KR20210044771A - 인간 지방세포에 대한 치료제의 표적화 전달 - Google Patents

인간 지방세포에 대한 치료제의 표적화 전달 Download PDF

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KR20210044771A
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마크 티보니에
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압타미르 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

발열 조절을 조절하는 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 이 조성물 및 방법은, 비만, 또는 2형 당뇨병, NAFLD 및 NASH 등의 심장 대사 장애 등의 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이 조성물은, 발열 조절을 조절할 수 있는 치료제, 세포 흡수 및 치료제의 표적화된 지방세포로의 전달을 촉진하는 표적화 요소; 및 스핑고미엘린, DMPC 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 입자을 포함하는 지방세포-표적화 조성물을 포함하며, 여기서 리포좀 입자는 치료제의 세포내 침투를 증강시키고, 치료제를 분해로부터 보호한다.

Description

인간 지방세포에 대한 치료제의 표적화 전달
관련 출원의 상호 참조
본 출원은, 2018년 7월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/693,025호 및 2019년 2월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/810,141호의 우선권의 이익을 주장하고, 이들은 모두 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 치료제(therapeutic agent)[마이크로RNA 유사체(analog), 소분자, 펩티드, 펩티드모방약, 영양보조식품 또는 유전자 편집 시스템 등의 올리고뉴클레오티드 치료제(oligonucleotide therapeutic)]를 포함하는 조성물, 및 2형 당뇨병, 비-알콜성 지방 간 질환(NAFLD) 및 비알콜성 지방성간염(NASH)을 포함하는, 인간 비만 및 관련 심장대사 장애(cardiometabolic disorder)를 치료하기 위해 이러한 치료제를 지방세포에 전달하는 방법에 관한 것이다.
지방 및 과체중은, 세계적인 건강 문제를 증대시키고 있다. 비만은 에너지 섭취량 및 소비량의 만성적 불균형의 결과이다. 이는, 지방세포에서 트리글리세라이드의 형태로 과다한 에너지의 저장을 유도하고, 통상적으로 비대(세포 크기의 증가) 및 과형성(세포 수 또는 지방생성의 증가) 둘 다를 나타낸다. 최근 비만의 악화는, 포화 지방과 당분을 다량 함유하는 에너지 밀도가 높은 식품의 과잉 섭취와 신체 활동의 저하의 조합에서 기인한다.
비만의 현재의 징후성 의료 요법은, 주로 한정된 약효 및 환자의 라이프스타일 변경 및 치료와의 불충분한 준수에 기인하여, 이들의 장기간 치료 목표를 달성하지 못하고 있다. 몇몇 비만 약물은 안전상의 이유로 시장으로부터 배제되어 있고, 현재 개발 중의 소분자는 이의 보통의 단기간 유효성과 미지의 안전성 프로파일 때문에 규제 당국의 승인을 획득하기 위해 고군분투하고 있다. 현재, 제한적 및 흡수불량의 비만 수술만이, 몇몇 바람직한 심장 이익과 함께, 체중 과잉의 유의한 장기적 감소를 달성할 수 있다. 그러나, 비만 수술은 만성적 소화 불량의 상태를 생성한다. 따라서, 당해 기술분야에서 비만의 신규 치료법의 필요성이 있다.
NAFLD는, 비만 및 2형 당뇨병의 유병율의 증가와 관련하여, 세계 성인 인간 모집단의 최대 31%에 영향을 미치는 증가하는 판데믹이다[1]. 1억명의 미국인은 지방간을 갖고 있고, 대부분은 이를 알지 못한다. 다수가 NAFLD, NASH, 간 섬유증, 아마도 말기 간 부전 및 암을 발증한다[2]. 현재 승인된 치료제는 없지만, NAFLD/NASH에는 안전하고 효과적인 치료법이 필요하다. NAFLD/NASH는 만성 간 질환의 주요 원인이고, 선진국에서는 상당한 이환율 및 사망율과 연관되어 있다[3]. NAFLD는 상당히 복잡한 질환이고, NAFLD의 발증을 설명하기 위해 "멀티-히트(multiple-hit)" 가설이 제안되어 있다[4]:
- 제1 히트: 지질 축적(지방증)
- 제2 히트: 염증, 미토콘드리아 기능장애 및 산화 스트레스(지방성간염)
- 제3 히트: 간세포 재생의 결함(섬유증)
단일 miRNA에 의한 다수 표적 유전자의 동시 조절이, 비만, 2형 당뇨병 및 NAFLD/NASH 등의 다인자성 질환의 효과적 치료를 제공할 수 있기 때문에, 마이크로RNA(miRNA)는 세포 운명 결정을 조절하고 복잡한 질환을 개선하기 위한 매력적인 약물 후보이다. 사실, miRNA는 지방세포 분화, 발달 및 기능의 광범위한 조절인자이고, 비만의 실행가능한 치료제이다. 몇몇 miRNA 작용제[아고미르(agomir)] 및 길항제[안타고미르(antagomir)]는 심장대사 장애를 포함하는 다수의 인간 질환을 치료하기 위해 현재 개발중에 있다. 이러한 약제의 예는 티보니에르(Thibonnier)의 미국 특허 제9,034,839호에 개시되어 있다. 올리고뉴클레오티드를 약물로 변환하기 위한 기술 플랫폼은 최근 성숙되었고, 몇몇 약물이 현재 임상 개발중에 있다[5, 6]. 그러나, 간 이외의 조직/장기로의 표적화 전달은 거의 시험되지 않았고, 혁신적 접근법으로부터 이익을 받을 수 있다[7, 8].
이들의 장기간 유효성/안전성 프로파일을 최적화하고 상품 비용을 감소시키고 오프-표적 효과를 최소화하기 위해, 지방세포에 대한, 소분자, 펩티드, 펩티드모방약, 영양보조식품 및 유전자 편집 시스템을 포함하는 마이크로RNA 조절인자 및 기타 치료제의 표적화 전달을 달성할 필요성이 존재한다[9].
이 목표를 달성하기 위해, 본 발명자들은, (a) 지질 산화 및/또는 발열 조절(thermogenic regulation)을 조절할 수 있는 치료제, 예컨대, miRNA 제제 조성물(예를 들면, miRNA 아고미르 및 안타고미르), 소분자, 펩티드모방약, 영양보조식품 및 유전자 편집 시스템; (b) 지방세포-특이적 세포 표면 마커, 수용체 또는 수송체에 결합하고 세포 흡수 및 발열 치료제의 표적화된 지방세포(targeted adipocyte)로의 전달을 촉진하는 표적화 요소(targeting element)[예를 들면, 지방산 수송체 또는 지방산 수송체를 인식하는 항체에 의해 수송된 분자]; 및 (c) 치료제를 표적화 지방세포에 전달하고 이들의 세포내 침투를 증진시키고 이들을 분해로부터 보호할 수 있는 담체(carrier) 또는 전달 나노입자의 다양한 신규 조합을 개발했다. 이러한 치료제, 표적화 요소 및 담체 또는 전달 나노입자를 사용하는 조성물은, 인간 지방 조직에 대한 치료제의 국소 피하 투여(주사, 패치 또는 마이크로니들)를 사용하는 방법에 사용될 수 있고, 이는 전신 노출 및 "오프 표적 효과(off target effect)"를 초래하고, 치료 지수를 추가로 개선시키고, 상품의 비용을 감소시키고, 환자의 편의성과 치료에 대한 준수를 개선시킨다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 것은, (a) 지질 산화 및/또는 발열 조절을 조절할 수 있는 치료제; (b) 세포 흡수 및 치료제의 표적화된 지방세포로의 전달을 촉진하는 표적화 요소; 및 (c) 스핑고미엘린(sphingomyelin), DMPC 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 입자로써, 치료제의 세포내 침투(intra-cellular penetration)를 증진시키고 치료제를 분해로부터 보호하는 리포좀 입자를 포함하는, 지방세포-표적화 조성물이다. 리포좀 입자는 다양한 제형을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포좀 입자 중의 콜레스테롤은 리포좀 입자의 30 내지 50중량%를 구성하고, DMPC는 리포좀 입자의 30 내지 50중량%를 구성하며, 콜레스테롤은 리포좀 입자의 10 내지 30중량%를 구성한다. 일부 실시형태에서, 콜레스테롤은 리포좀 입자의 40중량%를 구성하고, DMPC는 리포좀 입자의 40중량%를 구성하며, 콜레스테롤은 리포좀 입자의 20중량%를 구성한다. 일부 실시형태에서, 리포좀은 약 135 내지 150nm의 피크 평균 직경(peak mean diameter) 또는 약 0.035 미만의 다분산 지수(polydispersity index)를 갖는다.
조성물 중의 치료제는, 예를 들면, miRNA 아고미르 및 안타고미르, 소분자, 펩티드, 펩티드모방약, 영양보조식품, 유전자 편집 시스템 또는 지질 산화 및/또는 발열을 조절할 수 있는 임의의 기타 약제를 포함하는, 다양한 지질 산화 및/또는 발열 조절제의 하나 또는 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 길이가 7 내지 14개 뉴클레오티드의 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 miR-22 안타고미르, miR-515 아고미르, 디니트로페놀, 니클로스아미드, β3 아드레날린성 수용체 길항제, 갑상선모방제(thyromimetic), PPAR 알파 작용제, PPAR 감마 작용제, 레티노산, 헥사렐린, 트롬보스폰딘-1(Thrombospondin-1)[TSP-1], 프로히비틴(PHB), 폴리페놀, 레스베라트롤, 쿠르쿠민, 캡시시노이드(capsicinoid), 이소플라본, 또는 유전자 편집 시스템의 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적화 요소는 지질이다. 일부 실시형태에서, 지질은 치료제에 연결되어(linked) 있다. 일부 실시형태에서, 지질은 데칸산, 도데칸산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 올레오일 글리신, 도코사노산, 헥사데칸산, 도트리아콘타헥사엔산, 도코사헥사엔산 또는 콜레스테롤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질은, 지방산 트랜스로카제(FAT/CD36/SCARB3)에 의해 자연적으로 수송되는 지방산이다. 일부 실시형태에서, 치료제는 공유 결합, 디설파이드 결합, 디에스테르 결합, 펩티드 결합, 이온 결합 또는 비오틴-스트렙트아비딘 결합(biotin-streptavidin bond)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커(linker)에 의해 지질에 연결되어 있다.
