenz gp (Open reading frame (ORF) in SEQ ID NO: 25 dargestellt) enthält gegenüber dem LCMV-Stamm WE Mutationen an den Positionen 281, 329, 385, 397, 463, 521, 543, 631, 793, 1039, 1363 und 1370 und besitzt somit gegenüber dem Glykoprotein vom LCMV-Stamm WE Aminosäureaustäusche an den Positionen 94, 110, 129, 133, 155, 174, 181, 211, 265, 347, 455 und 457. Diese GP-Variante mit der in SEQ ID NO: 26 gezeigten Aminosäuresequenz weist den Vorteil auf, daß sie auch ohne zusätzliche LCMV-Hilfsproteine stabil ist und gegenüber dem Stamm WE eine verbesserte Pseudotypisierung bewirkt. Es wurde gezeigt, dass nur eine der Mutationen, die die zunächst veröffentlichte Sequenz des LCMV-Glykoproteins LCMV-WE gegenüber der neu klonierten Sequenz LCMV-WE-HPI enthält, eine Leucin ⇒ Prolin-Mutation an Aminosäure 110, die Prozessierung des exprimierten Proteins und damit die Expression auf der Oberfläche von Zellen beeinträchtigte (W. Beyer et al., J. Virol. 75 (2001) 1061-1064). Varianten mit dieser Mutation sollten daher bevorzugt nicht für die Pseudotypisierung verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft daher ferner die Verwendung einer Variante des Lymphozytären Chroriomeningitis Virus, die das Gen gp enthält, das für die in SEQ ID NO: 26 dargestellte Sequenz oder einen Teil derselben kodiert, wobei das gp-Gen vorzugsweise die in SEQ ID NO: 25 dargestellte Sequenz oder einen Teil derselben aufweist. Ferner ist erfindungsgemäß ein Protein mit der in SEQ ID NO: 26 gezeigten Aminosäuresequenz oder einem Teil derselben eingeschlossen sowie eine für dieses Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise die in SEQ ID NO: 25 dargestellte Sequenz oder ein Teil derselben. Diese Virusvariante sowie die letztgenannten Nuklein- und Aminosäuresequenzen sind, z.B. ausgehend von der LCMV-Variante WE, durch dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren (z.B. durch Einführung von Punktmutationen) erhältlich.
  • „LCMV" umfaßt erfindungsgemäß, wie bereits erwähnt, also neben dem LCMV Wildtyp auch andere LCMV-Stämme, insbesondere LCMV-WE-HPI (siehe SEQ ID NO: 25) oder die künstlich hergestellte kodonoptimierte und „spleißbereinigte" Variante LCMV-WE-HPIopt (siehe SEQ ID NO 27). Insbesondere kann im Rahmen der Erfindung für die Pseudotypisierung ein Glykoprotein verwendet werden, bei dem die Nukleotidsequenz des Glykoproteingens für ein Glykoprotein mit mindestens 80 % Homologie zu der Aminosäuresequenz des Glykoproteins von LCMV-Wildtyp oder von LCMV-WE, LCMV-WE-HPI, LCMV-WE-HPIopt oder Lassa-Virus kodiert (siehe SEQ ID NOS: 1, 25, 27, 28). Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 90 %, mindestens 95 % oder etwa 99 %.
  • Eine besondere Ausführungsform dieser Erfindung betrifft Stammzellen als Verpackungszellen zur Gentherapie solider Tumore, die ein oder mehrere Expressionskassetten für die retroviralen Gene gag, pol und ferner ein für Arenavirus- Glykoprotein kodierendes Gen umfassen, wobei das Arenavirus-Glykoprotein insbesondere Lassa-Virus Glykoprotein ist.
  • Zur Expression des Glykoproteins eignen sich allgemein Expressionsvektoren, die eine hohe stabile Genexpression in eukaryontischen Zellen ermöglichen. Die Wahl des Expressionsvektors ist für die Verpackung der retroviralen Pseudotypen jedoch nur insoweit entscheidend, als er ein hohes und stabiles Expressionsniveau gewährleisten muß, d.h. ein Expressionsniveau, das hoch genug ist, um die Bildung von Pseudotypen zu ermöglichen, und das dauerhaft (stabil) ist, ohne daß es zum Abschalten des Promoters kommt.
  • Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind die folgenden beiden Expressionskassetten (S. Mizushima, Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322, T. Uetsuki, J. Biol. Chem. 264 (1989) 5791-5798):
    (CMV-Promoter)--(β-Globin-Intron-2)--(gp)--(SV40 poly A-Signal)
    und
    (EF-1alpha-Promoter)--(gp)--(poly-A-Signal des G-CSF-Genes).
  • Die Sequenzen für die Bestandteile der Expressionskassetten sind im Sequenzprotokoll dargestellt oder allgemein bekannt:
    Cytomegalovirus-Promoter (CMV-Promoter): (M. Boshart et al., Cell 41 (1958) 521-530; F. Langle-Rouault et al., Virol. 72(7) 6181-5 (1998))
    betaglobin-Intron-2: (Jeffreys, A.J. et al., Cell 12 (1977) 1097-1108)
    SV40 poly A-Signal: (M. Boshart et al., Cell 41 (1958) 521-530; F. Langle-Rouault et al., Virol. 72(7) 6181-5 (1998))
    EF-1alpha-Promoter: SEQ ID NO: 9 (S. Mizushima, Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322, T. Uetsuki, J. Biol. Chem. 264 (1989) 5791-5798).
    G-CSF poly A-Signal: (S. Mizushima, Nucleic Acids Res. 18 (1990) 5322, T. Uetsuki, J. Biol. Chem. 264 (1989) 5791-5798).
    gp (LCMV): vgl. z.B. SEQ ID NO: 1, 3, für SEQ ID NO: 4 kodierender Bereich (siehe auch Anlage zum Sequenzprotokoll).
    gp (Lassa): vgl. SEQ ID NO 28
  • Beispielhafte Sequenzen für derartige Expressionsplasmide sind in der EMBL Datenbank unter den Zugangsnummern AJ318512 (pHCMV-LCMV-GP(WE), AJ318513 (pHCMV-LCMV-GP(WE-HPI) hinterlegt.
  • Änderungen in den jeweiligen Nukleinsäuresequenzen sind möglich, solange die Funktionalität der Expressionskassetten erhalten bleibt, d.h. deren erfindungsgemäße Verwendung die Pseudotypisierung der Verpackungszellen ermöglicht und auch die Transfektion der Zielzellen und die stabile Integration der Transgene in das Wirtsgenom nicht behindert.
  • Ferner zeigt auch ein episomaler EBV-Expressionsvektor (Epstein-Barr-Virus; vgl. F. Langle-Rouault et al., Virol. 72(7) (1998) 6181-5) (pCep4) der Firma Invitrogen hohe Expression und kommt daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt in Betracht.
