CN107083385A - 产热的miRNA调节剂 - Google Patents

产热的miRNA调节剂 Download PDF

Info

Publication number
CN107083385A
CN107083385A CN201610894105.5A CN201610894105A CN107083385A CN 107083385 A CN107083385 A CN 107083385A CN 201610894105 A CN201610894105 A CN 201610894105A CN 107083385 A CN107083385 A CN 107083385A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
hsa
mirna
reagents
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610894105.5A
Other languages
English (en)
Inventor
马克·蒂博尼耶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ai Potema Treats Co
Original Assignee
Ai Potema Treats Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ai Potema Treats Co filed Critical Ai Potema Treats Co
Publication of CN107083385A publication Critical patent/CN107083385A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Abstract

本发明提供了用于调节产热的新方法和组合物。这样的方法是特别有利的，因为它们能够减少对象的身体脂肪，而无需所述对象通过节食调节其热量摄取、改变身体活动或进行肥胖治疗手术。因此，本发明的方法对治疗或预防肥胖特别有用。本发明还提供了筛选调节产热调节子活性的新试剂的方法。

Description

产热的miRNA调节剂
本申请是申请号为201380030602.5的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2013/037579的中国国家阶段申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求对以下文件的优先权：于2012年4月20日提交的美国申请序列号61/636,059；于2012年8月10日提交的美国申请序列号61/681,750；和于2013年3月14日提交的美国申请序列号61/782,838，每个文件都通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及新的治疗肥胖的方法，具体地，涉及产热的miRNA调节剂。
背景技术
肥胖已经达到了流行病的比例，影响到所有年龄段和社会经济群体。世界卫生组织估计，在2008年，有15亿20岁及以上的成年人超重，并且有超过2亿的男性和超过3亿的女性肥胖。据估计，到2030年，超重和肥胖个体的数据将分别增长至21.6亿和11.2亿。肥胖导致收入损失、活动天数受到限制、缺勤、工作效率低下(出勤)、生活质量下降、永久性失能、显著的发病率和死亡率，以及寿命缩短。事实上，据估计，2009年美国和加拿大因医疗费用、过高的死亡率以及失能导致的超重和肥胖的年总经济费用为约3000亿美元。国际研究显示，肥胖症的经济费用占总医疗费用的2％至10％。
肥胖是由能量摄取与消耗之间的长期失衡造成的。这导致过多的能量储存在脂肪细胞中，这样的脂肪细胞通常表现出肥大(细胞体积增大)和增生(细胞数目或脂肪生成增加)二者。最近，肥胖的恶化源于过度消费含饱和脂肪和糖类的高能量密度食物结合体力活动的减少。
现有的肥胖的症状性医药治疗不能达到长期治疗的目的，这很大程度上是由于有限的药物效力以及患者很少能坚持生活方式改变和治疗所导致的。数种肥胖药物已经由于安全因素而被移出市场，而一些正在研发的小分子由于其不理想的短期疗效和未知的安全性能(profile)正挣扎于获取审批。目前，仅限制性肥胖治疗(bariatric)手术和吸收不良性肥胖治疗手术可实现显著的长期减重并伴有一些有利的心血管益处。
因此，本领域中需要新的治疗肥胖的方法。
发明内容
肥胖是能量摄取与消耗长期失衡的结果，导致过多的能量储存进白色脂肪细胞中。本公开内容涉及肥胖的新治疗方法，其靶向周围脂肪细胞， 包括储存能量的填充有脂质的白色脂肪细胞(white adipocytes，WAT)，以及消耗能量的富含线粒体的褐色脂肪细胞(brown adipocyte，BAT)。此外，本公开内容提供了通过使用微小RNA(miroRNA，miRNA)试剂来调节产热(生物体中的热产生过程)的方法。本文所描述的方法一般包括使用经分离的miRNA试剂直接和/或间接地调节细胞、组织和/或对象中的至少一种产热调节子(regulator)(例如，线粒体解偶联剂(uncoupler)，如解偶联蛋白1(Uncoupling Protein1，UCP1还被称为产热素)或解偶联蛋白2(UCP2))。UCP使氧化磷酸化与ATP合成解偶联。在某些情况下，该解偶联反应导致能量作为热消散。这样的方法是特别有利的，因为它们允许减少对象身体中的脂肪，而无需所述对象必须通过节食调节其热量摄入、改变身体活动或进行肥胖治疗手术。因此，本发明的方法对治疗或预防肥胖特别有用。
本发明还提供了可调节产热调节子活性的新miRNA试剂组合物(例如miRNA、agomir和antagomir)。此外，本发明提供了筛选调节产热调节子活性的新miRNA试剂的方法。此外，本发明还提供了提供miRNA试剂的细胞/组织特异性递送的新试剂组合物(例如，适配体(aptamer)-miRNA复合物或“aptamir”)。
因此，在一个方面，本发明提供了调节细胞中的呼吸链解偶联的方法，所述方法包括使细胞与调节至少一种线粒体解偶联剂的表达水平和/或活性的经分离的miRNA试剂接触。在一些实施方案中，所述方法还包括选择需要调节呼吸链解偶联的对象(例如，肥胖患者)的步骤。在一个实施方案中，所述miRNA试剂提高至少一种线粒体解偶联剂的表达水平和/或活性。在某些实施方案中，所述线粒体解偶联剂是UCP1或UCP2。在一些实施方案中，所述方法在体内提高细胞中的呼吸链解偶联。在另一些实施方案中，所述方法离体提高细胞中的呼吸链解偶联。在某些实施方案中，所述方法还包括测定线粒体解偶联剂的表达水平(mRNA或蛋白质)或活性。在某些实施方案中，所述细胞是前脂肪细胞、脂肪细胞、脂肪组织来源的间充质干细胞、肝细胞、肌细胞或其前体。任选地，脂肪细胞可为白色脂肪细胞或褐色脂肪细胞。
在另一个方面，本发明提供了调节组织中的产热的方法，所述方法包括使组织与调节至少一种线粒体解偶联剂的表达水平和/或活性的经分离的miRNA试剂接触。在一些实施方案中，所述方法还包括选择需要调节产热的对象(例如，肥胖患者)的步骤。在一个实施方案中，所述miRNA 试剂提高至少一种线粒体解偶联剂的表达水平和/或活性。在某些实施方案中，所述线粒体解偶联剂是UCP1或UCP2。在某些实施方案中，所述方法包括提高产热。在某些实施方案中，所述方法还包括测定线粒体解偶联剂的表达水平(mRNA或蛋白质)或活性。在某些实施方案中，所述组织是褐色脂肪组织、白色脂肪组织、皮下脂肪组织、肝或肌肉。在某些实施方案中，使所述组织与所述miRNA试剂离体接触。
在另一个方面，本发明提供了治疗需要此治疗的人对象的肥胖的方法，所述方法一般包括向所述人对象施用有效量的调节至少一种线粒体解偶联剂活性的miRNA试剂。在某些实施方案中，所选择用于治疗的人对象具有肥胖的遗传素质或表观遗传素质。在某些实施方案中，所述线粒体解偶联剂是UCP1、UCP2或UCP3。
在所有以上方面的某些实施方案中，所述miRNA试剂是选自以下的经分离的miRNA：hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、和hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a。在所有以上方面的某些实施方案中，所述miRNA试剂是与以上列出的miRNA序列有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经分离的miRNA试剂。在所有以上方面的某些实施方案中，所述miRNA试剂是上文列出的miRNA的种子序列(seed sequence)。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂是选自表1中记载的536个miRNA中的经分离的miRNA。在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂是与表1中列出的miRNA序列有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经分离的miRNA试剂。在所有以上方面的某些实施方案中，所述miRNA试剂是表1中列出的miRNA的种子序列。
表1.
以升序列出的脂肪细胞miRNA(miRBase 19命名法)：
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂是选自表11、13和14中记载的经分离的miRNA中的miRNA。在所有以上方面的某些实施方案中，所述miRNA试剂是与表1、11、13和14中列出的miRNA序列有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经分离的miRNA。在所有以上方面的某些实施方案中，所述miRNA试剂是表11、13和14中列出的miRNA的种子序列。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂是选自表1中记载 的miRNA中的miRNA的agomir或antagomir。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂是选自以下的miRNA的agomir或antagomir：hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、and hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂是选自表11中记载的miRNA中的miRNA的agomir或antagomir。
在所有上述方面的某些实施方案中，miRNA试剂是选自以下的miRNA的antagomir：hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p和hsa-miR-545。
在所有上述方面的某些实施方案中，miRNA试剂是选自以下的miRNA的antagomir：hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620和hsa-miR-1179。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂与靶向部分(例如适配体)连接。在一个实施方案中，所述靶向部分将miRNA试剂递送至特定细胞类型或组织。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂直接与至少一种线 粒体解偶联剂的mRNA或启动子区结合。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂直接与至少一种线粒体解偶联剂之mRNA的5’UTR或编码序列结合。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂直接与至少一种线粒体解偶联剂之mRNA的3’UTR结合。
在所有以上方面的某些实施方案中，miRNA试剂调节线粒体解偶联蛋白的激活蛋白(activator)或阻抑蛋白(repressor)的活性。在一个实施方案中，所述miRNA试剂直接与激活蛋白或阻抑蛋白的mRNA或启动子区结合。在一个实施方案中，miRNA试剂直接与激活蛋白或阻抑蛋白之mRNA的5’UTR或编码序列结合。在一个实施方案中，miRNA试剂直接与激活蛋白或阻抑蛋白之mRNA的3’UTR结合。在一个实施方案中，激活蛋白或阻抑蛋白选自列于表2中的组。
在所有以上方面的某些实施方案中，上调线粒体解偶联蛋白的mRNA或蛋白质表达。
在所有以上方面的某些实施方案中，上调线粒体解偶联蛋白的线粒体解偶联活性。
在另一个方面，本发明提供了筛选调节产热的miRNA试剂的方法，所述方法一般包括：提供指示细胞(indicator cell)；使所述指示细胞与受试miRNA试剂接触；以及在存在及不存在所述miRNA试剂的情况下，测定所述指示细胞中的至少一种产热调节子的细胞活性，其中，所述产热调节子活性在存在所述受试miRNA试剂的情况下的改变将所述受试miRNA试剂鉴定为调节产热的miRNA试剂。所述指示细胞可为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述指示细胞是包含至少部分人基因组的人细胞。
在某些实施方案中，所述细胞是前脂肪细胞、脂肪细胞、脂肪组织来源的间充质干细胞、肝细胞、肌细胞或其前体。
在某些实施方案中，在该方法中测定的产热调节子细胞活性是所述产热调节子的mRNA表达水平、蛋白质表达水平或线粒体解偶联活性。
在某些实施方案中，与不存在受试miRNA试剂的条件下产热调节子的活性水平相比，受试miRNA试剂提高了产热调节子的活性。
在某些实施方案中，产热调节子是UCP1或UCP2。
在另一个方面，本发明提供了调节细胞中的至少一种产热调节子活性的agomir或antagomir。
在某些实施方案中，agomir或antagomir是选自表11、13和14中所记载miRNA的miRNA的agomir或antagomir。
在某些实施方案中，agomir或antagomir是选自表1中所记载miRNA的miRNA的agomir或antagomir。
在某些实施方案中，agomir或antagomir是选自以下的miRNA的agomir或antagomir：hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsR-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、和hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a。
在某些实施方案中，agomir或antagomir是选自以下的miRNA的agomir或antagomir：hsa-miR-19b-2-5p、ha-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p和hsa-miR-545。
在某些实施方案中，agomir或antagomir是选自以下的miRNA的antagomir：hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620和hsa-miR-1179。
在某些实施方案中，agomir或antagomir与靶向部分连接。
在某些实施方案中，靶向部分是适配体。
在某些实施方案中，靶向部分将所述agomir或antagomir递送至特定细胞类型或组织。
在某些实施方案中，agomir或antagomir直接与至少一种线粒体解偶联剂的mRNA或启动子区结合。
在某些实施方案中，agomir或antagomir直接与至少一种线粒体解偶联剂之mRNA的5’UTR或编码序列结合。
在某些实施方案中，agomir或antagomir直接与至少一种线粒体解偶联剂之mRNA的3’UTR结合。
在某些实施方案中，agomir或antagomir调节线粒体解偶联蛋白的激活蛋白或阻抑蛋白的活性。
在某些实施方案中，激活蛋白或阻抑蛋白选自列于表2中的组。
在某些实施方案中，agomir或antagomir直接与激活蛋白或阻抑蛋白的mRNA或启动子区结合。
在某些实施方案中，agomir或antagomir直接与激活蛋白或阻抑蛋白之mRNA的5’UTR或编码序列结合。在另一些实施方案中，agomir或antagomir直接与激活蛋白或阻抑蛋白之mRNA的3’UTR结合。
本公开内容还提供了药物组合物，其包含选自以下的两种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30bantagomir。在某些实施方案中，所述药物组合物还包含可药用赋形剂。在某些实施方案中，所述两种或更多种miRNA由重组载体表达。所述重组载体可选自DNA质粒、病毒载体和DNA微环。
本公开内容还提供了诱导前脂肪细胞先分化成白色脂肪细胞并且随后分化成褐色脂肪细胞的方法，其包括向前体脂肪细胞群施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30bantagomir。所述一种或更多种miRNA还可选自hsa-let-7a agomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19bantagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir。在某些实施方案中，使前脂肪细胞分化成脂肪细胞的诱导大于当将前脂肪 细胞暴露于100nM罗格列酮两天随后暴露于维持培养基中时得到的前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。在某些实施方案中，所述脂肪细胞是褐色脂肪细胞。在另一些实施方案中，所述脂肪细胞是白色脂肪细胞。其他分化标准可在下文的实施例中找到。
本公开内容还提供了用于降低脂肪细胞的脂质含量的方法，其包括向脂肪细胞群施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir。在某些实施方案中，所述脂肪细胞中的脂质含量小于暴露于100nM罗格列酮两天随后暴露于维持培养基中的脂肪细胞中的脂质含量，或者小于在培养持续时间内暴露于100nM罗格列酮的脂肪细胞的脂肪含量。培养持续时间可为8天至16天、10天至14天或者14天。培养持续时间还可为8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。脂肪细胞之脂质含量的另外的标准可在下文的实施例中找到。
本公开内容还提供了用于在有此需要的对象中提高胰岛素敏感性的方法，其包括向所述对象施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19bantagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir。
在某些实施方案中，所述对象是哺乳动物。
本公开内容还提供了提高细胞中的一种或更多种解偶联蛋白之表达或活性的方法，其包括向所述细胞施用选自hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19bagomir和hsa-miR-30b agomir的一种或更多种、两种或多于两种或者三种或多于三种miRNA。在某些实施方案中，所述细胞选自褐色脂肪细胞、白色脂肪细胞、皮下脂肪细胞、肝细胞或者肌肉细胞。在另一些实施方案中，所述一种或更多种解偶联蛋白包括UCP1或者UCP2。在某些实施方案中，所述方法是离体方法。在另一些实施方案中，所述方法是体内方法。在某些实施方案中，所述方法包括选择需要提高一种或更多种解偶联蛋白(例如UCP1、UCP2)之表达水平或活性水平的对象(例如，人)。在一些实施方案中，所述对象患有肥胖或者有发展成肥胖的风险。在某些实施方案中，所述对象患有糖尿病或者有发展成糖尿病的风险。在某些实施方案中，所述方法还包括测定一种或 更多种解偶联蛋白的表达水平(mRNA或蛋白质)或活性。
本公开内容还提供了引起有此需要之对象中的脂肪消耗的方法，其包括向所述对象施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19b agomir和hsa-miR-30b agomir。在某些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在另一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
附图说明
图1A和1B是使用STRING 9.0数据库在两种不同严格(stringency)水平上确定的83种产热调节子相互作用的示意图。
图2A是使用Ingenuity Pathway Analysis Software程序确定的83种产热调节子相互作用的示意图。
图2B是使用Reactome Functional Interaction Network程序确定的83种产热调节子相互作用的示意图。
图3是多种miRNA预测程序预测的人UCP1基因的5’UTR、启动子区、编码序列和3’UTR的miRNA结合位点的结果的重叠示意图。
图4是多种miRNA预测程序预测的83种产热调节子基因的5’UTR、启动子区、编码序列和3’UTR的miRNA结合位点的结果的重叠示意图。
图5是线粒体中氧化磷酸化的示意图，描述通过UCP1使氧化磷酸化与ATP合成解偶联以产生热。
图6描述了由另一些示例性产热调节子对UCP1进行的转录控制。
图7描述了UCP1基因转录的示例性正性(a)转录调节子和负性(b)转录调节子。
图8A描述了人UCP1基因的15,910个碱基对(bp)序列(NCBI参考序列：gi|237858805|ref|NG_012139.1|人解偶联蛋白1(线粒体、质子载体)(UCP1)，4号染色体上的RefSeqGene)中多种调控元件相对于UCP1转录起始位点(第5,001位)的位置。
图8B描述了人UCP2基因的15,174bp序列(ENSG00000175567)(包含11号染色体上的5,000bp 5’UTR和2,000bp 3’UTR)中多种调控元件相对于转录起始位点(第5,001位)的位置。
图9是示出未标记的前脂肪细胞或者经Dy547-标记的非靶向miRNA模拟物或发夹抑制剂转染的前脂肪细胞中的相对荧光的条形图。
图10A是示出经siRNA对照和GAPDH siRNA转染的前脂肪细胞在转染4天后GAPDH基因表达降低的条形图。
图10B是示出经siRNA对照和GAPDH siRNA转染的前脂肪细胞在转染12天后GAPDH基因表达降低的条形图。
图11A是单独在维持培养基中培养两周后的前脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片(micrograph)。
图11B是在胰岛素、三-碘甲状腺原氨酸(tri-iodothyronine)、地塞米松、异丁基-甲基黄嘌呤和罗格列酮的存在下培养两天随后在维持培养基中培养12天的前脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图11C是实验中始终在胰岛素、三-碘甲状腺原氨酸、地塞米松、异丁基-甲基黄嘌呤和罗格列酮的存在下培养的前脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图11D是在hsa-miR-30b模拟物的存在下培养的前脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图11E是在非靶向miRNA模拟物的存在下培养的前脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图11F是在非靶向miRNA抑制剂的存在下培养的前脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图12A是示出在罗格列酮的存在下产热靶标的mRNA表达的条形图。
图12B是示出在hsa-let-7a抑制剂的存在下产热靶标的mRNA表达的条形图。
图12C是示出在hsa-miR-1模拟物的存在下产热靶标的mRNA表达的条形图。
图12D是示出在hsa-miR-19b模拟物的存在下产热靶标的mRNA表达的条形图。
图12E是示出在hsa-miR-30b模拟物的存在下产热靶标的mRNA表达的条形图。
图12F是示出未经处理的前脂肪细胞中产热靶标的mRNA表达的条形图。
图13是示出x轴上的平均基因表达和y轴上的碱基对之间的对数级差异的M-A图(plot)。
图14是示出维恩图的示意图，其示出在miRNA类似物hsa-let-7a抑制剂、hsa-miR-1模拟物、hsa-miR-19b模拟物和hsa-miR-30b模拟物的存在下，显著上调的基因数分别是305、247、255和267。127个基因的组通常被所列的miRNA类似物上调。
图15是示出维恩图的示意图，其示出在miRNA类似物hsa-let-7a抑制剂、hsa-miR-1模拟物、hsa-miR-19b模拟物和hsa-miR-30b模拟物的存在下，显著下调的基因数分别是143、177、115和165。60个基因的组通常被所列的miRNA类似物下调。
图16是示出未标记的脂肪细胞或者经Dy547-标记的非靶向miRIDIAN模拟物或发夹抑制剂转染的脂肪细胞中的相对荧光的条形图。
图17A是示出经siRNA对照和GAPDH siRNA转染的细胞在转染4天后GAPDH基因表达降低的条形图。
图17B是示出经siRNA对照和GAPDH siRNA转染的细胞在转染12天后GAPDH基因表达降低的条形图。
图18A是单独在维持培养基中培养两周后的成熟脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图18B是在罗格列酮的存在下培养两周的成熟脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图18C是在非靶向miRNA的存在下培养的成熟脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图18D是在hsa-miR-30b模拟物的存在下培养的成熟脂肪细胞用油红O染色的光学显微照片。
图19是示出暴露于多种miRNA类似物或罗格列酮的成熟脂肪细胞中脂质(尼罗红(Nile Red)荧光染料)的量的条形图。
图20是示出从暴露于多种转染试剂的成熟脂肪细胞中提取的RNA总量的条形图。
图21是示出使用多种转染试剂用GAPDH特异性的miRNA模拟物转染的成熟脂肪细胞中GAPDH基因表达降低的条形图。
图22示出在单独的维持培养基(对照)、50nM hsa-let-7a抑制剂、10μmβ肾上腺素能受体激动剂CL 316，243、50nM hsa-miR-1模拟物、10nM甲状腺激素三-碘甲状腺原氨酸、50nM hsa-miR-19b模拟物、100nM罗格列酮或50nM hsa-miR-30b模拟物中培养两周的成熟脂肪细胞的明场显微照片。
图23是用于分离特异性针对人细胞表面独特靶标的适配体的Cell-SELEX方法的示意图。
图24描述了评价所选的荧光适配体与人肝细胞和脂肪细胞结合的FACS实验的结果。
