DE102018215551A1

DE102018215551A1 - Verfahren zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus sowie Arenavirusmutanten

Info

Publication number: DE102018215551A1
Application number: DE102018215551.8A
Authority: DE
Inventors: Cornelia Hardt; Michael Bergerhausen; Hilal Bhat
Original assignee: Virolutions Biotech GmbH
Current assignee: Abalos Therapeutics GmbH
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2020-03-12
Also published as: CL2021000592A1; EP4019533A1; ZA202101833B; KR20210057782A; SG11202101970UA; CA3111305A1; ES2908854T3; JP2022500054A; BR112021004451A2; WO2020053324A1; EP3694868B1; DK3694868T3; PH12021550424A1; CN112996802A; IL281299A; AU2019340845A1; MX2021002937A; EP3694868A1; US20220033445A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
a) Inokulieren von primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 mit einem Ausgangsarenavirus,
b) Inkubieren der inokulierten primären Tumorzellen oder der inokulierten Zellen der Zelllinie H1975 unter Bedingungen, welche dazu geeignet sind, dass wenigstens ein Teil der inokulierten primären Tumorzellen oder wenigstens ein Teil der inokulierten Zellen der Zelllinie H1975 mit dem Ausgangsarenavirus infiziert werden,
c) Passagieren der inkubierten primären Tumorzellen oder der inkubierten Zellen der Zelllinie H1975, wobei der Ausgangsarenavirus in den infizierten primären Tumorzellen oder den infizierten Zellen der Zelllinie H1975 zu einem antitumoralen Arenavirus, insbesondere einem Arenavirus, welcher gegenüber dem Ausgangsarenavirus verbesserte antitumorale Eigenschaften aufweist, mutiert,
d) Isolieren des antitumoralen Arenavirus, insbesondere des Arenavirus, welcher gegenüber dem Ausgangsarenavirus verbesserte antitumorale Eigenschaften aufweist, aus den passagierten und infizierten primären Tumorzellen oder aus den passagierten und infizierten Zellen der Zelllinie H1975.
Die Erfindung betrifft des Weiteren Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutanten, isolierte Proteine oder Peptide, Nukleinsäuren, Gen-Cluster oder Operon, einen Expressionsvektor sowie eine Wirtszelle.

Description

ANWENDUNGSGEBIET UND STAND DER TECHNIK
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus, Arenavirusmutanten, isolierte Proteine oder Peptide, insbesondere isolierte Glykoproteine, eines Arenavirus sowie für entsprechende Proteine bzw. Peptide codierende Nukleinsäuren.
Die Arenaviren gehören zur Familie der humanpathogenen, pleomorphen RNA-Viren. Erkrankungen mit diesen Viren gehören aufgrund ihres natürlichen Reservoirs in Tieren, überwiegend Nagern, zu den Zoonosen. Als Zoonosen bezeichnet man Erkrankungen, die vom Tier auf den Menschen und umgekehrt vom Menschen auf das Tier übertragbar sind.
Wenigstens acht Arenaviren sind dafür bekannt, dass sie im Menschen eine Krankheit verursachen. Typisch sind aseptische Meningitis und hämorrhagisches Fieber. Bekannte Viren, welche im Menschen eine Erkrankung auslösen können, stellen das Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus (LCMV), Guanarito-Virus (GTOV), Junin-Virus (JUNV), Lassa-Virus (LASV), Lujo-Virus (LUJV), Machupo-Virus (MACV), Sabia-Virus (SABV) sowie das Whitewater-Arroyo-Virus (WWAV) dar.
Arenaviren mit dem Genus Mammarenavirus werden in zwei Gruppen, nämlich in die Altwelt-Arenaviren und die Neuwelt-Arenaviren, unterteilt. Diese Gruppen unterscheiden sich geografisch und genetisch. Altwelt-Arenaviren, wie beispielsweise das Lymphozytäre-Choriomeningitis-Virus, wurden hauptsächlich in Ländern der östlichen Hemisphäre, wie beispielsweise europäischen, asiatischen und afrikanischen Ländern, gefunden. Dagegen wurden Neuwelt-Arenaviren in Ländern der westlichen Hemisphäre, wie beispielsweise Argentinien, Bolivien, Venezuela, Brasilien und den Vereinigten Staaten von Amerika, gefunden.
Arenaviren replizieren in der Zelle und gelangen als Virione (infektiöse Partikel) in den extrazellulären Raum. Virione haben eine pleomorphe häufig runde Gestalt mit einem Durchmesser von meist 110 nm bis 130 nm bis hin zu 50 nm bis 300 nm. Das Capsid der Virione ist umgeben von einem Hüllprotein, das aus einer Doppellipidmembran und Homotrimeren von Glykoproteinen (GP1 und GP2) besteht, die wie Spikes herausragen. Das GP1 ist nach außen gerichtet und bindet bei der Infektion an den zellulären Rezeptor. Das GP2 ist entgegengesetzt gerichtet und vermittelt die Fusion mit der Zelle. Die Z-Proteine liegen wie ein Ring unterhalb der Lipidschicht, im Inneren des Nukleokapsids sind die Ribonukleoprotein(RNP)-Komplexe aus jeweils dem kürzeren RNA-Segment (S-Segment 3,5 kb) bzw. dem längeren RNA-Segment (L-Segment 7,2 kb) und den Nukleoproteinen lokalisiert. Das L-Protein, die virale Polymerase, ist mit den RNP-Komplexen assoziiert. L- und S-Segment tragen die genetische Information und kodieren für jeweils zwei Proteine. Die einzelsträngigen RNAs haben eine gemischte (d.h. ambisense Polarität), an ihren 3' untranslatierten Enden sind die Sequenzen (ca. 19-30 bp) konserviert, auch innerhalb der Virusfamilie. Zunächst werden die mRNAs von Nucleoprotein und L-Protein transkripiert, dann folgen Replikation und mRNA Transkription von Z-Protein und dem Glykoprotein-Precursor und schließlich die Translation und Modifikation der viralen Proteine.
Die Verwendung von Arenaviren als Impfvektoren ist bekannt. Ein prominentes Beispiel ist das gegen argentinisch hämorrhagisches Fieber eingesetzte Impfvirus Candid #1. Hierbei handelt es sich um eine Impfvariante des Junin-Virus.
Aus der WO 2009/083210 A1 ist die Verwendung von replikationsdefekten, d.h. gentechnologisch modifizierten, Arenavirus-Partikeln (Virionen) unter anderem zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen, wie beispielsweise Melanom, Prostatakarzinom, Mammakarzinom und Lungenkarzinom, bekannt. In der Publikation „Development of replicationdefective lymphocytic choriomeningitis virus vectors for the induction of potent CD8⁺ T cell immunity“ (Nature Medicine, Bd. 16, Nr. 3, März 2010, S. 339-345; doi: 10.1038/nm.2104) wird als potentielles Anwendungsgebiet für solche Viruspartikel die Krebsimmuntherapie erwähnt.
Ferner ist aus der WO 2006/008074 A1 die Verwendung von Verpackungszellen, welche retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Virionen produzieren, zur Gentherapie solider Tumore bekannt.
Die oben im Stand der Technik beschriebenen Methoden zur Behandlung von Tumoren beruhen auf der Verwendung von gentechnologisch sehr aufwendig herzustellenden Viruspartikeln. Bei gentherapeutischen Behandlungsmethoden kommt hinzu, dass eine ausreichende, therapeutisch wirksame Transduktion des Tumorgewebes mit gentechnisch hergestellten Virionen oder Verpackungszellen, welche Virionen produzieren, häufig nicht erzielbar ist.
Aus der WO 2016/166285 A1 sind zwar Arenaviren zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Tumoren bekannt, wobei die Arenaviren frei von genomischer Fremd-RNA sind. Obendrein ist aus der WO 2016/166285 A1 ein Verfahren zur Herstellung von Arenaviren mit tumorregressiven Eigenschaften bekannt.
Gleichwohl besteht weiterhin Bedarf an spezifisch und insbesondere therapeutisch wirksamen Arenaviren zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Vorbeugung von Tumoren.
AUFGABE UND LÖSUNG
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Arenaviren mit antitumoralen Eigenschaften und/oder verbesserten antitumoralen Eigenschaften herzustellen. Des Weiteren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, entsprechende Arenavirenmutanten, isolierte Proteine oder Peptide, insbesondere Glykoproteine und/oder L-Proteine, von Arenaviren sowie entsprechend codierende Nukleinsäuren bereitzustellen.
Die oben genannten Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren gemäß unabhängigem Anspruch 1, eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante gemäß Anspruch 8, ein Arzneimittel gemäß Anspruch 12, durch ein isoliertes Protein oder Peptid gemäß Anspruch 14 sowie durch eine isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 15. Bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens sowie der Lymphozytären Choriomeningitis-Virus-Mutante sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche sowie der vorliegenden Beschreibung. Zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung sind in der Beschreibung offenbart. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme zum Inhalt der vorliegenden Beschreibung gemacht.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus, d.h. eines tumorbekämpfenden oder -abstoßenden Arenavirus (sogenanntes tumorregressives Arenavirus), insbesondere eines Arenavirus, welches gegenüber einem Ausgangsarenavirus verbesserte antitumorale, d.h. verbesserte tumorbekämpfende oder -abstoßende, Eigenschaften aufweist.
Das Verfahren weist die folgenden Schritte auf:

a) Ausplattieren von primären Tumorzellen in einem Nährmedium, vorzugsweise flüssigen Nährmedium, oder Ausplattieren von Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 auf und/oder in ein Nährmedium, vorzugsweise flüssiges Nährmedium,
b) Inokulieren, d.h. Beimpfen, der ausplattierten primären Tumorzellen mit einem Ausgangsarenavirus oder Inokulieren, d.h. Beimpfen, der ausplattierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 mit einem Ausgangsarenavirus,
c) Inkubieren der inokulierten primären Tumorzellen oder Inkubieren der inokulierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2, d.h. Inkubieren der primären Tumorzellen und des Ausgangsarenavirus oder Inkubieren der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 und des Ausgangsarenavirus, unter Bedingungen, welche dazu geeignet sind, dass wenigstens ein Teil der inokulierten primären Tumorzellen oder wenigstens ein Teil der inokulierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2, insbesondere nur ein Teil der inokulierten primären Tumorzellen oder nur ein Teil der inokulierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 oder alle inokulierten primären Tumorzellen oder alle inokulierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2, mit dem Ausgangsarenavirus infiziert werden,
d) Entnehmen eines arenavirushaltigen Zellkulturüberstandes aus einer die inkubierten primären Tumorzellen enthaltenden Zellkultur oder Entnehmen eines arenavirushaltigen Zellkulturüberstandes aus einer die inkubierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 enthaltenden Zellkultur,

a)

d)

H1975

C643

C2

a)

d)

b)

d)

a)

d)

H1975

C643

C2

a)

d)

b)

d)

a)

d)