  • Retroviren, die mit dem Arenavirus Lymphozytärer Choriomeningitisvirus (LCMV) pseudotypisiert sind, und dafür geeignete retrovirale Verpackungssysteme sind im Stand der Technik bekannt ( EP 1 006 196 ; Miletic et al., J. Virol. 73 (1999) 6114-6116). Die dort beschriebenen, mit LCMV-Glykoprotein pseudotypisierten Vektoren sind für die Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie von Hirntumoren geeignet. Für die Pseudotypisierung werden im allgemeinen Verpackungszellen verwendet, die für das retrovirale Hüllprotein env defizient sind, so dass nur dann Virionen produziert werden, wenn ein Hüllprotein anderweitig zur Verfügung gestellt wird, z.B. durch Infektion der Zellen mit dem Virus, z.B. mit LCMV, oder durch Transduktion mit einem Plasmid mit einer Expressionskassette für das entsprechende Hüllprotein, z.B. das Glykoprotein des LCMV.
  • Im Vergleich zu Vektoren, die das oft verwendete Amphotrophe murine Leukämivirus-Hüllprotein (A-MLVenv) oder VSV-G enthalten, zeigt sich bei LCMV-pseudotypisierten Vektoren eine ähnliche Effizienz in der Produktion und Stabilität. Es können jedoch – im Gegensatz zu VSV-G – mit LCMV Glykoprotein stabile, das Glykoprotein konstitutiv exprimierende Verpackungszelllinien generiert werden, da dieses Protein nicht cytopathisch wirkt. Die pseudotypisierten Virionen sind auch stabil genug für eine starke Aufkonzentrierung durch Ultrazentrifugation, so dass LCMV-pseudotypisierte retrovirale Vektoren Grundvoraussetzungen für die Eignung zur Gentherapie aufweisen.
  • Das Retrovirus, das mit dem Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisiert ist, kann ein Onkoretrovirus oder ein Lentivirus sein. Ein häufig verwendetes Onkoretrovirus ist z.B. MLV (Murines Leukämivirus), insbesondere MoMLV (Moloney MLV). Vorzugsweise verwendet man jedoch ein Lentivirus, insbesondere HIV (Humanes Immunodefizienzvirus), SIV (Simian Immunodefizienzvirus), EIAV (Equines Infektiöses Anämievirus) oder FIV (Felines Immunodefizienzvirus), da Lentiviren auch ruhende Zellen transduzieren können.
  • Die Verpackungszellen umfassen die retroviralen Gene (die hier angegebenen Sequenzen beziehen sich beispielhaft auf MoMLV, die Sequenzen der Gene anderer Retroviren sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt) gag (für SEQ ID NO: 12 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 11), pol (für SEQ ID NO: 13 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 11) und gegebenenfalls das retrovirale Gen env (für SEQ ID NO: 14 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 11) und/oder regulatorische retrovirale Gene (im Falle lentiviraler Verpackungssysteme z.B. das für das lentivirale Rev-Protein kodierende Gen, das ein Spleißen der retroviralen genomischen RNA verhindert) und ferner das für die Glykoproteine GP-1 und GP-2 eines Arenavirus kodierende Gen gp (LCMV: z.B. für SEQ ID NO: 4 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 3; Lassa: SEQ ID NO: 28) oder einen Teil desselben. Gemäß einer besonderen Ausführungsform können die Verpackungssysteme auch die gag- und pol-Genprodukte von Lentiviren enthalten. In diesem Zusammenhang könnte es für eine effiziente Produktion infektiöser Lentivirusvektoren erforderlich sein, zusätzlich akzessorische lentivirale Gene wie rev (für SEQ ID NO: 21 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 15) oder tat (für SEQ ID NO: 20 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 15) bei HIV-Vektoren zu exprimieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können Arenavirus-Glykoproteine in allen lentiviralen Verpackungssystemen zur Pseudotypisierung eingesetzt werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verpackungszellen umfassen bevorzugt ein oder mehrere Expressionskassetten für die retroviralen Gene gag, pol, ein für ein Arenavirus-Glykoprotein kodierendes Gen und ferner einen retroviralen Gentransfervektor zur Verpackung in die pseudotypisierten Virionen, der mindestens ein therapeutisch anwendbares Transgen und/oder Markergen. Ferner können die Verpackungszellen auch das Gen tat, rev und/oder env umfassen. Ferner eingeschlossen sind Nukleinsäuresequenzen, die Abweichungen (Punktmutationen, Deletionen) in den Sequenzen aufweisen (Derivate). Bevorzugt haben die Nukleinsäuren eine Homologie von mindestens 70 %, mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 oder 95 % zu der ursprünglichen Nukleinsäure. Entscheidend ist, dass bei der erfindungsgemäßen Verwendung die Pseudotypisierung von retroviralen Gentransferpartikeln gewährleistet bleibt und auch die Transduktion der Zielzellen sowie die stabile Integration der Transgene in das Wirtsgenom nicht behindert wird. Im folgenden sollen diese Derivate stets mitumfaßt sein, wenn ein beliebiges Gen als solches erwähnt wird.
  • Erfindungsgemäß werden ferner Pseudotyp-Verpackungssysteme bereitgestellt, in denen neben dem gp-Genprodukt (SEQ ID NO: 4) ein oder mehrere weitere Gene von Arenaviren, z.B. LCMV exprimiert werden, wie zum Beispiel das für das Nukleoprotein kodierende Gen np (LCMV: für SEQ ID NO: 5 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 3), das für ein Protein mit unbekannter Funktion kodierenden Gen z (LCMV: für SEQ ID NO: 8 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 6) und das für die RNA-Polymerase kodierende Gen l (LCMV: für SEQ ID NO: 7 kodierender Bereich; vgl. Anlage zum Sequenzprotokoll, ZU SEQ ID NO: 6).
  • Diese Gene können gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung z.B. vom WE- oder Armstrong-Stamm des LCMV stammen. In diesem Zusammenhang können entweder die vollständigen Sequenzen der Gene np, z und/oder l eingesetzt werden (SEQ ID NOs: s.o.) oder Teile derselben verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verpackungszellen können daher zusätzlich zu dem gp-Gen des LCMV mindestens ein Gen aus der Gruppe bestehend aus dem für das Nukleoprotein kodierenden Gen np, dem für die RNA-Polymerase kodierenden Gen l und dem für ein Protein mit unbekannter Funktion kodierenden Gen z des LCMV umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen Verpackungszellen und die davon produzierten Virionen umfassen mindestens ein therapeutisch anwendbares Transgen und/oder Markergen. Unter einem therapeutisch anwendbaren Markergen wird dabei ein Gen verstanden, das in der Tumortherapie dazu verwendet werden kann, um direkt oder indirekt das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen oder diese zu töten. Beispielsweise kann das Suizid-Gen Herpes simplex-Thymidinkinase (HSV-tk) und/oder Cytosin-Deaminase verwendet werden. HSV-tk macht die damit transfizierten Zellen empfindlich gegenüber Gancyclovir. Weiterhin kann ein therapeutisch anwendbares Gen immunstimulatorisch wirken. Eine solche Wirkung haben z.B. IL-4 oder Flt3L. Auch eine Therapie mit B7 oder IL-2 kann zur Regression von Tumoren führen, wie für Hirntumore beispielhaft von T. Lichtor et al. gezeigt wurde (J. Neurooncol 63 (2003) 247-259). Bei der Therapie maligner Gliome wurden u.a. Erfolge bei einer Expression von Antisense-DNA erzielt, die z.B. gegen TGF-beta gerichtet ist (K. Lou, Ann. Med. 36 (2004) 2-8). Weitere Gene, die therapeutisch zur Tumortherapie verwendet werden können, sind z.B. in Y. Kew et al., Curr. Opin. Neurol. 16 (2003) 665-670, beschrieben. Selbstverständlich können auch zwei oder mehr therapeutisch anwendbare Gene, sowie gegebenenfalls zusätzlich ein oder mehrere Markergene umfasst sein.