具体实施方式
I.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有由本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。在相抵触的情况下，以本申请(包括定义)为准。
本文所用术语“miRNA试剂”是指直接或间接调节产热调节子(例如线粒体解偶联剂或其或激活蛋白或阻抑蛋白)活性的寡核苷酸或寡核苷酸模拟物。miRNA试剂可作用于靶基因或靶miRNA。
本文所用术语“miRNA”是指能够与靶基因(mRNA或DNA)结合并调节该基因表达的单链RNA分子(或其合成衍生物)。在某些实施方案中，miRNA天然表达于生物体中。
本文所用术语“种子序列”是指miRNA 5’端的前8个核苷酸(nt)内的6至8个核苷酸至个核苷酸长的子串(substring)(即，种子序列)，其为靶标特异性的重要决定因素。
本文所用术语“agomir”是指功能上模拟miRNA的合成寡核苷酸或寡核苷酸模拟物(oligonucleotide mimetic)。agomir可为与miRNA或miRNA的一部分具有相同或相似的核酸序列的寡核苷酸。在某些实施方案中agomir与其所模拟的miRNA具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸差异。此外，与其所模拟的miRNA相比，agomir还可具有 相同的长度、更长的长度或更短的长度。在某些实施方案中，agomir具有与其所模拟的miRNA 5’端的6至8个核苷酸相同的序列。在另一些实施方案中，agomir的长度可为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在另一些实施方案中，agomir的长度可为5至10个核苷酸、6至8个核苷酸、10至20个核苷酸、10至15个核苷酸或5至500个核苷酸。在某些实施方案中，agomir包含表1、11、13和14中所示的任意序列。这些经化学修饰的合成RNA双链包含与目的miRNA相同或基本相同的引导链，以允许有效地加载进miRISC复合物中，而过客链(passenger strand)经化学修饰以防止其加载到miRISC复合物的Argonaute蛋白中(Thorsen SB等，Cancer J.，18(3)：275-284(2012)；Broderick JA等，Gene Ther.，18(12)：1104-1110(2011))。
本文所用术语“antagomir”是指具有与特定的微小RNA互补并且抑制该miRNA活性的合成寡核苷酸或寡核苷酸模拟物。在某些实施方案中，antagomir与其所抑制的miRNA具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸差异。此外，与其所抑制的miRNA相比，antagomir还可具有相同的长度、更长的长度或更短的长度。在某些实施方案中，所述antagomir与其所抑制的miRNA 5’端的6至8个核苷酸杂交。在另一些实施方案中，antagomir的长度可为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在另一些实施方案中，antagomir的长度可为5至10个核苷酸、6至8个核苷酸、10至20个核苷酸、10至15个核苷酸或5至500个核苷酸。在某些实施方案中，antagomir包含与表1、11、13和14中所示的任意序列互补的核苷酸。antagomir是与特定miRNA紧密结合并使其失活的合成的反向互补。使用多种化学修饰以改进核酸酶抗性和结合亲和力。最常用的提高效价的修饰包括多种2’糖修饰，例如2’-O-Me、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)或2’-氟代(2’-F)。miRNA的核酸结构还可修饰成锁核酸(LNA)，其中在2’氧和4’碳之间具有亚甲基桥从而将核糖锁定为A型核酸构象的3’-内(North)构象(Lennox KA等，Gene Ther.Dec 2011；18(12)：1111-1120；Bader AG等，Gene Ther.Dec 2011；18(12)：1121-1126)。该修饰显著提高分子的靶特异性和杂交性质二者。
本文所用术语“aptamir”是指适配体(与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽分子)与如上文定义的agomir或antagomir的组合，其允许miRNA试剂的细胞特异性递送或组织特异性递送。
本文所用术语“干扰RNA”是指能够通过介导RNA干扰来抑制或下调基因表达的任何双链RNA序列或单链RNA序列。干扰RNA包括但不限于小干扰RNA(“siRNA”)和小发夹RNA(“shRNA”)。“RNA干扰”是指序列匹配(compatible)的信使RNA转录物的选择性降解。
本文所用术语“小干扰RNA”或“siRNA”是指能够通过以序列特异性的方式介导RNA干扰来抑制或下调基因表达的任何小RNA分子。所述小RNA的长度可为例如约16至21个核苷酸。
本文所用术语“shRNA”(小发夹RNA)是指包含反义区、环部分和正义区的RNA分子，其中所述正义区具有与所述反义区进行碱基配对的互补核苷酸以形成双链的茎。在转录后加工后，小发夹RNA通过由RNA酶III家族成员酶Dicer介导的切割事件转变成小干扰RNA(siRNA)。
本文所用术语“反义寡核苷酸”是指与DNA序列或mRNA序列(例如miRNA)互补的合成寡核苷酸或寡核苷酸模拟物。
本文所用术语“miR-掩蔽物(mask)”是指与靶mRNA中的miRNA结合位点互补并且用于抑制miRNA与该mRNA结合位点结合的单链反义寡核苷酸。参见例如，Xiao等，“Novelapproaches for gene-specific interference via manipulating actions ofmicroRNAs：examination on the pacemaker channel genes HCN2 and HCN4，”Journalof Cellular Physiology，第212卷，第2期，第285-292页，2007，其整体并入本文。
本文所用术语“miRNA海绵”是指包含目的miRNA的多个串联结合位点并且用于去除(titrate out)内源性目的miRNA以抑制目的miRNA与其内源靶标结合的合成核酸(例如mRNA转录物)。参见例如，Ebert等，“MicroRNA sponges：competitive inhibitors ofsmall RNAs in mammalian cells，”Nature Methods，第4卷，第9期，第721-726页，2007，其整体并入本文。
本文所用术语“呼吸链解偶联”是指使线粒体的内膜质子梯度消失从而阻止线粒体中通过氧化磷酸化来合成ATP。
本文所用术语“线粒体解偶联剂”是指可使线粒体内膜质子梯度消失从而阻止线粒体中通过氧化磷酸化来合成ATP的蛋白质(或编码核酸)。 示例性的线粒体解偶联剂包括UCP1和UCP2。
本文所用术语线粒体解偶联剂的“激活蛋白”或“阻抑蛋白”是指分别用于上调或下调线粒体解偶联剂活性的蛋白质。
本文所用术语“产热调节子”是指直接或间接调控产热的蛋白质(或编码核酸)。该术语涵盖线粒体线粒体解偶联剂，以及还涵盖线粒体解偶联剂的激活蛋白和阻抑蛋白。示例性的产热调节子记载于本文的表2中。
本文所用术语“调节”是指使参数提高或降低。例如，调节蛋白质的活性可为使蛋白质的活性提高或降低。
本文所用术语线粒体解偶联剂或产热调节子的“活性”是指任何可测量的生物学活性，包括但不限于，mRNA表达、蛋白质表达或呼吸链解偶联。
miRNA试剂组合物的“有效量”是足以在人中有效治疗或预防病症或控制生理学症状(condition)的量。在某些实施方案中，该生理学症状是肥胖。
“对象”是脊椎动物，包括哺乳纲的任何成员，包括人、家养动物和农场动物、动物园动物、运动场动物或宠物，例如小鼠、兔子、猪、绵羊、山羊、牛和高等灵长类。
术语“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，包括啮齿类、灵长类、犬、猫、骆驼科动物(camelid)和有蹄类。术语“啮齿类”是指作为啮齿目成员的任何种，包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和兔子。术语“灵长类”是指作为灵长目成员的任何种，包括猴子、猿和人。术语“骆驼科动物”是指作为骆驼科家族成员的任何种，包括骆驼和美洲驼(llama)。术语“有蹄类”是指作为有蹄超目成员的任何种，包括牛、马和骆驼科动物。根据一些实施方案，哺乳动物是人类。
本文所用的“治疗”定义为以治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改良或影响该疾病或病症、疾病或病症的症状或对疾病的易感性为目的，将治疗剂(例如miRNA试剂或载体或编码它们的转基因)应用或施用于患者，或将治疗剂应用或施用于从患有疾病或病症、疾病或病症的症状或者具有对疾病或病症的素质的患者分离的组织或细胞系。
本文所用的“药物基因组学”是指基因组学技术例如基因测序、统计遗传学和基因表达分析在对临床开发中和市售的药物的应用。更具体地，该术语是指患者的基因如何决定他或她对药物的响应的研究(例如，患者 的“药物响应表型”，或“药物响应基因型”)。
miRNA试剂组合物的“有效量”是足以在人中有效治疗或预防疾病或控制生理学病症的量。
II.产热和肥胖
在某些实施方案中，本发明提供了用于调节产热的方法。这些方法一般包括使细胞或组织与调节至少一种线粒体解偶联剂(例如UCP1和/或UCP2)活性的miRNA试剂接触。这样的方法和组合物对治疗肥胖特别有用。
哺乳动物脂肪细胞可基于其功能性质分为两大类：1)储存和释放能量的填充有脂质的白色脂肪细胞(WAT)，以及；2)消耗能量并产生热的富含线粒体的褐色脂肪细胞(BAT)。直至最近，认为BAT在幼儿期经历了快速的退化，在成年人中仅留下残余的量。然而，在人体中用示踪剂18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)进行的正电子发射断层成像(PET)研究证实：1)成年对象的颈部、锁骨上、腋部和椎旁区域中仍然存在多个BAT储库；2)成年人的BAT可通过暴露于冷温度而被迅速激活；3)BAT的活性与年龄、体重指数(BMI)、身体脂肪百分比、空腹血浆葡萄糖水平、β-阻滞剂的使用以及室外温度反相关；并且4)BAT的增加(expansion)可驱动与产生儿茶酚胺的嗜铬细胞瘤相关的重量减轻，但是已经将导致受体功能降低的β3-肾上腺素能受体多态性与体重增加和2型糖尿病的早期发作联系到一起。
虽然WAT和BAT来源于间充质干细胞，但是它们具有不同的谱系，其中Myf5(肌源性调节因子5)(也在骨骼肌祖细胞中表达)、PGC-1α和PRDM16(含PR-结构域的16)的表达将褐色脂肪细胞前体与白色脂肪细胞前体区分开来。除了典型的褐色脂肪细胞外，在WAT占优势的组织中还可诱导不同类型的褐色脂肪细胞。创造了术语“白中褐(brite)”(白色中的褐色)脂肪细胞，并且WAT储库中的褐色样脂肪细胞的外观与改进的代谢表型有关。BAT质量和/或活性的提高提供了对肥胖一定程度的预防。BAT的产热量为300W/g，相比之下，所有其他组织中的产热量为1W/g。因为少至50g BAT就将占有20％的日常能量消耗，所以对能量平衡产生显著影响仅需要相对有限量的BAT。据推测，在一个对象的锁骨上/颈旁的储库中发现的大约63g BAT在1年内可消耗掉的能量等于4.1kg WAT。
线粒体解偶联蛋白(UCP)是线粒体阴离子载体蛋白质(MACP)家族的成员。UCP使氧化磷酸化与ATP合成分开，使能量作为热散失(也称为“线粒体质子泄漏”)。UCP促进阴离子从线粒体的内膜向外膜转移和从线粒体外膜向内膜的返回传递，在该过程中产生热。UCP是负责产热和热耗散的主要蛋白质。解偶联蛋白1(UCP1)也称为产热素，是负责产热和热耗散的BAT特异性蛋白质。UCP2是同样在脂肪细胞中表达的另一种解偶联蛋白。UCP是产热调节蛋白网络的一部分(参见图1)。示例性的产热调节子记载于表2中。
调节产热调节子以诱导BAT分化和/或线粒体解偶联蛋白提供了在对象中诱导产热从而治疗肥胖的方法。然而，化学药理学方法不能靶向这些分子，因为它们不属于传统药物发现的“可用药空间(druggable space)”占主导地位的典型“靶标类型”(激酶、离子通道、G蛋白偶联受体等)。因此，本发明提供了使用miRNA试剂来调节这些产热调节子的新方法和组合物。
在某些实施方案中，使用miRNA试剂来上调线粒体解偶联剂的活性(例如，mRNA表达水平、蛋白质表达水平或线粒体解偶联活性)。线粒体解偶联剂的上调可通过几种方式实现。在一个实施方案中，miRNA试剂直接抑制负责下调线粒体解偶联剂之活性(例如，mRNA表达水平、蛋白质表达水平)的天然miRNA的活性。在另一个实施方案中，miRNA试剂上调线粒体解偶联剂之激活蛋白的活性(例如，mRNA表达水平或蛋白质表达水平)。该上调可例如通过直接抑制负责下调该激活蛋白表达的天然miRNA的活性来实现。在另一个实施方案中，miRNA试剂下调线粒体解偶联剂之阻抑蛋白的活性(例如，mRNA表达水平或蛋白质表达水平)。该下调可例如通过使用miRNA试剂直接抑制线粒体解偶联剂之阻抑蛋白的表达来实现。
在某些实施方案中，使用能够同时调节多种产热调节子活性的miRNA试剂(与通用miRNA试剂相反的通路特异性miRNA试剂)。例如，可使用与多种产热调节子结合的单一miRNA、agomir或antagomir。该方法是特别有利的，因为其允许使用单一miRNA试剂来调节整个信号通路中的多个成员。
在某些实施方案中，使用多种抑制性miRNA试剂(例如，antagomir或miR掩蔽物)。这些抑制性miRNA试剂可具有相同的miRNA靶标或 不同的miRNA靶标。
III.miRNA试剂
在某些实施方案中，本发明使用miRNA试剂来调节产热调节子(例如，线粒体解偶联剂，如UCP1和/或UCP2)。适用于本文所公开方法的miRNA试剂包括但不限于：miRNA、agomir、antagomir、miR-掩蔽物、miRNA-海绵、siRNA(单链或双链的)、shRNA、反义寡核苷酸、核酶或与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功能的其他寡核苷酸模拟物。
在某些实施方案中，所述miRNA试剂是miRNA分子或其合成衍生物(例如agomir)。在一个具体实施方案中，所述miRNA试剂是miRNA。miRNA是存在于包括哺乳动物在内的多种生物体中的一类非编码的小RNA(例如，18至24个核苷酸)，并且其在进化上是保守的。miRNA通过由RNA酶III酶drosha和dicer的顺序切割来加工来源于初级转录物的约70个核苷酸的发夹前体而得到。许多miRNA可在基因间区编码，位于前mRNA的内含子中或位于ncRNA基因内。许多miRNA还倾向于成簇分布并转录为多顺反子，并且经常具有相似的时空表达模式。一般而言，miRNA是转录后调节子，其与靶基因(mRNA或DNA)上的互补序列结合，通过例如转录抑制或靶向降解来导致基因沉默。一种miRNA可同时靶向多个不同基因。用于所公开方法的示例性miRNA分子包括但不限于：hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、hsa-miR-7a-g、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-19a-b、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-miR-3658、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、and hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。在另一些实施方案中，用于所公开方法的示例性miRNA分子是本文的表1、11、13和14中所公开的miRNA。在一个特定实施方案中，所述miRNA试剂是人miR-22或其功能性衍生物。
在另一个特定实施方案中，所述miRNA试剂是agomir。可使用本文公开的筛选方法来鉴定特定miRNA的agomir。在一个特定实施方案中，agomir是人miR-22的功能模拟物(Davidson BL等，Nat.Rev.Genet.，12(5)：329-340(2011))。
在某些实施方案中，所述miRNA试剂是抑制一种或更多种miRNA活性的寡核苷酸或寡核苷酸模拟物。这样的分子实例包括但不限于antagomir、干扰RNA、反义寡核苷酸、核酶、miRNA海绵和miR-掩蔽物。在一个特定实施方案中，所述miRNA试剂是antagomir。一般而言，antagomir是经化学修饰的反义寡核苷酸，其与靶miRNA结合并通过阻止该miRNA与其同源基因靶标结合来抑制miRNA的功能。antagomir可包含本领域已知的任何碱基修饰。在一个特定实施方案中，antagomir抑制人miR-22的活性(van Rooij E等，Circ.Res.，110(3)：496-507(2012)；Snead NM等，Nucleic Acid Ther.，22(3)：139-146(2012)；Czech MP等，Nat.Rev.Endocrinol.，7(8)：473-484(2011))。
在某些实施方案中，所述miRNA试剂的长度为10至50个核苷酸。本领域普通技术人员应理解，这体现在寡核苷酸具有长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或其中任意范围个核苷酸的反义部分。
在某些实施方案中，所述miRNA试剂是嵌合寡核苷酸，其包含两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸通常包含赋予一种或更多种有益性质(例如，提高核酸酶抗性、提高进入细胞的摄取、提高与靶标的结合亲和力)的至少一个经修饰的核苷酸区域，以及作为使酶能够切割RNA：DNA或RNA：RNA杂合体(hybrid)的底物的区域。本发明的嵌合抑制性核酸可形成为由上述两种或更多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡聚核苷(oligonucleoside)和/或寡核苷酸模拟物组成的复合结构。这样的化合物在本领域也被称为杂合体或缺口体(gapmer)，教导制备这样的杂合体结构的代表性美国专利包括但不限于以下美国专利no：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；以及5,700,922，其分别通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，所述miRNA试剂包含至少一种在糖的2＇位经修饰的核苷酸，最优选经2＇-O-烷基、2＇-O-烷基-O-烷基或2＇-氟代修饰的核苷酸。在另一些优选实施方案中，RNA修饰包括嘧啶的核糖、碱基残基或RNA 3＇端的反向碱基上的2＇-氟代、2＇-氨基以及2＇-O-甲基修饰。寡核苷酸中常规地并入这样的修饰，并且这些寡核苷酸比2＇-脱氧寡核苷酸示出了针对指定靶标的更高Tm(即，更高的靶向结合亲和力)。
已经示出许多核苷酸和核苷修饰以得到更加抗核酸酶消化的寡核苷酸，从而延长体内半衰期。经修饰寡核苷酸的具体实例包括包含含有例如以下之骨架的那些：硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷酸甲酯、短链烷基或环烷基糖间键(intersugar linkage)或短链杂原子或杂环糖间键。最优选的是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷酸，所述杂原子骨架特别是：CH2-NH-O-CH2、CH2～N(CH3)～O～CH2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中天然的磷酸二酯骨架表示为O-P-O-CH)；酰胺骨架(参见De Mesmaeker等.Ace.Chem.Res.1995，28：366-374)；吗啉基骨架结构(参见Summerton和Weller，美国专利No.5,034,506)；肽核酸(PNA)骨架(其中，寡核苷酸的磷酸二酯骨架由聚酰胺骨架替代，核苷酸直接或间接与聚酰胺骨架的氮杂氮原子结合，参见Nielsen等，Science 1991，254，1497)，各自通过引用整体并入本文。含磷连接包括但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3＇亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯在内的甲基膦酸酯或其他烷基膦酸酯、次膦酸酯、包括3＇-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在内的氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硼烷磷酸酯、以及这些物质的具有正常3＇-5＇连接、2＇-5＇连接的类似物，以及具有反转极性的那些(其中相邻核苷单元对连接从3＇-5＇变成5＇-3＇或者从2＇-5＇变成5＇-2＇)；参见美国专利no.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，其各自通过引用整体并入本文。基于 吗啉基的寡聚化合物描述在Dwaine A.Braasch和DavidR.Corey，Biochemistry，2002，41(14)，4503-4510)；Genesis，2001年第30卷第3期；Heasman，J.，Dev.Biol.，2002，243，209-214；Nasevicius等，Nat.Genet.，2000，26，216-220；Lacerra等，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，9591-9596；以及1991年7月23日出版的美国专利No.5,034,506中，其各自通过引用整体并入本文。环己烯基核酸寡核苷酸模拟物描述在Wang等，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602中，其内容通过引用整体并入本文。
其中不包含磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架具有由短链烷基或环烷基核苷酸间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷酸间连接或者一种或更多种短链杂原子或杂环核苷酸间连接形成的骨架。这些包含具有以下结构的那些：吗啉基连接(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫醚、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和亚甲基硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及混合了N、O、S和CH2组成部分的其他骨架；参见美国专利no.5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437以及5,677,439,其各自通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，miRNA试剂包含一种或更多种经取代的糖部分，例如在2＇位置的以下的一种：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为1至约10；Ci至CIO低级烷基、烷氧基烷氧基、经取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；CI；Br；CN；CF3；OCF3；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷基芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；经取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告子基团；嵌入子(intercalator)基团；用于改进寡核苷酸药代动力学性质的基团；或者用于改进寡核苷酸的药代动力学/药效学性质的基团以及具有类似性质的其他取代基。优选的修饰包括2＇-甲氧基乙氧基[2＇-O-CH2CH2OCH3，也称为2＇-O-(2-甲氧基乙基)](Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78，486)。其他优选的修饰包括2＇-甲氧基(2＇-O-CH3)、2＇-丙氧基(2＇-OCH2CH2CH3)和2＇-氟代(2＇-F)。类似的修饰还可在寡核苷酸的另一些位置上发生，特别是3＇端核苷酸上糖的3＇位置和5＇端核苷酸的5＇位置。寡核苷酸还可含有糖模拟物，例如环丁基替代戊呋喃基。
在某些实施方案中，miRNA试剂包含一种或更多种碱基修饰和/或替换。本文所用的“未经修饰的”或“天然的”碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的碱基包括但不限于天然核酸中发现的仅稀有的或瞬变的碱基，例如，次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2＇脱氧胞嘧啶，并且在本领域经常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基(gentobiosyl)HMC；以及合成碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂原子取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。(Kornberg，A.，DNA Replication，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，1980，第75-77页；Gebeyehu，G.等，Nucl.Acids Res.1987，15：4513)。还可包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。还可包括5-Me-C替换。已显示，这些修饰和/或替换使核酸双链的稳定性提高了0.6OC至1.2OC。(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T和Lebleu，B.编写，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)。另一些合适的经修饰的碱基在美国专利no.3,687,808，以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692中有描述，其各自通过引用并入本文。