Die erste Durchführung der Schrittabfolge a) bis d) kann im Sinne der vorliegenden Erfindung auch als erste Passage bezeichnet werden. Die erste Passage wird demnach mit dem Ausgangsarenavirus als Inokulum durchgeführt. Jede weitere Passage wird dann mit einem im Schritt d) einer vorhergehenden, vorzugsweise unmittelbar vorhergehenden, Passage entnommenen, arenavirushaltigen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon durchgeführt. Ab Durchführung einer zweiten Passage kann im Sinne der vorliegenden Erfindung auch von einem wiederholten Passagieren gesprochen werden.
Unter dem Ausdruck „Ausgangsarenavirus“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Arenavirus verstanden werden, welches vor der ersten Wiederholung der Schrittabfolge a) bis d), d.h. vor der ersten Passage, zum Inokulieren der primären Tumorzellen oder der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 (Schritt b)) verwendet wird. Bei dem Ausgangsarenavirus kann es sich, worauf nachfolgend noch näher eingegangen werden wird, insbesondere um ein Wildtyp-Arenavirus, d.h. ein sogenanntes wildtypisches Arenavirus, oder eine Mutante davon handeln. Insbesondere kann es sich bei dem Ausgangsarenavirus um ein Arenavirus ohne antitumorale Eigenschaften oder mit antitumoralen Eigenschaften handeln.
Unter dem Ausdruck „Wildtyp-Arenavirus“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Arenavirus verstanden werden, dessen Genom die in der Natur auftretende genetische Normalform darstellt.
Unter dem Begriff „primäre Tumorzellen“ sollen im Sinne der vorliegenden Erfindung unpassagierte oder nicht passagierte, d.h. direkt aus einem Tumorgewebe isolierte, Tumorzellen oder direkt aus einem Tumorgewebe isolierte Tumorzellen, welche vor Durchführen von Schritt a) höchstens 1000-mal, insbesondere höchstens 100-mal, bevorzugt höchstens 10-mal, passagiert wurden, oder primäre Tumorzellen, welche sich dadurch auszeichnen, dass sie unterschiedliche Zellklone aufweisen, verstanden werden. Im Falle Letzterer kann die Heterogenität durch unterschiedliche Proteinexpression sowie durch unterschiedliche DNA-Sequenzen (genetischer Fingerabdruck) nachgewiesen werden.
Unter dem Ausdruck „Zelllinie H1975“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Zelllinie verstanden werden, welche aus einem menschlichen Adenokarzinom isoliert wurde und bei ATCC (American Type Culture Collection) unter der Bezeichnung NCI-H1975 (ATCC^® CRL-5908^®) sowie unter der Akzessions- oder Hinterlegungsnummer CVCL-1511 hinterlegt ist.
Unter dem Ausdruck „Zelllinie C643“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Zelllinie verstanden werden, welche aus einem menschlichen anaplastischen Schilddrüsenkarzinom isoliert wurde und unter der Bezeichnung C643 sowie unter der Akzessions- oder Hinterlegungsnummer CVCL-5969 (ExPASy Cellosaurus) hinterlegt ist.
Unter dem Ausdruck „Zelllinie Tramp-C2“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Zelllinie verstanden werden, welche aus einem murinen Adenokarzinom isoliert wurde und unter der Bezeichnung Tramp-C2 sowie unter der Akzessions- oder Hinterlegungsnummer CVCL-3615 (ExPASy Cellosaurus) hinterlegt ist.
Unter dem Ausdruck „Ausplattieren“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Aus- oder Einbringen von primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 auf und/oder in ein Nährmedium, vorzugsweise flüssiges Nährmedium, verstanden werden. Anders ausgedrückt, soll unter dem Ausdruck „Ausplattieren“ im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Kultivieren, insbesondere ein initiales Kultivieren, von primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 auf und/oder in einem Nährmedium, vorzugsweise flüssigen Nährmedium, verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Arenavirusmutante“ oder „Mutante eines Arenavirus“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Arenavirus verstanden werden, dessen Genom und/oder Proteom gegenüber dem Genom und/oder Proteom seines Wildtyps wenigstens eine Mutation, insbesondere wenigstens eine Punktmutation, aufweist. Bevorzugt soll unter dem Ausdruck „Arenavirusmutante“ oder „Mutante eines Arenavirus“ ein Arenavirus mit einem Protein, insbesondere einem Glykoprotein oder einer Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins und/oder einem L-Protein, verstanden werden, welches gegenüber einem entsprechenden Protein, insbesondere einem entsprechenden Glykoprotein oder einer entsprechenden Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins und/oder einem entsprechenden L-Protein, eines entsprechenden wildtypischen Arenavirus, d.h. Wildytp-Arenavirus, wenigstens eine Mutation, vorzugsweise in Form einer Aminosäuresubstitution, aufweist.
Entsprechend soll unter dem Ausdruck „Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante“ ein Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus verstanden werden, dessen Genom und/oder Proteom gegenüber dem Genom und/oder Proteom des wildtypischen Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus wenigstens eine Mutation, insbesondere wenigstens eine Punktmutation, aufweist. Bevorzugt soll unter dem Ausdruck „Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante“ ein Arenavirus mit einem Protein, insbesondere einem Glykoprotein oder einer Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins und/oder einem L-Protein, verstanden werden, welches gegenüber einem entsprechenden Protein, insbesondere einem entsprechenden Glykoprotein oder einer entsprechenden Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins und/oder einem entsprechenden L-Protein, des Wildtyp-Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus wenigstens eine Mutation, vorzugsweise in Form einer Aminosäuresubstitution, aufweist.
Unter dem Ausdruck „Glykoprotein“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Makromolekül verstanden werden, welches aus einem Protein, welches in diesem Zusammenhang auch als Proteinbestandteil oder Proteinkomponente bezeichnet werden kann, und einer oder mehreren kovalent gebundenen Kohlenhydratgruppen (Zuckergruppen), insbesondere Mono- und/oder Oligo- und/oder Polysaccharidgruppen, besteht.
Unter dem Ausdruck „wiederholte Passage“ bzw. „wiederholtes Passagieren“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung, soweit nicht anders angegeben, ein ein- oder mehrfacher Vorgang, bei dem primäre Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 mit aus primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 produziertem Arenavirus behandelt werden, verstanden werden. Hierfür muss in der Regel ein für die primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975 C643 oder Tramp-C2 verwendetes Nährmedium, wie beispielsweise DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) mit 10% Fetalem Kälberserum (FKS) und 1% Penicillin/Streptomycin/Glutamin (entspricht 1 Unit/ml Penicillin, 100 microg/ml Streptomycin und 2mM L-Glutamin) verwendet werden. Nicht infizierte primäre Tumorzellen oder nicht infizierte Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 werden vorzugsweise 0 bis 7 Tage, insbesondere 1 bis 7 Tage, vor dem Inokulationsschritt (Schritt b)) ausplattiert. Vorzugsweise wird ein zum Ausplattieren der Zellen verwendetes Nährmedium vor dem Inokulationsschritt durch ein frisches Nährmedium ausgetauscht. In einigen Fällen kann das Nährmedium nach 1, 10 oder 100 Minuten nach dem Inokulationsschritt (Schritt b)) entfernt und durch ein frisches, d.h. neues, Nährmedium ersetzt werden. Nach einer Inkubation von 24, 48, 72 oder 96 Stunden wird ein Zellkulturüberstand, welcher eine Anreicherung von mutierten Arenaviren enthält, entnommen. Ein Teil dieses Überstandes wird neuen, nicht infizierten primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinien H 1975, C643 oder Tramp-C2 zugefügt.
Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass sich durch Passagieren von mit einem Arenavirus infizierten primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 ein Arenavirus mit antitumoralen Eigenschaften, insbesondere ein Arenavirus mit gegenüber dem eingesetzten Arenavirus verbesserten antitumoralen Eigenschaften, herstellen lässt. Die Herstellung eines solchen Arenavirus beruht darauf, dass sich das Ausgangsarenavirus, in der Regel ein Wildtyp-Arenavirus, erschwert in den primären Tumorzellen oder den Zellen der Zelllinie H1975 vermehren kann. Eine ebenso limitierte Vermehrung wurde in den Zelllinien C643 und Tramp-C2 festgestellt. Die limitierte Vermehrung löst bei dem Arenavirus bei Infektion und Replikation in den primären Tumorzellen oder in den Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 einen erhöhten Selektionsdruck oder erhöhten Adaptionszwang aus. Zufällig entstandene Virusmutanten, die sich besser in den primären Tumorzellen oder den Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 vermehren können, überwachsen somit das Ausgangsarenavirus, in der Regel das Wildtyp-Arenavirus. Durch ein Passagieren, insbesondere wiederholtes Passagieren (mehrfaches Wiederholen der Schrittabfolge a) bis d)), kommt es mit besonderem Vorteil zu einer Anreicherung eines Arenavirus, welcher in Bezug auf die eingesetzten primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 antitumoral wirkt oder im Vergleich zu dem eingesetzten Ausgangsarenavirus verbesserte antitumorale Eigenschaften besitzt. Die antitumorale Wirkung der Arenavirusmutante beruht darauf, dass diese die Zellen besser infizieren und sich in den Zellen besser replizierten kann. Auf diese Weise kann sich die Arenavirusmutante im Vergleich zum Ausgangsarenavirus in den eingesetzten Zellen besser ausbreiten und insbesondere eine verstärkte Immunaktivierung bewirken. Da viele Tumorzellen obendrein keine antiviralen Faktoren aufweisen und mithin eine limitierte virale Resistenz zeigen, kann das erfindungsgemäße Verfahren mit besonderem Vorteil nicht nur zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus, sondern zusätzlich auch zur Herstellung eines tumorspezifischen Arenavirus, d.h. zur Herstellung eines antitumoralen und tumorspezifischen Arenavirus, verwendet werden.
Die primären Tumorzellen sowie die Zellen der Zelllinie H1975, C643 und Tramp-C2 konnten von den Erfindern dabei überraschenderweise als Zellen identifiziert werden, welche lediglich eine verminderte Replikation von Arenaviren zulassen und im Zuge des Passagierens einen besonders hohen Selektionsdruck bzw. Adaptionszwang bei Arenaviren auslösen.
In Ausgestaltung der Erfindung werden die primären Tumorzellen vor Durchführen von Schritt a) höchstens 1000-mal, insbesondere höchstens 100-mal, bevorzugt höchstens 10-mal, passagiert. Unter dem Ausdruck „Passagieren“ soll in diesem Zusammenhang das Verdünnen der Zellen in einer Zellkultur, also eine Aufnahme der Zellen in eine Suspension und Ausplattieren eines Teiles der Zellen (z.B.: 50%, 10% oder 1%) in einem neuen Nährmedium, verstanden werden. Je weniger die primären Tumorzellen vor Durchführen von Schritt a) passagiert werden, desto mehr entsprechen die Zellen hinsichtlich ihrer Eigenschaften den Eigenschaften der Tumorzellen eines Patienten. Insbesondere große Unterschiede (Heterogenität) zwischen einzelnen primären Tumorzellen in Morphologie, RNA-Expressionsmuster, Proteinexpression und DNA-Sequenz bilden Tumorzellen in vivo ab. Dadurch kann in vorteilhafter Weise ein Arenavirus hergestellt werden, welcher für eine therapeutische Behandlung jeweiliger Tumorpatienten, insbesondere Patientengruppen davon, besonders geeignet ist.
Insbesondere können die primären Tumorzellen vor Durchführen von Schritt a) keiner Passage unterworfen werden. Anders ausgedrückt, können zum Durchführen von Schritt a) unpassagierte, d.h. nicht passagierte, primäre Tumorzellen verwendet werden. Dadurch wird das Ausgangsarenavirus bzw. das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus gezwungen, sich in Zellen zu adaptieren, welche die Tumorzellen eines Patienten besonders gut abbilden. Auf diese Weise können für eine therapeutische Behandlung jeweiliger Tumorpatienten, insbesondere Patientengruppen davon, besonders taugliche Arenaviren hergestellt werden.
Die bereits häufig passagierten Zellen der Zelllinien H1975, C643 sowie Tramp-C2 wurden von den Erfindern als ebenso geeignete Zellen identifiziert, obwohl sie bereits seit Jahren in vitro passagiert wurden.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird der Schritt c) während eines Zeitraumes von 1 Stunde bis 1000 Stunden, insbesondere 3 Stunden bis 300 Stunden, vorzugsweise 12 Stunden bis 96 Stunden, durchgeführt. Die in diesem Absatz offenbarten Zeiträume haben sich als besonders vorteilhaft für ein effizientes Inkubieren und mithin Infizieren der inokulierten primären Tumorzellen oder der inokulierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 mit dem Ausgangsarenavirus bzw. dem im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltenen Arenavirus herausgestellt.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird der Schritt b) und/oder der Schritt c) bei einer Temperatur von 4 °C bis 50 °C, insbesondere 20 °C bis 42 °C, bevorzugt 34 °C bis 39 °C, durchgeführt. Die in diesem Absatz offenbarten Temperaturbereiche haben sich als besonders vorteilhaft für ein effizientes Inokulieren und/oder Inkubieren (und mithin Infizieren) der primären Tumorzellen oder der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 mit dem Ausgangsarenavirus bzw. dem im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltenen Arenavirus herausgestellt.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird der Schritt a) und/oder der Schritt b) und/oder der Schritt c) und/oder der Schritt d) in einem Nährmedium durchgeführt, welches vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institut), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) und IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium). Das Nährmedium kann zusätzlich Serum (0,1 - 20 %), wie beispielsweise fetales Kälberserum und/oder humanes Serum, und/oder Aminosäuren, wie beispielsweise Glutamat und/oder Glutamin, und/oder Antibiotika enthalten. Durch ein Nährmedium ist eine Kultivierung der primären Tumorzellen oder der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 möglich.
Insbesondere begünstigt ein Nährmedium mit besonderem Vorteil ein Wachstum und/oder eine Zellteilung der primären Tumorzellen oder der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2. Die in diesem Absatz erwähnten Nährmedien eignen sich dabei in besonderer Weise für eine Kultivierung der primären Tumorzellen oder der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird der Schritt a) und/oder der Schritt b) und/oder der Schritt c) unter einer Kohlendioxidatmosphäre (CO₂-Atmosphäre) von 0% bis 20%, insbesondere 0,1 % bis 20 %, bevorzugt 2% bis 10%, weiter bevorzugt 4% bis 6%, durchgeführt. Dadurch kann insbesondere der pH-Wert eines für den Schritt a) und/oder den Schritt b) und/oder den Schritt c) verwendeten Nährmediums konstant gehalten werden. Hierdurch ist ein effizientes Ausplattieren und/oder Inokulieren und/oder Inkubieren (und mithin Infizieren) der primären Tumorzellen oder der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 mit dem Ausgangsarenavirus bzw. dem im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltenen Arenavirus erzielbar.
Vorzugsweise wird der Schritt a) und/oder der Schritt b) und/oder der Schritt c) in einem Inkubator, d.h. in einem Brutschrank oder Temperiergerät, durchgeführt, mittels dessen kontrollierte Außenbedingungen für ein Wachstum und/oder eine Zellteilung der primären Tumorzellen oder der Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 geschaffen werden können.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird die Schrittabfolge a) bis d) 3-mal bis 1000-mal, insbesondere 10-mal bis 100-mal, vorzugsweise 20-mal bis 50-mal, wiederholt. Eine mehrfache Wiederholung der Schrittabfolge a) bis d), insbesondere wie in diesem Absatz offenbart, hat sich als besonders vorteilhaft im Hinblick auf die Entstehung von unter antitumoralen Gesichtspunkten vorteilhaften Mutationen, insbesondere Punktmutationen, und mithin auf die Herstellung eines antitumoralen Arenavirus herausgestellt.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird das Nährmedium vor Durchführen von Schritt b) durch ein frisches oder neues Nährmedium ersetzt. Durch diesen Schritt können mit besonderem Vorteil die Bedingungen der Infektion standardisiert werden.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird das Nährmedium innerhalb eines Zeitraumes von 0,1 Minuten bis 600 Minuten, insbesondere 1 Minute bis 30 Minuten, bevorzugt 5 Minuten bis 15 Minuten nach Durchführen von Schritt b) durch ein frisches oder neues Nährmedium ersetzt.
Dieser Schritt erhöht in vorteilhafter Weise den Selektionsdruck der Infektion, da die Zeit der Infektion limitiert wird.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird ein mehrfacher Nährmediumwechsel vorgenommen. Beispielsweise kann das Nährmedium vor Durchführen von Schritt b) durch ein frisches oder neues Nährmedium ersetzt und Letzteres innerhalb eines Zeitraumes von 0,1 Minuten bis 600 Minuten, insbesondere 1 Minute bis 30 Minuten, bevorzugt 5 Minuten bis 15 Minuten nach Durchführen von Schritt b) durch ein weiteres frisches oder neues Nährmedium ersetzt werden.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung werden die primären Tumorzellen oder die Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 und/oder das Ausgangsarenavirus und/oder das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus vor Durchführen von Schritt d), insbesondere vor Durchführen von Schritt c), insbesondere vor Durchführen von Schritt b), insbesondere vor Durchführen von Schritt a), mit wenigstens einem Chemotherapeutikum behandelt. Dadurch können Tumorzellen simuliert werden, welche bereits chemotherapeutisch behandelt wurden. Dies erlaubt mit besonderem Vorteil die Herstellung eines Arenavirus, welcher insbesondere für eine Behandlung von Tumorpatienten tauglich ist, welche bereits mittels einer Chemotherapie behandelt wurden und/oder als austherapiert gelten.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird das Ausgangsarenavirus und/oder das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus vor Durchführen von Schritt b) mit wenigstens einem Chemotherapeutikum behandelt. Dadurch kann mit besonderem Vorteil die natürliche Mutationsrate im Arenavirus erhöht und somit dessen Adaption an die primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 beschleunigt werden.
Das wenigstens eine Chemotherapeutikum kann insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Alkylantien, Topoisomerase-Hemmstoffe, Mitose-Hemmstoffe, Antimetabolite, Antibiotika, Kinase-Hemmer, Thalidomid-Abkömmlinge, Zellapoptose-Induktoren, biologische Therapeutika wie biologische Zytostatika, isotopenhaltige Verbindungen, Hormone, Hormon-Antagonisten, Histon-Deacetylase-Hemmer und sonstige Zytostatika.
Die Alkylantien können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Oxazaphosphorine, N-Lost-Derivate, Alkylsulfonate, Hydrazine, platinhaltige Substanzen, Anthrazykline und Mischungen aus wenigstens zwei der vorgenannten Alkylantien.
Die Oxazaphosphorine können beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus Cyclophosphamid, Ifosfamid und Mischungen davon ausgewählt sein.
Die N-Lost-Derivate können beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus Chlorambucil, Melphalan und Mischungen davon ausgewählt sein.
Bei den Alkylsulfonaten kann es sich beispielsweise um Husulfan handeln.
Die Hydrazine können beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus Temozolomid, Dacarbazin, Procarbazin und Mischungen aus wenigstens zwei der vorgenannten Hydrazine ausgewählt sein.
Die platinhaltigen Substanzen können beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin und Mischungen aus wenigstens zwei der vorgenannten platinhaltigen Substanzen ausgewählt sein.
Die Anthrazykline können beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus Doxorubicin, Daunorubicin, Idarubicin, Elirubicin und Mischungen aus wenigstens zwei der vorgenannten Anthrazykline ausgewählt sein.
Die oben erwähnten Topoisomerase-Hemmer können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Topoisomerase-I-Hemmer, Topoisomerase-II-Hemmer (Etoposid) und Mischungen davon.