  • Bevorzugt ist das Markergen lacZ, ein Antibiotikaresistenzgen, wie z.B. neo, und/oder ein Gen für ein Fluoreszenz-Protein, wie z.B. eGFP (enhanced green fluorescent Protein). Vorzugsweise wird das therapeutisch anwendbare Transgen und/oder Markergen nach der Therapie spezifisch in den Zellen des Tumors exprimiert.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Verpackungszellen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ferner geeignete Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe umfaßt. Gegenstand der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Gentherapie solider Tumore geeignet ist und die Verpackungszellen umfasst, die mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren produzieren und infiltrierende Verpackungszellen sind und/oder mit Lassa-Virus-Glykoprotein pseudotypisiert sind, wobei die Verpackungszellen Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren und wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner geeignete Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe umfassen.
  • Bevorzugt werden die Vepackungszellen so formuliert, dass sie direkt in den Tumor eingebracht werden können, beispielsweise durch Injektion in den Tumor oder seine direkte Umgebung. Bei einem Hirntumor ist eine intracraniale Injektion geeignet. Es ist jedoch auch möglich, eine indirekte Verabreichung zu wählen, da die infiltrierenden Verpackungszellen spezifisch in den Tumor einwandern und die Virionen eine hohe Spezifität für die Tumorzellen aufweisen. Beispielsweise können die Verpackungszellen intravenös (i.v.) verabreicht werden. Besonders bevorzugt ist eine Applikation nach Resektion eines Tumors, bei der die pharmazeutische Zusammensetzung in die Resektionshöhle oder ihre direkte Umgebung gegeben wird.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Generierung von Verpackungszellen und Virionen
  • Produktion von Verpackungszellen. Multipotente adulte Progenitorzellen (MAPC) aus Ratten (Fischer-Ratten, Sprague-Dawley-Ratten) werden nach bekannten Verfahren gewonnen (Y. Jiang et al., Nature 418 (2992)41-49).
  • Diese Zellen werden mit dem Expressionsvektor pGag-Pol-IRES-bsr (S. Morita et al., Gene Therapy 7 (2000) 1063-1066) transfiziert und mit Blasticidin 10 Tage lang selektioniert. Der daraus resultierende Zellpool exprimiert stabil MoMLVgagpol.
  • Stabile LCMV-GP Expression in diesem Zellpool wird durch Transduktion mit dem lentiviralen selbstinaktivierenden (SIN) Vektor SEW/GPopt erzielt. Der lentivirale SIN Vektor SEW/GPopt wurde auf Basis des Vektors pHR'SIN.cPPT-SEW (C. Demaison et al., Hum. Gene Ther. 13 (2002) 803-813) entwickelt, in dem das GFP-Gen durch das kodonoptimierte LCMV-WE-HPIopt ersetzt wurde. Zur Produktion lentiviraler SEW/GPopt-Vektoren wurden 5μg SEW/GPopt mit 5μg pRSVrev und 15μg pMDLg/RRE (T. Dull et al., Journal of Virology 72 (1998) 8463-8471) in 293T Zellen kotransfiziert. Zellkulturüberstände wurden 48 bzw. 72 Stunden nach Transfektion abgenommen und direkt zur Transduktion MoMLVgagpol exprimierender MAPC-Zellpools verwendet. Drei Tage nach der Transduktion wurden die Zellpools mittels Durchflusszytometrie auf Expression von LCMV-GP untersucht.
  • Durchflußzytometrische Analyse der LCMV-GP-Expression. Zur Analyse der Expression des LCMV Glykoproteins wurden 5 × 105 Zellen geerntet, pelletiert und mit einem monoklonalen Antikörper gegen LCMV-GP1 inkubiert (M. Bruns et al., Virology 130 (1983) 247-251). Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und für weitere 20 Minuten in einer 1:10 Verdünnung eines PE-markierten Ziege Anti-Maus Antikörpers inkubiert (Dako, Glostrup, Dänemark). Nach drei abschließenden Waschschritten in PBS wurden die Zellen mittels eines FACScalibur Geräts analysiert (Becton Dickinson, Heidelberg).
  • Produktion von LCMV Pseudotypen. Zur Untersuchung der Vektorproduktion in stabil MoMLVgasgpol und LCMV-GPopt exprimierenden Zellpools wurden diese zunächst mit einem retroviralen Vektor, z.B. MP7IEGFP (A. Schambach et al. Molecular Therapy 2 (2000) 435-445), transduziert.
  • Dafür wurden retrovirale MP71EGFP-Vektorüberstände durch Kotransfektion von 293T Zellen mit pGag-Pol-IRES-bsr (12μg), MP71EGFP (7μg) pHCMV-LCMV-GP (WE-HPI) (2μg) produziert. Das Expressionsplasmid pHCMV-LCMV-GP (WE-HPI) wurde auf Basis der bekannten Sequenz des WE-HPI-Stammes (SEQ ID NO: 26; EMBL database accession no. AJ297484) und dem pHCMV Expressionsvektors (V. Romanowski et al., Virus Res. 3 (1985) 101-114; J.-K. Yee, Methods Cell Biol. 43 (1994) 99-112) entwickelt (W.R. Beyer et al., J. Virol. 75 (2001) 1061-1064; EMBL database accession no. AJ318513).
  • Fünf Tage nach Transduktion der Verpackungszellen mit MP71EGFP werden Zellkulturüberstände der stabil exprimierenden Pools abgenommen und je 0,5ml auf 5 × 104 Indikatorzellen transferiert. Expression des EGFP-Proteins (enhanced green fluorescence Protein) in den Indikatorzellen wurde drei Tage später mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
  • Der retrovirale Vektor MP71EGFP wurde mit Hilfe der GagPol- und LCMV-GP-Proteine, die in den stabil exprimierenden Zellpools vorhanden sind, in infektiöse Partikel verpackt. Die MAPC-Zellen sind als Verpackungszellen geeignet.