일부 실시형태에서, 표적화 요소는 지방산 트랜스로카제(FAT/CD36/SCARB3), 아쿠아포린 7(AQP7), 페리리핀 1(Perilipin)[PLIN1] 또는 페리리핀 2(PLIN2)에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 요소는 항체, 항체 단편, scFv 또는 단일 도메인 항체(single domain antibody)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 요소는 헥사렐린(His-D-2-Me-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2), 또는 TSP-1, 또는 아미노산 서열 GVITRIR 또는 VTCGVITRIR을 갖는 TSP-1 펩티드, 또는 아미노산 서열 CKGGRAKDC를 갖는 PHB 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 공유 결합, 디설파이드 결합, 디에스테르 결합, 펩티드 결합, 이온 결합 또는 비오틴-스트렙트아비딘 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커에 의해 표적화 요소에 연결되어 있다.
일부 실시형태에서, 치료제는 리포좀의 내부에 캡슐화되어(encapsulated) 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 리포좀의 표면과 회합되어(associating) 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 리포좀의 외부 표면과 회합되어 있고, 리포좀의 내부로부터 제외되어 있다.
일부 실시형태에서, 치료제는 호흡 쇄 언커플링(respiratory chain uncoupling)을 조절한다. 일부 실시형태에서, 치료제는 UCP1, UCP2 또는 UCP3의 활성을 조절한다.
또한, 본원에 개시된 것은, 디설파이드 결합을 통해 헥사렐린에 연결된 일본쇄(single-stranded) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지방세포-표적화 치료제이다. 일부 실시형태에서, 일본쇄 올리고뉴클레오티드는 길이가 7 내지 14개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 일본쇄 올리고뉴클레오티드는 miR-22의 안타고미르 또는 miR-515의 아고미르이다.
또한, 본원에 개시된 것은, 상기 기재된 임의의 조성물을 대상체(subject)에게 제공하는 것을 포함하는, 대상체에서 지질 산화 및/또는 발열 조절을 조절하는 방법이다. 일부 실시형태에서, 조성물 또는 치료제를 제공하는 것은 조성물 또는 치료제를 피하, 경피 또는 정맥내로 투여하는 것을 포함한다. 지질 산화 및/또는 발열 조절을 조절하는 방법은 질환 또는 상태를 치료하기 위한 전략의 일부일 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 상태는 비만 또는 2형 당뇨병, NAFLD 및 NASH 등의 심장대사 장애이다.
일부 실시형태에서, 조성물을 제공받은 환자는, 비만 또는 2형 당뇨병, NAFLD 및 NASH 등의 관련 심장대사 장애로 진단되거나 진단되었다.
도 1은, ATP를 생산하는 미토콘드리아 호흡 쇄 복합체(Respiratory Chain Complex)[상부 패널], 및 발열/에너지 소비를 유도하는 지방 조직에서 UCP1에 의한 복합체 IV 및 V의 언커플링(하부 패널)의 개략도이다.
도 2는 화학적으로 변형된 ss-miRNA의 작용 메카니즘을 나타낸다[10].
도 3은 인간 지방세포 배양물에서 RNA 기반 치료제를 시험하기 위한 실험 계획을 나타낸다.
도 4는, 분자 동력학 시뮬레이션 프로그램을 사용하여 인간 miR-22-3p 표적의 시드 영역과 상호작용하는 8-머(mer) miR-22-3p 안타고미르의 3-D 모델을 나타낸다.
도 5는 PyMOL 프로그램을 사용하여 생성된 지시된 AdipomiR의 3-D 모델을 나타낸다.
도 6은, 인간 miR-22-3p의 시드(seed) 영역을 표적화하고 분자 동력학 시뮬레이션 프로그램을 사용하여 생성된 디설파이드 결합을 통해 헥사렐린에 연결된 펩티드 핵산 골격을 갖는 12-머 miR-22-3p 안타고미르의 3-D 모델을 나타낸다.
도 7은 인간 지방세포의 세포질로의 녹색 형광 헥사렐린의 효율적 수송을 나타낸다.
도 8a-d는, 지시된 바와 같이, 지질 나노입자 LNP1, LNP2, LNP3 또는 LNP4를 갖는 제형 중의 지시된 양의 이본쇄(double stranded) miR-124와 함께 인큐베이팅된 지방세포에서 qRT-PCR에 의해 측정된, 지시된 RNA의 상대적 존재량을 나타내는 그래프이다. (a) miR-124의 상대적 존재량; (b) let-7 mRNA의 상대적 존재량; (c) IQGAP1 mRNA의 상대적 존재량; (d) 렙틴 mRNA의 상대적 존재량.
도 9는, 마우스(mouse)에 피하 주사 후의 마우스 조직에서 세포당 miR-515 카피의 양과 상관된 UCP1 mRNA의 상대적 발현을 나타내는 그래프이다.
도 10은 지방산 수송체(FAT/CD36/SCARB3)의 구조를 나타낸다[11].
I. 정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 출원이 우선한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "miRNA 유사체"는 간엽계 줄기 세포(ATMSC) 또는 백색 지방세포(WAT)가 갈색 지방세포로 되도록(become) 직접 또는 간접적으로 재프로그램하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 모방체를 지칭한다. miRNA 유사체는, 표적 유전자 또는 표적 유전자의 활성화인자 또는 억제인자, 또는 발열 조절인자(예를 들면, 미토콘드리아 언커플러(uncoupler) 또는 이의 활성화인자 또는 억제인자)를 직접 또는 간접적으로 조절하는 표적 miRNA에 작용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "miRNA"는, 표적 유전자(mRNA 또는 DNA)에 결합하고 그 유전자의 발현을 조절할 수 있는 일본쇄 RNA 분자(또는 이의 합성 유도체)를 지칭한다. 특정 실시형태에서, miRNA는 생물에서 자연적으로 발현된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시드 서열(seed sequence)"은, 표적 특이성의 중요한 결정인자인, miRNA의 5' 말단에서 최초 8 nt 내의 6 내지 8 뉴클레오티드(nt) 길이의 부분 스트링(substring)[즉, 시드 서열]을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아고미르"는, miRNA를 기능적으로 모방하는 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 모방체를 지칭한다. 아고미르는, miRNA 또는 miRNA의 일부와 동일 또는 유사한 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 아고미르는, 이것이 모방하는 miRNA와는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드의 차이를 갖는다. 추가로, 아고미르는, 이것이 모방하는 miRNA와 동일한 길이, 보다 긴 길이 또는 보다 짧은 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 아고미르는, 그것이 모방하는 miRNA의 5' 말단에 6 내지 8 뉴클레오티드와 동일한 서열을 갖는다. 다른 실시형태에서, 아고미르는 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 뉴클레오티드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 아고미르는 miRBase에 제시된 임의의 서열을 포함한다. 이들 화학적으로 변형된 합성 RNA 이중쇄(duplex)는, RISC 복합체로의 효율적 로딩을 가능하게 하기 위해 목적 miRNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 가이드 가닥(guide strand)를 포함하지만, 패신저 가닥(passenger strand)는 RISC 복합체에서 아르고너트(Argonaute) 단백질로의 로딩을 방지하기 위해 화학적으로 변형된다[참조: Thorsen SB et al., Cancer J., 18(3):275-284 (2012); Broderick JA et al., Gene Ther., 18(12):1104-1110 (2011)].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안타고미르"는, 특정 마이크로RNA에 상보성을 갖고 그 miRNA의 활성을 억제하는 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 모방체를 지칭한다. 용어 "안티미르"는 용어 "안타고미르"와 동의어이다. 특정 실시형태에서, 안타고미르는, 그것이 억제하는 miRNA와는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드 차이를 갖는다. 추가로, 안타고미르는, 그것이 억제하는 miRNA와 동일한 길이, 보다 긴 길이 또는 보다 짧은 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 안타고미르는, 그것이 억제하는 miRNA의 5' 말단에서 6 내지 8 뉴클레오티드에 하이브리드화한다. 다른 실시형태에서, 안타고미르는 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 뉴클레오티드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 안타고미르는, miRBase에 제시된 임의의 서열에 상보성인 뉴클레오티드를 포함한다. 안타고미르는, 특정 miRNA에 단단히 결합하고 이를 불활성화하는 합성 역 상보체이다. 뉴클레아제 내성 및 결합 친화력을 개선하기 위해, 다양한 화학 변형이 사용된다. 효력을 증가시키기 위해 가장 일반적으로 사용되는 변형은, 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 또는 2'-플루오로(2'-F) 등의 2' 당 변형을 포함한다. 또한, miRNA의 핵산 구조는, 2' 산소와 4' 탄소의 사이에 메틸렌 브릿지를 갖는 잠금(locked) 핵산(LNA)으로 변형되어, 리보스를 핵산의 A-유형 형태의 3'-엔도(endo)[북쪽] 형태로 잠글 수 있다[참조: Lennox KA et al.. Gene Ther. Dec 2011;18(12):1111-1120; Bader AG et al. Gene Ther. Dec 2011;18(12):1121-1126]. 이러한 변형은, 분자의 표적 특이성 및 하이브리드화 특성 둘 다를 대폭 증가시킨다. 다른 변형은 5'-(E)-비닐포스포네이트 보호(5'-VP), 골격 변형(포스포로티오에이트(PS), 펩티드 핵산(PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO), 에틸렌-브릿지 핵산(ENA)), 5-메틸시토신 변형, "피리미딘 카세트(pyrimidine cassette)"의 도입 및/또는 "DNA 갭"의 도입을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "간섭 RNA"는, RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현을 억제 또는 하향 조절할 수 있는 임의의 이본쇄 또는 일본쇄 RNA 서열을 지칭한다. 간섭 RNA는 작은 간섭 RNA("siRNA") 및 작은 헤어핀 RNA("shRNA")를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. "RNA 간섭"은 서열-적합성 메신저 RNA 전사물의 선택적 분해를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는, 서열 특이적 방법으로 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현을 억제 또는 하향 조절할 수 있는 임의의 작은 RNA 분자를 지칭한다. 작은 RNA는, 예를 들면, 약 16 내지 21 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "shRNA"(작은 헤어핀 RNA)는, 안티센스 영역(antisense region), 루프 부분 및 센스 영역을 포함하는 RNA 분자를 지칭하며, 여기서 센스 영역은, 안티센스 영역과 염기쌍을 형성하여 이중 줄기를 형성하는 상보성 뉴클레오티드를 갖는다. 전사후 프로세싱에 이어서, RNase II 패밀리의 구성원인 효소 다이서(Dicer)에 의해 매개된 절단 이벤트(cleavage event)에 의해 작은 헤어핀 RNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)로 전환된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는, DNA 또는 mRNA 서열(예를 들면, miRNA)에 상보성인 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 모방체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "miR-마스크"는, 표적 mRNA 중의 miRNA 결합 부위에 상보성이고 mRNA 결합 부위에 대한 miRNA의 결합을 억제하는 역할을 하는 일본쇄 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다[참조: 예를 들면, Xiao, et al. "Novel approaches for gene-specific interference via manipulating actions of microRNAs: examination on the pacemaker channel genes HCN2 and HCN4," Journal of Cellular Physiology, vol. 212, no. 2, pp. 285-292, 2007, 이는 그 전체가 본원에 도입된다.].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "miRNA 스폰지"는, 목적 miRNA의 복수의 탠덤-결합 부위(tandem-binding site)를 함유하고, 목적 내인성 miRNA를 적정하는 작용을 하고, 따라서 이의 내인성 표적에 대한 목적 miRNA의 결합을 억제하는 합성 핵산(예를 들면, mRNA 전사물)을 지칭한다[참조: 예를 들면, Ebert et al., "MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells," Nature Methods, vol. 4, no. 9, pp. 721-726, 2007, 이는 그 전체가 본원에 도입된다.].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "호흡 쇄 언커플링"은, 미토콘드리아 내막 프로톤 구배가 소실되어(dissipation), 이에 의해 산화적 포스포릴화에 의한 미토콘드리아 내의 ATP의 합성을 방지하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미토콘드리아 언커플러"는, 미토콘드리아 내막 프로톤 구배를 소실시킬 수 있고, 이에 의해 산화적 포스포릴화에 의한 미토콘드리아 내의 ATP의 합성을 방지할 수 있는 단백질(또는 코딩 핵산)을 지칭한다. 예시적 미토콘드리아 언커플러는 UCP1, UCP2 및 UCP3을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 미토콘드리아 언커플러의 용어 "활성화인자" 또는 "억제인자"는, 미토콘드리아 언커플러의 활성을 각각 상향조절 또는 하향조절하는 역할을 하는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발열 조절인자"는, 발열을 직접 또는 간접적으로 조절하는 치료제(올리고뉴클레오티드, 소분자, 펩티드, 펩티드모방약 또는 유전자 편집 시스템)을 지칭한다. 이 용어는 미토콘드리아 언커플러, 및 또한 미토콘드리아 언커플러의 활성화인자 및 억제인자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절하다"는 파라미터를 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들면, 단백질의 활성을 조절하기 위해, 그 단백질의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 미토콘드리아 언커플러 또는 발열 조절인자의 용어 "활성(activity)"은, mRNA 발현, 단백질 발현 또는 호흡 쇄 언커플링을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 임의의 측정가능한 생물학적 활성을 지칭한다.