Die Topoisomerase-I-Hemmer können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Irinotecan, Topotecan und Mischungen davon.
Bei den Topoisomerase-II-Hemmern kann es sich beispielsweise um Etoposid handeln.
Die oben erwähnten Mitose-Hemmstoffe oder Antimetabolite können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Vinca-Alkaloide, Taxane, Folsäure-Antagonisten, Pyrimidin-Antagonisten, Purin-Antagonisten, Ribonukleotidreduktase-Hemmer und Mischungen aus wenigsten zwei der vorgenannten Mitose-Hemmstoffe oder Antimetabolite.
Die Vinca-Alkaloide können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Vincristin, Vinblastin und Mischungen davon.
Die Taxane können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Docetaxel, Paclitaxel und Mischungen davon.
Die Folsäure-Antagonisten können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Methotrexat, Pemetrexed und Mischungen davon.
Die Pyrimidin-Antagonisten können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Cytarabin, 5-Fluoruracil, Gemcitabin, Capecitabin und Mischungen von wenigstens zwei der vorgenannten Pyrimidin-Antagonisten.
Die Purin-Antagonisten können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus 5-Azacytidin, Azathioprin, 6-Mercaptopurin, Fludarabin und Mischungen von wenigstens zwei der vorgenannten Purin-Antagonisten.
Bei dem Ribonukleotidreduktase-Hemmer kann es sich beispielsweise um Hydroxyurea handeln.
Die oben erwähnten Antibiotika können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Bleomycin, Actinomycin D, Mitomycin und Mischungen von wenigstens zwei der vorgenannten Antibiotika.
Die oben erwähnten Kinase-Hemmer können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Afatinib, Alectinib, Axitinib, Crizotinib, Cobimetinib, Dasatinib, Dabrafenib, Erlotinib, Gefitinib, Imatinib, Ixazomib, Lenvatinib, Nilotinib, Osimertinib, Palbociclib, Pazopanib, Ponatinib, Regorafenib, Sunitinib, Vemurafenib, Trametinib, Everolimus und Mischungen aus wenigstens zwei der vorgenannten Kinase-Hemmer.
Die oben erwähnten Thalidomid-Abkömmlinge können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Lenalidomid, Pomalidomid und Mischungen davon.
Die oben erwähnten Zellapoptose-Induktoren können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Methoxsalen, Venetoclax und Mischungen davon.
Die oben erwähnten biologischen Therapeutika können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Rituximab, Trastuzumab, Cetuximab, Panitumumab, Ipilimumab, Pembrolizumab, Nivolumab, Atezolizumab, Avelumab, Nivolumab, Olaratumab, Ramucirumab und Mischungen aus wenigstens zwei der vorgenannten biologischen Therapeutika.
Die oben erwähnten Hormone und/oder Hormon-Antagonisten können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Buserelin, Goserelin, Leuprorelin, Triptorelin, Estramustin, Tamoxifen, Aromatasehemmer wie Anastrozol, Antiandrogene wie Enzalutamid, Flutamid, Bicalutamid, Gestagene wie Megestrolacetat und Medroxyprogesteronacetat, Glukokortikoide und Mischungen aus wenigstens zwei der vorgenannten Hormone und/oder Hormon-Antagonisten.
Die oben erwähnten sonstigen Zytostatika können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Bexaroten, Afatinib, Crizotinib Erlotinib, Gefitinib, Lapatinib , Dasatinib, Imatinib, Nilotinib, P onatinib, Regorafenib, Sonidegib, Hydroxycarbamid, Trametinib, Tretinoin, Isotretinoin, Alitretinoin, MAOP (5-Amino-4-oxopentansäuremethylester) und Mischungen von wenigstens zwei der vorgenannten sonstigen Zytostatika.
Weiterhin können die primären Tumorzellen oder die Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 und/oder das Ausgangsarenavirus und/oder das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus vor Durchführen von Schritt d), insbesondere vor Durchführen von Schritt c), insbesondere vor Durchführen von Schritt b), insbesondere vor Durchführen von Schritt a), mit Strahlen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ultraviolette (UV)-Strahlen, insbesondere UVA-Strahlen und/oder UVB-Strahlen, Alpha-Strahlen, Beta-Strahlen, Gamma-Strahlen und Röntgenstrahlen, behandelt werden. Dadurch können mit besonderem Vorteil Tumorzellen simuliert werden, welche bereits therapeutischen Strahlen unterworfen wurden. Dies erlaubt mit besonderem Vorteil die Herstellung eines Arenavirus, welcher insbesondere für eine Behandlung von Tumorpatienten verwendet werden kann, welche bereits mittels einer Strahlentherapie behandelt wurden.
Weiterhin kann das Ausgangsarenavirus und/oder das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus vor Durchführen von Schritt b) mit Strahlen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ultraviolette (UV)-Strahlen, insbesondere UVA-Strahlen und/oder UVB-Strahlen, Alpha-Strahlen, Beta-Strahlen, Gamma-Strahlen und Röntgenstrahlen, behandelt werden. Dadurch kann mit besonderem Vorteil die natürliche Mutationsrate im Arenavirus erhöht und somit dessen Adaption an die primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 erhöht werden.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung werden primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 verwendet, welche gegenüber wenigstens einem Chemotherapeutikum resistent sind. Beispielsweise können primäre Tumorzellen verwendet werden, welche gegenüber Paclitaxel und/oder Trametinib resistent sind. Dadurch können mit besonderem Vorteil Tumorzellen eines Patienten simuliert werden, bei welchem im Rahmen einer Tumorbehandlung Resistenzen gegenüber wenigstens einem Chemotherapeutikum auftraten. Die in diesem Absatz beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung stellen somit weitere Möglichkeiten zur Herstellung eines leistungsstarken antitumoralen Arenavirus dar.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung werden die primären Tumorzellen oder die Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 und/oder das Ausgangsarenavirus und/oder das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus vor Durchführen von Schritt d), insbesondere vor Durchführen von Schritt c), insbesondere vor Durchführen von Schritt b), insbesondere vor Durchführen von Schritt a), mit wenigstens einer antiviralen Verbindung, insbesondere mit alpha-Interferon und/oder gamma-Interferon, behandelt. Dadurch kann das eingesetzte Ausgangsarenavirus bzw. das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus mit besonderem Vorteil dazu gezwungen werden, sich in einem antiviralen Umfeld zu adaptieren, wodurch ein antitumoraler und gleichzeitig eine Resistenz aufweisender Arenavirus hergestellt werden kann. Ein solcher Arenavirus ist unter therapeutischen Gesichtspunkten besonders wirksam, da sich mit seiner Hilfe auch Tumorgewebe bekämpfen lässt, welches unter Umständen eine virale Resistenz aufweist.
Ferner kann das Verfahren einen weiteren Schritt e) Isolieren und/oder Identifizieren eines antitumoralen Arenavirus, insbesondere eines Arenavirus, welcher gegenüber dem Ausgangsarenavirus verbesserte antitumorale Eigenschaften aufweist, aus dem entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon mittels Klonierung und/oder PCR (polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion) und/oder Sequenzierung, aufweisen.
Als primäre Tumorzellen werden vorzugsweise primäre maligne Tumorzellen, insbesondere primäre Karzinomzellen, primäre Melanomzellen, primäre Blastomzellen, primäre Lymphomzellen oder primäre Sarkomzellen, verwendet.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung werden als primären Tumorzellen primäre Aderhautmelanomzellen, primäre Analkarzinomzellen, primäre Angiosarkomzellen, primäre Astrozytomzellen, primäre Basalzellkarzinomzellen, primäre Cervixkarzinomzellen, primäre Chondrosarkomzellen, primäre Chorionkarzinomzellen, primäre dermale Plattenepithelkarzinomzellen, primäre Dünndarmkarzinomzellen, primäre Endometriumkarzinomzellen, primäre Ewing-Sarkomzellen, primäre Fibrosarkomzellen, primäre Gallenblasenkarzinomzellen, primäre Gallengangskarzinomzellen, primäre Glioblastomzellen, primäre Harnblasenkarzinomzellen, primäre Harnleiterkarzinomzellen, primäre Harnröhrenkarzinomzellen, primäre hepatozelluläre Karzinomzellen, primäre Hodentumorzellen, primäre Hypopharynxkarzinomzellen, primäre Hypophysenkarzinomzellen, primäre Kaposi-Sarkomzellen, primäre kleinzellige Bronchialkarzinomzellen, primäre Kolonkarzinomzellen, primäre kolorektale Karzinomzellen, primäre Larynxkarzinomzellen, primäre Leiomyosarkomzellen, primäre Liposarkomzellen, primäre Magenkarzinomzellen, primäre Maligne Fibröse Histiozytomzellen, primäre Mammakarzinomzellen, primäre Medulloblastomzellen, primäre Melanomzellen, primäre Mundbodenkarzinomzellen, primäre Nasennebenhöhlenkarzinomzellen, primäre Nasopharynxkarzinomzellen, primäre Nebennierenrindenkarzinomzellen, primäre Nebenschilddrüsenkarzinomzellen, primäre neurogene Sarkomzellen, primäre nicht-kleinzellige Bronchialkarzinomzellen, primäre Nierenzellkarzinomzellen, primäre Oropharynxkarzinomzellen, primäre Osteosarkomzellen, primäre Ovarialkarzinomzellen, primäre Pankreastumorzellen, primäre Peniskarzinomzellen, primäre Phäochromozytomzellen, primäre Pleuramesotheliomzellen, primäre Prostatakarzinomzellen, primäre rektale Karzinomzellen, primäre Retinoblastomzellen, primäre Rhabdomyosarkomzellen,primäre Schilddrüsenkarzinomzellen, primäre Speicheldrüsenkarzinomzellen, primäre Speiseröhrenkarzinomzellen, primäre Tonsillenkarzinomzellen, primäre Vaginalkarzinomzellen, primäre Vulvakarzinomzellen, primäre Wilms-Tumorzellen, primäre Zellen neuroendokriner Tumore oder primäre Zungenkarzinomzellen verwendet.
Besonders bevorzugt werden als primäre Tumorzellen primäre Melanomzellen, primäre Lungenkarzinomzellen, primäre Pankreaskarzinomzellen, primäre Kolonkarzinomzellen, primäre Magenkarzinomzellen, primäre Pharynxkarzinomzellen, primäre Larynxkarzinomzellen, primäre Nierenzellkarzinomzellen, primäre Ovarialkarzinomzellen, primäre Endometriumkarzinomzellen, primäre Schilddrüsenkarzinomzellen, primäre Prostatakarzinomzellen, primäre Leberkarzinomzellen oder primäre Sarkomzellen, wie beispielsweise primäre neurogene Sarkomzellen, primäre Osteosarkomzellen oder primäre Rhabdomyosarkomzellen verwendet.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird als Ausgangsarenavirus ein Wildtyp-Arenavirus, d.h. ein sogenanntes wildtypisches Arenavirus, verwendet.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird als Ausgangsarenavirus ein Altweltarenavirus verwendet. Das Altweltarenavirus ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Catarina Virus, Danfenong Virus, Ippy-Virus (IP-PYV), Kodoko Virus, Lassa-Virus (LASV), Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus (LCMV), Morogoro Virus, Mobala-Virus (MOBV), Gairo-Virus und Mopeia-Virus (MOPV), Pinhal Virus, Skinner Tank Virus.
Bevorzugt wird als Ausgangsarenavirus das Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus, insbesondere ein Wildtyp des Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus, verwendet. Beispielsweise kann als Ausgangsarenavirus ein Stamm des Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus WE, Armstrong, Klon 13 (Clone 13) und Docile, verwendet werden.
Besonders bevorzugt wird ein Wildtyp des Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus, d.h. ein Wildtyp-Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus verwendet, welches ein L-Protein, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 7, und/oder eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, bevorzugt L- Ribonukleinsäure, aufweisend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, insbesondere Ribonukleinsäuresequenz, bevorzugt L- Ribonukleinsäuresequenz, welche zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 8 komplementär ist, aufweist.
Weiterhin kann als Ausgangsarenavirus ein Neuweltarenavirus verwendet werden. Das Neuweltarenavirus ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Allpahuayo-Virus (ALLV), Amapari-Virus (AMAV), Bear-Canyon-Virus (BCNV), Chapare-Virus, Cupixi-Virus (CPXV), Flexal-Virus (FLEV), Guanarito-Virus (GTOV), Junin-Virus (JUNV), Candid #1 (Candid No.1), Latino-Virus (LATV), Machupo-Virus (MACV), Oliveros-Virus (OLVV), Parana-Virus (PARV), Pichinide-Virus (PICV), Pirital-Virus (PIRV), Sabia-Virus (SABV), Tacaribe-Virus (TCRV), Tamiami-Virus (TAMV) und Whitewater-Arroyo-Virus (WWAV).
Weiterhin kann als Ausgangsarenavirus ein Arenavirus ohne antitumorale Eigenschaften verwendet werden.
Alternativ kann als Ausgangsarenavirus ein Arenavirus mit antitumoralen Eigenschaften verwendet werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante, d.h. eine Mutante des Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus.
Die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante weist ein Protein oder Peptid, insbesondere ein Glykoprotein oder eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins oder ein L-Protein, auf. Das Protein oder Peptid, insbesondere das Glykoprotein oder die Proteinkomponente (Proteinbestandteil) des Glykoproteins oder das L-Protein, weist wenigstens eine Mutation, insbesondere eine Punktmutation, auf. Die Mutation, insbesondere Punktmutation, ist vorzugsweise gegenüber den Sequenzen/der Sequenz AJ297484 und/oder AJ233196 und/oder der Referenzsequenz LCMV (Stamm WE-Essen) unterschiedlich.
Bevorzugt weist die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante ein Glykoprotein oder eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins mit wenigstens einer Mutation auf, wobei es sich bei der wenigstens einen Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Isoleucins an der Position 181 des Glykoproteins oder der Proteinkomponente des Glykoproteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Methionin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Arginins an der Position 185 des Glykoproteins oder der Proteinkomponente des Glykoproteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Tryptophan, handelt.
Alternativ oder in Kombination weist die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante bevorzugt ein L-Protein mit wenigstens einer Mutation auf, wobei es sich bei der wenigstens einen Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Lysins an der Position 1513 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Glutamat, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Phenylalanins an der Position 1995 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Serin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Isoleucins an der Position 2094 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Valin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Threonins an der Position 2141 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Alanin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Arginins an der Position 2175 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Lysin, handelt.
Alternativ oder in Kombination weist die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante bevorzugt ein Protein oder Peptid, insbesondere ein Glykoprotein oder eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins oder ein L-Protein, auf, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 aufweist oder aus einer solchen Aminosäuresequenz besteht. Bei den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 handelt es sich jeweils vorzugsweise um die Aminosäuresequenz eines Glykoproteins oder einer Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante. Bei der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 5 handelt es sich vorzugsweise um die Aminosäuresequenz eines L-Proteins der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante.
Alternativ oder in Kombination weist die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante bevorzugt eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, auf, welche für ein Protein oder Peptid, insbesondere ein Glykoprotein oder eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins oder ein L-Protein, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5, codiert.
Alternativ oder in Kombination weist die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante bevorzugt eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, auf, welche eine Nukleinsäuresequenz, insbesondere Ribonukleinsäuresequenz, aufweist oder aus einer Nukleinsäuresequenz, insbesondere Ribonukleinsäuresequenz, besteht, welche zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 6 komplementär ist.
Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass eine Mutante/Mutanten des Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus - wie in den vorherigen Absätzen beschrieben - eine verbesserte Replikationskompetenz in primären Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975 sowie, insbesondere gegenüber dem Wildtyp des Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus, antitumorale oder verbesserte antitumorale, Eigenschaften aufweist/aufweisen.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn das Codon für Isoleucin an der Position 181 des Glykoproteins durch ein anderes Codon, bevorzugt durch ein Codon für Methionin, ersetzt ist.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn das Codon für Arginin an der Position 185 des Glykoproteins durch ein anderes Codon, bevorzugt durch ein Codon für Tryptophan, ersetzt ist.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn das Codon für Histidin an der Position 155 des Glykoproteins durch ein anderes Codon, bevorzugt durch ein Codon für Tyrosin, ersetzt ist.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn das Codon für Arginin an der Position 358 des Glykoproteins durch ein anderes Codon, bevorzugt durch ein Codon für Lysin, ersetzt ist.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, mit einer Mutation aufweist, wobei es sich bei der Mutation um eine Nukleotidsubstitution von Adenin an der Position 4537 der Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, durch Guanin handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, aufweist, welche für ein L-Protein mit einer Mutation codiert, wobei es sich bei der Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Lysins an der Position 1513 des L-Proteins, durch eine andere Aminosäure, bevorzugt durch Glutamat, handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere eine Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, aufweist, welche für ein L-Protein mit einer Mutation codiert, wobei es sich bei der Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Phenylalanin an der Position 1995 des L-Proteins, durch eine andere Aminosäure, bevorzugt durch ein Serin, handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, mit einer Mutation aufweist, wobei es sich bei der Mutation um eine Nukleotidsubstitution von Thymin an der Position 5984 der Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, bevorzugt durch das Nukleotid Cytosin handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, aufweist, welche für ein L-Protein mit einer Mutation codiert, wobei es sich bei der Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Isoleucins an der Position 2094 des L-Proteins, durch eine andere Aminosäure, bevorzugt durch Valin, handelt.
Des Weiteren ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, mit einer Mutation aufweist, wobei es sich bei der Mutation um eine Nukleotidsubstitution von Adenin an der Nukleotidposition 6280 der Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, durch ein anderes Nukleotid, bevorzugt Guanin handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, aufweist, welche für ein L-Protein mit einer Mutation codiert, wobei es sich bei der Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Threonins an der Position 2141 des L-Proteins, durch eine andere Aminosäure, bevorzugt durch Alanin, handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, mit einer Mutation aufweist, wobei es sich bei der Mutation um eine Nukleotidsubstitution von Adenin an der Position 6421 der Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, bevorzugt durch ein anderes Nukleotid, bevorzugt Guanin handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, aufweist, welche für ein L-Protein mit einer Mutation codiert, wobei es sich bei der Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Arginin an der Position 2175 des L-Proteins, bevorzugt durch Lysin, handelt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, mit einer Mutation aufweist, wobei es sich bei der Mutation um eine Nukleotidsubstitution von Guanin an der Position 6524 der Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, vorzugsweise L-Ribonukleinsäure, durch das Nukleotid Adenin handelt.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante um eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante zur Anwendung oder Verwendung in der Medizin.