  • Beispiel 2: Selektive Transduktion von Tumoren
  • Material und Methoden
  • Zelllinien. 9L Ratten-Gliosarcom-, 294 humane Nieren- und TE671 humane Fibroblasten-Zellinien wurden von der American Type Culture Collection erhalten. G62 humane Gliom-Zellen wurden freundlicherweise von M. Westphal (Universitätskrankenhaus Eppendorf, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt durch 10 % Fetales Kälberserum und Penicillin/Streptomycin in einer feuchten Atmosphäre bei 5 % CO2 kultiviert.
  • Transduktion von 9L Zellen mit DsRed. DsRed in einem pMP71-Vektorgerüst wurde freundlicherweise von Norbert Dinauer zur Verfügung gestellt. Zur Transduktion der 9L Zellen mit DsRed wurdeen 9L Zellen in 24-Well(Loch)-Platten in einer Dichte von 5 × 104 Zellen/well ausgesäat. Nach 4 Stunden wurden retrovirale Überstände zur Verpackung des pMP71 DsRed Vektors hinzugefügt. Die Platten wurden für 1 Stunde bei 1000xg zentrifugiert. Die Transduktion der Zellen wurde 16 Stunden nach der ersten Transduktion wiederholt. Die Expression von DsRed wurde fluoreszenzmikroskopisch bestätigt (Nicon Eclipse TE300, Düsseldorf, Deutschland). Zur Isolation DsRed exprimierender einzelner Klone wurden 100 transduzierte 9L Zellen in 10 cm Schalen ausplattiert und Kolonien wachsen gelassen. DsRed-positive Kolonien wurden mit Fluoreszenz-Mikroskopie identifiziert und in getrennte Wells von 24-Well-Platten übertragen. Das Expressionsniveau isolierter Klone wurde durchflußcytometrisch mit einem FACS-Calibur bestimmt (Becton Dickinson, San Jose, Californien). Zur in vivo Implantation wurde ein Klon ausgewählt, der 95 % DsRed-positive Zellen enthielt.
  • Transiente Produktion von Pseudotypen lentiviraler Vektoren.
  • Lentivirale Vektoren wurden durch transiente Transfektionen von 293T Zellen produziert. 16 Stunden vor der Transfektion wurden 5 × 106 Zellen in Kulturgefäßen mit 10 cm Durchmesser in DMEM/FBS ausgesät. Eine Stunde vor der Transfektion wurde das Kulturmedium gegen 10 ml DMEM/FBS/PS pro Gefäß ausgewechselt, mit 25 μmol/l Chloroquin, 50 U Penicillin/ml, 50 μg/ml Streptomycin (PS, Gibco-Invitrogen). Für die Transfektion eines Kulturgefäßes wurden dann 5 μg pRRL.sinCMVeGFPpre, 5 μg pRSV-Rev, 15 μg pMDLg/pRRE (Dull et al., J. Virol. 72 (1998) 8463-8471), und 1-2 μg eines pHCMV Expressionsplasmids für das Glykoprotein des LCMV, pHCMV-LCMV-GP (WE-HPI) (W.R. Beyer et al., J. Virol. 75 (2001) 1061-1064), verwendet. Eine Mischung, die 450 μl des Plasmids in ddH2O und 50 μl 2,5 mol/l CaCl2 enthielt, wurde gut gemischt und dann tropfenweise zu 500 μl zweifach HEPES-gepufferter Salzlösung (280 mmol/l NaCl, 100 mmol/l HEPES, 1,5 mmol/l Na2HPO4, pH 7,1) hinzugefügt. Nach dem Vortexen wurde der Niederschlag sofort zu den Kulturen hinzugefügt. Das Medium wurde nach acht Stunden gegen 10 ml pro Gefäß DMEM/FBS/PS mit 20 mmol/l HEPES ausgetauscht. Vektorenthaltende Überstände wurden 24 Stunden nach der Transfektion und danach alle 8-16 Stunden für einen Zeitraum von 2 Tagen gesammelt. Die Zellkulturüberstände wurden gepoolt und durch einen MILEX GP Filter mit 0,22 μm Porengröße (Millipore, Redford, Mass.) filtriert. Für in vivo und in vitro (kultivierte Gehirnzellen) Anwendungen, wurden die Vektorüberstände durch Ultrazentrifugation bei 19.500 rpm für 2 Stunden in einem SW28-Rotor (Beckmann Instruments, Kalifornien) konzentriert.
  • Vektortitration. Lentivirale Vektortiter wurden duch Transduktion verschiedener Zelllinien bestimt. Serielle Verdünnungen der Zellüberstände wurden hergestellt und 0,5 ml jeder Verdünnung wurden zu 5 × 104 Zellen hinzugefügt und in einem Well einer 24-Wellplatte vier Stunden vor der Transduktion ausgesät. Die Platten wurden für eine Stunde bei 1000 g zentrifugiert. Die Zellen wurden 65 Stunden nach der Transduktion durchflusscytometrisch mit einem FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, Kalifornien) auf GFP-Expression untersucht. Die Titer wurden aus den Verdünnungen errechnet, die zu 0,5% bis 20% eGFP positiven Zellen führten, einem Bereich der linearen Relation zwischen Vektoreinsatz und Prozentsatz transduzierter Zellen, da multiple Integrationen von Vektor in die Zielzelle normalerweise nicht erwartet werden.
  • Ratten-Hippocampus Neuronen Kultur. Primäre Hippocampus Neuronen Zellkulturen wurden, wie bereits beschrieben, hergestellt (Neumann et al., Science 269 (1995) 549-552). Im wesentlichen wurden Hippocampi aus dem gesamten Hirn von Wistarratten an Tag 16 der Embryonalentwicklung isoliert, die Hirnhaut wurde entfernt. Das beschnittene Gewebe wurde durch Zerreiben mit einer sterilen Pasteurpipette dissoziiert. 5 × 104 Zellen pro ml wurden in Vierkammerobjektträger, die mit Poly-L-Ornithin (0,5 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) in 0,15 mol/l Borsäure vorbehandelt wurden, gegeben. Die Zellen wurden in chemisch definiertem Medium kultiviert, das basales Eagle-Medium (BME, Invitrogen, Gaithersburg, MD) mit B27 Ergänzung (2% (v/v), Invitrogen) und Glucose (1% (v/v), 45%, Sigma) enthielt.
  • Für Ratten-Astrozyten angereicherte Gliazellkultur. Hippocampi von Wistarratten wurden an Tag 16 der Embryonalentwicklung isoliert und, wie für die neuronale Hippocampuszubereitung beschrieben, in Einzelzellsuspensionen dissoziiert. Zellen wurden in 50 ml Gewebekulturflaschen ausplattiert, die mit Poly-L-Lysin (5 μg/ml, Sigma) vorbehandelt wurden. Die Zellen wurden in Serum kultiviert, das Medium mit MEM-D-Valin (Invitrogen), 10% durch Hitze inaktiviertem FCS (Pan System, Würzburg, Deutschland) und 1% L-Glutamin enthielt. Für Astrozyten angereicherte Gliazellen wurden für 10-20 Tage kultiviert und dann in BME mit B27 Ergänzung (2% (v/v), Invitrogen) und Glucose (1% (v/v), 45%, Sigma) in einer Dichte von 2 × 104 Zellen/ml in Vierkammerobjekträgern vor der Transduktion ausplattiert.