조성물 또는 치료제의 "유효량"은, 장애를 치료 또는 예방하는데 효과적이거나 인간에서 생리학적 상태를 조절하기에 충분한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, "심장-대사 장애"는 심혈관 질환, 뇌졸중, 진성 당뇨병, 지질이상증, 대사 증후군 및 간 지방증을 포함한다.
대상체는, 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 염소, 소 및 고등 영장류를 포함하여 포유동물 부류의 임의의 구성원을 포함하는 척추동물이다.
용어 "포유동물"은, 설치류, 영장류, 개, 고양이, 낙타류 및 유제동물을 포함하는 포유동물 부류의 구성원인 임의의 종을 지칭한다. 용어 "설치류"는, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌 및 토끼을 포함하는 설치류 목의 구성원인 임의의 종을 지칭한다. 용어 "영장류"는, 원숭이, 유인원 및 인간을 포함하는 영장류 목의 구성원인 임의의 종을 지칭한다. 용어 "낙타류"는, 낙타 및 라마를 포함하는 낙타 과의 구성원인 임의의 종을 지칭한다. 용어 "유제동물"은, 소, 말 및 낙타를 포함하는 상목 유제동물의 구성원인 임의의 종을 지칭한다. 일부 실시형태에 따르면, 포유동물은 인간이다.
본원에 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은, 환자에 대한 치료제(예를 들면, 올리고뉴클레오티드, 소분자, 펩티드, 펩티드모방약, 영양보조식품 또는 유전자 편집 시스템)의 적용 또는 투여로서 정의되거나, 또는, 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 증상, 또는 질환의 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 구제, 개량, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로 질환 또는 장애, 질환 또는 장애의 증상 또는 질환의 소인을 갖는 환자로부터 단리된 조직 또는 세포주에 대한 치료제의 적용 또는 투여로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물유전체학"은, 임상 개발 중 및 시장에서 약물에 대한 유전자 서열분석, 통계적 유전학 및 유전자 발현 분석 등의 게놈 기술의 적용을 지칭한다. 보다 구체적으로, 이 용어는, 환자의 유전자가 약물에 대한 그 또는 그녀의 반응을 어떻게 결정하는지에 관한 연구를 지칭한다[예를 들면, 환자의 "약물 반응 표현형(phenotype)" 또는 "약물 반응 유전자형(genotype)"].
II. RNA 제제에 의한 유전자 발현의 조절
마이크로RNA(miRNA)는, 상보성 메신저 RNA(mRNA)에 결합하고 이어서 단백질 발현을 조절하는 작은 비-코딩 RNA이다[12]. 각각의 miRNA는, 유전자 발현의 경로를 조절하기 위해 진화적으로 선택된다. miRNA는, 헤어핀 루프 구조(hairpin loop structure)[pre-miRNA]로 폴딩되는 긴 일본쇄 RNA(pri-miRNA)로서 합성된다. 이들 헤어핀은, 효소 드로샤(drosha) 및 다이서(dicer)에 의해 이본쇄 성숙 miRNA로 처리된다. 표적 mRNA 전사물에 상보성인 가이드 가닥(guide strand)은, 패신저 가닥(passenger strand)이 제거되는 사이에 아르고너트(AGO) 단백질로 로딩된다[13]. 가이드 가닥/AGO 복합체는, mRNA의 3'-비번역된(untranslated) 영역(3'-UTR) 내에 통상적으로 위치하는 표적에 서열 상보성에 의해 이어서 결합한다.
miRNA 억제제(안타고미르)는, 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통해 상보성 miRNA에 결합하고 표적 mRNA와 이들의 상호작용을 차단하는, 가공된 일본쇄 올리고뉴클레오티드이다. miRNA 억제제의 구조-활성 상관을 개선하기 위해, 하기 화학적 변형을 실시할 수 있다. 골격의 포스페이트는, 뉴클레아제 분해를 억제하고 혈장 단백질 결합을 촉진하기 위해 포스포로티오에이트(phosphorothioate)에 의해 치환되고, 따라서 순환 시간 및 조직 분포를 연장시킨다. 당 그룹의 2' 탄소(2'-플루오르, 2'-O-메틸, 2'-메톡시에틸) 및 잠금 핵산(LNA) 형태에 대한 변형도, 뉴클레아제 분해를 억제하고 표적 RNA에 대한 친화도를 증가시키고 외래 DNA 및 RNA에 대한 면역 반응을 둔화시키기 위해 또한 사용된다[5]. 포스포로티오에이트 골격 변형된 올리고뉴클레오티드는 추가의 제형 없이 생리식염수 중으로 피하 투여될 수 있고[소위 "네이키드(naked) miRNA 억제제"로서 불리움], 일반적으로 유사한 및 예측가능한 약물동태를 갖는다. 초기 분포는 신속하고, 순환 t1/2는 수시간이며, 생물이용성은 90%를 초과한다. 간, 신장, 지방 조직, 비장 및 골수에 대한 전달은 강력하고, 심장 및 근육에서 발견되는 양은 훨씬 적다. 이들 화합물은 혈액-뇌 장벽을 통과하지 못한다.
miRNA 모방체(아고미르)는, RISC 복합체에 로딩되어, 상보성 "패신저" 가닥이 분해되는 동안, 이들의 "가이드" 가닥을 통해 표적 mRNA에 결합 및 조절할 수 있는 천연 miRNA의 화학적으로 변형된 버전이다. 화학적 변형은, miRNA 모방체를 뉴클레아제 분해로부터 보호하고 효력을 개선시키기 위해 사용되지만, 최적 화학적 변형의 패턴은 siRNA 및 일본쇄 miRNA 억제제와는 상이할 수 있다. 화학적으로 변형된 합성 일본쇄 miRNA(ss-miRNA)는, 도 2에 제시된 바와 같이, 표적 유전자의 발현을 침묵하기(silence) 위해 이본쇄 miRNA의 기능을 모방할 수 있다[14, 15]. 이러한 작용은, 표적 전사물에 아르고너트 2(AGO2) 단백질의 동원을 필요로 한다. 변형된 ss-miRNA 모방체는, RNAi 경로를 통해 기능의 파워(power)를 일본쇄 올리고뉴클레오티드의 보다 양호한 약리학적 특성과 조합할 수 있다. 동물에서 ss-miRNA의 생체내 효과는 전신 또는 국소 투여 후에 달성되었다[14, 16, 17]. 본 발명자들은, 일본쇄 및 이본쇄 miRNA를 지방세포에 효과적으로 전달하는 표적화 전략을 개발했다.
III. 발열 조절제 요소
특정 국면에서, 본원에 개시된 조성물은 발열을 조절하기 위한 치료제를 포함한다. 예시적 발열 조절제는 본원의 표 1에 기재되어 있다.
발열 조절제
치료 부류 화합물
올리고뉴클레오티드 miR-22 안타고미르
올리고뉴클레오티드 miR-515 아고미르
소분자 디니트로페놀
소분자 니클로스아미드
소분자 베타3 아드레날 수용체 작용제
소분자 발열모방제
소분자 PPAR 알파 작용제
소분자 PPAR 감마 작용제
소분자 레티노산
펩티드/펩티드모방약 헥사렐린
펩티드/펩티드모방약 트롬보스폰딘-1 (TSP-1)
펩티드/펩티드모방약 프로히비틴 (PHB)
영양보조식품 폴리페놀 (예를 들면, 레스베라트롤)
영양보조식품 쿠르쿠민
영양보조식품 캡시시노이드
영양보조식품 녹차 추출물 (예를 들면, EGCG)
영양보조식품 이소플라본 (예를 들면, 게니스테인)
영양보조식품 쿠에르세틴
유전자 편집 시스템 UCP1 유전자의 프로모터 영역에 위치하고 비만 및 당뇨병의 위험과 관련되는 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)의 유전자 편집
유전자 편집 시스템 UCP1 유전자 발현을 조절하는 전사 인자의 유전자 편집 억제 또는 활성화
유전자 편집 시스템 UCP1 유전자 메틸화의 후성적 감소
예시적 실시형태에서, miRNA 유사체 등의 발열 조절제는 적어도 하나의 미토콘드리아 언커플러(예를 들면, UCP1, UCP2 및/또는 UCP3)의 활성을 조절한다. 이러한 방법 및 조성물은 비만을 치료하기 위해 특히 유용하다. 2013년 4월 22일에 출원된 미국 특허 제9,034,839호 및 2013년 4월 22일자로 출원된 국제 출원 일련 번호 제PCT/US2013/037579호를 참조하고, 이들 각각은 참조에 의해 본원에 도입된다. 미토콘드리아 호흡 쇄 복합체 및 UCP1에 의한 복합체 IV 및 V의 언커플링의 개략에 대한 도 1을 참조한다.