Bevorzugt handelt es sich bei der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante um eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante zur Anwendung oder Verwendung bei der Behandlung und/oder Vorbeugung eines Tumors.
Der Tumor ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Karzinom, Melanom, Blastom, Lymphom und Sarkom.
Unter dem Ausdruck „Karzinom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie epithelialen Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Sarkom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie mesodermalen Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Melanom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie melanozytären Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Lymphom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie lymphozytären Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Blastom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie embryonalen Ursprungs verstanden werden.
Das Karzinom ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Analkarzinom, Bronchialkarzinom, Lungenkarzinom, Endometriumkarzinom, Gallenblasenkarzinom, Blasenkarzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hodenkarzinom, Kolonkarzinom, kolorektales Karzinom, rektales Karzinom, Larynxkarzinom, Speiseröhrenkarzinom, Magenkarzinom, Mammakarzinom, Nierenkarzinom, Ovarialkarzinom, Pankreaskarzinom, Pharynxkarzinom, Oropharynxkarzinom, Prostatakarzinom, Schilddrüsenkarzinom und Zervixkarzinom.
Das Sarkom kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Angiosarkom, Chondrosarkom, Ewing-Sarkom, Fibrosarkom, Kaposi-Sarkom, Liposarkom, Leiomyosarkom, malignes fibröses Histiozytom, neurogenes Sarkom, Osteosarkom und Rhabdomyosarkom.
Weiter kann die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante für eine lokale, insbesondere intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane, Verabreichung hergerichtet sein oder verwendet werden.
Alternativ kann die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante für eine systemische, insbesondere intravenöse, Verabreichung hergerichtet sein oder verwendet werden.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante wird vollständig auf die bisherige sowie die noch folgende Beschreibung Bezug genommen.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante, welche ein Protein oder Peptid, insbesondere ein Glykoprotein oder eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins oder ein L-Protein, aufweist, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 aufweist oder aus einer solchen Aminosäuresequenz besteht.
Alternativ oder in Kombination weist die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante bevorzugt eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, auf, welche für ein Protein oder Peptid, insbesondere ein Glykoprotein oder eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins oder ein L-Protein, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5, codiert.
Alternativ oder in Kombination weist die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante bevorzugt eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, auf, wobei die Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, eine Nukleinsäuresequenz, insbesondere Ribonukleinsäuresequenz, aufweist oder aus einer Nukleinsäuresequenz, insbesondere Ribonukleinsäuresequenz, besteht, welche zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 6 komplementär ist.
Bevorzugt handelt es sich bei der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante um eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante zur Anwendung oder Verwendung in der Medizin.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante um eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante zur Anwendung oder Verwendung bei der Behandlung und/oder Vorbeugung eines Tumors.
Der Tumor ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Karzinom, Melanom, Blastom, Lymphom und Sarkom.
Unter dem Ausdruck „Karzinom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie epithelialen Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Sarkom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie mesodermalen Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Melanom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie melanozytären Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Lymphom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie lymphozytären Ursprungs verstanden werden.
Unter dem Ausdruck „Blastom“ soll im Sinne der vorliegenden Erfindung eine maligne Neoplasie embryonalen Ursprungs verstanden werden.
Das Karzinom ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Analkarzinom, Bronchialkarzinom, Lungenkarzinom, Endometriumkarzinom, Gallenblasenkarzinom, Blasenkarzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hodenkarzinom, Kolonkarzinom, kolorektales Karzinom, rektales Karzinom, Larynxkarzinom, Speiseröhrenkarzinom, Magenkarzinom, Mammakarzinom, Nierenkarzinom, Ovarialkarzinom, Pankreaskarzinom, Pharynxkarzinom, Oropharynxkarzinom, Prostatakarzinom, Schilddrüsenkarzinom und Zervixkarzinom.
Das Sarkom kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Angiosarkom, Chondrosarkom, Ewing-Sarkom, Fibrosarkom, Kaposi-Sarkom, Liposarkom, Leiomyosarkom, malignes fibröses Histiozytom, neurogenes Sarkom, Osteosarkom und Rhabdomyosarkom.
Weiter kann die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante für eine lokale, insbesondere intramuskuläre, intraperitoneale oder subkutane, Verabreichung hergerichtet sein oder verwendet werden.
Alternativ kann die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante für eine systemische, insbesondere intravenöse, Verabreichung hergerichtet sein oder verwendet werden.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante wird zur Vermeidung von Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des zweiten Erfindungsaspekt gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante, das Protein oder Peptid, insbesondere Glykoprotein, sowie die Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante gemäß drittem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel oder Medikament, welches eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante gemäß zweitem oder drittem Erfindungsaspekt aufweist.
Das Arzneimittel oder Medikament kann ferner einen Checkpoint-Blocker, wie beispielsweise PD-1 (Programmed Cell Death Protein 1) oder anti-PD-1, und/oder einen Apoptose-Modulator, insbesondere Apoptose-Inhibitor, wie beispielsweise SMAC-Mimeticum (LCL-161), aufweisen.
Das Arzneimittel oder Medikament weist vorzugsweise ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger auf. Der Träger kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Wasser, wässrige Salzlösung, wässrige Pufferlösung, Zellkulturmedium und Kombinationen von wenigstens zwei der vorgenannten Träger.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Arzneimittels bzw. Medikaments wird zur Vermeidung von Wiederholungen vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des zweiten und dritten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für das Arzneimittel oder Medikament gemäß viertem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Protein oder isoliertes Peptid, insbesondere ein Glykoprotein oder eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins oder ein L-Protein, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7.
Bei den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 handelt es sich jeweils vorzugsweise um die Aminosäuresequenz eines Glykoproteins oder einer Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins einer Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante. Bei der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 5 handelt es sich vorzugsweise um die Aminosäuresequenz eines L-Proteins einer Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante. Bei der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 7 handelt es sich vorzugsweise um die Aminosäuresequenz eines L-Proteins eines Wildtyp-Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Proteins oder Peptids wird zur Vermeidung von Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des zweiten und dritten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf das Protein oder Peptid, insbesondere Glykoprotein, beschriebenen Vorteile und Merkmale gelten sinngemäß auch für das isolierte Protein oder Peptid gemäß fünftem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, aufweisend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, insbesondere Ribonukleinsäuresequenz, gemäß SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 oder SEQ ID No. 8.
Die Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 4 codieren jeweils vorzugsweise für ein Glykoprotein oder für eine Proteinkomponente (Proteinbestandteil) eines Glykoproteins einer Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante.
Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 6 codiert vorzugsweise für ein L-Protein einer Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante.
Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 8 codiert vorzugsweise für ein L-Protein eines Wildtyp-Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der isolierten Nukleinsäure wird zur Vermeidung von Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des zweiten und dritten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für die isolierte Nukleinsäure gemäß sechstem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Gen-Cluster oder Operon, enthaltend wenigstens eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, gemäß fünftem Erfindungsaspekt.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Gen-Cluster oder Operons wird zur Vermeidung von Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des sechsten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für das isolierte Gen-Cluster oder Operon gemäß siebtem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem achten Aspekt betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor, enthaltend wenigstens einen Nukleinsäure gemäß sechstem Erfindungsaspekt oder ein Gen-Cluster oder Operon gemäß siebtem Erfindungsaspekt.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Expressionsvektors wird zur Vermeidung von Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des sechsten und siebten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die Nukleinsäure sowie das Gen-Cluster oder Operon beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für den Expressionsvektor gemäß achtem Erfindungsaspekt.
Gemäß einem neunten Aspekt betrifft die Erfindung einen Organismus, einen Virus, einen Vektor oder ein Plasmid, welcher/welches ein Protein oder Peptid gemäß fünftem Erfindungsaspekt exprimiert oder enthält und/oder welcher/welches eine Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, gemäß sechstem Erfindungsaspekt enthält.
Bei dem Organismus kann es sich um eine Wirtszelle, einen Pilz oder ein Bakterium handeln.
Bei der Wirtszelle kann es sich beispielsweise um eine eukaryontische oder prokaryontische Zelle handeln. Weiterhin kann es sich bei der Wirtszelle um eine Zelle handeln, welche für die Produktion von Organismen und/oder Vektoren und/oder Plasmiden verwendet werden kann.
Bei dem Bakterium kann es sich beispielsweise um einen Impfvektor oder ein anderes therapeutisches Bakterium handeln.
Bei dem Virus kann es sich beispielsweise um einen Impfvektor oder einen anderen therapeutischen Virus handeln.
Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Wirtszelle wird zur Vermeidung von Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung, insbesondere auf die im Rahmen des fünften und sechsten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen, Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf das Protein oder Peptid, insbesondere Glykoprotein, sowie die Nukleinsäure, insbesondere Ribonukleinsäure, beschriebenen Merkmale und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Wirtszelle gemäß neuntem Erfindungsaspekt.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen in Form von Ausführungsbeispielen, den dazugehörigen Figuren sowie den Ansprüchen. Die nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen dienen lediglich der weiteren Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen.
BEISPIELTEIL
Methoden und Materialien
Mäuse
Für in vivo anti-tumorale Analysen wurden WT Tiere (auf C57BL/6 Hintergrund) oder NOD.SCID Mäuse, die kein adaptives Immunsystem haben, verwendet. OT-1 Mäuse tragen einen Ovalbumin-spezifischen MHC-I restringierten T Zellrezeptor als transgen.
Zelllinien
MC57 (CVCL_4985) ist eine murine Fibroblastenzelllinie, in der sich das Arenavirus LCMV gut vermehren kann. C643 (CVCL_5969) ist eine humane anaplastische Schilddrüsenkarzinomzelllinie. H1975 ist eine humane Lungenkarzinomzelllinie (CVCL_1511, ATCC, CRL-5908, Adenokarzinom). TrampC2 ist eine murine Adenokarzinomzelllinie (CVCL_3615). MOPC ist eine murine Oropharynxzelllinie. CMT167 (CVCL_2405) ist eine murine Lungenkarzinomzelllinie. B16F10-OVA ist eine murine Melanomzelllinie (CVCL_0159), die Ovalbumin als Modellantigen exprimiert. UKE-Mel-13a sind primäre Tumorzellen, isoliert aus einer Metastase eines humanen Melanoms und sind weniger als 100x passagiert. 511950 sind primäre Tumorzellen isoliert aus einem transgenen murinen Pankreaskarzinom (Mazur PK et al Nat Med. 2015 Oct;21(10):1163-71.) und sind weniger als 20x passagiert. 511950R entstammen aus 511950 Zellen und sind unter Behandlung des MEK Inhibitors Trametinib weniger als 100x passagiert wurden.
Viren
Der LCMV-Stamm WE wurde aus dem Labor von Prof. Zinkernagel (Experimentelle Immunologie, Zürich, Schweiz) erhalten und wurde in L929-Zellen oder BHK Zellen seit 2008 weiter vermehrt. Die Klone LCMV-P42, LCMV-P52 und LCMV-P91 wurden nach unterschiedlichen Passagen isoliert und sequenziert.
Reagenzien
LCL161 (Selleckchem) und anti-PD1 (BioXcell) wurden in Kombination mit LCMV bzw. LCMV-P52 auf seine anti-tumorale Wirkung getestet.
Bestimmung von LCMV infizierten Zellen mittels Immunfluoreszenz
Um LCMV in Zellen nachweisen zu können wurde Immunfluoreszenz verwendet. Zellen wurden in 24-Lochplatten, die je ein Deckgläschen enthielten, ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit LCMV infiziert und 24 Stunden später mit einem Fluorochrom-markierten anti-LCMV-NP Antikörper (Klon VL4) gefärbt, mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und mit einer integrierten CCD-Kamera fotografiert.
Bestimmung von LCMV im Überstand mittels Plaque-Assay
Um die LCMV Produktion von Zellen zu bestimmen wurden Zellen in 24-Lochplatten ausgesät und nach 24 Stunden mit LCMV infiziert. Nach 24 Stunden wurde der Überstand entnommen. Der Überstand wurde in 24 Loch-Platten titriert und anschließend wurden MC57 Zellen (150.000 Zellen/Loch) hinzugefügt. Nach 4 Stunden wurde Methylzellulose hinzugefügt. Nach weiteren 48 Stunden wurde der Zellrasen für LCMV-Plaques mittels anti-LCMV-NP Antikörper (Klon KL53) analysiert. Die Plaques wurden gezählt und somit die Anzahl der infektiösen Partikel/ml im Überstand bestimmt.
Passagieren von Viren
Um Viren an Tumoren anzupassen wurden unterschiedliche primäre Tumorzellen bzw. Tumorzelllinien mit LCMV-WE infiziert. Dazu wurden Zellen in 24 Lochplatten ausplattiert (ca. 100.000 Zellen/Loch in 1mL Medium). Nach 24 Stunden wurden Viren mit einer Multiplicity of Infection (MOI) = 1 in 100 µL dazugegeben. Je nach Setup wurde das initale Inokulum zwischen 1 - 30 Minuten entfernt und neues Medium hinzugefügt. Nach 24 bzw. 48 oder 72 Stunden wurde der Zellkulturüberstand entnommen und für weitere Analysen eingefroren. Mit 100 microL des entnommenen Überstandes wurden neu ausplattierte Zellen infiziert. Dieser Vorgang wurde zwischen 30 bis 100-mal wiederholt.
Sequenzieren
Nach reverser Transkription der viralen RNA wurde die cDNA mit Sequenz spezifischen Primer-Paaren (Oligonukleotide) in der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden gereinigt, anschließend mittels Cycle-Sequencing (modifizierte Sangermethode) sequenziert, die Produkte in der Kapillarelektrophorese getrennt und die Sequenz als Elektropherogramm aufgezeichnet. Die Nukleinsäuresequenz wurde translatiert um die Proteinsequenz zu erhalten.
Angeborene Immunaktivierung
Die Fähigkeit von LCMV, das angeborene Immunsystem zu aktivieren wurde über den Biomarker IFN-alpha mittels murinem IFN-alpha ELISA (ThermoFisher) bestimmt.
Adaptive Immunaktivierung
Die Fähigkeit von LCMV, das adaptive Immunsystem zu aktivieren, wurde mittels Tetramer Färbung (NIH, Tetramer Facility) aktivierter Lymphozyten getestet.
Tumorwachstum und Behandlungen
Zur Messung der anti-tumoralen Wirkung wurden C57BL/6 oder NOD.SCID Mäuse (6-12 Wochen alt) 5 × 10⁵ Tumorzellen (in 100 µL) subkutan in die rechte oder linke Flanke injiziert. Nachdem sich sichtbar ein Tumor gebildet hat, wurden die Tiere behandelt und der mittlere Tumordurchmesser bzw. das Tumorvolumen wurde ermittelt. Für ein Metastasen Modell wurden B16F10-OVA Zellen intravenös appliziert.
Isolieren und Transfer von Ovalbumin (Tumor)-spezifischen CD8⁺ T Zellen
Zur Analyse von Tumor-spezifischen CD8⁺ T Zellen wurden Zellen aus der Milz von OT-1 Mäusen in C57BL/6 Mäuse transferriert. die Ovalbumin-exprimierende Tumor (B16F10-OVA) Zellen trugen. Milzen wurden dazu mechanisch zerdrückt. Nach Filtration wurden 10⁷ Milzzellen pro Maus intravenös injiziert.
Messung Tumor-spezifischer CD8⁺ T Zellen
Zur Analyse der Anzahl von Tumor-spezifischen CD8⁺ T Zellen wurden Zellen aus dem Blut mit fluoreszierenden Ovalbumin-Tetrameren (Vier gekoppelte H-2 Kb MHC-I Moleküle, die das Peptid SIINFEKL tragen, NIH Tetramer Facility) und Fluorochrom gekoppelten anti-CD8 Antikörpern (eBioscience) inkubiert und nach dem Waschen im Durchflusszytometer analysiert. Zur Analyse der T Zellfunktion wurden Milzzellen mechanisch zerdrückt und nach Filtration mit Brefeldin A sowie mit oder ohne SIINFEKL Peptid inkubiert. Nach sechs Stunden wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit fluoreszierenden Antikörpern spezifisch für CD8 (anti-CD8, eBioscience) und intrazelluläres Interferon-gamma (anti-Interferon-gamma, eBioscience) gefärbt. Die Frequenz IFN-gamma produzierender Zellen wurde in der Durchflusszytometrie analysiert.
Statistische Analyse
Die Mittelwerte wurden unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen Student t-Test verglichen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Das Niveau der statistischen Signifikanz wurde bei p <0,05 festgelegt.
Untersuchungen
2.1 Die Tumorzelllinien MC57, C643, H1975 und die primären Tumorzellkulturen (UKE-Mel-13a) wurden mit LCMV (Stamm WE, MOI 1) infiziert. Die Replikation wurde nach 24 Stunden gemessen (n = 3).
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sich LCMV (Stamm WE) unterschiedlich ausbreitet. Im Vergleich zu den Tumorzelllinie MC57 war die Ausbreitung in den Zelllinien C643 und H1975 sowie in primären Tumorzellkulturen (UKE-Mel-13a) vermindert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 1 grafisch dargestellt.
In weiß sieht man die LCMV infizierten Zellen in den Kulturen mit MC57, C643, H1975 und UKE-Mel-13a. ∅ = ohne Infektion, LCMV = LCMV infiziert.
2.2 Die Tumorzelllinie MC57 und die primären Tumorzellkulturen 511950 wurden mit LCMV (Stamm WE, MOI 0,1) infiziert (linke Grafik). Die Tumorzelllinien MC57, Tramp-C2 und die primären Tumorzellkulturen (511950 und 511950R) wurden mit LCMV (Stamm WE, MOI 1) infiziert (rechte Grafik). Die Anzahl an infektiösen Viruspartikel wurden nach 24 Stunden im Überstand gemessen.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sich LCMV (Stamm WE) im Vergleich zu den Tumorzelllinie MC57 vermindert in der Zelllinie Tramp-C2 sowie den primären Tumorzellkulturen (511950 und 511950R) vermehren konnte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 grafisch dargestellt.
2 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Infektiöse LCMV-Partikel im Überstand (PFU/mL)
Abszisse: Behandlungsgruppen; MC57, Tramp-C2, 511950, 511950R.