  • Insgesamt waren, wie mit einer Immunomarkierung mit Kaninchenantikörpern gegen GFAP (10μg/ml, Dako, Glostrup, Dänemark) bestimmt wurde, 94% (+3% SD) der Zellen Astrozyten.
  • Transduktion kultivierter Gehirnzellen. 14 Tage nach dem Ausplattieren wurden Neuronen und Astrozyten mit lentiviralen pseudotypisierten Vektoren transduziert, die das eGFP Markergen trugen. Zwei Tage nach der Transduktion wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit monoklonalem Maus-Anti-beta-Tubulin-III Antikörper (Sigma) auf Neuronen und monoklonalem Kaninchen-Anti-GFAP Antikörper (Dako) auf Astrozyten gefärbt. Die Zellen wurden über Nacht bei 4° C mit dem Primärantikörper inkubiert. Cy3-Ziege-Anti-Maus und Cy3-Ziege-Anti-Kaninchen wurden als Sekundärantikörper für zwei Stunden bei Raumtemperatur verwendet. Die relativen Zahlen der transduzierten (eGFP-positiven) und untransduzierten (eGFP-negativen) neuronalen (beta-Tubulin-III positiven) und astrozytären (GFAP-positiven) Zellen wurde fluoreszenzmikroskopisch durch das Auszählen von 10 Kamerafeldern für jeden Pseudotyp bestimmt.
  • Tumorimplantation und Einbringen lentiviraler Vektoren
  • Erwachsene weibliche Fischer 344 Raten (Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland) wurden durch i.p. Injektion von Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (2 mg/kg) anästhetisiert. Intracraniale 9L Ds Red-Tumoren wurden etabliert, indem 1 × 105 9L Ds Red-Zellen (in 5μl PBS) unter Verwendung einer Hamilton-Spritze in einem stereotaktischen Apparat (Stoelting, IL) in das rechte Striatum injiziert wurden. Die verwendeten Koordinaten waren 4 mm lateral gegenüber dem Bregma und in 5 mm Tiefe gegenüber der duralen Oberfläche. 6 Tage nach der Tumorimplantation wurden die Ratten anästhetisiert und lentivirale Vektor-Pseudotypen mit Titern im Bereich von 2 × 106 bis 1 × 107 transduzierenden Units (TU)/ml wurden unter Verwendung derselben stereotaktischen Koordinaten und in 1 mm Entfernung (7 verschiedene Orte) injiziert. Ein Gesamtvolumen von 10 μl wurde in jeden Tumor injiziert. Fischerratten, die keine Tumorzellen erhielten, wurden anästhetisiert und lentivirale Pseudotypen wurden in das rechte Striatum oder den rechten Hippocampus injiziert. Die für die Hippocampusregion verwendeten Koordinaten waren 4,5 mm lateral gegenüber dem Bregma, 5,5 mm hinter der coronalen Platte und 3 mm tief gegenüber der duralen Oberfläche.
  • Analyse von Rattengehirn auf Transduktion durch Lentiviren. 7 (tumortragende Ratten) und 14 Tage (Ratten ohne Tumor) nach dem Einbringen des lentiviralen Vektors wurden die Tiere euthanisiert und mit 4% Paraformaldehyd durchströmt. Das Gehirn wurde entfernt, 3 Tage in 30% Sucrose suspendiert und dann in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan schockgefroren. Coronale Sektionen (12 μm) wurden mit einem Cryostat hergestellt und entweder mit Kaninchen-Anti-GFAP-Antikörpern (Dako, Hamburg, Deutschland) auf Astrozyten oder Maus-Anti-NeuN-Antikörpern (Chemicon, Hofheim, Deutschland) auf Neuronen gefärbt. Primäre Antikörper wurden über Nacht bei 4° C inkubiert. Cy3-Ziege-Anti-Maus und Cy3-Ziege-Anti-Kaninchen (Dianova, Hamburg, Deutschland) wurden als Sekundärantikörper für zwei Stunden bei Raumtemperatur benutzt. Die Sektionen wurden unter einem Floureszenz-Mikroskop untersucht (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Transduktionseffizienzen in infizierten Tumorregionen wurden geschätzt (0-10%, 10-50% und 50-100%). Zusätzlich wurden die Sektionen mit Confokaler Laser Scanning Mikroskopie (Leica, UK) analysiert.
  • Ergebnisse
  • Mit LCMV GP- und VSV G-pseudotypisierte lentivirale Vektoren transduzieren 9L Tumorzellen in vitro
  • Es wurde die Transduktionseffizienz sowohl VSV G- als auch LCMV GP-pseudotypisierter lentiviraler Vektoren in den Ratten gliomzelllinien 9L und 9LDsred (verwendet für Tumorimplantation) in vitro verglichen. Die humane epitheliale Zelllinie TE671, die sowohl durch mit VSV G als auch mit LCMV pseudotypisierte Vektoren transduziert werden konnte, wie in einer vorherigen Untersuchung gezeigt (Beyer et al., 2002, Loc. cit.), wurde als Infektionskontrolle verwendet. Es wurden Endpunktverdünnungen mit 9L, 9LDsred und TE671-Zellen durchgeführt, und der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde mittels durchflusszytometrischer Analyse gemessen. Beide Vektoren transduzierten 9L Zellen, VSV G-Pseudotypen jedoch mit einer höheren Effizienz (Tabelle 1). Die relative Transduktion im Vergleich zu TE671 war für LCMV 0,65 und für VSV G Pseudotypen 1,91. Weiterhin unterschieden sich die Transduktionseffizienzen für 9L und 9LDsred Tumorzellen in vitro nicht signifikant (Tabelle 1). Tabelle 1: Vektortiter pseudotypisierter lentiviraler Vektoren gegenüber TE671 und Gliom-Zelllinien
    Zelllinie (Zahl der Experimente) LCMV GP VSV G
    Pseudotyp Titer [TU/ml] (± SD) Titer gegnüber TE671 (± SD) Pseudotyp Titer [tu/ml] (± SD) Titer gegenüber TE671 (± SD)
    TE671 (4) 2,75 (± 1,07) × 104 1 6,08 (± 6,00) × 104 1
    9L (4) 1,80 (± 0,78) × 104 0,65 (± 0.03) 8,83 (± 5,81) × 104 1,91 (± 0,63)
    9LDsRed (2) 1,29 (± 1,00) × 104 0,35 (± 0,21) 8,35 (± 5,97) × 104 1,89 (± 0,07)
  • Zellinien wurden mit LCMV GP- oder VSV G-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren transduziert, die eGFP verpackten. Die Titer wurden durch FACS Analyse gemessen. Die Ergebnisse stellen Durchschnitt und Standardabweichung von mindestens zwei Experimenten dar.
  • VSV G-Pseudotypen transduzieren kultivierte Neuronen und Astrozyten effizienter als LCMV GP Pseudotypen.