不需要在指定的寡核苷酸中的所有位置进行统一修饰，并且事实上，在单一的寡核苷酸中可并入多于一种前述修饰，甚至在寡核苷酸内的单一核苷酸上并入多于一种前述修饰。
在某些实施方案中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即，骨架)两者都被新基团替换。碱基单元维持与合适的核酸靶标化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已示出具有优异杂交性质的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架例如氨基乙基甘氨酸骨架替代。核碱基(nucleobase)被保留，并直接或间接与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物之制备的代表性的美国专利包括但不限于美国专利no.5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，其各自通过引用并入本文。PNA化合物的另一些教导还可见于Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500中。
在某些实施方案中，miRNA试剂(共价或非共价地)与一种或更多种增强寡核苷酸活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物连接。这样的部分包括但不限于，脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)；巯基胆固醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.，1992，20，533-538)；脂肪族链，例如十二烷基二醇或十一烷基残基(Kabanov等，FEBSLett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75，49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)；聚胺链或聚乙二醇链(Mancharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)；或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)；棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)；或十八胺或己基氨基-羰基-叔氧胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)，其各自通过引用整体并入本文。还参见美国专利no.4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，其各自通过引用整体并入本文。
在一个特定实施方案中，miRNA试剂(共价或非共价地)与核酸适配体连接。适配体是与特定靶分子结合的合成的寡核苷酸分子或肽分子。适于与本文提供的miRNA试剂一起使用的适配体在2012年8月31日提交的美国临时专利申请No.61/695,477中有描述，其通过引用整体并入本文。
因此，在第一方面，本发明提供了脂肪细胞特异性的miRNA调节剂(modulator)组合物，其包含：I)与人脂肪靶细胞上的细胞表面标记选择性结合的靶向部分，以及II)产热的miRNA调节剂部分，其中所述靶向部分促进所述靶细胞对所述miRNA调节部分的摄取以使所述miRNA能够靶向产热通路并上调所述靶细胞中的产热。
在一个实施方案中，所述组合物包含含有作为靶向部分之适配体的agomir。
在某些实施方案中，与本文公开的miRNA一起使用的适配体与脂肪组织间充质干细胞(ATMSC)、白色脂肪组织(WAT)脂肪细胞以及褐色脂肪组织(BAT)脂肪细胞上的细胞表面标记蛋白特异性结合。ATMSC的细胞表面标记包括：CD9、CD10、CD13、CD29、CD36、CD44、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD73、CD90、CD91、CD105、CD137、CD146、CD166和HLA-ABC。WAT脂肪细胞的细胞表面标记包括：脂联蛋白、窖蛋白-1、窖蛋白-2、CD36(FAT)、CLH-22(网格蛋白重链Chr22)、FABP4(脂肪细胞蛋白2，aP2)、SLC27A1(FATP1)、SLC27A2(FATP2)、GLUT4(葡萄糖转运子4)、围脂滴蛋白2或抵抗素。所有脂肪细胞的细胞表面标记包括中性溶酶(CD10)、FAT(CD36)、Thy-1(CD90)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1或CD91)、窖蛋白-1、窖蛋白-2、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、细胞表面糖蛋白MUC18(CD146)、激活的白细胞细胞粘合分子(CD166)和利尿钠肽受体A(NPR1)。根据另一些实施方案，与本文公开的miRNA一起使用的适配体还可与包括以下的脂肪组织标记特异性结合：脂联蛋白、瘦素、抵抗素、FGF 17、FGF19、BMP7、PYY、MetAP2、RBP4、内皮抑制素和制管张素。
在某些实施方案中，通过使用整个活细胞作为靶标的Cell-SELEX技术来选择适配体，借此，通过重复扩增和与活细胞结合来选择识别完整细胞表面上的天然环境中处于其天然构象的特定分子的适配体。在该基于细胞的选择中，可在其天然环境中直接靶向特定的细胞表面分子或甚至未知的膜受体，从而允许对细胞特异性适配体的直接富集。
在某些示例性实施方案中，所述miRNA调节剂与适配体组合，产生“aptamir”组合物。有许多方法来将适配体和miRNA类似物组合成产生aptamir。它们包括例如，适配体-miRNA类似物嵌合体、适配体-剪接-转换寡核苷酸嵌合体以及与含miRNA类似物的纳米颗粒或脂质体缀合的适配体。“护送适配体(Escort Aptamer)”可插入至可携带多种miRNA类似物的功能性聚合物、脂质体和纳米颗粒的表面。例如，硫代适配体缀 合的脂质体的大小为约120nm。纳米颗粒方法有几个功能优点，包括例如，细胞摄取、跨膜能力以及经触发的纳米颗粒解体。
在一个实施方案中，aptamir组合物包含直接与miRNA调节剂连接或融合的适配体。这样的aptamir完全是化学合成的，这为缀合物的组合物提供了更多的控制。例如，化学计量学(miRNA类似物/适配体的比率)和附着位点可如前文所定义。缀合物的连接部分存在充当适配体和miRNA类似物之反应附着点的多个(两个或多于两个)亲核部分和/或亲电部分。此外，所述aptamir还可包含处于所述适配体和所述miRNA类似物之间的接头。在一些实施方案中，所述接头是聚亚烷基二醇，特别是聚乙二醇。在另一些实施方案中，所述接头是脂质体、外来体、树状聚体或梳形聚合物(comb polymer)。另一些接头可介导适配体与miRNA类似物之间的缀合，包括生物素链霉素桥或核糖核酸。示例性的非共价接头包括由miRNA部分的单链部分或突出端(overhang)与适配体部分的互补性单链部分或突出端碱基配对形成的接头。
在另一个特定实施方案中，适配体与miRNA类似物组合形成基于脂质体的aptamiR。脂质体是由脂质双层形成的可加载有药物例如miRNA的球形纳米结构。此外，脂质体表面可加载有不同物质，例如，聚乙二醇(延长其系统半衰期)或分子识别部分如与靶细胞特异性结合的适配体。例如，已开发出经适配体修饰的脂质体，其中每个脂质体展示与其表面结合的约250个适配体，以促进靶向结合。在一个优选实施方案中，制造了脂质体来包封miRNA类似物并在其表面展示以高亲和力和特异性与在脂肪细胞和ATMSC表面高表达的分子(例如脂质转运蛋白)特异性结合的适配体。所述脂质体与靶细胞的融合导致miRNA类似物释放至细胞质中，然后其改变特定的细胞内通路。或者，可在脂质体表面插入稳定的硫代适配体，以引导脂质体miRNA类似物递送并加载至靶向的ATMSC和脂肪细胞中。
在另一个特定实施方案中，适配体与miRNA类似物组合组合形成基于载体的aptamiR。示例性的载体包括纳米颗粒、脂质体或外来体。这样的基于载体之aptamir组合物具有在单一的载体中将多种miRNA调节剂货物递送至靶细胞的能力。为了完成靶向和积累，将所述载体配制成在其外表面存在靶向部分以使其可与所选的靶脂肪细胞上的细胞表面抗原或受体反应/结合。例如，可将载体制造为包封miRNA调节剂同时在其表面展示以高亲和力和特异性与在脂肪细胞和ATMSC表面高表达的分子(例 如脂质转运蛋白)特异性结合的适配体。内化的外来体在细胞的细胞质中释放其miRNA类似物负载，这改变了特定的细胞内通路。
在一个实施方案中，所述载体是外来体。外来体起源于晚期内体，是天然的特异性加载蛋白质、mRNA或miRNA的纳米颗粒，其由细胞进行内源性分泌。外来体从宿主细胞释放，不具有毒性，并且可基于其组分和外来体中/上的物质向特定细胞传递信息。因为外来体是直径为约20nm至100nm的颗粒，所以，外来体避过了单核巨噬细胞系统(其清除大小＞100nm的循环颗粒)的清除，并且被非常有效地递送至靶组织。
此外，相比于其他载体，合成的外来体可提供数个优点。例如，它们直接将其货物递送至细胞溶胶中，同时，其惰性避过了细胞外环境的攻击和清除。外来体的结构组分可包括负责例如信号转导、膜转运、抗原呈递、靶向/附着等过程的小分子。
所述miRNA试剂必须充分地与靶mRNA互补，即，充分杂交并且具有足够的特异性，以得到期望的效果。“互补”是指两条包含天然或非天然碱基或其类似物的序列之间通过氢键进行配对的能力。例如，如果miRNA试剂的一个位置上的碱基能够与靶核苷酸序列的相应位置上的碱基进行氢键结合，则认为在该位置上的碱基是彼此互补的。在某些实施方案中，不要求100％的互补性。在另一些实施方案中，要求100％的互补性。
用于本文公开的方法的miRNA试剂可使用常规方法设计。虽然本文记载了某些示例性靶核酸序列和miRNA试剂的具体序列，但是本领域技术人员应意识到，这些序列仅用于举例说明和描述在本发明范围内的具体实施方案。从本公开内容的角度来看，另外的靶区段对于本领域普通技术人员来说是容易鉴定的。包含在种子序列中或与其紧邻的至少五个(5)连续核苷酸延伸的长度为5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸的靶区段被认为适于靶向基因。在一些实施方案中，靶区段可包括包含来自种子序列之一的5′端的至少5个连续核苷酸的序列(其余核苷酸为同一RNA从种子序列5′端上游紧接着开始延伸并且延续直至miRNA试剂包含约5至约30个核苷酸)。在一些实施方案中，靶区段可由包含来自种子序列之一的3′端的至少5个连续核苷酸的RNA序列来代表(其余核苷酸为同一RNA从靶区段3′端下游紧接着开始延伸并且延续直至miRNA试剂包含约5至约30个核苷酸)。通过掌握本文提供的序列，本领域技术人员将能够在不进行过度实验的情况下即可鉴定其他优选区域以靶向使用miRNA试剂。 当鉴定了一个或更多个靶标区域、区段或位点后，选择与靶标充分互补——即，充分杂交并且具有足够的特异性(即，基本不与其他非靶核酸序列结合)——的抑制性核酸化合物以得到期望的效果。
在某些实施方案中，由重组载体表达用于实施本发明的miRNA试剂。合适的重组载体包括但不限于DNA质粒、病毒载体或DNA微环。可使用本领域公知的任何合适的基因工程技术来完成载体构建体的生成，包括但不限于PCR标准技术、寡核苷酸合成、限制核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序，例如，如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.(1989)，Coffin等(Retroviruses.(1997)，以及“RNA Viruses：APractical Approach”(Alan J.Cann编写，Oxford University出版社(2000))中所述。如对本领域普通技术人员显而易见的，用于将本发明的核酸转运至细胞中的多种合适的载体是可得到的。递送核酸的合适载体的选择以及将选择的表达载体插入至细胞中的条件优化在本领域普通技术人员能力范围内，无需进行过度实验。病毒载体包含具有用于在包封细胞中生产重组病毒之序列的核苷酸序列。表达本发明核酸的病毒载体可基于包括但不局限于以下的病毒骨架来构建：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、天花病毒或甲病毒。可如本文所描述的来递送重组载体，并且其可存在于靶细胞(例如稳定的转化体)中。
在某些实施方案中，使用化学合成技术在体外合成用于实施本发明的miRNA试剂，如在例如以下文献中所述，Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)NucleicAcids Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利No.4,458,066，其各自通过引用整体并入本文。
IV.治疗方法
在一个方面，本发明提供了治疗人对象的肥胖的方法。所述方法一般包括向人对象施用有效量的调节至少一种产热调节子(例如线粒体解偶联剂，如UCP1和/或UCP2)活性的miRNA试剂。
这样的治疗方法可基于从药物基因组领域得到的知识来具体调整和修改。因此，本发明的另一个方面提供了使用本发明的靶基因分子或根据 个体的药物响应基因型的靶基因调节剂来调整个体预防性或治疗性治疗的方法。药物基因组学使得临床医生或医师能够将预防性或治疗性治疗靶向从治疗中受到最大益处的患者，并避免治疗将经历药物相关毒性副作用的患者。
可在合适的动物模型例如肥胖模型(包括ob/ob小鼠(Lindstrom P.，ScientificWorld Journal，7：666-685(2007)和db/db小鼠(Sharma K等，Am J Physiol RenalPhysiol.，284(6)：F1138-1144(2003))中测试miRNA试剂。例如，可将本文所述的miRNA试剂(或编码所述miRNA试剂的表达载体或转基因)用于动物模型中，以确定使用所述试剂治疗的效力、毒性或副作用。或者，可将治疗剂用于动物模型中以确定这样的试剂的作用机制。例如，可将miRNA试剂用于动物模型中，以确定使用此试剂治疗的效力、毒性或副作用。或者，可将试剂用于动物模型中以确定此试剂的作用机制。
本公开内容还提供了诱导前脂肪细胞分化成白色脂肪细胞和将白色脂肪细胞分化成褐色脂肪细胞的方法，其包括向前体脂肪细胞群施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30bantagomir。在某些实施方案中，使前脂肪细胞分化成脂肪细胞的诱导大于当将前脂肪细胞暴露于100nM罗格列酮两天随后暴露于维持培养基中时得到的前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。在某些实施方案中，所述脂肪细胞是褐色脂肪细胞。在另一些实施方案中，所述脂肪细胞是白色脂肪细胞。
本公开内容还提供了用于在有此需要的对象中提高胰岛素敏感性的方法，其包括向所述对象施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-miR-1agomir、hsa-miR-1antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19bantagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir。在某些实施方案中，所述对象是哺乳动物。
本公开内容还提供了引起有此需要的对象中脂肪消耗的方法，其包括向所述对象施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1agomir、hsa-miR-19b agomir和hsa-miR-30b agomir。在某些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在另一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
经修饰以增强进入细胞(例如，脂肪细胞)之摄取的miRNA试剂可 以单位剂量施用，所述单位剂量低于约每kg体重15mg，或低于每kg体重10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg，并且低于每kg体重200纳摩尔miRNA试剂(例如约4.4×1016个拷贝)，或低于每kg体重1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015纳摩尔RNA沉默试剂。单位剂量例如可通过注射(例如静脉内或肌内)、吸入剂量或局部施用来施用。特别优选的剂量为低于2、1或0.1mg/kg体重。
可以大约0.00001mg至约3mg每器官/组织，或优选约0.0001mg至0.001mg每器官/组织，约0.03mg至3.0mg每器官/组织，约0.1mg至3.0mg每器官/组织或约0.3mg至3.0mg每器官/组织的剂量直接向器官或组织(例如，直接向脂肪组织)递送miRNA试剂。所述剂量可为对治疗或预防肥胖或提高胰岛素敏感性有效的量。在一个实施方案中，以低于一天一次的频率来施用单位剂量，例如低于每2天、4天、8天或30天一次。在另一个实施方案中，不以一定频率的方式来施用单位剂量(例如，不以规律的频率)。例如，可一次施用单位剂量。在一个实施方案中，以另一些传统治疗形式来施用有效剂量。
在某些实施方案中，向对象施用miRNA试剂的初始剂量，以及一次或更多次维持剂量。维持剂量一般低于初始剂量，例如，是初始剂量的一半。维持方案可包括用每天0.01mg/kg体重至1.4mg/kg体重的剂量来治疗对象，例如，每天10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg体重。维持剂量优选施用不多于每5天、10天或30天一次。此外，治疗方案的持续时间根据具体疾病的性质、其严重性以及的总体状况(condition)而不同。在一些优选实施方案中，剂量可以不高于每天一次递送，例如不高于每24小时、36小时、48小时或更多个小时一次，例如不高于每5天或8天一次。治疗后，可监测患者的状况改变，例如体脂肪百分比的改变。在患者对现有剂量水平不显著响应的情况下可增加所述化合物的剂量，或者如果观察到体脂肪降低或观察到不期望的副作用，则可降低剂量。
如在具体情况下适当期望或考虑，有效剂量可以单次给药(dose)或以两次或或更多次给药来施用。如果期望有助于反复输注或频繁输注，可建议植入递送装置，例如泵、半永久支架(例如，皮下、静脉内、腹膜内、脑池内(intracisternal)或囊内)，或储库。在一个实施方案中，药物组合物包含多个miRNA试剂种类。在另一个实施方案中，相对于天然靶序列，miRNA试剂种类具有与另一个试剂种类不重叠或不相邻的序列。在另一个实施方案中，多个miRNA试剂种类对不同的天然靶基因具有特异性。在另一个实施方案中，所述miRNA试剂是等位基因特异性的。在另一个实施方案中，多个miRNA试剂种类靶向两种或更多种SNP等位基因(例如，两个、三个、四个、五个、六个或更多个SNP等位基因)。
在成功的治疗后，可期望使患者经历维持治疗以预防疾病状态的复发，其中，以0.01mg/kg至100mg/kg体重的维持剂量来施用本发明的化合物(参见美国专利No.6,107,094)。
所施用的miRNA试剂的浓度或量将取决于为试剂和施用方法(例如经鼻、经口腔或经肺)所确定的参数。例如，经鼻制剂倾向于需要一些组分的浓度低得多以避免刺激或灼伤鼻通道。有时期望将经口制剂稀释多达10至100倍，以提供合适的经鼻制剂。
某些因素可影响有效治疗对象所需要的剂量，这些因素包括但不限于，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康和/或年龄，以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的miRNA试剂给对象治疗可包括单次治疗，或者优选可包括系列治疗。还应理解，在具体的疗程中用于治疗的miRNA试剂的有效剂量可提高或降低。剂量的改变可从本文描述的诊断测定结果得出并变得显而易见。例如，可在施用miRNA试剂组合物后监测对象。基于监测信息，可施用额外量的miRNA试剂组合物。
给药取决于待治疗疾病病状的严重性和响应性，治疗疗程持续数天到数个月或直至实现治愈，或实现疾病状态的缓解。可通过药物在患者体内的药物积累测量值来计算优化的给药方案。本领域技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法学和重复速率。最佳剂量可根据单种化合物的相对效力而变化，并且可一般基于在动物模型体外和体内发现的有效的EC50来估计。在一些实施方案中，所述动物模型包括表达人基因(例如产生靶mRNA的基因(例如产热调节子))的转基因动物。所述转基因动物可为相应内源mRNA缺陷的。在另一个实施方案中，用于测试的组合物包含至少在一个内部区域与在所述动物模型的核酸序列和人靶核酸序列之间保守的序列互补的miRNA试剂。
一些研究已经报道了使用miRNA试剂对哺乳动物进行的成功给药。例如，Esau C，等，Cell Metabolism，3(2)：87-98(2006)报道了用miR-122反义寡核苷酸的腹膜内剂量对正常小鼠进行给药，12.5mg/kg至75mg/kg，每周两次，持续四周。小鼠在治疗结束时表现健康并且正常，未 出现体重损失或摄食减少。除了75mg/kg剂量miR-122ASO显示非常轻微的ALT和AST水平增加以外，所有剂量的血浆转氨酶水平处于正常范围内(AST3/4 45，ALT3/435)。这可推断，50mg/kg是有效的无毒性的剂量。由Krutzfeldt J.，等，Nature，438，685-689(2005)进行的另一个研究采用每kg体重80mg、160mg或240mg的总剂量将antagomir注射至小鼠中以沉默miR-122。最高剂量导致完全失去miR-122信号。在另一个研究中，成功地将锁核酸(“LNA”)施用至灵长类动物中以沉默miR-122。(Elmen J.，等，(2008)Nature 452，896-899报道，通过三次10mg/kgLNA-antimiR的给药实现了在灵长类动物中有效沉默miR-122，导致总血浆胆固醇长时间并且可逆地降低，并且研究动物不显示任何LNA相关的毒性或组织病理学改变。
在某些实施方案中，通过从重组载体表达来施用用于实施本发明的miRNA试剂。合适的重组载体包括但不限于DNA质粒、病毒载体或DNA微环。可使用本领域公知的任何合适的基因工程技术来完成载体构建体的产生，包括但不限于PCR标准技术、寡核苷酸合成、限制核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序，例如，如Sambrook等.MolecularCloning：A Laboratory Manual.(1989)，Coffin等(Retroviruses.(1997)，以及“RNA Viruses：A Practical Approach”(Alan J.Caun，Ed.，Oxford University Press(2000))中所述。如对本领域技术人员显而易见的，用于将本发明的核酸转运至细胞中的多种合适的载体是可用的。递送核酸的合适载体的选择以及将选择的表达载体插入至细胞中的条件优化在本领域技术普通人员的能力范围内，无需进行过度实验。病毒载体包含具有用于在包封细胞中产生重组病毒之序列的核苷酸序列。表达本发明核酸的病毒载体可基于包括但不限于以下的病毒骨架来构建：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、天花病毒或甲病毒。重组载体可如本文所描述的来递送，并且其可存在于靶细胞(例如稳定的转化体)中。
miRNA试剂可直接引入细胞(例如脂肪细胞)中；或以细胞外的方式引入腔、间隙(interstitial)空间中，引入生物体的循环中，经口引入，或者可通过将细胞或生物体浴在含有核酸的溶液中来引入。血管或血管外循环、血液系统或淋巴系统以及脑脊液都是可引入核酸的位点。
可使用本领域已知的递送方法来引入本发明的miRNA试剂，所述方法包括：注射含核酸的溶液，用被核酸覆盖的颗粒进行轰击，将细胞或生物体浸渍于核酸溶液中，或在核酸的存在下对细胞膜进行电穿孔。可使用 本领域已知的另外的方法来将核酸引入细胞中，例如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染例如磷酸钙等。miRNA试剂可与另一些组分(例如增强细胞摄取miRNA试剂的化合物)一起引入。
在某些实施方案中，本文描述的方法包括将miRNA试剂与另一些药剂或药物(例如用于调节产热的组合物、用于治疗糖尿病的组合物、用于治疗肥胖的组合物)共施用。用于调节产热的组合物包括β-3肾上腺素能受体激动剂、甲状腺激素、PPARG激动剂、瘦素、脂联蛋白和食欲肽。
V.筛选方法
在另一个方面，本发明提供了筛选调节产热、减少肥胖或提高胰岛素敏感性的miRNA试剂的方法。所述方法一般包括以下步骤：提供指示细胞；使所述指示细胞与受试miRNA试剂接触；以及在存在和不存在所述miRNA试剂的情况下，测定所述指示细胞中的至少一种产热调节子的表达水平和/或细胞活性，其中，所述产热调节子活性在存在所述受试miRNA试剂的情况下的改变将所述受试miRNA试剂鉴定为调节产热、减少肥胖或提高胰岛素敏感性的miRNA试剂。在某些实施方案中，所述方法包括测定产热调节子(例如UCP1、UCP2)的表达水平和/或活性的提高。所述指示细胞可为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是包含至少部分人基因组的人细胞。
在本文公开的方法中可测定任何产热调节子。示例性的产热调节子记载于表2中。在一个优选实施方案中，产热调节子是线粒体解偶联蛋白，例如UCP1和/或UCP2。
其中可测量产热调节子之活性的任何细胞都适用于本文公开的方法。示例性的细胞包括前脂肪细胞、脂肪细胞、脂肪组织来源的间充质干细胞、肝细胞、肌细胞或其前体。
可测定产热调节子的任何活性，包括但不限于，产热调节子的mRNA表达水平、蛋白质表达水平或线粒体解偶联活性。用于测定这些活性的方法是本领域公知的。
可筛选任何miRNA试剂，包括但不限于：miRNA、agomir、antagomir、aptamir、miR-掩蔽物、miRNA-海绵、siRNA(单链或双链的)、shRNA、反义寡核苷酸、核酶或与至少靶核酸的一部分杂交并调节其功能的另外的寡核苷酸模拟物。
VI.药物组合物
在一个方面，本文公开的方法可包括施用包含能够调节至少一种产热调节子活性的miRNA试剂的药物组合物和制剂。
在某些实施方案中，用可药用载剂来配制所述组合物。所述药物组合物和制剂可经肠胃外施用、经局部施用、直接施用至胃肠道(例如，经口或经直肠)，或局部施用例如经气雾剂或经皮。所述药物组合物可以任何方式配制，并且可以多种单位剂型来施用，这取决于症状或疾病以及疾病的程度、每个患者的一般用药情况、产生优选结果的施用方法等。药物的配制和施用技术上的细节在科学文献和专利文献中有很好的描述，参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，2005。