2.3 LCMV-WE wurde 42-mal in primären Tumorzellkulturen (UKE-Mel-13a) passagiert. Nach 42 Passagen wurde eine funktionelle Mutation in dem neuen Virus (LCMV-P42) nachgewiesen.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass primäre Tumorzellen geeignet sind Arenaviren durch Passage zu verändern. Die experimentelle Durchführung ist in 3 grafisch dargestellt.
2.4 LCMV-WE wurde 52-mal in den Tumor-Zelllinien H1975 passagiert. Nach 52 Passagen wurden funktionelle Mutationen in dem neuen Virus LCMV-P52 nachgewiesen.
Dabei konnte am Beispiel H1975 nachgewiesen werden, dass Tumorzelllinien, die verminderte (im Vergleich zu der Zelllinie MC57) LCMV-Replikation aufweisen, geeignet sind, Arenaviren durch Passage zu verändern. Die experimentelle Durchführung ist in 4 grafisch dargestellt.
2.5 LCMV-P52 wurde 39-mal in den Tumor-Zelllinien H1975 passagiert. Nach 39 Passagen wurden weitere funktionelle Mutationen in dem neuen Virus LCMV-P91 nachgewiesen.
Dabei konnte gezeigt werden, dass H1975 Zellen geeignet sind, Arenaviren durch Passage zu verändern. Die experimentelle Durchführung ist in 5 grafisch dargestellt.
2.6 Die Zelllinien H1975 wurde mit LCMV-WE und LCMV-P52 infiziert (MOI 1). Virus wurde nach 12 Stunden im Überstand bestimmt (n=6).
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass LCMV-P52 besser als LCMV-WE in H1975 Zellen replizieren kann. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 6 grafisch dargestellt.
Die 6 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Infektiöse LCMV-Partikel im Überstand (PFU/mL)
Abszisse: Behandlungsgruppen; LCMV-WE bzw. LCMV-P52