  • Um den Tropismus beider pseudotypisierter Vektoren für normale Gehirnzellen in vitro zu analysieren, wurden kultivierte Neuronen und Astrozyten, die aus 16 Tage alten embryonalen Wistarratten durch Endpunktverdünnungen gewonnen wurden, infiziert. Die humane Gliom-Zelllinie G62, von der in einer vorhergehenden Untersuchung bereits gezeigt wurde, dass sie von beiden Pseudotypen infiziert werden kann, wurde als Infektionskontrolle verwendet. VSV G-Pseudotypen transduzierten GFAP-positive Astrozyten und beta-Tubulin-III-positive Neuronen auf einem höheren Niveau als LCMV-Pseudotypen (Tabelle 2). Insbesondere war die Transduktionseffizienz für Neuronen deutlich unterschiedlich: VSV G-Pseudotypen transduzierten 62,5%, während LCMV Pseudotypen nur 2,2% der gezählten Neuronen infizierten. Zusätzlich zeigten LCMV GP-Pseudotypen einen höheren Grad der Transduktion der humanen Gliom-Zelllinie G62 (89,5%) als von kultivierten Astrozyten (71,7%) und Neuronen (2,2%). Im Gegensatz dazu transduzierten VSV G-Pseudotypen Astrozyten (85,5%) und Neuronen (62,5%) zu einem höheren Grad als G62-Zellen (56,9%). Tabelle 2:
    Kultivierte Zellen Lentiviraler Pseudotypisierter Vector (Titer auf TE 671) Transduzierte cells/high power field (±SD) Gesmtzellzahl/high power field (±SD) Ratio (%) (± SD)
    Astrozyten LCMV-GP (8 × 104) 35.7 (± 12.6) 49.0 (± 13.3) 71.7 (± 10.3)
    VSV-G (3 × 104) 43.5 (± 18.0) 49.9 (± 16.4) 85.5 (± 12.4)
    Neuronen LCMV-GP (8 × 104) 0.4 (± 0.5) 17.9 (± 5.9) 2.2 (± 3.0)
    VSV-G (3 × 104) 8.2 (± 3.3) 13.8 (± 6.1) 62.5 (± 16.9)
    G62 LCMV-GP (8 × 104) 67.3 (± 18.3) 75.5 (± 20.3) 89.5 (± 6.7)
    VSV-G (3 × 104) 41.1 (± 14.5) 72.3 (± 12.2) 56.9 (± 17.0)
  • Kultivierte Ratten-Astrozyten oder -Neuronen wurden mit 3 × 104 bis 8 × 104 eGFP TU von mit LCMV GP- or VSV G-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren transduziert. Die Zellen wurden fluoreszenzmikroskopisch nach Färbung mit monoklonalen anti-GFAP Antikörpern gegen Astrozyten oder Anti-beta-Tubulin-III-Antikörpern gegen Neuronen analysiert. Die Ergebnisse stellen die durchschnittlichen Zellzahlen und Standardabweichungen aus 10 zufällig ausgewählten Kamerafeldern dar.
  • VSV G- und LCMV GP-Pseudotypen zeigen einen unterschiedlichen Tropismus gegenüber normalen Gehirnzellen in vivo
  • Die in vitro Ergebnisse wurden in einem Rattenmodell bestätigt. Zu diesem Zweck wurden LCMV GP- und VSV G-Pseudotypen in Striatum und Hippocampus von Fischerratten injiziert. Der relative Anteil der transduzierten Zelltypen wurde durch Immunfloureszenzfärbung mit zellspezifischen Markern und confokaler Mikroskopie analysiert. LCMV GP Pseudotypen transduzierten in beiden Gehirnregionen fast ausschließlich Astrozyten, wie mit der Färbung mit Antikörpern gegen GFAP gezeigt werden konnte (2A-C). Diese Beobachtung konnte sogar in Regionen mit hoher Neuronendichte bestätigt werden (2D-F). Transduktion von Neuronen kamen selten vor. Im Gegensatz dazu infizierten VSV G-Pseudotypen Neuronen sehr effizient und das geschätzte Verhältnis transduzierter Neuronen gegenüber Astrozyten war in beiden Gehirnregionen 3:1 (2G-I, K-M, N-P).
  • LCMV-GP-Pseudotypen zeigen eine spezifische und effiziente Transduktion glialer Tumorzellen in vivo
  • Schließlich wurde der Tropismus der verschiedenen Pseudotypen in einem Rattengliom-Modell untersucht. Zunächst wurde getestet, ob die in vivo Wachstumscharakteristika der genmarkierten, für die Tumorimplantation verwendeten Gliom-Zelllinie (9LDsred) sich von denen der parentalen Zelllinie 9L unterschieden. Zwei Wochen nach i.c. Tumorzellimplantation in Fischerratten wurden die etablierten Tumore histologisch auf ihre Größe und durch Licht (9L) oder Floureszenzmikroskopie (9LDsRed) auf ihre Fähigkeit, in das Hirnparenchym einzudringen, untersucht. 9L und 9LDsRed-Tumore zeigten keine Unterschiede in ihrer Größe, und beide infiltrierten zu einem gleichen Ausmaß normales Gehirn. Mit dem DsRed Marker konnten sogar einzelne Tumorzellen detektiert werden, die in das Gehirnparenchym einwanderten.
  • Um die Transduktion der 9LDsRed Tumore in vivo durch beide Pseudotypen zu analysieren, erhielten zwei Gruppen weiblicher Fischerratten, die 9LDsRed Tumore trugen, LCMV GP- und VSV G-Pseudotypen injiziert. Um die Transduktion des soliden Tumors und der infiltrierenden Gliom-Zellen zu messen, wurden die Injektionen in dem Zentrum des Tumors und 1 mm entfernt gesetzt. Die Transduktionseffizienzen der infizierten Tumorregionen wurden wie oben beschrieben geschätzt. LCMV GP-Pseudotypen zeigten eine sehr effiziente Transduktion des soliden Tumors: 50-100% der Tumorzellen waren in Tumorregionen, in die Vektorüberstände injiziert wurden, GFP-positiv (1A-C). In den infiltrierenden Regionen der 9LDsRed Tumore infizierten LCMV GP-Pseudotypen spezifisch die Gliomzellen (1D-F). Selbst einzelne infiltrierende Tumorzellen wurden durch diesen Vektorpseudotypen transduziert (1E-I). Nur wenige reaktive Astrozyten in dem Bereich des Tumorbettes waren GFP-positiv, wie durch Färbung mit Antikörpern gegen GFAP gezeigt werden konnte. Neuronen in infiltrierenden Tumorregionen waren nicht infiziert. VSV G-Pseudotypen zeigten ein unterschiedliches Transduktionsmuster: Solider Tumor wurde zu einem deutlich geringeren Ausmaß (0-10%) transduziert als mit den LCMV GP Pseudotypen (1K-M). Im Gegensatz dazu waren viele normale Gehirnzellen, einschl. Neuronen und reaktive Astrozyten in der infiltrierenden Region und um das Gehirnparenchym herum GFP-positiv, während nur selten Tumorzellen transduziert waren (1N-P).