miRNA试剂可单独施用，或作为药物制剂(组合物)的组分来施用。所述化合物可以任何方便用于人医药或兽医药施用的方式进行配制。所述组合物中还可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂。
本发明的组合物制剂包括适于皮内施用、吸入施用、经口/经鼻施用、经局部施用、经肠胃外施用、经直肠施用和/或经阴道内施用的那些。所述制剂可适宜地以单位剂型存在，并且可通过任何药学领域公知的方法来制备。可与载剂材料组合以生产单一剂型的活性成分(例如本发明的核酸序列)的量可根据待治疗的宿主、具体的施用方式例如皮内或吸入而不同。可与载剂材料组合以生产单一剂型的活性成分的量一般为产生治疗效果例如抗原特定T细胞应答或体液应答的化合物的量。
本发明的药物制剂可根据本领域已知的制造药物的任何方法来制备。这样的药物可包含甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。制剂可与适合于制造的无毒可药用赋形剂掺合。制剂可包含一种或更多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，并且可以这样的形式来提供：液体剂、散剂、乳剂、冻干散剂、喷雾剂、霜剂、洗剂、受控释放的制剂、片剂、丸剂、凝胶剂、贴剂、植入物等。
用于经口施用的药物制剂可使用本领域公知的可药用载剂以适当和合适的剂量来配制。这样的载剂使药物能够配制成适于患者摄取的以下单位剂型：片剂、丸剂、散剂、糖衣剂、胶囊剂、液体剂、锭剂、凝胶剂、 糖浆剂、浆料剂、混悬剂等。用于经口使用的药物制备物可配制成固体赋形剂，任选经研磨得到混合物，并加工成混合物颗粒，在按需要添加合适的额外化合物后得到片剂或糖衣剂芯。合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括例如：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素例如甲基纤维素、羟丙甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；以及树胶，包括阿拉伯胶和西黄蓍胶；以及蛋白质，例如明胶和骨胶原。可添加崩解剂或增溶剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。适于推送(push-fit)的胶囊剂可包含混合有填料或粘合剂(例如乳糖或淀粉)，润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)，以及任选地，稳定剂。在软胶囊剂中，活性剂可溶解于或悬浮于含有或不含稳定剂的合适液体中，例如，脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。
水性混悬剂可包含混合有适于制造水性混悬剂(例如水性皮内注射剂)的活性剂(例如，本发明的核酸序列)。这样的赋形剂包括悬浮试剂，例如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶，以及分散剂或润湿剂，例如天然磷脂(例如卵磷脂)、氧化烯与脂肪酸的缩合物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、氧化乙烯与长链脂肪族醇的缩合物(例如，十七乙烯氧基十六醇)、氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。所述水性混悬剂还可包含一种或更多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对基苯甲酸正丙酯；一种或更多种着色剂；一种或更多种调味剂和一种或更多种甜味剂，例如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可调节制剂的摩尔渗透压浓度。
在某些实施方案中，使用基于油的药物来施用miRNA试剂。可通过将活性剂混悬于以下物质中来配制基于油的混悬剂：植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油；或矿物油，例如液体石蜡；或这些物质的混合物。参见例如，美国专利No.5,716,928描述了使用精油或精油组分来提高生物利用度并降低经口施用的疏水性药物化合物的个体间差异和个体内差异(另参见美国专利No.5,858,401)。油混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可添加甜味剂以提供适口的经口制剂，例如甘油、山梨醇或蔗糖。这些制剂可通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。可注射油载剂的实例参见Minto(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281：93-102。
在某些实施方案中，所述药物组合物和制剂是水包油乳剂的形式。油相可为上文描述的植物油或矿物油，或其混合物。合适的乳化剂包括天然树胶，例如阿拉伯胶和西黄蓍胶；天然磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及这些偏酯与氧化乙烯的缩合物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。所述乳剂还可包含甜味剂和调味剂，如在糖浆剂和酏剂制剂中。这样的制剂还可包含缓和剂(demulcent)、防腐剂或着色剂。在一些替代实施方案中，本发明的这些可注射水包油乳剂包含石蜡油、脱水山梨糖醇单油酸酯、乙氧基化脱水山梨糖醇单油酸酯和/或乙氧基化山梨糖醇三油酸酯。
在某些实施方案中，药物组合物和制剂通过以鼻内、眼内和阴道内的途径来施用，包括栓剂、吹入剂、散剂和气雾剂制剂(类固醇吸入剂例如参见Rohatagi(1995)J.Clin.Pharmacol.35：1187-1193；Tjwa(1995)Ann.Allergy Asthma Immunol.75：107-111)。栓剂制剂可通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述非刺激性赋形剂在常温下为固体但是在体温下为液体，因而将在体内熔化以释放药物。这样的材料为可可油和聚乙二醇。
在某些实施方案中，通过局部途径经皮递送的药物组合物和制剂配制为涂敷棒(applicator stick)、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、霜剂、软膏剂、糊剂、胶凝剂(jully)、涂剂(paint)、散剂和喷雾剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物和制剂作为微球递送，以在体内缓慢释放。例如，微球可经药物的皮内注射来施用，所述药物缓慢地经皮下释放；参见Rao(1995)J.Biomater Sci.Polym.Ed.7：623-645；作为生物可降解和可注射凝胶制剂，参见例如，Gao(1995)Pharm.Res.12：857-863(1995)；或者作为经口施用的微球，参见例如，Eyles(1997)J.Pharm.Pharmacol.49：669-674。
在某些实施方案中，所述药物组合物和制剂经肠胃外施用，例如通过静脉内(Iv)施用，或施用至体腔或器官的管腔中。这些制剂可包括溶解于可药用载剂中的活性剂溶液。可使用的可接受的载剂和溶剂有水和作为等渗氯化钠的林格液(Ringer’s solution)。此外，可使用无菌的固定油作为溶剂或混悬培养基。为此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯和甘油二酯。此外，还可在可注射剂的制备中使用脂肪酸，例如油酸。这些溶液是无菌的，并且一般不含不期望的物质。这些制剂可通过常规的公知的灭菌技术来灭菌。所述制剂可按需要包含可药用辅料物质以 接近生理学状态，例如pH调节剂(adiusting)和缓冲剂，毒性调节剂，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可大范围地不等，并且将根据所选的具体施用方式和患者的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等来选择。对于IV施用，所述制剂可为无菌的可注射制备物，例如无菌的可注射水性混悬剂或油性混悬剂。该混悬剂可使用那些合适的分散剂或润湿剂或助悬剂来配制。所述无菌的可注射制备物还可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的混悬剂，例如1，3-丁二醇溶液。所述施用可为推注输注(bolus infusion)或连续输注(例如，在指定时间段内基本无打断地引入血管中)。
在某些实施方案中，冻干所述药物化合物和制剂。包含抑制性核酸的稳定冻干制剂可通过冻干包含本发明药物和填充剂例如甘露醇、海藻糖、棉籽糖和蔗糖或其混合物的溶液来得到。用于制备稳定的冻干制剂的方法可包括冻干这样的溶液，其含有约2.5mg/mL核酸、约15mg/mL蔗糖、约19mg/mL NaCl和pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲剂。参见例如美国20040028670。
在某些实施方案中，所述药物组合物和制剂通过使用脂质体来递送。通过使用脂质体，特别是其中脂质体表面携带对靶细胞具有特异性之配体的脂质体，或以其他方式优选指向特定器官的脂质体，我们可以着重于在体内将活性剂递送至靶细胞中。参见例如，美国专利No.6,063,400；6,007,839；Al-Muhammed(1996)J.Microencapsul.13：293-306；Chonn(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6：698-708；Ostro(1989)Am.J.Hosp.Pharm.46：1576-1587。
可施用本发明制剂用于预防性和/或治疗性治疗。在某些实施方案中，对于治疗应用，可以足以治愈、缓解或部分阻止病症或其并发症的临床表现的量将组合物施用至需要降低甘油三酯水平的对象，或有罹患本文所描述的病症风险或患有所述病症的对象；该量可称为治疗有效量。例如，在某些实施方案中，以足以治疗对象的肥胖的量来施用本发明的药物组合物。
足以实现该效果的药物组合物的量是治疗有效剂量。对该应用有效的给药时间表和量(即，给药方案)将取决于多种因素，包括疾病或症状的阶段、疾病或症状的严重程度、患者健康的一般状态(state)、患者的身体状态、年龄等。在为患者计算给药方案的过程中，还将施用方式纳入考虑。
给药方案将本领域公知的药代动力学参数纳入考虑，即，活性剂的吸收速率、生物利用度、代谢、清除率等(参见例如，Hidalgo-Aragones(1996)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.58：611-617；Groning(1996)Pharmazie 51：337-341；Fotherby(1996)Contraception 54：59-69；Johnson(1995)J.Pharm.Sci.84：1144-1146；Rohatagi(1995)Pharmazie 50：610-613；Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24：103-108；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，2005)。本领域现有技术使临床医生能够为每位个体患者、活性剂和被治疗的疾病或病症来确定给药方案。为用作药物的相似组合物提供的原则可用作指导来确定施用的给药方案(即给药时间表和剂量水平)实施本发明之方法是正确的并且是适当的。制剂的单独施用或多重使用可根据例如以下来给定：所需要的剂量和频率，以及患者的耐受，每次施用后所生成的胆固醇稳态的程度和量等。制剂应当提供足够量的活性剂以有效治疗、预防或缓解病症、疾病或症状，例如治疗肥胖。
在某些实施方案中，用于经口施用的药物制剂的每日量为每千克体重约1mg至100mg每天。与经口施用相比，可使用更低的剂量施用至血流、体腔或器官的管腔中。可使用充分更高的剂量用于经局部施用或经口施用或通过散剂、喷雾剂或吸入剂来施用。用于制备能够经肠胃外或经非肠胃外施用的制剂的实际方法对本领域技术人员是已知或是显而易见的，并且这些方法在出版物例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版，2005中有着更详细的描述。
VII.例证
进一步通过以下实施例对本发明进行举例说明，这些实施例不应当解读为进一步的限制。贯穿于本申请中的序列表内容、附图以及引用的所有文献、专利和已公开的专利申请都通过引用清楚地并入本文。
此外，根据本发明，可采用本领域范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory出版社Cold Spring Harbor，New York(本文中写为“Sambrook等，1989”)；DNACloning：A Practical Approach，I卷和II卷(D.N.Glover编写，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编写，1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames和S.J.Higgins编写(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames和S.J.Higgins编写(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编写(1986)]；Immobilized Cells AndEnzymes[IRL出版社，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编写)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。
实施例1.产热调节子的计算机分析
基于对有效的科学信息和我们自己的实验数据的重要评估和回顾，选择了八十三种在产热调控中涉及到的蛋白质。基于其功能，将这些蛋白质划分为产热的激活蛋白或阻抑蛋白。这些产热调节蛋白记载于表2中。
表2.
产热调节蛋白：
使用已知的STRING 9.0数据库和预测的蛋白质相互作用(string-db.org/)来测试这83个候选分子。该相互作用包括直接(物理的)缔合和间接(功能性的)缔合；它们来自四个来源：基因组背景；高通量实验；共表达；以及现有知识。STRING定量地整合了来自这些来源的大量生物体中的相互作用数据，在可适用的情况下在这些生物体之间转移信息。所述数据库目前覆盖了来自1，133种生物体中的5，214，234个蛋白质。例如，83种产热调节子分子之间的关系以UCP1为中心，与UCP1具有直接联系或间接联系的分子可通过使用最高为0.90的置信度分数来鉴别。该关系记载于图1A的示意图中。根据该分析发现，九个分子(CEBPB、CIDEA、KDM3A、NRIP1、PRDM16、PPARG、PPARGC1A、PPKAA2和UCP2)直接与UCP1关联，而更多分子在第二级或更高程度的级上与UCP1关联。
当置信度设置在0.70分时，发现另外八个蛋白质直接与UCP1关联(AZGP1、DIO2、KLF11、KLF15、NR1H3、PPARA、PPARD和PPARGC1B)，图1B。
类似地，使用其他软件程序独立地评估这83种产热调控分子之间的相互作用。由Ingenuity Pathway Analysis(IPA)Software程序(www.ingenuity.com)预测的相互作用在图2A中示出(UCP1为黄色，激活蛋白为绿色并且阻抑蛋白为紫色)。由ReactomeFunctional Interaction(Reactome IF)Software程序(http：//wiki.reactome.org)预测的相互作用在图2B中示出(UCP1为黄色，激活蛋白为绿色并且阻抑蛋白为紫色)。IPA和Reactome IF网络与图1A和1B中记载的使用STRING程序得到的网络不同。这些算法的结果不同并不令人意外，因为它们基于不同的预设参数、信息来源和选择标准。
实施例2.相关miRNA靶标的计算机选择
为了选择适合作为miRNA试剂靶标的产热调节子，采用了数种基于互联网的资源来使miRNA与其靶标匹配(“micronome”)。示例性的工具记载于表3中。
表3.
用于选择miRNA及其靶标的示例性生物信息学工具：
具体而言，这些工具用于进行：1)整合的数据挖掘(8个工具)；2)miRNA挖掘和绘图(6个工具)；3)miRNA靶向的靶标和表达(21个工具)；4)整合的miRNA靶标和表达(13个工具))5)miRNA二级结构的预测和比较(5个工具)；6)网络搜索和分析(8个工具)；7)分子显示(4个工具)；以及8)信息整合以及开发(1个工具)。
单个基因靶标可被几种miRNA来控制，然而单个miRNA可控制数个基因靶标。已经开发了庞杂的生物信息学资源来选择与靶疾病最相关的miRNA(Gallagher IJ等，Genomemedicine.2010；Fujiki K等，BMC Biol.2009；Okada Y，等，J Androl.2010；Hao T，等，MolBiosyst.2012；Hao T，等，Mol Biosyst.2012)。然而这些算法的结果严重依赖于预设参数，并且这些算法之间的会聚程度十分有限。因此，需要开发出更好的对鉴定miRNA/靶标关系具有改进的灵敏性、特异性和选择性的进行生物信息学分析的工具。
miRNA与其靶标之间的相互作用超出了作为转录后调节子的miRNA的初始描述，所述转录后调节子的驱动链(driver strand)的种子区域(5′碱基2位至7位)与靶mRNA的3′UTR区的互补序列结合，通常导致翻译抑制、靶标降解和基因沉默。所述相互作用还可包含miRNA的驱动链或过客链的多个区域以及mRNA的5′UTR、启动子和编码区。
根据对可用数据的分析，决定选择靶向一个离散的信号通路中多个基因的通路特异性miRNA，而不是在许多信号通路、功能或过程中涉及到的通用miRNA。通过使用34种可公开获取的互联网工具预测miRNA靶标，检索可潜在地调节实施例1中所选的83个产热调控分子(其中包括36个转录因子)中的数个靶标的特异性人miRNA。
考虑的数个范例：
A)一种微小RNA-多种mRNA通路特异性的范例
A1.一种小RNA-多种RNA通路特异性的范例的第一个实施例
组蛋白的甲基化状态可通过组蛋白甲基化转移酶和去甲基化酶来动态调控。人赖氨酸(K)特异性去甲基化酶3A(KDM3A)在代谢基因的表达调控中是至关重要的。其功能的缺失导致小鼠的肥胖和高脂血症。与UCP1基因的PPAR应答元件(PPRE)结合的KDM3A的β-肾上腺素能刺激不仅降低在PPRE的H3K9me2(对组蛋白H3的第9位赖氨酸进行二甲基化)水平，而且还促使PPARG和RXRA以及其共激活蛋白PPARGC1A、CREBBP和NCOA1募集至PPRE。TargetScan Human数据库(release 6.0)的查询显示，人KDM3A 3′UTR的29位至35位区域是hsa-miR-22的保守靶标。数种其他miRNA靶标数据库也确认了hsa-miR-22与KDM3A之间的该匹配。因此，通过hsa-miR-22antagomir使去甲基化酶KDM3A的产量提高将导致UCP1基因启动子区的去甲基化，从而促进数种调控元件的结合，并提高UCP1的产量。
此外，我们使用了34种miRNA靶标和表达工具(表4)来鉴定指定miRNA的mRNA靶标。
表4.
用于选择miRNA及其靶标的生物信息学工具：
通过应用上述计算机策略发现，hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p分别与所选83种产热靶标中的总共42种和8种相互作用。该数据记载于表5中。
表5.
鉴定为hsa-miR-22的预测靶标和/或已证实靶标的产热调节子：
A2.一种微小RNA-多mRNA通路特异性的范例的另一些实施例
我们还利用34种miRNA靶标和表达工具(表4)来寻找脂肪细胞的536种miRNA(表1)中的任意一种与83种产热靶标(表2)之间的潜在关系。
显示许多脂肪细胞miRNA与所述83种产热靶标中的至少一种相互作用(预测和/或证实)。例如miR-17-3p和hsa-miR-17-5p分别与所选83种产热靶标中的总共23种和65种相互作用。该数据记载于表6中。
表6.
鉴定为hsa-miR-17的预测和/或已证实的靶标的产热调节子：
当制作出目的miRNA及其mRNA靶标的清单后，使用以下过滤条件来提炼结果：
参数
1 目的组织/细胞中miRNA的表达
2 预测指定基因或基因组的一种miRNA的算法数量
3 来自算法的评分/百分比
4 由一种miRNA靶向的优选基因数量
5 靶基因中一种miRNA的结合位点数量
6 靶基因中数种miRNA的结合位点数量
7 靶基因中一种miRNA种子互补序列的过呈现(over-representation)(miRvestigator)
8 经证实的miRNA-mRNA靶标对
9 miRNA结合位点的基因位置(5’UTR-启动子-CDS-3’UTR)
10 miRNA的内含子位置
11 miRNA的聚类
12 在目的特异性组织/细胞中miRNA的丰度
使用以上参数发现，229种miRNA满足这些标准中的至少两种。该数据记载于表7中。
表7.
根据选择标准数目减少的miRNA排序：
B)多种微小RNA-一种mRNA范例.
B1.包括UCP1的一个示例性的多种miRNA-一种mRNA范例。
在脂肪细胞中，最关键的产热调节子是UCP1(也称为产热素)，并且因此，所有产热调节子必须最终影响UCP1活性。UCP1是产生质子跨线粒体内膜泄漏从而使氧化磷酸化与ATP合成解偶联的线粒体转运蛋白。因此，能量以热的形式散失(适应性产热)(参见图5)Lowell等，Nature(2000)；Friedman等，Bioinformatics(2010)；Hsu等，Nucleic acidsresearch(2011)；Rieger等，Frontiers in Genetics(2011))。
UCP1生物合成主要受到转录水平的控制。图6描述了由其他示例性产热调节子对UCP1的转录调控。UCP1基因的启动子区包含许多不同的调控位点，允许多种蛋白质正性(参见图7a)和负性(参见图7b)地影 响其转录。
孟德尔随机化是一种在非实验研究中使用已知功能基因中测量的变化来检查可变的暴露对疾病的因果效应。孟德尔随机化可视为“天然的”随机化临床试验。
据报道，UCP1基因的遗传多态性(例如UCP1的外显子2的启动子中-3826A/G单核苷酸多态性)与mRNA的表达降低及肥胖有关。基因型为G/G的健康儿童对高脂肪膳食和急性冷暴露具有较低的产热能力。年轻女性中，相同的-3826A/G UCP1遗传多态性降低静息能力消耗，并降低热调控交感神经系统的活性。在367位韩国女性的研究中，在优势模型(dominantmodel)中-3826A＞G的G等位基因和-412A＞C的C等位基因与大面积的腹部皮下脂肪显著相关(分别为，p＜0.001和p＜0.0004)；它们组合到一起(ht2[GC])提高了该显著性(p＜0.00005)。针对100名重度肥胖(BMI＞40kg/m2)的成年人和100名正常体重的对照对象(BMI范围＝19kg/m2至24.9kg/m2)的研究鉴定了UCP1基因启动子区的7个突变、内含子区的4个突变和外显子区的4个突变。这些突变可促进肥胖的产生，具体而言，g.-451C＞T，g.940G＞A，以及g.IVS4-208T＞G可表示促进能量储存的“节约(thrifty)”因子。最后，位于UCP1基因上游启动子区的两种多态性(A-3826G和C-3740A)影响基因表达，并且与人类的长寿相关。
所有前述信息都支持将靶向UCP1的表达和活性作为改变适应性产热并从而治疗人类肥胖的有意义的方法。可实施许多策略来达到实现该目的，但是，本发明方法采用的一种策略中使用miRNA试剂来同时调节产热通路中的数个元件以提高UCP1的合成和活性。miRNA与UCP1基因之间的直接相互作用和间接相互作用都被考虑。直接相互作用意为，miRNA与UCP1基因的多个区域直接结合，导致UCP1mRNA的转录、翻译、稳定性和/或降解发生改变。间接相互作用意为，miRNA改变产热mRNA的转录、翻译、稳定性和/或降解，所述产热mRNA表达的蛋白质改变UCP1基因的转录。另外，间接相互作用意为，miRNA改变修饰UCP1基因转录的其他miRNA的转录、翻译、稳定性和/或降解。
人UCP1基因(gi|237858805|ref|NG_012139.1|人解偶联蛋白1(线粒体，质子载体)(UCP1)，4号染色体上的RefSeqGene)的启动子区特别富含调控元件基序(表8)。
表8.
UCP1基因调控元件：
表8A描述了人UCP1基因的15,910碱基对(bp)(FASTA登录号：＞gi|237858805|ref|NG_012139.1|人解偶联蛋白1(线粒体、质子载体)(UCP1)，4号染色体上的RefSeqGene；NCBI参考序列：NG_012139.1)中这些多种调控元件相对于第5,001位核酸的UCP1转录起始位点的位置。
由miRNA直接或间接激活或抑制这些调控元件将导致UCP1基因表 达和活性的改变。在正常条件下，UCP1基因表达和活性受到丰富的调控元件网络抑制，以避免能量浪费。在胁迫条件下，例如暴露于冷环境，UCP1基因表达通过处于数种miRNA调控下的多种激活蛋白和阻抑蛋白上调。
用数种程序(包括microRNA.org)进行的靶向人UCP1 3’UTR之miRNA的初始调查是阴性的。然而，另一些程序，包括MicroCosm Targets，使用UCP1 Ensembl的1,462碱基对的转录物ENST00000262999作为靶标揭示出在UCP1 3’UTR中的28个位置上的27种miRNA的结合位点，其在表9中示出。
表9.
使用microCosm Targets确定的UCP1(NCBI参考序列NG_012139.1)的3’UTR中miRNA的结合位点：
另一些程序，例如miRWalk、miRGen、miRGator-miRanda和DIANA microT，使用UCP1Ensembl的1,462碱基对转录物(ENST00000262999)、UCP1 Ensembl的9,371碱基对基因序列(ENSG00000109424)或所述15,910碱基对UCP1序列(NCBI引用序列：NG_012139.1)作为靶标揭示出在UCP1 3’UTR的69个位置上总共50种miRNA的结合位点，其在表10中示出。
表10.
根据数种程序的UCP1(NCBI引用序列NG_012139.1)的3’UTR中miRNA的结合位点：
将人UCP1基因与数种miRNA序列的序列比对得到在UCP1基因的5’UTR、启动子区和编码区中的匹配。集成可公开获取的互联网工具预测靶向UCP1基因多个区域之miRNA诱发的数个命中(hit)。出乎意料的是，这些预测工具之间的重叠为零，如图3所示。