미토콘드리아 언커플링 단백질(UCP)은, 미토콘드리아 음이온 캐리어 단백질(MACP)의 패밀리의 구성원이다. UCP는, 산화적 포스포릴화를 ATP 합성으로부터 분리하고, 에너지를 열로서 방산한다[또한 "미토콘드리아 양성자 누출(mitochondrial proton leak)"로서 지칭됨]. UCP는, 미토콘드리아 내막으로부터 미토콘드리아 외막으로 음이온의 이동, 및 미토콘드리아 외막으로부터 미토콘드리아 내막으로 양성자의 역 이동을 촉진하여, 이 프로세스에서 열을 발생시킨다. UCP는, 발열과 열 방산에 관여하는 주요 단백질이다. 써모게닌 (thermogenin)으로도 불리우는 언커플링 단백질 1(UCP1)은, 발열 및 열 방산에 관여하는 BAT 특이적 단백질이다. UCP2는, 지방세포에서도 발현되는 또 다른 언커플링 단백질이다. UCP3은 주로 골격에서 발현된다. UCP는 발열 조절 단백질의 네트워크의 일부이다.
BAT 분화 및/또는 미토콘드리아 언커플링을 유도하기 위한 발열 조절인자의 조절은 대상체에서 발열을 유도하고 따라서 비만을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 그러나, 화학적 약리학적 접근법은 이들 분자를 표적화할 수 없는데, 그 이유는 이들 분자는 종래 약물 발견의 "약물가능한 공간(druggable space)"을 지배하는 고전적 "표적 클래스"(키나제, 이온 채널, G-단백질 커플링 수용체, 등)에 속하지 않기 때문이다. 따라서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 miRNA 제제를 사용하여 이들 발열 조절인자를 조절한다.
특정 실시형태에서, miRNA 조절인자 또는 다른 치료제는 미토콘드리아 언커플러의 활성(예를 들면, mRNA 발현 수준, 단백질 발현 수준 또는 미토콘드리아 언커플링 활성)을 상향조절하기 위해 사용된다. 미토콘드리아 언커플러의 상향조절은 몇몇 방식으로 달성할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, miRNA 유사체는, 미토콘드리아 언커플러의 활성(예를 들면, mRNA 발현 수준, 단백질 발현 수준)의 하향조절에 관여하는 천연에 존재한 miRNA의 활성을 직접 억제한다. 특정 실시형태에서, miRNA 제제는 미토콘드리아 언커플러의 mRNA 또는 프로모터 영역에 직접 결합한다. 예를 들면, miRNA 제제는, 적어도 하나의 미토콘드리아 언커플러의 5' UTR 또는 mRNA의 코딩 서열에 직접 결합할 수 있다.
특정 실시형태에서, miRNA 제제 또는 기타 치료제는 미토콘드리아 언커플링 단백질의 활성화인자 또는 억제인자의 활성을 조절한다. 또 다른 실시형태에서, miRNA 유사체는 미토콘드리아 언커플러의 활성화인자의 활성(예를 들면, mRNA 발현 수준, 단백질 발현 수준)을 상향조절한다. 이러한 상향조절은, 예를 들면, 활성화인자의 발현의 하향조절에 관여하는 천연 존재 miRNA의 활성을 직접 억제함으로써 달성할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, miRNA 유사체는 미토콘드리아 언커플러의 억제인자의 활성(예를 들면, mRNA 발현 수준, 단백질 발현 수준)을 하향조절한다. 이러한 하향조절은, 예를 들면, miRNA 유사체를 사용하여 미토콘드리아 언커플러의 억제인자의 발현을 직접 억제함으로써 달성할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 발열 조절인자(예를 들면, UCP1 등의 미토콘드리아 언커플러)의 조절을 위한 miRNA 유사체 또는 다른 치료제를 사용한다. 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 miRNA 유사체는 miRNA, 아고미르, 안타고미르, miR-마스크, miRNA-스폰지, siRNA(일본쇄 또는 이본쇄), shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 또는 표적 핵산의 적어도 일부에 하이브리드화하고 이의 기능을 조절하는 기타 올리고뉴클레오티드 모방체를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 miRNA 분자 또는 이의 합성 유도체(예를 들면, 아고미르)이다. 한 가지 특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 miRNA이다. miRNA는, 포유동물을 포함하여 다양한 생물에 존재하고 진화에서 보존되어 있는 작은(예를 들면, 18 내지 24 뉴클레오티드) 비-코딩 RNA의 부류이다. miRNA는, RNAse III 효소 드로샤 및 다이서에 의한 연속적 절단을 통해 일차 전사물로부터 유래하는 약 70 뉴클레오티드의 헤어핀 전구체로부터 처리된다. 다수의 miRNA는 유전자간 영역에 코딩되고, 전(pre)-mRNA의 인트론 내에 또는 ncRNA 유전자 내에 호스팅된다. 다수의 miRNA는 또한 폴리시스트론(polycistron)으로서 클러스터화 및 전사되는 경향이 있고, 종종 유사한 공간적 시간적 발현 패턴을 갖는다. 일반적으로, miRNA는, 표적 유전자(mRNA 또는 DNA)의 상보성 서열에 결합하는 전사후 조절인자이고, 예를 들면, 번역 억제 또는 표적 분해에 의해 유전자 침묵을 초래한다. 하나의 miRNA는 다수의 상이한 유전자를 동시에 표적화할 수 있다.
개시된 방법에서 사용하기 위한 예시적 miRNA 분자는 hsa-miR-1-1, hsa-miR-1-2, miR-19a-b, hsa-miR-105, hsa-miR-1283, hsa-mir-129, hsa-miR-133a-1, hsa-miR-133a-2, hsa-miR-143, hsa-mir-143-5p, hsa-mir-147, hsa-mir-149, hsa-mir-199a, hsa-mir-199b, hsa-mir-200c, hsa-mir-204, hsa-mir-205, hsa-miR-206, hsa-mir-21, hsa-mir-211, hsa-mir-218, hsa-mir-218-1, hsa-mir-218-2, hsa-mir-219-2, hsa-mir-219-2-3p, hsa-mir-22, hsa-mir-22-3p, hsa-mir-22-5p, hsa-mir-24-2, hsa-miR-30a-e, hsa-miR-3177-5p, hsa-mir-325, hsa-mir-331, hsa-mir-331-5p, hsa-miR-3613-3p, hsa-mir-362, hsa-mir-362-5p, hsa-miR-3658, hsa-mir-367, hsa-mir-371, hsa-mir-371-5p, hsa-mir-377, hsa-mir-378, hsa-mir-378a-5p, hsa-mir-382, hsa-mir-383, hsa-mir-422a, hsa-mir-425, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-491, hsa-mir-508, hsa-mir-508-5p, hsa-mir-512-1, hsa-mir-512-2, hsa-miR-515-3p, hsa-mir-519e, hsa-miR-520a, hsa-mir-543, hsa-mir-545, hsa-mir-549, hsa-mir-556, and hsa-miR-568, hsa-mir-620, hsa-mir-643, hsa-mir-654-3p, hsa-miR-7a-g, hsa-mir-765, hsa-mir-871, hsa-mir-888, hsa-mir-888-3p, hsa-mir-92b, hsa-mir-93, hsa-mir-96 및 hsa-mir-99a로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것들을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
조절인자 분자를 조절하는 추가의 miRNA는, miRNA 표적을 예측하는 공적 이용가능한 인터넷 도구를 사용하여 동정할 수 있다. 단일 miRNA의 조절은, 지방생성 전구체 세포로부터 지방세포의 형성을 촉진할 수 있다. 다수의 신호전달 경로, 기능 및 프로세스에 관여하는 보편적 miRNA보다도, 하나의 개별 신호전달 경로 내의 복수의 유전자를 표적화하는 경로-특이적(pathway-specific) miRNA가 바람직하다.
또 다른 특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 아고미르이다. 특정 miRNA의 아고미르는 본원에 개시된 스크리닝 방법을 사용하여 동정할 수 있다. 한 가지 특정 실시형태에서, 아고미르는 인간 miR-22의 기능적 모방체이다[참조: Davidson BL et al., Nat. Rev. Genet., 12(5):329-340 (2011)].
특정 실시형태에서, miRNA 유사체는, 하나 이상의 miRNA의 활성을 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 모방체이다. 이러한 분자의 예는 안타고미르, 간섭 RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, miRNA 스폰지 및 miR-마스크를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 한 가지 특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 안타고미르이다. 일반적으로, 안타고미르는 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 표적 miRNA에 결합하고, miRNA가 그 동족(cognate) 유전자 표적에 결합하는 것을 방지함으로써 miRNA 기능을 억제한다. 안타고미르는 당해 기술분야에 공지되어 있는 임의의 염기 변형을 포함할 수 있다. 한 가지 특정 실시형태에서, 안타고미르는 인간 miR-22의 활성을 억제한다[참조: van Rooij E et al., Circ. Res., 110(3):496-507 (2012); Snead NM et al., Nucleic Acid Ther., 22(3):139-146 (2012); Czech MP et al., Nat. Rev. Endocrinol., 7(8):473-484 (2011)].
특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 길이가 8 내지 50개 뉴클레오티드이다. 당업자는 이것이 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 뉴클레오티드 또는 그 중의 임의 범위의 안티센스 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 구체화하는 것을 이해한다.
특정 실시형태에서, miRNA 유사체는, 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 포함하고 각각이 적어도 1개의 뉴클레오티드로 구성되는 키메라 올리고뉴클레오티드(chimeric oligonucleotide)이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 통상적으로, 하나 이상의 유익한 특성(예를 들면, 뉴클레오티드 내성의 증가, 세포로의 흡수 증가, 표적에 대한 결합 친화성의 증가 등)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역, 및 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소의 기질인 영역을 함유한다. 키메라 억제 핵산은, 상기 기재된 바와 같이, 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오사이드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 복합 구조로서 형성될 수 있다. 이러한 화합물은 또한, 당해 기술분야에서는 하이브리드 또는 갭머(gapmer)로 지칭되어 왔다. 이러한 하이브리드 구조의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 미국 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호를 포함하지만, 이들로 한정되지 않고, 이들 각각은 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.