  • Die Versuche zeigen also, dass bei intracranialer Applikation lentiviraler Vektoren, die mit LCMV Glykoprotein pseudotypisiert waren, spezifisch Tumorzellen infiziert wurden. Obwohl bei in vitro Versuchen und auch bei der Verabreichung der LCMV GP-pseudotypisierten Vektoren in Gehirn, in denen keine Tumore vorlagen, durchaus Astrozyten und, wenn auch zu einem geringen Prozentsatz, Neuronen infiziert wurden, kann bei der Behandlung von Tumoren in vivo eine hervorragende Spezifität der Transduktion mit dem in den pseudotypisierten Vektoren enthaltenen Transgen erreicht werden.
  • Beispiel 3: Migrationsstudien
  • Material und Methoden
  • Rotfluoreszierendes Protein exprimierende Tumorzellen (9L RFP) wurden Fischerratten stereotaktisch intracranial implantiert (Protokoll siehe Beispiel 2). An Tag 5 wurden Zellen der zu untersuchenden Zelllinie implantiert. Diese Zellen waren mit grünfloureszierendem Protein (eGFP) transfiziert. An Tag 8 wurde das Gehirn entnommen und eine histologische Untersuchung durchgeführt. Es wurden folgende hämatopoetische und nichthämatopoetische Zelllinien auf ihre Migrationsfähigkeit untersucht:
    • – K562 (human, Chronisch Myeloide Leukämie-Zelllinie)
    • – U937 (human, Monozyten)
    • – Raji (human, B-Zelllinie)
    • – Jurkat (human, T-Zelllinie)
    • – 3T3 (murin, Fibroblasten)
  • Weiterhin wurden verschiedene Stammzellen, die nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt wurden, auf ihre Migrationsfähigkeit untersucht. Es wurden Multiple adulte Progenitorzellen (MAPC aus Fischerratten, fMAPC) (Young et al., Nature 418 (2002) 41-49), SdMSC (mesenchymale Stammzellen aus Sprague-Dawly-Ratten), sowie murine mesenchymale Stammzellen (mMSC) (P. Tropelet al., Exp Cell Res. 2004 May 1;295(2):395-406) und murine neurale Stammzellen (C17-2 Zelllinie: A.B. Brown et al., Hum Gene Ther. 2003 Dec 10;14(18):1777-85). getestet.
  • Die Fähigkeit verschiedener Zellen, den soliden Tumor spezifisch zu infiltrieren, ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3:
    Neurale Stammzellen (NSC), murin +++
    Mesinchemale Stammzellen (MSC), murin und Ratte +
    Mulitpotente adulte Progenitorzellen (MAPC), Ratte (Fisher, Sprague Dawly) +++
    K562, humane Chronisch Myeloide Leukämie-Zelllinie –
    Jurkat, humane T-Zelllinie –
    Raji, humane B-Zelllinie –
    U937, humane monozitäre Zelllinie –
    293, humane Nierenepithelzelllinie –
    TE671, humane Fibroblastenzelllinie –
    3T3 murine Fibroblastenzelllinie –
    • + und – zeigen die Fähigkeit des Zelltyps an, den Tumor spezifisch zu infiltrieren.
  • Wie in der Tabelle gezeigt, sind die untersuchten Tumor-Zelllinien nicht in der Lage, in den Tumor zu infiltrieren. In einigen Fällen verbleiben einige Zellen im Zentrum des Tumors, werden jedoch apoptotisch. Die Mehrzahl der Zellen ist rings um den Tumor angeordnet, einzelne Zellen waren jedoch auch im gesunden Gehirngewebe weit entfernt vom Tumor nachweisbar. Die aus primären Zellen gewonnenen Stammzelllinien sind in der Lage, den Tumor zu infiltrieren. Bei den MSC infiltriert ein Teil der Zellen den Tumor jedoch nur oberflächlich. Eine optimale Infiltration ist bei Verwendung von MAPC zu beobachten. Für NSC wurde eine solche spezifische Infiltration schon früher beobachtet. Primäre NSC sind ex vivo jedoch nur zu wenigen Teilungen fähig und müssen für die Anlage stabiler Linien erst genetisch (z.B. durch SV40 large T) transformiert werden. Somit können NSC nur nach Bestrahlung der Zellen eingesetzt werden. MAPC hingegen können über 80 Teilungen ex vivo vollziehen, ohne zu transformieren.
  • Der Versuch zeigt die Eignung von Stammzellen, als infiltrierende Verpackungszellen bei der Gentherapie solider Tumore eingesetzt zu werden.
  • Legenden der Abbildungen:
  • 1: Solide und infiltrierende Regionen eines Rattenglioms wurden effizient durch LCMV GP-pseudotypisierte lentivirale Vektoren transduziert.
  • Intracraniale 9LDsRed Gliome wurden 7 Tage nach der Tumorimplantation mit LCMV GP- oder VSV G-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren infiziert, die eGFP exprimierten, und an Tag 14 mit confokaler Laserscanning-Mikroskopie analysiert.
    • (A) 50-100% des soliden Tumors waren durch LCMV GP-pseudotypisierte Vektoren transduziert.
    • (B) Solider Tumor, der DsRed exprimiert.
    • (C) Zusammengeführte Bilder von (A) und (B).
    • (D) Transfektion infiltrierender Gliom-Regionen durch LCMV GP-pseudotypisierte Vektoren.
    • (E) Infiltrierende Gliom-Regionen, die DsRed exprimieren.
    • (F) Zusammengeführte Bilder von (D) und (E).
    • (G) Einzelne infiltrierende Tumorzellen, transduziert durch LCMV GP-pseudotypisierte Vektoren.
    • (H) Einzelne infiltrierende Tumorzellen, die DsRed exprimieren.
    • (I) Zusammengeführte Bilder von (G) und (H).
    • (K) 0-10% des soliden Tumors wurden durch VSV G-pseudotypisierte Vektoren transduziert.
    • (L) Solider Tumor, der DsRed exprimiert.
    • (M) Zusammengeführte Abbildungen von (K) und (L)
    • (N) Infiltrierende Gliom-Regionen, transduziert duch VSV G-pseudotypisierte Vektoren.
    • (O) Infiltrierende Gliom-Regionen, die DsRed exprimieren.
    • (P) Zusammengeführte Abbildung von (N) und (O). Originalvergrößerung 20 ×.
  • 2: Neuronen und Astrozyten wurden durch VSV G-pseudotypisierte lentivirale Vektoren in vivo transduziert.
  • Normales Rattenhirn wurde mit LCMV GP- oder VSV G-pseudotypisierten Vektoren infiziert, die eGFP exprimierten. Die Transduktion von Neuronen und Astrozyten wurde nach Färbung mit Antikörpern gegen NeuN und GFRP an Tag 14 durch confokale Laserscanning-Mikroskopie analysiert.