然而，使用比对程序Geneious筛选miRNA数据库。发现了总共191个人微小RNA，其在UCP1基因序列中具有450个互补结合位点(表11)。匹配的长度为7个碱基至12个碱基(例如，hsa-miR-24-2-5p和hsa-miR-192-5p)。每个miRNA的命中数为1至若干个不等(例如，hsa-miR-19b2有9个(丰富的脂肪细胞miRNA)，hsa-miR-26a-2-3p有14个，hsa-miR-181c有11个，并且hsa-miR-620有12个)。
表11.
在UCP1基因序列(NCBI参考序列：NG_012139.1)中具有预测的结合位点的miRNA：
B2.包括UCP2的另一个示例性的多种miRNA-一种mRNA范例。
UCP2是在WAT、骨骼肌、胰岛和中枢神经系统中表达的线粒体转运蛋白。与UCP1一样，其制造跨线粒体内膜的质子泄漏，从而使氧化磷酸化与ATP合成解偶联(适应性产热，参见图5)(Lowell等，Nature(2000))。
两个最近的元-分析报道了UCP2启动子区的多态性与肥胖之间的关联(Liu等，Gene(2013)；Andersen等，Int.J.Obes.(2013))。第一个元-分析包括14个研究(7,647个案例和11,322个对照)，并得出以下结论，在UCP2-866G/A多态性的A等位基因与肥胖风险的降低之间有显著的关联，特别是在欧洲人群中。在第二个元-分析中包括12,984位对象，常见的UCP2-866G等位基因与肥胖有关。在17,636位丹麦对象中，同样的UCP2-866G等位基因与胰岛素敏感性的降低有关。在一个研究中，在具有GG表型的对象中，内脏脂肪中UCP2的mRNA水平降低(Esterbauer等，Nat.Genet.(2001))。在另一个研究中发现了皮下脂肪细胞UCP2mRNA与体脂肪百分比之间的负相关趋势(Wang等，American Journal of Physiol.(2004))。该信息支持将靶向UCP2的表达和活性作为改变适应性产热并从而治疗人肥胖的有意义的方法。可实施许多策略来达到实现该目的，但是，本发明方法采用的一种策略中使用miRNA试剂来同时调节产热通路中的数个元件以提高UCP2的合成和活性。考虑miRNA与UCP2基因之间的直接相互作用和间接相互作用二者。直接相互作用意为，miRNA与UCP2基因的多个区域直接结合，导致UCP1mRNA的转录、翻译、稳定性和/或降解发生改变。间接相互作用意为，miRNA改变产热mRNA的转录、翻译、稳定性和/或降解，所述产热mRNA表达的蛋白质改变UCP2基因的转录。此外，间接相互作用意为，miRNA改变修饰UCP2基因之转录的其他miRNA转录、翻译、稳定性和/或降解。
人UCP2基因(ENSG00000175567，人解偶联蛋白2(线粒体，质子载体)(UCP2)，11号染色体上的RefSeqGene)的启动子区富含调控元件基序(表12)。
表12.
UCP2基因调控元件：
表8B描述了人UCP2基因的15,174碱基对(bp)中这些多种调控元件相对于第5,001位核酸的UCP2转录起始位点的位置。由miRNA直接 或间接激活或抑制这些调控元件将导致UCP2基因表达和活性的改变。
用数个预测程序使用UCP2Ensembl 2,113碱基对转录物ENST00000310473作为靶标进行的miRNA靶向人UCP2 3’UTR的调查显示了161个miRNAs的结合位点，其在表13中示出。
表13.
UCP2转录物序列3’UTR中具有预测的结合位点的miRNA：
此外，用数个预测程序使用包含5,000bp 5’UTR的人UCP2基因(ENSG00000175567，15,174碱基对(bp))作为靶标进行的miRNA靶向人UCP2 5’UTR的调查揭示了在UCP2的5’UTR中的54个miRNA结合位点，其在表14中示出。
表14.
在UCP2基因序列之5’UTR中具有预测的结合位点的miRNA：
C)多种微小RNA-多种mRNA范例。
在从表2中选择的83种产热调控分子中筛选高严谨性的多种miRNA-多种mRNA关联。用7种主要的预测工具进行的这些分析的结果在图4中示出。这7种工具的联合产生了4439个miRNA-基因对。随着工具数量的增加，这些工具之间的重叠降低，当考虑7种工具时，达到仅15个miRNA-基因对。
D)共调控的mRNA靶标范例中的一个微小RNA种子序列基序的过呈现。
可使用数种方法来鉴定通路特异性的miRNA。例如，检索推定为共调控基因的3’-UTR的来自miRNA种子区的过呈现序列可鉴定共有的调控miRNA。为了确定特定的miRNA种子序列是否在所选择的83种产热靶标的3’UTR中过呈现，使用miRvestigator网络应用(miRvestigator.systemsbiology.net/)。使用以下参数(基序大小为8bp，默认Weeder模式，种子模式为8聚体，100％的互补同源性，以及允许0.25的摆动碱基配对)，其确定，如在表15中所示，由hsa-miR-19a/19b识别的基序5’-UUUGUACA-3’在83种产热靶标的15种中过呈现，互补性p值为1.7×10-04。应注意，据报道，hsa-miR-19是丰富的人脂肪细胞miRNA。
表15.
共有基序UUUGUACA与hsa-miR-19a/19b之间的互补性：
通过miRvestigator鉴定，hsa-miR-19 mRNA/miRNA双链的最小自由能水平十分低，倾向于紧密结合。因此，使用较低的互补性严谨水平来重复miRvestigator分析。该分析还鉴定了与hsa-miR-19基序具有95％相似度至一致的10种另外的靶标(CEBPD、PRKAA1、TWIST1、IRS1、NCOA1、NCOA2、NCOA3、KLF5、RPS6KB1、NRIP1)。有趣的是，hsa-miR-19是脂肪组织组织中最丰富的miRNA之一。鉴定为包含hsa-miR-19种子区域的互补序列的基因记载于表16中。
表16.
鉴定为hsa-miR-19之靶标的产热调节子：
因此，以更低的互补性严谨水平(基序大小为8bp，默认Weeder模式，种子模式为8聚体，95％的互补同源性，以及允许0.25的摆动碱基配对)来重复miRvestigator分析。该分析还鉴定了与hsa-miR-19基序具有95％相似度至一致的10至12种另外的靶标(CEBPD、CREB1、 PRKAA1、TWIST1、INSR、IRS1、NCOA1、NCOA2、NCOA3、KLF5、RPS6KB1、NRIP1)。有趣的是，hsa-miR-19是脂肪组织组织中最丰富的miRNA之一。鉴定为包含hsa-miR-19种子区域之互补序列的基因记载于表17中。
表17.
鉴定为hsa-miR-19a/b的靶标，与共有基序有95％至100％相似度的产热调节子：
在没有摆动的情况下，相同的基序5’-UUUGUACA-3’在hsa-miR-1283的靶标中过呈现，互补性p值为1.4×104。此外，hsa-miR-1283与和遗传性的人类肥胖有关的另一些目的mRNA如ABCA1(胆固醇转运蛋白)、脂联素受体以及转录因子TCF7L2结合。
类似地，对在脂肪细胞中表达的miRNA鉴定了过呈现种子序列的另一些miRNA。它们包括通用hsa-let-7家族(序列CUAUACAA，p值＝7.5e-04)，以及脂肪细胞中富含的hsa-miR-30家族(序列UGUAAACA，p值＝1.9×10-3)等。
相对于根据STRING软件包与UCP1直接相连的PRDM16、CIDEA、NRIP1、KDM3A、CEPPB、PPARG、PPARGC1A和PPKAA2，似乎它们都和数个miRNA共享(基序大小8bp，默认Weeder模式，晶种模式8聚体，95％的互补同源性，以及0.25的摆动碱基配对允许)一个共有序列，所述miRNA包括hsa-miR-3658(p值＝1.9e-003)和hsa-miR30家族(p值＝6.3e-003)，如下所示：
hsa-miR-3658：
hsa-miR-30a/b/c/d/e：
E)内含子miRNA-多种mRNA通路特异性的范例。
许多哺乳动物miRNA位于蛋白编码基因的内含子中，而不是其本身的特有的转录单元中。内含子miRNA通常与它们所处在的前体mRNA一起表达和加工。虽然可对内含子miRNA和它们的宿主基因进行独立调控，但内含子miRNA可通过靶向宿主基因的UTR来下调其本身的宿主蛋白质编码基因。通过选择作为miRNA靶向的转录因子或通过内含子miRNA宿主基因产物与miRNA靶基因产品之间的蛋白质-蛋白质相互作用可实现宿主蛋白编码基因的反馈调控。例如，miR-33与SREBP宿主基因配合作用以控制胆固醇稳态，并且miR-33a和miR-33b的药物抑制是提高血浆HDL和低级VLDL甘油三酯水平以治疗血脂异常的有前景的治疗策略。
83种产热靶基因的检验揭示出两种内含子miRNA：位于PPARGC1B基因中的miR-378，和位于PRDM16基因中的miR-4251。
预测miRNA靶标的互联网工具的挖掘显示，miR-378靶标包括BMP2、PPARA、PPARGC1A、PRDM16、STAT5和WNT10A，以及ADIPOQ和IGFR1；并且miR-4251靶标包括BMP2、CTBP1、CTBP2、MAPK14、NCOA3、PLAC8、PPARA、PPARD、TRPM8以及ABCA5、ABCA13、ADIPOQR2、KDM5B、KLF-12、KLF-14和TCF7L2。
实施例3.高内涵细胞表型筛选
使用高内涵筛选方法来筛选调节产热调节子(例如UCP1和UCP2)活性的新miRNA试剂。高内涵筛选是使用活细胞图像以辅助分子发现的药物发现方法。这样的基于自动成像的筛选方法特别适用于鉴定改变细胞表型的试剂。
WAT细胞包含大脂滴，而相反地，BAT细胞包含许多较小的滴和较多数目的线粒体，所述线粒体包含铁并使其呈现棕色。与WAT相比，BAT中的大量线粒体导致氧消耗的增加。因此，可基于其细胞表型来视觉地区分BAT细胞和WAT细胞。
因此，高内涵筛选方法用于筛选调节产热调节子活性的新miRNA。具体地，通过经培养的细胞的相差显微术、测量细胞脂质含量(使用油红O染色或尼罗红荧光染色)；线粒体含量(例如，使用Life Technologies Mito-Tracker Red FM)，和/或体外氧消耗(例如，使用Seahorse Bioscience Extra-Cellular Flux Instrument)来评估在存在或不存在miRNA激动剂或拮抗剂的情况下生长的经培养的人脂肪细胞和来源于间充质干细胞的脂肪组织，持续两周。通过靶向的q-RT-PCR、NanoString和通用RNA测序来测量mRNA表达。由通过靶向的Western印迹和通用蛋白质组学分析(proteomic profiling)来测量蛋白质表达。
A.人前脂肪细胞分化成脂肪细胞。
1.分化方案。
为了评估miRNA类似物对人前脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞的影响，在第0天将人皮下的前脂肪细胞(来自8名女性供体的SuperLot 0048，ZenBio，NC)平板接种于96孔板上，并使其在前脂肪细胞培养基(DMEM/Ham’s F-12(1∶1，v/v)、HEPES缓冲剂、胎牛血清和抗生素)中附着过夜。次日(第1天)，去除该培养基，并用分化培养基(DMEM/Ham’s F-12(1∶1，v/v)，100μM抗坏血酸，0.85μM胰岛素，20nM亚硒酸钠，0.2nM三-碘甲状腺原氨酸，1μM地塞米松，100μM异丁基-甲基黄嘌呤，100nM罗格列酮和抗生素)更换。将细胞于37℃，5％CO2中孵育2天。两天后(第3天)，去除该培养基，并用新鲜维持培养基(DMEM/Ham’s F-12(1∶1，v/v)，100μM抗坏血酸，0.85μM胰岛素，20nM亚硒酸钠，0.2nM三-碘甲状腺原氨酸和抗生素)更换。在第3天，用miRNA类似物(Dharmacon特异性miRIDIAN模拟物和发夹抑制剂)，使用转染试剂Dharmafect1转染细胞。所有处理为一式三份。在转染后，阴性对照为仅维持培养基，并且阳性对照为具有100nM PPARG激动剂罗格列酮的维持培养基。2天后，去除培养基，并用新鲜的维持培养基替换。然后，每两天更换维持培养基，直至处理时间结束(第15天)。在处理结束时(总共培养15天)，将细胞加工用于表型筛选和基 因型筛选。
2.前脂肪细胞的转染.
使用转染试剂促进miRNA类似物渗透进靶细胞中。例如，本文中描述了我们用转染试剂Dharmafect 1(Dharmacon，CO)在前脂肪细胞中实现的转染效率的范围。通过两种方式来评估转染效率：
a.用荧光miRNA类似物转染后测量细胞的表面荧光。
在第15天测量第3天用Dy547标记的非靶向miRIDIAN模拟物和发夹抑制剂(100nM)转染的细胞中的荧光(540激发/590发射)。如图9所示，用荧光miRNA类似物转染的细胞具有显著更强的荧光，甚至在转染后第12天亦如此：
b.对照基因表达的降低。
为了确认前脂肪细胞的成功转染，在用GAPDH特异性siRNA转染前脂肪细胞后4天(第7天)(图10A)和12天(第15天)(图10B)测量对照基因GAPDH(“管家基因”)的表达降低。得到细胞裂解物，并使用通过细胞-至-Ct试剂得到的纯RNA来进行RT-PCR。在转染后第4天和第12天观察到GAPDH mRNA表达的91％和86％敲除，这两者都是高度显著的，如图10A和10B所示。
3.在人前脂肪细胞分化成脂肪细胞过程中的表型变化.
在处理结束时(培养的第15天)，用油红O对细胞进行染色来评估脂质含量。如图11A至11F所示，在不含罗格列酮的培养基存在的情况下，前脂肪细胞显示基本没有分化成加载有脂质的成熟脂肪细胞。在含有100nM罗格列酮的分化培养基的存在下保持两天，随后在维持培养基中保持12天(阴性对照)，观察到一些分化成加载有脂质的成熟脂肪细胞。在整个实验中100nM罗格列酮都存在的情况下(阳性对照)，大多数细胞变成加载有脂质的成熟脂肪细胞。例如，在25nM hsa-miR-30b模拟物存在的情况下，约一半的细胞变成加载有脂质的成熟脂肪细胞。非靶向miRNA模拟物和抑制剂示出与阴性对照相似的模式。
4.在人前脂肪细胞分化成脂肪细胞过程中的基因型变化.
通过RNA-Seq技术来进行在人前脂肪细胞由罗格列酮或miRNA类似物诱导分化成成熟脂肪细胞期间发生的mRNA变化的作图。小RNA 测序(RNA-Seq)是一种高通量的新一代测序平台，其现在允许在不需要在先的序列或二级结构信息的情况下对所有小RNA(已知或未知)进行转录组宽度的作图。
从前脂肪细胞(前脂肪细胞阴性对照)和在100nM罗格列酮(分化阳性对照)或25nMmiRNA模拟物或抑制剂的存在下培养12天的前脂肪细胞中提取RNA样品。使用Illumina Hi-Seq 2000设备进行RNA测序。将结果针对人基因组19进行作图(http：//genome.ucsc.edu/)。似乎在miRNA类似物的存在下，相对于前脂肪细胞，313至449个mRNA存在显著差异的表达。相对于罗格列酮，显著差异表达的基因数减少111至216个，从而提示miRNA和PPARG类似物之间激活脂肪细胞分化的共同通路。
关于我们的83种产热激活蛋白和抑制剂，其中73种的表达在罗格列酮或miRNA类似物的存在下改变。在罗格列酮的存在下(图12A)，或在miRNA类似物hsa-let-7a抑制剂、hsa-miR-1模拟物、hsa-miR-19b模拟物、hsa-miR-30b模拟物或对照脂肪细胞的存在下，产热靶标mRNA表达的改变分别在图12B至12F中示出。
在罗格列酮或miRNA类似物的存在下，还测量了UCP1、UCP2和UCP3的mRNA表达的改变，如下文表18所示。
表18.
产热mRNA表达的变化：
这三种解偶联蛋白的表达水平在前脂肪细胞中低。在隔天随培养基更换的100nM罗格列酮的存在下，UCP1的表达显著升高。随miRNA类似物的UCP1 mRNA的升高幅度低于罗格列酮，但是我们必须记住所使用的miRNA类似物浓度(25nM)，以及仅在RNA提取12天前进行了 一次转染的事实。主要发现的是，在罗格列酮以及miRNA类似物的存在下UCP2表达大幅升高。UCP3的表达在任何条件下都没有变化，如所预期的，其是主要在肌细胞中表达的基因。UCP1和UCP2表达的该升高说明，施用这些miRNA使得细胞分化成具有更大产热潜力的脂肪细胞，因此这些miRNA很可能是用于治疗肥胖和另一些代谢疾病或病症的有效药物。
此外，我们观察了在miRNA类似物的存在下前脂肪细胞培养期间差异表达的基因。例如在图13中所示，作了M-A图以显示在维持培养基中生长的前脂肪细胞和在hsa-miR-19b模拟物的存在下生长的前脂肪细胞之间mRNA表达的差异。x轴是平均基因表达，并且y轴是成对之间在对数级上的差值。红点是差异表达的基因(上调大于0并且下调小于0)。灰点是对照和hsa-miR-19b模拟物之间没有差异表达的基因(上调大于0并且下调小于0)。
例如在图14中所示，相对于在仅维持培养基培养的前脂肪细胞，在miRNA类似物hsa-let-7a抑制剂、hsa-miR-1模拟物、hsa-miR-19b模拟物和hsa-miR-30b模拟物的存在下显著差异表达的基因数目分别是406、382、370和433。127个基因的组被这4种miRNA类似物共同上调(维恩图，图14)。
它们不仅包括我们的83种产热靶标中的一些如ALDH1A1、AZGP1、CEBPA、PPARGC1A、UCP1和UCP2，还包括脂类代谢和脂肪细胞分化中涉及的许多基因(表19)。
表19.
被4种miRNA类似物共同上调的127个基因的组：
60个基因的组被这4种miRNA类似物共同下调(维恩图，图15)。
它们包括许多趋化因子基因以及细胞增殖中涉及的基因(表20)。
表20.
被4种miRNA类似物共同下调的60个基因的组：
ACTC1 CENPF ID1 KRTAP2-1
ANLN CKAP2L ID3 MALL
ARSI CXCL1 IER3 MMP3
ATOH8 CXCL2 IL13RA2 NCAPH
AURKB CXCL3 IL6 PHLDA1
BLM CXCL5 IL8 PLK1
BRCA2 CXCL6 INHBA PPAPDC1A
BUB1 E2F7 IQGAP3 PTGS2
BUB1B ESCO2 KIAA1244 RELN
CASC5 FAM83D KIF11 SHCBP1
CCL26 GABBR2 KIF14 SLC17A9
CDC6 GREM2 KIF18B SLC6A17
CDCA5 GTSE1 KIF2C THBD
CDCA8 HAS1 KIFC1 TMSL3
CDH15 HJURP KRT34 top2A
B.人白色脂肪细胞分化成褐色脂肪细胞。
1.分化方案。
为了评估miRNA类似物对人白色脂肪细胞分化成褐色脂肪细胞的影响，在第0天将人皮下的前脂肪细胞(来自8名女性供体的SuperLot 0048，ZenBio，NC)平板接种于96孔板上，并使其在前脂肪细胞培养基(DMEM/Ham’s F-12(1∶1，v/v)、HEPES缓冲剂、胎牛血清和抗生素)中附着过夜。在下一天(第1天)，去除该培养基，并用分化培养基-2(DMEM/Ham’s F-12(1∶1，v/v)、HEPES缓冲剂、胎牛血清、生物素、泛酸盐/酯、人胰岛素、地塞米松、异丁基-甲基黄嘌呤、专利的PPARG激动剂和抗生素)更换。使细胞于37℃，5％CO2中孵育7天。7天后(第7天)，用AM-1脂肪细胞维持培养基(DMEM/Ham’s F-12(1∶1，v/v)、HEPES缓冲剂、胎牛血清、生物素、泛酸盐/酯、人胰岛素、地塞米松和抗生素)更换部分培养基。使细胞于37℃，5％CO2中再孵育7天。在第17天，用miRNA类似物(Dharmacon特异性miRIDIAN模拟物和抑制剂)，使用转染试剂Dharmafect 3转染细胞。所有处理一式三份进行。在转染后，阴性对照为仅维持培养基，并且阳性对照为具有100nM PPARG激动剂罗格列酮的维持培养基。2天后，去除培养基，并用新鲜的维持培养基替换。然后，每2至3天更换维持培养基，直至处理持续时间结束(第30天)。在处理结束时(总共培养30天)，将细胞加工用于表型筛选和基因型筛选。
2.脂肪细胞的转染。
使用转染试剂以促进miRNA类似物渗透进靶细胞中。
例如，本文中描述了我们用转染试剂Dharmafect 3(Dharmacon，CO)在脂肪细胞中实现的转染效率的范围。通过两种方式来评估转染效率：
a.用荧光miRNA类似物转染后测量细胞表面荧光。
在第30天测量第17天用Dy547标记的非靶向miRIDIAN模拟物和发夹抑制剂(100nM)转染的细胞中的荧光(540激发/590发射)。如图16所示，用荧光miRNA类似物转染的细胞具有显著更强的荧光，甚至在转染后第12天亦如此。
b.对照基因表达的降低。
为了确认脂肪细胞的成功转染，在用GAPDH特异性siRNA进行的Dharmafect3(Dharmacon，CO)介导的脂肪细胞转染后4天(第22天)和12天(第30天)测量对照基因GAPDH(“管家基因”)的表达降低。得到细胞裂解物，并使用通过细胞-至-Ct试剂得到的纯RNA来进行RT-PCR。用转染试剂Dharmafect 3实现了对成熟脂肪细胞(已知难以进行转染的细胞类型)的有效转染，在转染后第4天和第12天观察到GAPDH mRNA表达的54％和71％敲除，这两者都是高度显著的，如图17所示。
3.将人脂肪细胞维持在培养物中30天的过程中表型的变化。
在处理结束时(总培养30天)，用油红O对细胞进行染色来评估脂质含量(图18)。在第16天至第30天仅维持培养基的存在下(对照)，脂肪细胞表现出加载有大脂滴。在100nM罗格列酮整个实验过程中都存在的情况下(阳性对照)，红色染色的强度似乎降低了，并且脂滴看起来更小。例如，在25nM hsa-miR-30b模拟物存在的情况下，红色染色似乎也降低了，并且脂滴看起来更小。在非靶向miRNA类似物存在的情况下，未观察到这样的变化。
用荧光尼罗红染料测量第30天存在于成熟脂肪细胞中的脂质的量。如图19所示，在第15天至第30天不暴露于罗格列酮的脂肪细胞中观察到最高荧光。在用非靶向miRNA模拟物和抑制剂转染的细胞中观察到相似的荧光水平。当将细胞暴露于罗格列酮两天时，荧光显著下降，并且在第15天至第30天存在罗格列酮的情况下，荧光进一步降低。看起来在受试的miRNA抑制剂存在的情况下，荧光水平处于用罗格列酮2天至贯穿实验所观察到的范围内。在miRNA模拟物存在的情况下，荧光水平看起来更低，指示更低的脂质含量。
4.人成熟脂肪细胞转染的优化。
已知成熟脂肪细胞有效转染是难以实现的，我们测试了11种不同转染试剂，并且评估了对照基因GAPDH的mRNA表达的降低程度。将人皮下前脂肪细胞平板接种于6孔板中，并根据上文描述的方案分化两周。然后，根据其制造商的操作方案使用转染试剂将靶向GAPDH的miRNA模拟物(50nM)引入分化的脂肪细胞。将经转染的细胞用试剂和miRNA模拟物孵育72小时，然后转移至维持培养基。转染14天后，使用GAPDHRNeasy Mini试剂盒分离RNA，并且在使用每孔100ng cDNA一式三份对对照基因GAPDH和参考基因18S进行RT-PCR反应。
除了在实验条件下可产生潜在细胞毒性的转染试剂TransIT TKO和TransITsiQuest外，每个孔提取的RNA的量非常相似(图20)。
用Dharmafect 1和siPORT NeoFX转染的细胞具有显著降低的18S表达水平，并且从RT-PCR实验分析中排除。在余下的7种转染试剂分析中，经常使用的转染试剂Lipofectamine RNAiMAX导致在转染后的第14天GAPDH表达降低66％，Dharmafect 3和Dharmafect 4分别导致GAPDH表达降低60％和75％(图21)。
5.在miRNA类似物或已知的脂肪生成和/或产热之激活蛋白的存在下培养两周的人成熟脂肪细胞的表型变化。
如上文所述，将人皮下脂肪细胞以每孔391,000个细胞的密度平板接种于6孔板中。使用Dharmafect 4，在第14天用以下物质转染这些脂肪细胞：
1.以下miRNA类似物中的一种(50nM)：
-hsa-let-7a抑制剂(hsa-let-7a是报道的调节脂肪生成的通用miRNA)
-hsa-miR-1模拟物(据报道hsa-miR-1调节PRDM16和UCP1)
-hsa-miR-19b模拟物(hsa-miR-19b是丰富的脂肪细胞miRNA，根据我们的计算机分析，预测其与我们的83种靶标中的许多相互作用)或者
-hsa-miR-30b模拟物(根据我们的计算机分析，预测hsa-miR-30b与我们的83种靶标中的许多相互作用)
2.阴性对照(模拟转染)
3.三种阳性对照(已知改变脂肪生成和/或适应性产热的PPARG激动剂罗格列酮(100nM)，β3肾上腺素能受体激动剂CL 316,243(10μm)或甲状腺激素三-碘甲状腺原氨酸(10nM))。
在第17天，将细胞转移到维持培养基中，然后每2至3天更换培养基，直至第28天，拍摄细胞的明场显微镜图片。
如图22所示，并对比于对照条件，在阳性对照CL 316,243和罗格列酮的存在下，以及在hsa-let-7a抑制剂、has-miR-19b和hsa-miR-30b模拟物的存在下，细胞密度增加，并且外观“变褐”。不同试剂对细胞密度、脂质含量、脂滴数量和大小的影响总结于表21中。
表21.
实施例4.通过荧光素酶活性和qRT-PCR进行的高通量miRNA靶标筛选
使用荧光素酶报告子测定构建体的高通量筛选用于鉴定产热中涉及的新miRNA靶标。
荧光素酶通常用作报告子，以评估用包含在目的启动子控制下的荧光素酶基因的基因构建体转染的细胞中的转录活性。SwitchGear Genomics已经建立了全基因组文库，将超过18,000种人启动子和12,000种人3’UTR区克隆至包含SwitchGear’s RenSP报告子盒(GoCloneTM)作为LightSwitchTM荧光素酶测定系统组分的优化的荧光素酶报告基因载体系统中。该荧光素酶的改进形式极大地促进了详细的动力学研究，特别是那些聚焦于抑制上的研究，否则这样的抑制可能被报告蛋白积累而掩盖。
用SwitchGear Genomic GoClone系统，使用UCP1作为单一的产热靶基因测试了多种微小RNAs-一种mRNA范例。为了探索多种人miRNA与Hela细胞和HepG2细胞中的人UCP1基因的3’UTR区、5’UTR区和启动子/增强子区的可能相互作用，制备了三种报告基因构建体：
1.人UCP1 3’UTR构建体，其包含被强组成型启动子(RPL10-prom)驱动的报告基因以及克隆于报告基因3’UTR区中的人UCP1序列2,218bp3’UTR片段。将特异性miRNA模拟物、抑制剂或非靶向对照对该报告基因之活性的影响与由空的3’UTR和肌动蛋白β-3’UTR的那些进行对比，以鉴定对假定的UCP1 3’UTR构建体具有特异性的影响。
2.人UCP1启动子构建体，其包含由人UCP1序列的4,147bp 5’UTR片段驱动的报告基因，所述人UCP1序列跨越转录起始位点和覆盖人UCP1基因序列之甲基化区和增强子区的上游区域。将特异性miRNA模拟物、抑制剂或非靶向对照对该报告基因之活性的影响与肌动蛋白β启动子的那些进行对比，以鉴定对假定的UCP1 5’UTR构建体具有特异性的影响。
3.人UCP1增强子区构建体，其包含由来自HSV-TK基因座的短的最小启动子驱动的报告基因以及跨越人UCP1基因序列之增强子区的人UCP1序列的601bp 5’UTR片段的。将特异性miRNA模拟物、抑制剂或非靶向对照对该报告基因活性的影响与由空的5’增强子区的那些进行对比，以鉴定对假定的UCP15’增强子构建体具有特异性的影响。