특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 당의 2' 위치에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, RNA 변형은 피리미딘의 리보스 상의 2'-플루오로, 2'-아미노 및 2'-메틸 변형, RNA의 3' 말단에 염기성 잔기 또는 역전 염기를 포함한다. 이러한 변형은 통상적으로 올리고뉴클레오티드에 도입되고, 이들 올리고뉴클레오티드는, 소정 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오티드보다 높은 Tm(즉, 보다 높은 표적 결합 친화성)을 갖는 것으로 밝혀져 있다.
다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오사이드 변형은, 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 소화에 대해 보다 내성으로 되게 하고, 이에 의해 생체내 반감기를 연장시키는 것으로 밝혀졌다. 변형된 올리고뉴클레오티드의 특정 예는, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄(short chain) 알킬 또는 사이클로알킬 당간 결합 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 당간 결합을 포함하는 골격을 포함하는 것들을 포함한다. 가장 바람직한 것은 포스포로티오에이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 헤테로원자 골격을 갖는 것들, 특히 CH2-NH-O-CH2, CH,~N(CH3)~O~CH2(메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨), CH2-O-N (CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 및 O-N(CH3)-CH2-CH2 골격을 갖는 것들이고, 여기서 천연 포스포디에스테르 골격은 O-P-O-CH; 아미드 골격[참조: De Mesmaeker et al. Ace. Chem. Res. 1995, 28:366-374]; 모르폴리노 골격 구조[참조: Summerton and Weller, U.S. Pat. No. 5,034,506]; 펩티드 핵산(PNA) 골격(여기서 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 골격은 폴리아미드 골격으로 치환되고, 뉴클레오티드는 폴리아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다.)[참조: Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497]로 나타내어지고, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다. 인-함유 결합은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3' 알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 이들의 정상 3'-5' 결합, 2'-5' 결합된 유사체를 갖는 보라노포스페이트, 및 역전 극성을 갖는 것들을 포함하지만 이들로 한정되지 않고, 여기서 뉴클레오사이드 단위의 인접 쌍은 3'-5'로부터 5'-3'로 또는 2'-5'로부터 5'-2'로 연결되어 있다[참조: 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호, 이들 각각은 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]. 모르폴리노-기반 올리고머 화합물은 당해 기술분야에 공지되어 있고 문헌[참조: Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510); Genesis, volume 30, issue 3, 2001; Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214; Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220; Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596; and U.S. Pat. No. 5,034,506, issued Jul. 23, 1991, 각각은 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다. 사이클로헥세닐 핵산 올리고뉴클레오티드 모방체는 문헌[참조: Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602, 이의 내용은 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다.
그 중에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합(internucleoside linkage), 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드간 결합에 의해 형성되는 골격을 갖는다. 이들은, 모르폴리노 결합(뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성)을 갖는 것들; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것들을 포함한다[참조: 미국 특허 번호 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.].
특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(moiety), 예를 들면, 2' 위치에 하기 중의 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3, OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 또는 O(CH2)n CH3(여기서, n은 1 내지 약 10이다); C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단 그룹; 리포터 그룹; 인터칼레이터(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약물동태 특성을 개선시키기 위한 그룹; 또는 올리고뉴클레오티드의 약물동력학/약력학 특성을 개선시키기 위한 그룹; 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환체. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸)로서 공지됨]를 포함한다. 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-프로폭시(2'-OCH2CH2CH3) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오티드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 그룹 대신에 사이클로부틸 등의 당 모방체를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, miRNA 유사체는 하나 이상의 염기 변형 및/또는 치환을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "비변형된" 또는 "천연" 염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 염기는, 천연 핵산에서 빈번하지 않게 또는 일시적으로 발견되는 염기, 예를 들면, 하이포크산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신(또한 5-메틸-2' 데옥시시토신으로 지칭되고 종종 당해 기술분야에서 5-Me-C로서 지칭됨), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC 및 겐토비오실 HMC, 게다가 합성 염기, 예를 들면, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 기타 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노푸린을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다[참조: Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77; Gebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res. 1987, 15:4513]. 당해 기술분야에 공지된 "보편적" 염기, 예를 들면, 이노신도 또한 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환도 또한 포함될 수 있다. 이들은 핵산 이중쇄의 안정성을 0.6-1.20C 증가시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]. 추가의 적합한 변형된 염기는 미국 특허 제3,687,808호, 게다가 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호 및 제5,681,941호에 기재되어 있고, 이들 각각은 참조에 의해 본원에 도입된다.
소정 올리고뉴클레오티드의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 실제, 전술한 변형 중 1개 이상이 단일 올리고뉴클레오티드에 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오사이드 내에 도입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오사이드간 결합, 즉 골격 둘 다는 신규 그룹으로 치환된다. 기본 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 우수한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 올리고뉴클레오티드 모방체인 이러한 올리고머 화합물 중의 하나는 펩티드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-골격은 아미드 함유 골격, 예를 들면, 아미노에틸글리신 골격으로 치환된다. 핵염기는 유지되고, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만 이들로 한정되지 않고, 이들 각각은 참조에 의해 본원에 도입된다. PNA 화합물의 추가의 교시는 문헌[참조: Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 발견할 수 있다.
특정 실시형태에서, miRNA 제제 또는 기타 치료제는, 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증진시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체에 (공유 또는 비-공유) 연결되어 있다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대, 콜레스테롤 모이어티[참조: Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556], 콜산[참조: Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060], 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올[참조: Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770], 티오콜레스테롤[참조: Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538], 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기[참조: Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54], 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트[참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783], 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄[참조: Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973], 또는 아다만탄 아세트산[참조: Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654], 팔미틸 모이어티[참조: Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237], 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티[참조: Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937]를 포함하지만 이들로 한정되지 않고, 이들 각각은 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다. 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호도 참조하고, 이들 각각은 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.
miRNA 유사체는 표적 mRNA에 대해 충분히 상보성이어야 하고, 즉 목적하는 효과를 제공하기 위해 충분히 양호하게 및 충분한 특이성으로 하이브리드화해야 한다. "상보성"은, 수소 결합을 통해, 천연 또는 비-천연 존재 염기 또는 이의 유사체를 포함하는 2개 서열 사이의 쌍형성의 능력을 지칭한다. 예를 들면, miRNA 유사체의 하나의 위치에서의 염기가 표적 핵산의 서열에 상응하는 위치에서의 염기와 수소 결합할 수 있는 경우, 그 염기는 그 위치에서 서로 상보성인 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 100% 상보성은 필요하지 않다. 다른 실시형태에서, 100% 상보성이 필요하다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 miRNA 유사체는 통상의 방법을 사용하여 설계할 수 있다. 추가의 표적 세그먼트는, 본 개시를 고려하여 당업자에 의해 용이하게 식별가능하다. 시드 서열 내 또는 그것에 직접 인접하는 적어도 5개(5) 연속 뉴클레오티드의 스트렛치(stretch)를 포함하는 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 표적 세그먼트는 유전자를 표적화하는데 적합한 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 표적 세그먼트는, 시드 서열 중 하나의 5'-말단으로부터 적어도 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함할 수 있다(나머지 뉴클레오티드는, 시드 서열의 5'-말단의 바로 상류에서 개시하고 miRNA 제제가 약 5 내지 약 30 뉴클레오티드를 함유할 때까지 연속하는, 동일한 RNA의 연속 스트렛치이다.). 일부 실시형태에서, 표적 세그먼트는, 시드 서열 중 하나의 3'-말단으로부터 적어도 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 서열에 의해 나타내어진다(나머지 뉴클레오티드는, 표적 세그먼트의 3'-말단의 바로 하류에서 개시하고 miRNA 제제가 약 5 내지 약 30 뉴클레오티드를 함유할 때까지 연속하는, 동일한 miRNA의 연속 스트렛치이다.). 미국 특허 제9,034,839호에 제공된 서열로 무장한 당업자는, 과도한 실험 없이, miRNA 유사체를 사용하여 표적에 대한 추가 바람직한 영역을 동정할 수 있다. 한 번 하나 이상의 표적 영역, 세그먼트 또는 부위가 동정되면, 표적에 충분히 상보성인, 즉 충분히 양호하게 및 충분한 특이성으로 하이브리드화하여(즉, 다른 비-표적 핵산 서열에 실질적으로 결합하지 않는) 목적하는 효과를 제공하는 억제 핵산 화합물이 선택된다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용된 miRNA 제제는 재조합 벡터(recombinant vector)로부터 발현된다. 적합한 재조합 벡터는 DNA 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 DNA 미니서클(minicircle)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 벡터 작제물(construct)의 생산은, 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 유전자 조작 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 특정 실시형태에서, miRNA 제제는 화학적 합성 기술을 사용하여 시험관내에서 합성된다.
특정 실시형태에서, 발열 조절제 요소는, 경구 투여 후의 지방세포의 발열 및 갈색화를 증가시키는 것으로 입증된 치료학적 부류의 소분자로부터 유래한다. 이들은 디니트로페놀, 베타3 아드레날린성 수용체 길항제, 갑상선모방제, PPAR 알파 작용제 및 PPAR 감마 작용제를 포함한다. 불운하게도, 이들의 전신 투여는 치료적 사용에 대한 이들의 규제 당국의 승인을 방해하는 부작용을 유발한다. 지방 조직으로 이들 소분자의 훨씬 소량의 표적화된 전달은, 표적외 및 독성 효과를 회피하면서, 목적하는 발열 효과를 생성한다는 것이 이론화되어 있다.
특정 실시형태에서, 발열 조절제 요소는, 경구 투여 후에 지방세포의 발열 및 갈색화를 증가시키는 것으로 입증된 치료학적 부류의 영양보조식품으로부터 유래한다. 이들은 폴리페놀(예를 들면, 레스베라트롤), 쿠르쿠민, 캡시시노이드, 쿠에르세틴, 이소플라본(예를 들면, 게니스테인) 및 녹차 추출물(예를 들면, 에피갈로카테킨 갈레이트 또는 EGCG)를 포함한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법에 따르는 지방 조직에 대한 훨씬 소량의 이들 영양보조식품의 표적화된 전달은, 표적외 및 독성 효과를 회피하면서, 목적하는 발열 효과를 생성할 것으로 예상된다.
특정 실시형태에서, 발열 조절제 요소는, 지방세포의 발열 및 갈색화를 잠재적으로 증가시키는 치료학적 부류의 유전자 편집 시스템으로부터 유래한다. 이들은, UCP1 유전자의 프로모터 영역에 위치하고 비만 및 당뇨병의 위험과 관련되는 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)의 유전자 편집, UCP1 유전자 발현을 조절하는 전사 인자의 유전자 편집 억제 또는 활성화, 및 UCP1 유전자 메틸화의 후성적(epigenetic) 감소를 포함한다. 명백한 안전상의 이유로, 이들 유전자 편집 시스템은, 이들의 효과를 제한할 필요가 있는 지방세포 조직으로 특이적으로 전달되어야 한다.