    • (A) Transduktion von Astrozyten im Striatum durch LCMV GP-pseudotypisierte Vektoren.
    • (B) Astrozyten im Striatum, die GFAP exprimieren.
    • (C) Zusammengeführte Abbildungen von (A) und (B).
    • (D) In Bereichen mit großer Neuronendichte (Hippocampus) wurden Neuronen nicht transduziert, jedoch einzelne Astrozyten.
    • (E) Hippocampusneuronen, die NeuN exprimieren.
    • (F) Zusammengeführte Abbildungen von (D) und (E).
    • (G) Transduktion von Hippocampus-Neuronen durch VSV G-pseudotypisierte Vektoren.
    • (H) Hippocampus-Neuronen, die NeuN exprimieren.
    • (I) Zusammengeführte Abbildung (G) und (H).
    • (K) Transduktion von Striatum-Neuronen durch VSV G-pseudotypisierte Vektoren.
    • (L) Striatum-Neuronen, die NeuN exprimieren.
    • (M) Zusammengeführte Abbildungen von (K) und (L).
    • (N) Hippocampus-Astrozyten, transduziert durch VSV G-pseudotypisierte Vektoren.
    • (O) Hippocampus-Astrozyten, die GFAP exprimieren.
    • (P) Zusammengeführte Abbildungen von (N) und (O). Originalvergrößerung 40 ×.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • ANLAGE ZUM SEQUENZPROTOKOLL
  • (Anmerkung: Die folgenden Angaben sind der Datenbank des National Institute of Health (NIH), U.S.A., entnommen. Die ursprünglich darin enthaltenen Nuklein- und Aminosäuresequenzen wurden durch den Verweis auf die entsprechende SEQ ID NO. (numerische Kennzahl <400> nach WIPO Standard ST. 25) des Sequenzprotokolls ersetzt.)
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Claims (38)

  1. Verwendung von Verpackungszellen, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen produzieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie solider Tumore, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszellen Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren, wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen mesenchymale Stammzellen (MSC) oder multipotente adulte Progenitorzellen (MAPC) sind.
  3. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszellen ein oder mehrere Expressionskassetten für die retroviralen Gene gag, pol, ein für ein Arenavirus-Glykoprotein kodierendes Gen und ferner einen retroviralen Gentransfervektor zur Verpackung in die pseudotypisierten Virionen umfassen, der mindestens ein therapeutisch anwendbares Transgen und/oder Markergen umfaßt.
  4. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszellen ferner das Gen tat, rev und/oder env umfassen.
  5. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszellen aus der zu behandelnden Spezies stammen.
  6. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszellen humanen Ursprungs sind.
  7. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Hirntumor ist.
  8. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Arenavirus LCMV oder Lassa-Virus ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass LCMV LCMV-Wildtyp, LCMV-WE-HPI und LCMV-WE-HPIopt umfaßt.
  10. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz des Glykoprotein-gens für ein Glykoprotein mit mindestens 80 % Homologie zu der Aminosäuresequenz des Glykoproteins von LCMV-Wildtyp, von LCMV-WE, LCMV-WE-HPI, LCMV-WE-HPIopt oder Lassa-Virus kodiert.
  11. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz des für das Glykoprotein kodierenden Gens der Sequenz von SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27 oder SEQ ID NO 28 entspricht.
  12. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus ein Onkoretrovirus oder ein Lentivirus ist.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Lentivirus HIV, SIV, EIAV oder FIV ist.
  14. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Virion mindestens ein therapeutisch anwendbares Transgen und/oder Markergen umfaßt.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutisch anwendbare Transgen das Suizid-Gen Herpes simplex-Thymidinkinase (HSV-tk) und/oder Cytosin-Deaminase, und/oder ein immunstimulatorisches Gen, wie IL-4 oder Flt3L, ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Markergen lacZ, ein Antibiotikaresistenzgen und/oder ein Gen für ein Fluoreszenz-Protein ist.
  17. Verwendung nach den Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutisch anwendbare Transgen und/oder Markergen nach der Therapie spezifisch in den Zellen des Tumors exprimiert werden.
  18. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Gliom, Neuroblastom, Oligodendrogliom oder Astrocytom ist.
  19. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor maligne ist.
  20. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein malignes Gliom ist.
  21. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung ferner geeignete Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe umfaßt.
  22. Verpackungszellen zur Gentherapie solider Tumore, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen produzieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren, wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind.
  23. Verpackungszellen nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere Expressionskassetten für die retroviralen Gene gag, pol und ferner ein für ein Arenavirus-Glykoprotein kodierendes Gen umfassen.
  24. Verpackungszellen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen mesenchymale Stammzellen (MSC) oder multipotente adulte Progenitorzellen (MAPC) sind.
  25. Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Arenavirus LCMV oder Lassa-Virus ist.
  26. Verpackungszellen nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass LCMV LCMV-Wildtyp, LCMV-WE-HPI und LCMV-WE-HPIopt umfaßt.
  27. Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz des Glykoprotein-gens für ein Glykoprotein mit mindestens 80 Homologie zu der Aminosäuresequenz des Glykoproteins von LCMV-Wildtyp, von LCMV-WE, LCMV-WE-HPI, LCMV-WE-HPIopt oder Lassa-Virus kodiert.
  28. Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz des für das Glykoprotein kodierenden Gens der Sequenz von SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27 oder SEQ ID NO 28 entspricht.
  29. Verpackungszellen zur Gentherapie solider Tumore, die retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen produzieren, wobei die Verpackungszellen Stammzellen sind, die in der Lage sind, solide Tumore zu infiltrieren, wobei menschliche embryonale Stammzellen ausgeschlossen sind, ferner dadurch gekennzeichnet, dass das Arenavirus-Glykoprotein Lassa-Virus Glykoprotein ist.
  30. Verpackungszellen nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere Expressionskassetten für die retroviralen Gene gag, pol und ferner ein für Lassa Virus-Glykoprotein kodierendes Gen umfassen.
  31. Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner das Gen tat, rev und/oder env umfassen.
  32. Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass sie humanen Ursprungs sind.
  33. Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus ein Onkoretrovirus oder ein Lentivirus ist.
  34. Verpackungszellen nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Lentivirus HIV, SIV, EIAV oder FIV ist.
  35. Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner einen retroviralen Gentransfervektor zur Verpackung in pseudotypisierte Virionen umfassen, der mindestens ein therapeutisch anwendbares Transgen und/oder Markergen umfaßt.
  36. Verpackungszellen nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutisch anwendbare Transgen das Suizid-Gen Herpes simplex-Thymidinkinase (HSV-tk) und/oder Cytosin-Deaminase, ein immunstimulatorisches Gen, wie IL-4 oder Flt3L, ist.
  37. Verpackungszellen nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Markergen lacZ, ein Antibiotikaresistenzgen und/oder ein Gen für ein Fluoreszenz-Protein ist.
  38. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Gentherapie solider Tumore, die Verpackungszellen nach den Ansprüchen 22 bis 37 umfasst.
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