此外，制备了miRNAxxx_3’UTR构建体。它们包含由与克隆于报告基因3’UTR区的miRNAxxx靶序列完全匹配之强启动子(RPL10_prom)驱动的报告基因。将miRNA模拟物、抑制剂或非靶向对照对该报告基因活性的影响与EMPTY_3’UTR和肌动蛋白B_3’UTR进行对比，以确定miRNA模拟物或抑制剂的活性是否可以在实验细胞类型中进行被合理地检测到。如果该细胞类型没有目的miRNA的内源性表达，则模拟物的添加应敲低了该报告子的活性，并且抑制剂的添加应没有显著效果。如果该细胞类型具有目的miRNA的内源性高表达，则添加抑制剂应提高该报告基因的活性，并且添加模拟物没有显著效果。在Hela和HepG2细胞类型中，内源miRNA的表达是宽范围的，因此，合成靶标活性的变化很可能影响可变性。
对于每种miRNA候选物(总共38种)，测试以下条件：
-Hela细胞中的miRNA模拟物(特异性)＊8种报告基因构建体
-HepG2细胞中的miRNA模拟物(特异性)＊8种报告基因构建体
-Hela细胞中的miRNA模拟物非靶向对照＊8种报告基因构建体
-HepG2细胞中的miRNA模拟物非靶向对照＊8报告基因构建体
-Hela细胞中的miRNA抑制剂(特异性)＊8种报告基因构建体
-HepG2细胞中的miRNA抑制剂(特异性)＊8种报告基因构建体
-Hela细胞中的miRNA抑制剂非靶向对照＊8种报告基因构建体
-HepG2细胞中的miRNA抑制剂非靶向对照＊8种报告基因构建体
对可以与UCP1序列结合的庞大的miRNA列表施加10种过滤条件(除了需要与UCP13’UTR区结合之外的)，以减少待测试miRNA候选物的数量。这些过滤条件是，结合位点长度、结合位点数目、与5’UTR区的结合、具有其他miRNA的染色体群、内含子位置、摆动、跨物种表达、与增强子区的结合、与甲基化区的结合以及证明与UCP1有关的实验证据。对满足这些标准中至少3个的38种miRNA中进行测试(表22)。
表22.
在UCP1基因序列中具有假定的结合位点的miRNA：
在这些荧光素酶报告基因测定实验中，如果满足特定miRNA抑制剂使荧光素酶信号升高以及特定miRNA模拟物使荧光素酶信号降低二者，并且抑制剂/模拟物比率≥1.5和或/p值＜0.05，则miRNA候选物视为与UCP1相互作用。这些选择标准鉴定出9种miRNA(hsa-miR-19b-2-5p、ha-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p和hsa-miR-545)(表23)。还有一些勉强符合这些选择标准；它们是hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620和hsa-miR-1179。
表23.
通过Hela和/或HepG2细胞中的荧光素酶测定鉴定为UCP1基因表达调节子的miRNA：
细胞系 miRNA
Hela hsa-miR-130b-5p
Hela+HepG2 hsa-miR-19b-2-5p
HepG2 hsa-miR-382-3p/5p
Hela hsa-miR-515-3p
Hela hsa-miR-543
HepG2 hsa-miR-545
Hela+HepG2 hsa-miR-21-5p
Hela hsa-miR-211-5p
Hela+HepG2 hsa-miR-325
这9种选择的miRNA中，3种呈现与被研究的UCP1的3个区域结合(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-211和hsa-miR-515-3p)；3种呈现与UCP1的2个区域结合(hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-130b-5p和hsa-miR-325)，并且3种与UCP1的单个区域结合(hsa-miR-331-5p、hsa-miR-543和hsa-miR-545)。除hsa-miR-331-5p以外的所有miRNA都显示与UCP1的3’UTR区结合(表24)。
表24.
通过荧光素酶测定鉴定为UCP1基因表达调节子的miRNA：
miRNA UCP1 3′UTR UCP1增强子 UCP1启动子
1 hsa-miR-21-5p X X X
2 hsa-miR-211 X X X
3 hsa-miR-515-3p X X X
4 hsa-miR-19b-2-5p X X
5 hsa-miR-130b-5p X X
6 hsa-miR-325 X X
7 hsa-miR-331-5p X
8 hsa-miR-543 X
9 hsa-miR-545 X
通过以下来进行进一步筛选：将启动子/3′UTR文库转染至细胞培养物中的人脂肪细胞或脂肪来源的间充质干细胞中，然后向细胞培养物中添加miRNA试剂(例如agomir或antagomir)。在转染并添加了miRNA试剂24小时后进行荧光素酶活性测量和mRNA鉴定。
为了在更长的时间框架中验证上文记载的转染实验结果，使用包含目的目的miRNA试剂(来自在允许copGFP荧光标记表达的pMIRNA1 SBI载体中表达的miRNA前体的System Biosciences(SBI)收集物)的慢病毒载体进行慢病毒转导实验。具体地，根据供应商的使用说明，用慢病毒颗粒以1∶10的MOI转导包含启动子/3′UTR文库的细胞，并且通过FACS分选GFP阳性细胞。在几个时间点(0小时、3小时和6小时；1天、4天和7天)通过Taqman实时定量PCR评估对照细胞(HEK293细胞)、人脂肪来源的间充质干细胞、人皮下前脂肪细胞和人增殖皮下脂肪细胞中成熟的miRNA以及它们靶向的mRNA的表达水平。汇集来自转导后5个不同时间点的RNA，任选地用于降低基于qRT-PCR的筛选方法的复杂性，同时保持检测灵敏性。
实施例5.蛋白质组学分析
还使用蛋白质组学分析来鉴定产热涉及的新的miRNA靶标。
鸟枪法蛋白质组学是使用高效液相色谱(HPLC)联合质谱(MS)在复杂混合物中鉴定蛋白质的方法。收获经miRNA试剂和启动子/3′UTR文库转染和转导的细胞(如实施例4中所描述)，并使其裂解以产生粗制的可溶(胞质)级分和不溶(核)级分。然后通过HPLC从这些级分中分离肽，并使用纳电喷雾-离子化串联MS使用同位素标记技术SILAC进行分析，以对蛋白质丰度进行定量。针对Ensembl公开的(release)54 种人蛋白质编码序列数据库，使用Sequest(Bioworks版本3.3.1，Thermo Scientific)来检索谱。
为了避免错过低丰度蛋白质，还使用了靶向蛋白质组学方法以对作为已知的脂肪生成、脂肪细胞分化和BAT功能之调节子的一系列蛋白质进行精确定量。一些实例包括UCP1、KDM3A、PRDM16、PPARA、PPARGC1A、CEBPB、CIDEA、BMP7、COX7A1、SIRT1、SIRT3、DIO2、FABP4和ADIPOQ。经基于ELISA或基于Luminex的免疫测定使用市售抗体来分析这些蛋白质。
任选地，在蛋白质组学平台上使用多反应监测-质谱来分析蛋白质级分，借此使用LC-MS-MS精确定量产热通路的仅一种蛋白质(例如UCP1)。
实施例6.特异性靶向人脂肪细胞的克隆DNA适配体的开发和表征
我们使用了Cell-SELEX技术来开发和表征特异性识别成熟的人皮下脂肪细胞的DNA适配体。使用Cell-SELEX，通过重复扩增和与活细胞结合来选择识别完整细胞表面上的天然环境中处于其天然构象的特定分子的适配体。在图23描述的基于细胞的选择中，可在其天然环境中直接靶向特定的已知或未知的细胞表面标志物或膜受体，从而允许对细胞特异性适配体的直接富集。Cell-SELEX由靶细胞的正选择和非靶标细胞的负选择的组合组成。在本发明的情况下，用新鲜分离的人肝细胞进行负选择，用人皮下脂肪细胞的初级培养物来进行正选择。完成了从32聚体文库中的两轮负选择和五轮正选择。对分离的适配体进行测序、合成并用6-荧光素酰胺(FAM)标记，用于结合研究。用饱和浓度(1μM)的FAM缀合的适配体在室温标记人肝细胞(阴性细胞)和脂肪细胞(阳性细胞)15分钟，并通过荧光活化细胞分选(FACS)来分析。如图24所示，一些适配体(例如，适配体974)既不与脂肪细胞结合也不与肝细胞结合，一些适配体(例如，适配体975与脂肪细胞和肝细胞二者都结合，比率：2.69)，并且另一些适配体优选与脂肪细胞结合(例如aptamers972和973，比率分别为：4.76和5.40)。这些脂肪细胞特异性的适配体的进一步表征还在进行中。
实施例7.表型、基因型和蛋白质组学数据集的统一(reconciliation)
在此处将实施例3至5记载的体外实验结果进行统一。具体地，为了将微小RNA、mRNA和靶蛋白质以及通路的初始集合进一步精选为相关的但是可管理的靶标数目，用网络检索和分析压缩包(DAVID，Ingenuity Systems IPA和ARIADNE Pathway Studio)整合实验数据。
本文中，用Business Intelligence工具TIBCO Spotfire来对实施例3至5中记载的体外实验结果进行全局性分析。这使得能够使miRNA试剂和靶基因之间的关系可视化。
实施例8.肥胖动物模型
已经开发并验证了数种肥胖动物模型(Kanasaki K等，J.Biomed.Biotechnol.，2011：197636(2011)；Speakman J等，Obesity reviews：an official journal of theInternational Association for the Study of Obesity，8Suppl 1：55-61(2007))。最常用的是瘦素信号缺陷的Lepob/ob小鼠模型和Leprdb/db小鼠模型，以及C57BL/6J小鼠中的高脂肪膳食模型(Wang CY等，Methods in molecular biology，821：421-433(2012))。这种膳食诱导的肥胖(diet-induced obesity，DIO)模式近似地模仿了现代社会中的高脂肪/高密度食物的提高的可获得性。
DIO小鼠模型用于体内验证本文描述的miRNA类似物在提高产热和/或治疗肥胖和另一些代谢疾病的有效性(Yin H等，Cell Metab.，17(2)：210-224(2013))。
向DIO小鼠施用以下的一种或更多种：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-miR-1agomir、hsa-miR-1antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19bantagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir中。使用罗格列酮作为阳性对照。在处理前和处理后测量小鼠的食物摄取、血液代谢参数、身体组成(体重、体脂肪、骨矿物质和瘦体重(lean mass)、体脂分布、体温、O2消耗和CO2产生、运动诱导的产热、冷诱导的产热和静息产热。体重或体脂肪的降低或者体温升高或者任何类型的产热都指示所使用组合物的体内有效性。
实施例9.人UCP1和UCP2基因的核酸序列和转录物
表25.
人UCP1基因的1,462碱基对(bp)转录物ENST00000262999的核酸序列(六个外显子以大写字母示出)：
表26.
人UCP1基因(ENSG00000109424)的9,371碱基对(bp)核酸序列(外显子以黑体字示出)：
＞染色体：GRCh37：4：141479988：141490559：-1
表27.
人UCP1基因的15,910碱基对(bp)核酸序列(NCBI参考序列：NG_012139.1，4号染色体上的RefSeqGene)：(SEQ ID NO：637)
表28.
人UCP2基因的2,113碱基对(bp)转录物ENST00000310473的核酸序列(八个编码外显子以大写字母示出)：
表29.
人UCP2基因的15,174碱基对(bp)核酸序列(ENSG00000175567)，包括5,000bp 5’UTR和2,000bp 3’UTR(八个外显子突出显示)：
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：
1.一种调节细胞中的呼吸链解偶联的方法，所述方法包括使所述细胞与调节至少一种线粒体解偶联剂之活性的miRNA试剂接触。
2.根据项1所述的方法，其中所述细胞是前脂肪细胞、脂肪细胞、脂肪组织来源的间充质干细胞、肝细胞、肌细胞或其前体。
3.一种调节组织中的产热的方法，所述方法包括使所述组织与调节至少一种线粒体解偶联剂之活性的miRNA试剂接触。
4.根据项3所述的方法，其中所述组织是褐色脂肪、白色脂肪、皮下脂肪组织、肝或肌肉。
5.根据项4所述的方法，其中使所述组织与所述miRNA试剂离体接触。
6.一种治疗有此治疗需要的人对象之肥胖的方法，所述方法包括向所述人对象施用有效量的调节至少一种线粒体解偶联剂之活性或表达的miRNA试剂。
7.根据项6所述的方法，其中所选进行治疗的所述人对象具有肥胖的遗传素质或表观遗传素质。
8.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述线粒体解偶联剂是UCP1或UCP2。
9.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA：hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556和hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。
10.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂是选自表1、11、13和14中记载的miRNA中的miRNA。
11.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA的agomir或antagomir：hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、和hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a。
12.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂是选自表1、11、13和14中记载的miRNA的agomir或antagomir。
13.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA的antagomir：hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p和hsa-miR-545。
14.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA的antagomir：hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620和hsa-miR-1179。
15.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂与靶向部分连接。
16.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是适配体。
17.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述靶向部分将所述miRNA试剂递送至特定细胞类型或组织。
18.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂直接与至少一种线粒体解偶联剂的mRNA或启动子区结合。
19.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂直接与 至少一种线粒体解偶联剂之mRNA的5’UTR或编码序列结合。
20.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述miRNA试剂调节线粒体解偶联蛋白的激活蛋白或阻抑蛋白的活性。
21.根据项18所述的方法，其中所述激活蛋白或阻抑蛋白选自表2中记载的激活蛋白或阻抑蛋白。
22.根据项20或21所述的方法，其中所述miRNA试剂直接与所述激活蛋白或阻抑蛋白的mRNA或启动子区结合。
23.根据项20或21所述的方法，其中所述miRNA试剂直接与所述激活蛋白或阻抑蛋白之mRNA的5’UTR或编码序列结合。
24.根据前述项中任一项所述的方法，其中上调所述线粒体解偶联蛋白的mRNA或蛋白质表达。
25.根据前述项中任一项所述的方法，其中上调所述线粒体解偶联蛋白的线粒体解偶联活性。
26.一种筛选调节产热的miRNA试剂的方法，所述方法包括：
a)提供包含人基因组的指示细胞；
b)使所述指示细胞与受试miRNA试剂接触；以及
c)在存在和不存在所述miRNA试剂的情况下，测定所述指示细胞中的至少一种产热调节子的细胞活性，其中，在存在所述受试miRNA试剂的情况下所述产热调节子活性的改变将所述受试miRNA试剂鉴定为调节产热的miRNA试剂。
27.根据项26所述的方法，其中所述细胞是脂肪细胞、脂肪组织来源的间充质干细胞、肝细胞、肌细胞或其前体。
28.根据项26所述的方法，其中在步骤(c)中测定的所述产热调节子的细胞活性是所述产热调节子的mRNA表达水平、蛋白质表达水平或线粒体解偶联活性。
29.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述产热调节子是UCP1。
30.一种调节细胞中至少一种产热调节子之活性的agomir或antagomir。
31.根据项30所述的agomir或antagomir，其为选自表1、11、13和14中记载的miRNA中的miRNA的agomir或antagomir。
32.根据项30所述的agomir或antagomir，其为选自以下的miRNA的agomir或antagomir：hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556和hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。
33.根据项30所述的agomir或antagomir，其为选自以下的miRNA的antagomir：hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-211、hsa-miR-325、hsa-miR-382-3p/5p、hsa-miR-543、hsa-miR-515-3p和hsa-miR-545。
34.根据项30所述的agomir或antagomir，其为选自以下的miRNA的antagomir：hsa-miR-331-5p、hsa-miR-552、hsa-miR-620和hsa-miR-1179。
35.根据项30至34中任一项所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir与靶向部分连接。
36.根据项35所述的agomir或antagomir，其中所述靶向部分是适配体。
37.根据项35或36所述的agomir或antagomir，其中所述靶向部分将所述agomir或antagomir递送至特定细胞类型或组织。
38.根据项28至33中任一项所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接与至少一种线粒体解偶联剂的mRNA或启动子区结合。
39.根据项30至37中任一项所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接与至少一种线粒体解偶联剂之mRNA的5’UTR或编码序列结合。
40.根据项30至37中任一项所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir调节线粒体解偶联蛋白的激活蛋白或阻抑蛋白的活性。
41.根据项30至37中任一项所述的agomir或antagomir，其中所述激活蛋白或阻抑蛋白选自表2中记载的激活蛋白或阻抑蛋白。
42.根据项30至37中任一项所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接与所述激活蛋白或阻抑蛋白的mRNA或启动子区结合。
43.根据项30至37中任一项所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接与所述激活蛋白或阻抑蛋白之mRNA的5’UTR或编码序列结合。
44.一种药物组合物，其包含选自以下的两种或更多种miRNA：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1antagomir、hsa-miR-19bagomir、hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir。
45.根据项44所述的药物组合物，其还包含可药用赋形剂。
46.根据项44所述的药物组合物，其中所述两种或更多种miRNA由重组载体表达。
47.根据项47所述的药物组合物，其中所述重组载体选自DNA质粒、病毒载体和DNA微环。
48.根据项44所述的药物组合物，其包含选自以下的两种或更多种miRNA：hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19b agomir和hsa-miR-30b agomir。
49.根据项48所述的药物组合物，其还包含可药用赋形剂。
50.根据项48所述的药物组合物，其中所述两种或更多种miRNA由 重组载体表达。
51.根据项48所述的药物组合物，其中所述重组载体选自DNA质粒、病毒载体和DNA微环。
52.一种诱导前脂肪细胞分化成脂肪细胞的方法，其包括向前脂肪细胞群施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir。
53.根据项52所述的方法，其中使前脂肪细胞分化成脂肪细胞的诱导大于当将前脂肪细胞暴露于100nM罗格列酮两天接着暴露于维持培养基时前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。
54.根据项52所述的方法，其中所述一种或更多种miRNA选自hsa-let-7aantagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19b agomir和hsa-miR-30b agomir。
55.一种降低脂肪细胞之脂质含量的方法，其包括向脂肪细胞群施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir、hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30bagomir和hsa-miR-30b antagomir。
56.根据项55所述的方法，其中所述脂肪细胞的脂质含量低于暴露于100nM罗格列酮两天随后暴露于维持培养基的脂肪细胞的脂肪含量。
57.根据项55所述的方法，其中所述脂肪细胞的脂质含量低于在培养持续时间内暴露于100nM罗格列酮之脂肪细胞的脂质含量。
58.根据项57所述的方法，其中所述培养持续时间是8天至16天。
59.根据项58所述的方法，其中所述培养持续时间是10天至14天。
60.根据项59所述的方法，其中所述培养持续时间是14天。
61.根据项55所述的方法，其中所述一种或更多种miRNA选自hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19b agomir和hsa-miR-30b agomir。
62.一种提高有此需要的对象之胰岛素敏感性的方法，其包括向所述对象施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a agomir、hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1agomir、hsa-miR-1 antagomir、hsa-miR-19b agomir 和hsa-miR-19b antagomir、hsa-miR-30b agomir和hsa-miR-30b antagomir。
63.根据项62所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
64.根据项63所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
65.根据项62所述的方法，其中所述一种或更多种miRNA选自：hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19b agomir和hsa-miR-30b agomir。
66.一种提高细胞中的一种或更多种解偶联蛋白表达或活性的方法，其包括向所述细胞施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19b agomir和hsa-miR-30b agomir。
67.根据项66所述的方法，其中所述细胞选自褐色脂肪细胞、白色脂肪细胞、皮下脂肪细胞、肝细胞或者肌肉细胞。
68.根据项66所述的方法，其中所述一种或更多种解偶联蛋白包括UCP-1或UCP-2。
69.一种引起有此需要的对象之脂肪消耗的方法，其包括向所述对象施用选自以下的一种或更多种miRNA：hsa-let-7a antagomir、hsa-miR-1 agomir、hsa-miR-19bagomir和hsa-miR-30b agomir。
70.根据项69所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
71.根据项70所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
72.选自表1、11、13和14中记载的miRNA中的一种或更多种miRNA的agomir或antagomir在制造用于治疗肥胖的药物中的用途。
73.根据项72所述的用途，其中所述一种或更多种miRNA选自has-let-7aantagomir、has-miR-1 agomir、has-miR-19b agomir和has-miR-30b agomir。
74.根据项72所述的用途，其中所述agomir或antagomir与靶向部分连接。
75.根据项74所述的用途，其中所述靶向部分是适配体。
76.一种用于治疗肥胖的组合物，其包含选自表1、11、13和14中记载的miRNA之一种或更多种miRNA的agomir或antagomir。
77.根据项76所述的组合物，其中所述一种或更多种miRNA选自has-let-7aantagomir、has-miR-1 agomir、has-miR-19b agomir和has-miR-30b agomir。
78.根据项76所述的组合物，其中所述agomir或antagomir与靶向部分连接。
79.根据项76所述的组合物，其中所述靶向部分是适配体。