IV. 지방-특이적 표적화
전술한 바와 같이, 본 개시내용은, 지방 조직, 예를 들면, 백색 지방 조직(WAT)으로 발열 조절제의 표적화된 전달을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 구체적으로, 본원에 개시된 조성물 및 제제는 지방 조직으로 발열 조절제를 선택적으로 전달한다. 인간 피하 지방 조직은 몇몇 세포 유형을 함유하고, 이들의 어떤 것도 본원에 개시된 조성물로 선택적으로 표적화할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 표적 세포는 지방세포이다. 다른 실시형태에서, 표적 세포는 전-지방세포 또는 지방 조직 간엽계 줄기 세포(ATMSC) 등의 지방세포 전구체일 수 있다. ATMSC는, 지방세포, 골세포 및 연골세포 등의 복수 계통으로 분화하는 능력을 보유하고, 인간 피하 지방 조직에 상당한 양으로 존재한다. 인간 ATMSC는, 전사 인자의 정의된 세트의 조절을 통해 갈색 지방세포(BAT)로 되도록(become) 재프로그램될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 ATMSC-양성 표면 마커를 포함하는 지방-표적 세포에 결합한다. 예시적 ATMSC-양성 표면 마커는 아쿠아포린 7(AQP7), CD9(테트라스판), CD10(MME), CD13(ANPEP), CD29(β-1 인테그린), CD36(FAT/SCARB3), CD44(히알루로네이트), CD49d(α-4 인테그린), CD54(ICAM-1), CD55(DAF), CD59, CD73(SH3), CD90(Thy1), CD91(LPR1), CD105(SH2, 엔도글린), CD137, CD146(Muc 18), CD166(ALCAM) 및 HLA-ABC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 피하 또는 백색 지방 조직(WAT)에 선택적으로 결합한다. WAT에 선택적으로 결합함으로써, 조성물은 백색 지방세포로부터 발열 브라이트(brite) 또는 갈색 또는 베이지색 지방세포(BAT)로의 전환을 촉진하는 발열 miRNA 조절제의 표적화된 전달을 촉진할 수 있다. 예시적 WAT-양성 마커는 아디포넥틴, 아쿠아포린 7(AQP7), 카베올린-1, 카베올린-2, CD36(FAT/SCARB3), CLH-22[클라트린 중쇄(heavy chain) chr. 22], FABP4(지방세포 단백질 2, ap2), SLC27A1(FATP1), SLC27A2(FATP2), GLUT4(글루코즈 수송체 4), 페리리핀 1, 페리리핀 2 및 레시스틴을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은, 지방세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 세포 마커(몇몇 지질 수송체를 포함)를 포함하는 지방 표적 세포에 결합한다. 예시적 지방세포 세포 마커는 아쿠아포린 7(AQP7), 카베올린-1(CAV1), 카베올린-2(CAV2), CD10(MME), CD36(FAT/SCARB3), CD90(Thy-1), CD91(저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1, LRP1), CD146(세포 표면 당단백질 MUC18, MCAM), CD166(활성화된 백혈구 세포 부착 분자, ALCAM), CLH-22(클라트린 중쇄 염색체 22), DPT(데르마토폰틴), FABP4(지방산 결합 단백질 4), GLUT4(글루코즈 수송체 4, SLC2A4), NPR1(나트리우레틱 펩티드 수용체 A), SLC27A1(FATP1) 및 SLC27A2(FATP2)를 포함한다. 지방 조직의 다른 특이적(양성) 마커는 아디포넥틴, BMP7, BMP8b, CIDEC, FGF 17, FGF 19, 렙틴, LPL, MetAP2, NR1H3(LXRA), 페리리핀 1, 페리리핀 2, 페리리딘 3, PPARG, RBP4 및 레시스틴을 포함한다.
세포 표면 단백질은 어느 정도 세포내(intra-cellularly) 순환하고, 다수의 표면 수용체 및 수송체는 리간드 결합(ligand binding)에 반응하여 활발하게 내재화된다. 예를 들면, 지방산 수송체(CD36 또는 SCARB3로도 공지됨, FAT)는 472 아미노산(53kDa)의 일본쇄로 이루어진 내재성 막 당단백질이고, 세포 세포질 내의 짧은 세그먼트로서 NH2 및 COOH 말단(termini) 둘 다를 갖는 2개 막관통 스패닝(spanning) 영역을 갖는 헤어핀 막 토폴로지(topology)를 갖는다[18-20], (도 10)[20].
FAT는 지방세포 막 및 세포내 구획(엔도좀) 사이를 순환한다. 따라서, 지방세포 세포 표면 수용체/수송체에 결합하는 분자는 다양한 발열 조절제를 세포에 전달하기 위해 이용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은, 하나 이상의 상기 동정된 마커에 선택적으로 결합하는 표적화 요소를 포함할 수 있고, 따라서 발열을 증진시키기 위해 지방세포로의 발열 조절제의 선택적 전달을 증진시킨다. 세포 표면 마커의 지식에 의해, 유세포분석 세포 선별(Flow Cytometry Cell Sorting)[FACS]에 의한 분리가 가능해지고, 그 후에 표적화제(targeting agent)의 스크리닝 및 선택이 가능해진다.
발열 조절제는 또한 지질 나노입자(LNP) 제형에 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드의 LNP 전달은 3개 성분으로 이루어진 나노입자 내로의 올리고뉴클레오티드의 캡슐화를 포함한다: 지질 이중층을 형성하고 이의 강성을 유지하는 구조 지질; 음으로 하전된 올리고뉴클레오티드의 입자로의 도입을 촉진하고 세포 내재화 후에 엔도좀 경로로부터의 탈출을 촉진하는 양이온성 지질; 및 순환 시간을 증가시키고 혈장 단백질 결합을 최소화하기 위한 "쉴드(shield)", 종종 폴리에틸렌 글리콜[21].) LNP-제형화된 올리고뉴클레오티드는 정맥내 투여할 수 있고, 그렇게 하면, 대부분의 약물은 간으로 귀착한다. 결과적으로, 이 기술은 주로 생명을 위협하는 간 질환(암 및 간염)에 적용되어 왔다. 그러나, 발명자들은 LNP가 지방 조직으로의 직접 주사에 의해 발열 조절인자를 지방세포에 전달하기 위해 사용될 수 있음을 발견했다.
V. 실시예
A. 실시예 1: 변형된 구조 및 길이를 갖는 일본쇄 miRNA(ss-miRNA) 유사체
시드 영역(염기 2 내지 8)의 중요한 역할, 및 ss-miRNA가 기능하는데 필요한 Ago2 단백질과의 상호작용을 고려하여, 하기 화학적 변형을 포함하는 상이한 길이의 ss-miRNA 유사체를 제조한다: 5'-(E)-비닐포스포네이트 보호(5'-VP), 포스포로티오에이트(PS) 골격, 2'F, 2'-O-Me 및 2'-O-MOE 변형, 5-메틸 시토신 변형, "피리미딘 카세트"의 도입, 및 "갭머"를 제조하기 위한 "DNA 갭"의 도입. 이들 분자는, 단독("네이키드")으로 또는 지질 태그(lipid tag)[예를 들면, 증가하는 길이의 지방산 또는 콜레스테롤) 또는 짧은 펩티드 태그(예를 들면, 헥사렐린)과 조합하여, 도 4 내지 6에 설명된 바와 같이, 인간 피하 지방세포, 항-비만 약물을 위한 최종적 표적의 일차 배양물의 모델에서 시험한다.
B. 실시예 2: 지방산/miRNA 접합체
성숙 인간 피하 지방세포 및 이들의 엑소좀의 광범위한 "Omic" 프로파일링을 실시했다. 발명자들은, 지방세포로의 지방산 흡수에 관여하는 불가결한 세포 막 수송체인, 지방산 트랜스로카제(스캐빈저 수용체 B3 또는 CD36로도 공지됨, FAT)의 고도의 발현을 관찰했다[19, 22-25]. ss-miRNA 유사체를 FAT에 의해 자연적으로 수송되는 지방산과 조합하는 것은 성숙 지방세포에 대한 이러한 ss-miRNA 유사체의 표적화된 전달을 촉진시킬 것으로 예상된다. 이는, 지방세포 FAT의 우선적 표적화 및 이에 의한 수송을 촉진하기 위해 지방산에 공유 부착되어 있는 일련의 miRNA 유사체를 합성하고 검증함으로써 나타난다. 이들 miRNA 유사체는 AdipomiR(지방(Adipo)세포-표적화 miRNA)로서 본원에서 지칭된다.
AdipomiR 합성 : 지방산은, 올리고뉴클레오티드를 포함하여, 다양한 약물에 대한 화학적 투과 증진제(CPE)로서 사용되어 왔다[26][27]. 지방산(AdipomiR)에 접합된 일본쇄 miRNA 유사체로 제조된 접합체를 합성한다. 상이한 길이의 지방산은 miRNA 유사체의 3'에서 부착된다. 형광 표지된 및 스크램블 miRNA AdipomiR도 또한 합성된다. 하기 표 2는 지방산을 길이에 따라 분류한 것이다:
길이에 따른 지방산의 분류
중쇄(medium chain) 지방산 C10:0 데칸산
C12:0 도데칸산
장쇄 지방산 C16:0 팔미트산
C18:0 스테아르산
C18:1 올레산
초장쇄 지방산 C22:0 도코산산
C32:6 도트리아콘타헥산산
오메가-3 지방산 C22:6 도코사헥사엔산
AdipomiR의 인 실리코 모델링 : 오픈-소스 모델 시각화 PyMOL 프로그램을 사용하여, 지방산에 접합된 일본쇄 miRNA 유사체의 3D 이미지를 생성했다. 도 5는 4개 AdipomiR의 3D 모델을 나타낸다.
기능적 miRNA의 AdipomiR 표적화된 전달의 시험관내 검증 : ss-miRNA 유사체를 지방세포에 표적화 및 전달하는 AdipomiR의 능력은 인간 피하 지방세포의 일차 배양물의 모델에서 평가했다. 제1 실험 단계는, 인간 피하 지방세포의 일차 배양물의 발명자의 시험관내 프로토콜을 사용하여, 지방산이 인간 성숙 지방세포에 효율적으로 수송되었음을 확인하는 것이었다. 이를 시험하기 위해, 팔미트산 및 헥사데칸산 등의 지방산을 녹색 형광 프로브(probe)로 표지하고, 배양된 지방세포와 함께 배양했다. 형광 현미경에 의한 지방세포의 검사는, 표지된 지방산이 일차 배양물에서 인간 지방세포에 의해 매우 효율적으로 수송되었음을 나타냈다.