2.7 Murine Knochenmarks-abstammende dendritische Zellen wurden mit LCMV-WE und LCMV-P52 infiziert (MOI 1). Virus wurde nach 24 Stunden im Überstand bestimmt (n=3).
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass LCMV-P52 besser als LCMV-WE in Antigen-präsentierenden Zellen replizieren kann. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 7 grafisch dargestellt.
Die 7 hat die nachfolgende Legende:

2.8 Die Tumor-Zelllinie H1975 wurde mit LCMV-WE oder LCMV-P52 (MOI 1) infiziert. Die Ausbreitung der Viren wurde mittels Immunfluoreszenz nach 24 Stunden gemessen.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sich LCMV-P52 im Vergleich zu LCMV-WE in Tumorzelllinien am Beispiel von H1975 besser ausbreiten kann. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 8 grafisch dargestellt.
In weiß sieht man die LCMV infizierten Zellen für eine Kultur infiziert mit LCMV-WE bzw. LCMV-P52.
2.9 Primäre Tumorzellen (UKE-Mel-13a) wurden mit LCMV-WE oder LCMV-P52 (MOI 1) infiziert. Die Ausbreitung der Viren wurde mittels Immunfluoreszenz nach 24 Stunden gemessen.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sich LCMV-P52 im Vergleich zu LCMV-WE in primären Tumorzellen besser ausbreiten kann. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 9 grafisch dargestellt.
In weiß sieht man die LCMV infizierten Zellen für Kulturen infiziert mit LCMV-WE bzw. LCMV-P52.
2.10 C57BL/6 Mäuse wurden mit LCMV-WE bzw. LCMV-P52 infiziert (2×10⁴ PFU intravenös). Ein Tag nach Infektion wurde die Aktivierung des angeborenen Immunsystems mittels Messung von IFN-alpha im Serum bestimmt.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass LCMV-P52 eine stärkere angeborene Immunaktivierung bewirkt als LCMV-WE. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 10 grafisch dargestellt.
Die 10 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: IFN-alpha Konzentration (ng/mL Serum)
Abszisse: Behandlungsgruppen; LCMV-WE bzw. LCMV-P52 infizierte Tiere.