Claims (22)

1.miRNA试剂在制备用于在有此需要的人对象中减少身体脂肪的药物中的用途，其中所述miRNA试剂调节UCP1或UCP2的至少一种的活性或表达；其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA：has-miR-22、has-miR-22-3p、has-miR-22-5p hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、and hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a，或其antagomir或agomir。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述有此需要的人对象肥胖。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述miRNA试剂与靶向部分连接。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述靶向部分是适配体。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述靶向部分将所述miRNA试剂递送至特定细胞类型或组织。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述miRNA试剂是miR-22-3p的antagomir。
7.根据权利要求1所述的用途，其中选择治疗的人对象具有肥胖的遗传素质或表观遗传素质。
8.miRNA试剂在制备用于在对象中治疗糖尿病的药物中的用途，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA：has-miR-22、has-miR-22-3p、has-miR-22-5p hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、andhsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a，或其antagomir或agomir。
9.根据权利要求8所述的用途，其中选择治疗的对象肥胖或具有肥胖的遗传素质或表观遗传素质。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述miRNA试剂包含miR-22-3p的antagomir。
11.根据权利要求8所述的用途，其中所述miRNA试剂与靶向部分连接。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述靶向部分是适配体。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述靶向部分将所述miRNA试剂递送至特定细胞类型或组织。
14.根据权利要求8所述的用途，其中所述对象是人。
15.根据权利要求8所述的用途，其中所述糖尿病包括2型糖尿病。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述2型糖尿病是2型糖尿病的早期发作。
17.miRNA试剂在制备用于在有此需要的对象中提高胰岛素敏感性的药物中的用途，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA：has-miR-22、has-miR-22-3p、has-miR-22-5p hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、and hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a，或其antagomir或agomir。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述对象是人。
19.miRNA试剂在制备用于调节细胞中的呼吸链解偶联或调节组织中的产热的药物中的用途，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA：has-miR-22、has-miR-22-3p、has-miR-22-5p hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、and hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a，或其antagomir或agomir。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述组织是褐色脂肪组织、白色脂肪组织、皮下脂肪组织、肝或肌肉。
21.一种调节细胞中的呼吸链解偶联或者组织中的产热的非治疗目的的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与miRNA试剂接触，其中所述miRNA试剂是选自以下的miRNA：has-miR-22、has-miR-22-3p、has-miR-22-5p hsa-miR-1-1、hsa-miR-1-2、miR-19a-b、hsa-miR-105、hsa-miR-1283、hsa-mir-129、hsa-miR-133a-1、hsa-miR-133a-2、hsa-miR-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-miR-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-24-2、hsa-miR-30a-e、hsa-miR-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-miR-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-miR-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-miR-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、and hsa-miR-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-miR-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a，或其antagomir或agomir。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述组织是褐色脂肪组织、白色脂肪组织、皮下脂肪组织、肝或肌肉。
CN201610894105.5A 2012-04-20 2013-04-22 产热的miRNA调节剂 Pending CN107083385A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261636059P 2012-04-20 2012-04-20
US61/636,059 2012-04-20
US201261681750P 2012-08-10 2012-08-10
US61/681,750 2012-08-10
US201361782838P 2013-03-14 2013-03-14
US61/782,838 2013-03-14
CN201380030602.5A CN104704122A (zh) 2012-04-20 2013-04-22 产热的miRNA调节剂