AdipomiR의 지방세포 전달을 확인하는 후속 단계를 위해, 인간 지방세포를 다양한 농도(25 내지 100nM)의 AdipomiR과 함께 배양한다. 1 내지 48시간의 몇몇 시점에서, 세포는, 기능적 발열 miRNA 유사체의 지방세포 흡수를 검증하기 위해 miRNA 유사체 및 표적 유전자의 공초점 현미경, 고함량 이미징(imaging) 및 qRT-PCR용으로 수집한다. AdipomiR 결합 및 내재화가 FAT-의존성인 것을 검증하기 위해, 세포를 설포-N-석신이미딜 올레에이트(SSO, FAT의 공지된 억제제)로 전-처리한다. 이들 AdipomiR을 인간 전-지방세포, 마크로파지 및 간세포에서 시험하여 세포 흡수 선택성을 평가한다.
생체내 AdipomiR 생물분포 및 유효성 : 성숙 인간 지방세포로 기능적 발열 miRNA 유사체의 시험관내 증진된 수송을 나타내는 AdipomiR를 생체내에서 추가로 시험한다. 식이-유도된 비만(DIO) C57BI/6J 마우스를 사용하여, 선택된 AdipomiR을 IACUC-승인된 생물분포 및 유효성 프로토콜하에 UT 오스틴 동물 자원 센터(UT Austin Animal Resources Center)에서 수행된 연구에서 조직 생물분포 및 치료 유효성에 대해 시험한다. 독성은 동물의 1일 2회 모니터링에 의해 모니터링한다. 중요한 조직 및 기관에 대한 AdipomiR의 생물분포는, miRNA 유사체 및 표적 유전자의 조직학적 염색 및 qRT-PCR을 위해 0, 2 및 4일에 사타구니 지방 패드에서 AdipomiR의 피하 주사후 7일에 이들을 수거함으로써 평가한다. "네이키드" miRNA 유사체(15mg/kg)를 대조군으로 사용한다.
WAT로부터 BAT로 발열 갈색화를 유도하는 AdipomiR의 능력은 DIO 마우스에서 결정된다. 8주 연구의 개시에서, DIO 마우스는 정상 고형사료 또는 60% 고지방 식이로 유지하고, 1주의 0, 2 및 4일에 사타구니 지방 패드로 AdipomiR의 피하 주사로 처리하고, 이어서 연구의 나머지 동안 1주 1회 주사로 처리한다. 마우스는 처리 1주 및 8주에서 NMR에 의한 신체 조성 분석을 수행한다. 지질 파라미터 및 인슐린 감수성을 평가한다. 처리 후, 동물을 희생시키고, 조직학적 및 유전자 발현 분석을 위한 중요한 조직 및 기관과 함께 분석을 위해 혈액을 수집한다. AdipomiR를 투여한 마우스는 체지방이 감소하고 인슐린 감수성이 감소하고 지질 파라미터가 양호할 것으로 예상된다. 이러한 활성을 갖는 것으로 예상되는 예시적 AdipomiR은, 중쇄(medium chain) 지방산, 장쇄 지방산 또는 초장쇄 지방산과 접합된 일본쇄 miR-22 안타고미르 및 miR-515 아고미르를 포함한다.
C. 실시예 3: 헥사렐린/miRNA 접합체
헥사렐린, 화학적으로 안정한 및 강력한 성장 호르몬 비서(secretagogue)[His-D-2-Me-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, 분자식: C47H58N12O6 분자량: 887]은 FAT/CD36 수송체를 통해 지방 대사에 유리한 효과를 갖고[28, 29], 이에 의해 지방산 대사 및 미토콘드리아 산화 포스포릴화 및 발열의 활성화를 초래하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 헥사렐린 처리는 글루코즈 및 인슐린 불내성을 현저히 개선시키고 MKR 인슐린-내성 마우스에서 혈장 및 간 트리글리세라이드를 감소시켰다. 추가로, 헥사렐린의 심장보호 효과는 잘 보고되어 있다[30].
ss-miRNA 유사체를 FAT에 의해 자연적으로 수송되는 헥사렐린과 조합하는 것은 성숙 지방세포로 이러한 ss-miRNA 유사체의 표적화된 전달을 촉진할 것으로 예상된다. 따라서, 지방세포 FAT로의 우선적 표적화를 촉진하기 위해 헥사렐린에 공유 부착되어 있는 일련의 miRNA 유사체를 합성하고 평가한다. 이들 헥사렐린-접합된 miRNA는 HexamiR[헥사(Hex)렐린-접합된 miRNA]로서 본원에서 지칭된다.
HexamiR의 인 실리코 모델링 : 상기 기재된 바와 같이, 오픈-소스 분자 동력학 시뮬레이션 프로그램을 사용하여, 도 6에 제시된 헥사렐린에 접합된 일본쇄 miRNA 유사체의 3D 이미지를 생성했다.
기능적 miRNA의 HexamiR 표적화된 전달의 시험관내 검증 : ss-miRNA 유사체를 지방세포로 표적화하고 전달하는 HexamiR의 능력은 인간 피하 지방세포의 일차 배양물의 모델에서 평가한다. 제1 실험 단계는, 인간 피하 지방세포의 일차 배양물의 시험관내 프로토콜을 사용하여, 헥사렐린이 인간 성숙 지방세포로 효율적으로 수송되는 것을 확인하는 것이었다. 이를 시험하기 위해, 녹색 형광 프로브로 표지된 헥사렐린을 배양된 지방세포와 함께 인큐베이팅했다. 형광 현미경에 의한 배양된 지방세포의 검사는, 헥사렐린이 도 7에 제시된 바와 같이 인간 지방세포의 세포질에 매우 효율적으로 수송되었음을 나타냈다.
HexamiR의 후속 시험관내 및 생체내 검증 단계는 AdipomiR에 대해 상기 기재된 실험에 의존한다. HexamiR을 투여한 마우스는 감소된 체지방, 감소된 인슐린 감수성 및 양호한 지질 파라미터를 가질 것으로 예상된다. 이러한 활성을 갖는 것으로 예상된 예시적 HexamiR은 His-D-2-Me-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2에 접합된 일본쇄 miR-22 안타고미르 및 miR-515 아고미르를 포함한다.
D. 실시예 4: 지질 나노입자/miRNA 접합체
지질 나노입자(LNP)는, 전신 투여 후에 siRNA의 세포 흡수 및 효율적 엔도좀 탈출에 대해 최적화되었지만[31-33], 지방 조직으로의 국소 전달 후에 광범위하게 평가하지 않았다.
인간 지방세포에 대한 대조군 miRNA의 시험관내 LNP 전달 : 실험을 구조적 지질, 양이온성 지질 및 PEG로 이루어진 LNP로 수행했다. 4개의 상이한 LNP 제형을 사용했다: LNP1, LNP2, LNP3 및 LNP4. 일차 배양에서 성숙 인간 지방세포를 음성 대조군[공(empty) LNP] 또는 상이한 양(5 내지 250nM)의 이본쇄 miR-124(지방세포에서 발현되지 않는 miRNA)로 로딩된 LNP로 형질감염시켰다. 2일 후, 지방세포에 도입된 miR-124의 양 및 표적 mRNA의 하향-조절을 qRT-PCR에 의해 측정했다. 도 8a에 제시된 바와 같이, miR-124는 용량-의존적 방식(최대 121배의 RQ)으로 지방세포에서 검출된 반면, 2개의 대조군 miRNA(let-7(도 8b) 및 miR-143(제시되지 않음))의 발현은 변형되지 않았다. 도 8a는 또한 LNP1 및 LNP2가 miRNA의 가장 효율적 전달을 제공하고, LNP3이 중간 수준의 효율을 제공하고, LNP4가 비교적 비효율적임을 나타낸다. miR-124의 3개 표적 유전자(CD164(제시되지 않음), IQGAP1(도 8c), VAMP3)의 발현은 용량-의존적 방식으로 녹-다운(knocked-down)된 반면, 2개 대조군 유전자[FABP4(제시되지 않음) 및 렙틴(도 8d)]의 발현은 변형되지 않았다.
뮤린(murine) 지방세포로 발열 miRNA의 생체내 LNP 전달 : 배양물(LNP1 및 LNP2)에서 인간 지방세포로 대조군 이본쇄 miRNA 모방체(miR-124)를 가장 효율적으로 전달한 2개 LNP를 마우스에서 시험했다. 대조군 miR-124 또는 발열 이본쇄 인간 miR-515-3p 모방체(Dharmacon)를 담고있는(carrying), SC 또는 IV 투여된 이들 2개 LNP의 다양한 기관 및 조직에 걸친 생물분포를 고지방 식이에 배치한 비만 C57BL/6J 수컷 마우스에서 시험했다. 제 2일에 단일 피하 주사 또는 제 0, 1 및 2일에 3회 정맥내 주사 후, 기관 및 조직을 제 4일에 수집했다. 예상된 바와 같이, LNP의 정맥내 주사는, 다양한 지방 조직에 의한 흡수가 없거나 거의 없이, 간 및 신장으로 대개 miR-515 모방체의 축적을 유도했다. 그러나, 단일 피하 주사 후, LNP는 좌측 사타구니 지방 패드(피하 주사 부위)로 발열 miRNA 모방체의 전달을 제공했다. miR-515 모방체의 충분한 카피(copy)가 사타구니 지방 패드(세포당 ≥100 miRNA 카피)에 전달된 경우, UCP1 mRNA 발현의 현저한 용량-의존적 증가가 관찰되었다. 도 a는 LNP1을 나타내고, 형태 2는 LNP2를 나타낸다. 놀랍게도, 단일 피하 주사 후, 하나의 나노입자(LNP2)는 또한 miR-515 모방체를 폐, 신장 및 대퇴사두근에 전달했다. 요약하면, 이 연구는, 소량의 이러한 miRNA가 조직 내부에 존재하는 경우, UCP1 유전자 발현의 상향조절로 번역되는 마우스 피하 지방 조직으로 LNP-담지(carried) 이본쇄 miRNA 모방체의 세포내 전달의 개념의 증거를 제공했다. 그러나, PEG화(PEGylated) LNP는 이들의 생물분포 프로파일 때문에 인간에서 miRNA의 전달에 적절하지 않을 수 있다. 추가로, 양이온성 지질은 세포 막에 대한 손상을 유도할 수 있다. 따라서, 추가의 LNP를 개발했다.