2.11 C57BL/6 Mäuse wurden mit LCMV-WE bzw. LCMV-P52 infiziert (2×10⁴ PFU intravenös). Die Aktivierung des adaptiven Immunsystems wurde mittels Tetramer (misst Virus-spezifische CD8⁺ T Zellen) in der Durchflusszytometrie bestimmt.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass LCMV-P52 eine stärkere adaptive Immunaktivierung bewirkt als LCMV-WE. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 11 grafisch dargestellt.
Die 11 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Virus-spezifische CD8⁺ T Zellen (% von gesamten CD8⁺ T Zellen im Blut)
Abszisse: Zeit (Tage nach Infektion)

2.12 NOD.SCID Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ H1975 Zellen (Tag -7) subkutan behandelt. Die Mäuse wurden zusätzlich mit 2 × 10⁴ PFU LCMV-WE bzw. LCMV-P52 intratumoral infiziert (Tag 0). Das Tumorwachstum wurde analysiert.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-P52 stärker anti-tumoral wirkte als die Behandlung mit LCMV-WE. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 12 grafisch dargestellt.
Die 12 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: mittlerer Tumordurchmesser (cm)
Abszisse: Zeit (Tage nach LCMV Behandlung)

2.13 C57BL/6 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ MOPC Zellen (Tag -7) subkutan behandelt. Eine Gruppe von Mäusen wurde zusätzlich mit 2 × 10⁴ PFU LCMV-P52 intravenös infiziert (n=3, Tag 0). Das Tumorwachstum wurde analysiert.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-P52 stark anti-tumoral wirkte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 13 grafisch dargestellt.
Die 13 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Tumorvolumen (mm³)
Abszisse: Zeit (Tage nach LCMV Behandlung)

2.14 C57BL/6 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ CMT167 Zellen (Tag -7) subkutan behandelt. Eine Gruppe von Mäusen wurde zusätzlich mit 2 × 10⁴ PFU LCMV-P52 intravenös infiziert (n=3, Tag 0). Das Tumorwachstum wurde analysiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-P52 stark anti-tumoral wirkte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 14 grafisch dargestellt.

Die 14 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Tumorvolumen (mm³)
Abszisse: Zeit (Tage nach LCMV Behandlung)

LCMV-P52

15

C57BL/6

⁵

⁺

OT-1

LCMV-P52

⁴

LCMV-P52

2.15 C57BL/6 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ B16F10-OVA Zellen (Tag -7) intravenös behandelt. Tumor-spezifische CD8⁺ T Zellen isoliert aus der Milz einer OT-1 Maus wurden transferiert (Tag -4). Eine Gruppe von Tieren wurde zusätzlich mit LCMV-P52 intravenös behandelt (2×10⁴ PFU, n=4). Am Tag 3 wurde die Frequenz der Tumor-spezifischen CD8⁺ T Zellen im Blut ermittelt.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-P52 die Expansion von Tumor-spezifischen CD8⁺ T Zellen erhöht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 16 grafisch dargestellt.
Die 16 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Frequenz Tumor-spezifischer CD8⁺ T Zellen im Blut (% von gesamten CD8⁺ T Zellen)
Abszisse: Behandlungsgruppen, ∅ = ohne Infektion LCMV-P52 = behandelt mit LCMV-P52

2.16 C57BL/6 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ B16F10-OVA Zellen (Tag -7) intravenös behandelt. Tumor-spezifische CD8⁺ T Zellen isoliert aus der Milz einer OT-1 Maus wurden transferiert (Tag -4). Eine Gruppe von Tieren wurde zusätzlich mit LCMV-P52 intravenös behandelt (2×10⁴ PFU, n=4). Am Tag 9 wurde die Funktion von Tumor-spezifischen CD8⁺ T Zellen in der Milz mittels in vitro Restimulation ermittelt.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-P52 die Funktion von Tumor-spezifischen CD8⁺ T Zellen erhöht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 17 grafisch dargestellt.
Die 17 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Frequenz von IFN-gamma produzierenden Tumor-spezifischer CD8⁺ T Zellen (% von gesamten CD8⁺ T Zellen)
Abszisse: Behandlungsgruppen; ∅: Ohne LCMV-P52 Behandlung; LCMV-P52: Behandlung mit LCMV-P52; Legende: -: Ohne Antigen; +: Restimulation mit Antigen (SIINFEKL Peptid).

2.17 C57BL/6 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ B16F10-OVA Zellen (Tag -7) subkutan behandelt. Eine Gruppe von Tieren wurde nicht weiter behandelt (n=3). Eine Gruppe von Tieren wurde ab Tag 0 mit dem Inhibitor LCL-161 (oral 50mg/kg Körpergewicht) zweimal pro Woche behandelt. Eine Gruppe wurde am Tag 0 mit LCMV-WE intratumoral behandelt (2×10⁴ PFU, n=4). Eine Gruppe wurde mit LCL-161 sowie LCMV behandelt. Tumorwachstum wurde analysiert.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-WE synergistisch zu LCL-161 wirkt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 18 grafisch dargestellt.
Die 18 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Tumorvolumen (mm³)
Abszisse: Zeit (Tage nach LCMV Gabe)

2.18 C57BL/6 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ B16F10-OVA Zellen (Tag -7) subkutan behandelt. Eine Gruppe von Tieren wurde nicht weiter behandelt (n=3). Eine Gruppe von Tieren wurde ab Tag 0 mit dem Inhibitor LCL-161 (oral 50mg/kg Körpergewicht) zweimal pro Woche behandelt. Eine Gruppe wurde am Tag 0 mit LCMV-WE intratumoral behandelt (2×10⁴ PFU, n=4). Eine Gruppe wurde mit LCL-161 sowie LCMV behandelt. Überleben der Tiere wurde analysiert.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-WE synergistisch zu LCL-161 wirkt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 19 grafisch dargestellt.
Die 19 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Überleben der Tiere (%)
Abszisse: Zeit (Tage nach LCMV Gabe)

2.19 C57BL/6 Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ B16F10-OVA Zellen (Tag -9) subkutan behandelt. Eine Gruppe von Tieren wurde nicht weiter behandelt (n=3). Eine Gruppe wurde am Tag 0 mit LCMV-P52 intratumoral behandelt (2×10⁴ PFU, n=6-8).
Eine Gruppe von Tieren wurde mit dem Checkpoint-Blocker anti-PD-1 (200 µg. intraperitoneal) an Tagen 1, 5 und 8 behandelt. Eine Gruppe wurde mit Checkpoint-Blocker anti-PD-1 sowie LCMV-P52 behandelt. Tumorwachstum wurde analysiert.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit LCMV-P52 synergistisch zu Checkpoint-Blockern (am Beispiel von anti-PD-1) wirkt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 20 grafisch dargestellt.
Die 20 hat die nachfolgende Legende:

Ordinate: Tumorvolumen (mm³)
Abszisse: Zeit (Tage nach LCMV Behandlung)

Die in der vorliegenden Beschreibung erwähnten Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen entsprechen den im nachfolgenden Sequenzprotokoll offenbarten Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen.
Sequenzprotokoll
SEQUENCE LISTING


 <110> Lang Karl Sebastian


 <120> Verfahren zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus und
 Arenavirusmutanten zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Vorbeugung
 eines Tumors




 <130> P57579DE
 <160> 8
 <170> BiSSAP 1.3
 <210> 1
 <211> 498
 <212> PRT
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Mutant p52 Glycoprotein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 1


 <210> 2
 <211> 1497
 <212> RNA
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Mutant p52 Glycoprotein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 2


 <210> 3
 <211> 498
 <212> PRT
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Mutant p42 Glycoprotein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 3


 <210> 4
 <211> 1497
 <212> RNA
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Mutant p42 Glycoprotein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 4


 <210> 5
 <211> 2209
 <212> PRT
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Mutant L-Protein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 5


 <210> 6
 <211> 6630
 <212> RNA
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Mutant L-Protein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 6


 <210> 7
 <211> 2209
 <212> PRT
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Wildtype L-Protein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 7


 <210> 8
 <211> 6630
 <212> RNA
 <213> Lymphocytic choriomeningitis virus
 <220>
 <223> Lymphocytic choriomeningitis virus Wildtype L-Protein; ssrna
       ambisense-strand viruses; arenaviridae; arenavirus; old world
       arenaviruses
 <400> 8

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

WO 2009/083210 A1 [0007]
WO 2006/008074 A1 [0008]
WO 2016/166285 A1 [0010]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus, insbesondere eines Arenavirus, welcher gegenüber einem Ausgangsarenavirus verbesserte antitumorale Eigenschaften aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Ausplattieren von primären Tumorzellen oder von Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 auf und/oder in ein Nährmedium, b) Inokulieren der ausplattierten primären Tumorzellen oder ausplattierten Zellen der Zelllinie H 1975, C643 oder Tramp-C2 mit einem Ausgangsarenavirus, c) Inkubieren der inokulierten primären Tumorzellen oder inokulierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 unter Bedingungen, welche dazu geeignet sind, dass wenigstens ein Teil der inokulierten primären Tumorzellen oder der inokulierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 mit dem Ausgangsarenavirus infiziert werden, d) Entnehmen eines arenavirushaltigen Zellkulturüberstandes aus einer die inkubierten primären Tumorzellen oder die inkubierten Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 enthaltenden Zellkultur, wobei die Schrittabfolge a) bis d) mehrfach wiederholt wird, wobei die primären Tumorzellen oder die Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 beim Durchführen der ersten Wiederholung der Schrittabfolge a) bis d) zum Durchführen von Schritt b) mit dem beim Durchführen von Schritt d) vor der ersten Wiederholung der Schrittabfolge a) bis d) entnommenen, arenavirushaltigen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon inokuliert werden und beim Durchführen jeder weiteren Wiederholung der Schrittabfolge a) bis d) zum Durchführen von Schritt b) mit einem beim Durchführen von Schritt d) einer vorhergehenden Wiederholung der Schrittabfolge a) bis d) entnommenen, arenavirushaltigen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon inokuliert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die primären Tumorzellen vor Durchführen von Schritt a) höchstens 1000-mal, insbesondere höchstens 100-mal, bevorzugt höchstens 10-mal, passagiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt c) - während eines Zeitraumes von 1 Stunde bis 1000 Stunden, insbesondere 3 Stunden bis 300 Stunden, bevorzugt 12 Stunden bis 96 Stunden, und/oder - bei einer Temperatur von 4 °C bis 50 °C, insbesondere 20 °C bis 42 °C, bevorzugt 34 °C bis 39 °C und/oder - in einem Nährmedium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RPMI-1640, DMEM und IMDM , wobei das Nährmedium insbesonderezusätzlich Serum, wie beispielsweise fetales Kälber Serum oder humanes Serum, und/oder Aminosäuren, wie beispielsweise Glutamat und/oder Glutamin, und/oder Antibiotika aufweist, und/oder - unter einer Kohlendioxidatmosphäre von 0 % bis 20 %, insbesondere 2 % bis 10 %, bevorzugt 4 % bis 6 % durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schrittabfolge 3-mal bis 1000-mal, insbesondere 10-mal bis 100-mal, vorzugsweise 20-mal bis 50-mal, wiederholt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass - die primären Tumorzellen oder die Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 und/oder das Ausgangsarenavirus und/oder das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus vor Durchführen von Schritt d) mit wenigstens einem Chemotherapeutikum behandelt und/oder einer Strahlenbehandlung unterworfen werden. und/oder - primäre Tumorzellen oder Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 verwendet werden, welche gegenüber wenigstens einem Chemotherapeutikum resistent sind, und/oder - die primären Tumorzellen oder die Zellen der Zelllinie H1975, C643 oder Tramp-C2 und/oder das Ausgangsarenavirus und/oder das im entnommenen Zellkulturüberstand oder einem Teil davon enthaltene Arenavirus vor Durchführen von Schritt d) mit wenigstens einer antiviralen Verbindung, insbesondere mit alpha-Interferon und/oder gamma-Interferon, behandelt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die primären Tumorzellen aus der Gruppe bestehend aus primäre Aderhautmelanomzellen, primäre Analkarzinomzellen, primäre Angiosarkomzellen, primäre Astrozytomzellen, primäre Basalzellkarzinomzellen, primäre Cervixkarzinomzellen, primäre Chondrosarkomzellen, primäre Chorionkarzinomzellen, primäre dermale Plattenepithelkarzinomzellen, primäre Dünndarmkarzinomzellen, primäre Endometriumkarzinomzellen, primäre Ewing-Sarkomzellen, primäre Fibrosarkomzellen, primäre Gallenblasenkarzinomzellen, primäre Gallengangskarzinomzellen, primäre Glioblastomzellen, primäre Harnblasenkarzinomzellen, primäre Harnleiterkarzinomzellen, primäre Harnröhrenkarzinomzellen, primäre hepatozelluläre Karzinomzellen, primäre Hodentumorzellen, primäre Hypopharynxkarzinomzellen, primäre Hypophysenkarzinomzellen, primäre Kaposi-Sarkomzellen, primäre kleinzellige Bronchialkarzinomzellen, primäre Kolonkarzinomzellen, primäre kolorektale Karzinomzellen, primäre Larynxkarzinomzellen, primäre Leiomyosarkomzellen, primäre Liposarkomzellen, primäre Magenkarzinomzellen, primäre Maligne Fibröse Histiozytomzellen, primäre Mammakarzinomzellen, primäre Medulloblastomzellen, primäre Melanomzellen, primäre Mundbodenkarzinomzellen, primäre Nasennebenhöhlenkarzinomzellen, primäre Nasopharynxkarzinomzellen, primäre Nebennierenrindenkarzinomzellen, primäre Nebenschilddrüsenkarzinomzellen, primäre neurogene Sarkomzellen, primäre nicht-kleinzellige Bronchialkarzinomzellen, primäre Nierenzellkarzinomzellen, primäre Oropharynxkarzinomzellen, primäre Osteosarkomzellen, primäre Ovarialkarzinomzellen, primäre Pankreastumorzellen, primäre Peniskarzinomzellen, primäre Phäochromozytomzellen, primäre Pleuramesotheliomzellen, primäre Prostatakarzinomzellen, primäre rektale Karzinomzellen, primäre Retinoblastomzellen, primäre Rhabdomyosarkomzellen,primäre Schilddrüsenkarzinomzellen, primäre Speicheldrüsenkarzinomzellen, primäre Speiseröhrenkarzinomzellen, primäre Tonsillenkarzinomzellen, primäre Vaginalkarzinomzellen, primäre Vulvakarzinomzellen, primäre Wilms-Tumorzellen, primäre Zellen neuroendokriner Tumore und primäre Zungenkarzinomzellen ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangs-Arenavirus ein Wildtyp-Arenavirus, insbesondere ein Wildtyp eines Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus, verwendet wird.
Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante, aufweisend - ein Glykoprotein mit wenigstens einer Mutation, wobei es sich bei der wenigstens einen Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Isoleucins an der Position 181 des Glykoproteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Methionin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Arginins an der Position 185 des Glykoproteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Tryptophan, handelt und/oder - ein L-Protein mit wenigstens einer Mutation, wobei es sich bei der wenigstens einen Mutation um eine Aminosäuresubstitution des Lysins an der Position 1513 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Glutamat, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Phenylalanins an der Position 1995 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Serin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Isoleucins an der Position 2094 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Valin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Threonins an der Position 2141 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Alanin, und/oder um eine Aminosäuresubstitution des Arginins an der Position 2175 des L-Proteins durch eine andere Aminosäure, bevorzugt Lysin, handelt.
Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante, insbesondere nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante ein Protein oder Peptid, insbesondere ein Glykoprotein oder L-Protein, aufweist, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 aufweist oder aus einer solchen Aminosäuresequenz besteht.
Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante, insbesondere nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure aufweist, welche für ein Protein oder Peptid, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5, codiert, und/oder die Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante eine Nukleinsäure aufweist, welche eine Nukleinsäuresequenz aufweist oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, welche zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 6 komplementär ist.
Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Anwendung in der Medizin, insbesondere zur Anwendung bei der Behandlung und/oder Vorbeugung eines Tumors, vorzugsweise eines Tumors ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Analkarzinom, Bronchialkarzinom, Lungenkarzinom, Endometriumkarzinom, Gallenblasenkarzinom, Blasenkarzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hodenkarzinom, Kolonkarzinom, kolorektales Karzinom, rektales Karzinom, Larynxkarzinom, Speiseröhrenkarzinom, Magenkarzinom, Mammakarzinom, Nierenkarzinom, Ovarialkarzinom, Pankreaskarzinom, Pharynxkarzinom, Opharynxkarzinom, Prostatakarzinom, Schilddrüsenkarzinom, Zervixkarzinom, Angiosarkom, Chondrosarkom, Ewing-Sarkom, Fibrosarkom, Kaposi-Sarkom, Liposarkom, Leiomyosarkom, Maligne Fibröse Histiozytom, Lymphom, Leukämie, neurogenes Sarkom, Osteosarkom und Rhabdomyosarkom.
Arzneimittel, aufweisend eine Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Mutante nach einem der Ansprüche 8 bis 11.
Arzneimittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel ferner einen Checkpoint-Blocker, wie beispielsweise PD-1, und/oder einen Apoptose-Modulator, insbesondere Apoptose-Inhibitor, wie beispielsweise SMAC-Mimeticum, aufweist.
Isoliertes Protein oder Peptid, insbesondere Glykoprotein oder L-Protein, aufweisend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7.
Isolierte Nukleinsäure, insbesondere codierend für ein Glykoprotein oder L-Protein, wobei die Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz aufweist oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, welcher zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 oder SEQ ID No. 8 komplementär ist.