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380030602.5A Division CN104704122A (zh) 2012-04-20 2013-04-22 产热的miRNA调节剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107083385A true CN107083385A (zh) 2017-08-22

Family

ID=49384237

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380030602.5A Pending CN104704122A (zh) 2012-04-20 2013-04-22 产热的miRNA调节剂
CN201610894105.5A Pending CN107083385A (zh) 2012-04-20 2013-04-22 产热的miRNA调节剂

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380030602.5A Pending CN104704122A (zh) 2012-04-20 2013-04-22 产热的miRNA调节剂

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20150211005A1 (zh)
EP (1) EP2839005B1 (zh)
JP (1) JP2015518485A (zh)
CN (2) CN104704122A (zh)
AU (1) AU2013248981B2 (zh)
CA (1) CA2871073A1 (zh)
HK (1) HK1211316A1 (zh)
IL (1) IL235185A0 (zh)
WO (1) WO2013159091A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111450253A (zh) * 2020-03-27 2020-07-28 深圳先进技术研究院 一种预防/治疗2型糖尿病的药物以及用途
CN109666727B (zh) * 2018-12-29 2020-11-06 中国药科大学 一种高活性抑制pcsk9表达的微小rna的用途
WO2021189390A1 (zh) * 2020-03-27 2021-09-30 深圳先进技术研究院 一种预防/治疗2型糖尿病的药物以及用途

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2868746A1 (en) * 2013-10-29 2015-05-06 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts Micrornas modulating the effect of glucocorticoid signaling
CN108064175A (zh) * 2014-08-04 2018-05-22 米拉根医疗股份有限公司 Myh7b的抑制剂及其用途
CN106267207A (zh) * 2015-06-05 2017-01-04 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 通过miR-96进行减肥、降血糖和降血脂的方法和药物及其应用
CN105368834B (zh) * 2015-10-14 2018-06-29 重庆市畜牧科学院 miRNA-199a在抑制成肌细胞的成脂分化试剂中的应用
CN105521490B (zh) * 2015-12-24 2018-08-17 北京致成生物医学科技有限公司 miRNA-888-3p在椎间盘退行性疾病诊治中的应用
CN105400893A (zh) * 2015-12-24 2016-03-16 北京泱深生物信息技术有限公司 椎间盘退行性病变miRNA标志物
CN105435247A (zh) * 2015-12-31 2016-03-30 中国医学科学院基础医学研究所 miR-378在预防和/或治疗肥胖症中的用途
GB201603967D0 (en) 2016-03-08 2016-04-20 Univ Birmingham Biomarkers of traumatic brain injury
WO2018017865A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Thomas Jefferson University Inhibiting microrna to prevent development of essential hypertension
ES2659845B1 (es) * 2016-09-19 2019-01-04 Univ Valencia Modulación de microRNAs contra la distrofia miotónica tipo 1 y antagonistas de microRNAs para ello
CN107569471A (zh) * 2017-08-22 2018-01-12 深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院 一种microRNA‑150纳米粒子的制备方法
CN109423519A (zh) * 2017-09-01 2019-03-05 安科默(北京)生物技术有限公司 早期胰腺癌标记物及其检测方法
CN107447016B (zh) * 2017-09-05 2020-08-25 辽宁大学 miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中的应用
CN107723365B (zh) * 2017-09-11 2019-10-01 朱伟 一种与肺鳞癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
MX2020002760A (es) * 2017-09-15 2020-07-20 Cynata Therapeutics Ltd Metodo para tratar la enfermedad alergica de las vias respiratorias (aad)/asma.
CN108103198B (zh) * 2018-02-13 2019-10-01 朱伟 一种与胰腺癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
KR20210044771A (ko) * 2018-07-02 2021-04-23 압타미르 테라퓨틱스, 인코포레이티드 인간 지방세포에 대한 치료제의 표적화 전달
CN108929910B (zh) * 2018-08-03 2022-11-29 朱伟 一种与肺腺癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用
CN108624695B (zh) * 2018-08-03 2019-10-01 朱伟 一种与甲状腺乳头状癌辅助诊断相关的循环miRNA标志物及其应用
CN109055557B (zh) * 2018-09-11 2022-11-29 朱伟 一种与胰腺癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用
CN109022586B (zh) * 2018-09-11 2022-11-29 朱伟 一种与宫颈癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
CN109182382A (zh) * 2018-09-18 2019-01-11 嘉兴学院 用于抑制lgals12基因表达的物质在抑制脂肪细胞分化中的应用
CN109628449B (zh) * 2018-12-18 2022-05-31 西北农林科技大学 一种牛脂肪细胞的microRNA及其应用
CN110305951A (zh) * 2019-06-05 2019-10-08 上海交通大学医学院附属瑞金医院 miR-129-5p作为靶分子在制备代谢性疾病药物中的应用
JP7418729B2 (ja) * 2019-08-08 2024-01-22 国立大学法人東京農工大学 核酸アプタマー、ヒト間葉系幹細胞吸着剤、ヒト間葉系幹細胞の分離方法、ヒト間葉系幹細胞の検出方法
CN113667753B (zh) * 2020-03-30 2022-03-22 中国医学科学院肿瘤医院 用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法
CN111904974B (zh) * 2020-08-28 2021-12-28 中国人民解放军北部战区总医院 miR-574-5p在糖尿病及其相关疾病中的医药用途
KR102525144B1 (ko) * 2021-03-04 2023-04-21 계명대학교 산학협력단 당뇨 전단계 진단 또는 당뇨 합병증 발병 예측용 바이오마커 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101675165A (zh) * 2006-12-08 2010-03-17 奥斯瑞根公司 Let-7微小rna的功能和靶标

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
DE3855864T2 (de) 1987-11-30 1997-09-25 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
DK0541722T3 (da) 1990-08-03 1996-04-22 Sterling Winthrop Inc Forbindelser og fremgangsmåder til inhibering af genekspression
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
ES2149962T3 (es) 1993-12-09 2000-11-16 Univ Jefferson Compuestos y metodos para mutaciones dirigidas al sitio en celulas eucarioticas.
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5716928A (en) 1995-06-07 1998-02-10 Avmax, Inc. Use of essential oils to increase bioavailability of oral pharmaceutical compounds
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US6007839A (en) 1996-02-16 1999-12-28 The Liposome Company, Inc. Preparation of pharmaceutical compositions containing etherlipid-containing multiple lipid liposomes
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6630137B1 (en) 1997-04-28 2003-10-07 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
CA2294900A1 (en) 1997-07-02 1999-01-14 Sdg, Inc. Targeted liposomal constructs for diagnostic and therapeutic uses
US20050256071A1 (en) * 2003-07-15 2005-11-17 California Institute Of Technology Inhibitor nucleic acids
EP2136846A4 (en) * 2007-03-26 2011-04-13 Crc For Asthma And Airways Ltd THERAPEUTIC OBJECTIVES AND MOLECULES
WO2009091972A2 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides and small molecules for use in reducing micro rna activity levels and uses thereof
US8557786B2 (en) * 2008-08-19 2013-10-15 Maine Institute of Human Genetics and Health Micro RNA (MiRNA) and neurofibromatosis type 1: a role in diagnosis and therapy
WO2010108126A2 (en) * 2009-03-19 2010-09-23 Fate Therapeutics, Inc. Reprogramming compositions and methods of using the same
FR2953220B1 (fr) * 2009-12-01 2012-11-23 Oreal Signature microarn de la differenciation epidermique et utilisations
EP2515947B1 (en) * 2009-12-23 2021-10-06 CuRNA, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
EP2566964B1 (en) * 2010-05-07 2016-10-19 Centre National De La Recherche Scientifique Ucp1 (thermogenin) - inducing agents for use in the treatment of a disorder of the energy homeostasis
JP6109069B2 (ja) * 2010-06-04 2017-04-05 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム ｍｉＲ−３７８による代謝調節
WO2012007725A2 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Plasticell Ltd Method of reprogramming a cell
US8883757B2 (en) * 2011-01-03 2014-11-11 Rosetta Genomics Ltd. Compositions and methods for treatment of ovarian cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101675165A (zh) * 2006-12-08 2010-03-17 奥斯瑞根公司 Let-7微小rna的功能和靶标

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDER R等: "MicroRNAs in adipogenesis and as therapeutic targets for obesity", 《EXPERT OPIN THER TARGETS》 *
MCGREGOR RA等: "microRNAs in the regulation of adipogenesis and obesity", 《CURR MOL MED.》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666727B (zh) * 2018-12-29 2020-11-06 中国药科大学 一种高活性抑制pcsk9表达的微小rna的用途
CN111450253A (zh) * 2020-03-27 2020-07-28 深圳先进技术研究院 一种预防/治疗2型糖尿病的药物以及用途
WO2021189390A1 (zh) * 2020-03-27 2021-09-30 深圳先进技术研究院 一种预防/治疗2型糖尿病的药物以及用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013248981B2 (en) 2018-11-29
WO2013159091A3 (en) 2015-04-30
HK1211316A1 (zh) 2016-05-20
CA2871073A1 (en) 2013-10-24
JP2015518485A (ja) 2015-07-02
WO2013159091A2 (en) 2013-10-24
AU2013248981A1 (en) 2014-11-06
EP2839005B1 (en) 2021-01-06
CN104704122A (zh) 2015-06-10
EP2839005A4 (en) 2016-10-05
US20150211005A1 (en) 2015-07-30
AU2013248981A2 (en) 2015-03-05
IL235185A0 (en) 2014-12-31
EP2839005A2 (en) 2015-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107083385A (zh) 产热的miRNA调节剂
US10612026B2 (en) Pharmaceutical composition for treating cancer comprising microrna as active ingredient
Sassi et al. Cardiac myocyte miR-29 promotes pathological remodeling of the heart by activating Wnt signaling
US9453224B2 (en) MiRNA modulators of thermogenesis
CN109414448A (zh) 用于减少PAPD5或PAPD7 mRNA治疗乙型肝炎感染的核酸分子
DE102007052114B4 (de) Verfahren zur Modulation der Funktion, des Wachstums oder der Differenzierung einer Zelle
SA519402226B1 (ar) مترافقات أوليجومرات تخطي الإكسون للحَثَل العَضَلِيّ
CN104313027B (zh) 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病
CN103476947A (zh) 寡聚体的增强的生物分布
CN102712925B (zh) 通过抑制sirtuin(sirt)的天然反义转录物来治疗sirtuin(sirt)相关性疾病
CN107108685A (zh) miR‑29模拟物及其用途
CN105658797A (zh) 用于调节rna的组合物和方法
CA2880833A1 (en) Cell-specific delivery of mirna modulators for the treatment of obesity and related disorders
CN103906838A (zh) Gccr表达的反义调节
CN104780976A (zh) 治疗和诊断黑素瘤
CN106983768A (zh) 用于在对象中调节smn2剪接的组合物和方法
JP2015523853A (ja) Ａｔｐ２ａ２発現を調節するための組成物及び方法
JP2021531252A (ja) ヒト脂肪細胞への治療薬の標的化送達
CN108064175A (zh) Myh7b的抑制剂及其用途
CN102335189A (zh) 包含针对miR-214的反义多核苷酸的药物组合物
Cai et al. Tetrahedral framework nucleic acids based small interfering RNA targeting receptor for advanced glycation end products for diabetic complications treatment
CN105457028B (zh) 在骨形成中发挥调控作用的应力敏感性microRNA
CN103370414A (zh) 降低恶性神经胶质瘤中下调肾细胞癌的表达的方法
Mäkilä et al. Noninvasive and quantitative monitoring of the distributions and kinetics of microRNA-targeting molecules in vivo by positron emission tomography
CN106139163B (zh) 一种抑制骨关节炎的microRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1240621

Country of ref document: HK