SDC 리포좀 제형 : 스핑고미엘린은 인간 지방세포 막의 가장 풍부한 인지질(40%)이다. 스핑고미엘린을 콜레스테롤과 조합하여, 막 선별 및 트래피킹(trafficking), 신호 형질전환 및 세포 편극화 등의 다수의 세포 프로세스에 관여하는 지질 라프트(lipid raft)를 형성했다[34, 35]. 스핑고미엘린/콜레스테롤 리포좀은 DSPC/콜레스테롤 리포좀보다 큰 안정성을 갖고, 보다 효율적으로 트래핑된(entrapped) 약물을 전달할 수 있다[36]. 상이한 조성의 다양한 리포좀을 특성화했다. 최상-실시 리포좀 후보는 스핑고미엘린, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC) 및 콜레스테롤을 40:40:20% 중량 대 중량 비율로 함유했다. 이들 "SDC" 리포좀은 140nm의 피크 평균 직경, <0.01의 다분산 지수(DPI) 및 +2.32mV의 제타 전위로 충분히 특성화되었고, 4°C에서 3개월에 걸친 저장 동안 현저한 변화가 없었다.
SDC 리포좀과 발열 miRNA(LipomiR)과의 복합체화 : miR-515 아고미르를 정제된 SDC 리포좀에 첨가하면, <0.032의 PDI와 함께 이들의 크기가 147nm로 다소 증가했고, 제타 전위가 +2.32mV로부터 -55.7mV로 감소했고, 이는 miRNA 표면 회합(association)을 나타낸다. 고함량 형광 이미징을 사용하여, 이들 SDC 리포좀 miRNA 복합체(LipomiR)는 형광 및 기능적 miRNA의 지방세포로의 효율적 전달을 나타냈다.
miRNA의 흡수는, qRT-PCR 분석에 의해 제시된 UCP1의 용량 의존적 유도와 함께 현미경에 의해 시각적으로 확인했다. UCP1 상향조절은 DharmaFect 형질감염 시약에 의해 전달된 유리(free) miRNA의 양성 대조군과 유사했다.
E. 실시예 5: SDC 리포좀(AdipoLipomiR)에 고정하는 지방산 접합된 miRNA
지방산 접합된 miRNA(AdipomiR)는 SDC 리포좀 막으로 발열 miRNA 유사체를 고정시키는 것에 도움이 될 수 있다. 2개의 접근법을 사용할 수 있다. 첫째, AdipomiR는 지질 필름 제조/수화 동안 도입될 수 있고, 이에 의해 SDC 리포좀에 대한 내부 및 외부 고정을 개선시킬 수 있다. 둘째, SDC 리포좀은 사전에 제조되고, 이어서 친지성 상호작용을 통한 표면 막 고정을 위해 지방산 접합된 miRNA와 함께 인큐베이팅될 수 있다. 제1 접근법은 리포좀 사이징 압출 프로세스 동안 접합된 miRNA의 현저한 손실을 겪지만, 리포좀 루멘 내에 miRNA의 보다 높은 내부 캡슐화로부터 이익을 받고, 이에 의해 전신 수송 동안 추가의 보호 및 전달 성능을 제공한다. 보완적 접근법으로서, 지질 수화 동안 막 고정을 위해 지방산에 접합된 최소 변형된 miRNA의 캡슐화는 비용 및 복잡성을 감소시키는 수단으로서 시도된다. 유리 또는 지방산-접합된 miRNA 유사체는 로딩 효능을 비교하기 위해 SDC 리포좀 형성 동안 또는 후에 첨가된다. LipomiR 사이즈 및 전하는 miRNA의 외부 로딩을 평가하기 위해 사용되는 한편, 총 miRNA 체류 수준은, 트리톤 X-100을 사용하는 UV-vis 스펙트럼 및 miRNA 추출에 의해 검정하고, 이어서 RiboGreen 형광 정량화를 수행할 수 있다. 덱스트란 설페이트를 사용한 이온성 경쟁은 리포좀 표면에 대한 miRNA의 지방산 고정을 평가하기 위해 사용된다. miRNA 안정성을 평가하기 위해, miRNA-로딩된 SDC 리포좀은 인간 혈청의 존재하에 인큐베이팅한다. 다양한 시점에서, miRNA는 HPLC에 의한 분해를 위해 평가한다. miRNA는 약한 양이온성 DMPC의 존재 때문에 SDC 리포좀과 복합체화하지만, 지방산의 접합은 조립된 LipomiR 내에서 장기간 안정성을 개선시키는 주요 인자일 수 있다. 추가로, 이는 DMPC의 제거를 전적으로 가능하게 할 수 있고, 이에 의해 확장 제조능 및 안전성을 추가로 단순화시킬 수 있다. 추가로, 가용성 형광 마커는, 주변 림 대 루미날 염색 패턴으로 2개-톤의 형광 나노입자를 밝히기 위해 제조 동안 이들 리포좀 내에 내부적으로 팩키징할 수 있다.
F. 실시예 6: 다른 표적화 제형
지방산을 사용하여 성숙 인간 지방세포에 대한 miRNA 유사체의 표적화된 전달을 용이하게 하는 것에 추가하여, 이러한 miRNA는, 수용체 및 수송체 등의 지방세포 막 단백질을 표적화함으로써 지방세포에 또한 전달될 수 있다. 발명자들은, 하기 단백질이 성숙 지방세포에 대량으로 특이적으로 발현되는 것을 "omics" 프로파일링에 의해 발견했다: 지방산 트랜스로카제(FAT/CD36/SCARB3 NCBI 유전자 ID 948), 아쿠아포린 7(AQP7, NCBI 유전자 ID 364), 페리리핀 1(PLIN1, NCBI 유전자 ID 5346), 및 페리리핀 2(PLIN2, NCBI 유전자 ID 123). FAT는, 예를 들면, VHH 단일 도메인 항체(15kDa)[37] 또는 기타 특이적 항체, 트롬보스폰딘-1 펩티드(GVITRIR)[38], 또는 헥사렐린 펩티드[29]와 표적화할 수 있다. 본 발명자들은, 항-FAT 항체를 갖는 지방세포 세포 막의 항체 염색을 나타내고 지방세포 세포 막의 수준에서 고밀도의 FAT 발현을 확인하는 실험을 성공적으로 수행했다. AQP7, PLIN1 및 PLIN2는 또한 특이적 항체로 표적화할 수 있다.
참조문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004

Claims (24)

  1. (a) 지질 산화 및/또는 발열 조절(thermogenic regulation)을 조절할 수 있는 치료제(therapeutic agent);
    (b) 세포 흡수 및 치료제의 표적화된 지방세포(targeted adipocyte)로의 전달을 촉진하는 표적화 요소(targeting element); 및
    (c) 스핑고미엘린(sphingomyelin), DMPC 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 입자로서, 치료제의 세포내 침투(intra-cellular penetration)를 증진시키고 치료제를 분해로부터 보호하는 리포좀 입자
    를 포함하는, 지방세포-표적화 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 스핑고미엘린이 리포좀 입자의 30 내지 50중량%를 구성하고, DMPC가 리포좀 입자의 30 내지 50중량%를 구성하며, 콜레스테롤이 리포좀 입자의 10 내지 30중량%를 구성하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스핑고미엘린이 리포좀 입자의 40중량%를 구성하고, DMPC가 리포좀 입자의 40중량%를 구성하고, 콜레스테롤이 리포좀 입자의 20중량%를 구성하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 리포좀이 약 135 내지 150nm의 피크 평균 직경(peak mean diameter) 또는 약 0.035 미만의 다분산 지수(polydispersity index)를 갖는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가, 길이가 7 내지 14 뉴클레오티드인 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가 miR-22 안타고미르, miR-515 아고미르, 디니트로페놀, 니클로스아미드, β3 아드레날린성 수용체 길항제, 갑상선모방제(thyromimetic agent), PPAR 알파 작용제, PPAR 감마 작용제, 레티노산, 헥사렐린, 트롬보스폰딘-1(TSP-1), 프로히비틴(PHB), 폴리페놀, 레스베라트롤, 쿠르쿠민, 캡시시노이드(capsicinoid), 이소플라본, 또는 유전자 편집 시스템의 성분을 포함하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적화 요소가, 치료제에 연결되어 있는 지질인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 지질이 데칸산, 도데칸산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 올레오일 글리신, 도코사노산, 헥사데칸산, 도트리아콘타헥사엔산, 도코사헥사엔산 또는 콜레스테롤을 포함하는, 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 지질이, 지방산 트랜스로카제(FAT/CD36/SCARB3)에 의해 자연적으로 수송되는 지방산인, 조성물.
  10. 제5항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가 리포좀의 내부에 캡슐화(encapsulating)되어 있는, 조성물.
  11. 제5항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가 리포좀의 표면과 회합(associated)되어 있는, 조성물.
  12. 제7항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가, 공유 결합, 디설파이드 결합, 디에스테르 결합, 펩티드 결합, 이온 결합 또는 비오틴-스트렙트아비딘 결합(biotin-streptavidin bond)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커(linker)에 의해 지질에 연결되어 있는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적화 요소가 지방산 트랜스로카제(FAT/CD36/SCARB3), 아쿠아포린 7(AQP7), 페리리핀 1(Perilipin 1)(PLIN1) 또는 페리리핀 2(PLIN2)에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 표적화 요소가 항체, 항체 단편, scFv 또는 단일 도메인 항체(single domain antibody)를 포함하는, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 표적화 요소가 헥사렐린, 또는 트롬보스폰딘-1(Thrombospondin-1), 또는 아미노산 서열 GVITRIR을 갖는 트롬보스폰딘-1 펩티드를 포함하는, 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가, 공유 결합, 디설파이드 결합, 디에스테르 결합, 펩티드 결합, 이온 결합 또는 비오틴-스트렙트아비딘 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커에 의해 표적화 요소에 연결되어 있는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가 지질 산화 및/또는 호흡 쇄 언커플링(respiratory chain uncoupling)을 조절하는, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 치료제가 UCP1, UCP2 또는 UCP3의 활성을 조절하는, 조성물.
  19. 디설파이드 결합을 통해 헥사렐린에 연결된(linked) 일본쇄(single stranded) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지방세포-표적화 치료제.
  20. 제19항에 있어서, 일본쇄 올리고뉴클레오티드의 길이가 7 내지 14개 뉴클레오티드인, 치료제.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 일본쇄 올리고뉴클레오티드가 miR-22의 안타고미르 또는 miR-515의 아고미르인, 치료제.
  22. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항의 조성물을 대상체(subject)에게 제공하는 것을 포함하는, 대상체에서 발열 조절을 조절하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 조성물 또는 치료제를 제공하는 것이 조성물 또는 치료제를 피하, 경피 또는 정맥내로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 환자가 비만, 또는 2형 당뇨병, NAFLD 및 NASH와 같은 관련 심장-대사 장애(related cardio-metabolic disorder)를 갖는, 방법.
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